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WO2022260149A1 - 低温管理された細胞凝集塊及び細胞凝集塊の維持方法 - Google Patents

低温管理された細胞凝集塊及び細胞凝集塊の維持方法 Download PDF

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WO2022260149A1
WO2022260149A1 PCT/JP2022/023371 JP2022023371W WO2022260149A1 WO 2022260149 A1 WO2022260149 A1 WO 2022260149A1 JP 2022023371 W JP2022023371 W JP 2022023371W WO 2022260149 A1 WO2022260149 A1 WO 2022260149A1
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WO
WIPO (PCT)
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cell
cells
aggregates
hours
cell aggregates
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2022/023371
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English (en)
French (fr)
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健二 長船
俊二郎 杉本
誠 兩坂
陽一 神保
文彦 北川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rege Nephro Co Ltd
Nikkiso Co Ltd
Kyoto University NUC
Original Assignee
Rege Nephro Co Ltd
Nikkiso Co Ltd
Kyoto University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to EP22820328.7A priority patent/EP4353817A4/en
Publication of WO2022260149A1 publication Critical patent/WO2022260149A1/ja
Priority to US18/535,328 priority patent/US20240110157A1/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature

Definitions

  • the present invention relates to cell aggregates of cultured cells and methods for maintaining cell aggregates.
  • the present invention further relates to methods for producing cell aggregates and cell preparations comprising cell aggregates.
  • nephron progenitor cells are fetal progenitor cells that derive multiple epithelial cells that compose renal glomeruli and renal tubules. Reducing renal injury in acute kidney injury (AKI) model mice due to perfusion injury (Toyohara T. et al., Stem Cells Transl Med. 2015 Sep; 4(9): 980-992; Hoshina A. et al., Sci Rep.
  • AKI acute kidney injury
  • nephron progenitor cell transplantation therapy is expected as a therapeutic method for renal diseases.
  • Patent Document 1 describes that adhesion between pluripotent stem cell aggregates can be suppressed by floating culture of pluripotent stem cells in a medium containing cell cycle arresting agents such as colchicine and cytochalasin.
  • a cell cycle arresting agent is a drug that inhibits cell division by stopping the cell cycle, which is the cell division cycle, at a specific time, and is a substance that is highly toxic to cells. Therefore, in regenerative medicine or the like, when the manufactured cells are transplanted into a living body, it is necessary to remove the cell cycle arresting agent.
  • Cell cycle arresting agents in culture media and buffers can be removed in the washing process, but it is difficult to remove the amount that has been taken up by cells, and it can be used in fields such as regenerative medicine. There is concern about the adverse effects of
  • the present invention maintains the original characteristics of cells that can be used as cell preparations in regenerative medicine and is highly safe cell aggregates, and cell aggregates suitable for use as cell preparations in regenerative medicine. It is an object of the present invention to provide a simple and safe method for maintaining cell size, cell characteristics and viability.
  • a maintaining step of maintaining a liquid containing a plurality of cell aggregates at a temperature lower than the culture temperature of the cells and at a temperature at which the liquid does not freeze It is a method of inclusion.
  • One embodiment according to the present invention includes a culturing step of forming a plurality of cell aggregates by culturing cells in a medium, and a liquid containing the plurality of cell aggregates, wherein the temperature is lower than the culture temperature of the cells, and It is a cell aggregate produced by a method including a cooling step of cooling to a temperature at which the liquid does not freeze.
  • FIG. 1 is a photomicrograph depicting the morphology of multiple mouse fetal nephron progenitor cell aggregates maintained in contact with each other at various temperatures for predetermined time periods. The length of the scale bar in the figure is 500 ⁇ m.
  • FIG. 2 is a photomicrograph showing the morphology of nephron progenitor cell aggregates derived from mouse embryos before and after induction of nephron differentiation.
  • FIG. 3 is a photomicrograph showing the differentiating and proliferating ability of cryopreserved fetal mouse-derived nephron progenitor cells. The length of the scale bar in the figure is 500 ⁇ m.
  • FIG. 4 is a photograph showing the state immediately after human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates were maintained in a 1.5 mL tube at 4° C. for 24 hours and the culture solution was stirred.
  • FIG. 5 is a photomicrograph showing the morphology of a plurality of human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates maintained in contact with each other at various temperatures for predetermined time periods.
  • D standing at 37°C for 24 hours.
  • SRP54 protein trafficking-related marker gene
  • RPL4 protein synthesis-related marker gene
  • SIX2 nephron progenitor cell-related marker gene
  • FIG. 4 is a diagram showing; A is SRP54, B is RPL4, and C is the expression level of SIX2, respectively, before cold maintenance (“control”), after standing at 4 ° C. for 24 hours (“4 ° C.”), and at 4 ° C. for 24 hours. It is a diagram comparing three conditions after standing at 37° C. for 24 hours (“37° C.”).
  • FIG. 7 shows that, among the gene groups related to cell components, gene
  • FIG. 10 is a table showing GO terms, GO term numbers, and adjusted P-values of the top 10 gene clusters with decreased expression levels.
  • FIG. FIG. 8 shows that, among the gene groups related to biological processes, gene FIG.
  • FIG. 10 is a table showing GO terms, GO term numbers, and adjusted P-values of the top 10 gene clusters with decreased expression levels.
  • FIG. Fig. 9 shows the expression levels of genes in a sample of human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates left at 4°C for 48 hours compared to a sample left at 37°C for 48 hours among genes related to molecular functions.
  • 1 is a table showing GO terms, GO term numbers and Adjusted P-values of the top 10 gene clusters in which .
  • FIG. 10 is a photomicrograph showing the morphology of multiple human iPS cell aggregates maintained in contact with each other at various temperatures for predetermined time periods.
  • FIG. 11 is a photograph showing a kidney of a cisplatin-induced acute kidney injury model mouse and human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates transplanted under the kidney capsule.
  • FIG. 12 shows the effect of transplanting human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates under the renal capsule of cisplatin-induced acute kidney injury model mice.
  • A is a graph showing blood urea nitrogen (“BUN”) levels, which are renal function markers in mice
  • B is a diagram showing serum creatinine (“Cre”) concentrations.
  • NPC blood urea nitrogen
  • saline physiological saline
  • pre indicates the value before administration
  • post indicates the value 4 days after administration.
  • FIG. 13 shows the effect of cryopreservation on the expression levels of nephron progenitor cell-associated marker genes (OSR1, SIX2) in human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates.
  • FIG. 14 is a photograph showing inhibition of adhesion of mouse fetal nephron progenitor cells obtained in a bioreactor. The length of the scale bar in the figure is 500 ⁇ m.
  • A is mouse embryo-derived nephron progenitor cell aggregates in a bioreactor immediately after culturing
  • B is a mouse embryo-derived nephron progenitor cell aggregate in a state of being transferred to a 15 mL tube and spontaneously sedimented.
  • C is a photomicrograph of fetal mouse-derived nephron progenitor cell aggregates immediately after the end of the culture and D after being maintained at 4° C. for 24 hours.
  • FIG. 15 is a photograph showing the effect of adding methylcellulose. The length of the scale bar in the figure is 500 ⁇ m.
  • A is a photograph showing the state of fetal mouse-derived nephron progenitor cell aggregates in a normal medium (left) and a medium supplemented with 0.6% methylcellulose (right).
  • B is a photomicrograph of fetal mouse-derived nephron progenitor cell aggregates immediately after culturing in normal medium, and C is after 24 hours at 4° C. in 0.6% methylcellulose-supplemented medium.
  • a maintaining step of maintaining a liquid containing a plurality of cell aggregates at a temperature lower than the culture temperature of the cells and at a temperature at which the liquid does not freeze is a method of inclusion.
  • another embodiment is a method for producing a cell aggregate, comprising a culturing step of forming a plurality of cell aggregates by culturing cells in a medium, and a liquid containing the plurality of cell aggregates,
  • the method for producing cell aggregates includes a cooling step of cooling to a temperature lower than the culture temperature of the cells and to a temperature at which the liquid does not freeze.
  • the cells used in the present invention are not particularly limited as long as they form aggregates in the culture medium.
  • Cells are preferably of mammalian origin, preferably from species commonly used in research such as humans, primates such as monkeys, or mice.
  • Examples of cells include cells used in regenerative medicine research and cells used as cell preparations, such as undifferentiated cells.
  • An undifferentiated cell refers to a cell having self-renewal ability and differentiation ability.
  • Specific examples of undifferentiated cells include pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, various progenitor cells such as nephron progenitor cells, ureteroblasts and stromal progenitor cells, mesenchymal stem cells, neural stem cells and adipocytes.
  • the cells may be cells induced to differentiate from undifferentiated cells, immortalized cells or established cell lines, or primary cultured cells isolated from tissues. In addition, depending on the purpose, it may be a normal cell, or a cell having a disease, genetic abnormality, or transgene.
  • Cultivation of cells can be carried out according to a conventional method, for example, under conditions of 37° C. and 5% CO 2 using a medium and culture vessel suitable for the cells to be cultured.
  • the medium for culturing cells is not particularly limited, and an appropriate medium can be selected and used according to the cells.
  • conventionally known materials and additives useful for cell culture can be used as appropriate.
  • the culture may be static culture, shaking culture, stirring culture, or the like. Cultivation may be adherent culture, but culture is preferably performed in a non-adherent state (for example, suspension culture) for at least part of the period. Certain types of cells can form cell aggregates by culturing them in a non-adherent state in a culture vessel.
  • Non-adhesive state refers to a state in which all or most of the cells are not adhered to the surface of the culture vessel, and a state in which all or most of the cells are separated from the surface of the culture vessel. It includes a state in which even if it is in contact with the surface, it can be easily separated from the surface of the culture vessel due to the coating of the culture vessel or the convection of the medium without using instruments or enzymes.
  • Any culture vessel can be used.
  • a dish or plate subjected to cell non-(low) adhesion treatment may be used to facilitate the formation of aggregates, and a spinner flask or bioreactor may be used for mass culture.
  • a "aggregate" of cells refers to a clump-like aggregate of several or more cells.
  • the number of cells constituting the aggregate can be any number depending on the type of cells and the purpose of use. 000 or more, or 200,000 or more.
  • the number of cells forming the aggregate is, for example, 500,000 or less, 400,000 or less, 300,000 or less, or 200,000 or less.
  • the number of cells in an aggregate having a predetermined diameter can be calculated by previously measuring the diameter (definition and measurement method will be described later) and the number of cells of the produced aggregate.
  • the number of cells is about 5,000 to about 10,000 and the diameter is 200 ⁇ m, the number of cells is about 50,000 to about 100,000 and the diameter is 500 ⁇ m, and the number of cells is about 100,000. ⁇ 300,000 aggregates with a diameter of 800 ⁇ m are formed. Therefore, the number of cells constituting nephron progenitor cell aggregates is preferably 5,000 or more, more preferably 10,000 or more, most preferably 50,000 or more, and 500,000. below, more preferably 400,000 or less, most preferably 300,000 or less.
  • the diameter of the aggregate is defined as the maximum width of the aggregate. That is, the diameter of the agglomerate is the length of the largest straight line connecting two points on the outer edge of the agglomerate. Since the agglomerate is almost spherical, the size of the agglomerate is sometimes referred to as the diameter of the agglomerate for convenience.
  • the diameter of the aggregate can be controlled by adjusting the number of cells seeded in the culture vessel and the culture period.
  • one cell aggregate is formed in one well.
  • fetal mouse-derived nephron progenitor cells when the number of cells seeded per well is about 5,000, aggregates containing about 100,000 cells after 96 hours, human iPS cell-derived nephron progenitor cells
  • clumps containing about 100,000 to about 300,000 cells are obtained after 168 hours when about 20,000 cells are seeded per well.
  • the diameter of the aggregate or the number of cells constituting one aggregate can be controlled by adjusting the seeding density and the number of days of culture. .
  • the cell aggregate used in the present invention can have any diameter, for example, 50 ⁇ m or more, 100 ⁇ m or more. In some cases, it can be 200 ⁇ m or more, 500 ⁇ m or more. When the cell aggregates are in such a range, the therapeutic effect tends to be high. On the other hand, it is preferable that the diameter of the cell aggregates is smaller than the inner diameter of the needle of the implantation device, because the aggregates will not be broken when passing through the needle. Therefore, in general, it is preferably 1,000 ⁇ m or less.
  • 80% or more of the total number of aggregates is within the desired diameter range (e.g., 200 ⁇ m or more and 1,000 ⁇ m or less), and more preferably 90% or more of the total number of aggregates is within the desired diameter range. (for example, 200 ⁇ m or more and 1,000 ⁇ m or less).
  • Such cell aggregates are usually collected from the medium and concentrated after being formed. If necessary, before or after the concentration step, a fractionation step of sorting the cell aggregates by size may be performed. Fractionation can be performed by any known method, for example, by a cell strainer.
  • a medium containing a population of cell aggregates immediately after cell culture is passed through two types of cell strainers (mesh diameters: 1,000 ⁇ m and 200 ⁇ m) of pluriStrainer (registered trademark, pluriselect).
