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WO2022123837A1 - 強膜菲薄化治療用点眼剤及び強膜菲薄化治療剤のスクリーニング方法 - Google Patents

強膜菲薄化治療用点眼剤及び強膜菲薄化治療剤のスクリーニング方法 Download PDF

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WO2022123837A1
WO2022123837A1 PCT/JP2021/032068 JP2021032068W WO2022123837A1 WO 2022123837 A1 WO2022123837 A1 WO 2022123837A1 JP 2021032068 W JP2021032068 W JP 2021032068W WO 2022123837 A1 WO2022123837 A1 WO 2022123837A1
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WO
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myopia
eye
thinning
atf6
pathway
Prior art date
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PCT/JP2021/032068
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English (en)
French (fr)
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一男 坪田
俊英 栗原
真一 池田
紀和子 森
效炎 姜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Tsubota Laboratory Inc
Original Assignee
Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Tsubota Laboratory Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Priority to AU2021395633A priority patent/AU2021395633A1/en
Priority to CN202180082955.4A priority patent/CN116801864A/zh
Priority to TNP/2023/000139A priority patent/TN2023000139A1/en
Priority to EP21902942.8A priority patent/EP4257148A4/en
Priority to MA61686A priority patent/MA61686A1/fr
Priority to KR1020237022415A priority patent/KR20230135055A/ko
Priority to US18/266,103 priority patent/US20240398736A1/en
Priority to MX2023006724A priority patent/MX2023006724A/es
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/16—Ophthalmology

Definitions

  • the present invention maintains the normal eye shape by suppressing scleral thinning that affects the scleral shape for the adult eye with advanced myopia, and causes eye diseases associated with scleral thinning.
  • the present invention relates to an ophthalmic agent for scleral thinning treatment containing an active ingredient that can be treated, and a method for screening the scleral thinning therapeutic agent.
  • Non-Patent Document 1 The latest research on myopia and severe myopia predicts a significant increase in the world's myopia population, with about 5 billion myopia and about 1 billion severe myopia in 2050. (See Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 Classification of these scleral thinning-related eye diseases includes posterior ocular diseases such as myopia macular degeneration, cataracts, and eye movement disorders.
  • posterior ocular diseases such as myopia macular degeneration, cataracts, and eye movement disorders.
  • Suppressing deformation is a radical cure.
  • myopia CNV myopia choroidal neovascularization
  • aflibercept and ranibizumab are known as existing drugs that suppress the neovascularization.
  • these antibody drugs can suppress new blood vessels, they have no therapeutic effect on scleral thinning, and poor prognosis such as scarring of the choroid is known. Therefore, there is a strong demand for early radical treatment (reduction of mechanical pressure on the posterior eye) before the disease becomes severe.
  • An object of the present invention is to provide a screening method for searching for a component capable of suppressing scleral thinning caused by severe myopia in an adult, and to use the active ingredient obtained by the screening method for scleral thinning and thinning of the sclera.
  • the purpose is to provide eye drops capable of treating the accompanying eye disease.
  • the present invention [1] An eye drop for scleral thinning treatment containing an inhibitor of the PERK (PKRK-like endoplasmic reticulum kinase) pathway and / or the ATF6 (Activating transcription factor 6) pathway as an active ingredient.
  • PERK PSRK-like endoplasmic reticulum kinase
  • ATF6 Activating transcription factor 6
  • [7] The step of contacting the candidate substance with the cell derived from the eye and the step of selecting the candidate substance using the protein of the signal transduction system of PERK and / or ATF6 and / or the gene change as an index in the cell.
  • a method for screening a scleral thinning therapeutic agent including.
  • the active ingredient obtained by the screening method can be used to provide eye drops capable of treating scleral thinning and its associated eye diseases.
  • (B) is an explanatory diagram for measuring the sclera, in which the position of the optic disc is "0" and the distances (400 ⁇ m, 700 ⁇ m, 1000 ⁇ m, 1300 ⁇ m) above (+) and below (-) from the optic disc. The sclera was measured at 1600 ⁇ m, 1900 ⁇ m, 2200 ⁇ m and 2500 ⁇ m).
  • (C) is a graph of the sclera measurement result.
  • FIG. 3 is a graph showing changes in axial elongation and refraction (myopia) due to instillation of various inhibitors of the PERK pathway, ATF6 pathway, and IRE1 pathway to mice.
  • the result (# p ⁇ 0.05) compared with the STF instillation NL group or the -30D lens wearing group.
  • It is a graph in which induction of myopia in mice induces upregulation of UPR gene expression in the sclera, and intraperitoneal injection of PBS (PBS) and administration of sodium phenylbutyrate (4-PBA; 200 mg / kg / day) sclera (each).
  • (A) is a transmission electron microscope image of scleral collagen fibers (three biologically independent images) when PBS or 4-PBA is instilled in C57BL6J mice without a lens (NL) and equipped with a -30D lens. It is a typical image of the sample).
  • the eye drops for treating scleral thinning and concomitant eye diseases according to the present invention contain an inhibitor of the PERK (PKR-like endoplasmic reticulum kinase) pathway and the ATF6 (Activating transition factor 6) pathway as active ingredients.
  • PERK PLR-like endoplasmic reticulum kinase
  • ATF6 Activating transition factor 6
  • scleral thinning As mentioned above, excessive axial elongation causes scleral thinning (deformation of the eyeball), which is involved in the induction and / or exacerbation of scleral thinning and concomitant eye diseases. As shown in the experimental examples described later, it was confirmed that the scleral thinning that causes the deformation of the eyeball is induced in the myopia-induced mouse model, and the mechanism is the upregulation of the expression of a specific gene in the UPR gene group. As a result, it was suggested that the narrowing of collagen fibers in the sclera was induced, leading to the thinning of the sclera. Therefore, a substance having an inhibitory effect on the thinning of the sclera can be an active ingredient.
  • genes and / or proteins involved in scleral thinning are targeted and suppressed, and nucleic acids such as antisense oligonucleotides and siRNA are used to treat scleral thinning and associated eye diseases. It can be added to eye drops as an effective ingredient.
  • the inhibitor of the PERK pathway and the ATF6 pathway means a substance having an inhibitory effect on both the PERK signal transduction system (PERK pathway) and the ATF6 signal transduction system (ATF6 pathway). ..
  • the inhibitory effect on these signal transduction systems can be evaluated by a known method using changes in genes and / or proteins involved in these signal transduction systems as an index, as in the examples described later.
  • a substance having an inhibitory effect on both the PERK pathway and the ATF6 pathway can be an active ingredient for suppressing pathological axial elongation (scleral thinning).
  • a compound that targets and reduces genes and proteins involved in PERK and / or ATF6 signaling and nucleic acids such as antisense oligonucleotides and siRNA that reduce protein expression in the PERK and / or ATF6 pathways. It can be added to eye drops as an effective ingredient for the treatment of strong membrane thinning.
  • the inhibitor of the PERK pathway or the ATF6 pathway means a substance having an inhibitory effect on the signal transduction system of PERK or the signal transduction system of ATF6 in the endoplasmic reticulum.
  • the inhibitory effect on these signal transduction systems should be evaluated by the method described in the experimental examples described later or by a known method, using changes in genes and / or proteins involved in these signal transduction systems as indicators. Can be done.
  • the evaluation is made by changing the expression of the factor by at least 1% depending on the candidate substance as compared with the control in which the candidate substance is not added. It is possible.
  • the expression of the factor fluctuates by at least 1% depending on the candidate substance as compared with the control in which the candidate substance is not added. It is possible to evaluate.
  • PERK is an endoplasmic reticulum transmembrane kinase, and as factors involved in its signal transduction, for example, eIF2 ⁇ (eucaryotic initiation factor 2 ⁇ ), ATF4 (Activating protein factor 4), CHOP (C / EBPhomo) Growth arrest DNA and damage protein 34) and the like can be mentioned.
  • eIF2 ⁇ eucaryotic initiation factor 2 ⁇
  • ATF4 Activating protein factor 4
  • CHOP C / EBPhomo Growth arrest DNA and damage protein 34
  • ATF6 is a membrane-bound transcription factor belonging to the CREB / ATF family, and examples of factors involved in its signal transduction include BiP (Binding immunoglobulin protein, also referred to as “GRP78”) and Txndc12 (thioredoxin dominant proteining). 12, (also referred to as "ERp18"), S1P (site-1 protease), S2P (site-2 protease) and the like.
  • the present invention is not limited to these, and at least a component specified as a component that suppresses the ATF6 pathway and a component newly specified as a component that suppresses the PERK pathway and the ATF6 pathway can also be used.
  • the inhibitor of the PERK pathway and the ATF6 pathway is not limited, but sodium phenylbutyrate is preferable from the viewpoint of solubility in eye drops.
  • sodium phenylbutyrate is preferable because it can inhibit the PERK pathway in addition to the ATF6 pathway.
  • Inhibitors of the PERK pathway and / or the ATF6 pathway may be synthesized and used by a known method, or commercially available products may be obtained and used.
  • the "pharmaceutically acceptable salt” is not particularly limited, and specific examples thereof include organic acid salts, inorganic acid salts, organic bases, and inorganic bases.
  • organic acid salt include monocarboxylates such as acetate, trifluoroacetate, butyrate, palmitate and stearate; fumarate, maleate, succinate, malonate and the like.
  • Examples of the inorganic acid salt include hydrochloride, sulfate, nitrate, hydrobromide, and phosphate.
  • Examples of the salt with an organic base include salts with organic amines such as methylamine, triethylamine, triethanolamine, diethanolamine, morpholine, piperazine, pyrrolidine, tripyridine, picolin and ethylenediamine.
  • Examples of the salt with an inorganic base include ammonium salts; alkali metals such as sodium or potassium, alkaline earth metals such as calcium or magnesium, and various salts such as salts with metals such as aluminum. These salts may be used alone or in any combination of two or more.
  • the "pharmaceutically acceptable salt” may include a solvate or hydrate of the salt.
  • the content of the inhibitor of the PERK pathway and / or the ATF6 pathway can be appropriately changed depending on the usage, dosage, type of additive and the like. For example, 0.01% by mass or more is preferable, 0.05% by mass or more is more preferable, 0.1% by mass or more is further preferable, and 0.2% by mass or more is particularly preferable with respect to the total amount of eye drops.
  • the content of the inhibitor of the PERK pathway and / or the ATF6 pathway is, for example, preferably 5% by mass or less, more preferably 4% by mass or less, still more preferably 3% by mass or less, based on the total amount of the eye drops. Mass% or less is particularly preferable.
  • the content of the inhibitor of the PERK pathway and / or the ATF6 pathway is, for example, preferably 0.01 to 5% by mass, more preferably 0.05 to 4% by mass, and 0.1 to 0.1% by mass, based on the total amount of eye drops. It is more preferably to 3% by mass, and particularly preferably 0.2 to 2% by mass.
  • the content thereof is, for example, 0. 01 to 5% by mass is preferable, 0.05 to 4% by mass is more preferable, 0.1 to 3% by mass is further preferable, and 0.2 to 2% by mass is particularly preferable.
  • Axial length grows rapidly from birth to about 2 years of age, after which it gradually grows.
  • the axial elongation accompanying such growth is called “physiological axial elongation” and is an indispensable phenomenon for eye development.
  • pathological axial elongation is an indispensable phenomenon for eye development.
  • pathological axial elongation an extension of 1 mm axial length in the adult eye leads to an increase in myopia of about 3.0D.
  • the eye drops according to the present invention are used for the treatment of scleral thinning and concomitant eye diseases.
  • the scleral thinning-related eye disease refers to a disease caused by an excessive extension of the axial length organically due to severe myopia.
  • severe myopia thinning of the sclera that maintains the shape of the eyeball is said to be the initial symptom of the above-mentioned associated eye disease (see Non-Patent Document 4).
  • the thinning of the sclera is selected from the group consisting of the thick film, the thickness of the collagen fibers in the sclera, or the collagen-related genes / proteins (COL1A1, COL4A3, COL8A2, COL11A2, and COL15A1) in the sclera. It is considered that it can be used for the treatment of scleral thinning and associated eye diseases by suppressing the deformation of the eyeball by evaluating by the expression of at least one type) and screening for a component capable of suppressing this thinning.
  • scleral thinning is evaluated by simultaneous enhancement of the PERK pathway and ATF6 pathway, and by screening for components that can suppress these, it is possible to suppress the deformation of the eyeball and use it for the treatment of scleral thinning and associated ophthalmopathy. It is thought that it can be done.
  • Eye diseases associated with macular thinning include myopic macular degeneration, myopic retina atrophy, myopic choroidal neovascularization, myopic optic neuropathy, myopic retinopathy, retinal macular atrophy, macular bleeding, and myopic traction macular disease.
  • Myopic macular disease myopic macular lesion, myopic macular separation, myopic refractory dark spot, myopic conus, myopic central fossa separation, diffuse atrophic lesion, localized atrophic lesion, Lacquer cracks, posterior grape Eye diseases such as tumor, macular detachment, macular foramen, tilted papillary syndrome, myopic turbulence, fixed internal squint, mechanical abduction limitation, internal squint, and severe myopic squint.
  • posterior ocular disease is preferable from the viewpoint of having a strong causal relationship with scleral thinning (deformation of the eyeball). Furthermore, from the viewpoint of clear and direct causal relationship, the present invention may be applied to myopia macular degeneration, myopia reticulochoroidal atrophy, myopia choroidal neovascularization, or myopia optic neuropathy. preferable.
  • the composition according to the present invention is used as an eye drop.
  • the dosage form of the eye drop for scleral thinning treatment is not limited, and examples thereof include an aqueous eye drop, a time-dissolving eye drop, a suspension eye drop, an oil-based eye drop, and an eye ointment. Be done. Among these, an aqueous eye drop is preferable from the viewpoint of remarkably exerting the effect of the present invention.
  • active ingredients can be added to the eye drops.
  • active ingredients are not particularly limited, and are, for example, decongestion components, eye muscle regulator components, anti-inflammatory drug components, astringent drug components, antihistamine drug components, antiallergic drug components, vitamins, amino acids, and antibacterial components.
  • examples thereof include drug components, sugars, polymer compounds or derivatives thereof, cellulose or derivatives thereof, local anesthetic components and the like.
  • various ingredients and additives are appropriately selected according to a conventional method according to the use and form thereof, as long as the effects of the present invention are not impaired, and one or two or more of them are contained in combination.
  • those components or additives for example, carriers, fragrances or refreshing agents, preservatives, bactericides or antibacterial agents, pH regulators, chelating agents, stabilizers, etc., which are generally used for preparing liquids and the like, etc.
  • examples thereof include various additives such as a tensioning agent, a buffering agent, and a thickening agent.
  • the following are examples of typical ingredients used in eye drops, but are not limited thereto.
  • the carrier examples include an aqueous solvent such as water and hydrous ethanol.
  • a solubilizer may be used.
  • the solubilizer include polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyoxyl 40 stearate, povidone, polysorbate 80 and the like.
  • fragrance or refreshing agent examples include terpenes (specifically, anethole, eugenol, camphor, geraniol, cineole, borneol, menthol, limonene, ryuno, etc., which may be d-form, l-form or dl-form. Good), essential oils (eucalyptol oil, cool mint oil, kehi oil, spear mint oil, sardine water, sardine oil, peppermint oil, bergamot oil, eucalyptus oil, rose oil, etc.) and the like.
