TW201734206A

TW201734206A - 高機能肝細胞及其利用

Info

Publication number: TW201734206A
Application number: TW106106568A
Authority: TW
Inventors: Yoshikazu Yonemitsu; Yui Harada; Satoru Saito
Original assignee: Yoshikazu Yonemitsu; Gaia Biomedicine Inc
Priority date: 2016-02-29
Filing date: 2017-02-24
Publication date: 2017-10-01
Also published as: JP6756493B2; EP3431586A1; EP3431586A4; WO2017150363A1; EP3431586B1; US20190062699A1; JP2017153387A

Abstract

本發明之課題在於自iPS細胞獲得氨代謝機能較高且理論上能夠無限增殖之高機能肝細胞。本發明提供一種人工肝細胞之製造方法，其包含以下步驟：分化誘導步驟1，其係於包含活化素A之分化誘導培養基I中培養iPS細胞；分化誘導步驟2，其係於包含骨形成蛋白質4(BMP4)及纖維芽細胞生長因子2(FGF2)之分化誘導培養基II中培養由分化誘導步驟1所獲得之細胞；及分化誘導步驟3，其係於包含肝細胞生長因子(HGF)、抑瘤素M、地塞米松、以及N,N'-(亞甲基雙(4,1-伸苯基))二乙醯胺(FH1)及/或2-(N-(5-氯-2-甲基苯基)(甲基磺醯胺基)-N-(2,6-二氟苯基)-乙醯胺(FPH1)之分化誘導培養基III中培養由分化誘導步驟2所獲得之細胞而獲得人工肝細胞。所獲得之人工肝細胞具有100μg/dl/24h以上之氨代謝機能，且能夠構成網狀構造體。

Description

高機能肝細胞及其利用

本發明係關於一種由iPS(induced pluripotent stem，誘導多潛能性幹)細胞誘導而成之高機能肝細胞及其利用。

目前，包含急性期之管理在內之醫療技術不斷提昇，於日本仍不斷出現因肝功能衰竭引起之死者。其中，猛爆性肝炎之死亡率非常高為70~90%，係預後不良之疾病。於肝功能衰竭治療中，肝移植手術之治療效果最高，但由於供體不足或急性肝功能衰竭之急遽之進程而導致無法實施肝移植手術之病例較多。

另一方面，期待於直至肝移植手術前、或直至自體肝之再生前之期間，使用混合型人工肝臟(Hybrid-artificial livers support system，HALSS)來輔助肝臟之機能。作為混合型人工肝臟所使用之肝細胞，於生長良好之方面而言，較佳為原代培養豬肝細胞，但有無法完全杜絕內源性反轉錄病毒之再活化之擔憂。又，自腦死亡供體之肝臟提取之肝細胞之獲得量有限。因此，需要能夠在體外(in vitro)增殖之人類肝細胞。

已知有幾種由多潛能性肝細胞分化誘導肝細胞之方法。例如，專利文獻1揭示有一種胚性幹細胞向肝細胞分化誘導之方法，其特徵在於：於缺失型肝細胞生長因子/bFGF(basic fibroblast growth factor，鹼性成纖維細胞生長因子)/DMSO(dimethyl sulfoxide，二甲基亞碸)/地塞米松之存在下培養胚性幹細胞。該專利文獻又指出：已知藉由在支架(scaffold)上三維培養細胞，能夠創造更接近活體內環境之條件而使細胞機能提昇，因此，提出於形成擬胚體後，將ES(embryonic stem cell，胚性幹細胞)填充至反應器並利用dHGF(deleted form of hepatocyte growth factor，肝細胞生長因子衍生物)進行三維之分化誘導，藉此，藉由平面培養，作為肝細胞所特異性之高度之機能的氨代謝能力等會大幅增強。專利文獻2揭示有一種肝組織、器官之製造方法，其特徵在於包含：次株分離步驟，其係重新選殖(recloning)胚性幹細胞，分離出次株；篩選步驟，其係選擇該次株中之如下者，即，使同時於相同條件下形成複數個源自上述次株之擬胚體後，對該擬胚體進行附著培養，於附著培養開始48小時後，跳動之上述擬胚體之個數相對於全部上述擬胚體之個數為70個數%以上之次株；及次株培養步驟，其係對上述所篩選出之次株進行培養。專利文獻2又指出，所獲得之細胞於形態學上及組織學上均具有正常肝細胞、器官之特徵，具體而言，具有如下特徵：具有2核之形態、對白蛋白染色呈陽性、具有氨分解能力、具有蛋白質(白蛋白)產生能力、具有睾丸酮之氫氧化活性等。專利文獻3揭示有一種用以誘導向肝臟之分化之方法。該方法包含以下步驟：(i)提供人工多潛能性幹(iPS)細胞之細胞群之步驟；(ii)於內胚葉誘導培養基中培養上述細胞群而生成前層確定性胚體(anterior definitive)內胚葉(ADE，anterior definitive endoderm)細胞之細胞群之步驟(此處，上述內胚葉誘導培養基係具有以下性質之特定之化學培養基：具有纖維芽細胞生長因子活性，刺激經由SMAD2及SMAD3之信令路徑以及經由SMAD1、SMAD5及SMAD9之信令路徑，以及抑制磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K，phosphatidylinositol 3-kinase)及糖原-合成酶-激酶3β(GSK 3β，glycogen synthase kinase-3β))；以及(iii)於肝臟性誘導培養基中培養 ADE細胞之上述細胞群而生成肝臟性前驅細胞之細胞群之步驟(此處，上述肝臟性誘導培養基係刺激經由SMAD2及SMAD3之信令路徑之特定之化學培養基)。進而，專利文獻4揭示有一種源自多潛能性幹細胞之高機能肝細胞之製造方法，其特徵在於：其係使用多潛能性幹細胞來製造高機能肝細胞之方法，藉由包含步驟(A)、(B)之方法，而自多潛能性幹細胞獲得源自多潛能性幹細胞之原始內胚葉，藉由包含步驟(C)之方法，而自源自多潛能性幹細胞之原始內胚葉獲得肝前驅細胞，藉由包含步驟(D)之方法，而自肝前驅細胞獲得高機能肝細胞。揭示有(A)於無血清且無飼養層環境下進行培養之步驟；(B)於白蛋白及至少1種細胞激素之存在下進行培養之步驟；(C)於SHH(Sonic Hedgehog，音蝟因子)或SHH促效劑及至少1種細胞激素之存在下進行培養之步驟；(D)於至少1種細胞激素之存在下進行培養而成熟之步驟。

