WO2021230259A1

WO2021230259A1 - 高ステビオール配糖体含有ステビア植物及びそのスクリーニング方法

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Publication number: WO2021230259A1
Application number: PCT/JP2021/017956
Authority: WO
Inventors: 正良平井; 一考岩城; 兼太郎落合; 沙織竹山; 克郎宮川
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2020-05-12
Filing date: 2021-05-11
Publication date: 2021-11-18
Anticipated expiration: 2022-11-12
Also published as: BR112022022789A2; JPWO2021230259A1; JP7737366B2; CN115516106A; PE20230079A1; US12338498B2; EP4151082A4; US20230265530A1; EP4151082A1; AU2021272618A1; AR122074A1

Abstract

本発明は、以下の遺伝的特徴（１）及び（２）を有する高ステビオール配糖体含有ステビア植物体、その作出方法、スクリーニング方法等を提供する。（１）配列番号１の２９０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。（２）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性又はヘテロ接合性である。

Description

高ステビオール配糖体含有ステビア植物及びそのスクリーニング方法

　本発明は、ステビオール配糖体の含有量が高いステビア植物及びそのスクリーニング方法等に関する。

　多様化する消費者ニーズに対応すべく、様々な飲料が開発され、市販されている。ショ糖等の糖類は、甘味を与える等の目的で飲料にごく普通に配合される成分であるが、過剰摂取による健康への影響が指摘されてきており、より低カロリーであり、かつ天然由来の甘味料に対するニーズが高まりつつある。例えば特許文献１は、ビタミン、高甘味度甘味料、及び甘味改善組成物を含有する機能性甘味料組成物を開示している。

　ステビオール配糖体は、ステビア抽出物に含まれる甘味成分として知られている。ステビア抽出物は、主にステビアの乾燥葉から抽出、精製される。ステビアは南米パラグアイを原産地とする菊科多年生植物で、学名をステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Stevia Rebaudiana Bertoni）という。ステビアは砂糖の約３００倍以上の甘味を持つ成分を含むので、この甘味成分を抽出して天然甘味料として用いるために栽培されている。ステビオール配糖体としては、レバウジオシドＡ（Rebaudioside A、以下「レバウジオシド」（Rebaudioside）を「Ｒｅｂ」と略すことがある）、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＭ等、様々な配糖体の存在が報告されている（特許文献２）。様々なステビオール配糖体の中で、例えばＲｅｂＡは、高甘味度と良質甘味を有する甘味料として評価されており、広く用いられている。その他のステビオール配糖体についても、その独自の甘さ及び付随する味を有することが判明しつつある。

　そのような状況において、甘味成分含量が高いステビア植物体をスクリーニングする方法が知られている（特許文献３）。

ＷＯ２００７／０７０２２４ＷＯ２０１０／０３８９１１ＷＯ２０２０／０２７１５５

　ステビオール配糖体の含有量が高いステビア植物が求められている。

　本発明は、その一側面において、以下を提供する。
［１］
　被験ステビア植物体のゲノムから、以下の遺伝的特徴（１）の存在及び／又は不在と、以下の遺伝的特徴（２）の存在及び／又は不在とを検出する工程を含む、高ステビオール配糖体含有ステビア植物体をスクリーニングする方法。
（１）配列番号１の２９０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性又はヘテロ接合性である。
［２］
　遺伝的特徴の存在及び／又は不在が検出された被験ステビア植物組織のステビオール配糖体の含有量を測定する工程をさらに含む、［１］に記載の方法。
［３］
　高ステビオール配糖体含有ステビア植物体のステビオール配糖体含有量が、遺伝的特徴（２）の存在及び／又は不在とを検出する工程を含むが、遺伝的特徴（１）の存在及び／又は不在を検出する工程を含まないスクリーニング方法で選択されたステビア植物体のステビオール配糖体含有量より３％以上高い、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
　遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出する工程が、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法を用いて行われる、［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。

［５］
　以下の遺伝的特徴（１）の存在及び／又は不在を検出するための試薬と、以下の遺伝的特徴（２）の存在及び／又は不在を検出するための試薬とを含む、高ステビオール配糖体含有ステビア植物体のスクリーニングキット。
（１）配列番号１の２９０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性又はヘテロ接合性である。
［６］
　試薬が、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法に使用するプライマー及び／又はプローブを含む、［５］に記載のキット。
［７］
　以下の遺伝的特徴（１）及び（２）を有する、高ステビオール配糖体含有ステビア植物体。
（１）配列番号１の２９０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性又はヘテロ接合性である。
［８］
　非遺伝子組換植物体である、［７］に記載の植物体。
［９］
　変異誘発処理を行ったステビア植物体及びその子孫植物体を含む、［７］又は［８］に記載の植物体。

［１０］
　［７］～［９］のいずれか一項に記載の植物体の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞。
［１１］
　胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスから選択される、［１０］に記載の組織、組織培養物又は細胞。
［１２］
　［７］～［９］のいずれか一項に記載のステビア植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、高ステビオール配糖体含有ステビア植物体を作出する方法。
［１３］
　第２の植物体が［７］～［９］のいずれか一項に記載のステビア植物体である、［１２］に記載の方法。
［１４］
　ステビア植物体のゲノムに、前記ゲノムが以下の遺伝的特徴（１）及び（２）を有するように改変を加える工程を含む、高ステビオール配糖体含有ステビア植物体を作出する方法。
（１）配列番号１の２９０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性又はヘテロ接合性である。
［１５］
　ゲノムの改変が、変異誘発処理によって行われる、［１４］に記載の方法。

［１６］
　ステビオール配糖体を含む、［７］～［９］のいずれか一項に記載の植物体、［１０］又は［１１］に記載の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞の抽出物。
［１７］
　［７］～［９］のいずれか一項に記載の植物体、［１０］又は［１１］に記載の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞から抽出物を得る工程を含む、ステビオール配糖体含有抽出物の製造方法。
［１８］
　［１６］に記載の抽出物からステビオール配糖体を精製する工程を含む、ステビオール配糖体の製造方法。
［１９］
　［７］～［９］のいずれか一項に記載の植物体の抽出物、［１０］又は［１１］に記載の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞の抽出物、或いは、［１６］に記載の抽出物を提供する工程、及び
前記抽出物を、飲食品、甘味料組成物、香料又は医薬品の原料に添加する工程
を含む、飲食品、甘味料組成物、香料又は医薬品の製造方法。

　本発明によって、ステビオール配糖体をより多く含むステビア植物体の取得、そのような植物体を作出するための手段、そのような植物体より得られる葉、この葉より得られたステビオール配糖体を含む食物や飲料等の提供が可能になる。

