[go: up one dir, main page]

WO2023068894A1 - 자연살해 세포의 면역 항암기능 증진을 위한 표면 개질용 고분자 화합물 - Google Patents

자연살해 세포의 면역 항암기능 증진을 위한 표면 개질용 고분자 화합물 Download PDF

Info

Publication number
WO2023068894A1
WO2023068894A1 PCT/KR2022/016204 KR2022016204W WO2023068894A1 WO 2023068894 A1 WO2023068894 A1 WO 2023068894A1 KR 2022016204 W KR2022016204 W KR 2022016204W WO 2023068894 A1 WO2023068894 A1 WO 2023068894A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
cells
natural killer
killer cells
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2022/016204
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김교범
김성준
마니가젠다이란
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Industry Academic Cooperation Foundation of Dongguk University
Original Assignee
Industry Academic Cooperation Foundation of Dongguk University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Industry Academic Cooperation Foundation of Dongguk University filed Critical Industry Academic Cooperation Foundation of Dongguk University
Publication of WO2023068894A1 publication Critical patent/WO2023068894A1/ko
Priority to US18/641,336 priority Critical patent/US20240366766A1/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G18/00—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates
    • C08G18/06—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen
    • C08G18/83—Chemically modified polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/15—Natural-killer [NK] cells; Natural-killer T [NKT] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G18/00—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates
    • C08G18/06—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen
    • C08G18/28—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen characterised by the compounds used containing active hydrogen
    • C08G18/30—Low-molecular-weight compounds
    • C08G18/38—Low-molecular-weight compounds having heteroatoms other than oxygen
    • C08G18/3855—Low-molecular-weight compounds having heteroatoms other than oxygen having sulfur
    • C08G18/3863—Low-molecular-weight compounds having heteroatoms other than oxygen having sulfur containing groups having sulfur atoms between two carbon atoms, the sulfur atoms being directly linked to carbon atoms or other sulfur atoms
    • C08G18/3865—Low-molecular-weight compounds having heteroatoms other than oxygen having sulfur containing groups having sulfur atoms between two carbon atoms, the sulfur atoms being directly linked to carbon atoms or other sulfur atoms containing groups having one sulfur atom between two carbon atoms
    • C08G18/3868—Low-molecular-weight compounds having heteroatoms other than oxygen having sulfur containing groups having sulfur atoms between two carbon atoms, the sulfur atoms being directly linked to carbon atoms or other sulfur atoms containing groups having one sulfur atom between two carbon atoms the sulfur atom belonging to a sulfide group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G18/00—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates
    • C08G18/06—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen
    • C08G18/83—Chemically modified polymers
    • C08G18/836—Chemically modified polymers by phosphorus containing compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G75/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing sulfur with or without nitrogen, oxygen, or carbon in the main chain of the macromolecule
    • C08G75/14—Polysulfides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G79/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing atoms other than silicon, sulfur, nitrogen, oxygen, and carbon with or without the latter elements in the main chain of the macromolecule
    • C08G79/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing atoms other than silicon, sulfur, nitrogen, oxygen, and carbon with or without the latter elements in the main chain of the macromolecule a linkage containing phosphorus
    • C08G79/04—Phosphorus linked to oxygen or to oxygen and carbon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L81/00—Compositions of macromolecular compounds obtained by reactions forming in the main chain of the macromolecule a linkage containing sulfur with or without nitrogen, oxygen or carbon only; Compositions of polysulfones; Compositions of derivatives of such polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L81/00—Compositions of macromolecular compounds obtained by reactions forming in the main chain of the macromolecule a linkage containing sulfur with or without nitrogen, oxygen or carbon only; Compositions of polysulfones; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L81/10—Polysulfonamides; Polysulfonimides

