WO2024019137A1

WO2024019137A1 - オリゴヌクレオチドの製造方法

Info

Publication number: WO2024019137A1
Application number: PCT/JP2023/026733
Authority: WO
Inventors: 玲央竹下; 俊史加納; 雄樹田中
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 2022-07-22
Filing date: 2023-07-21
Publication date: 2024-01-25
Anticipated expiration: 2025-01-22
Also published as: EP4559925A1; KR20250042734A; JPWO2024019137A1; CN119403816A

Abstract

本発明は、式（２）〔式中、Ｇ^２は水酸基の保護基を示し、Ｂ^ａは、保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し、Ｒは、保護された水酸基等を表し、Ｘは、酸素原子等を表し、そして、＊のついた結合は、核酸の３'末端側への結合を示す。〕で示される化合物と、式（４）〔式中、Ｇ^１は水酸基の保護基を示す。〕で示される２'－ＯＭｅ－Ｕアミダイトとをアクチベーターの存在下で縮合させる工程を含み、前記２'－ＯＭｅ－Ｕアミダイトが、アセトニトリル及び式（３）〔式中、Ｙ^１～Ｙ^６は、水素原子、メチル基等を表す。〕で示される芳香族系炭化水素を含む混合液に溶解している、オリゴヌクレオチドの製造方法、に関する。

Description

オリゴヌクレオチドの製造方法

　本特許出願は、日本国特許出願２０２２－１１７４２２号（２０２２年７月２２日出願）に基づくパリ条約上の優先権および利益を主張するものであり、ここに引用することによって、上記出願に記載された内容の全体が、本明細書中に組み込まれるものとする。
　本発明は、ホスホロアミダイト法を用いたオリゴヌクレオチドの製造方法に関する。

　核酸オリゴマーであるオリゴヌクレオチドは、遺伝子検出を目的とした核酸プローブや、PCRに用いられるDNAプローブ、医薬品としてのアンチセンス核酸、siRNA、アプタマーなど様々な分野において利用される有用な素材である。

　オリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイト法を用いた固相合成法により製造可能である。ホスホロアミダイト法では、ガラスや樹脂担体上にてモノマーであるヌクレオシドのホスホロアミダイト(以下「アミダイト」と称する)を順次連結させていき、任意の配列を有するオリゴヌクレオチドを製造する。具体的な製造工程は、酸性溶液を用いてヌクレオチドの5’末端の水酸基の保護基を脱保護する脱保護工程と、脱保護したヌクレオチドの5’末端の水酸基とアミダイトのアミダイト基をアクチベーター存在下で反応させる縮合工程と、新たに生じたヌクレオシド間の結合を3価のリンから5価のリンへと酸化する酸化工程と、未反応の5’末端の水酸基をアシル化するキャッピング工程を含む。これらの工程を順次繰り返すことにより、アミダイトを任意の順番に連結し、所望の配列を有するオリゴヌクレオチドが製造される。

　特許文献１等に開示されるように、縮合工程で用いるアミダイトはアセトニトリルに溶解させてアミダイト溶液として使用する。一方でアセトニトリルへの溶解度が低いアミダイトの場合には、この手法を用いることは困難である。

　アセトニトリルへの溶解度が低いアミダイトの１つとして2’-OMe-Uアミダイトが挙げられる。2’-OMe-Uアミダイトの溶解度を向上させる目的として、アセトニトリルに追加してジクロロメタン(特許文献２、非特許文献１)を添加してアミダイト溶液を調製する報告がなされている。これらの溶媒を添加することで、2’-OMe-Uアミダイトの溶解度が向上する。

　このようなオリゴヌクレオチドの製造法が開発されているが、合成されたオリゴヌクレオチドの純度は、必ずしも満足いくものではなかった。その理由の一つにｎ－1 mer不純物の存在がある。ｎ－1 mer不純物はオリゴヌクレオチド製造中に生じる不純物であり、目的鎖長と比較して１つ短い鎖長を持つ不純物のことである。このｎ－1 mer不純物は目的鎖長のオリゴヌクレオチドとの分離が困難であることが知られている(非特許文献２)。そのため、製造中に生じるｎ－1 mer不純物を低減させることが、オリゴヌクレオチドの効率的な製造において重要である。

国際公開第２０１９／１７０７３１号中国特許出願公開第１１２００７０４０号明細書

Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 28 (2018) 3774-3779 Mass Spectrometry Reviews 40 (2021) 75-109

　本発明は、2’-OMe-Uを１つ以上有するオリゴヌクレオチドの高純度な製造方法を提供することを目的とする。

　本発明者は、上記目的を達成するため鋭意検討を重ねた結果、2’-OMe-Uアミダイト溶液の溶媒として、アセトニトリルと芳香族系炭化水素を用いることを特徴とする、核酸製造方法を提供する。

　本発明は、以下の態様を包含するが、これらに限定されるものではない。
１．　式（２）：

〔式中、
　Ｇ^２は水酸基の保護基を示し、
　Ｂ^ａは、保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し、
　Ｒは、保護された水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
　Ｑ’は、リボースの４’位の炭素原子と結合しているアルキレン基を表し、
　Ｘは、酸素原子または硫黄原子を表し、そして、
　＊のついた結合は、核酸の３’末端側への結合を示す。〕
で示される化合物と、式（４）：

〔式中、
　Ｇ^１は水酸基の保護基を示す。〕
で示される２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイトとをアクチベーターの存在下で縮合させる工程を含み、
前記２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイトが、アセトニトリル及び式（３）：