又，專利文獻4指出：於較佳之態樣中，多潛能性幹細胞使用ES細胞或iPS細胞，進而較佳為iPS細胞使用由仙台病毒載體製造之iPS細胞。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開WO2006/082890(日本專利第4892740號)

[專利文獻2]日本專利特開2007-14273號公報

[專利文獻3]國際公開WO2012/025725(日本專利特表2013-535980號公報)

專利文獻4：國際公開WO2012-105505

期待混合型人工肝臟成為直至肝移植前或直至自體感之再生前之過渡，但每1個人工肝臟模組需要約1×10¹⁰~10¹¹個肝細胞。以往所研究出之人工肝細胞均於氨代謝機能等重要機能方面不明確或難言充分。本發明者等人對自人類iPS細胞獲得理論上能夠無限增殖之高機能肝細胞進行了努力研究。其結果，完成了本發明。

本發明提供以下者。

[1]一種人工肝細胞，其具有100μg/dl/24h以上之氨代謝機能，且能夠構成網狀構造體。

[2]如1所記載之人工肝細胞，其可於無血清且無飼養層環境下進行培養。

[3]如1或2所記載之人工肝細胞，其係由人工多潛能性幹(iPS)細胞誘導而成者。

[4]如3所記載之人工肝細胞，其中iPS細胞係使用仙台病毒載體而製造者。

[5]一種人工肝細胞之製造方法，其包含以下步驟：分化誘導步驟1，其係於包含活化素(Activin)A之分化誘導培養基I中培養iPS細胞；分化誘導步驟2，其係於包含骨形成蛋白質4(BMP4，bone morphogenetic protein 4)及纖維芽細胞生長因子2(FGF2，fibroblast growth factor 2)之分化誘導培養基II中培養由分化誘導步驟1所獲得之細胞；及分化誘導步驟3，其係於包含肝細胞生長因子(HGF，hepatocyte growth factor)、抑瘤素(Oncostatin)M、地塞米松(dexamethasone)、以及 N,N'-(亞甲基雙(4,1-伸苯基))二乙醯胺(FH1)及/或2-(N-(5-氯-2-甲基苯基)(甲基磺醯胺基)-N-(2,6-二氟苯基)-乙醯胺(FPH1)之分化誘導培養基III中培養由分化誘導步驟2所獲得之細胞而獲得人工肝細胞。

[6]如5所記載之製造方法，其中iPS細胞係使用仙台病毒載體而製造者。

[7]如5或6所記載之製造方法，其中分化誘導培養基III包含FH1及FPH1。

[8]如5至7中任一項所記載之製造方法，其中分化誘導步驟1~3係於無血清且無飼養層環境下實施。

[9]如5至8中任一項所記載之製造方法，其中分化誘導步驟1及分化誘導步驟2合計進行2~14天，且分化誘導步驟3進行2~14天。

[10]一種混合型人工肝臟，其包含如1至4中任一項所記載之人工肝細胞、或藉由如5至9中任一項所記載之製造方法而獲得之人工肝細胞。

[11]如10所記載之混合型人工肝臟，其至少使用有10⁹個人工肝細胞。

根據本發明，能夠由iPS細胞分化誘導高機能肝細胞。又，能夠提供一種藉由該誘導方法而製造之人工肝組織、使用其之混合型人工肝臟。

圖1係源自臍帶血(Cord blood)CD34(cluster of differentiation 34，分化群34)陽性細胞之iPS細胞(CiPS，chemically induced pluripotent stem，化學誘導多潛能性幹細胞)。

圖2係源自臍帶血CD34陽性細胞之iPS細胞(CiPS)。

圖3係確認rSeV(recombinant Sendai virus，重組仙台病毒)載體自CiPS脫落。

圖4係由最佳化之iPS細胞誘導而成之高機能肝細胞。

圖5係氨代謝量之確認。可知：相較於使用飼養層細胞(HUVECs(human umbilical vein endothelial cells，人臍靜脈內皮細胞)，MSCs(mesenchyal stem cells，間葉系幹細胞))，使用化合物(FH1、FPH1)之代謝機能增強效果較高。

圖6係氨代謝量之確認。可知：所獲得之iPS-HEP細胞視培養條件而保持與原代肝細胞之代謝能力(160~200μg/dl/24h)相同程度之氨代謝機能。

圖7係肝細胞標記物之確認(RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，逆轉錄-聚合酶鏈反應)。

圖8係肝細胞標記物之確認(RT-PCR)。

圖9係肝細胞標記物之確認(RT-PCR)。

除特別記載之情形以外，數值範圍「X~Y」包含兩端之數值X及Y。除特別記載之情形以外，「A及/或B」係指A及B中之至少一者。

<人口肝細胞>

本發明提供一種具有較高之氨代謝機能且能夠構成網狀構造體之人工肝細胞。

[網狀構造體]

關於細胞之特徵，所謂「能夠構成網狀構造體」，係指於在適當之條件下培養成為對象之細胞之情形時，構成特定之網狀構造體。網狀構造體係藉由將細胞以適當之密度接種於視需要利用細胞外基質(ECM，extra cellular matrix)、例如matrigel(註冊商標)、透明質酸、肝素、纖維黏連蛋白、層黏連蛋白、玻璃黏連蛋白或其他ECM塗佈之培養器中並使用適當之培養基培養數天而構成。網狀構造體包含至少1個細胞之寬度~1000μm(更特定為數個細胞之寬度~500μm，進而特定為20~250μm)之繩狀之部分及圓形、橢圓形等空隙部分。空隙之直徑典型而言為100~2000μm，更特定為200~1000μm，進而特定為300~1000μm。又，網狀構造體可具有1~3個細胞之厚度10~60μm。