図１は、配列番号１の塩基配列における、遺伝的特徴（１）に係る塩基の位置を示した図である。枠で囲った塩基が遺伝的特徴（１）に係る塩基である。図２は、配列番号２の塩基配列における、遺伝的特徴（２）に係る塩基の位置を示した図である。枠で囲った塩基が遺伝的特徴（２）に係る塩基である。図３は、集団Ａにおける種々の遺伝的特徴を有する個体群の乾燥葉中のＴＳＧ含量の平均値（％）を示したグラフである。「All」は集団Ａの全個体、「(2)」は遺伝的特徴（２）を有する個体、「(1)+(2)」は本発明の遺伝的特徴を有する個体、「Not (1)+(2)」は本発明の遺伝的特徴を有しない個体をそれぞれ示す。

　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をそのような実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
　なお、本明細書において引用した全ての文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０２０年５月１２日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０２０－０８４１３３号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。

１．高ステビオール配糖体含有ステビア植物体
　本発明は、１つの側面において、以下の遺伝的特徴（１）及び（２）を有する、高ステビオール配糖体含有ステビア植物体（以下、「本発明の植物体」と称することがある）を提供する。
（１）配列番号１の２９０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性又はヘテロ接合性である。
　本発明の植物体は、野生種のステビア植物体から派生した種であるが、ステビオール配糖体含量が高くなる上記遺伝的特徴（１）及び（２）を獲得したものである（以下、上記遺伝的特徴（１）及び（２）を「本発明の遺伝的特徴」と総称する場合がある）。

　「～に相当する位置」とは、ゲノム中に基準配列（例えば、配列番号１等）と同一の配列が存在する場合は、ゲノム中に存在するその配列中の位置（例えば、２９０位、４０位等）を意味し、ゲノム中に基準配列と同一の配列が存在しない場合は、ゲノム中の基準配列に相当する配列中の、基準配列中の位置に相当する位置を意味する。ゲノム中に基準配列と同一又はそれに相当する配列が存在するかどうかは、例えば、基準配列をＰＣＲで増幅し得るプライマーで、対象となるステビア植物のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅産物のシーケンシングを行い、得られた配列と基準配列とのアラインメント解析を行うことで決定することができる。基準配列に相当する配列の非限定例としては、例えば、基準配列に対し６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．１％以上、９８．４％以上、９８．７％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上又は９９．８％以上の配列同一性を有する塩基配列が挙げられる。ゲノム中の基準配列に相当する配列中の、基準配列中の位置に相当する位置は、基準配列中の位置の前後の塩基配列等を考慮して決定することができる。例えば、基準配列とゲノム中の基準配列に相当する配列とのアライメント解析により、ゲノム中の基準配列に相当する配列中の、基準配列中の位置に相当する位置を決定することができる。

　例えば、本発明の遺伝的特徴（１）の「配列番号１の２９０位に相当する位置」を例にとると、ステビア植物体のゲノムが配列番号１と同一の塩基配列からなる部分を有している場合、「配列番号１の２９０位に相当する位置」はゲノム中の配列番号１と同一の塩基配列からなる部分の５’側から２９０位である。一方、ステビア植物体のゲノムが配列番号１と同一ではないがこれに相当する塩基配列からなる部分を有している場合、ゲノムは配列番号１と同一の塩基配列からなる部分を有しないため、「配列番号１の２９０位に相当する位置」は、必ずしも配列番号１に相当する部分の５’側から２９０位に該当するわけではないが、配列番号１の２９０位の前後の塩基配列等を考慮し、かかるステビア植物のゲノムにおける「配列番号１の２９０位に相当する位置」を特定することができる。例えば、ステビア植物のゲノムにおける配列番号１に相当する部分の塩基配列と、配列番号１の塩基配列とのアライメント解析により、ステビア植物のゲノムにおける「配列番号１の２９０位に相当する位置」を特定することができる。

　「配列番号１に相当する塩基配列からなる部分」は、例えば、配列番号１の塩基配列に対し、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．１％以上、９８．４％以上、９８．７％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上又は９９．８％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる部分を意味する。

　一部の態様において、「配列番号１に相当する塩基配列からなる部分」には、配列番号１の５’末端から１～２８９位（すなわち、配列番号１の５’末端から、遺伝的特徴（１）に係る位置である２９０位の１塩基５’末端側の塩基まで）の部分の相補配列にハイブリダイズするフォワードプライマー（例えば、配列番号３の配列を有するもの）と、配列番号１の３’末端側から１～３６位（すなわち、配列番号１の３’末端から、遺伝的特徴（１）に係る位置である２９０位の１塩基３’末端側の塩基まで）の部分にハイブリダイズするリバースプライマー（例えば、配列番号４の配列を有するもの）とを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物体のゲノムの部分が含まれる。

　一部の態様において、「配列番号２に相当する塩基配列からなる部分」には、配列番号２の５’末端から１～３９位（すなわち、配列番号２の５’末端から、遺伝的特徴（２）に係る位置である４０位の１塩基５’末端側の塩基まで）の部分の相補配列にハイブリダイズするフォワードプライマー（例えば、配列番号５の配列を有するもの）と、配列番号２の３’末端側から１～１０５位（すなわち、配列番号２の３’末端から、遺伝的特徴（２）に係る位置である４０位の１塩基３’末端側の塩基まで）の部分にハイブリダイズするリバースプライマー（例えば、配列番号６の配列を有するもの）とを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物体のゲノムの部分が含まれる。

　特定の態様において、「配列番号１に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号３の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号２に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号５の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号６の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。

　特定の態様において、「配列番号１の２９０位に相当する位置の塩基がＴであるアレル」（以下、「遺伝的特徴（１）に係るアレル」と称することがある）は、配列番号１、７、８又は９の塩基配列を含む。
　特定の態様において、「配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＡであるアレル」（以下、「遺伝的特徴（２）に係るアレル」と称することがある）は、配列番号２、１０、１１又は１２の塩基配列を含む。
　ここで、（１）配列番号１の２９０位に相当する位置及び（２）配列番号２の４０位に相当する位置を、「本発明の多型部位」又は「本発明の遺伝的特徴に係る部位」と総称することがある。

　前記遺伝的特徴は、ＰＣＲ法、TaqMan PCR法、シーケンス法、マイクロアレイ法、インベーダー法、TILLING法、ＲＡＤ（random amplified polymorphic DNA）法、法制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ法、ＡＦＬＰ（amplified fragment length polymorphism）法、ＳＳＬＰ（simple sequence length polymorphism）法、ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）法、ｄＣＡＰＳ（derived cleaved amplified polymorphic sequence）法、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）法、ＡＲＭＳ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）法、ＣＣＭ（chemical cleavage of mismatch）法、ＤＯＬ法、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、パドロックプローブ法、分子ビーコン法、ＤＡＳＨ（dynamic allele specific hybridization）法、ＵＣＡＮ法、ＥＣＡ法、ＰＩＮＰＯＩＮＴ法、ＰＲＯＢＥ（primer oligo base extension）法、ＶＳＥＴ（very short extension）法、Survivor assay、Sniper assay、Luminex assay、ＧＯＯＤ法、ＬＣｘ法、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、Mass ARRAY法、パイロシーケンス法、ＳＮＰ－ＩＴ法、融解曲線分析法等により検出することが可能であるが、検出方法はこれらに限定されるものではない。遺伝子変異の検出方法の詳細については後述する。