〔式中、Ｙ^１～Ｙ^６は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、水素原子、メチル基、エチル基、又はハロゲン原子を表す。〕
で示される芳香族系炭化水素を含む混合液に溶解している、
オリゴヌクレオチドの製造方法。
２．　式（３）で示される芳香族系炭化水素が、メチル基、エチル基、及びハロゲン原子からなる群より選ばれる１つ又は２つの置換基を有するベンゼンであり、ベンゼンが２つの置換基を有する場合、置換基は同一でも異なっていてもよい、［１］に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
３．　式（３）で示される芳香族系炭化水素が、トルエン、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、クロロベンゼン、ｏ－ジクロロベンゼン、ｍ－ジクロロベンゼン、ｐ－ジクロロベンゼン、及びそれらの２種以上の混合物からなる群より選ばれる、［１］に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
４．　式（４）で示される２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイトが溶解する混合液に含まれるアセトニトリルと式（３）で示される芳香族系炭化水素との体積比率が、アセトニトリル：式（３）で示される芳香族系炭化水素で９９：１～１：９９である、［１］～［３］のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
５．　式（４）で示される２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイトが溶解する混合液に含まれるアセトニトリルと式（３）で示される芳香族系炭化水素の体積比率が、アセトニトリル：式（３）で示される芳香族系炭化水素で９０：１０～１０：９０である、［１］～［３］のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
６．　式（４）で示される２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイトが溶解する混合液に含まれるアセトニトリルと式（３）で示される芳香族系炭化水素の体積比率が、アセトニトリル：式（３）で示される芳香族系炭化水素で９０：１０～４０：６０である、［１］～［３］のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
７．　式（４）で示される２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイト溶液における２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイト濃度が、０．０１～０．４Ｍである、［１］～［６］のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
８．　式（４）で示される２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイト溶液における２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイト濃度が、０．０５～０．２Ｍである、［１］～［６］のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
９．　アクチベーターが５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾールである、［１］～［８］のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
１０．　式（２）で示される化合物におけるＲが保護された水酸基である場合、その水酸基の保護基が、式（１０）：

〔式中、
　ｑは０～５の整数を表し、
　Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ同一または相異なり、メチル基、エチル基又は水素原子を表し、
　＊印のついた結合は２’水酸基の酸素に結合し、
　Ｅｗは電子求引性基を表す。〕
で示される保護基である、［１］～［９］のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
１１．　式（４）で示される２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイトにおいて、Ｇ^１が４，４’－ジメトキシトリチル基である、［１］～［１０］のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
１２．　固相合成法により行われる、［１］～［１１］のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
１３．　式（４）：

〔式中、
　Ｇ^１は水酸基の保護基を示す。〕
で示される２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイト、アセトニトリル及び式（３）：

〔式中、Ｙ^１～Ｙ^６は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、水素原子、メチル基、エチル基、又はハロゲン原子を表す。〕
で示される芳香族系炭化水素を含む、溶液。
１４．　［１３］に記載された式（４）で示される２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイト、アセトニトリル及び式（３）で示される芳香族系炭化水素を含む溶液を、オリゴヌクレオチドの製造に用いる方法。

　本発明は、2’-OMe-Uアミダイトを１つ以上含むオリゴヌクレオチドの高純度な製造方法を提供する。

本発明の製法の工程（１）から（６）のスキーム（スキームＡ）を示す図面である。

　本発明のオリゴヌクレオチドの製造方法は、
　式（２）：

〔式中、Ｙ^１～Ｙ^６は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、水素原子、メチル基、エチル基、又はハロゲン原子を表す。〕
で示される芳香族系炭化水素を含む混合液に溶解している、
オリゴヌクレオチドの製造方法、に関する。

　オリゴヌクレオチドの製造方法は、アセトニトリルと式(３)で示される芳香族系炭化水素の混合液に、式(４)で示される2’-OMe-Uアミダイトを溶解させた2’-OMe-Uアミダイト溶液およびアクチベーターを反応させる工程を含むものであってよい。以下、オリゴヌクレオチドの製造方法について説明する。

　本発明における2’-OMe-Uアミダイト溶液の溶媒において、アセトニトリルと式（３）で示される芳香族系炭化水素を含む混合液を用いることで、製造したオリゴヌクレオチドの含まれるn-1 merを低減することができる。アセトニトリルと式（３）で示される芳香族系炭化水素を含む混合液における混合比は特に限定されるものではないが、アセトニトリルと芳香族系炭化水素の体積比が、例えば99:1～1:99、好ましくは90:10～10:90、より好ましくは90:10～40:60である。

　芳香族系炭化水素としては、メチル基、エチル基、またはハロゲン原子、からなる群から選ばれる置換基を有するベンゼン、好ましくはメチル基、エチル基、またはハロゲン原子、からなる群から選ばれる１つもしくは２つの置換基を有するベンゼン、より好ましくはトルエン、o-キシレン、m-キシレン、p-キシレン、クロロベンゼン、o-ジクロロベンゼン、m-ジクロロベンゼン、p-ジクロロベンゼン、及びそれらの２種以上の混合物が使用可能である。

　2’-OMe-Uアミダイト溶液にはアセトニトリルと芳香族系炭化水素以外の溶媒も混合して使用してもよい。

　2’-OMe-Uアミダイト溶液中の2’-OMe-Uアミダイト濃度は、好ましくは0.01 M～0.4 M、より好ましくは0.05 M～0.2 Mに調整される。

　2’-OMe-Uアミダイトを前述の混合溶媒に溶解させたのちに、ゼオラム等の乾燥材で水分を低減させたのちに使用することも可能である。

　2’-OMe-Uアミダイト溶液の保管には、ガラス製容器、プラスチック製容器、または金属製容器を使用することができる。プラスチック製容器としては、ポリエチレンまたはポリプロピレン製等の容器を使用することができ、金属製容器としては、ＳＵＳ製容器またはハステロイ製等の容器を使用することができる。

　式(４)で示される2’-OMe-Uアミダイトとの反応前駆体は、具体的には以下の式(１２):

（式中、
　Ｇ^２は水酸基の保護基を示し、
　Ｂ^ａは、それぞれ独立して、保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し、
　Ｒは、保護された水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
　Ｑ’は、リボースの４’位の炭素原子と結合しているアルキレン基を表し、
　Ｘは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、酸素原子または硫黄原子を表し、
　Ｚは、固相担体、および固相担体とオリゴヌクレオチドの３’末端のリボースの３’位の水酸基の酸素原子とをつなぐ連結部からなる基を表し、そして、
　ｌは、０～３００の整数を示す。）
で示される化合物であり、２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイトと反応することで、式(１３):

（式中、
　Ｇ^１は水酸基の保護基を表し、
　Ｇ^２、Ｂ^ａ、Ｒ、Ｘ、Ｚ、ｌは、前記定義のとおりである。）
で示されるオリゴヌクレオチドへと変換される。

　式（２）、（１２）および（１３）において、ＲがＯＱ’基を表し、Ｑ’がリボースの４’位の炭素原子と結合しているアルキレン基表すとき、当該構造としては、具体的には下記のＬＮＡ－１～ＬＮＡ－４が例示される。