[氨代謝能力]

於本發明中，除特別記載之情形以外，言及氨代謝機能時，係指在適當之條件下培養成為對象之細胞之情形時之氨代謝機能。氨代謝機能之測定方法已為業者所熟知，較佳為不使用飼養層細胞(HUVECs、MSCs等)而使用下述化合物(FH1)並使用視需要利用EMC塗佈下之培養器進行附著培養。更詳細之條件可參照本發明之實施例之項所記載之方法。

藉由本發明而獲得之人工肝細胞具有較高之氨代謝機能。具體而言，本發明之人工肝細胞能夠具有100μg/dl/24h以上、較佳為120μg/dl/24h以上、更佳為與原代肝細胞之代謝能力(160~200μg/dl/24h)相同程度即160μg/dl/24h、進而較佳為180μg/dl/24h之氨代謝機能。

[培養上之特徵] 於無血清及/或無飼養層環境下培養：

作為用以培養本發明之人工肝細胞之培養基，能夠使用為了培養肝細胞而開發之各種既有之培養基。作為能夠使用之培養基之例，可列舉下述分化誘導培養基III或HCM^TM BulletKit^TM培養基(Lonza Walkersville,Inc)或HBM^TM基礎培養基(Basal Medium)(Lonza Walkersville,Inc)。

本發明之人工肝細胞能夠於無血清及/或無飼養層環境下、較佳為於無血清且無飼養層環境下進行培養。所謂於無血清且無飼養層環境下進行培養，係指使用不含動物血清及人類血清之培養基，於不使目標人工肝細胞以外之細胞、例如小鼠胚胎纖維芽細胞或飼養層細胞(人臍靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)、間葉系幹細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)共存之環境下進行培養。

EMC塗佈：

於培養本發明之人工肝細胞時，能夠利用各種既有之培養器。關於培養器素材，只要為業者，則能夠適當選擇，就增殖良好且維持較高之機能之觀點而言，較佳為使用塗佈有EMC之培養器。較佳之ECM之例為matrigel(註冊商標)、透明質酸、肝素、纖維黏連蛋白、層黏連蛋白、及玻璃黏連蛋白、蛋白多糖(硫酸軟骨素蛋白多糖、硫酸乙醯肝素蛋白多糖、硫酸角質素蛋白多糖、硫酸皮膚素蛋白多糖)、各種膠原蛋白、明膠、腱蛋白(tenascin)、巢蛋白(entactin)、彈力蛋白(elastin)及肌原纖維蛋白(fibrilin)等。

維持、繼代：

確認本發明之人工肝細胞能夠使用下述分化誘導培養基III進行10天左右之連續培養。認為能夠藉由以適當之密度接種，而使其繼代、增殖。所謂適當之密度，係指例如人工肝細胞相互恰好相接之密度。於密度低於此之情形時，增殖差，又，於密度高於此之情形時，可能自表現出三維結構之區域誘導顯著之細胞死亡。

<人工肝細胞之製造方法>

本發明之人工肝細胞能夠藉由包含以下步驟之方法而製造：分化誘導步驟1，其係於包含活化素A之分化誘導培養基I中培養iPS細胞；分化誘導步驟2，其係於包含骨形成蛋白質4(BMP4)及纖維芽細胞生長因子2(FGF2)之分化誘導培養基II中培養由分化誘導步驟1所獲得之細胞；及分化誘導步驟3，其係於包含肝細胞生長因子(HGF)、抑瘤素M、地塞米松及具有N-苯基-2-(N-苯基甲基磺醯胺基)乙醯胺骨架之化合物之分化誘導培養基III中培養由分化誘導步驟2所獲得之細胞而獲得人工肝細胞。

分化誘導步驟1：

於分化誘導步驟1中，於至少包含活化素A之分化誘導培養基I中培養iPS細胞。

iPS細胞：

於本發明中，使用源自人類或非人類動物之iPS細胞作為起始細胞。眾所周知，iPS細胞之獲取方法及製造方法已為業者所熟知。人類iPS細胞能夠自理化學研究所生物資源中心(RIKEN BioResource Center)購買或自京都大學或國立成育醫療研究中心(National Center for Child Health and Development)分讓。作為能夠獲取且能夠用於本發明之iPS細胞之例，例如有：藉由利用反轉錄病毒載體將4因子(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)導入至源自臍帶之纖維芽細胞(RCB0436 HUC-F2)而製造之人類人工多潛能性幹(iPS)細胞株HiPS-RIKEN-1A(理化學研究所，HPS0003)、藉由利用反轉錄病毒載體將4因子(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)導入至源自臍帶之纖維芽細胞(RCB0197 HUC-Fm)而製造之人類iPS細胞株HiPS-RIKEN-2A(理化學研究所，HPS0009)、藉由利用反轉錄病毒載體將3因子(Oct3/4、Sox2、Klf4)導入至源自臍帶之纖維芽細胞而獲得之人類iPS細胞株HiPS-RIKEN-12A(理化學研究所，HPS0029)、藉由使用仙台病毒載體導入4因子(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)而製造之人類iPS細胞株Nips-B2(理化學研究所，HPS0223)等。

仙台病毒載體之使用：

製造iPS細胞時，較佳為使用仙台病毒載體作為用以導入因子之載體。反轉錄病毒載體係進入至細胞核並作為DNA(deoxyribonucleic acid，脫氧核糖核酸)進行基因表現者，因此，於將所獲得之iPS細胞用於患者時，雖極稀少，但有載體積極進入至患者之染色體、或引起與染色體DNA之遺傳重組之擔憂。另一方面，仙台病毒載體係不進入至細胞核中而於細胞質內對自身之基因組進行複製而製作出大量之蛋白質者。該基因組由RNA(ribonucleic acid，核糖核酸)形成，與患者之染色體之DNA在物質上不同，因此，認為原理上不存在仙台病毒載體改變核內之患者之染色體之風險。

