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WO2022064908A1 - 核酸オリゴマーの製造方法 - Google Patents

核酸オリゴマーの製造方法 Download PDF

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Publication number
WO2022064908A1
WO2022064908A1 PCT/JP2021/030423 JP2021030423W WO2022064908A1 WO 2022064908 A1 WO2022064908 A1 WO 2022064908A1 JP 2021030423 W JP2021030423 W JP 2021030423W WO 2022064908 A1 WO2022064908 A1 WO 2022064908A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
formula
nucleic acid
group
acid oligomer
production method
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2021/030423
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
卓也 宮川
英貴 奥村
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Chemical Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Chemical Co Ltd filed Critical Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority to EP21872040.7A priority Critical patent/EP4219520A4/en
Priority to US18/246,393 priority patent/US20240051986A1/en
Priority to JP2022551198A priority patent/JP7719788B2/ja
Priority to CN202180064903.4A priority patent/CN116209668A/zh
Priority to KR1020237013289A priority patent/KR20230074205A/ko
Publication of WO2022064908A1 publication Critical patent/WO2022064908A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a nucleic acid oligomer containing ribose, and more particularly to a method for deprotecting a protecting group of a ribose hydroxyl group contained in a nucleic acid oligomer.
  • nucleic acid oligomers include nucleic acids that induce RNA interference (RNAi) such as antisense nucleic acids, aptamers, ribozymes, and siRNA, which are called nucleic acid drugs.
  • RNAi RNA interference
  • Nucleic acid oligomers can be synthesized by the solid-phase synthesis method, and in the solid-phase synthesis method, phosphoramidite of nucleoside (hereinafter referred to as "amidite”) is used as a raw material.
  • the nucleic acid oligomer synthesized by extending the nucleic acid on the solid-phase carrier is excised from the solid-phase carrier, and then the nucleic acid oligomer containing ribose is removed by deprotecting the protecting group of the hydroxyl group at the 2'position of ribose. , The desired nucleic acid oligomer is produced.
  • the purity of the nucleic acid oligomer synthesized in this way undergoes a multi-step process such as an extension reaction step of the nucleic acid on the solid phase carrier, a cutting step from the solid phase carrier, and a deprotection step of each protecting group. It was not always satisfactory and the synthesis was not efficient (Patent Documents 1 and 2).
  • An object of the present invention is to provide an efficient method for producing a nucleic acid oligomer.
  • the present inventors have brought a nucleic acid oligomer into the nucleic acid oligomer by contacting it with fluoride ions in an inert gas atmosphere having an oxygen concentration of a certain level or less. Based on the finding that the protecting group of the hydroxyl group of ribose can be efficiently deprotected, it is possible to provide an efficient method for producing a nucleic acid oligomer as a result.
  • the present invention is a completion of the present invention based on these findings, and includes, but is not limited to, the following aspects.
  • G 4 represents a protecting group for a hydrogen atom or a hydroxyl group.
  • G 9 represents ammonium ion, alkylammonium ion, alkali metal ion, hydrogen ion or hydroxyalkylammonium ion.
  • B c independently represents the same or different nucleobases, respectively.
  • R independently represents a hydrogen atom, a fluorine atom or an OQ group, which are the same or different from each other.
  • Q is independently the same or different from each other, and has a tert-butyldimethylsilyl group, a methyl group, a 2-methoxyethyl group, a methylene group bonded to a carbon atom at the 4'position of ribose, and a 4'position of ribose.
  • the bonds marked with * indicate that they are bonds with the oxygen atom of the OQ group.
  • n represents any integer of 0 or more.
  • m represents any integer from 2 to 200, and represents W and X are defined by either (a) or (b) below.
  • W When W is a hydroxyl group, X has the same definition as the R group.
  • W When X is a hydroxyl group, W represents an OV group.
  • V represents a tert-butyldimethylsilyl group or a group of the above formula (1). However, at least one group among the R, W and X represents a hydroxyl group protected by the protecting group of the formula (1).
  • the nucleic acid oligomer represented by the formula (3) is p pieces (where p is the formula: m-1> p) between the nucleotides at the 5'end and the 3'end, respectively. It is a nucleic acid oligomer in which a non-nucleotide linker may be incorporated in place of the nucleotide of (a positive integer satisfying).
  • a method for producing a nucleic acid oligomer represented by (hereinafter, referred to as "the production method of the present invention” in the present specification). 2. 2. The production method according to item 1 above, wherein n in the formula (1) is 0 or 1. 3. 3. The production method according to item 1 above, wherein n in the formula (1) is 0. 4. The production method according to item 1 above, wherein n in the formula (1) is 1. 5. The production method according to any one of the above items 1 to 4, wherein the non-nucleotide linker is a linker having an amino acid skeleton. 6.
  • the production method according to the above item 5 wherein the linker composed of an amino acid skeleton is a linker having the structure of the following formula (A14-1), (A14-2) or (A14-3). (In the formula, 5'and 3'indicate the 5'end side and the 3'end side of the nucleic acid oligomer, respectively.) 7.
  • the fluoride ion source is tetraalkylammonium fluoride. 9.
  • the production method according to any one of the above items 1 to 16, wherein the temperature in the reaction system when the fluoride ion is brought into contact with the nucleic acid oligomer represented by the formula (3) is 25 ° C. or lower. 18.
  • the production method according to any one of the above items 1 to 16, wherein the temperature in the reaction system when the fluoride ion is brought into contact with the nucleic acid oligomer represented by the formula (3) is 20 ° C. or less.
  • the production method according to any one of the above items 1 to 16, wherein the temperature in the reaction system when the fluoride ion is brought into contact with the nucleic acid oligomer represented by the formula (3) is 15 ° C. or lower. 20.
  • the production method according to any one of the above items 1 to 16, wherein the temperature in the reaction system when the fluoride ion is brought into contact with the nucleic acid oligomer represented by the formula (3) is 10 ° C. or lower. 21. The production method according to any one of the above items 1 to 16, wherein the temperature in the reaction system when the fluoride ion is brought into contact with the nucleic acid oligomer represented by the formula (3) is 5 ° C. or lower. 22. The production method according to any one of the above items 1 to 16, wherein the time required for contacting the nucleic acid oligomer represented by the formula (3) with the total amount of fluoride ions is 30 minutes or more. 23.
  • the proportion of the protecting group of the formula (1) is 10% or more, and the nucleic acid chain length is 10 chain length or more.
  • the proportion of the protecting group of the formula (1) is 20% or more, and the nucleic acid chain length is 10 chain length or more.
  • the proportion of the protecting group of the formula (1) is 30% or more, and the nucleic acid chain length is 10 chain length or more.
  • the proportion of the protecting group of the formula (1) is 40% or more, and the nucleic acid chain length is 10 chain length or more.
  • the ratio of the protecting group of the formula (1) is 50% or more, and the nucleic acid chain length is 10 chain length or more.
  • the ratio of the protecting group of the formula (1) is 60% or more, and the nucleic acid chain length is 10 chain length or more.
  • the ratio of the protecting group of the formula (1) is 70% or more, and the nucleic acid chain length is 10 chain length or more.
  • the ratio of the protecting group of the formula (1) is 80% or more, and the nucleic acid chain length is 10 chain length or more.
  • the ratio of the protecting group of the formula (1) is 90% or more, and the nucleic acid chain length is 10 chain length or more.
  • the ratio of the protecting group of the formula (1) is 95% or more, and the nucleic acid chain length is 10 chain length or more.
  • the ratio of the protecting group of the formula (1) is 100%, and the nucleic acid chain length is 10 chain length or more.
  • the present invention provides an efficient method for producing a nucleic acid oligomer. It is expected that the purity of the produced nucleic acid oligomer will be improved.
  • n is any integer of 0 or more, more preferably an integer of 0 to 3, more preferably an integer of 0 to 2, still more preferably 0 or 1, and particularly preferably 1. be.
  • At least one group of R, W and X of the formula (3) represents a hydroxyl group protected by the protecting group of the formula (1).
  • the proportion of the formula (1) may be 1% or more, more preferably 5% or more, more preferably 10% or more, more preferably 20% or more, and more. It is preferably 30% or more, more preferably 40% or more, more preferably 50% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more, and even more preferably 80% or more. It is more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.
  • the nucleic acid chain length to be synthesized is preferably 10 chain length or more, more preferably 20 chain length or more, more preferably 30 chain length or more, more preferably 40 chain length or more, still more preferably. , 50 chain length or more.
  • tetraalkylammonium fluoride is typically used as the fluoride ion source.
  • the tetraalkylammonium fluoride include tetrabutylammonium fluoride and tetramethylammonium fluoride. Of these, tetrabutylammonium fluoride (TBAF) is more preferable.
  • the amount of fluoride ion used is usually 1 to 1000 mol, preferably 1 to 500 mol, more preferably 2 to 200 mol, more preferably 4 to 100 mol, per mol of the protecting group removed.
  • an organic solvent inert to the reaction is usually used, and specifically, for example, a sulfoxide solvent, a nitrile solvent, an ether solvent, an amide solvent, a ketone solvent, an aliphatic hydrocarbon solvent, an ester solvent, and an aromatic.
  • a sulfoxide solvent examples include dimethyl sulfoxide and the like.
  • the nitrile solvent include acetonitrile, propionitrile and the like.
  • the ether solvent include tetrahydrofuran and the like.
  • Examples of the amide solvent include N-methyl-2-pyrrolidone and the like.
  • Examples of the ketone solvent include acetone, methyl ethyl ketone and the like.
  • Examples of the aliphatic hydrocarbon solvent include hexane, heptane and the like.
  • Examples of the ester solvent include methyl acetate, ethyl acetate and the like.
  • Examples of the aromatic solvent include toluene, pyridine and the like. Of these, dimethyl sulfoxide or a mixed solvent of dimethyl sulfoxide and acetonitrile is preferable.
  • the fluoride ion source which is a reagent used in the step of removing the protecting group of the hydroxyl group represented by the formula (1), is usually dehydrated and used after being dissolved in a solvent.
  • the dehydrating agent include molecular sheaves and sulfates, and molecular sheaves 4A are preferably used.
  • the amount of the solvent used is usually 5 to 8,000 L, preferably 50 to 2,000 L, and more preferably 100 to 1,600 L per mole of the nucleic acid oligomer subjected to the deprotection step.
  • a compound that catches the compound by reacting with the compound represented by the following formula (2), which is a by-product in this step can be added.
  • the compound to be captured include nitroalkanes, alkylamines, amidines, thiols, thiol derivatives, or mixtures of two or more thereof.
  • the "nitroalkane” include nitromethane.
  • alkylamine include linear alkylamines having 1 to 6 carbon atoms and cyclic amines having 1 to 8 carbon atoms.
  • Examples of the "amidine” include benzamidine and form amidine.
  • Examples of the "thiol” include linear thiols having 1 to 6 carbon atoms. Specific examples thereof include methanethiol, ethanethiol, 1-propanethiol, 1-butanethiol, 1-pentanethiol, and 1-hexanethiol.
  • Examples of the "thiol derivative” include alcohols or ethers having the same or different linear alkylthiol groups having 1 to 6 carbon atoms.
  • 2-mercaptoethanol 4-mercapto-1-butanol, 6-mercapto-1-hexanol, mercaptomethyl ether, 2-mercaptoethyl ether, 3-mercaptopropyl ether, 4-mercaptobutyl ether, 5 -Mercaptopentyl ether and 6-mercaptohexyl ether can be mentioned. More preferably, nitromethane is used.
  • the amount of the compound that captures the compound represented by the formula (2), which is a by-product, is 0.1 to 100.0 with respect to the fluoride ion source that desorbs the protective group of the hydroxyl group represented by the formula (1). It can be used in mol%, preferably 1.0 to 50.0 mol%, preferably 2.0 to 40.0 mol%, and more preferably 3.0 to 30.0 mol%.
  • the fluoride ion may be added to the nucleic acid oligomer represented by the formula (3), or conversely, the fluoride ion may be added to the formula (3).
  • a method of adding fluoride ions to the nucleic acid oligomer represented by the formula (3) is preferable.
  • the time required to add the entire amount of fluoride ions to the nucleic acid oligomer represented by the formula (3) and bring them into contact is preferably 5 minutes or more, more preferably 10 minutes or more, more preferably 15 minutes or more, and 30 minutes or more.
  • the temperature of both or one of the solutions when adding fluoride ions to the nucleic acid oligomer represented by the formula (3) may be 80 ° C. or lower, preferably 40 ° C. or lower for both, and preferably 35 ° C. or lower for both. More preferably both are 30 ° C. or lower, more preferably both are 25 ° C. or lower, more preferably both are 20 ° C. or lower, and more preferably both are 15 ° C. or lower, more preferably. Both are below 10 ° C, and even more preferably both are below 5 ° C.
  • the heat may be kept for 1 minute or more, preferably 5 minutes or more, more preferably 10 minutes or more, and more preferably 15. It is kept warm for 1 minute or more, more preferably 30 minutes or more, and even more preferably 1 hour or more.
  • the temperature may be raised to 5 ° C. or higher and 80 ° C. or lower, preferably 10 ° C. or higher and 40 ° C. or lower, preferably 10 ° C. or higher and 35 ° C. or lower.
  • the temperature rise is preferably 15 ° C. or higher and 35 ° C. or lower, more preferably 20 ° C. or higher and 35 ° C.
  • the time of the deprotection reaction varies depending on the type of the deprotecting agent used and the reaction temperature, but is usually 1 hour to 100 hours, preferably 1 to 24 hours, more preferably 2 to 12 hours. More preferably, it is 3 to 6 hours. Fluoride ions may be added at any time.
  • an inert gas having an oxygen concentration of 15% or less is prepared and supplied to the reaction system, and the oxygen concentration in the gas phase is within the set concentration range. It may be adjusted by measuring and confirming that. Specifically, a high-purity inert gas such as argon or nitrogen or an inert gas whose oxygen concentration is adjusted to a predetermined concentration is circulated in the gas phase of the reaction system, or the gas phase atmosphere of the reaction system is described above. It can be adjusted by substituting with an inert gas or a concentration-adjusted inert gas.
  • the inert gas used in the production method of the present invention includes, but is not limited to, nitrogen gas, argon gas, helium gas, and carbon dioxide. Preferred are nitrogen gas and argon gas.
  • the reaction system atmosphere substitution method may be reduced pressure substitution, pressure substitution, flow substitution, substitution by bubbling, or substitution by freeze degassing, and at that time, ultrasonic waves may be applied or heating may be applied. More preferred methods are flow substitution and reduced pressure substitution.
  • the oxygen concentration is preferably 15% or less, more preferably 10% or less, more preferably 5% or less, more preferably 4% or less, more preferably 3% or less, and even more preferably 2% or less. Is better, more preferably 1% or less, and even more preferably 0%.
  • Stirring of the reaction system is not essential during the desorption reaction of the protecting group, but usually, stirring is performed in the range of stirring power Pv of 0.0 to 0.5 kW / m 3 , and Pv is 0.1 to 0.3 kW / m3. Stirring of m 3 is preferred.
  • nucleic acid oligomer produced after the reaction from the reaction mixture As a means for separating and purifying the nucleic acid oligomer produced after the reaction from the reaction mixture, ordinary methods are adopted, for example, extraction, concentration, neutralization, filtration, centrifugation, recrystallization, silica gel column chromatography, thin layer chromatography, etc.
  • nucleic acid oligomers can be isolated.
  • the isolated nucleic acid oligomer is usually obtained as a nucleic acid oligomer in which the hydroxyl group at the 5'end is protected.
  • the reaction for obtaining the nucleic acid oligomer represented by the following formula (4) by deprotecting the protecting group represented by the formula (1) from the nucleic acid oligomer represented by the formula (3) is as follows. (Scheme 1).
  • G 4 represents a protecting group for a hydrogen atom or a hydroxyl group.
  • G 9 represents ammonium ion, alkylammonium ion, alkali metal ion, hydrogen ion or hydroxyalkylammonium ion.
  • B c independently represents the same or different nucleobases, respectively.
  • R independently represents a hydrogen atom, a fluorine atom or an OQ group, which are the same or different from each other.
  • Q is independently the same or different from each other, and has a tert-butyldimethylsilyl group, a methyl group, a 2-methoxyethyl group, a methylene group bonded to a carbon atom at the 4'position of ribose, and a 4'position of ribose.
  • the bonds marked with * indicate that they are bonds with the oxygen atom of the OQ group.
  • n represents any integer of 0 or more.
  • m represents any integer from 2 to 200, and represents W and X are defined by either (a) or (b) below.
  • W When W is a hydroxyl group, X has the same definition as the R group.
  • W When X is a hydroxyl group, W represents an OV group.
  • V represents a tert-butyldimethylsilyl group or a group of the above formula (1). However, at least one group among the R, W and X represents a hydroxyl group protected by the protecting group of the formula (1).