  • terpenes specifically, anethole, eugenol, camphor, geraniol, cineole, borneol, menthol, limonene, ryuno, etc.
  • essential oils eucalyptol oil, cool mint oil, kehi oil, spear mint oil, sardine water, sardine oil, peppermint oil, berga
  • preservatives, bactericides or antibacterial agents examples include polydronium chloride, alkyldiaminoethylglycine hydrochloride, sodium benzoate, ethanol, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, chlorhexidine gluconate, chlorobutanol, sorbic acid, potassium sorbate, etc.
  • pH adjusting agent examples include hydrochloric acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, triethanolamine, monoethanolamine, diisopropanolamine, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • chelating agent examples include ascorbic acid, tetrasodium edetate, sodium edetate, citric acid and the like.
  • the stabilizer examples include sodium edetate hydrate, povidone, polysorbate 80, dibutylhydroxytoluene, trometamol, sodium formaldehyde sulfoxylate (longalit), tocopherol, sodium pyrosulfate, monoethanolamine, aluminum monostearate, and the like. Examples thereof include glycerin monostearate.
  • tonicity agent examples include potassium chloride, sodium chloride, concentrated glycerin, glucose, D-mannitol and the like.
  • buffering agent examples include sodium citrate hydrate, sodium acetate hydrate, sodium hydrogen carbonate, trometamol, boric acid, borosand, sodium hydrogen phosphate hydrate, sodium dihydrogen phosphate and the like.
  • thickening agent examples include carboxyvinyl polymer, povidone, polyvinyl alcohol (partially saponified product), hydroxyethyl cellulose, hypromellose, methyl cellulose, glycerin and the like.
  • the additive can be blended in the range where the effect of the present invention is expected or the effect of the present invention is not impaired.
  • the content thereof is not particularly limited, but is preferably about 0.001 to 1% by mass with respect to the total amount of eye drops.
  • the pH of the eye drops may be 3 to 10, preferably 4 to 9 from the viewpoint of usability, and more preferably 5 to 8.5 from the viewpoint of usability.
  • a known eye drop container can be used without limitation.
  • the eye drop container a container having a shape that allows the eye drop to be dropped onto the eye, for example, a shape having a nozzle and a container mouth at the tip of the nozzle can be used.
  • the instillation container has a structure in which a nozzle separately molded is attached to the container, and a container in which the nozzle portion (liquid pouring portion) and the container body are integrally molded (for example,). It may be any of the single-use type instillation containers, etc.).
  • the eye drop container may usually be a plastic container.
  • the constituent materials of the plastic container are not particularly limited, but for example, one of polyethylene terephthalate, polyarylate, polyethylene naphthalate, polycarbonate, polyethylene, polypropylene, and polyimide, copolymers thereof, or two or more thereof. Can be mentioned.
  • polyethylene terephthalate, polyarylate, polyethylene naphthalate, a copolymer thereof, or a mixture of two or more thereof is preferable from the viewpoint that the effect of the present invention can be easily exerted by adjusting the extrusion or the like.
  • the eye drops may be filled in a transparent container (a container having transparency enough to observe foreign substances) containing such a material as a main material, or may be filled in a light-shielded container. good.
  • the light shielding may be performed, for example, by adding a colorant to the transparent container material, or by covering the container with a shrink film, an outer box, or the like.
  • the capacity of the container is preferably about 0.5 to 50 mL, more preferably about 3 to 20 mL, in order to further facilitate the effect of the present invention by adjusting the extrusion or the like.
  • the structure and constituent materials of the nozzle provided in the eye drop container are not particularly limited.
  • the structure of the nozzle may be any structure generally adopted as the nozzle of the eye drop container.
  • the constituent material of the nozzle for example, the same material as the constituent material of the plastic container can be mentioned.
  • a nozzle containing polyethylene or polypropylene as a constituent material is suitable.
  • the type of polyethylene include high-density polyethylene and low-density polyethylene, and among them, a nozzle containing low-density polyethylene as a constituent material is preferable.
  • the eye drops according to the present invention can be prepared by a method commonly used or known to those skilled in the art. For example, after each component is dispersed on a carrier such as water, a solubilizer is added if necessary, heated as necessary, homogenized, dissolved or emulsified using a homomixer or the like to adjust the pH. It may be prepared by adjusting the pH with an agent. Further, as a method for sterilizing the preparation, a method such as electron beam sterilization, autoclave sterilization, or filtration sterilization can be selected.
  • the usage and dosage of the eye drops according to the present invention vary depending on the patient's symptoms and the like, but usually, about 1 to 6 times a day, about 1 to 2 drops may be instilled.
  • the eye drop according to the present invention is not limited, but contains at least one selected from the group consisting of phenylbutyric acid and a pharmacologically acceptable salt thereof as a therapeutic agent for thinning the membrane.
  • the eye drops can be instilled once or twice a day with one or two drops at a time, and it is preferable to instill the eye drops once a day with one drop.
  • the eye drops according to the present invention can be used, for example, before taking a nap, before going to bed, or other times when the activity is not active.
  • the screening method for the therapeutic agent for thinning of the membrane is a step of contacting a candidate substance with cells derived from the eye, and a protein and / or gene of the signal transduction system of PERK and / or ATF6 in the cells. It includes a step of selecting a candidate substance using a change as an index.
  • cells are contacted in the presence or absence of a candidate substance, and changes in PERK and / or ATF6 signaling system proteins and / or genes due to the candidate substance are measured and compared. This can lead to screening of candidate substances.
  • the cells derived from the eye are not limited, but are preferably cells in the sclera from the viewpoint of remarkably exerting the effect of the present invention.
  • the cells derived from the eye are preferably cells derived from the animal model that induced myopia.
  • a myopia induction model a known animal model can be used.
  • examples of the myopia-inducing model include an animal model in which a minus lens is worn to induce myopia, and an animal model in which a myopia-inducing agent is administered to induce myopia.
  • a negative lens As such a negative lens, a -20 to -40 diopter (D) can be used, and a -25 to -35 diopter (D) is preferable.
  • a method of wearing the minus lens a known method can be used, and the method of wearing the minus lens is not limited, and examples thereof include fixing the minus lens in front of the eyes of an animal using a fixative.
  • the wearing period of the minus lens can be, for example, at least one week, preferably two weeks or more, and more preferably three weeks or more.
  • the myopia inducer a known substance can be used, but for example, tunicamycin, thapsigargin, etc. can be used as the myopia inducer.
  • an activator of the PERK pathway and an activator of the ATF6 pathway can be used in combination.
  • Examples of the PERK pathway activator include CCT020312 and the like, and examples of the ATF6 pathway activator include AA147 and the like, which can be administered alone or in combination, and these can be administered in combination. It is preferable to do so.
  • Such myopia inducers are not limited, but can be administered as, for example, an injection or an eye drop from the viewpoint of acting on cells of the eye such as the sclera, and should be administered as an eye drop. Is preferable.
  • tunicamycin When used as an eye drop, it can be, for example, 10 to 100 ⁇ g / mL, preferably 20 to 80 ⁇ g / mL, and more preferably 40 to 60 ⁇ g / mL.
  • Thapsigargin When Thapsigargin is used as an eye drop, it can be, for example, 1 to 100 ⁇ M, preferably 2 to 60 ⁇ M, and more preferably 5 to 30 ⁇ M.
  • the time to start wearing the minus lens is preferably the weaning time, and more preferably a 3-week-old mouse.
  • physiological axial elongation occurs from 3 to 6 weeks of age. Therefore, by inducing myopia from the age of 3 weeks, it is possible to promote excessive axial elongation in addition to physiological axial elongation, and thus it is possible to cause pathological axial elongation.
  • the application time of the candidate substance is preferably, for example, during myopia induction (3 to 6 weeks of age, etc.) and / or after myopia induction (6 to 8 weeks of age, etc.). From the viewpoint of the period corresponding to adulthood in humans, where scleral thinning causes posterior ocular damage, the application time of the candidate substance is, for example, after myopia induction (6 to 8 weeks of age, etc.). ) Is more preferable.
  • the effect of the candidate substance on residual pathological axial elongation and scleral thinning after the end of myopia progression in childhood according to techniques that apply the candidate substance after induction of myopia. It is possible to evaluate.
  • the step of bringing the candidate substance into contact with cells derived from the eye is preferably administered by oral, intraperitoneal injection or eye drops, and more preferably by eye drops.
  • the candidate substance can be contained in eye drops and administered.
  • a known evaluation method can be used in the step of measuring the protein of the signal transduction system of PERK and / or ATF6 by the candidate substance and / or the gene change.
  • gene expression and protein expression or secretion can be measured by known methods such as microarray, real-time PCR method, PCR method, Western blotting method, ELISA method, and immune tissue staining.
  • RNA extraction method when measuring changes in genes in the signal transduction system of PERK or ATF6, it is possible to extract RNA from cultured cells using a known RNA extraction method and use it as a step for quantitative analysis of mRNA expression.
  • the step of quantitatively analyzing the expression of mRNA is not limited, but it is preferable to use the real-time PCR method.
  • the factor involved in signal transduction described above in the item inhibitor of PERK pathway and ATF6 pathway
  • Examples of factors involved in the PERK pathway include CHOP, ATF4, GADD34 and the like.
  • factors involved in the ATF6 pathway include GRP78, GRP94, PDI, Cnex, HYOU, ERdj3 and the like.
  • a known evaluation method can be used in the step of measuring the thinning of the sclera due to the candidate substance.
  • the sclera can be measured by staining the sclera tissue with HE staining or the like and observing and analyzing the tissue with a microscope or the like when evaluating by the strong film thickness.
  • OCT optical coherence tomography
  • SD spectral domain
  • SS swept source
  • the fiber area and the diameter in the fiber cross section are measured by observing and analyzing the collagen fibers in the sclera with an electron microscope or the like. It is possible to do.
  • the candidate substance can be selected as a therapeutic agent for scleral thinning and used as a therapeutic agent for scleral thinning.
  • the present invention may also have the following aspects.
  • An eye drop for the treatment of scleral thinning which contains an inhibitor of the PERK (PKRK-like endoplasmic reticulum kinase) pathway and / or the ATF6 (Activating transcription factor 6) pathway as an active ingredient; Eye drops containing an inhibitor of the PERK pathway and / or the ATF6 pathway as an active ingredient for use in the treatment of scleral thinning; Use of inhibitors of the PERK and / or ATF6 pathways for the production of eye drops for the treatment of scleral thinning; A method for treating scleral thinning, which comprises ingesting an effective amount of an inhibitor of the PERK pathway and / or the ATF6 pathway in a person; The eye drops, uses, or methods described above, wherein the inhibitor comprises selectively inhibiting at least the ATF6 pathway; The eye drops, uses, or methods described above, wherein the inhibitor is an inhibitor of both the PERK and ATF6 pathways; The
  • Myopic macular disease myopic macular lesion, myopic macular separation, myopic refractory dark spot, myopic conus, myopic central fossa separation, diffuse atrophic lesion, localized atrophic lesion, Lacquer cracks, posterior grape Tumors, macular detachment, macular foramen, tilted papillary syndrome, myopic turbulence, fixed internal squint, mechanical abduction limitation, internal squint, or severe myopic squint, the eye drops, use, or method described above.
  • the eye drops, use, or method according to the above, wherein the eye drops are aqueous eye drops;
  • the eye drops, use, or method according to the above, wherein the eye drops are used before taking a nap or before going to bed;
  • the sclera includes a step of contacting the candidate substance with the cell derived from the eye and a step of selecting the candidate substance using the protein of the signal transduction system of PERK and / or ATF6 and / or the gene change as an index in the
  • the screening method according to the above, wherein the cells derived from the eye are cells derived from an animal model that induced myopia;
  • the screening method according to the above, wherein the negative lens is a -20 to -40 diopter (D) lens;
  • the screening method according to the above, wherein the wearing period of the minus lens is at least one week;
  • the screening method according to the above, wherein the myopia inducer comprises tunicamycin and / or thapsigargin;
  • the screening method according to the above, wherein the concentration of the tunicamycin in the case of eye drop administration is 10 to 100 ⁇ g / mL;
  • the screening method according to the above, wherein the concentration of Thapsigargin in the case of eye drop administration is 1 to 100 ⁇ M;
  • the screening method which comprises selecting the candidate substance as a scleral thinning therapeutic agent when the expression of the protein and / or gene of the signal transduction system of PERK and ATF6 by the candidate substance is suppressed. ;
  • the screening method according to the above which comprises selecting the candidate substance as a therapeutic agent for scleral thinning when the expression of the collagen-related protein and / or the gene in the sclera by the candidate substance is normalized;
  • the screening method according to the above, wherein the collagen-related protein and / or the gene is at least one selected from the group consisting of COL1A1, COL4A3, COL8A2, COL11A2, and COL15A1.
  • Non-Patent Document 3 the human eye has hyperopia immediately after birth, and then the axis of the eye extends (that is, myopia) and becomes emmetropic in school age (around 8 years old).
  • the eye axis of the mouse C57BL6
  • the 3 to 6 weeks of age of this myopia induction period is equivalent to that of human children in terms of the dynamics of myopia progression.
  • after the end of the myopia induction period it corresponds to the real adult period.
  • Fig. 1 (a) schematically shows the mechanism by which axial myopia is induced by wearing a minus lens.
  • Emmetropia is a state in which the image is clearly visible because the parallel rays that enter the eye form an image on the retina.
  • axial myopia is a state in which parallel rays entering the eye form an image in front of the retina due to the long axial length of the eye, and therefore cannot be clearly seen.
  • the axis of the eye extends to the position where the image is formed when the minus lens is worn, that is, the state where the image is clearly visible when the minus lens is worn.
  • the axis of the eye is elongated, and it is possible to create an eye condition similar to that of axial myopia.
  • a myopia-guided mouse is prepared as follows.
  • the myopia guidance, axial length and refraction were measured by the same methods as in Non-Patent Documents 6 and 7.
  • male C57BL6J mice were housed in standard clear cages in a temperature controlled clean room under a 12 hour light-dark cycle. Animals were allowed free intake of standard feed and high pressure steam sterilized tap water.
  • mice Immediately after weaning, 3-week-old mice are anesthetized with a three-kind mixed anesthesia of Domitor (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.), Betorfar (Meiji Seika Pharma Co., Ltd.), and Midazolam (Sand Co., Ltd.), and the skull is exposed with scissors.
  • a support is erected on the skull and fixed with dental cement (Super-Bond, Sun Medical Co., Ltd.).
  • the stanchion is provided with a thread so that the adjustment device described later can be fixed with a nut.
  • a -30 diopter (D) minus lens (Rainbow Contact, Rainbow Optical Laboratory Co., Ltd.) as the right eye (myopia-guided eye), and use a 0D lens as a control, or only the frame as the left eye. Attach it to (control eye).
  • D diopter
  • a protector having a shape protruding laterally is adhered to the frame portion at the bottom of the lens so that the mouse is not damaged by the front legs or the like.
  • the protector prevents the mouse from touching the lens and does not scratch the lens.
  • the protector used here is one that is glued to the frame and integrated, but it is not necessary that the protector is integrated with the lens as long as the action of the mouse does not damage the lens. For example, it may be shaped like an Elizabethan collar worn by a traumatized animal.