使用仙台病毒(SeV)載體製造iPS細胞之方法已為業者所熟知，例如藉由在添加有搭載了重編程因子表現單元之仙台病毒載體的培養基中培養市售之人類纖維芽細胞等而製造。作為搭載了重編程因子表現單元之仙台病毒載體，例如可列舉CytoTune-iPS(DNAVEC股份有限公司製造)等。

分化誘導培養基I：

該步驟中所使用之分化誘導培養基I包含Wnt3A或活化素A等細胞激素。較佳為至少包含活化素A。關於細胞激素之量，例如，Wnt3A為10~50ng/ml左右，較佳為25ng/ml左右，活化素A為10~100ng/ml左右，較佳為100ng/ml左右。

分化誘導培養基I無血清，例如能夠於RPMI1640等基本組成中添加上述細胞激素及血清代替品而使用。作為血清代替品，可列舉B27(註冊商標)(Life Technologies公司製造)、KnockOut(註冊商標)血清代替品(Serum Replacement)(Life Technologies公司製造)等。分化誘導培養基I之具體之構成例係本案說明書之實施例之項所記載之組成者。B27之組成能夠參照G.J.Brewer et al.Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented NeurobasalTM,a New Serum-free Medium Combination.Journal of Neuroscience Research 35567476(1993)。

本步驟係藉由使用分化誘導培養基I並利用37℃、5% CO₂之培養箱培養iPS細胞數天而進行。分化誘導步驟1之培養時間具體而言為4~10天，較佳為6~8天，更佳為7天。分化誘導步驟1能夠進行直至形態上具有內胚葉細胞之特徵。

分化誘導步驟2：

於分化誘導步驟2中，於分化誘導培養基II中培養由分化誘導步驟1所獲得之細胞。

分化誘導培養基II：

該步驟中所使用之分化誘導培養基II包含各種細胞激素，例如，纖維芽細胞生長因子2(FGF2)、骨形成因子4(BMP4)、肝細胞生長因子(HGF)。關於細胞激素之量，例如，FGF2為5~50ng/ml，BMP4為5~50ng/ml，HGF為5~50ng/ml，較佳為：FGF2為10ng/ml左右，BMP4為20 ng/ml左右，HGF為20ng/ml左右。分化誘導培養基II至少包含骨形成蛋白質4(BMP4)及纖維芽細胞生長因子2(FGF2)。分化誘導培養基II亦能夠設為無血清，例如能夠於RPMI1640等基本組成中添加上述細胞激素及血清代替品而使用。分化誘導培養基II之具體之構成例係本案說明書之實施例之項所記載之組成者。

本步驟能夠藉由使用分化誘導培養基II並利用37℃、5% CO₂之培養箱培養步驟1所獲得之細胞而實施。分化誘導步驟2之培養時間具體而言為1~6天，較佳為2~5天，更佳為3~4天。

分化誘導步驟3

本步驟係於分化誘導培養基III中培養由分化誘導步驟2所獲得之細胞而獲得人工肝細胞之步驟。

分化誘導培養基III：

此處所使用之細胞激素及激素之例係腫瘤抑制素M(OSM)或地塞米松等。關於所使用之量，例如，OSM為10~50ng/ml，地塞米松為0.05~0.5μM，較佳為OSM為25ng/ml左右，地塞米松為0.1μM左右。分化誘導培養基III至少包含肝細胞生長因子(HGF)、抑瘤素M、地塞米松、以及N,N'-(亞甲基雙(4,1-伸苯基))二乙醯胺(FH1)及/或2-(N-(5-氯-2-甲基苯基)(甲基磺醯胺基)-N-(2,6-二氟苯基)-乙醯胺(FPH1)。分化誘導培養基III之具體之構成例係本案說明書之實施例之項所記載之組成者。

FH1及FPH1：

分化誘導培養基III包含下式所表示之N,N'-(亞甲基雙(4,1-伸苯基))二乙醯胺(FH1)及/或2-(N-(5-氯-2-甲基苯基)(甲基磺醯胺基)-N-(2,6-二氟苯基)-乙醯胺(FPH1)。

於較佳之態樣中，分化誘導培養基III包含FH1及FPH1。

本步驟能夠藉由於分化誘導培養基III中培養分化誘導步驟2所獲得之細胞數天~數週左右而實施。關於該培養時間，較佳為至少以3天1次、較佳為以每天之頻度進行培養基更換。

其他條件：

分化誘導步驟1~3之任一者均能夠於血清及/或無飼養層環境下、較佳為於無血清且無飼養層環境下實施。又，能夠視需要使用塗佈有ECM之培養器而實施。

肝細胞之確認：

已知於發生學上，上述肝實質細胞繼上述擬胚體中之上述心肌細胞之出現後出現。已知實驗上觀察到上述肝實質細胞於自擬胚體分化之上述心肌細胞附近表現。

作為確認細胞經由分化誘導步驟1~3向肝細胞分化之方法，能夠藉由甲狀腺素運載蛋白(TTR，transthyretin)、α-胎蛋白(AFP，α-fetoprotein)胎肝細胞、a1-抗胰蛋白酶(AAT，α1-antitrypsin)、酪胺酸轉胺酶(TAT，tyrosine aminotransferase)、色胺酸加氧酶(TO，tryptophan oxygenase)、酪胺酸轉胺酶、去唾液酸糖蛋白受體(ASGR，asialoglycoprotein receptor)、白蛋白等肝細胞(胎肝細胞)特異性標記物基因表現、或肝細胞特異性標記物蛋白質之表現、或利用抗白蛋白抗體之免疫染色等而進行確認。又，由於在小鼠之肝細胞中確認出多個具有2核之細胞，故而能夠藉由形態學上確認細胞核而進行確認。

