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WO2023145765A1 - 多孔質構造を有するハイドロゲルの製造方法 - Google Patents

多孔質構造を有するハイドロゲルの製造方法 Download PDF

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WO2023145765A1
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昇平 石川
宏幸 鎌田
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Gellycle Co Ltd
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Definitions

  • FIG. 5 shows images of the hydrogel immediately after production (upper, scale bar 10 mm) and its confocal microscope image (lower, scale bar 20 ⁇ m).
  • FIG. 6 shows images of the hydrogel in equilibrium in water (upper row, scale bar 10 mm) and its confocal microscope image (lower row, scale bar 20 ⁇ m).
  • FIG. 7 is a graph showing equilibrium swelling of hydrogels prepared at each total alkali metal salt concentration.
  • FIG. 8 is a graph showing the elongation breaking stress of hydrogels prepared at each total alkali metal salt concentration.
  • either one of the compounds A and B has a total of 2 or more nucleophilic or electrophilic functional groups in the side chain or terminal, linear (i.e., bi-branched), tri-branched, It is a 4-branched or 8-branched polyethylene glycol (PEG).
  • either one of the compounds A and B has a total of 2 or more nucleophilic functional groups or electrophilic functional groups in the side chain or terminal, linear, tri-branched, or tetra-branched or 8-branched polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • n 21 to n 24 may be the same or different. The closer the values of n 21 to n 24 are, the more the hydrogel can have a uniform three-dimensional structure and the higher the strength. If the values of n 21 to n 24 are too high, the strength of the gel will be weak, and if the values of n 21 to n 24 are too low, gel formation will be difficult due to steric hindrance of the compound. Therefore, n 21 to n 24 include integer values of 11 to 569, preferably 28 to 228, and more preferably 56 to 114.
  • the molecular weight of the second four-branching compound of the present invention is 2 ⁇ 10 3 to 100 ⁇ 10 3 Da, preferably 5 ⁇ 10 3 to 40 ⁇ 10 3 Da, and 10 ⁇ 10 3 to 20 ⁇ 10 3 . Da is more preferred.
  • PEG was dissolved therein at a concentration of 100 g/L to prepare a first solution and a second solution.
  • the first solution thus prepared (510 mM total alkali metal salt concentration, 100 g/L PEG concentration) and the second solution (510 mM total alkali metal salt concentration, 100 g/L PEG concentration) were combined into an empty Equal volume ratios were mixed in a centrifuge tube.
  • This mixed solution was used as a gelling solution containing PEG at a concentration of 100 g/L and an alkali metal salt at a concentration of 510 mM.
  • Example 6 potassium sulfate (K 2 SO 4 ), which is an alkali metal salt different from sodium dihydrogen phosphate and disodium hydrogen phosphate contained in PB, was additionally added to PB in advance. Specifically, K 2 SO 4 was added as a solid to PB prepared to have an alkali metal salt concentration of 200 mM and dissolved so that the K 2 SO 4 concentration was 100 mM. This resulted in a total alkali metal salt concentration of 300 mM with 200 mM PB and 100 mM K2SO4 . Using the obtained liquid containing K 2 SO 4 as PB, PEG was dissolved therein at a concentration of 250 g/L to prepare a first solution and a second solution.
  • K 2 SO 4 potassium sulfate
  • the gelling liquid was liquid for at least 5 seconds from the completion of preparation of the gelling liquid to the completion of ejection. After that, the gelling solution in the glass vial was allowed to stand for 24 hours without any particular external stimulation. When the glass vial was tilted, the gelling liquid lost fluidity and became a white solid. When the resulting hydrogel was compressed with a finger, it was observed to spit out water. This result indicates that the formation of the porous structure does not depend on the number of branches of the macromolecules that constitute the hydrogel.
  • Trilysine was dissolved in phosphate buffer (PB). At this time, the alkali metal salt concentration of PB was set to 400 mM. Trilysine concentration was 16.10 g/L.
