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WO2021117900A1 - 組成物およびその用途 - Google Patents

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WO2021117900A1
WO2021117900A1 PCT/JP2020/046426 JP2020046426W WO2021117900A1 WO 2021117900 A1 WO2021117900 A1 WO 2021117900A1 JP 2020046426 W JP2020046426 W JP 2020046426W WO 2021117900 A1 WO2021117900 A1 WO 2021117900A1
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WO
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composition
promoting
cells
function
composition according
Prior art date
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PCT/JP2020/046426
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English (en)
French (fr)
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靖子 間
智元 井上
真 佐竹
智大 重盛
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Megakaryon Corp
Original Assignee
Megakaryon Corp
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Publication date
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Priority to CN202080086634.7A priority patent/CN114829584B/zh
Priority to JP2021564075A priority patent/JPWO2021117900A1/ja
Priority to US17/785,009 priority patent/US20230046238A1/en
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells

Definitions

  • the present invention relates to a composition and its use.
  • tissue regeneration such as mesenchymal stem cells
  • cell preparations as therapeutic agents for regenerative medicine.
  • cells that promote tissue regeneration promote tissue regeneration by releasing proteins having physiological activities such as growth factors.
  • an object of the present invention is to provide a composition having cell-derived physiological activity.
  • composition of the present invention comprises a processed product of megakaryocytes or a culture thereof.
  • the cell growth-promoting composition of the present invention (hereinafter, also referred to as “proliferation-promoting composition”) includes the composition of the present invention.
  • the fibroblast function promoting composition of the present invention contains the composition of the present invention.
  • composition for promoting healing of skin disorders of the present invention includes the composition of the present invention.
  • the function-promoting composition for keratinocytes of the present invention includes the composition of the present invention.
  • the function-promoting composition for dermal papilla cells of the present invention includes the composition of the present invention.
  • the hair growth promoting composition of the present invention includes the composition of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of the enrichment system according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is a graph showing the proliferative activity of cells in Example 1, (A) shows a relative value of proliferative activity, and (B) shows a doubling time.
  • FIG. 3 is a graph showing the proliferative activity of cells in Example 2, (A) shows a relative value of proliferative activity, and (B) shows a doubling time.
  • FIG. 4 is a graph showing the proliferative activity of fibroblasts in Example 3.
  • FIG. 5 is a graph showing the amount of type I collagen produced in Example 3.
  • FIG. 6 is a graph showing the amount of hyaluronic acid produced in Example 3.
  • FIG. 7 is a photograph showing a phase difference image of cells in Example 4.
  • FIG. 8 is a graph showing the proliferative activity of keratinocytes in Example 4.
  • FIG. 9 is a graph showing the expression level of the FLG gene in Example 4.
  • FIG. 10 is a graph showing the expression level of the SPTLC1 gene in Example 4.
  • FIG. 11 is a graph showing the proliferative activity of dermal papilla cells in Example 5.
  • FIG. 12 is a graph showing the expression level of the FGF7 gene in Example 5.
  • FIG. 13 is a graph showing the expression level of the VEGFA gene in Example 5.
  • compositions of the present invention include treated megakaryocytes or cultures thereof, as described above.
  • the composition of the present invention is characterized by containing a processed product of megakaryocytes or a culture thereof, and other configurations and conditions are not particularly limited.
  • a composition having cell-derived physiological activity can be provided.
  • cell proliferation of mesenchymal cells, fibroblasts, keratinocytes, dermal papilla cells and the like can be promoted, and skin ulcers, pressure ulcers, burns, scars, wounds and skin. It is expected that it can be suitably used for promoting healing of skin disorders such as aging, maintaining or improving the barrier function of the skin, and hair growth.
  • megakaryocyte is the largest cell existing in bone marrow in the living body, and means a cell that releases platelets and a cell having an equivalent function.
  • the cell having the same function means a cell having an ability to produce platelets.
  • the megakaryocytes may be pre-polynuclear (polyploid) megakaryocytes, that is, immature megakaryocytes or proliferative megakaryocytes, or post-polynuclear megakaryocytes (multinucleated megakaryocytes). But it may be.
  • the megakaryocyte may be, for example, a pre-megakaryocyte, a megakaryocyte, a pre-megakaryocyte, or a mature megakaryocyte.
  • the number of sets of chromosomes contained in the megakaryocytes after multinucleation may exceed 2 sets, and as a specific example, 16 to 32 sets.
  • the origin of the megakaryocytes is not particularly limited, and examples thereof include humans and non-human animals.
  • the non-human animal include primates such as monkeys, gorillas, chimpanzees and marmosets, mice, rats, dogs, cats, rabbits, sheep, horses and guinea pigs.
  • the origin of other cells is the same.
  • the megakaryocytes can be identified by cell surface markers.
  • the cell surface markers include CD41a, CD42a and CD42b. That is, the megakaryocytes are cells positive for CD41a, CD42a and CD42b.
  • the cell surface marker is at least one selected from the group consisting of, for example, CD9, CD61, CD62p, CD42c, CD42d, CD49f, CD51, CD110, CD123, CD131, and CD203c. There may be.
  • the megakaryocytes may be megakaryocytes isolated from a living body, or may be megakaryocytes derived from cells undifferentiated from megakaryocytes such as pluripotent cells (hereinafter, also referred to as “progenitor cells”).
  • the "cell undifferentiated from megakaryocytes” means a cell capable of differentiating into the megakaryocyte.
  • the megakaryocyte When the megakaryocyte is a megakaryocyte isolated from a living body, the megakaryocyte can be isolated from the bone marrow because it exists in the bone marrow, for example. In this case, the megakaryocyte may contain other cells derived from the living body.
  • the megakaryocyte When the megakaryocyte is a megakaryocyte derived from a progenitor cell, the megakaryocyte can be induced in vitro as described later.
  • the megakaryocytes may contain the progenitor cells.
  • the progenitor cells include hematopoietic stem cells, hematopoietic progenitor cells, CD34-positive cells, megakaryocyte-erythroid progenitor (MEP), and megakaryocyte progenitor cells.
  • the precursor cells may be isolated from, for example, bone marrow, umbilical cord blood, peripheral blood, etc., ES cells (embryonic stem cells), artificial pluripotent stem cells (iPS cells), etc. It may be derived from pluripotent cells such as nuclear transplanted ES cells (ntES cells), reproductive stem cells, somatic stem cells, and embryonic tumor cells.
  • the megakaryocyte is preferably an immortalized megakaryocyte.
  • the immortalized megakaryocytes have higher homogeneity in the cell differentiation stage than, for example, megakaryocytes induced by other methods of inducing megakaryocytes, and thus suppress fluctuations in the component composition in the obtained processed product. it can.
  • the immortalized megakaryocytes are, for example, megakaryocytes induced by introducing an oncogene and a polycombe gene, or an oncogene, a polycombe gene, and an apoptosis suppressing gene into the precursor cells, as described later.
  • the "oncogene” means a gene capable of inducing canceration of cells in vivo, and for example, MYC family genes such as c-MYC, N-MYC, and L-MYC, SRC family genes, and RAS family genes.
  • MYC family genes such as c-MYC, N-MYC, and L-MYC
  • SRC family genes such as c-MYC, N-MYC, and L-MYC
  • RAS family genes examples include protein kinase family genes such as RAF family genes, c-kit (CD117), PDGFR (platelet growth factor receptor), and Abl (Abelson murine leukemia viral oncogene homolog).
  • the "polycomb gene” means a gene known to negatively regulate CDKN2a (cyclin-dependent kinase inhibition 2A, INK4a / ARF) and function to avoid cell aging (references 1 to 3 below). ).
  • the polycomb gene includes, for example, BMI1 (Polycomb complex protein BMI-1, polycomb group RING finger protein 4 (PCGF4), RING finger protein 51 (RNF51)), Mel18 (Polycomb group RING finger protein 2), Ring.
  • the "apoptosis-suppressing gene” means a gene having a function capable of suppressing cell apoptosis, for example, BCL2 (B-cell lymphoma 2), Bcl-xL (B-cell lymphoma-extra large), Survivin (Baculoviral). IAPRepeatContaining5), MCL1 (BCL2FamilyApoptosisRegulator), etc.
  • the immortalized megakaryocyte is preferably a megakaryocyte containing an exogenous BMI1 gene, a MYC gene, and a Bcl-xL gene.
  • the "foreign" means that it was introduced into the cell from the outside of the cell.
  • the exogenous gene may be present on the chromosome of the cell or in the nucleus or cytoplasm.
  • the exogenous gene can be detected, for example, by measuring the number of the gene.
  • the gene is a gene on an autosomal chromosome, one gene is present on each autosomal chromosome, so that one cell has two genes. Therefore, in the absence of the exogenous gene, two of the genes are detected in one cell.
  • the exogenous gene when the exogenous gene is present, three or more of the genes are detected in one cell.
  • the exogenous gene can be detected using, for example, PCR using primers, a probe, or a combination thereof.
  • the detection of the exogenous gene may be carried out by the detection of the tag sequence or the detection of the selectable marker.
  • the exogenous gene can be detected, for example, by using an antibody or the like against a protein translated from the gene.
  • the culture of megakaryocytes is, for example, a culture produced by culturing the megakaryocytes.
  • the culture of the megakaryocytes can be carried out, for example, by culturing the megakaryocytes in the presence of a medium, as described later.
  • the culture of the megakaryocytes is obtained by culturing the megakaryocytes, for example, it is a mixture containing the megakaryocytes and platelets produced from the megakaryocytes as cell components.
  • the cellular components mean cells and platelets.
  • the megakaryocytes can be derived from cells that are less differentiated than the megakaryocytes. Therefore, when the megakaryocytes for producing the culture of the megakaryocytes include megakaryocytes derived from cells undifferentiated from the megakaryocytes, the culture of the megakaryocytes is undifferentiated from the megakaryocytes. Cells may be included.
  • the culture of the megakaryocytes may be the culture itself obtained by culturing the megakaryocytes, or may be a processed product of the culture.
  • Processing of the culture includes, for example, removal of a liquid fraction, extraction of a cellular component fraction, modification of the composition of cellular components including platelets, and the like.
  • Changes in the composition of the cellular components include, for example, removal of cells and / or platelets in the mixture, extraction of cells and / or platelets in the mixture, addition of cells and / or platelets to the mixture, and the like.
  • the "platelet” is one of the cellular components in blood and means a cellular component that is positive for CD41a and CD42b.
  • the platelets for example, do not have a cell nucleus and are smaller in size than the megakaryocytes. Therefore, the platelets and the megakaryocytes can be distinguished by, for example, the presence and / or size of cell nuclei. It is known that the platelets play an important role in thrombus formation and hemostasis, and are also involved in the pathophysiology of tissue regeneration and inflammation after injury.