（式中、Ｂ^ａは、保護されていてもよい核酸塩基を表す。）

　本発明で使用されるオリゴヌクレオチド内に含まれるヌクレオシド（リボース、およびデオキシリボース）としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’－Ｏ－ＭＯＥ（２’－Ｏ－メトキシエチル）、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、および前記のＬＮＡが例示されるが、前記ヌクレオシドは、これらに限定されない。

　Ｚで示される、固相担体、および固相担体と核酸オリゴマーの３’末端のリボースの２’位もしくは３’位の水酸基の酸素原子とをつなぐ連結部からなる基としては、より具体的には、下記式（１８）で示される構造が挙げられる。

　式（１８）において、Ｓｐは、スペーサーを表す。
　スペーサー（Ｓｐ）としては、例えば、下記式（１９）に示す構造式を有するものが例示される。

　Ｌｉｎｋｅｒは、例えば、下記式（２０）に示す構造でもよいし、または式（２０）の構造においてヘキサメチレンアミノ基部分を有さない構造であって、アミノプロピル基がＳｉに結合した構造でもよい。または、Ｌｉｎｋｅｒは下記式（２１）で示す構造でもよい。

（式中、
　Ａは、水酸基、アルコキシ基、またはアルキル基のいずれかであってもよい。アルコキシ基としては、例えばメトキシ基およびエトキシ基が挙げられる。アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ－プロピル基が挙げられる。Ｓｉは、担体表面の水酸基の酸素と結合していることを示す。）
　Ｓｏｌｉｄ　ｓｕｐｐｏｒｔとしては、無機多孔質担体や有機系樹脂担体などが挙げられる。無機多孔質担体には、例えば、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）およびゼオライトが挙げられる。有機系樹脂担体には、例えば、ポリスチレンからなる担体が挙げられる。

　オリゴヌクレオチドの合成方法は、典型的には、以下の工程を含む。
（１）固相担体にリンカーを介して結合している水酸基が保護されたヌクレオシドの５’位の水酸基を脱保護する工程、
（２）前記工程で生成した５’位の水酸基をアミダイト化合物と縮合反応させて亜リン酸トリエステル化合物を得る工程、
（３）前記工程で生成した亜リン酸トリエステルを酸化してリン酸トリエステル結合に変換して伸長した核酸分子を製造する工程、あるいは、チオリン酸トリエステルに変換する任意の工程、
（４）前記工程（１）～（３）、すなわち、生成した核酸分子の５’位の水酸基の脱保護工程、５’位の水酸基とアミダイト化合物との縮合工程、および、生成した亜リン酸トリエステルの酸化工程、から構成される一連の反応のサイクルを、任意の回数繰り返し、固相担体上に核酸分子を合成する工程、
（５）工程（４）で生成した固相担体上の核酸分子を、切り出しおよび脱保護する工程に供し、固相担体から遊離させて、保護基が除かれたオリゴヌクレオチドを製造する工程、および、
（６）核酸分子を構成するリボースの２’水酸基の保護基を脱保護する工程。

　ただし、前記オリゴヌクレオチドの合成方法においては、工程（２）または（３）に続けて、アミダイト化合物との縮合反応が進行しなかった５’位の水酸基をキャッピングする工程を含んでいてもよく、工程（４）を構成する一連の反応のサイクルの何れかの工程の間にキャッピング工程が付加されていてもよい。

　前記（５）の工程は、より具体的には、工程（４）で生成した固相担体上の核酸分子を、以下の工程（５－１）および（５－２）の反応の順に実施される。ここで工程（５－１）の反応の実施は、任意であってもよいし、工程（５－２）の反応の実施は、特許第４７０５７１６号公報に記載の方法を用いてもよい。その結果、固相担体から遊離した核酸分子から保護基が除かれたオリゴヌクレオチド、あるいは、５’末端の水酸基が保護されたオリゴヌクレオチドを製造することができる。
　　（５－１）核酸分子の５’末端の水酸基の保護基を脱保護する反応、および、
　　（５－２）核酸分子を固相担体から切りだして遊離させる反応。

　前記工程（１）から（６）のスキームを、図１のスキームＡに示す。スキームＡにおける化学式中の置換基のうち、Ｇ^１、Ｇ^２、Ｂ^ａ、およびＲの定義は、前記定義のとおりである。また、Ｇ^３、Ｇ^４、Ｇ^５、Ｂ^ｃ、およびＲ’の定義は、後述のとおりである。また、スキームＡの化学式中、
　Ｙは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、酸素原子または硫黄原子を表し、
　Ｘは、Ｒ基を表すか、または、ＯＺ基を表し、ここで、Ｚは、前記定義のとおりであり、
　Ｗは、ＸがＲ基を表すとき、ＯＺ基を表し、ここで、Ｚは、前記定義のとおりであり、あるいは、Ｗは、ＸがＯＺ基を表すとき、ＯＶ基を表し、ここで、Ｖは、水酸基の保護基を表し、
　Ｗ_１は、Ｗ基、またはＷ基から誘導された基（例えば、固相担体から切り出された残基、脱保護された基など）であり、
　Ｗ_１０は、Ｗ_１基、またはＷ_１基から誘導された基（例えば、固相担体から切り出された残基、脱保護された基など）であり、
　Ｘ_１は、Ｘ基、またはＸ基から誘導された基（例えば、固相担体から切り出された残基、脱保護された基など）であり、
　Ｘ_１０は、Ｘ_１基、またはＸ_１基から誘導された基（例えば、固相担体から切り出された残基、脱保護された基など）であり、
　ｎは、１～３００の整数を示し、そして、
　ｍは、１～３００の整数を示す。

　式（Ａ５）の核酸化合物は、さらにアミダイト法によりヌクレオチド型または非ヌクレオチド型のリンカーを用いて任意の鎖長だけ伸長し、式（Ａ５’）で示される核酸化合物の製造に使用することができる。式（Ａ５’）の固相担体に結合した核酸化合物から核酸化合物のみを切り出して、式（Ａ６）で示されるオリゴヌクレオチドを得たのち、更に脱保護して式（Ａ７）で示されるオリゴヌクレオチドを得ることもできる。

