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WO2023062162A1 - Procédé et dispositif de dessalage et de concentration ou d'analyse d'un échantillon d'acides nucléiques - Google Patents

Procédé et dispositif de dessalage et de concentration ou d'analyse d'un échantillon d'acides nucléiques Download PDF

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Publication number
WO2023062162A1
WO2023062162A1 PCT/EP2022/078580 EP2022078580W WO2023062162A1 WO 2023062162 A1 WO2023062162 A1 WO 2023062162A1 EP 2022078580 W EP2022078580 W EP 2022078580W WO 2023062162 A1 WO2023062162 A1 WO 2023062162A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
flow
capillary
dna
during
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2022/078580
Other languages
English (en)
Inventor
Frédéric Ginot
Audrey BOUTONNET
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Adelis
Original Assignee
Adelis
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Adelis filed Critical Adelis
Priority to EP22803197.7A priority Critical patent/EP4392575A1/fr
Priority to US18/697,742 priority patent/US20240401115A1/en
Publication of WO2023062162A1 publication Critical patent/WO2023062162A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8827—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis

Definitions

  • the present invention relates to a method and a device for desalting and concentrating or analyzing a sample of nucleic acids. It applies, in particular, to the concentration and analysis of circulating DNA fragments and to medical diagnosis, in particular for certain cancers.
  • the DNA circulating in the blood plasma is currently the focus of intense clinical research in oncology, because it is possible to find mutations in the genomic DNA present in the tumor cells, which guide the therapy to be administered to the patient. These mutations, or other changes in the genome, can serve as a biomarker to follow the evolution of cancer.
  • biomarkers that are easy to follow in the context of cancers.
  • the only monitoring biomarker currently used routinely is Ca 19.9 (carbohydrate antigen 19.9) assayed in the circulating blood.
  • the sensitivity of this biomarker is 79% and its specificity 82% in this context.
  • the level of Ca 19.9 is high in other benign pancreatic pathologies such as acute pancreatitis, and in other digestive cancers.
  • the search for innovative biomarkers is therefore necessary, not only to improve the early diagnosis of pancreatic cancer, but also to assess the prognosis of these patients, their follow-up and in particular their response to treatment.
  • cfDNA free DNA circulating outside the cell
  • cfDNA is in the form of double-stranded DNA with an average size of 150-180 bp corresponding to the winding of DNA around the nucleosome. Its lifespan is less than two hours, before it is filtered and eliminated from the bloodstream by the spleen, liver and kidneys.
  • ctDNA is detected by looking for KRAS mutations by PCR (acronym for Polymerase Chain Reaction for polymerase chain reaction). But adenocarcinoma pancreatic has many other mutations affecting the Tp53 or p16 genes. Thus, it is more advantageous from the clinical point of view to carry out additional analyzes of these genes by high-throughput sequencing (NGS).
  • NGS high-throughput sequencing
  • Mechanisms contributing to dDNA production include apoptosis, necrosis, NETosis, active cell secretion which results in the release of DNA as extracellular vehicles (EVs), impaired clearance mechanisms. These mechanisms can be differentiated depending on the size of cfDNA that is detected in the bloodstream.
  • the device described in the documents PCT/FR2016/051774 and WO/2017/009566 makes it possible to easily and economically determine the characterization of the size profile of the cfDNA.
  • the device operates in two stages of concentration and separation carried out in line.
  • the DNA is concentrated via a system of capillaries formed by the junction of a small capillary and another of larger section.
  • the researchers laminarly flow a solution containing DNA into the large capillary and use an electric field to slow the migration. Because of the shear brought by laminar flow, this counter-electrophoresis causes a transverse force to appear, dependent on the size of the DNA, which pushes the DNA towards the walls.
  • FIG 1 is a diagram of such a device 40.
  • This device 40 can be installed in a CE (acronym for "Capillary electrophoresis” or capillary electrophoresis) Agilent (registered trademark), in place of a standard capillary.
  • CE acronym for "Capillary electrophoresis” or capillary electrophoresis
  • Agilent registered trademark
  • the total length of the device is approximately 30 cm, the minimum length that can be installed in an Agilent CE, which allows pressure and voltage to be applied to the terminals of the capillary device.
  • Agilent CE which allows pressure and voltage to be applied to the terminals of the capillary device.
  • an injection tip 43 5.5 cm long and 40 ⁇ m in diameter; this tip serves as a filter, and allows the injection chamber to be positioned inside the ventilated cassette of the CE Agilent, beyond the electrode.
  • an injection chamber 44 consisting of a capillary segment two cm long, which has a large internal diameter, for example 350 ⁇ m.
  • This capillary 47 has a larger diameter than the capillary 45 so that its electrical resistance and its hydraulic resistance are small compared to the combined resistances of the injection nozzle 43 and the separation capillary 45. If the separation capillary 45 went up to outlet 42, the voltage and the pressure to be applied to retain small DNA fragments would be beyond what the instrument allows.
  • a slightly larger capillary diameter can be suitable for very large DNA fragments (200 kb), or the way of assembling the capillaries can be modified to do DNA fractionation, for example to favor the quantity of DNA that can be stored at a junction, to the detriment of the analysis resolution.
  • the concentration zone is located at the junction between the injection chamber 44 and the separation capillary 45. In the rest of the description, it is considered that this distal capillary 47 does not play a role in the concentration of the DNA fragments. .
  • Figure 2 shows the typical sequence of DNA analysis with this device 40.
  • the distal capillary 47 is not shown in this figure.
  • the sample is injected into the device, by applying pressure for a given duration.
  • the injected sample is pushed by pressure into the middle of the injection chamber 44.
  • the DNA is concentrated at the concentration junction 48 of the injection chamber 44, by the application of pressure and voltage.
  • the separation capillary 45 fills with the sample solution, except for the largest DNA fragments, which remain retained at the concentration junction 48.
  • the DNA retained at the concentration junction 48 is separated according to size by a gradual reduction in the electric field applied between the inlet 41 and the outlet 42, the pressure generally being kept constant.
  • the DNA fragments are detected by fluorescence when they pass in front of the detector 46.
  • the viscosity and the resistivity of the solution in the capillary are respectively 40 mPa.s and 12.4 Q.m at 25°C.
  • the value of the electric field given above is valid as long as the conductivity of the sample is close to, or less than, that of the analysis buffer (approximately 12.4 Q.m at 25°C). This is generally the case when the DNA is purified beforehand, and taken up in a buffer that is not very conductive.
  • E i
  • E the electric field in Volt per meter
  • p the electric resistivity of the electrolyte in Ohm. meter
  • S the section of the capillary device in square meters, at the point considered, /, expressed in amperes, being constant all along the device.
  • the electric field in the separation capillary 45 which must retain the DNA in the injection chamber 44, is therefore only 7% of the value of the electric field in the tip of the device.
  • an electric field of 21400 V/cm would then be required in the tip 43, which is not achievable in practice because of heating by the Joule effect that this would cause, this heating in turn causing degassing of the electrolyte in the capillary, hence the formation of air bubbles cutting the electrical continuity of the electrolyte, virtually canceling any electric field downstream, in the separation capillary .
  • the electric field at the output of concentration junction 48 and at the output of the device can be modeled throughout a concentration/separation process as described in steps 53 to 55, for a device 40 to which 25,000 Volts.
  • the electric field 70 calculated one millimeter downstream of the concentration junction 48 is shown, as a function of time.
  • the sample is in the middle of the injection chamber 44, with a volume equal to half the volume of the injection chamber 44, i.e. approximately 1 pL.
  • the sample has a conductivity of 0.7 O.m.
  • the electric field is calculated one mm after the junction of concentration 48, without taking into account the effect of heating of the capillary 45 by Joule effect on the conductivity and the viscosity of the solution, nor of the phenomenon of electroosmosis which accelerates the flow .
  • the flow rate is then 0.68 pL/min throughout the analysis.
  • the sample is completely inside the injection chamber 44; the separation capillary and the inlet capillary, as well as the distal capillary, are completely filled with the analysis buffer, which has a conductivity of 12.4 O.m.
  • the electric field is 1500 V/cm, a field largely sufficient to retain the 100 bp fragments.
  • the low resistivity sample quickly fills the separation capillary 45, which represents a volume of 0.1 1 pL.
  • the electric field drops suddenly to around 90 V/cm; then it rises slightly as the separation capillary fills with sample.
  • the sample still partly fills the injection chamber 44, it completely fills the separation capillary 45, and it gradually fills the distal capillary 47, which represents a volume of 1.02 pL.
  • the electric field rises slowly to 215 V/cm. Such a field is very insufficient to retain the smallest DNA fragments.
  • the sample is completely evacuated from the injection chamber 44, and withdraws rapidly from the separation capillary 45, then more slowly from the distal capillary 47; the field increases suddenly when the sample no longer fills the observation point, but still fills most of the separation capillary 45.
  • the sample of conductivity 0.7 Om is completely evacuated from the device. We find the initial electric field of 1500 V/cm.
  • Figure 7 which shows the amperage flowing through the capillary during the concentration step, illustrates the kinetics of salt removal from the device.
  • BIABooster Online DNA Concentration and Size Profiling with a Limit of Detection of 10 fg/pL and Application to High-Sensitivity Characterization of Circulating Cell-Free DNA”, Anal. Chem. 2018, 90, 3766-3774; And
  • the present invention aims to remedy all or part of these drawbacks.
  • the present invention relates to a process for desalting and concentrating a sample of nucleic acids that is more conductive than an analysis buffer, a process which comprises at least one iteration of an alternation :
  • - a step of laminar flow of the sample in a capillary in a first direction of flow, the capillary being provided with at least one local restriction of its section and comprising the analysis buffer, during which the sample is subjected to a first electrical potential difference whose action on the nucleic acid molecules is opposite to the first direction of flow and causes the retention of nucleic acid molecules in the capillary, - a step of laminar flow of the sample, in a second direction of flow opposite to the first direction of flow.
  • a pressure lower than the pressure present in the restriction is applied upstream of the restriction.
  • the inventors have discovered that, when the electric field is insufficient to retain the small DNA fragments at the concentration junction, these fragments leak into the separation capillary. But the phenomena implemented always push them towards the wall, even if this pressing against the wall is insufficient for the counter-electrophoresis to be stronger than the fluid flow. It follows that the migration speed of these DNA fragments is lower than the average speed of the flow. On the other hand, the ions forming the salts are too small for there to appear a transverse force pushing them towards the wall, and they advance at the average speed of the flow, more or less their speed of electrophoresis according to their positive charge or negative.
  • the concentration operation is stopped before the smallest fragments arrive at the end of the separation capillary 45 and a pressure is applied, alone or in the presence of a potential difference, in the opposite direction to the initial pressure to return the volume of the separation capillary to the injection chamber. Then, a new concentration step is carried out and, possibly, this alternation of return and concentration phases is repeated.
  • the salts are thus gradually evacuated from the device, while the DNA molecules are essentially preserved.
  • the sample is subjected to a second electrical potential difference whose action on the molecules of nucleic acids is opposite to the first direction of flow.
  • the second potential difference may be equal to, greater than, or less than the first potential difference.
  • the molecules still close to the walls of the separation capillary return more quickly to the injection chamber than during a return by simple pressure.
  • the electrophoresis is added to the flow, and the electrophoresis has a constant speed in a plane transverse to the flow, unlike the laminar fluid flow, which is zero at the wall and maximum in the center.
  • the method further comprises a step of measuring the amperage flowing in the capillary during at least one flow step in the first flow direction and a step of selecting a number of iterations of the alternation according to the measured amperage. Thanks to these arrangements, the conductivity of the sample, representative of its salinity, is estimated by means of the measurement of the current passing through the sample and, depending on this salinity, a number of alternations of flows are chosen in one direction and then the other to reduce this salinity to an adequate level.
  • the number of iterations of the alternation is an increasing function of the amperage of a peak of this measured amperage or of a peak of a derivative of this measured amperage.
  • the inventors have observed that the height of at least one peak of the measured amperage as well as the peak of the first derivative of the measured amperage are increasing functions of the salinity of the sample.
  • the method further comprises a step of measuring the amperage flowing in the capillary during at least one step of flow in the first direction of flow and a step of selecting a duration d at least one flow stage in the first flow direction as a function of the measured amperage.
  • the estimation of salinity makes it possible to estimate the speed of movement of small fragments of nucleic acids.
  • a flow duration is therefore chosen to prevent these small fragments from leaving the capillary.
  • the duration selected is a decreasing function of the amperage of a peak of this measured amperage or of a peak of a derivative of this measured amperage.
  • the method comprises, after one iteration of the alternation, a step of changing the analysis buffer, the new analysis buffer having a pH lower than that of the analysis buffer previously used.
  • nucleic acids For example, in a biological sample containing proteins, some of these proteins are positively charged and then bind to the walls of the capillary, as well as to nucleic acids, which are negatively charged. This causes the nucleic acids to stick to the walls, a sticking that is harmful for the analysis.
  • a high pH buffer By choosing a high pH buffer, the majority of proteins are negatively charged, and the sticking of nucleic acids to the walls is reduced, or even disappears. But, at high pH, a separation of nucleic acids is not as resolute as at neutral or slightly acidic pH. With a change of buffer, the ability to separate nucleic acids is restored.
  • the present invention relates to a method for analyzing a sample of nucleic acids, which comprises the steps of the method of desalting and concentrating a sample which is the subject of the invention and, after the last iteration of the alternation, a step of separation by laminar flow of the sample in the capillary in the first flow direction, during which the sample is subjected to an electrical potential difference less than or equal to the first potential difference, of which the action on the nucleic acid molecules is opposite to the first direction of flow and causes partial retention of nucleic acid molecules in the capillary.
  • the nucleic acids are thus partially retained, which improves their separation according to their size.
  • the electrical potential difference is decreasing.
  • the analysis method comprises, during or after the separation step, a step for measuring a temporal profile of fluorescence of the fluorescent molecules of nucleic acids and a step for converting the temporal profile of fluorescence into a concentration profile of nucleic acid molecules of different lengths, by implementing a fluorescence profile of a standard sample, the concentration of which is known for each length of fluorescent nucleic acid molecule.
  • the nucleic acid molecules are rendered fluorescent by one of the techniques known to those skilled in the art, for example, by adding an intercalating fluorophore.
  • An intercalating fluorophore is a molecule which fluoresces little in the free state, and which fluoresces a lot when it is intercalated between the bases of DNA.
  • the samples are thus analyzed with compensation for the experimental variations that exist from one day to the next, in terms of the passage time of the DNA in front of the detector and in terms of fluorescence intensity.
  • the present invention relates to a device configured to implement a method of desalting and concentration object of the invention or a method of analysis object of the invention of a sample of nucleic acids more conductive than an analysis buffer, the device comprising:
  • capillary provided with a local restriction of its section and comprising the analysis buffer
  • the capillary is formed of a microfluidic channel.
  • FIG. 1 schematically represents a capillary device of the prior art
  • figure 2 represents a typical operating sequence of a DNA analysis with the device illustrated in figure 1
  • figure 3 represents a calculated electric field, over time, at one mm downstream of the concentration junction of the device illustrated in figure 1 operating as illustrated in figure 2, when the sample has a conductivity 18 times higher than that of the analysis buffer
  • figure 4 represents an analysis result for an unsalted DNA sample
  • figure 5 represents an analysis result for more or less salty standard DNA samples
  • FIG 6 reports the areas of the peaks in Figure 5, as a function of NaCl concentration in the sample
  • Figure 7 shows the amperage flowing through the capillary during the concentration step of the assays shown in
  • FIG. 8 represents the analysis of a purified circulating DNA sample containing more or less salt, with the device illustrated in FIG. 1 operating as illustrated in FIG. 2
  • FIG. 9 represents the evolution of the area of the first peak and of the second peak of the graphs of FIG. 8 as a function of the NaCI concentration in the sample
  • FIG. 10 represents a typical operating sequence of a DNA analysis with the method which is the subject of the invention implementing two returns
  • FIG. 11 represents an analysis carried out with the device illustrated in FIG. 1 operating according to the sequence illustrated in FIG.
  • FIG. 10 for samples containing more or less salt
  • figure 12 reports the areas of the peaks in figure 11 , as a function of the concentration of NaCI in the sample
  • figure 13 illustrates the temporal positioning of the two return times in the timing diagram of an embodiment of the method, returns during which, since no electrical voltage is applied, the electrical current is zero
  • FIG. 14 represents the result of an analysis with the device illustrated in FIG.