  • the treated product may be prepared from the megakaryocytes or may be prepared from a culture of the megakaryocytes.
  • the culture of the megakaryocytes may be processed.
  • the processed product may be, for example, a processed product of a cell fraction or a liquid fraction of the megakaryocyte or a culture thereof, or a processed product of a processed product obtained by processing the megakaryocyte or the culture thereof. ..
  • the treatment in the preparation of the treated product is not particularly limited, and for example, a treatment for changing the density of cellular components such as a concentration treatment, a separation treatment or a purification treatment; a drying treatment, a freezing treatment, a freeze-drying treatment, a solvent treatment, a surface activity Extraction treatment for extracting cell components such as agent treatment, enzyme treatment, and protein fraction extraction treatment; crushing treatment such as grinding treatment and crushing treatment; and the like can be mentioned.
  • Specific examples of the treated product include, for example, a concentrate, a dried product, a frozen product, a freeze-dried product, a solvent-treated product, a surfactant-treated product, an enzyme-treated product, and a protein fraction of the macronuclear sphere or a culture thereof.
  • Extracts such as ultrasonically treated products; crushed products such as ground products and crushed products; concentrates, dried products, frozen products, lyophilized products, solvents of cell fractions of the macronuclear cells or their cultures. Examples thereof include treated products, surfactant-treated products, enzyme-treated products, protein fractions, extracts of ultrasonically treated products; crushed products such as crushed products and crushed products; and the like.
  • the processed product may be composed of one type of processed product, or may be a mixture of two or more types of processed products. The mixture is not particularly limited, and may be a mixture mixed in any combination and ratio of processed products.
  • the treated product comprises, for example, one or more growth factors and at least one of the growth factor receptors.
  • the treated product has physiological activities such as cell growth promoting activity.
  • the treated product can be produced, for example, by treating the megakaryocytes or a culture thereof, as described above. Therefore, in the present invention, the processed product can be defined by using, for example, the following conditions (1) to (3).
  • the processed product may be specified by any of the following conditions (1) to (3), may be specified by a plurality of conditions, or may be specified by all conditions. As a specific example, the processed product can be defined by, for example, a combination of conditions.
  • condition (1) Content of growth factor and / or growth factor receptor; (2) Biological activity of the treated product; (3) Manufacturing method of processed product (combination of conditions) Conditions (1), (2), or (3); Conditions (1) and (2), conditions (1) and (3), or conditions (2) and (3); Conditions (1), (2), and (3)
  • Condition (1) is a condition relating to the content of growth factor and / or growth factor receptor as described above.
  • the condition (1) may define the content of the growth factor or the content of the growth factor receptor, or may define the content of the growth factor and the content of the growth factor receptor. Good.
  • the growth factor used in the regulation of the above condition (1) may be one kind or two or more kinds.
  • the growth factor receptor used in the regulation of the above condition (1) may be one kind or two or more kinds.
  • the growth factors are basic fibroblast growth factor (bFGF), insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1), and insulin-like growth factor-binding protein-2 (IGFBP-2).
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • IGFBP-1 insulin-like growth factor-binding protein-1
  • IGFBP-2 insulin-like growth factor-binding protein-2
  • IGFBP-3 Insulin-like growth factor-binding protein-3
  • IGFBP-6 insulin-like growth factor-binding protein-6
  • PIGF insulin-like growth factor-binding protein-6
  • PIGF insulin-like growth factor-binding protein-6
  • PIGF insulin-like growth factor-binding protein-6
  • PIGF placenta growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • EG-VEGF endocrine gland-derived vascular endothelial growth Factors
  • GDF-15 Differentiation Growth Factor-15
  • Amphiregulin AR
  • BMP-5 Bone Forming Protein-7
  • examples of the growth factor receptor include stem cell factor receptor (SCFR), epidermal growth factor receptor (EGFR), vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2), and the like.
  • SCFR stem cell factor receptor
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • VEGFR2 vascular endothelial growth factor receptor 2
  • the content may be, for example, the weight of each growth factor and each growth factor receptor in the treated product, or the weight of each growth factor and each growth factor receptor relative to the weight of the total protein of the treated product (per total protein). Content), but the latter is preferred.
  • the weight of the total protein can be determined, for example, by the BCA protein quantification method.
  • the BCA protein quantification method is a protein quantification method using a coordination bond between a monovalent copper ion and two molecules of bicinchoninic acid.
  • the sample used in the BCA protein quantification method preferably does not contain, for example, a reducing agent and / or a copper ion chelating agent.
  • the BCA protein quantification method can be carried out according to Reference 4 below, and for example, a commercially available kit or the like may be used.
  • As the kit for the BCA protein quantification method Pierce TM BCA Protein Assay Kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific) and the like can be used.
  • Reference 4 Shunji Hase et al., "Protein Science Experimental Method Based on Easy Principles 1 Extraction / Purification and Synthesis of Proteins", Chemistry Doujin, December 13, 2008
  • the total protein concentration in the treated product can be appropriately set, for example, depending on the number of cells to be treated and the volume of the solvent in the treated product.
  • the total protein concentration in the treated product is, for example, the total protein concentration in the treated product by increasing the number of cells to be subjected to the treatment, reducing the volume of the solvent in the treated product, or extracting from the megakaryocytes. Can be relatively high.
  • the total protein concentration in the treated product is, for example, by reducing the number of cells subjected to the treatment, increasing the volume of the solvent in the treated product, or extracting from the culture of megakaryocytes.
  • the total protein concentration in is relatively low.
  • a number of cells 1 ⁇ 10 8 cells subjected to the processing when the volume of solvent in the treated product is 100 [mu] l, total protein concentration in the treated product, for example, at 0.1 ⁇ 200 mg / ml is there.
  • the solvent is, for example, an aqueous solvent described later.
  • the weights of the growth factor and the growth factor receptor can be determined, for example, by the sandwich ELISA method.
  • the sandwich ELISA method can be carried out according to Reference 5 below, and for example, a commercially available kit or the like may be used.
  • As the sandwich ELISA kit Quantibody (registered trademark) Human Growth Factor Array 1 (manufactured by RayBiotech) or the like can be used.
  • Reference 5 Edited by Biochemical Measurement Study Group, "Immunometry from Basic to Advanced", Kodansha, December 20, 2014
  • Examples of the content of the growth factor and the content of the growth factor receptor in the treated product include the following examples.
  • the treated product contains, for example, 2000 to 20000 pg, 5000 to 20000 pg, or 10000 to 20000 pg of bFGF per 1 mg of total protein.
  • the treated product exhibits cell proliferation promoting activity as described later.
  • the treated product comprises 0-200 pg, 0.01-200 pg, 0.01-100 pg, or 0.01-50 pg of IGFBP-1 per 1 mg of total protein.
  • the treated product comprises 8000-80000 pg, 10000-80000 pg, or 20000-80,000 pg of IGFBP-2 per 1 mg of total protein.
  • the treated product comprises 1-60 pg, 1-30 pg, or 1-20 pg of PIGF per 1 mg of total protein.
  • the treated product comprises 20-800 pg, 20-600 pg, or 20-400 pg of VEGF per 1 mg of total protein.
  • the treated product comprises 1000-10000 pg, 1000-5000 pg, or 2000-5000 pg of GDF-15 per 1 mg of total protein.
  • the treated product comprises 0-16 pg, 0.01-16 pg, 0.1-16 pg, or 1-16 pg AR per 1 mg of total protein.
  • the treated product comprises 0-100 pg, 0.01-100 pg, 0.01-50 pg, or 0.01-30 pg of HGF per 1 mg of total protein.
  • the treated product comprises 0-1000 pg and 0.01-1000 pg of BMP-7 per 1 mg of total protein.
  • the treated product comprises 200-2000 pg, 300-1500 pg, or 400-1000 pg of SCFR per 1 mg of total protein.
  • the treated product comprises 0-60 pg, 0.01-60 pg, 1-50 pg, 1-45 pg, or 10-40 pg of EGFR per 1 mg of total protein.
  • the treated product comprises 20-400 pg, 50-350 pg, or 100-300 pg of VEGFR2 per 1 mg of total protein.
  • condition (1) may be defined by the content of one or more types of growth factors, or may be defined by the content of one or more types of growth factor receptors. However, these contents may be specified in any combination.
  • the condition (1) is, for example, at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 selected from the group consisting of the following conditions (A1) to (A9) and (B1) to (B3). , 8, 9, 10, 11 or 12 conditions.
  • the following combinations can be exemplified as the combination of the content of the growth factor and / or the content of the growth factor receptor.
  • (Combination of growth factor content and / or growth factor receptor content) Any one condition of (A1) to (A9) and (B1) to (B3): (A1) bFGF content, (A2) IGFBP-1 content, (A3) IGFBP-2 content, (A4) PIGF content, (A6) VEGF content, (A6) GDF-15 Content, (A7) AR content, (A8) HGF content, (A9) BMP-7 content, (B1) SCFR content, (B2) EGFR content, or (B3) Content of VEGFR2; Any two conditions of (A1) to (A9) and (B1) to (B3): (A1) and (A2), (A1) and (A3), (A1) and (A4), (A1) and (A5), (A1) and (A6), (A1) and (A7), (A1) ) And (A8), (A1) and (A9), (A1) and (B1), (A1) and (B2), (A1) and (B3), (A2) and (A3), (
  • the content per total protein may be adjusted, for example, by adding or removing proteins other than the growth factor and the growth factor receptor, depending on the use of the composition of the present invention.
  • proteins other protein include proteins that do not affect the activities of the growth factor and the growth factor receptor, and specific examples thereof include serum albumin such as human serum albumin and gamma globulin such as human gamma globulin. Be done.
  • the removal of the protein include removal using a column, removal using an antibody, and the like.
  • Condition (2) is a condition relating to the physiological activity of the treated product, as described above.
  • the physiological activity of the processed product means, for example, an activity of regulating the function of a cell, tissue, or organ.
  • the cell function include proliferation, differentiation, induction or suppression of gene expression, induction or suppression of expression of biopolymers such as proteins and sugar chains, and the like.
  • physiological activity of the treated product examples include cell proliferation promoting activity, fibroblast function promoting activity, keratinocyte function promoting activity, and dermal papilla cell function promoting activity.
  • the cells are not particularly limited in the growth promoting activity of the cells, and examples thereof include keratinized cells such as mesenchymal stem cells, fibroblasts and epidermal keratinocytes, and dermal papilla cells such as dermal papilla cells. Be done.
  • the treated product may have, for example, one activity or a plurality of activities.
  • the mesenchymal stem cells are cells having self-renewal ability and ability to differentiate into bone, cartilage, and adipocytes.