　以下、各式中の置換基についてさらに詳細に説明する。

　Ｇ^１としては、保護基として機能し得るものであれば特に制限なく使用することができ、アミダイト化合物で使用される公知の保護基を広く使用することができる。Ｇ^１は好ましくは、以下式（１４）で示される保護基である。

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれ独立して、同一又は相異なって水素又はアルコキシ基を表す。）

　Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は、１つが水素であり、残りの２つが同一または相異なる（同一が好ましい）アルコキシ基であることが好ましく、アルコキシ基としてはメトキシ基が特に好ましい。Ｇ^１としては、具体的には、４，４’－ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ基）、４－モノメトキシトリチル基、および４，４’，４”－トリメトキシトリチル基が好ましく、４，４’－ジメトキシトリチル基が特に好ましい。

　Ｇ^２としては、保護基として機能し得るものであれば特に制限なく使用することができ、アミダイト化合物で使用される公知の保護基を広く使用することができる。Ｇ^２としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、ハロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、シクロアルケニル基、シクロアルキルアルキル基、シクリルアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリルアルケニル基、ヘテロシクリルアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、シリル基、シリルオキシアルキル基、モノ、ジ又はトリアルキルシリル基、モノ、ジ又はトリアルキルシリルオキシアルキル基などが挙げられ、これらは１つ以上の電子求引基で置換されていてもよい。

　Ｇ^２は、好ましくは、電子求引基で置換されたアルキル基である。当該電子求引基としては、例えば、シアノ基、ニトロ基、アルキルスルホニル基、ハロゲン原子、アリールスルホニル基、トリハロメチル基、トリアルキルアミノ基などが挙げられ、好ましくはシアノ基である。Ｇ^２としては、特に好ましいのは、２－シアノエチル基（下記式で表される基）である。

　Ｇ^３は、アルキル基であり、２つのＧ^３が互いに結合して環状構造を形成していてもよく、好ましくは両方がイソプロピル基である。

　前記Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＧ^２、Ｇ^３の定義におけるアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれでもよく、好ましくは炭素数１～１２のアルキル基、より好ましくは炭素数１～６のアルキル基である。具体的なアルキル基の例としては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロビル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、及びヘキシルが挙げられる。前記置換基の定義におけるアルコキシ基を構成するアルキル基部分は、ここでのアルキル基の定義と同じ定義を有する。

　Ｇ^４は、水素原子、アルカリ金属イオン、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、またはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表す。アルカリ金属イオンとしては、例えば、ナトリウムイオン、およびリチウムイオンが挙げられる。また、アルキルアンモニウムイオンとして、具体的なアルキル基の例としては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロビル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、及びヘキシルが挙げられるが、より具体的には、例えば、ジエチルアンモニウムイオン、トリエチルアンモニウムイオン、テトラブチルアンモニウムイオン、ヘキシルアンモニウムイオン、およびジブチルアンモニウムイオンなどが挙げられる。また、ヒドロキシアルキルアンモニウムイオンとして、具体的なヒドロキシアルキル部分の例としては、例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシ－ｎ－プロビル、ヒドロキシイソプロピル、ヒドロキシ－ｎ－ブチル、トリスヒドロキシメチルが挙げられるが、より具体的なヒドロキシアルキルアンモニウムイオンの例としては、トリスヒドロキシメチルアンモニウムイオンなどが挙げられる。

　Ｇ^５は、水素原子、または保護基を表し、保護基を表す場合はＧ^１と同じ保護基を表す。Ｇ^５は脱保護された場合には水素原子であるが、その場合のヌクレオチド化合物もまた、一連の核酸伸張反応の工程に供される。

　また、本発明の方法において、アミダイト化合物は、フリーの状態又は塩の状態で使用することができる。アミダイト化合物の塩としては、塩基付加塩または酸付加塩が挙げられるが、特に制限されない。塩基付加塩としては、具体的には、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩等の無機塩基との塩；メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン等の有機塩基との塩；リジン、オルニチン、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩；及びアンモニウム塩が挙げられる。酸付加塩としては、具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、酒石酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、エタンスルホン酸等の有機酸；および、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸との酸付加塩が挙げられる。アミダイト化合物には、塩、水和物、溶媒和物、結晶多形などの形態も含まれる。

　本明細書においては、核酸塩基とは、天然型あるいは非天然型の核酸塩基骨格を有する基を意味する。前記核酸塩基は、天然型あるいは非天然型の核酸塩基骨格が修飾された修飾体も包含する。

　Ｂ^ａで示される保護基で保護されていてもよい核酸塩基は、特に限定されない。当該核酸塩基としては、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミン、５－メチルシトシン、シュードウラシル、１－メチルシュードウラシルなどが挙げられる。また、核酸塩基は、置換基により置換されていてもよい。そのような置換基としては、例えば、フルオロ基やクロロ基やブロモ基やヨード基のようなハロゲン原子、アセチル基のようなアシル基、メチル基やエキル基のようなアルキル基、ベンジル基のようなアリールアルキル基、メトキシ基のようなアルコキシ基、メトキシエチル基のようなアルコキシアルキル基、シアノエチル基のようなシアノアルキル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、アシルオキシメチル基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシ基、シアノ基、およびニトロ基など、並びにそれらの２種類以上の置換基の組み合わせが挙げられる。

　Ｂ^ａで表される核酸塩基としては、より具体的には、以下の構造が例示される。

（上記式中、
　Ｒ^４は、水素原子、メチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はベンゾイル基を表し、
　Ｒ^５は、水素原子、アセチル基、イソブチリル基又はベンゾイル基を表し、
　Ｒ^６は、水素原子、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はイソブチリル基を表し、
　Ｒ^７は、２－シアノエチル基を表し、
　Ｒ^８は、水素原子、メチル基、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基又は４－メチルベンゾイル基を表し、そして、
　Ｒ^９は、ジメチルアミノメチレン基を表す。）

　核酸塩基が環外にアミノ基を有する場合、当該アミノ基の保護基としては、特に限定されず、公知の核酸化学で用いられる保護基を使用することができ、そのような保護基としては、例えば、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、および（ジメチルアミノ）メチレン基など、並びにそれらの２種類以上の保護基の組み合わせが挙げられる。