  • FIG. 1 operating according to the sequence illustrated in figure 10 for previously purified cfDNA samples containing more or less salt figure 15 represents the evolution of the area of the first peak and of the second peak of the curves figure 14 according to the NaCI concentration
  • figure 16 represents an analysis carried out with the device illustrated in figure 1 operating according to a sequence with six returns
  • for standard samples containing more or less salt figure 17 reports the areas of the peaks in figure 16, as a function of the concentration of NaCI in the sample
  • FIG. 18 represents the result of an analysis with the device illustrated in FIG. 1 operating according to a six-return sequence for previously purified cfDNA samples containing more or less salt
  • figure 19 represents the evolution of the area of the first peak and the second peak of the curves of figure 18 as a function of NaCI concentration, with the device illustrated in figure 1 operating according to a sequence with six returns
  • figure 20 shows the result of the analysis of a plasma with a sequence comprising seven returns with a change of buffer
  • figure 21 shows the electric current obtained during the concentration step at pH8 of the analysis illustrated in figure 20, with seven returns
  • figure 22 shows the electric current obtained during of the last concentration step of the analysis illustrated in figure 20 with a change of buffer
  • figure 23 shows the comparison of migrations of a standard sample alone or in plasma, in a seven-return process
  • figure 24 shows the comparison of the migrations of a standard sample alone or in plasma, in a seven-return method
  • figure 25 represents an analysis of a DNA sample circulating directly from plasma with a fluorescence plot
  • figure 26 represents a concentration-size profile for the assay shown in Figure 25
  • Figure 27 shows an analysis of the same circulating DNA sample as Figures 25 and 26, after DNA purification
  • all or part of the means and variants of the devices disclosed in international application WO/2017/009566 are configured to implement the method object of the invention.
  • the structural characteristics of the devices disclosed for example with respect to the dimensions of the capillary provided with a local restriction, can be transposed to the method which is the subject of the invention.
  • the assay buffer is a viscoelastic fluid.
  • a viscoelasticity is obtained by adding a neutral polymer.
  • a neutral polymer is used in the analysis buffer at a mass concentration of between 0.1 and 10%.
  • a neutral polymer is chosen from polyvinylpyrrolidone (PVP), poly(ethylene oxide) (PEO) and polyacrylamide (PAM) or their mixture.
  • the analysis buffer is not a viscoelastic fluid and in particular does not contain any neutral polymer.
  • such variants are applied to samples comprising large fragments of nucleic acids, for example, having a size greater than or equal to 1000 bp.
  • the capillary has a diameter, upstream of the local restriction, of at least 100 ⁇ m and preferably of at least 300 ⁇ m.
  • the diameter of the capillary upstream of the local restriction is between 300 ⁇ m and 600 ⁇ m.
  • the local restriction has a section of at least 2 ⁇ m, preferentially of at least 20 ⁇ m and more preferentially of at least 40 ⁇ m. Preferably, such a section is less than 100 ⁇ m.
  • the device has a plurality of local restrictions.
  • such local restrictions have similar dimensions.
  • the device has:
  • capillary having a diameter, upstream of the restrictions, of between 0.5 and 5 mm and
  • restrictions being similar to channels, with a diameter of between 2 and 50 ⁇ m.
  • the diameter of the restriction section or the sum of the diameters of the restriction sections is between 5 and 20. In other words, the ratio between:
  • the area of the section of the restriction or the sum of the areas of the sections of the restrictions is between 25 and 400.
  • the capillary is a channel of a microfluidic chip provided with a restriction.
  • Examples of the dimensions of the channels and the restriction, applicable to these embodiments, are mentioned in the following scientific publications: - Sectionlet et al., “Characterization and minimization of band broadening in DNA electrohydrodynamic migration for enhanced size separation”, Soft Matter, 2020,16, 5640-5649; And
  • microfluidic chip embodiments have a smaller geometry and in particular a shorter length compared to other embodiments without a microfluidic chip mentioned in the present description.
  • the microfluidic chip comprises the so-called “wide capillary” or “wide channel” capillary, a constriction then a so-called “narrow capillary” or “narrow channel” capillary having a dimension smaller than the wide channel.
  • the assembly comprising the constriction and the narrow capillary form the restriction. It is noted that, generally but not restrictively, the channels of a microfluidic chip respectively have a rectangular section.
  • the wide channel has a width of at least 50 ⁇ m and preferably at least 400 ⁇ m.
  • the narrow channel has a width of at least 2 ⁇ m and preferably at least 10 ⁇ m.
  • the wide channel, the constriction and the narrow channel have a depth between 2 and 10 ⁇ m.
  • the wide channel, the constriction and the narrow channel have a constant depth.
  • the wide channel, the constriction and the narrow channel have variable or so-called “non-constant” depths.
  • the depth of the wide channel upstream of the constriction is greater than the depth of the constriction and/or of the narrow channel.
  • a method of forming channels and constricting a microfluidic chip includes at least one step of etching a silica and/or glass wafer.
  • the etching step comprises at least one step implementing a photolithography technique combined with a plasma etching technique known in electronics for producing printed circuits.
  • a plasma etching technique known in electronics for producing printed circuits.
  • such an etching is performed on a silica wafer, called “wafer” in English. Note that an example of such an etching step is mentioned in the scientific publication by Sectionlet et al. previously cited in this description.
  • the etching step comprises at least one step implementing a so-called “grayscale” lithography technique combined with a plasma etching technique. It is noted that such an etching step allows in particular the formation of the wide channel, of the constriction and of the narrow channel having variable depths. It is noted that an example of such an etching step is mentioned in the scientific publication by Tijunelyte et al. previously cited in this description.
  • a detection of nucleic acids is carried out, for example, by using fluorescence detectors or UV adsorption detectors known to the person of the job.
  • the nucleic acids are for example chemically marked by a fluorescent probe or marked by the use of an intercalator or binder of the DNA groove called “Groove binder”. It will be noted that these various markings are known to those skilled in the art.
  • Examples 1 and 2 described with reference to Figures 1 to 9, specify the experimental results of a device 40 of the prior art operating according to the sequence illustrated in Figure 2, sequence also called "0 return".
  • Example 1 “0 return” method in device 40, unsalted sample.
  • a “1 K DNA analysis” is a profiling of DNA sizes in a range going from 100 bp to 1500 bp (therefore of the order of 1 kb, hence the name 1 K). It is essentially defined by the analysis buffer and by the analysis method. The analysis method is essentially defined by the pressure/voltage chronogram for carrying out the concentration then the separation, with the washing/conditioning processes described in the examples below. Similarly, “10K DNA analysis” is the size profiling of DNA in the range of 1 kbp to 10 kbp.
  • the "DNA 1 K buffer” designates the analysis buffer for this "DNA 1 K” analysis.
  • the “1 K DNA standard sample” refers to the standard sample that serves as a standard for the 1 K DNA analyses. It is also called “1 K DNA ladder”, or even “1 K standard sample”.
  • the number of returns preferably depends on the salinity of the samples.
  • two types of analysis are defined, one for unsalted or slightly salted samples, the other for salted samples. So :
  • the 1K standard sample contains DNA fragments of the following sizes: 100 bp, 150 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 1000 bp, and 1500 bp.
  • the 0 return method for device 40 is described in Table 2 below.
  • FIG. 4 represents an analysis result 80 for a standard sample of unsalted DNA: trace of the fluorescence of a standard unsalted sample according to a DNA 1 K analysis, “0 return” method.
  • Each fluorescence peak 81 corresponds to the DNA size indicated on the graph in base pairs (bp).
  • Example 2 “0 return” method in device 40, salted samples.
  • the “0 return” method for device 40 is the same as in Example 1.
  • Figure 5 represents the 90 result for more or less salty standard DNA samples.
  • This analysis with the “0 return” method of samples containing: 0 mM NaCI is represented in curve 91, 10 mM NaCI, curve 92, 15 mM NaCI, curve 93, 20 mM NaCI, curve 94, 50 mM of NaCI, curve 95, 100 mM NaCI, curve 96, and 130 mM NaCI, curve 97.
  • the fluorescence values have been shifted on the vertical fluorescence axis by adding a constant to facilitate the visualization of the curves.
  • Figure 6 reports the areas 100 of the peaks as a function of the concentration of NaCI in the sample, for the peaks 10Obp, curve 101, 150bp, curve 102, 200bp, curve 103, 400bp, curve 104 and 1000bp, curve 105 as a function of the salt concentration in the DNA1 K buffer with the “0 return” method.
  • FIG 8 represents the 120 analysis with the "0 return” method of a sample of purified circulating DNA containing: 0 mM of NaCI, curve 121, 10 mM of NaCI, curve 122, 15 mM of NaCI, curve 123, 20 mM of NaCI, curve 124, 50 mM NaCI, curve 125, 100 mM NaCI, curve 126 and 130 mM NaCI, curve 127.
  • Figure 9 represents the evolution 130 of the area 131 of the first peak, on the left, and of the area 132 of the second peak, on the right, as a function of the NaCI concentration with the “0 return” method. The values are taken from figure 8. It is observed that, with the “0 return” method, the area of the second peak is stable whatever the concentration of salts in the sample. On the other hand, the area of the first peak is stable up to 10 to 15 mM, then decreases sharply. With 130 mM of salts in the sample, only 16% of the first peak 131 is retained during the concentration step.
  • Examples 3 to 9 illustrate results obtained by the implementation of the present invention.
  • experiments performed with samples containing DNA are described.
  • the present invention is not limited to this type of nucleic acid but extends, on the contrary, to other nucleic acids, for example single-stranded RNA or DNA.
  • Example 3 illustrated opposite Figures 11 to 15, by inserting two returns during the concentration step, it became possible to analyze small DNA samples containing up to 15 mM of salts, i.e. 50% more content than the 0 return method allows. Above 15 mM of salts, the small fragments are no longer correctly retained.
  • FIG 13 the temporal positioning of the two durations of returns 161 and 162 in the chronogram of the method. During these returns, since no electrical voltage is applied, the electrical current is zero.
  • the fluorescence profile is converted into a concentration profile thanks to the fluorescence profile of the standard sample, the concentration of which is known for each length of DNA fragment .
  • the slight decrease in intensity for the smaller DNA fragments is therefore compensated by the calibration based on the profile of the standard sample.
  • concentration at high pH it is preferable to carry out the concentration at high pH, so that the vast majority of proteins are negatively charged, and that the bonding of DNA to the walls via proteins disappears.
  • concentration at high pH takes place with returns, which makes it possible to evacuate the salts and the remains of proteins from the sample.
  • a new phase of concentration takes place, this time at neutral or slightly acidic pH, more favorable to separation.
  • This concentration phase allows the sample buffer to be changed.
  • a third step takes place the separation, identical to that which takes place in the other methods described in examples 1 and 2.
  • Example 6 thus shows how a standard DNA migrates in the same way in a plasma and in a non-salted buffer.
  • Example 7 we confirm the reliability of the method that is the subject of the invention by comparing circulating DNA size profiles obtained either by the method of Example 3 (two returns) after purification of the DNA, or by the process of example 5 directly on plasma (seven returns process).
  • the technology also works in a microfluidic chip format, and the present invention can be perfectly implemented for analyzes of salted DNA samples, or analyzes of DNA directly in biological fluids, using microfluidic chips.
  • Example 9 describes such a microfluidic chip.
  • FIG. 10 represents a typical operating sequence of a DNA analysis with the method object of the invention implemented with two returns and the device 40.
  • the distal capillary 47 is not represented in this figure.
  • the concentrated DNA is represented in black and the salts in hatching.
  • the sample is injected into the device, by applying pressure for a given duration.
  • the injected sample is pushed by pressure into the middle of the injection chamber 44.
  • the DNA is concentrated at the concentration junction 48 of the injection chamber 44, by the application of a first pressure causing a flow in a first direction of flow (from left on the right in figure 10) and a first electrical potential difference whose action on the nucleic acid molecules is opposite to the first direction of flow and causes the retention or braking of the nucleic acid molecules in the capillary .
  • the separation capillary 45 fills with the sample solution, except for the larger DNA fragments which remain retained at the concentration junction 48.
  • the migration speed of the smallest DNA fragments is lower than the average speed of the flow.
  • the ions forming the salts are too small for there to appear a transverse force pushing them towards the wall, and they advance at the average speed of the flow, more or less their speed of electrophoresis according to their positive charge or negative.
  • the sample is caused to flow in a second direction of flow opposite to the first direction of flow by applying a second pressure in the opposite direction to the pressure exerted on the solution of the sample.
  • Part of the sample solution which had entered the separation capillary 45 flows back into the injection chamber 44, entraining DNA fragments which thus return to the injection chamber 44.
  • the operation 65 is called a "return".
  • the concentration operation is stopped before the smallest fragments arrive at the end of the separation capillary and a second pressure is applied in the opposite direction to the first pressure to bring the volume of the separation capillary 45 back into the chamber. injection 44.
  • the DNA is again concentrated at concentration junction 48 of injection chamber 44, by application of the first pressure causing flow in the first direction of flow and of the first electrical potential difference whose action on the nucleic acid molecules is opposite to the first direction of flow and causes the retention of nucleic acid molecules in the capillary.
  • the separation capillary 45 fills with the sample solution, except for the largest DNA fragments which remain retained at the concentration junction 48. A new concentration step is thus carried out.
  • the sample is caused to flow in the second flow direction by applying a second pressure in the opposite direction to the pressure exerted on the sample solution. Again, part of the sample solution that had entered the separation capillary 45 flows back into the injection chamber 44, carrying DNA fragments which thus return to the injection chamber 44.
  • the DNA is again concentrated at concentration junction 48 of injection chamber 44, by application of the first pressure causing flow in the first direction of flow and of the first electrical potential difference whose action on the nucleic acid molecules is opposite to the first direction of flow and causes the retention of the nucleic acid molecules in the capillary.
  • the separation capillary 45 fills with the sample solution.
  • the DNA is separated according to size by a gradual drop in the electric field applied between the inlet 41 and the outlet 42, the pressure generally being kept constant.
  • the viscosity and the resistivity of the solution in the capillary are respectively 40 mPa.s and 12.4 O.m at 25°C.
  • the sample is subjected to a second electrical potential difference whose action on the nucleic acid molecules is opposite in the first direction of flow.
  • the second potential difference can therefore be identical to the first potential difference.
  • Example 3 Procedure with two returns for more or less salty standard DNA samples.
  • a method implementing two returns in a device 40 is described below.
  • the two passages at negative pressure -10 bars correspond to the two returns introduced during the concentration phase, operations 65 and 67 of FIG. 10, in accordance with the present invention.
  • a range of salts (0 mM to 130 mM) was made with a standard sample and analyzed with the two-way method.
  • 11 represents the result 140 of analysis with the two-return method of a standard sample containing 0 mM of NaCI in long regular broken lines, curve 141, containing 10 mM of NaCI in broken lines alternating between a line and a couple of dots, curve 142, containing 15 mM of NaCI in broken lines made up of regularly spaced dots, curve 143, containing 20 mM of NaCI in broken lines alternating between a short line and a dot, curve 144, containing 50 mM of NaCI in a continuous line, curve 145, containing 100 mM of NaCI in short regular broken lines, curve 146 and containing 130 mM of NaCI in broken lines alternating between a long line and a dot, curve 147.
  • Figure 12 reports the areas 150 of the peaks as a function of the concentration of NaCI in the standard sample, for the peaks 100 bp, curve 151, 150 bp, curve 152, 200 bp, curve 153, 400 bp, curve 154 and 1000 bp, curve 155.
  • the areas of the 200 bp, 400 bp and 1000 bp peaks remain stable regardless of the salt concentration in the sample.
  • the area of the 100 bp remains stable up to 15 mM of NaCl and then decreases sharply.
  • the area of the 150 bp decreases above 50 mM.
  • Switching to a two-return process therefore makes it possible to analyze DNA samples containing up to 15mM of salts in the sample.
  • the current profiles 160 during the analyzes are given in figure 13.
  • the zero current crossings 161 at minute 2 and 162 at minute 4.5 are the two returns that were introduced during the concentration phase, in accordance with the 'invention.
