WO2023095801A1

WO2023095801A1 - ヒト誘導性制御性ｔ細胞およびその作製方法

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Publication number: WO2023095801A1
Application number: PCT/JP2022/043220
Authority: WO
Inventors: 統久三上; 志文坂口
Original assignee: Regcell Co Ltd
Current assignee: Regcell Co Ltd
Priority date: 2021-11-24
Filing date: 2022-11-22
Publication date: 2023-06-01
Anticipated expiration: 2024-05-24
Also published as: US20250018033A1; KR20240116751A; JP7759136B2; TW202330911A; JPWO2023095801A1; JP7572755B2; CN118591619A; JP2025004140A; EP4438722A4; MX2024006360A; EP4438722A1; CA3239019A1

Abstract

本開示によれば、高い機能性を有し、安定した免疫抑制機能をもつ誘導性制御性Ｔ細胞が提供される。　本開示は、ＦｏｘＰ３陽性、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、ＡＲＥＧ陽性、ＣＤ１７２ｇ陽性、及びＣＤ２６陽性からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する誘導性制御性ヒトＴ細胞を提供する。

Description

ヒト誘導性制御性Ｔ細胞およびその作製方法

　本開示は、高い機能性を持つヒト誘導性制御性Ｔ細胞とその作製方法に関する。

　免疫系に内在するＣＤ２５陽性ＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞の重要な特徴として、転写因子ＦｏｘＰ３を特異的に発現しており、ＦｏｘＰ３の欠損あるいは突然変異によって、制御性Ｔ細胞の発生および分化、また抑制機能が障害されることがある。制御性Ｔ細胞はＦｏｘＰ３の他、ＣＴＬＡ４、ＩＬ－１０など多様な遺伝子の発現をもって免疫系を抑制する。ＦｏｘＰ３の安定な発現を始めとする制御性Ｔ細胞の包括的遺伝子発現制御にはＤＮＡ脱メチル化などエピジェネティクな状態が貢献していると考えられており、それらは機能的な制御性Ｔ細胞の表現型と相関がある。

　本発明者らは、ヒト末梢Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を誘導する際に、ヒト末梢Ｔ細胞から抗ＣＤ３抗体を用いた刺激によって安定な誘導性Ｔ細胞を誘導した後に、休眠培養を施し、再度抗ＣＤ３抗体刺激を行って培養し、さらに休眠培養を施すことによって、高い抑制性分子の発現と高い抑制機能を有する制御性Ｔ細胞を誘導できることを初めて見出した。

　したがって、本開示は以下を提供する。
（項目Ｘ１）
　ＦｏｘＰ３陽性、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、ＡＲＥＧ陽性、ＣＤ１７２ｇ陽性、及びＣＤ２６陽性からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する誘導性制御性ヒトＴ細胞。
（項目Ｘ１Ａ）
　ＮＴ５Ｅ陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞。
（項目Ｘ１Ｂ）
　ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞。
（項目Ｘ１Ｃ）
　ＡＲＥＧ陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞。
（項目Ｘ１Ｄ）
　ＣＤ１７２ｇ陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞。
（項目Ｘ１Ｅ）
　ＣＤ２６陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞。
（項目Ｘ１Ｆ）
　ＣＴＬＡ４陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞。
（項目Ｘ１Ｇ１）
　ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、ＡＲＥＧ陽性、ＣＤ１７２ｇ陽性、及びＣＤ２６陽性からなる群より選択される少なくとも２つの特徴を有する誘導性制御性ヒトＴ細胞。
（項目Ｘ１Ｇ２）
　ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、ＡＲＥＧ陽性、ＣＤ１７２ｇ陽性、及びＣＤ２６陽性からなる群より選択される少なくとも３つの特徴を有する誘導性制御性ヒトＴ細胞。
（項目Ｘ１Ｇ３）
　ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、ＡＲＥＧ陽性、ＣＤ１７２ｇ陽性、及びＣＤ２６陽性からなる群より選択される少なくとも４つの特徴を有する誘導性制御性ヒトＴ細胞。
（項目Ｘ１Ｇ４）
　ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、ＡＲＥＧ陽性、ＣＤ１７２ｇ陽性、及びＣＤ２６陽性からなる群より選択される少なくとも５つの特徴を有する誘導性制御性ヒトＴ細胞。
（項目Ｘ１Ｇ５）
　ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、ＡＲＥＧ陽性、ＣＤ１７２ｇ陽性、及びＣＤ２６陽性のすべての特徴を有する誘導性制御性ヒトＴ細胞。
（項目Ｘ２）
　少なくともＣＴＬＡ４陽性およびＦｏｘＰ３陽性である、上記項目のいずれか一項に請求項１に記載の誘導性制御性ヒトＴ細胞。
（項目Ｘ３）
　少なくともＣＤ１７２ｇ陽性および／またはＣＤ２６陽性である、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性ヒトＴ細胞。
（項目Ｘ４）
　ＦＯＸＰ３遺伝子のＣＮＳ２部位が脱メチル化されている、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性ヒトＴ細胞。
（項目Ｘ５）
　ＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性である、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性ヒトＴ細胞。
（項目Ｘ６）
　ヒトの末梢血Ｔ細胞、またはヒト組織由来Ｔ細胞から得られるか、または誘導される、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性ヒトＴ細胞。
（項目Ｘ７）
（ａ）ヒト末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、第一の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞を、第二の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、（ｄ）工程（ｃ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と
を含む方法によって得られる誘導性制御性ヒトＴ細胞。
（項目Ｘ８）
　上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＦｏｘＰ３陽性、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、ＡＲＥＧ陽性、ＣＤ１７２ｇ陽性、及びＣＤ２６陽性からなる群より選択される少なくとも１つの特徴の割合が約５０％以上である、細胞集団。
（項目Ｘ８Ａ）
　誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＮＴ５Ｅ陽性の割合が約５０％以上である、細胞集団。
（項目Ｘ８Ｂ）
　誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性の割合が約５０％以上である、細胞集団。
（項目Ｘ８Ｃ）
　誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＡＲＥＧ陽性の割合が約５０％以上である、細胞集団。
（項目Ｘ８Ｄ）
　誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＣＤ１７２ｇ陽性の割合が約５０％以上である、細胞集団。
（項目Ｘ８Ｅ）
　誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＣＤ２６陽性の割合が約５０％以上である、細胞集団。
（項目Ｘ８Ｆ）
　誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＣＴＬＡ４陽性の割合が約５０％以上である、細胞集団。
（項目Ｘ８Ｇ１）
　誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、ＡＲＥＧ陽性、ＣＤ１７２ｇ陽性、及びＣＤ２６陽性からなる群より選択される少なくとも２つの特徴の割合がそれぞれ約５０％以上である、細胞集団。
（項目Ｘ８Ｇ２）
　誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、ＡＲＥＧ陽性、ＣＤ１７２ｇ陽性、及びＣＤ２６陽性からなる群より選択される少なくとも３つの特徴の割合がそれぞれ約５０％以上である、細胞集団。
（項目Ｘ８Ｇ３）
　誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、ＡＲＥＧ陽性、ＣＤ１７２ｇ陽性、及びＣＤ２６陽性からなる群より選択される少なくとも４つの特徴の割合がそれぞれ約５０％以上である、細胞集団。
（項目Ｘ８Ｇ４）
　誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、ＡＲＥＧ陽性、ＣＤ１７２ｇ陽性、及びＣＤ２６陽性からなる群より選択される少なくとも５つの特徴の割合がそれぞれ約５０％以上である、細胞集団。
（項目Ｘ８Ｇ５）
　誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、ＡＲＥＧ陽性、ＣＤ１７２ｇ陽性、及びＣＤ２６陽性のすべての特徴の割合がそれぞれ約５０％以上である、細胞集団。
（項目Ｘ９）
　少なくとも前記ＣＴＬＡ４陽性およびＦｏｘＰ３陽性の割合が、それぞれ約５０％以上である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目Ｘ１０）
　少なくとも前記ＣＤ１７２ｇ陽性および／またはＣＤ２６陽性の割合が、それぞれ約５０％以上である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目Ｘ１１）
　前記細胞集団における前記少なくとも１つ特徴の割合が約６０％以上である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目Ｘ１２）
　前記細胞集団における前記少なくとも１つ特徴の割合が約８０％以上である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目Ｘ１２ａ）
　ＦｏｘＰ３強陽性の割合が、約５０％以上である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目Ｘ１３）
　前記細胞集団の約９０％以上がＴ細胞である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目Ｘ１４）
　上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性ヒトＴ細胞または上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団を含む医薬組成物。
（項目Ｘ１５）
　上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性ヒトＴ細胞または上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団を含む再生医療用材料または製品。
（項目Ｘ１６）
　誘導性制御性ヒトＴ細胞を製造する方法であって、
（ａ）ヒト末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、第一の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞を、第二の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、（ｄ）工程（ｃ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と
を含む、方法。
（項目Ｘ１７）
　前記第一の基礎培地が、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、ＣＤＫ８／１９阻害剤、及びアスコルビン酸からなる群から選択される少なくとも１つの因子を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１８）
　前記第一の基礎培地が、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、ＣＤＫ８／１９阻害剤、及びアスコルビン酸を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１９）
　前記第二の基礎培地が、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及びＣＤＫ８／１９阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの因子を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２０）
　前記第二の基礎培地が、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及びＣＤＫ８／１９阻害剤を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２１）
　工程（ａ）が、前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、前記第一の基礎培地で約３日間刺激する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２２）
　工程（ｂ）が、工程（ａ）で得られた細胞を、前記ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約２日間休眠培養する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２３）
　工程（ｃ）が、工程（ｂ）で得られた細胞を、前記第二の基礎培地で約３日間刺激する、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２４）
　工程（ｄ）が、工程（ｃ）で得られた細胞を、前記ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約２日間休眠培養する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２５）
　上記項目のいずれか一項に記載の方法によって生成される、誘導性制御性ヒトＴ細胞または前記誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団。