　Ｂ^ｃは無保護の核酸塩基を示すが、その種類は特に限定されない。当該核酸塩基としては、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミン、５－メチルシトシン、シュードウラシル、１－メチルシュードウラシルなどが挙げられる。また、核酸塩基は、置換基により置換されていてもよい。そのような置換基としては、例えば、フルオロ基やクロロ基やブロモ基やヨード基のようなハロゲン原子、アセチル基のようなアシル基、メチル基やエキル基のようなアルキル基、ベンジル基のようなアリールアルキル基、メトキシ基のようなアルコキシ基、メトキシエチル基のようなアルコキシアルキル基、シアノエチル基のようなシアノアルキル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、アシルオキシメチル基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシ基、シアノ基、およびニトロ基など、並びにそれらの２種類以上の置換基の組み合わせが挙げられる。

　Ｒが、保護された水酸基を示すとき、その保護基は、アミダイト法において使用できるものであればよく、例えば、２’－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基、２’－ビス（２－アセトキシ）メチル（ＡＣＥ）基、２’－（トリイソプロピルシリロキシ）メチル（ＴＯＭ）基、２’－（２－シアノエトキシ）エチル（ＣＥＥ）基、２’－（２－シアノエトキシ）メチル（ＣＥＭ）基（国際公開２００６／０２２３２３号）、２’－パラ－トルイルスルホニルエトキシメチル（ＴＥＭ）基、２’－ＥＭＭ基（国際公開２０１３／０２７８４３号）の他に、国際公開第２０１９／２０８５７１号に記載のものが使用できる。これらのリボヌクレオシド（ＲＮＡ）の２’保護基のうち、式（１０）で示される保護基が好ましい保護基として例示される。さらに好ましくは、Ｅ_Ｗで示される電子求引基としてシアノ基を有する式（１５）で示される保護基が例示される。

（式中、
　ｑは０～５の整数を表し、
　Ｒ^ａおよびＲ^ｂはそれぞれ同一または相異なって、メチル基、エチル基または水素原子を表し、
　＊印のついた結合は２’水酸基の酸素に結合する。
　そして、Ｅｗは電子求引性基を表す。）

　式（１５）で示される保護基は、例えば国際公開第２０１３／０２７８４３号および国際公開第２０１９／２０８５７１号に記載に従って合成することができ、かかる保護基を有するアミダイト化合物をオリゴヌクレオチドの製造に使用することができる。

　Ｒ基が、水酸基以外の置換基であるヌクレオチドおよびアミダイトは、特許第３７４５２２６号公報などに記載された公知の方法、国際公開第２００１／０５３５２８号あるいは特開２０１４－２２１８１７号公報およびそれらに引用される公知の方法で合成されるヌクレオシドから製造することもでき、さらには、市販品として入手可能なものを用いて、後述する実施例に記載の方法に則して又はこれらの方法に適宜変更を加えた方法により製造することができる。

　Ｒ’は、水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、Ｑ’は、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表す。

　前記オリゴヌクレオチドの合成は、本発明に関わる2’-OMe-Uアミダイトを用いた縮合工程以外は、一般的に公知の方法（例えば、前記の特許第５１５７１６８号公報または特許第５５５４８８１号公報に記載の方法）に従って、脱保護工程、縮合工程、の各工程を繰り返し行うことにより、核酸伸長反応を行うことができる。以下、各工程について説明する。

（核酸伸長反応）
　本明細書において、「核酸伸長反応」とは、ホスホジエステル結合を介して、ヌクレオチドを順次結合させることにより、核酸分子を伸長させる反応を意味する。核酸伸長反応は、一般的なアミダイト法（ホスホロアミダイト法）の手順に従い行うことができる。核酸伸長反応は、アミダイト法を採用する核酸自動合成装置等を用いて行ってもよく、液相合成で行ってもよい。

　オリゴヌクレオチドの鎖長は、例えば、２０ｍｅｒ以上、４０ｍｅｒ以上、５０ｍｅｒ以上、６０ｍｅｒ以上、８０ｍｅｒ以上、１００ｍｅｒ以上、２００ｍｅｒ以上、２～３００ｍｅｒ、２～２５０ｍｅｒ、２～２００ｍｅｒ、１０～３００ｍｅｒ、１０～２５０ｍｅｒ、１０～２００ｍｅｒ、１０～１５０ｍｅｒ、１５～３００ｍｅｒ、１５～２５０ｍｅｒ、１５～２００ｍｅｒ、１５～１５０ｍｅｒ、１５～１１０ｍｅｒであってもよい。

　工程（１）の脱保護工程は、固相担体上に担持されるＲＮＡ鎖末端の５’水酸基の保護基を脱保護する工程である（図１のスキームＡ参照）。Ｇ^１で表される一般的な保護基としては、４，４’－ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ基）や４－モノメトキシトリチル基、４，４’，４”－トリメトキシトリチル基が用いられる。脱保護は、酸を用いて行うことができる。脱保護用の酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸、ｐ－トルエンスルホン酸等が挙げられる。

　工程（２）の縮合工程は、前記脱保護工程により脱保護したオリゴヌクレオチド鎖末端の５’水酸基に対して、図１のスキームＡに記載の下記式（Ａ３）で示されるヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させる反応である。なお、核酸伸長に用いる下記式（Ａ３）で示されるホスホロアミダイトとしては、Ｒが保護された水酸基、２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、２’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基，２’－Ｏ－メトキシエチル基，２’－Ｈ，２'－フルオロ－２’－デオキシ－β－Ｄ－アラビノフラノシル等であるものが挙げられる。前記ヌクレオシドホスホロアミダイトとしては、５’水酸基が保護基（例、ＤＭＴｒ基）で保護されたものを用いる。縮合工程は、前記ヌクレオシドホスホロアミダイトを活性化するアクチベーターを用いて行うことができる。アクチベーターとしては、例えば、５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＴ）、１Ｈ－テトラゾール、４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）、Ｎ－メチルベンズイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＭｅＢＩＴ）、ベンズイミダゾリウムトリフラート（ＢＩＴ）、Ｎ－フェニルイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＰｈＩＭＴ）、イミダゾリウムトリフラート（ＩＭＴ）、５－ニトロベンズイミダゾリウムトリフラート（ＮＢＴ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）又は５－（ビス－３，５－トリフルオロメチルフェニル）－１Ｈ－テトラゾール等が挙げられ、５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＴ）が好ましい。