  • FIG. 14 represents the result 170 of the analysis with the two-return method of a sample of purified circulating DNA containing 0 mM of NaCI in long regular broken lines, curve 171 , containing 10 mM of NaCI in broken lines alternating one line and a couple of dots, curve 172, containing 15 mM of NaCl in broken lines made up of evenly spaced dots, curve 173, containing 20 mM of NaCl in broken lines alternating between a short line and a dot, curve 174, containing 50 mM of NaCI in solid line, curve 175, containing 100 mM NaCI in short regular broken lines, curve 176 and containing 130 mM NaCI in broken lines alternating a long line and a dot, curve 177.
  • FIG. 15 represents the evolution 180 of the area 181 of the first peak, on the left in each pair of areas, and of the area 182 of the second peak, on the right, as a function of the NaCl concentration with the method at two returns.
  • the values are taken from Figure 14.
  • the area 182 of the second peak is stable regardless of the salt concentration in the sample.
  • the area 181 of the first peak is stable up to 15 mM then decreases slightly down to 50 mM. With 130 mM of salts in the sample, 43% of the first peak is retained during the concentration step.
  • Example 4 made six returns.
  • Figure 17 shows the evolution of the area of the 10Obp peaks, curve 201, 150bp, curve 202, 200bp, curve 203, 400bp, curve 204 and 1000bp, curve 205, as a function of the concentration of NaCI in the sample with the six-return process. Peak area is stable for all peaks up to 130 mM NaCl. However, it seems that the 100 bp peak undergoes a slight decrease in intensity from 100 mM NaCl.
  • Switching to a six-return method therefore makes it possible to analyze DNA samples containing up to 130 mM of salts in the sample.
  • FIG. 18 represents results 210 for a more or less salty purified circulating DNA sample, with the six-return process the sample containing 0 mM NaCI in regular long dashed lines, curve 211 , 10 mM NaCI in dashed lines alternating a line and a couple of dots, curve 212, 15 mM of NaCI in broken lines made up of regularly spaced dots, curve 213, 20 mM of NaCI in broken lines alternating a short line and a dot, curve 214, 50 mM of NaCI in continuous line, curve 215, 100 mM of NaCI in short regular broken lines, curve 216 and 130 mM of NaCI in broken lines alternating a long line and a point, curve 217.
  • Graph 220 of figure 19 shows the evolution of the area 221 of the first peak and of the area 222 of the second peak as a function of the NaCI concentration with the six-return process. The values are taken from figure 18.
  • the area 221 of the first peak is stable up to 20-50 mM NaCl. At 100 and 130 mM, it shows a slight decrease in intensity. This drop in intensity is not a problem for the analysis, because it is corrected when converting the fluorescence results into concentration results thanks to the calibration based on the standard sample.
  • a first analysis buffer at basic pH, is added.
  • a pH8 Tris-acetate mixture was used: 20 mM Tris, 10 mM acetic acid, EDTA (Ethylenediaminetetraacetic, or ethylenediaminetetraacetic acid, a diaminotetracarboxylic acid) 0.5 mM, PVP (Polyvinylpyrrolidone) 5% , BSA (acronym of “bovine serum albumin”, or in French “albumine de serum bovine or BSA) 0.5 mg/mL.
  • RNAse Away (trademark) wash was added to the conditioning step.
  • Plasma samples are pretreated by proteinase K digestion in the presence of detergent, an operation intended to free the nucleic acids from the vesicles and nucleoprotein complexes in which they are most often trapped.
  • This proteinase K digestion step is commonly performed as the first step in DNA purification methods from a biological sample. We will simply make sure to put enough proteinase K (the activity of the enzyme depends on the supplier and the reference chosen), and to choose a non-ionic detergent (an ionic detergent causes electroosmosis and an electric current too high for the method).
  • 100 pL of plasma were pretreated with proteinase K; only 15 ⁇ L of pretreated plasma was placed in the Agilent CE injection vial. And about 1 pL of pretreated plasma was injected by the CE Agilent into the device 40 and analyzed by the 7-return method.
  • FIG. 20 represents the analysis 230 of a plasma with the seven-return method.
  • Figure 21 shows the current 240 obtained during the concentration step at pH8. This process comprises seven returns 241 to 247.
  • FIG. 22 shows the current obtained during the last stage 250 of concentration with the change of buffer. Around four minutes, the transition 251 between the two buffers in the separation capillary 45 can be visualized on the current.
  • the size profile in Figure 20 is a typical circulating DNA profile, with a main peak around 165 bp, and a second, smaller peak around 305 bp.
  • Example 6 Calibration for DNA circulating directly in plasma. Cancellation of the matrix effect.
  • the upper curve 261 corresponds to the pure standard sample, with 32 pg/pl, with a non-return process and the lower curve 262 corresponds to the standard sample spiked (or "spiked") in plasma, at a concentration of 9.1 ⁇ g/ ⁇ l.
  • the peaks of the two samples overlap correctly, with just a difference in fluorescence intensity that corresponds to the difference in concentration of the standard DNA in the two runs.
  • the concentration curve 270 is represented as a function of the size of the DNA fragments of the standard sample added to a plasma sample, using as calibration the migration of the pure standard sample. ; in other words, curve 262 is interpreted using curve 261 to calibrate DNA peak sizes.
  • Example 7 comparison of circulating DNA size profiles with or without prior purification of the DNA.
  • a plasma sample from a healthy donor was analyzed for its circulating DNA in two ways:
  • the concentration of circulating DNA in plasma between 75 and 1650 bp was measured at 7.1 pg/pL by the seven-return method.
  • the size profile is visually close; in particular, the asymmetry of the secondary peak and the ratio between the secondary peak and the main peak are similar in the two methods.
  • the seven-return process therefore makes it possible to determine the size profile of circulating DNA from only a few microliters of plasma, and without having to purify the DNA beforehand.
  • Example 8 performing a return for large DNAs
  • the 10K standard sample contains DNA fragments of the following sizes: 1kbp, 2kbp, 3kbp, 4kbp, 5kbp, 6kbp, 8kbp, 10kbp, and 20kbp.
  • 1 kbp is equal to 1000 bp, 1000 base pairs.
  • Examples 1 to 8 involve capillary devices 40, shown schematically in FIG.
  • the method that is the subject of the present invention also applies to microfluidic channels.
  • the present invention can therefore be implemented in microfluidic chips having a geometric shape configured so that small DNA fragments leak slowly in the event of high sample conductivity.
  • the flow zone that is to say the injection chamber 341 and the capillary 342 corresponding to the narrow channel have a depth (measured perpendicular to Figure 31) of two micrometers.
  • the shooting zone 343 is partially represented on the right of FIG. 31 . In this shooting zone, the narrow channel 342 downstream of the constriction has a width, measured from top to bottom in FIG. 31, of 15 ⁇ m.
  • the depth here 2 ⁇ m
  • the width here 15 ⁇ m
  • the depth can be increased, for example, up to 50 ⁇ m
  • the width here 15 ⁇ m
  • FIG. 32 illustrates, in the form of a flowchart, the steps of a particular embodiment of the desalting and concentration process 370 which is the subject of the invention and of the analysis process 350 which is the subject of the invention.
  • the method for desalting and concentrating 370 a sample of nucleic acids that is more conductive than an analysis buffer comprises, first of all, a step 352 of injecting the sample consisting of the nucleic acids and the first buffer in the device. During a step 353, the sample is transferred into the injection chamber 44. During a step 354, a laminar flow of the sample is carried out in a capillary provided with a local restriction of its section , in a first direction of flow. During this flow, the sample is subjected to a first electrical potential difference whose action on the nucleic acid molecules is opposite to the first direction of flow and causes the retention of nucleic acid molecules in the capillary, or at least their braking by pLAS effect in the separation capillary 45.
  • a measurement is made of the amperage flowing in the capillary during step 354.
  • a selection is made of a number of iterations of a alternation of steps 354 and 358, depending on the amperage measured.
  • the selected number of iterations of the alternation is an increasing function of the amperage of a peak of this measured amperage or of a peak of a derivative of this measured amperage.
  • the number of returns is not determined by a salinity measurement of the sample, it is predetermined, for example with a value given in one of examples 3 to 8.
  • the number of returns, and therefore of iterations is predetermined according to the minimum size of nucleic acids to be concentrated.
  • a favorable salinity is defined according to a minimum threshold fixed by the size of the nucleic acids to be concentrated.
  • the sizes of the nucleic acids retained are conditioned in particular by the flow rate, the voltage applied and the nature of the analysis buffer such as its conductivity.
  • a selection is made for a duration of at least one flow step 354 in the first flow direction.
  • the duration selected is a decreasing function of the amperage of a peak of this measured amperage or of a peak of a derivative of this measured amperage.
  • the duration of at least one concentration step is not determined by a salinity measurement of the sample, it is predetermined, for example with a value given in one of examples 3 to 8.
  • a laminar flow of the sample is carried out, in a second direction of flow opposite to the first direction of flow.
  • the sample is subjected to a second electric potential difference whose action on the molecules of nucleic acids is opposite to the first direction of flow.
  • step 358 If the number, selected or predetermined, of iterations of the alternation of steps 354 and 358 is greater than one, at the end of step 358, one returns to step 354. It is noted that, in the subsequent iterations, optional steps 355-357 may be omitted.
  • step 354-358 the desalting and nucleic acid concentration process is complete and the sample is extracted from the device.
  • an optional step 351 for releasing the nucleic acids, with or without purification may precede the iterations of steps 354 to 358.
  • a change of analysis buffer is carried out, the new buffer analysis buffer having a pH lower than that of the analysis buffer previously used.
  • the new buffer analysis buffer having a pH lower than that of the analysis buffer previously used.
  • the change of buffer /pH of step 359 is preferable before carrying out steps 360 to 363. If there are no proteins in the sample, steps 352 to 358 are carried out with an analysis buffer at a pH close to neutrality, or slightly acidic, and, after the last iteration of steps 354 to 358, one goes directly to step 360.
  • a laminar flow of the sample is carried out in a capillary provided with a local restriction of its section, in the first direction of flow.
  • the sample is subjected to an electrical potential difference whose action on the nucleic acid molecules is opposite to the first direction of flow and causes the retention of nucleic acid molecules in the capillary.
  • a separation by laminar flow of the sample is carried out in the capillary in the first direction of flow.
  • the sample is subjected to an electrical potential difference less than or equal to the first potential difference, the action of which on the nucleic acid molecules is opposite to the first direction of flow and causes a retention partial nucleic acid molecules in the capillary.
  • the difference electrical potential is decreasing during step 361, either in stages, or continuously decreasing, that is to say with a negative and non-zero time derivative.
  • a measurement of a temporal fluorescence profile of the nucleic acid molecules is carried out and a step of converting the temporal fluorescence profile into a concentration profile into nucleic acid molecules of different lengths.
  • the fluorescence profile of a standard sample is used, the concentration of which is known for each length of nucleic acid molecule to compensate for the experimental variations that exist from one day to another. , in terms of DNA passage time in front of the detector and fluorescence intensity.

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Abstract

Le procédé de dessalage et de concentration d'un échantillon d'acides nucléiques plus conducteur qu'un tampon d'analyse, comporte, au moins une itération d'une alternance : - d'une étape d'écoulement laminaire de l'échantillon dans un capillaire dans un premier sens d'écoulement, le capillaire étant muni d'une restriction locale de sa section et comportant le tampon d'analyse, pendant laquelle l'échantillon est soumis à une première différence de potentiel électrique dont l'action sur les molécules d'acides nucléiques est opposée au premier sens d'écoulement et provoque la retenue de molécules d'acides nucléiques dans le capillaire, - d'une étape d'écoulement laminaire de l'échantillon, dans un deuxième sens d'écoulement opposé au premier sens d'écoulement.

Description

PROCÉDÉ ET DISPOSITIF DE DESSALAGE ET DE CONCENTRATION OU D’ANALYSE D’UN ÉCHANTILLON D’ACIDES NUCLÉIQUES
Domaine technique de l’invention
La présente invention vise un procédé et un dispositif de dessalage et de concentration ou d’analyse d’un échantillon d’acides nucléiques. Elle s’applique, en particulier, à la concentration et à l’analyse de fragments d’ADN circulant et au diagnostic médical, notamment pour certains cancers.
État de la technique
L’ADN circulant dans le plasma sanguin est l’enjeu d’une intense recherche clinique actuellement en oncologie, car on peut y retrouver des mutations de l’ADN génomique présentes dans les cellules tumorales, qui orientent la thérapie à administrer au patient. Ces mutations, ou d’autres modifications du génome, peuvent servir de biomarqueur pour suivre l’évolution du cancer. Or, d’une façon générale, il manque des biomarqueurs faciles à suivre dans le cadre des cancers.
Par exemple, pour le cancer du pancréas, le seul biomarqueur de suivi utilisé en routine actuellement est le Ca 19.9 (Antigène carbohydrate 19.9) dosé dans le sang circulant. La sensibilité de ce biomarqueur est de 79% et sa spécificité de 82% dans ce cadre-là. Cependant, le taux de Ca 19.9 est élevé dans d’autres pathologies pancréatiques bénignes comme la pancréatite aiguë, et dans d’autres cancers digestifs. La recherche de biomarqueurs innovants est donc nécessaire, non seulement pour améliorer le diagnostic précoce du cancer du pancréas, mais aussi pour évaluer le pronostic de ces patients, leur suivi et notamment leur réponse aux traitements.
Il est établi que le sang véhicule une petite quantité d’ADN libre circulant provenant de la libération de matériel génétique par les tissus. Cet ADN libre circulant hors cellule (ADNcf) est sous la forme d’ADN double-brin d’une taille moyenne de 150-180pb correspondant à l’enroulement de l’ADN autour du nucléosome. Sa durée de vie est de moins de deux heures, avant qu'il ne soit filtré et éliminé de la circulation sanguine par la rate, le foie et les reins. Toutes les études s’accordent en une détection quantitative de base de l’ADNcf chez les individus sains et en son augmentation liée à différentes situations cliniques telles que les Accidents Vasculaires Cérébraux (AVC) et infarctus myocardiques, les exercices musculaires intensifs, l’insuffisance rénale aiguë, la cytolyse hépatique, les traumatismes, la chirurgie, le cancer, la présence d’un fœtus lors de la gestation...
Dans le cas du cancer, les progrès récents de la biologie moléculaire et du séquençage de l’ADN ont permis d’identifier de nombreuses mutations de gènes impliqués dans l’oncogenèse à partir de l’ADN circulant tumoral (ADNct). Une étude de 2014 de Bettegowda et al. a montré que le taux d’ADN tumoral circulant serait corrélé à la charge tumorale et au stade du cancer : il serait plus bas pour les cancers localisés que pour les cancers métastatiques.
L’utilisation en routine de l’ADNct comme biomarqueur tumoral donne des perspectives dans le dépistage, le diagnostic, la décision thérapeutique et le suivi des patients atteints de cancer. Seulement une dizaine d’études se sont intéressées à l’ADNct chez des patients porteurs d’un cancer du pancréas réséqué. Dans la majorité de ces publications, l’ADNct est détecté par la recherche de mutations KRAS par PCR (acronyme de Polymerase Chain Reaction pour réaction en chaine par polymérase). Mais l’adénocarcinome pancréatique présente de nombreuses autres mutations portant sur les gènes Tp53 ou p16. Ainsi il est plus avantageux du point de vue clinique d’effectuer des analyses complémentaires de ces gènes par séquençage haut débit (NGS).
Les mécanismes contribuant à la production dADNcf comportent l'apoptose, la nécrose, la NETose, la sécrétion active des cellules qui entraîne la libération d’ADN sous forme de véhicules extracellulaires (VE), l'altération des mécanismes de clairance. Ces mécanismes peuvent se différencier en fonction de la taille d’ADNcf qui est détecté dans la circulation sanguine.
Ainsi, les phénomènes physiologiques et pathologiques à l’origine de la libération passive et active d’ADN libre, se distinguent à l’aune de leur taille.
Dans le cas du cancer du pancréas, quelques articles très récents traitent de l’intérêt de mesurer la taille de l’ADNcf. Ainsi, Lapin M. et al. ‘Fragment size and level of cell-free DNA provide prognostic information in patients with advanced pancreatic cancer3’. J Transi Med, 2018. 16(1): p. 300.) montrent, en 2018, que la taille des fragments d'ADNct et les concentrations d'ADNct peuvent être utilisées pour prédire l'issue de la maladie chez les patients atteints d'un cancer du pancréas avancé. Zvereva M. et al. ‘Circulating tumour-derived KRAS mutations in pancreatic cancer cases are predominantly carried by very short fragments of cell-free DNA.” EBioMedicine, 2020. 55: p. 102462.) montrent que la proportion de cas présentant des mutations KRAS détectables par PCR est inversement proportionnelle à l'augmentation de la longueur des amplicons ; seulement la moitié des cas avec une PCR de 218 pb présente un ADNct détectable par rapport à ceux détectés avec des amplicons de moins de 80 pb. Enfin Liu X. et al. (‘Enrichment of short mutant cell-free DNA fragments enhanced detection of pancreatic cancer." EBioMedicine, 2019. 41 : p. 345-356.) montrent qu’il est possible d’enrichir la détection de mutations en créant des processus NGS adaptés à des fragments de très courtes tailles.
