[go: up one dir, main page]

WO2022162131A1 - Compositions liposomales orales - Google Patents

Compositions liposomales orales Download PDF

Info

Publication number
WO2022162131A1
WO2022162131A1 PCT/EP2022/052020 EP2022052020W WO2022162131A1 WO 2022162131 A1 WO2022162131 A1 WO 2022162131A1 EP 2022052020 W EP2022052020 W EP 2022052020W WO 2022162131 A1 WO2022162131 A1 WO 2022162131A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
phosphatidylserine
phosphatidyl
choline
weight
liposome
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2022/052020
Other languages
English (en)
Inventor
Jean-Yves RENAULT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to EP22701404.0A priority Critical patent/EP4284332A1/fr
Priority to CA3204844A priority patent/CA3204844A1/fr
Priority to US18/263,248 priority patent/US20240108685A1/en
Priority to AU2022212571A priority patent/AU2022212571A1/en
Priority to JP2023546165A priority patent/JP2024504814A/ja
Priority to CN202280019481.3A priority patent/CN116981441A/zh
Publication of WO2022162131A1 publication Critical patent/WO2022162131A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/14—Peptides containing saccharide radicals; Derivatives thereof, e.g. bleomycin, phleomycin, muramylpeptides or vancomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to novel oral liposomal compositions and their uses.
  • the therapeutic effect of an administered substance is usually directly related to the amount and rate at which the substance reaches the bloodstream.
  • Oral administration of a therapeutic substance is the most common form of administration today due to convenience and ease of administration. Factors which influence the absorption, and therefore the ability of the substance to reach the bloodstream of an orally administered substance are related to the physico-chemical properties of the substance, the physiological factors of the gastrointestinal tract and the characteristics of the dosage form.
  • Conventional oral dosage forms consist of solutions, suspensions, powders, two-part gelatin capsules, soft gelatin capsules, tablets with or without coating.
  • the present invention relates to a liposomal composition which can be administered by the oral, nasal or pulmonary route comprising a negatively charged phospholipid, a zwitterionic phospholipid, a sterol, and one or more amphiphilic substance(s) of biological interest, preferably a lipophilic immunostimulant useful for treating and/or preventing any pathology involving the activation of monocytes and/or macrophages (innate immune system).
  • a liposomal composition which can be administered by the oral, nasal or pulmonary route comprising a negatively charged phospholipid, a zwitterionic phospholipid, a sterol, and one or more amphiphilic substance(s) of biological interest, preferably a lipophilic immunostimulant useful for treating and/or preventing any pathology involving the activation of monocytes and/or macrophages (innate immune system).
  • liposomal mifamurtide also known as liposomal MTP-PE (muramyl tripeptide phosphatidyl ethanolamine) and marketed as Mepact®.
  • Mepact® a liposomal MTP-PE (muramyl tripeptide phosphatidyl ethanolamine)
  • Mepact® a liposomal MTP-PE (muramyl tripeptide phosphatidyl ethanolamine) and marketed as Mepact®.
  • Mepact® marketed as Mepact®.
  • the mode of administration of this drug is very restrictive for the patient since it is administered once or twice a week, in the form of an intravenous infusion for 1 hour.
  • the treatment must be administered under medical supervision, therefore preferably in a hospital. This medication is indicated for the treatment of non-metastatic osteosarcoma.
  • liposomes generally refers to uni- or multi-lamellar lipid structures that can be loaded with therapeutic agents, e.g. the therapeutic agent is encapsulated inside the liposome, and/or the therapeutic agent can be attached in the liposome or incorporated into the lipid bilayer(s).
  • therapeutic agents e.g. the therapeutic agent is encapsulated inside the liposome, and/or the therapeutic agent can be attached in the liposome or incorporated into the lipid bilayer(s).
  • These liposomal formulations have been shown to have increased efficacy over the free drug.
  • a liposomal formulation comprising the vinca alkaloid vincristine has been shown to have greater efficacy against leukemic cells, compared to free vincristine, and to exhibit reduced overall toxicity.
  • liposomes Besides their ability to improve the therapeutic efficacy of encapsulated biologically active compounds, liposomes have important advantages such as reducing the effective dose of formulated biologically active substances compared to the use of the same free compounds.
  • the pharmaceutical issues associated with oral administration of liposomes are: 1) stomach pH, 2) bile salts, and 3) digestive enzymes, primarily lipases.
  • the unbuffered pH of the stomach can range from 1.5 to 2.5 and can cause chemical instability of the liposomal membrane surface.
  • Bile salts act as detergents and cause instability of the liposomal bilayer through emulsification.
  • polar head groups or acyl chains of phospholipids can be cleaved and thereby rupture the liposomal vesicle.
  • Degradation of liposomes should be avoided because drugs formulated as liposomes and administered orally must be absorbed as intact, undegraded liposomes into the general bloodstream in order to retain their pharmacological properties.
  • the degradation of the liposomes also leads to variability in the absorption of the active principle contained in the liposomes. This variability in the absorption of the active principle is a problem since the proportion of active principle absorbed after oral administration must be controlled and reasonably predictable.
  • the state of the art has not disclosed sufficiently stable liposomal formulations in the presence of bile salts and optionally in an acid and enzymatic medium simulating the gastrointestinal environment, to ensure effective treatment when a liposomal formulation containing one or more amphiphilic substance(s) of biological interest, preferably a lipophilic immunostimulant, is administered orally.
  • document WO2007014754 describes a composition consisting of one or more amphiphilic substance(s) of biological interest, preferably a lipophilic immunostimulant and a combination of phospholipids, in the presence of cholesterol, useful for the in vivo activation of the immune system.
  • This document specifically describes a composition containing MTP-PE (muramyl tripeptide phosphatidyl ethanolamine), and comprising 62.5% palmitoyl-oleoyl-phosphatidylcholine (POPC), 26.8% di-oleoyl-phosphatidylserine (DOPS) and 10, 7% cholesterol.
  • MTP-PE muramyl tripeptide phosphatidyl ethanolamine
  • POPC palmitoyl-oleoyl-phosphatidylcholine
  • DOPS di-oleoyl-phosphatidylserine
  • This document describes the preparation of tablets consisting of Avicel, polyvinylpyrollidone and lyophil
  • Another document describes the in vivo biological activity of the synthetic muramyl tripeptide, CGP 19835A, when encapsulated in phosphatidylcholine liposomes (POPC-19835A) and administered orally as an immunomodulator to mice.
  • the liposomes were rapidly absorbed in the intestine and reached the systemic circulation within 4 h.
  • Alveolar macrophages harvested from the lungs of mice 24 h after a single feeding of POPC-19835A were tumoricidal against murine renal cell carcinoma target cells (S. Tanguay et al., Cancer Res. 1994 Nov. 15;54 (22):5882-8)
  • liposomal compositions which can be administered orally, there is still a need for new liposomal compositions which can be administered orally, containing one or more amphiphilic substance(s) of biological interest, the stability of which is improved in the presence of bile salts.
  • a first object of the invention is to propose a new liposomal composition.
  • a second object of the invention is to provide a method for producing said liposomal composition.
  • another object of the invention is to provide pharmaceutical compositions and their uses.
  • a liposome comprising a negatively charged phospholipid, a zwitterionic phospholipid, a sterol in certain ranges in % by weight or by mole and one or more amphiphilic substance(s) of interest biological, preferably a lipophilic immunostimulant useful for the activation of the immune system, in particular the activation of cells of the monocyte or macrophage type, has an improved stability at acid pH and/or in the presence of bile salts.
  • the present invention thus relates more particularly to a liposomal composition useful for oral administration consisting of or comprising: a) one or more amphiphilic substance(s) of biological interest, preferably a lipophilic immunostimulant, even more preferably 0, 1 to 10% by weight of the lipophilic derivative of Muramyl di or tri peptide (MDP or MTP), relative to the total weight of the liposomal composition; b) a liposome consisting of or comprising: i) from 25% to 35% by weight or by mole of at least one negatively charged phospholipid with respect to the total weight or the total molar mass of the lipids of the liposome, ii) from 30% to 50% by weight or by mole of at least one zwitterionic phospholipid, based on the total weight or the total molar mass of the lipids of the liposome, iii) from 20% to 30% by weight or by mole of at least one sterol, relative to the total weight or the total molar mass of the
  • the molar % of constituents i) to iii) concern only the lipids of the liposome, considered as excipients, and do not take into account the lipid part of one or more amphiphilic substance(s) d biological interest, for example lipophilic immunostimulant.
  • the range of 25% to 35% of at least one negatively charged phospholipid means that the at least one negatively charged phospholipid is present in the liposome at a concentration by weight or mole of preferably 25%, 26%, 27%, 28 %, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, or 35%.
  • the range of 30% to 50% of at least one zwitterionic phospholipid means that the at least one zwitterionic phospholipid is present in the liposome at a concentration by weight or mole of 30%, 31%, 32%, 33%, 34 %, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, or 50% .
  • the range of 20% to 30% of at least one sterol means that the at least one sterol is present in the liposome at a concentration by weight or mole of 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, or 30%.
  • the present invention relates to a liposomal composition of which the liposome consists or comprises, relative to the lipid composition by weight or by total mole of the liposome: i) from 25% to 35% by weight or by mole of at least one negatively charged phospholipid with respect to the total weight or the total molar mass of the liposome lipids, preferably from 26% to 32%, more preferably 30%, ii) from 30% to 50% by weight or by mole of at least one zwitterionic phospholipid relative to the total weight or to the total molar mass of the lipids of the liposome, preferably from 30% to 40%, more preferably 40%, iii) from 20% to 30% by weight or by mole of at least one sterol relative to the total weight or to the total molar mass of the lipids of the liposome, preferably from 22% to 28%, more preferably 25%, or 30%, characterized in that the said liposomal composition is stable in presence of bile salts
  • a negatively charged phospholipid must be understood as a phospholipid possessing a negative charge at physiological pH.
  • phosphatidylserine contains a serine moiety esterified with phosphatidic acid. Due to a single charge on the phosphate group, PS is negatively charged at physiological pH.
  • Phosphatidylinositol (PI) and phosphatidylglycerol (PG) have, respectively, a glycerol group esterified with phosphoric acid or a sugar esterified with phosphoric acid; PI and PG are negatively charged at physiological pH.
  • the at least one negatively charged phospholipid is chosen from the group comprising phosphatidylinositol (PI), phosphatidylserine (PS), phosphatidylglycerol (PG), phosphaphatic acid (PA), diphosphatidylglycerol (DPG ) or cardiolipin (CL), their derivatives comprising one or more fatty acid residue(s), and mixtures thereof.
  • PI phosphatidylinositol
  • PS phosphatidylserine
  • PG phosphatidylglycerol
  • PA phosphaphatic acid
  • DPG diphosphatidylglycerol
  • CL cardiolipin
  • the at least one negatively charged phospholipid is phosphatidyl serine (PS) or a derivative of phosphatidyl serine chosen from the group comprising palmitoyloleoyl-phosphatidylserine (POPS), palmitoyl-linoeoyl phosphatidylserine (PLPS), palmitoyl -arachidonoyl-phosphatidylserine (PAPS), palmitoyl-docosa-hexaenoyl-phosphatidylserine (PDPS), stearoyl-oleoyl-phosphatidylserine (OSPS), stearoyl-linoleoyl-phosphatidylserine (GPPS), stearoyl-arachidonoyl-phosphatidylserine (SAPS), stearoyl-docosa-hexaidenoyls phosphatine SDPS), di-
  • PS palmito
  • the at least one negatively charged phospholipid is phosphatidylglycerol or a phosphatidylglycerol derivative chosen from the group comprising palmitoyloleoyl-phosphatidylglycerol, palmitoyl-linoleoyl phosphatidylglycerol, palmitoyl-arachidonoyl-phosphatidylglycerol, palmitoyl-docosahexaenoyl-phosphatidylglycerol, stearoyl -oleoyl-phosphatidylglycerol, stearoyl-linoleoyl-phosphatidylglycerol, stearoyl-arachidonoyl-phosphatidylglycerol, stearoyl- docosahexaenoyl-phosphatidylglycerol, di-capryl phosphatidylglycerol
  • a zwitterionic phospholipid must be understood as a neutral phospholipid at physiological pH.
  • phosphatidylcholine contains a choline moiety esterified to phosphatidic acid.
  • PC phosphatidylcholine
  • Phosphatidylethanolamine contains an ethanolamine group esterified with phosphatidic acid. Since PE has a similar structure to PC, it is also a neutral phospholipid at physiological pH.
  • the at least one zwitterionic phospholipid is chosen from the group comprising phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, their derivatives comprising one or more residue(s) of fatty acid(s), lecithin, lysolecithin, lysophatidyl-ethanolamine, phosphoglycerides, and mixtures thereof.
  • the at least one zwitterionic phospholipid is phosphatidylcholine or a derivative of phosphatidylcholine chosen from the group comprising di-arachidonoyl-phosphatidyl-choline (DAPC), di-elaidoyl-phosphatidyl-choline (DEPC) , dilauroyl-phosphatidyl-choline (DLaPC), di-linoleoyl-phosphatidyl-choline (DLPC), di-linolenoyl-phosphatidyl-choline (DLnPC), di-myristoyl-phosphatidyl-choline (DMPC), di- myristoleoyl phosphatidylcholine (DMoPC), dioleoyl phosphatidylcholine (DOPC), di-palmitoyl-phosphatidyl-choline (DPPC), dipentadecanoyl phosphatidyl-choline (DPe
  • DAPC di
  • the at least one zwitterionic phospholipid is phosphatidyl-ethanolamine or a derivative of phosphatidyl-ethanolamine chosen from the group comprising palmitoyl-oleoyl-phosphatidyl-ethanolamine, palmitoyllinoleoyl-phosphatidyl-ethanolamine, palmitoyl-arachidonoyl- phosphatidyl-ethanolamine, palmitoyl-docosahexaenoyl phosphatidyl-ethanolamine, stearoyl-oleoyl phosphatidyl-ethanolamine, stearoyl-linoleoyl-phosphatidyl-ethanolamine, stearoyl-arachidonoyl phosphatidyl-ethanolamine, stearoyl-docosahexaenoyl-phosphatidyl-ethanolamine, di-lauroyl phosphatidyl-ethanolamine, di-lauroyl phosphatidy
  • the at least one sterol is chosen from the group consisting of cholesterol, cholesterol derivatives such as cholesterol-phosphocholine, cholesterolpolyethyleneglycol and cholesterol-S04, cholesteryl esters, vitamin D, phytosterols , such as sitosterol, campesterol and stigmasterol and mixtures thereof, preferably cholesterol.
  • the present invention relates to a liposomal composition of which the liposome consists or comprises, with respect to the lipid composition by weight or in total mole of the liposome: i) from 25% to 35% of DOPS, preferably 25 %, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, or 35%, ii) from 30% to 50% of DSPC, DPPC, DMPC, or DLPC preferably 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, or 50%, iii) from 20% to 30% cholesterol, preferably 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, or 30% based on the total weight or the total molar mass of the liposome.
  • the present invention relates to a liposomal composition useful for oral administration consisting of or comprising: a) one or more amphiphilic substance(s) of biological interest, preferably a lipophilic immunostimulant, even more preferably from 0.1 to 10% by weight of the lipophilic derivative of muramyl di or tri peptide (MDP or MTP), relative to the total weight of the liposomal composition; b) a liposome consisting of or comprising:
  • said at least one negatively charged phospholipid is chosen from the group comprising phosphatidylserine (PS), or a derivative of phosphatidyl serine selected from the group comprising palmitoyl-oleoyl-phosphatidylserine (POPS), palmitoyl-linoleoyl-phosphatidylserine (PLPS), palmitoyl-arachidonoyl-phosphatidylserine (PAPS), palmitoyl-docosa-hexaenoyl-phosphatidylserine (PDPS), stearoyl-oleoyl-phosphatidylser
  • PS phosphatidylserine
  • POPS palmitoyl-oleoyl-phosphatidylserine
  • PLPS palmitoyl-linoleoyl-phosphatidylserine
  • PAPS palmitoyl-arachidonoyl-phosphati
  • the present invention relates to a liposomal composition useful for oral administration consisting of or comprising: a) one or more amphiphilic substance(s) of biological interest, preferably a lipophilic immunostimulant, even more preferably from 0.1 to 10% by weight of the lipophilic derivative of muramyl di or tri peptide (MDP or MTP), relative to the total weight of the liposomal composition; b) a liposome consisting of or comprising: i) from 25% to 35% by weight or by mole of di-oleoyl-phosphatidylserine (DOPS), preferably 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30% , 31%, 32%, 33%, 34%, or 35%, based on the total weight or the total molar mass of the liposome lipids, ii) from 30% to 50% by weight or by mole of at least a zwitterionic phospholipid, preferably 30%, 31%, 32%, 3
  • DOPS di-
  • the present invention relates to a liposomal composition useful for oral administration consisting of or comprising: a) one or more amphiphilic substance(s) of biological interest, preferably a lipophilic immunostimulant, even more preferably from 0.1 to 10% by weight of the lipophilic derivative of muramyl di or tri peptide (MDP or MTP), relative to the total weight of the liposomal composition; b) a liposome consisting of or comprising: i) from 25% to 35% by weight or by mole of di-oleoyl-phosphatidylserine (DOPS), preferably 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30% , 31%, 32%, 33%, 34%, or 35%, based on the total weight or the total molar mass of the liposome lipids, ii) from 30% to 50% by weight or by mole of at least a zwitterionic phospholipid, preferably 30%, 31%, 32%, 3
  • DOPS di-
  • the present invention relates to a liposomal composition useful for oral administration consisting of or comprising: a) one or more amphiphilic substance(s) of biological interest, preferably a lipophilic immunostimulant, even more preferably from 0.1 to 10% by weight of the lipophilic derivative of muramyl di or tri peptide (MDP or MTP), relative to the total weight of the liposomal composition; b) a liposome consisting of or comprising: i) from 25% to 35% by weight or by mole of di-oleoyl-phosphatidylserine (DOPS), preferably 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30% , 31%, 32%, 33%, 34%, or 35%, based on the total weight or the total molar mass of the liposome lipids, ii) from 30% to 50% by weight or by mole of DSPC, DPPC , DMPC, or DLPC, preferably DSPC and
  • DOPS di-
  • the present invention relates to a liposomal composition useful for oral administration consisting of or comprising: a) one or more amphiphilic substance(s) of biological interest, preferably a lipophilic immunostimulant, even more preferably from 0.1 to 10% by weight of the lipophilic derivative of muramyl di or tri peptide (MDP or MTP), relative to the total weight of the liposomal composition; b) a liposome consisting of or comprising: i) from 25% to 35% by weight or by mole of di-oleoyl-phosphatidylserine (DOPS), preferably 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30% , 31%, 32%, 33%, 34%, or 35%, based on the total weight or the total molar mass of the liposome lipids, ii) from 30% to 50% by weight or by mole of DSPC, DPPC , DMPC, or DLPC, preferably DSPC and
  • DOPS di-
  • the present invention relates to a liposomal composition of which the liposome consists or comprises, with respect to the lipid composition by weight or by total mole of the liposome: i) from 25% to 35% by weight or by mole of DOPS, ii) from 30% to 50% by weight or by mole of DSPC, DPPC, DMPC, or DLPC, preferably DSPC and even more preferably DMPC, iii) from 20% to 30% by weight or by mole of cholesterol.