　また本開示は以下も提供する。
（項目１）
　ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、及びＡＲＥＧ陽性からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する誘導性制御性Ｔ細胞。
（項目２）
　ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、及びＡＲＥＧ陽性からなる群より選択される少なくとも２つの特徴を有する、上記項目に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
（項目３）
　少なくともＣＴＬＡ４陽性である、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
（項目４）
　ＦＯＸＰ３遺伝子のＣＮＳ２部位が脱メチル化されている、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
（項目５）
　ＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性である、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
（項目６）
　ヒトの末梢血Ｔ細胞、またはヒト組織由来Ｔ細胞から得られるか、または誘導される、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
（項目７）
（ａ）末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、第一の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞を、第二の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、（ｄ）工程（ｃ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と
を含む方法によって得られる誘導性制御性Ｔ細胞。
（項目８）
　Ｔ細胞を含む細胞集団であって、前記細胞集団のＴ細胞における約５０％以上が、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞である、細胞集団。
（項目９）
　前記細胞集団中のＴ細胞における約８０％以上が、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞である、請求項８に記載の細胞集団。
（項目１０）
　前記細胞集団におけるＴ細胞は、制御性Ｔ細胞である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１１）
　前記細胞集団の約９０％以上がＴ細胞である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１２）
　上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞または上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団を含む医薬組成物。
（項目１３）
　上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞または上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団を含む再生医療用材料または製品。
（項目Ａ１）
　誘導性制御性Ｔ細胞を製造する方法であって、
（ａ）末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、第一の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞を、第二の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、（ｄ）工程（ｃ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と
を含む、方法。
（項目Ａ２）
　前記第一の基礎培地が、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、ＣＤＫ８／１９阻害剤、及びアスコルビン酸からなる群から選択される少なくとも１つの因子を含む、上記項目に記載の方法。
（項目Ａ３）
　前記第一の基礎培地が、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、ＣＤＫ８／１９阻害剤、及びアスコルビン酸を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ４）
　前記第二の基礎培地が、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及びＣＤＫ８／１９阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの因子を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ５）
　前記第二の基礎培地が、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及びＣＤＫ８／１９阻害剤を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ６）
　工程（ａ）が、前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、前記第一の基礎培地で約３日間刺激する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ７）
　工程（ｂ）が、工程（ａ）で得られた細胞を、前記ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約　２日間休眠培養する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ８）
　工程（ｃ）が、工程（ｂ）で得られた細胞を、前記第二の基礎培地で約３日間刺激する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ９）
　工程（ｄ）が、工程（ｃ）で得られた細胞を、前記ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約２日間休眠培養する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１０）
　上記項目のいずれか一項に記載の方法によって生成される、誘導性制御性Ｔ細胞または前記誘導性制御性Ｔ細胞を含む細胞集団。

　本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。なお、本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。

　なお、上記した以外の本開示の特徴及び顕著な作用・効果は、以下の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。

　本開示は、ヒト末梢Ｔ細胞から高い機能性を有する制御性Ｔ細胞をインビトロで誘導する方法を提供することができる。本開示の方法によって誘導される制御性Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞に関連する遺伝子を高発現し、強い抑制能力を持つ。したがって、制御性Ｔ細胞として、様々な免疫疾患、自己免疫病などの炎症性疾患の治療や予防などに用い得る。

　本開示の方法によりヒト末梢Ｔ細胞から機能的な制御性Ｔ細胞をインビトロで誘導することができる。本開示の方法により得られる制御性Ｔ細胞は、機能性を有し（例えば、高い抑制機能を持ち）、制御性Ｔ細胞として安定である。すなわち、本開示の方法によって、ヒト末梢Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞のマスター遺伝子であるＦｏｘＰ３を安定に発現し、高い機能性を有する制御性Ｔ細胞を誘導することができる。

図１は、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞（ヒト高機能安定型ｉＴｒｅｇ（ＨＳＦ　ｉＴｒｅｇ）細胞ともいう）の一実施形態の表現型解析（フローサイトメトリー）を示す図である。ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞から本開示の誘導性制御性Ｔ細胞（図ではＨＳＦ－ｉＴｒｅｇ）を作製し、ＦＯＸＰ３、ＣＴＬＡ４、Ｈｅｌｉｏｓの発現をフローサイトメトリー法で解析した。通常のｎＴｒｅｇ（ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞）を刺激した細胞、および通常のｉＴｒｅｇ（Conventional　iTreg：ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＩＬ－２とＴＧＦ－β１の存在下で３日間ＣＤ３／ＣＤ２８刺激した細胞）を比較した。図２は、本開示のｉＴｒｅｇ（ＨＳＦ　ｉＴｒｅｇ）細胞の一実施形態のエピゲノム解析（バイサルファイト法）を示す図である。図１の各細胞についてＦＯＸＰ３　ＣＮＳ２領域の脱メチル化状態をバイサルファイト法で解析した。図３は、本開示のｉＴｒｅｇ（ＨＳＦ　ｉＴｒｅｇ）細胞の一実施形態の抑制能解析（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抑制アッセイ）を示す図である。図１の各細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ抑制能を解析した。ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞をCell　Trace　Violet試薬で染色し、図１の各細胞と一定の比率でTreg　Suppression　Inspector（Miltenyi　Biotec）（５μＬ／ｗｅｌｌ）存在下で３日間混合培養し、Cell　Trace　Violet強度をフローサイトメトリー法で解析した。図４は、本開示のｉＴｒｅｇ（ＨＳＦ　ｉＴｒｅｇ）細胞の一実施形態の遺伝子発現パターン解析（ＲＡＮ－ｓｅｑ法）を示す図である。図１の各細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞をＩＬ－２存在下で刺激したＦＯＸＰ３陰性細胞（Ｔｃｏｎｖ）について網羅的遺伝子発現パターンをＲＮＡシーケンス法で解析した。図５は、本開示のｉＴｒｅｇ（ＨＳＦ　ｉＴｒｅｇ）細胞の一実施形態のＣＤ１０３発現（フローサイトメトリー法）を示す図である。図１の各細胞についてＦＯＸＰ３陽性細胞におけるＣＤ１０３発現をフローサイトメトリー法で解析した。図６は、ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞から作製した本開示のｉＴｒｅｇ（ＨＳＦ　ｉＴｒｅｇ）細胞の一実施形態の表現型解析（フローサイトメトリー法）を示す図である。ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞から本開示の制御性Ｔ細胞を作製し、ＦＯＸＰ３、ＣＴＬＡ４、Ｈｅｌｉｏｓの発現をフローサイトメトリー法で解析した。図７は、本開示のｉＴｒｅｇ（ＨＳＦ　ｉＴｒｅｇ）細胞の一実施形態のＣＤ２５発現およびＦＯＸＰ３発現（フローサイトメトリー法）を示す図である。ＣＤ２５とＦＯＸＰ３の発現強度をＢＤ　ＦＡＣＳＬｙｒｉｃ　フローサイトメーターを用いたフローサイトメトリー法により解析した。図８は、本開示のｉＴｒｅｇ（ＨＳＦ　ｉＴｒｅｇ）細胞の一実施形態の表現型解析を示す図である。本開示の誘導性制御性Ｔ細胞（ＨＳＦ－ｉＴｒｅｇ）を作製し、ＣＤ１７２ｇやＣＤ２６などの発現を解析した。

　以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

　以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。

　本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。したがって、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。

　本明細書において、遺伝子名およびその産物を表記する際には、通常の用法とは異なり、すべて大文字で表記する場合には、遺伝子とタンパク質の両方を指すことがある。例えば、ＦＯＸＰ３遺伝子、ＦＯＸＰ３タンパク質と使い分けすることもあり、ＦｏｘＰ３と表記する場合には、当該遺伝子またはタンパク質の概念と実体の両方（全体）を指す。

　本明細書において、「制御性Ｔ細胞（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ）」とは、ＦｏｘＰ３発現が陽性のＴ細胞である。本明細書において、「Ｔｒｅｇ」とも称される場合がある。Ｔｒｅｇは内因性制御性Ｔ細胞（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ　Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ：ｎＴｒｅｇ）、誘導性制御性Ｔ細胞（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ：ｉＴｒｅｇ）などがある。制御性Ｔ細胞は、通常、種々の機能（例えば、免疫抑制機能）を有し得る。

　本明細書において、「誘導性制御性Ｔ細胞（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ、ｉＴｒｅｇ）」とは、制御性Ｔ細胞のうち、ＩＫＺＦ２（Ｈｅｌｉｏｓ）の発現が陰性であるものをいう。ｉＴｒｅｇは、通常、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞等などから分化誘導することによって得られる。

　本明細書において、「内因性制御性Ｔ細胞（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ　Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ、ｎＴｒｅｇ）」とは、制御性Ｔ細胞のうち、ＩＫＺＦ２（Ｈｅｌｉｏｓ）、及びＣＴＬＡ４の発現が陽性のものをいう。通常、生体内に存在する細胞である。

　本明細書において、「末梢Ｔ細胞」とは、胸腺外に存在するＴ細胞をいい、末梢血液、リンパ節、その他組織から取得することができる。本明細書において「末梢Ｔ細胞」というとき、細胞群に末梢Ｔ細胞が含まれていればよく、Ｔ細胞が単離されている必要はない。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）などＴ細胞の他にも種々のリンパ球を含む細胞画分を用いてもよい。