  • the mesenchymal stem cells can be identified by cell surface markers.
  • the mesenchymal stem cells are, for example, CD73, CD90, and CD105 positive, and CD14, CD34, and CD45 negative.
  • the fibroblast is a cell that constitutes connective tissue of organs such as skin, lung, and heart, and is a cell that supplies fiber components (extracellular matrix components such as collagen, elastin, and hyaluronic acid).
  • the fibroblasts can be identified by cell surface markers.
  • the fibroblasts are, for example, positive for vimentin, CD90, TE-7 antibody.
  • the keratinocyte is a cell having an ability to keratinize among epidermal cells, and is a cell that divides in the basal layer of the epidermis and contributes to epidermis formation.
  • the keratinocytes can be identified by cell surface markers.
  • the keratinized cells are, for example, positive for the androgen receptor, cytokeratin.
  • the keratinocytes are preferably epidermal keratinocytes.
  • the dermal papilla cells are cells existing in the dermal papilla at the base of the hair follicle, and are important cells for inducing and maintaining hair growth.
  • the dermal papilla cells can be identified by cell surface markers and / or gene expression.
  • the dermal papilla cells are, for example, alkaline phosphatase positive; SOX2 gene, WIF1 gene, Noggin gene, BMP4 gene, VCAN gene positive;
  • the dermal papilla cells are preferably scalp dermal papilla cells.
  • the cell proliferation promoting activity may be improved, for example, as compared with the same control group except that the composition of the present invention is not added.
  • cell proliferation may be improved from the start.
  • the ability may be reduced.
  • the "proliferation-promoting activity" can be said to be, for example, suppression of a decrease in the growth activity.
  • the mesenchymal stem cells decrease in proliferative activity with each passage. According to the composition of the present invention, it is possible to suppress a decrease in the proliferative activity of the mesenchymal stem cells. Therefore, for example, it can be said that the composition of the present invention exhibits a proliferative activity.
  • the growth promoting activity of the cells can be measured, for example, under culture conditions in which the target cells proliferate.
  • the culture conditions can be appropriately set according to, for example, the type of the cells.
  • the proliferative activity of the cells can be measured , for example, by culturing human-derived mesenchymal stem cells in vitro in the presence of a growth medium.
  • the proliferative activity of the mesenchymal stem cells can be measured, for example, based on Example 1 described later.
  • fibroblasts are used as the cells
  • the proliferative activity of the cells can be measured , for example, by culturing human-derived fibroblasts in vitro in the presence of a growth medium.
  • the proliferative activity of the fibroblasts can be measured, for example, based on Example 3 described later.
  • the proliferative activity of the cells can be measured , for example, by culturing human-derived epidermal keratinocytes in vitro in the presence of a growth medium.
  • the proliferative activity of the keratinocytes can be measured, for example, based on Example 4 described later.
  • dermal papilla cells are used as the cells, the proliferative activity of the cells can be measured , for example, by culturing human-derived dermal papilla cells in vitro in the presence of a growth medium.
  • the proliferative activity of the dermal papilla cells can be measured, for example, based on Example 5 described later.
  • the function-promoting activity of the fibroblasts may be improved, for example, as compared with the same control group except that the composition of the present invention is not added.
  • the function of the fibroblast may mean, for example, any of the proliferation of the fibroblast and the production of extracellular matrix by the fibroblast.
  • the extracellular matrix is, for example, a substrate such as collagens such as type I collagen, fibrous substances such as elastin; glycosaminoglycans such as hyaluronic acid and chondroitin sulfate, and cell adhesion proteins such as proteoglycan, integrin, fibronectin, and laminin. Properties; etc.
  • the function of the fibroblasts can be measured, for example, based on Example 3 described later.
  • the function-promoting activity of the keratinocytes may be improved, for example, as compared with the same control group except that the composition of the present invention is not added.
  • the function of the keratinocyte may mean any of, for example, proliferation of the keratinocyte, differentiation into epidermal cells, and induction of a barrier function gene.
  • the barrier function gene means, for example, a gene that functions to maintain the barrier function of the skin, and specific examples thereof include a profilaggrin gene (FLG) and a ceramide synthase gene (serine palmitoyltransferase long chain base subsystem 1: SPTLC1). And so on.
  • Examples of the human-derived profilaggrin gene include a polynucleotide having a base sequence registered in Genbank under Accession No .: NM_002016.2.
  • examples of the human-derived ceramide synthase gene include a polynucleotide having a base sequence registered in Genbank with Accession No .: NM_001281303.2.
  • the function of the keratinocytes can be measured, for example, based on Example 4 described later.
  • the function of the dermal papilla cells may be improved as compared with the same control group except that the composition of the present invention is not added.
  • the function of the dermal papilla cells may mean, for example, any of the proliferation of the dermal papilla cells and the induction of the hair growth promoting gene.
  • the hair growth promoting gene means, for example, a gene that functions for hair growth, hair growth or maintenance, and specific examples thereof include a FGF7 (fibroblast growth factor 7) gene and a vascular endothelial growth factor (VEGF). ) Genes, etc. Examples of the VEGF include VEGFA and the like.
  • Examples of the human-derived pro-FGF7 gene include a polynucleotide having a base sequence registered in Genbank under Accession No .: NM_002009.4.
  • Examples of the human-derived VEGFA gene include a polynucleotide having a base sequence registered in Genbank under Accession No .: NM_001025366.3.
  • the function of the dermal papilla cells can be measured, for example, based on Example 5 described later.
  • Condition (3) is a condition relating to a method for producing a processed product, as described above. As for the method for producing the processed product in the composition of the present invention, the description of the method for producing the composition of the present invention described later can be incorporated.
  • composition of the present invention can be produced, for example, by the method for producing the composition of the present invention described later.
  • the composition of the present invention is used, for example, as a cell proliferation promoting composition, a fibroblast function promoting composition, a keratinocyte function promoting composition, a hair papilla cell function promoting composition, and the like, as will be described later. it can. Further, the composition of the present invention is expected to be suitably used as, for example, a composition for promoting healing of skin disorders and a composition for promoting hair growth from the above-mentioned activities. For the method of use of the present invention, the description of the cell proliferation promoting composition, the fibroblast function promoting composition, the keratinocyte function promoting composition, and the dermal papilla cell function promoting composition, which will be described later, can be incorporated.
  • compositions of the present invention also apply to, for example, repairing knee joint injuries, tendon injuries, or ligament injuries; treating ulcers, pressure sores, burns, scars, or wounds; improving skin texture; hair growth; and / or beautifying skin; etc. Can be used.
  • the method for producing a composition of the present invention includes a treatment step for treating megakaryocytes or a culture thereof.
  • the production method of the present invention is characterized by including the processing step, and other steps and conditions are not particularly limited. According to the production method of the present invention, the composition of the present invention can be produced.
  • the production method of the present invention can be referred to the description of the composition of the present invention.
  • the treatment target in the treatment step is megakaryocytes or a culture thereof. Therefore, the production method of the present invention includes a megakaryocyte induction step of inducing the megakaryocytes from cells undifferentiated from the megakaryocytes and / or a production step of producing a culture of the megakaryocytes prior to the treatment step. But it may be.
  • the method for inducing megakaryocytes is not particularly limited, and can be carried out by a known induction method.
  • the method for inducing megakaryocytes is, for example, International Publication No. 2011/034073 (US Patent Application Publication No. 2012/0238023), International Publication No. 2012/157586 (US Patent Application Publication No. 2014/0127815). , International Publication No. 2014/123242 (US Patent Application Publication No. 2016/0002599) and other methods for inducing immortalized megakaryocytes; methods for inducing megakaryocytes described in Reference 6 below; Incorporated as a part of this specification.
  • the oncogene and the polycomb gene may be forcibly expressed in cells undifferentiated from the megakaryocytes.
  • an immortalized megakaryocyte that proliferates infinitely can be obtained.
  • the immortalized megakaryocytes can be induced into multinucleated megakaryocytes to produce platelets.
  • the tumor suppressor gene may be forcibly expressed in the megakaryocyte progenitor cells.
  • the immortalized megakaryocyte can be obtained. Furthermore, for example, by releasing the forced expression of the immortalized megakaryocytes, multinucleated megakaryocytes can be induced from the immortalized megakaryocytes to produce platelets.
  • Reference 6 Ann-Kathrin Borger et.al., “Generation of HLA-Universal iPSC-Derived Megakaryocytes and Platelets for Survival Under Refractoriness Conditions”, Mol. Med., 2016, vol. 22, pages 274-288
  • the oncogene, the polycomb gene, and the apoptosis suppressor gene may be forcibly expressed.
  • the oncogene, the polycomb gene, and the apoptosis suppressor gene may be forcibly expressed at the same time or separately.
  • the cancer gene and the polycomb gene may be forcibly expressed, then the forcible expression may be released, and then the apoptosis-suppressing gene may be forcibly expressed.
  • the polycomb gene and the apoptosis-suppressing gene may be forcibly expressed, or the cancer gene and the polycomb gene may be forcibly expressed, and the apoptosis-suppressing gene may be further expressed.
  • the immortalized megakaryocyte can be obtained.
  • multinucleated megakaryocytes can be induced from the immortalized megakaryocytes to produce platelets.
  • the giant nucleus sphere induction step can improve the introduction efficiency of each gene, for example, the first expression step of forcibly expressing the cancer gene and the polycomb gene in the cells undifferentiated from the giant nucleus sphere, and the undifferentiated cell.
  • forced expression of each gene and the release of the forced expression for example, the methods described in International Publication No. 2011/034073, International Publication No. 2012/157586, International Publication No. 2014/123242, or Reference 7 below are known. It can be carried out by the method of the above, or a method equivalent thereto, which is incorporated herein by reference as a part of the present specification.
  • forced expression and release of forced expression of each gene can be carried out using, for example, a drug-responsive gene expression induction system.
  • the gene expression induction system include a Tet-on (registered trademark) system and a Tet-off (registered trademark) system.
  • Tet-on system for example, in the step of forced expression, culture is carried out in the presence of a drug that induces gene expression such as tetracycline and doxycycline, and in the step of releasing the forced expression, the drug is used.
  • the culture is carried out in the absence.
  • Reference 7 Nakamura S et al, “Expandable megakaryocyte cell lines enable clinically applicable generation of platelets from human induced pluripotent stem cells.”, Cell Stem Cell, 2014, vol.14, No.4, pages 535-548
  • a culture of the megakaryocytes is produced.
  • the production step can be carried out, for example, by culturing the megakaryocytes in the presence of a medium.
  • the culture of megakaryocytes may be carried out, for example, on feeder cells or without feeder cells. Since the megakaryocytes can be cultured in suspension, for example, they can be cultured without the feeder cells.
  • the culture of megakaryocytes contains, for example, the platelets.