  • the present invention relates to a liposomal composition of which the liposome consists of or comprises with respect to the total lipid composition by weight or by mole of the liposome: i) 30% DOPS, ii) 40% DSPC , DPPC, DMPC, or DLPC, preferably DSPC and even more preferably DMPC, iii) 30% cholesterol.
  • the liposomes of the liposomal composition are stable in the presence of bile salts, that is to say the lipid bilayer of the liposomes is not destructured.
  • the liposomes of the present liposomal composition are stable in the presence of bile salts for at least 1 hour, preferably 2 hours or 3 hours.
  • the liposomes of the present liposomal composition are stable in the presence of bile salts and are absorbed and transferred to the bloodstream.
  • the therapeutic efficacy of the liposomal compositions of the present invention, administered orally, is conditioned by the stability of said liposomal compositions in a medium comprising bile salts.
  • the therapeutic agent is a lipophilic immunostimulant useful for activating the immune system, for treating and/or preventing cancer, in particular osteosarcoma.
  • This activation of the immune system is obtained by absorption of the liposomal suspension by immunocompetent cells which are then activated after the binding of the immunostimulating amphiphilic substance to specific receptors.
  • This activation can also be obtained via an initial ex vivo activation step under specific immunocompetent cell culture conditions such as monocytes, macrophages or dendritic cells.
  • the therapeutic agent is a lipophilic immunostimulant belonging to the therapeutic subgroup ATC L03 of the WHO Anatomical, Therapeutic and Chemical Classification, for example interferon or an interferon derivative.
  • an amphiphilic substance of biological interest or at least one of the amphiphilic substances of biological interest according to the invention is a selected amphiphilic immunostimulant.
  • the amphiphilic immunostimulant is combined with amphiphilic peptides or with lipopeptide antigens.
  • the combination of an amphiphile immunostimulant and one or more amphiphile peptides or lipopeptide antigens is designed to also induce specific immune responses to the amphiphile peptides or lipopeptide antigens.
  • immunosens denotes all substances capable of triggering innate immune responses via receptors such as the TOLL and NOD receptors of monocytes, macrophages, dendritic cells, NK cells or polynuclear cells, in vitro or in vivo, and capable to be anchored, by its lipid part, in the lipid bilayers of a liposome.
  • amphiphilic immunostimulants are muramyl tripeptide phosphatidyl ethanolamine (MTP-PE), bis-(taurine)-L-glutaminyl-N-palmitoyl-S-[2-(R)-3-dilauroyloxypropyl]-L-cystine (JBT 3002), sitosterol, lipid A or other LPS derivatives or nucleotides rich in amphiphilic CpG motifs.
  • MTP-PE muramyl tripeptide phosphatidyl ethanolamine
  • JBT 3002 bis-(taurine)-L-glutaminyl-N-palmitoyl-S-[2-(R)-3-dilauroyloxypropyl]-L-cystine
  • sitosterol sitosterol
  • lipid A or other LPS derivatives or nucleotides rich in amphiphilic CpG motifs are examples of amphiphilic immunostimulants described above.
  • the amphiphilic immunostimulant is muramyl tripeptide phosphatidyl ethanolamine (MTP-PE).
  • Muramyl tripeptide phosphatidyl ethanolamine has been described as an adjuvant for studies of protection against tumor antigens or virus antigens (virus of herpes simplex or HIV-1).
  • MTP-PE has a stimulating effect on cell proliferation and is able to activate the cytotoxic abilities of monocytes.
  • the amphiphilic immunostimulant is bis-(taurine)-L-glutaminyl-N-palmitoyl-S-[2-(R)-3-dilauroyloxypropyl]-L-cystine ( JBT3002), a synthetic bacterial lipopeptide capable of activating macrophages and inducing the production of inflammatory cytokines (TNF-[alpha], IL-I, IL-6).
  • the amphiphilic immunostimulant is sitosterol.
  • sitosterol is meant sitosterol, as well as [omicron] eta-sitosterol, [omicron] eta-sitosterol glucoside.
  • the immunostimulatory capacity of 6eta-sitosterol (a phytosterol) has been demonstrated in vitro and in vivo.
  • [epsilon] eta-sitosterol is able to enhance T cell proliferation in the presence of phytohemagglutinin, stimulate NK cell activity and induce increased secretion of IL-2 and interferon gamma by lymphocytes.
  • amphiphilic immunostimulants described above can be associated with amphiphilic peptides or with lipopeptide antigens.
  • Said amphiphilic peptides or lipopeptide antigens are preferably formed by peptide chains of 8 to 16 amino acids (considered as immunogenic peptides), linked via the NH2 terminal group to an aliphatic and lipid chain of 5 to 30 carbons, more preferably 8 at 18 carbons.
  • the typical immunogenic peptides used are chosen from wild-type or modified peptide antigens having a high affinity for MHC class I and MHC class IL molecules.
  • Said peptides can be selected from the group consisting of peptides inducing CTL, peptides d tumor cell antigen or hepatitis antigen peptides. More preferably, the peptides are chosen from the group consisting of carcinoma solid tumor cell antigens (WO 0142270, US 6,602,510, WO 0145728 and US 07,976,301), melanoma antigens (US 5,662,907 and US 5,750 .395), hepatitis B or C antigens or other tumor antigens such as 5T4 breast cancer antigens (WO 03068816), Her2/neu antigens (US 2004/157780) or p53 antigens (WO 00141787).
  • carcinoma solid tumor cell antigens WO 0142270, US 6,602,510, WO 0145728 and US 07,976,301
  • melanoma antigens US 5,662,907 and US 5,750 .395
  • the therapeutic agent is a lipophilic immunostimulant derived from lipopolysaccharide (LPS).
  • LPS lipopolysaccharide
  • the therapeutic agent is a combination of several lipophilic immunostimulants.
  • the therapeutic agent is a lipophilic derivative of Muramyl di or tri peptide (MDP or MTP).
  • the lipophilic derivative of MTP corresponds to formula (I) or (II) in which R represents an -NH2 group, or a -NH-CO-Ri group where R represents a C8-C24 fatty acid residue or a linear or branched C1-C30 alkyl group, optionally comprising one or more double carbon-carbon bond, preferably a C5-C6 alkyl group, optionally having one or more carbon-carbon double bonds.
  • Ri is selected from a residue of caprylic acid (8:0), capric acid (10:0), lauric acid (12:0), myristic acid (14 :0) palmitic acid (16:0), stearic acid (18:0), arachidic acid (20:0), behenic acid (22:0), lignoceric acid (24: 0), cerotic acid (26:0), myristoleic acid (14:1), palmitoleic acid (16:l), sapienic acid (16:l), oleic acid (18: l), elaidic acid (18:1), trans-vaccenic acid (18:1), linoleic acid (18:2), linolelaic acid (18:2), a- linolenic acid (18:3), y-linolenic acid (18:3), dihomo-y-linolenic acid (20:3), arachidonic acid (20:4), eicosapentaenoic acid (20: 5), clupanod
  • the lipophilic immunostimulant is MTP-PE (mifamurtide).
  • MTP-PE mifamurtide
  • This muramyl tripeptide comprises phospholipid residues which allow the association of the hydrophobic part of the molecule with a lipid environment while the muramyl peptide part associates with the aqueous environment.
  • Muramyl tripeptide phosphatidyl ethanolamine has been described as an adjuvant for studies of protection against tumor antigens or viral antigens (Herpes simplex virus or HIV-1).
  • MTP-PE has a stimulating effect on cell proliferation and is able to activate the cytotoxic abilities of monocytes.
  • Mepact® Mifamurtide is marketed as Mepact® and is indicated in patients aged two to 30 years for the treatment of high-grade non-metastatic osteosarcoma (a type of bone cancer). Mepact® is used in combination with other anti-cancer medicines after surgical removal of cancer.
  • Mepact® After intravenous infusion of Mepact®, the liposomes are selectively taken over by macrophages, phagocytosed and progressively degraded in the cells.
  • Side effects seen with Mepact® are: anemia (low red blood cell count), loss of appetite, headache, dizziness, tachycardia (rapid heartbeat), high blood pressure ( high blood pressure), hypotension (low blood pressure), dyspnea (difficulty breathing), tachypnea (fast breathing), cough, vomiting, diarrhoea, constipation, abdominal pain (stomach ache), nausea, hyperhidrosis (excessive sweating), myalgia (muscle pain), arthralgia (pain in joints), back pain, pain in extremities (arms and legs), fever, chills, fatigue, hypothermia (low body temperature), general pain, malaise, asthenia (weakness) and pain in the chest.
  • anemia low red blood cell count
  • loss of appetite headache
  • Mepact® The antimetastatic properties of Mepact® have also been shown in clinical studies (Kleinerman et al. American Journal of Clinical Oncology 1995, 18(2): 93-9. Anderson et al. Pediatric Blood & Cancer 2014, 61(2 ): 238-44 ).
  • the Mepact® liposomal composition contains 0.4% (4 mg of mifamurtide).
  • the liposome consists of l-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) and 1,2- dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) according to the molar ratio 7 :3.
  • POPC l-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • DOPS 1,2- dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine
  • the present invention relates to a liposomal composition, the lipophilic immunostimulant of which consists of or comprises a concentration of 0.1 to 10% by weight of the lipophilic derivative of Muramyl di or tri peptide (MDP or MTP), preferably 0.4% or less by weight of MTP-PE.
  • MDP or MTP Muramyl di or tri peptide
  • the present invention relates to a liposomal composition, consisting of or comprising: a) from 0.1 to 1% by weight of the lipophilic derivative of Muramyl di or tri peptide (MDP or MTP), preferably 0, 4% or less by weight of MTP-PE, b) a liposome consisting of or which comprises with respect to the total lipid composition by weight or by mole of the liposome: i) from 25% to 35% of a phosphatidylserine, preferably DOPS , preferably from 26% to 32%, more preferably 30%, ii) from 30% to 50% of a phosphatidylcholine, preferably DSPC, DPPC, DMPC, or DLPC, preferably from 30% to 40%, more preferably 40%, iii) from 20% to 30% of at least one sterol, preferably cholesterol, preferably from 22% to 28%, more preferably 25%, or 30%.
  • MDP or MTP Muramyl di or tri peptide
  • the present invention relates to a liposomal composition, consisting of or comprising: a) from 0.1 to 10% by weight of the lipophilic derivative of Muramyl di or tri peptide (MDP or MTP), preferably 0, 4% or less by weight of MTP-PE, b) a liposome consisting of or which comprises with respect to the lipid composition by weight or in total mole of the liposome: i) 30% of DOPS, ii) 40% of DSPC, DPPC, DMPC, or DLPC, preferably DSPC and even more preferably DMPC, iii) 30% cholesterol.
  • MDP or MTP Muramyl di or tri peptide
  • the present invention relates to a liposomal composition for the preparation of a pharmaceutical composition intended for oral administration.
  • Oral administration means administration by ingestion of tablets, pills or capsules containing the powder according to the invention.
  • Oral administration also refers to administration of a suspension of the powder in a pharmaceutically acceptable aqueous solvent, for example in the form of a syrup or an oral suspension.
  • the present invention relates to a liposomal composition for the preparation of a pharmaceutical composition administered by the nasal route.
  • the present invention relates to a liposomal composition for the preparation of a pharmaceutical composition administered by the pulmonary route.
  • the present invention relates to a liposomal composition for its use in a method for activating the innate immune system, in particular the activation of cells of the monocyte or macrophage type.
  • a person skilled in the art understands that the activation of the immune system, in particular the activation of cells of the monocyte or macrophage type, makes it possible to treat cancers and in particular cancerous metastases.
  • the present liposomal composition is used for the treatment of patients suffering from cancer, preferably osteosarcoma, kidney cancer or cancer of the mammary gland.
  • the present liposomal composition is used for the treatment and/or the prevention of cancerous metastases, in particular pulmonary metastases.
  • the present invention also relates to a method for treating cancers or preventing cancer recurrences, in particular cancers of the bones, kidney or mammary gland and their metastases, in particular pulmonary, using a liposomal composition described above .
  • the liposomes of the present invention are prepared according to techniques known to those skilled in the art.
  • this preparation method is based on two separate solubilization steps, in which the lipids are solubilized in a water-miscible polar solvent (tertiary butanol hereafter also called t-butanol) or a mixture of chloroform and of methanol (in the proportions 5:1) (solution A) and the biologically active agent is dispersed in a physiologically compatible aqueous medium optionally containing a cryoprotectant (solution B). Solution A and solution B are then mixed together. Consequently, according to this method, the amphiphilic substance of biological interest is initially not present in the t-butanol phase but only in the aqueous medium.
  • a water-miscible polar solvent tertiary butanol hereafter also called t-butanol
  • solution B a mixture of chloroform and of methanol
  • solution B a physiologically compatible a
  • the lipids and the biologically active agent are directly mixed in a water-miscible polar solvent.
  • This process which comprises a dispersion step (followed by a lyophilization or atomization/drying step) of phospholipids, and of cholesterol, and of one or more amphiphilic substances of biological interest in an appropriate mixture of solvents, allows the production of a liposomal suspension.
  • the process for preparing the liposomal suspension comprises: a) a step of preparing a mixture of a lipophilic immunostimulant and a liposome consisting of or which comprises, relative to the lipid composition by weight or in total mole of the liposome: i) from 25% to 35% of at at least one negatively charged phospholipid, ii) from 30% to 50% of at least one zwitterionic phospholipid, iii) from 20% to 30% of at least one sterol, b) a step of dispersing said mixture in a miscible polar solvent at the water.
  • the polar solvent consists of t-butanol dihydrate and t-butanol or a mixture of chloroform/methanol in particular in a 5:1 ratio.
  • the polar solvent can also consist of a mixture of 60 to 100% t-butanol dihydrate and 0 to 40% t-butanol, preferably in a mixture of 75% to 100% (w / w) of t -butanol dihydrate and 0-25% (w/w) t-butanol.
  • the invention also relates to a method for preparing a powder according to the invention, comprising a step c) of atomizing/drying the liposomal suspension obtained in step b).
  • the liposomal suspension contains a hydrophilic excipient, preferably mannitol added before the atomization/drying step.
  • the liposomal suspension is extruded through a porous device and then passed through a nozzle.
  • a sufficiently small diameter nozzle restricts the flow of the suspension after it has been extruded through the porous device.
  • Useful nozzles for carrying out this step of the method of the invention are also generally known to those skilled in the art. They include, for example, rotating disc nozzles, impact jet nozzles, capillary nozzles, single orifice nozzles, vibrating or pulsating type ultrasonic nozzles, two-fluid nozzles such as nozzles two-fluid coaxial, etc.
  • the nozzle is an orifice nozzle.
  • the preferred pore size of the nozzle is between about 0.05 mm and about 1 mm, more preferably between about 0.1 mm and about 0.2 mm.
  • the nozzle can be included in a container suitable for dehydrating the liposome obtained, in particular suitable for dehydration by atomization or by atomization.
  • the flow rate of the suspension can be between about 1 ml/min and about 1000 ml/min. More typically, liposomes were prepared by the method of the invention applying a flow rate of 10 ml/min to 200 ml/min, and more preferably from about 20 ml/min to about 100 ml/min.
  • the pressure used for the extrusion of the liposomal suspension through the porous device and the passage pressure of the liposomal suspension through the nozzle can be substantially identical, in particular be between 0.5 bar and 1200 bar. More typically, liposomes can be prepared by the method of the invention at 5 bar to 600 bar, preferably from about 10 bar to about 500 bar, and more preferably from about 20 bar to about 150 bar.
  • the drying of the liposomes after the formation of droplets can be carried out by bringing the droplets into contact with a gas stream, preferably a heated gas stream, to obtain solid particles.
  • the gas stream used is an inert gas.
  • the drying gas may preferably be a low oxygen gas containing less than 0.1 vol. %, preferably less than 0.05 vol. % oxygen.
  • Inert gases increase the safety of a heated drying system.
  • nitrogen is used as the inert gas.
  • the inert gas protects the active ingredients and the excipients contained in the formulation.
  • the spray drying is carried out in a device suitable for spray drying.
  • Spray drying can for example be carried out in a drying tower.
  • the dehydrated liposomes are separated from the gas stream and collected.
  • the liposomal suspension optionally includes a hydrophilic excipient.
  • hydrophilic excipients can be monomers, oligomers or polymers and can be found among several chemical classes of compounds.
  • the hydrophilic excipient is a saccharide, e.g. a mono-, di-, oligo- or polysaccharide, sugar alcohol, amino acid, peptide, protein, water-soluble polymer or a combination thereof.
  • a saccharide, or carbohydrate is defined as a compound primarily composed of carbon, hydrogen, and oxygen.
  • Useful saccharides include sugars and sugar alcohols, oligosaccharides, water-soluble polysaccharides and their derivatives.
  • Preferred saccharides according to the invention include, but are not limited to, glucose, fructose, lactose, sucrose, trehalose, maltose, cellobiose, galactose, maltotriose, maltopentose, raffinose, dextrin, dextran, inulin, mannitol, sorbitol, xylitol, chitosan; water-soluble cellulose derivatives such as methylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxyethylcellulose and hypromellose; alginates, soluble starches or starch fractions, xanthan gum, guar gum, pectin, carrageenan, galactomannan, gellan gum, tragacanth gum, including any derivative thereof.
  • Particularly preferred saccharides are glucose and trehalose.
  • hydrophilic excipients can be chosen from other chemical classes, such as water-soluble amino acids, peptides or proteins.
  • glycine or other natural amino acids can be used.
  • Useful proteins include, but are not limited to, gelatin, albumin, whey protein, soy protein, or other food or plant proteins.
  • hydrophilic excipients are polymers such as water-soluble polymers such as solid polyethylene glycols, polyvinyl alcohol, polyacrylates or polyvinylpyrrolidone.
  • mixtures of more than one hydrophilic excipient can be used.
  • a first hydrophilic excipient can be chosen as the basic carrier material for the colloidal systems, while one or more additional hydrophilic excipients can be incorporated to obtain a certain pH and/or wettability.
  • the aqueous medium comprising the liposomal suspension can comprise other excipients or auxiliary, hydrophilic or water-soluble substances. These substances are soluble and extracted by the extraction medium or not, these substances can be included in the dry particles or eliminated with water and the organic solvent. The substances, which are included in the dry particles, must be pharmaceutically acceptable.
  • excipients include stabilizers, surfactants, wetting agents, bulking agents, lyophilization aids, antioxidants, chelating agents, preservatives, osmotic agents, acidic or alkaline excipients to adjust the pH, etc.
  • antioxidants can prevent the oxidation of an incorporated active compound, but also that of the components of the colloid, in particular if oxidation-sensitive lipids are used.
  • Useful compounds include, for example, fat-soluble antioxidants such as alpha, beta and gamma-tocopherol, ubiquinol, lycopene, alpha and beta-carotene, nordihydroguaiaretic acid, butyl hydroxyanisole, butyl hydroxytoluene, ethylenediamine tetraacetic acid, proa-etriamine pentaacetic acid, etc.
  • Alpha-tocopherol and ethylenediaminetetraacetic acid are particularly preferred, including their pharmaceutically acceptable derivatives.
  • no antioxidant may be necessary.
  • the invention also relates to a powder described above such as that prepared by a process comprising steps a-c), said powder consisting of or comprising a liposome consisting of or which comprises, relative to the lipid composition by weight or in total mole of the liposome : i) from 25% to 35% of at least one negatively charged phospholipid, ii) from 30% to 50% of at least one zwitterionic phospholipid, iii) from 20% to 30% of at least one sterol, v ) from 0.1 to 10% by weight of the lipophilic derivative of Muramyl di or tri peptide (MDP or MTP).