  • a first solution with the same total alkali metal salt concentration and PEG concentration (total alkali metal salt concentration 200-500 mM, PEG concentration 20-100 g/L) and the second solution (total alkali metal salt concentration 200-500 mM, PEG concentration 20-100 g/L) were mixed at the same volume ratio in an empty tube to form a gelling solution.
  • 200 ⁇ L of each gelling solution was poured into a 96-well microplate and allowed to stand at 25° C. for 24 hours. After that, the hydrogel formed in each well was photographed (Fig. 3), and the transmittance of each well was measured using Perkinelmer ARVO X3 (Fig. 4). The degree of white turbidity with the naked eye in FIG.
  • K 2 SO 4 was added to a phosphate buffer (PB) prepared to have an alkali metal salt concentration of 200 mM, and K 2 SO 4 was adjusted to a concentration of 0 to 250 mM. 2SO4 was added as a solid and dissolved. This resulted in a total alkali metal salt concentration of 200-450 mM with 200 mM PB and 0-250 mM K 2 SO 4 . Tetra-PEG-SH was dissolved in the liquid. PEG concentration was 100 g/L.

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Abstract

【課題】　μｍスケールの多孔質構造を有するハイドロゲル材料の簡便な製造方法を提供することを課題とする。 【解決手段】　多孔質構造を有するハイドロゲルの製造方法であって、以下のａ）～ｄ）の工程を含む製造方法：ａ）化合物Ａを、アルカリ金属塩を０～１０００ｍＭの濃度で含有する水系溶媒に溶解させた第１の溶液を調製する工程；ｂ）前記化合物Ａと化学架橋可能な化合物Ｂを、アルカリ金属塩を０～１０００ｍＭの濃度で含有する水系溶媒に溶解させた第２の溶液を調製する工程；ｃ）前記第１の溶液と前記第２の溶液を混合して、１種類以上のアルカリ金属塩を３００ｍＭ～１０００ｍＭの濃度で含有するゲル化液を得る工程；及びｄ）前記ゲル化液中の前記化合物Ａと化合物Ｂが、外部刺激によらず化学架橋を形成することで、多孔質構造を有するハイドロゲルを得る工程を含み、かつ前記化合物ＡとＢのうちいずれか一方が、側鎖又は末端に合計２以上の求核性官能基又は求電子性官能基を有する、直鎖、３分岐、４分岐または８分岐のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。

Description

多孔質構造を有するハイドロゲルの製造方法
　本発明は、多孔質構造を有するハイドロゲルの製造方法に関する。
　近年、高分子の網目構造を有するハイドロゲルは、その優れた保水能力及び生体適合性等の特性を有することから、人工組織や再生医療用足場材、シーラント、癒着防止材、ドラッグデリバリー基材、コンタクトレンズなどの医療目的だけでなく、センサーや表面コーティング材などの多様な用途への応用が期待されている材料である（例えば、非特許文献１）。特に、再生医療用足場材等の用途においては、μｍスケールの大きさの多孔質構造を有する高分子材料の開発が望まれている。
　しかしながら、従来、μｍスケールの多孔質構造を得るためには、予め作製されたハイドロゲルや高分子構造体をリソグラフィー等により微細加工する等のトップダウン的な手法を用いるか、あるいは、溶媒に不溶な高分子原料を用いて高分子材料を作成する必要があった。一方、親溶媒性の高分子原料を用いる場合には、そもそも材料自体が溶媒に溶解してしまうか、もしくはｎｍスケールの小さな多孔質構造のハイドロゲルしか作成することができなかった。
Ｓａｋａｉら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、４１、５３７９－５３８４、２００８
　そこで、本発明は、μｍスケールの多孔質構造を有するハイドロゲル材料を提供すること、及びかかるハイドロゲル材料を親溶媒性の高分子原料から作製するために適した製造方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討の結果、高濃度のアルカリ金属塩の存在下においてゲル化反応を行うことで、μｍスケールの多孔質構造を有するハイドロゲルを簡便な手法で形成できることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。かかるハイドロゲルは、構成成分である高分子が製造過程において自発的に相分離することで形成されるスポンジ様の３次元網目構造（多孔質構造）を有するものである。
　すなわち、本発明は、一態様において、
＜１＞多孔質構造を有するハイドロゲルの製造方法であって、
ａ）化合物Ａを、アルカリ金属塩を０～１０００ｍＭの濃度で含有する水系溶媒に溶解させた第１の溶液を調製する工程；
ｂ）前記化合物Ａと化学架橋可能な化合物Ｂを、アルカリ金属塩を０～１０００ｍＭの濃度で含有する水系溶媒に溶解させた第２の溶液を調製する工程；
ｃ）前記第1の溶液と前記第２の溶液を混合して、１種類以上のアルカリ金属塩を３００ｍＭ～１０００ｍＭの濃度で含有するゲル化液を得る工程；
及び
ｄ）前記ゲル化液中の前記化合物Ａと化合物Ｂが、外部刺激によらず化学架橋を形成することで、多孔質構造を有するハイドロゲルを得る工程
を含み、かつ
　前記化合物ＡとＢのうちいずれか一方が、側鎖又は末端に合計２以上の求核性官能基又は求電子性官能基を有する、直鎖、３分岐、４分岐または８分岐のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であること
を特徴とする、該製造方法；
＜２＞前記ゲル化液の調製時から、ゲル化液が固体になるまでの時間が１秒以上であることを特徴とする、上記＜１＞に記載の製造方法；
＜３＞前記アルカリ金属塩が、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム及びこれらの任意の組合せよりなる群から選択される、上記＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法；
＜４＞前記ハイドロゲルが、４０５ｎｍの波長における透過率の最大値が８０％以下である、上記＜１＞～＜３＞のいずれか１に記載の製造方法；
＜５＞前記ハイドロゲルが、前記ポリエチレングリコールを２０ｇ／Ｌ～２５０ｇ／Ｌの範囲で含有する、上記＜１＞～＜４＞のいずれか１に記載の製造方法；
＜６＞前記第1の溶液と前記第２の溶液との混合溶液において、前記アルカリ金属塩が２００ｍＭの条件で形成されたハイドロゲルの平衡膨潤度をＱｌｏｗとし、任意濃度の前記アルカリ金属塩存在下で形成された前記ハイドロゲルの平衡膨潤度をＱとしたときに、Ｑが、
　　　　　Ｑ≧ １．１＊ Ｑｌｏｗ
の関係式を満たす、上記＜１＞～＜５＞のいずれか１に記載の製造方法；
＜７＞前記第1の溶液と前記第２の溶液との混合溶液において、前記アルカリ金属塩が２００ｍＭの条件で形成されたハイドロゲルの伸長時破断応力をσｌｏｗとし、任意濃度のアルカリ金属塩存在下で形成された前記ハイドロゲルの伸長時破断応力をσとしたときに、σが、
　　　σ≧ １．５＊ σｌｏｗ
の関係式を満たす、上記＜１＞～＜６＞のいずれか１に記載の製造方法；
＜８＞前記化合物ＡとＢのうち、一方がＰＥＧであって；他方がＰＥＧ、ペプチド、タンパク質、キトサン、ヒアルロン酸、及びそれらの誘導体よりなる群から選択される１種以上からなる、上記＜１＞～＜７＞のいずれか１に記載の製造方法；及び
＜９＞前記工程ｄ）における前記外部刺激が、光照射である、上記＜１＞～＜８＞のいずれかに記載の製造方法
を提供するものである。
　別の態様において、本発明は、上記ハイドロゲルの製造方法にも関し、
＜１０＞多孔質構造を有するハイドロゲルを作成するためのキットであって、
　化合物Ａを、アルカリ金属塩を０～１０００ｍＭの濃度で含有する水系溶媒に溶解させた第１の溶液；及び
　前記化合物Ａと化学架橋可能な化合物Ｂを、アルカリ金属塩を０～１０００ ｍＭの濃度で含有する水系溶媒に溶解させた第２の溶液
を含み、
　記第１の溶液と前記第２の溶液の混合した際のアルカリ金属塩の濃度が、合計で３００ｍＭ～１０００ｍＭの範囲であり、