  • the culture conditions for the megakaryocytes are not particularly limited, and the normal culture conditions for the megakaryocytes can be adopted.
  • the culture temperature is, for example, about 35 to about 42 ° C, about 36 to about 40 ° C, and about 37 to about 39 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 5 to about 15%.
  • O 2 concentration for example, from about 15 to about 25%, about 20%.
  • the culture period is not particularly limited, and is, for example, about 1 day to about 2 weeks and about 4 to about 8 days.
  • the medium is not particularly limited, and examples thereof include a known medium suitable for producing platelets from the megakaryocytes and a medium similar thereto.
  • the medium can be prepared, for example, using a medium used for culturing animal cells as a basal medium.
  • the basal medium is, for example, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM), Ham's F12 medium, RPMI1640 medium, Fischer's medium, Neurobasal (registered trademark). Examples thereof include a single medium (manufactured by Thermo Fisher Scientific) and a mixed medium thereof.
  • the medium may contain, for example, serum or plasma, or may be a serum-free medium containing no of these.
  • the origin of the serum and plasma is preferably the same as that of the megakaryocytes.
  • the megakaryocytes are of human origin
  • the serum and plasma are preferably of human origin, respectively.
  • the medium may contain, for example, other components.
  • the other components are not particularly limited, and are, for example, albumin, insulin, transferase, selenium, fatty acids, trace elements, 2-mercaptoethanol, thiolglycerol, monothioglycerol (MTG), lipids, amino acids (eg, L-glutamine). ), Ascorbic acid, heparin, non-essential amino acids, vitamins, growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, cytokines and the like.
  • the other components may be, for example, one type or two or more types.
  • the cytokine is, for example, a substance that promotes the differentiation of blood cell lineage cells, and specific examples thereof include vascular endothelial growth factor (VEGF), thrombopoietin (TPO), various TPO-like agents, StemCell Factor (SCF), and ITS. Examples include (insulin-transferrin-selenite) supplements, ADAM inhibitors, FLT inhibitors, WNT inhibitors, ROCK inhibitors, aromatic hydrocarbon receptor (AhR) inhibitors and the like.
  • the medium is preferably an IMDM medium containing, for example, serum, insulin, transferrin, serine, thiolglycerol, ascorbic acid, and TPO.
  • the medium may further contain, for example, SCF, and may further contain heparin.
  • concentration of the other component is not particularly limited.
  • the TPO concentration is, for example, about 10 ng / ml to about 200 ng / ml and about 50 ng / ml to about 100 ng / ml.
  • concentration of the SCF is, for example, about 10 ng / ml to about 200 ng / ml and about 50 ng / ml.
  • the concentration of the heparin is, for example, about 10 U / ml to about 100 U / ml and about 25 U / ml.
  • the medium may further contain, for example, a phorbol ester (eg, phorbol-12-millistart-13-acetate; PMA).
  • the megakaryocytes or a culture thereof is treated.
  • the protein is extracted, for example, by destroying the cell membrane of the cell contained in the megakaryocyte or the culture thereof.
  • the treatment in the treatment step is not particularly limited, and for example, a treatment for changing the density of cell components such as a concentration treatment; drying treatment, freezing treatment, freeze-drying treatment, solvent treatment, surfactant treatment, enzyme. Examples thereof include an extraction process for extracting cell components such as a treatment, a protein fraction extraction process, and an ultrasonic treatment; and a crushing process such as a grinding process and a crushing process.
  • the treatment to be carried out in the treatment step may be one type or two or more types. Further, in the treatment step, the treatment may be carried out once or twice or more.
  • the concentration treatment can be carried out, for example, by centrifuging the megakaryocytes or a culture thereof.
  • the centrifugation condition for example, a condition for precipitating cells or platelets can be adopted.
  • the drying treatment can be carried out, for example, by drying the megakaryocytes or a culture thereof with a dry spray, a drum dryer, or the like.
  • the freeze-drying treatment can be carried out using, for example, a freeze-dryer.
  • the solvent is, for example, an organic solvent such as phenol or chloroform; an aqueous solvent such as water, physiological saline, or a buffer solution.
  • the solvent treatment is preferably used in combination with, for example, a surfactant treatment, an enzyme treatment, and / or an ultrasonic treatment described later.
  • the solvent treatment can be carried out, for example, by mixing the megakaryocytes or a culture thereof with the solvent.
  • the surfactant is, for example, an ionic surfactant such as sodium lauryl sulfate; a nonionic surfactant such as NP-40, Triton X-100, Tween 20, n-Dodecyl- ⁇ -D-maltopyranoside and the like.
  • the concentration of the surfactant is, for example, a concentration capable of destroying the cell membrane of the cell component in the megakaryocyte or its culture.
  • the surfactant treatment can be carried out, for example, by contacting the megakaryocytes or a culture thereof with the surfactant in the presence of an aqueous solvent. Contact with the surfactant is carried out, for example, at about 0 to about 10 ° C.
  • the aqueous solvent include water, physiological saline, and a buffer solution.
  • the enzyme in the enzyme treatment include peptidase, protease and the like.
  • the enzyme treatment can be carried out, for example, by contacting the megakaryocytes or a culture thereof with the enzyme in the presence of the aqueous solvent.
  • the condition of the enzyme treatment is, for example, a condition in which the enzyme exhibits activity.
  • the protein fraction extraction treatment can be carried out, for example, by performing osmotic shock, freeze-thaw, or the like on the megakaryocytes or a culture thereof.
  • the ultrasonic treatment can be performed using, for example, an ultrasonic generator.
  • the conditions for the ultrasonic treatment for example, conditions for disrupting cells can be used.
  • the processing conditions and processing time in various processing can be appropriately determined according to, for example, the type of processing. Further, in the treatment step, for example, the concentration of the total protein in the treated product can be adjusted by adjusting the amount of the aqueous solvent.
  • the megakaryocytes or their culture may be processed (pretreated) prior to the treatment.
  • the culture of the megakaryocytes the culture itself obtained by culturing the megakaryocytes may be used, or the processed mixture may be used.
  • Processing of the culture includes, for example, removal of a liquid fraction, extraction of a cellular component fraction, modification of the composition of cellular components including platelets, and the like. Changes in the composition of the cellular components include, for example, removal of cells and / or platelets in the mixture, extraction of cells and / or platelets in the mixture, addition of cells and / or platelets to the mixture, and the like.
  • the production method of the present invention may include a removal step of removing platelets from the megakaryocytes or a culture thereof.
  • the treatment step the treatment is carried out using the megakaryocytes from which the platelets have been removed or the culture thereof, or the platelets from which the platelets have been removed, as the megakaryocytes or a culture thereof.
  • the megakaryocytes after the release of platelets have, for example, a high content of bFGF. Therefore, the production method of the present invention can produce a composition having a high content of bFGF, for example, by removing the platelets. By removing the platelets, the platelets can be separated from other cell fractions.
  • the removal step can also be referred to as, for example, a platelet separation step or a platelet separation step of separating other cell components.
  • the method for separating platelets from the culture of megakaryocytes is a known method such as the method described in International Publication No. 2017/065280 (US Patent Application Publication No. 2018/282697). , Or a method equivalent thereto, which is incorporated herein by reference.
  • the removal rate (separation rate) of platelets in the removal step is, for example, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98%. Or more, or 99% or more.
  • the removal rate of the platelets is, for example, 60 to 90%.
  • the production method of the present invention may include a storage step for preserving the megakaryocytes or a culture thereof, the megakaryocytes from which the platelets have been removed or a culture thereof, or the removed platelets.
  • Examples of the storage in the storage step include refrigerated storage (about 1 to about 10 ° C.) and frozen storage (about ⁇ 200 to about -4 ° C.).
  • the storage period in the storage step is not particularly limited. Since the storage step can also serve as, for example, a freezing treatment in the processing step, frozen storage is preferable.
  • the manufacturing method of the present invention can be carried out as an example as follows. However, the present invention is not limited to the following examples.
  • the medium containing the megakaryocytes or a culture thereof is subjected to a concentration treatment by centrifugation to concentrate the cell components.
  • the centrifugation is, for example, a condition under which the cell components precipitate.
  • the centrifugation can be carried out, for example, by centrifuging at 1000 to 3000 ⁇ g for 5 to 20 minutes.
  • the precipitate is collected after centrifugation, and the obtained precipitate is frozen by quick freezing.
  • the freezing treatment can be carried out, for example, by bringing the precipitate into contact with a liquefied gas such as liquid nitrogen.
  • the precipitate after freezing is treated with a surfactant by dissolving it in an aqueous solvent containing the surfactant.
  • the resulting solution is centrifuged to precipitate contaminants.
  • the centrifugation is a condition under which contaminants such as cell membranes are precipitated, for example.
  • the centrifugation can be carried out by centrifuging at 10,000 to 20,000 xg for 3 to 10 minutes, for example. Since the protein is present in the supernatant after the centrifugation, the treated product can be obtained by collecting the supernatant as a protein fraction.
  • composition obtained by manufacturing method> The composition of the present invention (hereinafter, also referred to as "second composition") can be obtained by the production method of the present invention.
  • the second composition of the present invention is characterized by being obtained by the production method of the present invention, and other configurations and conditions are not particularly limited.
  • a composition having physiological activity can be provided.
  • cell proliferation can be promoted.
  • the description of the composition and the production method of the present invention can be incorporated.
  • the present invention provides, in other examples, compositions capable of promoting cell proliferation.
  • the cell growth promoting composition of the present invention is characterized by containing the composition of the present invention as described above.
  • the growth promoting composition of the present invention is characterized by containing the composition of the present invention, and other configurations and conditions are not particularly limited. According to the growth promoting composition of the present invention, the growth of cells, particularly mesenchymal stem cells, can be promoted.
  • the description of the composition and the production method of the present invention can be incorporated.
  • the growth-promoting composition of the present invention may be used in vitro or in vivo .
  • the administration target includes, for example, cells, tissues, organs, etc.
  • the cells include, for example, cells collected from a living body, cultured cells, and the like. ..
  • the administration target includes, for example, humans or non-human animals other than humans.
  • the non-human animal include mice, rats, rabbits, dogs, sheep, horses, cats, goats, monkeys, guinea pigs and the like.
  • the conditions of use (administration conditions) of the growth promoting composition of the present invention are not particularly limited, and for example, the administration form, administration time, dose, etc. can be appropriately set according to the type of administration target and the like.
  • the growth-promoting composition of the present invention can be used, for example, by adding it to the medium of the target cell.
  • the final concentration of the total protein derived from the growth promoting composition of the present invention in the medium is 10 to 1000 ⁇ g / ml, 10 to 500 ⁇ g / ml, 10 to 320 ⁇ g / ml, 10 to 300 ⁇ g / ml, or 20 to 300 ⁇ g / ml. is there.