Concernant les limites actuelles à l’utilisation de l’ADNcf comme biomarqueur en routine diagnostic, les principaux obstacles sont liés : a/ aux processus pré-analytiques ; l’ADNcf peut être contaminé par la libération artéfactuelle d'ADN leucocytaire in vitro, il est donc fondamental d’utiliser des protocoles standardisés. b/ à la normalisation de l'extraction d’ADNcf et sa quantification ; il existe une grande variété de "protocoles internes" mais dans la plupart des cas, il n’existe aucune véritable stratégie de contrôle qualité et de standardisation des méthodes de quantification et normalisation de l’ADNcf extrait. c/ à l’absence de méthode générale pan-tumeurs permettant de caractériser l’ADNcf ; en l’absence d’anomalies génomiques somatiques, la caractérisation du profil de la taille du cfDNA, et donc son origine, est une piste très intéressante mais les approches actuelles sont soit trop complexes et coûteuses, soit insuffisamment sensibles pour un profilage de tous les patients, quel que soit le stade de la maladie, sujets sains compris.
Le dispositif décrit dans les documents PCT/FR2016/051774 et WO/2017/009566 permet de déterminer facilement et de façon économique la caractérisation du profil de taille du cfDNA. Afin d'analyser l'ADN, le dispositif opère en deux étapes de concentration et de séparation réalisées en ligne. D'abord, l'ADN est concentré via un système de capillaires formé de la jonction d'un petit capillaire et d'un autre de plus grande section. Les chercheurs font s’écouler de façon laminaire une solution contenant de l'ADN dans le grand capillaire et utilisent un champ électrique pour ralentir la migration. À cause du cisaillement apporté par l’écoulement laminaire, cette contre-électrophorèse fait apparaître une force transverse, dépendante de la taille de l’ADN, qui pousse l’ADN vers les parois. Le changement de vitesse d'écoulement et de champ électrique au niveau de la constriction permet d'arrêter l'ADN et de le concentrer comme une « galette ». En effet, en amont de la constriction, l’écoulement et la contre-électrophorèse sont lents, provoquant une faible force transverse. L’ADN se trouve donc dans la masse de l’écoulement, et avance vers la constriction. En revanche, en aval de la constriction, l’écoulement et la contre-électrophorèse sont rapides plaquant fortement l’ADN à la paroi, à un endroit où l’écoulement laminaire est très faible, et où la contre- électrophorèse domine. L’ADN recule alors vers la constriction, par contre-électrophorèse, le long de la paroi. Cette galette est ensuite libérée par la baisse progressive du champ électrique, ce qui permet également d'effectuer l'opération de séparation en fonction de la taille des fragments. Cette technologie est appelée « pLAS » dans la suite de la description.
La figure 1 est un schéma d’un tel dispositif 40. Ce dispositif 40 peut être installé dans une CE (acronyme de « Capillary electrophoresis » ou électrophorèse capillaire) Agilent (marque déposée), à la place d’un capillaire standard.
La longueur totale du dispositif est d’environ 30 cm, longueur minimale qui peut être installée dans une CE Agilent, qui permet d’appliquer pression et voltage aux bornes du dispositif capillaire. On trouve, de l’entrée (« inlet ») 41 vers la sortie (« outlet ») 42 :
- un embout d’injection 43, de 5,5 cm de long et de 40 pm de diamètre ; cet embout sert de filtre, et permet de positionner la chambre d’injection à l’intérieur de la cassette ventilée de la CE Agilent, au-delà de l’électrode.
- une chambre d’injection 44, constituée d’un segment de capillaire de deux cm de long, qui présente un grand diamètre interne, par exemple de 350 pm.
- un capillaire de séparation 45, de diamètre interne de 40 pm et long de neuf cm. La mesure 46 en fluorescence des molécules d’ADN a lieu sept cm après la jonction de concentration.
- un capillaire distal 47 de 100 pm de diamètre interne et de 13 cm de long, qui permet de rejoindre le flacon de sortie sur la CE Agilent. Ce capillaire 47 présente un plus grand diamètre que le capillaire 45 de façon que sa résistance électrique et sa résistance hydraulique soient petites devant les résistances cumulées de l’embout d’injection 43 et du capillaire de séparation 45. Si le capillaire de séparation 45 allait jusqu’à l’outlet 42, le voltage et la pression à appliquer pour retenir des petits fragments d’ADN seraient au- delà de ce que permet l’instrument.
Les dimensions données ci-dessus ne sont que des exemples. Par exemple, un diamètre de capillaire un peu plus élevé peut être adapté aux très grands fragments d’ADN (200 kb), ou la façon d’assembler les capillaires peut être modifiée pour faire du fractionnement d’ADN, par exemple pour favoriser la quantité d’ADN qu’on peut stocker à une jonction, au détriment de la résolution d’analyse.
La zone de concentration se trouve à la jonction entre la chambre d’injection 44 et le capillaire de séparation 45. Dans la suite de la description, on considère que ce capillaire distal 47 ne joue pas de rôle dans la concentration des fragments d’ADN.
La figure 2 représente la séquence typique d’une analyse d’ADN avec ce dispositif 40. Le capillaire distal 47 n’est pas représenté dans cette figure. Au cours d’une opération 51 , l’échantillon est injecté dans le dispositif, par l’application d’une pression pendant une durée donnée.
Au cours d’une opération 52, l’échantillon injecté est poussé par pression au milieu de la chambre d’injection 44.
Au cours d’opérations 53 et 54, l’ADN est concentré à la jonction de concentration 48 de la chambre d’injection 44, par l’application d’une pression et d’un voltage. Au démarrage de la concentration, le capillaire de séparation 45 se remplit de la solution de l’échantillon, sauf les plus grands fragments d’ADN, qui restent retenus à la jonction de concentration 48.
Au cours d’une opération 55, l’ADN retenu à la jonction de concentration 48 est séparé selon la taille par une baisse progressive du champ électrique appliqué entre l’inlet 41 et l’outlet 42, la pression étant en général maintenue constante. Les fragments d’ADN sont détectés par fluorescence lors de leur passage devant le détecteur 46.
Typiquement, lors de l’étape de concentration, on applique les ordres de grandeurs physiques suivants pour retenir des fragments d’ADN aussi petits que 100 bp :
- voltage : 25 000 V
- pression : 10 bars
- la viscosité et la résistivité de la solution dans le capillaire sont respectivement de 40 mPa.s et 12,4 Q.m à 25°C.
Dans le capillaire de séparation 45, on obtient :
- un champ électrique de 1500 V/cm et
- une vitesse fluidique moyenne de 9 mm/s.
La valeur du champ électrique donnée ci-dessus est valable tant que la conductivité de l’échantillon est proche de, ou inférieure à, celle du tampon d’analyse (environ 12,4 Q.m à 25°C). Ceci est en général le cas quand l’ADN est purifié au préalable, et repris dans un tampon peu conducteur.
Mais quand l’échantillon contient des sels, la résistance électrique du capillaire de séparation chute soudainement au démarrage de la concentration (étape 53), et le champ électrique présent au niveau de la jonction de concentration 48 chute brutalement, et peut ne plus suffire à concentrer les plus petits fragments d’ADN.
Le phénomène est exposé de façon analytique et schématique ci-dessous, pour un dispositif qui serait parfaitement symétrique de part et d’autre de la chambre d’injection 44.
Quand on applique un voltage U aux bornes du dispositif capillaire, un courant électrique s’établit, selon la loi d’Ohm U = Ri, R étant la résistance électrique du dispositif, et / le courant électrique.
Localement, en tout point de la longueur du dispositif, la loi d’Ohm s’écrit E =
Figure imgf000005_0001
i, avec E le champ électrique en Volt par mètre, p la résistivité électrique de l’électrolyte en Ohm. mètre, et S la section du dispositif capillaire en mètre carré, au point considéré, /, exprimé en ampère, étant constant tout le long du dispositif.
Quand on injecte un échantillon salé, donc de faible résistivité p, dans un dispositif, puis qu’on applique pression et voltage pour le concentrer, après un court moment, l’embout 43 du dispositif est rempli du tampon d’analyse, typiquement de l’ordre de p=10 Q.m, alors que le capillaire de séparation 45 est rempli de la solution de l’échantillon, typiquement p=0,7 Q.m pour du plasma humain, ce qui correspond environ à 130 mM de NaCI. Puisque, dans l’embout 43 comme dans le capillaire de séparation on a [Math 1] E = les champs électriques Ei et E2 présents respectivement dans l’embout et le capillaire de séparation sont dans un rapport [Math 2] — = — = — = 0,07.
P 1 10
Le champ électrique dans le capillaire de séparation 45, qui doit retenir l’ADN dans la chambre d’injection 44, ne vaut donc que 7% de la valeur du champ électrique dans l’embout du dispositif. Pour obtenir un champ électrique de 1500 V/cm dans le capillaire de séparation, il faudrait alors un champ électrique de 21400 V/cm dans l’embout 43, qui n’est pas atteignable en pratique à cause de réchauffement par effet Joule que cela engendrerait, cet échauffement entraînant à son tour un dégazage de l’électrolyte dans le capillaire, d’où la formation de bulles d’air coupant la continuité électrique de l’électrolyte, annulant quasiment tout champ électrique en aval, dans le capillaire de séparation.
On peut modéliser le champ électrique à la sortie de la jonction de concentration 48 et à la sortie du dispositif tout au long d’un procédé de concentration/séparation tel que décrit dans les étapes 53 à 55, pour un dispositif 40 auquel on applique 25000 Volts.
On représente, en figure 3, le champ électrique 70 calculé à un millimètre en aval de la jonction de concentration 48, en fonction du temps. À t=0, l’échantillon est au milieu de la chambre d’injection 44, avec un volume égal à la moitié du volume de la chambre d’injection 44, soit environ 1 pL. L’échantillon a une conductivité de 0,7 O.m. Le champ électrique est calculé un mm après la jonction de concentration 48, sans tenir compte de l’effet de réchauffement du capillaire 45 par effet Joule sur la conductivité et la viscosité de la solution, ni du phénomène d’électroosmose qui accélère l’écoulement. Le débit est alors de 0,68 pL/min tout au long de l’analyse.
Pendant une phase 71 , l’échantillon est complètement à l’intérieur de la chambre d’injection 44 ; le capillaire de séparation et le capillaire d’entrée, ainsi que le capillaire distal, sont complètement remplis du tampon d’analyse, qui a une conductivité de 12,4 O.m. Le champ électrique vaut 1500 V/cm, champ largement suffisant pour retenir les fragments de 100 bp.
Pendant une phase 72, l’échantillon de faible résistivité remplit rapidement le capillaire de séparation 45, qui représente un volume de 0,1 1 pL. Quand l’interface entre l’échantillon et le tampon d’analyse arrive au point d’observation, à 1 mm en aval de la jonction de concentration, le champ électrique chute brutalement à environ 90 V/cm ; puis il remonte légèrement au fur et à mesure que le capillaire de séparation se remplit d’échantillon.
Pendant une phase 73, l’échantillon remplit encore en partie la chambre d’injection 44, il remplit complètement le capillaire de séparation 45, et il remplit progressivement le capillaire distal 47, qui représente un volume de 1 ,02 pL. Le champ électrique s’élève lentement jusqu’à 215 V/cm. Un tel champ est très insuffisant pour retenir les plus petits fragments d’ADN.
Pendant une phase 74, l’échantillon est complètement évacué de la chambre d’injection 44, et se retire rapidement du capillaire de séparation 45, puis plus lentement du capillaire distal 47 ; le champ augmente brutalement au moment où l’échantillon ne remplit plus le point d’observation, mais remplit encore l’essentiel du capillaire de séparation 45. Pendant une phase 75, l’échantillon de conductivité 0,7 O.m est complètement évacué du dispositif. On retrouve le champ électrique initial de 1500 V/cm.
À l’extrémité distale du capillaire de séparation 45, avant le capillaire distal 47, on observe un profil similaire, mais décalé dans le temps puisque l’interface entre échantillon et tampon d’analyse arrive plus tard à ce niveau.
La faiblesse du champ électrique pendant les phases 72 et 73 empêche la concentration des plus petits fragments d’ADN.
La description en regard des figures 5 à 9 illustre expérimentalement le phénomène sur un échantillon d’ADN étalon ainsi que sur un échantillon réel d’ADN circulant. On y voit qu’au-delà de 10 mM NaCI dans l’échantillon, les fragments de 100 bp ne sont plus complètement retenus, et qu’au-delà de 20 mM NaCI, ces fragments ne sont quasiment plus retenus. En outre, la figure 7, qui montre l’ampérage circulant dans le capillaire pendant l’étape de concentration, illustre la cinétique d’évacuation des sels du dispositif.
On connaît les publications scientifiques suivantes qui divulguent une méthode de concentration et de séparation d’ADN, une telle méthode comportant l’application d’un champ électrique combiné à un flux hydrodynamique dans un capillaire comportant une restriction :
- Andriamanampisoa et al., « BIABooster: Online DNA Concentration and Size Profiling with a Limit of Detection of 10 fg/pL and Application to High-Sensitivity Characterization of Circulating Cell-Free DNA », Anal. Chem. 2018, 90, 3766-3774; et
- Milon et al., « pLAS technology for DNA isolation coupled to Cas9-assisted targeting for sequencing and assembly of a 30 kb region in plant genome », Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No. 15, 8050-8060.
Cependant, de telles méthodes ne permettent pas de réaliser le dessalage d’un échantillon d’acides nucléiques.
On connaît également la publication scientifique de Davis et al., « Capillary and Microfluidic Gradient Elution Isotachophoresis Coupled to Capillary Zone Electrophoresis for Femtomolar Amino Acid Detection Limits », Anal. Chem. 2009, 81 , 5452-5459, qui divulgue une méthode de concentration et de séparation d’acides aminés. Cependant, cette méthode ne permet pas le dessalage d’un échantillon d’acides nucléiques.
Présentation de l’invention
La présente invention vise à remédier à tout ou partie de ces inconvénients.
À cet effet, selon un premier aspect, la présente invention vise un procédé de dessalage et de concentration d’un échantillon d’acides nucléiques plus conducteur qu’un tampon d’analyse, procédé qui comporte, au moins une itération d’une alternance :
- d’une étape d’écoulement laminaire de l’échantillon dans un capillaire dans un premier sens d’écoulement, le capillaire étant muni d’au moins une restriction locale de sa section et comportant le tampon d’analyse, pendant laquelle l’échantillon est soumis à une première différence de potentiel électrique dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque la retenue de molécules d’acides nucléiques dans le capillaire, - d’une étape d’écoulement laminaire de l’échantillon, dans un deuxième sens d’écoulement opposé au premier sens d’écoulement.
Autrement dit :
- lors de l’étape d’écoulement laminaire de l’échantillon dans un capillaire muni d’une restriction locale de sa section, dans le premier sens d’écoulement, une pression supérieure à la pression présente dans la restriction est appliquée en amont de la restriction ; et
- lors de l’étape d’écoulement laminaire de l’échantillon, dans un deuxième sens d’écoulement opposé au premier sens d’écoulement, une pression inférieure à la pression présente dans la restriction est appliquée en amont de la restriction.
Les inventeurs ont découvert que, quand le champ électrique est insuffisant pour retenir les petits fragments d’ADN à la jonction de concentration, ces fragments fuient dans le capillaire de séparation. Mais les phénomènes mis en œuvre les poussent toujours vers la paroi, même si ce plaquage à la paroi est insuffisant pour que la contre-électrophorèse soit plus forte que l’écoulement fluidique. Il s’ensuit que la vitesse de migration de ces fragments d’ADN est plus faible que la vitesse moyenne de l’écoulement. En revanche, les ions formant les sels sont trop petits pour qu’il apparaisse une force transverse les poussant vers la paroi, et ils avancent à la vitesse moyenne de l’écoulement, plus ou moins leur vitesse d’électrophorèse selon leur charge positive ou négative.