　本明細書において「フローサイトメトリー」とは、液体中に懸濁する細胞，個体およびその他の生物粒子の粒子数，個々の物理的・化学的・生物学的性状を計測する技術をいう。この技術を用いた装置は、「フローサイトメーター」という。本開示において、細胞マーカー（例えば、ＦｏｘＰ３、ＣＴＬＡ４、Ｈｅｌｉｏｓ、ＣＤ１０３など）の「陽性」「陰性」は、当該分野において通常使用されるように、フローサイトメトリーによって定められる。より詳細には、フローサイトメトリーでは、細胞を一列に並べて流し、分光学的手法により細胞の数をカウントする。例えば、蛍光や発光酵素によって標識された細胞にレーザー光を照射し、これによって細胞から発せられる蛍光又は発光信号をフォトダイオード等の検出器で検出することで、標的細胞の数をカウントする。また、検出器での検出結果をコンピュータに取り込んで、二次元プロットを生成して表示することもできる。これにより、標的細胞の有無、及びその数等を容易に把握できる。

　本明細書において、「脱メチル化」とは、代表的にメチル化しているアデニン（例えば、６位；ｍ６Ａ、１位；ｍ１Ａ）やシトシン（例えば、５位；ｍ５Ｃ、３位；ｍ３Ｃ）のメチル化修飾が取り除かれることをいう。脱メチル化は、当該分野で公知の手法を用いて特定することができ、例えば、バイサルファイト法などを用いて測定することができる。

　本明細書において、「細胞集団」とは、２以上の細胞を含む集団であり、例えば、平面的に細胞同士が集まった状態のものであってもよく、３次元的に細胞同士が接着して構成された細胞塊であってもよい。また、「細胞集団」は、単一種の細胞により形成されていてもよいし、複数種の細胞が含まれていてもよい。

　本明細書において、「刺激」とは、ＴＣＲを介した刺激を意味する。例えば、Ｔ細胞の刺激とは、抗ＣＤ３抗体及びそれを含む複合体を用いた刺激、ＴＣＲに結合するペプチド及びペプチドを含む複合体を用いた刺激、抗原提示細胞を用いた刺激、抗ＣＤ３抗体と抗原提示細胞を同時に用いた刺激、ペプチドやタンパク質と抗原提示細胞を同時に用いた刺激などを含む。

　本明細書において、「休眠培養」とは、上記のような刺激がない状態で細胞を培養することをいう。

　（好ましい実施形態）
　以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。

（誘導性制御性Ｔ細胞）
　本開示は、高機能安定型誘導性制御性Ｔ細胞（高機能安定型ｉＴｒｅｇ、ＨＳＦ　ｉＴｒｅｇともいう。）およびその利用に関する。

　本開示の一局面において、ＦｏｘＰ３陽性、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、ＡＲＥＧ陽性、ＣＤ１７２ｇ陽性、及びＣＤ２６陽性からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する誘導性制御性ヒトＴ細胞が提供される。本開示の一実施形態において、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞は、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、及びＡＲＥＧ陽性からなる群より選択される少なくとも２つの特徴を有することもできる。また本開示の一実施形態において、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞は少なくともＣＴＬＡ４陽性であってもよい。限定を意図するものではないが、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞はＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性であってもよい。

　本開示の一実施形態において、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞は、少なくともＣＴＬＡ４陽性およびＦｏｘＰ３陽性であってもよい。本開示の一実施形態において、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞は、少なくともＣＤ１７２ｇ陽性および／またはＣＤ２６陽性であってもよい。

　本開示は、ＣＤ１７２ｇ陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞を提供する。ＣＤ１７２ｇは、チロシンキナーゼ関連のタンパク質であり、ニューロン等の細胞接着に関与している（adhesion of cerebellar neurons, neurite outgrowth and glial cell attachment）ことから、ＣＤ１７２ｇ陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞は、接着性などに関する機能が賦活化され、これに関連する種々の疾患に対する効果が高いことが期待される。

　本開示は、ＣＤ２６陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞を提供する。ＣＤ２６はＤＰＰ４とも呼ばれる遺伝子であり、糖代謝やインスリン代謝、免疫機能（感染症においても顕著）に関連していることから、ＣＤ２６陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞は、これに関連する種々の疾患に対する効果が高いことが期待される。

　本開示は、ＮＴ５Ｅ陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞を提供する。ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）は細胞外のヌクレオチドを膜透過性のヌクレオシドに変換する触媒作用を持つ細胞膜タンパク質である。コードされたタンパク質は、リンパ球の分化の決定因子として使用される。この遺伝子に欠陥があると、関節や動脈の石灰化を引き起こす可能性があるため、ＮＴ５Ｅ陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞は、これに関連する種々の疾患に対する効果が高いことが期待される。

　本開示は、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞を提供する。ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）は、Ｉドメインを持つαインテグリンをコードし、細胞外ドメインで翻訳後切断を受け、ジスルフィド結合した重鎖と軽鎖を生成する。このタンパク質は、β７インテグリンと結合して、ヒト粘膜リンパ球－１抗原として知られるＥ－カドヘリン結合インテグリンを形成する。このタンパク質は、ヒト腸管上皮内リンパ球（ＩＥＬ）に優先的に発現しており、接着の役割に加えて、ＩＥＬ活性化のためのアクセサリー分子として機能している可能性がある。そのため、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞は、これに関連する種々の疾患に対する効果が高いことが期待される。

　本開示は、ＡＲＥＧ陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞を提供する。ＡＲＥＧは、上皮成長因子ファミリーの一員であり、上皮成長因子（ＥＧＦ）およびトランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ－α）に関連している。このタンパク質はＥＧＦ／ＴＧＦ－α受容体と相互作用して正常な上皮細胞の成長を促進し、ある種の攻撃的な癌細胞株の成長を阻害する。また、乳腺、卵子、骨組織の発生にも機能する。この遺伝子は乾癬に似た皮膚表現型と関連しており、様々な種類の癌や炎症状態を含む他の病的疾患とも関連している。そのため、ＡＲＥＧ陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞は、これに関連する種々の疾患に対する効果が高いことが期待される。

　本開示は、ＣＴＬＡ４陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞を提供する。ＣＴＬＡ４は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、Ｔ細胞に抑制的なシグナルを伝達するタンパク質である。膜結合型ＣＴＬＡ４はジスルフィド結合で結ばれたホモダイマーとして機能し、可溶型ＣＴＬＡ４はモノマーとして機能する。この遺伝子の変異は、インスリン依存性糖尿病、バセドウ病、橋本甲状腺炎、セリアック病、全身性エリテマトーデス、甲状腺関連眼窩病、その他の自己免疫疾患と関連しているといわれている。そのため、ＣＴＬＡ４陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞は、これに関連する種々の疾患に対する効果が高いことが期待される。

　制御性Ｔ細胞におけるＦｏｘＰ３の発現については、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＩＬ２とＴＧＦβを含む培地中、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体の存在下で培養し、その後ＩＬ２及び　ＴＧＦβを含む培地にて培養することによって試験管内での誘導が可能である。また末梢Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を誘導する方法がいくつか知られているものの、誘導性制御性Ｔ細胞におけるＦｏｘＰ３の発現は不安定であり、ＦｏｘＰ３以外の多くの機能的分子発現については確認されていない。

　近年、誘導性制御性Ｔ細胞においてアスコルビン酸を培地中に添加する手法（Kasahara　et　al.　Int.　Immunol.　(2017)　29(10):457-469）、ＣＤ２８抗体刺激を使用しない手法（Mikami　et　al.　Proc　Natl　Acad　Sci　U　S　A.　(2020）117(22):12258-12268.）によってＤＮＡ脱メチル化誘導を引き起こす培養方法が開発されている。しかしこの手法で作製された誘導性制御性Ｔ細胞においても機能的分子の発現は確認されておらず、十分な免疫抑制活性が得られていない。臨床においても誘導性制御性Ｔ細胞を使用した臨床試験が１件、ＧＶＨＤを対象に実施されているが、使用された細胞の制御性Ｔ細胞の割合は低く、現時点でＧＶＨＤの予防など有効性は認められていない（MacMillan　et　al.,　Blood　Adv.　(2021)　5(5):1425-1436）。

　本開示においては、ＦｏｘＰ３の発現が安定であり、有利には、免疫抑制作用を安定的に保持する誘導性制御性Ｔ細胞を提供することができ、このような誘導性制御性Ｔ細胞は、例えば、本願明細書の他の箇所で説明する誘導性制御性Ｔ細胞を製造する方法によって製造することができる。例えば、本開示は、（ａ）末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、第一の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞を、第二の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、（ｄ）工程（ｃ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程とを含む方法によって得られる誘導性制御性Ｔ細胞を提供することができる。

　本開示において作製される誘導性制御性Ｔ細胞は誘導性制御性Ｔ細胞特異的脱メチル化状態を有している。得られた制御性Ｔ細胞が、制御性Ｔ細胞特異的脱メチル化状態にあることは、例えばＦｏｘＰ３の遺伝子（ＦＯＸＰ３（すべて斜体字））のＣＮＳ２部位が脱メチル化されていることにより確認することができる。このような脱メチル化状態は、安定型の指標となり得るため、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞は、脱メチル化状態を確認することで安定型の誘導性制御性Ｔ細胞であることを示すことができる。

　本明細書において、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞の免疫抑制活性または免疫抑制作用は、例えば、レスポンダーＴ細胞におけるCell　Trace　Violet強度を測定することによって確認することができる。本開示の誘導性制御性Ｔ細胞は免疫抑制活性または免疫抑制作用を安定的に提供することができ、例えば、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞は少なくとも約２週間にわたって免疫抑制活性または免疫抑制作用を提供することができる。後述の実施例において示されるように、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞は従来の制御性Ｔ細胞（誘導性および内因性を含む）よりも高い免疫抑制作用を有することができる。そのため、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞は機能性あるいは高機能の誘導性制御性Ｔ細胞ということもできる。

　一実施形態において、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞はＦｏｘＰ３を安定的に発現することができる。そのため、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞は安定型誘導性制御性Ｔ細胞ということもできる。本開示の誘導性制御性Ｔ細胞は、一側面において、高機能で安定型であり、高機能安定型誘導性制御性Ｔ細胞（ＨＳＦ　ｉＴｒｅｇ）ということができる。