  • MDP Muramyl di or tri peptide
  • the invention also relates to a process for the preparation of liposomes with a size and size distribution suitable for oral administration.
  • the liposomes of the composition of the present invention can have a diameter comprised from 100 nm to 10 ⁇ m, preferably from 1 to 10 ⁇ m and more preferably from 2 to 5 ⁇ m.
  • the diameter of the liposomes can be controlled, for example, by extruding the liposomal composition through a polycarbonate filter having a known pore size. Methods for controlling the size of liposomes are well known in the art and are described, for example, in Mayhew et al. (1984) Biochem. Biophys. act.
  • a particle size distribution is characterized by the mean values (mean values): mean diameter number (NMD), mean volume diameter (VMD) and the polydispersity in size is generally characterized by the VMD / NMD ratio (poly dispersity index, IP).
  • a value of 1.00 or close to 1.00 means that all particles are the same size, the greater the deviation from 1.00, the higher the size polydispersity.
  • the particle size distribution can be determined by the NANOTRAC technique based on the analysis of the Brownian motion of the particles dispersed in a liquid by acquisition of the energy spectrum corresponding to the Doppier shift.
  • the MTUPA 250 - NANOTRAC 250 device equipped with a 780 nm laser, operates by laser scattering for particles of size from 0.8 to 6500 nm.
  • the liposomes obtained according to the present invention are characterized by a polydispersity of 1.00 to 1.20.
  • Liposomes dry particles or a powder comprising them, as obtained by the process of the invention, can be used in the manufacture of a medicament. If the particles meet all the requirements of a pharmaceutical dosage form, they can be used as such and introduced directly into suitable containers.
  • the powder containing the liposomes may contain residual water (0.1 to less than 5%), closely bound to the lipids, resulting from the process for preparing said powder.
  • the powder containing the liposomes can be mixed with other active and/or inactive ingredients such as pharmaceutically acceptable carriers.
  • the powder is micronized to an average size of between 1 and 5 micrometers, suitable for administration by inhalation.
  • the powder according to the invention is loaded into a dry spray device to deliver said powder in the form of an aerosol.
  • Said dry spraying device makes it possible to deposit said powder for example in the throat, on the tonsils, or advantageously directly in the pulmonary alveoli where the resident macrophages can be directly activated by the liposomal suspension formed in situ.
  • the invention also relates to a liposomal suspension, preferably multi-lamellar, obtained by bringing a powder according to the invention into contact with an aqueous medium.
  • the aqueous medium may be sterile water, optionally buffered to pH 7.0-7.5 and optionally containing preservatives or antioxidants.
  • the invention also relates to the use of a multi-lamellar liposomal powder or suspension according to the invention for the in vivo activation of the immune system.
  • This activation of the immune system is obtained by absorption of the liposomal suspension by immunocompetent cells which are then activated after the binding of the immunostimulating amphiphilic substance to specific receptors.
  • This activation can also be obtained via an initial ex vivo activation step under specific immunocompetent cell culture conditions such as monocytes, macrophages or dendritic cells.
  • the pharmaceutical composition according to the invention contains the powder present in a range of 50 mg to 2 g in a single application or unit.
  • the liposomes of the present invention are stable in the presence of bile salts.
  • the term "stable liposome in the presence of bile salts” means a liposome, dispersed in an aqueous medium, the lipid bilayer of which is not destructured by treatment with bile salts, preferably in the presence of taurocholate sodium, sodium deoxycholate and sodium cholate hydrate or their mixtures, preferably a mixture containing the three bile salts.
  • the liposome stability test is carried out in the presence of bile salts at a concentration of 2 to 10 mM each, preferably 4 mM.
  • the test is carried out at an ambient temperature of 20°C or 37°C.
  • the liposomes are brought into contact with the bile salts for at least 1 hour, preferably 2 hours or 3 hours.
  • Figure 1 shows a vial containing a liposome suspension before treatment with bile salts.
  • Figure 2 shows optical microscopy images of liposomes before filtration (image A) and after filtration at 5 ⁇ m (image B).
  • image A shows optical microscopy images of liposomes before filtration
  • image B shows optical microscopy images of liposomes before filtration
  • image B shows optical microscopy images of liposomes before filtration
  • the magnification is xl030.
  • Figure 3 shows the size distribution of the liposomes obtained by an automated image analysis method.
  • Figure 4 shows a light microscopy image of liposomes forming aggregates larger than 20 ⁇ m.
  • Figure 5 shows a vial containing a liposome suspension after treatment with bile salts. Observation of the vial shows that the liposomes are denatured and the suspension becomes transparent (Image A)
  • Figure 6 shows an optical microscope image of a suspension of denatured liposomes.
  • MTP-PE or mifamurtide, Sigma-Aldrich
  • VWR Chemicals methanol
  • ethanol ethanol
  • chloroform Sigma-Aldrich
  • dichloromethane Carlo Erba
  • acetonitrile VWR Chemicals
  • acetone Sigma-Aldrich
  • ethyl acetate Carlo Erba
  • tetrahydrofuran VWR Chemicals
  • dimethylsulfoxide Honey Well
  • trifluoroacetic acid VWR Chemicals
  • ammonium formate Fluka
  • 2-oleoyl-l-palmitoyl-sn-glycero-3 -phosphocholine or POPC Lipoid
  • l,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine or DOPS as the sodium salt
  • lipids and mifamurtide were dissolved in a mixture of chloroform and methanol (5:1), at a concentration of approximately 30 mg/mL, then concentrated by drying in a rotary evaporator (2 hours at 40°C) to form a lipid film.
  • the lipid film was then rehydrated in an aqueous saline solution (0.9% NaCl, 5 mL) at room temperature and with magnetic stirring.
  • the suspension obtained was then filtered 10 times through a 5 ⁇ m polycarbonate membrane with the aid of an Avanti Polar Mini-Extruder in order to obtain a liposomal suspension.
  • lipids containing 0.4% of MTP-PE (ie 1 mg of mifamurtide for 250 mg of lipids), were prepared using variable proportions of lipids (expressed in %).
  • the liposomal suspensions thus prepared were analyzed in three ways: 1.) by visual observation of the vials, 2.) by visual observation of the liposomes under an optical microscope and 3.) by measurement of the size distribution of the particles. (DTP), by an automated image analysis system. For this analysis, a 5 ⁇ L aliquot is placed between two microscope slides, and several fields are examined for the evaluation of the particle size distribution. Automated image analysis measures the size of approximately 30,000 liposomal particles for each suspension. Results: The method of preparation makes it possible to obtain translucent and slightly opaque liposomal suspensions, for example Figure 1 shows a bottle containing suspension No. 8.
  • Figure 2 shows optical microscopy images of the liposomes of suspension No. 8, before filtration (image A) and after filtration at 5 ⁇ m (image B).
  • the magnification is xl030.
  • image A shows a liposomal suspension obtained without any filtration.
  • the liposomes are heterogeneous, without a round shape, and have sizes which can exceed 50 ⁇ m.
  • Image B shows a liposomal suspension after a series of ten filtrations through a 5 ⁇ m filter membrane. In this case, the liposomes observed were much more homogeneous in terms of shape and sizes (less than 10 ⁇ m.)
  • Figure 3 gives a typical example of the particle size distribution obtained by the automated image analysis method.
  • the results of this analysis are characterized by the d10, d50 and d90 values which indicate the maximum size (in pm) reached by 10%, 50 and 90% of the liposomal particles, respectively, of each suspension analyzed.
  • the soluble fraction of MTP-PE (in free form or encapsulated in liposomes) was quantified in each preparation, after dilution of an aliquot in a mixture of solvent in order to allow its injection into a chromatography apparatus. Solution concentration was measured by HPLC. HPLC analysis conditions are summarized in Table 3.
  • Example 3 Effects of Bile Salts on the Stability of Liposomal MTP-PE Suspensions
  • Liposomal suspensions No. 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 and 15 described in 1 were exposed to a mixture of bile salts (sodium taurocholate, sodium deoxycholate and sodium cholate hydrate) at a concentration of 4 mM each, at 37° C. and for 3 hours. Stability was assessed using the methods outlined in Example 1, at T-Oh (immediately after exposure to bile salts), then at T-1h and T-3h (after 1 hour and three hours of bile salt exposure, respectively.) The results are summarized in Table 4.
  • Table 4 Figure 5 shows photographs of vials containing suspension No. 2 on the left (image A) and suspension No. 8 on the right (image B). These two suspensions were mixed with bile salts. Suspension No. 2 became limpid and transparent after a few minutes of exposure to bile salts. On microscopic observation, it was impossible to find liposomes. Conversely, suspension No. 8 resisted degradation by bile salts.
  • Figure 6 shows a photograph taken under an optical microscope of suspension No. 12 after one hour of exposure to bile salts. The image reveals almost total degradation of the liposomes since only a few debris are visible.
  • liposomal formulations that include DSPC, DPPC, DMPC, or DLPC in place of POPC, as well as 25-35% DOPS and 20-30% cholesterol resist degradation by bile salts for several hours.
  • Liposomal suspensions No. 2 and No. 8 were exposed for 1 hour at pH 1. Visual examination of the suspensions in the bottles and under a microscope did not reveal any noticeable degradation effect.
  • the method was prepared according to the method described in Example No. 1 and using the lipid proportions of solution No. 8. Different proportions of MTP-PE were added: 0.4%, 1%, 5% and 10%.
  • the dried liposomal particles were prepared using an atomization drying method known as "spray drying.”
  • the device used was a Büchi mini spray dryer 290.
  • the atomization-drying process involves four steps: atomization of the product in a spray nozzle, air-spray contact, drying of the spray droplets and collection of the solid product.
  • the method was used according to the proportions of solution No. 8.
  • the lipids and mifamurtide were dissolved in a mixture of chloroform and methanol (5:1) to the final concentration of 80 ⁇ M.
  • the solution was injected using a 1 mm diameter spray nozzle and a flow rate of 20 ml/minute.
  • the temperature of the drying chamber was 90°C.
  • Spray-dried particles were collected in a tank attached to a cyclone and stored in a refrigerator prior to characterization.
  • the particles obtained were measured by microscopy and had an average diameter of between 1 and 5 ⁇ m.
  • the dry powder thus obtained was dissolved in an aqueous saline solution (NaCl 0.9%).
  • the suspension was shaken manually for a few minutes. Microscopic observation showed a liposomal suspension composed of particles with an average size of 2 ⁇ m, thus demonstrating that the dry powder thus obtained is water-dispersible.
  • Two types of dry liposomal particles were prepared using the method described in Example 5, either by adding mannitol (35 mM) to the starting solution, or without adding any.
  • Liposomal MTP-PE suspensions No. 1 and No. 10 were prepared according to the method indicated in Example 1. In addition, these liposomes were prepared by incorporating 0.5% of a fluorescent label N-4- nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolephosphatidylethanolamine.
  • a batch of 30 BALB/c mice was randomly divided into two Groups A and B of 15 mice.
  • Group A mice received an administration of suspension No. 1 by oral gavage at the dose of 20 ⁇ g of MTP-PE and Group B mice were administered suspension No. 10 at the same dose of MTP-PE.
  • Blood samples (approximately 100 ⁇ L) were taken at 1, 4 and 24 hours after oral administration (5 mice per group and per collection time). Smears were taken from each blood sample. The smears were examined with a fluorescence microscope (Zeiss fluorescence microscope) and the number of fluorescent monocytes was counted for each smear.
  • the number of fluorescent monocytes is a marker of the level of absorption of the liposomes, that is to say the transfer of the intact and unstructured liposomes from the lumen of the intestinal tract to the bloodstream. After passing through the bloodstream, liposomes that have been absorbed are rapidly phagocytosed by circulating monocytes.
  • the mean number of fluorescent monocytes was 3, 7 and 5 times higher in Group B compared to Group A, at times 1, 4 and 24 hours, respectively.
  • Example 9 Preclinical study of proof of concept - Therapeutic efficacy of liposomal MTP-PE prepared according to the invention and administered orally in a kidney cancer model
  • the objective of this study was to evaluate the ability of a suspension of liposomal MTP-PE, prepared according to the invention and administered orally, to inhibit the development of lung metastases from kidney cancer.
  • the experimental model consisted of using immunocompetent mice of the BALB/c strain and transplanting them with RENCA cells of kidney cancer of murine origin under the capsule of one of the two kidneys. This orthotopic graft forms a syngeneic kidney tumor.
  • tumor cells disseminate continuously in the animal's body and form numerous metastases in the lungs after 17 days.
  • the RENCA cell line is derived from a tumor that arose spontaneously as renal cortical adenocarcinoma in BALB/c mice and was provided by the American Type Culture Collection (USA).
  • the tumor cells were cultured in a monolayer at 37°C in a humidified atmosphere (5% CO2, 95% air).
  • the culture medium was RPMI 1640 containing 2 mM L-glutamine supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.1 mM non-essential amino acids and 1 mM sodium pyruvate. Tumor cells adhere to plastic vials.
  • the tumor cells are detached from the culture flask by a 5-minute treatment with trypsin-versene, in Hanks' medium without calcium or magnesium and neutralized by adding complete culture medium. The cells are then counted and the viability is assessed using a 0.25% trypan blue exclusion test.
  • RENCA tumors were induced on day zero (D0) by the orthotopic route in 40 BALB/c female mice under anesthesia. Briefly, the animal's abdomen was opened through a midline incision under aseptic conditions. A total of 500,000 RENCA tumor cells in 25 ⁇ L of RPMI medium were slowly injected into the subcapsular space of the right kidney.
  • Animals were randomized based on their individual body weight on Day -2. The animals were randomized into four groups of ten animals each (Group 1, Group 2, Group 3 and Group 4.) The homogeneity of body weight between the groups was tested by an analysis of variance (ANOVA).
  • Group 1 animals were untreated.
  • Groups 2, 3 and 4 animals were treated with Lots B, A and C, respectively.
  • Treatments were given on Days 0, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 and 17.
  • Treatment was given by oral gavage using a gavage tube.
  • the volume of administration was 5 ml/kg adjusted to the most recent individual body weight.
  • the dose of MTP-PE was 1 mg/kg.
  • a blood sample of 500 LIL was taken by intracardiac puncture. Blood was collected in collection tubes with an anticoagulant (lithium heparin). The tubes were centrifuged (2000 g, 10 minutes, 4°C) to obtain the plasma and the cell pellet. Plasma from each animal was aliquoted and stored in two propylene tubes (approximately 125 ⁇ L/tube) at -80° C. to assess the plasma levels of liposomal MTP-PE according to the method described in the article Venkatakrishnan et al. British Journal of Clinical Pharmacology 77(6): 986-97, 2014.) The cell pellet from each animal was transferred and stored in a propylene tube at -80°C for further analysis.
  • an anticoagulant lithium heparin
  • Lung pairs from all mice were removed and weighed. Lung weight reflects the total amount of lung metastases.
  • a macroscopic enumeration of lung metastases on each lung was performed in all mice.
  • the lungs were then fixed in 4% neutral buffered formalin for 24–48 h and then embedded in paraffin (Histowax®, Histolab, Sweden). Samples were stored at room temperature for further microscopic analysis
  • Plasma levels of liposomal MTP-PE were also significantly higher in Group 3 compared to Groups 2 and 4.
  • MTP-PE formulated in bile salt degraded liposomes did not show antimetastatic activity.
  • Example 10 Preclinical study of proof of concept - Therapeutic efficacy of liposomal MTP-PE prepared according to the invention and administered orally in a model of osteosarcoma (bone cancer)
  • the objective of this study was to evaluate the ability of a suspension of liposomal MTP-PE, prepared according to the invention and administered orally, to inhibit the development of pulmonary metastases from bone cancer.
  • the experimental model consisted of using immunocompetent mice of the C57BL/6 strain and grafting them with MOS-J osteosarcoma cells of murine origin by paratibial intramuscular injection, thus reproducing the human disease.
  • This orthotopic graft forms an osteolytic bone tumor.
  • tumor cells disseminate continuously in the animal's body and form metastases in the lungs after 5 weeks.
  • Bile salt resistance tests were carried out according to the method described in Example 3 and showed that Batches D2 and E2 are resistant whereas Batch F2 is rapidly destructured.
  • the MOS-J cell line is derived from a mouse bone tumor and was provided by the Jackson Laboratory (USA).
  • the tumor cells were cultured in a monolayer at 37°C in a humidified atmosphere (5% CO2, 95% air).
  • the culture medium was RPMI 1640 supplemented with 5% fetal bovine serum.
  • the animals were randomized two days later based on their individual body weights into 5 groups of ten animals each (Group 1, Group 2, Group 3, Group 4, and Group 5.)
  • Group 1 animals were untreated.
  • Groups 2, 3 and 4 animals were treated with Lots E2, D2 and F2, respectively.
  • Group 5 animals were treated with an aqueous solution of MTP-PE. The treatments were administered orally two to three times per week. In Groups 3, 4 and 5, the dose of MTP-PE was 1 mg/kg.
  • Example 11 Preclinical study of proof of concept - Therapeutic efficacy of the liposomal MTP-PE prepared according to the invention and administered orally in a breast cancer model.
  • the objective of this study was to evaluate the capacity of a suspension of liposomal MTP-PE, prepared according to the invention and administered orally, to inhibit the development of pulmonary metastases from cancer of the mammary gland.
  • the experimental model consisted of using immunocompetent mice of the BALB/c strain and performing an orthotopic transplant of 4T-1 cells of mammary cancer of murine origin.
  • This orthotopic graft forms a tumor reproducing human breast cancer which disseminates and forms metastases in the lungs after 3 weeks.
  • the 4T1 cell line is derived from mouse mammary tumor and was provided by ATCC (USA).
  • the tumor cells were cultured in a monolayer at 37°C in a humidified atmosphere (5% CO2, 95% air).
  • the culture medium was RPMI 1640 supplemented with 5% fetal bovine serum.
  • 4T1 tumors were induced on day zero (D0) orthotopically in 60 BALB/c female mice under anesthesia. A total of 300,000 4T1 tumor cells were slowly injected into the right thoracic breast tissue.
  • the animals of Groups 1, 2 and 3 were treated respectively with Lot H3 (control), Lot G3 and Lot G3 twice a week orally. Additionally, animals in Groups 2 and 4 were treated with intravenous injections of doxorubicin at 8 mg/kg once weekly for 3 weeks. Animals in Groups 3 and 5 were treated with intraperitoneal injections of an anti-PD-L1 monoclonal antibody twice weekly for 3 weeks. All animals were euthanized after 3 weeks. The number of lung metastases was counted using a binocular loupe. The results showed that there were between 10 and 30 lung metastases in Groups 1, 4 and 5, while metastases were significantly reduced in Groups 2 and 3.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