  • pluriStrainer registered trademark, pluriselect
  • On a cell strainer with a mesh diameter of 200 ⁇ m cell aggregates with a size of 200 ⁇ m or more and 1,000 ⁇ m or less were separated into cell aggregates with a size of 200 ⁇ m or less in the filtrate. be. Thereby, the diameter of the cell aggregate can be made uniform within a desired range.
  • the collection may be performed by allowing the medium to stand still to settle cell aggregates, or may be performed by centrifugation. After collecting the cell clumps and removing the excess medium, the cell clumps can be suspended in a suitable amount of liquid to obtain a concentrated suspension of cell clumps.
  • the liquid in which the cell aggregates are suspended is not particularly limited as long as it does not adversely affect the cell aggregates.
  • a liquid other than the medium for example, physiological saline, buffer solution, etc.
  • This liquid may contain salts, buffers, serum, vitamins, amino acids, glucose (sugar), electrolytes, antibiotics, growth factors (compounds, proteins).
  • the liquid preferably does not substantially contain a cell cycle arresting agent. In other words, it is preferred that substantially no cell cycle arresting agent is added to the liquid.
  • the expression that the liquid "substantially does not contain a cell cycle arresting agent” means that the liquid "contains a cell cycle arresting agent to the extent that it does not affect the cell cycle of cells, or does not contain a cell cycle arresting agent at all.” It means “no”.
  • the concentration of the cell cycle arresting agent in the liquid is preferably less than 3 ng/mL, less than 1 ng/mL, and particularly preferably 0 ng/mL.
  • this liquid may contain a viscosity modifier.
  • the viscosity modifier may be added before or after suspending the cell aggregates in the liquid.
  • Viscosity modifiers include methyl cellulose and gellan gum. Viscosity modifiers can be added at a concentration of 0.1% to 1.0% by weight based on the total solution. Alternatively, the viscosity modifier can be added so that the solution has a viscosity of 0.8 mPa ⁇ s to 25 mPa ⁇ s (JIS Z8803) at 4°C. Viscosity modifiers can slow or reduce contact between cell clumps by reducing the settling velocity of cell clumps in concentrated suspensions of cell clumps. Therefore, by containing a viscosity modifier, the effect of suppressing adhesion between cell aggregates is enhanced.
  • this liquid may contain lysophospholipids.
  • the lysophospholipid may be added before or after suspending the cell aggregates in the liquid.
  • Lysophospholipids include lysophosphatidic acid (LPA) and sphingosine-1-phosphate (S1P).
  • Lysophospholipids can be added at a concentration of 1.0 ng/mL to 10.0 mg/mL based on total solution. Lysophospholipids can inhibit adhesion between cell clumps in concentrated suspensions of cell clumps. Therefore, by containing lysophospholipid, the effect of suppressing adhesion between cell aggregates is enhanced.
  • One embodiment of the present invention is a method for producing cell aggregates, wherein a liquid containing a plurality of cell aggregates, i.e., a suspension of cell aggregates, is heated to a temperature lower than the cell culture temperature and the liquid does not freeze.
  • a cooling step of cooling to a temperature (hereinafter sometimes referred to as “maintenance temperature” for convenience) is included.
  • the optimum temperature can be appropriately selected depending on the type of cells, the application of the cell aggregates, the period of time during which function maintenance and/or adhesion inhibition is required, and the like.
  • the maintenance temperature can be, for example, 10° C. or higher, preferably 15° C. or higher, more preferably 20° C. or higher, lower than the cell culture temperature.
  • the maintenance temperature is generally 36°C or lower, preferably 32°C or lower, 28°C or lower, 24°C or lower, 22°C or lower, and more preferably 16°C or lower. The lower the maintenance temperature, the lower the cell activity and the longer the adhesion inhibition time tends to be.
  • the maintenance temperature is generally above 0° C., 2° C. or higher, preferably 4° C. or higher. When the maintenance temperature is in this range, partial freezing in the cells is less likely to occur, and cell aggregates with high cell viability can be obtained.
  • the maintenance temperature may be constant, or may be managed within a predetermined temperature range.
  • Cooling can be performed by using an incubator, a constant temperature room, a refrigerator, etc. adjusted to the desired temperature to maintain the container containing the cell aggregate suspension until the maintenance temperature is reached.
  • the medium may be aspirated off and the medium may be rapidly cooled by, for example, adding a new chilled liquid. Cooling may proceed gradually, but is preferably completed within 6 hours from the end of the culture to reaching the maintenance temperature. Cooling can be initiated at any desired time after formation of the cell clumps as needed to inhibit adhesion between cell clumps.
  • a method for maintaining cell aggregates which is one embodiment of the present invention, includes a step of maintaining a liquid containing a plurality of cell aggregates at a maintenance temperature.
  • the maintaining step can be performed by keeping the container containing the suspension of cell aggregates in an environment at the same temperature as the maintaining temperature achieved in the cooling step.
  • the period of the maintenance process can be set appropriately as necessary. In general, lower maintenance temperatures tend to allow longer-term maintenance of cell clump numbers, cell viability and cell properties. As described above, at 4° C., the temperature can be maintained for 48 hours or longer. Note that the upper limit time is not particularly limited, and is, for example, 168 hours.
  • the number of cell aggregates can be 40% or more of the number at the start of the maintenance step, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, most preferably 85% or more. be.
  • the cell viability of the cell aggregates can be 60% or higher, preferably 70% or higher, more preferably 80% or higher. The cell viability can be calculated, for example, by converting cell aggregates into single cells and determining the percentage of cells that were not stained with trypan blue solution among all cells.
  • cooling process and the maintenance process do not necessarily have to be performed by standing still. Therefore, it can be performed under conditions of vibration that does not cause breakage of cell aggregates, such as on a shaker or during transportation.
  • a cell aggregate which is one embodiment of the present invention, can be provided as a cell preparation by being housed in an appropriate container.
  • Containers for containing cell aggregates include syringes, plastic or glass vials, plastic bottles, plastic bags, centrifuge tubes, and the like.
  • the liquid (preservation solution) filled in the container together with the cell aggregates can be the same liquid as the liquid for suspending the cell aggregates described above, and can be physiological saline, glucose solution, fresh medium, refrigerated storage medium, frozen Storage medium and the like are exemplified.
  • the storage solution can contain additives as necessary.
  • Such additives include serum, vitamins, amino acids, glucose (sugar), electrolytes, antibiotics, viscosity modifiers (methylcellulose, etc.), lysophospholipids, ROCK (Rho-associated coiled-coil forming kinase) Examples include low-molecular-weight compounds such as inhibitors, growth factors (compounds, proteins), and the like.
  • the preservation solution is preferably substantially free of cell cycle arresting agents.
  • mice fetal nephron progenitor cell aggregates ⁇ 1-1. Aggregate morphology and cell viability>
  • Mouse fetal nephron progenitor cells were cultured according to Li Z. et al., Cell Stem Cell. 2016 Oct 06; 19(4): 516-529. 100,000 cells/mL mouse fetal nephron progenitor cells were seeded in a 96-well plate (PrimeSurface (registered trademark) plate 96U, Sumitomo Bakelite) at 50 ⁇ L (5,000 cells)/well, and mouse fetal nephron progenitor cells were seeded.
  • Progenitor cell culture medium (Li et al., supra) was cultured in an incubator at 37° C. and 5% CO 2 . On the second day of culture, 100 ⁇ L of medium was overlaid. After 96 hours, it was confirmed by microscopic observation that mouse fetal nephron progenitor cells formed aggregates with a diameter of 500 ⁇ m to 1,000 ⁇ m. The diameter of cell aggregates was measured using an all-in-one fluorescence microscope (BZ-X710, Keyence Corporation) and analysis application software.
  • the nephron progenitor cell aggregates were aspirated with a 200 ⁇ L tip with a cut tip, and placed in 3 wells of a 96-well plate. Add 100 ⁇ L of mouse embryo-derived nephron progenitor cell culture medium to each well of the 96-well plate, and leave the medium in an incubator at 4° C., 8° C., 16° C., or 22° C. in an atmospheric environment, or in an incubator at 37° C. It was left still under the condition of 5% CO2 .
  • the medium in each well was pipetted to confirm the presence or absence of adhesion among the three cell aggregates standing still on the bottom of the well. Furthermore, the state of adhesion between cell aggregates before and after pipetting was confirmed using an all-in-one fluorescence microscope (BZ-X710, Keyence Corporation). In addition, the cell aggregates allowed to stand under each condition were transferred to a 1.5 mL tube and treated with ACCUMAX (trademark, STEMCELL TECHNOLOGIES) for 10 minutes to form single cells.
  • ACCUMAX trademark, STEMCELL TECHNOLOGIES
  • Fig. 1 shows the morphology of fetal mouse-derived nephron progenitor cell aggregates left at 4°C, 22°C, or 37°C for 24 hours or 48 hours.
  • Tables 1 and 2 show the cell viability and the presence or absence of adhesion between aggregates after standing at 4°C, 8°C, 16°C, 22°C, or 37°C for the times shown in the tables, respectively.
  • mice embryo-derived nephron progenitor cells were seeded in a 96-well plate, and the cells were subjected to the above 1-1. was cultured for 96 hours in the same manner as in , to form aggregates. Aggregates were allowed to rest at 4° C., 8° C., 16° C., 22° C., or 37° C. for 24 hours, or 48 hours and plated on Transwell®, Corning Inc. using nephron induction medium (Li et al.). , supra) for 144 hours at 37°C and 5% CO 2 conditions in semi-gas phase culture. 100 ⁇ L of the medium under the Transwell membrane was replaced every two days. As a control, nephron induction was similarly performed with respect to mouse embryo-derived nephron progenitor cell clusters normally cultured at 37°C.
  • Fig. 2 shows fetal mouse-derived nephron progenitor cell aggregates left at 4°C for 48 hours before (A) and after nephron induction (B), and nephrons of fetal mouse-derived nephron progenitor cell aggregates obtained by a conventional method.
  • the morphology after induction (C) is shown.
  • Table 3 shows the results of nephron induction of fetal mouse-derived nephron progenitor cell aggregates that were allowed to stand at 4°C, 8°C, 16°C, 22°C, or 37°C for 24 hours (or 48 hours).
  • Mouse embryo-derived nephron progenitor cell aggregates left at rest at 22° C. or lower were confirmed to differentiate into nephron tissue as in the control. Therefore, it was confirmed that the properties of nephron progenitor cells can be maintained even when mouse embryo-derived nephron progenitor cells are allowed to stand in an environment at a lower temperature than normal culture (37° C., 5% CO 2 environment).
  • Fig. 3 shows mouse embryo-derived nephron progenitors that were subcultured at 4°C (A) or 37°C (B) for 144 hours after passage of mouse embryo-derived nephron aggregates maintained at 4°C for 48 hours. Morphology of cells and morphology after nephron induction in (B) (C).
  • mice embryo-derived nephron progenitor cells maintained at 4°C for 48 hours were single-celled, subcultured, and cultured at 37°C, the cells proliferated, aggregates grew, and nephron differentiation was confirmed. Therefore, it was confirmed that when the temperature of the cells whose activity was decreased by maintaining at 4°C was returned to 37°C, the proliferation ability was recovered. On the other hand, it was confirmed that when the cells were cultured at 4°C, the cells did not proliferate and the aggregates did not grow.
  • Human iPS cell-derived nephron progenitor cells were prepared from human iPS cells and cultured according to the method for producing nephron progenitor cells (International Publication WO2018/216743). Human iPS cell-derived nephron progenitor cells adjusted to 200,000 cells/mL were seeded in a 96-well plate (PrimeSurface (registered trademark) plate 96U, Sumitomo Bakelite) at 100 ⁇ L (20,000 cells)/well, and FGF9 and CHIR99021 were added.
  • a 96-well plate PrimarymeSurface (registered trademark) plate 96U, Sumitomo Bakelite
  • human iPS cell-derived nephron progenitor cell expansion culture medium at 37° C. and 5% CO 2 . After 48 hours, 96 hours and 144 hours of culture, 100 ⁇ L of medium was replaced. After 168 hours, it was confirmed that human iPS cell-derived nephron progenitor cells formed cell aggregates with a diameter of 500 ⁇ m to 1,000 ⁇ m.
  • the culture solution in the 1.5 mL tube was stirred, and the state of adhesion between the left human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates was confirmed. Further, it was treated with ACCUMAX (trademark, STEM CELL TECHNOLOGIES) for 10 minutes to form a single cell. 20 ⁇ L each of the cell suspension in which the single cells were dispersed and 0.5% trypan blue solution (Nacalai Tesque) were mixed, and the cell viability was measured using a cell counter (TC20 (trademark), Bio-Rad Laboratories). .
  • ACCUMAX trademark, STEM CELL TECHNOLOGIES
  • Fig. 4 shows the state immediately after the human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates were transferred to a 1.5 mL tube, allowed to stand at 4°C for 24 hours, and then the culture solution was stirred. It was confirmed that 5 clumps were maintained without adhesion. Also, in Tables 4 and 5, human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates after standing at 4°C, 8°C, 16°C, 22°C, or 37°C for the times shown in Tables 4 and 5 The survival rate and the presence or absence of inhibition of aggregate adhesion are shown, respectively.
  • human iPS cell-derived nephron progenitor cells like mouse fetal nephron progenitor cells, can suppress adhesion between clumps at low temperatures while maintaining a high survival rate.