　前記化合物ＡとＢのうちいずれか一方が、側鎖又は末端に合計２以上の求核性官能基又は求電子性官能基を有する、直鎖、３分岐、４分岐または８分岐のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、該キット。
を提供するものである。
　本発明の製造方法によれば、高分子溶液中のアルカリ金属濃度を調整することにより、当該溶液を混合するだけで、μｍスケールの多孔質構造を有するハイドロゲルを簡便かつ効率的に得ることができる。
　本発明の製造方法により得られるハイドロゲルは、スポンジ様のμｍスケールの３次元網目構造（多孔質構造）を形成するため、細胞の浸潤や接着に好適な材料となり得る。
図１は、アルカリ金属塩濃度２００ｍＭ、ＰＥＧ濃度１００ｇ／Ｌの条件におけるゲル化の様子を示す画像である。 図２は、アルカリ金属塩濃度４００ｍＭ、PEG濃度１００ｇ／Ｌの条件におけるゲル化の様子を示す画像である。 図３は、異なる合計アルカリ金属塩濃度において作製されたハイドロゲル（ＰＥＧ濃度：２０、５０、８０、１００ｇ／Ｌ）の画像である。 図４は、異なる合計アルカリ金属塩濃度で作製されたハイドロゲル（ＰＥＧ濃度：２０、５０、８０、１００ｇ／Ｌ）における４０５ ｎｍの透過率を示すグラフである。 図５は、作製直後のハイドロゲルの様子（上段、スケールバー10 mm）とその共焦点顕微鏡像（下段、スケールバー20 μm）を示す画像である。 図６は、水中における平衡状態のハイドロゲルの様子（上段、スケールバー10 mm）とその共焦点顕微鏡像（下段、スケールバー20 μm）を示す画像である。 図７は、各合計アルカリ金属塩濃度で調製されたハイドロゲルの平衡膨潤度を示すグラフである。 図８は、各合計アルカリ金属塩濃度で調製されたハイドロゲルの伸長時破断応力を示すグラフである。
　以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
（１）ハイドロゲルの製造方法
　本発明の製造方法は、多孔質構造を有するハイドロゲルの製造方法であって、以下の工程ａ）～ｄ）を含むことを特徴とする：
ａ）化合物Ａを、アルカリ金属塩を０～１０００ｍＭの濃度で含有する水系溶媒に溶解させた第１の溶液を調製する工程；
ｂ）前記化合物Ａと化学架橋可能な化合物Ｂを、アルカリ金属塩を０～１０００ｍＭの濃度で含有する水系溶媒に溶解させた第２の溶液を調製する工程；
ｃ）前記第1の溶液と前記第２の溶液を混合して、１種類以上のアルカリ金属塩を３００ｍＭ～１０００ｍＭの濃度で含有するゲル化液を得る工程；
及び
ｄ）前記ゲル化液中の前記化合物Ａと化合物Ｂが、外部刺激によらず化学架橋を形成することで、多孔質構造を有するハイドロゲルを得る工程。
　加えて、前記化合物ＡとＢのうちいずれか一方が、側鎖又は末端に合計２以上の求核性官能基又は求電子性官能基を有する、直鎖（すなわち、２分岐）、３分岐、４分岐または８分岐のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
　本発明の製造方法により得られるハイドロゲルは、構成成分である高分子が製造過程において自発的に相分離することで形成されるスポンジ様の３次元網目構造（多孔質構造）を有する（以下、かかる構造を「スポンジ様の多孔質構造」と呼ぶ場合がある。）。その網目サイズは、従来のハイドロゲルで得られるｎｍオーダーより遥かに大きいμｍオーダーであることも特徴である。このハイドロゲルにおいては、多孔質構造を成す空隙には、高分子ユニットは観察されない。すなわち、ハイドロゲル全体として、高分子の密度が大きく異なる2つ以上の領域を有さない。また、空隙に高分子ユニットがないことで、外力によってハイドロゲルが圧縮されると、いわゆる通常のスポンジのように水を吐き出すことができる。また、本発明における製造工程では、用いる高分子ユニットの一部または全てがある一定の時間を境に自発的に親溶媒性ではなくなる。その時点からは非親溶媒性の高分子ユニットが架橋されていくことになり、結果的に非親溶媒性の高分子を構成成分とする相分離構造が得られる。
　本明細書中において、「ゲル」とは、一般に、高粘度で流動性を失った高分子の分散系であり、貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ”においてＧ’≧Ｇ”の関係性を有する状態をいう。特に、ゲルが含む溶媒が水系溶媒である場合に、当該ゲルを「ハイドロゲル」と呼ぶ。
　以下では、本発明のハイドロゲルを構成する化合物Ａ及びＢ、及び各種工程における諸条件について説明する。
１－ａ．化合物Ａ及びＢ（ゲル構成成分）
　本発明のハイドロゲルを形成するための成分である化合物Ａ及びＢとしては、典型的には、親溶媒性の高分子種でありすなわち、ゲルがハイドロゲルである場合には、当該化合物Ａ及びＢは、親水性の高分子種を用いることができる。当該高分子種は、外部刺激によらず溶液中でのゲル化反応（架橋反応等）によってハイドロゲルを形成し得るものであれば、当該技術分野において公知のものを最終的なハイドロゲルの用途や形状等に応じて用いることができる。より詳細には、最終的なハイドロゲルにおいて、高分子種が互いに架橋にすることにより網目構造、特に、３次元網目構造を形成し得る高分子ユニットが好ましい。
　化合物Ａ及びＢとして用いられる親水性高分子としては、好ましくは、ポリエチレングリコール骨格又はポリビニル骨格を有する高分子であることができる。ポリエチレングリコール骨格を有する高分子としては、代表的には、２分岐、３分岐、４分岐または８分岐などの複数のポリエチレングリコール骨格の分岐を有する高分子種が挙げられ、特に、４つのポリエチレングリコール骨格の分岐を有する高分子種が好ましい。かかる４分岐型のポリエチレングリコール骨格よりなるゲルは、一般に、Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧゲルとして知られており、それぞれ末端に活性エステル構造等の求電子性の官能基とアミノ基等の求核性の官能基を有する２種の四分岐高分子間のＡＢ型クロスエンドカップリング反応によって網目構造ネットワークが構築される（Ｍａｔｓｕｎａｇａら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｖｏｌ.４２、Ｎｏ.４、ｐｐ.１３４４－１３５１、２００９）。また、Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧゲルは各高分子溶液の単純な二液混合で簡便にその場で作製可能である。Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧ技術を用いれば、ハイドロゲル調製時のｐＨやイオン強度を調節することでゲル化時間を制御することも可能である。得られるハイドロゲルはＰＥＧを主成分としているため、生体適合性にも優れている。
　互いに架橋してゲル化し得るものであればポリエチレングリコール骨格以外の高分子も用いることができ、例えば、メチルメタクリレートなどのポリビニル骨格を有する高分子も用いることができる。
　本発明の製造方法では、前記化合物ＡとＢのうちいずれか一方が、側鎖又は末端に合計２以上の求核性官能基又は求電子性官能基を有する、直鎖、３分岐、４分岐または８分岐のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
　好ましい態様では、前記化合物ＡとＢのうち、一方がＰＥＧであって；他方がＰＥＧ、ペプチド、タンパク質、多糖類よりなる群から選択される１種以上からなることができる。タンパク質としては、例えば、ゼラチン、アルブミンなどを挙げることができる。多糖類としては、例えば、キトサン、ヒアルロン酸、それらの誘導体などを挙げることができる。
　前記化合物ＡとＢのうち、ＰＥＧ以外の分子の分子量は特に限定されない。一方、ＰＥＧの分子量としては、２×１０３～１００×１０３Ｄａが挙げられ、５×１０３～４０×１０３Ｄａが好ましく、１０×１０３～２０×１０３Ｄａがより好ましい。ＰＥＧは分子量が大きいほど相分離しやすい傾向にあるため、分子量が大き過ぎる場合には、架橋反応前の溶液状態で相分離が生じる可能性があり好ましくない。本発明では、化合物ＡとＢの分子量を所定の範囲内としつつ、後述のアルカリ金属塩の濃度を所定の範囲とすることによって、多孔質構造を有するハイドロゲルを得ることができる。
　典型的な態様においては、化合物ＡとＢがいずれもＰＥＧであることができる。この場合、前記化合物Ａが、側鎖又は末端に合計２以上の求核性官能基を有する第１の高分子ユニットであり、前記化合物Ｂが、側鎖又は末端に合計２以上の求電子性官能基を有する第２の高分子ユニットであることができ、これら２種類の高分子種を反応させて架橋させる手段が好適である。ここで、求核性官能基と求電子性官能基の合計は、５以上であることが好ましい。これらの官能基は、末端に存在することが好ましい。また、第１の高分子ユニットの含有量が第２の高分子ユニットの含有量より多い組成であることもできるし、又は第２の高分子ユニットの含有量が第１の高分子ユニットの含有量より多い組成であることもできる。
　高分子ユニットに存在する求核性官能基としては、チオール基（－ＳＨ）（スルフヒドリル基とも呼ぶ）、アミノ基などを挙げることができ、当業者であれば公知の求核性官能基を適宜用いることができる。好ましくは、求核性官能基はチオール基またはアミノ基である。求核性官能基は、それぞれ同一であっても、異なってもよいが、同一である方が好ましい。官能基が同一であることによって、架橋結合を形成することとなる求電子性官能基との反応性が均一になり、均一な立体構造を有するハイドロゲルを得やすくなる。