較佳為如上述人工肝細胞之項所述，以能夠構成網狀構造體、具有較高之氨代謝能力為指標。

<其他> (混合型人工肝臟)

本發明提供一種混合型人工肝臟及其製造方法。混合型人工肝臟較佳為使用至少10⁹個本發明之人工肝細胞。

混合型人工肝臟有配戴於體外並與血管連接者、放置於體內並與血管連接者、或不與血管連接而放置於腹腔內者這3個形態。本發明之混合型人工肝臟使用源自iPS細胞之肝細胞，因此，就避免伴隨細胞移入等所產生之風險之方面而言，認為較佳為體外型。

於混合型人工肝臟之開發中，反應器之設計、開發亦為重要之要素。作為生物反應器，已知有使用豬肝細胞之混合型人工肝臟治療用之HepatAssist(Hui T,RozgaJ,Demetriou AA.J Hepatobiliary Pancreat Surg 2001；8：1-15.)、使用豬肝細胞之MELS(模塊式體外肝臟系統(Modular Extracorporeal Liver System))等各種類型。於本發明中亦能夠使用該等反應器。肝細胞有於懸浮狀態下分化機能未充分表現之傾向，進而容易與周圍之細胞碰撞而受到應力刺激。又，根據本發明者等人之研究，就本發明之人工肝細胞於附著培養之情形時氨分解能力更高之觀點而言，認為於本發明中，較佳為中空纖維及不織布等包含支架之反應器，以便能夠為肝細胞提供空間。

作為中空纖維膜，只要細胞不會附著於膜表面而妨礙物質交換，則能夠使用任意者，具體而言，較佳為先前用於醫療用之市售品，例如聚碸膜、乙烯-乙酸乙烯酯無規共聚物皂化物膜(例如，商品名：Eval，Kuraray Medical股份有限公司製造等)等。市售之中空纖維膜之孔徑根據其用途有透析膜(~5nm)、血漿成分分離膜(20~30nm)、血漿分離膜(30~200nm)等。就物質之透過性之方面而言，較佳為血漿分離膜(30~200nm)。為了避免排斥反應之危險性，最佳為30nm~100nm，以使於中空纖維內流動之血液中之免疫活性細胞或免疫球蛋白不與填充至中空纖維外之不織布等支架上之細胞直接接觸。

作為不織布，較佳為以細胞能夠附著之方式加工、修飾者。作為不織布之纖維，可列舉聚四氟乙烯(PTFE)等。其中，就其加工之容易度之方面而言，較佳為對聚四氟乙烯(PTFE)實施有聚胺基酸胺基甲酸酯(PAU)加工者。

(毒性試驗)

藉由本發明而獲得之人工肝細胞能夠用於用以對藥劑之毒性進行評價之試驗。於用於毒性之試驗之情形時，能夠將目標藥劑添加至人工肝細胞，利用例如37℃、5% CO₂之培養箱進行培養，將隨著時間經過，氨代謝能力之變化或細胞死亡之有無或程度作為指標來進行評價。作為細胞死亡測定技術，可列舉利用電泳之染色體DNA片段化之檢測、使用流式細胞儀之染色體DNA減少細胞之檢測、使用AnnexinV(膜聯蛋白V)之凋亡細胞之檢測、使用碘化丙錠(PI，Propidiumiodide)等死亡細胞染色劑之死亡細胞之檢測、ATP(adenosine triphosphate，腺苷三磷酸)檢測、MTT檢測、細胞內麩胱甘肽(glutathione)檢測、LDH(lactate dehydrogenase，乳酸脫氫酶)檢測等。

(藥物篩選方法)

藉由本發明而獲得之人工肝細胞能夠用於藥物篩選。作為藥物篩選之具體之方法，例如，可列舉將受驗物質添加至本發明之人工肝細胞或包含人工肝細胞之組織之培養液中，進行一定時間培育(incubate)後，對上述培養液中及構成上述肝組織、器官之細胞中之至少任一者所包含之代謝產物等進行分析之方法等。

作為受驗物質，並無特別限制，能夠視目的適當選擇，例如，可列舉與肝機能相關之醫藥、診斷藥、機能性食品、及該等之有效成分之任一者。藥物篩選能夠作為對肝機能提昇有用之成分之篩選或作為對肝臟造成損傷之有害成分之篩選而進行。作為對肝機能提昇有用之成分之篩選，例如，可列舉膽固醇分解促進物質及膽固醇生物合成抑制物質之探索等。

[實施例] <iPS細胞之製作> [iPS細胞之製作]

利用下述方法製作iPS細胞。

1.將POIETICS(註冊商標)臍帶血CD34+細胞(Cat.No.2C-101A)、POIETICS(註冊商標)激活(Mobilized)CD34+細胞(Cat.No.2G-101B)解凍。

2.使用CytoTune(註冊商標)-iPS2.0仙台病毒重編程試劑盒(Sendai Reprogramming Kit)，按照試劑盒所附帶之操作說明製作iPS細胞。

[iPS細胞之確認]

進行下述操作，確認已獲得iPS細胞。

免疫染色：

1.利用CytoSpin(註冊商標)將253G1(自理研獲取)及CiPS貼附於載玻片上(800rpm，5min)

2.利用4%多聚甲醛(Nacalai Tesque)將其固定(15min，室溫)

3.利用PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸鹽緩衝液)清洗3次

4.封閉(0.3% TritonX-100，1% BSA(bovine serum albumin，牛血清白蛋白)，10% AB血清或BlockingOne-Histo(Nacalai Tesque))10~20min，室溫

5.0.1% Tween PBS處理5min，室溫

6.R&D，人多潛能幹細胞3色免疫細胞化學試劑盒(Human Pluripotent stem cell 3 color Immunocytochemistry kit)各稀釋10倍，3h，室溫或o/n，4℃