　特定の態様において、本発明の遺伝的特徴は、以下のプライマーセット及び制限酵素の組合せによるｄＣＡＰＳ法で検出することが可能である。
　候補植物体が遺伝的特徴（１）を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号２１に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号２２に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３２６ｂｐ長、例えば、配列番号３０）に対し制限酵素ＲｓａＩによる処理を行うと、約２９０ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号３１）と約３６ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号３２）が生じる。一方、候補植物体が遺伝的特徴（１）を有しない場合、上記と同様にＰＣＲ増幅を行うと約３２６ｂｐ長のＰＣＲ産物（例えば、配列番号３３、又は配列番号３０及び３３）が生じるが、制限酵素処理を行っても、切断されていない約３２６ｂｐ長のＰＣＲ産物（例えば、配列番号３３）のバンドが確認される。

　候補植物体が遺伝的特徴（２）を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号２５に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号２８に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３６７ｂｐ長、例えば、配列番号３４、又は配列番号３４及び３５）に対し制限酵素ＲｓａＩによる処理を行うと、約４６ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号３６）と約３２０ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号３７）が生じる。一方、候補植物体が遺伝的特徴（２）を有しない場合、上記と同様にＰＣＲ増幅を行うと約３６７ｂｐ長のＰＣＲ産物（例えば、配列番号３５）が生じるが、制限酵素処理を行っても、切断されていない約３６７ｂｐ長のＰＣＲ産物（例えば、配列番号３５）のバンドのみが確認される。

　本発明のステビア植物体は、野生種のステビア植物体から派生した種であり、ステビオール配糖体含量が高くなる前述の遺伝的特徴を獲得したものである。当該遺伝的特徴は、遺伝子組換的手法により生じたものであっても、非遺伝子組換的手法により生じたものであってもよい。したがって、本発明の植物体は、遺伝子組換的手法により得られたもの又はその子孫（以下、「遺伝子組換植物体」と称することがある）であっても、非遺伝子組換的手法により得られたもの又はその子孫（以下、「非遺伝子組換植物体」と称することがある）であってもよい。

　本明細書中、「非遺伝子組換的手法」の例としては、外来遺伝子の導入を行わずに宿主細胞（又は宿主植物体）の遺伝子に変異を誘発する方法が挙げられる。そのような方法としては植物細胞の変異誘発剤を作用させる方法が挙げられる。そのような変異誘発剤としては、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）及びアジ化ナトリウム等が挙げられる。例えば、ＥＭＳは、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％等の濃度で植物細胞を処理することができる。処理時間は約１時間～約４８時間、約２時間～約３６時間、約３時間～約３０時間、約４時間～約２８時間、約５時間～約２６時間、約６時間～約２４時間である。処理の手順自体は公知であるが、吸水過程を経た吸水種子を上記濃度で変異誘発剤を含む処理液に、上記処理時間浸漬することで行うことができる。

　非遺伝子組換的手法の別の例として、Ｘ線、γ線、紫外線等の放射線や光線を植物細胞に照射する方法が挙げられる。紫外線を照射する場合、適当な紫外線の照射量（紫外線ランプ強さ、距離、時間）を用いて照射した細胞を、選択培地等で培養した後、目的の形質を有する細胞、カルス、植物体を選択できる。その際の照射強度は０．０１～１００Ｇｒ、０．０３～７５Ｇｒ、０．０５～５０Ｇｒ、０．０７～２５Ｇｒ、０．０９～２０Ｇｒ、０．１～１５Ｇｒ、０．１～１０Ｇｒ、０．５～１０Ｇｒ、１～１０Ｇｒであってよく、照射距離は１ｃｍ～２００ｍ、５ｃｍ～１００ｍ、７ｃｍ～７５ｍ、９ｃｍ～５０ｍ、１０ｃｍ～３０ｍ、１０ｃｍ～２０ｍ、１０ｃｍ～１０ｍであってよく、照射時間は１分～２年、２分～１年、３分～０．５年、４分～１か月、５分～２週間、１０分～１週間であってよい。照射の強度、距離及び時間は、放射線や光線の種類や照射対象となる状態（細胞、カルス、植物体）により異なるが、当業者であれば適宜調整することができる。

　また、細胞融合、葯培養（半数体育成）、遠縁交雑（半数体育成）等の手法も公知である。
　一般に、植物細胞は、培養の間に変異を伴うことがあるため、より安定した形質維持のために植物個体に戻すことが好ましい。
　非遺伝子組換ステビア植物体を宿主として事後的に遺伝子組換（例えばゲノム編集等により）を行って得られた植物体（例えば、本発明の植物体を宿主として遺伝子組換を行って、さらに別の形質を付加した植物体）も、本発明の範囲から除外されるものではない。

　本発明の植物体は、ステビオール配糖体高含有型である。高ステビオール配糖体含有ステビア植物とは、本発明の遺伝的特徴を有しないステビア植物に比べ、ステビオール配糖体の含有量が高いことを意味する。ステビオール配糖体の含有量が高いとは、例えば、本発明のステビア植物体の集団におけるステビオール配糖体含有量の平均値又は中央値が、本発明の遺伝的特徴を有しないステビア植物体の集団におけるステビオール配糖体の含有量の平均値又は中央値に比べて高いこと、及び／又は、遺伝的特徴（２）を有するステビア植物体の集団におけるステビオール配糖体含有量の平均値又は中央値に比べて高いことを意味する。

　一部の態様において、本発明の植物体の集団におけるステビオール配糖体の含有量の平均値は、本発明の遺伝的特徴を有しないステビア植物体の集団におけるステビオール配糖体の含有量の平均値より約１０％以上、約１１％以上、約１２％以上、約１３％以上、約１４％以上、約１５％以上、約１６％以上、約１７％以上、約１８％以上、約１９％以上、約２０％以上、約２１％以上、約２２％以上、約２３％以上、約２４％以上、約２５％以上、約２６％以上、約２７％以上、約２８％以上、約２９％以上、約３０％以上、約３１％以上、約３２％以上、約３３％以上、約３４％以上、約３５％以上、約３６％以上、約３７％以上、約３８％以上、約３９％以上、約４０％以上、約４１％以上、約４２％以上、約４３％以上、約４３．５％以上、約４４％以上、約４５％以上、約４６％以上、約４７％以上、約４８％以上、約４９％以上又は約５０％以上高い。