　高分子ユニットに存在する求電子性官能基としては、マレイミジル基、活性エステル基を用いることができる。活性エステル基としては、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミジル（ＮＨＳ）基やスルホスクシンイミジル基などを挙げることができる。当業者であればその他の公知の求電子性官能基を適宜用いることができる。好ましくは、求電子性官能基はマレイミジル基である。求電子性官能基は、それぞれ同一であっても、異なってもよいが、同一である方が好ましい。官能基が同一であることによって、架橋結合を形成することとなる求核性官能基との反応性が均一になり、均一な立体構造を有するハイドロゲルを得やすくなる。
　前記の求核性官能基と求電子性官能基の組み合わせ以外にも、アジドとアルキンによる環化付加反応や、クリックケミストリーと呼ばれるその他の反応など、当業者にとって公知の共有結合形成反応を適宜用いることもできる。
　末端に求核性官能基を有する高分子ユニットとして好ましい非限定的な具体例には、例えば、４つのポリエチレングリコール骨格の分岐を有し、末端にチオール基を有する下記式（Ｉ）で表される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　ｎ１１～ｎ１４は、それぞれ同一でも又は異なってもよい。ｎ１１～ｎ１４の値が近いほど、均一な立体構造をとることができ、高強度となる。このため、高強度のハイドロゲルを得るためには、同一であることが好ましい。ｎ１１～ｎ１４の値が高すぎるとゲルの強度が弱くなり、ｎ１１～ｎ１４の値が低すぎると化合物の立体障害によりゲルが形成されにくい。そのため、ｎ１１～ｎ１４は、１１～５６９の整数値が挙げられ、２８～２２８が好ましく、５６～１１４がさらに好ましい。そして、その分子量としては、２×１０３～１００×１０３
Ｄａが挙げられ、５×１０３～４０×１０３Ｄａが好ましく、１０×１０３～２０×１０３Ｄａがより好ましい。
　上記式（Ｉ）中、Ｒ１１～Ｒ１４は、官能基とコア部分をつなぐリンカー部位である。Ｒ１１～Ｒ１４は、それぞれ同一でも異なってもよいが、均一な立体構造を有する高強度なハイドロゲルを製造するためには同一であることが好ましい。Ｒ１１～Ｒ１４は、Ｃ１－Ｃ７アルキレン基、Ｃ２－Ｃ７アルケニレン基、－ＮＨ－Ｒ１５－、－ＣＯ－Ｒ１５－、－Ｒ１６－Ｏ－Ｒ１７－、－Ｒ１６－ＮＨ－Ｒ１７－、－Ｒ１６－ＣＯ２－Ｒ１７－、－Ｒ１６－ＣＯ２－ＮＨ－Ｒ１７－、－Ｒ１６－ＣＯ－Ｒ１７－、Ｒ１６－ＮＨ－ＣＯ－Ｒ１７－又は－Ｒ１６－ＣＯ－ＮＨ－Ｒ１７－を示す。ここで、Ｒ１５はＣ１－Ｃ７アルキレン基を示す。Ｒ１６はＣ１－Ｃ３アルキレン基を示す。Ｒ１７はＣ１－Ｃ５アルキレン基を示す。
　ここで、「Ｃ１－Ｃ７アルキレン基」とは、分岐を有してもよい炭素数が１以上７以下のアルキレン基を意味し、直鎖Ｃ１－Ｃ７アルキレン基又は１つ又は２つ以上の分岐を有するＣ２－Ｃ７アルキレン基（分岐を含めた炭素数が２以上７以下）を意味する。Ｃ１－Ｃ７アルキレン基の例は、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基である。Ｃ１－Ｃ７アルキレン基の例は、－ＣＨ2－、－(ＣＨ2)2－、－(ＣＨ2)3－、－ＣＨ(ＣＨ3)－、－(ＣＨ2)3－、－(ＣＨ(ＣＨ3))2－、－(ＣＨ2)2－ＣＨ(ＣＨ3)－、－(ＣＨ2)3－ＣＨ(ＣＨ3)－、－(ＣＨ2)2－ＣＨ(Ｃ2Ｈ5)－、－(ＣＨ2)6－、－(ＣＨ２)2－Ｃ(Ｃ2Ｈ5)2－、及び－(ＣＨ2)3Ｃ(ＣＨ3)2ＣＨ2－などが挙げられる。
　「Ｃ２－Ｃ７アルケニレン基」とは、鎖中に１個若しくは２個以上の二重結合を有する状又は分枝鎖状の炭素原子数２～７個のアルケニレン基であり、例えば、前記アルキレン基から隣り合った炭素原子の水素原子の２～５個を除いてできる二重結合を有する２価基が挙げられる。
　一方、末端に求電子性官能基を有する高分子ユニットとして好ましい非限定的な具体例には、例えば、４つのポリエチレングリコール骨格の分岐を有し、末端にマレイミジル基を有する下記式（ＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　上記式（ＩＩ）中、ｎ２１～ｎ２４は、それぞれ同一でも又は異なってもよい。ｎ２１～ｎ２４の値は近いほど、ハイドロゲルは均一な立体構造をとることができ、高強度となるので好ましく、同一である方が好ましい。ｎ２１～ｎ２４の値が高すぎるとゲルの強度が弱くなり、ｎ２１～ｎ２４の値が低すぎると化合物の立体障害によりゲルが形成されにくい。そのため、ｎ２１～ｎ２４は、１１～５６９の整数値が挙げられ、２８～２２８が好ましく、５６～１１４がより好ましい。本発明の第２の四分岐化合物の分子量としては、２×１０３～１００×１０３Ｄａがあげられ、５×１０３～４０×１０３Ｄａが好ましく、１０×１０３～２０×１０３Ｄａがより好ましい。
　上記式（ＩＩ）中、Ｒ２１～Ｒ２４は、官能基とコア部分をつなぐリンカー部位である。Ｒ２１～Ｒ２４は、それぞれ同一でも異なってもよいが、均一な立体構造を有する高強度なゲルを製造するためには同一であることが好ましい。式（ＩＩ）中、Ｒ２１～Ｒ２４は、それぞれ同一又は異なり、Ｃ１－Ｃ７アルキレン基、Ｃ２－Ｃ７アルケニレン基、－ＮＨ－Ｒ２５－、－ＣＯ－Ｒ２５－、－Ｒ２６－Ｏ－Ｒ２７－、－Ｒ２６－ＮＨ－Ｒ２７－、－Ｒ２６－ＣＯ２－Ｒ２７－、－Ｒ２６－ＣＯ２－ＮＨ－Ｒ２７－、－Ｒ２６－ＣＯ－Ｒ２７－、－Ｒ２６－ＮＨ－ＣＯ－Ｒ２７－、又は－Ｒ２６－ＣＯ－ＮＨ－Ｒ２７－を示す。ここで、Ｒ２５はＣ１－Ｃ７アルキレン基を示す。Ｒ２６はＣ１－Ｃ３アルキレン基を示す。Ｒ２７はＣ１－Ｃ５アルキレン基を示す。
　本明細書において、アルキレン基及びアルケニレン基は任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれであってもよい）、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、アシル基、又はアリール基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルキルオキシ基やアラルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
　また、本明細書において、ある官能基について「置換基を有していてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。
１－ｂ．各工程における諸条件
　第１及び第２の溶液において用いられるアルカリ金属塩は、好ましくは、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム及びこれらの任意の組合せよりなる群から選択されることができる。第１及び第２の溶液の少なくとも一方は、当該アルカリ金属塩を含む。
　第１の溶液および第２の溶液のアルカリ金属塩濃度は、高すぎると意図しない相分離が生じてしまい好ましくない。第１の溶液におけるアルカリ金属塩の濃度は、０～１０００ ｍＭの濃度、好ましくは０～５００ｍＭ、より好ましくは０～４５０ｍＭの範囲である。同様に、第２の溶液におけるアルカリ金属塩の濃度は、０～１０００ ｍＭの濃度、好ましくは０～５００ｍＭ、より好ましくは０～４５０ｍＭの範囲である。典型的には、第１の溶液および第２の溶液のいずれか一方又は両方におけるアルカリ金属塩濃度の下限値は、０．０１ｍＭであることができる。
　第１の溶液と第２の溶液を混合したゲル化液（ゲル化前の混合溶液）におけるアルカリ金属塩の濃度は、３００～１０００ ｍＭの濃度、好ましくは３５０～５００ｍＭ、より好ましくは４００～４５０ｍＭの範囲である。アルカリ金属塩の濃度が当該範囲より低い場合には、架橋した高分子ユニットを相分離させることが出来ず、多孔質構造が形成されない。一方、アルカリ金属塩の濃度が濃すぎる場合には、高分子ユニットが架橋する前に溶液状態で相分離が生じてしまい好ましくない。
　工程ｃ）の混合時において、各溶液の温度が高すぎると架橋反応の開始前に意図しない相分離が生じてしまい、また、低すぎると各溶液の流動性が悪くなり扱いづらくなる場合がある。そのため、温度は好ましくは１０～４０℃、より好ましくは２５～３５℃、更に好ましくは２５℃に管理することが望ましい。例えば、各液温と同じ温度に設定された恒温気槽において第１及び第２の溶液を混合することができる。なお、化合物ＡとＢの架橋反応が開始した後は、ある程度溶液温度が変化しても構わない場合がある。例えば、第１及び第２の溶液を生体内などのｉｎ ｖｉｖｏ環境に直接注入し、その場で多孔質ハイドロゲルを形成することもできる。
　工程ｄ）における「外部刺激によらず」という語は、外部からの光刺激や熱刺激を印加することなく、第１の溶液と第２の溶液とを混合するだけで、ゲル化が進行することを意味する。好ましくは、外部刺激は、光刺激である。
　工程ｃ）及びｄ）において、前記ゲル化液の調製時から、ゲル化液が固体になるまでの時間が１秒以上であることが好ましい。これにより、第１の溶液と第２の溶液が混合されるための時間を確保することができる。これよりも速い場合には混合がうまくいかず、ハイドロゲルが不均一に形成されやすくなるため好ましくない。別の観点からは、ゲル化液が固体になるまでの時間は５秒以上であることが好ましい。その場合にはゲル化液を液体として鋳型に流し込んだり、注射筒に充填後にｉｎ ｖｉｖｏ環境に直接注入したりして、多孔質ハイドロゲルを望みの場所で望みの形に成型することができる。