  • human iPS cell-derived nephron progenitor cells were seeded in a 96-well plate, and 2-1. and cultured for 120 hours to form aggregates. Aggregates were allowed to rest at 4°C, 8°C, or 16°C for 24 hours, or 48 hours, and plated on Transwell® (Corning) in nephron induction medium for 144 hours, 37°C, 5°C. Semi-gas phase culture was performed under % CO2 conditions. 100 ⁇ L of the medium under the Transwell membrane was replaced every 48 hours. As a control, human iPS cell-derived nephron progenitor cell clusters routinely cultured at 37° C. were similarly subjected to nephron induction. Table 6 shows the results.
  • human iPS cell-derived nephron progenitor cells formed cell aggregates with a diameter of 500 ⁇ m to 800 ⁇ m.
  • the human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates were aspirated with a 200 ⁇ L chip with the tip cut off, and placed in 3 wells of a 96-well plate. To each well of this 96-well plate, 100 ⁇ L of HypoThermosol (registered trademark, HemaCare), which is a refrigerated storage medium, or a medium for human iPS cell-derived nephron progenitor cell expansion culture was added.
  • HypoThermosol registered trademark, HemaCare
  • Fig. 5 shows the morphology of human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates after each elapsed time. 2-1 above. Similarly, after 24 hours, the aggregates were adhered to each other when left at 37°C, while the aggregates were maintained without adhesion at 4°C. Further, after standing at 4° C., the aggregates were adhered to each other when further standing at 37° C. for 24 hours. Therefore, it was confirmed that the adhesiveness between the aggregates was restored when the temperature of the cells whose adhesiveness between the aggregates was lowered by maintaining the temperature at 4°C was returned to 37°C.
  • FIG. 6 shows the measurement results of the gene expression levels of SRP54, RPL4, and SIX2 in human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates in each aggregate (relative values where the average of the control group is 1).
  • SRP54 a protein transport-related marker gene
  • RPL4 a protein synthesis-related marker gene
  • SIX2 which is a nephron progenitor cell-associated marker gene
  • human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates maintained the properties of nephron progenitor cells by cryopreservation, and that the properties did not change even after storage for 24 hours.
  • the human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates were aspirated with a 200 ⁇ L chip with the tip cut off, and placed in 3 wells of a 96-well plate. To each well of this 96-well plate, 100 ⁇ L of HypoThermosol (registered trademark, HemaCare), which is a refrigerated storage medium, or a medium for human iPS cell-derived nephron progenitor cell expansion culture was added.
  • HypoThermosol registered trademark, HemaCare
  • RNA sequence analysis (ENCODE-DCC long read RNA-seq pipeline (2.3.4); https://www.encodeproject.org/pipelines/ENCPL002LPE/) was performed. Specifically, first, reference sequences were created and mapped. Next, using the R language (R (3.6.3); https://www.r-project.org/), a two-group comparison (DESeq2 (1.26.0)) was performed, and the sample Genes whose expression levels fluctuated between were detected.
  • GSEA gene ontology enrichment analysis
  • FIG. 7 shows the GO terms of the top 10 gene clusters (GO terms) in which gene expression levels were lower in samples placed at 4°C than in samples placed at 37°C among gene groups related to cell components ( GO Term), GO term number (GO ID) and Adjusted P-value (q-value, also referred to as Q value).
  • GO terms the top 10 gene clusters
  • GO ID GO term number
  • Q value Adjusted P-value
  • FIG. 8 shows the GO term of the top 10 gene groups ( GO Term), GO term number (GO ID) and Adjusted P-value. As shown in FIG. 8, all of the top five gene clusters were gene clusters related to translation. Therefore, it was found that the expression of the gene cluster related to translation was lower in the sample left at 4°C than in the sample left at 37°C.
  • FIG. 9 shows the GO terms of the top 10 gene groups in which the gene expression level decreased in the sample left at 4°C compared to the sample left at 37°C among the gene groups related to molecular function. ), GO term number (GO ID) and Adjusted P-value.
  • GO ID GO term number
  • Adjusted P-value As shown in FIG. 9, compared to the sample left at 37° C., the sample left at 4° C. showed the lowest expression level of the gene group related to RNA binding (GO term number: 0003723), followed by cadherin binding ( GO term number: 0045296).
  • RNA binding is primarily regulated during post-transcriptional (eg, translational) processes of RNA.
  • Cadherin is also one of the cell-cell adhesion molecules and contributes to cell-cell adhesion.
  • a ROCK inhibitor (Y-27632, Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the medium to 10 ⁇ M, and after 24 hours, the medium was replaced with 100 ⁇ L of human iPS cell medium. After 48 hours, it was confirmed by microscopic observation that human iPS cells formed aggregates with a diameter of 100 ⁇ m to 400 ⁇ m.
  • the human iPS cell aggregates were aspirated with a 200 ⁇ L tip with a cut end, and placed in 3 wells of a 96-well plate. To each well of this 96-well plate, 100 ⁇ L of HypoThermosol (registered trademark, HemaCare), which is a refrigerated storage medium, or human iPS cell medium was added. Those to which the refrigerated storage medium was added were placed in an incubator at 4°C in an atmospheric environment, and those to which the human iPS cell medium was added were placed in an incubator at 37°C under 5% CO 2 conditions. After 24 hours, the medium in the wells left in the 4°C incubator was replaced with 100 ⁇ L of human iPS cell medium, and left in the 37°C incubator under 5% CO 2 conditions for 24 hours.
  • HypoThermosol registered trademark, HemaCare
  • Fig. 10 shows the morphology of human iPS cell aggregates after each elapsed time. After 24 hours, the aggregates were adhered to each other when left at 37°C, while the aggregates were maintained without adhesion at 4°C. Further, after standing at 4° C., the aggregates were adhered to each other when further standing at 37° C. for 24 hours. Therefore, it was confirmed that human iPS cells, like mouse fetal nephron progenitor cells, can suppress adhesion between aggregates at low temperatures. In addition, it was confirmed that the adhesiveness between the aggregates was restored when the temperature of the cells, whose adhesiveness between the aggregates had decreased due to the maintenance at 4°C, was returned to 37°C.
  • Human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates were prepared by preparing human iPS cell-derived nephron progenitor cells from human iPS cells and culturing them in the same manner as described above. However, human iPS cell-derived nephron progenitor cells adjusted to 1,000,000 cells/mL were seeded in a 96-well plate (PrimeSurface (registered trademark) plate 96U, Sumitomo Bakelite) at 100 ⁇ L (100,000 cells)/well. , human iPS cell-derived nephron progenitor cells were cultured for 2 days at 37°C and 5% CO 2 in a medium for expansion culture. Agglomerate diameters ranged from 500 ⁇ m to 800 ⁇ m.
  • This human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregate was stored in a refrigerator set at 4°C in an air environment for 24 hours.
  • the storage temperature in the stationary place in the refrigerator was measured with a thermometer, it was 2°C to 4°C. It was confirmed by pipetting that adhesion between aggregates could be suppressed by keeping the aggregates at a low temperature.
  • FIG. 11 shows a photograph of human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates (black arrows) immediately after administration under the left renal capsule of cisplatin-induced acute kidney injury model mice.
  • a physiological saline-administered group (6 mice) was prepared except that approximately 50 ⁇ L of physiological saline was administered instead of the human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates.
  • BUN blood urea nitrogen
  • serum creatinine concentration which are renal function markers
  • A is the result of blood BUN level (“BUN”) and B is the result of serum creatinine concentration (“Cre”).
  • BUN blood BUN level
  • Cre serum creatinine concentration
  • pre is the value before administration of human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates (“NPC”) or physiological saline (“saline”)
  • post is the value 4 days after administration.
  • human iPS-derived nephron progenitor cell aggregates In the group administered human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates, both the blood BUN level and serum creatinine concentration were significantly lower than in the physiological saline administration group. Therefore, human iPS-derived nephron progenitor cell aggregates stored at 4° C. for 24 hours were found to have an effect of suppressing exacerbation of renal function in cisplatin-induced acute kidney injury model mice.
  • Human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates were prepared by preparing human iPS cell-derived nephron progenitor cells from human iPS cells and culturing them in the same manner as described above. Agglomerate diameters ranged from 500 ⁇ m to 800 ⁇ m.
  • This human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregate (3,000,000 cells in total, 20 human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates) and 25 mL of a refrigerated preservation medium, HypoThermosol (registered trademark, HemaCare), It was placed in a 25 mL tube and suspended. Furthermore, this 25 mL tube was stored in a cryogenic transportation system, iP-TEC (registered trademark) Premier BOX-V8.5 (Sanplatec Co., Ltd.). A latent heat cold storage material-5 (Sun Platech Co., Ltd.) was placed in the containment vessel, and the inside of the containment vessel was maintained at 5°C to 6°C. After 48 hours of storage, the culture medium in the 25 mL tube was agitated by pipetting, and the state of adhesion between the left human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates was confirmed.
  • HypoThermosol registered trademark, Hem
  • a 25 mL tube prepared in the same manner was placed in a refrigerator set at 4 ° C. (actual value 2 ° C. to 4 ° C.) instead of being placed in a containment vessel, and similarly for 48 hours in an atmospheric environment. saved.
  • the internal temperature of the transportation system's containment vessel was maintained at around 6°C for 48 hours, and the cell masses were maintained without adhering to each other.
  • the human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates preserved in the containment vessel maintained a cell viability of 90% or more after 48 hours.
  • Fig. 13 shows nephron precursors of human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates before storage and after storage for 48 hours in a storage container (5°C to 6°C) or in a refrigerator (2°C to 4°C) (3 samples for each group). Shown are the results of measurement of cell-related marker gene expression level (relative value with the mean of the group before storage as 1) and the results of significant difference test by One-way ANOVA.
  • A is OSR1 and B is SIX2.
  • OSR1 and SIX2 which are nephron progenitor cell-related marker genes, among the three groups. Therefore, the properties of the human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates are maintained by the transportation system and the low temperature storage in the refrigerator, and the performance of the human iPS cell-derived nephron progenitor cell aggregates does not change even after storage for 48 hours. was confirmed.
  • the cell aggregates were collected in a 15 mL tube and allowed to settle naturally to obtain aggregates with a volume of about 2 mL. This was dispensed into four 15 mL tubes, 10 mL of fresh medium was added, and the mixture was allowed to stand at 4°C or 37°C.
  • the medium was resuspended and the presence or absence of adhesion between cell aggregates was confirmed. Further, it was treated with ACCUMAX (trademark, STEM CELL TECHNOLOGIES) for 10 minutes to form a single cell. 20 ⁇ L each of the cell suspension in which the single cells were dispersed and 0.5% trypan blue solution (Nacalai Tesque) were mixed, and the cell viability was measured using a cell counter (TC20 (trademark), Bio-Rad Laboratories). .
  • ACCUMAX trademark, STEM CELL TECHNOLOGIES
  • Fig. 14 shows mouse embryo-derived nephron progenitor cell aggregates immediately after culturing in a 100 mL single-use bioreactor (A) and after being transferred to a 15 mL tube and spontaneously sedimented (B).
  • A mouse embryo-derived nephron progenitor cell aggregates immediately after culturing in a 100 mL single-use bioreactor
  • B spontaneously sedimented
  • the morphology of fetal mouse-derived nephron progenitor cell aggregates immediately after culturing in the bioreactor (0h, C) and after standing at 4° C. for 24 hours (24h, D) are shown.
  • These nephron progenitor cell aggregates were about 200 ⁇ m to about 1,000 ⁇ m in diameter when observed microscopically.
  • mouse embryo-derived nephron progenitor cell aggregates maintained the desired aggregate diameter without adhering to each other even after being maintained at 4°C for 24 hours. Moreover, the cell viability was 87%, confirming that a high cell viability was maintained.
  • mice fetal nephron progenitor cells were seeded in a 100 mL single-use bioreactor (Able), and 100 mL of mouse fetal nephron progenitor cell culture medium (for convenience, normal medium or It was cultured with stirring at 40 rpm in a medium (sometimes simply referred to as medium). After 48 hours, 96 hours, 120 hours, 144 hours and 168 hours of culture, 50 mL of medium was replaced. After culturing for 192 hours, stirring was stopped to allow cell aggregates to settle, and then the supernatant was removed by aspiration.
  • Able single-use bioreactor
  • the medium was resuspended and the presence or absence of adhesion between cell aggregates was confirmed. Further, it was treated with ACCUMAX (trademark, STEM CELL TECHNOLOGIES) for 10 minutes to form a single cell. 20 ⁇ L each of the cell suspension in which the single cells were dispersed and 0.5% trypan blue solution (Nacalai Tesque) were mixed, and the cell viability was measured using a cell counter (TC20 (trademark), Bio-Rad Laboratories). .
  • ACCUMAX trademark, STEM CELL TECHNOLOGIES
  • Fig. 15 shows mouse embryo-derived nephron progenitor cell aggregates suspended in a normal medium (A, left) or a medium supplemented with 0.6% methylcellulose (A, right), respectively, and transferred to a 15 mL tube for 1 minute. Indicates status.