La présente invention concerne une composition liposomale administrable par voie orale, nasale ou pulmonaire comprenant un phospholipide chargé négativement, optionnellement un phospholipide zwitterionique, un stérol, et une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile utile pour traiter et / ou prévenir toute pathologie mettant en œuvre l'activation des monocytes et/ou des macrophages.

Description

DESCRIPTION
COMPOSITIONS LIPOSOMALES ORALES
DOMAINE DE L’INVENTION
L’invention concerne de nouvelles compositions liposomales orales et leurs utilisations.
CONTEXTE DE L’INVENTION
L'effet thérapeutique d'une substance administrée est habituellement directement lié à la quantité et à la vitesse à laquelle la substance atteint la circulation sanguine.
De nombreux facteurs affectent la capacité de la substance à atteindre la circulation systémique, notamment: le site d'entrée dans l'organisme, la forme physique de la substance, la conception de la formulation du produit, les propriétés physico-chimiques de la substance active et des excipients, et une absorption appropriée de ladite substance active.
L'administration orale d'une substance thérapeutique est la forme d'administration la plus courante aujourd'hui en raison de la commodité et de la facilité d'administration. Les facteurs qui influencent l'absorption, et donc la capacité de la substance à atteindre la circulation sanguine d'une substance administrée par voie orale sont liés aux propriétés physico-chimiques de la substance, aux facteurs physiologiques du tractus gastro-intestinal et aux caractéristiques de la forme posologique. Les formes posologiques orales conventionnelles se composent de solutions, suspensions, poudres, capsules de gélatine en deux parties, capsules de gélatine molle, comprimés avec ou sans enrobage.
La présente invention concerne une composition liposomale administrable par voie orale, nasale ou pulmonaire comprenant un phospholipide chargé négativement, un phospholipide zwitterionique, un stérol, et une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile utile pour traiter et / ou prévenir toute pathologie mettant en œuvre l’activation des monocytes et/ou des macrophages (système immunitaire inné).
Il existe des médicaments anticancéreux sous la forme de liposomes qui stimulent le système immunitaire des patients. Cependant ces médicaments sont le plus souvent administrés sous formes parentérales, notamment par la voie intraveineuse. L’un de ces médicaments est le mifamurtide liposomal, également connu sous le nom de MTP-PE (muramyl tripeptide phosphatidyl éthanolamine) liposomal et commercialisé sous le nom de Mepact®. Le mode d’administration de ce médicament est très contraignant pour le patient puisqu’il est administré une à deux fois par semaine, sous forme d’une perfusion intraveineuse pendant 1 heure. De plus, le traitement doit être administré sous surveillance médicale, donc préférentiellement dans un hôpital. Ce médicament est indiqué pour le traitement de l’ostéosarcome non-métastatique.
Le terme "liposomes" se réfère généralement à des structures lipidiques uni- ou multilamellaires qui peuvent être chargés d'agents thérapeutiques, par exemple l'agent thérapeutique est encapsulé à l'intérieur du liposome, et / ou l'agent thérapeutique peut être attachés au liposome ou incorporés dans la ou les bicouche(s) lipidique(s). Ces formulations liposomales se sont avérées avoir une efficacité accrue par rapport au médicament libre. Par exemple, il a été démontré qu'une formulation liposomale comprenant la vinca alcaloïde vincristine a une plus grande efficacité contre les cellules leucémiques, par rapport à la vincristine libre et qu'elle présente une toxicité globale réduite.
Outre leur capacité à améliorer l'efficacité thérapeutique des composés biologiquement actifs encapsulés, les liposomes présentent des avantages importants tels que la réduction de la dose efficace de substances biologiquement actives formulées par rapport à l'utilisation des mêmes composés libres.
Les problèmes pharmaceutiques associés à l'administration orale de liposomes sont: 1) le pH de l'estomac, 2) les sels biliaires et 3) les enzymes digestives, principalement les lipases. Le pH non tamponné de l'estomac peut varier de 1,5 à 2,5 et peut provoquer une instabilité chimique de la surface de la membrane liposomale.
Les sels biliaires agissent comme des détergents et provoquent une instabilité de la bicouche liposomique par émulsification. Lors d'une exposition à des lipases et à d'autres enzymes, les groupes de tête polaire ou les chaînes acyle des phospholipides peuvent être clivés et ainsi rompre la vésicule liposomique.
La dégradation des liposomes doit être évitée car les médicaments formulés sous forme de liposomes et administrés par voie orale doivent être absorbés sous la forme de liposomes intacts et non dégradés dans la circulation sanguine générale afin de conserver leurs propriétés pharmacologiques . La dégradation des liposomes entraine également une variabilité de l’absorption du principe actif contenu dans les liposomes. Cette variabilité de l’absorption du principe actif est un problème puisque la proportion de principe actif absorbé après une administration orale doit être contrôlée et raisonnablement prédictible.
L’état de la technique a déjà proposé plusieurs types de liposomes renfermant différentes combinaisons de lipides avec ou sans immunostimulant lipophile.
Cependant, l’état de la technique n’a pas divulgué de formulations liposomales suffisamment stables en présence de sels biliaires et optionnellement dans un milieu acide et enzymatique simulant l’environnement gastro-intestinal, pour assurer un traitement efficace lorsqu’une formulation liposomale renfermant une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile est administrée par voie orale.
Par exemple, le document W02007014754 décrit une composition constituée d'une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, préférentiellement un immunostimulant lipophile et une combinaison de phospholipides, en présence de cholestérol, utile pour l'activation in vivo du système immunitaire. Ce document décrit spécifiquement une composition renfermant du MTP-PE (muramyl tripeptide phosphatidyl éthanolamine), et comprenant 62,5% de palmitoyl-oléoyl-phosphatidylcholine (POPC), 26,8% de di-oléoyl- phosphatidylsérine (DOPS) et 10,7% de cholesterol. Ce document décrit la préparation de comprimés constitué d'Avicel, de polyvinylpyrollidone et de lyophilisât d’une composition liposomale comprenant un lipopeptide synthétique, 70% de POPC et 30% de DOPS.
Un autre document décrit l'activité biologique in vivo du muramyl tripeptide synthétique, CGP 19835A, lorsqu'il est encapsulé dans des liposomes de phosphatidylcholine (POPC-19835A) et administré par voie orale comme immunomodulateur à des souris. Les liposomes ont été rapidement absorbés dans l'intestin et ont atteint la circulation systémique en 4 h. Les macrophages alvéolaires récoltés dans les poumons de souris 24 h après une alimentation unique de POPC-19835A étaient tumoricides vis-à-vis des cellules cibles du carcinome rénal murin (S. Tanguay et al., Cancer Res. 1994 Nov. 15;54(22):5882-8)
Ainsi, malgré l’existence de plusieurs compositions liposomales pouvant être administrées par voie orale, il existe toujours un besoin de nouvelles compositions liposomales administrables par voie orale, renfermant une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, dont la stabilité est améliorée en présence de sels biliaires.
BREF APERÇU DE L’INVENTION
Dans ce contexte d’une recherche de nouvelles compositions thérapeutiques améliorées, un premier but de l’invention est de proposer une nouvelle composition liposomale. Un second but de l’invention est de proposer un procédé permettant de produire ladite composition liposomale. Enfin, un autre but de l’invention est de proposer des compositions pharmaceutiques et leurs utilisations.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Le demandeur de la présente invention a donc montré qu'un liposome comprenant un phospholipide chargé négativement, un phospholipide zwitterionique, un stérol dans certaines gammes en % en poids ou en mole et une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile utile pour l'activation du système immunitaire, en particulier l’activation des cellules de types monocytes ou macrophages présente une stabilité à pH acide et/ou en présence de sels biliaires améliorée.
La présente invention concerne ainsi plus particulièrement une composition liposomale utile pour une administration orale constituée ou comprenant : a) une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile, encore plus de préférence de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), par rapport au poids total de la composition liposomale; b) un liposome constitué ou comprenant: i) de 25% à 35% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide chargé négativement par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide zwitterionique, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole d'au moins un stérol, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, pourvu que le au moins un phospholipide zwitterionique ne soit ni la palmitoyl-oleoyl- phosphatidyl-choline (POPC), ni la 1 ,2-didecanoyl 1-sn- glycero-3 -phosphocholine (DDPC). Selon la présente invention, le au moins un phospholipide zwitterionique est un phospholipide zwitterionique dont la ou les chaines carbonées est (sont) saturée(s).
Selon la présente invention, les % molaires des constituants i) à iii) concernent uniquement les lipides du liposome, considérés comme des excipients, et ne tiennent pas compte de la partie lipidique d’une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, par exemple de 1’ immunostimulant lipophile.
La gamme de 25% à 35% d'au moins un phospholipide chargé négativement signifie que le au moins un phospholipide chargé négativement est présent dans le liposome à une concentration en poids ou en mole de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%.
La gamme de 30% à 50% d'au moins un phospholipide zwitterionique signifie que le au moins un phospholipide zwitterionique est présent dans le liposome à une concentration en poids ou en mole de 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%.
La gamme de 20% à 30% d'au moins un stérol signifie que le au moins un stérol est présent dans le liposome à une concentration en poids ou en mole de 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30%.
Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale dont le liposome est constitué ou comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome: i) de 25% à 35% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide chargé négativement par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, de préférence de 26% à 32%, plus préférentiellement 30%, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide zwitterionique par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, de préférence de 30% à 40%, plus préférentiellement 40%, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole d'au moins un stérol par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, de préférence de 22% à 28%, plus préférentiellement 25%, ou 30%, caractérisée en ce que ladite composition liposomale est stable en présence de sels biliaires, pourvu que le au moins un phospholipide zwitterionique ne soit ni la palmitoyl-oleoyl- phosphatidyl-choline (POPC), ni la 1 ,2-didecanoyl 1-sn- glycero-3 -phosphocholine (DDPC).
Selon l’invention, un phospholipide chargé négativement doit être compris comme un phospholipide possédant une charge négative à pH physiologique. Par exemple, la phosphatidylsérine (PS) contient un groupement sérine estérifié à l’acide phosphatidique. Du fait d’une charge unique sur le groupement phosphate, la PS est chargée négativement à pH physiologique. Le phosphatidylinositol (PI) et le phosphatidylglycérol (PG) ont, respectivement un groupement glycérol estérifié à l’acide phosphorique ou un sucre estérifié à l’acide phosphorique ; le PI et PG sont chargés négativement à pH physiologique.
Plus particulièrement selon l’invention, le au moins un phospholipide chargé négativement est choisi dans le groupe comprenant le phosphatidylinositol (PI), la phosphatidylsérine (PS), le phosphatidylglycérol (PG), l'acide phosphaphatique (PA), le diphosphatidylglycérol (DPG) ou cardiolipin (CL), leurs dérivés comprenant un ou plusieurs résidu(s) d’acide(s) gras, et leurs mélanges.
Selon un mode de réalisation préféré, le au moins un phospholipide chargé négativement est la phosphatidyl sérine (PS) ou un dérivé de la phosphatidyl sérine choisi dans le groupe comprenant la palmitoyloléoyl-phosphatidylsérine (POPS), palmitoyl-linoeoyl phosphatidylsérine (PLPS), palmitoyl-arachidonoyl-phosphatidylsérine (PAPS), palmitoyl docosa-hexaénoyl phosphatidylsérine (PDPS) , stéaroyl-oleoyl-phosphatidylsérine (OSPS), stéaroyl-linoléoyl-phosphatidylsérine (GPPS), stéaroyl- arachidonoyl-phosphatidylsérine (SAPS), stéaroyl docosa-hexaénoyl phosphatidylsérine (SDPS), di-capryl-phosphatidylsérine (C10PS), di-lauroyl-phosphatidylsérine (DLPS), di-myristoyl-phosphatidylsérine (DMPS), di- phytanoyl-phosphatidylsérine (DPhPS), di-heptadecanoyl phosphatidylsérine (PS 17:0/17:0), di-oléoyl-phosphatidylsérine (DOPS), di-palmitoyl-phosphatidylsérine (DPPS), di-stéaroyl phosphatidylsérine (DSPS), di-linoleoyl phosphatidylsérine (dil8:3 PS) di-erucoyl phosphatidylsérine, di-docosahexaenoyl- phosphatidylsérine, et leurs mélanges, de préférence la dioleoyl- phosphatidylsérine (DOPS).
Selon un mode de réalisation préféré, le au moins un phospholipide chargé négativement est le phosphatidylglycérol ou un dérivé de phosphatidylglycérol choisi dans le groupe comprenant le palmitoyloléoyl-phosphatidylglycérol, palmitoyl-linoleoyl phosphatidylglycérol, palmitoyl-arachidonoyl-phosphatidylglycérol, palmitoyl- docosahexaenoyl-phosphatidylglycérol, stéaroyl-oléoyl-phosphatidylglycérol, stéaroyl- linoleoyl-phosphatidylglycérol, stéaroyl-arachidonoyl-phosphatidylglycérol, stéaroyl- docosahexaenoyl-phosphatidylglycérol, di-capryl phosphatidylglycérol di-lauroyl phosphatidylglycérol, di-heptadecanoyl-phosphatidylglycérol, di-phytanoyl- phosphatidylglycérol, di-myristoyl phosphatidylglycérol , di-palmitoyl-phosphatidylglycérol (DPPG), di-élaidoyl-phosphatidylglycérol (DEPG), di-stéaroyl-phosphatidylglycérol, di- oléoyl-phosphatidylglycérol, di-linoéoyl-phosphatidylglycérol, di-arachidonoyl- phosphatidylglycérol, et leurs mélanges, en particulier le di-oléoyl-phosphatidylglycérol.
Selon l’invention, un phospholipide zwitterionique doit être compris comme un phospholipide neutre à pH physiologique. Par exemple, la phosphatidylcholine (PC) contient un groupement choline estérifié à l’acide phosphatidique. Au pH physiologique, La PC possède à la fois une charge négative portée par le groupement phosphate et une charge positive portée par le groupement choline. La phosphatidyléthanolamine (PE) contient un groupement éthanolamine estérifié à l’acide phosphatidique. La PE ayant une structure similaire à la PC, c’est également un phospholipide neutre à pH physiologique.
Plus particulièrement selon l’invention, le au moins un phospholipide zwitterionique est choisi dans le groupe comprenant la phosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, leurs dérivés comprenant un ou plusieurs résidu(s) d’acide(s) gras, la lécithine, la lysolécithine, la lysophatidyl-éthanolamine, les phosphoglycérides, et leurs mélanges.
Selon un mode de réalisation préféré, le au moins un phospholipide zwitterionique est la phosphatidylcholine ou un dérivé de la phosphatidylcholine choisi dans le groupe comprenant la di-arachidonoyl-phosphatidyl-choline (DAPC), la di-élaidoyl-phosphatidyl- choline (DEPC), la dilauroyl-phosphatidyl-choline (DLaPC), la di-linoléoyl-phosphatidyl- choline (DLPC), la di-linolénoyl-phosphatidyl-choline (DLnPC), la di-myristoyl-phosphatidyl- choline (DMPC), la di-myristoleoyl phosphatidylcholine (DMoPC), la dioléoyl phosphatidylcholine (DOPC), la di-palmitoyl-phosphatidyl-choline (DPPC), la dipentadécanoyl phosphatidyl-choline (DPePC), la dipalmitoléoyl-phosphatidyl-choline (DPoPC), la diphytanoyl phosphatidyl-choline (DPhPC), la di-petrosélénoyl-phosphatidyl-choline (DPsPC), la di-tridécanoyl phosphatidyl-choline (DTPC), la l-hexadécyl-2-arachidonoyl phosphatidylcholine (HAPC), la palmitoyl-arachidonoyl-phosphatidyl-choline (P APC), la 1 ,2- dihexadécanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), et la l,2-distéaroyl-sn-glycero-3- phosphocholine (DSPC) et leurs mélanges, de préférence la l,2-distéaroyl-sn-glycero-3- phosphocholine (DSPC) et encore plus de préférence la di-myristoyl-phosphatidyl-choline (DMPC). Selon un mode de réalisation préféré, le au moins un phospholipide zwitterionique est la phosphatidyl-éthanolamine ou un dérivé de la phosphatidyl-éthanolamine choisi dans le groupe comprenant la palmitoyl-oléoyl- phosphatidyl-éthanolamine, palmitoyllinoleoyl- phosphatidyl-éthanolamine, palmitoyl-arachidonoyl-phosphatidyl-éthanolamine, palmitoyl- docosahexaenoyl phosphatidyl-éthanolamine, stéaroyl-oleoyl phosphatidyl-éthanolamine, stéaroyl-linoleoyl-phosphatidyl-éthanolamine, stéaroyl-arachidonoyl phosphatidyl- éthanolamine, stéaroyl-docosahexaenoyl-phosphatidyl-éthanolamine, di-lauroyl phosphatidyl- éthanolamine, di-myristoyl-phosphatidyl-éthanolamine, di-phytanoyl phosphatidyl- éthanolamine, dipalmitoyl phosphatidyl-éthanolamine, diheptadecanoyl phosphatidyl- éthanolamine, distéaroyl phosphatidyl-éthanolamine, di-élaidoyl phosphatidyl-éthanolamine, diarachidonoyl phosphatidyl-éthanolamine, docosa-hexaenoyl phosphatidyl-éthanolamine, et leurs mélanges.
Selon l’invention, le au moins un stérol est choisi dans le groupe constitué par le cholestérol, les dérivés du cholestérol tels que le cholestérol-phosphocholine, le cholestérolpolyéthylèneglycol et le cholestérol-S04, les esters de cholestéryle, la vitamine D, les phytostérols, tels que le sitostérol, le campestérol et le stigmastérol et leurs mélanges, de préférence le cholestérol.
Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale dont le liposome est constitué ou comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome: i) de 25% à 35% de DOPS, de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%, ii) de 30% à 50% de DSPC, DPPC, DMPC, ou DLPC de préférence 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%, iii) de 20% à 30% de cholestérol, de préférence 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30% par rapport au poids total ou à la masse molaire totale du liposome.
Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale utile pour une administration orale constituée ou comprenant : a) une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile, encore plus de préférence de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), par rapport au poids total de la composition liposomale; b) un liposome constitué ou comprenant:
1. i) de 25% à 35% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide chargé négativement, de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, ledit au moins un phospholipide chargé négativement est choisi dans le groupe comprenant la phosphatidylsérine (PS), ou un dérivé de la phosphatidyl sérine choisi dans le groupe comprenant la palmitoyloléoyl-phosphatidylsérine (POPS), palmitoyl-linoléoyl phosphatidylsérine (PLPS), palmitoyl-arachidonoyl-phosphatidylsérine (PAPS), palmitoyl docosa-hexaénoyl phosphatidylsérine (PDPS), stéaroyl-oléoyl- phosphatidylsérine (OSPS), stéaroyl-linoléoyl-phosphatidylsérine (GPPS), stéaroyl- arachidonoyl-phosphatidylsérine (SAPS), stéaroyl docosa-hexaénoyl phosphatidylsérine (SDPS), di-capryl- phosphatidylsérine (C10PS), di-lauroyl- phosphatidylsérine (DLPS), di-myristoyl-phosphatidylsérine (DMPS), di-phytanoyl- phosphatidylsérine (DPhPS), di-heptadecanoyl phosphatidylsérine (PS 17:0/17:0), di- oléoyl-phosphatidylsérine (DOPS), di-palmitoyl-phosphatidylsérine (DPPS), di- stéaroyl phosphatidylsérine (DSPS), di-linoléoyl phosphatidylsérine (dil8:3 PS) di- erucoyl phosphatidylsérine, di-docosahexaenoyl- phosphatidylsérine, et leurs mélanges, de préférence la di-oleoyl-phosphatidylsérine (DOPS), ii) de 30% à 50% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide zwitterionique, de préférence 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole d'au moins un stérol, de préférence 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, pourvu que le au moins un phospholipide zwitterionique ne soit ni la palmitoyl-oleoyl- phosphatidyl-choline (POPC), ni la 1 ,2-didecanoyl 1-sn- glycero-3 -phosphocholine (DDPC).
Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale utile pour une administration orale constituée ou comprenant : a) une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile, encore plus de préférence de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), par rapport au poids total de la composition liposomale; b) un liposome constitué ou comprenant: i) de 25% à 35% en poids ou en mole de di-oleoyl-phosphatidylsérine (DOPS), de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide zwitterionique, de préférence 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole d'au moins un stérol, de préférence 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, pourvu que le au moins un phospholipide zwitterionique ne soit ni la palmitoyl-oleoyl- phosphatidyl-choline (POPC), ni la 1 ,2-didecanoyl 1-sn- glycero-3 -phosphocholine (DDPC).
Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale utile pour une administration orale constituée ou comprenant : a) une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile, encore plus de préférence de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), par rapport au poids total de la composition liposomale; b) un liposome constitué ou comprenant: i) de 25% à 35% en poids ou en mole de di-oleoyl-phosphatidylsérine (DOPS), de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide zwitterionique, de préférence 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole de cholestérol, de préférence 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, pourvu que le au moins un phospholipide zwitterionique ne soit ni la palmitoyl-oleoyl- phosphatidyl-choline (POPC), ni la 1 ,2-didecanoyl 1-sn- glycero-3 -phosphocholine (DDPC). Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale utile pour une administration orale constituée ou comprenant : a) une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile, encore plus de préférence de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), par rapport au poids total de la composition liposomale; b) un liposome constitué ou comprenant: i) de 25% à 35% en poids ou en mole de di-oleoyl-phosphatidylsérine (DOPS), de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole de DSPC, DPPC, DMPC, ou DLPC, de préférence le DSPC et encore plus de préférence le DMPC, de préférence 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole d'au moins un stérol, de préférence 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome.
Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale utile pour une administration orale constituée ou comprenant : a) une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile, encore plus de préférence de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), par rapport au poids total de la composition liposomale; b) un liposome constitué ou comprenant: i) de 25% à 35% en poids ou en mole de di-oleoyl-phosphatidylsérine (DOPS), de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole de DSPC, DPPC, DMPC, ou DLPC, de préférence le DSPC et encore plus de préférence le DMPC, de préférence 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole de cholestérol, de préférence 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale dont le liposome est constitué ou comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome: i) de 25% à 35% en poids ou en mole de DOPS, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole de DSPC, DPPC, DMPC, ou DLPC, de préférence le DSPC et encore plus de préférence le DMPC, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole de cholestérol.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale dont le liposome est constitué ou comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome: i) 30% de DOPS, ii) 40% de DSPC, DPPC, DMPC, ou DLPC, de préférence le DSPC et encore plus de préférence le DMPC, iii) 30% de cholestérol.
Selon un mode de réalisation préféré, les liposomes de la composition liposomale sont stables en présence de sels biliaires, c’est-à-dire la bicouche lipidique des liposomes n’est pas déstructurée.
Selon un mode de réalisation préféré, les liposomes de la présente composition liposomale sont stables en présence de sels biliaires pendant au moins 1 heure, de préférence 2 heures ou 3 heures.
Selon un mode de réalisation préféré, les liposomes de la présente composition liposomale sont stables en présence de sels biliaires et sont absorbés et transférés vers la circulation sanguine.
L’homme du métier comprend que l’efficacité thérapeutique des compositions liposomales de la présente invention, administrées par voie orale est conditionnée par la stabilité des dites compositions liposomales dans un milieu comprenant des sels biliaires. Selon un mode de réalisation préféré, l'agent thérapeutique est un immunostimulant lipophile utile pour l'activation du système immunitaire, pour soigner et / ou prévenir un cancer, en particulier l’ostéosarcome.
Cette activation du système immunitaire est obtenue par absorption de la suspension liposomale par des cellules immunocompétentes qui sont ensuite activées après la liaison de la substance amphiphile immunostimulante à des récepteurs spécifiques. Cette activation peut également être obtenue via une étape initiale d'activation ex vivo dans des conditions de culture de cellules immunocompétentes spécifiques telles que des monocytes, des macrophages ou des cellules dendritiques.
Selon un mode de réalisation préféré l'agent thérapeutique est un immunostimulant lipophile appartenant au sous-groupe thérapeutique ATC L03 de la Classification Anatomique, Thérapeutique et Chimique de l'OMS, par exemple l’interféron ou un dérivé de l’interféron.
Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, une substance amphiphile d’intérêt biologique ou au moins une des substances amphiphiles d’intérêt biologique selon l’invention est un immunostimulant amphiphile sélectionné. Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, 1’ immunostimulant amphiphile est associé à des peptides amphiphiles ou à des antigènes lipopeptides. L’association d’un immunostimulant amphiphile et d’un ou plusieurs peptides amphiphiles ou antigènes lipopeptides est conçue pour induire également des réponses immunitaires spécifiques aux peptides amphiphiles ou aux antigènes lipopeptides.
L’expression « immunostimulant amphiphile » désigne toutes les substances capables de déclencher des réponses immunitaires innées via des récepteurs tels que les récepteurs TOLL et NOD des monocytes, macrophages, cellules dendritiques, cellules NK ou cellules polynucléaires, in vitro ou in vivo, et capables de s’ancrer, par sa partie lipidique, dans les bicouches lipidiques d’un liposome. Des exemples d’ immunostimulants amphiphiles sont le muramyl tripeptide phosphatidyl éthanolamine (MTP-PE), la bis-(taurine)-L-glutaminyl-N- palmitoyl-S-[2-(R)-3-dilauroyloxypropyl]-L-cystine (JBT 3002), le sitostérol, le lipide A ou d’autres dérivés du LPS ou les nucléotides riches en motif CpG amphiphiles. La présente invention ne se limite pas aux immunostimulants amphiphiles décrits ci-dessus.
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, 1’ immunostimulant amphiphile est le muramyl tripeptide phosphatidyl éthanolamine (MTP-PE).
Le muramyl tripeptide phosphatidyl ethanolamine a été décrit comme un adjuvant pour les études de protection contre les antigènes tumoraux ou les antigènes du virus (virus de l’herpès simplex ou VIH-1). MTP-PE a un effet stimulant sur la prolifération cellulaire et est capable d’activer les capacités cytotoxiques des monocytes.
Dans un autre mode de réalisation particulier de la présente invention, 1’ immunostimulant amphiphile est la bis-(taurine)-L-glutaminyl-N-palmitoyl-S-[2-(R)-3- dilauroyloxypropyl]-L-cystine (JBT3002), un lipopeptide bactérien synthétique capable d’activer les macrophages et d’induire la production de cytokines inflammatoires (TNF-[alpha], IL-I, IL-6).
Dans un autre mode de réalisation particulier de la présente invention, 1’ immunostimulant amphiphile est le sitostérol. Par sitostérol, on entend le sitostérol, ainsi que 1' [omicron] eta-sitostérol, l'[omicron]eta-sitostérol glucoside. La capacité immunostimulante du 6eta-sitostérol (un phytostérol) a été démontrée in vitro et in vivo. L'[epsilon]éta-sitostérol est capable d’améliorer la prolifération des lymphocytes T en présence de phytohémagglutinine, de stimuler l’activité des cellules NK et d’induire une sécrétion accrue d’IL-2 et d’interféron gamma par les lymphocytes.
Les immunostimulants amphiphiles décrits ci-dessus peuvent être associés à des peptides amphiphiles ou à des antigènes lipopeptides. Lesdits peptides amphiphiles ou antigènes lipopeptides sont de préférence formés par des chaînes peptidiques de 8 à 16 acides aminés (considérés comme des peptides immunogènes), liées via le groupe terminal NH2 à une chaîne aliphatique et lipidique de 5 à 30 carbones, plus préférentiellement de 8 à 18 carbones. Les peptides immunogènes typiques utilisés sont choisis parmi des antigènes peptidiques sauvages ou modifiés ayant une affinité élevée pour les molécules du CMH de classe I et du CMH de classe IL Lesdits peptides peuvent être sélectionnés dans le groupe constitué de peptides induisant le CTL, de peptides d’antigène des cellules tumorales ou de peptides de l’antigène de l’hépatite. Plus préférentiellement, les peptides sont choisis dans le groupe constitué par les antigènes des cellules tumorales solides du carcinome (WO 0142270, US 6.602.510, WO 0145728 et US 07.976.301), les antigènes du mélanome (US 5.662.907 et US 5.750.395), les antigènes de l’hépatite B ou C ou d’autres antigènes tumoraux tels que les antigènes du cancer du sein 5T4 (WO 03068816), les antigènes Her2/neu (US 2004/157780) ou les antigènes p53 (WO 00141787).
Selon un mode de réalisation préféré l'agent thérapeutique est un immunostimulant lipophile dérivé de lipopolysaccharide (LPS).
Selon un mode de réalisation préféré l'agent thérapeutique est une combinaison de plusieurs immunostimulants lipophiles. Selon un mode de réalisation préféré l'agent thérapeutique est un dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP).
Dans un autre mode de réalisation préféré le dérivé lipophile du MTP correspond à la formule (I) ou (II)
Figure imgf000016_0001
dans laquelle R représente un groupe -NH2, ou un groupe -NH-CO-Ri où Ri représente un résidu d’acide gras en C8-C24 ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié, en C1-C30, comportant optionnellement une ou plusieurs double liaison carbone-carbone, de préférence un groupe alkyle en Cs-Cis, comportant optionnellement une ou plusieurs double liaison carbone-carbone.
Dans un autre mode de réalisation préféré, Ri est choisi parmi un résidu d’acide caprylique (8:0), d’acide caprique(10:0), d’acide laurique(12:0), d’acide myristique(14:0) d’acide palmitique (16:0), d’acide stéarique (18:0), d’acide arachidique (20:0), d’acide béhénique (22:0), d’acide lignocérique (24:0), d’acide cérotique (26:0), d’acide myristoléique (14:1), d’acide palmitoléique(16:l), d’acide sapiénique(16:l), d’acide oléique(18:l), d’acide élaïdique (18:1), d’acide trans-vaccénique (18:1), d’acide linoléique (18:2), d’acide linolélaïdique (18:2), d’acide a-linolénique (18:3), d’acide y-linolénique(18:3), d’acide dihomo-y-linolénique(20:3), d’acide arachidonique (20:4), d’acide eicosapentaénoïque (20:5), d’acide clupanodonique (22:5), ou d’acide docosahexaénoïque (22:6); ou
Figure imgf000017_0001
Dans un mode de réalisation préféré l’immunostimulant lipophile est le MTP-PE (mifamurtide). Ce tripeptide muramyl comprend des résidus phospholipidiques qui permettent l'association de la partie hydrophobe de la molécule avec un environnement lipidique tandis que la partie muramyl peptide s'associe à l'environnement aqueux.
Le muramyl tripeptide phosphatidyl éthanolamine a été décrit comme un adjuvant pour les études de protection contre les antigènes tumoraux ou les antigènes viraux (virus Herpes simplex ou VIH-1). MTP-PE a un effet stimulant sur la prolifération cellulaire et est capable d'activer les capacités cytotoxiques des monocytes.
Le mifamurtide est commercialisé sous la dénomination Mepact® et est indiqué chez des patients âgés de deux à 30 ans pour le traitement de l’ostéosarcome non métastatique de haut grade (un type de cancer des os). Mepact® est utilisé en association avec d’autres médicaments anticancéreux après élimination chirurgicale du cancer.
Selon le résumé du rapport européen public d'évaluation (EPAR) relatif à Mepact®, l’utilisation du mifamurtide en association avec d’autres médicaments anticancéreux, augmente la durée de survie des patients sans récidive de la maladie: 68% des patients sous Mepact® (231 sur 338) ont survécu sans récidive de la maladie, par comparaison à 61% des patients (207 sur 340) qui ne l’ont pas reçu. Le risque de décès était également réduit de 28% chez les patients sous Mepact®. Ce traitement est injecté par perfusion. La dose de mifamurtide recommandée pour l’ensemble des patients est de 2 mg/m2 de surface corporelle. Elle doit être administrée deux fois par semaine à 3 jours d’intervalle minimum pendant 12 semaines, puis une fois par semaine pendant 24 semaines supplémentaires, soit un total de 48 perfusions en 36 semaines.
Après perfusion intraveineuse de Mepact®, les liposomes sont sélectivement pris en charge par les macrophages, phagocytés et progressivement dégradés dans les cellules. Les effets indésirables observés sous Mepact® (chez plus d’un patient sur 10) sont les suivants: anémie (faible numération de globules rouges), perte d’appétit, maux de tête, vertiges, tachycardie (rythme cardiaque rapide), hypertension (tension artérielle élevée), hypotension (tension artérielle basse), dyspnée (difficultés à respirer), tachypnée (respiration rapide), toux, vomissements, diarrhées, constipation, douleurs abdominales (maux d’estomac), nausées, hyperhydrose (transpiration excessive), myalgies (douleurs musculaires), arthralgies (douleurs dans les articulations), douleurs dans le dos, douleurs dans les extrémités (les bras et les jambes), fièvre, frissons, fatigue, hypothermie (faible température corporelle), douleurs générales, malaises, asthénie (faiblesse) et douleurs dans la poitrine.
Les propriétés anti-métastatiques du Mepact® ont également été montré dans des études cliniques (Kleinerman et al. American Journal of Clinical Oncology 1995, 18(2) : 93-9. Anderson et al. Pediatric Blood & Cancer 2014, 61(2) : 238-44 ).
La composition liposomale Mepact® contient 0,4% (4 mg de mifamurtide). Le liposome est constitué de l-Palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3 -phosphocholine (POPC) et de 1,2- dioléoyl-sn-glycéro-3-phospho-L-sérine (DOPS) selon le ratio molaire 7:3.
Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale, dont 1’ immunostimulant lipophile est constitué ou comprend une concentration de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), de préférence 0,4% ou moins en poids de MTP-PE.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale, constituée ou comprenant : a) de 0,1 à 1 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), de préférence 0,4% ou moins en poids de MTP-PE, b) un liposome constitué ou qui comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome: i) de 25% à 35% d’une phosphatidylsérine, de préférence DOPS, de préférence de 26% à 32%, plus préférentiellement 30%, ii) de 30% à 50% d’une phosphatidylcholine, de préférence DSPC, DPPC, DMPC, ou DLPC, de préférence de 30% à 40%, plus préférentiellement 40%, iii) de 20% à 30% d'au moins un stérol, de préférence le cholestérol, de préférence de 22% à 28%, plus préférentiellement 25%, ou 30%. Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale, constituée ou comprenant: a) de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), de préférence 0,4% ou moins en poids de MTP-PE, b) un liposome constitué ou qui comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome : i) 30% de DOPS, ii) 40% de DSPC, DPPC, DMPC, ou DLPC, de préférence le DSPC et encore plus de préférence le DMPC, iii) 30% de cholestérol.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale pour la préparation d’une composition pharmaceutique destinée à une administration par voie orale.
L'administration orale désigne une administration par ingestion de comprimés, pilules ou capsules contenant la poudre selon l’invention. L'administration orale désigne également une administration d’une suspension de la poudre dans un solvant aqueux pharmaceutiquement acceptable, par exemple sous la forme d’un sirop ou d’une suspension buvable.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale pour la préparation d’une composition pharmaceutique administrée par voie nasale.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale pour la préparation d’une composition pharmaceutique administrée par voie pulmonaire.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale pour son utilisation dans une méthode d’activation du système immunitaire inné, en particulier l’activation des cellules de types monocytes ou macrophages. L’homme du métier comprend que l’activation du système immunitaire, en particulier l’activation de cellules de types monocytes ou macrophages permet de traiter les cancers et notamment les métastases cancéreuses. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la présente composition liposomale est utilisée pour le traitement de patients atteints de cancer, de préférence l’ostéosarcome, du cancer du rein ou du cancer de la glande mammaire.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la présente composition liposomale est utilisée pour le traitement et/ou la prévention de métastases cancéreuses en particulier de métastases pulmonaires.
La présente invention concerne également une méthode de traitement des cancers ou de prévention des récidives cancéreuses, en particulier les cancers des os, du rein ou de la glande mammaire et de leurs métastases, en particulier pulmonaires, en utilisant une composition liposomale décrite ci-dessus.
Préparation des liposomes
Les liposomes de la présente invention sont préparés selon des techniques connues de l’Homme du métier. Par exemple, cette méthode de préparation est basée sur deux étapes séparées de solubilisation, dans lesquelles les lipides sont solubilisés dans un solvant polaire miscible à l'eau (butanol tertiaire ci-après également nommé t-butanol) ou bien un mélange de chloroforme et de méthanol (dans les proportions 5:1) (solution A) et l'agent biologiquement actif est dispersé dans un milieu aqueux physiologiquement compatible contenant éventuellement un cryoprotecteur (solution B). La solution A et la solution B sont ensuite mélangées. Par conséquent, selon cette méthode, la substance amphiphile d'intérêt biologique n'est initialement pas présente dans la phase t-butanol mais uniquement dans le milieu aqueux.
Alternativement, les lipides et l'agent biologiquement actif sont directement mélangés dans un solvant polaire miscible à l'eau.
Le document W02007014754 décrit un autre procédé qui est particulièrement adapté à la préparation des liposomes selon la présente invention.
Ce procédé, qui comprend une étape de dispersion (suivie d'une étape de lyophilisation ou d’atomisation/séchage) de phospholipides, et de cholestérol, et d'une ou plusieurs substances amphiphiles d'intérêt biologique dans un mélange approprié de solvants, permet la production d'une suspension liposomale.
Plus particulièrement le procédé de préparation de la suspension liposomale comprend: a) une étape de préparation d'un mélange d’un immunostimulant lipophile et d’un liposome constitué ou qui comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome : i) de 25% à 35% d’au moins un phospholipide chargé négativement, ii) de 30% à 50% d'au moins un phospholipide zwitterionique, iii) de 20% à 30% d'au moins un stérol, b) une étape de dispersion dudit mélange dans un solvant polaire miscible à l'eau.
Selon un mode de réalisation particulier, le solvant polaire est constitué de t-butanol dihydraté et de t-butanol ou d’un mélange de chloroforme/méthanol en particulier dans un ratio 5:1. Le solvant polaire peut aussi être constitué d'un mélange de 60 à 100% de t-butanol dihydraté et de 0 à 40% de t-butanol, de préférence dans un mélange de 75% à 100% (p / p) de t-butanol dihydraté et de 0 à 25% (p / p) de t-butanol.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'une poudre selon l'invention, comprenant une étape c) d’atomisation/séchage de la suspension liposomale obtenue à l’étape b).
Selon un mode de réalisation particulier, la suspension liposomale contient un excipient hydrophile, de préférence du mannitol ajouté avant l’étape d’atomisation/séchage.
Selon un autre aspect de l’invention la suspension liposomale est extradée à travers un dispositif poreux et ensuite passée à travers une buse. L'utilisation d'une buse de diamètre suffisamment petit limite l'écoulement de la suspension après avoir été extradée à travers le dispositif poreux.
Des buses utiles pour réaliser cette étape du procédé de l'invention sont également généralement connues de l'homme du métier. Ils comprennent, par exemple, des buses à disque rotatif, des buses à jet d'impact, des buses capillaires, des buses à un seul orifice, des buses à ultrasons de type vibrant ou pulsé, des buses à deux fluides telles que des buses coaxiales à deux fluides, etc. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la buse est une buse à orifice. Dans la présente invention, la taille de pore préférée de la buse est comprise entre environ 0,05 mm et environ 1 mm, plus préférablement entre environ 0,1 mm et environ 0,2 mm. Dans l'appareil de l'invention, la buse peut être comprise dans un récipient adapté à la déshydratation du liposome obtenu, en particulier adapté à la déshydratation par atomisation ou par atomisation.
Le débit de la suspension peut être compris entre environ 1 ml / min et environ 1000 ml / min. Plus typiquement, les liposomes ont été préparés par le procédé de l'invention en appliquant un débit de 10 ml / min à 200 ml / min, et plus préférablement d'environ 20 ml / min à environ 100 ml / min.
Selon un autre mode de réalisation, la pression utilisée pour l'extrusion de la suspension liposomale à travers le dispositif poreux et la pression de passage de la suspension liposomale à travers la buse peuvent être sensiblement identiques, en particulier être comprises entre 0,5 bar et 1200 bars. Plus typiquement, les liposomes peuvent être préparés par le procédé de l'invention avec 5 bars à 600 bars, de préférence d'environ 10 bars à environ 500 bars et plus préférablement d'environ 20 bars à environ 150 bars.