  • the growth promoting composition of the present invention When used in vivo, it can be appropriately determined depending on, for example, the type, symptom, age, administration method and the like of the administration target. As a specific example, when administered to humans, the daily dose of the growth-promoting composition is not particularly limited to the total amount of total protein derived from the growth-promoting composition. Can be set. The number of administrations per day is, for example, 1 to 5 times, 1 to 3 times, 1 time or 2 times.
  • the administration form of the growth promoting composition of the present invention is not particularly limited. When the growth promoting composition of the present invention is administered in vivo , it may be administered orally or parenterally.
  • the parenteral administration includes, for example, intravenous injection (intravenous administration), intramuscular injection (intramuscular administration), transdermal administration, subcutaneous administration, intradermal administration, enteral administration, rectal administration, vaginal administration, and nasal administration. Examples include transpulmonary administration, intraperitoneal administration, and local administration.
  • the dosage form of the growth promoting composition of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately determined, for example, according to the above-mentioned administration form.
  • the dosage form may be, for example, liquid or solid.
  • the growth promoting composition of the present invention may contain, for example, an additive, if necessary.
  • the additive is preferably a pharmaceutically acceptable additive or a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention provides, in other examples, compositions capable of promoting the function of fibroblasts.
  • the fibroblast function-promoting composition of the present invention contains the composition of the present invention as described above.
  • the fibroblast function-promoting composition of the present invention is characterized by containing the composition of the present invention, and other configurations and conditions are not particularly limited. According to the fibroblast function promoting composition of the present invention, the function of fibroblasts can be promoted.
  • the fibroblast function-promoting composition of the present invention can be referred to the description of the composition, production method, and growth-promoting composition of the present invention.
  • the fibroblast function-promoting composition of the present invention may be used in vitro or in vivo .
  • the fibroblast function-promoting composition of the present invention can be used, for example, by adding it to a target fibroblast medium.
  • the fibroblast function-promoting composition of the present invention for example, by maintaining the fibroblast in a medium containing the fibroblast function-promoting composition, the fibroblast proliferates and / or It can promote the production of extracellular matrix by fibroblasts.
  • the final concentration of the total protein of the fibroblast function promoting composition of the present invention in the medium is 10 to 1000 ⁇ g / ml, 10 to 500 ⁇ g / ml, or 10 to 300 ⁇ g / ml.
  • the description of the administration target and administration conditions in the growth promoting composition of the present invention can be incorporated.
  • the present invention provides, in other examples, compositions that can be used to promote healing of skin disorders.
  • the composition for promoting healing of skin disorders of the present invention (hereinafter, also referred to as "promoting composition for healing") includes the composition of the present invention as described above.
  • the healing-promoting composition of the present invention is characterized by containing the composition of the present invention, and other configurations and conditions are not particularly limited. According to the healing promoting composition of the present invention, it is expected that healing of skin disorders can be promoted.
  • the description of the composition, the production method, and the growth promoting composition of the present invention can be incorporated.
  • the skin disorder means, for example, a state in which a wound, damage, etc. to the skin has occurred, that is, a state in which the structure of normal skin tissue is impaired or destroyed, and as a specific example, the skin. Examples include ulcers, pressure sores, burns, scars, wounds, and skin aging.
  • the healing-promoting composition of the present invention may be used in vitro or in vivo .
  • the healing-promoting composition of the present invention can be used, for example, by adding it to the medium of a cell of interest.
  • the final concentration of the total protein of the healing promoting composition of the present invention in the medium is 10 to 1000 ⁇ g / ml, 10 to 500 ⁇ g / ml, or 10 to 300 ⁇ g / ml.
  • the healing-promoting composition of the present invention is preferably used in a dosage form that can be administered subcutaneously or transdermally.
  • the present invention provides, in another example, a composition capable of promoting the function of keratinocytes.
  • the keratinocyte function-promoting composition of the present invention contains the composition of the present invention as described above.
  • the function-promoting composition for keratinocytes of the present invention is characterized by containing the composition of the present invention, and other configurations and conditions are not particularly limited. According to the function-promoting composition of keratinocytes of the present invention, the function of keratinocytes can be promoted.
  • the function-promoting composition for keratinocytes of the present invention the description of the composition, production method, and growth-promoting composition of the present invention can be incorporated.
  • the function-promoting composition for keratinized cells of the present invention may be used in vitro or in vivo .
  • the keratinocyte function-promoting composition of the present invention can be used, for example, by adding it to the medium of the keratinocyte of interest.
  • the function-promoting composition for keratinocytes of the present invention may be added to, for example, a maintenance medium used for maintaining the keratinocytes, or the keratinocytes may be added to epithelial cells such as epidermal cells. It may be added to the differentiation medium to be differentiated, or may be added to both the maintenance medium and the differentiation medium.
  • the keratinocyte function-promoting composition of the present invention for example, by maintaining the keratinocyte in a medium containing the keratinocyte function-promoting composition, the keratinocyte proliferates and the epidermal cells. Can promote differentiation into and / or induction of barrier function genes.
  • the final concentration of the total protein of the keratinocyte function-promoting composition of the present invention in the medium is 10 to 1000 ⁇ g / ml, 10 to 500 ⁇ g / ml, or 10 to 300 ⁇ g / ml.
  • the description of the administration subject and administration condition in the growth promoting composition of the present invention can be incorporated.
  • the keratinocyte function-promoting composition of the present invention promotes the differentiation of keratinocytes into epithelial cells such as epidermal cells. Therefore, it is expected that the keratinocyte function-promoting composition of the present invention can be suitably used as, for example, an additive in artificial skin culture.
  • the keratinocyte function-promoting composition of the present invention exhibits fibroblast function-promoting activity as described above. Therefore, the keratinocyte function-promoting composition of the present invention is suitably used for the regeneration of aged skin by promoting the turnover of skin tissue by, for example, the function-promoting activity of keratinocytes and fibroblasts. It is expected to be possible. Therefore, it is expected that the keratinocyte function-promoting composition of the present invention can be suitably used as, for example, an external composition for skin such as cosmetics, an injection for subcutaneous administration, and the like.
  • the present invention provides, in another example, a composition capable of promoting the function of dermal papilla cells.
  • the dermal papilla cell function-promoting composition of the present invention contains the composition of the present invention as described above.
  • the function-promoting composition for dermal papilla cells of the present invention is characterized by containing the composition of the present invention, and other configurations and conditions are not particularly limited. According to the function-promoting composition of dermal papilla cells of the present invention, the function of keratinocytes can be promoted.
  • the function-promoting composition for dermal papilla cells of the present invention can be referred to the description of the composition, production method, and growth-promoting composition of the present invention.
  • the dermal papilla cell function-promoting composition of the present invention may be used in vitro or in vivo .
  • the dermal papilla cell function promoting composition of the present invention can be used, for example, by adding it to the medium of the target dermal papilla cell.
  • the hair papilla cell function-promoting composition of the present invention for example, by maintaining the hair papilla cells in a medium containing the hair papilla cell function-promoting composition, the hair papilla cells proliferate and / or It can promote the induction of hair growth promoting genes.
  • the final concentration of the total protein of the dermal papilla cell function promoting composition of the present invention in the medium is 10 to 1000 ⁇ g / ml, 10 to 500 ⁇ g / ml, or 10 to 300 ⁇ g / ml.
  • the description of the administration target and administration condition in the growth promoting composition of the present invention can be incorporated.
  • the present invention provides, in other examples, compositions capable of promoting hair growth.
  • the hair growth promoting composition of the present invention contains the composition of the present invention as described above.
  • the hair growth promoting composition of the present invention is characterized by containing the composition of the present invention, and other configurations and conditions are not particularly limited.
  • the function of dermal papilla cells is promoted, so that it is expected that hair growth can be promoted.
  • the function-promoting composition for dermal papilla cells of the present invention can be referred to the description of the composition, production method, and growth-promoting composition of the present invention.
  • promoting hair growth refers to increasing (increasing, increasing) the likelihood of hair growth from the absence of hair, hair growth (eg, hair length and / or thickness growth). It means promotion and / or reduction (suppression, reduction) of hair loss.
  • the hair growth promoting composition of the present invention may be used, for example, for preventing, suppressing, or preventing hair loss.
  • the hair growth promoting composition of the present invention can also be referred to as, for example, a hair loss preventing, suppressing, or preventing composition.
  • the hair growth promoting composition of the present invention may be used in vitro or in vivo .
  • the hair growth promoting composition of the present invention can be used, for example, by adding it to a medium of target hair papilla cells.
  • the hair growth promoting composition of the present invention for example, by maintaining the hair papilla cells in a medium containing the composition of the present invention, the proliferation of the hair papilla cells and / or the induction of the hair growth promoting gene It is expected that hair growth will be promoted.
  • the final concentration of the total protein of the hair growth promoting composition of the present invention in the medium is 10 to 1000 ⁇ g / ml, 10 to 500 ⁇ g / ml, or 10 to 300 ⁇ g / ml.
  • the description of the administration target and administration conditions in the growth promoting composition of the present invention and the hair growth promoting method described later can be incorporated.
  • the cell proliferation promoting method of the present invention uses the cell proliferation promoting composition of the present invention.
  • the growth promoting method of the present invention is characterized by using the growth promoting composition of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited. According to the growth promoting method of the present invention, the growth of cells, particularly mesenchymal stem cells, can be promoted.
  • the description of the composition, the production method, the growth promoting composition, and the differentiation promoting composition of the present invention can be incorporated.
  • the growth promoting method of the present invention may be carried out in vitro or in vivo , for example.
  • the growth promoting method of the present invention includes, for example, a culturing step of culturing cells in the presence of the growth promoting composition.
  • the administration subject and administration condition of the growth promoting composition of the present invention for example, the description of the administration subject and administration condition in the growth promotion composition of the present invention can be incorporated.
  • the present invention provides, in another example, a method capable of promoting the function of fibroblasts.
  • the method for promoting the function of fibroblasts of the present invention uses the composition of the present invention.
  • the method for promoting the function of fibroblasts of the present invention is characterized by using the composition of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited. According to the method for promoting the function of fibroblasts of the present invention, the function of fibroblasts can be promoted.
  • the description of the composition, the method for producing, the composition for promoting growth, and the composition for promoting the function of fibroblasts of the present invention can be incorporated.
  • the method for promoting the function of fibroblasts of the present invention may be carried out in vitro or in vivo , for example.
  • the method for promoting the function of fibroblasts of the present invention includes, for example, a culturing step of culturing the fibroblasts in the presence of the composition.