  • the morphology of fetal mouse-derived nephron progenitor cell aggregates immediately after culturing in a normal medium in a bioreactor (B) and after standing at 4° C. in a medium supplemented with 0.6% methylcellulose for 24 hours (C). indicates
  • sedimented cell aggregates are confirmed in the normal medium, whereas sediment is not confirmed in the medium supplemented with 0.6% methylcellulose. Therefore, by suspending mouse embryo-derived nephron progenitor cell aggregates in a medium supplemented with 0.6% methylcellulose, it is possible to significantly reduce the sedimentation velocity of a large amount of concentrated aggregates. was confirmed. Since it is possible to reduce the chances of the aggregates settling and coming into contact with each other, it is thought that adhesion between the aggregates can be further suppressed.
  • a first embodiment of the present invention is a method for maintaining cell aggregates, in which a maintaining step of maintaining a liquid containing a plurality of cell aggregates at a temperature lower than the culture temperature of the cells and at a temperature at which the liquid does not freeze. is a method that includes As a result, it is possible to prevent adhesion between aggregates and enlargement without using an additive that may adversely affect cells while maintaining the therapeutic effect of the cell aggregates.
  • a second embodiment of the present invention is a method according to the first embodiment, wherein the temperature is 2°C or higher and 22°C or lower. As a result, it is possible to prevent adhesion and enlargement of cell aggregates such as nephron progenitor cells for a longer period of time.
  • a third embodiment of the present invention is the method according to the first or second embodiment, wherein the period of the maintaining step is 2 hours or more. As a result, it is possible to prevent adhesion and enlargement of cell aggregates such as nephron progenitor cells for a longer period of time.
  • a fourth embodiment of the present invention is the method according to the first to third embodiments, wherein the liquid further contains a viscosity modifier.
  • a fifth embodiment of the present invention is the method according to the first to fourth embodiments, wherein the cell aggregate has a diameter of 50 ⁇ m or more and 1,000 ⁇ m or less. This has the effect of reducing the risk of the clump breaking up as it passes through the needle of the implantation device.
  • a sixth embodiment of the present invention is the method according to the first to fifth embodiments, wherein the cell aggregate is a cell aggregate of undifferentiated cells. As a result, it is possible to obtain cell aggregates that can be used for treatment of various diseases by regenerative medicine.
  • a seventh embodiment of the present invention is a method for producing cell aggregates, comprising: a culturing step of forming a plurality of cell aggregates by culturing cells in a medium; and a method for producing a cell aggregate, comprising a cooling step of cooling to a temperature lower than the cell culture temperature and to a temperature at which the liquid does not freeze.
  • the eighth embodiment of the present invention is the method according to the seventh embodiment, further comprising a concentration step of concentrating the cell aggregates in the liquid. This has the effect of reducing the volume of liquid containing cell clumps, resulting in cell clumps suitable for the manufacture, transport and use of cell preparations.
  • a ninth embodiment of the present invention is the method according to the seventh or eighth embodiment, further comprising a fractionating step of fractionating the cell aggregates by diameter. Thereby, there is an effect that a cell aggregate suitable for transplantation can be selected.
  • a tenth embodiment of the present invention is the method according to the seventh to ninth embodiments, wherein the medium and the liquid do not substantially contain a cell cycle arresting agent.
  • the eleventh embodiment of the present invention is a cell aggregate obtained by the seventh to tenth embodiments. As a result, the properties and viability of cells are maintained, and cell aggregates with high therapeutic effects and suitable for use in regenerative medicine can be obtained.
  • a twelfth embodiment of the present invention is the cell aggregate according to the eleventh embodiment, wherein the cell aggregate has a cell viability of 70% or more after being maintained at the temperature for 24 hours. This has the effect of making it possible to manufacture and transport cell aggregates and cell preparations that maintain high cell viability until use.
  • the thirteenth embodiment of the present invention is the eleventh or twelfth embodiment, wherein the cells are undifferentiated cells. As a result, there is an effect that various diseases can be treated by regenerative medicine.
  • a fourteenth embodiment of the present invention is the eleventh to thirteenth embodiments, wherein the cells are nephron progenitor cells, and at least part of the nephron progenitor cells constituting the cell aggregate are differentiated It is a cell aggregate with potency. As a result, there is an effect that renal disease can be treated by regenerative medicine.
  • a fifteenth embodiment of the present invention is a cell preparation comprising the cell aggregates of the eleventh to fourteenth embodiments. This provides an effect of providing a cell preparation containing high-quality cell aggregates that maintains therapeutic effects until the time of use.
  • the present invention can be used to produce and maintain cell aggregates that can be used in regenerative medicine and the like.

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Abstract

再生医療における細胞製剤として利用し得る、細胞の本来の特性を維持しており、かつ安全性の高い細胞凝集塊、及び再生医療における細胞製剤としての利用に適した細胞凝集塊の大きさ、細胞の特性及び生存率を簡便かつ安全に維持する方法を提供する。本発明のある態様は、細胞凝集塊を維持する方法において、複数の前記細胞凝集塊を含む液体を、前記細胞の培養温度より低く、かつ前記液体が凍結しない温度に維持する維持工程を含む方法である。

Description

低温管理された細胞凝集塊及び細胞凝集塊の維持方法
　本発明は、培養細胞の細胞凝集塊、及び細胞凝集塊の維持方法に関する。本発明は、更に、細胞凝集塊の製造方法及び細胞凝集塊を含む細胞製剤にも関する。
　近年、損傷した組織等の修復のために、幹細胞や前駆細胞などの細胞を移植する試みが行われている。これらの細胞は、様々な細胞に分化する能力を有していることから、これらの細胞を用いる再生医療は、これまで治療が困難とされていた疾患の新たな治療方法となることが期待されている。例えば、ネフロン前駆細胞は、腎糸球体と尿細管を構成する複数の上皮細胞を派生させる胎生期の前駆細胞であり、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞の細胞塊の腎被膜下移植が虚血再灌流障害による急性腎障害（Ａｃｕｔｅ　ｋｉｄｎｅｙ　ｉｎｊｕｒｙ；ＡＫＩ）モデルマウスの腎障害を軽減すること（Toyohara T. et al., Stem Cells Transl Med. 2015 Sep; 4(9): 980-992；Hoshina A. et al., Sci Rep. 2019 Jul 18; 9(1): 10701）、マウス胎仔由来ネフロン前駆細胞の細胞塊の腎被膜下移植がシスプラチンによる薬剤性ＡＫＩモデルマウスの腎障害を軽減すること（Li Z. et al., Cell Stem Cell. 2016 Oct 06; 19(4): 516-529）が報告されている。そのため、腎疾患の治療法として、ネフロン前駆細胞移植療法が期待されている。
　このような再生医療に基づく新たな治療方法の実用化には、治療法の確立とともに、安定的に細胞製剤を製造できる方法、及び製造された細胞製剤を使用時まで良好な状態に維持する方法が求められている。
　細胞製剤として培養した細胞凝集塊を利用する場合、細胞を培養後、回収し、濃縮し、輸送する過程において、複数の細胞凝集塊が接触する状況下では、使用時までに細胞凝集塊同士が接着して巨大化することが問題となっている。細胞凝集塊が巨大化すると、凝集塊内部の細胞が死滅して生存率が低下する。また、接着により細胞塊が変性する可能性や、移植する際に、細胞移植デバイスの針の内径よりも凝集塊が大きいと凝集塊がばらばらに破壊され、治療効果が低下する可能性が考えられる。
　したがって、細胞凝集塊を用いた細胞療法の実現のためには、細胞製剤の製造や輸送中に、細胞凝集塊同士が接着せず、移植に適した凝集塊の大きさと、治療効果をもたらす細胞の特性を維持する方法の開発が必須である。
　特許文献１には、コルヒチン、サイトカラシン等の細胞周期停止剤を含む培地中で多能性幹細胞を浮遊培養することにより、多能性幹細胞凝集塊同士の接着を抑制できることが記載されている。
　しかし、細胞周期停止剤は、細胞分裂サイクルである細胞周期を特定の時期で停止させ、細胞分裂を阻害する薬剤であり、細胞に対して毒性が強い物質である。そのため、再生医療等において、製造した細胞を生体内に移植する場合、細胞周期停止剤を除去する必要がある。培養液や緩衝液中の細胞周期停止剤は、洗浄工程で取り除くことが可能であるが、細胞に取り込まれた分を除去することは困難であり、再生医療等の分野で用いる細胞凝集塊への悪影響が懸念される。
国際公開公報ＷＯ２０１９／１３１９４０
　本発明は、再生医療における細胞製剤として利用し得る、細胞の本来の特性を維持しており、かつ安全性の高い細胞凝集塊、及び再生医療における細胞製剤としての利用に適した細胞凝集塊の大きさ、細胞の特性及び生存率を簡便かつ安全に維持する方法の提供を目的とする。
　本発明に係る一実施態様は、細胞凝集塊を維持する方法において、複数の前記細胞凝集塊を含む液体を、この細胞の培養温度より低く、かつこの液体が凍結しない温度に維持する維持工程を含む方法である。