　また、一部の態様において、本発明の植物体の集団におけるステビオール配糖体の含有量の平均値は、遺伝的特徴（２）を有するステビア植物体の集団におけるステビオール配糖体の含有量の平均値より約１．０％以上、約１．３％以上、約１．５％以上、約１．８％以上、約２．０％以上、約２．３％以上、約２．５％以上、約２．８％以上、約３．０％以上、約３．３％以上、約３．５％以上、約３．８％以上、約４．０％以上、約４．３％以上、約４．５％以上、約４．８％以上、約５．０％以上、約５．３％以上、約５．５％以上、約５．８％以上、約６．０％以上、約６．３％以上、約６．５％以上、約６．８％以上、約７．０％以上、約７．２％以上、約７．５％以上、約７．８％以上、約８．０％以上、約８．３％以上、約８．５％以上、約８．８％以上、約９．０％以上、約９．３％以上、約９．５％以上、約９．８％以上又は約１０．０％以上高い。

　ステビオール配糖体は、ステビオール骨格にグルコース、ラムノース、キシロース等の糖が結合した化合物の総称であり、例えば、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＧ、ＲｅｂＩ、ＲｅｂＪ、ＲｅｂＫ、ＲｅｂＮ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＯ、ＲｅｂＱ、ＲｅｂＲ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ステビオシド等を包含する。一部の態様において、ステビオール配糖体は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＩ、ＲｅｂＪ、ＲｅｂＫ、ＲｅｂＮ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＯ、ＲｅｂＱ、ＲｅｂＲ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド及びステビオシドから選択される１種以上の配糖体を包含する。特定の態様において、ステビオール配糖体は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＧ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ及びステビオシドを含むか、又はこれらのステビオール配糖体から選択される。

　総ステビオール配糖体（Total Steviol Glycoside：ＴＳＧ）は、測定可能なステビオール配糖体の総称であり、未知のステビオール配糖体や、検出限界未満の量で存在するステビオール配糖体を含まない。好ましくは、ＴＳＧは、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＧ、ＲｅｂＩ、ＲｅｂＪ、ＲｅｂＫ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ、ＲｅｂＯ、ＲｅｂＱ、ＲｅｂＲ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド及びステビオシドからなる群より選択される２つ以上の任意の組み合わせである。特定の態様において、ＴＳＧは、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＧ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ及びステビオシドの組合せからなる。

　ステビオール配糖体は、本発明の植物体の新鮮葉又は乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより抽出液の状態で抽出することができる。抽出条件等はOhta et al., J. Appl. Glycosci., Vol. 57, No. 3, 199-209 (2010)又はWO2010/038911に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。乾燥葉とは、新鮮葉を乾燥させることにより含水量を１０重量％以下、７重量％以下、５重量％以下、４重量％以下、３重量％以下、２重量％以下、１重量％以下にまで減らしたものをいう。好ましくは、本発明の植物体の乾燥葉の含水量は３～４重量％である。
　さらに、このようにして得られた抽出液に対し、酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography：HPLC）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Time-of-Flight mass spectrometry：TOF-MS）、超高速液体クロマトグラフィー（Ultra (High) Performance Liquid chromatography：UPLC）等の公知の方法を用いることによりステビオール配糖体を精製することができる。

　本発明に係るステビオール配糖体含量は、上記Ohta et al.又はWO2010/038911に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法で測定することができる。具体的には、例えば、本発明のステビア植物体から新鮮葉をサンプリングし、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを行うことなどにより測定することができる。

　本発明の植物体には植物体全体のみならず、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）或いは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルス等が含まれ得る。葉は乾燥葉であってもよい。

　また、本発明の植物体には、組織培養物又は植物培養細胞も含まれ得る。このような組織培養物又は植物培養細胞を培養することにより、植物体を再生することができるからである。本発明の植物体の再生可能な形態の例としては、胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルス等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

２．本発明の植物体の作出方法
　本発明は、別の実施態様において、本発明のステビア植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、高ステビオール配糖体含有ステビア植物体を作出する方法（以下、「本発明の作出方法」という）を提供する。
　当該方法により作出される「高ステビオール配糖体含有ステビア植物体」は、本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的特徴を有する。

　具体的には、本発明の作出方法により作出される植物体の表現型は、本発明の植物体の項に記載した高ステビオール配糖体含有型の表現型である。本発明の作出方法により作出される植物体の遺伝的特徴は、本発明の遺伝的特徴を有することである。これらの遺伝的特徴の検出方法については、前述及び後述のとおりである。

　本発明の作出方法において、「交雑させる」とは、本発明の植物体と、第２の植物体とを交配させることにより、その子植物体（本発明の作出方法により作出される植物体）を得ることを意味する。交雑方法としては、戻し交雑が好ましい。「戻し交雑」とは、本発明の植物体と第２の植物体との間に生まれた子植物体を、さらに本発明の植物体（つまり、本発明の遺伝的特徴を有する植物体）と交雑させて、本発明の遺伝的特徴を有する植物体を作出する手法である。本発明の作出方法に用いられる第２の植物体が、本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的特徴を有する場合には、実質的に戻し交雑となる。交雑は二代以上に亘って行うことが好ましいが、遺伝的特徴がヘテロ接合性等の場合は、一代で所望の遺伝的特徴の組合せを有する植物体が得られることがある。

　或いは、本発明の植物体は自殖により作出することもできる。自殖は、本発明の植物体のおしべの花粉を本発明の植物体のめしべに自家受粉させることにより行うことができる。

　本発明の作出方法により作出される植物体は、表現型及び遺伝的特徴が本発明の植物体と同じであるため、本発明の作出方法により作出される植物体をさらに第３のステビア植物体と交雑させることにより、高ステビオール配糖体含有ステビア植物体を作出することも可能である。

　別の態様として、本発明の植物体は、先に述べた組織培養物又は植物培養細胞を培養することにより植物体を再生することで作出することも可能である。培養条件については、野生型ステビア植物の組織培養物又は植物培養細胞を培養する条件と同じであり、公知である（Protocols for In Vitro cultures and secondary metabolite analysis of aromatic and medicinal plants, Method in molecular biology, vol. 1391, pp113-123）。

　さらに別の態様として、本発明の植物体は、ステビア植物体のゲノムを改変し、本発明の遺伝的特徴を獲得させることで作出することも可能である。本発明の遺伝的特徴の獲得は、遺伝子組換的手法により行っても、上述のような非遺伝子組換的手法により行ってもよい。非遺伝子組換的手法は、本発明の植物体の項に記載した、変異誘発剤による処理や、放射線又は光線の照射による処理等の変異誘発処理を含む。具体的には、例えば、配列番号１の２９０位に相当する位置の塩基がＴではないアレル（例えば、前記位置の塩基がＣであるアレル）を有する個体に対しては、前記位置の塩基のＴへの置換、配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＡではないアレル（例えば、前記位置の塩基がＣであるアレル）を有する個体に対しては、前記位置の塩基のＡへの置換により本発明の遺伝的特徴を獲得させることができる。