7.利用PBS清洗

8.利用VECTA SHIELD(註冊商標)Hard Set with DAPI封入

9.利用多功能(All-in-One)螢光顯微鏡BZ-9000(KEYENCE)進行觀察

流式細胞儀：

1.以37℃、5min之Accutase處理將253G1(自理研獲取)及CiPS剝離並回收

2.利用SSEA-4 FITC、SSEA-3 PE、TRA-1-81 PE(各最終濃度為1μg/ml)抗體進行染色(4℃，30min)

3.利用FACSCalibur進行測定

4.利用CellQuest或FlowJo進行分析

形態觀察：

於下述培養法中，定期地利用多功能螢光顯微鏡BZ-9000(KEYENCE)進行觀察

SeV載體(CytoTune_iPS2.0)之脫落確認：

1.利用12孔板培養iPS細胞

2.利用PBS進行清洗

3.利用10%中性福馬林以1ml/孔進行固定(5min，室溫)

4.利用PBS進行清洗

5.添加抗Sev抗體(利用0.1% TritonX-100/PBS以1/500稀釋)500μl

6.於37℃下反應1h

7.利用PBS進行清洗

8.添加Dyelight550標記抗兔IgG抗體(利用0.1% TritonX-100/PBS以1/500稀釋)500μl

9.於37℃下反應1h

10.利用PBS進行清洗

11.利用多功能螢光顯微鏡BZ-9000(KEYENCE)進行觀察

結果：

將免疫染色及流式細胞儀之結果示於圖1，將定期觀察細胞之形態之結果示於圖2，將確認rSeV載體自CiPS細胞脫落之結果示於圖3。CiPS細胞係於製作至擴大培養之全部步驟中無飼養層。又，藉由自感染開始進行大概3個月之繼代，能夠獲取sReV已脫落之CiPS。

<用以誘導CiPS-Hep之iPS細胞之準備>

利用下述方法，準備用以誘導源自iPS之高機能肝細胞(CiPS-Hep)之iPS細胞。再者，於進行iPS細胞群落觀察等上述所製作之iPS細胞之確認中，實施本項所示之方法。

[層黏連蛋白塗佈盤之製作]

1.預先以4℃融解層黏連蛋白-5¹⁾(-80℃)。注意不要用手加溫。

2.將PBS³⁾以1ml/孔放入至6孔板²⁾中，使其遍及整個孔。

3.預先以4℃將放入有PBS之6孔板及200μl之ChIP(Chromatin Immunoprecipitation，染色質免疫沈澱緩衝液)冷卻。

4.將已融解之層黏連蛋白-5均勻澆灑於放入有PBS之孔中，快速搖晃10次左右，使其遍及整個孔。層黏連蛋白-5吸附性非常強，因此絕對不要移液。

5.於4℃下培育一晚或於37℃下培育2小時以上並進行塗佈。不要於37℃下放置。

6.於不立刻使用之情形時，可利用封口膜密封2層，並於4℃下進行保存。(1週)

[冷凍細胞之解凍及培養]

1.將P2之離心分離機設定為20℃。

2.將各種抑制劑(以下之步驟9中使用之4種)預先自-30℃之冷凍器中取出。

3.製備培養基(以下記作ReproFF2)。

4.將ReproFF2分別以9ml及4ml分注至15ml管⁷⁾，於37℃下加溫。

5.利用PBS(-)將層黏連蛋白塗佈盤沖洗2次，將1ml之PBS(-)預先放入至孔中。

6.自液態氮取出冷凍細胞，並將其浸入至37℃之水浴2min，使其融解。於冷凍細胞之體積較少之情形時，藉由適量添加已加溫之培養基並輕柔地移液，以使其快速解凍。

7.回收已解凍之細胞，將其移至放入有9ml之培養基之15ml管中，輕柔地倒置混合，進行摻混。

8.離心分離條件：160g，5min，有R.T.加速器，有制動。

9.於離心中製備4ml之培養基+各種抑制劑。

10.回收離心後之15ml管，小心地去除上清液。

11.添加1ml抑制劑培養基，藉由移液將細胞團塊輕柔地分開。

12.去除層黏連蛋白塗佈盤之PBS(-)，將細胞懸浮培養液移至孔中。利用剩餘之抑制劑培養基沖洗15ml管，並移至孔中。

13.搖晃塗佈盤，使細胞均勻地分散，於37℃、5% CO₂下進行培育。

14.第二天，輕柔地混合孔中之培養基後，去除上清液。

15.再次添加培養基+各種抑制劑4ml，於37℃、5% CO₂下進行培養。

[培養基之更換]

1.去除培養上清液。

2.以4ml/孔添加新鮮之培養基ReproFF2。

3.每隔2~3天(週一，週三，週五)進行上述操作。

[細胞之繼代]

1.製作層黏連蛋白塗佈盤。

2.去除培養上清液。

3.添加PBS(-)1ml，清洗細胞表面。

4.去除PBS(-)，以1ml/孔添加ESGRO Complete Accutase¹²⁾，於37℃、5% CO₂下培育5min。

5.藉由移液將孔中未完全剝落之細胞剝離，將細胞溶液回收至15ml管。

6.將1ml之ReproFF2添加至孔中，清洗孔內部，將溶液回收至15ml管，進而，再添加1ml之ReproFF2至15ml管，使總體積成為3ml。

7.將經調整之細胞懸浮液充分混合後，利用錐蟲藍染色液¹³⁾稀釋2倍，進行細胞計數。

8.根據繼代之孔數，以成為5×10⁵細胞/孔之方式將細胞懸浮液分注至新的15ml管。視需要冷凍保存剩餘之細胞。

9.進行離心分離。條件：160g，5min，有R.T.加速器，有制動。

10.於離心中以成為4ml/孔之方式調整培養基+抑制劑。

11.離心後去除上清液，使用培養基+抑制劑，藉由移液將細胞團塊分開，並接種至各層黏連蛋白塗佈孔。

12.於培養板上記載日期、iPS細胞之名稱、繼代數，於37℃、5%CO₂下進行培養。

按照週一→週五→週三→週一之間隔持續繼代。

[細胞之冷凍保存]