  • the nucleic acid oligomer represented by the formula (3) is p pieces (where p is the formula: m-1> p) between the nucleotides at the 5'end and the 3'end, respectively. It is a nucleic acid oligomer in which a non-nucleotide linker may be incorporated in place of the nucleotide of (a positive integer satisfying). )
  • the nucleosides (ribose and deoxyribose) contained in the nucleic acid oligomer used in the present invention include DNA, RNA, 2'-O-MOE (2'-O-methoxyethyl), 2'-O-Me, and the like. 2'-F RNA and the above LNA are exemplified, but the nucleoside is not limited thereto.
  • the nucleic acid oligomer represented by the formula (3) is obtained, for example, by cutting out the nucleic acid oligomer produced by the solid phase synthesis represented by the formula (5) from the solid phase carrier, as shown in Scheme 2.
  • nucleic acid oligomer of the formula (5) synthesized on the solid phase carrier will be described.
  • Substituents Ba each represent the same or different protected nucleic acid bases independently.
  • G4 and Y are as defined in the above equation (3).
  • G 2 independently represents the same or different phosphoric acid protecting groups.
  • X 1 represents OZ
  • W 1 represents an OV group.
  • V represents a tert-butyldimethylsilyl group or a group of the above formula (1).
  • W 1 represents a group represented by OZ.
  • Z represents a solid phase carrier and a group consisting of a linking portion connecting the solid phase carrier and the oxygen atom of the hydroxyl group at the 2'-position or 3'-position of ribose at the 3'end of the nucleic acid oligomer.
  • Z represents the structure represented by the following equation (6).
  • Sp represents a spacer.
  • Examples of the spacer (Sp) include those having the structural formula shown in the following formula (7).
  • the Linker is represented by, for example, the following formulas (8-1) (8-2) (8-3) (8-4) (8-5) (8-6) (8-7), (8-8). It may be a structure.
  • the solid support include an inorganic porous carrier and an organic resin carrier.
  • the inorganic porous carrier include Controlled pore Glass (CPG) and zeolite.
  • the organic resin carrier include a carrier made of polystyrene.
  • A may be independently a hydroxyl group, an alkoxy group, or an alkyl group.
  • alkoxy group include a methoxy group and an ethoxy group.
  • alkyl group include a methyl group and an ethyl group. Examples thereof include an isopropyl group and an n-propyl group.
  • Si indicates that it is bonded to the oxygen of the hydroxyl group on the surface of the carrier.
  • G 4 represents a protecting group of a hydrogen atom or a hydroxyl group, and when representing a protecting group, it represents the same protecting group as G 1 .
  • G 4 is a hydrogen atom when deprotected, in which case the nucleotide compound is also subject to a series of nucleic acid extension reaction steps.
  • G 9 represents an ammonium ion, an alkylammonium ion, an alkali metal ion, a hydrogen ion or a hydroxyalkylammonium ion.
  • alkyl moieties of the alkylammonium ion include methyl, ethyl, n-provyl, isopropyl, n-butyl, dibutyl, isobutyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, and hexyl.
  • diethylammonium ion, triethylammonium ion, tetrabutylammonium ion, hexylammonium ion, dibutylammonium ion and the like can be mentioned.
  • alkali metal ion include sodium ion and lithium ion.
  • examples of the hydroxyalkylammonium ion examples of a specific hydroxyalkyl moiety include hydroxymethyl, hydroxyethyl, hydroxy-n-propyl, hydroxyisopropyl, hydroxy-n-butyl, and trishydroxymethyl. More specific examples of hydroxyalkylammonium ions include trishydroxymethylammonium ions.
  • the compound of the formula (5) is produced, for example, by the amidite method using the amidite compound of the following formula (A13).
  • R represents a hydrogen atom, a fluorine atom, or an OQ group.
  • Q is a tert-butyldimethylsilyl group, a methyl group, a 2-methoxyethyl group, a methylene group bonded to a carbon atom of 4', an ethylene group bonded to a carbon atom of 4', and ethylidene bonded to a carbon atom of 4'.
  • Ba represents a nucleic acid base that may be protected.
  • G 1 represents a hydroxyl-protecting group.
  • G 2 represents a phosphoric acid protecting group
  • G 3 represents an alkyl group or a cyclic structure bonded to each other at its terminal.
  • B a represents a nucleobase represented by B c or a nucleobase in which the nucleobase is protected by a protecting group.
  • the nucleobase in Ba is not particularly limited. Examples of the nucleobase include adenine, cytosine, guanine, uracil, thymine, 5-methylcytosine, pseudouracil, 1-methyl pseudouracil and the like. Further, the nucleobase may be substituted with a substituent.
  • Such substituents include, for example, a halogen atom such as a fluoro group, a chloro group bromo group and an iodo group, an acyl group such as an acetyl group, an alkyl group such as a methyl group and an ethyl group, and an arylalkyl group such as a benzyl group.
  • a halogen atom such as a fluoro group, a chloro group bromo group and an iodo group
  • an acyl group such as an acetyl group
  • an alkyl group such as a methyl group and an ethyl group
  • an arylalkyl group such as a benzyl group.
  • an alkoxy group such as a methoxy group
  • an alkoxyalkyl group such as a methoxyethyl group
  • a cyanoalkyl group such as a cyanoethyl group
  • a hydroxy group such as a hydroxyalkyl group
  • an acyloxymethyl group such as an amino group, a monoalkylamino group, a dialkylamino group, and a carboxy group.
  • Examples include groups, cyano groups, and nitro groups, as well as combinations of two or more substituents thereof.
  • the protecting group for the amino group is not particularly limited, and a protecting group used in known nucleic acid chemistry can be used, and as such a protecting group, For example, benzoyl group, 4-methoxybenzoyl group, acetyl group, propionyl group, butyryl group, isobutyryl group, phenylacetyl group, phenoxyacetyl group, 4-tert-butylphenoxyacetyl group, 4-isopropylphenoxyacetyl group, and (dimethyl). Amino) methylene groups and the like, as well as combinations of two or more of them protecting groups.
  • R4 represents a hydrogen atom, a methyl group, a phenoxyacetyl group, a 4-tert-butylphenoxyacetyl group, a 4-isopropylphenoxyacetyl group, a phenylacetyl group, an acetyl group or a benzoyl group.
  • R 5 represents a hydrogen atom, an acetyl group, an isobutyryl group or a benzoyl group.
  • R 6 represents a hydrogen atom, a phenoxyacetyl group, a 4-tert-butylphenoxyacetyl group, a 4-isopropylphenoxyacetyl group, a phenylacetyl group, an acetyl group or an isobutyryl group.
  • R 7 represents a 2-cyanoethyl group.
  • R 8 represents a hydrogen atom, a methyl group, a benzoyl group, a 4-methoxybenzoyl group or a 4-methylbenzoyl group.
  • R 9 represents a dimethylaminomethylene group. ) Represents a group represented by any of.
  • any one that can function as a protecting group can be used without particular limitation, and a known protecting group used in an amidite compound can be widely used.
  • G 1 is preferably based on the following.
  • R 1 , R 2 and R 3 represent the same or different hydrogen or alkoxy groups.
  • R 1 , R 2 and R 3 is preferably hydrogen, and the other two are preferably the same or different (preferably the same) alkoxy groups, and the methoxy group is particularly preferable as the alkoxy group.
  • G 2 any one that can function as a protecting group can be used without particular limitation, and a known protecting group used in an amidite compound can be widely used.
  • Examples of G 2 include an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, a cycloalkyl group, a haloalkyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an arylalkyl group, a cycloalkenyl group, a cycloalkylalkyl group, a cyclylalkyl group, and a hydroxyalkyl.
  • aminoalkyl group alkoxyalkyl group, heterocyclylalkenyl group, heterocyclylalkyl group, heteroarylalkyl group, silyl group, silyloxyalkyl group, mono, di or trialkylsilyl group, mono, di or trialkylsilyloxyalkyl group Etc., which may be substituted with one or more electron-withdrawing groups.
  • G 2 is preferably an alkyl group substituted with an electron-withdrawing group.
  • the electron-withdrawing group include a cyano group, a nitro group, an alkylsulfonyl group, a halogen atom, an arylsulfonyl group, a trihalomethyl group, a trialkylamino group and the like, and a cyano group is preferable.
  • the G 3 may be formed by combining two G 3s with each other to form a cyclic structure.
  • G3 it is preferable that both are isopropyl groups.
  • the alkyl group in the definition of R 1 , R 2 , R 3 and G 2 may be linear or branched, preferably an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, and more preferably 1 to 6 carbon atoms.
  • Alkyl group. Examples of specific alkyl groups include, for example, methyl, ethyl, n-provyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, and hexyl.
  • the alkyl group moiety constituting the alkoxy group in the above definition has the same definition as the definition of the alkyl group here.
  • the nucleobase means a group having a natural or non-natural nucleobase skeleton.
  • the nucleobase also includes a modified product having a modified natural or non-natural nucleobase skeleton. More specifically, the following structure is exemplified as the nucleobase represented by BC.
  • R 4' represents a hydrogen atom or a methyl group.
  • R 5' represents a hydrogen atom or an acetyl group.
  • R 6' represents a hydrogen atom
  • R 8' represents a hydrogen atom or a methyl group.
  • non-nucleotide linker that can be introduced instead of nucleotides will be described.
  • the non-nucleotide linker include a linker having an amino acid skeleton (for example, a linker having an amino acid skeleton described in Japanese Patent No. 5157168 or Japanese Patent No. 5554881).
  • a linker having an amino acid skeleton for example, a linker having an amino acid skeleton described in Japanese Patent No. 5157168 or Japanese Patent No. 5554881.
  • the formula (A14-1), (A14-2) or (14-3) for example, described in Japanese Patent No. 5555346 or Japanese Patent No.
  • the linker represented is exemplified.
  • the linkers described in International Publication No. 2012/005368, International Publication No. 2018/182008, or International Publication No. 2019/0741110 are exemplified.
  • Nucleotides and amidites in which the R group in the formula (3) and the R'group in the formula (4) are substituents other than hydroxyl groups are known methods described in Japanese Patent No. 3745226 and the like, International Publication No. 2001/053528. It can also be produced from JP-A-2014-221817 and a nucleoside synthesized by a known method cited therein, and further, commercially available products can be used in Examples described later. It can be produced according to the described methods or by a method obtained by appropriately modifying these methods.
  • a nucleic acid oligomer (hereinafter, also referred to as an oligonucleotide) from a solid-phase carrier
  • the cutting-out step was carried out by using a nucleic acid oligomer having a desired chain length as a cutting agent and using concentrated aqueous ammonia.
  • each step of the deprotection step, the condensation step, and the oxidation step is repeated according to a generally known method (for example, the method described in the above-mentioned Japanese Patent No. 5157168 or Japanese Patent No. 5554881). By doing so, a nucleic acid extension reaction is carried out.
  • nucleic acid extension reaction means a reaction in which an oligonucleotide is extended by sequentially binding nucleotides via a phosphodiester bond.
  • the nucleic acid extension reaction can be carried out according to the procedure of a general phosphoramidite method.
  • the nucleic acid extension reaction may be carried out using an automatic nucleic acid synthesizer or the like that employs a phosphoramidite method.
  • the chain length of the nucleic acid oligomer may be, for example, 2 to 200 mer, 10 to 150 mer, or 15 to 110 mer.
  • the 5'deprotection step is a step of deprotecting the protecting group of the 5'hydroxyl group at the end of the RNA chain supported on the solid phase carrier.
  • a general protecting group a 4,4'-dimethoxytrityl group (DMTr group), a 4-monomethoxytrityl group, and a 4,4', 4 "-trimethoxytrityl group are used.
  • DMTr group 4,4'-dimethoxytrityl group
  • 4-monomethoxytrityl group 4-monomethoxytrityl group
  • a 4,4', 4 "-trimethoxytrityl group are used for deprotection.
  • an acid is used for deprotection.
  • deprotecting acid examples include trifluoroacetic acid, dichloroacetic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trichloroacetic acid, methanesulfonic acid, hydrochloric acid, acetic acid, p-toluenesulfonic acid and the like.
  • the condensation step is a reaction in which the nucleoside phosphoramidite represented by the formula (A13) is bound to the 5'hydroxyl group at the terminal of the oligonucleotide chain deprotected by the deprotection step.
  • the phosphoramidite used for nucleic acid elongation an amidite compound represented by the formula (A13) or (A12) is used.
  • other phosphoramidite that can be used 2'-OMe, 2'-F, 2'-O-tert-butyldimethylsilyl group, 2'-O-methoxyethyl group, 2'-H, 2'.
  • nucleoside phosphoramidite one in which a 5'hydroxyl group is protected with a protecting group (eg, DMTr group) is used.
  • the condensation step can be carried out using an activator that activates the nucleoside phosphoramidite.
  • the activator include 5-benzylthio-1H-tetrazole (BTT), 1H-tetrazole, 4,5-dicyanoimidazole (DCI), 5-ethylthio-1H-tetrazole (ETT), and N-methylbenzimidazolium.
  • N-MeBIT benzimidazolium triflate
  • BIT N-phenylimidazolium triflate
  • IMT imidazolium triflate
  • NBT 5-nitrobenzimidazolium triflate
  • HOBT 1-hydroxybenzotriazole
  • 5- (bis-3,5-trifluoromethylphenyl) -1H-tetrazole and the like can be mentioned.
  • Capping can be performed using known capping solutions such as acetic anhydride-tetrahydrofuran solution and phenoxyacetic acid anhydride / N-methylimidazole solution.
  • the oxidation step is a step of converting the phosphorous acid group formed by the condensation step into a phosphorous acid group or a thiophosphate group.
  • This step is a reaction for converting trivalent phosphorus to pentavalent phosphorus using an oxidizing agent, and can be carried out by allowing the oxidizing agent to act on the oligonucleic acid derivative supported on the solid phase carrier. ..
  • an "oxidizing agent" for example, iodine, a peracid such as tert-butyl hydroperoxide or hydrogen peroxide, or (1S)-(+)-( 10-Champhorsulphonyl) -oxaziridine (CSO), or a mixture of two or more of these can be used.
  • the oxidizing agent can be diluted with a suitable solvent so as to have a concentration of 0.005 to 2M before use.
  • the solvent used in the reaction is not particularly limited as long as it is not involved in the reaction, and examples thereof include pyridine, THF, water, acetonitrile, or any mixed solvent of two or more thereof.
  • Acetonitrile, or iodine / pyridine-acetic acid or peracid tert-butyl hydroperoxide / methylene chloride
  • an "oxidizing agent” for example, sulfur, 3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1-dioxide (Beaucage reagent), etc.
  • an oxidizing agent for example, sulfur, 3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1-dioxide (Beaucage reagent), etc.
  • 3-Amino-1,2,4-dithiazol-5-thione (ADTT), 5-phenyl-3H-1,2,4-dithiazol-3-one (POS), [(N, N-dimethylaminomethylidene) ) Amino] -3H-1,2,4-dithiazolin-3-thione (DDTT), or phenylacetyldisulfide (PADS) can be used.
  • the oxidizing agent can be diluted with a suitable solvent so as to have a concentration of 0.01 to 2 M before use.
  • the solvent used in the reaction is not particularly limited as long as it is not involved in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, pyridine, and any mixed solvent thereof.
  • the oxidation step may be performed after the capping operation, or conversely, the capping operation may be performed after the oxidation step, and the order is not limited.
  • amines are allowed to act to deprotect the protecting group of the phosphate moiety.
  • examples of the amines include diethylamine described in Japanese Patent No. 4705716.
  • the protecting group for the 5'hydroxyl group of nucleoside introduced at the end of the extension was used for column purification tagged with the 5'protecting group after excision from the solid phase carrier and deprotection of the protecting group described below. Also, after column purification, the protecting group of the 5'hydroxyl group may be deprotected.
  • oligonucleotide chain is cleaved from the solid phase carrier and recovered.
  • amines include methylamine, ethylamine, propylamine, isopropylamine, ethylenediamine, diethylamine and the like.
  • the nucleoside contained in the nucleic acid oligomer has RNA, DNA, and 2'-O-MOE, 2'-O-Me, and 2'-F.
  • examples include, but are not limited to, RNA and nucleic acid oligomers which are LNAs.
  • RNA and nucleic acid oligomers which are LNAs.
  • nucleic acid oligomers that can be used in the production method of the present invention are shown below in addition to the examples described in Examples, but the present invention is not limited thereto.
  • U stands for uridine
  • C stands for cytidine
  • A stands for adenosine
  • G stands for guanosine.
  • a typical example is a nucleic acid oligomer having the following sequence (D). Sequence (D): 5'-AGAGCCAGCCUUCUUAUUGUUUUAGAGCUAUGCUGU-3' (SEQ ID NO: 5) 36mer Examples thereof include nucleic acid oligomers described in Japanese Patent No. 4965745.