　本開示の一実施形態において、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞におけるマーカーが陽性か否かについては、フローサイトメトリーによる陽性率測定によって行うことができる。例えば、フローサイトメーターで解析し、基準以上の抗原発現量を示す細胞の割合から陽性か否かを判定することができる。細胞表面マーカーの発現強度に応じて、陰性、弱陽性、中陽性、強陽性（弱陽性、中陽性、および強陽性をまとめて「陽性」とする）などと区分することもできる。例えば、機器の設定に応じて、各マーカーの蛍光強度中央値／陰性対照の蛍光強度中央値（アイソタイプコントロール抗体による染色）の値が、５未満、５以上１０未満、１０以上３０未満、３０以上の場合に、それぞれ陰性、弱陽性、中陽性、強陽性とすることもできる。そのような判定は（フローサイトメトリーによる陽性率測定）で例示されるように判定することができるが、本開示はこれに限定されない。

　本開示の一実施形態において、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞における細胞表面マーカーの発現強度は、例えば、本願実施例に記載されるようにして準備したサンプルを用いて、ＢＤ　ＦＡＣＳＬｙｒｉｃ　フローサイトメーター（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によって解析した結果に基づき、その発現強度が、１０^２以上が弱陽性、１０^３以上が中陽性、１０^４以上が強陽性としてもよく、または１０^３以上を強陽性、それ以下を弱陽性としてもよく、または１０^２以上を強陽性、それ以下を弱陽性としてもよい。このような判定は実験条件、実験目的、細胞の種類、機器の設定条件などによって適宜設定することができ、本開示はこれに限定されない。またＢＤ　ＦＡＣＳＬｙｒｉｃ　フローサイトメーター以外のフローサイトメーター機器で解析した場合にも、ＢＤ　ＦＡＣＳＬｙｒｉｃ　フローサイトメーターで解析した場合の発現強度に対応する他の機器における発現強度を算出することができ、使用する機器に応じて発現強度を示す値を適宜見出すことができる。

　本開示の一実施形態において、本開示において作製される誘導性制御性Ｔ細胞は任意の細胞から誘導することができるが、好ましくはヒトの末梢血Ｔ細胞、またはヒト組織由来Ｔ細胞から誘導して得ることができる。

　本開示の一実施形態において、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞またはその細胞集団は、ヒト細胞を対象とすることができ、ヒトの末梢血から得られたＴ細胞を材料として、所定の手法によって誘導された誘導性制御性ヒトＴ細胞またはその細胞集団とすることができる。ヒト細胞とマウス細胞とではその性質は明確に異なり、仮に同じ細胞表面マーカーが存在していたとしても、細胞の性質が同一とみなすことはできない。例えば、誘導性制御性Ｔ細胞の分野では、マウスとヒトとでは適用し得る技術が異なり、マウスの場合、抗原未感作のリンパ球が大部分である一方で、ヒトの場合、末梢血中Ｔ細胞は抗原感作の程度や活性化の程度が多様なものとなる。そのため、マウスでは、マウスリンパ組織から採取したＴ細胞から高機能安定型誘導性制御性Ｔ細胞を直接作製することができるものの、ヒトではそのようなことが困難であり、単に細胞表面マーカーの存在のみをもって、同様の細胞とみなすことはできない。

　本開示の一局面において、上記のような誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＦｏｘＰ３陽性、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、ＡＲＥＧ陽性、ＣＤ１７２ｇ陽性、及びＣＤ２６陽性からなる群より選択される少なくとも１つの特徴の割合が約５０％以上である、細胞集団が提供される。

　本開示の他の局面において、誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＣＴＬＡ４陽性およびＦｏｘＰ３陽性の割合がそれぞれ約５０％以上である、細胞集団が提供される。一実施形態において、本開示の細胞集団は、ＣＴＬＡ４陽性およびＦｏｘＰ３陽性の割合が、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、または約９９％以上とすることができる。

　本開示の一実施形態において、本開示の細胞集団において、少なくとも前記ＣＤ１７２ｇ陽性および／またはＣＤ２６陽性の割合が、それぞれ約５０％以上とすることができる。一実施形態において、本開示の細胞集団は、ＣＤ１７２ｇ陽性および／またはＣＤ２６陽性の割合が、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、または約９９％以上とすることができる。

　本開示の一実施形態において、本開示の細胞集団において、ＦｏｘＰ３強陽性の割合が、約５０％以上とすることができる。一実施形態において、本開示の細胞集団は、ＦｏｘＰ３強陽性の割合が、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、または約９９％以上とすることができる。限定を意図するものではないが、このような細胞集団において、細胞表面マーカーの発現強度の測定は、上述のようなフローサイトメトリーによる陽性率測定によって行うことができる。

　本開示の他の局面において、誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＦｏｘＰ３陽性の割合が約５０％以上である、細胞集団が提供される。限定を意図するものではないが、一実施形態において、このような細胞集団は、ＦｏｘＰ３陽性の誘導性制御性ヒトＴ細胞を、細胞数基準で、約５０％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、または約９９％以上含むことができる。

　本開示の他の局面において、誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＣＴＬＡ４陽性の割合が約５０％以上である、細胞集団が提供される。限定を意図するものではないが、一実施形態において、このような細胞集団は、ＣＴＬＡ４陽性の誘導性制御性ヒトＴ細胞を、細胞数基準で、約５０％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、または約９９％以上含むことができる。

　本開示の他の局面において、誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＮＴ５Ｅ陽性の割合が約５０％以上である、細胞集団が提供される。限定を意図するものではないが、一実施形態において、このような細胞集団は、ＮＴ５Ｅ陽性の誘導性制御性ヒトＴ細胞を、細胞数基準で、約５０％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、または約９９％以上含むことができる。

　本開示の他の局面において、誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性の割合が約５０％以上である、細胞集団が提供される。限定を意図するものではないが、一実施形態において、このような細胞集団は、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性の誘導性制御性ヒトＴ細胞を、細胞数基準で、約５０％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、または約９９％以上含むことができる。

　本開示の他の局面において、誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＡＲＥＧ陽性の割合が約５０％以上である、細胞集団が提供される。限定を意図するものではないが、一実施形態において、このような細胞集団は、ＡＲＥＧ陽性の誘導性制御性ヒトＴ細胞を、細胞数基準で、約５０％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、または約９９％以上含むことができる。

　本開示の他の局面において、誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＣＤ１７２ｇ陽性の割合が約５０％以上である、細胞集団が提供される。限定を意図するものではないが、一実施形態において、このような細胞集団は、ＣＤ１７２ｇ陽性の誘導性制御性ヒトＴ細胞を、細胞数基準で、約５０％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、または約９９％以上含むことができる。

　本開示の他の局面において、誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＣＤ２６陽性の割合が約５０％以上である、細胞集団が提供される。限定を意図するものではないが、一実施形態において、このような細胞集団は、ＣＤ２６陽性の誘導性制御性ヒトＴ細胞を、細胞数基準で、約５０％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、または約９９％以上含むことができる。

　上記のとおり、ヒト細胞とマウス細胞とではその性質は明確に異なるため、誘導の条件が同じであっても、マウス細胞とヒト細胞とでは特定の細胞の誘導の割合は異なり、本開示では、所定の誘導方法で誘導した場合に、所定の細胞表面マーカーの陽性の割合が約５０％以上となる細胞集団を得ることができ、好ましくは「ＣＴＬＡ４陽性およびＦｏｘＰ３陽性の割合がそれぞれ約５０％以上である」細胞集団を取得することができる。

　ＣＴＬＡ４は細胞内に局在する分子であり、少なくとも濃縮や精製の指標として使えるレベルではない。また、ＦｏｘＰ３は転写因子であり全て細胞内に存在する分子であるため、表面では全く検出できず、精製に使うことも不可能である。すなわち、ＣＴＬＡ４およびＦｏｘＰ３はＴ細胞「内」に発現するマーカーとなるため、ＣＴＬＡ４および／またはＦｏｘＰ３を指標としてソーティングして濃縮し、ＣＴＬＡ４陽性および／またはＦｏｘＰ３陽性が約５０％以上の細胞集団を得ることはできない。したがって、従来の方法に従ってＣＴＬＡ４陽性およびＦｏｘＰ３陽性の割合がそれぞれ約５０％未満の細胞集団を得て、そのような細胞集団を原料として、ＣＴＬＡ４および／またはＦｏｘＰ３を指標として濃縮し、当該細胞がそれぞれ約５０％以上の細胞集団を得ることもできない。

　本開示の一実施形態において、本願発明の誘導性制御性ヒトＴ細胞は、Ｔｒｅｇによる免疫抑制機能を主に担うものとなるところ、この細胞が、ある細胞集団において半数以上を占めることで、医学上有効な免疫抑制効果が安定的に達成できることとなり、技術的・医学的効果にも重要となる。すなわち、医学上有効な免疫抑制効果を奏するＴ細胞を５０％以上含むことで、細胞製剤として安定なものを提供することができるため、この効果は、医学上は極めて重要なポイントであり、単に量や数値の違いにとどまらず、製剤として成立するかという品質の問題として重要な点となる。

　本開示の一実施形態において、本開示の細胞集団において、誘導性制御性ヒトＴ細胞は、さらにＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、および／またはＡＲＥＧ陽性の特徴を備えることができる。これらの細胞マーカーは、免疫抑制機能において重要な役割を果たす遺伝子であり、これらのマーカーが高発現していることにより、細胞の投与後、従来の誘導性制御性Ｔ細胞に比してより機能的安定性を保つことができる。例えば、ＣＤ１０３は炎症部位への制御性Ｔ細胞の遊走、ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）は免疫抑制能を持つａｄｅｎｏｓｉｎｅの産生、またＡＲＥＧは制御性Ｔ細胞による組織の再生に重要である。本開示の細胞集団は、これらのマーカーが高発現していることにより、機能的安定性を保つことができるという効果を達成することができる。