　図１のスキームＡに記載の式（Ａ３）で示されるヌクレオシドホスホロアミダイト（以下、アミダイトと呼称する）とは、以下のとおりである。
　式（Ａ３）:

（式中、
　Ｇ^１、Ｇ^２、Ｇ^３、Ｂ^ａ、およびＲは、前記の通りである。）
で示される化合物。

　本発明では、式（Ａ３）のアミダイトとして、縮合工程の少なくとも１回に、２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイト（式（４）で示される化合物）が用いられる。そして、その縮合工程において、２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイトが、アセトニトリル及び式（３）で示される芳香族系炭化水素を含む混合液に溶解された溶液を用いることができる。アクチベーターは、前記混合液に添加され得る。アクチベーターは、前記混合液に溶解していてもよい。

　縮合工程の後は、適宜、未反応の５’水酸基をキャッピングしてもよい。キャッピングは、無水酢酸－テトラヒドロフラン溶液、フェノキシ酢酸無水物／Ｎ－メチルイミダゾール溶液等の公知のキャッピング溶液を用いて行うことができる。

　工程（３）の酸化工程は、前記縮合工程により形成された亜リン酸基をリン酸基又はチオリン酸基に変換する工程である。本工程は、３価のリンから５価のリンに酸化剤を使用して変換する反応であり、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に酸化剤を作用させることにより実施することができる。

　亜リン酸基をリン酸基に変換する場合には、「酸化剤」として、例えば、ヨウ素を使用することができる。該酸化剤は、０．００５～２Ｍの濃度になるように調製して使用することができる。酸化の酸素源としては水を用いることができ、反応を進行させる塩基としてはピリジン、Ｎ－メチルイミダゾール（ＮＭＩ）、Ｎ－メチルモルフォリン、トリエチルアミンを用いることができる。また、溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）又はこれらの任意の割合で混合して使用することもできる。例えば、ヨウ素／水／ピリジン／アセトニトリル、あるいはヨウ素／水／ピリジンあるいはヨウ素／水／ピリジン／ＮＭＩ、あるいはヨウ素／水／ピリジン／ＴＨＦを用いることができる。反応温度は、５℃～５０℃が好ましい。反応時間は、通常１分～３０分が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持されている化合物１ｍｏｌに対して１～１００ｍｏｌが好ましく、より好ましくは１～１０ｍｏｌである。

　亜リン酸トリエステル基をチオリン酸基に変換する場合には、「酸化剤」として、例えば、硫黄、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン－１，１－ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＡＤＴＴ）、５－フェニル－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－オン（ＰＯＳ）、［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾリン－３－チオン（ＤＤＴＴ）、およびフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）を使用することができる。該酸化剤は、０．００１～２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。反応に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ピリジン又はこれらの任意の混合溶媒が挙げられる。酸化工程は、前記キャッピング操作の後で行ってもよいし、逆に、酸化工程の後でキャッピング操作を行ってもよいし、この順序は限定されない。

　工程（５）において、リン酸保護基を脱保護する工程は、所望の配列を有する核酸の合成が完了した後は、リン酸部分の保護基を脱保護するためにアミン化合物を作用させる。アミン化合物としては、例えば、特許第４７０５７１６号公報に記載されるジエチルアミン等が挙げられる。

　伸長の最後に導入したヌクレオシドの５’水酸基の保護基は、後述の固相担体からの切り出し及び保護基の脱保護の後、５’保護基をタグとするカラム精製のために使用してもよく、カラム精製後、５’水酸基の保護基を脱保護してもよい。

　工程（５）における、固相担体上で所望の鎖長に伸長したオリゴヌクレオチドの、固相担体からの切り出しは、通常、切り出し剤として濃アンモニア水を用いて実施される。

　更にアンモニア又はアミン化合物等を用いて、例えば、固相担体からオリゴヌクレオチド鎖を切断して回収する。アミン化合物としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミン、ジエチルアミン等が挙げられる。

　工程（６）において、工程（５）において固相担体から切り出された核酸化合物（Ａ６）のリボースの２’水酸基の保護基は、国際公開第２００６／０２２３２３号）、国際公開第２０１３／０２７８４３号、または国際公開第２０１９／２０８５７１号に記載の方法に従って除くことができて、脱保護したオリゴヌクレオチド（Ａ７）を得ることができる。

　本発明の製造方法を用いて製造可能なオリゴヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチド内に含まれるヌクレオシドが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、並びに２’－Ｏ－ＭＯＥ、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆを有するＲＮＡ、およびＬＮＡであるオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、Xiulong, Shenら著、Nucleic Acids Research, 2018, Vol. 46, No.46, 1584-1600、およびDaniel O'Reillyら著、Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No.2, 546-558に記載された、様々なヌクレオシドの例が挙げられる。

　本発明の製造方法において使用可能なオリゴヌクレオチドの典型的な例を、実施例に記載の例に加えて下記の例を示すが、これらに限定されるものではない。

　以下、配列の説明中、Ｕはウリジン（ST.25形式）を、Ｃはシチジンを、Ａはアデノシンを、またＧはグアノシンを示す。また、ST.26形式に準じたＴはウリジンを示す。

　国際公開第２０１９／０６０４４２号に記載されている、下記の配列（Ａ）および（Ｂ）を有するオリゴヌクレオチドを挙げられる。
配列（Ａ）：５’－AUGGAAUmACUCUUGGUUmACdTdT－３’（ST.25形式に準じる）（５’－ATGGAATmACTCTTGGTTmACdTdT－３’（ST.26形式に準じる））（Antisense）（配列番号１）　２１ｍｅｒ
配列（Ｂ）：５’－GUmAACmCmAAGAGUmAUmUmCmCmAUmdTdT－３’（ST.25形式に準じる）（５’－GTmAACmCmAAGAGTmATmTmCmCmATmdTdT－３’（ST.26形式に準じる））（Sense）（配列番号２）　２１ｍｅｒ
　配列（Ａ）および（Ｂ）中、Umは2'-O-メチルウリジン（ST.25形式）を、Tmは2'-O-メチルウリジン（ST.26形式）を、Cmは2'-O-メチルシチジンを、またdTはチミジンを示す。本明細書中、特に断らない限り、配列における略号はST.25形式およびST.26形式の両方に適用する。