  • a typical example is a nucleic acid oligomer having the following sequence (E). Sequence (E): 5'-CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-P-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU-3'49mer. CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC (SEQ ID NO: 6), GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU (SEQ ID NO: 7).
  • P is represented by a partial structure separated by wavy lines in the following formula (A5).
  • nucleic acid oligomers having the following sequence (F) described in Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No. 2: 547. Sequence (F): 5'-ACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3'(SEQ ID NO: 8) 67mer Examples thereof include nucleic acid oligomers having the following sequence (G) described in JP 2015-523856, pp. 173.
  • U indicates 2'-O-methyluridine
  • Am indicates 2'-O-methyladenosine
  • Gm indicates 2'-O-methylguanosine
  • s indicates phosphorothioate modification.
  • HPLC measurement conditions are shown in Table 1 below.
  • the oxygen concentration in the atmosphere (gas phase) of the reaction system is IIJIMA ELECTRONICS CORP.
  • the measurement was carried out using PACK KEEPER (Residal Oxygen Meter) manufactured by Japan.
  • PACK KEEPER Residal Oxygen Meter
  • calibrate the device by measuring the oxygen concentration in the air and pure nitrogen, and then pierce the container such as a flask covered with a septum with the needle attached to the device to measure the oxygen concentration in the gas phase part of the system. It was measured.
  • the measured value of oxygen concentration was displayed in real time, and the place where the measured value was stable was taken as the oxygen concentration in the atmosphere.
  • HPLC measurement conditions are shown in Table 2 below.
  • Enzymatic decomposition method The method of enzymatic degradation of oligonucleotides is shown below. After adding 83 ⁇ L of an aqueous solution of crude product of oligonucleotide adjusted to a concentration of 0.5 mg / mL in a 2 mL vial, 2 ⁇ L of an aqueous solution of 0.2 unit / ⁇ L of Nuclease P (from Penicillium citrinum) was added, and 60 The mixture was kept warm in a ° C. incubator for 2 hours.
  • the HPLC plane 100 value of A15) is shown, [c] shows the number of adenosine contained in the target oligonucleotide, and [d] is the formula (A15) and the formula (A15) detected by the HPLC analysis described in the measurement method 4. From the HPLC plane 100 value of A16), the content of the adenosine cyanoethyl adduct, which is an impurity contained in the oligomer, is shown.
  • N, N-diisopropylphosphoroamidite (A17), N 4 -acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) according to Example 5.
  • Cytidine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphosphoroamidite) (A16), 5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- described in Example 2.
  • the oligonucleotide produced by the production method of the present invention in the following examples is an oligonucleotide having the sequences (I) shown in SEQ ID NOs: 1 and 2.
  • the guanosine derivative described in the following Examples and Comparative Examples means a compound represented by the following structural formula.
  • the circles illustrated in the following structural formula schematically represent CPG.
  • Example 1 The CPG carrying 77.89 ⁇ mol of a guanosine derivative and the amidite represented by the formula (A8), the formula (A9), the formula (A10), the formula (A11), or the formula (A12) are used in the sequence (I).
  • Solid phase synthesis was carried out with AKTA oligopilot plus 100. Then, a CPG carrier carrying 30.06 ⁇ mol worth of oligonucleotide was collected, the oligonucleotide was released from the solid phase carrier using 10.17 g of aqueous ammonia and 3.03 g of ethanol, and then the carrier was filtered off and released. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • a needle that blows argon from an argon cylinder into the system, a needle for removing the sprayed argon, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the inside of the system is replaced with argon by flowing argon, and the gas phase.
  • the oxygen concentration in the solution was set to 0%.
  • the oxygen concentration in the gas phase was measured by using the method described in the measurement method 3.
  • 1.13 g of a dimethyl sulfoxide solution of 1 M tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF) dehydrated with molecular sieve 4A (the amount of TBAF is 12.7 mol per 1 mol of protecting group) is stirred with a stirrer.
  • the 2'-EMM protecting group was deprotected by dropping onto the surface of the oligonucleoside solution at 33 ° C. for 1 hour using a KDScientific syringe pump and then keeping the mixture warm at 33 ° C. for 4 hours.
  • the crude product was obtained by a precipitation operation.
  • the yield was 13.0 mg and the purity was 58%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 1, and the yield of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 2.
  • Example 2 The CPG carrying 77.89 ⁇ mol of a guanosine derivative and the amidite represented by the formula (A8), the formula (A9), the formula (A10), the formula (A11), or the formula (A12) are used in the sequence (I).
  • Solid phase synthesis was carried out with AKTA oligopilot plus 100. Then, a CPG carrier carrying 30.06 ⁇ mol worth of oligonucleotide was collected, the oligonucleotide was released from the solid phase carrier using 10.17 g of aqueous ammonia and 3.03 g of ethanol, and then the carrier was filtered off and released. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • a needle that blows argon from an argon cylinder into the system, a needle for removing the sprayed argon, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the inside of the system is replaced with argon by flowing argon, and the gas phase.
  • the oxygen concentration in the medium was set to 5%.
  • the oxygen concentration in the gas phase was measured by using the method described in the measurement method 3.
  • 0.76 g of a dimethylsulfoxide solution of 1 M tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF) dehydrated with molecular sieve 4A (the amount of TBAF is 13.2 mol per 1 mol of protecting group) is stirred with a stirrer.
  • the 2'-EMM protecting group was deprotected by dropping onto the surface of the oligonucleoside solution at 33 ° C. for 1 hour using a KDScientific syringe pump and then keeping the mixture warm at 33 ° C. for 4 hours.
  • the crude product was obtained by a precipitation operation.
  • the yield was 8.3 mg and the purity was 54%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 1, and the yield of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 2.
  • Example 3 The CPG carrying 77.89 ⁇ mol of a guanosine derivative and the amidite represented by the formula (A8), the formula (A9), the formula (A10), the formula (A11), or the formula (A12) are used in the sequence (I).
  • Solid phase synthesis was carried out with AKTA oligopilot plus 100. Then, a CPG carrier carrying 30.06 ⁇ mol worth of oligonucleotide was collected, the oligonucleotide was released from the solid phase carrier using 10.17 g of aqueous ammonia and 3.03 g of ethanol, and then the carrier was filtered off and released. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • a needle that blows argon from an argon cylinder into the system, a needle for removing the sprayed argon, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the inside of the system is replaced with argon by flowing argon, and the gas phase.
  • the oxygen concentration in the solution was set to 10%.
  • the oxygen concentration in the gas phase was measured by using the method described in the measurement method 3.
  • 0.74 g of a dimethylsulfoxide solution of 1 M tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF) dehydrated with molecular sieve 4A (the amount of TBAF is 12.7 mol per 1 mol of protecting group) is stirred with a stirrer.
  • the 2'-EMM protecting group was deprotected by dropping onto the surface of the oligonucleoside solution at 33 ° C. for 1 hour using a KDScientific syringe pump and then keeping the mixture warm at 33 ° C. for 4 hours.
  • the crude product was obtained by a precipitation operation.
  • the yield was 8.4 mg and the purity was 49%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 1, and the yield of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 2.
  • Example 4 The CPG carrying 77.89 ⁇ mol of a guanosine derivative and the amidite represented by the formula (A8), the formula (A9), the formula (A10), the formula (A11), or the formula (A12) are used in the sequence (I).
  • Solid phase synthesis was carried out with AKTA oligopilot plus 100. Then, a CPG carrier carrying 30.06 ⁇ mol worth of oligonucleotide was collected, the oligonucleotide was released from the solid phase carrier using 10.17 g of aqueous ammonia and 3.03 g of ethanol, and then the carrier was filtered off and released. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • a needle that blows argon from an argon cylinder into the system, a needle for removing the sprayed argon, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the inside of the system is replaced with argon by flowing argon, and the gas phase.
  • the oxygen concentration in the solution was set to 15%.
  • the oxygen concentration in the gas phase was measured by using the method described in the measurement method 3.
  • 0.75 g of a dimethylsulfoxide solution of 1 M tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF) dehydrated with Molecular Sieve 4A (the amount of TBAF is 12.9 mol per 1 mol of protecting group) is stirred with a stirrer.
  • the 2'-EMM protecting group was deprotected by dropping onto the surface of the oligonucleoside solution at 33 ° C. for 1 hour using a KDScientific syringe pump and then keeping the mixture warm at 33 ° C. for 4 hours.
  • the crude product was obtained by a precipitation operation.
  • the yield was 8.4 mg and the purity was 46%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 1, and the yield of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 2.
  • Example 5 The CPG carrying 77.89 ⁇ mol of a guanosine derivative and the amidite represented by the formula (A15), the formula (A16), the formula (A17), the formula (A18), or the formula (A12) are used in the sequence (I).
  • Solid phase synthesis was carried out with AKTA oligopilot plus 100. Then, a CPG carrier carrying 30.04 ⁇ mol worth of oligonucleotide was collected, the oligonucleotide was released from the solid phase carrier using 10.17 g of aqueous ammonia and 3.06 g of ethanol, and then the carrier was filtered off and released. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • a needle that blows argon from an argon cylinder into the system, a needle for removing the sprayed argon, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the inside of the system is replaced with argon by flowing argon, and the gas phase.
  • the oxygen concentration in the solution was set to 0%.
  • the oxygen concentration in the gas phase was measured by using the method described in the measurement method 3.
  • 1.13 g of a dimethyl sulfoxide solution of 1 M tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF) dehydrated with molecular sieve 4A (the amount of TBAF is 12.7 mol per 1 mol of protecting group) is stirred with a stirrer.
  • the 2'-cyanoethoxymethoxy (CEM) protecting group was deprotected by flowing into the surface of the oligonucleoside solution at 33 ° C. below using a syringe within 1 minute and then keeping the mixture warm at 33 ° C. for 4 hours.
  • the crude product was obtained by a precipitation operation.
  • the yield was 13.5 mg and the purity was 48%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 1, and the yield of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 2.
  • a needle that blows argon from an argon cylinder into the system, a needle for removing the sprayed argon, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the inside of the system is replaced with argon by flowing argon, and the gas phase.
  • the oxygen concentration in the medium was set to 5%.
  • the oxygen concentration in the gas phase was measured by using the method described in the measurement method 3.
  • 1.14 g of a dimethyl sulfoxide solution of 1 M tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF) dehydrated with molecular sieve 4A (the amount of TBAF is 12.7 mol per 1 mol of protecting group) is stirred with a stirrer.
  • the 2'-cyanoethoxymethoxy (CEM) protecting group was deprotected by flowing into the surface of the oligonucleoside solution at 33 ° C. below using a syringe within 1 minute and then keeping the mixture warm at 33 ° C. for 4 hours.
  • the crude product was obtained by a precipitation operation.
  • the yield was 13.5 mg and the purity was 46%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 1, and the yield of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 2.
  • Example 7 The CPG carrying 77.89 ⁇ mol of a guanosine derivative and the amidite represented by the formula (A15), the formula (A16), the formula (A17), the formula (A18), or the formula (A12) are used in the sequence (I).
  • Solid phase synthesis was carried out with AKTA oligopilot plus 100. Then, a CPG carrier carrying 30.04 ⁇ mol worth of oligonucleotide was collected, the oligonucleotide was released from the solid phase carrier using 10.17 g of aqueous ammonia and 3.06 g of ethanol, and then the carrier was filtered off and released. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • a needle that blows argon from an argon cylinder into the system, a needle for removing the sprayed argon, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the inside of the system is replaced with argon by flowing argon, and the gas phase.
  • the oxygen concentration in the solution was set to 10%.
  • the oxygen concentration in the gas phase was measured by using the method described in the measurement method 3.
  • 1.14 g of a dimethyl sulfoxide solution of 1 M tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF) dehydrated with molecular sieve 4A (the amount of TBAF is 13.0 mol per 1 mol of protecting group) is stirred with a stirrer.
  • the 2'-cyanoethoxymethoxy (CEM) protecting group was deprotected by flowing into the surface of the oligonucleoside solution at 33 ° C. below using a syringe within 1 minute and then keeping the mixture warm at 33 ° C. for 4 hours.
  • the crude product was obtained by a precipitation operation.
  • the yield was 13.4 mg and the purity was 45%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 1, and the yield of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 2.
  • Example 8 The CPG carrying 77.89 ⁇ mol of a guanosine derivative and the amidite represented by the formula (A15), the formula (A16), the formula (A17), the formula (A18), or the formula (A12) are used in the sequence (I).
  • Solid phase synthesis was carried out with AKTA oligopilot plus 100. Then, a CPG carrier carrying 30.04 ⁇ mol worth of oligonucleotide was collected, the oligonucleotide was released from the solid phase carrier using 10.17 g of aqueous ammonia and 3.06 g of ethanol, and then the carrier was filtered off and released. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • a needle that blows argon from an argon cylinder into the system, a needle for removing the sprayed argon, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the inside of the system is replaced with argon by flowing argon, and the gas phase.
  • the oxygen concentration in the solution was set to 15%.
  • the oxygen concentration in the gas phase was measured by using the method described in the measurement method 3.
  • 1.11 g of a dimethyl sulfoxide solution of 1 M tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF) dehydrated with molecular sieve 4A (the amount of TBAF is 12.7 mol per 1 mol of protecting group) is stirred with a stirrer.
  • the 2'-cyanoethoxymethoxy (CEM) protecting group was deprotected by flowing into the surface of the oligonucleoside solution at 33 ° C. below using a syringe within 1 minute and then keeping the mixture warm at 33 ° C. for 4 hours.
  • the crude product was obtained by a precipitation operation.
  • the yield was 13.3 mg and the purity was 44%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 1, and the yield of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 2.
  • Example 9 The CPG carrying 77.89 ⁇ mol of a guanosine derivative and the amidite represented by the formula (A8), the formula (A9), the formula (A10), the formula (A11), or the formula (A12) are used in the sequence (I).
  • Solid phase synthesis was carried out with AKTA oligopilot plus 100. Then, a CPG carrier carrying 30.06 ⁇ mol worth of oligonucleotide was collected, the oligonucleotide was released from the solid phase carrier using 10.17 g of aqueous ammonia and 3.03 g of ethanol, and then the carrier was filtered off and released. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • a needle that blows argon from an argon cylinder into the system, a needle for removing the sprayed argon, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the inside of the system is replaced with argon by flowing argon, and the gas phase.
  • the oxygen concentration in the solution was set to 0%.
  • the oxygen concentration in the gas phase was measured by using the method described in the measurement method 3. Further, this solution was stirred at 0 ° C. under ice-cooling for 20 minutes and dehydrated with a molecular sieve 4A.
  • the purity of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 1, and the yield of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 2. Further, the orignucleotide is decomposed by the method described in the enzymatic decomposition method, and the HPLC surface 100 values of the formulas (A15) and (A16) are obtained by using the method described in the measurement method 4, respectively. As a result, it was 31.1945% and 0.0064%. Since the number of adenosine in the target oligonucleotide is 13, the impurity content is calculated using the above formula and is shown in Table 4.
  • Example 10 The CPG carrying 77.89 ⁇ mol of a guanosine derivative and the amidite represented by the formula (A8), the formula (A9), the formula (A10), the formula (A11), or the formula (A12) are used in the sequence (I).
  • Solid phase synthesis was carried out with AKTA oligopilot plus 100. Then, a CPG carrier carrying 30.06 ⁇ mol worth of oligonucleotide was collected, the oligonucleotide was released from the solid phase carrier using 10.17 g of aqueous ammonia and 3.03 g of ethanol, and then the carrier was filtered off and released. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • a needle that blows argon from an argon cylinder into the system, a needle for removing the sprayed argon, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the inside of the system is replaced with argon by flowing argon, and the gas phase.
  • the oxygen concentration in the solution was set to 0%.
  • the oxygen concentration in the gas phase was measured by using the method described in the measurement method 3. Further, this solution was stirred at 0 ° C.
  • TBAF tetra-n-butylammonium fluoride
  • the amount of TBAF is 14.0 mol per 1 mol of protecting group) and 0.20 g of acetonitrile is stirred with a stirrer under 0 ° C. conditions and flows into the surface of the oligonucleoside solution within 1 minute using a syringe. After stirring with heat retention at ° C., the temperature was raised to 33 ° C., and the mixture was kept warm for 4 hours to deprotect the 2'-EMM protecting group.
  • the crude product was obtained by a precipitation operation.
  • the yield was 8.5 mg and the purity was 58%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 1, and the yield of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 2.
  • the orignucleotide is decomposed by the method described in the enzymatic decomposition method, and the HPLC surface 100 values of the formulas (A15) and (A16) are obtained by using the method described in the measurement method 4, respectively. As a result, it was 31.1150% and 0.0052%. Since the number of adenosine in the target oligonucleotide is 13, the impurity content is calculated using the above formula and is shown in Table 4.
  • a needle that blows argon from an argon cylinder into the system, a needle for removing the sprayed argon, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the inside of the system is replaced with argon by flowing argon, and the gas phase.
  • the oxygen concentration in the solution was set to 0%.