  • An adjustment device for adjusting the width and angle of the attached lens is adhered to the frame above the lens as the mouse grows.
  • the adjuster is bent into a dogleg shape, one with a lens glued on it and the other with a slotted hole for attachment to a strut erected on the head.
  • the mouse By passing a long hole through a support and screwing it with a nut, the mouse can be firmly attached to the skin and fixed without pressing the periphery of both eyes.
  • a three-point adjustment mechanism consisting of a support, a nut, and an adjustment device, the width and angle can be adjusted according to the growth of the mouse, and the lens can be adjusted so that it is at the position of the mouse's eyes. Further, since the lens can be removed, it is possible to measure changes in the axial length and the refraction value with time.
  • eyeballs were removed from C57BL6J mice.
  • mouse eyeballs were fixed in ice-cold 2.5% glutaraldehyde PBS for 1 hour and cut along the sagittal plane. The cornea and lens were removed and the remaining tissue was further fixed overnight with 2.5% glutaraldehyde / 60 mM HEPES buffer (pH 7.4).
  • Specimens were washed with 60 mM HEPES buffer, incubated with 1% tetroxidoosmium / 60 mM HEPES buffer for 2 hours at 4 ° C., dehydrated through ethanol series, replaced and wrapped in Epon 812 (EM Japan, Tokyo, Japan). Buried. After embedding, the blocks were sliced at 70 nm and stained with uranyl acetate and lead citrate. The classification was visualized by JEM-1400Plus (JEOL Ltd., Tokyo, Japan).
  • the eyeballs were frozen with an OCT compound (Sakura Finetek, Tokyo, Japan).
  • the freezing block was cut to a thickness of 5 ⁇ m using a cryostat (CM3050S; Leica Biosystems, Wetzlar, Germas). Sections were stored at ⁇ 80 ° C. until use.
  • paraffin sections To prepare paraffin sections (mice), the eyeballs were fixed overnight with 4% paraformaldehyde, embedded in paraffin, and sliced into 3 ⁇ m sections by a microtome (REM-710, Yamato Kohki, Saitama, Japan). The sections were then stained with hematoxylin and eosin and visualized using a BX53 microscope (Olympus, Tokyo, Japan). The sclera was measured using cellSens software (Olympus).
  • Quantitative real-time PCR was performed on PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, CA, USA) using the StepOnePlus real-time PCR system. Expression levels were standardized by ⁇ -actin.
  • the axial elongation and refractive change after myopia induction were evaluated in myopia-induced mice (Fig. 2).
  • the eyeball after myopia induction was removed and stained with hematoxylin and eosin to observe the sclera (FIGS. 3a and 3b).
  • the sclera of the stained tissue according to the distance from the optic disc was graphed (FIG. 3c).
  • the myopia-guided eye was significantly thinner than the control eye over almost the entire circumference of the sclera (Fig. 3c).
  • Fig. 3c the sclera becomes thin and exhibits early symptoms of eye deformity that can cause various posterior ocular diseases.
  • GSK2656157 GSK
  • GSK2606414 were used as PERK inhibitors
  • Nelfinavir Mesyslate Hydrate (NFV) and Ceapin-A7 were used as ATF6 inhibitors
  • STF080312 STF and 4 ⁇ 8C were used as IRE1 inhibitors (FIG. 4).
  • FIGS. 5a and 5b show axial extension (a) and inflection (b) after instillation of 60 ⁇ M STF, 100 ⁇ M GSK, and 100 ⁇ M NFV once daily for 10 days during the period of myopia induction in mice. .. Further, in FIGS. 5-c and d, the combination of these inhibitors (STF + GSK: S + G, GSK + NFV: G + N, NFV + STF: N + S, STF + GSK + NTF: S + G + N) is similarly instilled into the axial extension (c) and the refractive change (c). d) is shown. In addition, FIG. 6 shows the axial extension (a) and the refractive change (b) after similarly instilling 100 ⁇ M GSK2606414, Ceapin-A7, and 4 ⁇ 8C, respectively.
  • the axial length is significantly suppressed only when at least two types of PERK inhibitor and ATF6 inhibitor are present (G + N, S + G + N), myopia of refraction is suppressed, and single instillation is performed. No axial extension of the control eye was observed (Fig. 5c, d). Furthermore, the changes in axial length and refraction due to single instillation of the inhibitors GSK2606414, Ceapin-A7, 4 ⁇ 8C, which are different from those in FIG. 5, are exactly the same as the results in FIG. 5, and neither axial elongation nor refraction myopia is suppressed. With single instillation other than 4 ⁇ 8C, it extended to the axis of the control eye (Fig. 6).
  • FIG. 7 shows changes in gene expression after daily intraperitoneal injection of 4-PBA throughout the period of myopia induction in mice.
  • FIG. 8 also shows the axial extension (a) and the refractive change (b) at the first and third weeks of myopia induction by 4-PBA administration.
  • FIG. 9 also shows the axial extension (b) and the refractive change (a) at the first week and the third week of myopia induction by TUDCA administration.
  • ⁇ Test Example 4 Collagen fiber narrowing inhibitory effect of 4-PBA in the sclera of myopia-induced mice>
  • the sclera is a tissue mainly composed of collagen, and it is said that the narrowing of collagen fibers is involved in the thinning of the sclera (see Non-Patent Document 5). Therefore, in this Test Example 4, when PBS was intraperitoneally injected daily throughout the period of myopia induction in mice, narrowing of collagen fibers was observed in the sclera of the myopia-induced eye, but 4-PBA was administered in the same manner. However, the narrowing of collagen fibers in this sclera was suppressed and the original thickness was restored (Fig. 10a).
  • 4-PBA (200 mg / kg body weight) was intraperitoneally administered for 1 week. One hour after the last dose, the eyeballs were removed and each tissue was separated. Tissues from 16 mice (32 eyes) were pooled into a single sample and cryopreserved in liquid nitrogen until measurement. Prior to measurement by LC-MS / MS, 9 times the weight of methanol / water (1: 1, v / v) was added for homogenization, centrifugation (10000 xg, 4 ° C., 5 minutes) and analysis of the supernatant. Used for.
  • MS mass spectrometry
  • ESI electrospray ionization
  • MRM multiple reaction monitoring
  • 4-PBA was detected not only in the retina and choroid but also in the sclera by intraperitoneal administration of 4-PBA.
  • Example 7-2 Effect on major collagen components in vitro> Collagen 1A1 whose expression is reduced by myopia induction in Test Example 7-1 when a UPR pathway-specific inhibitor is administered to primary human scleral fibroblasts treated with tunicamycin, which can activate the same UPR pathway as myopia induction.
  • the effect on (COL1A1) and the like was confirmed.
  • the specific test method is as follows.
  • scleral fibroblasts (huScF) (Lifeline Cell Technology, USA) were grown in FibroLifeS2 fibroblast medium (Lifeline Cell Technology). After treating these cells with tunicamycin 200 ng / mL for 6 hours, STF (IER1 inhibitor), GSK (PERK inhibitor), and NFV (ATF6 inhibitor) were administered as DMSO or UPR gene inhibitors to collect proteins. , Western brotting was done.
  • FIGS. 13 (D) and 13 (E) show the results in FIG.
  • tunicamycin treatment reduced collagen 1A1 (COL1A1) protein and mRNA.
  • the mRNAs of Col4a3, Col8a2, Col11a2, and Col15a1 were upregulated by treatment with tunicamycin. This result was consistent with the expression profile of the myopia-induced eye in the scleral tissue of Test Example 7-2.