１－ｂ．ハイドロゲルの物性等
　本発明の製造方法により得られるハイドロゲルは、上述のように、μｍオーダーの多孔質構造を有することを特徴とする。その孔径は、合計アルカリ金属塩濃度等の条件によって変化するが、一例として１～５００μｍの大きさであることができ、ハイドロゲルの機械的特性の観点からは、好ましくは、１～１００μｍである。当該孔やその大きさは、様々な方法で観察できるが、一例としては、ハイドロゲルを構成する高分子に蛍光色素を結合させた後に、共焦点顕微鏡像を取得することで測定することができる。本発明のハイドロゲルにおいては、多孔質構造を成す空隙には、高分子ユニットは実質的に観察されない。すなわち、ハイドロゲル全体として、高分子の密度が大きく異なる２つ以上の領域を有さない。また、空隙に高分子ユニットが実質的に存在しないことで、外力によってハイドロゲルが圧縮されると、いわゆる通常のスポンジのように水を吐き出すことができる。
　また、本発明のハイドロゲルにおける高分子含有量は、特に限定されないが、好ましい態様では、ポリエチレングリコールを２０ｇ／Ｌ～２５０ｇ／Ｌの範囲で含有する。
　本発明のハイドロゲルは、ゲル化前の高分子ユニットの透過率よりも低い透過率を有する。これは、本発明のハイドロゲルでは、構成成分である高分子が製造過程において自発的に相分離する。これによって、あたかも貧溶媒性の高分子が溶媒中で相分離した状態のようにふるまい、完全に透明ではなく白濁を呈することによる。好ましくは、本発明のハイドロゲルは、４０５ｎｍの波長範囲における透過率の最大値が８０％以下の透過率を有する。かかる透過率の点において、ほぼ透明である通常のハイドロゲルとは全く異なる特性を示す。
　好ましくは、前記第1の溶液と前記第２の溶液との混合溶液において、前記アルカリ金属塩が２００ ｍＭの条件で形成された前記ハイドロゲルの平衡膨潤度をＱｌｏｗとし、任意濃度の前記アルカリ金属塩存在下で形成された前記ハイドロゲルの平衡膨潤度をＱとしたときに、Ｑが、
　　　　　Ｑ≧ １．１＊ Ｑｌｏｗ
の関係式を満たす。
　また、本発明のハイドロゲルは、伸長時破断応力の点でも特徴を有する。具体的には、前記第1の溶液と前記第２の溶液との混合溶液において、前記アルカリ金属塩が２００ ｍＭの条件で形成された前記ハイドロゲルの伸長時破断応力をσｌｏｗとし、任意濃度のアルカリ金属塩存在下で形成された前記ハイドロゲルの伸長時破断応力をσとしたときに、σが、
　　　σ≧ １．５＊ σｌｏｗ
の関係式を満たす。
　本発明のハイドロゲルは、その用途に応じて、薄膜等の種々の形状に加工することができる。そのような加工は、当該技術分野において知られている任意の手法を用いることができる。例えば、薄膜の場合には、例えば、ゲル化液が完全に固化する前の流動性を有する状態で、ガラス等の平面基板上に塗布する等の手法により薄膜を得ることができる。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。なお、以下の実施例において、高分子濃度のｇ／Ｌの単位を用いているが、１ｇ／Ｌ＝０．１重量％に相当する。
１．共通の材料の調製
　各実験の高分子溶液の緩衝液としては、リン酸緩衝液（PB）を用いた。PBには、アルカリ金属塩であるリン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムが含まれる。PBは一般に報告されている方法で調製できるが、ここでは、Kurakazuらの報告（Macromolecules 2010, 43, 8, 3935-3940）に従い、pH 7.4となるように調製した。このとき、溶質のモル濃度（アルカリ金属塩濃度）を0～1000 mMの範囲で変えることで、緩衝液の緩衝能を調整した。
２．四分岐のポリエチレングリコール（PEG）を用いたハイドロゲルの調製
　原料高分子として、末端に－ＳＨ基を有するTetra-PEG-SH（テトラスルフヒドリル－ポリエチレングリコール；日油株式会社、商品名PTE-100SH）及び末端にスクシンイミジル基を有するTetra-PEG-OSu（テトラスクシンイミジル－ポリエチレングリコール；日油株式会社、商品名PTE-100HS）を用いた。重量平均分子量（Ｍｗ）は、どちらも１００００である。
第1の溶液の調製
　Tetra-PEG-SHを、リン酸緩衝液（PB）に溶解させた。このとき、PBのアルカリ金属塩濃度は0～1000 mMのいずれかの濃度とした。PEG濃度は20～250 g/Lのいずれかの濃度とした。
第2の溶液の調製
　Tetra-PEG-OSuを、PBに溶解させた。このとき、PBのアルカリ金属塩濃度は0～1000 mMのいずれかの濃度とした。PEG濃度は20～250 g/Lのいずれかの濃度とした。
＜比較例１＞
　前記第1の溶液（アルカリ金属塩濃度200 mM、PEG濃度100 g/L）と前記第2の溶液（アルカリ金属塩濃度200 mM、PEG濃度100 g/L）を、空の遠心チューブの中で、同じ体積比率で混合した。この混合液を、PEGを100 g/Lの濃度で含み、アルカリ金属塩を200 mMの濃度で含むゲル化液とした。1 mLのゲル化液を27Gの注射針（内径0.22±0.03）が接続された2.5 mL注射筒にとり、ガラスバイアルの中に吐出した。ゲル化液調製完了から吐出完了までの少なくとも5秒間はゲル化液が液体であることを目視で確認した。その後、ガラスバイアルに入ったゲル化液を、特別な外部刺激を与えずに10分間静置した。ガラスバイアルを傾けたところ、ゲル化液は流動性を失っており、透明の固体となっていた（図１）。得られた透明のハイドロゲルは指で圧縮しても水を吐き出すことはなかった。これは（酒井ら、Macromolecules 2008, 41, 14, 5379-5384）に報告されている既報のPEGハイドロゲル作製プロセスであり、透明なハイドロゲルが得られることは予想された結果である。
＜比較例２＞
　前記第1の溶液（アルカリ金属塩濃度200 mM、PEG濃度250 g/L）と前記第2の溶液（アルカリ金属塩濃度200 mM、PEG濃度250 g/L）を、空の遠心チューブの中で、同じ体積比率で混合した。この混合液を、PEGを250 g/Lの濃度で含み、アルカリ金属塩を200 mMの濃度で含むゲル化液とした。1 mLのゲル化液を27Gの注射針（内径0.22±0.03）が接続された2.5 mL注射筒にとり、ガラスバイアルの中に吐出した。ゲル化液調製完了から吐出完了までの少なくとも5秒間はゲル化液が液体であることを目視で確認した。その後、ガラスバイアルに入ったゲル化液を、特別な外部刺激を与えずに24時間静置した。ガラスバイアルを傾けたところ、ゲル化液は流動性を失っており、透明の固体となっていた。得られた透明のハイドロゲルは指で圧縮しても水を吐き出すことはなかった。比較例１に比して単純にPEG濃度が高くなったとしても、多孔質構造は得られないことが示された。
＜実施例１＞
　前記第1の溶液（アルカリ金属塩濃度400 mM、PEG濃度100 g/L）と前記第2の溶液（アルカリ金属塩濃度400 mM、PEG濃度100 g/L）を、空の遠心チューブの中で、同じ体積比率で混合した。この混合液を、PEGを100 g/Lの濃度で含み、アルカリ金属塩を400 mMの濃度で含むゲル化液とした。1 mLのゲル化液を、27Gの注射針（内径0.22±0.03）が接続された2.5 mL注射筒にとり、ガラスバイアルの中に吐出した。ゲル化液調製完了から吐出完了までの少なくとも5秒間はゲル化液が液体であることを目視で確認した。その後、ガラスバイアルに入ったゲル化液を、特別な外部刺激を与えずに10分間静置した。ガラスバイアルを傾けたところ、ゲル化液は流動性を失っており、白色の固体となっていた（図２）。得られたハイドロゲルを指で圧縮したところ、水を吐き出す様子が観察された。このことは、このハイドロゲルが通常のスポンジに見られる多孔質構造を有していることを直接的に示している。この結果は、これまでに報告されているゲル作製プロセスよりも高い濃度でアルカリ金属塩が存在していることによって、ハイドロゲル中のPEGが相分離したことに起因するものである。
＜実施例２＞
　前記第1の溶液（アルカリ金属塩濃度1000 mM、PEG濃度100 g/L）と前記第2の溶液（アルカリ金属塩濃度0 mM、PEG濃度100 g/L）を、空の遠心チューブの中で、同じ体積比率で混合した。この混合液を、PEGを100 g/Lの濃度で含み、アルカリ金属塩を500 mMの濃度で含むゲル化液とした。1 mLのゲル化液を、27Gの注射針（内径0.22±0.03）が接続された2.5 mL注射筒にとり、ガラスバイアルの中に吐出した。ゲル化液調製完了から吐出完了までの少なくとも5秒間はゲル化液が液体であることを目視で確認した。その後、ガラスバイアルに入ったゲル化液を、特別な外部刺激を与えずに24時間静置した。ガラスバイアルを傾けたところ、ゲル化液は流動性を失っており、白色の固体となっていた。得られたハイドロゲルを指で圧縮したところ、水を吐き出す様子が観察された。
　同様に、前記第1の溶液（アルカリ金属塩濃度0 mM、PEG濃度100 g/L）と前記第2の溶液（アルカリ金属塩濃度1000 mM、PEG濃度100 g/L）を、空の遠心チューブの中で、同じ体積比率で混合した。この混合液を、PEGを100 g/Lの濃度で含み、アルカリ金属塩を500 mMの濃度で含むゲル化液とした。1 mLのゲル化液を、27Gの注射針（内径0.22±0.03）が接続された2.5 mL注射筒にとり、ガラスバイアルの中に吐出した。ゲル化液調製完了から吐出完了までの少なくとも5秒間はゲル化液が液体であることを目視で確認した。その後、ガラスバイアルに入ったゲル化液を、特別な外部刺激を与えずに24時間静置した。ガラスバイアルを傾けたところ、ゲル化液は流動性を失っており、白色の固体となっていた。得られたハイドロゲルを指で圧縮したところ、水を吐き出す様子が観察された。