　本開示の一実施形態において、本開示の細胞集団におけるＴ細胞は、制御性Ｔ細胞とすることができる。この場合、本開示の細胞集団の制御性Ｔ細胞において、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、または約９９％以上が、本願明細書の他の箇所に記載された誘導性制御性Ｔ細胞とすることができる。

　本開示の一実施形態において、本開示の細胞集団は、Ｔ細胞以外の細胞を含んでいてもよいが、好ましくは、本開示の細胞集団の約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、または約９９％以上がＴ細胞であってもよく、好ましくは、約９０％以上がＴ細胞であってもよい。

　本開示の一局面において、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞または細胞集団を含む医薬組成物が提供される。また他の局面において、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞または細胞集団を含む再生医療用材料または製品が提供される。この医薬組成物や再生医療用材料または製品は、免疫抑制作用によって処置することができる自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギーで使用されることができる。これらの医薬、再生医療用材料または製品は、培地、その他の当該分野で使用される任意の添加物質とともに使用されることができる。このような培地としては、細胞の培養に用いられる動物細胞培養用基礎培地へ必要な因子を添加した培地を用いることができる。このような培地の例は本明細書の他の個所に詳述されている。培地に添加される成分についても、その例は本明細書の他の個所に詳述されている。このような製品として提供される場合は、ＤＭＳＯなどを含んでいてもよい。

（製法）
　本開示は、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞を製造する方法を提供する。本開示の方法は、高機能で、安定型の誘導性制御性Ｔ細胞を製造することができる新規の方法であり、本明細書において以下に詳細に説明する。

　本開示の一局面において、誘導性制御性Ｔ細胞を製造する方法であって、（ａ）末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、第一の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞を、第二の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、（ｄ）工程（ｃ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程とを含む、方法が提供される。本開示においては、ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞のいずれを原料として用いても本開示の誘導性制御性Ｔ細胞を製造することができ、一実施形態において、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の混合細胞を原料として製造することもできる。

　一実施形態において、本開示の方法は、ヒト末梢Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体刺激の存在下でＴＧＦβおよびＩＬ－２を含む培地で培養する工程、抗ＣＤ３抗体非存在下でＩＬ－２を含む培地で培養する工程、再度抗ＣＤ３抗体刺激の存在下でＴＧＦβおよびＩＬ－２を含む培地で培養する工程を含む、ヒト末梢Ｔ細胞（ＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を含む）から制御性Ｔ細胞を製造する方法とすることもできる。

　一実施形態において、Ｔ細胞の刺激とは、Ｔｒｅｇを得る際の刺激であって、ＴＣＲを介した刺激であれば特に限られない。例えば、Ｔ細胞の刺激としては、抗ＣＤ３抗体及びそれを含む複合体を用いた刺激、ＴＣＲに結合するペプチド及びペプチドを含む複合体を用いた刺激、抗原提示細胞を用いた刺激、抗ＣＤ３抗体と抗原提示細胞を同時に用いた刺激、ペプチドやタンパク質と抗原提示細胞を同時に用いた刺激などを含むことができるが、Ｔｒｅｇを得ることができるものであれば、その培地や条件は特に限定されない。

　一実施形態において、休眠培養としては、上記のような刺激がない状態で細胞を培養するものであれば、その培地や条件は特に限られない。

　本明細書において、「抗ＣＤ３抗体刺激」とは、細胞上のＣＤ３受容体に特異的な刺激を与えることを意味する。ＣＤ３刺激としては、例えば抗ＣＤ３アゴニスト抗体が例示される。抗ＣＤ３アゴニスト抗体は、研究用試薬として市販されている製品を用いても、常套方法にて作成してもよい。抗ＣＤ３抗体は、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシなどの動物由来、及びヒト由来のものを使用できる。

　一実施形態において、本開示の方法では、一旦、ｉＴｒｅｇを誘導（脱メチル化誘導を引き起こすＴ細胞への刺激）した後（工程ａ）、培地交換して１～３日間休眠培養することで細胞を回復させ（工程ｂ）、更にもう一度、脱メチル化誘導を引き起こすためにＴ細胞を刺激（工程ｃ）することで、機能性を有し、かつ安定性のある誘導性制御性ヒトＴ細胞を得ることができる。通常は２回刺激とすると、Ｔ細胞はアポトーシスを示すことが技術常識であるところ、本開示の方法では、「休眠培養」と「２回目の刺激」を行うことで、アポトーシスを示すことなく、機能性を有し、かつ安定性のある誘導性制御性ヒトＴ細胞を得ることを見出している。

　すなわち、本開示の方法においては、Ｔ細胞刺激、休眠培養、その後の再度の刺激を行うことで、機能性を有し、かつ安定性のある誘導性制御性ヒトＴ細胞を得ることができるため、このようにして得られた誘導性制御性ヒトＴ細胞またはそのような誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であれば、本開示の所望の効果を達成することができる。したがって、本開示の一実施形態において、培養のための培地や刺激の種類は特に限られず、任意の組成の培地及び任意の種類の刺激を用いることで、機能性を有し、かつ安定性のある誘導性制御性ヒトＴ細胞を得ることができる。

　一実施形態において、各工程で使用する培地にはさらにレチノイン酸および／またはアスコルビン酸を含んでいてもよい。好ましくは培地にはアスコルビン酸を含むことができる。一実施形態において、培地にはさらにＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及び／またはＣＤＫ８／１９阻害剤を含んでいてもよい。好ましくは培地にはＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及び／またはＣＤＫ８／１９阻害剤を含むことができる。

　本開示の一実施形態において、前記第一の基礎培地および前記第二の基礎培地は、それぞれ独立して、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、ＣＤＫ８／１９阻害剤、及びアスコルビン酸からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは全部の因子を含むこともできる。また他の実施形態において、前記第一の基礎培地および前記第二の基礎培地は、それぞれ独立して、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、ＣＤＫ８／１９阻害剤、及びアスコルビン酸を含むこともできる。これらの各成分として含まれる濃度としては、当該分野で使用される通常の濃度であることができる。一実施形態において、使用され得るＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及び／またはＣＤＫ８／１９阻害剤の濃度は、当該分野で使用され得る任意の適切な濃度であってよく、例えばＳｅｎｅｘｉｎＡを用いる場合には、約０．１μＭ以上、約０．５μＭ以上、約１μＭ以上、約２μＭ以上、約３μＭ以上、約４μＭ以上、約５μＭ以上、約６μＭ以上、約７μＭ以上、約８μＭ以上、約９μＭ以上、約１０μＭ以上、約１２μＭ以上、約１４μＭ以上、約１６μＭ以上、約１８μＭ以上、約２０μＭ以上などとすることができるが、これらの濃度に限られるものではなく、適宜当業者は他の培地組成に応じて変更することができる。

　一実施形態において、本開示の方法では、ヒトの末梢Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を製造する。末梢Ｔ細胞には、ナイーブ制御性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞などが含まれている。複数種類のＴ細胞を含む培養物から制御性Ｔ細胞を誘導しても、これらの細胞からＣＤ４陽性Ｔ細胞やＣＤ８陽性Ｔ細胞など特定の細胞を単離した上で制御性Ｔ細胞を誘導してもよい。また、特定の抗原に特異的なＴ細胞を単離した上で制御性Ｔ細胞を誘導してもよい。したがって、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性のもの、ＣＤ８陽性のものを包含する。なお、本明細書において「ＣＤ４陽性」あるいは「ＣＤ４＋」という場合、特に断りがなければＣＤ４陽性ＣＤ８陰性のシングルポジティブ細胞をいうものとする。また、本開示における製法においてはＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性のいずれかのＴ細胞を原料として使用することができ、誘導性制御性Ｔ細胞が生成した後も、特別な操作をしない限り、ＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性の特徴が維持されることができる。

　一実施形態において、本開示の方法において抗体は、培地へ添加しても、培養容器の内壁や、不溶性担体表面に固定化したものを用いてもよい。不溶性担体は、抗ＣＤ３抗体を物理的又は化学的に結合できる部材であって、水溶液に対して不溶なものを用いることができる。抗ＣＤ３抗体を物理的に吸着可能な素材として、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリプロピレンなどの合成樹脂やガラスなどがあげられる。不溶性担体の形状は特に限定されず、例えば、プレート形状やビーズ形状、容器形状などが採用できる。抗ＣＤ３抗体量は使用する抗体の力価や由来により変動するが、制御性Ｔ細胞の誘導のための十分な刺激を与えられるよう適宜設定すればよい。

　一実施形態において、本開示の方法では、細胞の培養には、動物細胞培養用基礎培地へ必要な因子を添加した培地を用いることができる。本開示の方法において用い得る動物細胞培養用基礎培地としては、例えば、Iscove's　modified　Eagle's　Medium培地、Ham's　F12培地、MEM　Zinc　Option培地、IMEM　Zinc　Option培地、IMDM培地、Medium　199培地、Eagle's　Minimum　Essential　Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco's　modified　Eagle's　Medium（DMEM）培地、RPMI1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地または一部組成を改変した培地などが包含される。

　基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。無血清培地には必要に応じて、例えば、アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、トランスフェリン、アポトランスフェリン、KnockOut　Serum　Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（Thermo　Fisher　Scientific）、Ｎ２サプリメント（Thermo　Fisher　Scientific）、Ｂ２７サプリメント（Thermo　Fisher　Scientific）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロール、モノチオグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよい。基礎培地にはまた、脂質（例えば、chemically　defined　lipid　concentrate）、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、GlutaMAX（Thermo　Fisher　Scientific）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ビタミン類（例えば、ニコチンアミド、アスコルビン酸）、増殖因子、抗生物質（例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシン）、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有しうる。

