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WO2023055009A1 - 항염증 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

항염증 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Publication number
WO2023055009A1
WO2023055009A1 PCT/KR2022/014394 KR2022014394W WO2023055009A1 WO 2023055009 A1 WO2023055009 A1 WO 2023055009A1 KR 2022014394 W KR2022014394 W KR 2022014394W WO 2023055009 A1 WO2023055009 A1 WO 2023055009A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
inflammatory
peptide
disease
present
composition
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/KR2022/014394
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English (en)
French (fr)
Inventor
정용지
김은미
김선수
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Caregen Co Ltd
Original Assignee
Caregen Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to JP2024518623A priority patent/JP2024536080A/ja
Priority to CN202280062548.1A priority patent/CN118302432A/zh
Priority to EP22876781.0A priority patent/EP4410819A4/en
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
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    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
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    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
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    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a peptide having anti-inflammatory activity and an anti-inflammatory composition comprising the peptide as an active ingredient.
  • the inflammatory response is one of the defense responses of biological tissues against external stimuli, and is a mechanism to restore and regenerate damage caused by physical actions, harmful substances, chemical stimuli, and bacterial infection. Induces various diseases such as cancer.
  • Lipopolysaccharide (LPS) an outer membrane component of Gram-negative bacteria, causes various reactions such as local inflammation, antibody production, and sepsis, and macrophages respond early to LPS infection and play a pivotal role in host defense and homeostasis.
  • LPS Lipopolysaccharide
  • macrophages respond early to LPS infection and play a pivotal role in host defense and homeostasis.
  • high-dose LPS stimulation secretes pro-inflammatory mediators such as tumor necrosis factor- ⁇ (TNF- ⁇ ), interleukin (IL)-1, IL-6, and nitric oxide (NO) from macrophages, resulting in lethal consequences for the host.
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor- ⁇
  • IL-1 interle
  • NO is produced from inducible NO synthase (iNOS) when macrophages are activated and has an antibacterial effect that inhibits some viruses or parasites.
  • iNOS inducible NO synthase
  • excessive NO formation causes inflammation and tissue damage, gene mutation, and nerve damage. It is known to cause
  • cytokines such as TNF- ⁇ , IL-1 and IL-6
  • ERK1/2 extracellular signal-regulated kinase 1/2
  • p38 p38
  • JNK c-Jun NH2-terminal kinase
  • MAKs mitogen-activated protein kinases
  • NF- ⁇ B nuclear factor kappa B
  • NF- ⁇ B plays an important role in the expression of genes related to immune and inflammatory responses.
  • the inhibitory kappa B ⁇ (I ⁇ B ⁇ ) associated with NF- ⁇ B is degraded, and NF- ⁇ B is released from the cell cytoplasm to the nucleus. and then acts as a transcription factor for the expression of cytokines such as TNF- ⁇ , IL-12, and IL-6.
  • interleukin-17 is known to be closely related to chronic inflammation.
  • IL-17 is an inflammatory cytokine that plays an important role in the host's defense mechanism against extracellular bacterial and fungal infection.
  • T-helper 17 (Th17) cells play an important role in the production and differentiation of IL-17.
  • Increased production and secretion of IL-17 in vivo is associated with psoriasis, psoriatic arthritis (PsA), rheumatoid arthritis (RA), atopic dermatitis (AD)), acne It is closely related to several inflammatory and autoimmune diseases, including acne lesions and ankylosing spondylitis (AS).
  • PsA psoriatic arthritis
  • RA rheumatoid arthritis
  • AD atopic dermatitis
  • AS ankylosing spondylitis
  • IL-17 and Th17 cells play major etiological roles in inflammation and autoimmune diseases, inhibition and control of them have been proposed as important strategies for disease treatment, and inhibition and neutralization of cytokines of the Th17 cell lineage and the development of specific transcription factors have been proposed. Potential targeted treatment methods through suppression control are being studied.
  • Non-steroidal anti-inflammatory drugs which are currently used as anti-inflammatory drugs, are drugs that are involved in the biosynthesis of prostaglandin from arachidonic acid called cyclooxygenase (COX). By inhibiting enzyme activity, it exhibits anti-inflammatory action, but in addition to the main therapeutic action, it causes serious side effects such as gastrointestinal disorders, liver disorders, and renal disorders, so long-term use is restricted.
  • COX cyclooxygenase
  • next-generation anti-inflammatory drugs that can overcome the limitations of drugs acting on the central nervous system and gastrointestinal tract.
  • the direction of development of anti-inflammatory drugs is in the direction of developing drugs that act locally on the central nervous system and gastrointestinal tract, and the importance is expanding from oral low-molecular-weight synthetic compounds to the development of synthetic peptides for subcutaneous or intravascular injection (non-patent literature).
  • the development of synthetic peptide therapeutics is a promising driving force for the biopharmaceutical industry in the future, and the development of new drug targets and mechanisms, development of peptide-based drugs, and delivery optimization technology are very important because they have great potential for clinical effectiveness in the field of anti-inflammatory drug development.
  • Non-Patent Document 1 Sara La Manna et al., Peptides as Therapeutic Agents for Inflammatory-Related Diseases. Int. J. Mol. Sci. 2018;19:2714
  • One object of the present invention is to provide a peptide having anti-inflammatory activity.
  • Another object of the present invention is to provide an anti-inflammatory composition comprising the above-described peptide having the activity as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating inflammatory diseases comprising a peptide having the above-described activity as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide an anti-inflammatory cosmetic composition comprising the above-described peptide having the activity as an active ingredient.
  • one aspect of the present invention provides a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Another aspect of the present invention provides an anti-inflammatory composition comprising the peptide as an active ingredient.
  • Another aspect of the present invention provides a composition for preventing or treating inflammatory diseases comprising the peptide as an active ingredient.
  • Another aspect of the present invention provides an anti-inflammatory cosmetic composition
  • an anti-inflammatory cosmetic composition comprising the peptide as an active ingredient.
  • the peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 according to the present invention has anti-inflammatory activity, it can be used as a raw material for medicines for the purpose of preventing, improving or treating inflammatory diseases or cosmetics for preventing or improving skin inflammation. can be used
  • FIG. 1 is an RT-PCR electrophoresis image showing the effect of the peptides of the present invention on the expression of COX-2 and IFN- ⁇ induced by LPS in splenocytes.
  • Figure 2a is an ELISA result graph showing the effect of the peptides of the present invention on the secretion of TNF- ⁇ induced by LPS in splenocytes.
  • Figure 2b is an ELISA result graph showing the effect of the peptides of the present invention on the secretion of IFN- ⁇ induced by LPS in splenocytes.
  • 2c is an ELISA result graph showing the effect of the peptides of the present invention on LPS-induced secretion of IL-17 in splenocytes.
  • Figure 3a is an ELISA result graph showing the effect of the peptide of the present invention on the secretion of TNF- ⁇ in splenocytes.
  • Figure 3b is an ELISA result graph showing the effect of the peptide of the present invention on the secretion of IL-1 ⁇ induced by TNF- ⁇ in splenocytes.
  • Figure 3c is an ELISA result graph showing the effect of the peptides of the present invention on the secretion of IFN- ⁇ induced by TNF- ⁇ in splenocytes.
  • Figure 4 is an ELISA result graph showing the effect of the peptides of the present invention on the secretion of IFN- ⁇ induced by LPS, TGF- ⁇ and IL-23 in splenocytes.