  • the oxygen concentration in the gas phase was measured by using the method described in the measurement method 3. Further, this solution was stirred at 10 ° C. for 20 minutes, dehydrated with a molecular sieve 4A, and then cooled to 10 ° C.
  • the purity of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 1, and the yield of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 2. Further, the orignucleotide is decomposed by the method described in the enzymatic decomposition method, and the HPLC surface 100 values of the formulas (A15) and (A16) are obtained by using the method described in the measurement method 4, respectively. As a result, it was 31.1972% and 0.0056%. Since the number of adenosine in the target oligonucleotide is 13, the impurity content is calculated using the above formula and is shown in Table 4.
  • Example 12 The CPG carrying 77.89 ⁇ mol of a guanosine derivative and the amidite represented by the formula (A8), the formula (A9), the formula (A10), the formula (A11), or the formula (A12) are used in the sequence (I).
  • Solid phase synthesis was carried out with AKTA oligopilot plus 100. Then, a CPG carrier carrying 30.06 ⁇ mol worth of oligonucleotide was collected, the oligonucleotide was released from the solid phase carrier using 10.17 g of aqueous ammonia and 3.03 g of ethanol, and then the carrier was filtered off and released. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • a needle that blows argon from an argon cylinder into the system, a needle for removing the sprayed argon, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the inside of the system is replaced with argon by flowing argon, and the gas phase.
  • the oxygen concentration in the solution was set to 0%.
  • the oxygen concentration in the gas phase was measured by using the method described in the measurement method 3. Further, this solution was stirred at 20 ° C. for 20 minutes, dehydrated with a molecular sieve 4A, and then adjusted to 20 ° C.
  • TBAF tetra-n-butylammonium fluoride
  • the amount of TBAF (14.0 mol per 1 mol of protecting group) is poured into the surface of the oligonucleoside solution under 20 ° C. conditions with a stirrer within 1 minute using a syringe, and the temperature is adjusted after stirring at 20 ° C. for 1 hour. The temperature was raised to 33 ° C. and the mixture was kept warm for 4 hours to deprotect the 2'-EMM protecting group. The crude product was obtained by a precipitation operation. The yield was 8.2 mg and the purity was 57%.
  • TBAF tetra-n-butylammonium fluoride
  • the purity of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 1, and the yield of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 2. Further, the orignucleotide is decomposed by the method described in the enzymatic decomposition method, and the HPLC surface 100 values of the formulas (A15) and (A16) are obtained by using the method described in the measurement method 4, respectively. As a result, it was 31.364% and 0.0246%. Since the number of adenosine in the target oligonucleotide is 13, the impurity content is calculated using the above formula and is shown in Table 4.
  • a needle that blows argon from an argon cylinder into the system, a needle for removing the sprayed argon, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the inside of the system is replaced with argon by flowing argon, and the gas phase.
  • the oxygen concentration in the solution was set to 0%.
  • the oxygen concentration in the gas phase was measured by using the method described in the measurement method 3. Further, this solution was stirred at 25 ° C. for 20 minutes, dehydrated with a molecular sieve 4A, and then adjusted to 25 ° C.
  • TBAF tetra-n-butylammonium fluoride
  • the amount of TBAF (12.8 mol per 1 mol of protecting group) is poured into the surface of the oligonucleoside solution under 25 ° C. conditions with a stirrer within 1 minute using a syringe, and after warming and stirring at 25 ° C. for 1 hour, the temperature is adjusted. The temperature was raised to 33 ° C. and the mixture was kept warm for 4 hours to deprotect the 2'-EMM protecting group. The crude product was obtained by a precipitation operation. The yield was 8.4 mg and the purity was 56%.
  • TBAF tetra-n-butylammonium fluoride
  • the purity of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 1, and the yield of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 2. Further, the orignucleotide is decomposed by the method described in the enzymatic decomposition method, and the HPLC surface 100 values of the formulas (A15) and (A16) are obtained by using the method described in the measurement method 4, respectively. As a result, it was 31.1564% and 0.0351%. Since the number of adenosine in the target oligonucleotide is 13, the impurity content is calculated using the above formula and is shown in Table 4.
  • a needle that blows argon from an argon cylinder into the system, a needle for removing the sprayed argon, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the inside of the system is replaced with argon by flowing argon, and the gas phase.
  • the oxygen concentration in the solution was set to 0%.
  • the oxygen concentration in the gas phase was measured by using the method described in the measurement method 3.
  • 1.13 g of a dimethyl sulfoxide solution of 1 M tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF) dehydrated with molecular sieve 4A (the amount of TBAF is 12.7 mol per 1 mol of protecting group) is stirred with a stirrer.
  • the 2'-EMM protecting group was deprotected by dropping onto the surface of the oligonucleoside solution at 33 ° C. for 1 hour using a KDScientific syringe pump and then keeping the mixture warm at 33 ° C. for 4 hours.
  • the crude product was obtained by a precipitation operation.
  • the yield was 13.0 mg and the purity was 58%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 1, and the yield of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 2.
  • the orignucleotide is decomposed by the method described in the enzymatic decomposition method, and the HPLC surface 100 values of the formulas (A15) and (A16) are obtained by using the method described in the measurement method 4, respectively. As a result, it was 31.401% and 0.0245%. Since the number of adenosine in the target oligonucleotide is 13, the impurity content is calculated using the above formula and is shown in Table 4.
  • a needle that blows argon from an argon cylinder into the system, a needle for removing the sprayed argon, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the inside of the system is replaced with argon by flowing argon, and the gas phase.
  • the oxygen concentration in the solution was set to 0%.
  • the oxygen concentration in the gas phase was measured by using the method described in the measurement method 3. Further, this solution was stirred at 33 ° C. and dehydrated with molecular sieve 4A. 12.7 mol) was poured into the surface of the oligonucleoside solution under stirring with a stirrer within 1 minute using a syringe, and the mixture was kept warm at 33 ° C.
  • Example 15 The CPG carrying 77.89 ⁇ mol of a guanosine derivative and the amidite represented by the formula (A15), the formula (A16), the formula (A17), the formula (A18), or the formula (A12) are used in the sequence (I).
  • Solid phase synthesis was carried out with AKTA oligopilot plus 100. Then, a CPG carrier carrying 30.04 ⁇ mol worth of oligonucleotide was collected, the oligonucleotide was released from the solid phase carrier using 10.17 g of aqueous ammonia and 3.06 g of ethanol, and then the carrier was filtered off and released. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • a needle that blows argon from an argon cylinder into the system, a needle for removing the sprayed argon, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the inside of the system is replaced with argon by flowing argon, and the gas phase.
  • the oxygen concentration in the solution was set to 0%.
  • the oxygen concentration in the gas phase was measured by using the method described in the measurement method 3.
  • 4.48 g of a dimethylsulfoxide solution of 1 M tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF) dehydrated with molecular sieve 4A (TBAF amount is 13.0 mol per 1 mol of protecting group) is stirred with a stirrer.
  • the mixture flows into the surface of the oligonucleoside solution within 1 minute using a syringe, and then the mixture is kept warm at 25 ° C. for 1 hour, then heated to 33 ° C. and kept warm for 4 hours to obtain 2'-cyanoethoxy.
  • Deprotection of the methoxy (CEM) protecting group was performed.
  • the crude product was obtained by a precipitation operation. The yield was 52.0 mg and the purity was 50%. With respect to the obtained crude product, the purity of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 1, and the yield of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 2.
  • the orignucleotide is decomposed by the method described in the enzymatic decomposition method, and the HPLC surface 100 values of the formulas (A15) and (A16) are obtained by using the method described in the measurement method 4, respectively. As a result, it was 31.441% and 0.0253%. Since the number of adenosine in the target oligonucleotide is 13, the impurity content is calculated using the above formula and is shown in Table 4.
  • a needle that blows argon from an argon cylinder into the system, a needle for removing the sprayed argon, and a needle for measuring Oxygen Meter are pierced into the septum, and the inside of the system is replaced with argon by flowing argon, and the gas phase.
  • the oxygen concentration in the solution was set to 0%.
  • the oxygen concentration in the gas phase was measured by using the method described in the measurement method 3.
  • 1.13 g of a dimethyl sulfoxide solution of 1 M tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF) dehydrated with molecular sieve 4A (the amount of TBAF is 12.7 mol per 1 mol of protecting group) is stirred with a stirrer.
  • the 2'-cyanoethoxymethoxy (CEM) protecting group was deprotected by flowing into the surface of the oligonucleoside solution at 33 ° C. below using a syringe within 1 minute and then keeping the mixture warm at 33 ° C. for 4 hours.
  • the crude product was obtained by a precipitation operation.
  • the yield was 13.5 mg and the purity was 48%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 1, and the yield of the oligonucleotide was measured by using the method described in the measurement method 2.
  • the orignucleotide is decomposed by the method described in the enzymatic decomposition method, and the HPLC surface 100 values of the formulas (A15) and (A16) are obtained by using the method described in the measurement method 4, respectively. As a result, it was 31.3067% and 0.0395%. Since the number of adenosine in the target oligonucleotide is 13, the impurity content is calculated using the above formula and is shown in Table 4.
  • the present invention provides an efficient method for producing a nucleic acid oligomer. It is expected that the purity of the nucleic acid oligomer produced according to the method for producing the nucleic acid oligomer will be improved.
  • SEQ ID NOs: 1 to 13 in the sequence listing represent the base sequences of oligonucleotides produced according to the production method of the present invention.

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Abstract

本発明は、核酸オリゴマーの効率的な製造方法、とりわけ、核酸オリゴマー中のリボースの水酸基の保護基を効率よく脱保護する方法、を提供することを目的とする。本発明はまた、酸素濃度が１５％以下の不活性ガス雰囲気下で、式（３）で示される核酸オリゴマーを、フッ化物イオンと接触させることを含む、式（４）で示される核酸オリゴマー（式（３）および式（４）中の各基の定義は明細書中に定義する通りである）の製造方法を提供することを目的とする。

Description

核酸オリゴマーの製造方法
　本特許出願は、日本国特許出願２０２０－１５９４６０号（２０２０年９月２４日出願）に基づくパリ条約上の優先権および利益を主張するものであり、ここに引用することによって、上記出願に記載された内容の全体が本明細書中に組み込まれるものとする。
　本発明は、リボースを含む核酸オリゴマーの製造方法に関するものであり、さらに詳しくは、核酸オリゴマーに含まれるリボースの水酸基の保護基の脱保護方法に関する。
　近年、核酸オリゴマーの医療分野への応用に関心が高まっている。例えば、アンチセンス核酸、アプタマー、リボザイム、およびｓｉＲＮＡなどのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導する核酸などが挙げられ、これらは核酸医薬品と呼ばれている。
　核酸オリゴマーは、固相合成法により合成可能であり、固相合成法ではヌクレオシドのホスホロアミダイト（以下、「アミダイト」と称する）が原料として用いられる。固相担体上で、核酸を伸長して合成された核酸オリゴマーは、固相担体から切り出し、次いで、リボースを含む核酸オリゴマーは、リボースの２’位の水酸基の保護基を脱保護して除いて、目的とする核酸オリゴマーが製造されている。このようにして合成された核酸オリゴマーの純度は、核酸の固相担体上での伸長反応工程、固相担体からの切り出し工程、各保護基の脱保護工程などの多段階の工程を経ているため必ずしも満足いくものではなく、合成は効率的ではなかった（特許文献１、２）。
国際公開第２００６／０２２３２３号公報 国際公開第２０１３／０２７８４３号公報
　本発明は、核酸オリゴマーの効率的な製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、核酸オリゴマーに、酸素濃度が一定以下の不活性ガス雰囲気下で、フッ化物イオンを接触させることにより、該核酸オリゴマーに含まれるリボースの水酸基の保護基を効率よく脱保護することができるという知見を得て、結果として、核酸オリゴマーの効率的な製造方法を提供することができる。
　本発明は、これら知見に基づき本発明を完成させたものであり、以下の態様を包含するが、これらに限定されるものではない。
１．　酸素濃度が１５％以下の不活性ガス雰囲気下で、式（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、
　Ｇ４は、水素原子または水酸基の保護基を表し、
　Ｇ９は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、アルカリ金属イオン、水素イオンまたはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表し、
　Ｂｃは、それぞれ独立して同一又は相異なる核酸塩基を表し、
　Ｒは、それぞれ独立して同一又は相異なって、水素原子、フッ素原子またはＯＱ基を表し、
　Ｑは、それぞれ独立して同一又は相異なって、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、メチル基、２－メトキシエチル基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基、または式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、
　＊印のついた結合は、ＯＱ基の酸素原子との結合であることを表し、