Definitions

  • the present invention synthesizes and manufactures a polymer compound that can be attached to the surface of natural killer cells to enhance the anticancer function of the cell, and injects the polymer compound into the body to enhance the recognition and killing effect of cancer cells, thereby preventing or treating cancer diseases. It is an invention related to a high molecular compound capable of dramatically improving effects.
  • Cell coating technology may be introduced as a method for enhancing the immune response and enhancing the activity of effector cells as described above, but it has the following limitations.
  • the layer-by-layer method is a simple and versatile deposition process that is widely applied to solve many problems such as biomolecule deposition, concentration, bioactivity, coating thickness and release rate.
  • cell surface modification is required, and for cell surface modification, cationic or anionic substrate materials are alternately reacted and laminated. there is.
  • coating material covering the entire surface of the cell there is a possibility of functional degradation of surface membrane proteins involved in signal transduction and cancer cell recognition.
  • cell surface coating is used for a single purpose, such as preventing cell aggregation, there are many cases in which a strategy for multifunctionality that can expect an appropriate anti-cancer immunotherapeutic effect is lacking.
  • the present inventors have completed the present invention by synthesizing a high molecular compound having an anticancer effect, which can prevent functional degradation of surface membrane proteins involved in signal transduction and cancer cell recognition even when the surface of natural killer cells is coated.
  • the technical problem to be achieved by the present invention is to enhance the anti-cancer functionality of natural killer cells through a single surface attachment process, and to reduce the function of cell signaling transmembrane proteins through partial adhesion to the surface of natural killer cells in the surface attachment process. It is an object of the present invention to provide a multifunctional polymer capable of maintaining the original function of natural killer cells and reducing side effects through a sensitive unmasking process according to reducing conditions of cancer cells or cancer tissue environments.
  • a polymer compound that recognizes natural killer cells and cancer cells includes a hydrophobic moiety that binds to natural killer cells; cancer cell recognition moiety; and a linker having the structure of Formula 1, wherein the hydrophobic moiety may be coupled to one end of the linker, and the cancer cell recognition moiety may be coupled to the other end of the linker.
  • n is an integer of 30 to 50.
  • a polymeric compound that recognizes natural killer cells and cancer cells may include a hydrophobic moiety and a cancer cell recognition moiety, wherein the hydrophobic moiety can bind to natural killer cells and recognize the cancer cells.
  • the moiety can recognize cancer cells and promote the death of cancer cells.
  • a polymer compound that recognizes natural killer cells and cancer cells may include a hydrophobic moiety that binds to natural killer cells, and the hydrophobic moiety that binds to natural killer cells has 12 to 12 carbon atoms.
  • phospholipids with 24 alkyl chains sterol-type lipids having 10 to 30 carbon atoms; 1,2-bis(diphenylphosphino)ethane (DPPE); and 1,2-bis(dimethylphosphino)ethane (DMPE).
  • DPPE 1,2-bis(diphenylphosphino)ethane
  • DMPE 1,2-bis(dimethylphosphino)ethane
  • the polymer compound that recognizes natural killer cells and cancer cells may include a cancer cell recognition moiety, and the cancer cell recognition moiety is folic acid, biotin, lactobionic acid ( phenylboronic acid) and phenylboronic acid (Phenylboronic acid) may be any one selected from the group consisting of.
  • a polymeric compound that recognizes natural killer cells and cancer cells may be coupled to a linker having the structure of Chemical Formula 1, wherein any one or more of a compound for preventing internalization of cells, a cationic amino acid, and a fluorescent dye compound may be bound. .
  • the compound for preventing cell internalization coupled to a linker comprising the structure of Formula 1 in a polymer compound that recognizes natural killer cells and cancer cells may include polyethylene glycol (PEG); polyethylene oxide (PEO); polyvinyl alcohol (PVA); And it may be at least one selected from the group consisting of copolymers thereof.
  • the cationic amino acids bonded to the linker including the structure of Formula 1 include arginine, lysine, and histidine. ) It may be one or more selected from the group consisting of.
  • a method for producing a polymer compound that recognizes natural killer cells and cancer cells is (a) binding a compound represented by Chemical Formula 2 to one end of a compound represented by Chemical Formula 1 below to obtain a compound represented by Chemical Formula 3 providing a compound;
  • n is an integer of 30 to 50
  • X is acetyl, trifluoroacetyl, t-butoxycarbonyl (BOC), benzyloxycarbonyl (CBZ), and 9-fluorenylmethyleneoxycarbonyl. It is one selected from carbonyl (Fmoc), p is a natural number of 12 to 20, and q is a natural number of 12 to 20.
  • the step of replacing X of the compound represented by Formula 1 with any one of a compound for preventing internalization of cells, a cationic amino acid, and a fluorescent dye compound can include more.
  • the cancer cell recognition moiety bound to the other end of the compound represented by Formula 3 is folic acid, biotin, It may be at least one selected from the group consisting of lactobionic acid (phenylboronic acid) and phenylboronic acid (Phenylboronic acid).
  • the compound for preventing cell internalization that can be bound to X of the compound represented by Formula 1 is polyethylene glycol (PEG); polyethylene oxide (PEO); polyvinyl alcohol (PVA); And it may be at least one selected from the group consisting of copolymers thereof.
  • the cationic amino acids that can be bound to X of the compound represented by Formula 1 include arginine, lysine, And it may be at least one selected from the group consisting of histidine.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer of the present invention includes a hydrophobic moiety that binds to natural killer cells; cancer cell recognition moiety; and a linker comprising the structure of Formula 1, wherein the hydrophobic moiety is bound to one end of Formula 1 and the cancer cell recognition moiety is bound to the other end of Formula 1, natural killer cells and cancer cells.
  • a polymeric compound that recognizes may be included as an active ingredient.
  • n is an integer of 30 to 50.
  • diseases in which the anticancer effect is achieved by a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing, as an active ingredient, a polymer compound that recognizes natural killer cells and cancer cells include prostate cancer, thyroid cancer, gastric cancer, Colorectal cancer, lung cancer, breast cancer, liver cancer, pancreatic cancer, testicular cancer, oral cancer, basal cell cancer, brain tumor, gallbladder cancer, biliary tract cancer, laryngeal cancer, retinoblastoma, ampulla of Vater cancer, bladder cancer, peritoneal cancer, adrenal cancer, non-small cell lung cancer, tongue cancer, small cell Lung cancer, small intestine cancer, meningioma, esophageal cancer, renal ureteral cancer, kidney cancer, malignant bone tumor, malignant soft tissue tumor, malignant pymphoma, malignant melanoma, eye tumor, urethral cancer, stomach cancer, urinary tract cancer, pharyngeal cancer, cervical cancer, endometrium It
  • the blood cancer means that hematopoietic organs such as bone marrow that produce blood necessary for our body, immune function that protects our body from infection, etc., and specifically, cancer leukemia, lymphoma, multiple myeloma, etc. can mean
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing a polymer compound that recognizes natural killer cells and cancer cells as an active ingredient may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent.
  • the cancer treatment method of the present invention may include administering to a subject a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing the natural killer cells and a polymer compound that recognizes cancer cells. .
  • the present invention relates to a polymer compound containing a hydrophobic moiety for binding to the surface of a natural killer cell and a cancer cell recognition moiety, and bearing various functional groups, wherein natural killer cells surface-modified with the polymer compound have cancer cell recognition ability. This increase can significantly increase cancer cell death by the release of lytic granule and cytokine.
  • the cancer cell recognition moiety is cleaved by glutathione released from cancer cells killed by the surface-modified natural killer cells, and the cancer cell recognition moiety continuously binds to the surface of the cancer cell, resulting in a synergistic effect of killing cancer cells.
  • the overall cancer cell killing effect can be significantly improved.
  • FIG. 1 is a view for explaining a method of enhancing the immuno-anticancer function of natural killer cells through the attachment of a polymer compound for surface modification of natural killer cells according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a photograph of natural killer cells coated with a solution in which the polymer compound is dissolved, labeled with a fluorescent labeling material, and observed under a fluorescence microscope.
  • Figure 3 is a graph showing the ratio of the fluorescence intensity of the actual coated coating material compared to natural killer cells.
  • Figure 4 is a graph confirming through flow cytometry that biopolymers attached to the cell membrane surface of natural killer cells can maintain their attachment function for up to 48 hours. Indicates when time has not elapsed after attaching to the cell membrane (0 hr), and the peak range shown second from the right represents the case when 6 hours have elapsed (6 hr), and the peak range shown third from the right represents the case where 12 hours have elapsed (12 hr), the 4th peak range from the rightmost represents the case where 24 hours have elapsed (24 hr), and the 5th peak range from the rightmost represents 48 hours The peak ranges of the elapsed case (48 hr) and uncoated natural killer cells (no coating) are shown.
  • the peak range means including the range of the left and right of the portion where the peak value appears on the graph.
  • the left side of FIG. 5 is a graph showing the viability of natural killer cells according to the coating material concentration, and the right side is a graph showing the viability of natural killer cells over time.
  • FIG. 6 is a graph showing that, after surface attachment of biopolymers, signal transduction receptors originally present on the cell membrane surface of natural killer cells maintain their original characteristics and normally bind and interact with corresponding ligand substances. .
  • FIG. 7 is a diagram showing that cancer cells are killed by breaking the chemical bond of cancer cell recognition enhancing ligand under cancer cell/cancer tissue microenvironmental conditions after the polymer is attached to the surface.
  • Fmoc-Asp Fmoc-protected aspartate
  • cystamine dihydrochloride Fmoc-PEDS intermediates
  • (A) is Fmoc-protected aspartate (Fmoc-Asp)
  • (B) is cystamine, dihydrochloride
  • (C) is a picture confirming the chemical structure of the synthesized Fmoc-PEDS intermediate by FTIR spectra.
  • FIG. 10 (A) is a picture confirming the chemical structure of the Fmoc-PEDS intermediate, (B) the DSPE lipid, and (C) the DSPE-Fmoc-PEDS conjugate by NMR spectra.
  • FIG. 11 (A) is a picture confirming the chemical structure of the Fmoc-PEDS intermediate, (B) the DSPE lipid, and (C) the DSPE-Fmoc-PEDS conjugate by FTIR spectra.
  • (A) is a picture confirming the chemical structure of succinoyl-DSPE-Fmoc-PEDS, (B) folic acid (FA), and (C) DSPE-PEDS-FA through NMR spectra.
  • (A) is a picture confirming the chemical structure of succinoyl-DSPE-Fmoc-PEDS, (B) folic acid (FA), and (C) DSPE-PEDS-FA through FT-IR spectra.
  • (A) is PEG 1k -COOH
  • (B) is Fmoc-arginine
  • (C) is 5CFL dye
  • (D) is NMR the chemical structure of the synthesized multifunctional lipid-PEDS 5CFL-Arg-PEG1k -FA This is a picture confirmed by spectra.
  • A is DSPE-PEDS-FA
  • B is PEG 1k -COOH
  • C is Fmoc-arginine
  • D is 5CFL dye
  • E is synthesized multifunctional lipid-PEDS 5CFL- This is a picture confirming the chemical structure of Arg-PEG1k -FA by FT-IR spectra.
  • Example 20 is a graph showing the results of specific cell lysis in NK-92mi cells cultured according to the method of Example 1 above.
  • the x-axis represents the ratio of effector cells and target cells, and the y-axis represents the ratio of cell degradation and death.
  • 21 is a graph showing the specific cell lysis results of NK-92mi cells cultured according to the method of Example 2 above.
  • the x-axis represents the ratio of effector cells and target cells, and the y-axis represents the ratio of cell degradation and death.
  • MCF-7 breast cancer cells MDA-MB-231 breast cancer cells
  • MIA PaCa-2 pancreatic cancer cells human fibroblast cells
  • FIG. 23 is a schematic diagram showing an experimental process for preparing a structure that mimics a coated natural killer cell in which a natural killer cell coating material is anchored through a hydrophobic interaction and confirming the effect of killing cancer cells through antifolic acid-mediated using the structure am.
  • 24 is a schematic diagram showing an experimental process for confirming the cancer cell killing effect in the body of coated natural killer cells.
  • 25A is a photograph of hematoxylin and eosin (H&E) staining of tumor tissues harvested from MDA MB-231 xenograft mice, where T represents a tumor tissue area and N represents a necrotic area.
  • white arrows indicate expanded eosinophilic cell types
  • white triangles indicate cell types with enriched nuclei
  • black arrows indicate cell types with lysed nuclei
  • B is a hematoxylin and eosin (H&E) staining image of the entire tumor mass.
  • C is a photo showing the expression level of cleaved caspase3 as a cell death marker , and the aggregated form shown in the square represents the cell portion in which cleaved caspase 3 is expressed
  • D is a graph quantifying caspase 3 positive cells cleaved in tumor tissue and cleaved caspase 3 positive cells in the coated NK cell group The ratio of was found to be significantly higher than all other groups, up to 26%
  • E is a photograph of proliferating tumor cell parts identified with the proliferation marker Ki67.
  • the aggregated form shown in the square is the part where tumor cells proliferated, and F A graph quantifying the tumor cell portion identified by the proliferation marker Ki67.
  • the proportion of proliferating tumor cells in the coated NK cell group was about 1/5 of that of the control group, and G was CD56 (human specific NK cell marker)-positive cells
  • the aggregated form shown in the square represents CD56 (human-specific NK cell marker)-positive cells
  • H represents the biodistribution of NK cells or coated NK cells in major organs and tumors, and the ratio of CD56-positive cells
  • the distribution of coated NK cells in the heart, kidney, liver, lung, and spleen was higher than that of the heart, kidney, liver, lung, and spleen, and the ratio of coated NK cells distributed in the tumor was higher than that of the NK cell group.
  • a reaction mixture was prepared by mixing 1 mmol of Fmoc-ASP, 2 mmol of EDC, and 3 mmol of NHS in 5 mL of anhydrous dimethylformamide (DMF) and stirring at 25° C. for 3 hours.
  • DMF dimethylformamide
  • Fmoc-PEDS Fmoc-poly (ethylene aspartamido disulfide) intermediates were synthesized.
  • the molecular weight of the synthesized 334 mg of the Fmoc-PEDS intermediate was measured using a GPC instrument (Agilent GPC system) equipped with a GPC column (Styragel) using poly(methyl methacrylate) as a GPC (gel permeation chromatography) standard.
  • (A) is Fmoc-protected aspartate (Fmoc-Asp)
  • (B) is cystamine, dihydrochloride
  • (C) is the result of confirming the chemical structure of the synthesized Fmoc-PEDS intermediate by FTIR spectra.
  • the degree of polymerization (DP) was calculated by the following formula.
  • reaction mixture was precipitated in 100 mL of diethyl ether at -20 °C and vacuum dried at -80 °C to synthesize 100 mg of DSPE-Fmoc-PEDS conjugate (including 4.90 ⁇ mol of terminal amine groups).
  • (A) is the Fmoc-PEDS intermediate
  • (B) is the DSPE lipid
  • (C) is the result of confirming the chemical structure of the DSPE-Fmoc-PEDS conjugate by NMR spectra.
  • (A) is the Fmoc-PEDS intermediate
  • (B) is the DSPE lipid
  • (C) is the result of confirming the chemical structure of the DSPE-Fmoc-PEDS conjugate by FTIR spectra.
  • a reaction mixture was prepared by dissolving 100 mg of DSPE-Fmoc-PEDS synthesized in Preparation Example 1-2 and 4.9 mg of succinic anhydride (49 ⁇ mol of succinic acid concentration) in 5 mL of anhydrous dimethylformamide.
  • the reaction mixture was stirred at a rate of 600 rpm for 24 hours at 25° C. with a stirring device (Corning, pC-620D) to prepare a reaction mixture.
  • the stirred reaction mixture was precipitated in 100 mL of diethyl ether at -20 ° C, 10 mL of distilled water (DW) was added, centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes (LABOGENE, 1580R), and unreacted succinic anhydride (C 4 H 4 O 3 ) was removed to prepare a reaction mixture.
  • DW distilled water
  • the reaction mixture from which the succinic anhydride (C 4 H 4 O 3 ) was removed was dialyzed (molecular cutoff: 2 kD) and lyophilized at 0° C. to obtain 100 mg of succinoyl-DSPE-Fmoc-PEDS conjugate (equivalent terminal carboxyl group concentration of 4.90). ⁇ mol) was prepared.
  • EDC EDC
  • NHS 100 mg of the prepared succinoyl-DSPE-Fmoc-PEDS conjugate (equivalent terminal carboxyl group concentration: 4.90 ⁇ mol) were mixed with anhydrous dimethyl
  • a solution was prepared by dissolving it in 5 mL of formamide, with the concentration of EDC adjusted to 1 mmol and the concentration of NHS adjusted to 1.5 mmol, and stirred at 25°C for 1 hour at 600 rpm with a stirring device (Corning, pC-620D).
  • a reaction mixture was prepared by stirring.
  • the synthesized lipid (DSPE)-PEDS-FA conjugate (lipid-PEDS-FA) was precipitated in 100 mL of diethyl ether at -20 ° C, centrifuged at 10,000 rpm for 15 minutes, and vacuum-dried at -80 ° C. , In order to remove impurities, it was dialyzed in distilled water (DW) (molecular cutoff: 2 kD) and lyophilized.
  • DW distilled water
  • (A) is succinoyl-lipid (DSPE) -Fmoc-PEDS
  • (B) is folic acid (FA)
  • (C) is a result of confirming the chemical structure of DSPE-lipid (PEDS) -FA through NMR spectra am.
  • (A) succinoyl-lipid (PEDS) -Fmoc-PEDS
  • (B) is folic acid (FA)
  • (C) is the chemical structure of lipid (PEDS) -PEDS-FA through FT-IR spectra This is the result of checking
  • the DSPE-PEDS-FA conjugate of Preparation Example 1-3 (the concentration of the grafted amine group in the polymer is 212 ⁇ mol) and 20 ⁇ L of triethylamine were mixed with the 5CFL solution, Fmoc-Arg solution, EDC and NHS in anhydrous dimethyl It was dissolved in a formamide solution, added to the stirred reaction mixture, and stirred at 25° C. for 48 hours to prepare a reaction mixture.
  • reaction mixture was precipitated in 100 mL of diethyl ether at -20 ° C. for 48 hours, dialyzed (molecular cutoff: 2 kD), and lyophilized to obtain 100 mg of 5CFL, PEG1k-NHS, and a compound in which Arginine and DSPE-PEDS-FA were combined ( DSPE-PEDS 5CFL-Arg-PEG1k -FA conjugate) was synthesized.
  • (A) is PEG 1k -COOH
  • (B) is Fmoc-arginine
  • (C) is 5CFL dye
  • (D) is NMR the chemical structure of the synthesized multifunctional lipid-PEDS 5CFL-Arg-PEG1k -FA This is the result confirmed by spectra.
  • A is DSPE-PEDS-FA
  • B is PEG 1k -COOH
  • C is Fmoc-arginine
  • D is 5CFL dye
  • E is synthesized multifunctional lipid-PEDS 5CFL- This is the result of confirming the chemical structure of Arg-PEG1k -FA by FT-IR spectra.
  • a DSPE-Fmoc-PEDS-Biotin conjugate was prepared in the same manner as in Preparation Example 1-3 using 100 mg of the DSPE-Fmoc-PEDS conjugate synthesized in Preparation Example 1-2, but the reaction was stirred with the DSPE-Fmoc-PEDS conjugate. 5 mL of 5.90 ⁇ mol folic acid in the mixture was replaced with 5 mL of 5.90 ⁇ mol biotin.
  • succinoyl-DSPE-Fmoc-PEDS-Biotin conjugate was confirmed by NMR (500 MHz FT-NMR spectrometer, Bruker, Germany) and FT-IR (Perkin Elmer FTIR Spectrum Two, PerkinElmer, USA) spectroscopy. .
  • FIG. 16 (a) is DSPE-PEDS-Biotin, (b) is 5-CFL, (c) is Fmoc-Arg, (d) is PEG1k, (e) is DSPE-PEDS 5CFL/Arg/PEG1k -Biotin It shows the result of confirming the chemical structure by NMR spectra.
  • FIG. 17 (a) is DSPE-PEDS-Biotin, (b) is 5-CFL, (c) is Fmoc-Arg, (d) is PEG1k, (e) is DSPE-PEDS 5CFL/Arg/PEG1k -Biotin The result of confirming the chemical structure by FT-IR spectra is shown.
  • NK-92mi cells were purchased from ATCC (American Type Culture Collection, USA) as natural killer cells that bind to the surface of cancer cells.
  • the NK-92mi cells were seeded at a concentration of 1 x 10 5 cells/mL in a T25 culture flask, and 12.5% of fetal bovine serum (FBS, Gibco) and 12.5% of horse serum (Gibco) were added. ), 1% penicillin-streptomycin solution (Corning, USA), 0.2 mM inositol (Sigma-Aldrich, USA), 0.1 mM ⁇ -mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) and 0.02 mM folic acid (Sigma-Aldrich) was cultured in 10 mL MEM ⁇ (Minimum Essential Medium Alpha, Gibco, USA) containing phosphorus. Cell culture was performed for 48 hours at 37°C, 5% CO, and 95% humidity conditions.
  • Breast cancer cell line MCF-7 (ATCC), breast cancer cell line MDA-MB-231 (ATCC), pancreatic cancer cell line MIA PaCa-2 (ATCC), and normal cell line human dermal Fibroblast (Lonza, USA) were also purchased from ATCC. .
  • the cells were cultured for 24 hours at 37°C, 5% CO, and 95% humidity in a culture medium containing 89% Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Corning), 1% penicillin-streptomycin solution, and 10% FBS (Corning).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • penicillin-streptomycin solution 1% penicillin-streptomycin solution
  • FBS FBS
  • the breast cancer cell line MCF-7 (ATCC) was seeded at a concentration of 5 x 10 4 cells/mL in a T25 culture flask, and the breast cancer cell line MDA-MB-231 (ATCC) was seeded in a T25 culture flask (T25 culture flask).
  • pancreatic cancer cell line MIA PaCa-2 (ATCC) was seeded at a concentration of 5 x 10 4 cells/mL in a T25 culture flask, and normal A cell line, human dermal Fibroblast (Lonza, USA) was seeded in a T25 culture flask at a concentration of 5 x 10 4 cells/mL and used for the experiment.
  • Example 1 Natural killer cells cultured under a coating component containing a DSPE-PEDS 5CFL-Arg-PEG1k -FA conjugate
  • Powder DSPE-PEDS 5CFL-Arg-PEG1k -FA prepared by the method of Preparation Example 1 was dissolved in ⁇ MEM medium in 10 mL ⁇ MEM medium containing 5 x 10 5 cells of NK-92mi cells cultured by the method of Preparation Example 3 100 ⁇ L of the prepared 2 mg/mL coating solution was mixed, and the NK-92mi cells were incubated at 25° C. for 30 minutes to obtain NK-92mi whose surface was coated with the DSPE-PEDS 5CFL-Arg-PEG1k -FA compound. Cells were prepared.
  • NK-92mi cells were washed twice with 1 mL of DPBS (dulbecco's phosphate buffered saline, Sigma-Aldrich).
  • DPBS dulbecco's phosphate buffered saline
  • Example 2 Natural killer cells cultured under a coating component containing DSPE-PEDS 5CFL-Arg-PEG1k -Biotin conjugate
  • a coating solution (2 mg/mL) of 0.5 mL was prepared by dissolving 1 mg of DSPE-PEDS 5CFL-Arg-PEG1k- Biotin prepared by the method of Preparation Example 2 in 0.5 mL of 100% ⁇ MEM.
  • NK-92mi cells (5 x 10 5 cells) were centrifuged to form a cell pellet, and 0.1 mL of the coating solution (2 mg/mL) was added to the cell pellet and incubated at 25° C. for 30 minutes Thus, NK-92mi cells whose surfaces were coated with the DSPE-PEDS 5CFL-Arg-PEG1k -Biotin compound were prepared.
  • NK-92mi cells were washed twice with 1 mL of DPBS (dulbecco's phosphate buffered saline, Sigma-Aldrich).
  • DPBS dulbecco's phosphate buffered saline
  • the surface-coated NK-92mi cells were labeled with 5-carboxyfluorescein, a fluorescent substance, and confirmed under a fluorescence microscope (Ti-E System, Nikon, Japan).
  • the coating efficiency of the DSPE-PEDS 5CFL-Arg-PEG1k -FA conjugate was treated on the surface of uncoated NK-92mi cells with coating solutions at concentrations of 0.5 mg/mL, 1 mg/mL, and 2 mg/mL, respectively. was confirmed through a cell analyzer (flow cytometry, (Beckman Coulter, USA)) to calculate an optimal coating concentration of 2 mg/mL.
  • Figure 3 shows the above results, and the left side shows that the coating efficiency of NK-92mi cells changes as the concentration of the coating solution is changed to 0.5 mg/mL, 1 mg/mL, and 2 mg/mL, respectively.
  • the concentration of the coating solution was 2 mg/mL
  • the fluorescence intensity was measured to be the highest, so it was confirmed that the coating efficiency was the best in the coating solution having the concentration of 2 mg/mL.
  • the surface-coated NK-92mi cells were incubated in a complete growth medium at 37°C.
  • Figure 4 shows that the above results coincide with the fluorescence signal of uncoated NK-92mi cells after 48 hours, so that the DSPE-PEDS 5CFL-Arg-PEG1k -FA conjugate is NK-92mi up to 48 hours after coating. It was confirmed that it exists on the cell surface.
  • MCF-7 breast cancer cells MDA-MB-231 breast cancer cells, MIA PaCa-2 pancreatic cancer cells, and normal control human fibroblasts (hFibroblast) were seeded at 10,000 cells per well in a 96-well plate and incubated at 37°C. It was incubated for 24 hours under % CO 2 and 95°C temperature conditions.
  • folic acid receptor FAR
  • 0.1 mL of folic acid (1 mM) was added to the cell medium at 37° C. for 2 hours.
  • NK-92mi cells were coated in the same manner as in Example 1 or Example 2, labeled with 10 ⁇ M CellTrackerTMBlue CMAC Dye (Invitrogen, USA) at 37° C. for 30 minutes, and washed twice with DPBS.
  • NK-92mi cells of Comparative Example 1 were labeled with 10 ⁇ M CellTrackerTMBlue CMAC Dye (Invitrogen, USA) at 37° C. for 30 minutes and washed twice with DPBS.
  • the ratio of the effector cells (NK-92mi cells (Comparative Example 1) or coated NK-92mi cells (Example 1 or 2)) to 10, target cells (MCF-7 breast cancer cells, MDA-MB-231 breast cancer cells) , MIA PaCa-2 pancreatic cancer cells and human fibroblasts respectively) at a ratio of 1 to effector cells to target cells (E: T) of 10: 1 and co-cultured at 37 ° C. for 30 minutes, unbound effector cells was collected. Unbound effector cells were then quantified using a standard curve based on the fluorescence intensity of labeled effector cells to calculate the remaining effector cell to target cell (E:T) ratio.
  • 18 is a graph showing the ratio of effector cells recognizing target cells to target cells
  • the coated NK-92mi cells target cells (MCF-7 breast cancer cells, MDA-MB-231 breast cancer cells or MIA PaCa-2 pancreatic cancer cells) showed the highest cancer cell recognition degree. , it was found that the cancer cell recognition ability of the coated natural killer cells was significantly improved by about 1.4 times compared to the uncoated natural cells.
  • NK-92mi cells Comparative Example 1 or coated NK-92mi cells (Example 1 or 2)
  • target cells MCF-7 breast cancer cells, MDA-MB-231 breast cancer cells, MIA PaCa-2 pancreatic cancer cells, and human fibroblasts, respectively
  • MCF-7 breast cancer cells
  • MDA-MB-231 breast cancer cells MDA-MB-231 breast cancer cells
  • MIA PaCa-2 pancreatic cancer cells MDA-MB-231 breast cancer cells
  • human fibroblasts respectively
  • Example 20 confirms the killing effect of cancer cell lines of NK-92mi cells cultured according to the methods of Example 1 and Comparative Example 1.
  • NK-92mi cells Comparative Example 1 or coated NK-92mi cells (Example 1 or 2)
  • target cells MCF-7 breast cancer cells, MDA-MB-231 breast cancer cells, MIA PaCa-2 pancreatic cancer cells, and human fibroblasts, respectively
  • MCF-7 breast cancer cells MDA-MB-231 breast cancer cells
  • MIA PaCa-2 pancreatic cancer cells MDA-MB-231 breast cancer cells
  • human fibroblasts respectively
  • Example 21 confirms the killing effect of cancer cell lines of NK-92mi cells cultured according to the methods of Example 2 and Comparative Example 1.
  • NK-92mi cells Comparative Example 1 or coated NK-92mi cells (Examples 1 or 2)
  • target cells MCF-7 breast cancer cells, MDA-MB-231 breast cancer cells
  • MIA PaCa-2 pancreatic cancer cells MIA PaCa-2 pancreatic cancer cells
  • human fibroblasts a ratio of 10:1 and incubated for 4 hours at 37°C, 5% CO 2 and 95% humidity, respectively, to MCF-7 breast cancer cells, MDA-MB
  • GSH glutathione
  • Triton x-100 is a positive control in which cancer cells are artificially destroyed to release glutathine (GSH) from the cancer cells.
  • MCF-7 breast cancer cells MDA-MB-231 breast cancer cells
  • MIA PaCa-2 pancreatic cancer cells human fibroblast cells
  • Example 1 a 2 mg/mL coating solution of Example 1 was applied to the lipid for 30 minutes to prepare a structure simulating the natural killer cell surface (FIG. 23).
  • MCF-7 breast cancer cells, MDA-MB-231 breast cancer cells, MIA PaCa-2 pancreatic cancer cells, and normal control human fibroblasts were seeded in a 24-well plate at 10,000 cells per well ( seeding) and incubated for 24 hours at 37°C 5% CO 2 and 95% humidity conditions.
  • the cell culture medium was replaced with a fresh cell culture medium containing 100 ⁇ M glutathione (Sigma-Aldrich, G6013), and the coated transwell was inserted into a plate in which cells were seeded and cultured, and incubated at 37° C. for 24 hours. .
  • the cells were separated by trypsinization, collected by centrifugation, lysed using a homogenizer, and transwelled using the Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) according to the manufacturer's protocol. We quantified the amount of DNA in target cells cultured in .
  • DSPE-PEDS 5CFL-Arg- of Preparation Example 1 of the present invention fixed to a gelatin-coated transwell in an environment treated with glutathione (GSH) compared to the case of only GSH or gelatin-coated It was confirmed that folic acid (FA) was dissociated by breaking the disulfide bond of the PEG1k -FA complex, and after dissociation, folic acid, a cancer cell recognition moiety, was converted to antifolate, which additionally induced cancer cell death.
  • GSH glutathione
  • NK-92mi cells In the process of preparing the surface-coated NK-92mi cells, NK-92mi cells in which the concentration of the coating solution was adjusted to 0.5 mg/mL and 1 mg/mL, respectively, were separately prepared.