  • FIG. 5 is an ELISA result graph showing the effect of the peptides of the present invention on the secretion of IL-17 induced by TNF- ⁇ and IL-17A in splenocytes.
  • FIG. 6 is an RT-PCR electrophoresis image showing the effect of the peptides of the present invention on the expression of TNF- ⁇ , COX2, IL-6 and IL-8 induced by TNF- ⁇ and hIL-17A in keratinocytes. .
  • FIG. 7 is a Western blot electrophoresis image showing the effect of the peptide of the present invention on the expression of iNOS and JNK induced by TNF- ⁇ and hIL-17A in keratinocytes.
  • One aspect of the present invention provides a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the term 'peptide' refers to a linear molecule composed of amino acid residues, and specifically, the peptide of the present invention may include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the 'peptide' may be amino acid variants or fragments having a different sequence by deletion, insertion, substitution, or combination thereof within the range that does not affect the function. Amino acid exchanges that do not entirely alter the activity of the peptide are known in the art. In some cases, the peptide may be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, and the like. Accordingly, the peptide of the present invention includes a peptide having an amino acid sequence substantially identical to that of the peptide including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and variants or active fragments thereof.
  • the substantially identical protein refers to at least 75%, preferably at least 80%, such as at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It means an amino acid sequence having, but is not limited thereto, and is included in the scope of the present invention if it has 75% or more amino acid sequence homology and has the same activity.
  • the peptide of the present invention may additionally include a targeting sequence, a tag (tag), a labeled residue, an amino acid sequence prepared for a specific purpose to increase half-life or peptide stability.
  • N A protecting group may be bonded to the -terminus or C-terminus.
  • the 'stability' is used to mean not only in vivo stability that protects the peptide of the present invention from attack by proteolytic enzymes in vivo , but also storage stability (eg, storage stability at room temperature).
  • the N-terminal modification is an acetyl group, a fluorenylmethoxycarbonyl group, a formyl group, a palmitoyl group, a myristyl group at the N-terminus of the peptide ), a stearyl group, and polyethylene glycol (PEG), but may be bound to a protecting group selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the C-terminal modification may be a combination of a hydroxyl group (hydroxyl group, -OH), an amino group (amino group, -NH 2 ), azide (-NHNH 2 ), etc. to the C-terminus of the peptide, but is limited thereto It is not.
  • Synthesis of the peptides of the present invention can be performed using, for example, equipment or genetic engineering techniques.
  • a desired peptide can be synthesized using an Fmoc solid-phase method in an automatic peptide synthesizer.
  • a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention was synthesized and identified using the Fmoc solid-phase method, and selected by verifying the efficacy of the identified peptide It became.
  • the peptide of the present invention was selected through validation of the effect of inhibiting inflammatory cytokine expression or activity.
  • a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention has anti-inflammatory activity.
  • Another aspect of the present invention provides an anti-inflammatory composition
  • a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • anti-inflammatory or “inhibiting inflammation” is used as a meaning including improvement (relief of symptoms), treatment, and suppression or delay of onset of the inflammatory disease defined below.
  • the peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention inhibits the expression of COX-2 (cyclooxygenase-2) and IFN- ⁇ (interferon-gamma) in LPS-stimulated splenocytes It was found to inhibit the secretion of any one inflammatory cytokine selected from the group consisting of TNF- ⁇ (Tumor necrosis factor alpha), INF- ⁇ and IL-17 (interleukin 17).
  • COX-2 cyclooxygenase-2
  • IFN- ⁇ interferon-gamma
  • the peptide was shown to inhibit secretion of any one inflammatory cytokine selected from the group consisting of TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ (interleukin-1 ⁇ ) and IFN- ⁇ in splenocytes stimulated with TNF- ⁇ .
  • the peptide inhibits the secretion of IFN- ⁇ in splenocytes stimulated by LPS, TGF- ⁇ and IL-23, and the secretion of IL-17 in splenocytes stimulated by TNF- ⁇ and IL-17A has been shown to inhibit
  • the peptide is expressed in inflammatory cytokines such as TNF- ⁇ , IL-6 and IL-8 and COX2 in HaCaT cells, which are an in vitro psoriatic dermatitis test model induced by TNF- ⁇ and IL-17A It has been shown to inhibit the activity of inflammatory mediators such as iNOS and JNK.
  • the peptide of the present invention inhibits inflammatory cytokines by regulating the expression of inflammatory cytokine genes, and blocks inflammatory responses such as inhibiting PGE2, NO production, and JNK activity by regulating the expression of COX-2 and INOS. It can be seen that it has an anti-inflammatory effect.
  • the peptide of the present invention means that it has a therapeutic effect on general inflammatory diseases through its anti-inflammatory activity and is also effective in treating autoimmune diseases including psoriasis.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the “inflammatory disease” is a pathology caused by an inflammatory reaction characterized by external physicochemical stimuli or infection of external infectious agents such as bacteria, fungi, viruses, and various allergens, or a local or systemic biological defense response to autoimmunity. symptoms can be defined.
  • the inflammatory response is the activation of various inflammatory mediators and enzymes related to immune cells (eg, iNOS, COX-2, etc.), secretion of inflammatory mediators (eg, TNF- ⁇ , IL-6, IL-8, IL-17, secretion of IL-1 ⁇ , IFN- ⁇ , etc.), body fluid infiltration, cell migration, tissue destruction, etc., accompanied by a series of complex physiological reactions, such as erythema, pain, edema, fever, deterioration or loss of specific body functions, etc. It can be manifested externally by symptoms.
  • the inflammatory disease may be an acute, chronic, ulcerative, allergic or necrotic disease, as long as any disease is included as such an inflammatory disease, all include acute, chronic, ulcerative, allergic or necrotic disease do.
  • the inflammatory disease may be an inflammatory skin disease or an inflammatory autoimmune disease.
  • the inflammatory skin disease may include atopic dermatitis, contact dermatitis, allergic skin disease, acne, acne, and urticaria.
  • the inflammatory autoimmune diseases include psoriasis, systemic scleroderma, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, asthma, ulcerative colitis, Behçet's disease, Crohn's disease, multiple sclerosis, dermatomyositis, collagen disease, vasculitis, arthritis, granulomatosis, organ-specific autoimmunity immune lesions, ulcerative colitis and graft-versus-host disease (GvHD).
  • 'prevention' refers to all activities that inhibit or delay the occurrence, spread, and recurrence of inflammation by the peptide of the present invention or a composition containing the same.
  • improvement or treatment refers to any action that beneficially changes in relation to inflammation, such as delaying, stopping or reversing the progress of inflammation by the peptide of the present invention or a composition containing the same.
  • the peptide inhibits the expression of COX-2 and IFN- ⁇ in splenocytes, and inhibits the secretion of TNF- ⁇ , IL-17, IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ and IL-17 By doing so, it is possible to prevent, improve or treat inflammatory diseases.
  • the peptide inhibits the expression of inflammatory cytokines such as TNF- ⁇ , IL-6, IL-8 and COX2 in keratinocytes, and reduces the expression of inflammatory mediators such as iNOS and JNK, thereby preventing inflammatory diseases , can be improved or cured.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may further include, for example, a carrier for oral administration or a carrier for parenteral administration.
  • Carriers for oral administration may include lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid and the like.