  • a culturing step of culturing the fibroblasts in the presence of the composition As the administration subject and administration condition of the composition of the present invention, for example, the description of the administration subject and administration condition in the growth promoting composition of the present invention can be incorporated.
  • the present invention provides, in other examples, methods that can be used to promote healing of skin disorders.
  • the method for promoting healing of skin disorders of the present invention (hereinafter, also referred to as "method for promoting healing") uses the composition of the present invention.
  • the healing promoting method of the present invention is characterized by using the composition of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited. According to the healing promoting method of the present invention, it is expected that healing of skin disorders can be promoted.
  • the description of the composition, the method for producing, the composition for promoting growth, and the composition for promoting healing of skin disorders can be incorporated.
  • the method for promoting healing of a skin disorder of the present invention can also be referred to as, for example, a method for treating or treating a skin disorder.
  • the method for promoting healing of the present invention may include, for example, an administration step of administering the composition of the present invention to a subject.
  • the subject include a patient having a skin disorder, a patient having a possibility of a skin disorder, and the like.
  • the healing promotion method of the present invention may be carried out in vitro or in vivo , for example.
  • the healing promoting method of the present invention is, for example, a culturing step of culturing skin-related cells such as keratinocytes and fibroblasts in the presence of the composition.
  • the administration subject and administration condition of the composition of the present invention for example, the description of the administration subject and administration condition in the growth promoting composition of the present invention can be incorporated.
  • the present invention provides, in another example, a method capable of promoting the function of keratinocytes.
  • the method for promoting the function of keratinocytes of the present invention uses the composition of the present invention.
  • the method for promoting the function of keratinocytes of the present invention is characterized by using the composition of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited. According to the method for promoting the function of keratinocytes of the present invention, the function of keratinocytes can be promoted.
  • the description of the composition, the method for producing, the composition for promoting growth, and the composition for promoting the function of keratinocytes of the present invention can be incorporated.
  • the method for promoting the function of keratinized cells of the present invention may be carried out in vitro or in vivo , for example.
  • the method for promoting the function of keratinocytes of the present invention includes, for example, a culturing step of culturing the keratinocytes in the presence of the composition.
  • a culturing step of culturing the keratinocytes in the presence of the composition As the administration subject and administration condition of the composition of the present invention, for example, the description of the administration subject and administration condition in the growth promoting composition of the present invention can be incorporated.
  • the present invention provides, in another example, a method capable of promoting the function of dermal papilla cells.
  • the method for promoting the function of dermal papilla cells of the present invention uses the composition of the present invention.
  • the method for promoting the function of dermal papilla cells of the present invention is characterized by using the composition of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited. According to the method for promoting the function of dermal papilla cells of the present invention, the function of dermal papilla cells can be promoted.
  • the description of the composition, the method for producing, the composition for promoting growth, and the composition for promoting the function of dermal papilla cells of the present invention can be incorporated.
  • the method for promoting the function of dermal papilla cells of the present invention may be carried out in vitro or in vivo , for example.
  • the method for promoting the function of dermal papilla cells of the present invention includes, for example, a culturing step of culturing the dermal papilla cells in the presence of the composition.
  • a culturing step of culturing the dermal papilla cells in the presence of the composition As the administration subject and administration condition of the composition of the present invention, for example, the description of the administration subject and administration condition in the growth promoting composition of the present invention can be incorporated.
  • the present invention provides, in another example, a method capable of promoting hair growth.
  • the hair growth promoting method of the present invention uses the composition of the present invention.
  • the hair growth promoting method of the present invention is characterized by using the composition of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited. According to the hair growth promoting method of the present invention, it is expected that hair growth can be promoted.
  • the description of the composition, the production method, the growth promoting composition, and the hair growth promoting composition of the present invention can be incorporated.
  • the hair growth promoting method of the present invention can also be, for example, a treatment method or a treatment method for alopecia or thinning hair.
  • the hair growth promoting method of the present invention may be used, for example, for preventing, suppressing, or preventing hair loss.
  • the hair growth promoting method of the present invention can also be referred to as, for example, a method for preventing, suppressing, or preventing hair loss.
  • the hair growth promoting method of the present invention may include, for example, an administration step of administering the composition of the present invention to a subject.
  • the subject include a patient having alopecia, a patient having a possibility of alopecia, and the like.
  • the alopecia patient include male pattern baldness, female pattern baldness, and alopecia after anticancer drug treatment.
  • the patient having the possibility of hair loss include a patient before treatment with an anticancer drug, a patient with genetic alopecia, and a patient before the onset of hair loss.
  • the hair growth promoting method of the present invention may be carried out in vitro or in vivo , for example.
  • the hair growth promoting method of the present invention is, for example, a culturing step of culturing cells related to hair growth such as hair papilla cells in the presence of the composition. Including.
  • the administration subject and administration condition of the composition of the present invention for example, the description of the administration subject and administration condition in the growth promoting composition of the present invention can be incorporated.
  • the present invention is a composition or use thereof that comprises, as an active ingredient, a processed product of megakaryocytes or a culture thereof for use in promoting cell proliferation.
  • the present invention is also a composition or use thereof, which comprises, as an active ingredient, a processed product of megakaryocytes or a culture thereof for use for promoting the function of fibroblasts.
  • the present invention is a composition or use thereof comprising a processed product of megakaryocytes or a culture thereof as an active ingredient for use in promoting healing of skin disorders.
  • the present invention is a composition or use thereof comprising a processed product of megakaryocytes or a culture thereof as an active ingredient for use for promoting the function of keratinocytes.
  • the present invention is a composition or use thereof comprising a processed product of megakaryocytes or a culture thereof as an active ingredient for use for promoting the function of dermal papilla cells.
  • the present invention is a composition or use thereof, which comprises, as an active ingredient, a processed product of megakaryocytes or a culture thereof for use for promoting hair growth.
  • the present invention is the use of a composition comprising a processed product of megakaryocytes or a culture thereof as an active ingredient for producing a cell growth promoting composition.
  • the present invention is also the use of a composition comprising a processed product of megakaryocytes or a culture thereof as an active ingredient for producing a function-promoting composition for fibroblasts.
  • the present invention is the use of a composition comprising a processed product of megakaryocytes or a culture thereof as an active ingredient for producing a composition for promoting healing of skin disorders.
  • the present invention is the use of a composition comprising a processed product of megakaryocytes or a culture thereof as an active ingredient for producing a function-promoting composition of keratinocytes.
  • the present invention is the use of a composition comprising a processed product of megakaryocytes or a culture thereof as an active ingredient for producing a function-promoting composition of dermal papilla cells.
  • the present invention is the use of a composition comprising a treated megakaryocyte or a culture thereof as an active ingredient for producing a hair growth promoting composition.
  • Example 1 The composition of the present invention was produced, and it was confirmed that it contained a growth factor and a growth factor receptor and had a cell growth promoting activity.
  • TKDN SeV2 and NIH5 human fetal skin fibroblast-derived iPS cells established using Sendai virus
  • differentiation culture into blood cells was carried out. Specifically, human ES / iPS cell colonies were co-cultured with C3H10T1 / 2 feeder cells in the presence of 20 ng / ml VEGF (manufactured by R & D SYSTEMS) for 14 days to prepare hematopoietic progenitor cells (HPC). ..
  • the gene transfer system used the lentiviral vector system.
  • the lentiviral vector is a Tetracycline-controlled Tet-on® gene expression induction system vector. It was made by recombining the mOKS cassette of LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G (Reference 9 below) with c-MYC, BMI1, or BCL-xL. Vectors with c-MYC, BMI1, or BCL-xL introduced into LV-TRE-c-Myc-Ubc-tTA-I2G, LVTRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G, and LV-TRE-BCL-, respectively.
  • the c-MYC, BMI1, and BCL-xL viruses were prepared by gene transfer into 293T cells with the lentiviral vector. By infecting the cells of interest with the resulting virus, the c-MYC, BMI1, and BCL-xL genes are introduced into the genomic sequence of the cells of interest. These genes, which have been stably introduced into the genome sequence, can be forcibly expressed by adding doxycycline (clontech # 631311) to the medium.
  • Reference 9 Kobayashi, T. et al., “Generation of rat pancreas in mouse by interspecific blastocyst injection of pluripotent stem cells.”, Cell, 2010, vol.142, No.5, pages 787-799
  • the spin infection was performed twice every 12 hours.
  • the medium was basal medium (15% Fetal Bovine Serum (GIBCO), 1% Penicillin-Streptomycin-Glutamine (GIBCO), 1% Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS-G) (GIBCO), 0.45 mmol / l 1-Thioglycerol).
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • Sigma-Aldrich containing (Sigma-Aldrich), 50 ⁇ g / ml L-Ascorbic Acid (Sigma-Aldrich), 50 ng / ml Human thrombopoietin (TPO) (R & D SYSTEMS), Protamine was further added to the medium (hereinafter referred to as differentiation medium) to which 50 ng / ml Human Stem Cell Factor (SCF) (R & D SYSTEMS) and 2 ⁇ g / ml Doxycycline (Dox, clontech # 631311) were added so as to be the final concentration. The medium was added so that the value was 10 ⁇ g / ml.
  • SCF Human Stem Cell Factor
  • Dox Dox, clontech # 631311
  • virus-infected blood cells obtained by the above method were collected by pipetting and centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes to remove the supernatant. It was then suspended in a new differentiation medium and seeded on new C3H10T1 / 2 feeder cells (6 well plate). Subculture was performed by performing the same operation on the 9th day of infection. At the time of re-seeding, after counting the number of cells, the cells were seeded on C3H10T1 / 2 feeder cells so as to have 1 ⁇ 10 5 cells / 2 ml / well (6 well plate).
  • BCL-xL was introduced into the megakaryocyte self-proliferating strain on the 14th day of infection by a lentivirus method using BCL-xL virus.
  • Virus particles were added to the medium to achieve MOI 10 and infected by spin infection (32 ° C, 900 rpm, centrifuge for 60 minutes). Forced expression of the BCL-xL gene was carried out by adding DOX to the medium to a concentration of 1 ⁇ g / ml DOX.
  • the BCL-xL infection day 24 were collected megakaryocyte self-propagating strains transformed gene, cells 1.0 ⁇ 10 5 per anti-human CD41a-APC antibody (BioLegend), anti-human CD42b-PE antibody (eBioscience), and Anti-human CD235ab-Pacific Blue (Anti-CD235ab-PB; BioLegend) antibodies were immunostained with 2 ⁇ l, 1 ⁇ l, and 1 ⁇ l, respectively, and then analyzed with FACS Verse TM. Then, on the 24th day of infection, a strain having a CD41a positive rate of 50% or more was designated as an immortalized megakaryocyte cell line. These cells, which were able to proliferate for 24 days or more after infection, were designated as immortalized megakaryocyte cell lines SeV2-MKCL and NIH5-MKCL.