  • NK-92mi cells adjusted for each prepared concentration (0.5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL) were washed three times with 1 mL of DPBS (dulbecco's phosphate buffered saline, Sigma-Aldrich). .
  • DPBS dulbecco's phosphate buffered saline
  • the viability of the surface-coated NK-92mi cells adjusted for each washing concentration was evaluated through WST-1 assay using EZ-Cytox (DoGenBio, Korea). UV absorbance was measured at 450 nm using an Infinite M200 micro-plate reader (Tecan, Zurich, Switzerland).
  • the graph on the left in FIG. 5 is the result of measuring the viability of surface-coated NK-92mi cells adjusted for each concentration through the WST-1 assay, compared to the control group without surface coating. As a result, there was little change in absorbance, indicating that coating the surface of NK-92mi cells with a solution containing up to 2 mg/mL of the DSPE-PEDS 5CFL-Arg-PEG1k -FA compound did not affect viability.
  • NK-92mi cells In the process of preparing the surface-coated NK-92mi cells, NK-92mi cells in which the concentration of the coating solution was adjusted to 0.5 mg/mL and 1 mg/mL, respectively, were separately prepared.
  • NK-92mi cells adjusted for each prepared concentration (0.5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL) were washed three times with 1 mL of DPBS (dulbecco's phosphate buffered saline, Sigma-Aldrich). .
  • DPBS dulbecco's phosphate buffered saline
  • Proliferation capacity was compared according to cell culture density during long-term cell culture. The proliferative capacity of each cell was confirmed by calculating the proliferation rate according to each passage through the number of cells obtained after the initial inoculated cell number and the end of culture, and the results are shown on the right side of FIG. 6 .
  • LPS lipopolysaccharide-dependent interferon gamma
  • the amount of interferon gamma secretion of NK-92mi cells was the same as that of coated NK-92mi cells, and in the lipopolysaccharide-treated experimental group, the amount of interferon gamma secretion of NK-92mi cells was higher than that of coated NK-92mi cells. It was confirmed that the amount of interferon gamma secretion was improved to the same level.
  • the xenograft model was prepared by subcutaneously inoculating 1x10 7 MDA-MB-231 cells into the left flank of 40 8-week-old nude (BALB/c nu/nu) mice (narabio, Korea).
  • Sorted control group or each injection group was inoculated with 250 ⁇ L of phosphate-buffered saline (PBS).
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the uncoated NK-92mi cell injection group was inoculated with 1x10 7 uncoated NK-92mi cells
  • the coated NK cell injection group was inoculated with 1x10 7 coated NK cells, respectively, intravenously.
  • the atezolizumab injection group was inoculated with atezolizumab (BioXCell, USA) by intraperitoneal injection at 10 mg/kg every 3 days.
  • control group was only inoculated with 250 ⁇ L of phosphate-buffered saline (PBS) during the above process, and no other inoculation was performed.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • mice per group (20 mice in total) were randomly selected, and tumor volume change, tumor growth inhibition ratio (TGI) change, weight change fold change and survival probability were analyzed as in the following experimental examples.
  • TGI tumor growth inhibition ratio
  • the experimental process for confirming the cancer cell killing effect in the body of the coated natural killer cells is schematically shown in FIG. 24A.
  • tumor growth was monitored for 14 days and the recorded value was divided by the initial value to calculate the tumor volume by the following formula.
  • Tumor volume 0.5 xaxb 2 (where a is the diameter of the longest tumor tissue and b is the diameter of the shortest tumor tissue)
  • the tumor volume of each mouse in the coated NK-92mi cell injection group was lower than that of other control or injection groups.
  • the average tumor volume of the uncoated NK-92mi cell injection group was suppressed compared to the control group, but the tumor continued to grow.
  • the group injected with coated NK-92mi cells a significant decrease in average tumor volume was observed from day 4 onwards.
  • the tumor volume after 14 days was 1/4 compared to the control group, and the tumor volume after 14 days was 1/2 compared to the Atezolizumab injection group. Therefore, it was confirmed that the cancer cell killing effect was remarkable.
  • TGI tumor growth inhibition ratio
  • the average tumor volume is an average value after calculating the tumor volume of each mouse with the tumor volume calculation formula of Experimental Example 10-1.
  • the tumor growth inhibition rate of the uncoated NK-92mi cell injection group was 10%, and the tumor growth inhibition rate of the coated NK-92mi cell injection group was 80%.
  • the tumor growth inhibition rate of the NK-92mi cell-injected group was 8 times higher than that of the uncoated NK-92mi cell-injected group, indicating a significant anticancer effect.
  • the atezolizumab injection group tumor suppression was significantly promoted when compared to the control group and the uncoated NK-92mi cell injection group, but compared to the coated NK-92mi cell injection group, 14 days At the time of this elapsed time, the tumor volume doubled, and the tumor growth inhibition rate was also 60% compared to the coated NK-92mi cell injection group, it was confirmed that the anticancer effect was relatively low.
  • mice in the control group and each injection group was monitored for 14 days.
  • the survival probability of the mice (10 mice in each group) classified into the above groups was monitored for 100 days.
  • the survival probability was calculated by the following formula.
  • the daily surviving population means the number of surviving individuals observed at a certain point in the day
  • the coated NK-92mi cell injection group had a survival probability of 80% at 100 days, the atezolizumab injection group had a survival rate of 60%, the control group and the uncoated
  • the NK-92mi cell injection group was 0%, and it was confirmed that the coated NK-92mi cell injection group had a remarkably excellent anticancer effect compared to the control group or other injection groups.
  • a xenograft mouse model was prepared in the same manner as in Experimental Example 10, and 5 mice per group (20 mice in total) were randomly selected and euthanized for histological analysis.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • specimen sections (5- ⁇ m thick) were stained with a fluorescent dye compound, and the slides were heated in 100 mL of 10 mM citrate buffer (pH 6.0) at 98° C. for 20 minutes and cooled at 25° C. for 20 minutes.
  • the sample was stained with CD56 (MAB24083; R&D Systems, USA; 1:200), cleaved caspase3 (9661, Cell Signaling Technology, USA; 1:200), Ki67 (ab16667, Abcam; 1:200), HMGB- 1 (ab18256, Abcam; 1:100), CD8a (14-0081-82, Invitrogen; 1:100), HLA (Class I ABC, ab70328, Abcam; 1:200), and von Willebrand factor (vWF, AB7356, Sigma-Aldrich; 1:200), and incubated at 4°C for 16 hours.
  • CD56 MAB24083; R&D Systems, USA; 1:200
  • Ki67 ab16667, Abcam; 1:200
  • HMGB- 1 ab18256, Abcam; 1:100
  • CD8a 14-0081-82, Invitrogen; 1:100
  • HLA Class I ABC, ab70328, Abcam; 1:200
  • vWF von Will
  • Fluorescence detection was performed using a confocal laser microscope (DMi8; Leica, Germany). Tumor and central necrotic areas were tracked on H&E images and measured using ImageJ software. The number of marker-positive cells was counted and specific marker-positive areas were measured in immunohistochemical images. Five regions of interest (ROIs; 200 x 200 ⁇ m) were randomly selected from a single staining slide (5 samples per group) of each sample (total of 25 ROIs per group).
  • ROIs regions of interest
  • T represents a tumor tissue region and N represents a necrotic region.
  • the tumor tissue showing necrotic forms such as eosinophilic cell expansion, nuclear fusion, and nuclear lysis were control and uncoated NK-92mi cells. Since much more was observed in the group injected with atezolizumab and coated NK-92mi cells than in the injected group, it was confirmed that the anticancer effect of the NK-92mi cell injected group was remarkable.
  • the cleaved caspase 3 is a protein that induces the death of cancer cells by apoptosis.
  • 25E and F show the degree of tumor cell proliferation using the proliferation marker Ki67. Extensive expression of Ki67 was observed in the control group, the atezolizumab injection group, and the uncoated NK-92mi cell injection group, but significantly lower expression was observed in the coated NK-92mi cell injection group.
  • the specimens of the group injected with coated NK-92mi cells expressed human-specific CD56. It was confirmed that the number of NK cells significantly increased, and through this, when NK cells were coated using the polymer compound of Example 1 of the present invention, compared to uncoated NK cells, the property of invading cancer cells was improved, and through this It was found to exhibit excellent cancer cell killing effect.
  • the CD56+cell ratio represents the relative ratio of human-specific CD56 expressed in all cells.
  • relative proportions of CD56 were observed in liver, lung and spleen, but not in heart and lung.
  • Natural killer cells are a sub-population of lymphocytes involved in non-phagocytic immunity. Natural killer cells can be obtained by various techniques known in the art, such as blood samples, cell component collection, and collection.
  • Characteristics and biological properties of natural killer cells include expression of surface antigens including CD16, CD56, and/or CD57; absence of alpha/beta or gamma/delta TCR complexes on the cell surface; the ability to bind to and kill cells that fail to express “self” MHC/HLA antigens by activation of specific cytolytic enzymes; the ability to kill tumor cells or other diseased cells that express NK activating receptor-ligands; ability to release cytokines that stimulate or inhibit the immune response; and the ability to undergo multiple cycles of cell division and produce daughter cells with similar biological properties to the parent cell.
  • the manufacturing method of the polymer compound and the pharmaceutical composition containing or utilizing the polymer compound, cancer disease prevention or It can be applied in the same or similar way to the treatment method.
  • the present invention relates to a hydrophobic moiety that binds to immune cells; cancer cell recognition moiety; and a linker having the structure of Chemical Formula 1 below.
  • the immune cells may be T cells, B cells, or natural killer cells, preferably natural killer cells, but are not limited thereto.
  • the polymer compound of the present disclosure includes a hydrophobic moiety that binds to natural killer cells; cancer cell recognition moiety; and a linker having a structure represented by Chemical Formula 1 below.
  • modification of the surface may mean binding of a hydrophobic moiety to the surface of natural killer cells.
  • the hydrophobic moiety may be bound to one end of Formula 1, and the cancer cell recognition moiety may be bound to the other end of Formula 1, wherein n may be an integer of 30 to 50.
  • the hydrophobic moiety may be connected or bonded to one end of Formula 1 through an amide bond, and the cancer cell recognition moiety may be connected or bonded to the other end of Formula 1 through an amide bond.
  • connection may mean that one end of Formula 1 is connected to a hydrophobic moiety, which means that one end of Formula 1 is directly connected to a hydrophobic moiety and one end of Formula 1 is connected to a hydrophobic moiety indirectly.
  • the indirect connection may mean that one end of Formula 1 and the hydrophobic moiety are connected through a linker or the like, and the bond may mean a chemical bond.
  • n is less than 30, there may be a problem in that the compound for preventing cell internalization, a cationic amino acid, or a fluorescent dye compound, which will be described below, is not sufficiently bound into the structural unit, and when it exceeds 50, the chain length is excessively long. There may be a problem in that the disulfide bonds in the unit become too large and the natural killer cells and cancer cells are not properly connected.
  • the disulfide bond cleavage may occur randomly within the n repeating units of Chemical Formula 1 to form fragments of various lengths. However, it was confirmed that the cancer cell recognition moiety coupled to the other end of Chemical Formula 1 had no effect on the cancer cell recognition and killing effect, and thus did not induce cytotoxicity.
  • the hydrophobic moiety can bind to natural killer cells, and the cancer cell recognition moiety can recognize cancer cells and promote the death of cancer cells.
  • one end of Chemical Formula 1 may be the CH 3 end of a repeating structural unit containing n disulfide bond structures, and the other end may be a repeating structure containing n disulfide bond structures. It may be the CH 3 terminal in a structure other than a unit.
  • a hydrophobic moiety may be bound to one end, and the cancer cell recognition moiety may be bound to the other end.
  • a hydrophobic moiety that binds to natural killer cells; cancer cell recognition moiety; And a polymer compound including a linker having the structure of Formula 1 was prepared (Preparation Example 1, Preparation Example 2), and the prepared polymer compound was coated on the surface of natural killer cells (Example 1 and Example 2).
  • Preparation Example 2 Improvement of cancer cell recognition ability of natural killer cells coated with the surface (Experimental Example 2), improvement of cancer cell killing ability of coated natural killer cells (Experimental Examples 3 to 6), cancer cell killing effect of coated natural killer cells (Experimental Example 10, Experimental Example 11) were confirmed.
  • Natural killer cells were cultured under a component containing the DSPE-PEDS 5CFL-Arg-PEG1k -FA conjugate, which is an example of the prepared polymer compound, and the DSPE-PEDS 5CFL-Arg-PEG1k -FA conjugate was bound to the surface. Killer cells were prepared.
  • the DSPE-PEDS 5CFL-Arg-PEG1k -FA conjugate of Preparation Example 1 When the coated natural killer cells and cancer cell lines were co-cultured, compared to the case where the uncoated natural killer cells were cultured together with the cancer cell line, there was a significant increase in the cell killing effect of the cancer cell line, and the DSPE- of Preparation Example 1 of the present invention As the number of natural killer cells coated with PEDS 5CFL-Arg-PEG1k -FA conjugate gradually increased and cultured with cancer cell lines, it was confirmed that the effect of promoting apoptosis of cancer cell lines increased more dramatically.
  • Natural killer cells are cultured under a component containing the DSPE-PEDS 5CFL-Arg-PEG1k -Biotin conjugate, which is an example of the prepared polymer compound, and the DSPE-PEDS 5CFL-Arg-PEG1k -Biotin conjugate is bound to the surface. Killer cells were prepared.
  • hydrophobic means a property that lacks affinity for water, and this property can mean that it can have a high affinity for a lipid of a biomolecule, and "moiety ( moiety)” may mean a part in one molecule having a function.
  • a hydrophobic moiety which is a component of a polymer compound, may refer to a part that specifically binds to a biomolecule while having the above hydrophobic property, and the lipid of the biomolecule ( It can have a high affinity for lipid) and can mean a part firmly attached to the surface of natural killer cells.
  • the hydrophobic moiety since the hydrophobic moiety has a hydrophobic property, it can be characterized in that it can bind or attach to the double membrane of a cell, and the hydrophobic moiety can be administered in vivo such as lipids, antibodies, hormones, drugs, etc. It may be configured through a low molecular weight material that may be, but is not necessarily limited thereto.
  • hydrophobic moiety herein may be bound or attached to the lipid bilayer of immune cells, and specifically to the lipid bilayer of natural killer cells.
  • the polymeric compound that recognizes natural killer cells and cancer cells may include a hydrophobic moiety that binds to natural killer cells, and the hydrophobic moiety that binds to natural killer cells has 12 carbon atoms.
  • phospholipids with ⁇ 24 alkyl chains sterol-type lipids having 10 to 30 carbon atoms; 1,2-bis(diphenylphosphino)ethane (DPPE); and 1,2-bis(dimethylphosphino)ethane (DMPE)
  • DPPE 1,2-bis(diphenylphosphino)ethane
  • DMPE 1,2-bis(dimethylphosphino)ethane
  • phospholipid having an alkyl chain having 12 to 24 carbon atoms preferably 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DSPE), dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), distearoylphosphatidylcholine (DSPC), 1,2-dioleoyl-sn -glycero-3-phosphocholine (DOPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC), dioleoyl-3-trimethylammonium propane (DOTAP), 1,2-distearoyl-3-trimethylammonium-propane chloride (DSTAP), etc.
  • DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • DOPC distearoylphosphatidylcholine
  • DOPC 1,2-dioleo
  • sterol lipid having 10 to 30 carbon atoms preferably cholesterol, cholesterol hexasuccinate, 3 ⁇ dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol, ergosterol, stigmasterol or lanosterol
  • Any biomolecule in the form of a lipid that can be fixed to a surface and dissolved in a non-polar solvent can be used without limitation.
  • the DSPE-PEDS 5CFL-Arg-PEG1k -Biotin conjugate is partially bound to the 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DSPE), and the DSPE It is a compound in which CH 2 is continuously bonded in the form of a hydrophobic chain to be anchored on the surface of actual natural killer cells.
  • DSPE 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • the hydrophobic moiety constituting the surface-modifying natural killer cell surface of the present invention is attached to the surface of the natural killer cell, and the cancer cell recognition moiety recognizes a receptor on the surface of the cancer cell, thereby reviving the surface of the coated natural killer cell. It is characterized by improving the ability to decompose or kill cancer cells.
  • the improvement in cancer cell recognition ability as described above is a mechanism in which the cell membrane structure of cancer cells is destroyed by the enzymatic action of natural killer cells, and glutathione (GSH) inside the cancer cells flows out of the cells to break the disulfide bond of the polymer compound. , which can be referred to as a sensitive unmasking process according to the reducing conditions of the cancer tissue environment.
  • the cancer cell recognition moiety attached to the end of the polymer compound binds to a receptor on the surface of the cancer cell to induce death of the cancer cell (Fig. 7(a), Fig. 7(b)).
  • the polymer compound that recognizes natural killer cells and cancer cells of the present invention hydrophobically binds to the cell membrane of natural killer cells through a hydrophobic moiety to coat the cell surface, and specifically recognizes cancer cells through a cancer cell recognition moiety. It is possible to increase the killing ability of cancer cells by killer cells.
  • cancer cell death due to cancer cell death, glutathione present in cancer cells is leaked, disulfide bonds of the polymer compound of the present invention are broken, and the cancer cell recognition moiety is converted to a form such as antifolate, thereby inhibiting DNA replication of cancer cells, thereby preventing additional cancer cells. can induce death.
  • Natural killer cells whose surface is modified with the polymer compound of the present invention have increased cancer cell recognition ability, which can significantly increase cancer cell death by release of lytic granules and cytokine, and release of glutathione inside cancer cells. As a result, the cancer cell recognition moiety is cleaved and cancer cell death can be further enhanced.
  • the polymeric compound that recognizes natural killer cells and cancer cells of the present invention may include a cancer cell recognition moiety, and the cancer cell recognition moiety is folic acid, biotin, lactobionic acid, and phenylboronic acid. It may be at least one selected from the group consisting of boronic acid, preferably folic acid or biotin.
  • the polymeric compound for recognizing natural killer cells and cancer cells of the present invention may bind to a linker having the structure of Formula 1 above, wherein any one or more of a compound for preventing internalization of cells, a cationic amino acid, and a fluorescent dye compound may be bound.
  • the cell internalization prevention compound is polyethylene glycol (polyethylene glycol, PEG); polyethylene oxide (PEO); polyvinyl alcohol (PVA); And it may be at least one selected from the group consisting of copolymers thereof.
  • the compound for preventing cell internalization may function to maintain attachment to the cell membrane surface without incorporating the polymeric compound that recognizes natural killer cells and cancer cells into natural killer cells.
  • the cationic amino acid bonded to the linker having the structure of Formula 1 is from the group consisting of arginine, lysine, and histidine. There may be one or more selected.
  • the cationic amino acid may function to induce access to natural killer cells through electrical interaction.
  • the fluorescent dye compound coupled to the linker comprising the structure of Formula 1 is used to diagnose target cells or cancer through fluorescence imaging when natural killer cells or cancer cells are recognized. Or it may enable detection.
  • the fluorescent dye compound is a fluorescent dye having rhodamine, coumarin, EvoBlue, oxazine, carbopyronine, naphthalene, biphenyl, anthracene, phenanthrene, pyrene or carbazole as a basic skeleton or a derivative of the fluorescent dye It may be, and any dye compound exhibiting fluorescent properties may be used without limitation.
  • the high molecular compound may be characterized in that it does not inhibit the viability and growth of natural killer cells even when bound to the surface of natural killer cells. Specifically, it was confirmed that coating the surface of natural killer cells with the polymer compound prepared in one embodiment of the present invention had no effect on the survival of natural killer cells. Despite coating the surface of natural killer cells up to mg / mL concentration, it was confirmed that there was no effect on the viability of natural killer cells, and it was confirmed that natural killer cells grew well up to 48 hours after coating at the above concentration ( Fig. 5).
  • the receptors for signal transduction originally present on the cell membrane surface of the natural killer cell maintain their original characteristics and can normally bind and interact with the corresponding ligand material.
  • LPS lipopolysaccharide
  • interferon- ⁇ IFN- ⁇
  • the method of preparing a polymer compound that recognizes natural killer cells and cancer cells of the present invention is (a) a compound represented by Chemical Formula 1 by binding a compound represented by Chemical Formula 2, which is a hydrophobic moiety, to one end of a compound represented by Chemical Formula 1 below, represented by Chemical Formula 3 providing a compound that is; (b) binding a cancer cell recognition moiety to the other terminal of the compound represented by Formula 3; preferably, but not limited thereto.
  • n may be an integer of 30 to 50
  • X is acetyl, trifluoroacetyl, t-butoxycarbonyl (BOC), benzyloxycarbonyl (CBZ) and 9-fluorenylmethyleneoxy It may be one selected from carbonyl (Fmoc), p is a natural number of 12 to 20, and q is a natural number of 12 to 20.
  • the length of the lipid attached to the natural killer cells of the polymer compound may be shortened, resulting in a decrease in the ability to attach to the natural killer cells. (Steric hindrance) is induced or micelles are formed before coating, which may cause problems in that coating efficiency is inhibited.
  • the method for preparing a polymer compound that recognizes natural killer cells and cancer cells may further include replacing X in Formula 1 with any one of a compound for preventing cell internalization, a cationic amino acid, and a fluorescent dye compound. there is.
  • the cancer cell recognition moiety bound to the other end of Formula 3 is folic acid, biotin, lactobionic acid ( phenylboronic acid) and phenylboronic acid (Phenylboronic acid) may be at least one selected from the group consisting of.
  • the compound for preventing cell internalization that can be bound to X in Formula 1 is polyethylene glycol (PEG); polyethylene oxide (PEO); polyvinyl alcohol (PVA); And it may be at least one selected from the group consisting of copolymers thereof.
  • the cationic amino acids capable of binding to X in Formula 1 are arginine, lysine, and histidine. ) It may be one or more selected from the group consisting of.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer of the present invention includes a hydrophobic moiety that binds to natural killer cells; cancer cell recognition moiety; and a linker comprising the structure of Formula 1, wherein the hydrophobic moiety is bound to one end of Formula 1 and the cancer cell recognition moiety is bound to the other end of Formula 1, natural killer cells and cancer cells.
  • a polymeric compound that recognizes may be included as an active ingredient.
  • n is an integer of 30 to 50.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising, as an active ingredient, a polymer compound that recognizes natural killer cells and cancer cells, is a pharmaceutical composition for prostate cancer, thyroid cancer, stomach cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, and liver cancer.
  • pancreatic cancer testicular cancer, oral cancer, basal cell cancer, brain tumor, gallbladder cancer, biliary tract cancer, larynx cancer, retinoblastoma, ampulla of Vater cancer, bladder cancer, peritoneal cancer, adrenal cancer, non-small cell lung cancer, tongue cancer, small cell lung cancer, small intestine cancer, meningioma, esophageal cancer , renal ureteral cancer, kidney cancer, malignant bone tumor, malignant soft tissue tumor, malignant lymphoma, malignant melanoma, eye tumor, urethral cancer, gastric cancer, hysteroma, pharynx cancer, cervical cancer, endometrial cancer, uterine sarcoma, metastatic brain tumor, Any one or more cancer diseases selected from the group consisting of rectal cancer, vaginal cancer, spinal cord tumor, salivary gland cancer, tonsil cancer, squamous cell cancer, hematological cancer and anal cancer can be prevented or treated.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing a polymer compound that recognizes natural killer cells and cancer cells as an active ingredient may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent.
  • compositions containing a pharmaceutically acceptable carrier may be in various oral or parenteral formulations. When formulated, it may be prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • the carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, It may be at least one selected from the group consisting of polyvinyl pyrrolidone, physiological saline, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil, dextrin, calcium carbonate, propylene glycol, and liquid paraffin. It is not limited, and all conventional carriers, excipients or diluents can be used.
  • the components may be added independently or in combination with the active ingredient, the polymer compound.
  • the pharmaceutical composition is any one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, internal solutions, emulsions, syrups, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. It can have one formulation.
  • a base for the suppository witepsol, macrogol, tween 60, cacao butter, laurin paper, glycerogeratin, and the like may be used.
  • the pharmaceutical composition may have any one dosage form selected from the group consisting of powders, granules, tablets, capsules, and liquid forms.
  • the present invention provides a hydrophobic moiety that binds to natural killer cells; cancer cell recognition moiety; and a linker comprising the structure of Chemical Formula 1, wherein the hydrophobic moiety is bound to one end of the linker and the cancer cell recognition moiety is bound to the other end of the linker.
  • a cancer disease treatment method comprising administering to a subject a pharmaceutical composition containing a polymer compound capable of recognizing killer cells and cancer cells.
  • n is an integer of 30 to 50.
  • the pharmaceutical composition containing the polymer compound may be administered orally, and may be a solid preparation or a liquid preparation.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations contain at least one excipient in the composition, for example, starch, calcium carbonate, sucrose ) or by mixing lactose and gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions for oral administration, emulsions, syrups, etc.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations, and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the administration dose is not particularly limited, and may vary depending on absorption in the body, body weight, patient's age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate, and severity of the disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in consideration of the effective amount range, and the unit dosage formulation formulated in this way can be administered according to the judgment of an expert who monitors or observes the administration of drugs as necessary and a specialized dosing method according to individual needs. It can be used or administered several times at regular time intervals.
  • the administration may preferably be administered once a day, or may be administered in several divided doses.
  • the subject means a subject in need of treatment of a disease, and more specifically, mammals (eg, dogs, cats, horses, rabbits, zoo animals, including non-human animals such as cows, pigs, and sheep, and non-human primates). refers to In certain embodiments, the subject herein is a human.
  • mammals eg, dogs, cats, horses, rabbits, zoo animals, including non-human animals such as cows, pigs, and sheep, and non-human primates.
  • the present invention relates to a polymeric compound that can be attached to the surface of natural killer cells and enhances the anticancer function of the cell and a method for preparing the same, wherein the polymeric compound is included in a pharmaceutical composition, thereby dramatically preventing or treating cancer diseases. It can be improved, so it has industrial applicability.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 자연살해 세포에 결합하는 소수성 모이어티; 암세포 인지 모이어티; 및 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 고분자 화합물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 링커의 일 말단에는 상기 소수성 모이어티가 결합되고, 상기 링커의 타 말단에 상기 암세포 인지 모이어티가 결합되어, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물 및 이의 제조방법에 관한 발명이다.