　本発明に係る一実施態様は、細胞を培地中で培養することにより複数の細胞凝集塊を形成させる培養工程、及び複数の前記細胞凝集塊を含む液体を、この細胞の培養温度より低く、かつこの液体が凍結しない温度に冷却する冷却工程を含む方法により製造された、細胞凝集塊である。
　本発明によれば、ネフロン前駆細胞などの細胞凝集塊の治療効果を維持したまま、細胞に悪影響を与え得る添加剤を用いずに凝集塊同士の接着及び巨大化を防ぐことが可能になる。
　また、本発明によれば、適切な細胞凝集塊の大きさ、細胞の特性及び生存率が維持され、使用時まで治療効果を保つ細胞凝集塊及び細胞製剤の製造及び輸送が可能になる。
図１は、互いに接触する状態で種々の温度にて所定の時間維持した複数のマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊の形態を表す顕微鏡写真である。図中のスケールバーの長さは５００μｍである。 図２は、マウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊のネフロン分化誘導前後の形態を表す顕微鏡写真である。Ａは、４℃で４８時間維持したマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊のネフロン誘導前、Ｂは、４℃で４８時間維持したマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊のネフロン誘導後、Ｃは、通常方法（３７℃）で得られたマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊のネフロン誘導後の形態である。 図３は、低温維持したマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞の分化能及び増殖能を示す顕微鏡写真である。図中のスケールバーの長さは５００μｍである。Ａは、４℃で４８時間維持した後、再継代し、４℃で１４４時間培養したマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞、Ｂは、４℃で４８時間維持した後、再継代し、３７℃で１４４時間培養したマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞のネフロン誘導前、Ｃは、４℃で４８時間維持した後、再継代し、３７℃で１４４時間培養したマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞のネフロン誘導後の形態である。 図４は、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊を１．５ｍＬチューブ中で４℃で２４時間維持し、培養液を撹拌した直後の状態を示す写真である。 図５は、互いに接触する状態で種々の温度にて所定の時間維持した複数のヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊の形態を示す顕微鏡写真である。Ａは、維持前、Ｂは、４℃で２４時間静置後、Ｃは、４℃で２４時間静置後、更に３７℃で２４時間静置後、Ｄは、３７℃で２４時間静置後の形態である。 図６は、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊における、タンパク質輸送関連マーカー遺伝子（ＳＲＰ５４）、タンパク質合成関連マーカー遺伝子（ＲＰＬ４）及びネフロン前駆細胞関連マーカー遺伝子（ＳＩＸ２）発現量に対する低温保存の影響を示す図である。ＡはＳＲＰ５４、ＢはＲＰＬ４、ＣはＳＩＸ２の発現量を、それぞれ、低温維持前（「ｃｏｎｔｒｏｌ」）、４℃で２４時間静置後（「４℃」）、及び４℃で２４時間静置後、更に３７℃で２４時間静置後（「３７℃」）の３条件で比較した図である。 図７は、細胞の構成要素に係る遺伝子群のうち、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊を３７℃に４８時間静置したサンプルと比較して、４℃に４８時間静置したサンプルにおいて遺伝子発現量が低下した、上位１０遺伝子群のＧＯターム、ＧＯターム番号及びAdjusted P-valueを示す表である。 図８は、生物学的プロセスに係る遺伝子群のうち、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊を３７℃に４８時間静置したサンプルと比較して、４℃に４８時間静置したサンプルにおいて遺伝子発現量が低下した、上位１０遺伝子群のＧＯターム、ＧＯターム番号及びAdjusted P-valueを示す表である。 図９は、分子機能に係る遺伝子群のうち、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊を３７℃に４８時間静置したサンプルと比較して、４℃に４８時間静置したサンプルにおいて遺伝子発現量が低下した、上位１０遺伝子群のＧＯターム、ＧＯターム番号及びAdjusted P-valueを示す表である。 図１０は、互いに接触する状態で種々の温度にて所定の時間維持した複数のヒトｉＰＳ細胞凝集塊の形態を示す顕微鏡写真である。Ａは、維持前、Ｂは、４℃で２４時間静置後、Ｃは、４℃で２４時間静置後、更に３７℃で２４時間静置後、Ｄは、３７℃で２４時間静置後の形態である。 図１１は、シスプラチン誘発性急性腎障害モデルマウスの腎臓と、その腎被膜下に移植されたヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊を示す写真である。 図１２は、シスプラチン誘発性急性腎障害モデルマウスの腎被膜下にヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊を移植した効果を示す図である。Ａは、マウスの腎機能マーカーである血中尿素窒素（「ＢＵＮ」）値、Ｂは、血清クレアチニン（「Ｃｒｅ」）濃度をそれぞれ示す図である。ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊（「ＮＰＣ」）又は生理食塩水（「生食」）の、「ｐｒｅ」は投与前の値、「ｐｏｓｔ」は投与後４日目の値をそれぞれ表す。 図１３は、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊におけるネフロン前駆細胞関連マーカー遺伝子（ＯＳＲ１、ＳＩＸ２）発現量に対する低温保存の影響を示す図である。ＡはＯＳＲ１、ＢはＳＩＸ２の発現量を、それぞれ、低温保存前（「保存前」）、輸送システムの格納容器中（５℃～６℃）で４８時間保存後（「輸送容器」）、及び冷蔵庫内（２℃～４℃）で４８時間保存後（「４℃」）の３条件で比較した図である。 図１４は、バイオリアクターで得られたマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞の接着抑制を示す写真である。図中のスケールバーの長さは５００μｍである。Ａは、培養終了直後のバイオリアクター中、Ｂは、１５ｍＬチューブに移して自然沈降した状態の、マウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊である。Ｃは、培養終了直後、Ｄは、４℃で２４時間維持した後の、マウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊の顕微鏡写真である。 図１５は、メチルセルロースの添加の効果を示す写真である。図中のスケールバーの長さは５００μｍである。Ａは、通常培地（左）及び０．６％メチルセルロース添加培地（右）中の、マウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊の状態を示す写真である。Ｂは、通常培地中での培養終了直後、Ｃは、０．６％メチルセルロース添加培地中で４℃で２４時間維持した後の、マウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊の顕微鏡写真である。
　以下、本発明について詳述する。なお、本明細書中、数値範囲の説明における「ａ～ｂ」との表記は、特に断らない限り、ａ以上ｂ以下であることを表す。また、複数の上限値と複数の下限値とが別々に記載されている場合、これらの上限値と下限値とを自由に組み合わせて設定可能な全ての数値範囲が記載されているものとする。
　本発明に係る一実施態様は、細胞凝集塊を維持する方法において、複数の前記細胞凝集塊を含む液体を、この細胞の培養温度より低く、かつこの液体が凍結しない温度に維持する維持工程を含む方法である。また、別の実施態様は、細胞凝集塊の製造方法であって、細胞を培地中で培養することにより複数の細胞凝集塊を形成させる培養工程、及び複数の前記細胞凝集塊を含む液体を、前記細胞の培養温度より低く、かつ前記液体が凍結しない温度に冷却する冷却工程を含む、細胞凝集塊の製造方法である。
　本発明において使用される細胞は、培養液中で凝集塊を形成するものであればよく、特に限定されない。細胞は、哺乳類由来であることが好ましく、ヒト、サルなどの霊長類又はマウス等の研究に一般的に使用される種由来であることが好ましい。細胞の例としては、再生医療に関する研究に使用される細胞、細胞製剤として使用される細胞が挙げられ、例えば、未分化細胞が挙げられる。未分化細胞とは、自己複製能及び分化能を有する細胞を指す。未分化細胞として、具体的には、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞、ネフロン前駆細胞、尿管芽細胞及び間質前駆細胞などの各種前駆細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞及び脂肪幹細胞などの各種幹細胞が挙げられる。細胞は、未分化細胞から分化誘導された細胞、不死化細胞又は株化細胞であってもよく、組織から単離された初代培養細胞であってもよい。また、目的に応じて、正常細胞であってもよく、疾患又は遺伝子異常もしくは導入遺伝子を有する細胞であってもよい。
　細胞の培養は、培養しようとする細胞に適した培地及び培養容器を用いることにより、常法に従って、例えば３７℃、５％ＣＯ２条件下で、行うことができる。細胞を培養する培地は、細胞に応じて適切な培地を選択して使用することができ、特に限定されない。また、細胞培養に有用な従来公知の材料及び添加剤を適宜使用することができる。
　培養は、静置培養、振盪培養又は撹拌培養などのいずれであってもよい。培養は、接着培養であってもよいが、少なくとも一部の期間は非接着の状態で培養を行うこと（例えば浮遊培養）が好ましい。ある種の細胞は、培養容器に非接着の状態で培養することによって細胞凝集塊を形成させることができる。「非接着（の）状態」とは、全て又は大部分の細胞が培養容器表面に接着していない状態を指し、全て又は大部分の細胞が培養容器表面から離れて存在する状態、及び培養容器表面に接触している場合でも、器具もしくは酵素などを用いずに培養容器のコーティングや培地の対流などにより培養容器表面から容易に離れ得る状態を含む。
　培養容器は、任意のものを使用することができる。凝集塊の形成を容易にするために細胞非（低）接着処理が施されたディッシュ又はプレートを用いてもよく、大量培養のためにスピナーフラスコやバイオリアクターを用いてもよい。
　本明細書において、細胞の「凝集塊」は、数個以上の細胞の塊状の集合体を指す。凝集塊を構成する細胞の数は、細胞の種類及び使用目的などに応じて任意の数であることができ、例えば１，０００個以上、５，０００個以上、１０，０００個以上、１００，０００個以上、又は２００，０００個以上である。凝集塊を構成する細胞の数は、例えば、５００，０００個以下、４００，０００個以下、３００，０００個以下、又は２００，０００個以下である。所定直径を有する凝集塊の細胞数は、事前に、作製した凝集塊の直径（定義及び測定方法については、後述する）及び細胞数を測定しておくことにより、算出することができる。ネフロン前駆細胞凝集塊の場合は、細胞数約５，０００個～約１０，０００個で直径２００μｍ、細胞数約５０，０００個～約１００，０００個で直径５００μｍ、細胞数約１００，０００個～３００，０００個で直径８００μｍの凝集塊が形成される。したがって、ネフロン前駆細胞凝集塊を構成する細胞の数としては、５，０００個以上が好ましく、より好ましくは１０，０００個以上、最も好ましくは５０，０００個以上であり、また、５００，０００個以下が好ましく、より好ましくは４００，０００個以下、最も好ましくは３００，０００個以下である。
　なお、凝集塊の直径は、凝集塊の最大幅と定義される。すなわち、凝集塊の直径は、凝集塊の外縁上の２点をつなぐ直線のうち最大のものの長さである。凝集塊はほぼ球形であるため、適宜、凝集塊の大きさを便宜的に凝集塊の直径ということがある。
　凝集塊の直径は、培養容器に播種する細胞数及び培養期間を調整することにより、制御することができる。マルチウェルプレートで培養する場合、１つのウェルに１つの細胞凝集塊が形成される。例えば、マウス胎仔由来ネフロン前駆細胞であれば、１ウェルあたりの細胞の播種数が約５，０００個のとき、９６時間後に約１００，０００個の細胞を含む凝集塊、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞であれば、１ウェルあたりの細胞の播種数が約２０，０００個のとき、１６８時間後に約１００，０００個～約３００，０００個の細胞を含む凝集塊が得られる。
　ディッシュ又はスピナーフラスコなどの培養容器を用いて培養する場合も、凝集塊の直径、又は１つの凝集塊を構成する細胞の数は、播種密度と培養日数を調整することにより、制御することができる。
　本発明において使用される細胞凝集塊は、任意の直径であることができ、例えば５０μｍ以上、１００μｍ以上であることができる。また、ある場合には、２００μｍ以上、５００μｍ以上であることができる。細胞凝集塊がこのような範囲であると、治療効果が高くなる傾向がある。一方、細胞凝集塊の直径は、移植デバイスの針の内径よりも小さいと、針を通過する際に凝集塊が破壊されることがなくなるため、好ましい。したがって、一般に、好ましくは１，０００μｍ以下である。好適には、全凝集塊数の８０％以上が所望の直径の範囲内（例えば２００μｍ以上１，０００μｍ以下）であり、より好適には全凝集塊数の９０％以上が所望の直径の範囲内（例えば２００μｍ以上１，０００μｍ以下）である。
　このような細胞凝集塊は、通常、形成された後、培地から回収され、濃縮される。必要に応じて、濃縮工程の前又は後に、細胞凝集塊を大きさにより分別する分別工程を行ってもよい。分別は、公知の任意の方法によって行うことができ、例えば、セルストレーナーによって行うことができる。具体例としては、ｐｌｕｒｉＳｔｒａｉｎｅｒ（登録商標、ｐｌｕｒｉｓｅｌｅｃｔ社）の２種類のセルストレーナー（メッシュ径１，０００μｍ、２００μｍ）に、細胞培養直後の細胞凝集塊の集団を含む培地を通すことで、メッシュ径１，０００μｍのセルストレーナー上には１，０００μｍ以上の細胞凝集塊、メッシュ径２００μｍのセルストレーナー上には２００μｍ以上１，０００μｍ以下の細胞凝集塊、ろ液には２００μｍ以下の細胞凝集塊に分別される。これにより、細胞凝集塊の直径を所望の範囲に均一化することができる。
　回収は、培地を静置することによる細胞凝集塊の沈降によって行ってもよく、遠心分離によって行ってもよい。細胞凝集塊を回収し、過剰な培地を除去した後、細胞凝集塊を適量の液体に懸濁させて細胞凝集塊の濃縮懸濁液を得ることができる。
　細胞凝集塊を懸濁させる液体は、細胞凝集塊に悪影響を与えない限り特に限定されず、凝集塊を回収した際に少量残した培地であってもよく、新鮮培地であってもよく、あるいは培地以外の液体（例えば生理食塩水や緩衝液など）であってもよい。この液体は、塩類、緩衝剤、血清、ビタミン、アミノ酸、グルコース（糖)、電解質、抗生物質、成長因子（化合物、タンパク質)を含有していてもよい。ただし、当該液体は、細胞周期停止剤を実質的に含まないことが好ましい。換言すると、当該液体に細胞周期停止剤が実質的に添加されていないことが好ましい。ここで、当該液体が「細胞周期停止剤を実質的に含まない」とは、当該液体が「細胞周期停止剤を細胞の細胞周期に影響がない程度に含む、又は細胞周期停止剤を全く含まない」ことを指す。具体的には、当該液体における細胞周期停止剤の濃度は、好ましくは３ｎｇ／ｍＬ未満、１ｎｇ／ｍＬ未満であり、０ｎｇ／ｍＬが特に好ましい。
　また、この液体は、粘度調整剤を含有していてもよい。粘度調整剤の添加は、液体に細胞凝集塊を懸濁させる前でも後でもよい。粘度調整剤としては、メチルセルロース、ジェランガムが挙げられる。粘度調整剤は、溶液全体を基準として０．１質量％～１．０質量％の濃度で添加することができる。あるいは、粘度調整剤は、溶液の粘度が４℃にて０．８ｍＰａ・ｓ～２５ｍＰａ・ｓ（ＪＩＳ　Ｚ８８０３）になるように添加することができる。粘度調整剤は、細胞凝集塊の濃縮懸濁液において細胞凝集塊の沈降速度を低下させることにより、細胞凝集塊同士の接触を遅延又は低減させることができる。したがって、粘度調整剤を含有させることにより、細胞凝集塊同士の接着抑制の効果が増強される。