　ｎは０以上の何れかの整数を表す。）
の保護基を表し、
　Ｙは、それぞれ独立して同一又は相異なって、酸素原子または硫黄原子を表し、
　ｍは、２以上２００までの何れかの整数を表し、
　ＷおよびＸは、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかで定義され、
（ａ）Ｗが水酸基であるときは、Ｘは前記Ｒ基と同じ定義である。
（ｂ）Ｘが水酸基であるときは、ＷはＯＶ基を表し、
　Ｖは、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、または前記式（１）の基を表す。
　ただし、前記Ｒ、ＷおよびＸのうち少なくとも一つの基は、前記式（１）の保護基で保護された水酸基を表す。そして
　ｍが３以上の整数のとき、式（３）で示される核酸オリゴマーは、それぞれの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間のｐ個（ただし、ｐは、式：ｍ－１＞ｐを満たす正の整数である。）のヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい核酸オリゴマーである。）
で示される核酸オリゴマーを、フッ化物イオンと接触させることを特徴とする、式（４）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中、Ｒ’は、それぞれ独立して同一又は相異なって、水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
　Ｑ’は、それぞれ独立して同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、
　式（４）の置換基Ｇ４、Ｇ９、Ｙ、Ｂｃおよびｍの定義は、前記式（３）における定義と同じであり、
　Ｗ０は、水酸基であり、
　Ｘ０は、前記Ｒ’基と同じ定義である。
　そして、ｍが３以上の整数のとき、式（４）で示される核酸オリゴマーは、それぞれの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間のｐ個（ただし、ｐは、式：ｍ－１＞ｐを満たす正の整数である。）のヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい核酸オリゴマーである。）
で示される核酸オリゴマーの製造方法（以下、本明細書中、「本発明の製造方法」と呼称する）。
２．　式（１）中のｎが０または１である、前項１に記載の製造方法。
３．　式（１）中のｎが０である、前項１に記載の製造方法。
４．　式（１）中のｎが１である、前項１に記載の製造方法。
５．　非ヌクレオチドリンカーが、アミノ酸骨格からなるリンカーである、前項１～４の何れか１項に記載の製造方法。
６．　アミノ酸骨格からなるリンカーが、下記式（Ａ１４－１）、（Ａ１４－２）または（Ａ１４－３）の構造を有するリンカーである、前項５に記載の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中、５’および３’は、核酸オリゴマーの５’末端側および３’末端側をそれぞれ示す。）
７．　Ｗが水酸基であり、ＸがＲ基であり、Ｗ０が水酸基であり、そしてＸ０がＲ’基である、前項１～６の何れか１項に記載の製造方法。
８．　フッ化物イオン源が、フッ化テトラアルキルアンモニウムである、前項１～７の何れか１項に記載の製造方法。
９．フッ化物イオン源が、フッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）である、前項１～８の何れか１項に記載の製造方法。
１０．　酸素濃度が１０％以下の不活性ガス雰囲気下でフッ化物イオンと接触させる、前項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
１１．　酸素濃度が５％以下の不活性ガス雰囲気下でフッ化物イオンと接触させる、前項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
１２．　酸素濃度が４％以下の不活性ガス雰囲気下でフッ化物イオンと接触させる、前項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
１３．　酸素濃度が３％以下の不活性ガス雰囲気下でフッ化物イオンと接触させる、前項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
１４．　酸素濃度が２％以下の不活性ガス雰囲気下でフッ化物イオンと接触させる、前項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
１５．　酸素濃度が１％以下の不活性ガス雰囲気下でフッ化物イオンと接触させる、前項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
１６、　酸素濃度が０％の不活性ガス雰囲気下でフッ化物イオンと接触させる、前項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
１７．　式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンを接触させる際の反応系中温度が２５℃以下である、前項１～１６の何れか１項に記載の製造方法。
１８．　式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンを接触させる際の反応系中温度が２０℃以下である、前項１～１６の何れか１項に記載の製造方法。
１９．　式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンを接触させる際の反応系中温度が１５℃以下である、前項１～１６の何れか１項に記載の製造方法。
２０　．式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンを接触させる際の反応系中温度が１０℃以下である、前項１～１６の何れか１項に記載の製造方法。
２１．　式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンを接触させる際の反応系中温度が５℃以下である、前項１～１６の何れか１項に記載の製造方法。
２２．　式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンの全量と接触させるために要する時間が３０分以上である、前項１～１６の何れか１項に記載の製造方法。
２３．　式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンの全量と接触させるために要する時間が１時間以上である、前項１～１６の何れか１項に記載の製造方法。
２４．　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が１０％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である、前項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
２５．　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が２０％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である、前項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
２６．　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が３０％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である、前項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
２７．　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が４０％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である、前項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
２８．　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が５０％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である前項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
２９．　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が６０％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である前項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
３０．　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が７０％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である前項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
３１．　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が８０％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である前項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
３２．　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が９０％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である前項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
３３．　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が９５％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である前項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
３４．　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が１００％であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である前項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
３５．　核酸鎖長が２０鎖長以上である、前項１～３４の何れか１項に記載の製造方法。
３６．　核酸鎖長が３０鎖長以上である、前項１～３４の何れか１項に記載の製造方法。
３７．　核酸鎖長が４０鎖長以上である、前項１～３４の何れか１項に記載の製造方法。
３８．　核酸鎖長が５０鎖長以上である、前項１～３４の何れか１項に記載の製造方法。
　本発明は、効率的な核酸オリゴマーの製造方法を提供する。製造される核酸オリゴマーの純度向上が期待できる。
　酸素濃度が１５％以下の不活性ガス雰囲気下で、式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンを接触させ、式（１）の保護基が脱保護された式（４）で示される核酸オリゴマーを製造する方法について説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　式（１）において、ｎは、０以上のいずれかの整数であり、より好ましくは０～３の整数、より好ましくは、０～２の整数、更に好ましくは０又は１、特に好ましくは１である。
　式（３）のＲ、ＷおよびＸのうち少なくとも一つの基は、前記式（１）の保護基で保護された水酸基を表す。Ｒ、ＷおよびＸのうち、式（１）の割合は、１％以上でもよく、より好ましくは５％以上であり、より好ましくは１０％以上であり、より好ましくは２０％以上であり、より好ましくは３０％以上であり、より好ましくは４０％以上であり、より好ましくは５０％以上であり、より好ましくは６０％以上であり、より好ましくは７０％以上であり、より好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、更により好ましくは９５％以上である。また、合成する核酸鎖長は、１０鎖長以上が好ましく、より好ましくは２０鎖長以上が好ましく、より好ましくは３０鎖長以上が好ましく、より好ましくは４０鎖長以上が好ましく、更により好ましくは、５０鎖長以上である。
　この式（１）で示される水酸基の保護基を脱保護する工程では、フッ化物イオン源として、典型的には、フッ化テトラアルキルアンモニウムが使用される。
　フッ化テトラアルキルアンモニウムとしては、テトラブチルアンモニウムフルオリド、およびテトラメチルアンモニウムフルオリド等が挙げられる。中でもテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）がより好ましい。
　使用するフッ化物イオンの量は、通常、除去される保護基１モル当たり１～１０００モル、好ましくは１～５００、より好ましくは２～２００モル、より好ましくは４～１００モルである。
　この工程では、通常、反応に不活性な有機溶媒が使用され、具体的には、例えば、スルホキシド溶媒、ニトリル溶媒、エーテル溶媒、アミド溶媒、ケトン溶媒、脂肪族炭化水素溶媒、エステル溶媒、芳香族溶媒、またはこれらの２種類以上の混合溶媒が挙げられ、これらの溶媒のうちスルホキシド溶媒が好ましい。スルホキシド溶媒としては、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。ニトリル溶媒としては、アセトニトリル、およびプロピオニトリル等が挙げられる。エーテル溶媒としては、テトラヒドロフラン等が挙げられる。アミド溶媒としては、Ｎ－メチル－２－ピロリドン等が挙げられる。ケトン溶媒としては、アセトン、およびメチルエチルケトン等が挙げられる。脂肪族炭化水素溶媒としては、ヘキサン、およびヘプタン等が挙げられる。エステル溶媒としては、酢酸メチル、および酢酸エチル等が挙げられる。芳香族溶媒としては、トルエン、およびピリジン等が挙げられる。中でも、ジメチルスルホキシドまたはジメチルスルホキシドとアセトニトリルとの混合溶媒が好ましい。
　式（１）で示される水酸基の保護基を脱離する工程で使用される試薬であるフッ化物イオン源は、溶媒に溶解後、通常、脱水して使用する。脱水剤としてモレキュラーシーブ、硫酸塩などが挙げられ、好ましくはモレキュラーシーブ４Ａを使用する。
　使用する溶媒の量は、通常、脱保護工程に供される核酸オリゴマー１モル当たり、５～８，０００Ｌ、好ましくは５０～２，０００Ｌ、より好ましくは１００～１，６００Ｌである。
　必要であれば、本工程における副生成物である下記式（２）に示す化合物と反応して当該化合物を捕捉する化合物を添加することができる。該捕捉する化合物としては、例えば、ニトロアルカン、アルキルアミン、アミジン、チオール、チオール誘導体又はこれらの２種類以上の混合物を挙げることができる。「ニトロアルカン」としては、例えばニトロメタンを挙げることができる。「アルキルアミン」としては、例えば、直鎖状の炭素数１～６のアルキルアミン、および炭素数１～８の環状アミンを挙げることができる。具体的には、例えば、メチルアミン、エチルアミン、ｎ－プロピルアミン、ｎ－ブチルアミン、ｎ－ペンチルアミン、ｎ－ヘキシルアミン、モルホリン、およびピペリジンを挙げることができる。「アミジン」としては、例えば、ベンズアミジン、およびホルムアミジンを挙げることができる。「チオール」としては、例えば、直鎖状の炭素数１～６のチオールを挙げることができる。具体的には、例えば、メタンチオール、エタンチオール、１－プロパンチオール、１－ブタンチオール、１－ペンタンチオール、および１－ヘキサンチオールを挙げることができる。「チオール誘導体」としては、例えば、同一又は異なる直鎖状の炭素数１～６のアルキルチオール基を有するアルコール又はエーテルを挙げることができる。具体的には、例えば、２－メルカプトエタノール、４－メルカプト－１－ブタノール、６－メルカプト－１－ヘキサノール、メルカプトメチルエーテル、２－メルカプトエチルエーテル、３－メルカプトプロピルエーテル、４－メルカプトブチルエーテル、５－メルカプトペンチルエーテル、および６－メルカプトヘキシルエーテルを挙げることができる。より好ましくはニトロメタンを使用する。
　式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　副生成物である式（２）に示す化合物を捕捉する化合物の使用量は、式（１）で示される水酸基の保護基を脱離させるフッ化物イオン源に対して０．１～１００．０モル％で用いることができ、好ましくは１．０～５０．０モル％、好ましくは２．０～４０．０モル％、より好ましくは３．０～３０．０モル％である。
　式（３）で示される核酸オリゴマーとフッ化物イオンとの接触反応は、フッ化物イオンを式（３）で示される核酸オリゴマーに添加してもよいし、逆に、フッ化物イオンに式（３）で示される核酸オリゴマーを添加してもよいし、両者を同時に加えてもよい。フッ化物イオンを式（３）で示される核酸オリゴマーに添加する方法が好ましい。
　式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンの全量を添加して接触させるために要する時間は、５分以上が好ましく、１０分以上がより好ましく、１５分以上がより好ましく、３０分以上がより好ましく、更に好ましくは１時間以上かけて滴下することである。
　かかる添加は、式（３）で示される核酸オリゴマーを含む溶液の液表面または液中に５分以上かけて滴下することが好ましく、１０分以上かけて滴下することがより好ましく、１５分以上かけて滴下することがより好ましく、３０分以上かけて滴下することがより好ましく、更に好ましくは１時間以上かけて滴下することである。
　式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンを添加する際の両方または片方の溶液の温度は、８０℃以下でもよく、好ましくは両方とも４０℃以下であり、好ましくは両方とも３５℃以下であり、より好ましくは両方とも３０℃以下であり、より好ましくは両方とも２５℃以下であり、より好ましくは両方とも２０℃以下であり、より好ましくは両方とも１５℃以下であり、より好ましくは両方とも１０℃以下であり、更により好ましくは両方とも５℃以下である。
　式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンを添加終了後、１分以上保温してもよく、好ましくは５分以上保温であり、より好ましくは１０分以上保温であり、より好ましくは１５分以上保温であり、より好ましくは３０分以上保温であり、更により好ましくは１時間以上保温である。
　更に、保温後、昇温してもよく、５℃以上８０℃以下に昇温してもよく、好ましくは１０℃以上４０℃以下への昇温であり、好ましくは１０℃以上３５℃以下への昇温であり、好ましくは１５℃以上３５℃以下への昇温であり、より好ましくは２０℃以上３５℃以下への昇温であり、更に好ましくは２５℃以上３５℃以下への昇温である。
　更に昇温後、脱保護反応の時間は、使用する脱保護剤の種類、反応温度によって異なるが、通常、１時間～１００時間、好ましくは、１～２４時間、より好ましくは２～１２時間、更に好ましくは３～６時間である。
　尚、フッ化物イオンは、任意のタイミングで追加してもよい。
　酸素濃度が１５％以下の不活性ガス雰囲気は、例えば、前記所定の酸素濃度以下の不活性ガスを調製して、反応系に供給し、気相中の酸素濃度が前記設定濃度範囲内であることを測定して、確認することにより調整してもよい。具体的には、反応系の気相にアルゴンもしくは窒素などの高純度の不活性ガス、または酸素濃度を所定の濃度に調整した不活性ガスを流通させるか、あるいは反応系の気相雰囲気を前記不活性ガスまたは濃度調整した不活性ガスで置換することによって調整することができる。
　ここで、本発明の製法で使用する不活性ガスとは、窒素ガス、アルゴンガス、ヘリウムガス、二酸化炭素を挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、窒素ガスまたはアルゴンガスを挙げられる。
　反応系雰囲気置換方法は、減圧置換、加圧置換、フロー置換、バブリングによる置換、または凍結脱気による置換でもよく、その際超音波をかけても加熱してもよい。より好ましい方法は、フロー置換および減圧置換である。
　酸素濃度は、好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下がよく、より好ましくは４％以下がよく、より好ましくは３％以下がよく、より好ましくは２％以下がよく、より好ましくは１％以下がよく、更により好ましくは０％である。
　保護基の脱離反応時に反応系の攪拌は必須ではないが、通常、攪拌動力Ｐｖが０．０～０．５ｋＷ／ｍ３の範囲で攪拌を行い、Ｐｖが０．１～０．３ｋＷ／ｍ３の攪拌が好ましい。
　反応後に生成した核酸オリゴマーの反応混合物からの分離精製手段は、通常の方法が採用され、例えば、抽出、濃縮、中和、濾過、遠心分離、再結晶、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー、沈殿（例えば、エタノール、イソプロパノール、メタノールまたはポリエチレングリコールを用いた核酸オリゴマーの沈殿）、透析、限外ろ過などの手段を用いることにより、２’位または３’位の水酸基の保護基である式（１）による保護が脱保護される。精製された核酸オリゴマーを単離することができる。単離された核酸オリゴマーは、通常、その５’末端の水酸基が保護された核酸オリゴマーとして得られる。
　式（３）で示される核酸オリゴマーから式（１）で示される保護基を脱保護することにより下記式（４）で示される核酸オリゴマーを得る反応は、以下のとおりである。（スキーム１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 　Ｇ４は、水素原子または水酸基の保護基を表し、
　Ｇ９は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、アルカリ金属イオン、水素イオンまたはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表し、
　Ｂｃは、それぞれ独立して同一又は相異なる核酸塩基を表し、
　Ｒは、それぞれ独立して同一又は相異なって、水素原子、フッ素原子またはＯＱ基を表し、
　Ｑは、それぞれ独立して同一又は相異なって、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、メチル基、２－メトキシエチル基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基、または式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （式中、
　＊印のついた結合は、ＯＱ基の酸素原子との結合であることを表し、
　ｎは０以上の何れかの整数を表す。）
の保護基を表し、
　Ｙは、それぞれ独立して同一又は相異なって、酸素原子または硫黄原子を表し、
　ｍは、２以上２００までの何れかの整数を表し、
　ＷおよびＸは、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかで定義され、
（ａ）Ｗが水酸基であるときは、Ｘは前記Ｒ基と同じ定義である。
（ｂ）Ｘが水酸基であるときは、ＷはＯＶ基を表し、
　Ｖは、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、または前記式（１）の基を表す。
　ただし、前記Ｒ、ＷおよびＸのうち少なくとも一つの基は、前記式（１）の保護基で保護された水酸基を表す。そして
　ｍが３以上の整数のとき、式（３）で示される核酸オリゴマーは、それぞれの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間のｐ個（ただし、ｐは、式：ｍ－１＞ｐを満たす正の整数である。）のヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい核酸オリゴマーである。）
　式（３）または式（４）において、Ｒが、ＯＱ基を表し、Ｒ’が、ＯＱ’基を表す際、リボースの構造は、下記式（ＬＮＡ－１）、（ＬＮＡ－２）または（ＬＮＡ－３）で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 （式中、Ｂａｓｅは、核酸塩基を示す）
　本発明で使用される核酸オリゴマー内に含まれるヌクレオシド（リボース、およびデオキシリボース）としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’－Ｏ－ＭＯＥ（２’－Ｏ－メトキシエチル）、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、および前記のＬＮＡが例示されるが、前記ヌクレオシドは、これらに限定されない。
　式（３）で表される核酸オリゴマーは、例えば、スキーム２に示すように、式（５）で示される固相合成により製造される核酸オリゴマーを固相担体から切り出して得られる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　固相担体上で合成される式（５）の核酸オリゴマーについて説明する。
　置換基Ｂａは、それぞれ独立して同一又は相異なる保護されていてもよい核酸塩基を表す。
　Ｇ４およびＹは、前記の式（３）において定義されたとおりであり、
　Ｇ２は、それぞれ独立して同一又は相異なるリン酸の保護基を表し、
　Ｘ１がＯＺを表すとき、Ｗ１はＯＶ基を表し、
　Ｖは、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、または前記式（１）の基を表す。
　Ｘ１がＲ基を表すとき、Ｗ１はＯＺで表される基を表し、
　Ｚは、固相担体、および固相担体と核酸オリゴマーの３’末端のリボースの２’位もしくは３’位の水酸基の酸素原子とをつなぐ連結部からなる基を表す。
　より具体的には、Ｚは、下記式（６）で示される構造を表し、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 　式（６）において、Ｓｐは、スペーサーを表す。
　スペーサー（Ｓｐ）は、例えば、下記式（７）に示す構造式を有するものが例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　Ｌｉｎｋｅｒは、例えば、下記式（８－１）（８－２）（８－３）（８－４）（８－５）（８－６）（８－７）、（８－８）に示す構造でもよい。
　Ｓｏｌｉｄ　ｓｕｐｐｏｒｔとしては、無機多孔質担体や有機系樹脂担体などが挙げられる。無機多孔質担体には、例えば、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）およびゼオライトが挙げられる。有機系樹脂担体には、例えば、ポリスチレンからなる担体が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 （式中、Ａは、それぞれ独立して水酸基、アルコキシ基、またはアルキル基であってもよい。アルコキシ基としては例えばメトキシ基およびエトキシ基が挙げられる。アルキル基としては例えばメチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ－プロピル基が挙げられる。Ｓｉは、担体表面の水酸基の酸素と結合していることを示す。）
　Ｇ４は、水素原子または水酸基の保護基を表し、保護基を表す場合はＧ１と同じ保護基を表す。Ｇ４は脱保護された場合には水素原子であるが、その場合のヌクレオチド化合物もまた、一連の核酸伸張反応の工程に供される。
　Ｇ９は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、アルカリ金属イオン、水素イオンまたはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表す。アルキルアンモニウムイオンとして、具体的なアルキル部分の例としては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロビル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ジブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、及びヘキシルが挙げられるが、より具体的には、例えば、ジエチルアンモニウムイオン、トリエチルアンモニウムイオン、テトラブチルアンモニウムイオン、ヘキシルアンモニウムイオン、およびジブチルアンモニウムイオンなどが挙げられる。また、アルカリ金属イオンとしては、例えば、ナトリウムイオン、およびリチウムイオンが挙げられる。また、ヒドロキシアルキルアンモニウムイオンとして、具体的なヒドロキシアルキル部分の例としては、例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシ－ｎ－プロピル、ヒドロキシイソプロピル、ヒドロキシ－ｎ－ブチル、トリスヒドロキシメチルが挙げられるが、より具体的なヒドロキシアルキルアンモニウムイオンの例としては、トリスヒドロキシメチルアンモニウムイオンなどが挙げられる。