Ainsi, on arrête l’opération de concentration avant que les plus petits fragments arrivent à l’extrémité du capillaire de séparation 45 et on applique une pression, seule ou en présence d’une différence de potentiel, en sens contraire de la pression initiale pour ramener le volume du capillaire de séparation dans la chambre d’injection. Puis, on effectue une nouvelle étape de concentration et, éventuellement, on réitère cette alternance de phases de retour et de concentration. Les sels s’évacuent ainsi progressivement du dispositif, alors que les molécules d’ADN sont essentiellement conservées.
Les petits fragments d’ADN peuvent donc être analysés correctement, ce qui était impossible avec les dispositifs et procédés de l’art antérieur.
Dans des modes de réalisation, au cours de l’étape d’écoulement laminaire de l’échantillon, dans le deuxième sens d’écoulement, l’échantillon est soumis à une deuxième différence de potentiel électrique dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement.
On note que la deuxième différence de potentiel peut être égale, supérieure ou inférieure à la première différence de potentiel.
Ainsi, les molécules encore proches des parois du capillaire de séparation reviennent plus rapidement dans la chambre d’injection que lors d’un retour par pression simple. En effet, d’une part l’électrophorèse s’ajoute à l’écoulement, et l’électrophorèse est de vitesse constante dans un plan transversal à l’écoulement, contrairement à l’écoulement fluidique laminaire, qui est nul à la paroi et maximal au centre. Et, d’autre part, il apparaît une force transverse poussant cette fois les molécules vers le centre de la veine fluidique (et non vers les parois, comme c’est le cas pendant la phase de concentration), là où l’écoulement est plus rapide.
Dans des modes de réalisation, le procédé comporte, de plus, une étape de mesure de l’ampérage circulant dans le capillaire pendant au moins une étape d’écoulement dans le premier sens d’écoulement et une étape de sélection d’un nombre d’itérations de l’alternance en fonction de l’ampérage mesuré. Grâce à ces dispositions, on estime la conductivité de l’échantillon, représentative de sa salinité par l’intermédiaire de la mesure du courant traversant l’échantillon et, en fonction de cette salinité, on choisit un nombre d’alternances d’écoulements dans un sens puis dans l’autre permettant de réduire cette salinité à un niveau adéquat.
Dans des modes de réalisation, le nombre d’itérations de l’alternance est une fonction croissante de l’ampérage d’un pic de cet ampérage mesuré ou d’un pic d’une dérivée de cet ampérage mesuré.
Les inventeurs ont observé que la hauteur d’au moins un pic de l’ampérage mesuré ainsi que le pic de la dérivée première de l’ampérage mesuré sont des fonctions croissantes de la salinité de l’échantillon.
Dans des modes de réalisation, le procédé comporte, de plus, une étape de mesure de l’ampérage circulant dans le capillaire pendant au moins une étape d’écoulement dans le premier sens d’écoulement et une étape de sélection d’une durée d’au moins une étape d’écoulement dans le premier sens d’écoulement en fonction de l’ampérage mesuré.
L’estimation de la salinité permet d’estimer la vitesse de déplacement des petits fragments d’acides nucléiques. On choisit donc une durée d’écoulement évitant que ces petits fragments sortent du capillaire.
Dans des modes de réalisation, la durée sélectionnée est une fonction décroissante de l’ampérage d’un pic de cet ampérage mesuré ou d’un pic d’une dérivée de cet ampérage mesuré.
Dans des modes de réalisation, le procédé comporte, après une itération de l’alternance, une étape de changement de tampon d’analyse, le nouveau tampon d’analyse présentant un pH inférieur à celui du tampon d’analyse précédemment utilisé.
Par exemple, dans un échantillon biologique comportant des protéines, certaines de ces protéines sont chargées positivement et se fixent alors aux parois du capillaire, ainsi qu’aux acides nucléiques, qui sont chargés négativement. Ceci entraîne un collage des acides nucléiques aux parois, collage délétère pour l’analyse. En choisissant un tampon à pH élevé, la majorité des protéines est chargée négativement, et le collage des acides nucléiques aux parois est réduit, voire disparaît. Mais, à pH élevé, une séparation des acides nucléiques n’est pas aussi résolue qu’à pH neutre ou légèrement acide. Avec un changement de tampon, on restaure la capacité de séparation des acides nucléiques.
Selon un deuxième aspect, la présente invention vise un procédé d’analyse d’un échantillon d’acides nucléiques, qui comporte les étapes du procédé de dessalage et de concentration d’un échantillon objet de l’invention et, après la dernière itération de l’alternance, une étape de séparation par écoulement laminaire de l’échantillon dans le capillaire dans le premier sens d’écoulement, pendant laquelle l’échantillon est soumis à une différence de potentiel électrique inférieure ou égale à la première différence de potentiel, dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque une retenue partielle de molécules d’acides nucléiques dans le capillaire.
On retient ainsi partiellement, les acides nucléiques, ce qui améliore leur séparation en fonction de leur taille.
Dans des modes de réalisation, au cours de l’étape de séparation, la différence de potentiel électrique est décroissante.
Les plus grands fragments d’acides nucléiques sont ainsi retenus plus longtemps dans le dispositif capillaire, si bien que l’analyse des tailles des acides nucléiques est plus fine. Dans des modes de réalisation, le procédé d’analyse comporte, pendant ou après l’étape de séparation, une étape de mesure d’un profil temporel de fluorescence des molécules fluorescentes d’acides nucléiques et une étape de conversion du profil temporel de fluorescence en un profil de concentration en molécules d’acides nucléiques de différentes longueurs, par la mise en œuvre d’un profil de fluorescence d’un échantillon étalon, dont on connaît la concentration pour chaque longueur de molécule fluorescente d’acides nucléiques.
Les molécules d’acides nucléiques sont rendues fluorescentes par une des techniques connues de la personne du métier, par exemple, par ajout d’un fluorophore intercalant. Un fluorophore intercalant est une molécule qui fluoresce peu à l’état libre, et qui fluoresce beaucoup quand elle est intercalée entre les bases de l’ADN.
On réalise ainsi une analyse des échantillons avec une compensation des variations expérimentales qui existent d’un jour à l’autre, en termes de temps de passage de l’ADN devant le détecteur et en termes d’intensité de fluorescence.
Selon un troisième aspect, la présente invention vise un dispositif configuré pour mettre en œuvre un procédé de dessalage et de concentration objet de l’invention ou un procédé d’analyse objet de l’invention d’un échantillon d’acides nucléiques plus conducteur qu’un tampon d’analyse, le dispositif comportant :
- un capillaire muni d’une restriction locale de sa section et comportant le tampon d’analyse,
- un moyen de mise en écoulement laminaire de l’échantillon dans le capillaire, dans un premier sens d’écoulement,
- un moyen d’application d’une première différence de potentiel électrique pendant l’écoulement dans le premier sens, différence de potentiel dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque la retenue de molécules d’acides nucléiques dans le capillaire,
- un moyen de mise en écoulement laminaire de l’échantillon dans le capillaire, dans un deuxième sens d’écoulement opposé au premier sens d’écoulement et
- un moyen de commande des moyens de mise en écoulement laminaire et du moyen d’application de la première différence de potentiel configuré pour commander au moins une itération d’une alternance,
- d’un écoulement laminaire de l’échantillon dans le capillaire dans le premier sens d’écoulement, écoulement pendant lequel l’échantillon est soumis à la première différence de potentiel électrique et
- d’un écoulement laminaire de l’échantillon dans le deuxième sens d’écoulement.
Dans des modes de réalisation, le capillaire est formé d’un canal microfluidique.
Les avantages, buts et caractéristiques particulières de ce procédé d’analyse et de ce dispositif étant similaires à ceux du procédé de dessalage et de concentration ou d’analyse d’un échantillon d’acides nucléiques objet de l’invention, ils ne sont pas rappelés ici.
Brève description des figures
D’autres avantages, buts et caractéristiques particulières de l’invention ressortiront de la description non limitative qui suit d’au moins un mode de réalisation particulier du procédé et du dispositif de dessalage et de concentration ou d’analyse objet de la présente invention, en regard des dessins annexés, dans lesquels : la figure 1 représente, schématiquement, un dispositif capillaire de l’art antérieur, la figure 2 représente une séquence de fonctionnement typique d’une analyse d’ADN avec le dispositif illustré en figure 1 , la figure 3 représente un champ électrique calculé, au cours du temps, à un mm en aval de la jonction de concentration du dispositif illustré en figure 1 fonctionnant comme illustré en figure 2, quand l’échantillon présente une conductivité 18 fois plus élevée que celle du tampon d’analyse, la figure 4 représente un résultat d’analyse pour un échantillon d’ADN non salé, avec le dispositif illustré en figure 1 fonctionnant comme illustré en figure 2, la figure 5 représente un résultat d’analyse pour des échantillons d’ADN étalon plus ou moins salés, avec le dispositif illustré en figure 1 fonctionnant comme illustré en figure 2, la figure 6 rapporte les aires des pics de la figure 5, en fonction de la concentration en NaCI dans l’échantillon, la figure 7 montre l’ampérage circulant dans le capillaire pendant l’étape de concentration des analyses représentées en figure 5, illustrant la cinétique d’évacuation des sels du dispositif illustré en figure 1 , la figure 8 représente l’analyse d’un échantillon d’ADN circulant purifié contenant plus ou moins de sel, avec le dispositif illustré en figure 1 fonctionnant comme illustré en figure 2, la figure 9 représente l’évolution de l’aire du premier pic et du deuxième pic des graphes de la figure 8 en fonction de la concentration en NaCI dans l’échantillon, avec le dispositif illustré en figure 1 fonctionnant comme illustré en figure 2, la figure 10 représente une séquence de fonctionnement typique d’une analyse d’ADN avec le procédé objet de l’invention mettant en œuvre deux retours, la figure 11 représente une analyse réalisée avec le dispositif illustré en figure 1 fonctionnant selon la séquence illustrée en figure 10, pour des échantillons comportant plus ou moins de sel, la figure 12 rapporte les aires des pics de la figure 11 , en fonction de la concentration en NaCI dans l’échantillon, la figure 13 illustre le positionnement temporel des deux durées de retours dans le chronogramme d’un mode de réalisation du procédé, retours pendant lesquels, puisqu’aucun voltage électrique n’est appliqué, le courant électrique est nul, la figure 14 représente le résultat d’une analyse avec le dispositif illustré en figure 1 fonctionnant selon la séquence illustrée en figure 10 pour des échantillons d’ADNcf préalablement purifiés comportant plus ou moins de sel la figure 15 représente l’évolution de l’aire du premier pic et du deuxième pic des courbes la figure 14 en fonction de la concentration en NaCI, avec le dispositif illustré en figure 1 fonctionnant comme illustré en figure 10, la figure 16 représente une analyse réalisée avec le dispositif illustré en figure 1 fonctionnant selon une séquence à six retours, pour des échantillons étalons comportant plus ou moins de sel la figure 17 rapporte les aires des pics de la figure 16, en fonction de la concentration en NaCI dans l’échantillon, la figure 18 représente le résultat d’une analyse avec le dispositif illustré en figure 1 fonctionnant selon une séquence à six retours pour des échantillons d’ADNcf préalablement purifiés comportant plus ou moins de sel, la figure 19 représente l’évolution de l’aire du premier pic et du deuxième pic des courbes de la figure 18 en fonction de la concentration en NaCI, avec le dispositif illustré en figure 1 fonctionnant selon une séquence à six retours, la figure 20 montre le résultat de l’analyse d’un plasma avec une séquence comportant sept retours avec changement de tampon, la figure 21 montre le courant électrique obtenu lors de l’étape de concentration à pH8 de l’analyse illustrée en figure 20, avec sept retours, la figure 22 montre le courant électrique obtenu lors de la dernière étape de concentration de l’analyse illustrée en figure 20 avec un changement de tampon, la figure 23 montre la comparaison de migrations d’un échantillon étalon seul ou dans le plasma, dans un procédé à sept retours, la figure 24 montre la comparaison des migrations d’un échantillon étalon seul ou dans le plasma, dans un procédé à sept retours, la figure 25 représente une analyse d’un échantillon d’ADN circulant directement à partir du plasma avec tracé de fluorescence, la figure 26 représente un profil de concentration selon la taille pour l’analyse illustrée en figure 25, la figure 27 représente une analyse du même échantillon d’ADN circulant que celui des figures 25 et 26, après purification de l’ADN à partir du plasma, avec tracé de fluorescence, la figure 28 représente un profil de concentration selon la taille pour l’analyse illustrée en figure 27, la figure 29 représente un résultat d’analyse avec un procédé de concentration/séparation sans retour sur des grands fragments d’ADN, la figure 30 représente un résultat d’analyse avec un procédé de concentration/séparation avec un retour sur des grands fragments d’ADN, la figure 31 représente un dispositif microfluidique pour la mise en œuvre du procédé objet de l’invention et la figure 32 illustre, sous forme d’un logigramme, des étapes d’un mode de réalisation particulier du procédé objet de l’invention.
Description des modes de réalisation
La présente description est donnée à titre non limitatif, chaque caractéristique d’un mode de réalisation pouvant être combinée à toute autre caractéristique de tout autre mode de réalisation de manière avantageuse.
On note dès à présent que les figures ne sont pas à l’échelle.
Dans des modes de réalisation, tout ou partie des moyens et variantes des dispositifs divulgués dans la demande internationale WO/2017/009566 sont configurés pour mettre en œuvre la méthode objet de l’invention. Autrement dit, dans ces modes de réalisation, les caractéristiques structurelles des dispositifs divulgués, par exemple vis-à-vis des dimensions du capillaire muni d’une restriction locale, sont transposables au procédé objet de l’invention.
Dans des modes de réalisation, le tampon d’analyse est un fluide viscoélastique. Préférentiellement, une telle viscoélasticité est obtenue par ajout d’un polymère neutre. Plus préférentiellement, un tel polymère neutre est utilisé dans le tampon d’analyse à une concentration massique comprise entre 0,1 et 10%. Par exemple, un tel polymère neutre est choisi parmi le polyvinylpyrrolidone (PVP), le poly(oxyde d'éthylène) (PEO) et le polyacrylamide (PAM) ou leur mélange.
Dans des variantes, le tampon d’analyse n’est pas un fluide viscoélastique et notamment ne contient pas de polymère neutre. Préférentiellement, de telles variantes sont appliquées à des échantillons comportant de grands fragments d’acides nucléiques, par exemple, présentant une taille supérieure ou égale à 1000 bp.
Dans des modes de réalisation, le capillaire présente un diamètre, en amont de la restriction locale, d’au moins 100 pm et préférentiellement d’au moins 300 pm.
Dans des modes de réalisation, le diamètre du capillaire en amont de la restriction locale est compris entre 300 pm et 600 pm.
Dans des modes de réalisation, la restriction locale présente une section d’au moins 2 pm, préférentiellement d’au moins 20 pm et plus préférentiellement d’au moins 40 pm. Préférentiellement, une telle section est inférieure à 100 pm.
Dans des modes de réalisation, le dispositif présente une pluralité de restrictions locales. Préférentiellement, de telles restrictions locales présentent des dimensions similaires. Par exemple, le dispositif présente :
- un capillaire présentant un diamètre, en amont des restrictions, compris entre 0,5 et 5 mm et
- une pluralité de restrictions locales, de telles restrictions étant assimilables à des canaux, de diamètre compris entre 2 et 50 pm.
Dans des modes de réalisation, lorsque le capillaire et la restriction ou les restrictions présentent une géométrie circulaire, le ratio entre :
- le diamètre de la section du capillaire en amont de la restriction et
- le diamètre de la section de la restriction ou la somme des diamètres des sections des restrictions est compris entre 5 et 20. Autrement dit, le ratio entre :
- l’aire de la section du capillaire en amont des restrictions et
- l’aire de la section de la restriction ou la somme des aires des sections des restrictions est compris entre 25 et 400.
Ainsi, des tels ratios assurent non seulement une rétention optimale des acides nucléiques de petite taille lors de la concentration et du dessalage et assure également la concentration des acides nucléique de taille supérieure, dits de grande taille, sans obstruction.