　また、この液体は、リゾリン脂質を含有していてもよい。リゾリン脂質の添加は、液体に細胞凝集塊を懸濁させる前でも後でもよい。リゾリン脂質としては、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）が挙げられる。リゾリン脂質は、溶液全体を基準として１．０ｎｇ／ｍＬ～１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度で添加することができる。リゾリン脂質は、細胞凝集塊の濃縮懸濁液において、細胞凝集塊同士の接着を抑制することができる。したがって、リゾリン脂質を含有させることにより、細胞凝集塊同士の接着抑制の効果が増強される。
　本発明に係る一実施態様である細胞凝集塊を製造する方法は、複数の細胞凝集塊を含む液体、すなわち細胞凝集塊の懸濁液を、細胞の培養温度より低く、かつ前記液体が凍結しない温度（以下、便宜上「維持温度」と呼ぶことがある）に冷却する冷却工程を含む。
　細胞の培養温度より低く、かつ前記液体が凍結しない温度は、細胞の種類や細胞凝集塊の用途、機能維持及び／又は接着抑制が必要な期間などに応じて最適温度を適宜選択することができる。維持温度は、例えば細胞の培養温度より１０℃以上、好ましくは１５℃以上、更に好ましくは２０℃以上、低い温度とすることができる。維持温度は、一般に３６℃以下であり、好ましくは３２℃以下、２８℃以下、２４℃以下、２２℃以下、更に好ましくは１６℃以下である。維持温度が低いほど、細胞の活性が低下し、接着抑制時間が長くなる傾向がある。また、維持温度は、一般に０℃超であり、２℃以上、好ましくは４℃以上である。維持温度がこのような範囲であると、細胞内での部分的な凍結などが起きにくく、細胞生存率が高い細胞凝集塊を取得できる。なお、維持温度は一定であってもよく、所定の温度範囲に管理してもよい。
　冷却は、所望の温度に調整したインキュベーター、恒温室、冷蔵庫などを使用して、維持温度になるまで細胞凝集塊の懸濁液を含む容器を保つことにより行うことができる。あるいは、培養終了後に、培地を吸引除去して、冷却した新たな液体を添加すること等により急冷してもよい。冷却は、徐々に進行させてもよいが、培養終了から維持温度に到達するまでを６時間以内に完了することが好ましい。冷却は、細胞凝集塊同士の接着を抑制するために必要に応じて細胞凝集塊の形成後の所望の時点で開始することができる。濃縮工程及び／又は分別工程を行う場合は、これらの工程の後に冷却工程を行うことが好ましい。
　本発明に係る一実施態様である細胞凝集塊を維持する方法は、複数の細胞凝集塊を含む液体を、維持温度に維持する工程を含む。維持工程は、冷却工程で達成した維持温度と同じ温度の環境下に細胞凝集塊の懸濁液を含む容器を保つことにより行うことができる。これにより、（１）細胞間接着分子の遺伝子発現量低下による、直接的な細胞間接着の抑制、及び／又は（２）リボソーム関連タンパク質の発現量低下による翻訳機能阻害の結果、細胞間接着分子の発現が抑制された、間接的な細胞間接着の抑制が起きるため、凝集塊同士の接着を抑制すると推察される。
　維持工程の期間は、必要に応じて適宜設定することができる。一般に、維持温度が低いほど、細胞凝集塊の数、細胞生存率及び細胞特性の長期間の維持が可能である傾向があり、例えば、ネフロン前駆細胞の細胞凝集塊については、１６℃では２４時間以上、４℃では４８時間以上の維持が可能である。なお、上限時間は特に限定されず、例えば１６８時間である。
　維持工程終了時において、細胞凝集塊の数は、維持工程の開始時の数の４０％以上であることができ、好ましくは６０％以上、更に好ましくは７０％以上、最も好ましくは８５％以上である。維持工程終了時において、細胞凝集塊の細胞生存率は、６０％以上であることができ、好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上である。細胞生存率は、例えば、細胞凝集塊をシングルセル化し、全細胞のうちトリパンブルー溶液によって染色されなかった細胞の割合を求めることにより算出できる。
　なお、冷却工程及び維持工程は、必ずしも静置により行う必要はない。したがって、シェーカー上又は輸送中など、細胞凝集塊の破壊が起こらない程度の振動がある状況下で行うことができる。
　本発明に係る一実施態様である細胞凝集塊は、適切な容器中に収容して、細胞製剤として提供することができる。細胞凝集塊を収容する容器としては、シリンジ、プラスチック又はガラスバイアル、プラスチックボトル、プラスチックバッグ、遠心チューブ等が挙げられる。細胞凝集塊とともに容器に充填する液体（保存液）は、上述した細胞凝集塊を懸濁させる液体と同様の液体であることができ、生理食塩水、ブドウ糖溶液、新鮮培地、冷蔵保存培地、冷凍保存培地等が例示される。保存液には、必要に応じて適宜添加剤を含有させることができる。このような添加剤としては、血清、ビタミン、アミノ酸、グルコース(糖)、電解質、抗生物質、粘度調整剤（メチルセルロース等）、リゾリン脂質、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ：Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤等の低分子化合物、成長因子(化合物、タンパク質)等が挙げられる。保存液は、好ましくは細胞周期停止剤を実質的に含まない。
　本発明は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、当業者の知識に基づいて各種の設計変更などの変形を加えることも可能であり、そのような変形が加えられた実施の形態も本発明の範囲に含まれる。なお、以上の構成要素の任意の組み合わせや、本発明の構成要素や表現を方法、装置、システムなどの間で相互に置換したものもまた、本発明の態様として有効である。
１．　マウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊に対する維持温度の影響
＜１－１．　凝集塊の形態及び細胞生存率＞
　マウス胎仔由来ネフロン前駆細胞は、Li Z. et al., Cell Stem Cell. 2016 Oct 06; 19(4): 516-529に従って培養した。１００，０００細胞／ｍＬのマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞を、９６ウェルプレート（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）プレート９６Ｕ、住友ベークライト社）に、５０μＬ（５，０００細胞）／ウェルで播種し、マウス胎仔由来ネフロン前駆細胞用培地（Ｌｉら、前出）にてインキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培養２日目に培地１００μＬを重層した。９６時間経過後、マウス胎仔由来ネフロン前駆細胞が直径５００μｍ～１，０００μｍの凝集塊を形成していることを顕微鏡観察により確認した。細胞凝集塊の直径は、オールインワン蛍光顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７１０、キーエンス社）及び解析アプリケーションソフトにより計測した。
　このネフロン前駆細胞凝集塊を、先端が切断された２００μＬ用チップにて吸引し、９６ウェルプレートのウェルに３個ずつ入れた。この９６ウェルプレートの各ウェルにマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞用培地を１００μＬ追加し、温度を４℃、８℃、１６℃、２２℃のインキュベーターに大気環境にて静置、又は３７℃のインキュベーターに５％ＣＯ２の条件下にて静置した。
　静置開始から所定時間経過後に、各ウェルの培地をピペッティングして、ウェル底に静置している３つの細胞凝集塊同士の接着の有無を確認した。更に、オールインワン蛍光顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７１０、キーエンス社）にてピペッティング前後の細胞凝集塊同士の接着状態を確認した。また、各条件で静置した細胞凝集塊を１．５ｍＬチューブに移し、ＡＣＣＵＭＡＸ（商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）にて１０分間処理して、シングルセル化した。シングルセルが分散した細胞懸濁液と０．５％トリパンブルー溶液（ナカライテスク社）を２０μＬずつ混合し、セルカウンター（ＴＣ２０（商標）、バイオ・ラッドラボラトリーズ社）にて細胞生存率を計測した。
　図１に、４℃、２２℃、又は３７℃にて２４時間又は４８時間静置したマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊の形態を示す。また、表１及び表２に、４℃、８℃、１６℃、２２℃、又は３７℃で表に示した時間静置した後の、細胞生存率及び凝集塊同士の接着の有無をそれぞれ示す。表２において、凝集塊同士の接着の有無は、「Ａ」＝接着なし、「Ｂ」＝弱い接着あり（ピペッティングにて剥離）、「Ｃ」＝接着あり（ピペッティング後も接着）、で表す（表５においても同様である）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　マウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊を通常培養温度（３７℃）より低温に維持すると、高い生存率を保ったまま、凝集塊同士の接着が抑制されることが示された。特に、１６℃以下にて静置すると、凝集塊同士が長時間接着せず、高い生存率が維持されることが確認された。静置温度が３７℃に近くなるほど凝集塊同士が接着する傾向が徐々に強くなるものの、２２℃でも少なくとも４時間までは接着抑制効果が見られ、低温に維持することにより凝集塊同士の接着を一定時間抑制できることが確認された。
＜１－２．　生理機能＞
　低温で静置したマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊が、ネフロン前駆細胞の本来の状態を維持しているか調べるために、Ｌｉら（前出）の記載に従ってネフロン分化能を確認した。
　９６ウェルプレートにマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞を５，０００個播種し、上記１－１．と同様に９６時間培養して凝集塊を形成させた。凝集塊を、４℃、８℃、１６℃、２２℃、又は３７℃にて２４時間、又は４８時間静置し、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標、コーニング社）上にのせて、ネフロン誘導培地（Ｌｉら、前出）にて１４４時間、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて半気相培養した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜下側の培地は２日毎に１００μＬ交換した。コントロールとして３７℃にて通常培養したマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞塊に関しても同様にネフロン誘導を実施した。
　図２に、ネフロン誘導前（Ａ）及び後（Ｂ）の４℃、４８時間静置したマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊と、通常方法で得られたマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊のネフロン誘導後（Ｃ）の形態を示す。また、表３に、４℃、８℃、１６℃、２２℃、又は３７℃にて、２４時間（又は４８時間）静置したマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊のネフロン誘導結果を示す。表３において、誘導結果は、「ＮＧ」＝ネフロン未形成、「ＯＫ」＝ネフロン形成、で表す（表６においても同様である）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　２２℃以下にて静置したマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊は、コントロールと同様、ネフロン組織に分化することが確認された。よって、通常培養（３７℃、５％ＣＯ２環境）より低温の環境にマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞を静置しても、ネフロン前駆細胞の性質を維持できることが確認された。
　次に、４℃にて静置したマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊が、生体内環境（３７℃）にて、元の状態に戻るかどうかを調べた。
　上記１－１．と同様に作製した後、４℃にて４８時間静置したマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊を、１．５ｍＬチューブに移し、ＡＣＣＵＭＡＸ（商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）にて１０分間処理して、シングルセル化した。１００，０００細胞／ｍＬに調整した懸濁液を９６ウェルプレートに５０μＬ（５,０００細胞）播種し、３７℃、５％ＣＯ２環境下にてマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞用培地で培養した。また、比較のため、４℃、大気環境下でも培養した。培養４８時間目に培地１００μＬを重層し、４日目に１００μＬ培地交換した。１４４時間経過後、得られた凝集塊を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標、コーニング社）上にのせて、ネフロン誘導培地にて１４４時間、３７℃、５％ＣＯ２環境下にて半気相培養した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜下側の培地は４８時間毎に１００μＬ交換した。
　図３に、４℃にて４８時間維持したマウス胎仔由来ネフロン凝集塊を継代後、４℃（Ａ）又は３７℃（Ｂ）にて１４４時間培養した、再継代したマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞の形態と、（Ｂ）のネフロン誘導後（Ｃ）の形態を示す。
　４℃にて４８時間維持したマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞をシングルセル化後、継代して３７℃で培養すると、細胞が増殖して凝集塊が成長し、ネフロン分化することが確認された。よって、４℃に維持することにより活性が低下していた細胞を３７℃に戻すと、増殖能が回復することが確認された。一方、４℃で培養すると、細胞が増殖せず、凝集塊が成長しないことが確認された。
２．　ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞に対する維持温度の影響
＜２－１．　凝集塊の形態及び細胞生存率＞
　ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞は、ネフロン前駆細胞の製造方法（国際公開公報ＷＯ２０１８／２１６７４３）に従ってヒトｉＰＳ細胞より作製し、培養した。２００，０００細胞／ｍＬに調整したヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞を９６ウェルプレート（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）プレート９６Ｕ、住友ベークライト社）に１００μＬ（２０，０００細胞）／ウェルで播種し、ＦＧＦ９、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｙ-２７６３２が添加されたヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞拡大培養用培地にて３７℃、５％ＣＯ２で培養した。培養４８時間目、９６時間目、１４４時間目に培地１００μＬを交換した。１６８時間経過後、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞が直径５００μｍ～１，０００μｍの細胞凝集塊を形成していることを確認した。
　このヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊を、先端が切断された２００μＬ用チップにて回収し、１．５ｍＬチューブに５個ずつ入れた。これらのチューブを、４℃、８℃、１６℃、２２℃のインキュベーターに大気環境にて静置、又は３７℃のインキュベーターに５％ＣＯ２環境下にて静置した。
　静置開始から所定時間経過後、１．５ｍＬチューブ内の培養液を攪拌し、静置したヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊同士の接着状態を確認した。更に、ＡＣＣＵＭＡＸ（商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）にて１０分間処理して、シングルセル化した。シングルセルが分散した細胞懸濁液と０．５％トリパンブルー溶液（ナカライテスク社）を２０μＬずつ混合し、セルカウンター（ＴＣ２０（商標）、バイオ・ラッドラボラトリーズ社）にて細胞生存率を計測した。