Description

자연살해 세포의 면역 항암기능 증진을 위한 표면 개질용 고분자 화합물
본 발명은 자연살해 세포의 표면에 부착되어 해당 세포의 항암 기능을 강화할 수 있는 고분자 화합물을 합성하고 제조하여, 이를 체내로 주입함으로써 암세포의 인식 및 사멸효과를 증진하고, 이를 통해 암질환 예방 또는 치료 효과를 획기적으로 향상시킬 수 있는 고분자 화합물에 관한 발명이다.
인터루킨(interleukin) 또는 인터페론(interferon)과 같은 사이토카인(cytokine) 단백질 제제의 투여를 통한 기존의 면역반응 증강 및 효과기 세포(effector cell)의 활성 유도 방법은 전신 면역독성(systemic immunotoxicity) 부작용이 발생할 가능성이 있다.
아울러, 암조직에서 분비되는 T 세포 활성 저하인자 등을 포함한 면역억제 미세환경 요인으로 인하여, T 세포가 도달하기 어려운 고형암에는 기존의 면역반응 증강 및 효과기 세포(effector cell)의 활성 유도 방법의 적용이 어려울 수 있다.
상기와 같은 면역반응 증강 및 효과기 세포(effector cell)의 활성을 강화하기 위한 방안으로 세포 코팅 기술이 도입될 수 있지만, 이는 하기와 한계가 존재한다.
상기 세포 코팅 기술로는 층상자기 조립법(layer-by-layer)이 활용될 수 있다. 상기 층상자기 조립법(layer-by-layer)은 생체분자 침착, 농도, 생물활성, 코팅 두께 및 방출 속도와 같은 많은 문제를 해결하기 위해 광범위하게 적용되는 간단하고 다용도의 침착 공정이다.
다만, 상기 층상자기 조립법(layer-by-layer)을 활용하기 위해서는 세포의 표면 개질이 필요하며, 세포의 표면 개질을 위해서는 양이온성 또는 음이온성 기질 물질을 번갈아 가며 반응시켜 적층해야 하는 공정상의 어려움이 있다. 또한 세포의 전체 표면에 대한 코팅물질의 뒤덮임으로 인해, 신호전달 및 암세포 인식에 관여하는 표면 막단백질의 기능저하 가능성이 있다. 이와 함께, 세포 응집 방지 등의 단일 목적으로 세포 표면 코팅이 활용되는 경우, 적절한 면역 항암 치료효과를 기대할 수 있는 다기능성에 대한 전략이 부족한 경우가 다수이다.
본 발명자들은 자연살해 세포의 표면을 코팅하더라도 신호전달 및 암세포 인식에 관여하는 표면 막단백질의 기능저하를 방지할 수 있으면서도 항암 효과가 있는 고분자 화합물을 합성하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 표면 부착 단일공정을 통한 자연살해 세포의 항암 기능성 강화가 가능하며, 표면 부착 공정에 있어 자연살해 세포 표면의 국소부위 부분적 부착을 통해 세포신호전달 막단백질의 기능감소를 방지할 수 있고, 암세포 또는 암조직 환경의 환원성 조건에 따른 감응형 언마스킹(unmasking) 과정을 통해 자연살해 세포의 원천기능 유지 및 부작용 감소가 가능한 다기능성 고분자를 제공함에 있다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예로써, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물은 자연살해 세포에 결합하는 소수성 모이어티; 암세포 인지 모이어티; 및 화학식 1의 구조를 포함하는 링커를 포함할 수 있고, 상기 링커의 일 말단에는 상기 소수성 모이어티가 결합될 수 있고, 상기 링커의 타 말단에 상기 암세포 인지 모이어티가 결합될 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022016204-appb-img-000001
여기에서, 상기 n은 30~50의 정수이다.
본 발명의 일 실시예로써, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물은 소수성 모이어티 및 암세포 인지 모이어티를 포함할 수 있으며, 상기 소수성 모이어티는 자연살해 세포와 결합할 수 있고, 상기 암세포 인지 모이어티는 암세포를 인지하여 암세포의 사멸을 촉진할 수 있다.
본 발명의 일 실시예로써, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물은 상기 자연살해 세포에 결합하는 소수성 모이어티를 포함할 수 있으며, 상기 자연살해 세포에 결합하는 소수성 모이어티는 탄소수가 12~24개인 알킬 사슬을 가지는 인지질; 탄소수가 10~30개인 스테롤류 지질; 1,2-bis(diphenylphosphino)ethane (DPPE); 및 1,2-bis(dimethylphosphino)ethane (DMPE) 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 실시예로써, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물은 암세포 인지 모이어티를 포함할 수 있으며, 상기 암세포 인지 모이어티는 엽산(folic acid), 바이오틴(biotin), 락토바이오닉산(phenylboronic acid) 및 페닐보론산(Phenylboronic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예로써, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물은 상기 화학식 1의 구조를 포함하는 링커에 세포 내재화 방지용 화합물, 양이온성 아미노산 및 형광염료 화합물 중 어느 하나 이상이 결합될 수 있다.
본 발명의 일 실시예로써, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물에서 상기 화학식 1의 구조를 포함하는 링커에 결합되는 상기 세포 내재화 방지용 화합물은 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG); 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide, PEO); 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol, PVA); 및 이들의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예로써, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물에서 상기 화학식 1의 구조를 포함하는 링커에 결합되는 상기 양이온성 아미노산은 아르기닌(arginine), 라이신(lysine), 및 히스티딘(histidine)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예로써, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물 제조방법은 (a) 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물의 일 말단에 화학식 2로 표시되는 화합물을 결합시켜 화학식 3으로 표시되는 화합물을 제공하는 단계; 및
(b) 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물의 타 말단에 암세포 인지 모이어티를 결합시키는 단계를 포함할 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022016204-appb-img-000002
[화학식 2]
Figure PCTKR2022016204-appb-img-000003
[화학식 3]
Figure PCTKR2022016204-appb-img-000004
여기서, 여기서, 상기 n은 30~50의 정수이고, 상기 X는 아세틸, 트리플루오로아세틸, t-부톡시카르보닐(BOC), 벤질옥시카르보닐(CBZ) 및 9-플루오레닐메틸렌옥시카르보닐(Fmoc) 중 선택되는 하나이고, p는 12~20인 자연수, q는 12~20인 자연수이다.
본 발명의 일 실시예로써, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물 제조방법에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 X를 세포 내재화 방지용 화합물, 양이온성 아미노산 및 형광염료 화합물 중 어느 하나로 치환하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예로써, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물 제조방법에서 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물의 타 말단에 결합되는 암세포 인지 모이어티는 엽산(folic acid), 바이오틴(biotin), 락토바이오닉산(phenylboronic acid) 및 페닐보론산(Phenylboronic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예로써, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물 제조방법에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 X에 결합될 수 있는 세포 내재화 방지용 화합물은 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG); 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide, PEO); 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol, PVA); 및 이들의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예로써, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물 제조방법에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 X에 결합될 수 있는 상기 양이온성 아미노산은 아르기닌(arginine), 라이신(lysine), 및 히스티딘(histidine)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예로써, 본 발명의 암예방 또는 암치료용 약학적 조성물은 자연살해 세포에 결합하는 소수성 모이어티; 암세포 인지 모이어티; 및 상기 화학식 1의 구조를 포함하는 링커를 포함하고, 상기 화학식 1의 일 말단에는 상기 소수성 모이어티가 결합되고, 상기 화학식 1의 타 말단에는 상기 암세포 인지 모이어티가 결합되는, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물을 유효 성분으로 포함할 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022016204-appb-img-000005
여기서, 상기 n은 30~50의 정수이다.
본 발명의 일 실시예로써, 상기 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물을 유효 성분으로 포함하는 암예방 또는 암치료용 약학적 조성물에 의해서 항암 효과가 달성되는 질환은 전립선암, 갑상선암, 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 간암, 췌장암, 고환암, 구강암, 기저세포암, 뇌종양, 담낭암, 담도암, 후두암, 망막세포종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부신암, 비소세포폐암, 설암, 소세포폐암, 소장암, 수막종, 식도암, 신우요관암, 신장암, 악성골종양, 악성연부조직종양, 악성핌프종, 악성흑색종, 안종양, 요도암, 위암, 욱종, 인두암, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전이성뇌종양, 직장암, 질암, 척수종양, 침샘암, 편도암, 편평상피세포암, 혈액암 및 항문암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 혈액암은 우리 몸에 필요한 혈액을 만드는 골수와 같은 조혈기관, 감염 등으로부터 우리 몸을 지켜주는 면역기능을 하는 것을 의마하고, 구체적으로 림프절, 림프기관에 생기는 암 백혈병, 림프종, 다발성 골수종 등을 의미할 수 있다.
본 발명의 일 실시예로써, 상기 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물을 유효 성분으로 포함하는 암예방 또는 암치료용 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예로써, 본 발명의 암질환 치료방법은 상기 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물을 포함하는 암예방 또는 암치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 자연살해 세포 표면결합을 위한 소수성 모이어티 및 암세포 인식 모이어티를 포함하며, 다양한 기능기를 담지한 형태의 고분자 화합물에 관한 것으로, 상기 고분자 화합물로 표면이 개질된 자연살해세포는 암세포 인지능력이 증가되어 용해성 과립(lytic granule) 및 사이토카인(cytokine)의 방출에 의한 암세포 사멸을 현저히 증가시킬 수 있다.
또한, 상기 표면이 개질된 자연살해세포에 의해서 사멸된 암세포에서 방출된 글루타치온에 의해서 암세포 인지 모이어티가 절단되고 상기 암세포 인지 모이어티가 암세포의 표면에 계속적으로 결합하고 있음으로써 암세포 사멸 효과가 상승적으로 작용하여 전체적으로 암세포 사멸 효능이 월등히 향상될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 자연살해 세포 표면 개질용 고분자 화합물의 부착을 통해 자연살해 세포의 면역항암 기능 증진의 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 해당 고분자 화합물이 녹아 있는 용액으로 코팅된 자연살해 세포를 형광표지 물질로 표지하고, 이를 형광 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 3은 자연살해세포 대비, 실제 코팅된 코팅물질의 형광강도를 비율로 나타낸 그래프이다.
도 4는 자연살해 세포의 세포막 표면에 부착된 생체 고분자가 최대 48시간까지 부착기능을 유지할 수 있음을 유세포 분석(flow cytometry)을 통해 확인한 그래프로, 가장 우측에 나타난 피크 범위는 생체 고분자를 자연살해 세포막에 부착시킨 후 시간이 경과되지 않았을 경우(0 hr)를 나타내며, 가장 우측에서 2번째에 나타난 피크 범위는 6시간이 경과된 경우(6 hr)를 나타내며, 가장 우측에서 3번째에 나타난 피크 범위는 12시간이 경과된 경우(12 hr)를 나타내며, 가장 우측에서 4번째에 나타난 피크 범위는 24시간이 경과된 경우(24 hr)를 나타내며, 가장 우측에서 5번째에 나타난 피크 범위는 48시간이 경과된 경우(48 hr)와 코팅되지 않은 자연살해 세포(no coating)의 피크 범위를 나타낸다. 여기에서 피크 범위는 그래프 상에서 피크 값이 나타난 부분의 좌우의 범위를 포함하는 것을 의미한다.
도 5의 좌측은 코팅 물질 농도에 따른 자연살해 세포의 생존능력을 나타낸 그래프이고, 우측은 시간의 경과에 따른 자연살해 세포의 생존능력을 나타낸 그래프이다.
도 6은 생체 고분자의 표면 부착이 이루어 진 후, 자연살해 세포의 세포막 표면에 원래 존재하는 신호전달용 수용체들이 그 원천특성을 유지하여 대응하는 리간드 물질과 정상적으로 결합 상호작용을 하고 있는 것으로 나타낸 그래프이다.
도 7은 고분자의 표면 부착이 이루어진 후, 암세포/암조직 미세환경 조건에서 암세포 인식 강화용 리간드의 화학결합이 끊어지면서 암세포를 사멸시키는 것을 나타낸 그림이다.
도 8은 Fmoc-protected aspartate (Fmoc-Asp), cystamine dihydrochloride, Fmoc-PEDS 중간체의 화학적 구조를 NMR spectra로 확인한 그림이다.
도 9에서 (A)는 Fmoc-protected aspartate (Fmoc-Asp), (B)는 cystamine, dihydrochloride, (C)는 합성된 Fmoc-PEDS 중간체의 화학적 구조를 FTIR spectra로 확인한 그림이다.
도 10에서 (A)는 Fmoc-PEDS 중간체, (B)는 DSPE 지질, (C)는 DSPE-Fmoc-PEDS 결합체의 화학적 구조를 NMR spectra로 확인한 그림이다.
도 11에서 (A)는 Fmoc-PEDS 중간체, (B)는 DSPE 지질, (C)는 DSPE-Fmoc-PEDS 결합체의 화학적 구조를 FTIR spectra로 확인한 그림이다.
도 12에서 (A)는 succinoyl-DSPE-Fmoc-PEDS, (B)는 folic acid (FA), (C)는 DSPE-PEDS-FA의 화학적 구조를 NMR spectra를 통해 확인한 그림이다.
도 13에서 (A)는 succinoyl-DSPE-Fmoc-PEDS, (B)는 folic acid (FA), (C)는 DSPE-PEDS-FA의 화학적 구조를 FT-IR spectra를 통해 확인한 그림이다.
도 14에서 (A)는 PEG1k-COOH, (B)는 Fmoc-arginine, (C)는 5CFL dye, (D)는 합성된 다관능성 lipid-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA의 화학적 구조를 NMR spectra로 확인한 그림이다.
도 15에서 (A)는 DSPE-PEDS-FA, (B)는 PEG1k-COOH, (C)는 Fmoc-arginine, (D)는 5CFL dye, (E)는 합성된 다관능성 lipid-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA의 화학적 구조를 FT-IR spectra로 확인한 그림이다.
도 16은 (a)는 DSPE-PEDS-Biotin, (b)는 5-CFL, (c)는 Fmoc-Arg, (d)는 PEG1k, (e)는 DSPE-PEDS5CFL/Arg/PEG1k-Biotin의 화학적 구조를 NMR spectra로 확인한 그림이다.
도 17은 (a)는 DSPE-PEDS-Biotin, (b)는 5-CFL, (c)는 Fmoc-Arg, (d)는 PEG1k, (e)는 DSPE-PEDS5CFL/Arg/PEG1k-Biotin의 화학적 구조를 FT-IR spectra로 확인한 그림이다.
도 18은 효과기 세포(NK-92mi 세포 또는 코팅된 NK-92mi 세포) 대 표적세포(target cell) 비율을 10:1로 했을 때, 표적세포에 부착된 효과기 세포의 비율(remaining E:T ratio)을 나타낸 그래프이다.
도 19는 상기 표적세포들의 DNA 양 정량화 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 상기 실시예 1의 방법에 따라 배양된 NK-92mi 세포를 통한 특이적 세포 용해 결과를 나타낸 그래프이다. x축은 효과기 세포 및 표적 세포 비율을 나타내고, y축은 세포 분해 및 사멸 비율을 나타낸다.
도 21은 상기 실시예 2의 방법에 따라 배양된 NK-92mi 세포를 통한 특이적 세포 용해 결과를 나타낸 그래프이다. x축은 효과기 세포 및 표적 세포 비율을 나타내고, y축은 세포 분해 및 사멸 비율을 나타낸다.
도 22는 각각의 표적세포(MCF-7 유방암 세포, MDA-MB-231 유방암 세포, MIA PaCa-2 췌장암 세포 또는 인간 섬유아세포)에서 흘러나온 글루타치온의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 23은 자연살해 세포 코팅 물질이 소수성 상호작용을 통해서 결합(anchor)된 코팅된 자연살해 세포를 모사하는 구조체를 제조하고 이를 사용해서 항엽산 매개를 통한 암세포 사멸 효과를 확인하는 실험과정을 나타낸 모식도이다.
도 24는 코팅된 자연살해 세포의 체내에서의 암세포 사멸효과 확인하기 위한 실험과정을 나타낸 모식도이다.
도 25의 A는 MDA MB-231 이종이식 마우스로부터 수확된 종양 조직의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 사진이며, 여기에서 T는 종양 조직 영역을 나타내고, N은 괴사 영역을 나타낸다. 여기에서 흰색 화살표는 호산구성 세포 팽창 형태, 흰색 삼각형은 핵이 농축된 세포 형태이고, 검은색 화살표는 핵이 용해된 세포 형태이고, B는 전체 종양 덩어리의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 이미지에서 괴사 영역을 정량화한 그래프이고 괴사 면적의 비율은 코팅된 NK 세포에서 최대 36%로 다른 그룹보다 유의하게 나타났고, C는 세포 사멸 마커로써 절단된 케스페이즈3(caspase3)의 발현 정도를 나타낸 사진이고 사각형 안에 나타난 응집된 형태는 절단된 케스페이즈3가 발현된 세포 부분을 나타내고, D는 종양 조직에서 절단된 카스파제3 양성 세포를 정량화한 그래프이고 코팅된 NK 세포군에서 절단된 케스페이즈3 양성 세포의 비율은 최대 26%로 다른 모든 그룹보다 유의하게 높은 것으로 나타났고, E는 증식한 종양 세포 부분을 증식 마커 Ki67로 확인한 사진으로 사각형 안에 나타난 응집된 형태가 종양 세포가 증식된 부분이고, F는 증식 마커 Ki67로 확인한 종양 세포 부분을 정량화한 그래프로 코팅된 NK 세포 그룹에서 증식하는 종양 세포의 비율은 대조군의 약 1/5로 나타났고, G는 CD56(인간 특이적 NK 세포 마커)-양성 세포를 나타낸 사진으로 사각형 안에 나타난 응집된 형태가 CD56(인간 특이적 NK 세포 마커)-양성 세포를 나타냈고, H는 주요 장기 및 종양에서 NK 세포 또는 코팅된 NK 세포의 생체 분포를 CD56 양성 세포의 비율을 기준으로 정량화한 그래프로 코팅된 NK 세포의 심장,신장,간,폐,비장 대비 높은 종양 내 분포도를 나타내고 종양에 분포하는 코팅된 NK세포의 비율은 NK 세포군보다 높은 것으로 나타났다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
다만, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 자연살해 세포의 면역 항암기능 증진을 위한 표면 개질용 고분자 화합물의 제조
본 발명의 고분자 화합물을 제조하는데 사용한 성분들은 표 1에 기재되어 있다.
성분 제조사
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC) Sigma-Aldrich, 03449
N-히드록시 숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS) Sigma-Aldrich, 130672
시스타민 디히드로클로라이드(cystamine dihydrochloride, Cys) Sigma-Aldrich, 30050
4-디메틸아미노피리딘(4-Dimethylaminopyridine, DMAP) Sigma-Aldrich, 39405
무수 디메틸포름아미드(N,N-Dimethylformamide, DMF) Sigma-Aldrich, 227056
엽산(folic acid, FA) Sigma-Aldrich, F7876
5-카르복시플루오레세인(5-carboxyfluorescein, 5CFL) Sigma-Aldrich, 86826
트리에틸아민(triethylamine) Sigma-Aldrich, 471283
1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine DSPE) TCI, 850745P
PEG1k-NHS Biopharma PEG Scientific Inc., HE023017
Fmoc-aspartic acid(Fmoc-Asp) BOC Science, 119062-05-04
Fmoc-arginine(Fmoc-Arg) BOC Science, 91000-69-0
숙신산 무수물(succinic anhydride) Daejung, 7673-4405
디에틸 에테르(diethyl ether) Duksan, D558
피페리딘(piperidine) Sigma-Aldrich, 104094
바이오틴(biotin) Sigma-Aldrich, B4501
다이메틸 설폭사이드 Sigma-Aldrich, 276855
1-1. Fmoc-PEDS 중간체 합성
1 mmol의 Fmoc-ASP, 2 mmol 의 EDC, 3 mmol의 NHS를 5 mL의 무수 디메틸포름아미드(DMF)에 혼합하고, 25℃에서 3시간 동안 교반하여 반응 혼합물을 준비하였다.
상기 반응 혼합물에 시스타민 디히드로클로라이드를 무수 디메틸포름아미드 5 mL에 용해시킨 용액(시스타민 디히드로클로라이드의 농도는 1 mmol)과 4-디메틸아미노피리딘 5 mL를 첨가하였다.
상기 시스타민 디히드로클로라이드 및 4-디메틸아미노피리딘을 첨가한 반응 혼합물을 15시간 동안 방치하였다.
1 mmol 의 EDC, 1 mmol의 NHS와 2mg 의 4-디메틸아미노피리딘을 1 mL의 무수 디메틸포름아미드에 용해시킨 뒤 상기 방치한 반응 혼합물에 추가로 첨가하고, 교반 장치(Corning, pC-620D)에서 600 rpm으로 60℃에서 60시간 동안 교반하였다.
반응이 완료되는 시점인 60시간 후, 수득된 생성물을 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리(LABOGENE, 1580R)를 사용하여 -20℃인 디에틸 에테르 100mL에 침전시켜 334mg의 Fmoc-PEDS(Fmoc-poly(ethylene aspartamido disulfide) 중간체를 합성하였다.
상기 합성된 334mg의 Fmoc-PEDS 중간체의 분자량은 폴리(메틸 메타크릴레이트)를 GPC(gel permeation chromatography) 표준으로 사용하는 GPC 컬럼(Styragel사)이 장착된 GPC 기기(Agilent GPC 시스템)로 측정했다.
Fmoc-PEDS 중간체의 화학적 구조 확인은 NMR(500 MHz FT-NMR spectrometer, Bruker, Germany) 및 FTIR(Perkin Elmer FTIR Spectrum Two, PerkinElmer, USA) 분광분석으로도 확인하였다.
도 8은 Fmoc-protected aspartate (Fmoc-Asp), cystamine dihydrochloride, Fmoc-PEDS 중간체의 화학적 구조를 NMR spectra로 확인한 결과이다.
도 9에서 (A)는 Fmoc-protected aspartate (Fmoc-Asp), (B)는 cystamine, dihydrochloride, (C)는 합성된 Fmoc-PEDS 중간체의 화학적 구조를 FTIR spectra로 확인한 결과이다.
중합도(DP)는 하기의 식으로 계산되었다.
Figure PCTKR2022016204-appb-img-000006
1-2. DSPE-Fmoc-PEDS 결합체의 형성
1mmol의 EDC, 1.5 mmol의 NHS 및 제조예 1-1에서 합성된 100 mg의 Fmoc-PEDS 중간체(말단 카르복실기는 4.90 μmol 포함)를 5mL의 무수 디메틸포름아미드에 용해시켜, 교반 장치(Corning, pC-620D)로 25℃에서 3시간 동안 600 rpm의 속도로 교반하여 혼합물을 제조하였다.
이 후, 20μmoL DSPE를 5mL 4-디메틸아미노피리딘에 용해한 용액을 상기 교반이 완료된 혼합물에 추가하고, 25℃질소(N2) 조건에서 48시간 동안 유지하며 상기 혼합물에 첨가하여 반응혼합물을 형성하였다.
상기 반응 혼합물을 -20℃인 디에틸 에테르 100mL에 침전시키고 -80℃에서 진공건조하여 100 mg의 DSPE-Fmoc-PEDS 결합체(말단 아민기는 4.90μmol 포함)를 합성하였다.
DSPE-Fmoc-PEDS 결합체의 화학적 구조의 확인은 NMR(500 MHz FT-NMR spectrometer, Bruker, Germany) 및 FTIR(Perkin Elmer FTIR Spectrum Two, PerkinElmer, USA) 분광분석으로도 확인하였다.
도 10에서 (A)는 Fmoc-PEDS 중간체, (B)는 DSPE 지질, (C)는 DSPE-Fmoc-PEDS 결합체의 화학적 구조를 NMR spectra로 확인한 결과이다.
도 11에서 (A)는 Fmoc-PEDS 중간체, (B)는 DSPE 지질, (C)는 DSPE-Fmoc-PEDS 결합체의 화학적 구조를 FTIR spectra로 확인한 결과이다.
1-3. DSPE-PEDS-FA 결합체의 합성
제조예 1-2에서 합성된 100mg의 DSPE-Fmoc-PEDS, 4.9mg의 숙신산 무수물(숙신산 농도 49 μmol)을 5 mL의 무수 디메틸포름아미드에 용해시켜 반응 혼합물을 제조하였다.
상기 반응 혼합물을 교반 장치(Corning, pC-620D)로 25℃에서 24시간 동안 600 rpm의 속도로 교반하여 반응 혼합물을 제조하였다.
상기 교반된 반응 혼합물을 -20℃인 디에틸 에테르 100mL에 침전시키고 10mL의 증류수(DW)를 첨가한 후 10,000 rpm에서 10분간 원심분리 하고(LABOGENE, 1580R), 미반응한 숙신산 무수물(C4H4O3)을 포함하는 상등액을 제거하여 반응 혼합물을 제조하였다.
상기 숙신산 무수물(C4H4O3)을 제거한 반응 혼합물은 투석(분획분자량 2kD)한 다음 O℃에서 동결건조하여, 100 mg의 succinoyl-DSPE-Fmoc-PEDS 결합체(등가의 말단 카르복실기 농도는 4.90 μmol)를 제조하였다.
succinoyl-DSPE-Fmoc-PEDS 결합체의 Fmoc 모이어티의 탈보호 및 FA 접합을 위해서, EDC, NHS 및 상기 제조된 succinoyl-DSPE-Fmoc-PEDS 결합체(등가의 말단 카르복실기 농도는 4.90 μmol) 100mg을 무수 디메틸포름아미드 5 mL에 용해시키되, EDC의 농도는 1 mmol, NHS의 농도는 1.5 mmol로 조절한 용액을 준비하고, 교반 장치(Corning, pC-620D)로 25℃에서 1시간 동안 600 rpm의 속도로 교반하여 반응혼합물을 제조하였다.
5.90μmol 엽산(FA)을 5mL의 4-디메틸아미노피리딘 및 5mL의 다이메틸 설폭사이드(DMSO)를 혼합한 용매에 용해시키고, 여기에 상기 교반된 반응혼합물에 혼합한 뒤, 25℃에서 질소(N2) 분위기 하에 48시간 동안 교반하였다.
상기 48시간 교반의 완료 후, Fmoc 모이어티의 탈보호 및 FA 접합을 위해서 피페리딘 용액 3mL를 첨가하고 교반장치를 통해 600 rpm으로 30분 동안 교반하여 DSPE-PEDS-FA 결합체를 합성하였다.
상기 합성한 지질(DSPE)-PEDS-FA 결합체(lipid-PEDS-FA)를 -20℃인 디에틸 에테르 100mL에 침전시킨 후, 10,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하고, -80℃에서 진공건조하고, 불순물을 제거하기 위해서 증류수(DW)에서 투석(분획분자량 2kD)하고 동결건조시켰다.
상기 합성한 지질-PEDS-FA 결합체의 화학적 구조 확인은 NMR(500 MHz FT-NMR spectrometer, Bruker, Germany) 및 FT-IR(Perkin Elmer FTIR Spectrum Two, PerkinElmer, USA) 분광분석으로 확인하였다.
도 12에서 (A)는 succinoyl-lipid(DSPE)-Fmoc-PEDS, (B)는 folic acid (FA), (C)는 DSPE-lipid(PEDS)-FA의 화학적 구조를 NMR spectra를 통해 확인한 결과이다.
도 13에서 (A)는 succinoyl-lipid(PEDS)-Fmoc-PEDS, (B)는 folic acid (FA), (C)는 lipid(PEDS)-PEDS-FA의 화학적 구조를 FT-IR spectra를 통해 확인한 결과이다.
1-4. DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체의 합성
21.23 μmoL 5CFL, 106.15 μmoL Fmoc-Arg, EDC 및 NHS를 무수 디메틸포름아미드 용액 5 mL에 용해시키되, EDC는 1 mmol, NHS는 1.5 mmol로 조절한 한 용액을 25℃에서 1시간 동안 교반하여 반응 혼합물을 제조하였다.
이후, 제조예 1-3의 DSPE-PEDS-FA 결합체(중합체 내 그라프트된 아민기의 농도가 212 μmol) 및 트리에틸아민 20 μL를 상기 5CFL 용액, Fmoc-Arg 용액, EDC 및 NHS를 무수 디메틸포름아미드 용액에 용해하여 교반한 반응 혼합물에 첨가하고, 25℃에서 48시간 동안 교반하여 반응 혼합물을 제조하였다.
이후, 상기 반응 혼합물을 -20℃인 디에틸 에테르 100mL에서 48시간 동안 침전시키고 투석(분획분자량 2kD)하고 동결건조시켜서 100mg의 5CFL, PEG1k-NHS 및 Arginine과 DSPE-PEDS-FA가 결합된 화합물(DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체)을 합성하였다.
상기 형성된 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체의 기능적 모이어티(moiety)의 화학적 구조 확인은 NMR(500 MHz FT-NMR spectrometer, Bruker, Germany) 및 FT-IR(Perkin Elmer FTIR Spectrum Two, PerkinElmer, USA) 분광분석으로 확인하였다.
도 14에서 (A)는 PEG1k-COOH, (B)는 Fmoc-arginine, (C)는 5CFL dye, (D)는 합성된 다관능성 lipid-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA의 화학적 구조를 NMR spectra로 확인한 결과이다.
도 15에서 (A)는 DSPE-PEDS-FA, (B)는 PEG1k-COOH, (C)는 Fmoc-arginine, (D)는 5CFL dye, (E)는 합성된 다관능성 lipid-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA의 화학적 구조를 FT-IR spectra로 확인한 결과이다.
제조예 2: DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-Biotin의 제조
2-1. DSPE-PEDS-Biotin 결합체의 합성
제조예 1-2에서 합성된 100mg의 DSPE-Fmoc-PEDS 결합체를 사용하여 제조예 1-3과 동일한 방법으로 DSPE-Fmoc-PEDS-Biotin 결합체를 제조하되, DSPE-Fmoc-PEDS 결합체와 교반하는 반응 혼합물의 5.90 μmol 엽산 5 mL를 5.90μmol 바이오틴(biotin) 5 mL로 치환하였다.
상기 형성된 succinoyl-DSPE-Fmoc-PEDS-Biotin 결합체의 화학적 구조 확인은 NMR(500 MHz FT-NMR spectrometer, Bruker, Germany) 및 FT-IR(Perkin Elmer FTIR Spectrum Two, PerkinElmer, USA) 분광분석으로 확인하였다.
도 16에서 (a)는 DSPE-PEDS-Biotin, (b)는 5-CFL, (c)는 Fmoc-Arg, (d)는 PEG1k, (e)는 DSPE-PEDS5CFL/Arg/PEG1k-Biotin의 화학적 구조를 NMR spectra로 확인한 결과를 나타낸다.
도 17에서 (a)는 DSPE-PEDS-Biotin, (b)는 5-CFL, (c)는 Fmoc-Arg, (d)는 PEG1k, (e)는 DSPE-PEDS5CFL/Arg/PEG1k-Biotin의 화학적 구조를 FT-IR spectra로 확인한 결과를 나타낸다.