1.與細胞繼代時同樣地將細胞剝離，進行計數。

2.對細胞懸浮液進行離心分離。條件：160g，5min，有R.T.加速器，有制動。

3.於用於冷凍之血清管¹⁴⁾上標註日期、細胞名、繼代數。

4.離心後，將上清液確實地去除，以成為1×10⁶細胞/500μl之方式使細胞懸浮於STEM-CELLBANKER¹⁵⁾中。

5.以500μl/根預先將細胞懸浮液分注至已標註之血清管中。

6.分注後，將血清管放入至-80℃之超低溫冷凍器。

7.於1~3天後之內使冷凍之細胞自-80℃移動至液態氮細胞保存系統進行保管。

<CiPS-Hep之誘導>

利用下述方法，自CiPS細胞分化誘導高機能肝細胞(CiPS-Hep)。

[第1天：源自iPS之高機能肝細胞分化誘導第1步：將培養基變更為源自iPS之高機能肝細胞分化誘導培養基I(以下稱為培養基I)]

1.製備所需量(4ml/孔)之培養基I。

2.去除上清液，添加1ml無血清RPMI1640，清洗細胞表面。

3.以成為4ml/孔之方式添加培養基I。

4.每天進行去除上清液並添加新鮮之培養基I之作業直至第6天。

[第7天：源自iPS之高機能肝細胞分化誘導第2步：將培養基變更為源自iPS之高機能肝細胞分化誘導培養基II(以下稱為培養基II)]

1.製備所需量(4ml/孔)之培養基II。

2.輕柔地將培養上清液移液後，去除上清液，以成為4ml/孔之方式添加培養基II。

3.每天進行去除上清液並添加新鮮之培養基II之作業直至第9天。

[第10天：源自iPS之高機能肝細胞分化誘導第3步]

1.培養板之Matrigel塗佈

1.1.以4℃將300μl之BD matrigel低生長因子(growth factor reduced)²⁰⁾解凍。

1.2.預先以4℃將24孔板盤²¹⁾、KnockOut-DMEM²²⁾冷卻。

1.3.Matrigel融解後，等量添加KnockOut-DMEM，藉由移液充分混合。

1.4.以每1孔為200μl將Matrigel稀釋液放入至24孔板盤，使其遍及整個孔。

1.5.將24孔板盤於常溫下靜置3小時以上進行塗佈。

2.源自iPS細胞之高機能肝細胞之繼代

2.1.以成為1ml/孔之方式製備源自iPS之高機能肝細胞分化誘導培養基III(以下稱為培養基III)。

2.2.去除培養上清液，利用1ml之PBS(-)清洗細胞表面。

2.3.添加1ml之ESGRO Complete Accutase，於37℃下培育5min。

2.4.仔細地移液，將細胞剝離，將細胞溶液回收至15ml管。

2.5.利用1ml之HCM清洗孔內，將溶液回收至15ml管，進而，再添加1ml之HCM至15ml管，使總體積成為3ml。

2.6.將細胞懸浮液充分混合，利用錐蟲藍稀釋2倍，進行細胞計數。

2.7.根據進行繼代之孔數，以成為1.0×10⁶細胞/孔之方式將所需量分注至新的15ml管。

2.8.以160g、5min、R.T.進行離心分離。

2.9.於離心中添加1ml之PBS(-)至Matrigel塗佈孔，進行清洗，去除上清液。將該清洗作業反覆進行2次，添加1ml之PBS(-)至孔中。

2.10.離心後去除上清液，於進行附著培養(Adhesion cultivation)之情形時，亦去除Matrigel塗佈孔之上清液後，使用培養基III，藉由移液將細胞團塊分開，並接種至Matrigel塗佈孔。

於進行懸浮培養(Floating cultivateon)之情形時，使用培養基III，藉由移液將細胞團塊分開，並接種至MPC(mouse pituitary cells，小鼠垂體細胞)處理板(MD6，帶蓋，低細胞結合力(with Lid Low-Cell Binding)，Nalge Nunc International，Japan)。

於將HUVEC及MSC用作飼養層細胞之情形時，作為附著培養，適當進行共培養(參照下文揭示之非專利文獻1)。

2.11.於培養板上記載日期、細胞之名稱等，於37℃、5% CO₂之培養箱內進行培養。

2.12.每隔一天進行去除上清液並添加新鮮之培養基III之作業直至第17天。

[第17天：完成CiPS-Hep→氨代謝測試]

1.以成為1ml/孔×2之方式製備HBM(混合液-)+氨水(以下稱為氨培養基)。

[表7]

2.去除培養上清液，利用1ml之HBM清洗細胞表面1次，利用氨HBM清洗細胞表面1次。

3.去除上清液，以1ml/孔添加氨培養基。

4.將氨培養基及HBM各放入1ml至空孔中，作為陽性對照及陰性對照。

5.於37℃、5% CO₂下培養24h。

[第18天：氨代謝測試樣品之回收]

1.將上清液回收至微量離心管(Eppendorf tube)，以500g離心分離5min。

2.將上清液各回收300μl至3根新的微量離心管，於-80℃下冷凍。

3.利用PBS清洗孔，添加1ml之胰蛋白酶EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸)³⁰⁾，於37℃下培育5min。

4.仔細地移液，將細胞剝離，將細胞溶液通入至FACS(fluorescence activated cell sorter，螢光流式細胞分選儀)管³¹⁾。

5.利用1ml之HBM進行清洗，使總體積成為2ml。

6.利用錐蟲藍進行計數。

<iPS-HEP細胞之確認>

進行下述操作，確認已獲得iPS細胞。

Ammonia Test.Wako ³²⁾ ：

1.使上清液融解。

2.以8000rpm於4℃下離心5min。

3.製作氨稀釋液。不使用套組內之標準溶液及標準稀釋液。將40μl之銨離子標準溶液(1000mg/L)添加至960μl之HBM(無添加)中，進行漩渦攪拌，製成標準溶液。