　１つの実施態様において、基礎培地としては血清およびHEPES（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic　acid）を含むＲＰＭＩ　１６４０培地が例示される。

　本開示の方法において、細胞の培養は一般的な動物細胞培養条件下で行えば良い。培養温度は、以下に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃である。培養は、好適にはＣＯ_２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ_２濃度は、好ましくは約２～５％である。

　本開示の方法において、抗ＣＤ３抗体は培地中にそのまま添加されても、あるいは培養容器の内壁や、不溶性担体表面に固定化したものを用いてもよい。抗ＣＤ３抗体量は使用する抗体の力価や由来により変動するが、制御性Ｔ細胞の誘導のための十分な刺激を与えられるよう適宜設定すればよい。

　使用されるＴＧＦβとしては、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３が例示され、例えばＴＧＦβ１である。ＴＧＦβの濃度は当業者が適宜定めれば良く特に限定されない。ＴＧＦβとしてＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３を用いる場合、培地中の濃度は特に限定されないが０．２５～２５ｎｇ／ｍＬ、例えば約１０ｎｇ／ｍＬとすればよい。

　使用される培地中のＩＬ－２の濃度は限定されないが、約５Ｕ／ｍＬ～約５００Ｕ／ｍＬ、例えば約１００Ｕ／ｍＬとすることができる。

　本開示において使用される培地には、さらにレチノイン酸および／またはアスコルビン酸を添加してもよい。好ましくは培地にはアスコルビン酸を含む。アスコルビン酸の濃度は限定されないが、約１～約１００μｇ／ｍＬ、例えば約１０μｇ／ｍＬである。

　本開示において使用される培地には、さらにＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及び／またはＣＤＫ８／１９阻害剤を添加してもよい。ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及び／またはＣＤＫ８／１９阻害剤としては任意のものを使用することができるが、例えば、4-[1-(2-メチル-1H-ベンゾイミダゾール-5-イル)-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-2-イル]-1,2,5-オキサジアゾール-3-アミン、3-{1-[1-(4-メトキシフェニル)ピペリジン-4-イル]-4-メチル-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-2-イル}ピラジン-2-アミン又はそれらの塩、水和物、溶媒和物等、または米国特許第8598344、WO2013/001310、WO2013/040153、WO2013/116786、WO2014/029726、WO2014/063778、WO2014/072435、WO2014/090692、WO2014/106606、WO2014/123900、WO2014/154723、WO2014/194245、WO2015/049325、WO2015/100420、WO2015/144290、WO2015/159937、WO2015/159938、WO2016/009076、またはWO2018/139660などに記載される化合物などが挙げられる。一つの例としては、ＳｅｎｅｘｉｎＡまたはＡＳ２８６３６１９が例示されるが、本開示はこれに限定されない。使用され得るＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及び／またはＣＤＫ８／１９阻害剤の濃度は、当該分野で使用され得る任意の適切な濃度であってよく、上記文献に記載される任意の適切な濃度であってもよく、適宜当業者は他の培地組成に応じて変更することができる。

　本開示の方法においては、ヒト末梢Ｔ細胞を、ＴＧＦβおよびＩＬ－２を含む培地で抗ＣＤ３抗体刺激することによって、制御性Ｔ細胞を誘導し、また抗ＣＤ３抗体を含まないＩＬ－２含有培地で休眠培養実施後に再度抗ＣＤ３抗体で刺激することで、高い免疫抑制機能を有する制御性Ｔ細胞を誘導することができる。得られた誘導性制御性Ｔ細胞が、高い免疫抑制機能を持つことは、例えばＲＮＡシーケンス法による網羅的遺伝子発現解析、インビトロにおける細胞増殖抑制試験により確認することができる。

　本開示の一実施形態において、（ａ）末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、第一の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程での培養日数は、当業者が適宜設定することができ、特に限定されるものではないが、例えば約３日とすることもできる。

　また一実施形態において、工程（ｂ）の休眠培養工程での培養日数は、当業者が適宜設定することができ、特に限定されるものではないが、例えば約２日とすることもできる。

　また一実施形態において、工程（ｃ）の第二の基礎培地における培養工程での培養日数は、当業者が適宜設定することができ、特に限定されるものではないが、例えば約３日とすることもできる。

　また一実施形態において、工程（ｄ）の休眠培養工程での培養日数は、当業者が適宜設定することができ、特に限定されるものではないが、例えば約２日とすることもできる。一実施形態において、ＩＬ－２の存在下で、無刺激状態で培養することによって、誘導された制御性Ｔ細胞特異的脱メチル化状態を有する制御性Ｔ細胞を増殖させることができる。培地がアスコルビン酸をさらに含んでいてもよいこと、またさらにＩＬ－２を含む培地で培養することによって誘導された制御性Ｔ細胞の安定した制御性Ｔ細胞培養物を得ることができる。

　得られた制御性Ｔ細胞を含む細胞培養物から制御性Ｔ細胞を単離するには、制御性Ｔ細胞に特有な細胞表面マーカーに基づいて常套方法により細胞を単離すればよく、例えばセルソーターによりＦｏｘＰ３陽性分画を取り出せばよい。また、所望により特定の抗原特性を有する制御性Ｔ細胞を単離してもよい。

　本開示の方法によって得られる誘導性制御性Ｔ細胞は、ヒトの炎症性疾患、例えば自己免疫疾患やアレルギーの治療に用いることが期待される。

（フローサイトメトリーによる陽性率測定）
　一実施形態において、フローサイトメトリーによる陽性率測定は以下のようにして行うことができる。

準備
・Fixation/Permeabilization　Concentrate（以下、Buffer）（eBio　Science、00-5123-43）
・Fixation/Permeabilization　Diluent（以下、Diluent）（eBio　Science、00-5223-56）
・Permeabilization　Buffer（10×）（eBio　Science、00-833-56）
・FOXP3　Monoclonal　Antibody　(236A/E7),　PE（以下、抗FOXP3抗体）（eBio　Science、12-4777-42）
・Mouse　IgG1　kappa　Isotype　Control　(P3.6.2.8.1),　PE（以下、PEコントロール）（eBio　Science）
・BV421,Mouse,Anti-Human,CD152（以下、抗CTLA4抗体）（BD）
・BV421　Mouse　IgG2a,　k　Isotype　Control（以下、BV421コントロール）（BD）
・CD4　Monoclonal　Antibody　(RPA-T4),　APC (以下、抗CD4抗体)（eBio　Science）
・Mouse　IgG1　kappa　Isotype　Control　(P3.6.2.8.1),　APC（以下、APCコントロール）（eBio　Science）
・D-PBS（ナカライテスク、14249-95）
・FBS（HyClone、SH30084.03）
・0.5　mol/l-EDTA溶液（pH　8.0）（ナカライテスク、06894-14）
・MilliQ水
・遠心機
・安全キャビネット
・マイクロピペット（P200、P1000）
・5mLポリスチレン　ラウンド・チューブ（以下、専用チューブ）（Falcon、352008）
・ナイロンメッシュ（65μm）（共進理工、PP-65N）

試薬調製
※Fixation　Buffer（1サンプル当たり100μL使用）
　BufferとDiluentを1：3の割合で混合する。
※Perm　Buffer
　Permeabilization　Buffer（10×）をMilliQ水で10倍希釈する。
※FACS　Bufer（500mL調製の場合）
D-PBS　　　　　　　　　489mL
FBS　　　　　　　　　　10mL（終濃度2%）
0.5mol/l　EDTA溶液　　　1mL（終濃度1mM）
以上の試薬は調製後、4℃または氷上で保管する。

方法
（１）1.5mLチューブにFACS　Buferを500μL添加する。
（２）（１）のチューブに1x10⁶個の最終製品を添加し、マイクロピペットでやさしく懸濁する。
（３）遠心機で500×g、4℃、5分間遠心する。
（４）上清をアスピレーターで除去後、Fixation　Bufferを100μL添加しやさしくピペッティングする。→泡立てないように注意する。
（５）氷上遮光で30分以上静置により固定する。→45分でもよい。
（６）固定後、チューブにPerm　Bufferを1mL添加しやさしくピペッティングする。
（７）新しい1.5mLチューブをサンプル数分準備する。
（８）サンプルをコントロール用と抗体染色用に500μLずつ分注する。
（９）遠心機で500×g、4℃、5分間遠心する。
（１０）遠心中に抗FOXP3抗体（原液濃度＝0.05mg/ml）、抗CTLA4抗体（Lot:0030269原液濃度＝0.2mg/ml）抗CD4抗体（原液濃度＝0.1mg/ml）をPerm　Bufferで100倍希釈で調製する（以下、抗体調製液）。コントロールサンプル用に、PEコントロール（原液濃度＝0.1mg/ml）、BV421コントロール（原液濃度＝0.2mg/ml）APCコントロール（原液濃度＝0.1mg/ml）を対応する色素の抗体と同濃度で調整する（以下コントロール液）
＊工程内管理試験においてはCTLA4の染色は実施しない。
（１１）上清をアスピレーターで除去後、抗体染色サンプルに抗体調製液を、コントロールサンプルにコントロール液をそれぞれ100μL添加しやさしくピペッティングする。→泡立てないように注意する。
（１２）氷上遮光で60分静置により固定する。
（１３）染色中に測定機器の立ち上げを実施する。
（１４）染色後、FACS　Buferを1mL添加しやさしくピペッティングする。
（１５）遠心機で500×g、4℃、5分間遠心する。→上清をアスピレーターで除去後、（１４）及び（１５）をもう一度繰り返して洗浄する。
（１６）上清をアスピレーターで除去後、FACS　Buferを500μL添加しやさしくピペッティングする。
（１７）専用チューブにナイロンメッシュをピンセットで載せ、懸濁液をフィルトレーションする。
（１８）任意のフローサイトメーター機器で解析する。データ回収細胞数は１００００個以上とする。標的抗原陽性率算出においては、コントロールサンプルの陽性率が５％以下となるように基準線を引き、基準以上の抗原発現量を示す細胞の割合を陽性率とする。