Le séchage des liposomes après la formation de gouttelettes peut être réalisé en mettant en contact les gouttelettes avec un courant gazeux, de préférence un courant gazeux chauffé, pour obtenir des particules solides. De préférence, le flux gazeux utilisé est un gaz inerte. Le gaz de séchage peut être de préférence un gaz à faible teneur en oxygène contenant moins de 0,1 vol. %, de préférence moins de 0,05 vol. % en oxygène. Les gaz inertes augmentent la sécurité d'un système de séchage chauffé. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'azote est utilisé comme gaz inerte. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le gaz inerte protège les ingrédients actifs et les excipients contenus dans la formulation. De préférence, le séchage par atomisation est effectué dans un dispositif approprié pour le séchage par atomisation.
Le séchage par atomisation peut par exemple être réalisé dans une tour de séchage. Les liposomes déshydratés sont séparés du courant gazeux et collectés.
Dans un mode de réalisation préféré, la suspension liposomale comprend éventuellement un excipient hydrophile. Les excipients hydrophiles utiles peuvent être monomères, oligomères ou polymères et peuvent être trouvés parmi plusieurs classes chimiques de composés. Selon l'un des modes de réalisation préférés de l'invention, l'excipient hydrophile est un saccharide, par ex. un mono-, di-, oligo- ou polysaccharides, un alcool de sucre, un acide aminé, un peptide, une protéine, un polymère hydrosoluble ou une combinaison de ceux-ci. Un saccharide, ou hydrate de carbone, est défini comme un composé principalement composé de carbone, d'hydrogène et d'oxygène. Les saccharides utiles comprennent les sucres et les alcools de sucre, les oligosaccharides, les polysaccharides hydrosolubles et leurs dérivés. Les saccharides préférés selon l'invention comprennent, mais sans s'y limiter, le glucose, le fructose, le lactose, le saccharose, le tréhalose, le maltose, le cellobiose, le galactose, le maltotriose, le maltopentose, le raffinose, la dextrine, le dextran, l'inuline, le mannitol, le sorbitol, le xylitol, le chitosane; les dérivés de cellulose hydrosolubles tels que la méthylcellulose, l'hydroxypropylcellulose, l'hydroxyéthylcellulose et fhypromellose; les alginates, les amidons solubles ou les fractions d'amidon, la gomme xanthane, la gomme de guar, la pectine, la carraghénine, le galactomannane, la gomme gellane, la gomme adragante, y compris tout dérivé de ceux-ci. Les saccharides particulièrement préférés sont le glucose et le tréhalose.
D'autres excipients hydrophiles utiles peuvent être choisis parmi d'autres classes chimiques, telles que des acides aminés, des peptides ou des protéines solubles dans l'eau. Par exemple, la glycine ou d'autres acides aminés naturels peuvent être utilisés. Les protéines utiles comprennent, mais sans s'y limiter, la gélatine, l'albumine, la protéine de lactosérum, la protéine de soja ou d'autres protéines alimentaires ou végétales.
D'autres exemples d'excipients hydrophiles utiles sont des polymères tels que des polymères solubles dans l'eau tels que des polyéthylèneglycols solides, de l'alcool polyvinylique, des polyacrylates ou de la polyvinylpyrrolidone.
Selon l'invention, des mélanges de plus d'un excipient hydrophile peuvent être utilisés. Par exemple, il peut être nécessaire d'ajuster indépendamment plusieurs paramètres tels que le pH, la solubilité et la mouillabilité. Dans ce cas, un premier excipient hydrophile peut être choisi comme matériau support basique pour les systèmes colloïdaux, tandis qu'un ou plusieurs excipients hydrophiles supplémentaires peuvent être incorporés pour obtenir un certain pH et / ou mouillabilité.
Bien entendu, le milieu aqueux comprenant la suspension liposomale peut comprendre d'autres excipients ou substances auxiliaires, hydrophiles ou hydrosolubles. Ces substances sont solubles et extraites par le milieu d'extraction ou non, ces substances peuvent être incluses dans les particules sèches ou éliminées avec l'eau et le solvant organique. Les substances, qui sont comprises dans les particules sèches, doivent être pharmaceutiquement acceptables.
D'autres excipients préférés comprennent des stabilisants, des tensioactifs, des agents mouillants, des agents gonflants, des auxiliaires de lyophilisation, des antioxydants, des agents chélatants, des conservateurs, des agents osmotiques, des excipients acides ou alcalins pour ajuster le pH, etc.
Parmi les excipients préférés selon l'invention figurent les stabilisants et les antioxydants. Les antioxydants peuvent empêcher l'oxydation d'un composé actif incorporé, mais aussi celle des composants du colloïdal en particulier si l'on utilise des lipides sensibles à l'oxydation. Des composés utiles comprennent, par exemple, des antioxydants liposolubles tels que l'alpha, bêta et gamma-tocophérol, l'ubiquinol, le lycopène, l'alpha et le bêta-carotène, l'acide nordihydroguaiarétique, le butyl hydroxyanisole, le butyl hydroxytoluène, l'acide éthylènediamine tétraacétique, l’acide dienta-étriamine pentaacétique, etc. L'alpha-tocophérol et l'acide éthylènediamine tétraacétique sont particulièrement préférés, y compris leurs dérivés pharmaceutiquement acceptables. D'autre part, si des lipides saturés chimiquement purs, semi- synthétiques ou synthétiques sont utilisés pour la composition des systèmes colloïdaux, aucun antioxydant ne peut être nécessaire.
L'invention concerne également une poudre décrite ci-dessus telle que celle préparée par un procédé comprenant les étapes a-c), ladite poudre étant constituée ou comprend un liposome constitué ou qui comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome: i) de 25% à 35% d'au moins un phospholipide chargé négativement, ii) de 30% à 50% d'au moins un phospholipide zwitterionique, iii) de 20% à 30% d'au moins un stérol, v) de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP).
L'invention concerne également un procédé pour la préparation de liposomes avec une taille et une distribution de taille appropriées pour une administration par voie orale.
De préférence, les liposomes de la composition de la présente invention peuvent avoir un diamètre compris de 100 nm à 10 pm, de préférence de 1 à 10 pm et plus préférentiellement de 2 à 5 pm. Le diamètre des liposomes peut être contrôlé, par exemple, par l'extrusion de la composition liposomale à travers un filtre en polycarbonate ayant une taille de pore connue. Les procédés de contrôle de la taille des liposomes sont bien connus dans l'art et sont décrits, par exemple, dans Mayhew et al. (1984) Biochim. Biophys. Acta.
Il est possible de déterminer la granulométrie moyenne des liposomes. En effet, une distribution granulométrique est caractérisée par les valeurs moyennes (valeurs moyennes): nombre de diamètre moyen (NMD), volume moyen diamètre (VMD) et la polydispersité en taille est généralement caractérisée par le rapport VMD / NMD (poly dispersity index, PI ).
Une valeur de 1,00 ou proche de 1,00 signifie que toutes les particules ont la même taille, plus l'écart par rapport à 1,00 est élevé, plus la polydispersité de taille est élevée.
La distribution granulométrique peut être déterminée par la technique NANOTRAC basée sur l'analyse du mouvement brownien des particules dispersées dans un liquide par acquisition du spectre d'énergie correspondant au décalage de Doppier.
L'appareil MTUPA 250 - NANOTRAC 250, équipé d'un laser à 780 nm, fonctionne par diffusion laser pour des particules de taille de 0,8 à 6500 nm.
Les liposomes obtenus selon la présente invention sont caractérisés par une polydispersité de 1 ,00 à 1 , 20.
Les liposomes, les particules sèches ou une poudre les comprenant, tels qu'obtenus par le procédé de l'invention, peuvent être utilisés dans la fabrication d'un médicament. Si les particules satisfont à toutes les exigences d'une forme galénique pharmaceutique, elles peuvent être utilisées telles quelles et introduites directement dans des récipients appropriés.
La poudre contenant les liposomes peut contenir de l'eau résiduelle (0,1 à moins de 5%), étroitement liée aux lipides, résultant du procédé de préparation de ladite poudre.
En variante, la poudre contenant les liposomes peut être mélangée avec d'autres ingrédients actifs et / ou inactifs comme par exemple des supports pharmaceutiquement acceptables.
Selon un mode de réalisation particulier, la poudre est micronisée à une taille moyenne comprise entre 1 et 5 micromètres, adaptée à une administration par inhalation.
Pour une application par inhalation, la poudre selon l'invention est chargée dans un dispositif de pulvérisation à sec pour délivrer ladite poudre sous la forme d'un aérosol.
Ledit dispositif de pulvérisation à sec permet de déposer ladite poudre par exemple dans la gorge, sur les amygdales, ou avantageusement directement dans les alvéoles pulmonaires où les macrophages résidents peuvent être directement activés par la suspension liposomale formée in situ. L'invention concerne également une suspension liposomale, de préférence multi- lamellaire obtenue par mise en contact d'une poudre selon l'invention avec un milieu aqueux. Le milieu aqueux peut être de l’eau stérile, éventuellement tamponnée à pH 7,0 - 7,5 et contient éventuellement des conservateurs ou anti-oxydants.
L'invention concerne également l'utilisation d'une poudre ou d'une suspension liposomale multi-lamellaire selon l'invention pour l'activation in vivo du système immunitaire. Cette activation du système immunitaire est obtenue par absorption de la suspension liposomale par des cellules immunocompétentes qui sont ensuite activées après la liaison de la substance amphiphile immunostimulante à des récepteurs spécifiques. Cette activation peut également être obtenue via une étape initiale d'activation ex vivo dans des conditions de culture de cellules immunocompétentes spécifiques telles que des monocytes, des macrophages ou des cellules dendritiques.
Dans un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique selon l'invention contient la poudre présente dans une gamme de 50 mg à 2 g en une seule application ou unité.
Les liposomes de la présente invention sont stables en présence de sels biliaires. Selon la présente invention, on entend par «liposome stable en présence de sels biliaires », un liposome, dispersé dans un milieu aqueux, dont la bicouche lipidique n’est pas déstructurée par un traitement par les sels biliaires, de préférence en présence de taurocholate de sodium, déoxycholate de sodium et cholate hydrate de sodium ou leurs mélanges, de préférence un mélange contenant les trois sels biliaires.
Le test de stabilité des liposomes est réalisé en présence de sels biliaires à une concentration comprise de 2 à 10 mM chacun, de préférence 4 mM. Le test est effectué à une température ambiante de 20°C ou de 37°C. Les liposomes sont mis en contact avec les sels biliaires pendant au moins 1 heure, de préférence 2 heures ou 3 heures.
La stabilité des liposomes après traitement en présence de sels biliaires est mise en évidence par un test visuel. En effet, la suspension de liposomes avant traitement apparait légèrement opaque d’une couleur blanchâtre ; lorsque les liposomes sont dénaturés par les sels biliaires, la suspension de liposomes dénaturés est transparente. Une observation au microscope optique montre des débris de liposomes (voir Figure 6). La présente invention est par ailleurs illustrée, sans toutefois s’y limiter, par les figures et exemples suivants.
LISTE DES FIGURES
La figure 1 montre un flacon contenant une suspension de liposome avant traitement par des sels biliaires.
La figure 2 montre des images de microscopie optique de liposomes avant filtration (image A) et après filtration à 5 pm (image B). Le grossissement est de xl030.
La figure 3 montre la distribution de tailles des liposomes obtenue par une méthode d’analyse d’image automatisée.
La figure 4 montre une image de microscopie optique de liposomes formant des agrégats d’une taille supérieure à 20 pm.
La figure 5 montre un flacon contenant une suspension de liposome après traitement par des sels biliaires. L’observation du flacon montre que les liposomes sont dénaturés et la suspension devient transparente (Image A)
La figure 6 montre une image de microscope optique d’une suspension de liposomes dénaturés.
PARTIE EXPERIMENTALE :
Exemple 1: Fabrication et analyses des suspensions de MTP-PE liposomal
Les réactifs suivants ont été utilisés (les fournisseurs sont indiqués entre parenthèses) : MTP- PE (ou mifamurtide, Sigma-Aldrich), méthanol (VWR Chemicals), éthanol (Sigma- Aldrich), chloroforme (Sigma-Aldrich), dichlorométhane (Carlo Erba), acétonitrile (VWR Chemicals), acétone (Sigma-Aldrich), acétate d’éthyle (Carlo Erba), tétrahydrofurane (VWR Chemicals), dimethylsulfoxide (Honey Well), acide trifluoroacétique (VWR Chemicals), formate d’ammonium formate (Fluka), 2-oleoyl-l-palmitoyl-sn-glycero-3 -phosphocholine ou POPC (Lipoid), l,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine ou DOPS, sous forme de sel de sodium (Avanti Polar Lipids), cholesterol (Sigma-Aldrich), l,2-didecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine ou DDPC (Lipoid), l,2-dilauroyl-sn-glycero-3 -phosphocholine ou DLPC (Lipoid), l,2-dimyristoyl-sn-glycero-3 -phosphocholine ou DMPC (Lipoid), 1 ,2-dipalmitoyl- sn-glycero-3-phosphocholine ou DPPC (Lipoid) et l,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine ou DSPC (Lipoid). Méthode: Les lipides et le mifamurtide ont été dissouts dans un mélange de chloroforme et de méthanol (5: 1), à la concentration de 30 mg/mL approximativement, puis concentré par séchage dans un évaporateur rotatif (2 heures à 40°C) pour former un film lipidique. Le film lipidique a ensuite été réhydraté dans une solution aqueuse saline (0.9% NaCl, 5 mL) à température ambiante et sous agitation magnétique. La suspension obtenue a ensuite été filtrée 10 fois au travers d’une membrane polycarbonate de 5 pm avec l’aide d’un Mini-Extruder Avanti Polar afin d’obtenir une suspension liposomale.
Plusieurs types de liposomes, contenant 0,4 % de MTP-PE (soit 1 mg de mifamurtide pour 250 mg de lipides), ont été préparés en utilisant des proportions de lipides variables (exprimées en %).
Figure imgf000028_0001
Tableau 1
Les suspensions liposomales ainsi préparées ont été analysées de trois façons: 1.) par l’observation visuelle des flacons, 2.) par l'observation visuelle des liposomes au microscope optique et 3.) par la mesure de la distribution de tailles des particules (DTP), par un système d’analyse d’image automatisé. Pour cette analyse, une aliquote de 5 pL est placée entre deux lamelles de microscope, et plusieurs champs sont examinés pour l’évaluation de la distribution granulométrique. L’analyse d’image automatisée mesure la taille d’environ 30 000 particules liposomale pour chaque suspension. Résultats: La méthode de préparation permet d’obtenir des suspensions liposomales translucides et légèrement opaque, par exemple la Figure 1 montre un flacon contenant la suspension N°8.
La Figure 2 montre des images de microscopie optique des liposomes de la suspension N°8, avant filtration (image A) et après filtration à 5 pm (image B). Le grossissement est de xl030.
Dans la Figure 2, l’image A montre une suspension liposomale obtenue sans aucune filtration. Les liposomes sont hétérogènes, sans forme ronde, et ont des tailles qui peuvent dépasser 50 pm. L’image B montre une suspension liposomale après une série de dix filtrations à travers une membrane filtrante de 5 pm. Dans ce cas, les liposomes observées étaient beaucoup plus homogènes en termes de forme et de tailles (inférieures à 10 pm.)
La Figure 3 donne un exemple typique de la distribution de tailles des particules qui est obtenue par la méthode d’analyse d’image automatisée. Les résultats de cette analyse sont caractérisés par les valeurs dlO, d50 et d90 qui indiquent la taille maximale (en pm) atteinte par 10%, 50 et 90% des particules liposomales, respectivement, de chaque suspension analysée.
Le Tableau 2 ci-dessous résume les résultats de ces analyses pour les suspensions de liposomes décrites dans le Tableau 1.
Figure imgf000030_0001
Tableau 2
L’observation des flacons de suspensions liposomales N° 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 et 15 montrent des liquides translucides, légèrement opaques et similaires à la Figure 1. L’observation au microscope de ces suspensions a montré qu’elles étaient similaires à celle qui est illustrée dans la Figure 2-Image B. Ces suspensions ont fait l’objet d’une étude de distribution de tailles des particules par analyse d’image automatisée. Les résultats sont indiqués dans le Tableau 2.
Ces résultats montrent que sans addition de DOPS, les particules liposomales obtenues après extrusion au travers d’un filtre 5 pm sont instables et reforment spontanément de gros agrégats.
Ces résultats montrent également que la proportion de cholesterol ne doit pas dépasser 30% puisqu’une proportion supérieure empêche l’obtention de suspensions liposomales homogènes. Exemple 2 : Analyse de la concentration de MTP-PE
La fraction soluble de MTP-PE (sous forme libre ou encapsulée dans des liposomes) a été quantifiée dans chaque préparation, après dilution d’un aliquote dans un mélange de solvant afin de permettre son injection dans un appareil de chromatographie. La concentration en solution a été mesurée par HPLC. Les conditions d’analyse HPLC sont résumées dans le Tableau 3.
Figure imgf000031_0001
Tableau 3 Dans ces conditions, un pic de rétention est observé à 6,5 minutes. Les analyses des pics des suspensions n° 2, 3, 4, 7 et 8 révèlent des concentrations de 0,08 mg/ml qui sont cohérentes avec leurs préparations.
Exemple 3: Effets des sels biliaires sur la stabilité des suspensions de MTP-PE liposomal Les suspensions liposomales N° 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 et 15 décrites dans l’exemple 1 ont été exposées à un mélange de sels biliaires (taurocholate de sodium, déoxycholate de sodium et cholate hydrate de sodium) à la concentration de 4 mM chacun, à 37° C et pendant 3 heures. La stabilité a été évaluée à l’aide des méthodes indiquées dans l’exemple 1, à T-Oh (immédiatement après exposition aux sels biliaires), puis à T-lh et à T-3h (au bout d’une heure et de trois heures d’exposition aux sels biliaires, respectivement.) Les résultats sont résumés dans le Tableau 4.
Figure imgf000032_0001
Tableau 4 La Figure 5 montre des photographies de flacons contenant une suspension N°2 à gauche (image A) et une suspension N°8 à droite (image B). Ces deux suspensions ont été mélangées avec des sels biliaires. La suspension N°2 est devenue limpide et transparente après quelques minutes d’exposition aux sels biliaires. A l’observation microscopique, il a été impossible de retrouver des liposomes. A l’inverse, la suspension N°8 a résisté à la dégradation par les sels biliaires.
La Figure 6 montre une photographie prise au microscope optique de la suspension N°12 après une heure d’exposition aux sels biliaires. L’image révèle une dégradation presque totale des liposomes puisque seuls quelques débris sont visibles.
Pris collectivement, ces résultats montrent que les formulations liposomales qui incluent la DSPC, la DPPC, la DMPC ou la DLPC à la place de la POPC, ainsi que la DOPS à 25-35% et une proportion de cholestérol comprise entre 20 et 30% permettent de résister à la dégradation par les sels biliaires pendant plusieurs heures.
Exemple 4: Effets du pH acide sur la stabilité des suspensions de MTP-PE liposomal
Les suspensions liposomales N° 2 et N° 8 ont été exposées pendant 1 heure à un pH 1. L’examen visuel des suspensions dans les flacons et au microscope n’a pas révélé d’effet notable de dégradation.
Exemple 5: Inclusion de MTP-PE dans les liposomes
La méthode a été préparée selon la méthode décrite dans l’exemple n° 1 et en utilisant les proportions de lipides de la solution N°8. Différentes proportions de MTP-PE ont été additionnées: 0,4%, 1%, 5% et 10%.
L’observation des flacons et au microscope de ces suspensions a montré des suspensions liposomales similaires aux Figures 1 et 2-B. L’addition de MTP-PE jusqu’à une proportion de 10% n’entraine donc pas de désorganisation de la structure des liposomes.
Exemple 6: Fabrication de MTP-PE liposomal sous forme de poudre sèche
Les particules liposomales séchées ont été préparées en utilisant une méthode d’atomisation séchage connue comme « spray drying .» L’appareil utilisé était un Büchi mini spray dryer 290. Le processus d’atomisation séchage comporte quatre étapes: atomisation du produit dans une buse de pulvérisation, contact air-pulvérisation, séchage des gouttelettes de pulvérisation et collecte du produit solide.
La méthode a été utilisée selon les proportions de la solution N°8. Les lipides et le mifamurtide ont été dissouts dans un mélange de chloroforme et de méthanol (5:1) à la concentration finale de 80 pM.
La solution a été injectée à l'aide d'une buse de pulvérisation de 1 mm de diamètre et un flux de 20 ml/minutes. La température de la chambre de séchage était de 90°C. Les particules séchées par atomisation ont été collectées dans un réservoir attaché à un cyclone et stockées dans un réfrigérateur avant leur caractérisation.
Les particules obtenues ont été mesurées par microscopie et avaient un diamètre moyen compris entre 1 et 5 urn.
La poudre sèche ainsi obtenue a été dissoute dans une solution aqueuse saline (NaCl 0,9%). La suspension a été secouée manuellement pendant quelques minutes. L’observation au microscope a montré une suspension liposomale composée de particules d’une taille moyenne de 2 pm, démontrant ainsi que la poudres sèche ainsi obtenue est hydrodispersible.
Exemple 7: Fabrication de MTP-PE liposomal sous forme de poudre sèche
Deux types de particules liposomales sèches ont été préparées en utilisant la méthode décrite dans l’exemple 5, soit en rajoutant du mannitol (35 mM) dans la solution de départ, soit sans en rajouter.