  • carriers for parenteral administration may include water, suitable oil, saline, aqueous glucose and glycol, and the like.
  • stabilizers and preservatives may be further included. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium bisulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers may be referenced as described in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to mammals including humans by any method.
  • it can be administered orally or parenterally, and parenteral administration methods include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal , intranasal, enteral, topical, sublingual or rectal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated into a preparation for oral administration or parenteral administration according to the administration route as described above, and the preparation for parenteral administration is specifically formulated in the form of an injection preparation or an external preparation. can be used
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • 'pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type, severity, activity of the drug, It may be determined according to factors including sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other anti-inflammatory agents, may be administered simultaneously, separately, or sequentially with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition may vary depending on the patient's age, sex, condition, body weight, absorption rate, inactivity rate, excretion rate, disease type, concomitant drug of the active ingredient in the body, route of administration, severity, gender, It may increase or decrease according to body weight, age, etc., and for example, about 0.0001 ⁇ g to 500 mg, preferably 0.01 ⁇ g to 100 mg of the pharmaceutical composition per 1 kg of patient body weight per day may be administered.
  • Another aspect of the present invention provides an anti-inflammatory cosmetic composition
  • a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the cosmetic composition may be prepared in any formulation commonly prepared in the art, for example, a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleansing, It may be formulated as an oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray, but is not limited thereto.
  • the cosmetic composition includes softening lotion, nutrient lotion, nutrient cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray, powder, hair tonic, hair cream, hair lotion, hair shampoo, and hair rinse. , hair conditioners, hair sprays, hair aerosols, pomades, solutions such as gels, sol gels, emulsions, oils, waxes, aerosols, etc., but may be prepared in various forms, but are not limited thereto.
  • the cosmetic composition of the present invention may include other additives such as excipients and carriers, and it is possible to apply and blend ordinary ingredients formulated in general skin cosmetics as needed.
  • the formulation of the cosmetic composition is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or oxide as a carrier component Zinc and the like may be used.
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component, especially in the case of a spray, additionally chlorofluorohydrocarbon , propellants such as, but not limited to, propane/butane or dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizing agent or emulsifying agent may be used as a carrier component, for example, water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl Benzoate, propylene glycol, 1,3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic esters, polyethylene glycol, or sorbitan fatty acid esters may be used.
  • the form of the formulation of the cosmetic composition is a suspension
  • a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol, an ethoxylated isostearyl alcohol, a suspending agent such as polyoxyethyl sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester , microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracanth, and the like
  • a suspending agent such as polyoxyethyl sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester
  • microcrystalline cellulose aluminum metahydroxide
  • bentonite agar or tracanth, and the like
  • the formulation of the cosmetic composition is surfactant-containing cleansing
  • carrier components aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyl taurate, sarcosinate, fatty acid Amide ether sulfates, alkylamidobetaines, fatty alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives, or ethoxylated glycerol fatty acid esters may be used.
  • base components for forming the shampoo such as a thickener, a surfactant, a viscosity modifier, a moisturizer, a pH modifier, a preservative, and an essential oil
  • a thickener such as a thickener, a surfactant, a viscosity modifier, a moisturizer, a pH modifier, a preservative, and an essential oil
  • CDE may be used as the thickener
  • LES an anionic surfactant, and coco betaine
  • an amphoteric surfactant may be used as the surfactant
  • polyquater may be used as the viscosity modifier.
  • Glycerin may be used, and citric acid and sodium hydroxide may be used as the pH adjusting agent.
  • Grapefruit extract and the like may be used as the preservative, and in addition, essential oils such as cedarwood, peppermint, and rosemary, and silk amino acids, pentaol, or vitamin E may be added.
  • ingredients included in the cosmetic composition are components commonly used in cosmetic compositions, for example, antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and flavorings, in addition to the peptide and carrier component of the present invention as active ingredients. It may further include an auxiliary agent and the like, but is not limited thereto.
  • the peptide of the present invention since the peptide of the present invention has an excellent anti-inflammatory effect, it can be used as a raw material for pharmaceuticals for the purpose of preventing, improving or treating inflammatory diseases or cosmetics for the purpose of improving skin inflammation.
  • Another aspect of the present invention provides a method for preventing or treating an inflammatory disease comprising administering a therapeutically effective amount of a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to a subject.
  • the peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the same as the peptide described in the 'pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases', and the detailed description is incorporated hereinbefore.
  • the term “therapeutically effective amount” refers to an amount of a peptide that achieves the goal of improving the incidence of disease during treatment with the peptide, while avoiding harmful side effects usually associated with other therapies.
  • Another aspect of the present invention provides the use of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 for use in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of inflammatory diseases.
  • a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 shown in [Table 1] was synthesized using an automatic peptide synthesizer (Liberty, CEM Corporation, USA), and C18 reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC) (U-3000, Thermo Fisher Scientific, USA) was used to separate pure peptides from these synthesized peptides.
  • the column used was Pursuit XRs C18 (250 * 4.65 mm 100 ⁇ , Agilent, USA).
  • mice 6-7 week old mice (C57BL/6, Youngbio Co., Ltd.) were sacrificed to obtain spleens, and the spleens were mashed using a cell strainer and centrifuged with serum-free RPMI-1640 medium. The supernatant was discarded and RBC lysis buffer was used twice to remove red blood cells (RBC). Thereafter, after washing with serum-free RPMI-1640 medium, an appropriate amount of serum-free RPMI-1640 medium was added. After measuring the number of mouse splenocytes, they were inoculated into a 24-well plate at a density of 1x10 7 cells/well and cultured overnight.
  • the medium was replaced with a serum-free medium, cultured for 4 hours, treated with the peptide of the present invention (5 ⁇ M and 50 ⁇ M) and an inflammatory substance, LPS (2 ⁇ g/ml), and further cultured for 3 hours.
  • RNA extraction kit Qiagen RNeasy kit
  • cDNA was synthesized using a cDNA synthesis kit (Intron, Korea) after RNA quantification.
  • Polymerase chain reaction (PCR) was performed by mixing the PCR premix (Intron, Korea), the synthesized cDNA, and the primers shown in [Table 2] specific to each gene of COX2, INF ⁇ , and GAPDH.
  • the PCR products were electrophoresed on a 5% agarose gel and stained with ethidium bromide to confirm the mRNA expression levels of COX2 and INF ⁇ , which are genes associated with inflammatory and autoimmune diseases.
  • mice 6-7 week old mice (C57BL/6, Youngbio Co., Ltd.) were sacrificed to obtain spleens, and the spleens were mashed using a cell strainer and centrifuged with serum-free RPMI-1640 medium. The supernatant was discarded and RBC lysis buffer was used twice to remove red blood cells (RBC). Thereafter, after washing with serum-free RPMI-1640 medium, an appropriate amount of serum-free RPMI-1640 medium was added. After measuring the number of mouse splenocytes, they were inoculated into a 24-well plate at a density of 1x10 7 cells/well and cultured overnight.
  • the medium was replaced with a serum-free medium, cultured for 4 hours, treated with the peptide of the present invention (5 ⁇ M and 50 ⁇ M) and an inflammatory substance, LPS (2 ⁇ g / ml) as a stimulant, and further cultured for 24 hours.
  • the cell culture medium was recovered and absorbance was measured (Spectramax M2, Molecular Devices) was performed.
  • the peptides of the present invention can significantly reduce the secretion of inflammatory cytokines TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , and IL-17.