備考
・固定及び染色で使用する試薬類は「Foxp3/Transcription　Factor　Staining　Buffer　Set」（Cat.：00-5523）として3本セットでの購入も可能である。
・機器の設定等は一般的・科学的見地から明確に正常な測定を実施できていないと判断できる程度に逸脱していない限りにおいて、任意の設定で問題無い。明確な逸脱とは対象となる細胞集団の各種シグナルが設定された蛍光threshold値を下回る場合、コントロールサンプルまたは測定対象サンプルの各種シグナル値が機器で正常に測定できる限界値を下回る、または上回る場合、などである。

（免疫抑制活性測定）
　本開示の細胞は、免疫抑制活性を有し得る。免疫抑制活性は、種々の手法で測定することができる。

　一実施形態において、実施例に記載されるように、レスポンダーＴ細胞が起こす免疫反応による細胞増殖を測定することで抑制されるかを判定することができる。このほか、種々のキットを用いることができ、Ｔｒｅｇ免疫抑制アッセイ(horizon　discovery；https://www.horizondiscoverykk.com/products/research-services/immune-cell-based-assay/immune-suppression-assays/#Treg）などを用いることができるがこれに限定されない。本開示の細胞が有する免疫抑制活性は、従来のｉＴｒｅｇよりも増強されていてもよい。

　（一般技術）
　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ　Ｅｄ．（２００１）；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８９）．　Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．　（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｗｉｌｅｙ，　ａｎｄ　ａｎｎｕａｌ　ｕｐｄａｔｅｓ；　Ｓｎｉｎｓｋｙ，　Ｊ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）．　ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。

　人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えばＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）などの遺伝子合成やフラグメント合成サービスを用いることもでき、その他、例えば、Ｇａｉｔ，　Ｍ．Ｊ．（１９８５）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｇａｉｔ，　Ｍ．Ｊ．（１９９０）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，　Ｆ．（１９９１）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｄａｍｓ，　Ｒ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）．　Ｔ　ｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，　Ｃｈａｐｍａｎ　＆　Ｈａｌｌ；　Ｓｈａｂａｒｏｖａ，　Ｚ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；　Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，　Ｇ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，　Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。

　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

　以下の実施例において、グルタミン不含RPMI1640（10%　FCS　(v/v),　60　μg/mL　penicillin　G,　100　μg/mL　streptomycin,　10　mM　HEPESを含有）を基礎培地として用いた。必要に応じて30~300mg/LのL-グルタミンを培地に添加して使用した。

バイサルファイトシーケンス
　誘導された細胞よりゲノムDNAを取得し、MethylEasy　Xceed　Rapid　DNA　Bisulphite　Modification　Kit　(Human　Genetic　Signatures)を用いて処理後、制御性T細胞に特徴的な遺伝子の脱メチル化について、調べた。各遺伝子の脱メチル化の解析は、既知の方法およびプライマーを用いた(Floess　et　al.(2007)　PloS　Biology　Volume　5,　Issue　2,　e38、およびOhkura　et　al.(2012)　Immunity　37(5)　785-799)。

　また、ヒトFoxp3　CNS2領域の解析においてはフォワード側に5'-TTGGGTTAAGTTTGTTGTAGGATAG-3'（配列番号1）、リバース側に5'-ATCTAAACCCTATTATCACAACCCC-3'（配列番号2）を用いた。

各Ｔ細胞の画分の取得
　ヒトCD4　+T細胞を健常人のPBMCより単離した。濃縮したPBMCから、CliniMACS　CD4　GMP　MicroBeadsを用いて製品プロトコルに従い精製した。

（実施例１：ＣＤ４陽性ヒト末梢Ｔ細胞からの制御性Ｔ細胞の製造）
　ＣＤ４陽性Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ濃度の抗体をウェル当たり１００μＬ添加し、室温で６０分間静置することで容器へ固相化）、ｈＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）、ｈＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（１μＭ）、ＳｅｎｅｘｉｎＡ（５μＭ）を含む基礎培地で３日間刺激した。その後ｈＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）を含む基礎培地で２日間休眠培養した。２日後に同様に培地交換し、さらに２日間休眠培養した。２日後に再度抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ濃度の抗体をウェル当たり１００μＬ添加し、室温で６０分間静置することで容器へ固相化）、ｈＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）、ｈ　ＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（１μＭ）、ＳｅｎｅｘｉｎＡ（５μＭ）、アスコルビン酸（１０μｇ／ｍｌ）を含む基礎培地で２日間刺激した。その後ｈＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）を含む基礎培地で２日間休眠培養した。２日後に同様に培地交換し、さらに２日間休眠培養した。２日後に得られた制御性Ｔ細胞のＦｏｘＰ３、ＣＴＬＡ４、Ｈｅｌｉｏｓの発現をフローサイトメトリー法により解析した（図１）。

　従来の誘導性制御性Ｔ細胞（conventional　iTreg）では機能的分子（例えば、この場合ＣＴＬＡ４）の発現が不十分であり、ＦｏｘＰ３誘導効率も低い。一方で内在性制御性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ）ではＣＴＬＡ４、ＦｏｘＰ３を発現しており、ｎＴｒｅｇマーカー分子として代表的なＨｅｌｉｏｓを発現している。本願の作成法で得られた高機能な誘導性制御性Ｔ細胞はＨｅｌｉｏｓ陰性であり、ＦｏｘＰ３およびＣＴＬＡ４を発現する細胞を多く含む集団であることが確認できる。Ｈｅｌｉｏｓは体内に内在する制御性Ｔ細胞のマーカーであり、Ｈｅｌｉｏｓが陰性であることは、誘導性制御性Ｔ細胞であることを示す。従来の方法で得られた誘導性制御性Ｔ細胞は、一例としてＣＴＬＡ４が陰性であることから、少なくともＣＴＬＡ４が陽性である点で、得られた誘導性制御性Ｔ細胞はｉｎ　ｖｉｔｒｏで新規に誘導された誘導性制御性Ｔ細胞であることが分かる。

　また、同じ実験系で培養した細胞の脱メチル化状態をバイサルファイトシーケンス法による確認した（図２）。本開示の作成法で得られた誘導性制御性Ｔ細胞はｎＴｒｅｇと類似した脱メチル化状態を示している。

　以上の実施例より得られた誘導性制御性Ｔ細胞は内在性ｎＴｒｅｇとは異なりｉｎ　ｖｉｔｒｏで新規に誘導された制御性Ｔ細胞でありながら、高い誘導効率、高いＣＴＬＡ４発現、ＦＯＸＰ３　ＣＮＳ２領域の脱メチル化を有する既存の誘導性制御性Ｔ細胞にない特徴を持つ細胞であることが示されている。

（実施例２：制御性Ｔ細胞のＩｎ　ｖｉｔｒｏ抑制活性）
　実施例１と同じ実験系により制御性Ｔ細胞を得た。Cell　Trace　Violet標識したレスポンダーＴ細胞（５ｘ１０^４）、作製した制御性Ｔ細胞（５ｘ１０^４）を、Treg　Suppression　Inspector（Miltenyi　Biotec）（５μＬ／ｗｅｌｌ）存在下で３日間混合培養し、Cell　Trace　Violet強度をフローサイトメトリー法で解析した。レスポンダーＴ細胞が免疫反応を起こすと細胞増殖のためにCell　Trace　Violet強度は複数の弱いピークを示すが、この免疫反応が抑制されるとCell　Trace　Violet強度は単独の強いピークのまま保持される。本開示の作成法で得られた制御性Ｔ細胞は、レスポンダーＴ細胞の免疫反応を強く抑制することが確認された。したがって、得られた制御性Ｔ細胞は既存の制御性Ｔ細胞集団に比べて高い抑制機能を持つことが確認された（図３）。

（実施例３：制御性Ｔ細胞の網羅的遺伝子発現解析）
　実施例１の方法で作製した制御性Ｔ細胞の遺伝子発現パターンをＲＮＡシーケンス法により確認した（図４）。ＲＮＡシーケンスは既知の方法を用いて行った(Kitagawa　et　al.(2017)　Nat.　Immunol.　18,　173-183)。ＦＯＸＰ３、ＩＬ－２ＲＡ（ＣＤ２５）、およびＴｒｅｇの主要な抑制性分子（ＣＴＬＡ４など）の遺伝子は、既存の誘導性制御性Ｔ細胞および活性化Ｔｃｏｎｖ細胞に比較して、本開示の作製法で得られた誘導性制御性Ｔ細胞およびｎＴｒｅｇ細胞で高い発現が確認できた。また、誘導性制御性Ｔ細胞ではｎＴｒｅｇ細胞のマーカーであるＩＫＺＦ２の発現が低いことを確認した。本開示の作製法で得られた誘導性制御性Ｔ細胞は他の制御性Ｔ細胞集団と比較して、ＥＮＴＰＤ１、ＮＴ５Ｅ、ＡＲＥＧなどいくつかの抑制性分子発現が高いことが確認できる。また、ＩＴＧＡＥなどの接着分子、ＣＣＲ４などのケモカイン受容体発現が高いことが確認できる（図４）。

　例としてＩＴＧＡＥがコードするＣＤ１０３分子の発現をフローサイトメトリー法で解析すると、本願の作製法で得られた誘導性制御性Ｔ細胞は他の制御性Ｔ細胞集団と比較して、ＣＤ１０３発現が高いことが確認できる（図５）。総合的な考察として、本願の作製法で得られた誘導性制御性Ｔ細胞は既存の制御性Ｔ細胞と比較して、高い抑制能を発揮することが期待できる。