　前記式（５）の化合物は、例えば、下記式（Ａ１３）のアミダイト化合物を用いてアミダイト法により製造される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 （式中、
　Ｒは、水素原子、フッ素原子、またはＯＱ基を表し、
　Ｑは、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、メチル基、２－メトキシエチル基、４’の炭素原子と結合したメチレン基、４’の炭素原子と結合したエチレン基、４’の炭素原子と結合したエチリデン基、または前記式（１）で示される保護基を表し、
　Ｂａは、保護されていてもよい核酸塩基を表し、
　Ｇ１は、水酸基の保護基を表し、
　Ｇ２は、リン酸の保護基を表し、
　Ｇ３は、アルキル基、または互いにその末端で結合して環状構造を表す。）
　Ｂａは、Ｂｃで表される核酸塩基または当該核酸塩基が保護基で保護された核酸塩基を表す。
　Ｂａにおける核酸塩基は、特に限定されない。当該核酸塩基としては、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミン、５－メチルシトシン、シュードウラシル、１－メチルシュードウラシルなどが挙げられる。また、核酸塩基は、置換基により置換されていてもよい。そのような置換基としては、例えば、フルオロ基、クロロ基ブロモ基、およびヨード基などのハロゲン原子、アセチル基などのアシル基、メチル基、およびエチル基などのアルキル基、ベンジル基などのアリールアルキル基、メトキシ基などのアルコキシ基、メトキシエチル基などのアルコキシアルキル基、シアノエチル基などのシアノアルキル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、アシルオキシメチル基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシ基、シアノ基、およびニトロ基など、並びにそれらの２種類以上の置換基の組み合わせが挙げられる。
　核酸塩基が環外にアミノ基を有する場合、当該アミノ基の保護基としては、特に限定されず、公知の核酸化学で用いられる保護基を使用することができ、そのような保護基としては、例えば、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、および（ジメチルアミノ）メチレン基など、並びにそれらの２種類以上の保護基の組み合わせが挙げられる。
　Ｂａは、より具体的には、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
（上記式中、
　Ｒ４は、水素原子、メチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はベンゾイル基を表し、
　Ｒ５は、水素原子、アセチル基、イソブチリル基又はベンゾイル基を表し、
　Ｒ６は、水素原子、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はイソブチリル基を表し、
　Ｒ７は、２－シアノエチル基を表し、
　Ｒ８は、水素原子、メチル基、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基又は４－メチルベンゾイル基を表し、
　Ｒ９は、ジメチルアミノメチレン基を表す。）
のいずれかで表される基を表す。
　Ｇ１としては、保護基として機能し得るものであれば特に制限なく使用することができ、アミダイト化合物で使用される公知の保護基を広く使用することができる。
　Ｇ１としては、好ましくは、以下の基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 （式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同一又は相異なって水素又はアルコキシ基を表す。）
　Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、１つが水素であり、残りの２つが同一または相異なる（同一が好ましい）アルコキシ基であることが好ましく、アルコキシ基としてはメトキシ基が特に好ましい。
　Ｇ２としては、保護基として機能し得るものであれば特に制限なく使用することができ、アミダイト化合物で使用される公知の保護基を広く使用することができる。Ｇ２としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、ハロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、シクロアルケニル基、シクロアルキルアルキル基、シクリルアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリルアルケニル基、ヘテロシクリルアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、シリル基、シリルオキシアルキル基、モノ、ジ又はトリアルキルシリル基、モノ、ジ又はトリアルキルシリルオキシアルキル基などが挙げられ、これらは１つ以上の電子求引基で置換されていてもよい。
　Ｇ２は、好ましくは、電子求引基で置換されたアルキル基である。当該電子求引基としては、例えば、シアノ基、ニトロ基、アルキルスルホニル基、ハロゲン原子、アリールスルホニル基、トリハロメチル基、トリアルキルアミノ基などが挙げられ、好ましくはシアノ基である。
　Ｇ２としては、特に好ましいのは、以下の基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　Ｇ３は、２つのＧ３が互いに結合して環状構造を形成していてもよい。Ｇ３としては、両方がイソプロピル基であることが好ましい。
　前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＧ２の定義におけるアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれでもよく、好ましくは炭素数１～１２のアルキル基、より好ましくは炭素数１～６のアルキル基である。具体的なアルキル基の例としては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロビル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、及びヘキシルが挙げられる。前記置定義におけるアルコキシ基を構成するアルキル基部分は、ここでのアルキル基の定義と同じ定義を有する。
　本明細書においては、核酸塩基とは、天然型あるいは非天然型の核酸塩基骨格を有する基を意味する。前記核酸塩基は、天然型あるいは非天然型の核酸塩基骨格が修飾された修飾体も包含する。ＢＣで表される核酸塩基としては、より具体的には、以下の構造が例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
（上記式中、
　Ｒ４’は、水素原子、またはメチル基を表し、
　Ｒ５’は、水素原子、またはアセチル基を表し、
　Ｒ６’は、水素原子を表し、
　Ｒ８’は、水素原子、メチル基を表す。）
　式（３）および式（４）の核酸オリゴマーの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間のｐ個（ただし、ｐは、式：ｍ－１＞ｐを満たす正の整数である。）のヌクレオチドの代わりに、導入されうる非ヌクレオチドリンカーについて説明する。
　非ヌクレオチドリンカーとしては、アミノ酸骨格からなるリンカー（例えば、特許第５１５７１６８号公報または特許第５５５４８８１号公報に記載されたアミノ酸骨格からなるリンカー）が例示される。具体的には、非限定的な例として、例えば、式（Ａ１４－１）、（Ａ１４－２）または（１４－３）（例えば、特許第５５５５３４６号公報または特許第５８７６８９０号公報に記載）で表されるリンカーが例示される。これらのリンカー以外に国際公開第２０１２／００５３６８号公報、国際公開第２０１８／１８２００８号公報または国際公開第２０１９／０７４１１０号公報に記載のリンカーが例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　式（３）におけるＲ基および式（４）におけるＲ’基が、水酸基以外の置換基であるヌクレオチドおよびアミダイトは、特許第３７４５２２６号公報などに記載された公知の方法、国際公開第２００１／０５３５２８号公報あるいは特開２０１４－２２１８１７号公報およびそこに引用される公知の方法で合成されるヌクレオシドから製造することもでき、さらには、市販品として入手可能なものを用いて、後述する実施例に記載の方法に則して又はこれらの方法に適宜変更を加えた方法により製造することができる。
核酸オリゴマー（以下、オリゴヌクレオチドとも記す）の固相担体からの切り出し
　切り出し工程は、所望の鎖長の核酸オリゴマーを、切り出し剤として濃アンモニア水を用いて実施した。
　ホスホロアミダイト法では、一般的に公知の方法（例えば、前記の特許第５１５７１６８号公報または特許第５５５４８８１号公報に記載の方法）に従って、脱保護工程、縮合工程、及び酸化工程の各工程を繰り返し行うことにより、核酸伸長反応を行う。
（核酸伸長反応）
　本明細書において、「核酸伸長反応」とは、ホスホジエステル結合を介して、ヌクレオチドを順次結合させることにより、オリゴヌクレオチドを伸長させる反応を意味する。核酸伸長反応は、一般的なホスホロアミダイト法の手順に従い行うことができる。核酸伸長反応は、ホスホロアミダイト法を採用する核酸自動合成装置等を用いて行ってもよい。
　核酸オリゴマーの鎖長は、例えば、２～２００ｍｅｒや１０～１５０ｍｅｒ、１５～１１０ｍｅｒであってもよい。
　５’脱保護工程は、固相担体上に担持されるＲＮＡ鎖末端の５’ヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程である。一般的な保護基としては、４，４’－ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ基）や４－モノメトキシトリチル基、４，４’，４”－トリメトキシトリチル基が用いられる。脱保護は、酸を用いて行うことができる。脱保護用の酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸、ｐ－トルエンスルホン酸等が挙げられる。
　縮合工程は、前記脱保護工程により脱保護したオリゴヌクレオチド鎖末端の５’ヒドロキシル基に対して、式（Ａ１３）で示されるヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させる反応である。なお、核酸伸長に用いるホスホロアミダイトとしては、式（Ａ１３）または（Ａ１２）で示されるアミダイト化合物を用いる。また、他に使用可能なホスホロアミダイトとして、２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、２’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基，２’－Ｏ－メトキシエチル基，２’－Ｈ，２'－フルオロ－２’－デオキシ－β－Ｄ－アラビノフラノシル等が挙げられる。前記ヌクレオシドホスホロアミダイトとしては、５’ヒドロキシル基が保護基（例、ＤＭＴｒ基）で保護されたものを用いる。縮合工程は、前記ヌクレオシドホスホロアミダイトを活性化する活性化剤を用いて行うことができる。活性化剤としては、例えば、５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＴ）、１Ｈ－テトラゾール、４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）、Ｎ－メチルベンズイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＭｅＢＩＴ）、ベンズイミダゾリウムトリフラート（ＢＩＴ）、Ｎ－フェニルイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＰｈＩＭＴ）、イミダゾリウムトリフラート（ＩＭＴ）、５－ニトロベンズイミダゾリウムトリフラート（ＮＢＴ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）又は５－（ビス－３，５－トリフルオロメチルフェニル）－１Ｈ－テトラゾール等が挙げられる。
　縮合工程の後は、適宜、未反応の５’ヒドロキシル基をキャッピングしてもよい。キャッピングは、無水酢酸－テトラヒドロフラン溶液、フェノキシ酢酸無水物／Ｎ－メチルイミダゾール溶液等の公知のキャッピング溶液を用いて行うことができる。
　酸化工程は、前記縮合工程により形成された亜リン酸基をリン酸基又はチオリン酸基に変換する工程である。本工程は、３価のリンから５価のリンに酸化剤を使用して変換する反応であり、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に酸化剤を作用させることにより実施することができる。
　亜リン酸基をリン酸基に変換する場合には、「酸化剤」として、例えば、ヨウ素、あるいはｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシドや過酸化水素などの過酸、あるいは（１Ｓ）－（＋）－（１０－ｃａｍｐｈｏｒｓｕｌｆｏｎｙｌ）－ｏｘａｚｉｒｉｄｉｎｅ（ＣＳＯ）、またはこれらの２つ以上の混合物を使用することができる。該酸化剤は、０．００５～２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。反応に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ピリジン、ＴＨＦ、水、アセトニトリル又はこれらの２つ以上の任意の混合溶媒を挙げることができる。例えば、ヨウ素／水／ピリジン／アセトニトリル、あるいはヨウ素／水／ピリジン、あるいはヨウ素／水／ピリジン／アセトニトリル／ＮＭＩ、あるいはヨウ素／水／ピリジン／ＴＨＦ、あるいはヨウ素／水／ピリジン／ＴＨＦ／ＮＭＩ、あるいはＣＳＯ／アセトニトリル、あるいはヨウ素／ピリジン－酢酸や過酸（ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド／メチレンクロリド）を用いることができる。
　亜リン酸トリエステル基をチオリン酸基に変換する場合には、「酸化剤」として、例えば、硫黄、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン－１，１－ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＡＤＴＴ）、５－フェニル－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－オン（ＰＯＳ）、［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾリン－３－チオン（ＤＤＴＴ）、またはフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）を使用することができる。該酸化剤は、０．０１～２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。反応に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ピリジン又はこれらの任意の混合溶媒が挙げられる。酸化工程は、前記キャッピング操作の後で行ってもよいし、逆に、酸化工程の後でキャッピング操作を行ってもよいし、この順序は限定されない。
　リン酸保護基を脱保護する工程は、所望の配列を有する核酸の合成が完了した後は、リン酸部分の保護基を脱保護するためにアミン類を作用させる。アミン類としては、例えば、特許第４７０５７１６号公報に記載されるジエチルアミン等が挙げられる。
　伸長の最後に導入したヌクレオシドの５’ヒドロキシル基の保護基は、後述の固相担体からの切り出し及び保護基の脱保護の後、５’保護基をタグとするカラム精製のために使用してもよく、カラム精製後、５’ヒドロキシル基の保護基を脱保護してもよい。
　更にアンモニア水又はアミン類等を用いて、例えば、前記スキーム２で示されるように固相担体からオリゴヌクレオチド鎖を切断して回収する。アミン類としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミン、ジエチルアミン等が挙げられる。
　本発明の製造方法を用いて製造可能な核酸オリゴマーとしては、核酸オリゴマー内に含まれるヌクレオシドが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、並びに２’－Ｏ－ＭＯＥ、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆを有するＲＮＡ、およびＬＮＡである核酸オリゴマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　例えば、Xiulong, Shenら著、Nucleic Acids Research, 2018, Vol. 46, No.46, 1584-1600、およびDaniel O'Reillyら著、Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No.2, 546-558に記載された、様々なヌクレオシドの例が挙げられる。
　本発明の製造方法において使用可能な核酸オリゴマーの典型的な例を、実施例に記載の例に加えて下記の例を示すが、これらに限定されるものではない。
　以下、配列の説明中、Ｕはウリジンを、Ｃはシチジンを、Ａはアデノシンを、またはＧはグアノシンを示す。
　国際公開第２０１９／０６０４４２号に記載されている、下記の配列（Ｂ）および（Ｃ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｂ）：５’－AUGGAAUmACUCUUGGUUmACdTdT－３’（Antisense）（配列番号３）　２１ｍｅｒ
配列（Ｃ）：５’－GUmAACmCmAAGAGUmAUmUmCmCmAUmdTdT－３’（Sense）（配列番号４）　２１ｍｅｒ
　配列（Ｂ）および（Ｃ）中、Umは2'-O-メチルウリジンを、Cmは2'-O-メチルシチジンを、またdTはチミジンを示す。
　Daniel O'Reillyら著、Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No.2, 546-558に記載されている核酸オリゴマー（553頁参照）が挙げられる。典型例として、下記の配列（Ｄ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｄ）：５’－AGAGCCAGCCUUCUUAUUGUUUUAGAGCUAUGCUGU－３’（配列番号５）　３６ｍｅｒ
　特許第４９６５７４５号公報に記載されている核酸オリゴマーが挙げられる。典型例として、下記の配列（Ｅ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｅ）：５’－CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-P-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU－３’　４９ｍｅｒ。CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC（配列番号６）、GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU（配列番号７）。
　配列（Ｅ）中、”Ｐ”は、以下の式（Ａ５）において波線で区切られる部分構造で示される。
　Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No. 2: 547に記載されている、下記の配列（Ｆ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｆ）：５’－ACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU－３’（配列番号８）　６７ｍｅｒ
　ＪＰ　２０１５－５２３８５６, １７３頁に記載されている、下記の配列（Ｇ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｅ）：５’－GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGCCCUCCCUUGUUUAAACCUGACCAGUUAACCGGCUGGUUAGGUUUUU－３’（配列番号９）　９４ｍｅｒ
　ＪＰ　２０１７－５３７６２６に記載されている核酸オリゴマーが挙げられる。典型例として、下記の配列（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｊ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｆ）：５’－AGUCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUUAGAGCUAGUAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU－３’（配列番号１０）　１００ｍｅｒ
配列（Ｇ）：５’－GCAGAUGUAGUGUUUCCACAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU－３’（配列番号１１）　１１３ｍｅｒ
配列（Ｈ）：５’－dAdGdTdCdCdTdCdAdTdCdTdCdCdCdTdCdAdAdGdCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU －３’（配列番号１２）　１１３ｍｅｒ
　配列（Ｈ）中、dTはチミジンを、dCは2'-デオキシシチジンを、dAは2'-デオキシアデノシンを、またdGは2'-デオキシグアノシンを示す。
配列（Ｊ）：５’－AmsGmsUmsCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUmsUmsUmsU－３’（配列番号１３）　１１３ｍｅｒ
　配列（Ｊ）中、Umは2'-O-メチルウリジンを、Amは2'-O-メチルアデノシンを、Gmは2'-O-メチルグアノシンを、またsはホスホロチオエート修飾を示す。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
測定方法
　以下の試験で用いた各測定方法を以下に示す。
（測定方法１：オリゴヌクレオチドの純度の測定方法）
　固相合成後のオリゴヌクレオチド粗生成物の純度の測定は、ＨＰＬＣにより行った。粗生成物をＨＰＬＣ（波長２６０ｎｍ、カラムＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ＢＥＨ　Ｃ１８，　２．１ｍｍ×１００ｍｍ，　１．７μｍ）によって各成分に分離し、得られたクロマトグラムの総面積値における主生成物の面積値からオリゴヌクレオチドの純度を算出した。
　ＨＰＬＣ測定条件を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
（測定方法２：オリゴヌクレオチド収量の測定）
　前記粗生成物のＯＤ２６０を測定した。ＯＤ２６０とは１ｍＬ溶液（ｐＨ＝７．５）における１０ｍｍ光路長あたりのＵＶ２６０ｎｍの吸光度を表す。一般的にＲＮＡでは１ＯＤ＝４０μｇであることが知られていることから、前記ＯＤ２６０の測定値に基づき、収量を算出した。さらに、固相担体の単位体積当たりの収量を算出した。実施例１～５及び比較例１、２については実施例１の収量に対する相対収量を求めた。
（測定方法３：酸素濃度の測定）
　反応系の雰囲気（気相）の酸素濃度はＩＩＪＩＭＡ　ＥＬＥＣＴＲＯＮＩＣＳ　ＣＯＲＰ．製のＰＡＣＫ　ＫＥＥＰＥＲ（Ｒｅｓｉｄｕａｌ　Ｏｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒ）を用いて測定した。酸素濃度測定前には空気中及び純窒素中酸素濃度の測定により装置を校正後、装置に付属の針をセプタムなどで蓋をしたフラスコなどの容器に突き刺し、系中気相部分の酸素濃度を測定した。酸素濃度の測定値はリアルタイムで表示され、測定値が安定した所をその雰囲気の酸素濃度とした。
（測定方法４：オリゴヌクレオチドの酵素分解物の測定方法）
　固相合成後のオリゴヌクレオチド粗生成物の酵素分解物の測定は、ＨＰＬＣにより行った。分解物をＨＰＬＣ（波長２６０ｎｍ、カラムＤｅｖｅｌｉｓｉｌ　ＯＤＳ－ＵＧ－５，　４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，　５μｍ）によって各成分に分離し、得られたクロマトグラムの総面積値における、式（Ａ１５）に示すアデノシン、及び式（Ａ１６）に示すアデノシンシアノエチル付加体のＨＰＬＣ面百値を算出した。ここで、本明細書中、以下、「ＨＰＬＣ面百値」は「ＨＰＬＣ面積百分率値」を意味する。
　ＨＰＬＣ測定条件を下記表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
オリゴマーの酵素分解によりＨＰＬＣにて検出される成分であるアデノシンとアデノシンのシアノエチル付加体の構造式をそれぞれ式（Ａ１５）、式（Ａ１６）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
（酵素分解法）
　オリゴヌクレオチドの酵素分解の方法について以下に示す。
　０．５ｍｇ／ｍＬの濃度に調節したオリゴヌクレオチドの粗生成物水溶液８３μＬを２ｍＬバイヤルに入れた後、０．２ｕｎｉｔ／μＬのＮｕｃｌｅａｓｅＰ（ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｉｔｒｉｎｕｍ由来）の水溶液　２μＬを添加し、６０℃インキュベーター中で２時間保温した。更に、Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｃａｌｆ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ由来）１０ｘ　Ｂｕｆｆｅｒ　１０μＬ、およびＡｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｃａｌｆ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ由来）　５μＬを添加し、５６℃インキュベーター中で２時間保温した。
　オリゴヌクレオチドの酵素分解の結果、測定法４に記載するＨＰＬＣ分析によって検出された式（Ａ１５）と式（Ａ１６）のＨＰＬＣ面百値から、オリゴマー中に含有する不純物である、アデノシンシアノエチル付加体の含量を算出した。該算出方法を以下に示す。
［ｄ］＝［ａ］×（［ａ］＋［ｂ］）×１００×［ｃ］
　上記式中、［ａ］は測定法４に記載するＨＰＬＣ分析によって検出された式（Ａ１６）のＨＰＬＣ面百値を示し、［ｂ］は測定法４に記載するＨＰＬＣ分析によって検出された式（Ａ１５）のＨＰＬＣ面百値を示し、［ｃ］は目的オリゴヌクレオチド中に含まれるアデノシンの個数を示し、［ｄ］は測定法４に記載するＨＰＬＣ分析によって検出された式（Ａ１５）と式（Ａ１６）のＨＰＬＣ面百値から、オリゴマー中に含有する不純物である、アデノシンシアノエチル付加体の含量を示す。
オリゴヌクレオチドの固相合成
　配列（Ｉ）：５’－AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G－３’（配列番号１、２）　５３ｍｅｒ
　前記配列（Ｉ）において、”Ａ”は、以下の式（Ａ１）において波線で区切られる部分構造で示される。”Ｃ”は、以下の式（Ａ２）において波線で区切られる部分構造で示される。”Ｇ”は、以下の式（Ａ３）において波線で区切られる部分構造で示される。Ｕは、以下の式（Ａ４）において波線で区切られる部分構造で示される。”Ｐ”は、以下の式（Ａ５）において波線で区切られる部分構造で示される。なお、５‘末端の”Ａ”は、以下の式（Ａ６）において波線で区切られる部分構造で示される。また、３‘末端の”Ｇ”は、以下の式（Ａ７）において波線で区切られる部分構造で示される。但し、構造式中のリン酸基は塩であってもよい。
AGCAGAGUAC ACACAGCAUA UACC（配列番号１）
GGUAUAUGCU GUGUGUACUC UGCUUC（配列番号２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　固相担体として、コントロールド・ポア・ガラス（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ））を使用し、核酸合成機としてＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、ホスホロアミダイト固相合成法により、上記配列（Ｉ）からなるオリゴヌクレオチドを３’側から５’側に向かって合成した。合成は７７．８９μｍｏｌスケールにて実施した。また、合成には、米国特許公開第２０１２／００３５２４６号公報の実施例２に記載のウリジンＥＭＭアミダイト（Ａ１１）、実施例３に記載のシチジンＥＭＭアミダイト（Ａ９）、実施例４に記載のアデノシンＥＭＭアミダイト（Ａ８）、実施例５に記載のグアノシンＥＭＭアミダイト（Ａ１０）、および国際公開第２０１７／１８８０４２号公報に記載の化合物（Ａ１２）、および特許第５１５７１６８号公報の実施例９に記載のＮ６－アセチル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）アデノシン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト（Ａ１５）、実施例８に記載のＮ２－アセチル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）グアノシン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）（Ａ１７）、実施例５に記載のＮ４－アセチル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）シチジン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）（Ａ１６）、実施例２に記載の　５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）ウリジン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）（Ａ１８）を使用し、デブロッキング溶液として高純度トリクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、そしてキャッピング溶液としてフェノキシ酢酸無水物溶液とＮ－メチルイミダゾール溶液を使用した。核酸伸長終了後、担体上の核酸にジエチルアミン溶液を作用させることでリン酸部分のシアノエチル保護基を選択的に脱保護した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