３．本発明の植物体のスクリーニング方法
　本発明の植物体及び本発明の植物体と同じ表現型及び／又は遺伝的特徴を有する植物体は、被験植物体の組織から本発明の遺伝的特徴を検出することによりスクリーニングすることができる。ここで、「スクリーニング」とは、本発明の植物体とそれ以外の植物体とを識別し、本発明の植物体を選択することを意味する。
　したがって、本発明は、別の側面において、被験ステビア植物体のゲノムから、本発明の遺伝的特徴（１）の存在及び／又は不在と、本発明の遺伝的特徴（２）の存在及び／又は不在とを検出する工程を含む、高ステビオール配糖体含有ステビア植物体をスクリーニングする方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」と称する場合がある）を提供する。
　本発明のスクリーニング方法は、上記の少なくとも１つの遺伝的特徴の存在が検出された植物体を被験植物の中から選択する工程をさらに含んでもよい。

　本発明の遺伝的特徴の存在は、例えば、
・配列番号１の２９０位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号１、７、８又は９の塩基配列を含むアレル）のみの存在の検出、
・配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号２、１０、１１又は１２の塩基配列を含むアレル）の存在の検出、及び／又は、
・配列番号１の２９０位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号１３、１４、１５又は１６の塩基配列を含むアレル）の不在の検出、
により決定することができる。

　本発明の遺伝的特徴の不在は、例えば、
・配列番号１の２９０位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号１、７、８又は９の塩基配列を含むアレル）、及び
・配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号２、１０、１１又は１２の塩基配列を含むアレル）、
からなる群から選択されるアレルの不在の検出、及び／又は、
・配列番号１の２９０位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号１３、１４、１５又は１６の塩基配列を含むアレル）の存在の検出
により決定することができる。

　本発明の変異の検出方法の具体例としては、ＰＣＲ法、TaqMan PCR法、シーケンス法、マイクロアレイ法、インベーダー法、TILLING法、ＲＡＤ法、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ法、ＡＦＬＰ法、ＳＳＬＰ法、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法、ＡＳＯ法、ＡＲＭＳ法、ＤＧＧＥ法、ＣＣＭ法、ＤＯＬ法、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、パドロックプローブ法、分子ビーコン法、ＤＡＳＨ法、ＵＣＡＮ法、ＥＣＡ法、ＰＩＮＰＯＩＮＴ法、ＰＲＯＢＥ法、ＶＳＥＴ法、Survivor assay、Sniper assay、Luminex assay、ＧＯＯＤ法、ＬＣｘ法、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、Mass ARRAY法、パイロシーケンス法、ＳＮＰ－ＩＴ法、融解曲線分析法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

　ＰＣＲ法の場合、３’末端部分が本発明の遺伝的特徴に係る部位に相補的な配列を有するようなプライマーを作製することが好ましい。このように設計されたプライマーを用いると、鋳型となるサンプルが本発明の遺伝的特徴に係るアレルを有する場合には、プライマーが完全に鋳型にハイブリダイズするため、ポリメラーゼ伸長反応が進むが、鋳型が本発明の遺伝的特徴に係るアレルを有しない場合には、プライマーの３’末端のヌクレオチドが鋳型とミスマッチを生じるので、伸長反応は起こらない。したがって、このようなプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動等によって分析し、所定のサイズの増幅産物が確認できれば、サンプルである鋳型が本発明の遺伝的特徴に係るアレルを有していることになり、増幅産物が存在しない場合には、鋳型が本発明の遺伝的特徴に係るアレルを有していないものと判断できる。
　或いは、本発明の遺伝的特徴に係る部位とプライマー配列とは重複させず、かつ本発明の遺伝的特徴に係るアレルを含むヌクレオチド断片をＰＣＲ増幅させることが可能なようにプライマー配列を設計し、増幅されたヌクレオチド断片の塩基配列をシーケンスすることにより、本発明の遺伝的特徴を検出することができる。
　ＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動については、以下を参照：Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press。

　TaqMan PCR法とは、蛍光標識したアレル特異的オリゴとTaq DNAポリメラーゼによるPCR反応とを利用した方法である（Livak, K.J. Genet. Anal. 14, 143 (1999); Morris T. et al., J. Clin.Microbiol. 34, 2933 (1996)）。
　シーケンス法とは、遺伝的特徴に係る部位を含む領域をPCRにて増幅させ、Dye Terminator等を用いてＤＮＡ配列をシーケンスすることで、遺伝的特徴の有無を解析する方法である（Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
　ＤＮＡマイクロアレイは、ヌクレオチドプローブの一端が支持体上にアレイ状に固定されたものであり、ＤＮＡチップ、Geneチップ、マイクロチップ、ビーズアレイ等を包含する。本発明の遺伝的特徴を含む配列と相補的な配列を含むプローブを用いることで、網羅的に本発明の遺伝的特徴の有無を検出することができる。ＤＮＡチップ等のＤＮＡマイクロアレイアッセイとしてはGeneChipアッセイが挙げられる（Affymetrix社；米国特許第6,045,996号、同第5,925,525号、及び同第5,858,659号参照）。GeneChip技術は、チップに貼り付けたオリゴヌクレオチドプローブの小型化高密度マイクロアレイを利用するものである。

　インベーダー法とは、ＳＮＰ等の遺伝的特徴を有する又は有しないアレルのそれぞれに特異的な２種類のレポータープローブ及び１種類のインベーダープローブの鋳型ＤＮＡへのハイブリダイゼーションと、ＤＮＡの構造を認識して切断するという特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有するCleavase酵素によるＤＮＡの切断を組み合わせた方法である（Livak, K. J. Biomol. Eng. 14, 143-149 (1999); Morris T. et al., J. Clin.Microbiol. 34, 2933 (1996); Lyamichev, V. et al., Science, 260, 778-783 (1993)等）。
　TILLING（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes）法とは、変異導入した変異体集団のゲノム中の変異ミスマッチをＰＣＲ増幅とＣＥＬ　Ｉヌクレアーゼ処理によってスクリーニングする方法である。

　一態様において、本発明の遺伝的特徴（１）は、例えば、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
・プライマーセット：
　配列番号１の２８９位より５’側に位置する任意の連続する１５塩基以上の配列（例えば、配列番号２１）を含むフォワードプライマーと、配列番号２２～２４から選択される配列の３’末端から１５～３６塩基長の連続する配列を含むリバースプライマーとを含む、プライマーセット。
・制限酵素：
　配列番号２２に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＲｓａＩ、配列番号２３に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＳｎａＩ、配列番号２４に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＡｌｕＩをそれぞれ含む。

　一態様において、本発明の遺伝的特徴（２）は、例えば、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
・プライマーセット：
　配列番号２５～２７から選択される配列の３’末端から１５～４８塩基長の連続する配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２９の４９位より３’側に位置する任意の連続する１５塩基以上の配列（例えば、配列番号２８）を含むリバースプライマーとを含む、プライマーセット。
・制限酵素：
　配列番号２５に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＳｐｅＩ又はＭａｅＩ、配列番号２６に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＡｆｌＩＩ／ＭｓｅＩ、配列番号２７に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＢｓｐＨＩをそれぞれ含む。

　プライマーの配列は、上記の条件を満たす範囲で最適化することができる。プライマー設計の最適化については、例えば、Sambrook and Russell, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 3rd Edition (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press等を参照のこと。上記各プライマーは、１５～５０塩基長、１８～４８塩基長、２０～４５塩基長、３０～４０塩基長等であってよい。各プライマーセットに対応する制限酵素には、上記酵素と同じ配列を認識し、同じ個所を切断する他の酵素、又は上記酵素のアイソシゾマーも含まれる。また、本発明の遺伝的特徴に基づき、上記以外のプライマーセットを設計し、それに対応する制限酵素を選択することも可能である。

　特定の態様において、本発明の遺伝的特徴は、例えば、以下の配列を有するプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。

　なお、上記プライマーセットと制限酵素との組合せは一例にすぎず、当業者であれば、本発明の遺伝的特徴を検出し得る他のプライマーセットと制限酵素との組合せを見出すことができる。

　本発明のスクリーニング方法は、本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物組織（例えば葉）のステビオール配糖体の含有量（例えば、ＴＳＧの含有量）を測定する工程をさらに含んでもよい。ステビオール配糖体含有量の測定は、本発明の植物体の項に記載したとおりである。また、この態様において、本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物体のうち、ステビオール配糖体の含有量が高い個体を選択して、これを他のステビア植物体と交配し、得られた子植物体について、本発明のスクリーニング方法を適用してもよい。したがって、本発明のスクリーニング方法は、以下の１以上の工程を含み得る。
（ｉ）被験ステビア植物のゲノムから、本発明の遺伝的特徴を検出する工程、
（ｉｉ）本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物組織のステビオール配糖体の含有量を測定する工程、
（ｉｉｉ）本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物体のうち、ステビオール配糖体の含有量が高い個体を選択する工程、
（ｉｖ）選択したステビオール配糖体の含有量が高い個体を他のステビア植物体と交配する工程、
（ｖ）交配により得られた子植物体のゲノムから、本発明の遺伝的特徴を検出する工程、
（ｖｉ）本発明の遺伝的特徴が検出された子植物組織のステビオール配糖体の含有量を測定する工程、
（ｖｉｉ）本発明の遺伝的特徴が検出された子植物体のうち、ステビオール配糖体の含有量が高い個体を選択する工程。

　選択するステビオール配糖体の含有量が高い個体は、例えば、本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物体のうち、ステビオール配糖体の含有量の高さに関し上位５０％まで、上位４０％まで、上位３０％まで、上位２０％まで、上位１０％まで、上位５％まで、上位４％まで、上位３％まで、上位２％まで又は上位１％までの個体等であってよい。また、交配する他のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴を含んでいても含んでいなくてもよい。上記態様において、工程（ｉｖ）～（ｖｉｉ）は、複数回繰り返すことができる。このようにして、ステビオール配糖体の含有量がより高いステビア植物体をスクリーニングすることができる。

　本発明のスクリーニング方法において、被験ステビア植物体は、天然植物体であっても、非遺伝子組換植物体であってもよい。非遺伝子組換植物体については、本発明の植物体の項に記載したとおりである。
　本発明のスクリーニング方法において、被験ステビア植物体は、変異誘発処理を行ったステビア植物及びその子孫植物を含んでもよい。変異誘発処理については、本発明の植物体の項に記載したとおりであり、変異誘発剤による処理や、放射線又は光線の照射による処理等を含む。

　また本発明は、上記に記載されたプライマーセット又はその組合せ、例えば、上記表１～２に記載のプライマーセット、及び、上記表１に記載の遺伝的特徴（１）を検出するプライマーセットと、上記表２に記載の遺伝的特徴（２）を検出するプライマーセットとの組合せを提供する。本発明は、さらに、配列番号１、２、１３及び１７からなる群から選択される塩基配列を有する領域をＰＣＲにより増幅し得るプライマーセット、例えば、配列番号３の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号５の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号６の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセットを提供する。本発明は、さらにまた、配列番号１又は１３の塩基配列を有する領域をＰＣＲにより増幅し得るプライマーセットと、配列番号２又は１７の塩基配列を有する領域をＰＣＲにより増幅し得るプライマーセットとの組合せ、例えば、配列番号３の塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号４の塩基配列を含むリバースプライマーのプライマーセットと、配列番号５の塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号６の塩基配列を含むリバースプライマーのプライマーセットとの組合せを提供する。

　さらに、本発明は、本発明の遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出し得るプローブ（以下、「本発明のプローブ」と称する場合がある）を提供する。本発明のプローブは、本発明の遺伝的特徴の存在及び／又は不在の各種検出方法（例えば、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法等のリアルタイムＰＣＲ法）に適した構造を有し得る。例えば、本発明のプローブは、本発明の遺伝的特徴に係る部位を含むゲノムの部分に相補性を有する塩基配列を含み得る。かかるプローブの非限定例としては、配列番号７～１２、１４～１６、１８～２０から選択される塩基配列に相補的な配列を含むものが挙げられる。これらの配列のうち、配列番号７～１２は本発明の遺伝的特徴に係るアレルに特異的であり、配列番号１４～１６、１８～２０は、本発明の遺伝的特徴に係るアレルではないアレルに特異的である。また、配列番号７～９は本発明の遺伝的特徴（１）に係るアレルに特異的であり、配列番号１０～１２は本発明の遺伝的特徴（２）に係るアレルに特異的である。さらに、配列番号１４～１６は本発明の遺伝的特徴（１）に係るアレルではないアレルに特異的であり、配列番号１８～２０は本発明の遺伝的特徴（２）に係るアレルではないアレルに特異的である。本発明の遺伝的特徴の存在は、本発明の遺伝的特徴に係るアレルの検出及び／又は本発明の遺伝的特徴に係るアレルではないアレルの非検出により検出することができ、本発明の遺伝的特徴の不在は、本発明の遺伝的特徴に係るアレルの非検出及び／又は本発明の遺伝的特徴に係るアレルではないアレルの検出により検出することができる。本発明のプローブは、好ましくは標識を有する。かかる標識の非限定例としては、蛍光標識、発光標識、放射性標識、色素、酵素、クエンチャー、検出可能な標識との結合部分等が挙げられる。特定の態様において、本発明のプローブは、配列番号７～１２、１４～１６、１８～２０から選択される配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドと、標識とを有する。