  • mice 6-7 week old mice (C57BL/6, Youngbio Co., Ltd.) were sacrificed to obtain spleens, and the spleens were mashed using a cell strainer and centrifuged with serum-free RPMI-1640 medium. The supernatant was discarded and RBC lysis buffer was used twice to remove red blood cells (RBC). Thereafter, after washing with serum-free RPMI-1640 medium, an appropriate amount of serum-free RPMI-1640 medium was added. After measuring the number of mouse splenocytes, they were inoculated into a 24-well plate at a density of 1x10 7 cells/well and cultured overnight.
  • the medium was replaced with a serum-free medium, cultured for 4 hours, treated with the peptide of the present invention (5 ⁇ M and 50 ⁇ M) and an inflammatory substance, TNF- ⁇ (20 nM), and further cultured for 24 hours.
  • the cell culture medium is recovered and the amount of secretion of inflammatory cytokines TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ and INF ⁇ is measured using an ELISA kit specific for TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ and INF ⁇ (Quantikine ELISA Kit, R&D system, USA) Absorbance was measured using (Spectramax M2, Molecular Devices).
  • the peptides of the present invention can significantly reduce the secretion of inflammatory cytokines TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ and INF ⁇ .
  • mice 6-7 week old mice were sacrificed to obtain spleens, and the spleens were crushed using a cell strainer and centrifuged with serum-free RPMI-1640 medium. The supernatant was discarded and RBC lysis buffer was used twice to remove red blood cells (RBC). Thereafter, after washing with serum-free RPMI-1640 medium, an appropriate amount of serum-free RPMI-1640 medium was added. After measuring the number of mouse splenocytes, they were inoculated into a 24-well plate at a density of 1x10 7 cells/well and cultured overnight.
  • the medium was replaced with a serum-free medium and cultured for 4 hours, and then the peptides of the present invention (5 ⁇ M and 50 ⁇ M) and stimulants LPS (2 ⁇ g / ml), TGF- ⁇ (20 ng / ml), IL -23 (20ng/ml) was treated and further cultured for 24 hours.
  • the cell culture medium was recovered, and the amount of secretion of the inflammatory cytokine INF ⁇ was measured for absorbance (Spectramax M2, Molecular Devices) using an ELISA kit (Quantikine ELISA Kit, R&D system, USA) specific to INF ⁇ (Spectramax M2, Molecular Devices). .
  • the peptide of the present invention can significantly reduce the secretion of INF ⁇ , an inflammatory cytokine.
  • mice 6-7 week old mice were sacrificed to obtain spleens, and the spleens were crushed using a cell strainer and centrifuged with serum-free RPMI-1640 medium. The supernatant was discarded and RBC lysis buffer was used twice to remove red blood cells (RBC). Thereafter, after washing with serum-free RPMI-1640 medium, an appropriate amount of serum-free RPMI-1640 medium was added. After measuring the number of mouse splenocytes, they were inoculated into a 24-well plate at a density of 1x10 7 cells/well and cultured overnight.
  • the peptides of the present invention (5 ⁇ M and 50 ⁇ M) and stimulants, TNF- ⁇ (20 nM) and IL-17A (200 ng/ml) , and further cultured for 24 hours.
  • the cell culture medium was recovered and the secretion of the inflammatory cytokine IL-17 was measured using an IL-17-specific ELISA kit (Quantikine ELISA Kit, R&D system, USA) to measure absorbance (Spectramax M2, Molecular Devices). ) was performed.
  • the peptide of the present invention can significantly reduce the secretion of IL-17, an inflammatory cytokine.
  • HaCaT human keratinocyte
  • HaCaT human keratinocyte
  • the medium was replaced with serum-free medium and cultured for 4 hours, and then the peptides of the present invention (5 ⁇ M and 50 ⁇ M) and Th17 type proinflammatory cytokines used as stimulants, TNF- ⁇ (10 nM) and hIL-17A (200 ng /ml), and further incubated for 1 hour.
  • RNA extraction kit Qiagen RNeasy kit
  • cDNA was synthesized using a cDNA synthesis kit (Intron, Korea) after RNA quantification.
  • Polymerase chain reaction (PCR) was performed using PCR premix (Intron, Korea), synthesized cDNA, TNF- ⁇ , COX2, IL-6, IL-8 and GAPDH specific to each gene in [Table 3]. This was done by mixing the indicated primers.
  • PCR products were electrophoresed on a 5% agarose gel and stained with ethidium bromide to determine the mRNA expression levels of TNF- ⁇ , COX2, IL-6, and IL-8, which are genes associated with inflammatory and autoimmune diseases. Confirmed.
  • HaCaT human keratinocyte
  • HaCaT human keratinocyte
  • the medium was replaced with serum-free medium and cultured for 4 hours, and then the peptides of the present invention (5 ⁇ M and 50 ⁇ M) and Th17 type inflammatory cytokines, TNF- ⁇ (10 nM) and hIL-17A (200 ng/ml) were used as stimulants. ), and further cultured for 24 hours.
  • the peptides of the present invention can reduce the phosphorylation of iNOS and JNK, which are inflammation-inducing factors and signaling proteins, even in a Th17-mediated inflammation-inducing environment.

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Abstract

본 발명은 항염증 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 항염증 활성을 가지므로 이를 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료를 목적으로 하는 의약품 또는 피부 염증을 예방 또는 개선을 목적으로 하는 화장품의 원료로 사용할 수 있다.

Description

항염증 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도
본 발명은 항염증 활성을 갖는 펩타이드와 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것이다.
염증 반응은 외부 자극에 대한 생체조직의 방어 반응의 하나로서 물리적 작용이나 유해물질, 화학적 자극, 세균감염 등에 의한 손상을 수복 재생하려는 기전이며, 지속적인 염증반응은 오히려 점막 손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등 각종 질환을 유도한다. 그람 음성균의 외막성분인 lipopolysaccharide(LPS)는 국소 염증, 항체 생산, 패혈증과 같은 다양한 반응을 일으키며, 대식세포는 LPS 감염 초기에 반응하고 숙주의 방어와 항상성 유지에 중추적인 역할을 한다. 그러나 고농도의 LPS 자극은 대식세포에서 tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin(IL)-1 및 IL-6, nitric oxide (NO)와 같은 전 염증성 매개물질을 분비시켜 숙주에 치명적인 결과를 초래 할 수 있다. 일반적으로 NO는 대식세포가 활성화되면 inducible NO synthase (iNOS)로부터 생산되며 몇몇 바이러스나 기생충을 억제하는 항균 효과를 가지고 있지만, 과도한 NO의 형성은 염증을 유발시키게 되며 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경 손상 등을 유발하는 것으로 알려져 있다.
TNF-α, IL-1 및 IL-6와 같은 전염증성 사이토카인의 발현은 extracellular signal-regulated kinase1/2(ERK1/2), p38 kinases (p38), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK)와 같은 mitogen-activated protein kinases(MARKs)와 nuclear factor kappa B (NF-κB)에 의해 조절된다. NF-κB는 면역과 염증 반응에 관계된 유전자의 발현에 중요한 역할을 하는데, NF-κB가 활성화되면 NF-κB와 결합해 있던 inhibitory kappa B α(IκBα)가 분해되면서 NF-κB가 세포 원형질에서 핵으로 들어가게 되며 이후 TNF-α, IL-12, IL-6와 같은 사이토카인 발현의 전사 인자로서 작용한다.