2-2. DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-Biotin 결합체의 합성
제조예 1-4과 동일한 방법을 통해 제조예 2-1에서 합성된 DSPE-Fmoc-PEDS-Biotin 결합체를 사용하여 5CFL, PEG1k-NHS 및 Arginine과 지질(DSPE)-PEDS-FA가 결합된 화합물을 합성(DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-Biotin결합체)하였다.
상기 형성된 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-Biotin 결합체의 기능적 모이어티(moiety)의 화학적 구조 확인은 NMR(500 MHz FT-NMR spectrometer, Bruker, Germany) 및 FT-IR(Perkin Elmer FTIR Spectrum Two, PerkinElmer, USA) 분광분석으로 확인하였다.
도 16은 (a)는 DSPE-PEDS-Biotin, (b)는 5-CFL, (c)는 Fmoc-Arg, (d)는 PEG1k, (e)는 DSPE-PEDS5CFL/Arg/PEG1k-Biotin의 화학적 구조를 NMR spectra로 확인한 그림이다.
도 17은 (a)는 DSPE-PEDS-Biotin, (b)는 5-CFL, (c)는 Fmoc-Arg, (d)는 PEG1k, (e)는 DSPE-PEDS5CFL/Arg/PEG1k-Biotin의 화학적 구조를 FT-IR spectra로 확인한 그림이다.
제조예 3: 세포 배양(cell culture)
암세포의 표면에 결합되는 자연살해 세포로 NK-92mi cell을 ATCC(American Type Culture Collection, USA)로부터 분양 받았다.
상기 NK-92mi 세포를 T25 배양 플라스크(T25 culture flask)에 1 x 105 cells/mL의 농도로 시딩(seeding)하고, 12.5%의 소태아 혈청(FBS, Gibco), 12.5%의 말 혈청(Gibco), 1%의 페니실린-스트렙토마이신 용액(Corning, USA), 0.2mM의 이노시톨(Sigma-Aldrich, USA), 0.1mM의 β메르캅토에탄올(Sigma-Aldrich) 및 0.02mM의 엽산(Sigma-Aldrich)을 포함시킨 인 10 mL MEMα(Minimum Essential Medium Alpha, Gibco, USA)에 배양하였다. 세포배양은 37℃5% CO, 95% 습도 조건에서 48시간 이뤄졌다.
유방암 세포주인 MCF-7(ATCC), 유방암 세포주인 MDA-MB-231(ATCC), 췌장암 세포주인 MIA PaCa-2 (ATCC) 및 정상세포주인 human dermal Fibroblast (Lonza, USA)도 ATCC에서 각각 분양 받았다. 상기 세포들은 89% Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Corning), 1% penicillin-streptomycin solution, 및 10% FBS (Corning)를 혼합한 배양액에서 37℃5% CO, 95% 습도 조건에서 24시간 배양했다.
유방암 세포주인 MCF-7(ATCC)는 T25 배양 플라스크(T25 culture flask)에 5 x 104 cells/mL의 농도로 시딩하였고, 유방암 세포주인 MDA-MB-231(ATCC)는 T25 배양 플라스크(T25 culture flask)에 5 x 104 cells/mL의 농도로 시딩하였고, 췌장암 세포주인 MIA PaCa-2 (ATCC)는 T25 배양 플라스크(T25 culture flask)에 5 x 104 cells/mL의 농도로 시딩하였고, 정상세포주인 human dermal Fibroblast (Lonza, USA)는 T25 배양 플라스크(T25 culture flask)에 5 x 104 cells/mL의 농도로 시딩하여 실험에 사용하였다.
실시예 1: DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체를 포함하는 코팅성분 하에 배양된 자연살해 세포
제조예 3의 방법으로 배양된 NK-92mi 세포 5 x 105 cells를 포함하고 있는 10 mL αMEM 배지에 제조예 1의 방법으로 제조한 파우더 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA을 αMEM 배지에 녹여 제조한 2 mg/mL 농도의 코팅 용액 100 μL 용액을 혼합하고, 상기 NK-92mi 세포를 25℃에서 30분간 배양하여 상기 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 화합물로 표면이 코팅된 NK-92mi 세포를 준비하였다.
상기 표면이 코팅된 NK-92mi 세포를 1 mL의 DPBS(dulbecco's phosphate buffered saline, Sigma-Aldrich)으로 2번 세척했다.
실시예 2: DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-Biotin 결합체를 포함하는 코팅성분 하에 배양된 자연살해 세포
100% 농도인 αMEM 0.5 mL에 제조예 2의 방법으로 제조한 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-Biotin 1 mg을 용해하여 0.5 mL의 코팅용액(2 mg/mL)을 제조하였다.
NK-92mi 세포(5 x 105 cells)를 원심분리 하여 세포 펠릿(pellet)을 형성하고, 세포 펠릿(pellet)에 상기 코팅용액(2 mg/mL) 0.1 mL를 투입하고 25℃에서 30분간 배양하여 상기 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-Biotin 화합물로 표면이 코팅된 NK-92mi 세포를 준비하였다.
상기 표면이 코팅된 NK-92mi 세포를 1 mL의 DPBS(dulbecco's phosphate buffered saline, Sigma-Aldrich)으로 2번 세척했다.
비교예 1. 코팅되지 않은 NK-92mi 세포
실시예 1 및 2와 동일하게 배양하되, 세포 배양액에 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 및 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-Biotin을 첨가하지 않았다.
실험예 1. NK-92mi 세포 표면의 코팅 형태, 코팅 효율 및 코팅 유지능력 확인
1-1: 코팅 형태의 확인
코팅 형태를 시각화하기 위해 상기 표면이 코팅된 NK-92mi 세포를 형광물질인 5-카르복시플루오레세인으로 표지하고 형광 현미경(Ti-E System, Nikon, Japan)으로 이를 확인했다.
도 2은 상기의 결과로써, NK-92mi 세포의 표면에 상기 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체를 포함하는 코팅성분의 코팅이 잘 이루어 졌음을 확인할 수 있었다.
1-2: 코팅 효율 확인
상기 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체의 농도를 0.5mg/mL, 1mg/mL 및 2 mg/mL로한 코팅 용액을 코팅되지 않은 NK-92mi 세포의 표면에 각각 처리한 후, 세포 코팅 효율을 세포 분석기(flow cytometry, (Beckman Coulter, USA))를 통해 확인하여 2 mg/mL의 최적 코팅 농도를 산출하였다.
도 3은 상기의 결과로써, 좌측은 코팅 용액의 농도를 0.5 mg/mL, 1 mg/mL 및 2 mg/mL로 각각 변화시킴에 따라, NK-92mi 세포의 코팅 효율이 변화하는 것을 나타낸 것이고, 우측은 NK-92mi 세포의 코팅 효율을 형광 표지물질을 통해 분석한 것으로, 마이크로플레이트 분광광도법(Ex/Em = 485/535 nm 파장)을 사용하여 각 농도마다의 상청액의 형광 강도를 측정한 것이다.
여기에서 코팅 용액의 농도가 2 mg/mL일 때, 형광 강도가 가장 높게 측정 되었으므로, 상기 2 mg/mL 농도의 코팅 용액에서의 코팅 효율이 가장 우수함을 확인하였다.
1-3: 코팅 유지 능력 확인
상기 표면이 코팅된 NK-92mi 세포를 37℃의 조건으로 완전 성장 배지에서 인큐베이션하였다.
0시간, 6시간, 12시간, 24시간 및 48시간에 세포를 수집하고 세포 분석기(flow cytometry, (Beckman Coulter, USA))를 통해 형광 신호를 측정하였고, 이를 코팅되지 않은 NK-92mi 세포의 형광신호와 비교하여 어느 시간까지 상기 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체가 남아 있는지를 분석하였다.
도 4는 상기의 결과로써, 48시간 이후에 코팅되지 않은 NK-92mi 세포의 형광신호와 일치하는 것으로 나타남으로써, 코팅 이후 48시간까지는 상기 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체가 NK-92mi 세포 표면에 존재함을 확인하였다.
실험예 2: 암세포 인식 능력 향상 확인
MCF-7 유방암 세포, MDA-MB-231 유방암 세포, MIA PaCa-2 췌장암 세포 및 정상 대조군인 인간 섬유아세포(hFibroblast)를 96개 웰 플레이트에 웰 당 10,000개 세포를 시딩(seeding)하고 37℃5% CO2 및 95℃온도 조건에서 24시간 동안 인큐베이션했다.
상기 유방암 세포 및 췌장암 세포의 표면에 있는 엽산 수용체(folic acid receptor, FAR)를 충분히 포화시키기 위해 엽산(1mM) 0.1mL를 37℃에서 2시간 동안 세포 배지에 첨가했다.
NK-92mi 세포는 실시예 1 또는 실시예 2과 같은 방법으로 코팅하고 10 μM의 CellTracker™Blue CMAC Dye(Invitrogen, USA)로 37℃에서 30분간 표지하고 DPBS로 2회 세척하였다. 대조군으로 비교예 1의 NK-92mi 세포는 10 μM의 CellTracker™Blue CMAC Dye(Invitrogen, USA)로 37℃에서 30분간 표지하고 DPBS로 2회 세척하였다.
상기 효과기 세포(NK-92mi 세포(비교예 1) 또는 코팅된 NK-92mi 세포(실시예 1 또는 2))의 비율을 10으로, 표적세포(MCF-7 유방암 세포, MDA-MB-231 유방암 세포, MIA PaCa-2 췌장암 세포 및 인간 섬유아세포 각각)의 비율을 1로 하여 효과기 세포 대 표적세포(E:T)를 10:1로 하고 37℃에서 30분 동안 공동배양하고, 결합되지 않은 효과기 세포를 수집하였다. 이후, 나머지 효과기 세포 대 표적세포(E:T) 비율을 계산하기 위해, 표지된 효과기 세포의 형광 강도를 기반으로 하는 표준 곡선을 사용하여 결합되지 않은 효과기 세포를 정량화했다.
도 18은 표적세포 대비 표적세포를 인지하고 있는 효과기 세포의 비율을 나타낸 그래프이다
상기의 결과를 통해 코팅된 NK-92mi 세포: 표적세포(MCF-7 유방암 세포, MDA-MB-231 유방암 세포 또는 MIA PaCa-2 췌장암 세포) 그룹에서 가장 높은 암세포의 인식 정도를 보였음을 확인할 수 있었고, 이를 통해 코팅된 자연살해 세포의 암세포 인식 능력이 코팅되지 않은 자연 세포에 비해서 약 1.4배 가량 현저히 향상되었음을 알 수 있었다.
실험예 3: 코팅된 자연살해 세포의 암세포 사멸 능력 향상 확인-FA
효과기 세포(NK-92mi 세포(비교예 1) 또는 코팅된 NK-92mi 세포(실시예 1 또는 2)) 대 표적세포(MCF-7 유방암 세포, MDA-MB-231 유방암 세포, MIA PaCa-2 췌장암 세포, 및 인간 섬유아세포 각각)의 비율을 각각 1:1, 2:1, 4:1, 10:1로하여 각각 37℃ 5% CO2 및 95% 습도 조건에서 24시간 동안 인큐베이션하여 MCF-7 유방암 세포, MDA-MB-231 유방암 세포, 또는 MIA PaCa-2 췌장암 세포의 분해 또는 사멸을 검증하기 위한 실험을 수행하였다. 여기에서 코팅된 NK-92mi cell은 실시예 1의 방법으로 배양된 세포를 사용하였고, 코팅되지 않은 NK-92mi cell은 비교예 1의 방법으로 배양된 세포를 사용하였다.
자연살해 세포에 의한 세포 분해(lysis)/사멸(death)의 확인은 칼세인 AM 방출 분석방법(calcein-AM release assay)을 사용하였다. 세포 분해/사멸의 수치 비율은 공지된 칼세인 AM 방출 분석방법을 활용하여 계산하였다.
도 20은 상기 실시예 1 및 비교예 1의 방법에 따라 배양된 NK-92mi 세포의 암세포주의 사멸효과를 확인한 것이다.
그 결과, 도 20에서 확인할 수 있는 것과 같이 본 발명의 제조예 1의 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체로 코팅된 자연살해 세포와 암세포주를 같이 배양한 경우 코팅되지 않은 자연살해 세포를 암세포주와 같이 배양한 경우에 비해서 암세포주의 세포 사멸 효과의 현저한 상승이 있었고, 본 발명의 제조예 1의 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체로 코팅된 자연살해 세포의 숫자를 점점 증가시켜서 암세포주와 배양할수록 암세포주의 세포 사멸 효과를 촉진하는 효과는 더욱 드라마틱하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
다만, 대조군으로 사용한 암세포주가 아닌 인간 섬유아세포에 자연살해 세포를 같이 배양한 경우 아무리 많은 본 발명의 제조예 1의 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체로 코팅된 자연살해 세포를 배양한다고 하더라도 세포 사멸을 유도하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4: 코팅된 자연살해 세포의 암세포 사멸 능력 향상 확인-Biotin
효과기 세포(NK-92mi 세포(비교예 1) 또는 코팅된 NK-92mi 세포(실시예 1 또는 2)) 대 표적세포(MCF-7 유방암 세포, MDA-MB-231 유방암 세포, MIA PaCa-2 췌장암 세포, 및 인간 섬유아세포 각각)의 비율을 1:1, 2:1, 4:1, 10:1로하여 각각 37℃5% CO2 및 95% 습도 조건에서 24시간 동안 인큐베이션하여 MCF-7 유방암 세포, MDA-MB-231 유방암 세포, 또는 MIA PaCa-2 췌장암 세포의 분해 또는 사멸을 검증하기 위한 실험을 수행하였다. 여기에서 코팅된 NK-92mi cell은 실시예 2의 방법으로 배양된 세포를 사용하였고, 코팅되지 않은 NK-92mi cell은 비교예 1의 방법으로 배양된 세포를 사용하였다.
자연살해 세포에 의한 세포 분해(lysis)/사멸(death) 확인은 칼세인 AM 방출 분석방법(calcein-AM release assay)을 사용하였다. 세포 분해/사멸의 수치 비율은 공지된 칼세인 AM 방출 분석방법을 활용하여 계산하였다.
도 21은 상기 실시예 2 및 비교예 1의 방법에 따라 배양된 NK-92mi 세포의 암세포주의 사멸효과를 확인한 것이다.
그 결과, 도 21에서 확인할 수 있는 것과 같이 본 발명의 제조예 1의 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-Biotin 결합체로 코팅된 자연살해 세포와 암세포주를 같이 배양한 경우 코팅되지 않은 자연살해 세포를 암세포주와 같이 배양한 경우에 비해서 암세포주의 세포 사멸 효과의 현저한 상승이 있었고, 본 발명의 제조예 2의 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-Biotin 결합체로 코팅된 자연살해 세포의 숫자를 점점 증가시켜서 암세포주와 배양할수록 암세포주의 세포 사멸 효과를 촉진하는 효과는 더욱 드라마틱하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
다만, 대조군으로 사용한 암세포주가 아닌 인간 섬유아세포에 자연살해 세포를 같이 배양한 경우 아무리 많은 본 발명의 제조예 2의 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-Biotin 결합체로 코팅된 자연살해 세포를 배양한다고 하더라도 세포 사멸을 유도하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 5: 글루타치온 방출 확인을 통한 암세포 사멸 효과 확인
실험예 3와 같은 방법으로 효과기 세포(NK-92mi 세포(비교예 1) 또는 코팅된 NK-92mi 세포(실시예 1 또는 2)) 대 표적세포(MCF-7 유방암 세포, MDA-MB-231 유방암 세포, MIA PaCa-2 췌장암 세포, 및 인간 섬유아세포 각각)의 비율을 10:1로하여 각각 37℃5% CO2 및 95% 습도 조건에서 4시간 동안 인큐베이션하여 MCF-7 유방암 세포, MDA-MB-231 유방암 세포, 또는 MIA PaCa-2 췌장암 세포에서 글루타치온(glutathione, GSH)을 방출하는 정도를 측정하였다. 여기에서 Triton x-100은 암세포를 인위적으로 파괴시켜 암세포 내부의 글루타치온(Glutathine, GSH)을 흘러나오게 한 양성 대조군이다.
파괴된 암세포에서 유출된 글루타치온의 측정은 EZ-glutathione assay kit (DoGenBio)를 활용하여 제조사의 프로토콜에 따라서 수행되었다.
도 22는 각각의 표적세포(MCF-7 유방암 세포, MDA-MB-231 유방암 세포, MIA PaCa-2 췌장암 세포 또는 인간 섬유아세포)에서 흘러나온 글루타치온의 농도를 확인한 결과 그래프이다.
그 결과 도 22에서 확인할 수 있는 것과 같이 본 발명의 제조예 1의 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-Biotin 결합체로 코팅된 NK-92mi 세포를 암세포주와 공동배양하는 경우 코팅되지 않은 NK-92mi 세포를 암세포주와 공동배양하는 경우에 비해서 글루타치온 방출효과 현저히 향상되었다. 이를 통해, 본 발명의 제조예 1의 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-Biotin 결합체로 코팅된 NK-92mi 세포가 암세포를 파괴하는 효과가 상당히 우수함을 확인할 수 있었다.
자연살해세포와 암세포를 공배양한 경우 자연살해세포가 암세포주를 파괴하여 글루타치온(GSH)가 방출되었으며, 이 효과는 코팅된 NK세포 그룹에서 더 많은 암세포 사멸이 유도되었으므로 글루타치온 방출 또한 증가함을 확인하였다.
그 결과 도 22에 나타난 것과 같이, 일반세포주 triton-x100 처리그룹에서 보면 일반세포주가 사멸될 경우에도 글루타치온(GSH)가 방출된 것이 확인된다.
다만 자연살해세포와 일반세포를 공배양하였을 경우에는 자연살해세포가 혹은 코팅된 자연살해세포가 일반세포를 파괴하지 않아 글루타치온(GSH)의 방출이 나타나지 않았다.
실험예 6: 항엽산 매개를 통한 암세포 사멸 효과
항엽산 매개(anti-folate-mediated)를 통한 암세포 사멸효과를 확인하기 위해서 젤라틴 코팅된 용액에 본 발명의 제조예 1의 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체를 고정시킨 구조체를 제작하고, 암세포에서 흘러나온 글루타치온 환경을 모사하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
10 μL의 2%(w/v) 젤라틴 용액(돼지 피부 유래, Sigma-Aldrich, G1890)을 폴리카보네이트 트랜스웰(0.4μm 기공, Corning, CLS3428-24EA)의 바닥 표면에 떨어뜨리고, 젤라틴 처리된 트랜스웰을 실온에서 2시간 동안 건조시켰다.
이후 제조된 5 mM 1,2-디스테아로일-sn-글리세로 3-포스포에탄올아민-N-[숙신이미딜(PEG)](DSPE-PEG-NHS, Nanosoft Polymers, USA) 용액 1mL를 젤라틴이 코팅된 트랜스웰에 첨가하고 1시간 동안 교반하여 젤라틴의 아미노 그룹과 1,2-디스테아로일-sn-글리세로 3-포스포에탄올아민-N-[숙신이미딜(PEG)]의 NHS 모이어티가 컨쥬게이션되고 지질 부분(DSPE)이 외부로 노출되도록 하였다.
마지막으로, 실시예 1의 2 mg/mL의 코팅 용액을 상기 지질에 30분 동안 도포하여 자연살해 세포 표면을 모사하는 구조물을 제조하였다(도 23).
실험예 1과 동일하게 MCF-7 유방암 세포, MDA-MB-231 유방암 세포, MIA PaCa-2 췌장암 세포 및 정상 대조군인 인간 섬유아세포(hFibroblast)를 24개 웰 플레이트에 웰 당 10,000개 세포를 시딩(seeding)하고 37℃5% CO2 및 95% 습도 조건에서 24시간 동안 인큐베이션했다.
세포 배양 배지를 100 μM 글루타치온(Sigma-Aldrich, G6013)을 함유하는 새로운 세포 배양 배지로 교체하고, 상기 코팅된 트랜스웰을 세포를 시드하여 배양하고 있는 플레이트에 삽입하고 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션했다.
그리고 나서 트립신 처리하여 세포를 분리하고 원심분리하여 수집한 후 호모지나이저를 사용하여 세포를 용해시키고, Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Kit(Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 트랜스웰에서 배양한 표적 세포의 DNA 양을 정량화했다.
도 19는 글루타치온에 의해서 본 발명의 제조예 1의 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체의 이황화결합이 끊어져 해리된 FA가 암세포의 DNA 합성을 방해하여 암세포 사멸을 촉진하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
상기 결과를 통해, GSH만 처리하거나, 젤라틴으로 코팅된 경우에 비해서 글루타치온(glutathione, GSH)을 처리한 환경에서 젤라틴 코팅된 트렌스웰에 고정된 본 발명의 제조예 1의 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체의 이황화결합이 끊어져 엽산(FA)이 해리되고, 해리 이후 암세포 인식 모이어티인 엽산이 항엽산(antifolate)로 전환되어 이를 통해 암세포의 사멸을 추가적으로 유도함을 확인할 수 있었다.
실험예 7: 코팅된 자연살해 세포의 생존능력 측정
제조예 3의 방법으로 배양된 NK-92mi 세포를 배양하고 있는 10 mL αMEM 배지에 제조예 1의 방법으로 제조한 파우더 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA을 αMEM 배지에 녹여 제조한 2 mg/mL 농도의 코팅 용액 100 μL 용액을 혼합하고, 상기 NK-92mi 세포를 25℃에서 30분간 배양하여 상기 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 화합물로 표면이 코팅된 NK-92mi 세포를 준비하였다.
상기의 표면이 코팅된 NK-92mi 세포의 준비 과정에서 코팅 용액의 농도를 각각 0.5mg/mL, 1mg/mL로 조절한 NK-92mi 세포를 따로 준비하였다.
준비된 각 농도별로 조절되어(0.5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL) 표면이 코팅된 NK-92mi 세포를 1 mL의 DPBS(dulbecco's phosphate buffered saline, Sigma-Aldrich)으로 3번 세척했다.
상기 세척된 각 농도별로 조절되어 표면이 코팅된 NK-92mi 세포를 EZ-Cytox(DoGenBio, korea)를 이용한 WST-1 분석(WST-1 assay)을 통해 생존능력을 평가하였다. UV 흡광도는 450 nm에서 Infinite M200 micro-plate reader (Tecan, Zurich, Switzerland)를 사용하여 측정되었다.
도 5에서 좌측의 그래프는 상기 WST-1 분석(WST-1 assay)을 통한 각 농도별로 조절되어 표면이 코팅된 NK-92mi 세포의 생존능력을 측정한 결과로, 표면이 코팅되지 않은 대조군과 비교해 보았을 때, 흡광도의 변화가 거의 없으므로 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 화합물의 농도를 2 mg/mL까지 포함한 용액으로 NK-92mi 세포의 표면을 코팅하더라도 생존능력에 영향이 없음을 나타냈다.
실험예 8: 코팅된 자연살해 세포의 증식능력 확인
제조예 3의 방법으로 배양된 NK-92mi 세포를 배양하고 있는 10 mL αMEM 배지에 제조예 1의 방법으로 제조한 파우더 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA을 αMEM 배지에 녹여 제조한 2 mg/mL 농도의 코팅 용액 100 μL 용액을 혼합하고, 상기 NK-92mi 세포를 25℃에서 30분간 배양하여 상기 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 화합물로 표면이 코팅된 NK-92mi 세포를 준비하였다.
상기의 표면이 코팅된 NK-92mi 세포의 준비 과정에서 코팅 용액의 농도를 각각 0.5 mg/mL, 1 mg/mL로 조절한 NK-92mi 세포를 따로 준비하였다.
준비된 각 농도별로 조절되어(0.5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL) 표면이 코팅된 NK-92mi 세포를 1 mL의 DPBS(dulbecco's phosphate buffered saline, Sigma-Aldrich)으로 3번 세척했다.
장기간 세포 배양 시 세포 배양 밀도에 따른 증식능 비교를 수행하였다. 각 세포의 증식능은 초기 접종 세포 수와 배양이 끝난 후 얻어지는 세포의 수를 통해 각 계대에 따른 증식률을 계산하여 확인하였고, 그 결과는 도 6의 우측에 나타냈다.
실험예 9: 코팅된 자연살해 세포의 면역인자의 분비 측정
실시예 1의 방법으로 코팅된 NK-92mi 세포의 항원 인식을 통한 면역인자의 분비 정도를 통해 확인하기 위해서, 지질 다당류(lipopolysaccharide, LPS)에 의존적인 인터페론 감마(IFN-γ분비량을 분석했다.
1.5 X 105개의 비교예 1의 코팅되지 않은 NK-92mi 세포 및 1.5 X 105개의 실시예 1의 코팅되지 않은 NK-92mi 세포를 배양하는 배지에 1㎍/mL의 LPS(Escherichia coli O26:B6, Sigma-Aldrich)를 처리한 후, 세포를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고 원심분리 후 배지를 수집하였다.
이 후에는, 1.5 X 105개의 비교예 1의 코팅되지 않은 NK-92mi 세포 및 1.5 X 105개의 실시예 1의 코팅되지 않은 NK-92mi 세포를 각각 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고 원심분리 후 배지를 수집하여 대조군으로 활용하였다.
그 결과 도 6에서 확인할 수 있는 것과 같이, 지질 다당류로 처리가 되지 않은 대조군(control)에서는 코팅되지 않은 NK-92mi 세포의 인터페론 감마 분비량이 코팅된 NK-92mi 세포의 인터페론 감마 분비량에 비하여 다소 높게 나타났지만, 지질 다당류로 처리된 실험군에서는 코팅된 NK-92mi 세포의 인터페론 감마의 분비량이 코팅되지 않은 NK-92mi 세포의 인터페론 감마 분비량보다 높게 나타났다.
이를 통해, NK-92mi 세포의 인터페론 감마 분비량이 코팅된 NK-92mi 세포의 인터페론 감마 분비량과 동일한 수준이었으며, 지질 다당류로 처리된 실험군에서는 NK-92mi 세포의 인터페론 감마 분비량이 코팅된 NK-92mi 세포의 인터페론 감마 분비량과 동일한 수준으로 향상된 것을 확인하였다.
요약하면, 요약하면 LPS와 같은 항원물질을 인식한 뒤 이에 따른 세포신호기작이 발생하고, 그 결과물질인 인터페론 감마가 세포 외부로 방출되는 일련의 과정에 NK세포 표면에 코팅된 코팅물질이 영향을 주지 않는것을 확인할 수 있었다.
실험예 10: 코팅된 자연살해 세포의 체내에서의 암세포 사멸효과 확인
실시예 1의 방법으로 코팅된 NK-92mi 세포의 암세포 사멸 효과의 확인을 위하여, MDA-MB-231 이종이식 모델을 준비하였다.
상기 이종이식 모델은 상기 8주령 누드(BALB/c nu/nu) 마우스(narabio, Korea) 40마리의 왼쪽 옆구리에 1x107개 MDA-MB-231 세포를 피하 주사로 접종함으로써 준비하였다.
이 후, 상기 이종이식 마우스들의 종양 부피가 100mm3에 도달했을 때, 상기 이종이식 마우스를 무작위로 대조군, 아테졸리주맙(Atezolizumab) 주입 군, 코팅되지 않은 NK-92mi 세포 주입 군 및 코팅된 NK 세포 주입 군으로 분류하였다(각 군당 n = 10마리).
분류된 대조군 또는 각각의 주입 군에는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline, PBS) 250 μL을 접종하였다.
이 후, 코팅되지 않은 NK-92mi 세포 주입군은 1x107 개의 코팅되지 않은 NK-92mi 세포를, 코팅된 NK 세포 주입군은 1x107 개의 코팅된 NK 세포를, 각각 정맥주사로 접종하였다. 한편, 아테졸리주맙(Atezolizumab) 주입 군은 아테졸리주맙(Atezolizumab) (BioXCell, USA)을 3일마다 10 mg/kg씩 복강내 주사로 접종하였다.
대조군은 상기 과정에서 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline, PBS) 250 μL만을 접종하였을 뿐, 다른 접종을 하지 않았다.
이후, 각 군당 5마리의 마우스(총 20마리)를 무작위로 선별하여 종양 부피 변화, 종양 성장 억제 비율(TGI) 변화, 체중 변화의 배수변화 및 생존확률을 하기의 실험예들과 같이 분석했다.
코팅된 자연살해 세포의 체내에서의 암세포 사멸효과 확인하기 위한 실험의 프로세스는 도 24의 A에 개략적으로 나타나 있다.
10-1: 종양부피의 배수변화 측정
체내에서의 암세포 사멸 효과를 알아보기 위하여, 종양 성장을 14일 동안 모니터링하고 기록된 값을 초기 값으로 나누어 종양 부피를 하기의 식으로 계산하였다.
종양 부피= 0.5 x a x b2 (여기에서 a는 가장 긴 종양 조직의 직경, b는 가장 짧은 종양 조직의 직경이다.)
그 결과 도 24의 E에 나타난 것과 같이, 코팅된 NK-92mi 세포 주입 군에서의 마우스 각각의 종양 부피는 다른 대조군 또는 주입 군에 비하여 낮게 나타났다.
또한, 도 24의 B에 나타난 것과 같이, 코팅되지 않은 NK-92mi 세포 주입 군의 평균 종양 부피는 대조군과 비해서는 억제되었으나 종양은 지속적으로 성장한 것으로 나타났다. 반면, 코팅된 NK-92mi 세포 주입 군은 4일째부터 평균 종양 부피의 감소가 두드러지게 관찰되었다. 코팅된 NK-92mi 세포 주입 군은 대조군과 대비하여 14일 경과 후의 종양 부피는 1/4로 나타났고, 아테졸리주맙(Atezolizumab) 주입 군과 대비하여 14일 경과 후의 종양 부피는 1/2로 나타났으므로, 암세포 사멸 효과가 현저함을 확인할 수 있었다.
10-2: 종양 성장 억제 비율 측정
체내에서의 암세포 사멸 효과를 알아보기 위하여, 종양 성장을 14일 동안 모니터링하고 하기의 식으로 종양 성장 억제 비율(tumor growth inhibition, TGI)을 계산하였다.
Figure PCTKR2022016204-appb-img-000007
(여기에서
Figure PCTKR2022016204-appb-img-000008
는 일정 시점에서 처리된 그룹의 평균 종양 부피,
Figure PCTKR2022016204-appb-img-000009
는 초기 시점에서 처리된 그룹의 평균 종양 부피,
Figure PCTKR2022016204-appb-img-000010
는 일정 시점에서의 대조군의 평균 종양 부피이고,
Figure PCTKR2022016204-appb-img-000011
는 초기 시점에서의 대조군의 평균 종양 부피이다.)
여기에서 평균 종양 부피는 실험예 10-1의 종양부피의 계산식으로 각각의 마우스의 종양부피를 계산한 후 평균한 값이다.
그 결과 도 24의 C에 나타난 것과 같이, 코팅되지 않은 NK-92mi 세포 주입 군의 종양 성장 억제 비율은 10%, 코팅된 NK-92mi 세포 주입 군의 종양 성장 억제 비율은 80%로 나타나, 코팅된 NK-92mi 세포 주입 군의 종양 성장 억제 비율은 코팅되지 않은 NK-92mi 세포 주입 군의 억제 비율 대비 8배로 현저한 항암 효과가 있음을 확인하였다.
한편, 아테졸리주맙(Atezolizumab) 주입 군의 경우에는 대조군 및 코팅되지 NK-92mi 세포 주입 군과 대비하여 볼 때는 종양 억제가 유의하게 촉진되었지만, 코팅된 NK-92mi 세포 주입 군과 비교할 때, 14일이 경과한 시점에 종양부피는 2배 였고, 종양 성장 억제율도 60%로 코팅된 NK-92mi 세포 주입 군과 대비하여 볼 때, 항암 효과가 상대적으로 떨어짐을 확인하였다.
10-3: 체중의 배수변화 측정
체내에서의 암세포 사멸 효과를 알아보기 위하여, 대조군 및 각 주입군에서의 마우스들의 평균 체중을 14일 동안 모니터링하였다.
그 결과 도 24의 D에 나타난 것과 같이, 상기 각 군으로 분류된 마우스의 체중의 배수변화는 거의 일정하게 나타났으므로, 이를 통해서 각 군으로 분류하여 접종한 치료가 전신 독성을 일으키지 않았음을 확인할 수 있었다.
10-4: 생존확률 측정
체내에서의 암세포 사멸 효과를 알아보기 위하여, 상기 각 군으로 분류된 마우스(각 군당 10마리)를 100일간 생존확률을 모니터링하였다.
생존확률은 하기의 식으로 계산하였다.
Figure PCTKR2022016204-appb-img-000012
(여기에서, 일일 생존 개체수는 하루 중 일정 시점에 관찰하여 생존해 있는 개체수를 의미한다)
그 결과, 도 24의 F에 나타난 것과 같이, 코팅된 NK-92mi 세포 주입 군은 100일이 지난 시점에서 생존확률이 80%, 아테졸리주맙(Atezolizumab) 주입 군은 60%, 대조군 및 코팅되지 않은 NK-92mi 세포 주입 군은 0%였으며, 코팅된 NK-92mi 세포 주입 군이 대조군 또는 다른 주입군과 대비하여 볼 때 항암 효과가 현저히 뛰어남을 확인하였다.
실험예 11: 조직학 분석을 통한 코팅된 자연살해 세포의 암 억제 능력 향상 및 생체 적합성 확인
상기 실험예 10과 동일한 방법으로 이종이식 마우스 모델을 제조하고, 각 군당 5마리의 마우스(총 20마리)를 무작위로 선별하여 조직학적 분석을 위해 안락사시켰다.
상기 각 군의 이종이식 마우스로부터 채취한 종양 및 주요 장기를 4%의 파라포름알데히드(paraformaldehyde)가 포함된 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline, PBS) 내에서 24시간 동안 고정한 다음 파라핀에 보관하였다.
이 후 표본 절편(5-μm 두께)을 형광 염료 화합물로 염색하였으며, 슬라이드를 10mM 시트르산 완충액(pH 6.0) 100mL에서 20분 동안 98℃로 가열하고, 25℃에서 20분 동안 냉각하였다.