　（実施例４：ＣＤ８陽性ヒト末梢Ｔ細胞からの制御性Ｔ細胞の製造）
　ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ濃度の抗体をウェル当たり１００μＬ添加し、室温で６０分間静置することで容器へ固相化）、ｈＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）、ｈＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（１μＭ）、ＳｅｎｅｘｉｎＡ（５μＭ）を含む基礎培地で３日間刺激した。その後ｈＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）を含む基礎培地で２日間休眠培養した。２日後に同様に培地交換し、さらに２日間休眠培養した。２日後に再度抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ濃度の抗体をウェル当たり１００μＬ添加し、室温で６０分間静置することで容器へ固相化）、ｈＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）、ｈＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（１μＭ）、ＳｅｎｅｘｉｎＡ（５μＭ）、アスコルビン酸（１０μｇ／ｍｌ）を含む基礎培地で２日間刺激した。その後ｈＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）を含む基礎培地で２日間休眠培養した。２日後に同様に培地交換し、さらに２日間休眠培養した。２日後に得られた制御性Ｔ細胞のＦｏｘＰ３、ＣＴＬＡ４、Ｈｅｌｉｏｓの発現をフローサイトメトリー法により解析した（図６）。

　ＣＤ８陽性Ｔ細胞から作成した本開示の誘導性制御性Ｔ細胞についても、Ｈｅｌｉｏｓ陰性であり、ＦｏｘＰ３およびＣＴＬＡ４を発現する細胞を多く含む集団であることが確認できた。

　（実施例５：ヒト末梢Ｔ細胞からの誘導性制御性Ｔ細胞の製造）
　ヒト末梢Ｔ細胞を用いて、実施例１と同じようにして誘導性制御性Ｔ細胞またはその細胞集団を得る。この誘導性制御性Ｔ細胞またはその細胞集団と担体とを含む医薬を製造する。この医薬は誘導性制御性Ｔ細胞またはその細胞集団として約２ｘ１０^５個の細胞を含み、炎症疾患患者に投与してから１ヶ月後に回収した組織における炎症の程度から、有効性を確認することができる。

　（実施例６：製剤例）
　実施例１と同じようにして誘導性制御性Ｔ細胞またはその細胞集団を得る。この誘導性制御性Ｔ細胞またはその細胞集団を担体とを含む医薬を製造する。

　（実施例７：発現強度解析）
　実施例１で製造した誘導性制御性Ｔ細胞の細胞集団について、ＣＤ２５とＦＯＸＰ３の発現強度をＢＤ　ＦＡＣＳＬｙｒｉｃ　フローサイトメーターを用いたフローサイトメトリー法により解析した。結果を図７に示す。
　試験したすべての細胞において、ＦＯＸＰ３^Ｈｉの誘導性制御性Ｔ細胞の細胞集団が高い割合で存在していることが確認できた。

　（実施例８：誘導性制御性Ｔ細胞の抗体パネル解析）
　実施例１で製造した誘導性制御性Ｔ細胞における細胞表面マーカーを網羅的に解析するため、抗体パネル解析を行った。ＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＬＥＧＥＮＤＳｃｒｅｅｎ　Ｈｕｍａｎ　ＰＥ　Ｋｉｔを用いて、実施例１で製造した誘導性制御性Ｔ細胞を染色し、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞に反応する抗体をフローサイトメトリー法により解析した。結果の一部（明確かつ有意義な発現を確認できたもの）を表１～４に示す。
　４００種類弱を含む抗体パネルによって染色したところ、少なくとも１８５種類の表面マーカー分子によって本開示の誘導性制御性Ｔ細胞における細胞表面マーカーの陽性／陰性の特徴を確認することができた。

　（実施例９：誘導性制御性Ｔ細胞における細胞表面マーカー解析）
　実施例８で実施した抗体スクリーニングの結果のうち特徴的なものを図８に示す。
　本開示の誘導性制御性Ｔ細胞では、ＣＤ１７２ｇ及びＣＤ２６など特有の細胞表面マーカーが陽性となっていることがわかった。

　（注記）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０２１年１１月２４日に出願された特願２０２１－１９０１２７に対して優先権主張をするものであり、その内容はその全体があたかも本願の内容を構成するのと同様に参考として援用される。

　本開示の誘導性制御性Ｔ細胞および／または細胞集団は様々な免疫疾患、自己免疫病などの炎症性疾患の治療や予防のために用いることができる。また本開示の誘導性制御性Ｔ細胞および／または細胞集団を作製する方法により末梢Ｔ細胞から高い機能性を持つ制御性Ｔ細胞を安定に誘導することが可能となり、医療分野への応用が期待できる。

配列番号１：実施例において用いたフォワードプライマー
配列番号２：実施例において用いたリバースプライマー

Claims

　ＦｏｘＰ３陽性、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、ＡＲＥＧ陽性、ＣＤ１７２ｇ陽性、及びＣＤ２６陽性からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する誘導性制御性ヒトＴ細胞。
　ＮＴ５Ｅ陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞。
　ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞。
　ＡＲＥＧ陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞。
　ＣＤ１７２ｇ陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞。
　ＣＤ２６陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞。
　ＣＴＬＡ４陽性である誘導性制御性ヒトＴ細胞。
　少なくともＣＴＬＡ４陽性およびＦｏｘＰ３陽性である、請求項１～７のいずれか一項に記載の誘導性制御性ヒトＴ細胞。
　少なくともＣＤ１７２ｇ陽性および／またはＣＤ２６陽性である、請求項１～８のいずれか一項に記載の誘導性制御性ヒトＴ細胞。
　ＦＯＸＰ３遺伝子のＣＮＳ２部位が脱メチル化されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の誘導性制御性ヒトＴ細胞。
　ＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の誘導性制御性ヒトＴ細胞。
　ヒトの末梢血Ｔ細胞、またはヒト組織由来Ｔ細胞から得られるか、または誘導される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の誘導性制御性ヒトＴ細胞。
（ａ）ヒト末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、第一の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞を、第二の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、（ｄ）工程（ｃ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と
を含む方法によって得られる誘導性制御性ヒトＴ細胞。
　請求項１～１３のいずれか一項に記載の誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＦｏｘＰ３陽性、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、ＡＲＥＧ陽性、ＣＤ１７２ｇ陽性、及びＣＤ２６陽性からなる群より選択される少なくとも１つの特徴の割合が約５０％以上である、細胞集団。
　誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＮＴ５Ｅ陽性の割合が約５０％以上である、細胞集団。
　誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性の割合が約５０％以上である、細胞集団。
　誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＡＲＥＧ陽性の割合が約５０％以上である、細胞集団。
　誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＣＤ１７２ｇ陽性の割合が約５０％以上である、細胞集団。
　誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＣＤ２６陽性の割合が約５０％以上である、細胞集団。
　誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団であって、該細胞集団は、ＣＴＬＡ４陽性の割合が約５０％以上である、細胞集団。
　少なくとも前記ＣＴＬＡ４陽性およびＦｏｘＰ３陽性の割合が、それぞれ約５０％以上である、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の細胞集団。
　少なくとも前記ＣＤ１７２ｇ陽性および／またはＣＤ２６陽性の割合が、それぞれ約５０％以上である、請求項１４～２１のいずれか一項に記載の細胞集団。
　前記細胞集団における前記少なくとも１つ特徴の割合が約６０％以上である、請求項１４～２２のいずれか一項のいずれか一項に記載の細胞集団。
　前記細胞集団における前記少なくとも１つ特徴の割合が約８０％以上である、請求項１４～２３のいずれか一項に記載の細胞集団。
　ＦｏｘＰ３強陽性の割合が、約５０％以上である、請求項１４～２４のいずれか一項に記載の細胞集団。
　前記細胞集団の約９０％以上がＴ細胞である、請求項１４～２５のいずれか一項に記載の細胞集団。
　請求項１～１３のいずれか一項に記載の誘導性制御性ヒトＴ細胞または請求項１４～２６のいずれか一項に記載の細胞集団を含む医薬組成物。
　請求項１～１３のいずれか一項に記載の誘導性制御性ヒトＴ細胞または請求項１４～２６のいずれか一項に記載の細胞集団を含む再生医療用材料または製品。
　誘導性制御性ヒトＴ細胞を製造する方法であって、
（ａ）ヒト末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、第一の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞を、第二の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、（ｄ）工程（ｃ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と
を含む、方法。
　前記第一の基礎培地が、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、ＣＤＫ８／１９阻害剤、及びアスコルビン酸からなる群から選択される少なくとも１つの因子を含む、請求項２９に記載の方法。
　前記第一の基礎培地が、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、ＣＤＫ８／１９阻害剤、及びアスコルビン酸を含む、請求項２９または３０に記載の方法。
　前記第二の基礎培地が、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及びＣＤＫ８／１９阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの因子を含む、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。
　前記第二の基礎培地が、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及びＣＤＫ８／１９阻害剤を含む、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の方法。
　工程（ａ）が、前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、前記第一の基礎培地で約３日間刺激する、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の方法。
　工程（ｂ）が、工程（ａ）で得られた細胞を、前記ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約２日間休眠培養する、請求項２９～３４のいずれか一項に記載の方法。
　工程（ｃ）が、工程（ｂ）で得られた細胞を、前記第二の基礎培地で約３日間刺激する、請求項２９～３５のいずれか一項に記載の方法。
　工程（ｄ）が、工程（ｃ）で得られた細胞を、前記ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約２日間休眠培養する、請求項２９～３６のいずれか一項に記載の方法。
　請求項２９～３７のいずれか一項に記載の方法によって生成される、誘導性制御性ヒトＴ細胞または前記誘導性制御性ヒトＴ細胞を含む細胞集団。