한편, 인터루킨17(interleukin-17, IL-17)은 만성 염증(chronic inflammation)과 밀접한 관련을 맺고 있는 것으로 알려져 있다. IL-17은 세포외 박테리아 및 곰팡이 감염에 대한 숙주의 방어 메커니즘에서 중요한 역할을 수행하는 염증성 사이토카인으로서, 특히 T-헬퍼 17(Th17) 세포가 IL-17의 생산 및 분화에 중요한 역할을 수행한다. 생체 내에서 IL-17의 생산 및 분비의 증가는, 건선(Psoriasis), 건선성 관절염(Psoriatic arthritis; PsA)), 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis; RA), 아토피 피부염(Atopic dermatitis; AD)), 여드름 병변(Acne lesions) 및 강직성 척추염(Ankylosing spondylitis; AS)을 비롯한 여러 염증성 질환 및 자가면역질환과 깊은 관련이 있다. IL-17과 Th17 세포가 염증과 자가면역질환에서 주요 병인 역할이 규명되면서 이들에 대한 억제와 조절이 질환 치료를 위한 중요 전략으로 제안되었고, Th17세포계열 사이토카인의 억제, 중화 및 특이 전사인자들의 억제 조절을 통한 잠재적 표적 치료 방법 등이 연구되고 있는 상황이다.
현재 항염증제로 사용되고 있는 제제인 비스테로이드성 소염제(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDS)는 시클로옥시게나제(cyclooxygenase, COX)라고 하는 아라키돈산(arachidonic acid)로부터 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생합성에 관여하는 효소 활성을 억제함으로써, 항염증 작용을 나타내는데, 주 치료작용 외에 위장관 장애, 간장애, 신장애 등의 심각한 부작용을 야기하므로 장기간의 사용에 있어서 제약이 따르는 실정이다.
이에 중추신경계와 위장관에 작용하는 약물들의 한계를 극복할 수 있는 차세대 항염증제의 개발이 요구되고 있다. 최근 항염증제의 개발 방향은 중추신경계 및 위장관 작용 약물에서 국소 작용 약물 개발의 방향으로, 경구투여 저분자 합성 화합물에서 피하 또는 혈관 주사용 합성 펩타이드 개발로 중요성이 확대되는 추세이다(비특허문헌). 합성 펩타이드 치료제 개발은 미래의 바이오 의약품 산업의 유망한 동력으로, 항염증제 개발 분야에서도 임상적 유효성의 잠재력이 크기 때문에 새로운 약물표적 및 기전 발굴, 펩타이드 기반 약물 개발과 전달 최적화 기술 개발이 매우 중요한 실정이다.
[선행기술문헌]
[비특허문헌]
(비특허문헌 1)Sara La Manna et al., Peptides as Therapeutic Agents for Inflammatory-Related Diseases. Int.J.Mol.Sci. 2018;19:2714
본 발명의 일 목적은 항염증 활성을 보유한 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은 상술한 활성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일 목적은 상술한 활성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일 목적은 상술한 활성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 항염증활성을 가지므로 이를 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료를 목적으로 하는 의약품 또는 피부 염증을 예방 또는 개선을 목적으로 하는 화장품의 원료로 사용할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 펩타이드가 비장세포에서 LPS에 의해 유도된 COX-2 및 IFN-γ의 발현에 미치는 영향을 보여주는 RT-PCR 전기영동 사진이다.
도 2a는 본 발명의 펩타이드가 비장세포에서 LPS에 의해 유도된 TNF-α의 분비에 미치는 영향을 보여주는 ELISA 결과 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 펩타이드가 비장세포에서 LPS에 의해 유도된 IFN-γ의 분비에 미치는 영향을 보여주는 ELISA 결과 그래프이다.
도 2c는 본 발명의 펩타이드가 비장세포에서 LPS에 의해 유도된 IL-17의 분비에 미치는 영향을 보여주는 ELISA 결과 그래프이다.
도 3a는 본 발명의 펩타이드가 비장세포에서 TNF-α의 분비에 미치는 영향을 보여주는 ELISA 결과 그래프이다.
도 3b는 본 발명의 펩타이드가 비장세포에서 TNF-α에 의해 유도된 IL-1β의 분비에 미치는 영향을 보여주는 ELISA 결과 그래프이다.
도 3c는 본 발명의 펩타이드가 비장세포에서 TNF-α에 의해 유도된 IFN-γ의 분비에 미치는 영향을 보여주는 ELISA 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 펩타이드가 비장세포에서 LPS, TGF-β 및 IL-23에 의해 유도된 IFN-γ의 분비에 미치는 영향을 보여주는 ELISA 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 펩타이드가 비장세포에서 TNF-α 및 IL-17A에 의해 유도된 IL-17의 분비에 미치는 영향을 보여주는 ELISA 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 펩타이드가 각질형성세포에서 TNF-α와 hIL-17A에 의해 유도된 TNF-α, COX2, IL-6 및 IL-8의 발현에 미치는 영향을 보여주는 RT-PCR 전기영동 사진이다.
도 7은 본 발명의 펩타이드가 각질형성세포에서 TNF-α와 hIL-17A에 의해 유도된 iNOS 및 JNK의 발현에 미치는 영향을 보여주는 웨스턴 블롯 전기영동 사진이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 '펩타이드'란 아미노산 잔기로 이루어진 선형의 분자를 의미하며, 구체적으로 본 발명의 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 '펩타이드'는 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 상기 펩타이드의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서, 펩타이드는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 이에, 본 발명의 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다.
상기 실질적으로 동일한 단백질이란 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 예컨대, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 75% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 본 발명의 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 상기 '안정성'은 생체 내 단백질 절단 효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 생체내(in vivo)에서의 안정성뿐만 아니라, 저장안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 포함하는 의미로 사용된다.
상기 N-말단 변형은 펩타이드의 N-말단에 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택된 보호기가 결합한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 C-말단 변형은 펩타이드의 C-말단에 히드록시기(hydroxyl group, -OH), 아미노기(amino group, -NH2), 아자이드(azide, -NHNH2) 등이 결합한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 펩타이드의 합성은 예를 들어 기기를 이용하거나 유전공학 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 기기를 이용하여 합성하는 경우, 자동 펩타이드 합성기에서 원하는 펩타이드를 Fmoc 고체상(Fmoc solid-phase) 방법으로 합성할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 Fmoc 고체상(Fmoc solid-phase) 방법을 이용하여 합성 및 동정하였고, 동정된 펩타이드의 효능을 검증하는 것에 의해 선별되었다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 동정된 펩타이드의 효능을 검증하기 위해 염증성 사이토카인 발현 또는 활성 억제 효과에 대한 유효성 검증을 통해 본 발명의 펩타이드를 선별하였다.
이에 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 항염증 활성을 갖는다.
본 발명의 다른 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.
상기 “항염증” 또는 “염증 억제”는 아래에서 정의되는 염증성 질환의 개선(증상의 경감), 치료, 및 상기 질환의 발병 억제 또는 지연을 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 LPS로 자극된 비장세포에서 COX-2 (cyclooxygenase-2) 및 IFN-γ (interferon-gamma)의 발현을 억제하고, TNF-α(Tumor necrosis factor alpha), INF-γ 및 IL-17(interleukin 17)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염증성 사이토카인의 분비를 억제하는 것으로 나타났다.