상기 냉각 후에, 상기 표본을 CD56 (MAB24083; R&D Systems, USA; 1:200), cleaved caspase3 (9661,Cell Signaling Technology, USA; 1:200), Ki67 (ab16667, Abcam; 1:200), HMGB-1 (ab18256, Abcam; 1:100), CD8a (14-0081-82, Invitrogen; 1:100), HLA (Class I ABC, ab70328, Abcam; 1:200), 및 von Willebrand factor (vWF , AB7356, Sigma-Aldrich; 1:200)를 인지하는 항체 각각을 포함하는 용액 하에서, 4°C에서 16시간 동안 인큐베이션했다.
상기 인큐베이션 후에, 상기 표본을 2차 항체(Invitrogen; 1:200)와 함께 20℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, TO-PRO-3(TP3, T3605, Invitrogen, 1μM)으로 대조 염색했다.
형광 검출은 공초점 레이저 현미경(DMi8; Leica, Germany)을 사용하여 수행하였다. H&E 이미지에서 종양 및 중심 괴사 영역을 추적하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정했다. 마커 양성 세포의 수를 세고 면역 조직 화학 이미지에서 특정 마커 양성 영역을 측정했다. 각 샘플의 단일 염색 슬라이드(그룹당 5개의 샘플)에서 5개의 관심 영역(ROIs; 200 x 200 μm)을 무작위로 선택하였다(그룹당 ROI 총 25개).
MDA-MB-231 이종이식 마우스(각 군당 5마리의 마우스)로부터의 종양 조직을 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색하였다. 도 25의 A에서 여기서 T는 종양 조직 영역을 나타내고, N은 괴사 영역을 나타낸다.
종양 조직을 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색한 결과, 도 25의 A에 나타난 것과 같이 호산구성 세포 팽창, 핵융합 및 핵융해와 같은 괴사 형태를 나타내는 종양 조직은 대조군 및 코팅되지 않은 NK-92mi 세포 주입 군보다 아테졸리주맙 및 코팅된 NK-92mi 세포 주입 군에서 훨씬 많이 관찰되었으므로, NK-92mi 세포 주입 군의 항암효과가 현저함을 확인할 수 있었다.
또한, 도 25의 B에 나타난 것과 같이 괴사 면적의 백분율(necrosis area)은 코팅된 NK-92mi 세포가 36%로 가장 높으므로, 다른 군들과 대비할 때, 가장 광범위한 종양 괴사를 유도한다는 것을 확인할 수 있다.
절단된 케스페이즈3(caspase3)는 세포 사멸사에 의한 암세포의 사멸을 유도하는 있는 단백질인데, 절단된 케스페이즈3의 발현이 높을수록 활발한 세포사멸이 유도되어 항암효과가 뛰어남을 의미한다.
절단된 케스페이즈3(cleaved caspase3)의 발현 정도를 분석한 결과, 도 25의 C에 나타난 것과 같이 대조군 및 코팅되지 않은 NK-92mi 세포 주입 군보다 아테졸리주맙 및 코팅된 NK-92mi 세포 주입 군에서 훨씬 많이 관찰되었으므로, NK-92mi 세포 주입 군의 항암효과가 현저함을 확인할 수 있었다.
도 25의 E 및 F는 증식 마커 Ki67을 이용하여 종양 세포 증식의 정도를 나타낸 것이다. 여기에서 Ki67의 광범위한 발현은 대조군, 아테졸리주맙 주입군, 코팅되지 않은 NK-92mi 세포 주입군에서 관찰되었지만, 코팅된 NK-92mi 세포 주입군에서는 현저히 낮은 발현을 나타냈다.
인간 특이적 CD56(자연살해 세포 마커)을 이용하여 코팅된 NK-92mi 세포 주입한 군과 코팅되지 않은 NK-92mi 세포를 주입한 군에서의 종양 또는 침윤된 세포의 상대적인 비율을 확인했다.
그 결과 도 25의 G에 나타난 것과 같이, 코팅되지 않은 NK-92mi 세포를 주입한 군의 표본과 대비하여 볼 때, 코팅된 NK-92mi 세포를 주입한 군의 표본에서 인간 특이적 CD56을 발현하는 NK 세포의 수가 현저히 증가한 것을 확인 할 수 있었고, 이를 통해 본 발명의 실시예 1의 고분자 화합물을 이용하여 NK 세포를 코팅하는 경우 코팅되지 않은 NK 세포에 비해서 암세포에 침윤되는 특성이 향상되고, 이를 통해 우수한 암세포 사멸효과를 나타냄을 알 수 있었다.
코팅된 NK-92mi 세포를 주입한 군의 표본에서 종양 또는 침윤된 세포의 상대적인 비율이 낮음을 확인할 수 있었다.
도 25의 H에서 CD56+cell ratio는 전체 세포에서 발현된 인간 특이적 CD56의 상대적인 비율을 나타낸다. 여기에서 CD56의 상대적인 비율이 간, 폐 및 비장에서는 관찰되었지만, 심장 및 폐에서는 관찰되지 않았다.
결론적으로, 조직학적 분석 결과를 통해 코팅된 자연살해 세포의 투여가 이종이식 모델에서 종양 성장을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다. 그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
자연살해 세포(neutral killer cell, NK cell)는 비-고식적 면역에 수반된 림프구의 하위-집단이다. 자연살해 세포는 혈액 샘플, 세포성분 채집술, 수집 등과 같은 당업계에 알려진 다양한 기술에 의해 얻어질 수 있다.
자연살해 세포의 특성 및 생물학적 성질은 CD16, CD56, 및/또는 CD57을 포함하는 표면항원의 발현; 세포 표면위의 알파/베타 또는 감마/델타 TCR 착체의 부재 ; 특이적 세포용해 효소의 활성화에 의한 "자가" MHC/HLA 항원을 발현하는데 실패하는 세포에 결합하고 그것을 죽이는 능력; NK 활성화 수용체-리간드를 발현하는 종양 세포 또는 다른 질병의 세포를 죽이는 능력; 면역반응을 자극하거나 저해하는 사이토카인을 방출하는 능력; 및 세포 분할의 다중 순환을 겪고 모 세포와 유사한 생물학적 성질을 갖는 딸 세포를 생산하는 능력을 포함한다.
본 발명에 있어서, 고분자 화합물의 기술적 특징 및 효과에 관련된 구체적 사항들은 본 발명의 본질적 사항에 배치되지 않는 한 상기 고분자 화합물의 제조방법 및 상기 고분자 화합물을 포함하거나 활용한 약학적 조성물, 암질환 예방 또는 치료방법 등에 동일 또는 유사하게 적용될 수 있다.
본 발명은 면역 세포에 결합하는 소수성 모이어티; 암세포 인지 모이어티; 및 하기 화학식 1의 구조를 포함하는 링커를 포함하는 고분자 화합물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 면역 세포는 T 세포, B 세포 또는 자연 살해 세포일 수 있고, 바람직하게는 자연살해 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 본원의 고분자 화합물은 자연살해 세포에 결합하는 소수성 모이어티; 암세포 인지 모이어티; 및 하기 화학식 1의 구조를 포함하는 링커를 포함하는 고분자 화합물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 있어서 “표면의 개질”은 자연살해 세포의 표면에 소수성 모이어티가 결합하는 것을 의미할 수 있다.
상기 화학식 1의 일 말단에는 상기 소수성 모이어티가 결합될 수 있고, 상기 화학식 1의 타 말단에는 상기 암세포 인지 모이어티가 결합될 수 있고, 여기서, 상기 n은 30~50의 정수일 수 있다.
상기 화학식 1의 일 말단은 상기 소수성 모이어티가 아마이드(amide) 결합을 통해 연결 또는 결합될 수 있고, 상기 화학식 1의 타 말단에도 아마이드(amide) 결합을 통해 상기 암세포 인지 모이어티가 연결 또는 결합될 수 있다.
상기 연결은 화학식 1의 일 말단이 소수성 모이어티와 연결되는 것을 의미할 수 있고, 이는 화학식 1의 일 말단이 소수성 모이어티와 직접연결되는 것과 화학식 1의 일 말단이 소수성 모이어티와 간접연결을 의미할 수 있고, 상기 간접연결시 화학식 1의 일 말단과 소수성 모이어티가 링커 등을 통해 연결되는 것을 의미할 수 있고, 상기 결합은 화학적 결합을 의미할 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022016204-appb-img-000013
상기 n이 30 미만일 경우에는 하기에서 설명할 세포 내재화 방지용 화합물, 양이온성 아미노산 또는 형광염료 화합물이 구조 단위 내에 충분히 결합하지 못하는 문제가 있을 수 있고, 50을 초과할 경우에는 사슬의 길이가 지나치게 길어져 구조 단위 내의 이황화 결합이 너무 많아져서 자연살해 세포와 암세포가 적절하게 연결되지 못하는 문제가 있을 수 있다.
상기 이황화 결합의 절단(disulfide bond cleavage)은 상기 화학식 1의 n개의 반복 구조단위(repeating unit) 내에서 무작위적으로 발생하여 여러가지 길이의 단편(fragment)를 형성할 수 있다. 하지만, 이는 화학식 1의 타 말단에 결합되는 암세포 인지 모이어티가 암세포를 인지하여 암세포를 사멸하는 효능에 미치는 영향은 없고, 이로 인한 세포 독성(cytotoxicity)이 유발되지 않음을 확인하였다.
상기 소수성 모이어티는 자연살해 세포와 결합하고, 상기 암세포 인지 모이어티는 암세포를 인지하여 암세포의 사멸을 촉진할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 1의 일 말단은 상기 n개의 이황화 결합 구조를 포함하고 반복되는 구조단위의 CH3 말단일 수 있고, 타 말단은 n개의 이황화 결합 구조를 포함하고 반복되는 구조단위 이외의 구조에서의 CH3 말단일 수 있다. 여기에서 상기 일 말단에는 소수성 모이어티가 결합될 수 있고, 상기 타 말단에는 상기 암세포 인지 모이어티가 결합될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 자연살해 세포에 결합하는 소수성 모이어티; 암세포 인지 모이어티; 및 상기 화학식 1의 구조를 포함하는 링커를 포함하는 고분자 화합물을 제조하였고(제조예 1, 제조예 2), 제조된 고분자 화합물을 자연살해 세포의 표면에 코팅하였고(실시예 1, 실시예 2), 상기 표면이 코팅된 자연살해 세포의 암세포 인식 능력의 향상(실험예 2), 코팅된 자연살해 세포의 암세포 사멸 능력 향상(실험예 3 내지 실험예 6), 코팅된 자연살해 세포의 암세포 사멸 효과(실험예 10, 실험예 11)를 확인하였다.
상기 제조된 고분자 화합물의 일 실시예인 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체를 포함하는 성분 하에 자연살해 세포를 배양하여 상기 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체가 표면에 결합되어 있는 자연살해 세포를 준비하였다.
상기 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체로 코팅된 자연살해 세포에 대해 실험예 2의 방법에 따라 암세포 인식 능력을 분석한 결과, 제조예 1의 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체로 코팅된 자연살해 세포의 암세포 인식 능력이 코팅되지 않은 자연 세포에 비해서 약 1.4배 가량 현저히 향상되었음을 나타냈다.
상기 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체로 코팅된 자연살해 세포에 대해 실험예 3의 방법에 따라 암세포 사멸 효과를 분석한 결과, 제조예 1의 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체로 코팅된 자연살해 세포와 암세포주를 같이 배양한 경우 코팅되지 않은 자연살해 세포를 암세포주와 같이 배양한 경우에 비해서 암세포주의 세포 사멸 효과의 현저한 상승이 있었고, 본 발명의 제조예 1의 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체로 코팅된 자연살해 세포의 숫자를 점점 증가시켜서 암세포주와 배양할수록 암세포주의 세포 사멸 효과를 촉진하는 효과는 더욱 드라마틱하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체로 코팅된 자연살해 세포에 대해 실험예 5의 방법에 따라 암세포 사멸 효과를 분석한 결과, 상기 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체로 코팅된 자연살해 세포가 더 많은 암세포 사멸이 유도하면서 글루타치온 방출 또한 증가한 것을 확인할 수 있었다.
상기 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체로 코팅된 자연살해 세포에 대해 실험예 6의 방법에 따라 암세포 사멸 효과를 분석한 결과, 제조예 1의 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체의 이황화결합이 끊어져 엽산(FA)이 해리되고, 해리 이후 암세포 인식 모이어티인 엽산이 항엽산(antifolate)로 전환되어 이를 통해 암세포의 사멸을 추가적으로 유도함을 확인할 수 있었다.
상기 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체로 코팅된 자연살해 세포에 대해 실험예 10의 방법에 따라 체내에서의 암세포 사멸 효과를 분석한 결과, 코팅된 자연살해 세포를 주입한 실험군에서 시간의 경과에 따른 종양부피는 다른 대조군 또는 실험군에 비하여 상대적으로 작은 것을 확인할 수 있었고, 종양 성장 억제 비율은 상대적으로 높았으며, 생존확률 역시 높음을 확인할 수 있었다.
상기 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체로 코팅된 자연살해 세포에 대해 실험예 11의 방법에 따라 조직학 분석을 통해 세포의 암 억제 능력의 향상 효과를 분석한 결과, DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-FA 결합체로 코팅된 자연살해 세포가 암세포에 침윤되는 특성이 향상되고, 이를 통해 우수한 암세포 사멸효과를 나타냄을 확인할 수 있었다
상기 제조된 고분자 화합물의 일 실시예인 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-Biotin 결합체를 포함하는 성분 하에 자연살해 세포를 배양하여 상기 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-Biotin 결합체가 표면에 결합되어 있는 자연살해 세포를 준비하였다.
상기 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-Biotin 결합체로 코팅된 자연살해 세포에 대해 실험예 4의 방법에 따라 암세포 사멸 효과를 분석한 결과, 제조예 2의 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-Biotin 결합체로 코팅된 자연살해 세포와 암세포주를 같이 배양한 경우 코팅되지 않은 자연살해 세포를 암세포주와 같이 배양한 경우에 비해서 암세포주의 세포 사멸 효과의 현저한 상승이 있었고, 본 발명의 제조예 2의 PEDS5CFL-Arg-PEG1k-Biotin 결합체로 코팅된 자연살해 세포의 숫자를 점점 증가시켜서 암세포주와 배양할수록 암세포주의 세포 사멸 효과를 촉진하는 효과는 더욱 드라마틱하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-Biotin 결합체로 코팅된 자연살해 세포에 대해 실험예 5의 방법에 따라 암세포 사멸 효과를 분석한 결과, 상기 DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-Biotin결합체로 코팅된 자연살해 세포가 더 많은 암세포 사멸이 유도하면서 글루타치온 방출 또한 증가한 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에서 있어서 “소수성(hydrophobic)”은 물에 대하여 친화력이 부족한 성질을 의미하고, 이러한 성질은 생체 분자의 지질(lipid)에 높은 친화력을 가질 수 있게 하는 것을 의미할 수 있고, “모이어티(moiety)”는 기능성이 있는 하나의 분자 내에서의 일부분을 의미할 수 있다.
본 발명 일 실시예에서 고분자 화합물의 일 구성인 소수성 모이어티(hydrophobic moiety)는 상기와 같은 소수성(hydrophobic)을 가지면서 생체 분자에 특이적으로 결합하는 부분을 의미할 수 있으며, 생체 분자의 지질(lipid)에 높은 친화력을 가질 수 있어 자연살해 세포의 표면에 견고하게 부착(anchoring)되는 부분을 의미할 수 있다.
본 발명에 있어서, 소수성 모이어티는 소수성 성질을 가지고 있으므로, 세포의 이중막에 결합 또는 부착 등이 될 수 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 소수성 모이어티는 지질, 항체, 호르몬, 약제 등 생체 내에 투여될 수 있는 저분자 물질을 통해 구성될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 본원에서 상기 소수성 모이어티는 면역세포의 지질 이중막에 결합 또는 부착될 수 있고, 구체적으로 자연살해 세포의 지질 이중막(lipid bilayer)에 결합 또는 부착될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물은 상기 자연살해 세포에 결합하는 소수성 모이어티를 포함할 수 있으며, 상기 자연살해 세포에 결합하는 소수성 모이어티는 탄소수가 12~24개인 알킬 사슬을 가지는 인지질; 탄소수가 10~30개인 스테롤류 지질; 1,2-bis(diphenylphosphino)ethane (DPPE); 및 1,2-bis(dimethylphosphino)ethane (DMPE) 중 어느 하나일 수 있으며, 표면 코팅의 대상이 되는 자연살해 세포의 세포막 지질이중층과 유사한 구조를 갖는 지질 분자 일 수 있다.
상기 탄소수가 12~24개인 알킬 사슬을 가지는 인지질로써 바람직하게는 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DSPE), dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), distearoylphosphatidylcholine (DSPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC), dioleoyl-3-trimethylammonium propane (DOTAP), 1,2-distearoyl-3-trimethylammonium-propane chloride (DSTAP) 등이 사용될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며, 자연살해 세포의 표면에 부착되어 고정될 수 있고 비극성 용매에 용해되는 지질 형태의 생체분자라면 제한없이 사용될 수 있다.
상기 탄소수가 10~30개인 스테롤류 지질로써 바람직하게는 콜레스테롤, 콜레스테롤헥사숙시네이트, 3β디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤, 에르고스테롤, 스티그마스테롤 또는 라노스테롤 등이 사용될 수 있지만, 자연살해 세포의 표면에 부착되어 고정될 수 있고 비극성 용매에 용해되는 지질 형태의 생체분자라면 제한없이 사용될 수 있다.
본원 실시예 1에서 볼 수 있는 바와 같이, DSPE-PEDS5CFL-Arg-PEG1k-Biotin 결합체는 상기 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DSPE)가 부분적으로 결합되어 있으며, 상기 DSPE는 실제 자연살해 세포의 표면에 부착(anchoring)될 소수성 사슬 형태를 띄는 CH2가 연속적으로 결합되어 있는 화합물이다.
본 발명의 자연살해 세포 표면 개질용 고분자 화합물을 구성하고 있는 소수성 모이어티는 자연살해 세포의 표면에 부착되고, 암세포 인지 모이어티는 암세포 표면에 있는 수용체를 인지함으로써, 표면이 코팅된 자연살해 세포의 암세포의 분해 또는 사멸 능력을 향상시킨 특징이 있다.
상기와 같은 암세포 인식능력이 향상은 자연살해 세포의 효소작용 등으로 암세포의 세포막 구조가 파괴되고 암세포 내부에 있던 글루타치온(glutathione, GSH)이 세포의 외부로 흘러나와 고분자 화합물의 이황화 결합을 절단시키는 메커니즘에 기인하는데, 이를 암조직 환경의 환원성 조건에 따른 감응형 언마스킹(unmasking) 과정이라 할 수 있다.
본 발명의 일 실시에에서 상기 고분자 화합물의 이황화 결합이 절단되더라로 고분자 화합물의 말단에 부착된 암세포 인지 모이모티가 암세포 표면의 수용체(receptor)와 결합하여 암세포의 사멸을 유도할 수 있다(도 7(a), 도 7(b)).
즉, 본 발명의 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물은 소수성 모이어티를 통해서 자연살해 세포의 세포막과 소수성 결합하여 세포 표면을 코팅하고, 암세포 인지 모이어티를 통해서 암세포를 특이적으로 인식하여 자연살해 세포에 의한 암세포의 사멸 능력을 증대시킬 수 있다.
또한, 암세포 사멸에 의해서 암세포 내에 존재하는 글루타치온이 누출되어 본 발명의 고분자 화합물의 이황화결합이 끊어져 암세포 인지 모이어티를 항엽산(antifolate)과 같은 형태로 전환시켜 암세포의 DNA 복제가 저해되어 추가적인 암세포의 사멸을 유도할 수 있다.
본 발명의 고분자 화합물로 표면이 개질된 자연살해세포는 암세포 인지능력이 증가되어 용해성 과립(lytic granule) 방출 및 사이토카인 방출에 의한 암세포 사멸을 현저히 증가시킬 수 있고, 암세포의 내부의 글루타치온이 방출됨에 의해서 암세포 인지 모이어티가 끊어져 나와 암세포 사멸을 더욱 향상시킬 있다.
본 발명의 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물은 암세포 인지 모이어티를 포함할 수 있으며, 상기 암세포 인지 모이어티는 엽산(folic acid), 바이오틴(biotin), 락토바이오닉산(phenylboronic acid) 및 페닐보론산(Phenylboronic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 엽산(folic acid) 또는 바이오틴(biotin) 일 수 있다.
본 발명의 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물은 상기 화학식 1의 구조를 포함하는 링커에 세포 내재화 방지용 화합물, 양이온성 아미노산 및 형광염료 화합물 중 어느 하나 이상이 결합될 수 있다.
상기 세포 내재화 방지용 화합물은 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG); 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide, PEO); 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol, PVA); 및 이들의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 세포 내재화 방지용 화합물은 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물이 자연살해 세포의 내부로 함입되지 않고 세포막 표면에 부착을 유지하는 기능을 할 수 있다.
본 발명의 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물에서 상기 화학식 1의 구조를 포함하는 링커에 결합되는 상기 양이온성 아미노산은 아르기닌(arginine), 라이신(lysine), 및 히스티딘(histidine)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 양이온성 아미노산은 전기적 상호작용을 통해 자연살해 세포로의 접근을 유도하는 기능을 할 수 있다.
본 발명의 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물에서 상기 화학식 1의 구조를 포함하는 링커에 결합되는 형광염료 화합물은 자연살해 세포 또는 암세포를 인지하였을 때, 형광영상을 통해 표적세포 또는 암의 진단 또는 검출을 가능하게 할 수 있다.
상기 형광염료 화합물은 로다민, 쿠마린, 에보블루(EvoBlue), 옥사진, 카보피로닌, 나프탈렌, 비페닐, 안트라센, 페난트렌, 피렌 또는 카바졸을 기본 골격으로 갖는 형광염료 또는 상기 형광염료의 유도체 일 수 있고, 형광적 특성을 나타내는 염료 화합물이면 제한없이 사용 가능할 수 있다.
상기 고분자 화합물은 자연살해 세포의 표면에 결합하더라도 자연살해 세포의 생존능력(viability) 및 생장능력(proliferation)을 저해하지는 않는 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적으로, 자연살해 세포 표면에 본 발명의 일 실시예에서 제조한 고분자 화합물을 코팅하여도 자연 살해세포의 생존에 미치는 영향은 없는 것을 확인하였고, 본 발명의 일 실시예에서 제조한 고분자 화합물을 2 mg/mL 농도까지 자연살해 세포의 표면을 코팅하였음에도 불구하고 자연살해 세포의 생존 능력에 미치는 영향이 없음을 확인하였고, 상기 농도로 코팅한 이후 48시간까지 자연살해세포가 잘 생장함을 확인하였다(도 5).
또한, 고분자 화합물이 자연살해 세포의 표면에 결합이 되더라도 자연살해 세포의 세포막 표면에 원래 존재하는 신호전달용 수용체들이 그 원천특성을 유지하여 대응하는 리간드 물질과 정상적으로 결합 상호작용을 할 수 있다.
이는 자연살해세포 표면에 고분자 화합물을 부착시키더라도, 원래 자연살해세포의 표면에 존재하는 다양한 수용체의 활동에 물리적 또는 생물학적 영향을 주지 않고, 이를 통한 세포 신호전달 기작이 정상적으로 작동함을 의미할 수 있다.
지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)는 자연살해세포 표면의 톨유사 수용체(toll-like receptor)에 결합하여 세포내 신호전달 기작을 거쳐 인터페론 감마(Interferon-γ, IFN-γ)를 방출하게 되는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 자연살해 세포의 표면에 상기 고분자 화합물이 부착된 경우에도 인터페론 감마(Interferon-γ, IFN-γ)의 방출이 정상적으로 이루어 지고 있음을 확인하였으므로, 상기 신호전달 기작이 정상적으로 작동함을 의미한다. 이는 도 6의 실험결과를 통해 확인할 수 있다.
본 발명의 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물을 제조하는 방법은 (a) 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물의 일 말단에 소수성 모이어티인 화학식 2로 표시되는 화합물을 결합시켜 화학식 3으로 표시되는 화합물을 제공하는 단계; (b) 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물의 타 말단에 암세포 인지 모이어티를 결합시키는 단계;를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022016204-appb-img-000014
[화학식 2]
Figure PCTKR2022016204-appb-img-000015
[화학식 3]
Figure PCTKR2022016204-appb-img-000016
여기서, 여기서, 상기 n은 30~50의 정수일 수 있고, 상기 X는 아세틸, 트리플루오로아세틸, t-부톡시카르보닐(BOC), 벤질옥시카르보닐(CBZ) 및 9-플루오레닐메틸렌옥시카르보닐(Fmoc) 중 선택되는 하나일 수 있고, p는 12~20인 자연수, q는 12~20인 자연수이다.
상기 p 또는 q가 12 미만의 자연수일 경우에는 고분자 화합물의 자연살해 세포에 부착되는 지질의 길이가 짧아져서 자연살해 세포로의 부착 능력이 떨어지는 문제가 발생할 수 있으며, 20 이상의 자연수일 경우에는 입체장애(steric hindrance)가 유도되거나 코팅이전에 미쉘(micelle)이 형성되어 코팅효율이 저해되는 문제가 발생할 수 있다.
본 발명의 일 실시예로써, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물 제조방법에서 상기 화학식 1의 X를 세포 내재화 방지용 화합물, 양이온성 아미노산 및 형광염료 화합물 중 어느 하나로 치환하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예로써, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물 제조방법에서 상기 화학식 3의 타 말단에 결합되는 암세포 인지 모이어티는 엽산(folic acid), 바이오틴(biotin), 락토바이오닉산(phenylboronic acid) 및 페닐보론산(Phenylboronic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예로써, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물 제조방법에서 상기 화학식 1의 X에 결합될 수 있는 세포 내재화 방지용 화합물은 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG); 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide, PEO); 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol, PVA); 및 이들의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예로써, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물 제조방법에서 상기 화학식 1의 X에 결합될 수 있는 상기 양이온성 아미노산은 아르기닌(arginine), 라이신(lysine), 및 히스티딘(histidine)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예로써, 본 발명의 암예방 또는 암치료용 약학적 조성물은 자연살해 세포에 결합하는 소수성 모이어티; 암세포 인지 모이어티; 및 상기 화학식 1의 구조를 포함하는 링커를 포함하고, 상기 화학식 1의 일 말단에는 상기 소수성 모이어티가 결합되고, 상기 화학식 1의 타 말단에는 상기 암세포 인지 모이어티가 결합되는, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물을 유효 성분으로 포함할 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022016204-appb-img-000017
여기서, 상기 n은 30~50의 정수이다.
본 발명의 일 실시예로써, 상기 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물을 유효 성분으로 포함하는 암예방 또는 암치료용 약학적 조성물은 전립선암, 갑상선암, 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 간암, 췌장암, 고환암, 구강암, 기저세포암, 뇌종양, 담낭암, 담도암, 후두암, 망막세포종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부신암, 비소세포폐암, 설암, 소세포폐암, 소장암, 수막종, 식도암, 신우요관암, 신장암, 악성골종양, 악성연부조직종양, 악성핌프종, 악성흑색종, 안종양, 요도암, 위암, 욱종, 인두암, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전이성뇌종양, 직장암, 질암, 척수종양, 침샘암, 편도암, 편평상피세포암, 혈액암 및 항문암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 암 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 일 실시예로써, 상기 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물을 유효 성분으로 포함하는 암예방 또는 암치료용 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
발명의 용어 "약학적으로 허용 가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 생리식염수, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜 및 리퀴드 파라핀으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용 가능하다. 상기 성분들은 상기 유효성분인 고분자 화합물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
상기 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 60, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제 및 액체 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 자연살해 세포에 결합하는 소수성 모이어티; 암세포 인지 모이어티; 및 화학식 1의 구조를 포함하는 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 고분자 화합물로서, 상기 링커의 일 말단에는 상기 소수성 모이어티가 결합되고, 상기 링커의 타 말단에 상기 암세포 인지 모이어티가 결합되어, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물을 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암질환 치료방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022016204-appb-img-000018
여기에서, 상기 n은 30~50의 정수이다.
상기 고분자 화합물을 포함하는 약학 조성물은 경구로 투여될 수 있으며, 고형제제 또는 액상제제일 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 그 투여 용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다. 상기 투여는 바람직하게는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.
상기 개체는 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 포유류(예를 들어, 개, 고양이, 말, 토끼, 동물원 동물, 소, 돼지, 양과 같은 비인간 동물 및 비인간 영장류 포함)를 지칭한다. 특정한 실시형태에서, 본원의 상기 개체는 인간이다.
본 발명은 자연살해 세포의 표면에 부착되어 해당 세포의 항암 기능을 강화할 수 있는 고분자 화합물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상기 고분자 화합물을 약학 조성물에 포함시켜, 이를 통해 암질환 예방 또는 치료 효과를 획기적으로 향상시킬 수 있으므로 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (17)