4.將樣品之上清液及氨稀釋液各200μl移至新的微量離心管。

5.添加800μl之除蛋白液，進行漩渦攪拌。

6.以8000rpm於4℃下離心5min。

7.於離心中接通微盤讀取器及電腦之電源，預先選擇Tecan i-control。

8.將上清液分注至96孔平底板各60μl。複製(Duplicate)

9.將顯色試液A添加至各孔各60μl。

10.打開蓋，安放於微盤讀取器，攪拌培養板。(雙擊振盪(Shaking)，10sec，設置為普通(Normal)，點擊開始(Start))

11.將顯色試液B添加至各孔各30μl。

12.安放於微盤讀取器，攪拌培養板。

13.將顯色試液C添加至各孔各60μl。儘可能迅速。

14.安放於微盤讀取器，攪拌培養板。

15.利用37℃、5% CO₂之培養箱培育20min。

16.以4℃冷卻10min以上，使反應停止。

17.將培養板之底面擦乾淨，與左上一併安放於微盤讀取器。

18.對吸光度(620或630nm)進行測定。(雙擊測定(Measure)之吸光度(Absorbance)；620nm；於詳情(Details)中選擇將測定之孔；點擊開始(Start))

RT-PCR：

1.使用ISOGEN II(Nippon Gene)，按照附帶之操作說明進行RNA提取

2.利用NanoDrop(註冊商標)測定RNA濃度

3.利用PrimeScript高保真度(High Fidelity)RT-PCR試劑盒合成cDNA

4.利用Veriti 96孔熱循環儀(Thermal Cycler)(Applied Biosystems)實施PCR

5.引子組(primer set)如下所述

7.利用1%瓊脂糖凝膠對RT-PCR產物進行電泳

8.利用凝膠紅(Gel Red)進行染色，並進行觀察

結果：

將所獲得之iPS-HEP細胞之照片示於圖4。所獲得之細胞係構成獨特之網狀構造體者。空隙之直徑約為300~1000μm，網部分之寬度約為20 ~200μm。具有1~3個細胞之厚度約10~60μm。

將所獲得之氨代謝測試及RT-PCR之結果示於圖5~9。可知：iPS-HEP細胞視培養條件而具有與原代肝細胞之代謝能力(160~200μg/dl/24h)相同程度之氨代謝機能。又，相較於使用飼養層細胞(人臍靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs))、間葉系幹細胞(mesenchymal stem cells，MSCs))，使用化合物(FH1、FPH1)之氨代謝機能之增強效果更高。

<實施例中所使用之材料之一覽>

<實施例中所引用之文獻>

非專利文獻1：T. Takebe et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature 499, 481-484 (2013), doi：10.1038/nature 12271, Published online 03 7月2013

[產業上之可利用性]

藉由本發明而獲得之由iPS細胞誘導而成之高機能人工肝細胞能夠較佳地用作混合型人工肝臟。又，亦能夠用於藥物之篩選或以氨代謝等為指標之毒性試驗等。

[序列表非關鍵文字]

序列編號：1 hALB For

序列編號：2 hALB Rev

序列編號：3 hHNF4a For

序列編號：4 hHNF4a Rev

序列編號：5 hOCT4 For

序列編號：6 hOCT4 Rev

序列編號：7 hCYP3A4 For

序列編號：8 hCYP3A4 Rev

序列編號：9 hβ-肌動蛋白For

序列編號：10 hβ-肌動蛋白Rev

<110> 米滿吉和蓋亞生物製藥有限公司

<120> 高機能肝細胞及其利用

<130> F17570H

<150> JP 2016-037518

<151> 2016-02-29

<160> 10

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引子，hALB For

<400> 1

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引子，hALB Rev

<400> 2

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引子，hHNF4a For

<400> 3

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引子，hHNF4a Rev

<400> 4

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引子，hOCT4 For

<400> 5

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引子，hOCT4 Rev

<400> 6

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引子，hCYP3A4 For

<400> 7

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引子，hCYP3A4 Rev

<400> 8

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCr引子，hfA-肌動蛋白For

<400> 9

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引子，hfA-肌動蛋白Rev

<400> 10

Claims

一種人工肝細胞，其具有100μg/dl/24h以上之氨代謝機能，且能夠構成網狀構造體。
如請求項1之人工肝細胞，其能夠於無血清且無飼養層環境下進行培養。
如請求項1或2之人工肝細胞，其係由人工多潛能性幹(iPS)細胞誘導而成者。
如請求項3之人工肝細胞，其中iPS細胞係使用仙台病毒載體而製造者。
一種人工肝細胞之製造方法，其包含以下步驟：分化誘導步驟1，其係於包含活化素A之分化誘導培養基I中培養iPS細胞；分化誘導步驟2，其係於包含骨形成蛋白質4(BMP4)及纖維芽細胞生長因子2(FGF2)之分化誘導培養基II中培養由分化誘導步驟1所獲得之細胞；及分化誘導步驟3，其係於包含肝細胞生長因子(HGF)、抑瘤素M、地塞米松、以及N,N'-(亞甲基雙(4,1-伸苯基))二乙醯胺(FH1)及/或2-(N-(5-氯-2-甲基苯基)(甲基磺醯胺基)-N-(2,6-二氟苯基)-乙醯胺(FPH1)之分化誘導培養基III中培養由分化誘導步驟2所獲得之細胞而獲得人工肝細胞。
如請求項5之製造方法，其中iPS細胞係使用仙台病毒載體而製造者。
如請求項5或6之製造方法，其中分化誘導培養基III包含FH1及FPH1。
如請求項5至7中任一項之製造方法，其中分化誘導步驟1~3係於無血清且無飼養層環境下實施。
如請求項5至8中任一項之製造方法，其中分化誘導步驟1及分化誘導步驟2合計進行2~14天，且分化誘導步驟3進行2~14天。
一種混合型人工肝臟，其包含如請求項1至4中任一項之人工肝細胞、或藉由如請求項5至9中任一項之製造方法而獲得之人工肝細胞。
如請求項10之混合型人工肝臟，其使用至少10⁹個人工肝細胞。