  • two components, GSK and NFV were administered (inhibiting PERK and ATF6), the decrease in collagen 1A1 protein induced by tunicamycin was canceled, and a strong increase in collagen expression was observed.
  • Example 8 Involvement of ATF6 pathway in the treatment of scleral thinning and its associated posterior ocular disease> The extent to which the ATF6 pathway, of the PERK and ATF6 pathways, is involved in the treatment of scleral thinning and its associated posterior ocular disease was further investigated. Concentration measurement analysis by Western blotting was performed according to the above description of [Experimental method], and the amount of ATF6 activated form (ATF6-N) and the amount of ATF6 precosor form (ATF6-P) were determined.
  • the method of instilling a single inhibitor of each of PERK, ATF6, and IRE1 in the sclera of a myopia-induced juvenile mouse, or the method of instilling an instillation using a combination of inhibitors, and the like are based on the description of Test Example 2.
  • the value obtained by dividing the amount of the activation form (ATF6-N) of ATF6 by the amount of the precosor form (ATF6-P) of ATF6 is shown in FIG. 14 as an index of activation.
  • the value obtained by dividing the amount of ATF6-N of ATF6 by the amount of ATF6-P of ATF6 showed significantly higher values in some groups.
  • the group showing the high value was consistent with the group showing the pathological axial elongation and the decrease in the refraction value shown in FIGS. 5c and 5d, respectively. That is, in the case of myopia (axial extension or decrease in refraction value) in an eye that has not been induced to myopia (non-LIM eye), ATF6 is always activated (ATF6-N is increased with respect to ATF6-P). When ATF6 was inactivated in the myopia-guided eye (LIM eye), it was shown that myopia was suppressed.
  • FIG. 15 (B) when 4-PBA was administered by eye drops, no thickening of the crystalline lens was observed in the -30D lens-mounted group. That is, it was shown that eye drops are suitable as a method for administering 4-PBA from the viewpoint of reachability to the target tissue.

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Abstract

【課題】強膜の菲薄化を抑制乃至治療する成分を探索するスクリーニング方法、及びその有効成分を含有することで、強膜の過度の菲薄化抑制を可能にし、その結果、強膜菲薄化に随伴する後眼部疾患を治療することができる点眼剤を提供する。 【解決手段】ＰＥＲＫ経路及び／又はＡＴＦ６経路を同時に抑制できる成分を有効成分として含有する点眼剤により上記課題を解決する。眼由来の細胞に候補物質を接触させる工程と、前記細胞における、強膜菲薄化への影響を指標して候補物質を選択する工程とを含む、ＰＥＲＫ経路及び／又はＡＴＦ６経路を同時に抑制できる成分のスクリーニング方法により上記課題を解決する。

Description

強膜菲薄化治療用点眼剤及び強膜菲薄化治療剤のスクリーニング方法
　本発明は、近視が進行している成人の眼に対して、眼球形状に影響を与える強膜菲薄化を抑制することで眼球形状を正常に維持し、強膜菲薄化に随伴する眼疾患を治療することが可能な有効成分を含有する強膜菲薄化治療用点眼剤、及びその強膜菲薄化治療剤のスクリーニング方法に関する。
　近視及び強度近視に関する最新の研究によれば、世界的に顕著な近視人口の増大が予想され、２０５０年には近視は約５０億人、強度近視は約１０憶人に上ると予想されている（非特許文献１を参照）。
　また、日本における幾つかの疫学調査の結果、－６Ｄ以上の強度近視の有病率は５％前後であり、また、一般住民を対象とした疫学研究である多治見スタディでは、強度近視によって惹起される近視性黄斑変性が失明原因の第３位となっている（非特許文献２を参照）。
　こうした強度近視によって、眼球の形状を維持するために決定的な役割を担っている強膜で菲薄化が生じることが知られており、この強膜菲薄化が様々な眼疾患を惹起することが知られている（非特許文献２を参照）。これらの強膜菲薄化随伴眼疾患を分類すると、近視性黄斑変性等の後眼部疾患、白内障、眼球運動障害が挙げられる。いずれの強膜菲薄化随伴眼疾患においても、一度損傷した視神経や水晶体を治療又は再生することは容易ではなく、これら疾患の根本原因である過剰な眼軸伸長に伴う強膜菲薄化（眼球の変形）を抑制することが根治療法になる。
　例えば、強膜菲薄化随伴眼疾患の一つである近視性脈絡膜新生血管（近視性ＣＮＶ）の場合、新生血管を抑制する既存薬としてアフリベルセプト及びラニビズマブが知られている。しかし、これらの抗体医薬においては、新生血管は抑制できるものの、強膜菲薄化治療効果はなく、また、脈絡膜が瘢痕化する等の予後不良が知られている。したがって、この疾患が重症化する前の早期の根本治療（後眼部への機械的圧力の軽減）が強く求められている。
国際公開ＷＯ２０１８／１６４１１３
Ｇｌｏｂａｌ　ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ　ｏｆ　ｍｙｏｐｉａ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ｍｙｏｐｉａ　ａｎｄ　ｔｅｍｐｏｒａｌ　ｔｒｅｎｄｓ　ｆｒｏｍ　２０００　ｔｈｒｏｕｇｈ　２０５０、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ１２３、Ｎｕｍｂｅｒ５、Ｍａｙ　２０１６． 増加する近視・強度近視、医学のあゆみ、Ｖｏｌ．２５３、Ｉｓｓｕｅ２、１５９－１６１、２０１５． 不二門尚、「日本眼科学会専門医制度生涯教育講座　総説５４　小児の近視の進行防止」、日眼会誌、１１７巻、４号、３９７頁～４０６頁（平成２５年４月１０日）． Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ　ｓｔａｐｈｙｌｏｍａ　ｉｎ　ｐａｈｔｏｌｏｇｉｃ　ｍｙｏｐｉａ、　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｒｅｔｉｎａｌ　ａｎｄ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、　７０（２０１９）９９－１００． Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗｏｒｓｅｎｉｎｇ　Ａｘｉａｌ　Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｙｏｐｉａ、　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ　２０２０：１４　８５３－８７３． Ｊｉａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ．ａｌ．，　Ａ　ｈｉｇｈｌｙ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｕｒｉｎｅ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｍｙｏｐｉａ．　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｒｅｐｏｒｔｓ　８，２０２６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１８－２０２７２－ｗ（２０１８）． Ｍｏｒｉ，Ｋ．，ｅｔ．ａｌ．，　Ｏｒａｌ　ｃｒｏｃｅｔｉｎ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ　ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ　ｓｈｉｆｔ　ａｎｄ　ａｘｉａｌ　ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｉｎ　ａ　ｍｕｒｉｎｅ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｌｅｎｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｍｙｏｐｉａ．　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｒｅｐｏｒｔｓ　９，２９５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１８－３６５７６－ｗ　（２０１９）．
　近年、強膜菲薄化（本明細書において、眼球の変形ともいう）に関する因子が明らかになってきた。本発明者らがこの因子群について鋭意研究した結果、ＵＰＲ（ｕｎｆｏｌｄｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ）遺伝子群が眼軸伸長に関与することが見出された（特許文献１を参照）。この因子群には、ＰＥＲＫ（ＰＫＲ－ｌｉｋｅ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ　ｋｉｎａｓｅ）、ＡＴＦ６（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　６）、ＩＲＥ１（Ｉｎｏｓｉｔｏｌ　ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ　１）の三つが知られているが、これらをどのように制御すれば強膜菲薄化を抑制乃至治療できるのかは不明であった。言い換えれば、この遺伝子群をどう制御するかは強膜菲薄化及び随伴眼疾患の治療戦略上きわめて決定的かつ困難であると考えられていた。
　本発明者らは、成人の強膜菲薄化（過剰な眼軸伸長）をシミュレートする試験系を検討し、マウスの近視誘導完了後の強膜菲薄化におけるメカニズムと、その強膜菲薄化治療に有効な成分を検討した。このような成分であれば、強膜菲薄化を抑制し、さらには強膜菲薄化に随伴する眼疾患を治療することができることが強く期待される。
　本発明の目的は、成人の強度近視によって惹起される強膜菲薄化を抑制できる成分を探索するスクリーニング方法を提供すること、また、そのスクリーニング方法により得られた有効成分により、強膜菲薄化及びその随伴眼疾患を治療できる点眼剤を提供することにある。
　すなわち、本発明は、
　［１］ＰＥＲＫ（ＰＫＲＫ－ｌｉｋｅ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ　ｋｉｎａｓｅ）経路及び／又はＡＴＦ６（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　６）経路の阻害剤を有効成分として含有する、強膜菲薄化治療用点眼剤。
　［２］前記阻害剤が、フェニル酪酸及びその薬理学的に許容される塩からなる群より選択される少なくとも１種である、上記［１］に記載の点眼剤。
　［３］前記阻害剤が、フェニル酪酸ナトリウムである、上記［１］又は［２］に記載の点眼剤。
　［４］前記阻害剤の含有量が、点眼剤全量に対して、０．０１～５質量％である、上記［１］～［３］のいずれか１に記載の点眼剤。
　［５］前記強膜菲薄化治療が、強膜菲薄化によって惹起される後眼部疾患を治療するものである、上記［１］～［４］のいずれか１に記載の点眼剤。
　［６］前記後眼部疾患が、近視性黄斑変性、近視性網脈絡膜萎縮、近視性脈絡膜新生血管、又は、近視性視神経症である、上記［５］に記載の点眼剤。
　［７］眼由来の細胞に候補物質を接触させる工程と、前記細胞における、ＰＥＲＫ及び／又はＡＴＦ６のシグナル伝達系のタンパク質、及び／又は、遺伝子の変化を指標として候補物質を選択する工程とを含む、強膜菲薄化治療剤のスクリーニング方法。
　本発明によれば、強膜菲薄化を抑制できる成分を探索するスクリーニング方法を提供することができる。また、そのスクリーニング方法により得られた有効成分により、強膜菲薄化及びその随伴眼疾患を治療できる点眼剤を提供することができる。