  1. 자연살해 세포에 결합하는 소수성 모이어티;
    암세포 인지 모이어티; 및
    화학식 1의 구조를 포함하는 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 고분자 화합물로서,
    상기 링커의 일 말단에는 상기 소수성 모이어티가 결합되고,
    상기 링커의 타 말단에 상기 암세포 인지 모이어티가 결합되어, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022016204-appb-img-000019
    여기에서, 상기 n은 30~50의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 소수성 모이어티는 자연살해 세포와 결합하고, 상기 암세포 인지 모이어티는 암세포를 인지하여 암세포의 사멸을 촉진하는 것을 특징으로 하는, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 자연살해 세포에 결합하는 소수성 모이어티는 탄소수가 12~24개인 알킬 사슬을 가지는 인지질; 탄소수가 10~30개인 스테롤류 지질; 1,2-bis(diphenylphosphino)ethane (DPPE); 및 1,2-bis(dimethylphosphino)ethane (DMPE) 중 어느 하나로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 암세포 인지 모이어티는 엽산(folic acid), 바이오틴(biotin), 락토바이오닉산(phenylboronic acid) 및 페닐보론산(Phenylboronic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1의 구조를 포함하는 링커에 세포 내재화 방지용 화합물, 양이온성 아미노산 및 형광염료 화합물 중 어느 하나 이상이 결합된, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 세포 내재화 방지용 화합물은 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG); 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide, PEO); 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol, PVA); 및 이들의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 양이온성 아미노산은 아르기닌(arginine), 라이신(lysine) 및 히스티딘(histidine)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물.
  8. 하기의 단계를 포함하는, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물 제조방법로서,
    (a) 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물의 일 말단에 화학식 2로 표시되는 화합물을 결합시켜 화학식 3으로 표시되는 화합물을 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물의 타 말단에 암세포 인지 모이어티를 결합시키는 단계를 포함하는 고분자 화합물 제조방법.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022016204-appb-img-000020
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2022016204-appb-img-000021
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2022016204-appb-img-000022
    여기서, 상기 n은 30~50의 정수이고, 상기 X는 아세틸, 트리플루오로아세틸, t-부톡시카르보닐(BOC), 벤질옥시카르보닐(CBZ) 및 9-플루오레닐메틸렌옥시카르보닐(Fmoc) 중 선택되는 하나 이상이고, p는 12~20인 자연수, q는 12~20인 자연수이다.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 X를 세포 내재화 방지용 화합물, 양이온성 아미노산 및 형광염료 화합물 중 어느 하나로 치환하는 단계를 더 포함하는, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물 제조방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 암세포 인지 모이어티는 엽산(folic acid), 바이오틴(biotin), 락토바이오닉산(phenylboronic acid) 및 페닐보론산(Phenylboronic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물 제조방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 세포 내재화 방지용 화합물은 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG); 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide, PEO); 및 이들의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물 제조방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 양이온성 아미노산은 아르기닌(arginine), 라이신(lysine), 및 히스티딘(histidine)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물 제조방법.
  13. 청구항 제8항 또는 청구항 제9항의 제조방법을 통해 제조된 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물.
  14. 자연살해 세포에 결합하는 소수성 모이어티;
    암세포 인지 모이어티; 및
    화학식 1의 구조를 포함하는 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 고분자 화합물로서,
    상기 링커의 일 말단에는 상기 소수성 모이어티가 결합되고, 상기 링커의 타 말단에 상기 암세포 인지 모이어티가 결합되고, 자연살해 세포 및 암세포를 인지하는 고분자 화합물을 유효 성분으로 포함하는, 암질환 예방 또는 암질환 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022016204-appb-img-000023
    여기서, 상기 n은 30~50의 정수이다.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 약학적 조성물에 의해서 항암 효과가 달성되는 질환은 전립선암, 갑상선암, 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 간암, 췌장암, 고환암, 구강암, 기저세포암, 뇌종양, 담낭암, 담도암, 후두암, 망막세포종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부신암, 비소세포폐암, 설암, 소세포폐암, 소장암, 수막종, 식도암, 신우요관암, 신장암, 악성골종양, 악성연부조직종양, 악성핌프종, 악성흑색종, 안종양, 요도암, 위암, 욱종, 인두암, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전이성뇌종양, 직장암, 질암, 척수종양, 침샘암, 편도암, 편평상피세포암, 혈액암 및 항문암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암질환 예방 또는 암질환 치료용 약학적 조성물.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 암질환 예방 또는 암질환 치료용 약학적 조성물.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암질환 치료방법.
PCT/KR2022/016204 2021-10-22 2022-10-21 자연살해 세포의 면역 항암기능 증진을 위한 표면 개질용 고분자 화합물 Ceased WO2023068894A1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18/641,336 US20240366766A1 (en) 2021-10-22 2024-04-20 Polymer compound for surface modification to enhance anticancer immune function of natural killer cells