또한, 상기 펩타이드는 TNF-α로 자극된 비장세포에서 TNF-α, IL-1β(interleukin-1β) 및 IFN-γ로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염증성 사이토카인의 분비를 억제하는 것으로 나타났다.
또한, 상기 펩타이드는 LPS, TGF-β 및 IL-23에 의해 자극된 비장세포에서 IFN-γ의 분비를 억제하고, TNF-α 및 IL-17A에 의해 자극된 비장세포에서 IL-17의 분비를 억제하는 것으로 나타났다.
또한, 상기 펩타이드는 TNF-α 및 IL-17A에 의해 유발된 인 비트로(in vitro) 건선 피부염 시험모델인 HaCaT 세포에서 TNF-α, IL-6, IL-8과 같은 염증성 사이토카인 및 COX2의 발현을 억제하고, iNOS와 JNK와 같은 염증매개인자의 활성을 감소시키는 것으로 나타났다.
이러한 결과는 본 발명의 펩타이드가 염증성 사이토카인 유전자의 발현 조절을 통해 염증성 사이토카인을 억제하고, COX-2, INOS의 발현 조절을 통한 PGE2, NO 생산억제, JNK 활성을 억제하는 등 염증 반응들을 차단함으로써 항염증 효과를 가짐을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 기존의 항염증 활성을 통해 일반적인 염증 질환에 치료 효과를 가질 뿐만 아니라 건선을 포함하는 자가면역질환의 치료에 효과를 가진다는 것을 의미한다.
본 발명의 다른 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, 상기 “염증성 질환”은 외부의 물리 화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염 또는 자가면역에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 염증 반응이 일으키는 병리적 증상으로 정의될 수 있다. 상기 염증 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소 (예컨대 iNOS, COX-2 등)의 활성화, 염증 매개 물질의 분비 (예컨대, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-17, IL-1β, IFN-γ 등의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타날 수 있다.
상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성 질환일 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환으로 포함되는 한, 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성 질환을 모두 포함한다.
구체적으로 상기 염증성 질환은 염증성 피부질환 또는 염증성 자가면역질환일 수 있다.
상기 염증성 피부질환은 아토피 피부염, 접촉성 피부염, 알레르기성 피부질환, 여드름, 좌창 및 두드러기 등일 수 있다.
상기 염증성 자가면역질환은 건선, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 류마티스성 관절염, 천식, 궤양성 대장염, 베체씨병, 크론씨병, 다발성 경화증, 피부근염, 교원병, 혈관염, 관절염, 육아종증, 장기 특이적 자가면역병변, 궤양성 대장염 및 이식편대숙주병(graft-versus-host disease, GvHD) 등 일 수 있다.
본 명세서에서, '예방'은 본 발명의 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물에 의해 염증의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서, “개선 또는 치료”는 본 발명의 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물에 의해 염증의 진행을 지연, 중단 또는 역전시키는 등, 염증과 관련하여 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 펩타이드는 비장세포에서 COX-2 및 IFN-γ의 발현을 억제하고, TNF-α, IL-17, IFN-γ, IL-1β 및 IL-17의 분비를 억제함으로써 염증성 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
또한, 상기 펩타이드는 각질형성세포에서 TNF-α, IL-6, IL-8과 같은 염증성 사이토카인 및 COX2의 발현을 억제하고, iNOS와 JNK와 같은 염증매개인자의 발현을 감소시킴으로써 염증성 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있다. 또한 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체로는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995)에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들어, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구적인 투여방법으로는 이에 제한되는 것은 아니나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있고, 비경구 투여용 제제는 구체적으로 주사용 제제 또는 외용제의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 '약학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 항염증제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있으며, 예를 들어 상기 약학적 조성물을 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.0001㎍ 내지 500mg, 바람직하게는 0.01㎍ 내지 100mg 투여할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물은 본 기술분야에서 통상적으로 제조되는 임의의 제형으로 제조될 수 있고, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 파우더, 헤어토닉, 헤어크림, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 헤어스프레이, 헤어 에어졸, 포마드, 젤 등과 같은 용액, 솔젤, 에멀젼, 오일, 왁스, 에어졸 등의 다양한 형태로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물은 부형제, 담체 등 기타 첨가제를 포함할 수 있으며 일반 피부 화장료에 배합되는 보통의 성분을 필요한 만큼 적용 배합하는 것이 가능하다.
상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀루로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토오스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 사용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체가 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있고, 예를 들면 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형의 형태가 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 등과 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 헤어샴푸인 경우에는 본 발명의 펩타이드에 증점제, 계면활성제, 점도 조절제, 보습제, pH 조절제, 방부제, 에센셜 오일 등과 같이 샴푸를 조성하기 위한 베이스 성분들이 혼합될 수 있다. 상기 증점제로는 CDE가 사용될 수 있고, 상기 계면활성제로는 음이온 계면활성제인 LES와, 양쪽성 계면활성제인 코코 베타인이 사용될 수 있고, 상기 점도조절제로는 폴리 쿼터가 사용될 수 있으며, 상기 보습제로는 글리세린이 사용될 수 있고, 상기 pH 조절제로는 구연산, 수산화나트륨이 사용될 수 있다. 상기 방부제로는 자몽 추출물 등이 사용될 수 있고, 이 외에도 시더우드, 페퍼민트, 로즈마리 등의 에센셜 오일과 실크 아미노산, 펜타올 또는 비타민 E가 첨가될 수 있다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 본 발명의 펩타이드와 담체 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 성분들, 예를 들면 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 등을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 염증을 억제하는 효과가 뛰어나므로, 염증성 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 목적으로 하는 의약품 또는 피부 염증의 개선을 목적으로 하는 화장품의 원료로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 치료적 유효량의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 상기 '염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물' 항목에서 설명한 펩타이드와 동일한바, 구체적인 설명은 위에서 기재한 내용을 원용한다.
본 명세서에 있어서, 상기 용어 "치료적 유효량"은 상기 펩타이드의 처치 동안, 질환의 발병 빈도를 개선시키기 위한 목적을 달성하되, 통상 다른 치료법과 관련된 유해한 부작용은 피하는 펩타이드의 양을 의미한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 서열번호 1의 아미노산 서열의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[합성예 1]
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 합성
자동 펩타이드 합성기(Liberty, CEM Corporation, 미국)를 이용하여 하기의 [표 1]에 기재된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 합성하고, C18 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC)(U-3000, Thermo fisher scientific, 미국)를 이용하여 이들 합성된 펩타이드를 순수 분리하였다. 컬럼은 Pursuit XRs C18(250 * 4.65 mm 100Å, Agilent, 미국)을 이용하였다.
서열번호 펩타이드의 아미노산 서열
1 SVSVGMKPSPRP
[실험예 1]
비장세포에서 LPS로 유도된 염증 억제 효과 확인
<1-1> 전염증성 사이토카인 유전자의 발현 변화 확인
합성예 1에서 합성된 본 발명의 펩타이드가 LPS로 유도된 염증 반응에 미치는 영향을 확인하기 위하여 염증성 사이토카인 COX2 및 INFγ의 mRNA의 발현 정도를 RT-PCR로 측정하였다.