　本発明はまた、上記のプライマーセットとこれに対応する制限酵素とを含むキットを提供する。特定の態様において、本発明のキットは前記表１～２に記載のフォワードプライマーとリバースプライマーとの組合せを含むプライマーセットと、これに対応する制限酵素とを含む。
　本発明のキットはまた、配列番号１、２、１３及び１７からなる群から選択される塩基配列を有する領域をＰＣＲにより増幅し得るプライマーセットと、それに対応する上記の本発明のプローブとを含む。

　これらのプライマーセット、プローブ及びキットは、本発明の遺伝的特徴を検出するために用いること、本発明のスクリーニング方法に用いることなどが可能である。また、これらのプライマーセット及びキットには、本発明の遺伝的特徴の検出や、本発明のスクリーニング方法に関する説明を含む指示、例えば、使用説明書や、使用方法に関する情報を含むサイトの情報（例えば、ＵＲＬ、二次元コード）、使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリー等が含まれていてもよい。

　一部の態様において、本発明は、遺伝的特徴（１）の存在及び／又は不在を検出するための試薬と、遺伝的特徴（２）の存在及び／又は不在を検出するための試薬とを含む、高ステビオール配糖体含有ステビア植物体のスクリーニングキットを提供する。試薬は、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法に使用するプライマー及び／又はプローブを含み得る。特定の態様において、遺伝的特徴（１）の存在及び／又は不在を検出するための試薬は、上記の遺伝的特徴（１）をｄＣＡＰＳ法で検出するためのプライマーセットと制限酵素との組合せ、例えば表１に記載のプライマーセットと制限酵素との組合せ、又は、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法等で使用することができる、遺伝的特徴（１）に係る部位（例えば、配列番号７～９から選択される配列を含む部位）を増幅するプライマーセットと、遺伝的特徴（１）に係る部位に相補的なプローブとの組合せを含む。特定の態様において、遺伝的特徴（２）の存在及び／又は不在を検出するための試薬は、上記の遺伝的特徴（２）をｄＣＡＰＳ法で検出するためのプライマーセットと制限酵素との組合せ、例えば表２に記載のプライマーセットと制限酵素との組合せ、又は、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法等で使用することができる、遺伝的特徴（２）に係る部位（例えば、配列番号１０～１２から選択される配列を含む部位）を増幅するプライマーセットと、遺伝的特徴（２）に係る部位に相補的なプローブとの組合せを含む。

４．植物体由来抽出物の製造方法及び当該抽出物を用いた製品
　本発明のさらなる態様において、本発明の植物体、本発明のスクリーニング方法により選別されたステビア植物体若しくは本発明の作出方法により製造されたステビア植物体、又は当該植物体の種子、葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）、組織、組織培養物若しくは細胞から抽出物を得る工程を含む、ステビオール配糖体（例えば、ＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭ）を含有する抽出物の製造方法（以下、「本発明の抽出物の製造方法」と称する場合がある）が提供される。

　さらに、本発明の植物体、本発明のスクリーニング方法により選別されたステビア植物体若しくは本発明の作出方法により製造されたステビア植物体、又は当該植物体の種子、葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）、組織、組織培養物若しくは細胞からのステビオール配糖体（例えば、ＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭ）を含有する抽出物（以下、「本発明の抽出物」と称する場合がある）が提供される。本発明の抽出物は、好適には、本発明の抽出物の製造方法により製造されたものである。さらにまた、本発明の抽出物からステビオール配糖体（例えば、ＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭ）を精製する工程を含む、ステビオール配糖体の製造方法（以下、「本発明のステビオール配糖体の製造方法」と称する場合がある）が提供される。本発明のステビオール配糖体の製造方法は、本発明のステビア植物体、本発明のスクリーニング方法により選別されたステビア植物体又は本発明の作出方法により製造されたステビア植物体からステビオール配糖体を含む抽出物を得る工程をさらに含んでもよい。

　ステビオール配糖体を含む抽出物は、本発明の植物体の新鮮葉又は乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより得ることができる。抽出条件等は上記Ohta et al.又はWO2010/038911に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
　また、ステビオール配糖体を含む抽出物を酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography:HPLC）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Time-of-Flight mass spectrometry:TOF-MS）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ultra (High) Performance Liquid chromatography:UPLC）等の公知の方法を用いることにより個々のステビオール配糖体を精製することができる。ステビオール配糖体の例は、本発明の植物体の項に記載したとおりである。

　本発明の抽出物の製造方法により得られた抽出物（以下、「本発明の抽出物」という）の一態様は、本発明の遺伝的特徴を有しないステビア植物体の抽出物と比べ、ステビオール配糖体をより高い含量で含む。
　本発明の抽出物は、本発明の遺伝的特徴を有しないステビア植物体から得られた抽出物と比べステビオール配糖体を５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１１％以上、１２％以上、１３％以上、１４％以上、１５％以上、１６％以上、１７％以上、１８％以上、１９％以上、２０％以上、２１％以上、２２％以上、２３％以上、２４％以上、２５％以上、２６％以上、２７％以上、２８％以上、２９％以上、３０％以上、３１％以上、３２％以上、３３％以上、３４％以上、３５％以上高い含量で含んでいてもよい。ここで、本発明の抽出物と、本発明の遺伝的特徴を有しないステビア植物体から得られた抽出物は、同じ方法で得られたものであってよい。

　このようにして得られた本発明の抽出物及び／又は本発明のステビオール配糖体精製品の製造方法により得られるステビオール配糖体精製品（例えば、ＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭ）と他の成分とを混合することにより、ステビオール配糖体を含む飲食品、甘味料組成物、香料又は医薬品を製造することができる。そこで、本発明は、別の実施態様として、本発明の抽出物及び／又は本発明のステビオール配糖体精製品の製造方法により得られるステビオール配糖体精製品と他の成分とを混合する工程を含む、飲食品、甘味料組成物、香料又は医薬品の製造方法を提供する。さらに、本発明は、前記製造方法により得られた、ステビオール配糖体を含む飲食品、甘味料組成物、香料又は医薬品を提供する。ここで飲食品は、飲料及び食品を含む。したがって、ある実施態様では、本発明は飲料、食品、甘味料組成物、香料又は医薬品を提供し、また、当該飲料、食品、甘味料組成物、香料又は医薬品の製造方法を提供する。

５．本発明の植物体に係る塩基配列
　本発明は、別の態様において、本発明のステビア植物体に係る塩基配列を提供する。
　遺伝的特徴（１）を有するステビア植物体に係る塩基配列は、配列番号１、７、８及び９から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。遺伝的特徴（２）を有するステビア植物体に係る塩基配列は、配列番号２、１０、１１及び１２から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。本発明の遺伝的特徴を有するステビア植物体に係る塩基配列は、配列番号１、７、８及び９から選択される塩基配列と、配列番号２、１０、１１及び１２から選択される塩基配列との組合せを含む、又はそれからなる。