　次に、本発明の製法により製造されるオリゴヌクレオチド（核酸オリゴマー）の具体的な製造例を示す。ここで、下記の実施例において本発明の製法により製造されるオリゴヌクレオチドは、前記配列番号１および２で示される配列（Ｉ）を有するオリゴヌクレオチドである。
　また、以下の実施例および比較例中に記載するグアノシン誘導体とは、下記の構造式で示される化合物を意味する。下記構造式において図示されたサークルは、ＣＰＧを模式的に示すものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
（実施例１）
　７７．８９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０６μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１７ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２１ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．２２ｇとアセトニトリル２．４７ｇを添加した溶液から、１．５３μｍｏｌ分の溶液を容量５０ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこに直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内にアルゴンボンベからアルゴンを吹き付ける針と、吹き付けたアルゴンを抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、アルゴンをフローすることで系内をアルゴンに置換し、気相中の酸素濃度を０％とした。ここで、気相中の酸素濃度は、前記測定方法３に記載の方法を用いて測定した。更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液１．１３ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１２．７モル）をスターラーによる攪拌下３３℃でオリゴヌクレオシド溶液表面にＫＤＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のシリンジポンプを用いて１時間かけて滴下し、その後混合物を３３℃で４時間保温することにより２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は１３．０ｍｇ、純度は５８％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例２）
　７７．８９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０６μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１７ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２１ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．２２ｇとアセトニトリル２．４７ｇを添加した溶液から、０．９８μｍｏｌ分の溶液を容量５０ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこに直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内にアルゴンボンベからアルゴンを吹き付ける針と、吹き付けたアルゴンを抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、アルゴンをフローすることで系内をアルゴンに置換し、気相中の酸素濃度を５％とした。ここで、気相中の酸素濃度は、前記測定方法３に記載の方法を用いて測定した。更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７６ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１３．２モル）をスターラーによる攪拌下３３℃でオリゴヌクレオシド溶液表面にＫＤＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のシリンジポンプを用いて１時間かけて滴下し、その後混合物を３３℃で４時間保温することにより２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は８．３ｍｇ、純度は５４％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例３）
　７７．８９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０６μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１７ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２１ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．２２ｇとアセトニトリル２．４７ｇを添加した溶液から、１．００μｍｏｌ分の溶液を容量５０ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこに直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内にアルゴンボンベからアルゴンを吹き付ける針と、吹き付けたアルゴンを抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、アルゴンをフローすることで系内をアルゴンに置換し、気相中の酸素濃度を１０％とした。ここで、気相中の酸素濃度は、前記測定方法３に記載の方法を用いて測定した。更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７４ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１２．７モル）をスターラーによる攪拌下３３℃でオリゴヌクレオシド溶液表面にＫＤＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のシリンジポンプを用いて１時間かけて滴下し、その後混合物を３３℃で４時間保温することにより２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は８．４ｍｇ、純度は４９％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例４）
　７７．８９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０６μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１７ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２１ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．２２ｇとアセトニトリル２．４７ｇを添加した溶液から、１．００μｍｏｌ分の溶液を容量５０ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこに直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内にアルゴンボンベからアルゴンを吹き付ける針と、吹き付けたアルゴンを抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、アルゴンをフローすることで系内をアルゴンに置換し、気相中の酸素濃度を１５％とした。ここで、気相中の酸素濃度は、前記測定方法３に記載の方法を用いて測定した。更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７５ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１２．９モル）をスターラーによる攪拌下３３℃でオリゴヌクレオシド溶液表面にＫＤＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のシリンジポンプを用いて１時間かけて滴下し、その後混合物を３３℃で４時間保温することにより２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は８．４ｍｇ、純度は４６％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（参考例１）
　７７．８９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０６μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１７ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２１ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．２２ｇとアセトニトリル２．４７ｇを添加した溶液から、１．５１μｍｏｌ分の溶液を容量５０ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこに直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、気相中の酸素濃度を測定した所２１％であった。ここで、気相中の酸素濃度は、前記測定方法３に記載の方法を用いて測定した。更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液１．０９ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１２．４モル）をスターラーによる攪拌下３３℃でオリゴヌクレオシド溶液表面にＫＤＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のシリンジポンプを用いて１時間かけて滴下し、その後混合物を３３℃で４時間保温することにより２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は１３．０ｍｇ、純度は４５％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例５）
　７７．８９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０４μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１７ｇとエタノール３．０６ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２１ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．２２ｇとアセトニトリル２．４２ｇを添加した溶液から、１．５３μｍｏｌ分の溶液を容量５０ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこに直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内にアルゴンボンベからアルゴンを吹き付ける針と、吹き付けたアルゴンを抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、アルゴンをフローすることで系内をアルゴンに置換し、気相中の酸素濃度を０％とした。ここで、気相中の酸素濃度は、前記測定方法３に記載の方法を用いて測定した。更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液１．１３ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１２．７モル）をスターラーによる攪拌下３３℃でオリゴヌクレオシド溶液表面にシリンジを用いて１分以内に流入し、その後混合物を３３℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は１３．５ｍｇ、純度は４８％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例６）
　７７．８９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０４μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１７ｇとエタノール３．０６ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２１ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．２２ｇとアセトニトリル２．４２ｇを添加した溶液から、１．５３μｍｏｌ分の溶液を容量５０ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこに直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内にアルゴンボンベからアルゴンを吹き付ける針と、吹き付けたアルゴンを抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、アルゴンをフローすることで系内をアルゴンに置換し、気相中の酸素濃度を５％とした。ここで、気相中の酸素濃度は、前記測定方法３に記載の方法を用いて測定した。更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液１．１４ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１２．７モル）をスターラーによる攪拌下３３℃でオリゴヌクレオシド溶液表面にシリンジを用いて１分以内に流入し、その後混合物を３３℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は１３．５ｍｇ、純度は４６％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例７）
　７７．８９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０４μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１７ｇとエタノール３．０６ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２１ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．２２ｇとアセトニトリル２．４２ｇを添加した溶液から、１．５０μｍｏｌ分の溶液を容量５０ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこに直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内にアルゴンボンベからアルゴンを吹き付ける針と、吹き付けたアルゴンを抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、アルゴンをフローすることで系内をアルゴンに置換し、気相中の酸素濃度を１０％とした。ここで、気相中の酸素濃度は、前記測定方法３に記載の方法を用いて測定した。更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液１．１４ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１３．０モル）をスターラーによる攪拌下３３℃でオリゴヌクレオシド溶液表面にシリンジを用いて１分以内に流入し、その後混合物を３３℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は１３．４ｍｇ、純度は４５％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例８）
　７７．８９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０４μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１７ｇとエタノール３．０６ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２１ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．２２ｇとアセトニトリル２．４２ｇを添加した溶液から、１．５０μｍｏｌ分の溶液を容量５０ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこに直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内にアルゴンボンベからアルゴンを吹き付ける針と、吹き付けたアルゴンを抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、アルゴンをフローすることで系内をアルゴンに置換し、気相中の酸素濃度を１５％とした。ここで、気相中の酸素濃度は、前記測定方法３に記載の方法を用いて測定した。更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液１．１１ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１２．７モル）をスターラーによる攪拌下３３℃でオリゴヌクレオシド溶液表面にシリンジを用いて１分以内に流入し、その後混合物を３３℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は１３．３ｍｇ、純度は４４％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（参考例２）
　７７．８９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０４μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１７ｇとエタノール３．０６ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２１ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．２２ｇとアセトニトリル２．４２ｇを添加した溶液から、１．５１μｍｏｌ分の溶液を容量５０ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこに直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、気相中の酸素濃度を測定した所２１％であった。ここで、気相中の酸素濃度は、前記測定方法３に記載の方法を用いて測定した。更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液１．１０ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１２．５モル）をスターラーによる攪拌下３３℃でオリゴヌクレオシド溶液表面にＫＤＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のシリンジポンプを用いて１時間かけて滴下し、その後混合物を３３℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は１３．３ｍｇ、純度は４３％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（参考例３）
　７７．８９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０４μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１７ｇとエタノール３．０６ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２１ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．２２ｇとアセトニトリル２．４２ｇを添加した溶液から、１．５１μｍｏｌ分の溶液を容量５０ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこに直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、気相中の酸素濃度を測定した所２１％であった。ここで、気相中の酸素濃度は、前記測定方法３に記載の方法を用いて測定した。更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液１．１０ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１２．５モル）をスターラーによる攪拌下３３℃でオリゴヌクレオシド溶液表面にシリンジを用いて１分以内に流入し、その後混合物を３３℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は１３．３ｍｇ、純度は４３％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例９）
　７７．８９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０６μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１７ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２１ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．２２ｇとアセトニトリル２．４７ｇを添加した溶液から、６．０４μｍｏｌ分の溶液を容量１００ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこに直径１５ｍｍの撹拌子とアセトニトリル０．２６ｇを入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内にアルゴンボンベからアルゴンを吹き付ける針と、吹き付けたアルゴンを抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、アルゴンをフローすることで系内をアルゴンに置換し、気相中の酸素濃度を０％とした。ここで、気相中の酸素濃度は、前記測定方法３に記載の方法を用いて測定した。更にこの溶液を氷冷下０℃で２０分撹拌し、モレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液４．４９ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１２．８モル）とアセトニトリル０．９０ｇの混合溶液をスターラーによる攪拌下０℃条件でオリゴヌクレオシド溶液表面にＫＤＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のシリンジポンプを用いて１時間かけて滴下し、滴下終了後温度を３３℃まで昇温し、混合物を４時間保温することで２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は５２．４ｍｇ、純度は５８％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。更にオリグヌクレオチドを前記酵素分解法に記載の方法を用いて分解を実施し、前記測定法４に記載の方法を用いて、式（Ａ１５）および式（Ａ１６）のＨＰＬＣ面百値をそれぞれ得たところ、３１．１９４５％と０．００６４％であった。尚、目的とするオリゴヌクレオチド中のアデノシンの個数が１３であることから、不純物含量を前記計算式を用いて算出し、表４に記載する。
（実施例１０）
　７７．８９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０６μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１７ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２１ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．２２ｇとアセトニトリル２．４７ｇを添加した溶液から、０．９９μｍｏｌ分の溶液を容量５０ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこに直径１５ｍｍの撹拌子とアセトニトリル０．１２ｇを入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内にアルゴンボンベからアルゴンを吹き付ける針と、吹き付けたアルゴンを抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、アルゴンをフローすることで系内をアルゴンに置換し、気相中の酸素濃度を０％とした。ここで、気相中の酸素濃度は、前記測定方法３に記載の方法を用いて測定した。更にこの溶液を氷冷下０℃で２０分撹拌し、モレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した後氷冷した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．８１ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１４．０モル）とアセトニトリル０．２０ｇの混合溶液をスターラーによる攪拌下０℃条件でオリゴヌクレオシド溶液表面にシリンジを用いて１分以内に流入し、１時間０℃で保温攪拌後、温度を３３℃まで昇温し、混合物を４時間保温することで２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は８．５ｍｇ、純度は５８％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。更にオリグヌクレオチドを前記酵素分解法に記載の方法を用いて分解を実施し、前記測定法４に記載の方法を用いて、式（Ａ１５）および式（Ａ１６）のＨＰＬＣ面百値をそれぞれ得たところ、３１．１１５０％と０．００５２％であった。尚、目的とするオリゴヌクレオチド中のアデノシンの個数が１３であることから、不純物含量を前記計算式を用いて算出し、表４に記載する。
（実施例１１）
　７７．８９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０６μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１７ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２１ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．２２ｇとアセトニトリル２．４７ｇを添加した溶液から、０．９９μｍｏｌ分の溶液を容量５０ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこに直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内にアルゴンボンベからアルゴンを吹き付ける針と、吹き付けたアルゴンを抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、アルゴンをフローすることで系内をアルゴンに置換し、気相中の酸素濃度を０％とした。ここで、気相中の酸素濃度は、前記測定方法３に記載の方法を用いて測定した。更にこの溶液を１０℃で２０分撹拌し、モレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した後１０℃に冷した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７７ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１３．２モル）とアセトニトリル０．１８ｇの混合溶液をスターラーによる攪拌下１０℃条件でオリゴヌクレオシド溶液表面にシリンジを用いて１分以内に流入し、１時間１０℃で保温攪拌後、温度を３３℃まで昇温し、混合物を４時間保温することで２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は８．５ｍｇ、純度は５８％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。更にオリグヌクレオチドを前記酵素分解法に記載の方法を用いて分解を実施し、前記測定法４に記載の方法を用いて、式（Ａ１５）および式（Ａ１６）のＨＰＬＣ面百値をそれぞれ得たところ、３１．１９７２％と０．００５６％であった。尚、目的とするオリゴヌクレオチド中のアデノシンの個数が１３であることから、不純物含量を前記計算式を用いて算出し、表４に記載する。