マウスにおける近視誘導の説明図であって、（ａ）は近視誘導の模式的構造図であり、（ｂ）は近視誘導マウスの写真である。 近視誘導が強膜において眼軸伸長と屈折変化を誘発することを示すグラフであり、（ａ）はマウス（ｎ＝４）における近視誘導３週間の眼軸長の変化であり（＊ｐ＜０．０５）、（ｂ）はマウス（ｎ＝４）における近視誘導３週間の屈折の変化（＊ｐ＜０．０５）である。 近視誘導後の眼科学的及び細胞学的変化の説明図である。（ａ）は、対照眼及び近視誘導眼のヘマトキシリン及びエオジン染色であって、黄色の棒は強膜の厚さを示している（各群ｎ＝５、スケールバーは５０μｍである）。（ｂ）は、強膜厚の測定についての説明図であり、視神経乳頭の位置を「０」とし、視神経乳頭からの上方（＋）及び下方（－）の距離（４００μｍ、７００μｍ、１０００μｍ、１３００μｍ、１６００μｍ、１９００μｍ、２２００μｍ及び２５００μｍ）で強膜厚を測定した。（ｃ）は、その強膜厚測定結果のグラフである。 ＵＰＲ遺伝子であるＰＥＲＫ経路、ＡＴＦ６経路、ＩＲＥ１経路それぞれの各種阻害剤を示す説明図である。 マウスへのＰＥＲＫ経路、ＡＴＦ６経路、ＩＲＥ１経路の各種阻害剤の点眼による眼軸伸長及び屈折の変化（近視化）を示すグラフである。（ａ）は、ＳＴＦ０８０３１０（ＳＴＦ）、ＧＳＫ２６５６１５７（ＧＳＫ）及びネルフィナビル（ＮＦＶ）の単独点眼が眼軸伸長に及ぼす影響を示すグラフであり（各群ｎ＝５）、ＤＭＳＯ点眼ＮＬ（＝ｎｏ　ｌｅｎｓ）群と比較した結果（＊ｐ＜０．０５）と、ＳＴＦ点眼ＮＬ群又は－３０Ｄレンズ装着群と比較した結果（＃ｐ＜０．０５）である。（ｂ）は、ＳＴＦ、ＧＳＫ及びＮＦＶの単独点眼が屈折の近視化に及ぼす影響を示す結果であり（各群ｎ＝５）、ＤＭＳＯ点眼ＮＬ群と比較した結果（＊ｐ＜０．０５）と、ＳＴＦ点眼ＮＬ群又は－３０Ｄレンズ装着群と比較した結果（＃ｐ＜０．０５）である。（ｃ）は、ＳＴＦ、ＧＳＫ及びＮＦＶの併用点眼が眼軸伸長に及ぼす影響を示す結果であり（各群ｎ＝４）、ＤＭＳＯ点眼ＮＬ群と比較した結果（＊ｐ＜０．０５）である。（ｄ）は、ＳＴＦ、ＧＳＫ及びＮＦＶの併用点眼が屈折の近視化に及ぼす影響を示す結果であり（各群ｎ＝４）、ＤＭＳＯ点眼ＮＬ群と比較した結果（＊ｐ＜０．０５）である。 図５とは異なる阻害剤における、マウスへのＰＥＲＫ経路、ＡＴＦ６経路、ＩＲＥ１経路の各種阻害剤の点眼による眼軸伸長及び屈折の変化（近視化）を示すグラフである。（ａ）は、４μ８Ｃ、ＧＳＫ２６０６４１４及びＣｅａｐｉｎ－Ａ７の単独点眼が眼軸伸長に及ぼす影響を示すグラフであり（各群ｎ＝５）、ＤＭＳＯ点眼ＮＬ（＝ｎｏ　ｌｅｎｓ）群と比較した結果（＊ｐ＜０．０５）と、４μ８Ｃ点眼ＮＬ群又は－３０Ｄレンズ装着群と比較した結果（＃ｐ＜０．０５）である。（ｂ）は、４μ８Ｃ、ＧＳＫ２６０６４１４及びＣｅａｐｉｎ－Ａ７の単独点眼が屈折の近視化に及ぼす影響を示す結果であり（各群ｎ＝５）、ＤＭＳＯ点眼ＮＬ群と比較した結果（＊ｐ＜０．０５）と、４μ８Ｃ点眼ＮＬ群又は－３０Ｄレンズ装着群と比較した結果（＃ｐ＜０．０５）である。 マウスにおける近視誘導が強膜におけるＵＰＲ遺伝子発現亢進を誘導するグラフであって、ＰＢＳの腹腔内注射（ＰＢＳ）及びフェニル酪酸ナトリウムの投与（４－ＰＢＡ；２００ｍｇ／ｋｇ／日）の強膜（各群ｎ＝６）においてＵＰＲ遺伝子の発現を定量的ＰＣＲにより測定し、コントロール眼（白色カラム）に対し近視誘導眼（灰色カラム）において遺伝子発現が亢進し、４－ＰＢＡによるその抑制を示す結果である（＊ｐ＜０．０５）。 マウスにおける近視誘導が眼軸伸長及び屈折の近視化を誘導するグラフであって、（ａ）は、眼軸伸長が近視誘導（ＬＩＭ）１週目及び３週目のフェニル酪酸の腹腔内注射（４－ＰＢＡ；２００ｍｇ／ｋｇ／日）により抑制されることを示す結果であり（各群ｎ＝６、＊ｐ＜０．０５）、（ｂ）は、屈折の近視化が近視誘導（ＬＩＭ）１週目及び３週目の４－ＰＢＡ投与により抑制されることを示す結果である（各群ｎ＝６、＊ｐ＜０．０５）。 マウスにおける近視誘導が眼軸伸長及び屈折の近視化を誘導するグラフであって、（ａ）は、屈折の近視化がタウロウルソデオキシコール酸の腹腔内注射（ＴＵＤＣＡ；１００ｍｇ／ｋｇ体重）により抑制されることを示すグラフであり（各群ｎ＝４、＊ｐ＜０．０５）、（ｂ）は、眼軸伸長がＴＵＤＣＡにより抑制されることを示すグラフである（各群ｎ＝４、＊ｐ＜０．０５）。 （ａ）は、レンズなし（ＮＬ）及び－３０Ｄレンズを装着したＣ５７ＢＬ６ＪマウスにＰＢＳ又は４－ＰＢＡを点眼した場合の、強膜コラーゲン線維の透過型電子顕微鏡像（生物学的に独立した３つのサンプルの代表的な画像）である。（ｂ）は、強膜コラーゲン線維面積（ｎ＝生物学的に独立した３サンプル）の結果である。線維面積は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて１つの強膜から得た５つの画像からを測定した。 ４－ＰＢＡ点眼が近視進行が終わった後の成人における近視化に有効であることの説明図であって、３週間の近視誘導（ＬＩＭ）期間が終了した後（成人の近視期間をシミュレート）に点眼する実験の計画を示す模式図である。 成人の近視期間に相当するマウスの近視誘導期間終了後に４－ＰＢＡを点眼した時の近視抑制効果であって、（ａ）は、ビヒクル（ｎ＝７）及び４－ＰＢＡ（ｎ＝５）点眼群における前処置（Ｐｒｅ－ｔｅａｔｍｅｎｔ）から１週（１ｗｋ）又は３週（３ｗｋ）の眼軸伸長結果であり、（ｂ）は、同様に点眼した時の屈折変化（ｎ＝５）である。 試験例７における、主要コラーゲン成分の減少に対する４－ＰＢＡ点眼あるいはＵＰＲ遺伝子阻害剤投与の影響を評価した結果である。 試験例８における、強膜菲薄化及びその随伴後眼部疾患の治療におけるＡＴＦ６経路の関与を評価したグラフである。 試験例９における、近視誘導による水晶体肥厚への投与形態の違いによる影響を示したグラフである。
　以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下の実施形態及び実験例に限定されず、本発明の要旨を包含する範囲で種々の変形例や応用例を含む。
　［強膜菲薄化治療用点眼剤］
　本発明に係る強膜菲薄化及びそれに随伴する眼疾患治療用点眼剤は、ＰＥＲＫ（ＰＫＲ－ｌｉｋｅ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ　ｋｉｎａｓｅ）経路及びＡＴＦ６（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　６）経路の阻害剤を有効成分として含有する。
　（強膜菲薄化治療剤）
　上述のとおり、過度の眼軸伸長が強膜の菲薄化（眼球の変形）を引き起こし、強膜菲薄化及び随伴眼疾患の惹起及び／又は増悪に関与している。後述の実験例で示すように、近視誘導マウスモデルにおいて、眼球の変形の原因となる強膜菲薄化が惹起されていることが確認され、そのメカニズムはＵＰＲ遺伝子群の特定の遺伝子の発現亢進であり、その結果、強膜におけるコラーゲン線維の狭細化が惹起され、強膜菲薄化に至ることが示唆された。よって、強膜の菲薄化に対して抑制効果を有する物質が有効成分となり得る。
　すなわち、強膜の菲薄化に関与する遺伝子、及び／又は、タンパク質を標的とし、これらを抑制する化合物や、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等の核酸等を、強膜菲薄化及び随伴眼疾患の治療に有効な成分として点眼剤に配合し得る。
　本明細書において、ＰＥＲＫ経路及びＡＴＦ６経路の阻害剤とは、ＰＥＲＫのシグナル伝達系（ＰＥＲＫ経路）、及び、ＡＴＦ６のシグナル伝達系（ＡＴＦ６経路）のいずれに対しても阻害効果を有する物質をいう。これらのシグナル伝達系への阻害効果は、後述の実施例のように、公知の方法によって、これらのシグナル伝達系に関与する遺伝子、及び／又は、タンパク質の変化を指標として評価することができる。
　（ＰＥＲＫ経路及び／又はＡＴＦ６経路の阻害剤）
　上述のとおり、強膜菲薄化（病的眼軸伸長）に関する因子として、小胞体中の異常蛋白質である折りたたみ不全蛋白質に応答する遺伝子経路が病的眼軸伸長に関与している。この遺伝子経路には、ＰＥＲＫ経路、ＡＴＦ６経路及びＩＲＥ１経路の三つが知られているが、後述の実験例に示すように、少なくともＡＴＦ６経路を抑制することが近視抑制に必須であることが新たに見出された。また、これら三つの経路のうち、ＰＥＲＫ経路とＡＴＦ６経路とを抑制することで近視進行抑制効果が更に高まることが新たに見出された。ＰＥＲＫ経路又はＡＴＦ６経路のいずれかのみを抑制した場合には、他方の経路を代償的に活性化してしまう場合があることも確認された。よって、限定はされないが、一つの実施形態においては、ＰＥＲＫ経路とＡＴＦ６経路のいずれに対しても阻害効果を有する物質が病的眼軸伸長（強膜菲薄化）抑制の有効成分となり得る。
　すなわち、ＰＥＲＫ及び／又はＡＴＦ６のシグナル伝達に関わる遺伝子やタンパク質を標的とし、これらを低減させる化合物や、ＰＥＲＫ経路及び／又はＡＴＦ６経路のタンパク質発現を低減させるアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等の核酸を、強膜菲薄化治療に有効な成分として点眼剤に配合し得る。
　本明細書において、ＰＥＲＫ経路又はＡＴＦ６経路の阻害剤とは、小胞体におけるＰＥＲＫのシグナル伝達系、又は、ＡＴＦ６のシグナル伝達系に対して阻害効果を有する物質をいう。これらのシグナル伝達系への阻害効果は、後述の実験例に記載の方法により、又は公知の方法によって、これらのシグナル伝達系に関与する遺伝子、及び／又は、タンパク質の変化を指標として評価することができる。
　ＰＥＲＫのシグナル伝達系に関わる因子の遺伝子発現、又は、タンパク質の発現を評価する場合、候補物質を添加しないコントロールと比較して、候補物質によりその因子の発現が少なくとも１％変動することにより評価することが可能である。
　また、ＡＴＦ６のシグナル伝達系に関わる因子の遺伝子発現、又は、タンパク質の発現を評価する場合、候補物質を添加しないコントロールと比較して、候補物質によりその因子の発現が少なくとも１％変動することにより評価することが可能である。
　ＰＥＲＫは、小胞体膜貫通型キナーゼであり、そのシグナル伝達に関わる因子としては、例えば、ｅＩＦ２α（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　２α）、ＡＴＦ４（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　４）、ＣＨＯＰ（Ｃ／ＥＢＰ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＡＤＤ３４（ｇｒｏｗｔｈ　ａｒｒｅｓｔ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ｄａｍａｇｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　３４）等が挙げられる。
　また、ＡＴＦ６は、ＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリーに属する膜結合型転写因子であり、そのシグナル伝達に関わる因子としては、例えば、ＢｉＰ（Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ，「ＧＲＰ７８」とも称される）、Ｔｘｎｄｃ１２（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｄｏｍａｉｎ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　１２，「ＥＲｐ１８」とも称される）、Ｓ１Ｐ（ｓｉｔｅ－１　ｐｒｏｔｅａｓｅ）、Ｓ２Ｐ（ｓｉｔｅ－２　ｐｒｏｔｅａｓｅ）等が挙げられる。
　後述の実験例において、ＰＥＲＫ経路とＡＴＦ６経路の両方を抑制することができる成分をスクリーニングすることで、フェニル酪酸、タウロウルソデオキシコール酸及びその薬理学的に許容される塩からなる群より選択される少なくとも１種が見出されている。しかし、これらに限らず、新たに、少なくともＡＴＦ６経路を抑制する成分として特定される成分や、新たにＰＥＲＫ経路とＡＴＦ６経路とを抑制する成分として特定される成分も使用することができる。ＰＥＲＫ経路及びＡＴＦ６経路の阻害剤としては、限定はされないが、点眼剤における溶解性の観点から、フェニル酪酸ナトリウムが好ましい。後述の実験例に記載のとおり、フェニル酪酸ナトリウムであれば、ＡＴＦ６経路に加えて、ＰＥＲＫ経路も阻害することができるため、好ましい。ＰＥＲＫ経路及び／又はＡＴＦ６経路の阻害剤は、公知の方法により合成して使用してもよいし、市販品を入手して使用してもよい。
　本明細書において、「薬学的に許容できる塩」は、特に制限されないが、具体的には、有機酸塩、無機酸塩、有機塩基、又は無機塩基が挙げられる。有機酸塩としては、例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酪酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩等のモノカルボン酸塩；フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩等の多価カルボン酸塩；乳酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩等のオキシカルボン酸塩；メタンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、トシル酸塩等の有機スルホン酸塩が挙げられる。無機酸塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩が挙げられる。有機塩基との塩としては、例えば、メチルアミン、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モルホリン、ピペラジン、ピロリジン、トリピリジン、ピコリン、エチレンジアミン等の有機アミンとの塩が挙げられる。無機塩基との塩としては、例えば、アンモニウム塩；ナトリウム又はカリウム等アルカリ金属、カルシウム又はマグネシウム等のアルカリ土類金属、アルミニウム等の金属との塩等の各種の塩が挙げられる。これらの塩は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。「薬学的に許容される塩」には、塩の溶媒和物又は水和物を含んでいてもよい。
　ＰＥＲＫ経路及び／又はＡＴＦ６経路の阻害剤の含有量は、用法、用量、添加剤の種類等により適宜変更され得る。例えば、点眼剤全量に対して、０．０１質量％以上が好ましく、０．０５質量％以上がより好ましく、０．１質量％以上がさらに好ましく、０．２質量％以上が特に好ましい。また、ＰＥＲＫ経路及び／又はＡＴＦ６経路の阻害剤の含有量は、例えば、点眼剤全量に対して、５質量％以下が好ましく、４質量％以下がより好ましく、３質量％以下がさらに好ましく、２質量％以下が特に好ましい。また、ＰＥＲＫ経路及び／又はＡＴＦ６経路の阻害剤の含有量は、例えば、点眼剤全量に対して、０．０１～５質量％が好ましく、０．０５～４質量％がより好ましく、０．１～３質量％がさらに好ましく、０．２～２質量％が特に好ましい。
　強膜菲薄化治療剤として、フェニル酪酸及びその薬理学的に許容される塩からなる群より選択される少なくとも１種を用いる場合、その含有量は、例えば、点眼剤全量に対して、０．０１～５質量％が好ましく、０．０５～４質量％がより好ましく、０．１～３質量％がさらに好ましく、０．２～２質量％が特に好ましい。
　［用途］
　眼軸長は、出生後から２歳頃までに急速に伸長し、その後は徐々に伸長するようになる。このような成長に伴う眼軸伸長は、「生理的眼軸伸長」といい、眼の発達には不可欠な現象である。しかし、学童期以降においても眼軸長が伸長し続けることは、近視の進行に繋がるため、「病的眼軸伸長」であると考えられている。例えば、病的眼軸伸長では、成人の眼で１ｍｍ眼軸長が伸長することは、約３．０Ｄの近視度が増加することに繋がる。
　本発明に係る点眼剤は、強膜菲薄化及び随伴眼疾患の治療用として用いられる。本明細書において、強膜菲薄化随伴眼疾患とは、強度近視により器質的に眼軸長が過度に伸長することで惹起される疾患をいう。強度近視において、眼球の形を維持している強膜の菲薄化が、上記随伴眼疾患の初期症状だと言われている（非特許文献４を参照）。
　後述の実施例では、近視誘導マウスにおいて、近視誘導終了後の３週間でも継続して眼軸は伸長し、強膜の菲薄化が生じていた。すなわち、近視誘導終了後の病的眼軸伸長と強膜菲薄化は、小児の近視進行の後の成人期に相当する期間でも継続することが確認され、これが強膜菲薄化及び随伴眼疾患発症のメカニズムであることが示唆された。よって、強膜の菲薄化を、強膜厚、強膜におけるコラーゲン線維の太さ、あるいは、強膜におけるコラーゲン関連遺伝子・蛋白（ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ８Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ２、及びＣＯＬ１５Ａ１からなる群より選択される少なくとも１種）の発現等にて評価し、この菲薄化を抑制できる成分をスクリーニングすることにより、眼球の変形を抑え、強膜菲薄化及び随伴眼疾患の治療に利用できるものと考えられる。
　後述の実施例では、近視誘導マウスにおいて、近視誘導終了後にＰＥＲＫ経路及びＡＴＦ６経路が亢進しており、強膜の菲薄化の原因である眼軸伸長が生じていた。すなわち、近視誘導による病的眼軸伸長と強膜菲薄化は、小児の近視進行の後の成人期に相当する期間でも継続することが確認され、これが強膜菲薄化及び随伴眼疾患発症のメカニズムであることが示唆された。よって、強膜の菲薄化を、ＰＥＲＫ経路及びＡＴＦ６経路の同時亢進にて評価し、これらを抑制できる成分をスクリーニングすることにより、眼球の変形を抑え、強膜菲薄化及び随伴眼疾の治療に利用できるものと考えられる。
　強膜菲薄化随伴眼疾患としては、近視性黄斑変性、近視性網脈絡膜萎縮、近視性脈絡膜新生血管、近視性視神経症、近視性網膜症、網膜脈絡膜萎縮、黄斑部出血、近視性牽引黄斑症、近視性黄斑症、近視性黄斑部病変、近視性黄斑分離症、近視性屈折暗点、近視性コーヌス、近視性中心窩分離症、びまん性萎縮病変、限局性萎縮病変、Lacquer　cracks、後部ぶどう腫、網膜剥離、黄斑円孔、傾斜乳頭症候群、近視性乱視、固定内斜視、機械的外転制限、内斜視、強度近視性斜視、等の眼疾患が挙げられる。
　これらの強膜菲薄化随伴眼疾患のうち、強膜菲薄化（眼球の変形）と強い因果関係があるという観点から後眼部疾患が好ましく。さらに、明確かつ直接的な因果関係があるという観点から、近視性黄斑変性、近視性網脈絡膜萎縮、近視性脈絡膜新生血管、又は、近視性視神経症に対して、本発明が適用されることが好ましい。
　（剤形）
　本発明に係る組成物は、点眼剤として用いられる。本発明において、強膜菲薄化治療用点眼剤の剤形は、限定はされないが、例えば、水性点眼剤、用時溶解点眼剤、懸濁性点眼剤、油性点眼剤、眼軟膏剤等が挙げられる。これらの中でも、本発明の効果を顕著に奏する観点から、水性点眼剤であることが好ましい。
　点眼剤には、上述の成分に加えて、その他の有効成分（薬理活性成分、生理活性成分等）を配合することができる。このような成分の種類は特に制限されず、例えば、充血除去成分、眼筋調節薬成分、抗炎症薬成分、収斂薬成分、抗ヒスタミン薬成分、抗アレルギー薬成分、ビタミン類、アミノ酸類、抗菌薬成分、糖類、高分子化合物又はその誘導体、セルロース又はその誘導体、局所麻酔薬成分等が挙げられる。