　これらの結果は、アルカリ金属塩は、第1の溶液または第2の溶液の両方に含有することが必須ではなく、最終的なゲル化液（混合）に存在していれば十分であることを示唆している。
＜実施例３＞
　前記第1の溶液（アルカリ金属塩濃度1000 mM、PEG濃度100 g/L）と前記第2の溶液（アルカリ金属塩濃度1000 mM、PEG濃度100 g/L）を、空の遠心チューブの中で、同じ体積比率で混合した。この混合液を、PEGを100 g/Lの濃度で含み、アルカリ金属塩を1000 mMの濃度で含むゲル化液とした。1 mLのゲル化液を、27Gの注射針（内径0.22±0.03）が接続された2.5 mL注射筒にとり、ガラスバイアルの中に吐出した。ゲル化液調製完了から吐出完了までの少なくとも5秒間はゲル化液が液体であることを目視で確認した。その後、ガラスバイアルに入ったゲル化液を、特別な外部刺激を与えずに24時間静置した。ガラスバイアルを傾けたところ、ゲル化液は流動性を失っており、白色の固体となっていた。得られたハイドロゲルを指で圧縮したところ、水を吐き出す様子が観察された。このように比較的高いアルカリ金属塩濃度でも多孔質構造が形成されることが確認された。
＜実施例４＞
　前記第1の溶液（アルカリ金属塩濃度600 mM、PEG濃度20 g/L）と前記第2の溶液（アルカリ金属塩濃度600 mM、PEG濃度20 g/L）を、空の遠心チューブの中で、同じ体積比率で混合した。この混合液を、PEGを20 g/Lの濃度で含み、アルカリ金属塩を600 mMの濃度で含むゲル化液とした。1 mLのゲル化液を、27Gの注射針（内径0.22±0.03）が接続された2.5 mL注射筒にとり、ガラスバイアルの中に吐出した。ゲル化液調製完了から吐出完了までの少なくとも5秒間はゲル化液が液体であることを目視で確認した。その後、ガラスバイアルに入ったゲル化液を、特別な外部刺激を与えずに24時間静置した。ガラスバイアルを傾けたところ、ゲル化液は流動性を失っており、白色の固体となっていた。得られたハイドロゲルを指で圧縮したところ、水を吐き出す様子が観察された。比較的低いPEG濃度（例えば20 g/L）においても、多孔質化が可能であることが確認できた。
＜実施例５＞
　実施例５では、リン酸緩衝液（PB）に含まれるリン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムとは異なるアルカリ金属塩である硫酸カリウム（K2SO4）を、予め追加でPBに添加した。具体的には、アルカリ金属塩濃度が10mMとなるように調製されたPBに対し、K2SO4濃度が500 mMになるように、K2SO4を固体として添加し、溶解させた。このとき、PBが10 mMおよびK2SO4が500 mMの合計アルカリ金属塩濃度510 mMとなった。得られたK2SO4を含む液体をPBとして用い、そこにPEGを100 g/Lの濃度で溶解させ、第1の溶液と第2の溶液を作製した。このようにして調製した第1の溶液（合計アルカリ金属塩濃度510mM、PEG濃度100 g/L）と前記第2の溶液（合計アルカリ金属塩濃度510mM、PEG濃度100 g/L）を、空の遠心チューブの中で、同じ体積比率で混合した。この混合液を、PEGを100 g/Lの濃度で含み、アルカリ金属塩を510mMの濃度で含むゲル化液とした。1 mLのゲル化液を、27Gの注射針（内径0.22±0.03）が接続された2.5 mL注射筒にとり、ガラスバイアルの中に吐出した。ゲル化液調製完了から吐出完了までの少なくとも5秒間はゲル化液が液体であることを目視で確認した。その後、ガラスバイアルに入ったゲル化液を、特別な外部刺激を与えずに24時間静置した。ガラスバイアルを傾けたところ、ゲル化液は流動性を失っており、白色の固体となっていた。得られたハイドロゲルを指で圧縮したところ、水を吐き出す様子が観察された。この結果は、多孔質構造の形成がアルカリ金属塩の種類に依存しないことを示唆している。
＜実施例６＞
　実施例６では、PBに含まれるリン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムとは別のアルカリ金属塩である硫酸カリウム（K2SO4）を、予め追加でPBに添加した。具体的には、アルカリ金属塩濃度が200mMとなるように調製されたPBに対し、K2SO4濃度が100mMになるように、K2SO4を固体として添加し、溶解させた。このとき、PBが200 mMおよびK2SO4が100 mMの合計アルカリ金属塩濃度300 mMとなった。得られたK2SO4を含む液体をPBとして用い、そこにPEGを250 g/Lの濃度で溶解させ、第1の溶液と第2の溶液を作製した。このようにして調製した第1の溶液（合計アルカリ金属塩濃度300 mM、PEG濃度250 g/L）と前記第2の溶液（合計アルカリ金属塩濃度300 mM、PEG濃度250 g/L）を、空の遠心チューブの中で、同じ体積比率で混合した。この混合液を、PEGを250 g/Lの濃度で含み、アルカリ金属塩を300 mMの濃度で含むゲル化液とした。1 mLのゲル化液を、27Gの注射針（内径0.22±0.03）が接続された2.5 mL注射筒にとり、ガラスバイアルの中に吐出した。ゲル化液調製完了から吐出完了までの少なくとも5秒間はゲル化液が液体であることを目視で確認した。その後、ガラスバイアルに入ったゲル化液を、特別な外部刺激を与えずに24時間静置した。ガラスバイアルを傾けたところ、ゲル化液は流動性を失っており、白色の固体となっていた。得られたハイドロゲルを指で圧縮したところ、水を吐き出す様子が観察された。この結果は、高いPEG濃度（例えば250 g/L）であれば、合計アルカリ金属塩濃度が300 mMでも多孔質構造を誘導できることを示している。
３．二分岐のPEGと四分岐のPEGを用いたハイドロゲルの調製
　原料高分子として、末端に－ＳＨ基を有するLinear-PEG-SH（リニアスルフヒドリル－ポリエチレングリコール；日油株式会社、商品名DE-100SH）及び末端にスクシンイミジル基を有するTetra-PEG-OSu（テトラスクシンイミジル－ポリエチレングリコール；日油株式会社、商品名PTE-100HS）を用いた。重量平均分子量（Ｍｗ）は、どちらも１００００である。
第1の溶液の調製
　Linear-PEG-SHを、リン酸緩衝液（PB）に溶解させた。このとき、PBのアルカリ金属塩濃度は400 mMとした。PEG濃度は200 g/Lとした。
第2の溶液の調製
　Tetra-PEG-OSuを、PBに溶解させた。このとき、PBのアルカリ金属塩濃度は400 mMとした。PEG濃度は100 g/Lとした。
＜実施例７＞
　前記第1の溶液（アルカリ金属塩濃度400 mM、PEG濃度200 g/L）と前記第2の溶液（アルカリ金属塩濃度400 mM、PEG濃度100 g/L）を、空の遠心チューブの中で、同じ体積比率で混合した。この混合液を、PEGを150 g/Lの濃度で含み、アルカリ金属塩を400 mMの濃度で含むゲル化液とした。1 mLのゲル化液を、27Gの注射針（内径0.22±0.03）が接続された2.5 mL注射筒にとり、ガラスバイアルの中に吐出した。ゲル化液調製完了から吐出完了までの少なくとも5秒間はゲル化液が液体であることを目視で確認した。その後、ガラスバイアルに入ったゲル化液を、特別な外部刺激を与えずに24時間静置した。ガラスバイアルを傾けたところ、ゲル化液は流動性を失っており、白色の固体となっていた。得られたハイドロゲルを指で圧縮したところ、水を吐き出す様子が観察された。この結果は、多孔質構造の形成は、ハイドロゲルを構成する高分子の分岐数に依存しないことを示している。
４．四分岐のPEGとペプチドを用いたハイドロゲルの調製
　原料高分子の一つとして、末端にスクシンイミジル基を有するTetra-PEG-OSu（テトラスクシンイミジル－ポリエチレングリコール；日油株式会社、商品名PTE-100HS）を用いた。重量平均分子量（Ｍｗ）は１００００である。ここではTetra-PEG-OSuと反応する物質として、ペプチドの一種であるトリリシン(Lys-Lys-Lys、Sigma-Aldrich)を用いた。トリリシンの分子量は402.53 g/molである。
第1の溶液の調製
　トリリシンを、リン酸緩衝液（PB）に溶解させた。このとき、PBのアルカリ金属塩濃度は400 mMとした。トリリシン濃度は16.10 g/Lとした。
第2の溶液の調製
　Tetra-PEG-OSuを、PBに溶解させた。このとき、PBのアルカリ金属塩濃度は400 mMとした。PEG濃度は100 g/Lとした。
＜実施例８＞
　前記第1の溶液（アルカリ金属塩濃度400 mM、トリリシン濃度16.10 g/L）と前記第2の溶液（アルカリ金属塩濃度400 mM、PEG濃度100 g/L）を、空の遠心チューブの中で、同じ体積比率で混合し、ゲル化液とした。1 mLのゲル化液を、27Gの注射針（内径0.22±0.03）が接続された2.5 mL注射筒にとり、ガラスバイアルの中に吐出した。ゲル化液調製完了から吐出完了までの少なくとも5秒間はゲル化液が液体であることを目視で確認した。その後、ガラスバイアルに入ったゲル化液を、特別な外部刺激を与えずに24時間静置した。ガラスバイアルを傾けたところ、ゲル化液は流動性を失っており、白色の固体となっていた。得られたハイドロゲルを指で圧縮したところ、水を吐き出す様子が観察された。この結果は、第1の溶液または第2の溶液のいずれかがPEGで構成されていれば、多孔質構造体が得られることを示している。