La cristallinité de ces particules sèches préparées avec et sans mannitol a été déterminée par diffraction des rayons X, avec une source de cuivre (Philips, modèle XPERT). Les mesures ont été effectuées à température ambiante en utilisant quelques milligrammes de chaque échantillon et une vitesse de balayage de 2 degrés par minute.
Les résultats montrent une plus grande cristallinité pour les suspensions préparées sans mannitol.
Exemple 8: Etude de l’administration orale de MTP-PE liposomal chez la souris
Des suspensions de MTP-PE liposomal N° 1 et N°10 ont été préparées selon la méthode indiquée dans l’exemple 1. En outre, ces liposomes ont été préparées en incorporant 0,5% d’un marqueur fluorescent N-4-nitrobenzo-2-oxa-l ,3-diazolephosphatidyléthanolamine.
Un lot de 30 souris BALB/c a été divisé au hasard en deux Groupes A et B de 15 souris. Les souris du Groupe A ont reçu une administration de la suspension N°1 par gavage orale à la dose de 20 Lig de MTP-PE et les souris du Groupe B ont reçu une administration de la suspension N°10 à la même dose de MTP-PE. Des échantillons de sang (environ 100 uL) ont été prélevés à 1, 4 et 24 heures après l’administration orale (5 souris par Groupe et par temps de prélèvement). Des frottis ont été réalisés à partir de chaque prélèvement de sang. Les frottis ont été examinés avec un microscope à fluorescence (Zeiss fluorescence microscope) et le nombre de monocytes fluorescents a été compté pour chaque frottis. Le nombre de monocytes fluorescent est un marqueur du niveau d’absorption des liposomes, c’est-à-dire du transfert des liposomes intacts et non déstructurés de la lumière du tractus intestinal vers la circulation sanguine. Après leur passage dans la circulation sanguine, les liposomes qui ont été absorbés sont rapidement phagocytés par les monocytes circulants. Le nombre moyen de monocytes fluorescents était 3, 7 et 5 fois plus élevé dans le Groupe B par comparaison au Groupe A, aux temps 1 , 4 et 24 heures, respectivement.
Exemple 9: Etude préclinique de preuve de concept - Efficacité thérapeutique du MTP- PE liposomal préparé selon l’invention et administré par voie orale dans un modèle de cancer de rein
L’objectif de cette étude était d’évaluer la capacité d’une suspension de MTP-PE liposomal, préparée selon l’invention et administrée oralement, d’inhiber le développement de métastases pulmonaires à partir d’un cancer de rein.
Le modèle expérimental consistait à utiliser des souris immunocompétentes de souche BALB/c et à leur greffer des cellules RENCA de cancer de rein d’origine murine sous la capsule de l’un des deux reins. Cette greffe orthotopique forme une tumeur rénale syngénique. Dans ce modèle, des cellules tumorales disséminent de façon continue dans l’organisme de l’animal et forment de très nombreuses métastases dans les poumons après 17 jours.
Matériel et méthodes
Des suspensions de liposomes ont été préparées selon la méthode indiquée dans l’exemple 1.
Figure imgf000035_0001
Tableau 5 Des tests de résistance aux sels biliaires ont été réalisés selon la méthode décrite dans l’ Exemple 3 et ont montré que les Lots A et B sont résistants alors quel le lot C est rapidement déstructuré. La lignée cellulaire RENCA est dérivée d'une tumeur qui est apparue spontanément sous la forme d'un adénocarcinome cortical rénal chez des souris BALB/c et a été fourni par l’ American Type Culture Collection (USA). Les cellules tumorales ont été cultivées en monocouche à 37°C dans une atmosphère humidifiée (5 % CO2, 95 % air). Le milieu de culture était du RPMI 1640 contenant 2 mM de L-glutamine additionné de 10 % de sérum bovin fœtal et 0,1 mM d’acides aminés non essentiels et 1 mM de pyruvate de sodium. Les cellules tumorales adhèrent aux flacons en plastique. Pour une utilisation expérimentale, les cellules tumorales sont détachées du flacon de culture par un traitement de 5 minutes à la trypsine-versène, dans du milieu de Hanks sans calcium ni magnésium et neutralisées par ajout de milieu de culture complet. Les cellules sont ensuite comptées et la viabilité est évaluée à l'aide d'un test d'exclusion au bleu trypan à 0,25%.
Quarante souris femelles saines BALB/c, âgées de 6 à 7 semaines à la réception, ont été obtenues auprès de Charles River.
Les tumeurs RENCA ont été induites au jour zéro (J0) par voie orthotopique sur 40 souris femelles BALB/c sous anesthésie. Brièvement, l'abdomen de l'animal a été ouvert par une incision médiane dans des conditions aseptiques. Un total de 500 000 cellules tumorales RENCA dans 25 pL de milieu RPMI ont été injectées lentement dans l'espace sous capsulaire du rein droit.
Les animaux ont été randomisés en fonction de leur poids corporel individuel au Jour -2. Les animaux ont été randomisés en quatre groupes de dix animaux chacun (Groupe 1, Groupe 2, Groupe 3 et Groupe 4.) L'homogénéité de poids corporel entre les groupes a été testée par une analyse de variance (ANOVA).
Les animaux du Groupe 1 n’ont pas été traités. Les animaux des Groupes 2, 3 et 4 ont été traités avec les Lot B, A et C, respectivement. Les traitements ont été administrés aux Jours 0, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 et 17. Le traitement a été administré par gavage oral à l’aide d’un tube de gavage. Le volume d'administration était de 5 ml/kg ajusté au poids corporel individuel le plus récent. Dans les Groupes 3 et 4, la dose de MTP-PE était de 1 mg/kg.
Tous les animaux ont été euthanasiés par une anesthésie profonde au gaz isoflurane au Jour 17, une heure après le traitement.
Un échantillon de sang de 500 LIL a été prélevé par ponction intracardiaque. Le sang a été collecté dans des tubes de prélèvement avec un anticoagulant (héparine de lithium). Les tubes ont été centrifugés (2000 g, 10 minutes, 4°C) pour obtenir le plasma et le culot cellulaire. Le plasma de chaque animal a été aliquoté et conservé dans deux tubes en propylène (environ 125 uL/tube) à -80°C pour évaluer les taux plasmatiques de MTP-PE liposomal selon la méthode décrite dans l’article Venkatakrishnan et al. British Journal of Clinical Pharmacology 77(6): 986-97, 2014.) Le culot cellulaire de chaque animal a été transféré et conservé dans un tube en propylène à -80°C pour une analyse ultérieure.
Les paires de poumons de toutes les souris ont été prélevés et pesés. Le poids des poumons reflète la quantité totale de métastases pulmonaires. En outre, une numération macroscopique des métastases pulmonaires sur chaque poumon a été effectuée chez toutes les souris. Les poumons ont ensuite été fixés dans du formol tamponné neutre à 4 % pendant 24 à 48 h, puis inclus dans de la paraffine (Histowax®, Histolab, Suède). Les échantillons ont été conservés à température ambiante pour une analyse microscopique ultérieure
Résultats Les résultats des comptages des métastases pulmonaires sont résumés dans Tableau 6.
Figure imgf000037_0001
Tableau 6 Ces résultats montrent une réduction importante du nombre de métastases pulmonaires dans le Groupe 3 par comparaison aux Groupes 1 , 2 et 4.
Les résultats concernant le poids des poumons sont résumés dans Tableau 7.
Figure imgf000038_0001
Tableau 7
Ces résultats ont montré une réduction importante du poids de poumons dans le Groupe 3 par comparaison aux Groupes 1, 2 et 4. Cette réduction était statistiquement significative (p<0,05, test T de Student) par comparaison aux Groupes 2 et 4.
Les taux plasmatiques de MTP-PE liposomal étaient également significativement plus élevés dans le Groupe 3 par comparaisons aux Groupes 2 et 4.
Conclusion
Ces résultats démontrent la capacité du MTP-PE d’inhiber la dissémination métastatique d’une tumeur cancéreuse quand il est formulé dans des liposomes préparés selon l’invention et administré par voie orale. Ces résultats démontrent également qu’une suspension de liposomes préparés selon l’invention et sans ajout de MTP-PE n’a pas cette capacité. Ces résultats montrent également que le MTP-PE formulé dans des liposomes qui sont déstructurés en présence de sels biliaires n’a pas cette capacité. Dans une étude publiée avec un modèle murin utilisant également des celleules RENCA (S. Tanguay et al., Cancer Res. 1994 Nov. 15 ;54(22):5882-8), l'activité anticancéreuse in vivo du MTP-PE formulé des liposomes de phosphatidylcholine et administré par voie orale à des souris avait montré une activité anticancéreuse modérée. Les conditions expérimentales utilisées dans notre modèle étaient beaucoup plus sévères. En effet, dans l’étude de Tanguay, une quantité maximum de 25 000 cellules RENCA avait été injectée une seule fois par voie intraveineuse aux souris. Dans notre modèle, une quantité de 500 000 cellules a été greffée dans un rein des animaux et ces cellules ont constitué une tumeur rénale chez chaque animal. Dans l’étude de Tanguay, la quantité maximale de métastases pulmonaires était de 150 alors que cette quantité dépassait 400 dans notre modèle.
Ainsi, dans nos conditions expérimentales qui reflètent une maladie cancéreuse métastatique beaucoup plus sévère, le MTP-PE formulé dans des liposomes dégradés par les sels biliaires (Groupe 4) n’a pas montré d’activité anti-métastatique.
Exemple 10 : Etude préclinique de preuve de concept - Efficacité thérapeutique du MTP- PE liposomal préparé selon l’invention et administré par voie orale dans un modèle d’ostéosarcome (cancer de l’os)
L’objectif de cette étude était d’évaluer la capacité d’une suspension de MTP-PE liposomal, préparée selon l’invention et administrée oralement, d’inhiber le développement de métastases pulmonaires à partir d’un cancer de l’os.
Le modèle expérimental consistait à utiliser des souris immunocompétentes de souche C57BL/6 et à leur greffer des cellules MOS-J d’ostéosarcome d’origine murine par injection intramusculaire paratibiale, reproduisant ainsi la maladie humaine. Cette greffe orthotopique forme une tumeur osseuse ostéolytique. Dans ce modèle syngénique, des cellules tumorales disséminent de façon continue dans l’organisme de l’animal et forment des métastases dans les poumons au bout de 5 semaines.
Des suspensions de liposomes ont été préparées selon la méthode indiquée dans l’exemple 1.
Figure imgf000039_0001
Figure imgf000040_0001
Des tests de résistance aux sels biliaires ont été réalisés selon la méthode décrite dans l’ Exemple 3 et ont montré que les Lots D2 et E2 sont résistants alors quel le lot F2 est rapidement déstructuré.
La lignée cellulaire MOS-J est dérivée d'une tumeur osseuse de souris et a été fournie par le Jackson Laboratory (USA). Les cellules tumorales ont été cultivées en monocouche à 37°C dans une atmosphère humidifiée (5 % CO2, 95 % air). Le milieu de culture était du RPMI 1640 additionné de 5 % de sérum bovin fœtal.
Cinquante souris C57B1/6, âgées de 5 à 6 semaines à la réception, ont été obtenues auprès de Charles River. Les tumeurs osseuses ont été induites par injection intramusculaire paratibiale de 3 000 000 cellules MOS-J par souris.
Les animaux ont été randomisés deux jours plus tard en fonction de leur poids corporel individuel en 5 groupes de dix animaux chacun (Groupe 1, Groupe 2, Groupe 3, Groupe 4 et Groupe 5.)
Les animaux du Groupe 1 n’ont pas été traités. Les animaux des Groupes 2, 3 et 4 ont été traités avec les Lot E2, D2 et F2, respectivement. Les animaux du Groupe 5 ont été traités avec une solution aqueuse de MTP-PE. Les traitements ont été administrés par voie orale deux à trois fois par semaine. Dans les Groupes 3, 4 et 5, la dose de MTP-PE était de 1 mg/kg.
Tous les animaux ont été euthanasiés après 5 semaines et le nombre de métastases pulmonaires a été compté à l’aide d’une loupe binoculaire.
Les résultats ont montré qu’il y avait entre 0 et 7 métastases pulmonaires par souris dans le Groupe 2 alors que ce nombre variait entre 6 et 23 dans les autres Groupes. Ces résultats ont donc montré un effet anti-métastatique du MTP-PE quand ce composé est formulé sous forme de liposomes résistants aux sels biliaires et administré par voie orale.
Exemple 11 : Etude préclinique de preuve de concept - Efficacité thérapeutique du MTP- PE liposomal préparé selon l’invention et administré par voie orale dans un modèle de cancer mammaire. L’objectif de cette étude était d’évaluer la capacité d’une suspension de MTP-PE liposomal, préparée selon l’invention et administrée oralement, d’inhiber le développement de métastases pulmonaires à partir d’un cancer de la glande mammaire.
Le modèle expérimental consistait à utiliser des souris immunocompétentes de souche BALB/c et à réaliser une greffe orthotopique de cellules 4T-1 de cancer mammaire d’origine murine. Cette greffe orthotopique forme une tumeur reproduisant le cancer du sein humain qui dissémine et forme des métastases dans les poumons au bout de 3 semaines.
Des suspensions de liposomes ont été préparées selon la méthode indiquée dans l’exemple 1.
Figure imgf000041_0001
La lignée cellulaire 4T1 est dérivée d'une tumeur mammaire de souris et a été fournie par l’ATCC (USA). Les cellules tumorales ont été cultivées en monocouche à 37°C dans une atmosphère humidifiée (5 % CO2, 95 % air). Le milieu de culture était du RPMI 1640 additionné de 5 % de sérum bovin fœtal.
Les tumeurs 4T1 ont été induites au jour zéro (JO) par voie orthotopique sur 60 souris femelles BALB/c sous anesthésie. Un total de 300 000 cellules tumorales 4T1 ont été injectées lentement dans le tissu mammaire thoracique droit.
Les animaux ont été randomisés en fonction de la taille de leur tumeur au Jour 9 en six groupes de dix animaux chacun (Groupes 1, 2, 3, 4 et 5.) L'homogénéité des tailles de tumeur entre les groupes a été testée par une analyse de variance (ANOVA).
Les animaux des Groupe 1, 2 et 3 ont été traités respectivement avec le Lot H3 (contrôle), le Lot G3 et le Lot G3 deux fois par semaine par voie orale. De plus, les animaux des Groupe 2 et 4 ont été traités avec des injections intraveineuses de doxorubicine à 8 mg/kg une fois par semaine pendant 3 semaines. Les animaux des Groupe 3 et 5 ont été traités avec des injections intrapéritonéales d’un anticorps monoclonal anti-PD-Lldeux fois par semaine pendant 3 semaines. Tous les animaux ont été euthanasiés après 3 semaines. Le nombre de métastases pulmonaires a été compté à l’aide d’une loupe binoculaire. Les résultats ont montré qu’il y avait entre 10 et 30 métastases pulmonaires dans les Groupes 1, 4 et 5 alors que les métastases étaient significativement réduites dans les Groupes 2 et 3. Les traitements par chimiothérapie (doxorubicine) et immunothérapie (anti PD-L1) n’ont pas montré d’efficacité significative dans ce modèle. Par contre, le nombre de métastases étaient très réduit quand les animaux recevaient une combinaison de chimiothérapie ou d’immunothérapie, en combinaison avec le MTP-PE formulé sous forme de liposomes résistants aux sels biliaires et administré par voie orale.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition liposomale utile pour une administration orale constituée ou comprenant : a) une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile, encore plus de préférence de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), par rapport au poids total de la composition liposomale; b) un liposome constitué ou comprenant: i) de 25% à 35% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide chargé négativement, de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide zwitterionique, de préférence 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole d'au moins un stérol, de préférence 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, pourvu que le au moins un phospholipide zwitterionique ne soit ni la palmitoyl-oleoyl- phosphatidyl-choline (POPC), ni la 1 ,2-didecanoyl 1-sn- glycero-3 -phosphocholine (DDPC).
2. Composition liposomale selon la revendication 1, caractérisée en ce que le au moins un phospholipide chargé négativement est choisi dans le groupe comprenant le phosphatidylinositol (PI), la phosphatidylsérine (PS), le phosphatidylglycérol (PG), l'acide phosphaphatique (PA), le diphosphatidylglycérol (DPG) ou la cardiolipine (CL), leurs dérivés comprenant un ou plusieurs résidu(s) d’acide(s) gras, et leurs mélanges.
3. Composition liposomale selon la revendication 2, caractérisée en ce que le au moins un phospholipide chargé négativement est choisi dans le groupe comprenant la phosphatidylsérine (PS), ou un dérivé de la phosphatidyl sérine choisi dans le groupe comprenant la palmitoyloléoyl-phosphatidylsérine (POPS), palmitoyl-linoléoyl phosphatidylsérine (PLPS), palmitoyl-arachidonoyl-phosphatidylsérine (PAPS), palmitoyl docosa-hexaénoyl phosphatidylsérine (PDPS), stéaroyl-oléoyl-phosphatidylsérine (OSPS), stéaroyl-linoléoyl-phosphatidylsérine (GPPS), stéaroyl- arachidonoyl-phosphatidylsérine (SAPS), stéaroyl docosa-hexaénoyl phosphatidylsérine (SDPS), di-capryl- phosphatidylsérine (Cl OPS), di-lauroyl-phosphatidylsérine (DLPS), di-myristoyl-phosphatidylsérine (DMPS), di- phytanoyl-phosphatidylsérine (DPhPS), di-heptadecanoyl phosphatidylsérine (PS 17:0/17:0), di-oléoyl-phosphatidylsérine (DOPS), di-palmitoyl-phosphatidylsérine (DPPS), di-stéaroyl phosphatidylsérine (DSPS), di-linoléoyl phosphatidylsérine (dil8:3 PS) di-erucoyl phosphatidylsérine, di-docosahexaenoyl- phosphatidylsérine, et leurs mélanges, de préférence la di-oleoyl-phosphatidylsérine (DOPS).
4. Composition liposomale selon la revendication 1, caractérisée en ce que le au moins un phospholipide zwitterionique est choisi dans le groupe comprenant la phosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, leurs dérivés comprenant un ou plusieurs résidu(s) d’acide(s) gras, la lécithine, la lysolécithine, la lysophatidyl-éthanolamine, les phosphoglycérides, et leurs mélanges, pourvu que le au moins un phospholipide zwitterionique ne soit pas la palmitoyl-oleoyl- phosphatidyl-choline (POPC).
5. Composition liposomale selon la revendication 4, caractérisée en ce que le au moins un phospholipide zwitterionique est la phosphatidylcholine ou un dérivé de la phosphatidylcholine choisi dans le groupe comprenant la di-arachidonoyl-phosphatidyl-choline (DAPC), la di-élaidoyl-phosphatidyl-choline (DEPC), la dilauroyl-phosphatidyl-choline (DLaPC), la di-linoléoyl-phosphatidyl-choline (DLPC), la di-linolénoyl-phosphatidyl-choline (DLnPC), la di-myristoyl-phosphatidyl-choline (DMPC), la di-myristoleoyl phosphatidylcholine (DMoPC), la di-oléoyl phosphatidyl-choline (DOPC), la di-palmitoyl- phosphatidyl-choline (DPPC), la di-pentadécanoyl phosphatidyl-choline (DPePC), la di- palmitoléoyl-phosphatidyl-choline (DPoPC), la di-phytanoyl-phosphatidyl-choline (DPhPC), la di-petrosélénoyl-phosphatidyl-choline (DPsPC), la di-tridécanoyl phosphatidyl-choline (DTPC), la l-hexadécyl-2-arachidonoyl phosphatidylcholine (HAPC), la palmitoyl- arachidonoyl-phosphatidyl-choline (PAPC), la l,2-dihexadécanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (DPPC), et la l,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) et leurs mélanges, de préférence la l,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) et encore plus de préférence la di-myristoyl-phosphatidyl-choline (DMPC).
6. Composition liposomale selon la revendication 1, caractérisée en ce que le au moins un stérol est choisi dans le groupe constitué par le cholestérol, les dérivés du cholestérol tels que le cholestérol-phosphocholine, le cholestérolpolyéthylèneglycol et le cholestérol-S04, les esters de cholestéryle, la vitamine D, les phytostérols, tels que le sitostérol, le campestérol et le stigmastérol et leurs mélanges, de préférence le cholestérol.
7. Composition liposomale selon la revendication 1, caractérisée en ce que: a) 1’ immunostimulant lipophile est le MTP-PE (mifamurtide), de préférence à une concentration de 0,1 à 10 % en poids par rapport au poids de la composition liposomale, b) un liposome constitué ou qui comprend: i) de 25% à 35% en poids ou en mole de DOPS, de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale du liposome, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole de DSPC, DPPC, DMPC, ou DLPC, de préférence 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale du liposome, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole de cholestérol, de préférence 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30% par rapport au poids total ou à la masse molaire totale du liposome.
8. Composition liposomale selon l’une quelconque des revendications précédentes, pour la préparation d’une composition pharmaceutique destinée à une administration par voie orale.
9. Composition liposomale selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle se présente sous la forme d’une poudre sèche, comprenant optionnellement un stabilisant, ou un autre excipient pharmaceutiquement acceptable.
10. Composition liposomale selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, pour son utilisation pour le traitement ou la prévention d’un cancer, notamment l’ostéosarcome, le cancer du rein ou le cancer de la glande mammaire.
11. Composition liposomale selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, pour son utilisation pour le traitement et/ou la prévention de métastases cancéreuses, en particulier de métastases pulmonaires.
PCT/EP2022/052020 2021-01-29 2022-01-28 Compositions liposomales orales Ceased WO2022162131A1 (fr)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP22701404.0A EP4284332A1 (fr) 2021-01-29 2022-01-28 Compositions liposomales orales
CA3204844A CA3204844A1 (fr) 2021-01-29 2022-01-28 Compositions liposomales orales
US18/263,248 US20240108685A1 (en) 2021-01-29 2022-01-28 Oral liposomal compositions
AU2022212571A AU2022212571A1 (en) 2021-01-29 2022-01-28 Oral liposomal compositions
JP2023546165A JP2024504814A (ja) 2021-01-29 2022-01-28 経口リポソーム組成物
CN202280019481.3A CN116981441A (zh) 2021-01-29 2022-01-28 口服脂质体组合物