구체적으로, 6-7 주령의 마우스(C57BL/6, (주) 영바이오)를 희생하여 비장(spleen)을 얻고, 세포 여과기를 이용하여 비장을 으깨어 무혈청 RPMI-1640 배지와 함께 원심분리하였다. 상층은 버리고 적혈구(RBC)를 제거하기 위해 RBC 용해 버퍼를 2회 사용하였다. 이후, 무혈청 RPMI-1640 배지로 세척한 뒤, 적당량의 무혈청 RPMI-1640 배지를 첨가하였다. 마우스 비장세포의 수를 측정하여 1x107세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종한 후 밤새 배양하였다. 다음날 무혈청 배지로 배지를 교체하여 4시간 동안 배양한 후 본 발명의 펩타이드 (5 μM 및 50 μM) 및 자극제로 염증유도 물질인 LPS (2 μg/ml)를 처리하여, 3시간 추가 배양하였다.
다음으로, 배양 후 세포를 회수하여 RNA 추출 키트(Qiagen RNeasy kit)를 이용해 전체 RNA를 추출하였고, RNA 정량 후 cDNA 합성 키트 (Intron, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chian reaction, PCR)은 PCR 프리믹스(Intron, Korea), 합성한 cDNA, COX2, INFγ 및 GAPDH 각 유전자에 특이적인 하기 [표 2]에 나타낸 프라이머를 혼합하여 수행하였다. PCR 산물을 5% 아가로스겔에 전기영동하였고, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 염증 및 자가면역 질환과 연관된 유전자인 COX2 및 INFγ 의 mRNA 발현 레벨을 확인하였다.
유전자 프라이머 서열(5'->3') 서열번호
COX2 F TGAGTGGTAGCCAGCAAAGC 2
R CTGCAGTCCAGGTTCAATGG 3
INFγ F GAGGTCAACAACCCACAGGT 4
R GGGACAATCTCTTCCCCACC 5
그 결과, [도 1]에 나타난 바와 같이 비장세포에서 LPS로 염증 환경을 조성한 후에도 본 발명의 펩타이드를 처리하면 염증과 관련된 유전자의 발현을 현저하게 감소시킬 수 있음을 확인하였다.<1-2> 전염증성 사이토카인의 분비량 확인
합성예 1에서 합성된 본 발명의 펩타이드가 LPS로 유도된 염증 반응에 미치는 영향을 확인하기 위하여 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-17 및 INFγ의 분비량을 ELISA로 측정하였다.
구체적으로, 6-7 주령의 마우스(C57BL/6, (주) 영바이오)를 희생하여 비장(spleen)을 얻고, 세포 여과기를 이용하여 비장을 으깨어 무혈청 RPMI-1640 배지와 함께 원심분리하였다. 상층은 버리고 적혈구(RBC)를 제거하기 위해 RBC 용해 버퍼를 2회 사용하였다. 이후, 무혈청 RPMI-1640 배지로 세척한 뒤, 적당량의 무혈청 RPMI-1640 배지를 첨가하였다. 마우스 비장세포의 수를 측정하여 1x107세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종한 후 밤새 배양하였다. 다음날 무혈청 배지로 배지를 교체하여 4시간 동안 배양한 후 본 발명의 펩타이드 (5 μM 및 50 μM) 및 자극제로 염증유도 물질인 LPS (2 μg/ml)를 처리하여, 24시간 추가 배양하였다.
다음으로, 배양 후 세포배양액을 회수하여 Th17 분화시 분비 마커인 IL-17, IFN-γ 및 TNF-α 에 특이적인 ELISA 키트(Quantikine ELISA Kit, R&D system사, USA)를 사용하여 흡광도 측정(Spectramax M2, Molecular Devices사)을 수행하였다.
그 결과, 도 2a 내지 도 2c에 나타난 바와 같이 본 발명의 펩타이드는 염증성 사이토카인인 TNF-α, IFN-γ, IL-17의 분비를 현저하게 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
[실험예 2]
비장세포에서 다양한 염증유도물질로 유도된 염증 억제 효과 확인
<2-1> TNF-α로 유도된 염증 억제 효과 확인
합성예 1에서 합성된 본 발명의 펩타이드가 TNF-α로 유도된 염증 반응에 미치는 영향을 확인하기 위하여 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 INFγ의 분비량을 ELISA로 측정하였다.
구체적으로, 6-7 주령의 마우스(C57BL/6, (주) 영바이오)를 희생하여 비장(spleen)을 얻고, 세포 여과기를 이용하여 비장을 으깨어 무혈청 RPMI-1640 배지와 함께 원심분리하였다. 상층은 버리고 적혈구(RBC)를 제거하기 위해 RBC 용해 버퍼를 2회 사용하였다. 이후, 무혈청 RPMI-1640 배지로 세척한 뒤, 적당량의 무혈청 RPMI-1640 배지를 첨가하였다. 마우스 비장세포의 수를 측정하여 1x107세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종한 후 밤새 배양하였다. 다음날 무혈청 배지로 배지를 교체하여 4시간 동안 배양한 후 본 발명의 펩타이드 (5 μM 및 50 μM) 및 자극제로 염증유도 물질인 TNF-α (20 nM)를 처리하고, 24시간 추가 배양하였다.
다음으로, 배양 후 세포배양액을 회수하여 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 INFγ의 분비량을 TNF-α, IL-1β 및 INFγ에 특이적인 ELISA 키트(Quantikine ELISA Kit, R&D system사, USA)를 사용하여 흡광도 측정(Spectramax M2, Molecular Devices사)을 수행하였다.
그 결과, 도 3a 내지 도 3c에 나타난 바와 같이 본 발명의 펩타이드는 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 INFγ의 분비를 현저하게 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
<2-2> LPS, TGF-β, IL-23으로 유도된 염증 억제 효과 확인
합성예 1에서 합성된 본 발명의 펩타이드가 LPS, TGF-β, IL-23로 유도된 염증 반응에 미치는 영향을 확인하기 위하여 염증성 사이토카인 INFγ의 분비량을 ELISA로 측정하였다.
구체적으로, 6-7 주령의 마우스를 희생하여 비장(spleen)을 얻고, 세포 여과기를 이용하여 비장을 으깨어 무혈청 RPMI-1640 배지와 함께 원심분리하였다. 상층은 버리고 적혈구(RBC)를 제거하기 위해 RBC 용해 버퍼를 2회 사용하였다. 이후, 무혈청 RPMI-1640 배지로 세척한 뒤, 적당량의 무혈청 RPMI-1640 배지를 첨가하였다. 마우스 비장세포의 수를 측정하여 1x107세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종한 후 밤새 배양하였다. 다음날 무혈청 배지로 배지를 교체하여 4시간 동안 배양한 후 본 발명의 펩타이드 (5 μM 및 50 μM) 및 자극제로 염증유도 물질인 LPS (2μg/ml), TGF-β(20ng/ml), IL-23 (20ng/ml)를 처리하여, 24시간 추가 배양하였다.
다음으로, 배양 후 세포배양액을 회수하여 염증성 사이토카인 INFγ의 분비량을 INFγ에 특이적인 ELISA 키트(Quantikine ELISA Kit, R&D system사, USA)를 사용하여 흡광도 측정(Spectramax M2, Molecular Devices사)을 수행하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 본 발명의 펩타이드는 염증성 사이토카인인 INFγ의 분비를 현저하게 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
<2-3> TNF-α 및 IL-17A로 유도된 염증 억제 효과 확인
합성예 1에서 합성된 본 발명의 펩타이드가 TNF-α 및 IL-17A로 유도된 염증 반응에 미치는 영향을 확인하기 위하여 염증성 사이토카인 IL-17의 분비량을 ELISA로 측정하였다.