　点眼剤には、さらに本発明の効果を損なわない範囲で、その用途や形態に応じて、常法に従い、様々な成分や添加物を適宜選択し、１種又は２種以上を併用して含有させることができる。それらの成分又は添加物として、例えば、液剤等の調製に一般的に使用される担体、香料又は清涼化剤、防腐剤、殺菌剤又は抗菌剤、ｐＨ調節剤、キレート剤、安定化剤、等張化剤、緩衝剤、粘稠化剤等の各種添加剤を挙げることができる。以下に、点眼剤に使用される代表的な成分を例示するが、これらに限定されない。
　担体としては、例えば、水、含水エタノール等の水性溶媒が挙げられる。なお、各種成分が水性溶媒に溶けにくい場合には、可溶化剤を用いてもよい。可溶化剤としては、例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポビドン、ポリソルベート８０等が挙げられる。
　香料又は清涼化剤としては、例えば、テルペン類（具体的には、アネトール、オイゲノール、カンフル、ゲラニオール、シネオール、ボルネオール、メントール、リモネン、リュウノウ等。これらはｄ体、ｌ体又はｄｌ体のいずれでもよい。）、精油（ウイキョウ油、クールミント油、ケイヒ油、スペアミント油、ハッカ水、ハッカ油、ペパーミント油、ベルガモット油、ユーカリ油、ローズ油等）等が挙げられる。
　防腐剤、殺菌剤又は抗菌剤としては、例えば、塩化ポリドロニウム、塩酸アルキルジアミノエチルグリシン、安息香酸ナトリウム、エタノール、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、クロロブタノール、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、硫酸オキシキノリン、フェネチルアルコール、ベンジルアルコール、ビグアニド化合物（具体的には、ポリヘキサメチレンビグアニド又はその塩酸塩等）、グローキル（ローディア社製の商品名）等が挙げられる。
　ｐＨ調節剤としては、例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、トリエタノールアミン、モノエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、硫酸、リン酸等が挙げられる。
　キレート剤としては、例えば、アスコルビン酸、エデト酸四ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸等が挙げられる。
　安定化剤としては、例えば、エデト酸ナトリウム水和物、ポビドン、ポリソルベート８０、ジブチルヒドロキシトルエン、トロメタモール、ナトリウムホルムアルデヒドスルホキシレート（ロンガリット）、トコフェロール、ピロ亜硫酸ナトリウム、モノエタノールアミン、モノステアリン酸アルミニウム、モノステアリン酸グリセリン等が挙げられる。
　等張化剤としては、例えば、塩化カリウム、塩化ナトリウム、濃グリセリン、ブドウ糖、Ｄ－マンニトール等が挙げられる。
　緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム水和物、酢酸ナトリウム水和物、炭酸水素ナトリウム、トロメタモール、ホウ酸、ホウ砂、リン酸水素ナトリウム水和物、リン酸二水素ナトリウム等が挙げられる。
　粘稠化剤としては、例えば、カルボキシビニルポリマー、ポビドン、ポリビニルアルコール（部分けん化物）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒプロメロース、メチルセルロース、グリセリン等が挙げられる。
　本発明に係る点眼剤において、添加剤は、本発明の効果を期待して、又は本発明の効果を阻害しない範囲内で配合することができる。その含有量は特に限定されないが、点眼剤全量に対して、０．００１～１質量％程度であることが好ましい。
　点眼剤のｐＨは、３～１０とすればよく、４～９が使用感の観点から好ましく、５～８．５が使用感の観点からより好ましい。
　本発明に係る点眼剤を収容する容器としては、公知の点眼容器を制限なく使用できる。点眼容器としては、通常、眼に点眼剤を滴下できる形状、例えばノズルを備え、ノズルの先に容器口を備える形状のものを使用することができる。また、点眼容器としては、容器にそれとは別成形されたノズルが装着されている構造のもの、及びノズル部（液の注出部）と容器本体とが一体成型された構造のもの（例えば、１回使い切りタイプの点眼容器等）のいずれであってもよい。
　点眼容器は、通常、プラスチック容器とすればよい。プラスチック容器の構成材料については、特に制限されないが、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリアリレート、ポリエチレンナフタレート、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイミドのいずれか１種、これらの共重合体、又はこれらの２種以上の混合体が挙げられる。特に押出の加減等で本発明の効果を発揮し易い点から、ポリエチレンテレフタレート、ポリアリレート、ポリエチレンナフタレート又はこれらの共重合体、又はこれらの２種以上の混合体が好ましい。
　点眼剤は、このような材料を主材料とする透明容器（異物を観察するのに差し支えない程度の透明性を備えた容器）に充填されてもよいし、遮光された容器に充填されてもよい。遮光は、例えば透明容器材料に着色剤を添加することにより行ってもよいし、容器をシュリンクフィルムや外箱等で覆うことにより遮光してもよい。また、容器の容量は、押出の加減等で本発明の効果をより一層発揮し易くするために、０．５～５０ｍＬ程度が好ましく、３～２０ｍＬ程度がより好ましい。
　また、点眼容器に備えられているノズルについても、その構造や構成材料については特に制限されるものではない。ノズルの構造については、点眼容器のノズルとして一般的に採用されている構造であればよい。また、ノズルの構成材料については、例えば、上記プラスチック容器の構成材料と同様のものが挙げられる。点眼剤の液切れを一層良好にさせ、滴下量のバラツキも抑えるという観点からは、ポリエチレン又はポリプロピレンを構成材料として含むノズルが好適である。ポリエチレンの種類としては、高密度ポリエチレン、低密度ポリエチレン等が挙げられるが、中でも低密度ポリエチレンを構成材料として含むノズルが好適である。
　（点眼剤の製造方法）
　本発明に係る点眼剤は、当業者に慣用又は公知の方法で調製できる。例えば、各成分を水等の担体に分散させた後、必要であれば可溶化剤を添加し、必要に応じて加温し、ホモミキサー等を用いて均一化、溶解又は乳化させ、ｐＨ調整剤でｐＨを調整することにより調製すればよい。また、製剤の滅菌方法としては、電子線滅菌、オートクレーブ滅菌、ろ過滅菌等の方法を選択することができる。
　（使用方法）
　本発明に係る点眼剤の用法及び用量は、患者の症状等により変動するが、通常、１日約１～６回、１回約１～２滴を点眼すればよい。
　本発明に係る点眼剤は、限定はされないが、強膜菲薄化治療剤として、フェニル酪酸及びその薬理学的に許容される塩からなる群より選択される少なくとも１種を含有させた点眼剤を用いる場合、例えば、点眼剤を１日１～２回、１回１～２滴で点眼することが可能であり、１日１回、１回１滴で点眼することが好ましい。
　また、本発明の効果を顕著に奏する観点から、本発明に係る点眼剤は、例えば、昼寝前、就寝前等の活動が活発でない時間帯に用いることが可能である。
　［強膜菲薄化治療剤のスクリーニング方法］
　本発明において、強膜菲薄化治療剤のスクリーニング方法は、眼由来の細胞に候補物質を接触させる工程と、前記細胞における、ＰＥＲＫ及び／又はＡＴＦ６のシグナル伝達系のタンパク質、及び／又は、遺伝子の変化を指標として候補物質を選択する工程とを含む。限定はされないが、例えば、候補物質の存在下又は不存在下で細胞に接触させ、候補物質によるＰＥＲＫ及び／又はＡＴＦ６のシグナル伝達系のタンパク質、及び／又は、遺伝子の変化を測定して比較することによって候補物質のスクリーニングが行われ得る。
　眼由来の細胞としては、限定はされないが、本発明の効果を顕著に奏する観点から、強膜における細胞であることが好ましい。
　限定はされないが、眼由来の細胞は、近視を誘導した動物モデルに由来する細胞であることが好ましい。このような近視誘導モデルとしては、公知の動物モデルを利用することが可能である。
　限定はされないが、近視誘導モデルとしては、マイナスレンズを装用させて近視を誘導した動物モデル、近視誘導剤を投与することにより近視誘導した動物モデル等が挙げられる。
　このようなマイナスレンズとしては－２０～－４０ディオプター（Ｄ）のものが利用でき、好ましくは－２５～－３５ディオプター（Ｄ）である。マイナスレンズの装用方法は、公知の方法を用いることができ、限定はされないが、動物の眼前に固定具を用いてマイナスレンズを固定すること等が挙げられる。
　マイナスレンズの装用期間は、例えば、少なくとも１週間とすることができ、２週間以上が好ましく、３週間以上がより好ましい。
　また、近視誘導剤としては、公知の物質を利用することが可能であるが、例えば、近視誘導剤として、ツニカマイシン、タプシガルギン等を用いることが可能である。また、近視誘導剤としては、ＰＥＲＫ経路の活性化剤や、ＡＴＦ６経路の活性化剤を組み合わせて用いることも可能である。ＰＥＲＫ経路の活性化剤としては、ＣＣＴ０２０３１２等が挙げられ、ＡＴＦ６経路の活性化剤としては、ＡＡ１４７等が挙げられ、これらを単剤投与、又は混合投与することが可能であり、これらを混合投与することが好ましい。
　このような近視誘導剤は、限定はされないが、強膜等の眼の細胞へ作用させる観点から、例えば、注射剤、又は、点眼剤として投与することが可能であり、点眼剤として投与することが好ましい。ツニカマイシンを点眼剤として用いる場合は、例えば、１０～１００μｇ／ｍＬとすることができ、２０～８０μｇ／ｍＬが好ましく、４０～６０μｇ／ｍＬがより好ましい。
　タプシガルギンを点眼剤として用いる場合は、例えば、１～１００μＭとすることができ、２～６０μＭが好ましく、５～３０μＭがより好ましい。
　近視誘導モデルを用いる場合、強膜菲薄化及び随伴眼疾患への適用を想定した動物モデルとする観点から、近視誘導完了後の動物を用いることが好ましい。限定はされないが、マウスである場合、マイナスレンズの装用開始時期は、離乳時期にすることが好ましく、３週齢マウスであることがより好ましい。Ｃ５７ＢＬ６等のマウスでは、３週齢から６週齢にかけて生理的眼軸伸長が生じる。よって、３週齢から近視を誘導することにより、生理的眼軸伸長に加えて、過剰な眼軸伸長を促進させることができるため、病的眼軸伸長を生じさせることが可能となる。
　また、候補物質の適用時期は、例えば、近視誘導中（３週齢～６週齢等）、及び／又は、近視誘導後（６週齢～８週齢等）が好ましい。強膜菲薄化によって後眼部障害が惹起される、ヒトで言う成人期に相当する期間に行う観点からは、候補物質の適用時期は、例えば、近視誘導後（６週齢～８週齢等）がより好ましい。限定はされないが、近視誘導後に候補物質を適用する手法によれば、候補物質が、小児期の近視進行が終わった後の残余した病的眼軸伸長、及び、強膜の菲薄化に与える影響を評価することが可能である。
　限定はされないが、候補物質を眼由来の細胞に接触させるステップは、当該候補物質を経口、腹腔内注射又は点眼により投与することが好ましく、点眼により投与することがより好ましい。例えば、強膜における細胞において評価する場合は、候補物質を点眼剤に含有させて投与することが可能である。
　候補物質によるＰＥＲＫ及び／又はＡＴＦ６のシグナル伝達系のタンパク質、及び／又は、遺伝子の変化を測定するステップでは、公知の評価方法を用いることが可能である。限定はされないが、遺伝子の発現やタンパク質の発現又は分泌は、マイクロアレイ、リアルタイムＰＣＲ法、ＰＣＲ法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、免疫組織染色等の公知の方法により測定することができる。
　例えば、ＰＥＲＫ又はＡＴＦ６のシグナル伝達系の遺伝子の変化を測定する場合、培養細胞から公知のＲＮＡ抽出方法を用いてＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡの発現を定量分析するステップに供することが可能である。
　ｍＲＮＡの発現を定量分析するステップは、限定はされないが、リアルタイムＰＣＲ法を用いることが好ましい。リアルタイムＰＣＲ法で測定するマーカーとしては、（ＰＥＲＫ経路及びＡＴＦ６経路の阻害剤）の項目で上述した、シグナル伝達に関わる因子を測定項目とすることが可能である。
　ＰＥＲＫ経路に関わる因子としては、例えば、ＣＨＯＰ、ＡＴＦ４、ＧＡＤＤ３４等が挙げられる。
　ＡＴＦ６経路に関わる因子としては、例えば、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４、ＰＤＩ、Ｃｎｅｘ、ＨＹＯＵ、ＥＲｄｊ３等が挙げられる。
　候補物質による強膜の菲薄化を測定するステップでは、公知の評価方法を用いることが可能である。限定はされないが、強膜厚により評価する場合、強膜組織をＨＥ染色等により染色し、顕微鏡等により組織観察及び分析を行うことにより、強膜厚を測定することが可能である。また、強膜厚をｉｎ　ｓｉｔｕで計測するには、光干渉断層計（ＯＣＴ）を用いることが可能であり、より高精度の強膜厚観察のため、スペクトラルドメイン（ＳＤ）－ＯＣＴやスウェプトソース（ＳＳ）－ＯＣＴを用いることもできる。
　また、限定はされないが、強膜におけるコラーゲン線維の太さ又は量により評価する場合、強膜におけるコラーゲン線維を電子顕微鏡等により組織観察及び分析を行うことにより、線維面積や線維断面における径を測定することが可能である。
　候補物質による強膜の菲薄化が抑制されている場合、当該候補物質を強膜菲薄化治療剤として選定し、強膜菲薄化治療剤として用いることが可能である。
　本発明は、以下の態様でもあり得る。
　ＰＥＲＫ（ＰＫＲＫ－ｌｉｋｅ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ　ｋｉｎａｓｅ）経路及び／又はＡＴＦ６（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　６）経路の阻害剤を有効成分として含有する、強膜菲薄化治療用点眼剤；
　強膜菲薄化治療における使用のための、ＰＥＲＫ経路及び／又はＡＴＦ６経路の阻害剤を有効成分として含有する点眼剤；
　ＰＥＲＫ経路及び／又はＡＴＦ６経路の阻害剤の、強膜菲薄化治療用点眼剤の製造のための使用；
　ＰＥＲＫ経路及び／又はＡＴＦ６経路の阻害剤を、人に有効量摂取させることを含む、強膜菲薄化治療方法；
　前記阻害剤が、少なくともＡＴＦ６経路を選択的に抑制することを含む、上記に記載の点眼剤、使用、又は方法；
　前記阻害剤が、ＰＥＲＫ経路及びＡＴＦ６経路の両経路の阻害剤である、上記に記載の点眼剤、使用、又は方法；
　前記阻害剤が、フェニル酪酸及びその薬理学的に許容される塩からなる群より選択される少なくとも１種である、上記に記載の点眼剤、使用、又は方法；
　前記阻害剤が、フェニル酪酸ナトリウムである、上記に記載の点眼剤、使用、又は方法；
　前記阻害剤の含有量が、点眼剤全量に対して、０．０１～５質量％である、上記に記載の点眼剤、使用、又は方法；
　前記阻害剤の含有量が、点眼剤全量に対して、０．１～３質量％である、上記に記載の点眼剤、使用、又は方法；
　前記阻害剤の含有量が、点眼剤全量に対して、０．２～２質量％である、上記に記載の点眼剤、使用、又は方法；
　前記強膜菲薄化治療が、生理的眼軸伸長を抑制しないものである、上記に記載の点眼剤、使用、又は方法；
　前記強膜菲薄化治療が、病的眼軸伸長を抑制するものである、上記に記載の点眼剤、使用、又は方法；
　前記強膜菲薄化治療が、強膜菲薄化随伴眼疾患の治療用として用いられる、上記に記載の点眼剤、使用、又は方法；
　前記強膜菲薄化随伴眼疾患が、近視性黄斑変性、近視性網脈絡膜萎縮、近視性脈絡膜新生血管、近視性視神経症、近視性網膜症、網膜脈絡膜萎縮、黄斑部出血、近視性牽引黄斑症、近視性黄斑症、近視性黄斑部病変、近視性黄斑分離症、近視性屈折暗点、近視性コーヌス、近視性中心窩分離症、びまん性萎縮病変、限局性萎縮病変、Lacquer　cracks、後部ぶどう腫、網膜剥離、黄斑円孔、傾斜乳頭症候群、近視性乱視、固定内斜視、機械的外転制限、内斜視、又は、強度近視性斜視である、上記に記載の点眼剤、使用、又は方法；
　前記強膜菲薄化随伴眼疾患が、近視性黄斑変性、近視性網脈絡膜萎縮、近視性脈絡膜新生血管、又は、近視性視神経症である、上記に記載の点眼剤、使用、又は方法；
　前記点眼剤が、水性点眼剤である、上記に記載の点眼剤、使用、又は方法；
　前記点眼剤が、１日１～２回の点眼で用いられるものである、上記に記載の点眼剤、使用、又は方法；
　前記点眼剤が、１日１～２回の点眼で用いられるものである、上記に記載の点眼剤、使用、又は方法；