　特表２０１７－５３７６２６号に記載されているオリゴヌクレオチドが挙げられる。典型例として、下記の配列（Ｃ）を有するオリゴヌクレオチドを挙げられる。
配列（Ｃ）：５’－AmsGmsUmsCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUmsUmsUmsU－３’（ST.25形式に準じる）（５’－AmsGmsTmsCCTCATCTCCCTCAAGCGTTTAAGAGCTATGCTGGTAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTmsTmsTmsT－３’（ST.26形式に準じる））（配列番号３）　１１３ｍｅｒ
　配列（Ｃ）中、Umは2'-O-メチルウリジン（ST.25形式）を、Tmは2'-O-メチルウリジン（ST.26形式）を、Amは2'-O-メチルアデノシンを、Gmは2'-O-メチルグアノシンを、またsはホスホロチオエート修飾を示す。

　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

測定方法
　まず、以下の試験で用いた各種測定方法を以下に示す。

（測定方法１：オリゴヌクレオチド中のn-1 mer不純物およびFLP割合の測定）
　オリゴヌクレオチド純度は、ＨＰＬＣを用いて測定した。ＦＬＰとは目的物質（Full Length Product）を意味する。
　ＨＰＬＣ測定条件を下記表１に示す。

（測定方法２：オリゴヌクレオチド収量の測定）
　前記粗生成物のＯＤ_２６０を測定した。ＯＤ_２６０とは１ｍＬ溶液（ｐＨ＝７．５）における１０ｍｍ光路長あたりのＵＶ２６０ｎｍの吸光度を表す。一般的にＲＮＡでは１ＯＤ＝４０μｇであることが知られていることから、前記ＯＤ_２６０の測定値に基づき、収量を算出した。

オリゴヌクレオチドの固相合成
　配列（Ｉ）：５’－UmUmUmUmUmUmUmUmUmUmUmUmUmUmUmUmUmUmUmUmUmUmUmUmUm－３’（ST.25形式に準じる）（５’－TmTmTmTmTmTmTmTmTmTmTmTmTmTmTmTmTmTmTmTmTmTmTmTmTm－３’（ST.26形式に準じる））（配列番号４）　25ｍｅｒ
　配列（Ｉ）中、Umは2'-O-メチルウリジン（ST.25形式）を、またTmは2'-O-メチルウリジン（ST.26形式）を示す。

　前記配列（Ｉ）は以下の構造(１６)を示す。

　固相担体として、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）を使用し、核酸合成機としてＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、ホスホロアミダイト固相合成法により、上記配列（Ｉ）からなるオリゴヌクレオチドを３’側から５’側に向かって合成した。合成は、約５３μｍｏｌスケールにて実施した。また、合成には、式（４）で示される2’-OMe-Uアミダイトを任意の溶媒に溶解させた2’-OMe-Uアミダイト溶液を使用し、デブロッキング溶液として高純度ジクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、縮合剤として５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール溶液を使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、キャッピング溶液としてフェノキシ酢酸無水物溶液とＮ－メチルイミダゾール溶液を使用した。

　次に、本発明の製法により製造されるオリゴヌクレオチドの具体的な製造例を示す。ここで、下記の実施例において本発明の製法により製造されるオリゴヌクレオチドは、前記配列番号４で示される配列（Ｉ）を有するオリゴヌクレオチドである。

　また、以下の実施例および比較例中に記載する2’-OMe-U誘導体CPGは下記式（１７）に示される化合物を意味する。ただし、式（１７）において図示されたサークルは、ＣＰＧを模式的に示すものである。

実施例１
　53.7μｍｏｌの2’-OMe-U誘導体CPGと、アセトニトリル：トルエン９：１を溶媒として75 mMに調整した2’-OMe-Uアミダイト溶液とを用いて、配列（Ｉ）に示すオリゴヌクレオチドをＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００（ＧＥヘルスケア社製）により、３’側から５’側に向かって自動合成した。自動合成の手順は、まず、３％ジクロロ酢酸トルエン溶液をＣＰＧに送液し、５’位のトリチル保護基を脱保護し、続いて、2’-OMe-Uアミダイト溶液と縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールアセトニトリル溶液をＣＰＧに送液し、５’位の水酸基に縮合反応を進行させた。続いて、50ｍＭヨウ素溶液を送液し、亜リン酸基をリン酸基に変換した。続いて、キャッピング溶液として０．１Ｍフェノキシ酢酸無水物アセトニトリル溶液と１０wt％Ｎ－メチルイミダゾール／１０wt％２，６－ルチジンアセトニトリル溶液を使用し、縮合反応が進行しなかった反応点にキャッピングを施した。これらの工程を合計２４回繰り返し、配列（Ｉ）に示される配列の核酸オリゴヌクレオチドをＣＰＧ担体上に合成した。その後、５’位のトリチル保護基を３％ジクロロ酢酸トルエン溶液にて脱保護した。その後、８．０μｍｏｌのオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体に対して、４．０９ｇのアンモニア水と１．２１ｇのエタノールを用いて、オリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた。その後、固相担体をろ過により除去し、減圧乾燥によりアンモニア水とエタノールを除去し、所望のオリゴヌクレオチドを乾固体として得た。測定方法２による測定の結果、収量は５７．３ｍｇ、測定方法１による測定の結果、FLP割合は７６．０４％、n-1 mer割合は７．１７％であった。

実施例２
　実施例１の方法において、５５．６μｍｏｌの2’-OMe-U誘導体CPGと、2’-OMe-Uアミダイト溶液の溶媒としてアセトニトリル：トルエン４：１を用いる以外は、同様の方法で配列（Ｉ）のオリゴヌクレオチドを得た。収量は５８．３ｍｇ、FLP割合は７８．０１％、n-1 mer割合は５．２４％であった。