구체적으로, 6-7 주령의 마우스를 희생하여 비장(spleen)을 얻고, 세포 여과기를 이용하여 비장을 으깨어 무혈청 RPMI-1640 배지와 함께 원심분리하였다. 상층은 버리고 적혈구(RBC)를 제거하기 위해 RBC 용해 버퍼를 2회 사용하였다. 이후, 무혈청 RPMI-1640 배지로 세척한 뒤, 적당량의 무혈청 RPMI-1640 배지를 첨가하였다. 마우스 비장세포의 수를 측정하여 1x107세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종한 후 밤새 배양하였다. 다음날 무혈청 배지로 배지를 교체하여 4시간 동안 배양한 후 본 발명의 펩타이드 (5 μM 및 50 μM) 및 자극제로 염증유도 물질인 TNF-α (20 nM), IL-17A (200 ng/ml)를 처리하고, 24 시간 추가 배양하였다.
다음으로, 배양 후 세포배양액을 회수하여 염증성 사이토카인 IL-17의 분비량을 IL-17에 특이적인 ELISA 키트(Quantikine ELISA Kit, R&D system사, USA)를 사용하여 흡광도 측정(Spectramax M2, Molecular Devices사)을 수행하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 본 발명의 펩타이드는 염증성 사이토카인인 IL-17의 분비를 현저하게 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
[실험예 3]
각질형성세포에서 Th17 매개 염증 억제 효과 확인
<3-1> 전염증성 사이토카인 유전자의 발현 변화 확인
합성예 1에서 합성된 본 발명의 펩타이드가 Th17 매개 염증 반응에 미치는 영향을 확인하기 위하여 TNF-α, COX2, IL-6 및 IL-8의 mRNA 발현 정도를 RT-PCR로 측정하였다.
구체적으로, 각질형성세포 HaCaT(human Keratinocyte (CLS Cell Lines Service))의 수를 측정하여 3x105세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종한 후 밤새 배양하였다. 다음날 무혈청 배지로 배지를 교체하여 4시간 동안 배양한 후 본 발명의 펩타이드 (5 μM 및 50 μM) 및 자극제로 사용된 Th17 타입 염증유도 사이토카인, TNF-α (10nM)와 hIL-17A (200ng/ml)를 처리하고, 1시간 추가 배양하였다.
다음으로, 배양 후 세포배양액을 회수하여 RNA 추출 키트(Qiagen RNeasy kit)를 이용해 전체 RNA를 추출하였고, RNA 정량 후 cDNA 합성 키트 (Intron, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chian reaction, PCR)은 PCR 프리믹스(Intron, Korea), 합성한 cDNA, TNF-α, COX2, IL-6, IL-8 및 GAPDH 각 유전자에 특이적인 하기 [표 3]에 나타낸 프라이머를 혼합하여 수행하였다. PCR 산물을 5% 아가로스겔에 전기영동하였고, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 염증 및 자가면역 질환과 연관된 유전자인 TNF-α, COX2, IL-6, IL-8의 mRNA 발현 수준을 확인하였다.
유전자 프라이머 서열(5'->3') 서열번호
TNF-α F AACATCCAACCTTCCCAAACG 6
R GACCCTAAGCCCCCAATTCTC 7
COX2 F ATCATTCACCAGGCAAATTGC 8
R GGCTTCAGCATAAAGCGTTTG 9
IL-6 F AAAGAGGCACTGCCAGAAAA 10
R ATCTGAGGTGCCCATGCTAC 11
IL-8 F GAAGGTGCAGTTTTGCCAAG 12
R ACCCTCTGCACCCAGTTTTC 13
GAPDH F GGAGCCAAAAGGGTCATCAT 14
R GTGATGGCATGGACTGTGGT 15
그 결과, [도 6]에 나타난 바와 같이 본 발명의 펩타이드는 염증 및 자가면역과 관련된 유전자의 발현을 현저하게 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
<3-2> 염증성 사이토카인의 활성 변화 확인
합성예 1에서 합성된 본 발명의 펩타이드가 Th17 매개 염증 반응에 미치는 영향을 확인하기 위하여 염증유도 인자 및 신호전달 단백질인 iNOS 및 pJNK의 인산화 정도를 웨스턴 블롯으로 측정하였다.
구체적으로, 각질형성세포 HaCaT(human Keratinocyte (CLS Cell Lines Service)) 의 수를 측정하여 1x107세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종한 후 밤새 배양하였다. 다음날 무혈청 배지로 배지를 교체하여 4시간 동안 배양한 후 본 발명의 펩타이드 (5 μM 및 50 μM) 및 자극제로 Th17 타입 염증유도 사이토카인인 TNF-α (10nM)와 hIL-17A (200ng/ml)를 처리하고, 24 시간 추가 배양하였다.
배양 후 세포를 회수하여 세포 용해물(lysate)를 준비하고, iNOS 와 pJNK에 대한 항체 (Cell Signaling Technology, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯(western blotting)을 수행하고 단백질 발현 양상을 확인하였다.
그 결과, [도 7]에 나타난 바와 같이 본 발명의 펩타이드는 Th17 매개 염증 유도 환경에서도 염증 유도 인자 및 신호전달 단백질인 iNOS와 JNK의 인산화를 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
이상에서 본 발명은 기재된 실시예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims (12)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩타이드는 항염증 활성을 갖는 것인, 펩타이드.
  3. 청구항 1의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 펩타이드는 염증반응 유도된 비장세포에서 i) COX-2(cyclooxygenase 2) 및 INF-γ(Interferon gamma)의 발현을 억제하거나, ii) TNF-α(Tumor necrosis factor alpha), INF-γ, IL-17(interleukin 17), IL-1β(interleukin 1 beta)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염증성 사이토카인의 분비를 억제하는 것인 항염증용 조성물.
  5. 청구항 3에 있어서,
    상기 펩타이드는 염증반응 유도된 각질형성세포에서 TNF-α, IL-6(interleukin 6) 및 IL-8(interleukin 8)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염증성 사이토카인, 및 COX-2(cyclooxygenase 2)의 발현을 억제하는 것인 항염증용 조성물.
  6. 청구항 3에 있어서,
    상기 펩타이드는 염증반응 유도된 각질형성세포에서 iNOS(inducible nitric oxide synthase) 및 COX-2(cyclooxygenase 2)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 활성을 억제하는 것인 항염증용 조성물.
  7. 청구항 1의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 염증성 질환은 염증성 피부질환인 것인, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 염증성 피부질환은 아토피 피부염, 접촉성 피부염, 알레르기성 피부질환, 여드름, 좌창 및 두드러기로 구성된 군에서 선택되는 것인 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 청구항 7에 있어서,
    상기 염증성 질환은 염증성 자가면역질환인 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 염증성 자가면역질환은 건선, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 류마티스성 관절염, 천식, 궤양성 대장염, 베체씨병, 크론씨병, 다발성 경화증, 피부근염, 교원병, 혈관염, 관절염, 육아종증, 장기 특이적 자가면역병변, 궤양성 대장염 및 이식편대 숙주 반응 질환(graft-versus-host disease, GvHD)으로 구성된 군에서 선택되는 것인 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 청구항 1의 펩타이드를 포함하는 항염증용 화장료 조성물.
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