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR2100892A FR3119325B1 (fr) 2021-01-29 2021-01-29 Compositions liposomales orales
FRFR2100892 2021-01-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022162131A1 true WO2022162131A1 (fr) 2022-08-04

Family

ID=74871674

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2022/052020 Ceased WO2022162131A1 (fr) 2021-01-29 2022-01-28 Compositions liposomales orales

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20240108685A1 (fr)
EP (1) EP4284332A1 (fr)
JP (1) JP2024504814A (fr)
CN (1) CN116981441A (fr)
AU (1) AU2022212571A1 (fr)
CA (1) CA3204844A1 (fr)
FR (1) FR3119325B1 (fr)
WO (1) WO2022162131A1 (fr)

Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4663311A (en) * 1983-08-16 1987-05-05 Tenu Jean P Derivatives of muramyl-peptides and of steroids having macrophage-activating properties
WO1993017702A1 (fr) * 1992-03-03 1993-09-16 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Vaccin oral
US5662907A (en) 1992-08-07 1997-09-02 Cytel Corporation Induction of anti-tumor cytotoxic T lymphocytes in humans using synthetic peptide epitopes
US5750395A (en) 1993-08-06 1998-05-12 Cytel Corporation DNA encoding MAGE-1 C-terminal cytotoxic t lymphocyte immunogenic peptides
WO2001041787A1 (fr) 1999-12-10 2001-06-14 Epimmune Inc. Induction de reponses immunes cellulaires a her2/neu a l'aide de compositions renfermant des peptides et des acides nucleiques
WO2001042270A1 (fr) 1999-12-10 2001-06-14 Epimmune Inc. Induction de reponses immunes cellulaires a l'antigene carcinoembryonnaire a l'aide des compositions renfermant des peptides et des acides nucleiques
WO2001045728A2 (fr) 1999-12-21 2001-06-28 Epimmune Inc. Induction de reponses immunitaires cellulaires aux antigenes du cancer de la prostate au moyen de compositions de peptides et d'acides nucleiques
CA2117769C (fr) * 1992-04-10 2003-07-22 Shuji Sato Composition de liposome
US6602510B1 (en) 2000-04-05 2003-08-05 Epimmune Inc. HLA class I A2 tumor associated antigen peptides and vaccine compositions
WO2003068816A1 (fr) 2002-02-13 2003-08-21 Oxford Biomedica Uk Limited Epitopes peptidiques de classe i mhc provenant de l'antigene associe aux tumeurs 5t4 humain
US20040157780A1 (en) 1993-11-29 2004-08-12 Epimmune Inc. CTL inducing peptides from c-erb2 (HER-2/neu)
WO2007014754A1 (fr) 2005-08-02 2007-02-08 I.D.M. Immuno-Designed Molecules Procede pour la preparation de formulations liposomiques
US7976301B2 (en) 2005-07-19 2011-07-12 Takata-Petri Ag Device and method for removing an oblong burr from a molded part
US20140050780A1 (en) * 2010-12-23 2014-02-20 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Liposomal formulation of nonglycosidic ceramides and uses thereof
US20170165200A1 (en) * 2015-11-20 2017-06-15 University Of North Texas Health Science Center Composition of lipid-based nanoparticles for small molecules and macromolecules

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4663311A (en) * 1983-08-16 1987-05-05 Tenu Jean P Derivatives of muramyl-peptides and of steroids having macrophage-activating properties
WO1993017702A1 (fr) * 1992-03-03 1993-09-16 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Vaccin oral
CA2117769C (fr) * 1992-04-10 2003-07-22 Shuji Sato Composition de liposome
US5662907A (en) 1992-08-07 1997-09-02 Cytel Corporation Induction of anti-tumor cytotoxic T lymphocytes in humans using synthetic peptide epitopes
US5750395A (en) 1993-08-06 1998-05-12 Cytel Corporation DNA encoding MAGE-1 C-terminal cytotoxic t lymphocyte immunogenic peptides
US20040157780A1 (en) 1993-11-29 2004-08-12 Epimmune Inc. CTL inducing peptides from c-erb2 (HER-2/neu)
WO2001041787A1 (fr) 1999-12-10 2001-06-14 Epimmune Inc. Induction de reponses immunes cellulaires a her2/neu a l'aide de compositions renfermant des peptides et des acides nucleiques
WO2001042270A1 (fr) 1999-12-10 2001-06-14 Epimmune Inc. Induction de reponses immunes cellulaires a l'antigene carcinoembryonnaire a l'aide des compositions renfermant des peptides et des acides nucleiques
WO2001045728A2 (fr) 1999-12-21 2001-06-28 Epimmune Inc. Induction de reponses immunitaires cellulaires aux antigenes du cancer de la prostate au moyen de compositions de peptides et d'acides nucleiques
US6602510B1 (en) 2000-04-05 2003-08-05 Epimmune Inc. HLA class I A2 tumor associated antigen peptides and vaccine compositions
WO2003068816A1 (fr) 2002-02-13 2003-08-21 Oxford Biomedica Uk Limited Epitopes peptidiques de classe i mhc provenant de l'antigene associe aux tumeurs 5t4 humain
US7976301B2 (en) 2005-07-19 2011-07-12 Takata-Petri Ag Device and method for removing an oblong burr from a molded part
WO2007014754A1 (fr) 2005-08-02 2007-02-08 I.D.M. Immuno-Designed Molecules Procede pour la preparation de formulations liposomiques
US20140050780A1 (en) * 2010-12-23 2014-02-20 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Liposomal formulation of nonglycosidic ceramides and uses thereof
US20170165200A1 (en) * 2015-11-20 2017-06-15 University Of North Texas Health Science Center Composition of lipid-based nanoparticles for small molecules and macromolecules

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDERSON ET AL., PÉDIATRIE BLOOD & CANCER, vol. 61, no. 2, 2014, pages 238 - 44
KLEINERMAN ET AL., AMERICAN JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY, vol. 18, no. 2, 1995, pages 93 - 9
MAYHEW ET AL., BIOCHIM. BIOPHYS. ACTA, 1984
S. TANGUAY ET AL., CANCER RES., vol. 54, no. 22, 15 November 1994 (1994-11-15), pages 5882 - 8
VENKATAKRISHNAN ET AL., BRITISH JOURNAL OF CLINICAL PHARMACOLOGY, vol. 77, no. 6, 2014, pages 986 - 97

Also Published As

Publication number Publication date
EP4284332A1 (fr) 2023-12-06
FR3119325B1 (fr) 2023-08-11
AU2022212571A1 (en) 2023-08-03
CA3204844A1 (fr) 2022-08-04
US20240108685A1 (en) 2024-04-04
AU2022212571A9 (en) 2024-05-16
FR3119325A1 (fr) 2022-08-05
JP2024504814A (ja) 2024-02-01
CN116981441A (zh) 2023-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU731397B2 (en) Preparation of pharmaceutical compositions
JP2010013461A (ja) 低い水溶性を有する生物学的に活性な化合物を可溶化するための方法および組成物
CA2172110A1 (fr) Vehicules pharmaceutiques pour nanosuspensions
CH677605A5 (fr)
TW201124425A (en) Parenteral formulations of gemcitabine derivatives
EP3703718B1 (fr) Formulation liposomale de lipopolysaccharide bactérien combinée à un agent cytotoxique, et son utilisation en therapie anti-tumorale
JP2009507049A (ja) リン脂質のポリエチレングリコール誘導体に包み込まれたビンカアルカロイド系制癌剤のナノミセル製剤
WO2019102606A1 (fr) Formulation liposomale spécifique à un site de maladie
RU2571283C2 (ru) Парентеральные составы производных элацитарабина
JP2008534525A (ja) リン脂質のポリエチレングリコール誘導体に包み込まれたアンスラサイクリン系抗腫瘍抗生物質のナノミセル製剤
EP2830591B1 (fr) Materiau, son procede de preparation et ses utilisations
WO2009083664A1 (fr) Nouvelles compositions a base de taxoides
WO1998056352A1 (fr) Nouveaux vecteurs liposomaux de principes actifs
WO2021196659A1 (fr) Liposome de composé de polyéther glycosylique, procédé de préparation de celui-ci et médicament à base de celui-ci
RU2325151C2 (ru) Способ получения системы доставки водонерастворимых и плохорастворимых биологически активных веществ и лекарственная форма на ее основе
CN100350912C (zh) 一种新型的聚乙二醇衍生化磷脂包载前列腺素e1的纳米微粒给药系统
JPWO1992008467A1 (ja) 分散製剤
JPWO2005021012A1 (ja) ゲムシタビン封入薬剤担体
CN118105524B (zh) 一种靶向肠上皮细胞的焦亡抑制剂药物递送系统及其制备方法和应用
CN1980671B (zh) 含有水难溶性喜树碱的脂质体制剂
WO2022162131A1 (fr) Compositions liposomales orales
CN113197854A (zh) 一种氟康唑三元纳米胶束及其制备方法
JP7186385B2 (ja) 疾患部位特異的リポソーム製剤
Sharma et al. Pharmacosomes as Unique and Potential Drug Delivery System
JPH11199488A (ja) 抗腫瘍薬のリポソーム化製剤

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22701404

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3204844

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18263248

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023546165

Country of ref document: JP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022212571

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20220128

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022701404

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022701404

Country of ref document: EP

Effective date: 20230829

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202280019481.3

Country of ref document: CN