Dans des modes de réalisation, le capillaire est un canal d’une puce microfluidique muni d’une restriction. Des exemples de dimensions des canaux et de la restriction, applicables à ces modes de réalisation, sont mentionnés dans les publications scientifiques suivantes : - Teillet et al., « Characterization and minimization of band broadening in DNA electrohydrodynamic migration for enhanced size separation », Soft Matter, 2020,16, 5640-5649; et
- Tijunelyte et al., « Hybridization-based DNA biosensing with a limit of detection of 4 fM in 30 s using an electrohydrodynamic concentration module fabricated by grayscale lithography » , Biomicrofluidics 16, 2022, 044111 .
Les modes de réalisation en puce microfluidique présentent une géométrie plus petite et notamment une longueur plus courte comparés à d’autres modes de réalisation sans puce microfluidique mentionnés dans la présente description.
Dans ces modes de réalisation, la puce microfluidique comporte le capillaire dit « capillaire large » ou « canal large », une constriction puis un capillaire dit « capillaire étroit » ou « canal étroit » présentant une dimension inférieure au canal large. Dans ces modes de réalisation, l’ensemble comportant la constriction et le capillaire étroit forme la restriction. On note que, de manière générale mais non restrictive, les canaux d’une puce microfluidique présentent respectivement une section rectangulaire.
Dans des modes de réalisation, le canal large présente une largeur d’au moins 50 pm et préférentiellement d’au moins 400 pm.
Dans des modes de réalisation, le canal étroit présente une largeur d’au moins 2 pm et préférentiellement d’au moins 10 pm.
Dans des modes de réalisation, le canal large, la constriction et le canal étroit présentent une profondeur comprise entre 2 et 10 pm.
Dans des modes de réalisation, le canal large, la constriction et le canal étroit présentent une profondeur constante.
Dans des variantes, le canal large, la constriction et le canal étroit présentent des profondeurs variables ou dites « non constantes ». Préférentiellement, la profondeur du canal large en amont de la constriction est supérieure à la profondeur de la constriction et/ou du canal étroit. Ainsi, une telle variation de profondeur, combinée à la variation de la largeur des canaux et de la constriction, assure une augmentation plus importante du ratio entre la section du canal large et la section du canal étroit, comparé à une unique variation de la largeur des canaux et de la constriction à profondeur constante.
Dans des modes de réalisation, un procédé de formation des canaux et de la constriction d’une puce microfluidique comporte au moins une étape de gravure d’une plaquette de silice et/ou de verre.
Dans des modes de réalisation, l’étape de gravure comporte au moins une étape mettant en œuvre une technique de photolithographie combinée à une technique de gravure au plasma, en anglais « plasma etching » connue en électronique pour la réalisation de circuit imprimé. Préférentiellement, une telle gravure est réalisée sur une plaquette de silice, nommée « wafer » en anglais. On note qu’un exemple d’une telle étape de gravure est mentionné dans la publication scientifique de Teillet et al. précédemment citée dans la présente description.
Par exemple, à l’issue d’une telle gravure, les capillaires suivants sont obtenus :
- un capillaire correspondant au canal large, présentant une largeur égale à 800 pm, et
- un capillaire correspondant au canal étroit en aval de la restriction présentant une largeur égale à 15 pm ; les capillaires et la constriction présentant une profondeur constante égale à 2 pm. Dans des variantes, l’étape de gravure comporte au moins une étape mettant en œuvre une technique dite de lithographie « grayscale » combinée à une technique de gravure au plasma. On note qu’une telle étape de gravure permet notamment la formation du canal large, de la constriction et du canal étroit présentant des profondeurs variables. On note qu’un exemple d’une telle étape de gravure est mentionné dans la publication scientifique de Tijunelyte et al. précédemment citée dans la présente description.
Dans des modes de réalisation, lors de la mise en œuvre de la méthode objet de l’invention, une détection des acides nucléiques est réalisée, par exemple, par utilisation de détecteurs de fluorescence ou de détecteurs d’adsorption UV connus de la personne du métier. Lorsqu’un détecteur de fluorescence est utilisé, les acides nucléiques sont par exemple marqués chimiquement par une sonde fluorescente ou marqués par utilisation d’intercalant ou de liant du sillon d’ADN nommés « Groove binder » en anglais. On note que ces différents marquages sont connus de la personne du métier.
Les exemples 1 et 2, décrits en regard des figures 1 à 9, précisent les résultats expérimentaux d’un dispositif 40 de l’art antérieur fonctionnant selon la séquence illustrée en figure 2, séquence aussi appelée « 0 retour ».
Exemple 1 : méthode « 0 retour » en dispositif 40, échantillon non salé.
Matériels utilisés :
- CE G1600 Agilent (marque déposée),
- Détecteur Picometrics (marque déposée), Zetalif LED480 (marque déposée) (PMT réglé sur 630V, RT réglé sur 0,5s),
- Produits chimiques :
[Table 1]
Figure imgf000015_0001
Une « analyse DNA 1 K » est un profilage de tailles de l’ADN dans une gamme allant de 100 bp à 1500 bp (donc de l’ordre de 1 kb, d’où l’appellation 1 K). Elle est définie essentiellement par le tampon d’analyse et par la méthode d’analyse. La méthode d’analyse est définie essentiellement par le chronogramme pression/voltage pour faire la concentration puis la séparation, avec des procédés de lavage/conditionnement décrits dans des exemples ci-dessous. Similairement, une « analyse DNA 10K » est le profilage de taille de l’ADN dans la gamme allant de 1 kbp à 10 kbp. Le « tampon DNA 1 K » désigne le tampon d’analyse pour faire cette analyse « DNA 1 K ». L’« échantillon étalon DNA 1 K » désigne l’échantillon étalon qui sert d’étalon pour les analyses DNA 1 K. On l’appelle aussi « DNA ladder 1 K », ou encore « échantillon étalon 1 K ».
Comme exposé ci-dessous, préférentiellement, le nombre de retours dépend de la salinité des échantillons. On définit, par exemple, deux types d’analyse, l’une pour les échantillons pas ou peu salés, l’autre pour les échantillons salés. Ainsi :
- l’analyse DNA 1 K « LoSalt » utilise la méthode à deux retours comme illustré dans l’exemple 3 ; elle est recommandée pour des échantillons entre 0 et 15 mM NaCI ; et
- l’analyse DNA 1 K « HiSalt » utilise la méthode à six retours comme illustré dans l’exemple 4 ; elle est recommandée pour des échantillons jusqu’à 130 mM NaCI.
Ces deux analyses utilisent le même tampon d’analyse DNA 1 K, et le même échantillon étalon 1 K. Elles diffèrent seulement par le nombre et la temporalité des retours présents pendant la phase de concentration.
L’échantillon étalon 1 K contient des fragments d’ADN des tailles suivantes : 100 bp, 150 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 1000 bp, et 1500 bp.
La méthode 0 retour pour le dispositif 40 est décrite dans le tableau 2 ci-dessous.
[Table 2] Méthode 0 retour pour le dispositif 40
Figure imgf000017_0001
La figure 4 représente un résultat 80 d’analyse pour un échantillon étalon d’ADN non salé : tracé de la fluorescence d’un échantillon étalon non salé selon une analyse DNA 1 K, méthode « 0 retour ». Chaque pic de fluorescence 81 correspond à la taille d’ADN indiquée sur le graphe en paires de base (bp).
Exemple 2 : méthode « 0 retour » en dispositif 40, échantillons salés.
Les matériels et réactifs sont identiques à ce qui est décrit pour l’exemple 1 . La gamme de sels dans l’échantillon étalon 1 K a été réalisée de la manière suivante :
[Table 3]
Figure imgf000018_0001
Pour la préparation de la gamme de sels avec un échantillon d’ADN circulant, le volume d’échantillon disponible étant seulement de 140pL, la gamme a été réalisée de la manière suivante : [Table 4]
Figure imgf000018_0002
La méthode « 0 retour » pour le dispositif 40 est la même que dans l’exemple 1 . La figure 5 représente le résultat 90 pour des échantillons d’ADN étalons plus ou moins salés. Cette analyse avec la méthode « 0 retour » des échantillons contenant : 0 mM de NaCI, est représentée en courbe 91 , 10 mM de NaCI, courbe 92, 15 mM de NaCI, courbe 93, 20 mM de NaCI, courbe 94, 50 mM de NaCI, courbe 95, 100 mM de NaCI, courbe 96, et 130 mM de NaCI, courbe 97.
Les valeurs de fluorescence ont été décalées sur l’axe vertical de fluorescence par ajout d’une constante pour faciliter la visualisation des courbes.
On voit, sur la figure 5, que le pic 98 de 100 bp, correspondant à un peu moins de neuf minutes sur l’axe des temps est bien présent dans les échantillons contenant 0 et 10 mM NaCI, qu’il est diminué dans les échantillons contenant 15 ou 20 mM NaCI, puis qu’il est quasiment absent pour les concentrations en sel plus élevées. De même, le fragment 99 de 150 bp est bien présent jusqu’à une concentration de 50 mM environ, puis disparaît. La figure 6 rapporte les aires 100 des pics en fonction de la concentration en NaCI dans l’échantillon, pour les pics 10Obp, courbe 101 , 150bp, courbe 102, 200bp, courbe 103, 400bp, courbe 104 et 10OObp, courbe 105 en fonction de la concentration en sels dans le tampon DNA1 K avec la méthode « 0 retour ».
Un autre enseignement tiré de ces expériences provient de l’intensité 110 du courant électrique observé pendant la concentration, et rapporté en figure 7. Nous voyons que l’intensité du pic 118 de courant pendant la phase de concentration, vers 1 ,5 minute, renseigne sur la concentration en sels de l’échantillon, les courbes 111 à 117 correspondant, respectivement aux concentrations des courbes 91 à 97 de la figure 5. Cette mesure peut être utilisée comme contrôle qualité de l’analyse, pour prévenir l’utilisateur quand la conductivité de l’échantillon est trop forte pour une analyse fiable de son échantillon par la méthode 0 retour. Cette mesure peut aussi être utilisée pour ajuster le nombre et la temporalité des retours dans le procédé objet de l’invention décrit en regard des figures 11 et suivantes, en fonction de la salinité de l’échantillon. La mesure du courant, ou la mesure de la dérivée du courant peut ainsi être utilisée pour provoquer un retour plus tôt, lorsque la salinité est élevée.
Pour un échantillon d’ADN circulant plus ou moins salé, une gamme de sels (de 0 mM à 130 mM) a été réalisée sur un échantillon d’ADN circulant avec la méthode « 0 retour », comme illustré en figure 8. La figure 8 représente l’analyse 120 avec la méthode « 0 retour » d’un échantillon d’ADN circulant purifié contenant : 0 mM de NaCI, courbe 121 , 10 mM de NaCI, courbe 122, 15 mM de NaCI, courbe 123, 20 mM de NaCI, courbe 124, 50 mM de NaCI, courbe 125, 100 mM de NaCI, courbe 126 et 130 mM de NaCI, courbe 127.
La figure 9 représente l’évolution 130 de l’aire 131 du premier pic, à gauche, et de l’aire 132 du deuxième pic, à droite, en fonction de la concentration en NaCI avec la méthode « 0 retour ». Les valeurs sont issues de la figure 8. On observe que, avec la méthode « 0 retour », l’aire du deuxième pic est stable quelle que soit la concentration en sels dans l’échantillon. En revanche, l’aire du premier pic est stable jusqu’à 10 à 15 mM, puis diminue fortement. Avec 130 mM de sels dans l’échantillon, seul 16% du premier pic 131 est retenu lors de l’étape de concentration.
Les exemples 3 à 9 illustrent des résultats obtenus par la mise en œuvre de la présente invention. Dans toute la description, on décrit des expériences réalisées avec des échantillons contenant de l’ADN. Cependant, la présente invention ne se limite pas à ce type d’acide nucléique mais s’étend, au contraire aux autres acides nucléiques, par exemple l’ARN ou l’ADN simple brin.
Dans l’exemple 3, illustré en regard des figures 11 à 15, en insérant deux retours pendant l’étape de concentration, il est devenu possible d’analyser des échantillons d’ADN de petite taille contenant jusqu’à 15 mM de sels, soit 50% de teneur en plus que ce que permet la méthode 0 retour. Au-dessus de 15 mM de sels, les petits fragments ne sont plus correctement retenus. On visualise, en figure 13, le positionnement temporel des deux durées de retours 161 et 162 dans le chronogramme du procédé. Pendant ces retours, puisqu’aucun voltage électrique n’est appliqué, le courant électrique est nul.
Dans l’exemple 4, illustré en regard des figures 16 et 17, l’introduction de six retours pendant la phase de concentration permet de retenir complètement tous les fragments de 100 bp à 1500 bp jusqu’à 130 mM NaCI, avec une légère baisse d’intensité toutefois pour les fragments de 100 et 150 bp au-delà de 100 mM NaCI. De la même façon, avec ces six retours, le pic principal d’ADN circulant est retenu jusqu’à une concentration en NaCI de 130 mM, avec diminution d’intensité de seulement environ 15 %.
Lors de l’analyse des résultats d’un échantillon d’ADN inconnu, le profil de fluorescence est converti en profil de concentration grâce au profil de fluorescence de l’échantillon étalon, dont on connaît la concentration pour chaque longueur de fragment d’ADN. La légère baisse d’intensité pour les fragments d’ADN les plus petits est donc compensée par l’étalonnage basé sur le profil de l’échantillon étalon.
Dans un échantillon biologique humain, il y a non seulement une salinité équivalente à environ 130 mM NaCI, mais aussi, le plus souvent, des protéines. Certaines de ces protéines sont chargées positivement. Elles se fixent alors aux parois du capillaire, ainsi qu’à l’ADN, qui sont chargés négativement. Ceci entraîne un collage de l’ADN aux parois, collage délétère pour l’analyse.
Pour éviter ce phénomène, il est préférable de réaliser la concentration à pH élevé, de façon que l’immense majorité des protéines soit chargée négativement, et que le collage de l’ADN aux parois via des protéines disparaisse. Malheureusement, à pH élevé, la qualité de séparation de l’ADN n’est pas aussi bonne qu’à pH neutre ou légèrement acide, sans doute à cause d’un phénomène d’électroosmose trop intense. C’est pour cela que, dans des modes de réalisation, on met en œuvre un procédé avec retours et avec changement de tampon pour analyser l’ADN circulant directement dans le plasma. Dans un premier temps a lieu une concentration à pH élevé avec retours, qui permet d’évacuer les sels et les restes de protéines de l’échantillon. Puis, après un ultime retour, une nouvelle phase de concentration a lieu, cette fois, à pH neutre ou légèrement acide, plus favorable à la séparation. Cette phase de concentration permet de changer le tampon de l’échantillon. Dans une troisième étape a lieu la séparation, identique à celle qui a lieu dans les autres méthodes décrites dans les exemples 1 et 2.
Ce procédé avec retour(s) et changement de tampon est décrit dans l’exemple 5. Il permet d’obtenir un profil d’ADN circulant directement à partir du plasma, sans purification préalable de l’ADN. La première partie de la concentration, à pH élevée, a lieu à 11 bars. La seconde partie de la concentration, et la séparation, ont lieu à pH légèrement acide et à 7 bars pour améliorer la qualité de séparation de l’ADN.
Ce procédé permet de réduire, voire d’annihiler, l’effet éventuel de la matrice de l’échantillon biologique sur le profil de séparation de l’ADN. L’exemple 6 montre ainsi comment un ADN étalon migre de la même façon dans un plasma et dans un tampon non salé.
Dans l’exemple 7, nous confirmons la fiabilité du procédé objet de l’invention en comparant des profils de taille d’ADN circulant obtenus soit par le procédé de l’exemple 3 (deux retours) après purification de l’ADN, soit par le procédé de l’exemple 5 directement sur plasma (procédé à sept retours).
Dans l’exemple 8, nous montrons que le principe du retour fonctionne aussi sur des ADNs de plus grande taille, entre 1 et 10 kb. Il va de soi que ce principe du retour fonctionnera aussi sur des ADNs d’encore plus grande taille, par exemple jusqu’à 200 kb.
Tous les exemples précédents correspondent à des expériences faites avec le dispositif 40 développé par Adelis (marque déposée), qui utilise un dispositif capillaire (figure 1) installé dans un instrument d’électrophorèse capillaire Agilent.
La technologie fonctionne aussi dans un format de puces microfluidiques, et la présente invention peut tout à fait être mise en œuvre pour des analyses d’échantillons d’ADN salés, ou des analyses d’ADN directement dans des fluides biologiques, à l’aide de puces microfluidiques. L’exemple 9 décrit une telle puce microfluidique.