　以下に本発明に関する実験例、実施例等を記載するが、本発明はこれらの具体的な態様に限定されるものではない。

（１）ステビオール配糖体高含有集団の創出
　野生型ステビア種子（市販品種）に対してエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）処理を行い、これをサントリーワールドリサーチセンター内温室にて播種、栽培した。成長した各個体より適量の新鮮葉をサンプリングし、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（島津LCMS8050）にてステビオール配糖体の濃度を定量した。具体的には、０．２５ｇの新鮮葉をフリーズドライにより乾燥し、破砕乾物０．０５ｇを１００倍量（５ｍＬ）の純水中に投入した。超音波処理２０分にて抽出し、遠心・濾過した後、３２％アセトニトリルで６０倍希釈したものをサンプル液とした。このサンプル液１ｍＬをLCMS8050のＭＲＭモードにてＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行い、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ、ＲｅｂＯ及びステビオシドの濃度を定量し、その合計濃度が約５～２０％の個体を選別して交配し、種子を得た。このような選別を４世代にわたって繰り返し、集団Ａを得た。

（２）高ステビオール配糖体含有個体の遺伝子解析
　集団Ａの各個体より適量の新鮮葉をサンプリングし、上記（１）と同様にＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（島津LCMS8050）にてＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＧ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ及びステビオシド（ＴＳＧ）の濃度を定量した。また、一部の個体の新鮮葉からゲノムＤＮＡを抽出し、シーケンサー（HiSeq 2500、Illumina）により遺伝子解析を行った。その結果、本発明の遺伝的特徴を有する個体群のＴＳＧ含量の平均値が、本発明の遺伝的特徴を有しない個体、集団Ａの全個体、さらには、遺伝的特徴（２）を有する個体のＴＳＧ含量の平均値より高い傾向が認められた。そこで、遺伝的特徴の検出を効率化すべく、遺伝的特徴（１）及び（２）を検出するためのｄＣＡＰＳプライマーを作製し、残りの個体についてこれらの遺伝的特徴の有無をｄＣＡＰＳ法により評価した。

　ｄＣＡＰＳプライマー及び制限酵素は、以下のものを使用した。

　ｄＣＡＰＳ法による各遺伝的特徴の検出は以下のように行った。まず、各個体の新鮮葉からゲノムＤＮＡを抽出し、各遺伝的特徴に対応する上記ｄＣＡＰＳプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に各遺伝的特徴に対応する上記制限酵素を添加し、３７℃で酵素反応を行った。マイクロチップ型電気泳動装置LabChip GX Touch HT（PerkinElmer）により制限酵素処理物の電気泳動を行い、得られたバンドパターンに基づいて遺伝的特徴の有無を判定した。具体的には、ホモ接合性である遺伝的特徴（１）については、分解産物のバンドのみが認められた個体を遺伝的特徴あり、ホモ又はヘテロ接合性である遺伝的特徴（２）については、非分解物のバンドが認められた個体を遺伝的特徴ありと判定した。

　表４及び図３に示す結果からシーケンスで認められた傾向が確認された。すなわち、本発明の遺伝的特徴を有する個体群のＴＳＧ含量の平均値は、本発明の遺伝的特徴を有しない個体、集団Ａの全個体、さらには、遺伝的特徴（２）を有する個体のＴＳＧ含量の平均値のそれぞれに対し、４３．５％、２７．４％及び７．２％高かった。また、遺伝的特徴（２）は甘味成分高含有型ステビア植物体の選抜用マーカーとして知られているが（特許文献３）、本発明の遺伝的特徴（１）を組み合わせることで、よりＴＳＧ含量の高い個体を選抜できることが分かる。

　本発明によってステビオール配糖体がより効率的に提供可能になるので、ステビオール配糖体を十分な量含むことによって上質な味質の飲食品、甘味料組成物、香料又は医薬品等を提供することができる。

Claims

　被験ステビア植物体のゲノムから、以下の遺伝的特徴（１）の存在及び／又は不在と、以下の遺伝的特徴（２）の存在及び／又は不在とを検出する工程を含む、高ステビオール配糖体含有ステビア植物体をスクリーニングする方法。
（１）配列番号１の２９０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性又はヘテロ接合性である。
　遺伝的特徴の存在及び／又は不在が検出された被験ステビア植物組織のステビオール配糖体の含有量を測定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
　高ステビオール配糖体含有ステビア植物体のステビオール配糖体含有量が、遺伝的特徴（２）の存在及び／又は不在とを検出する工程を含むが、遺伝的特徴（１）の存在及び／又は不在を検出する工程を含まないスクリーニング方法で選択されたステビア植物体のステビオール配糖体含有量より３％以上高い、請求項１又は２に記載の方法。
　遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出する工程が、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法を用いて行われる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
　以下の遺伝的特徴（１）の存在及び／又は不在を検出するための試薬と、以下の遺伝的特徴（２）の存在及び／又は不在を検出するための試薬とを含む、高ステビオール配糖体含有ステビア植物体のスクリーニングキット。
（１）配列番号１の２９０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性又はヘテロ接合性である。
　試薬が、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法に使用するプライマー及び／又はプローブを含む、請求項５に記載のキット。
　以下の遺伝的特徴（１）及び（２）を有する、高ステビオール配糖体含有ステビア植物体。
（１）配列番号１の２９０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性又はヘテロ接合性である。
　非遺伝子組換植物体である、請求項７に記載の植物体。
　変異誘発処理を行ったステビア植物体及びその子孫植物体を含む、請求項７又は８に記載の植物体。
　請求項７～９のいずれか一項に記載の植物体の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞。
　胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスから選択される、請求項１０に記載の組織、組織培養物又は細胞。
　請求項７～９のいずれか一項に記載のステビア植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、高ステビオール配糖体含有ステビア植物体を作出する方法。
　第２の植物体が請求項７～９のいずれか一項に記載のステビア植物体である、請求項１２に記載の方法。
　ステビア植物体のゲノムに、前記ゲノムが以下の遺伝的特徴（１）及び（２）を有するように改変を加える工程を含む、高ステビオール配糖体含有ステビア植物体を作出する方法。
（１）配列番号１の２９０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性又はヘテロ接合性である。
　ゲノムの改変が、変異誘発処理によって行われる、請求項１４に記載の方法。
　ステビオール配糖体を含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の植物体、請求項１０又は１１に記載の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞の抽出物。
　請求項７～９のいずれか一項に記載の植物体、請求項１０又は１１に記載の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞から抽出物を得る工程を含む、ステビオール配糖体含有抽出物の製造方法。
　請求項１６に記載の抽出物からステビオール配糖体を精製する工程を含む、ステビオール配糖体の製造方法。
　請求項７～９のいずれか一項に記載の植物体の抽出物、請求項１０又は１１に記載の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞の抽出物、或いは、請求項１６に記載の抽出物を提供する工程、及び
前記抽出物を、飲食品、甘味料組成物、香料又は医薬品の原料に添加する工程
を含む、飲食品、甘味料組成物、香料又は医薬品の製造方法。