５．四分岐のPEGとタンパク質を用いたハイドロゲルの調製
　原料高分子の一つとして、末端にスクシンイミジル基を有するTetra-PEG-OSu（テトラスクシンイミジル－ポリエチレングリコール；日油株式会社、商品名PTE-100HS）を用いた。重量平均分子量（Ｍｗ）は１００００である。ここではTetra-PEG-OSuと反応する物質として、タンパク質の一種であるゼラチン（株式会社ニッピ、商品名APAT）を用いた。ゼラチンの分子量はメーカー公称値で約6万 g/molである。
第1の溶液の調製
　アルカリ金属塩濃度が200 mMとなるように調製されたリン酸緩衝液（PB）に対し、K2SO4濃度が500 mMになるように、K2SO4を固体として添加し、溶解させた。このとき、PBが200 mMおよびK2SO4が500 mMの合計アルカリ金属塩濃度700 mMとなった。ゼラチンを当該液体に溶解させた。ゼラチン濃度は24 g/Lとした。
第2の溶液の調製
　アルカリ金属塩濃度が200 mMとなるように調製されたPBに対し、K2SO4濃度が500 mMになるように、K2SO4を固体として添加し、溶解させた。このとき、PBが200 mMおよびK2SO4が500 mMの合計アルカリ金属塩濃度700 mMとなった。Tetra-PEG-OSuを当該液体に溶解させた。PEG濃度は100 g/Lとした。
＜実施例９＞
　第1の溶液（合計アルカリ金属塩濃度700 mM、ゼラチン濃度24 g/L）と前記第2の溶液（合計アルカリ金属塩濃度700 mM、PEG濃度100 g/L）を、空の遠心チューブの中で、同じ体積比率で混合し、ゲル化液とした。1 mLのゲル化液を、27Gの注射針（内径0.22±0.03）が接続された2.5 mL注射筒にとり、ガラスバイアルの中に吐出した。ゲル化液調製完了から吐出完了までの少なくとも5秒間はゲル化液が液体であることを目視で確認した。その後、ガラスバイアルに入ったゲル化液を、特別な外部刺激を与えずに24時間静置した。ガラスバイアルを傾けたところ、ゲル化液は流動性を失っており、白色の固体となっていた。得られたハイドロゲルを指で圧縮したところ、水を吐き出す様子が観察された。この結果は、タンパク質をPEGで架橋してハイドロゲルを得る際にも多孔質構造体を付与できることを示している。
６．四分岐のPEGと多糖を用いたハイドロゲルの調製
　原料高分子の一つとして、末端にスクシンイミジル基を有するTetra-PEG-OSu（テトラスクシンイミジル－ポリエチレングリコール；SINOPEG社、商品名4-arm PEG-SC）を用いた。重量平均分子量（Ｍｗ）は１００００である。ここではTetra-PEG-OSuと反応する物質として、多糖を用いた。多糖にはキトサンやヒアルロン酸等が含まれるが、ここでは一例としてキトサン（サンタクルーズバイオテクノロジー社、商品名Carboxymethyl chitosan）を用いた。
第1の溶液の調製
　アルカリ金属塩濃度が200 mMとなるように調製されたリン酸緩衝液（PB）に対し、K2SO4濃度が0～500 mMになるように、K2SO4を固体として添加し、溶解させた。このとき、PBが200 mMおよびK2SO4が0～500 mMの合計アルカリ金属塩濃度200～700 mMとなった。キトサンを当該液体に溶解させた。キトサン濃度は60 g/Lとした。
第2の溶液の調製
　アルカリ金属塩濃度が200 mMとなるように調製されたPBに対し、K2SO4濃度が0～500 mMになるように、K2SO4を固体として添加し、溶解させた。このとき、PBが200 mMおよびK2SO4が0～500 mMの合計アルカリ金属塩濃度200～700 mMとなった。Tetra-PEG-OSuを当該液体に溶解させた。PEG濃度は120 g/Lとした。
＜比較例３＞
　前記第1の溶液（合計アルカリ金属塩濃度200 mM、キトサン濃度60 g/L）と前記第2の溶液（合計アルカリ金属塩濃度200 mM、PEG濃度120 g/L）を、空の遠心チューブの中で、同じ体積比率で混合し、ゲル化液とした。1 mLのゲル化液を27Gの注射針（内径0.22±0.03）が接続された2.5 mL注射筒にとり、テフロン製容器の中に吐出した。ゲル化液調製完了から吐出完了までの少なくとも5秒間はゲル化液が液体であることを目視で確認した。その後、テフロン製容器に入ったゲル化液を、特別な外部刺激を与えずに24時間静置した。テフロン製容器を傾けたところ、ゲル化液は流動性を失っており、透明の固体となっていた。得られた透明のハイドロゲルは指で圧縮しても水を吐き出すことはなかった。
＜実施例１０＞
　第1の溶液（合計アルカリ金属塩濃度600 mM、キトサン濃度60 g/L）と前記第2の溶液（合計アルカリ金属塩濃度600 mM、PEG濃度120 g/L）を、空の遠心チューブの中で、同じ体積比率で混合し、ゲル化液とした。1 mLのゲル化液を、27Gの注射針（内径0.22±0.03）が接続された2.5 mL注射筒にとり、テフロン製容器の中に吐出した。ゲル化液調製完了から吐出完了までの少なくとも5秒間はゲル化液が液体であることを目視で確認した。その後、テフロン製容器に入ったゲル化液を、特別な外部刺激を与えずに24時間静置した。テフロン製容器を傾けたところ、ゲル化液は流動性を失っており、白色の固体となっていた。得られたハイドロゲルを指で圧縮したところ、水を吐き出す様子が観察された。この結果は、多糖をPEGで架橋してハイドロゲルを得る際にも多孔質構造体を付与できることを示している。
７．ハイドロゲルの透過率測定
　原料高分子として、末端に－ＳＨ基を有するTetra-PEG-SH（テトラスルフヒドリル－ポリエチレングリコール；日油株式会社、商品名PTE-100SH）及び末端にスクシンイミジル基を有するTetra-PEG-OSu（テトラスクシンイミジル－ポリエチレングリコール；日油株式会社、商品名PTE-100HS）を用いた。重量平均分子量（Ｍｗ）は、どちらも１００００である。
第1の溶液の調製
　アルカリ金属塩濃度が200 mMとなるように調製されたリン酸緩衝液（PB）に対し、K2SO4が0～300 mMのいずれかの濃度になるように、K2SO4を固体として添加し、溶解させた。このとき、PBが200 mMおよびK2SO4が0～300 mMの合計アルカリ金属塩濃度200～500 mMとなった。Tetra-PEG-SHを当該液体に溶解させた。PEG濃度は20～100 g/Lのいずれかの濃度とした。
第2の溶液の調製
　アルカリ金属塩濃度が200 mMとなるように調製されたPBに対し、K2SO4が0～300 mMのいずれかの濃度になるように、K2SO4を固体として添加し、溶解させた。このとき、PBが200 mMおよびK2SO4が0～300 mMの合計アルカリ金属塩濃度200～500 mMとなった。Tetra-PEG-OSuを当該液体に溶解させた。PEG濃度は20～100 g/Lのいずれかの濃度とした。
　同じ合計アルカリ金属塩濃度とPEG濃度を有する第1の溶液（合計アルカリ金属塩濃度200～500 mM、PEG濃度20～100 g/L）と前記第2の溶液（合計アルカリ金属塩濃度200～500 mM、PEG濃度20～100 g/L）のペアを、空のチューブの中で、同じ体積比率で混合し、ゲル化液とした。各ゲル化液を96ウェルマイクロプレートに200 μLずつ注ぎ、24時間25℃で静置した。その後、各ウェルに形成されたハイドロゲルの写真を撮影した上で（図３）、Perkinelmer ARVO X3を用いて各ウェルの透過率を測定した（図４）。図３における肉眼での白濁度と図４における透過率はよく相関していた。50 g/L以上のPEG濃度においては、合計アルカリ金属塩濃度が400 mM以上のときに透過率が80%を大きく下回り、白濁した多孔質構造を取ることがわかった。PEG濃度が20 g/Lのときでも、合計アルカリ金属塩濃度が450 mM以上において白濁が確認された。透過率が80%以上のハイドロゲルにおいては、指で圧縮しても水を吐き出すことはなかった。一方、白濁したハイドロゲルはすべて、指で圧縮すると水を吐き出す様子が観察された。これらの結果は、PEG濃度が低い場合でも、合計アルカリ金属塩濃度を高めることで多孔質化が実現できることを意味している。
８．ハイドロゲルのミクロ構造観察と膨潤度測定
　原料高分子として、末端に－ＳＨ基を有するTetra-PEG-SH（テトラスルフヒドリル－ポリエチレングリコール；日油株式会社、商品名PTE-100SH）及び末端にスクシンイミジル基を有するTetra-PEG-OSu（テトラスクシンイミジル－ポリエチレングリコール；日油株式会社、商品名PTE-100HS）を用いた。重量平均分子量（Ｍｗ）は、どちらも１００００である。
第1の溶液の調製
　アルカリ金属塩濃度が200 mMとなるように調製されたリン酸緩衝液（PB）に対し、K2SO4が0～300 mMのいずれかの濃度になるように、K2SO4を固体として添加し、溶解させた。このとき、PBが200 mMおよびK2SO4が0～300 mMの合計アルカリ金属塩濃度200～500 mMとなった。Tetra-PEG-SHを当該液体に溶解させた。PEG濃度は100 g/Lとした。調製したTetra-PEG-SH液に対し、1 mg/mLとなるようにジメチルスルホキシドに溶解させたAlexa FluorTM 594 C5 Maleimideを、Tetra-PEG-SH液の1 vol%分、追加で添加した。