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2021-0141920 2021-10-22
KR20210141920 2021-10-22

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US18/641,336 Continuation US20240366766A1 (en) 2021-10-22 2024-04-20 Polymer compound for surface modification to enhance anticancer immune function of natural killer cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023068894A1 true WO2023068894A1 (ko) 2023-04-27

Family

ID=86058259

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/016204 Ceased WO2023068894A1 (ko) 2021-10-22 2022-10-21 자연살해 세포의 면역 항암기능 증진을 위한 표면 개질용 고분자 화합물

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20240366766A1 (ko)
KR (1) KR20230058297A (ko)
WO (1) WO2023068894A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024219743A1 (ko) * 2023-04-17 2024-10-24 동국대학교 산학협력단 삼중음성유방암이 다른 장기로 전이되는 것을 억제하기 위한 자연살해 세포의 표면 개질용 고분자 화합물

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014012479A1 (en) * 2012-07-18 2014-01-23 Shanghai Birdie Biotech, Inc. Compounds for targeted immunotherapy

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014012479A1 (en) * 2012-07-18 2014-01-23 Shanghai Birdie Biotech, Inc. Compounds for targeted immunotherapy

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEE R. J., LOW P. S.: "FOLATE-MEDIATED TUMOR CELL TARGETING OF LIPOSOME-ENTRAPPED DOXORUBICIN IN VITRO.", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA., ELSEVIER, NL, vol. 1233., 1 January 1995 (1995-01-01), NL , pages 134 - 144., XP000607467, ISSN: 0006-3002, DOI: 10.1016/0005-2736(94)00235-H *
SZILáGYI BARNABáS ÁRON; NéMETHY ÁRPáD; MAGYAR ANNA; SZABó ILDIKó; BőSZE SZILVIA; GYAR: "Amino acid based polymer hydrogel with enzymatically degradable cross-links", REACTIVE AND FUNCTIONAL POLYMERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 133, 27 September 2018 (2018-09-27), AMSTERDAM, NL , pages 21 - 28, XP085542223, ISSN: 1381-5148, DOI: 10.1016/j.reactfunctpolym.2018.09.015 *
TERAMURA YUJI; KUROYAMA KOHEI; TAKAI MADOKA: "Influence of molecular weight of PEG chain on interaction between streptavidin and biotin–PEG-conjugated phospholipids studied with QCM-D", ACTA BIOMATERIALIA, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 30, 3 November 2015 (2015-11-03), AMSTERDAM, NL, pages 135 - 143, XP029364325, ISSN: 1742-7061, DOI: 10.1016/j.actbio.2015.11.003 *
WANG XIANWU, LUO XI, TIAN YUNPENG, WU TING, WENG JIAN, LI ZHU, YE FENG, HUANG XUEFEI: "Equipping Natural Killer Cells with Cetuximab through Metabolic Glycoengineering and Bioorthogonal Reaction for Targeted Treatment of KRAS Mutant Colorectal Cancer", ACS CHEMICAL BIOLOGY, vol. 16, no. 4, 16 April 2021 (2021-04-16), pages 724 - 730, XP093057759, ISSN: 1554-8929, DOI: 10.1021/acschembio.1c00022 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230058297A (ko) 2023-05-03
US20240366766A1 (en) 2024-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2017034335A1 (en) Improved cell-permeable (icp)-socs3 recombinant protein and uses thereof
WO2012002759A2 (ko) 세포의 원형질체에서 유래한 마이크로베시클 및 이의 용도
WO2010126319A2 (ko) 항체의 Ｆｃ 영역에 특이적 결합능을 가지는 리포펩타이드 및 그를 포함하는 항원 인지형 지질 나노입자
WO2017188731A1 (ko) 경구 투여용 유전자 전달을 위한 나노입자 및 이를 포함하는 약학 조성물
WO2020085767A1 (ko) 암세포 사멸 조성물 및 이의 용도
WO2018030806A1 (ko) 항체 중쇄불변부위 이종이중체에 융합된 사이토카인 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
CN101528263A (zh) 用于癌症的先天性免疫方法的缀合物
WO2011142514A1 (ko) Pias3을 유효성분으로 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2021206428A1 (ko) 로즈마린산 유도체, 로즈마린산-유래 입자 및 이를 포함하는 염증성 질환 치료용 조성물
WO2014126332A1 (ko) 금나노입자-앱타머 결합체를 기반으로 하는 단백질 전달체 및 이의 제조 방법
WO2023068894A1 (ko) 자연살해 세포의 면역 항암기능 증진을 위한 표면 개질용 고분자 화합물
WO2020080912A1 (ko) 치료 효능을 개선한 핵산 변형체 및 이를 포함하는 항암용 약학 조성물
WO2022035302A1 (ko) 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체를 포함하는 혈압 강하용 약학 조성물
WO2024219743A1 (ko) 삼중음성유방암이 다른 장기로 전이되는 것을 억제하기 위한 자연살해 세포의 표면 개질용 고분자 화합물
WO2020060260A1 (ko) 헬리코박터 파일로리 인지용 고분자 복합체 및 이를 포함하는 광역학 치료용 조성물
WO2021201654A1 (ko) Glp-2 유도체 또는 이의 지속형 결합체를 포함하는 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2015137777A1 (ko) 신규한 양이온성 폴리포스파젠 화합물, 폴리포스파젠-약물 컨쥬게이트 화합물 및 그 제조 방법
WO2022086257A1 (ko) 항암제를 포함한 미토콘드리아 및 이의 용도
WO2024025396A1 (ko) 신규 오리스타틴 전구약물
WO2024136597A1 (ko) Glp-2 유도체 또는 이의 지속형 결합체를 포함하는 이식편대숙주질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2021137611A1 (ko) 나노 구조체가 부착된 면역세포
WO2023113243A1 (ko) 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 및 이의 용도
WO2023204631A1 (ko) Ddx5 단백질에 결합하는 캄토테신 유도체 및 이의 프로드럭
WO2022114736A1 (ko) 난용성 캄토테신 화합물을 포함하는 나노 입자를 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물 및 이의 병용요법
WO2023277620A1 (ko) 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체를 포함하는 조합물의 치료학적 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22884115

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 22884115

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1