　図４に、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊を１．５ｍＬチューブに移し、４℃にて２４時間静置後、培養液を攪拌した直後の状態を示す。５個の凝集塊が接着せずに維持されていることが確認された。また、表４及び表５に、４℃、８℃、１６℃、２２℃、又は３７℃にて表４及び表５に示した時間静置した後の、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊の生存率及び凝集塊接着抑制の有無をそれぞれ示す。
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Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞もマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞と同様に、低温状態では、凝集塊同士の接着を、高い生存率を保ったまま抑制可能であることが確認された。
＜２－２．　生理機能＞
　低温で静置したヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊が、ネフロン前駆細胞の本来の状態を維持しているか調べるために、上記１－２．と同様にしてネフロン分化能を確認した。
　９６ウェルプレートにヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞を２０，０００個播種し、上記２－１．と同様に１２０時間培養して凝集塊を形成させた。凝集塊を、４℃、８℃、又は１６℃にて２４時間、又は４８時間静置し、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標、コーニング社）上にのせて、ネフロン誘導培地にて１４４時間、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて半気相培養した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜下側の培地は４８時間毎に１００μＬ交換した。コントロールとして３７℃にて通常培養したヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞塊に関しても同様にネフロン誘導を実施した。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　１６℃以下にて静置したヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊は、コントロールと同様、ネフロン組織に分化することが確認された。よって、通常培養（３７℃、５％ＣＯ２環境）より低温の環境にヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞を静置しても、ネフロン前駆細胞の性質を維持できることが確認された。
　次に、４℃にて静置したヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊が、生体内環境（３７℃）にて、元の状態に戻るかどうかを調べた。
　上記２－１．と同様に凝集塊を作製し、培養４８時間経過後に、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞が直径５００μｍ～８００μｍの細胞凝集塊を形成していることを確認した。
　このヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊を、先端が切断された２００μＬ用チップにて吸引し、９６ウェルプレートのウェルに３個ずつ入れた。この９６ウェルプレートの各ウェルに、冷蔵保存培地であるＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標、ＨｅｍａＣａｒｅ社）、又はヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞拡大培養用培地を１００μＬ追加した。冷蔵保存培地を追加したものは４℃のインキュベーターに大気環境にて、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞拡大培養用培地を追加したものは３７℃のインキュベーターに５％ＣＯ２の条件下にて、それぞれ静置した。２４時間経過後、４℃のインキュベーターに静置したウェルの培地を、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞拡大培養用培地１００μＬに交換し、３７℃のインキュベーターに５％ＣＯ２の条件下にて２４時間静置した。
　図５に、各経過時間後におけるヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊の形態を示す。上記２－１．と同様に、２４時間経過後において、３７℃に静置した場合は凝集塊同士が接着しているのに対し、４℃に静置した場合は凝集塊が接着せずに維持されていた。更に、４℃で静置した後、３７℃で更に２４時間静置すると、凝集塊同士が接着していた。よって、４℃に維持することにより凝集塊同士の接着性が低下していた細胞を３７℃に戻すと、凝集塊同士の接着性が回復することが確認された。
　更に、上記のヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊のうち、静置前の凝集塊（コントロール）、４℃で２４時間静置後の凝集塊、及び４℃で２４時間静置後、更に３７℃で２４時間静置後の凝集塊の一部を、それぞれサンプリングし、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、ｍＲＮＡ抽出及び精製を行った。更に、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標）　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、ｃＤＮＡ合成を行った。これらのｃＤＮＡを鋳型として、リアルタイムＰＣＲ法（Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｉ、タカラバイオ（株））にて、ＳＲＰ５４、ＲＰＬ４及びＳＩＸ２の遺伝子発現量を調べた。
　図６に、各凝集塊におけるヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊の、ＳＲＰ５４、ＲＰＬ４及びＳＩＸ２の遺伝子発現量の測定結果（コントロール群の平均を１とする相対値）を示す。
　タンパク質輸送関連マーカー遺伝子であるＳＲＰ５４及びタンパク質合成関連マーカー遺伝子であるＲＰＬ４は、４℃に維持することにより発現が低下し、３７℃に戻すことで発現量が回復する傾向があった。一方、ネフロン前駆細胞関連マーカー遺伝子であるＳＩＸ２は、３試験区間で発現量は同等であった。よって、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊は、低温保存によりネフロン前駆細胞の性質が維持され、２４時間の保存後も性質に変化が生じないことが確認された。
＜２－３．　凝集塊同士の接着抑制機構＞
　上記２－１．と同様に凝集塊を作製し、培養４８時間経過後に、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞が直径５００μｍ～８００μｍの細胞凝集塊を形成していることを確認した。
　このヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊を、先端が切断された２００μＬ用チップにて吸引し、９６ウェルプレートのウェルに３個ずつ入れた。この９６ウェルプレートの各ウェルに、冷蔵保存培地であるＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標、ＨｅｍａＣａｒｅ社）、又はヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞拡大培養用培地を１００μＬ追加した。冷蔵保存培地を追加したものは４℃のインキュベーターに大気環境にて、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞拡大培養用培地を追加したものは３７℃のインキュベーターに５％ＣＯ２の条件下にて、それぞれ静置した。
　静置４８時間経過後に、３７℃に静置した場合は凝集塊同士が接着しているのに対し、４℃に静置した場合は凝集塊同士が接着せずに維持されていることを、ピペッティングにより確認した。
　また、上記の各ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊の一部を、それぞれサンプリングし、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、ｍＲＮＡ抽出及び精製を行った。精製した各ｍＲＮＡサンプルについて、次世代シークエンサー（ＮｏｖａＳｅｑ（登録商標）　６０００、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いてリード情報を取得した。取得したリード情報を用いて、ＲＮＡシークエンス解析（ＥＮＣＯＤＥ－ＤＣＣロングリードＲＮＡ－ｓｅｑパイプライン（２．３．４）；https://www.encodeproject.org/pipelines/ENCPL002LPE/）を行った。具体的には、まず、リファレンス配列の作成及びマッピングを行った。次に、Ｒ言語（Ｒ（３．６．３）；https://www.r-project.org/）を用いて、二群間比較（ＤＥＳｅｑ２（１．２６．０））を行い、サンプル間で発現量が変動した遺伝子を検出した。
　続いて、上記のＲＮＡシークエンス解析の結果を用いて遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント解析（ＧＳＥＡ（４．１．０）；https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）を行った。具体的には、サンプル間で発現量が変動した上記遺伝子について、細胞の構成要素、生物学的プロセス、分子機能の観点ごとに解析した。
　図７に、細胞の構成要素に係る遺伝子群のうち、３７℃に静置したサンプルと比較して、４℃に静置したサンプルにおいて遺伝子発現量が低下した、上位１０遺伝子群のＧＯターム（ＧＯ　Ｔｅｒｍ）、ＧＯターム番号（ＧＯ　ＩＤ）及びAdjusted P-value（q-value、Ｑ値ともいう）を示す。図７より、３７℃に静置したサンプルと比較して、４℃に静置したサンプルにおいて、リボソームに関する遺伝子群（ＧＯターム番号：００２２６２５、００１５９３４、０００５８４０、００２２６２７及び００１５９３５）及び細胞間接着に関する遺伝子群（ＧＯターム番号：０００５９２５及び００３００５５）の発現が低下していることが分かった。
　図８に、生物学的プロセスに係る遺伝子群のうち、３７℃に静置したサンプルと比較して、４℃に静置したサンプルにおいて遺伝子発現量が低下した、上位１０遺伝子群のＧＯターム（ＧＯ　Ｔｅｒｍ）、ＧＯターム番号（ＧＯ　ＩＤ）及びAdjusted P-valueを示す。図８に示すように、上位５遺伝子群はいずれも翻訳に関する遺伝子群であった。したがって、３７℃に静置したサンプルと比較して、４℃に静置したサンプルにおいて、翻訳に関する遺伝子群の発現が低下していることが分かった。
　図９に、分子機能に係る遺伝子群のうち、３７℃に静置したサンプルと比較して、４℃に静置したサンプルにおいて遺伝子発現量が低下した、上位１０遺伝子群のＧＯターム（ＧＯ　Ｔｅｒｍ）、ＧＯターム番号（ＧＯ　ＩＤ）及びAdjusted P-valueを示す。図９より、３７℃に静置したサンプルと比較して、４℃に静置したサンプルにおいて、ＲＮＡ結合（ＧＯターム番号：０００３７２３）に関する遺伝子群の発現量が最も低下し、次いで、カドヘリン結合（ＧＯターム番号：００４５２９６）に関する遺伝子群の発現量が低下していることが分かった。ＲＮＡ結合は、主に、ＲＮＡ転写後（例えば、翻訳）の過程で制御される。また、カドヘリンは細胞間接着分子の１つであり、細胞間接着に寄与する。以上の結果から、凝集塊を低温に静置した場合、（１）細胞間接着分子の遺伝子発現量低下による、直接的な細胞間接着の抑制、及び／又は（２）リボソーム関連タンパク質の発現量低下による翻訳機能阻害の結果、細胞間接着分子の発現が抑制された、間接的な細胞間接着の抑制が起きたと推察された。
３．　ヒトｉＰＳ細胞に対する維持温度の影響
　ヒトｉＰＳ細胞は、２０１Ｂ７株（Takahashi K., Yamanaka S. et al., Cell. 2007 Nov 30; 131(5): 861-872）を使用した。１０，０００細胞／ｍＬに調整したヒトｉＰＳ細胞を９６ウェルプレート（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）プレート９６Ｕ、住友ベークライト社）に１００μＬ（１，０００細胞）／ウェルで播種し、ヒトｉＰＳ細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）、味の素社）にて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培養開始時に、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２、富士フイルム和光純薬社）を１０μＭになるように培地に添加し、２４時間経過後に培地をヒトｉＰＳ細胞用培地１００μＬに交換した。４８時間経過後、ヒトｉＰＳ細胞が直径１００μｍ～４００μｍの凝集塊を形成していることを顕微鏡観察により確認した。
　このヒトｉＰＳ細胞凝集塊を、先端が切断された２００μＬ用チップにて吸引し、９６ウェルプレートのウェルに３個ずつ入れた。この９６ウェルプレートの各ウェルに、冷蔵保存培地であるＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標、ＨｅｍａＣａｒｅ社）、又はヒトｉＰＳ細胞用培地を１００μＬ追加した。冷蔵保存培地を追加したものは４℃のインキュベーターに大気環境にて、ヒトｉＰＳ細胞用培地を追加したものは３７℃のインキュベーターに５％ＣＯ２の条件下にて、それぞれ静置した。２４時間経過後、４℃のインキュベーターに静置したウェルの培地を、ヒトｉＰＳ細胞用培地１００μＬに交換し、３７℃のインキュベーターに５％ＣＯ２の条件下にて２４時間静置した。
　図１０に、各経過時間後におけるヒトｉＰＳ細胞凝集塊の形態を示す。２４時間経過後において、３７℃に静置した場合は凝集塊同士が接着しているのに対し、４℃に静置した場合は凝集塊が接着せずに維持されていた。更に、４℃で静置した後、３７℃で更に２４時間静置すると、凝集塊同士が接着していた。よって、ヒトｉＰＳ細胞もマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞と同様に、低温状態で凝集塊同士の接着を抑制可能であることが確認された。また、４℃に維持することにより凝集塊同士の接着性が低下していた細胞を３７℃に戻すと、凝集塊同士の接着性が回復することが確認された。
４．　ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞を用いた治療効果
　上記２－１．と同様にして、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞を、ヒトｉＰＳ細胞より作製し、培養することにより、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊を作製した。ただし、１，０００，０００細胞／ｍＬに調整したヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞を９６ウェルプレート（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）プレート９６Ｕ、住友ベークライト社）に１００μＬ（１００，０００細胞）／ウェルで播種し、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞拡大培養用培地にて３７℃、５％ＣＯ２で２日間培養した。凝集塊の直径は、５００μｍ～８００μｍであった。
　このヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊を、４℃に設定した冷蔵庫にて大気環境にて２４時間保存した。冷蔵庫内の静置場所の保管温度を温度計にて測定したところ、２℃～４℃を示した。凝集塊を低温維持することで凝集塊同士の接着を抑制できていることをピペッティングにより確認した。
　この凝集塊を、１群６匹のシスプラチン誘発性急性腎障害モデルマウス（Ｌｉら、前出）に、１匹あたり細胞総量３，０００，０００細胞（ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊２０個）で移植により投与した。図１１に、シスプラチン誘発性急性腎障害モデルマウスの左腎被膜下に投与した直後のヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊（黒矢印）の写真を示す。コントロールとして、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊の代わりに約５０μＬの生理食塩水を投与したこと以外は同一である生理食塩水投与群（６匹）を作製した。