  • SeV2-MKCL and NIH5-MKCL were statically cultured in a 10 cm dish (10 ml / dish).
  • IMDM was used as the basal medium, and the following components were added (concentration is final concentration).
  • the culture conditions were 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the cells were cultured in the presence of the platelet production medium for 6 days to produce platelets, thereby producing a culture of megakaryocytes.
  • the culture of the megakaryocytes was concentrated using a hollow fiber membrane (Plasmaflow OP, manufactured by Asahi Kasei Medical Co., Ltd.), and the obtained concentrate of the culture of megakaryocytes was placed in a storage bag. Recovered.
  • a cell bag containing the culture to which the ACD-A solution was added was bonded to the ACP215 disposable set using a sterile bonding device. Then, I started ACP215 in service mode and set the rotation speed to 2500 rpm (350 x g). ACP215 was started and the culture in the cell bag was introduced into a separation bowl at about 100 ml / min. The liquid component flowing out of the separation bowl was collected in a collection bag. After introducing the entire amount of the culture in the cell bag into the separation bowl, an additional 500 ml of a wash-preserving solution was introduced into the separation bowl. After introducing the washing and preserving solution into the separation bowl, centrifugation was stopped and the recovery bag containing the recovery liquid (recovered liquid component containing platelets) was separated using a tube sealer.
  • a recovery bag containing a recovery solution (including platelets) was joined to the new ACP215 disposable set using the aseptic joining device.
  • the recovery bag containing the recovery liquid was installed on the stand.
  • centrifugation speed of ACP215 was changed to 5000 rpm (1398.8 x g), and centrifugation was started.
  • automatic injection was changed to manual injection.
  • the recovered liquid was introduced into the separation bowl at an introduction rate of about 100 ml / min. After adding the entire amount of the recovered liquid to the separation bowl, an additional 500 ml of a washing and preserving liquid was added.
  • Each raw material was washed twice with a cleaning solution.
  • the cleaning solution used was one in which the pH was adjusted to the range of 7.0 to 7.4 by adding NaOH to the vicanate infusion solution so that the ACD-A solution was about 20 (v / v)%. There was.
  • each raw material was centrifuged at 2000 ⁇ g for 10 minutes at room temperature (about 25 ° C.). After the centrifugation, the precipitate was collected and the precipitate was frozen using liquid nitrogen. Next, a cell lysis buffer was added to the frozen precipitate and lysed by shaking at 50 rpm and 4 ° C. for 30 minutes.
  • the cell lysis buffer is a commercially available cell lysis buffer (2 ⁇ Cell Lysis Buffer, RayBiotech, Cat.No .: AA-LYS) and a protease inhibitor cocktail (Protease Inhibitor Cocktail, RayBiotech, Cat.No .:). The one to which AA-PI) was added was used.
  • the obtained solution was centrifuged at 14000 ⁇ g for 5 minutes at 4 ° C. After the centrifugation, the supernatant was recovered as a treated product of the example.
  • the total protein concentration of the processed product obtained from each raw material was measured using the Pierce TM BCA Protein Assay Kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • Pierce TM BCA Protein Assay Kit manufactured by Thermo Fisher Scientific.
  • adipose tissue-derived mesenchymal stem cells were seeded in a 10 cm dish so as to be 2.4 to 4.8 ⁇ 10 5 cells / 10 ml medium / dish.
  • mesenchymal stem cells commercially available mesenchymal stem cells derived from human adipose tissue (Cat. No .: C-12977 manufactured by Takara Bio Co., Ltd.) were subcultured twice and then recovered. ..
  • the medium is prepared by freezing a composition prepared from thrombocytopenic giant nucleus cell culture 2 in Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2, manufactured by Takara Bio, Cat.
  • the dissolved medium was added.
  • the composition was added so that the total protein concentration derived from the composition in the medium was a predetermined concentration (0, 125, 250, or 500 ⁇ g / ml).
  • the medium is a maintenance medium.
  • the mesenchymal stem cells were cultured for 3 days under wet conditions of 37 ° C. and 5% CO 2. After the culture, the mesenchymal stem cells were collected, seeded under the same conditions, and cultured again for 3 days under wet conditions of 37 ° C. and 5% CO 2. Next, the mesenchymal cells after the culture were collected and the number of cells was counted. Then, a relative value of the number of cells at the time of recovery when the number of cells at the time of seeding was used as a reference (1) was calculated, and this was used as a relative value of the proliferative activity. In addition, the time required for the cells to proliferate once (doubling time) was calculated based on the number of cells at the time of seeding and the number of cells at the time of collection. These results are shown in FIG.
  • FIG. 2 is a graph showing the proliferative activity of cells.
  • (A) shows proliferative activity and (B) shows doubling time.
  • the horizontal axis represents the total protein concentration derived from the composition
  • the vertical axis represents the relative value of proliferative activity.
  • the horizontal axis indicates the total protein concentration derived from the composition
  • the vertical axis indicates the doubling time
  • the numerical value in the figure indicates the doubling time.
  • FIG. 2 (A) when the composition of the present invention was added, the proliferative activity of mesenchymal stem cells increased depending on the total protein concentration derived from the composition.
  • the doubling time after the third passage was 21 hours in the mesenchymal stem cells to which the composition was not added.
  • the doubling time of mesenchymal stem cells was extended about 1.5 times when the composition of the present invention was not added.
  • the composition of the present invention when the composition of the present invention is added, it is necessary for mesenchymal stem cells to proliferate once, depending on the total protein concentration derived from the composition. Time has been reduced.
  • the composition of the present invention was cultured in a medium to which no addition was added, the doubling time of mesenchymal stem cells was extended when the number of passages was obtained.
  • the composition of the present invention was added, the elongation of the doubling time was almost suppressed. Therefore, it was found that the composition of the present invention can exhibit cell growth promoting activity and suppress a decrease in growth activity.
  • composition of the present invention has cell growth promoting activity.
  • the mesenchymal stem cells were subcultured twice, then collected and cryopreserved. After thawing the cryopreserved cells, using the cells subcultured once, the total protein concentration derived from the composition in the maintenance medium was set to a predetermined concentration (0, 0.2, 1.3, 31.3.
  • the proliferation activity and doubling time were calculated in the same manner as in Example 1 (5) above, except that the mixture was added so as to be 62.5 or 125 ⁇ g / ml).
  • FIG. 3 is a graph showing the proliferative activity of cells.
  • (A) shows proliferative activity and (B) shows doubling time.
  • the horizontal axis represents the total protein concentration derived from the composition, and the vertical axis represents the relative value of proliferative activity.
  • the horizontal axis represents the total protein concentration derived from the composition, and the vertical axis represents the doubling time.
  • the composition of the present invention when added, the proliferative activity of mesenchymal stem cells increases depending on the total protein concentration derived from the composition, and in particular, the total protein concentration is 31.
  • the proliferative activity of mesenchymal stem cells was remarkably increased.
  • the doubling time after the third passage was 17 hours in the mesenchymal stem cells to which the composition was not added.
  • the doubling time of mesenchymal stem cells was extended by about 1.5 times.
  • the composition of the present invention when the composition of the present invention is added, it is necessary for mesenchymal stem cells to proliferate once, depending on the total protein concentration derived from the composition.
  • the composition of the present invention was cultured in a medium to which no addition was added, the doubling time of mesenchymal stem cells was extended when the number of passages was obtained.
  • the composition of the present invention was added, the elongation of the doubling time was almost suppressed, and this effect was remarkable when the total protein concentration derived from the composition was 31.3 ⁇ g / ml or more. there were. Therefore, it was found that the composition of the present invention can exhibit cell growth promoting activity and suppress a decrease in growth activity.
  • composition of the present invention has a function-promoting activity of fibroblasts.
  • fibroblasts Normal human skin fibroblasts (nHDF, manufactured by KURABO, Cat. No .: KF-4109) lie down in a T-75 flask (manufactured by Sumilon) using a growth medium. , CO 2 incubator under predetermined culture conditions (5% CO 2 , 37 ° C., wet conditions, the same applies hereinafter).
  • the growth medium contains 10% fetal bovine serum (FBS, Sigma-Aldrich, Cat. No .: 172012) and 1% penicillin streptomycin (Thermo Fisher Scientific, Cat. No .: 15140-122).
  • a DMEM medium manufactured by nacalai tesque, Cat. No .: 08456-65 was used.
  • the medium was changed every 1 to 2 days. When the confluence of about 80% was reached, the cells were collected and used for the subsequent test.
  • the cell passage was carried out as follows. First, the cells were washed with phosphate buffer (PBS) (-/-) (manufactured by nacalai tesque, Cat. No .: 14249-95), and then a stripping solution (2.5 g / l-Trypsin / 1 mmol /). Cells were detached using l-EDTA Solution, with Phenol Red (0.25% Trypsin-EDTA), Thermo Fisher Scientific, Cat. No .: 32777-44), and growth medium was added to neutralize trypsin.
  • PBS phosphate buffer
  • a stripping solution 2.5 g / l-Trypsin / 1 mmol /
  • the cell suspension was collected in a 15 ml centrifuge tube and centrifuged (room temperature, 1000 rpm, 5 minutes) using a centrifuge (multipurpose cooling centrifuge, manufactured by TOMY, Cat. No .: CAX-571). did. After the centrifugation, the supernatant was removed, a new growth medium was added, the cells were stirred, and the number of viable cells was counted by the trypan blue method. The growth medium was used to adjust the cell concentration to the desired level, and the cells were seeded in an incubator used in subsequent tests.
  • a centrifuge multipurpose cooling centrifuge
  • the concentrations of total protein derived from the composition in each culture medium are 25 ⁇ g / ml (0.5%), 50 ⁇ g / ml (1%), 125 ⁇ g / ml (2.5%), 250 ⁇ g / ml. (5%) and 500 ⁇ g / ml (10%) (hereinafter, the same applies).
  • Two types of compositions prepared from platelet-depleted megakaryocyte cultures were used (iMDF1 and iMDF2). After the medium exchange, the cells were cultured for 48 hours.
  • the proliferative activity of the cells in each well was measured by measuring the number of viable cells by the WST-8 method.
  • the medium was replaced with DMEM medium containing 10% of a color-developing reagent (Cell Count Reagent SF, manufactured by nacalai tesque, Cat. No .: 07553-15), and incubated under the above culture conditions.
  • Negative control (NC) was carried out in the same manner except that the composition was not added.
  • FBS Positive control
  • ASA L-ascorbic acid
  • MeS N-Methyl-L-serine
  • FIG. 4 is a graph showing the proliferative activity of fibroblasts.
  • the horizontal axis represents the type and concentration of the sample, and the vertical axis represents the cell viability (proliferative activity).