（実施例１２）
　７７．８９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０６μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１７ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２１ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．２２ｇとアセトニトリル２．４７ｇを添加した溶液から、１．００μｍｏｌ分の溶液を容量５０ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこに直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内にアルゴンボンベからアルゴンを吹き付ける針と、吹き付けたアルゴンを抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、アルゴンをフローすることで系内をアルゴンに置換し、気相中の酸素濃度を０％とした。ここで、気相中の酸素濃度は、前記測定方法３に記載の方法を用いて測定した。更にこの溶液を２０℃で２０分撹拌し、モレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した後２０℃に温調した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．８２ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１４．０モル）をスターラーによる攪拌下２０℃条件でオリゴヌクレオシド溶液表面にシリンジを用いて１分以内に流入し、１時間２０℃で保温攪拌後、温度を３３℃まで昇温し、混合物を４時間保温することで２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は８．２ｍｇ、純度は５７％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。更にオリグヌクレオチドを前記酵素分解法に記載の方法を用いて分解を実施し、前記測定法４に記載の方法を用いて、式（Ａ１５）および式（Ａ１６）のＨＰＬＣ面百値をそれぞれ得たところ、３１．３３６４％と０．０２４６％であった。尚、目的とするオリゴヌクレオチド中のアデノシンの個数が１３であることから、不純物含量を前記計算式を用いて算出し、表４に記載する。
（実施例１３）
　７７．８９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０６μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１７ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２１ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．２２ｇとアセトニトリル２．４７ｇを添加した溶液から、１．０３μｍｏｌ分の溶液を容量５０ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこに直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内にアルゴンボンベからアルゴンを吹き付ける針と、吹き付けたアルゴンを抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、アルゴンをフローすることで系内をアルゴンに置換し、気相中の酸素濃度を０％とした。ここで、気相中の酸素濃度は、前記測定方法３に記載の方法を用いて測定した。更にこの溶液を２５℃で２０分撹拌し、モレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した後２５℃に温調した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７７ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１２．８モル）をスターラーによる攪拌下２５℃条件でオリゴヌクレオシド溶液表面にシリンジを用いて１分以内に流入し、１時間２５℃で保温攪拌後、温度を３３℃まで昇温し、混合物を４時間保温することで２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は８．４ｍｇ、純度は５６％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。更にオリグヌクレオチドを前記酵素分解法に記載の方法を用いて分解を実施し、前記測定法４に記載の方法を用いて、式（Ａ１５）および式（Ａ１６）のＨＰＬＣ面百値をそれぞれ得たところ、３１．１５６４％と０．０３５１％であった。尚、目的とするオリゴヌクレオチド中のアデノシンの個数が１３であることから、不純物含量を前記計算式を用いて算出し、表４に記載する。
（実施例１４）
　７７．８９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０６μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１７ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２１ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．２２ｇとアセトニトリル２．４７ｇを添加した溶液から、１．５３μｍｏｌ分の溶液を容量５０ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこに直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内にアルゴンボンベからアルゴンを吹き付ける針と、吹き付けたアルゴンを抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、アルゴンをフローすることで系内をアルゴンに置換し、気相中の酸素濃度を０％とした。ここで、気相中の酸素濃度は、前記測定方法３に記載の方法を用いて測定した。更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液１．１３ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１２．７モル）をスターラーによる攪拌下３３℃でオリゴヌクレオシド溶液表面にＫＤＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のシリンジポンプを用いて１時間かけて滴下し、その後混合物を３３℃で４時間保温することにより２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は１３．０ｍｇ、純度は５８％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。更にオリグヌクレオチドを前記酵素分解法に記載の方法を用いて分解を実施し、前記測定法４に記載の方法を用いて、式（Ａ１５）および式（Ａ１６）のＨＰＬＣ面百値をそれぞれ得たところ、３１．１４０１％と０．０２４５％であった。尚、目的とするオリゴヌクレオチド中のアデノシンの個数が１３であることから、不純物含量を前記計算式を用いて算出し、表４に記載する。
（参考例４）
　７７．８９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０６μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１７ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２１ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．２２ｇとアセトニトリル２．４７ｇを添加した溶液から、１．５５μｍｏｌ分の溶液を容量５０ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこに直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内にアルゴンボンベからアルゴンを吹き付ける針と、吹き付けたアルゴンを抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、アルゴンをフローすることで系内をアルゴンに置換し、気相中の酸素濃度を０％とした。ここで、気相中の酸素濃度は、前記測定方法３に記載の方法を用いて測定した。更にこの溶液を３３℃で撹拌し、モレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液１．１４ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１２．７モル）をスターラーによる攪拌下でオリゴヌクレオシド溶液表面にシリンジを用いて１分以内に流入し、混合物を３３℃で４時間保温することにより２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は１３．２ｍｇ、純度は５４％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。更にオリグヌクレオチドを前記酵素分解法に記載の方法を用いて分解を実施し、前記測定法４に記載の方法を用いて、式（Ａ１５）および式（Ａ１６）のＨＰＬＣ面百値をそれぞれ得たところ、３１．１９２７％と０．１２５２％であった。尚、目的とするオリゴヌクレオチド中のアデノシンの個数が１３であることから、不純物含量を前記計算式を用いて算出し、表４に記載する。
（実施例１５）
　７７．８９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０４μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１７ｇとエタノール３．０６ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２１ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．２２ｇとアセトニトリル２．４２ｇを添加した溶液から、５．９４μｍｏｌ分の溶液を容量１００ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこに直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内にアルゴンボンベからアルゴンを吹き付ける針と、吹き付けたアルゴンを抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、アルゴンをフローすることで系内をアルゴンに置換し、気相中の酸素濃度を０％とした。ここで、気相中の酸素濃度は、前記測定方法３に記載の方法を用いて測定した。更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液４．４８ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１３．０モル）をスターラーによる攪拌下２５℃でオリゴヌクレオシド溶液表面にシリンジを用いて１分以内に流入し、その後混合物を２５℃で１時間保温攪拌後、３３℃へ昇温し、４時間保温することで２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は５２．０ｍｇ、純度は５０％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。更にオリグヌクレオチドを前記酵素分解法に記載の方法を用いて分解を実施し、前記測定法４に記載の方法を用いて、式（Ａ１５）および式（Ａ１６）のＨＰＬＣ面百値をそれぞれ得たところ、３１．４４１３％と０．０２５３％であった。尚、目的とするオリゴヌクレオチド中のアデノシンの個数が１３であることから、不純物含量を前記計算式を用いて算出し、表４に記載する。
（参考例５）
　７７．８９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０４μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１７ｇとエタノール３．０６ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２１ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．２２ｇとアセトニトリル２．４２ｇを添加した溶液から、１．５３μｍｏｌ分の溶液を容量５０ｍＬ、口径２９ｍｍナス型フラスコに採取し、更にそこに直径１５ｍｍの撹拌子を入れた後、口径２９ｍｍのセプタムにて蓋をして密閉した。更に系内にアルゴンボンベからアルゴンを吹き付ける針と、吹き付けたアルゴンを抜くための針、更にＯｘｙｇｅｎ　Ｍｅｔｅｒの測定用針をセプタムに突き刺し、アルゴンをフローすることで系内をアルゴンに置換し、気相中の酸素濃度を０％とした。ここで、気相中の酸素濃度は、前記測定方法３に記載の方法を用いて測定した。更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液１．１３ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり１２．７モル）をスターラーによる攪拌下３３℃でオリゴヌクレオシド溶液表面にシリンジを用いて１分以内に流入し、その後混合物を３３℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は１３．５ｍｇ、純度は４８％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。更にオリグヌクレオチドを前記酵素分解法に記載の方法を用いて分解を実施し、前記測定法４に記載の方法を用いて、式（Ａ１５）および式（Ａ１６）のＨＰＬＣ面百値をそれぞれ得たところ、３１．３０６７％と０．０３９５％であった。尚、目的とするオリゴヌクレオチド中のアデノシンの個数が１３であることから、不純物含量を前記計算式を用いて算出し、表４に記載する。
　測定結果を下記表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
　上記表２に示す通り、明細書中に記載のオリゴヌクレオチドに含まれるリボースの水酸基の保護基の脱保護反応を、酸素濃度が１５％以下の濃度の不活性ガス雰囲気下で行ったところ、酸素濃度が１５％より高い濃度で行った場合と比べると、該脱保護反応が効率よく進行し、更に反応系中の温度を２５℃以下にしてＴＢＡＦと接触させることで、２５℃以上にしてＴＢＡＦと接触させるよりも更に該脱保護反応が効率よく進行し、更にＴＢＡＦの添加に要する時間を３０分以上にすることで、１分以下にする場合よりも更に該脱保護反応が効率よく進行し、結果、生成する脱保護されたオリゴヌクレオチドの純度が高いことが分かった。
　本発明は、効率的な核酸オリゴマーの製造方法を提供する。核酸オリゴマーの製造方法に従って製造される核酸オリゴマーの純度向上が期待できる。
　配列表の配列番号１～１３は、本発明の製造方法に従って製造されるオリゴヌクレオチドの塩基配列を表す。

Claims (38)

  1. 　酸素濃度が１５％以下の不活性ガス雰囲気下で、式（３）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、
    　Ｇ４は、水素原子または水酸基の保護基を表し、
    　Ｇ９は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、アルカリ金属イオン、水素イオンまたはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表し、
    　Ｂｃは、それぞれ独立して同一又は相異なる核酸塩基を表し、
    　Ｒは、それぞれ独立して同一又は相異なって、水素原子、フッ素原子またはＯＱ基を表し、
    　Ｑは、それぞれ独立して同一又は相異なって、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、メチル基、２－メトキシエチル基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基、または式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、
    　＊印のついた結合は、ＯＱ基の酸素原子との結合であることを表し、
    　ｎは０以上の何れかの整数を表す。）
    の保護基を表し、
    　Ｙは、それぞれ独立して同一又は相異なって、酸素原子または硫黄原子を表し、
    　ｍは、２以上２００までの何れかの整数を表し、
    　ＷおよびＸは、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかで定義され、
    （ａ）Ｗが水酸基であるときは、Ｘは前記Ｒ基と同じ定義である。
    （ｂ）Ｘが水酸基であるときは、ＷはＯＶ基を表し、
    　Ｖは、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、または前記式（１）の基を表す。
    　ただし、前記Ｒ、ＷおよびＸのうち少なくとも一つの基は、前記式（１）の保護基で保護された水酸基を表す。そして
    　ｍが３以上の整数のとき、式（３）で示される核酸オリゴマーは、それぞれの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間のｐ個（ただし、ｐは、式：ｍ－１＞ｐを満たす正の整数である。）のヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい核酸オリゴマーである。）
    で示される核酸オリゴマーを、フッ化物イオンと接触させることを特徴とする、式（４）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、Ｒ’は、それぞれ独立して同一又は相異なって、水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
    　Ｑ’は、それぞれ独立して同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、
    　式（４）の置換基Ｇ４、Ｇ９、Ｙ、Ｂｃおよびｍの定義は、前記式（３）における定義と同じであり、
    　Ｗ０は、水酸基であり、
    　Ｘ０は、前記Ｒ’基と同じ定義である。
    　そして、ｍが３以上の整数のとき、式（４）で示される核酸オリゴマーは、それぞれの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間のｐ個（ただし、ｐは、式：ｍ－１＞ｐを満たす正の整数である。）のヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい核酸オリゴマーである。）
    で示される核酸オリゴマーの製造方法。
  2. 　式（１）中のｎが０または１である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　式（１）中のｎが０である、請求項１に記載の製造方法。
  4. 　式（１）中のｎが１である、請求項１に記載の製造方法。
  5. 　非ヌクレオチドリンカーが、アミノ酸骨格からなるリンカーである、請求項１～４の何れか１項に記載の製造方法。
  6. 　アミノ酸骨格からなるリンカーが、下記式（Ａ１４－１）、（Ａ１４－２）または（Ａ１４－３）の構造を有するリンカーである、請求項５に記載の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、５’および３’は、核酸オリゴマーの５’末端側および３’末端側をそれぞれ示す。）
  7. 　Ｗが水酸基であり、ＸがＲ基であり、Ｗ０が水酸基であり、そしてＸ０がＲ’基である、請求項１～６の何れか１項に記載の製造方法。
  8. 　フッ化物イオン源が、フッ化テトラアルキルアンモニウムである、請求項１～７の何れか１項に記載の製造方法。
  9. 　フッ化物イオン源が、フッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）である、請求項１～８の何れか１項に記載の製造方法。
  10. 　酸素濃度が１０％以下の不活性ガス雰囲気下でフッ化物イオンと接触させる、請求項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
  11. 　酸素濃度が５％以下の不活性ガス雰囲気下でフッ化物イオンと接触させる、請求項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
  12. 　酸素濃度が４％以下の不活性ガス雰囲気下でフッ化物イオンと接触させる、請求項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
  13. 　酸素濃度が３％以下の不活性ガス雰囲気下でフッ化物イオンと接触させる、請求項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
  14. 　酸素濃度が２％以下の不活性ガス雰囲気下でフッ化物イオンと接触させる、請求項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
  15. 　酸素濃度が１％以下の不活性ガス雰囲気下でフッ化物イオンと接触させる、請求項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
  16. 　酸素濃度が０％の不活性ガス雰囲気下でフッ化物イオンと接触させる、請求項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
  17. 　式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンを接触させる際の反応系中温度が２５℃以下である、請求項１～１６の何れか１項に記載の製造方法。
  18. 　式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンを接触させる際の反応系中温度が２０℃以下である、請求項１～１６の何れか１項に記載の製造方法。
  19. 　式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンを接触させる際の反応系中温度が１５℃以下である、請求項１～１６の何れか１項に記載の製造方法。
  20. 　式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンを接触させる際の反応系中温度が１０℃以下である、請求項１～１６の何れか１項に記載の製造方法。
  21. 　式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンを接触させる際の反応系中温度が５℃以下である、請求項１～１６の何れか１項に記載の製造方法。
  22. 　式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンの全量と接触させるために要する時間が３０分以上である、請求項１～１６の何れか１項に記載の製造方法。
  23. 　式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンの全量と接触させるために要する時間が１時間以上である、請求項１～１６の何れか１項に記載の製造方法。
  24. 　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が１０％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である、請求項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
  25. 　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が２０％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である、請求項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
  26. 　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が３０％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である、請求項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
  27. 　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が４０％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である、請求項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
  28. 　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が５０％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である、請求項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
  29. 　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が６０％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である、請求項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
  30. 　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が７０％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である、請求項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
  31. 　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が８０％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である、請求項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
  32. 　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が９０％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である、請求項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
  33. 　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が９５％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である、請求項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
  34. 　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が１００％であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である、請求項１～２３の何れか１項に記載の製造方法。
  35. 　核酸鎖長が２０鎖長以上である、請求項１～３４の何れか１項に記載の製造方法。
  36. 　核酸鎖長が３０鎖長以上である、請求項１～３４の何れか１項に記載の製造方法。
  37. 　核酸鎖長が４０鎖長以上である、請求項１～３４の何れか１項に記載の製造方法。
  38. 　核酸鎖長が５０鎖長以上である、請求項１～３４の何れか１項に記載の製造方法。
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