　投与４日後、腎機能マーカーである血中尿素窒素（ＢＵＮ）値と血清クレアチニン濃度を測定し、結果をＳｔｕｄｅｎｔ　ｔテストにより統計学的に評価した。
　結果を図１２に示す。Ａは、血中ＢＵＮ値（「ＢＵＮ」）、Ｂは、血清クレアチニン濃度（「Ｃｒｅ」）の結果である。「ｐｒｅ」はヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊（「ＮＰＣ」）又は生理食塩水（「生食」）投与前、「ｐｏｓｔ」は投与後４日目の値である。
　ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊を投与した群は、生理食塩水投与群に比べて、血中ＢＵＮ値、血清クレアチニン濃度ともに有意に低下していた。したがって、４℃、２４時間保存したヒトｉＰＳ由来ネフロン前駆細胞凝集塊において、シスプラチン誘発性急性腎障害モデルマウスの腎機能増悪を抑制する効果が認められた。
５．　ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊の輸送試験
　上記４．と同様にして、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞を、ヒトｉＰＳ細胞より作製し、培養することにより、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊を作製した。凝集塊の直径は、５００μｍ～８００μｍであった。
　このヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊（細胞総量３，０００，０００細胞、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊２０個）と２５ｍＬの冷蔵保存培地であるＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標、ＨｅｍａＣａｒｅ社）を、２５ｍＬチューブに入れ懸濁した。更に、この２５ｍＬチューブを低温輸送システムであるｉＰ―ＴＥＣ（登録商標）プレミアＢＯＸ―Ｖ８．５（サンプラテック社）に格納した。格納容器内に潜熱蓄冷材－５(サンプラテック社)を入れ、格納容器内を５℃～６℃に維持した。格納４８時間経過後、２５ｍＬチューブ内の培養液をピペッティングにより攪拌し、静置したヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊同士の接着状態を確認した。
　比較のため、同様に調製した２５ｍＬチューブを、格納容器に入れる代わりに４℃に設定した冷蔵庫の庫内（実測値２℃～４℃）に静置して、大気環境にて同様に４８時間保存した。
　これらのヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊をＡＣＣＵＭＡＸ（商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）にて１０分間処理して、シングルセル化した。シングルセルが分散した細胞懸濁液と０．５％トリパンブルー溶液（ナカライテスク社）を２０μＬずつ混合し、セルカウンター（ＴＣ２０（商標）、バイオ・ラッドラボラトリーズ社）にて細胞生存率を計測した。また、前記凝集塊の一部をサンプリングし、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、ｍＲＮＡ抽出及び精製を行った。更に、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標）　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、ｃＤＮＡ合成を行った。これらのｃＤＮＡを鋳型として、リアルタイムＰＣＲ法（Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｉ、タカラバイオ（株））にて、ＯＳＲ１、ＳＩＸ２の遺伝子発現量を調べた。
　結果、輸送システムの格納容器の内部温度は、４８時間の間６℃前後に保たれており、細胞塊同士が接着せずに維持されていた。また、格納容器内で保存したヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊の細胞生存率は４８時間後に９０％以上を維持していた。
　図１３に、保存前、格納容器（５℃～６℃）又は冷蔵庫（２℃～４℃）にて４８時間保存後（各群３サンプル）のヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊のネフロン前駆細胞関連マーカー遺伝子発現量の測定結果（保存前群の平均を１とする相対値）及びＯｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡによる有意差検定結果を示す。Ａは、ＯＳＲ１、Ｂは、ＳＩＸ２である。
　ネフロン前駆細胞関連マーカー遺伝子であるＯＳＲ１、ＳＩＸ２は、いずれも３群間で発現量に有意差が無かった。したがって、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊は、輸送システムや冷蔵庫での低温保存により性質が維持され、４８時間の保存後もヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞凝集塊の性能に変化が生じないことが確認された。
６．　大量培養系での細胞凝集塊の作製及び維持
　１００ｍＬシングルユースバイオリアクター（エイブル社）にマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞を４，０００，０００細胞播種し、１００ｍＬのマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞用培地にて４０ｒｐｍで攪拌培養した。培養４８時間目、９６時間目、１２０時間目、１４４時間目、１６８時間目に５０ｍＬ培地交換した。１９２時間培養後、攪拌を停止して細胞凝集塊を沈降させた後、上清を吸引除去した。新たに新鮮培地を１０ｍＬ添加して再懸濁後、１５ｍＬチューブに細胞凝集塊を回収し、自然沈降させた後、容積約２ｍＬ分の凝集塊を得た。これを、４本の１５ｍＬチューブに分注し、新鮮培地を１０ｍＬ追加して、４℃又は３７℃にて静置した。
　２４時間後、培地を再懸濁して、細胞凝集塊同士の接着の有無を確認した。更に、ＡＣＣＵＭＡＸ（商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）にて１０分間処理して、シングルセル化した。シングルセルが分散した細胞懸濁液と０．５％トリパンブルー溶液（ナカライテスク社）を２０μＬずつ混合し、セルカウンター（ＴＣ２０（商標）、バイオ・ラッドラボラトリーズ社）にて細胞生存率を計測した。
　図１４に、１００ｍＬシングルユースバイオリアクターで培養直後（Ａ）と１５ｍＬチューブに移して自然沈降した状態（Ｂ）のマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊を示す。また、バイオリアクターにて培養直後（０ｈ、Ｃ）と、４℃にて２４時間静置した後（２４ｈ、Ｄ）のマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊の形態を示す。これらのネフロン前駆細胞凝集塊は、顕微鏡観察すると、直径約２００μｍ～約１，０００μｍであった。
　マウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊は、４℃にて２４時間維持した後も、凝集塊同士が接着せずに目的の凝集塊直径を維持していることが確認された。また、細胞生存率は８７％であり、高い細胞生存率を維持していることが確認された。
　一方、３７℃にて２４時間維持した場合、凝集塊同士が接着し、巨大な凝集塊を形成していることが確認された。細胞生存率も１０％と低く、目的の凝集塊直径及び機能を維持できないことが確認された。
７．　添加剤による接着抑制効果
　１００ｍＬシングルユースバイオリアクター（エイブル社）にマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞を４，０００，０００細胞播種し、１００ｍＬのマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞用培地（便宜上、ここでは通常培地又は単に培地ということがある）にて４０ｒｐｍで攪拌培養した。培養４８時間目、９６時間目、１２０時間目、１４４時間目、１６８時間目に５０ｍＬ培地交換した。１９２時間培養後、攪拌を停止して細胞凝集塊を沈降させた後、上清を吸引除去した。新たに新鮮培地、又は０．６％メチルセルロース（メチルセルロース４００（商標）、富士フイルム和光純薬社）を添加した新鮮培地を１０ｍＬ添加して再懸濁後、１５ｍＬチューブに細胞凝集塊を回収した。これを、４℃にて静置した。
　２４時間後、培地を再懸濁して、細胞凝集塊同士の接着の有無を確認した。更に、ＡＣＣＵＭＡＸ（商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）にて１０分間処理して、シングルセル化した。シングルセルが分散した細胞懸濁液と０．５％トリパンブルー溶液（ナカライテスク社）を２０μＬずつ混合し、セルカウンター（ＴＣ２０（商標）、バイオ・ラッドラボラトリーズ社）にて細胞生存率を計測した。
　図１５に、通常培地（Ａ、左）又は０．６％メチルセルロースを添加した培地（Ａ、右）にそれぞれ懸濁し、１５ｍＬチューブに移して１分経過後のマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊の状態を示す。また、バイオリアクターにて通常培地中で培養直後（Ｂ）と、４℃にて０．６％メチルセルロース添加培地中で２４時間静置した後（Ｃ）のマウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊の形態を示す。
　図１５において、通常培地では沈降した細胞凝集塊が確認されるのに対し、０．６％メチルセルロースを添加した培地中では沈降物が確認されない。よって、マウス胎仔由来ネフロン前駆細胞凝集塊を０．６％メチルセルロースが添加された培地中に懸濁することで、濃縮された大量の凝集塊の沈降速度を大幅に低下させることが可能になることが確認された。凝集塊が沈降して接触する機会を減らすことができるため、凝集塊同士の接着をより抑制することが可能になると考えられる。
　このネフロン前駆細胞凝集塊を０．６％メチルセルロースが添加された培地中にて４℃で２４時間維持すると、凝集塊同士が接着せずに目的の凝集塊直径を維持していることが確認された。また、細胞生存率も、上記５．で示した培地中で維持した場合より向上し、９２％と高い生存率を維持していることが確認された。したがって、０．６％メチルセルロースの添加は、凝集塊同士の接着の抑制及び細胞生存率の維持に有効であり、細胞に対して悪影響を与えないと考えられる。
　（発明の実施態様）
　本発明の第１の実施態様は、細胞凝集塊を維持する方法において、複数の前記細胞凝集塊を含む液体を、前記細胞の培養温度より低く、かつ前記液体が凍結しない温度に維持する維持工程を含む方法である。これにより、細胞凝集塊の治療効果を維持したまま、細胞に悪影響を与え得る添加剤を用いずに凝集塊同士の接着及び巨大化を防ぐという効果を奏する。
　本発明の第２の実施態様は、第１の実施態様において、更に、前記温度が、２℃以上２２℃以下である方法である。これにより、ネフロン前駆細胞などの細胞凝集塊同士の接着及び巨大化をより長時間防ぐことが可能になるという効果を奏する。
　本発明の第３の実施態様は、第１又は第２の実施態様において、更に、前記維持工程の期間が、２時間以上である方法である。これにより、ネフロン前駆細胞などの細胞凝集塊同士の接着及び巨大化をより長時間防ぐことが可能になるという効果を奏する。
　本発明の第４の実施態様は、第１～第３の実施態様において、前記液体が、粘度調整剤を更に含有する方法である。これにより、細胞凝集塊同士の接触機会及び沈降速度を低減させ、細胞凝集塊同士の接着及び巨大化を更に防ぐことが可能になるという効果を奏する。
　本発明の第５の実施態様は、第１～第４の実施態様において、更に、前記細胞凝集塊の直径が、５０μｍ以上１，０００μｍ以下である方法である。これにより、移植デバイスの針を通過する際に凝集塊が破壊されるリスクが低減するという効果を奏する。
　本発明の第６の実施態様は、第１～第５の実施態様において、前記細胞凝集塊が、未分化細胞の細胞凝集塊である方法である。これにより、種々の疾患に対する再生医療による治療に使用可能な細胞凝集塊が得られるという効果を奏する。
　本発明の第７の実施態様は、細胞凝集塊の製造方法であって、細胞を培地中で培養することにより複数の細胞凝集塊を形成させる培養工程、複数の前記細胞凝集塊を含む液体を、前記細胞の培養温度より低く、かつ前記液体が凍結しない温度に冷却する冷却工程を含む、細胞凝集塊の製造方法である。これにより、細胞凝集塊の治療効果を維持したまま、細胞に悪影響を与え得る添加剤を用いずに凝集塊同士の接着及び巨大化を防いだ細胞凝集塊が得られるという効果を奏する。
　本発明の第８の実施態様は、第７の実施態様において、前記細胞凝集塊を前記液体中に濃縮する濃縮工程を更に含む方法である。これにより、細胞凝集塊を含む液体の容積を低減し、細胞製剤の製造、輸送、及び使用に好適な細胞凝集塊が得られるという効果を奏する。
　本発明の第９の実施態様は、第７又は第８の実施態様において、前記細胞凝集塊を直径により分別する分別工程を更に含む方法である。これにより、移植に適した細胞凝集塊を選択できるという効果を奏する。
　本発明の第１０の実施態様は、第７～第９の実施態様において、更に、前記培地及び前記液体が、細胞周期停止剤を実質的に含有しない方法である。これにより、細胞凝集塊の細胞及び移植後の生体に対する細胞周期停止剤の悪影響のリスクを低減し、安全性を向上できるという効果を奏する。
　本発明の第１１の実施態様は、第７～第１０の実施態様により得られた細胞凝集塊である。これにより、細胞の特性及び生存率が維持され、治療効果が高く再生医療での使用に適した細胞凝集塊が得られるという効果を奏する。
　本発明の第１２の実施態様は、第１１の実施態様において、前記細胞凝集塊が、前記温度で２４時間維持した後に７０％以上の細胞生存率を有する細胞凝集塊である。これにより、使用時まで高い細胞生存率を保つ細胞凝集塊及び細胞製剤の製造及び輸送が可能になるという効果を奏する。
　本発明の第１３の実施態様は、第１１又は第１２の実施態様において、更に、前記細胞が未分化細胞である。これにより、種々の疾患に対して再生医療による治療が可能になるという効果を奏する。
　本発明の第１４の実施態様は、第１１～第１３の実施態様において、更に、前記細胞がネフロン前駆細胞であり、かつ、前記細胞凝集塊を構成する少なくとも一部の前記ネフロン前駆細胞が分化能を有する細胞凝集塊である。これにより、腎疾患に対する再生医療による治療が可能になるという効果を奏する。
　本発明の第１５の実施態様は、第１１～第１４の実施態様の細胞凝集塊を含む細胞製剤である。これにより、使用時まで治療効果を保つ良質な細胞凝集塊を含む細胞製剤が提供されるという効果を奏する。
　本発明は、再生医療などにおいて使用し得る細胞凝集塊の製造及び維持に利用することができる。
 

 

Claims (15)

  1. 　細胞凝集塊を維持する方法において、
    　複数の前記細胞凝集塊を含む液体を、前記細胞の培養温度より低く、かつ前記液体が凍結しない温度に維持する維持工程
    を含む方法。
  2. 　前記温度が、２℃以上２２℃以下である、請求項１記載の方法。
  3. 　前記維持工程の期間が、２時間以上である、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　前記液体が、粘度調整剤を更に含有する、請求項１又は２記載の方法。
  5. 　前記細胞凝集塊の直径が、５０μｍ以上１，０００μｍ以下である、請求項１又は２記載の方法。
  6. 　前記細胞凝集塊が、未分化細胞の細胞凝集塊である、請求項１又は２記載の方法。
  7. 　細胞凝集塊の製造方法であって、
    　細胞を培地中で培養することにより複数の細胞凝集塊を形成させる培養工程、及び
    　複数の前記細胞凝集塊を含む液体を、前記細胞の培養温度より低く、かつ前記液体が凍結しない温度に冷却する冷却工程を含む、細胞凝集塊の製造方法。
  8. 　前記細胞凝集塊を前記液体中に濃縮する濃縮工程を更に含む、請求項７記載の方法。
  9. 　前記細胞凝集塊を直径により分別する分別工程を更に含む、請求項７又は８記載の方法。
  10. 　前記培地及び前記液体が、細胞周期停止剤を実質的に含有しない、請求項７又は８記載の方法。
  11. 　請求項７又は８記載の方法により得られた細胞凝集塊。
  12. 　前記細胞凝集塊が、前記温度で２４時間維持した後に７０％以上の細胞生存率を有する、請求項１１記載の細胞凝集塊。
  13. 　前記細胞が未分化細胞である、請求項１１記載の細胞凝集塊。
  14. 　前記細胞がネフロン前駆細胞であり、かつ、前記細胞凝集塊を構成する少なくとも一部の前記ネフロン前駆細胞が分化能を有する、請求項１１記載の細胞凝集塊。
  15. 　請求項１１記載の細胞凝集塊を含む細胞製剤。

     
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