La figure 10 représente une séquence de fonctionnement typique d’une analyse d’ADN avec le procédé objet de l’invention mis en œuvre avec deux retours et le dispositif 40. Le capillaire distal 47 n’est pas représenté dans cette figure. Dans la figure 10, sont représentés, en noir, l’ADN concentré et en hachures, les sels.
Au cours d’une opération 61 , l’échantillon est injecté dans le dispositif, par l’application d’une pression pendant une durée donnée. Au cours d’une opération 62, l’échantillon injecté est poussé par pression au milieu de la chambre d’injection 44.
Au cours d’opérations 63 et 64, l’ADN est concentré à la jonction de concentration 48 de la chambre d’injection 44, par l’application d’une première pression provoquant un écoulement dans un premier sens d’écoulement (de gauche à droite en figure 10) et d’une première différence de potentiel électrique dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque la retenue ou le freinage des molécules d’acides nucléiques dans le capillaire. Le capillaire de séparation 45 se remplit de la solution de l’échantillon, sauf les plus grands fragments d’ADN qui restent retenus à la jonction de concentration 48.
La vitesse de migration des plus petits fragments d’ADN est plus faible que la vitesse moyenne de l’écoulement. En revanche, les ions formant les sels sont trop petits pour qu’il apparaisse une force transverse les poussant vers la paroi, et ils avancent à la vitesse moyenne de l’écoulement, plus ou moins leur vitesse d’électrophorèse selon leur charge positive ou négative.
Au cours d’une opération 65, on provoque un écoulement de l’échantillon, dans un deuxième sens d’écoulement opposé au premier sens d’écoulement par application d’une deuxième pression dans le sens inverse de la pression exercée sur la solution de l’échantillon. Une partie de la solution de l’échantillon qui avait pénétré dans le capillaire de séparation 45 reflue dans la chambre d’injection 44, entraînant des fragments d’ADN qui retournent ainsi dans la chambre d’injection 44. Dans la description, l’opération 65 est appelée un « retour ».
Ainsi, on arrête l’opération de concentration avant que les plus petits fragments arrivent à l’extrémité du capillaire de séparation et on applique une deuxième pression en sens contraire de la première pression pour ramener le volume du capillaire de séparation 45 dans la chambre d’injection 44.
Au cours d’une opération 66, l’ADN est, de nouveau, concentré à la jonction de concentration 48 de la chambre d’injection 44, par l’application de la première pression provoquant un écoulement dans le premier sens d’écoulement et de la première différence de potentiel électrique dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque la retenue de molécules d’acides nucléiques dans le capillaire. Le capillaire de séparation 45 se remplit de la solution de l’échantillon, sauf les plus grands fragments d’ADN qui restent retenus à la jonction de concentration 48. On effectue ainsi une nouvelle étape de concentration.
Au cours d’une opération 67 de deuxième retour, on provoque un écoulement de l’échantillon, dans le deuxième sens d’écoulement par application d’une deuxième pression dans le sens inverse de la pression exercée sur la solution de l’échantillon. De nouveau, une partie de la solution de l’échantillon qui avait pénétré dans le capillaire de séparation 45 reflue dans la chambre d’injection 44, entraînant des fragments d’ADN qui retournent ainsi dans la chambre d’injection 44.
Au cours d’une opération 68, l’ADN est, de nouveau, concentré à la jonction de concentration 48 de la chambre d’injection 44, par l’application de la première pression provoquant un écoulement dans le premier sens d’écoulement et de la première différence de potentiel électrique dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque la retenue des molécules d’acides nucléiques dans le capillaire. Le capillaire de séparation 45 se remplit de la solution de l’échantillon. On réitère ainsi cette alternance de phases de retour et de concentration. Les sels s’évacuent ainsi progressivement du dispositif, alors que les molécules d’ADN sont essentiellement conservées. Les petits fragments d’ADN peuvent donc être analysés correctement, ce qui était impossible avec les dispositifs et procédés de l’art antérieur.
Au cours d’une opération 69, l’ADN est séparé selon la taille par une baisse progressive du champ électrique appliqué entre l’inlet 41 et l’outlet 42, la pression étant en général maintenue constante.
Typiquement, lors des étapes 63, 64, 66 et 68 de concentration, on applique les ordres de grandeurs physiques suivants pour retenir des fragments d’ADN aussi petits que 100 bp :
- voltage : 25 000 V
- pression : 10 bars
- la viscosité et la résistivité de la solution dans le capillaire sont respectivement de 40 mPa.s et 12,4 O.m à 25°C.
Dans le capillaire de séparation 45, on obtient :
- un champ électrique de 100 à 1500 V/cm, selon la résistivité de l’échantillon et
- une vitesse fluidique moyenne de 9 mm/s.
Préférentiellement, au cours des étapes 65 et 67 d’écoulement laminaire de l’échantillon dans le deuxième sens d’écoulement, l’échantillon est soumis à une deuxième différence de potentiel électrique dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement. La deuxième différence de potentiel peut donc être identique à la première différence de potentiel. Les molécules encore proches des parois du capillaire de séparation reviennent ainsi plus rapidement dans la chambre d’injection que lors d’un retour par pression simple, comme exposé ci-dessus.
Exemple 3 : Procédé à deux retours pour des échantillons d’ADN étalons plus ou moins salés.
On décrit, ci-dessous, un procédé mettant en œuvre deux retours dans un dispositif 40.
Les matériels et méthodes sont identiques à ceux des exemples 1 et 2.
Le procédé est décrit numériquement dans le tableau ci-dessous.
[Table 5] : Méthode 2 retours pour le dispositif 40
Figure imgf000023_0001
Les deux passages à pression négative -10 bars correspondent aux deux retours introduits pendant la phase de concentration, opérations 65 et 67 de la figure 10, conformément à la présente invention. Une gamme de sels (de 0 mM à 130 mM) a été réalisée avec un échantillon étalon et analysée avec le procédé à deux retours. La figure 11 représente le résultat 140 d’analyse avec le procédé à deux retours d’un échantillon étalon contenant 0 mM de NaCI en traits discontinus réguliers longs, courbe 141 , contenant 10 mM de NaCI en traits discontinus alternant un trait et un couple de points, courbe 142, contenant 15 mM de NaCI en traits discontinus constitués de points régulièrement espacés, courbe 143, contenant 20 mM de NaCI en traits discontinus alternant un trait court et un point, courbe 144, contenant 50 mM de NaCI en trait continu, courbe 145, contenant 100 mM de NaCI en traits discontinus réguliers courts, courbe 146 et contenant 130 mM de NaCI en traits discontinus alternant un trait long et un point, courbe 147.
La figure 12 rapporte les aires 150 des pics en fonction de la concentration en NaCI dans l’échantillon étalon, pour les pics 100 bp, courbe 151 , 150 bp, courbe 152, 200 bp, courbe 153, 400 bp, courbe 154 et 1000 bp, courbe 155. Les aires des pics 200 bp, 400 bp et 1000 bp restent stables quelle que soit la concentration en sels dans l’échantillon. L’aire du 100 bp reste stable jusqu’à 15 mM de NaCI puis diminue fortement. L’aire du 150 bp diminue au-delà de 50 mM.
Le passage à un procédé à deux retours permet donc d’analyser des échantillons d’ADN contenant jusqu’à 15mM de sels dans l’échantillon.
Les profils 160 de courant pendant les analyses sont donnés dans la figure 13. Les passages à courant nul 161 à la minute 2 et 162 à la minute 4,5 sont les deux retours qui ont été introduits pendant la phase de concentration, conformément à l’invention.
Nous obtenons des résultats équivalents avec un échantillon d’ADN circulant. La figure 14 représente le résultat 170 de l’analyse avec le procédé à deux retours d’un échantillon d’ADN circulant purifié contenant 0 mM de NaCI en traits discontinus réguliers longs, courbe 171 , contenant 10 mM de NaCI en traits discontinus alternant un trait et un couple de points, courbe 172, contenant 15 mM de NaCI en traits discontinus constitués de points régulièrement espacés, courbe 173, contenant 20 mM de NaCI en traits discontinus alternant un trait court et un point, courbe 174, contenant 50 mM de NaCI en trait continu, courbe 175, contenant 100 mM de NaCI en traits discontinus réguliers courts, courbe 176 et contenant 130 mM de NaCI en traits discontinus alternant un trait long et un point, courbe 177.
La figure 15 représente l’évolution 180 de l’aire 181 du premier pic, à gauche dans chaque couple d’aires, et de l’aire 182 du deuxième pic, à droite, en fonction de la concentration en NaCI avec le procédé à deux retours. Les valeurs sont issues de la figure 14. Avec le procédé à deux retours, l’aire 182 du deuxième pic est stable quelle que soit la concentration en sels dans l’échantillon. L’aire 181 du premier pic est stable jusqu’à 15 mM puis diminue légèrement jusqu’à 50mM. Avec 130 mM de sels dans l’échantillon, 43% du premier pic est retenu lors de l’étape de concentration. Exemple 4 : procédé à six retours.
Les matériels et méthodes sont identiques à ceux décrits dans les exemples précédents.
Le procédé à six retours est décrit, numériquement, dans le tableau ci-dessous, étant à noter que les étapes de pré-conditionnement A, d’injection de l’échantillon B, puis de transfert de l’échantillon C dans la chambre d’injection, sont similaires aux étapes correspondantes de la méthode 0 retour.
[Table 6] : Procédé à six retours pour un dispositif 40
Figure imgf000025_0001
Pour obtenir un résultat pour des échantillons d’ADN étalons plus ou moins salés, une gamme de sels (de 0 mM à 130 mM) a été réalisée avec l’échantillon étalon 1 K, selon la même méthode que dans l’exemple 2. La figure 16 représente le résultat 190 de l’analyse avec le procédé à six retours de l’échantillon étalon
1 K contenant 0 mM de NaCI en traits discontinus réguliers longs , courbe 191 , 10 mM de NaCI en traits discontinus alternant un trait et un couple de points, courbe 192, 15 mM de NaCI en traits discontinus constitués de points régulièrement espacés , courbe 193, 20 mM de NaCI traits discontinus alternant un trait court et un point, courbe 194, 50 mM de NaCI en trait continu, courbe 195, 100mM de NaCI en traits discontinus réguliers courts, courbe 196 et 130 mM de NaCI en traits discontinus alternant un trait long et un point, courbe 197. La figure 17 montre l’évolution de l’aire des pics 10Obp, courbe 201 , 150bp, courbe 202, 200bp, courbe 203, 400bp, courbe 204 et 1000bp, courbe 205, en fonction de la concentration en NaCI dans l’échantillon avec le procédé à six retours. L’aire des pics est stable pour tous les pics, jusqu’à 130 mM NaCI. Il semble toutefois que le pic de 100 bp subisse une légère baisse d’intensité à partir de 100 mM NaCI.
Le passage à un procédé à six retours permet donc d’analyser des échantillons d’ADN contenant jusqu’à 130 mM de sels dans l’échantillon.
La figure 18 représente des résultats 210 pour un échantillon d’ADN circulant purifié plus ou moins salé, avec le procédé à six retours l’échantillon contenant 0 mM de NaCI en traits discontinus réguliers longs, courbe 211 , 10 mM de NaCI en traits discontinus alternant un trait et un couple de points, courbe 212, 15 mM de NaCI en traits discontinus constitués de points régulièrement espacés, courbe 213, 20 mM de NaCI en traits discontinus alternant un trait court et un point, courbe 214, 50 mM de NaCI en trait continu, courbe 215, 100 mM de NaCI en traits discontinus réguliers courts, courbe 216 et 130 mM de NaCI en traits discontinus alternant un trait long et un point, courbe 217.
Le graphique 220 de la figure 19 montre l’évolution de l’aire 221 du premier pic et de l’aire 222 du deuxième pic en fonction de la concentration en NaCI avec le procédé à six retours. Les valeurs sont issues de la figure 18.
On observe que l’aire 222 du second pic est stable jusqu’à 130 m NaCI.
L’aire 221 du premier pic est stable jusqu’à 20-50 mM NaCI. À 100 et 130 mM, elle accuse une légère baisse d’intensité. Cette baisse d’intensité n’est pas gênante pour l’analyse, car elle est corrigée lorsqu’on convertit les résultats de fluorescence en résultats de concentration grâce au calibrage basé sur l’échantillon étalon.
Exemple 5 : Procédé à sept retours pour l’analyse directe de plasma
Les matériels utilisés sont identiques à ceux des exemples précédents.
On ajoute toutefois un premier tampon d’analyse, à pH basique. Dans cet exemple, c’est un mélange Tris-acétate pH8 qui a été utilisé : Tris 20 mM, acide acétique 10 mM, EDTA (Éthylènediaminetétraacétique, ou acide éthylènediaminetétraacétique, un acide diaminotétracarboxylique) 0,5 mM, PVP (Polyvinylpyrrolidone) 5%, BSA (acronyme de « bovine serum albumin », soit en français « albumine de sérum bovin ou ASB) 0,5 mg/mL.
Aussi, dans cet exemple, le produit de lavage RNAse Away (marque déposée) de ThermoFisher Scientific (marque déposée) a été ajouté à l’étape de conditionnement.
Les échantillons de plasma sont prétraités par une digestion à la protéinase K en présence de détergent, opération destinée à libérer les acides nucléiques des vésicules et des complexes nucléoprotéiques dans lesquels ils sont le plus souvent emprisonnés. Cette étape de digestion à la protéinase K est couramment pratiquée comme première étape dans les procédés de purification de l’ADN d’un échantillon biologique. On s’assurera simplement de mettre suffisamment de protéinase K (l’activité de l’enzyme dépend du fournisseur et de la référence choisie), et de choisir un détergent non ionique (un détergent ionique entraîne une électroosmose et un courant électrique trop importants pour la méthode). Dans cet exemple, 100 pL de plasma ont été prétraités par la protéinase K ; seulement 15 pL de plasma prétraité ont été placés dans le flacon d’injection de la CE Agilent. Et environ 1 pL de plasma prétraité a été injecté par la CE Agilent dans le dispositif 40 et analysé par la méthode 7 retours.
Description du procédé à sept retours : [Table 7] : Procédé à sept retours et changement de tampon pour le dispositif 40
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000028_0001
La figure 20 représente l’analyse 230 d’un plasma avec le procédé à sept retours. La figure 21 montre le courant 240 obtenu lors de l’étape de concentration à pH8. Ce procédé comporte sept retours 241 à 247. La figure 22 montre le courant obtenu lors de la dernière étape 250 de concentration avec le changement de tampon. Vers quatre minutes, on peut visualiser sur le courant la transition 251 entre les deux tampons dans le capillaire de séparation 45.
Le profil de taille de la figure 20 est un profil typique d’ADN circulant, avec un pic principal d’environ 165 bp, et un second pic plus petit d’environ 305 bp.
Exemple 6 : étalonnage pour l’ADN circulant directement dans le plasma. Annulation de l’effet matrice.
Les matériels et préparations des réactifs sont identiques à ceux de l’exemple 5.
Les échantillons étalons et les procédés d’analyse sont décrits ci-après. Dans cet exemple, on analyse :
- un échantillon étalon pur, analysé en méthode « 0 retour » ; expérience identique à celle de l’exemple 1 et
- le même échantillon étalon ajouté à un échantillon de plasma, et analysé en procédé à sept retours, même procédé que celui de l’exemple 5.
En figure 23, la courbe supérieure 261 correspond à l’échantillon étalon pur, avec 32pg/pl, avec un procédé sans retour et la courbe inférieure 262 correspond à l’échantillon étalon spiké (ou « ajouté ») dans du plasma, à une concentration de 9,1 pg/pl. Nous pouvons voir que les pics des deux échantillons se superposent correctement, avec simplement une différence dans l’intensité de fluorescence qui correspond à la différence de concentration de l’ADN étalon dans les deux analyses.
Pour être plus précis, en figure 24, est représentée la courbe de concentration 270 en fonction de la taille des fragments d’ADN de l’échantillon étalon ajouté à un échantillon de plasma, en utilisant comme étalonnage la migration de l’échantillon étalon pur ; en d’autres termes, la courbe 262 est interprétée en utilisant la courbe 261 pour étalonner la taille des pics d’ADN.