　前記点眼剤が、昼寝前、又は、就寝前に用いられるものである、上記に記載の点眼剤、使用、又は方法；
　眼由来の細胞に候補物質を接触させる工程と、前記細胞における、ＰＥＲＫ及び／又はＡＴＦ６のシグナル伝達系のタンパク質、及び／又は、遺伝子の変化を指標として候補物質を選択する工程とを含む、強膜菲薄化治療剤のスクリーニング方法；
　前記眼由来の細胞が、近視を誘導した動物モデルに由来する細胞である、上記に記載のスクリーニング方法；
　前記動物モデルが、マイナスレンズを装用させて近視を誘導した動物モデル、又は、近視誘導剤を投与することにより近視誘導した動物モデルである、上記に記載のスクリーニング方法；
　前記マイナスレンズが、－２０～－４０ディオプター（Ｄ）のレンズである、上記に記載のスクリーニング方法；
　前記マイナスレンズの装用期間が、少なくとも１週間である、上記に記載のスクリーニング方法；
　前記近視誘導剤が、ツニカマイシン、及び／又は、タプシガルギンを含む、上記に記載のスクリーニング方法；
　前記ツニカマイシンの点眼投与の場合の濃度が、１０～１００μｇ／ｍＬである、上記に記載のスクリーニング方法；
　前記タプシガルギンの点眼投与の場合の濃度が、１～１００μＭである、上記に記載のスクリーニング方法；
　前記動物モデルが、離乳時期にマイナスレンズを装用開始するものである、上記に記載のスクリーニング方法；
　前記眼由来の細胞に候補物質を接触させる工程が、前記候補物質を経口、腹腔内注射又は点眼により投与することを含む、上記に記載のスクリーニング方法；
　候補物質によるＰＥＲＫ及び／又はＡＴＦ６のシグナル伝達系のタンパク質、及び／又は、遺伝子の発現が抑制されている場合、当該候補物質を強膜菲薄化治療剤として選択することを含む、上記に記載のスクリーニング方法；
　候補物質によるＰＥＲＫ及びＡＴＦ６のシグナル伝達系のタンパク質、及び／又は、遺伝子の発現が抑制されている場合、当該候補物質を強膜菲薄化治療剤として選択することを含む、上記に記載のスクリーニング方法；
　候補物質による強膜におけるコラーゲン関連タンパク質、及び／又は、遺伝子の発現を正常化されている場合、当該候補物質を強膜菲薄化治療剤として選択することを含む、上記に記載のスクリーニング方法；
　前記コラーゲン関連タンパク質、及び／又は、遺伝子が、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ８Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ２、及びＣＯＬ１５Ａ１からなる群より選択される少なくとも１種である、上記に記載のスクリーニング方法。
　以下に実験結果を挙げて本発明を具体的に説明する。
　［実験方法］
　本実験におけるすべての動物実験は、慶応義塾大学動物実験委員会の承認を受け、慶応義塾大学動物実験に関する施設ガイドライン、眼科・視覚研究における動物の使用に関するＡＲＶＯ声明、動物研究：研究における動物の使用に関するｉｎ　ｖｉｖｏ実験の報告（ＡＲＲＩＶＥ）ガイドラインを遵守した。
　（近視誘導マウスの特徴）
　非特許文献３に記載されているように、ヒトの眼は出生直後は遠視であり、その後に眼軸が伸長（つまり近視化）し、学童期（８歳ごろ）に正視化する。また、マウス（Ｃ５７ＢＬ６）の３から６週齢の期間も成長に伴い眼軸が伸長しており、この近視誘導期間の３～６週齢は、近視進行の動態という点でヒトの小児に相当し、近視誘導期間終後は実質成人期に相当する。この動物モデルを用いることで、ヒト成人の近視進行（強膜菲薄化）におけるメカニズム解明と、強膜菲薄化治療剤又はその随伴眼疾患治療剤のスクリーニングが可能である。
　マイナスレンズを装用させて軸性近視が誘導される機構を図１（ａ）に模式的に示した。正視は目に入ってくる平行光線が網膜上で像を結ぶことから、像がはっきりと見える状態をいう。一方、軸性近視は、眼軸長が長くなっているために目に入ってくる平行光線が網膜の手前で像を結ぶため、はっきりと見えない状態をいう。ヒトを含め、動物の眼は成長とともに大きくなる。幼若なマウスにマイナスレンズを装用させると、マイナスレンズを装用しているときに像を結ぶ位置、すなわちマイナスレンズ装用時にはっきりと見える状態まで眼軸が伸長する。その結果、眼軸が伸長し、軸性近視と同様の眼の状態を作り出すことができる。
　（近視誘導マウスの作製）
　具体的には以下のようにして近視誘導マウスを作製する。なお、近視誘導、眼軸長及び屈折の計測は非特許文献６，７と同様の方法で行った。まず、雄性Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスを、１２時間の明暗サイクル下で温度制御クリーンルームで標準透明ケージに収容した。動物には、標準飼料と高圧蒸気滅菌した水道水を自由摂取させた。離乳直後の３週齢のマウスをドミトール（日本全薬工業株式会社）、ベトルファール（Ｍｅｉｊｉ　Ｓｅｉｋａファルマ株式会社）、ミダゾラム（サンド株式会社）の３種混合麻酔で麻酔し、ハサミで頭蓋を露出させる。図１（ｂ）に示すように、頭蓋に支柱を立設し、歯科用セメント（Ｓｕｐｅｒ－Ｂｏｎｄ、サンメディカル株式会社）で固定する。支柱は、後述の調節器具をナットで固定できるようにねじ山が設けてある。
　近視を誘導するために－３０ジオプター（ｄｉｏｐｔｅｒ、Ｄ）のマイナスレンズ（レインボーコンタクト、株式会社レインボーオプチカル研究所）を右眼（近視誘導眼）に、コントロールとして０Ｄのレンズ、又はフレームのみを左眼（コントロール眼）に装着させる。レンズはマウスに装着させた際に、マウスが前脚等によって傷をつけないように、レンズ下部のフレーム部に側方に突出した形状のプロテクターが接着されている。プロテクターによって、マウスはレンズを触ることができず、レンズに傷がつくことがない。プロテクターはここではフレーム部に接着し一体となったものを使用しているが、マウスの行動によってレンズに傷がつかなければよく、レンズと一体になっている必要はない。例えば、外傷を負った動物が装用するエリザベスカラーのような形状のものであってもよい。
　レンズ上方のフレーム部には、マウスの成長に合わせて、装着したレンズの幅や角度を調節するための調節器具が接着されている。調節器具は「く」の字形状に折れ曲がっており、一方はレンズが接着されており、他方は頭部に立設された支柱に装着できるように長穴が設けられている。長穴を支柱に通し、ナットでネジ止めすることによってマウスの両目の周縁を圧迫することなく、皮膚に密着させ固定することができる。支柱、ナット、調節器具の３点からなる調節機構によって、マウスの成長に合わせて幅、角度を調節し、マウスの目の位置にレンズがくるように調整できる。また、レンズの取り外しが可能であることから、眼軸長、屈折値の経時的な変化を計測することが可能である。
　（眼軸伸長と屈折の計測）
　コントロール眼はフレームのみ、近視誘導眼は－３０Ｄレンズを３週間装用させ、屈折値、眼軸長を測定し、装用前後の差を求めた。屈折値は屈折計（Ｉｎｆｒａｒｅｄ　ｐｈｏｔｏｒｅｆｒａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｍｉｃｅ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ大学Ｓｃｈａｅｆｆｅｌ教授作製）、眼軸長はＳＤ－ＯＣＴ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ－ｄｏｍａｉｎ　ＯＣＴ、スペクトラルドメイン光干渉断層撮影、Ｅｎｖｉｓｕ　Ｒ４３１０、ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ　Ｉｎｃ．）によって計測した。
　（強膜試料の調製）
　実験的介入と眼パラメータ測定の後、眼球をＣ５７ＢＬ６Ｊマウスから摘出した。透過型電子顕微鏡観察のために、マウスの眼球を氷冷した２．５％グルタールアルデヒドのＰＢＳ中で１時間固定し、矢状面に沿って切断した。角膜と水晶体を摘出し、残りの組織をさらに２．５％グルタールアルデヒド／６０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で一晩固定した。標本を６０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄し、１％テトロキシドオスミウム／６０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液で２時間４℃でインキュベートし、エタノールシリーズを通して脱水し、交換し、Ｅｐｏｎ　８１２（ＥＭ　Ｊａｐａｎ、東京、日本）に包埋した。包埋後、ブロックを７０ｎｍで薄切し、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色した。区分をＪＥＭ－１４００Ｐｌｕｓ（ＪＥＯＬ　Ｌｔｄ．，東京、日本）で可視化した。
　凍結切片（マウス）を調製するために、眼球をＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ　Ｆｉｎｅｔｅｋ、東京、日本）で凍結した。冷凍ブロックは、クライオスタット（ＣＭ３０５０Ｓ；ライカ・バイオシステムズ、ウェッツラー、ジェルマス）を用いて５μｍの厚さで切断した。切片は使用まで－８０℃で保存した。
　パラフィン切片（マウス）の作製には、４％パラホルムアルデヒドで眼球を一晩固定し、パラフィンに包埋し、ミクロトーム（ＲＥＭ－７１０、Ｙａｍａｔｏ　Ｋｏｈｋｉ、埼玉、日本）により３μｍ切片にスライスした。次に、切片をヘマトキシリンとエオジンで染色し、ＢＸ５３顕微鏡（オリンパス、東京、日本）を用いて可視化した。強膜厚は、ｃｅｌｌＳｅｎｓソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて測定した。
　（被験薬の調製）
　フェニル酪酸ナトリウム(Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＭＩ、ＵＳＡ)及びタウロウルソデオキシコール酸（シグマ・アルドリッチ、東京、日本）は、ＰＢＳに溶解した。ＩＲＥ１阻害剤であるＳＴＦ０８０３１０（セレック・バイオテック、東京、日本）又は４μ８Ｃ（セルレック・バイオテック）、ＰＥＲＫ阻害剤であるＧＳＫ２６５６１５７（セルレック・バイオテック）又はＧＳＫ２６０６４１４（セルレック・バイオテック）、ＡＴＦ６阻害剤であるネルフィナビルメシステレイトハイドレート（東京化学工業、東京、日本）又はＣｅａｐｉｎ－Ａ７(シグマ・アルドリッチ)は、ＤＭＳＯで溶解し、１：１０００でＰＢＳにより希釈して点眼試験に用いた。
　（ＵＰＲ阻害剤の近視誘導中の点眼）
　６０μＭのＳＴＦ０８０３１２（ＳＴＦ）、１００μＭの４μ８Ｃ（４μ８Ｃ）、１００μＭのＧＳＫ２６５６１５７（ＧＳＫ）、１００μＭのＧＳＫ２６０６４１４（ＧＳＫ２６０６４１４）、１００μＭのネルフィナビルメシステレイトハイドレート（ＮＦＶ）、１００μＭのＣｅａｐｉｎ－Ａ７（Ｃｅａｐｉｎ）を、近視誘導中に、１０日間、毎日、１日１回、夕方、両眼に点眼した。
　（腹腔内注射）
　フェニル酪酸ナトリウムＰＢＳ溶液（４－ＰＢＡ；２００ｍｇ／ｋｇ体重）又はタウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ；１００ｍｇ／ｋｇ体重）を、近視誘導期間を通して、毎日腹腔内注射（ｉ．ｐ．）した。
　（フェニル酪酸ナトリウムの近視誘導期間終了後の点眼）
　２％のフェニル酪酸ナトリウムのＰＢＳ溶液（４－ＰＢＡ）を、近視誘導マウスにおいて、ヒト成人期に相当する近視誘導期間が終了した後に、１０日間、毎日、１日１回、夕方、両眼に点眼した。なお、近視誘導期間（ＬＩＭ）とその期間終了後の投与スケジュールを図１１に模式的に示した。
　（ウエスタンブロット法での濃度測定分析）
　強膜のタンパク質（１０μｇ／ウェル）は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離され、ＰＶＤＦ膜（米国ＭＡ州、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移され、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ（東京、Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）でブロックされ、抗ＡＴＦ６（バイオアカデミア株式会社）、リン酸化－ＩＲＥ１（Ｓｅｒ７２４、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＬ）、ＩＲＥ１、リン酸化－ｅＩＦ２α、ｅＩＦ２α、及びβ－アクチン（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｊａｐａｎ、東京、日本）抗体と共に４℃で一晩インキュベートされた。膜を適切なＨＲＰ結合二次抗体とインキュベートし、ＥｚＷｅｓｔＬｕｍｉ　ｐｌｕｓ　（ＡＴＴＡ、東京日本）を用いて可視化した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは１０％アクリルアミドゲルで蛋白サイズマーカー（ＭａｇｉｃＭａｒｋ　ＸＰ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔａｎｄａｒｄ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて濃度測定分析を行った。
　（定量的ＰＣＲ）
　定量的ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲは、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステムを用いてＰｏｗｅｒＵｐ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）で行った。発現レベルは、β－アクチンにより標準化した。
　（統計解析）
　実験で得たデータは、すべて平均値±標準偏差で表す。群間差は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定又は一元配置分散分析又は一般化推定方程式により解析した。ＡＮＯＶＡが有意差を示した場合、次にＴｕｋｅｙ　ＨＳＤを行い、各平均値間の差の有意性を判定した。ｐ値が０．０５未満の場合は、統計学的有意差を示す。
　［実験結果］
　＜試験例１　近視誘導マウスの近視誘導後の強膜の菲薄化＞
　強度近視において、眼球形状を維持している強膜の菲薄化が、眼球変形の初期症状だと言われている（非特許文献４を参照）。そこで、近視誘導マウスの強膜でも菲薄化が発生していることを確認するために、近視誘導後の強膜の組織学的評価を実施した。
　上記の試験方法にしたがって、近視誘導マウスにおいて近視誘導した後の眼軸伸長と屈折変化を評価した（図２）。また、近視誘導後の眼球を摘出し、ヘマトキシリンとエオジン染色し強膜厚を観察した（図３ａ、ｂ）。また、染色組織において神経乳頭（ｄｉｓｋ）からの距離別の強膜厚をグラフ化した（図３ｃ）。
　その結果、コントロール眼に対して近視誘導眼は強膜のほぼ全周にわたって有意に菲薄化していた（図３ｃ）。これらの結果にあるように、近視により眼軸が病的に伸長すると、強膜が菲薄化し、様々な後眼部疾患の原因になり得る眼球の変形の初期症状を呈することが確認された。
　＜試験例２　近視誘導マウスのＵＰＲ遺伝子の抑制による眼軸伸長＞
　強度近視において、ＵＰＲ遺伝子経路発現亢進が病的眼軸伸長及び強膜菲薄化の原因だと言われている（特許文献１）。そこで、この試験例２では、強膜菲薄化が生じた近視誘導マウスの強膜において、ＵＰＲ遺伝子の既知阻害剤によって眼軸伸長という表現型がどう影響を受けるかを評価した。なお、ＰＥＲＫ阻害剤としてＧＳＫ２６５６１５７（ＧＳＫ）、ＧＳＫ２６０６４１４、ＡＴＦ６阻害剤としてネルフィナビルメシステレイトハイドレート（ＮＦＶ）、Ｃｅａｐｉｎ－Ａ７、ＩＲＥ１阻害剤としてＳＴＦ０８０３１２（ＳＴＦ）、４μ８Ｃを用いた（図４）。
　前述の試験方法にしたがって、近視誘導マウスにおいて各種遺伝子阻害剤による眼軸伸長を評価した（図４）。
　図５ａ，ｂに、マウスの近視誘導期間に６０μＭのＳＴＦ、１００μＭのＧＳＫ、１００μＭのＮＦＶを、１０日間・毎日１回点眼した後の眼軸伸長（ａ）及び屈折変化（ｂ）を示した。また、図５－ｃ，ｄに、これら阻害剤の組合せ（ＳＴＦ＋ＧＳＫ：Ｓ＋Ｇ、ＧＳＫ＋ＮＦＶ：Ｇ＋Ｎ、ＮＦＶ＋ＳＴＦ：Ｎ＋Ｓ、ＳＴＦ＋ＧＳＫ＋ＮＴＦ：Ｓ＋Ｇ＋Ｎ）を、同様に点眼した後の眼軸伸長（ｃ）及び屈折変化（ｄ）を示した。また、図６に、各々１００μＭのＧＳＫ２６０６４１４、Ｃｅａｐｉｎ－Ａ７、４μ８Ｃを、同様に点眼した後の眼軸伸長（ａ）及び屈折変化（ｂ）を示した。
[規則91に基づく訂正 17.09.2021]　