実施例３
　実施例１の方法において、５３．５μｍｏｌの2’-OMe-U誘導体CPGと、2’-OMe-Uアミダイト溶液の溶媒としてアセトニトリル：トルエン４：６を用いる以外は、同様の方法で配列（Ｉ）のオリゴヌクレオチドを得た。収量は５４．３ｍｇ、FLP割合は７４．２４％、n-1 mer割合は４．１４％であった。

実施例４
　実施例１の方法において、５３．１μｍｏｌの2’-OMe-U誘導体CPGと、2’-OMe-Uアミダイト溶液の溶媒としてアセトニトリル：o－キシレン４：１を用いる以外は、同様の方法で配列（Ｉ）のオリゴヌクレオチドを得た。収量は５８．６ｍｇ、FLP割合は７７．８４％、n-1 mer割合は５．２２％であった。

実施例５
　実施例１の方法において、５３．１μｍｏｌの2’-OMe-U誘導体CPGと、2’-OMe-Uアミダイト溶液の溶媒としてアセトニトリル：クロロベンゼン４：１を用いる以外は、同様の方法で配列（Ｉ）のオリゴヌクレオチドを得た。収量は５７．３ｍｇ、FLP割合は７７．８２％、n-1 mer割合は５．７８％であった。

実施例６
　実施例１の方法において、５２．４μｍｏｌの2’-OMe-U誘導体CPGと、2’-OMe-Uアミダイト溶液の溶媒としてアセトニトリル：o－ジクロロベンゼン４：１を用いる以外は、同様の方法で配列（Ｉ）のオリゴヌクレオチドを得た。収量は５６．４ｍｇ、FLP割合は７６．６２％、n-1 mer割合は５．５０％であった。

比較例１
　実施例１の方法において、５２．８μｍｏｌの2’-OMe-U誘導体CPGと、2’-OMe-Uアミダイト溶液の溶媒としてアセトニトリル：ジクロロメタン４：１を用いる以外は、同様の方法で配列（Ｉ）のオリゴヌクレオチドを得た。収量は５９．４ｍｇ、FLP割合は７６．８７％、n-1 mer割合は７．６８％であった。

　FLP割合と、ｎ－１　ｍｅｒ割合について、実施例１～６、および比較例１の結果を、表２に示す。

　上記表２の結果より、アセトニトリルと芳香族系炭化水素を2’-OMe-Uアミダイト溶液の溶媒として用いた場合には、比較例１の溶液を用いた場合と比較して、n-1 mer不純物を相対的に低減可能であることが分かった。

　配列表の配列番号１～４は、本発明の製造方法に従って製造されるオリゴヌクレオチドの塩基配列を表す。

Claims

　式（２）：

〔式中、
　Ｇ^２は水酸基の保護基を示し、
　Ｂ^ａは、保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し、
　Ｒは、保護された水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
　Ｑ’は、リボースの４’位の炭素原子と結合しているアルキレン基を表し、
　Ｘは、酸素原子または硫黄原子を表し、そして、
　＊のついた結合は、核酸の３’末端側への結合を示す。〕
で示される化合物と、式（４）：

〔式中、
　Ｇ^１は水酸基の保護基を示す。〕
で示される２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイトとをアクチベーターの存在下で縮合させる工程を含み、
前記２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイトが、アセトニトリル及び式（３）：

〔式中、Ｙ^１～Ｙ^６は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、水素原子、メチル基、エチル基、又はハロゲン原子を表す。〕
で示される芳香族系炭化水素を含む混合液に溶解している、
オリゴヌクレオチドの製造方法。
　式（３）で示される芳香族系炭化水素が、メチル基、エチル基、及びハロゲン原子からなる群より選ばれる１つ又は２つの置換基を有するベンゼンであり、ベンゼンが２つの置換基を有する場合、置換基は同一でも異なっていてもよい、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
　式（３）で示される芳香族系炭化水素が、トルエン、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、クロロベンゼン、ｏ－ジクロロベンゼン、ｍ－ジクロロベンゼン、ｐ－ジクロロベンゼン、及びそれらの２種以上の混合物からなる群より選ばれる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
　式（４）で示される２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイトが溶解する混合液に含まれるアセトニトリルと式（３）で示される芳香族系炭化水素との体積比率が、アセトニトリル：式（３）で示される芳香族系炭化水素で９９：１～１：９９である、請求項１～３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
　式（４）で示される２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイトが溶解する混合液に含まれるアセトニトリルと式（３）で示される芳香族系炭化水素の体積比率が、アセトニトリル：式（３）で示される芳香族系炭化水素で９０：１０～１０：９０である、請求項１～３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
　式（４）で示される２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイトが溶解する混合液に含まれるアセトニトリルと式（３）で示される芳香族系炭化水素の体積比率が、アセトニトリル：式（３）で示される芳香族系炭化水素で９０：１０～４０：６０である、請求項１～３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
　式（４）で示される２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイト溶液における２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイト濃度が、０．０１～０．４Ｍである、請求項１～６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
　式（４）で示される２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイト溶液における２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイト濃度が、０．０５～０．２Ｍである、請求項１～６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
　アクチベーターが５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾールである、請求項１～８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
　式（２）で示される化合物におけるＲが保護された水酸基である場合、その水酸基の保護基が、式（１０）：

〔式中、
　ｑは０～５の整数を表し、
　Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ同一または相異なり、メチル基、エチル基又は水素原子を表し、
　＊印のついた結合は２’水酸基の酸素に結合し、
　Ｅｗは電子求引性基を表す。〕
で示される保護基である、請求項１～９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
　式（４）で示される２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイトにおいて、Ｇ^１が４，４’－ジメトキシトリチル基である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
　固相合成法により行われる、請求項１～１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
　式（４）：

〔式中、
　Ｇ^１は水酸基の保護基を示す。〕
で示される２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイト、アセトニトリル及び式（３）：

〔式中、Ｙ^１～Ｙ^６は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、水素原子、メチル基、エチル基、又はハロゲン原子を表す。〕
で示される芳香族系炭化水素を含む、溶液。
　請求項１３に記載された式（４）で示される２’－ＯＭｅ－Ｕアミダイト、アセトニトリル及び式（３）で示される芳香族系炭化水素を含む溶液を、オリゴヌクレオチドの製造に用いる方法。