第2の溶液の調製
　アルカリ金属塩濃度が200 mMとなるように調製されたPBに対し、K2SO4が0～300 mMのいずれかの濃度になるように、K2SO4を固体として添加し、溶解させた。このとき、PBが200 mMおよびK2SO4が0～300 mMの合計アルカリ金属塩濃度200～500 mMとなった。Tetra-PEG-OSuを当該液体に溶解させた。PEG濃度は100 g/Lとした。
　同じ合計アルカリ金属塩濃度とPEG濃度を有する第1の溶液（合計アルカリ金属塩濃度200～500 mM、PEG濃度100 g/L）と前記第2の溶液（合計アルカリ金属塩濃度200～500 mM、PEG濃度100 g/L）のペアを、空のチューブの中で、同じ体積比率で混合し、ゲル化液とした。各ゲル化液を、ポリテトラフルオロエチレン製の円筒状の鋳型（直径15 mm、高さ7 mm）に注いで24時間25℃で静置した。その後、ハイドロゲルを鋳型から取り出した。この状態を作製直後と定義し、各ハイドロゲルの写真を撮影した（図５上段）。次に、共焦点顕微鏡LSM 800 (ZEISS)にて、励起波長590 nm、蛍光波長617 nmとして各ハイドロゲルの共焦点顕微鏡像を撮影した（図５下段）。続いて、ハイドロゲルを24時間、リン酸緩衝生理食塩水（富士フイルム和光純薬）に浸漬させた。この状態を平衡状態と定義し、再び各ハイドロゲルの写真を撮影した（図６上段）。同様に、各ハイドロゲルの共焦点顕微鏡像も撮影した（図６下段）。白濁した状態および多孔質構造は平衡状態でも維持されていた。高い合計アルカリ金属塩濃度においては、μmオーダーで多孔質構造が形成され、その構造が水中でも長時間保存されることがわかった。
　さらに、ハイドロゲルの平衡膨潤度Qを(d_eq/d_0)3と定義してプロットした（図７）。ここで、「d_eq」は平衡状態でのハイドロゲルの直径、「d_0」は作製直後のハイドロゲルの直径である。350 mMまでの合計アルカリ金属塩濃度においては、平衡膨潤度は比較的平坦で、一方400 mM以上の合計アルカリ金属塩濃度においては平衡膨潤度が上昇する傾向が認められた。具体的には、200 mMの合計アルカリ金属塩濃度における値をQ_lowとすると、400 mM以上の合計アルカリ金属塩濃度においては、1.1 * Q_low以上の値となった。このことは、先のミクロな構造観察の結果とよく対応しているため、生成された多孔質構造が値に影響を及ぼしたものと考えられる。すなわち、平衡膨潤度からミクロな多孔質構造の存在を間接的に判定できる。
９．ハイドロゲルの伸長時破断応力測定
　原料高分子として、末端に－ＳＨ基を有するTetra-PEG-SH（テトラスルフヒドリル－ポリエチレングリコール；日油株式会社、商品名PTE-100SH）及び末端にスクシンイミジル基を有するTetra-PEG-OSu（テトラスクシンイミジル－ポリエチレングリコール；日油株式会社、商品名PTE-100HS）を用いた。重量平均分子量（Ｍｗ）は、どちらも１００００である。
第1の溶液の調製
　アルカリ金属塩濃度が200 mMとなるように調製されたリン酸緩衝液（PB）に対し、K2SO4が0～250 mMのいずれかの濃度になるように、K2SO4を固体として添加し、溶解させた。このとき、PBが200 mMおよびK2SO4が0～250 mMの合計アルカリ金属塩濃度200～450 mMとなった。Tetra-PEG-SHを当該液体に溶解させた。PEG濃度は100 g/Lとした。
第2の溶液の調製
　アルカリ金属塩濃度が200 mMとなるように調製されたPBに対し、K2SO4が0～250 mMのいずれかの濃度になるように、K2SO4を固体として添加し、溶解させた。このとき、PBが200 mMおよびK2SO4が0～250 mMの合計アルカリ金属塩濃度200～450 mMとなった。Tetra-PEG-OSuを当該液体に溶解させた。PEG濃度は100 g/Lとした。
　同じ合計アルカリ金属塩濃度とPEG濃度を有する第1の溶液（合計アルカリ金属塩濃度200～450 mM、PEG濃度100 g/L）と前記第2の溶液（合計アルカリ金属塩濃度200～450 mM、PEG濃度100 g/L）のペアを、空のチューブの中で、同じ体積比率で混合し、ゲル化液とした。各ゲル化液を、JIS K6251で定めるダンベル型のシリコーン製鋳型に注いで24時間25℃で静置した。その後、ハイドロゲルを鋳型から取り出した。各ハイドロゲルについてAutograph AG-X plus（島津製作所）にて引張試験を行い、破断時の応力σ（伸長時破断応力）を記録した。各ハイドロゲルについて５回同じ試験を行い、平均値とその標準偏差をプロットした（図８）。350 mMまでの合計アルカリ金属塩濃度においては、伸長時破断応力は比較的平坦で、一方400 mM以上の合計アルカリ金属塩濃度においては伸長時破断応力が上昇する傾向が認められた。具体的には、200 mMの合計アルカリ金属塩濃度における値をσ_lowとすると、400 mM以上の合計アルカリ金属塩濃度においては、1.5 * σ_low以上の値となった。このことは、先のミクロな構造観察の結果とよく対応しているため、生成された多孔質構造が値に影響を及ぼしたものと考えられる。すなわち、伸長時破断応力からミクロな多孔質構造の存在を間接的に判定できる。

Claims (10)

  1. 　多孔質構造を有するハイドロゲルの製造方法であって、
    ａ）化合物Ａを、アルカリ金属塩を０～１０００ｍＭの濃度で含有する水系溶媒に溶解させた第１の溶液を調製する工程；
    ｂ）前記化合物Ａと化学架橋可能な化合物Ｂを、アルカリ金属塩を０～１０００ｍＭの濃度で含有する水系溶媒に溶解させた第２の溶液を調製する工程；
    ｃ）前記第1の溶液と前記第２の溶液を混合して、１種類以上のアルカリ金属塩を３００ｍＭ～１０００ｍＭの濃度で含有するゲル化液を得る工程；
    及び
    ｄ）前記ゲル化液中の前記化合物Ａと化合物Ｂが、外部刺激によらず化学架橋を形成することで、多孔質構造を有するハイドロゲルを得る工程
    を含み、かつ
    　前記化合物ＡとＢのうちいずれか一方が、側鎖又は末端に合計２以上の求核性官能基又は求電子性官能基を有する、直鎖、３分岐、４分岐または８分岐のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であること
    を特徴とする、該製造方法。
  2. 　前記ゲル化液の調製時から、ゲル化液が固体になるまでの時間が１秒以上であることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記アルカリ金属塩が、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム及びこれらの任意の組合せよりなる群から選択される、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　前記ハイドロゲルが、４０５ｎｍの波長における透過率の最大値が８０％以下である、請求項１～３のいずれか１に記載の製造方法。
  5. 　前記ハイドロゲルが、前記ポリエチレングリコールを２０ｇ／Ｌ～２５０ｇ／Ｌの範囲で含有する、請求項１～４のいずれか１に記載の製造方法。
  6. 　前記第1の溶液と前記第２の溶液との混合溶液において、前記アルカリ金属塩が２００ｍＭの条件で形成されたハイドロゲルの平衡膨潤度をＱｌｏｗとし、任意濃度の前記アルカリ金属塩存在下で形成された前記ハイドロゲルの平衡膨潤度をＱとしたときに、Ｑが、
    　　　　　Ｑ≧ １．１＊ Ｑｌｏｗ
    の関係式を満たす、請求項１～５のいずれか１に記載の製造方法。
  7. 　前記第1の溶液と前記第２の溶液との混合溶液において、前記アルカリ金属塩が２００ｍＭの条件で形成されたハイドロゲルの伸長時破断応力をσｌｏｗとし、任意濃度のアルカリ金属塩存在下で形成された前記ハイドロゲルの伸長時破断応力をσとしたときに、σが、
    　　　σ≧ １．５＊ σｌｏｗ
    の関係式を満たす、請求項１～６のいずれか１に記載の製造方法。
  8. 　前記化合物ＡとＢのうち、一方がＰＥＧであって；他方がＰＥＧ、ペプチド、タンパク質、キトサン、ヒアルロン酸、及びそれらの誘導体よりなる群から選択される１種以上からなる、請求項１～７のいずれか１に記載の製造方法。
  9. 　前記工程ｄ）における前記外部刺激が、光照射である、請求項１～８のいずれかに記載の製造方法。
  10. 　多孔質構造を有するハイドロゲルを作成するためのキットであって、
    　化合物Ａを、アルカリ金属塩を０～１０００ｍＭの濃度で含有する水系溶媒に溶解させた第１の溶液；及び
    　前記化合物Ａと化学架橋可能な化合物Ｂを、アルカリ金属塩を０～１０００ ｍＭの濃度で含有する水系溶媒に溶解させた第２の溶液
    を含み、
    　記第１の溶液と前記第２の溶液の混合した際のアルカリ金属塩の濃度が、合計で３００ ｍＭ～１０００ｍＭの範囲であり、
    　前記化合物ＡとＢのうちいずれか一方が、側鎖又は末端に合計２以上の求核性官能基又は求電子性官能基を有する、直鎖、３分岐、４分岐または８分岐のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、該キット。
PCT/JP2023/002236 2022-01-31 2023-01-25 多孔質構造を有するハイドロゲルの製造方法 Ceased WO2023145765A1 (ja)

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