　その結果、近視誘導マウスの強膜において、ＵＰＲ遺伝子であるＰＥＲＫ、ＡＴＦ６、ＩＲＥ１の各々の阻害剤の単独点眼により、予想に反して眼軸伸長抑制も屈折の近視化の抑制も認められなかった（図５ａ、ｂ）。むしろ、ＳＴＦを除いた阻害剤単独の点眼により、近視誘導していないコントロール眼の眼軸がＤＭＳＯ点眼に比較して有意に伸長し屈折が近視化していた。また、これらを組み合わせて点眼すると、ＰＥＲＫ阻害剤とＡＴＦ６阻害剤の少なくとも２種が存在する時（Ｇ＋Ｎ、Ｓ＋Ｇ＋Ｎ）のみ眼軸長が有意に抑制され、屈折の近視化が抑制され、単独点眼で認められたコントロール眼の眼軸伸長も認められなかった（図５ｃ、ｄ）。さらに、図５とは異なる阻害剤ＧＳＫ２６０６４１４、Ｃｅａｐｉｎ－Ａ７、４μ８Ｃの単独点眼による眼軸長及び屈折の変化は、図５の結果と全く同様であり、眼軸伸長も屈折近視化も抑制されず、４μ８Ｃ以外の単独点眼ではコントロール眼の眼軸まで伸長していた（図６）。
　これらの結果から、ＵＰＲ遺伝子の内、少なくともＰＥＲＫとＡＴＦ６とを両方抑制した場合に眼軸伸長が抑制され、屈折の近視化が抑制されることが確認された。ＰＥＲＫ単独、ＡＴＦ６単独、ＰＥＲＫとＩＲＥ１、ＡＴＦ６とＩＲＥ１の抑制では、病的な眼軸伸長をもたらすことが確認された。このことは、ＰＥＲＫ経路とＡＴＦ６経路の抑制が眼軸伸長抑制には重要であるものの、片方だけの抑制では、もう一方が代償的に亢進してトータルでは眼軸伸長抑制できないものと考えられ、ＰＥＲＫ経路とＡＴＦ６経路の両方の抑制が強膜菲薄化の抑制に必須であると考えられた。さらに言えば、強膜菲薄化治療剤を探索するには、少なくともＰＥＲＫ経路とＡＴＦ６経路を両方抑制できる成分を探索する必要があることが新たに見出された。さらに、異なる阻害剤を用いても同じ結果となることから、強膜菲薄化の抑制にＰＥＲＫ経路とＡＴＦ６経路の同時阻害が有効であることは、特定の阻害剤に限定されるものではなく、普遍的なメカニズムであること言える。
　＜試験例３　近視誘導マウスの強膜における４－ＰＢＡのＵＰＲ遺伝子発現抑制効果＞
　試験例２において、強膜菲薄化治療剤探索には、少なくともＰＥＲＫ経路とＡＴＦ６経路とを両方抑制する成分を探索する必要があることが確認されたので、この試験例３では、既に眼軸伸長を抑制することが知られている成分（フェニル酪酸ナトリウム｛４－ＰＢＡ｝、タウロウルソデオキシコール酸｛ＴＵＤＣＡ｝）について、ＵＰＲ遺伝子の抑制プロファイルを評価した。
　図７に、４－ＰＢＡをマウスの近視誘導期間を通して毎日腹腔内注射した後の遺伝子発現変化を示した。図８に、同様に４－ＰＢＡ投与による近視誘導１週目と３週目の眼軸伸長（ａ）と屈折変化（ｂ）を示した。また、図９に、同様にＴＵＤＣＡ投与による近視誘導１週目と３週目の眼軸伸長（ｂ）と屈折変化（ａ）を示した。
　その結果、近視誘導マウスにおいて亢進していたＰＥＲＫ経路とＡＴＦ６経路の下流（図４）にある遺伝子発現が、２％４－ＰＢＡ点眼により有意に抑制された（図７）。また、２％４－ＰＢＡ点眼１週目と３週目の眼軸伸長は同程度に有意に抑制され、屈折の近視化もまた同程度に有意に抑制された。また同時に近視誘導されなかったコントロール眼の眼軸伸長（生理的眼軸伸長）までは抑制せず、近視誘導眼の病的眼軸伸長のみを抑制した（図８）。また同様に、ＵＰＲ遺伝子抑制剤として知られているＴＵＤＣＡの投与でも４－ＰＢＡ同様に生理的眼軸伸長は抑制せず、病的眼軸伸長のみを抑制した（図９）。
　これらの結果から、４－ＰＢＡやＴＵＤＣＡはＵＰＲ遺伝子経路において、強膜菲薄化のメカニズムであるＰＥＲＫ経路とＡＴＦ６経路を抑制することで、病的眼軸伸長のみを抑制することが確認された。すなわち、４－ＰＢＡ、ＴＵＤＣＡ、ＰＥＲＫ阻害剤とＡＴＦ６阻害剤の組合せのように少なくともＰＥＲＫとＡＴＦ６の両方を抑制する成分は、強膜菲薄化及び随伴後眼部疾患を治療し得ることが示唆された。
　＜試験例４　近視誘導マウスの強膜における４－ＰＢＡのコラーゲン線維狭細化抑制効果＞
　強膜はコラーゲンを主とした組織であり、強膜菲薄化にはコラーゲン線維の狭細化が関与していると言われている（非特許文献５を参照）。そこで、この試験例４では、ＰＢＳをマウスの近視誘導期間を通して毎日腹腔内注射したところ、近視誘導眼の強膜においてコラーゲン線維の狭細化がみとめられたが、４－ＰＢＡを同様に投与したところ、この強膜におけるコラーゲン線維の狭細化が抑制され元の太さに戻っていた（図１０ａ）。そして、それらコラーゲン線維の太さ別の断面積を計算したところ、断面積８０００μｍ２以下の細いコラーゲン線維の総面積が近視化によって増加していた（ＰＢＳの－３０Ｄで細い線維が多い）が、２％４－ＰＢＡ点眼によりその面積プロファイルも元に戻っていた（図１０ｂ）。
　これらの結果より、近視により眼軸が病的に伸長することにより強膜が菲薄化することが確認された。そして、４－ＰＢＡ投与はこの強膜菲薄化を打ち消す効果を有することが確認された。
　＜試験例５　近視誘導マウスの強膜における近視誘導後の４－ＰＢＡの病的眼軸伸長抑制効果＞
　特許文献１にあるような小児の近視進行をシミュレートしたマウスモデルにおける近視誘導期間（３週齢～６週齢）の点眼とは異なり、近視誘導期間が終了した後（６週齢～８週齢）、すなわち強膜菲薄化によって後眼部障害が惹起されるヒトで言う成人期に相当する期間（図１１）における眼軸伸長を４－ＰＢＡ点眼が抑制するか否かを評価した。
　近視誘導が終了した後、２％４－ＰＢＡを毎日点眼し、１週目と３週目の眼軸伸長抑制を図１２ａに示し、屈折変化を図１２ｂに示した。
　その結果、近視誘導終了後の３週間でも継続して眼軸は伸長しており、いわゆる成人期の眼軸伸長を２％４－ＰＢＡ点眼が抑制する傾向が認められた（図１２ａ）。また、屈折も近視誘導終了後に近視化しており、同様に、２％４－ＰＢＡ点眼が抑制する傾向が認められた（図１２ｂ）。
　これらの結果から、小児の近視進行が終了した後の成人期においても近視の進行が残余しており、２％４－ＰＢＡはこの過度の眼軸伸長を抑制し、強膜菲薄化及び随伴後眼部疾患を治療できることが示唆された。
　試験例１～５の結果より、近視誘導マウスモデルにおいて、眼球の変形の原因となる強膜菲薄化が惹起されていることが確認され、それは強膜におけるコラーゲン線維の狭細化によるものであることが確認された。また、これらのメカニズムには、ＵＰＲ遺伝子群が関与しており、強膜菲薄化を抑制するためには、ＵＰＲ遺伝子の中でもＰＥＲＫ経路とＡＴＦ６経路を同時に抑制することが重要であると考えられた。これらの結果は、近視誘導マウスモデルが強膜菲薄化及び随伴後眼部疾患の治療剤探索のために有用な試験系であることを示している。
　また、強膜菲薄化を惹起する病的眼軸伸長は、小児の近視進行の後の成人期に相当する期間でも継続することが確認され、これが強膜菲薄化及びその随伴後眼部疾患のメカニズムであると考えられた。４－ＰＢＡは、小児期の近視進行のみならず、成人期の病的眼軸伸長をも抑制することが確認され、またそれだけではなく、近視誘導によって惹起されるコラーゲン線維の狭細化を元に戻す効果も有することが確認された。これらの結果は、４－ＰＢＡが強膜菲薄化及びその随伴後眼部疾患の治療剤として有用であることを示している。
　＜試験例６　４－ＰＢＡの薬物動態＞
　４－ＰＢＡの全身投与による、眼組織での薬物動態を確認した。具体的な試験方法は以下のとおりである。
　４－ＰＢＡ（２００ｍｇ／ｋｇ体重）を１週間、腹腔内投与した。最後の投与から１時間後、眼球を摘出し、各組織を分離した。１６匹のマウス（３２眼）からの組織をプールして一つのサンプルとし、測定まで液体窒素で凍結保存した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる測定前に、９倍の重量のメタノール／水（１：１、ｖ／ｖ）を添加して均質化し、遠心分離（１００００ｘｇ、４℃、５分）し、上澄みを分析に使用した。
　なお、標準試薬として４－フェニル酪酸（東京化成工業株式会社）、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（ＬＣ－２０ＡＤシステム：株式会社島津製作所、ＡＰＩ４０００：ＳＣＩＥＸ、東京、日本）、ＨＰＬＣカラム、Ａｔｌａｎｔｉｓ　ｄｃ１８（５μｍ、２．１ｍｍＩＤ×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を使用した。移動相はギ酸／水（１：１００００、ｖ／ｖ）とアセトニトリルとを用い、分析中、各移動相のグラジエントは５０％に保った。サンプル注入量は１０μＬ、カラム温度は５０℃、流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎとした。
　また、質量分析（ＭＳ）条件としては、ネガティブモードのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を用い、イオンはマルチプルリアクションモニタリング（ＭＲＭ）によって測定した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すとおり、４－ＰＢＡの腹腔内投与により、網膜や脈絡膜だけでなく強膜においても４－ＰＢＡが検出された。
　＜試験例７－１　主要なコラーゲン成分への影響　ｉｎ　ｖｉｖｏ＞
　近視誘導マウスモデルへ４－ＰＢＡを点眼投与し、眼球形状維持の主要コラーゲンであるコラーゲン１Ａ１（ＣＯＬ１Ａ１）等への影響を確認した。具体的な試験方法は以下のとおりである。
　近視誘導したマウスに、ＰＢＳ（Ｖｅｈ）、あるいは、２％４－ＰＢＡを点眼し、その強膜（ｎ＝７）におけるコラーゲン１Ａ１をウエスタンブロッティング法で、コラーゲン関連ｍＲＮＡ発現を定量的ＰＣＲで評価した。
　結果を図１３に示す。図１３（Ａ）及び図１３（Ｂ）に示すとおり、近視誘導眼の強膜においてコラーゲン１Ａ１（ＣＯＬ１Ａ１）タンパク質及びｍＲＮＡは減少した。一方で、４－ＰＢＡを点眼投与した場合、近視により誘導されたコラーゲン１Ａ１タンパク質及びｍＲＮＡの減少をキャンセルできることが見出された。また、同様にＣｏｌ４ａ３、Ｃｏｌ８ａ２、Ｃｏｌ１１ａ２、及びＣｏｌ１５ａ１のｍＲＮＡについても評価したところ、これらの遺伝子は近視誘導により発現亢進し、４－ＰＢＡの点眼投与によりその亢進がキャンセルされた（図１３（Ｃ））。これらの結果は、４－ＰＢＡの点眼投与が、近視によって惹起されるコラーゲンタンパク質群の発現異常を正常化することで強膜菲薄化を抑制し、その随伴後眼部疾患の治療剤・予防剤となり得ることを示している。
　＜試験例７－２　主要なコラーゲン成分への影響　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ＞
　近視誘導と同じＵＰＲ経路を活性化できるツニカマイシンで処理した初代ヒト強膜線維芽細胞において、ＵＰＲ各経路特異的な阻害剤を投与し、試験例７－１において近視誘導で発現が減少するコラーゲン１Ａ１（ＣＯＬ１Ａ１）等への影響を確認した。具体的な試験方法は以下のとおりである。
　初代ヒト強膜線維芽細胞（ｈｕＳｃＦ）（Ｌｉｆｅｌｉｎｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）をＦｉｂｒｏＬｉｆｅＳ２線維芽細胞培地（Ｌｉｆｅｌｉｎｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で増殖させた。この細胞をツニカマイシン２００ｎｇ／ｍＬで６時間処理した後、ＤＭＳＯ、あるいはＵＰＲ遺伝子阻害剤としてＳＴＦ（ＩＥＲ１阻害剤）、ＧＳＫ（ＰＥＲＫ阻害剤）、ＮＦＶ（ＡＴＦ６阻害剤）を投与し、タンパク質を収集し、ウエスタンブロッティングを行なった。
　結果を図１３に示す。図１３（Ｄ）及び図１３（Ｅ）に示すとおり、ツニカマイシン処理により、コラーゲン１Ａ１（ＣＯＬ１Ａ１）タンパク質及びｍＲＮＡは減少した。また、Ｃｏｌ４ａ３、Ｃｏｌ８ａ２、Ｃｏｌ１１ａ２、及びＣｏｌ１５ａ１のｍＲＮＡはツニカマイシン処理により発現亢進した。この結果は、試験例７－２の近視誘導眼の強膜組織での発現プロファイルと一致していた。また、ＧＳＫとＮＦＶの二成分を投与（ＰＥＲＫとＡＴＦ６を阻害）した場合、ツニカマイシンにより誘導されたコラーゲン１Ａ１タンパク質の減少がキャンセルされ、強いコラーゲン発現亢進が認められた。この結果は、次に述べる試験例８の近視誘導マウスにおいて、ＧＳＫ＋ＮＦＶの二成分を投与した場合の顕著な強膜菲薄化抑制の結果に一致するものであり、ＰＥＲＫ経路とＡＴＦ６経路の同時抑制がコラーゲン分泌正常化による強膜菲薄化抑制に極めて有効であることを示している。
　＜試験例８　強膜菲薄化及びその随伴後眼部疾患の治療におけるＡＴＦ６経路の関与＞
　強膜菲薄化及びその随伴後眼部疾患の治療において、ＰＥＲＫ経路とＡＴＦ６経路の両経路のうち、ＡＴＦ６経路がどの程度関与しているかをさらに検討した。上記［実験方法］の記載にしたがってウエスタンブロット法での濃度測定分析を行い、ＡＴＦ６の活性化ｆｏｒｍ（ＡＴＦ６－Ｎ）量、及び、ＡＴＦ６のｐｒｅｃｏｓｏｒ　ｆｏｒｍ（ＡＴＦ６－Ｐ）量を求めた。近視誘導幼若マウスの強膜における、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ６、ＩＲＥ１の各々の阻害剤の単独点眼方法、又は、阻害剤の組合せによる点眼方法等は、試験例２の記載に準じる。
　ＡＴＦ６の活性化ｆｏｒｍ（ＡＴＦ６－Ｎ）の量をＡＴＦ６のｐｒｅｃｏｓｏｒ　ｆｏｒｍ（ＡＴＦ６－Ｐ）の量で除した値を活性化の指標として、図１４に示した。
　図１４に示すとおり、ＡＴＦ６のＡＴＦ６－Ｎの量をＡＴＦ６のＡＴＦ６－Ｐの量で除した値はいくつかの群で有意に高い値を示した。高値を示した群は、図５ｃ及び図５ｄでそれぞれ示された病的眼軸伸長及び屈折値の低下が認められた群と一致していた。すなわち、近視誘導していない眼（非ＬＩＭ眼）において近視化（眼軸伸長あるいは屈折値低下）している場合は、必ずＡＴＦ６が活性化（ＡＴＦ６－ＮのＡＴＦ６－Ｐに対する増加）しており、近視誘導眼（ＬＩＭ眼）においてＡＴＦ６が不活化している場合は、近視化が抑制されていることが示された。この相関関係が、図５ｃ－ｄと図１４とを対比することにより示されるが、まとめると下記表２のとおりである。表２中の「ＳＴＦ」又は「Ｓ」はＩＲＥ１阻害剤を示し、「ＧＳＫ」又は「Ｇ」はＰＥＲＫ阻害剤を示し、「ＮＦＶ」又は「Ｎ」はＡＴＦ６阻害剤を示していることは、これまでの試験例と同様である。表２にまとめられた結果は、近視眼の強膜においてＡＴＦ６経路の活性化がトリガーとなって眼軸伸長に伴う強膜菲薄化が惹起されること、その逆に、ＡＴＦ６経路の不活化により眼軸伸長に伴う強膜菲薄化が抑制されることを示している。強膜菲薄化に随伴する後眼部疾患の治療には、この薬効・薬理を有する薬剤（４－ＰＢＡ）が有効である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　＜試験例９　近視誘導による水晶体肥厚への点眼剤投与の影響＞
　近視誘導（ＬＩＭ）により、水晶体が僅かに厚くなる傾向が確認されている。４－ＰＢＡの投与形態の違いによって、水晶体の変化に影響があるか否かを検討した。上記［実験方法］の記載にしたがって、近視誘導幼若マウスに４－ＰＢＡを点眼、又は、腹腔内投与し、眼軸長の計測と同様に、ＳＤ－ＯＣＴを用いて水晶体の厚さを計測した。
　図１５（Ａ）に示すとおり、ＤＭＳＯ点眼ＮＬ（＝ｎｏ　ｌｅｎｓ）群と比較して、－３０Ｄレンズ装着群では、近視誘導（ＬＩＭ）により、水晶体が厚くなることが確認された。４－ＰＢＡを腹腔内投与した場合は、水晶体の肥厚に影響を与えなかった。一方、図１５（Ｂ）に示すとおり、４－ＰＢＡを点眼にて投与した場合は、－３０Ｄレンズ装着群において水晶体の肥厚は認められなかった。すなわち、４－ＰＢＡの投与方法としては、ターゲット組織への到達性の観点で点眼が好適であることが示された。

Claims (7)

  1. 　ＰＥＲＫ（ＰＫＲＫ－ｌｉｋｅ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ　ｋｉｎａｓｅ）経路及び／又はＡＴＦ６（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　６）経路の阻害剤を有効成分として含有する、強膜菲薄化治療用点眼剤。
  2. 　前記阻害剤が、フェニル酪酸及びその薬理学的に許容される塩からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の点眼剤。
  3. 　前記阻害剤が、フェニル酪酸ナトリウムである、請求項１又は２に記載の点眼剤。
  4. 　前記阻害剤の含有量が、点眼剤全量に対して、０．０１～５質量％である、請求項１～３のいずれか１項に記載の点眼剤。
  5. 　前記強膜菲薄化治療が、強膜菲薄化によって惹起される後眼部疾患を治療するものである、請求項１～４のいずれか１項に記載の点眼剤。
  6. 　前記後眼部疾患が、近視性黄斑変性、近視性網脈絡膜萎縮、近視性脈絡膜新生血管、又は、近視性視神経症である、請求項５に記載の点眼剤。
  7. 　眼由来の細胞に候補物質を接触させる工程と、前記細胞における、ＰＥＲＫ及び／又はＡＴＦ６のシグナル伝達系のタンパク質、及び／又は、遺伝子の変化を指標として候補物質を選択する工程とを含む、強膜菲薄化治療剤のスクリーニング方法。
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