On observe, en figure 24 et dans le tableau ci-dessous que les tailles des fragments d’ADN de l’échantillon étalon ajouté à un échantillon de plasma sont déterminées correctement, sauf pour le fragment de 150 bp, à cause de la présence du pic principal d’ADN circulant, qui est à 167 bp et qui interfère avec le pic étalon de 150 bp. [Table 8]
Figure imgf000029_0001
Exemple 7 : comparaison de profils de taille d’ADN circulant avec ou sans purification préalable de l’ADN.
Les matériels et méthodes mis en œuvre sont les suivants :
Un échantillon de plasma en provenance d’un donneur sain a été analysé pour son ADN circulant de deux façons :
- Soit avec purification de l’ADN, puis analyse selon le procédé à deux retours (comme dans l’exemple 3). La purification de l’ADN a été faite au moyen d’un automate IDEAL-32 (marque déposée) et à l’aide de kits IDXtract-MAG (marque déposée) de la société ID-Solutions (marque déposée).
- Soit avec prétraitement puis analyse directe sans purification selon le procédé à sept retours (comme dans l’exemple 5).
Les résultats d’analyse directement en plasma, sont donnés, en figure 25, par le tracé 280 de fluorescence et, en figure 26, par le profil 290 de concentration selon la taille de l’ADN.
La concentration d’ADN circulant dans le plasma entre 75 et 1650 bp a été mesurée à 7,1 pg/pL par le procédé à sept retours.
Les résultats d’analyse avec purification de l’ADN sont donnés, en figure 27, par le tracé 300 de fluorescence, et en figure 28, par profil 310 de concentration selon la taille de l’ADN. La concentration d’ADN circulant dans le plasma entre 75 et 1650 bp a été mesurée à 6,7 pg/pL par le procédé à deux retours.
On observe que :
- Les concentrations d’ADN circulant mesurées par les deux procédés sont très proches,
- Les tailles des pics principaux et des pics secondaires sont aussi proches,
- Le profil de taille est visuellement proche ; en particulier, la dissymétrie du pic secondaire et le ratio entre le pic secondaire et le pic principal sont similaires dans les deux procédés. Le procédé à sept retours permet donc de déterminer le profil de taille de l’ADN circulant à partir de quelques microlitres de plasma seulement, et sans avoir à purifier l’ADN au préalable. Exemple 8 : procédé à un retour pour grands ADNs
Les matériels et méthodes utilisés sont les suivants :
- CE G1600 Agilent (marque déposée)
- Détecteur Picometrics (marque déposée), Zetalif LED480 (marque déposée). (PMT réglé sur 630V, RT réglé sur 0,5s)
[Table 9]
Figure imgf000030_0001
L’échantillon étalon 10K contient des fragments d’ADN des tailles suivantes : 1 kbp, 2kbp, 3kbp, 4kbp, 5kbp, 6kbp, 8kbp, 10kbp, et 20kbp. 1 kbp vaut 1000 bp, 1000 paires de base. Le procédé de concentration/séparation sans retour est décrit, numériquement, ci-dessous :
[Table 10]
Figure imgf000030_0002
Le procédé de concentration/séparation pour grands ADNs avec un retour est décrit, numériquement, ci-dessous :
[Table 11]
Figure imgf000031_0001
Pour évaluer l’effet de la présence de sels dans la concentration d’un échantillon d’ADN de grande taille, du NaCI a été ajouté à l’échantillon étalon 10K, respectivement aux concentrations de 0, 10 et 20 mM. Les résultats des analyses 320 des échantillons d’ADN étalons, pour le procédé DNA 10K sans retour, sont illustrés en figure 29 ; 0 mM NaCI, courbe 321 , 10 mM NaCI, courbe 322 et 20 mM NaCI, courbe 323.
On observe que, quand 10 mM NaCI est ajouté à l’échantillon étalon, le fragment de 1 kb n’est pas correctement retenu. Avec 20 mM NaCI dans l’échantillon, le fragment de 1 kbp a quasiment disparu, et le fragment de 2 kbp n’est plus correctement retenu non plus.
Les résultats des analyses 330, avec l’ajout d’un retour entre la minute huit et la minute neuf de concentration, et quelques modifications de temps et de gradient pour accélérer le procédé, sont représentés en figures 30 : - 0 mM NaCI, courbe 331 ,
- avec 10 mM de NaCI, courbe 332,
- avec 20 mM de NaCI, courbe 333 et
- avec 50 mM de NaCI, courbe 334. En introduisant un retour entre la minute huit et la minute neuf, le fragment de 1 kbp est correctement retenu pendant la phase de concentration. À 20 mM NaCI, le fragment de 1 kbp n’est pas complètement retenu, mais le fragment de 2 kbp est désormais complètement retenu.
Exemple 9 : Dispositif de type « puce microfluidique »
Les exemples 1 à 8 mettent en jeu des dispositifs capillaires 40, schématisés en figure 1 . Le procédé objet de la présente invention s’applique aussi à des canaux microfluidiques. On peut donc mettre en œuvre la présente invention dans des puces microfluidiques ayant une forme géométrique configurée pour que les petits fragments d’ADN fuient lentement en cas de conductivité élevée de l’échantillon. Par exemple, dans la forme représentée en figure 31 , la zone d’écoulement, c’est-à-dire la chambre d’injection 341 et le capillaire 342 correspondant au canal étroit ont une profondeur (mesurée perpendiculairement à la figure 31) de deux micromètres. La zone de prise de vue 343 est partiellement représentée à droite de la figure 31 . Dans cette zone de prise de vue, le canal étroit 342 en aval de la constriction a une largeur, mesurée de haut en bas en figure 31 , de 15 pm.
On note que la profondeur, ici de 2 pm, peut être augmentée, par exemple, jusqu’à 50 pm et que la largeur, ici de 15 pm, peut varier, par exemple, entre 2 et 50 pm.
La figure 32 illustre, sous forme d’un logigramme, des étapes d’un mode de réalisation particulier du procédé 370 de dessalage et de concentration objet de l’invention et du procédé d’analyse 350 objet de l’invention.
Le procédé de dessalage et de concentration 370 d’un échantillon d’acides nucléiques plus conducteur qu’un tampon d’analyse, comporte, d’abord, une étape 352 d’injection de l’échantillon constitué des acides nucléiques et du premier tampon dans le dispositif. Au cours d’une étape 353, l’échantillon est transféré dans la chambre d’injection 44. Au cours d’une étape 354, on réalise un écoulement laminaire de l’échantillon dans un capillaire muni d’une restriction locale de sa section, dans un premier sens d’écoulement. Pendant cet écoulement, l’échantillon est soumis à une première différence de potentiel électrique dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque la retenue de molécules d’acides nucléiques dans le capillaire, ou au moins leur freinage par effet pLAS dans le capillaire de séparation 45.
Au cours d’une étape 355 optionnelle, on effectue une mesure de l’ampérage circulant dans le capillaire pendant l’étape 354. Au cours d’une étape 356 optionnelle, on effectue une sélection d’un nombre d’itérations d’une alternance des étapes 354 et 358, en fonction de l’ampérage mesuré. Préférentiellement, le nombre sélectionné d’itérations de l’alternance est une fonction croissante de l’ampérage d’un pic de cet ampérage mesuré ou d’un pic d’une dérivée de cet ampérage mesuré.
Lorsque le nombre de retours n’est pas déterminé par une mesure de salinité de l’échantillon, il est prédéterminé, par exemple avec une valeur donnée dans l’un des exemples 3 à 8.
Par exemple, le nombre de retours, et donc d’itérations, est prédéterminé en fonction de la taille minimale d’acides nucléiques à concentrer. Ainsi, une salinité favorable est définie selon un seuil minimum fixé par la taille des acides nucléiques à concentrer. Lors de la mise en œuvre du procédé objet de l’invention, on note que les tailles des acides nucléiques retenus sont conditionnées notamment par la vitesse d’écoulement, le voltage appliqué et la nature du tampon d’analyse telle que sa conductivité. Au cours d’une étape 357 optionnelle, on effectue une sélection d’une durée d’au moins une étape d’écoulement 354 dans le premier sens d’écoulement. Préférentiellement, la durée sélectionnée est une fonction décroissante de l’ampérage d’un pic de cet ampérage mesuré ou d’un pic d’une dérivée de cet ampérage mesuré.
Lorsque la durée d’au moins une étape de concentration n’est pas déterminée par une mesure de salinité de l’échantillon, elle est prédéterminée, par exemple avec une valeur donnée dans l’un des exemples 3 à 8.
À la fin de la durée sélectionnée ou prédéterminée de l’étape 354, au cours d’une étape de retour 358, on réalise un écoulement laminaire de l’échantillon, dans un deuxième sens d’écoulement opposé au premier sens d’écoulement. Dans des modes de réalisation préférentiels, au cours de l’étape 358 d’écoulement laminaire de l’échantillon dans le deuxième sens d’écoulement, l’échantillon est soumis à une deuxième différence de potentiel électrique dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement.
Au cas où le nombre, sélectionné ou prédéterminé, d’itérations de l’alternance des étapes 354 et 358 est supérieur à un, à la fin de l’étape 358, on retourne à l’étape 354. On note que, dans les itérations suivantes, les étapes optionnelles 355 à 357 peuvent être omises.
À la fin de toutes les itérations des étapes 354 à 358, le procédé de dessalement et de concentration d’acides nucléiques est achevé et l’échantillon est extrait du dispositif.
Dans le procédé 350 d’analyse d’acides nucléiques, une étape optionnelle 351 de libération des acides nucléiques, avec ou sans purification, peut précéder les itérations des étapes 354 à 358.
Si la libération des acides nucléiques laisse subsister des protéines dans l’échantillon, à la suite de la dernière itération des étapes 354 à 358, au cours d’une étape optionnelle 359, on réalise un changement de tampon d’analyse, le nouveau tampon d’analyse présentant un pH inférieur à celui du tampon d’analyse précédemment utilisé. C’est, par exemple, le cas de la libération des acides nucléiques, comme la digestion à la protéinase K dans l’exemple 5. Dans ce cas, c’est que l’échantillon est un échantillon biologique, et le changement de tampon/pH de l’étape 359 est préférable avant de réaliser les étapes 360 à 363. S’il n’y a pas de protéines dans l’échantillon, les étapes 352 à 358 se font avec un tampon d’analyse à pH proche de la neutralité, ou légèrement acide, et, après la dernière itération des étapes 354 à 358, on passe directement à l’étape 360.
Au cours de cette étape 360, on réalise un écoulement laminaire de l’échantillon dans un capillaire muni d’une restriction locale de sa section, dans le premier sens d’écoulement. Pendant cet écoulement, l’échantillon est soumis à une différence de potentiel électrique dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque la retenue de molécules d’acides nucléiques dans le capillaire.
Au cours d’une étape 361 , on effectue une séparation par écoulement laminaire de l’échantillon dans le capillaire dans le premier sens d’écoulement. Préférentiellement, pendant cet écoulement, l’échantillon est soumis à une différence de potentiel électrique inférieure ou égale à la première différence de potentiel, dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque une retenue partielle de molécules d’acides nucléiques dans le capillaire. Préférentiellement, la différence de potentiel électrique est décroissante au cours de l’étape 361 , soit par paliers, soit continuellement décroissante, c’est-à-dire avec une dérivée temporelle négative et non nulle.
Au cours d’une étape 362, réalisée pendant ou après l’étape de séparation, on effectue une mesure d’un profil temporel de fluorescence des molécules d’acides nucléiques et une étape de conversion du profil temporel de fluorescence en un profil de concentration en molécules d’acides nucléiques de différentes longueurs. Préférentiellement, pour cette étape de conversion, on utilise le profil de fluorescence d’un échantillon étalon, dont on connaît la concentration pour chaque longueur de molécule d’acides nucléiques pour compenser les des variations expérimentales qui existent d’un jour à l’autre, en termes de temps de passage de l’ADN devant le détecteur et d’intensité de fluorescence.

Claims

34 REVENDICATIONS
1. Procédé de dessalage et de concentration d’un échantillon d’acides nucléiques plus conducteur qu’un tampon d’analyse, procédé caractérisé en ce qu’il comporte, au moins une itération d’une alternance :
- d’une étape d’écoulement laminaire de l’échantillon dans un capillaire dans un premier sens d’écoulement, le capillaire étant muni d’au moins une restriction locale de sa section et comportant le tampon d’analyse, pendant laquelle l’échantillon est soumis à une première différence de potentiel électrique dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque la retenue de molécules d’acides nucléiques dans le capillaire,
- d’une étape d’écoulement laminaire de l’échantillon, dans un deuxième sens d’écoulement opposé au premier sens d’écoulement.
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel, au cours de l’étape d’écoulement laminaire de l’échantillon dans le deuxième sens d’écoulement, l’échantillon est soumis à une deuxième différence de potentiel électrique dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement.
3. Procédé selon l’une des revendications 1 ou 2, qui comporte, de plus, une étape de mesure de l’ampérage circulant dans le capillaire pendant au moins une étape d’écoulement dans le premier sens d’écoulement et une étape de sélection d’un nombre d’itérations de l’alternance en fonction de l’ampérage mesuré.
4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel le nombre d’itérations de l’alternance est une fonction croissante de l’ampérage d’un pic de cet ampérage mesuré ou d’un pic d’une dérivée de cet ampérage mesuré.
5. Procédé selon l’une des revendications 1 à 4, qui comporte, de plus, une étape de mesure de l’ampérage circulant dans le capillaire pendant au moins une étape d’écoulement dans le premier sens d’écoulement et une étape de sélection d’une durée d’au moins une étape d’écoulement dans le premier sens d’écoulement en fonction de l’ampérage mesuré.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel la durée sélectionnée est une fonction décroissante de l’ampérage d’un pic de cet ampérage mesuré ou d’un pic d’une dérivée de cet ampérage mesuré.
7. Procédé selon l’une des revendications 1 à 6, qui comporte, après une itération de l’alternance, une étape de changement de tampon d’analyse, le nouveau tampon d’analyse présentant un pH inférieur à celui du tampon d’analyse précédemment utilisé.
8. Procédé d’analyse d’un échantillon d’acides nucléiques, qui comporte les étapes du procédé de dessalage et de concentration d’un échantillon selon l’une des revendications 1 à 7 et, après la dernière itération de l’alternance, une étape de séparation par écoulement laminaire de l’échantillon dans le capillaire dans le premier sens d’écoulement, pendant laquelle l’échantillon est soumis à une différence de potentiel 35 électrique inférieure ou égale à la première différence de potentiel, dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque une retenue partielle de molécules d’acides nucléiques dans le capillaire.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel, au cours de l’étape de séparation, la différence de potentiel électrique est décroissante.
10. Procédé selon l’une des revendications 8 ou 9, qui comporte, pendant ou après l’étape de séparation, une étape de mesure d’un profil temporel de fluorescence des molécules fluorescentes d’acides nucléiques et une étape de conversion du profil temporel de fluorescence en un profil de concentration en molécules d’acides nucléiques de différentes longueurs, par la mise en œuvre d’un profil de fluorescence d’un échantillon étalon, dont on connaît la concentration pour chaque longueur de molécule fluorescente d’acides nucléiques.
11 . Dispositif configuré pour mettre en œuvre le procédé de dessalage et de concentration selon l’une des revendications 1 à 7 ou d’analyse selon l’une des revendications 8 à 10 d’un échantillon d’acides nucléiques plus conducteur qu’un tampon d’analyse, le dispositif étant caractérisé en ce qu’il comporte :
- un capillaire muni d’une restriction locale de sa section et comportant le tampon d’analyse,
- un moyen de mise en écoulement laminaire de l’échantillon dans le capillaire, dans un premier sens d’écoulement,
- un moyen d’application d’une première différence de potentiel électrique pendant l’écoulement dans le premier sens, différence de potentiel dont l’action sur les molécules d’acides nucléiques est opposée au premier sens d’écoulement et provoque la retenue de molécules d’acides nucléiques dans le capillaire,
- un moyen de mise en écoulement laminaire de l’échantillon dans le capillaire, dans un deuxième sens d’écoulement opposé au premier sens d’écoulement et
- un moyen de commande des moyens de mise en écoulement laminaire et du moyen d’application de la première différence de potentiel configuré pour commander au moins une itération d’une alternance,
- d’un écoulement laminaire de l’échantillon dans le capillaire dans le premier sens d’écoulement, écoulement pendant lequel l’échantillon est soumis à la première différence de potentiel électrique et
- d’un écoulement laminaire de l’échantillon dans le deuxième sens d’écoulement.
12. Dispositif selon la revendication 11 , dans lequel le capillaire est formé d’un canal microfluidique.
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