  • any of the compositions prepared from the platelet-removed megakaryocyte cultures (iMDF1, iMDF2) or platelets (PLT, PLTMax Human Platelet Lysate, EMD Millipore, Cat. No .: SCM141) was added. Even in this case, the cell proliferation promoting effect was observed in a concentration-dependent manner. Moreover, the cell proliferation promoting activity of the composition of the present invention was considered to be higher than that of FBS at the same concentration.
  • the amount of type I collagen in the culture supernatant was measured by type I collagen measurement kit (Human Collagen type I, ELISA kit (without pepsin), ACEL, Cat. No .: EC1. -Measured using E105).
  • type I collagen measurement kit Human Collagen type I, ELISA kit (without pepsin), ACEL, Cat. No .: EC1. -Measured using E105.
  • the amount of hyaluronic acid in the culture supernatant was measured using a hyaluronic acid measurement kit (Hyaluronan DuoSet ELISA, manufactured by R & D Systems, Cat. No .: DY3614). The measurement method using each kit followed the attached protocol. Negative control (NC) was carried out in the same manner except that the above composition was not added.
  • NC Negative control
  • the FBS addition group was carried out in the same manner as in Example 3 (2) above.
  • the positive control (ASA or Mes) is L-ascorbic acid (ASA), which has collagen production promoting activity, instead of the above composition, manufactured by Fujifilm-Wako. , Cat. No.: 013-19641) was added so as to be 2 mmol / l, and for the sample used for hyaluronic acid measurement, instead of the above composition, N-methyl-L- having a hyaluronic acid production promoting activity was used.
  • the procedure was carried out in the same manner except that serine (N-Methyl-L-serine (MeS), manufactured by Sigma-Aldrich, Cat.
  • FIG. 5 is a graph showing the amount of type I collagen produced.
  • the horizontal axis represents the type of sample, and the vertical axis represents the amount of type I collagen produced.
  • the numerical value of ASA in the figure indicates the amount of collagen produced ( ⁇ g / ml) in the reference example (ASA).
  • ASA the amount of collagen produced in the reference example
  • FIG. 6 is a graph showing the amount of hyaluronic acid produced.
  • the horizontal axis represents the type and concentration of the sample, and the vertical axis represents the amount of hyaluronic acid produced.
  • an increase in the amount of hyaluronic acid produced was observed in a concentration-dependent manner when either the platelet-depleted megakaryocyte culture or the composition prepared from platelets was added.
  • the hyaluronic acid production promoting activity is an activity independent of the cell proliferation promoting activity, that is, the composition of the present invention acts on fibroblasts to promote hyaluronic acid production. It was presumed to be.
  • the composition of the present invention has a growth promoting activity of fibroblasts and a production promoting activity of extracellular matrix components such as type I collagen and hyaluronic acid.
  • the fibroblasts migrate to the damaged site and contribute to healing of the damaged site through cell division and secretion of extracellular matrix components. Since the composition of the present invention promotes these functions in fibroblasts, it was expected that it could promote the healing of skin disorders.
  • composition of the present invention has a function-promoting activity of keratinocytes.
  • Culture of keratinized cells Normal human epidermal keratinocytes (nHEK, manufactured by KURABO, Cat. No .: KK-4109) lie down in a T-75 flask (manufactured by Sumilon) using a growth medium. , CO 2 incubator under predetermined culture conditions (5% CO 2 , 37 ° C., wet conditions, the same applies hereinafter).
  • the growth medium was Humedia-KG2 medium (KURABO, Cat. No .: KK-2150S). In the culture, the medium was changed every 1 to 2 days.
  • the cells were collected and used for the subsequent test.
  • the cell passage was carried out as follows. First, the cells were washed with phosphate buffer (PBS) (-/-) (manufactured by nacalai tesque, Cat. No .: 14249-95), and then a stripping solution (2.5 g / l-Trypsin / 1 mmol /). Cells were detached using l-EDTA Solution, with Phenol Red (0.25% Trypsin-EDTA), Thermo Fisher Scientific, Cat. No .: 32777-44), and growth medium was added to neutralize trypsin.
  • PBS phosphate buffer
  • a stripping solution 2.5 g / l-Trypsin / 1 mmol /
  • the cell suspension was collected in a 15 ml centrifuge tube and centrifuged (room temperature, 1000 rpm, 5 minutes) using a centrifuge (multipurpose cooling centrifuge, manufactured by TOMY, Cat. No .: CAX-571). did. After the centrifugation, the supernatant was removed, a new growth medium was added, the cells were stirred, and the number of viable cells was counted by the trypan blue method. The growth medium was used to adjust the cell concentration to the desired level, and the cells were seeded in an incubator used in subsequent tests.
  • a centrifuge multipurpose cooling centrifuge
  • FIG. 7 is a photograph showing a phase difference image of cells in each well.
  • the addition group of the composition prepared from the platelet-depleted megakaryocyte cultures (iMDF1, iMDF2) or platelets (PLT) an example of the 10% addition group is shown as a representative example.
  • the boundary of keratinocytes was clear, and differentiation of the epithelial (epidermal) layer into cells (epidermal cells) was not observed.
  • keratinized cells were elongated on the plate and the cell boundaries were obscured.
  • the keratinocytes are differentiated into cells (epidermis cells) in the epithelial (epidermal) layer.
  • the proportion of cells in the epithelial (epidermal) layer increased in a concentration-dependent manner, and in particular, the platelet-depleted megakaryocytes.
  • a marked increase was observed when the bulb cultures (iMDF1, iMDF2) were used. From these results, it was found that the composition of the present invention promotes cell differentiation of keratinocytes into the epithelial layer.
  • FIG. 8 is a graph showing the proliferative activity of keratinocytes.
  • the horizontal axis represents the type and concentration of the sample, and the vertical axis represents the cell viability (proliferative activity).
  • the cell proliferation promoting effect was observed when either the platelet-depleted megakaryocyte culture (iMDF1, iMDF2) or the composition prepared from platelets (PLT) was added.
  • the cell proliferation promoting activity of the composition of the present invention was considered to be higher than that of FBS at the same concentration.
  • RNA extraction kit (RNeasy 96 Kit, manufactured by QIAGEN, Cat. No .: 74181). RNA extraction followed the protocol attached to the kit. The concentration of the obtained purified RNA was measured using a spectrophotometer (NanoDrop One, manufactured by Thermo Fisher Scientific, Cat. No .: ND-ONE-W), and the purity was confirmed by A260 / A280 and reversed. It was stored at ⁇ 80 ° C. until it was used for the photoreaction.
  • CDNA was synthesized from the purified RNA using a reverse transcription kit (QuantiTect Reverse Transcription Kit, manufactured by QIAGEN). The reverse transcription reaction followed the protocol attached to the kit. The obtained cDNA was stored at ⁇ 30 ° C. Next, using the obtained cDNA, the following primer set for the GAPDH gene, FLG gene or SPTLC1 gene, and the qPCR kit (TB Green Premix Ex Taq II (TliRNase H Plus), Takara, Cat. No .: RR820A). Quantitative PCR was performed. The PCR reaction was carried out by heat treatment at 95 ° C. for 30 seconds, followed by 40 cycles with 95 ° C., 5 seconds, 60 ° C.
  • Nicotinamide (NA, manufactured by Sigma-Aldrich) having an expression promoting activity of the SPTLC1 gene was used.
  • Cat. No .: N0636-100G was added so as to be 30 ⁇ mol / l, and the same procedure was carried out.
  • the group to which the additive was added was prepared and carried out in the same manner.
  • FIG. 9 is a graph showing the expression level of the FLG gene.
  • the horizontal axis represents the type and concentration of the sample, and the vertical axis represents the expression level of the FLG gene.
  • the effect of promoting the expression of the FLG gene was observed when either the platelet-depleted megakaryocyte culture (iMDF1, iMDF2) or the composition prepared from platelets (PLT) was added.
  • the expression promoting activity of the FLG gene of the composition of the present invention was considered to be higher than that of the positive control JTC801 at the same concentration.
  • FIG. 10 is a graph showing the expression level of the SPTLC1 gene.
  • the horizontal axis represents the type and concentration of the sample, and the vertical axis represents the expression level of the SPTLC1 gene.
  • the expression promoting effect of the SPTLC1 gene was observed when either the platelet-depleted megakaryocyte culture (iMDF1, iMDF2) or the composition prepared from platelets (PLT) was added.
  • the expression-promoting activity of the SPTLC1 gene of the composition of the present invention was considered to be higher than that of the positive control nicotinamide (NA) at the same concentration.
  • NA positive control nicotinamide
  • the composition of the present invention has an activity of promoting proliferation of keratinocytes, an activity of promoting differentiation into epidermal cells, and an activity of promoting expression of barrier function genes such as FLG gene and SPTLC1 gene. It is known that proliferation of keratinocytes, differentiation into epidermal cells, and induction of expression of barrier function genes are important for maintenance of skin tissue and its barrier function. Therefore, since the composition of the present invention promotes these functions in keratinocytes, it is expected that the composition can be used for maintaining skin conditioning such as maintenance of skin function and maintenance of skin barrier function.
  • composition of the present invention has a function-promoting activity of dermal papilla cells.
  • the cells were collected and used for the subsequent test.
  • the cell passage was carried out as follows. First, the cells were washed with phosphate buffer (PBS) (-/-) (manufactured by nacalai tesque, Cat. No .: 14249-95), and then a stripping solution (2.5 g / l-Trypsin / 1 mmol /). Cells were detached using l-EDTA Solution, with Phenol Red (0.25% Trypsin-EDTA), Thermo Fisher Scientific, Cat. No .: 32777-44), and growth medium was added to neutralize trypsin.
  • PBS phosphate buffer
  • a stripping solution 2.5 g / l-Trypsin / 1 mmol /
  • the cell suspension was collected in a 15 ml centrifuge tube and centrifuged (room temperature, 1000 rpm, 5 minutes) using a centrifuge (multipurpose cooling centrifuge, manufactured by TOMY, Cat. No .: CAX-571). did. After the centrifugation, the supernatant was removed, a new growth medium was added, the cells were stirred, and the number of viable cells was counted by the trypan blue method. The growth medium was used to adjust the cell concentration to the desired level, and the cells were seeded in an incubator used in subsequent tests.
  • a centrifuge multipurpose cooling centrifuge
  • FIG. 11 is a graph showing the proliferative activity of dermal papilla cells.
  • the horizontal axis represents the type and concentration of the sample, and the vertical axis represents the cell viability (proliferative activity).
  • the cell proliferation promoting effect was observed when either the platelet-depleted megakaryocyte culture (iMDF1, iMDF2) or the composition prepared from platelets (PLT) was added. In addition, it was suggested that 2.5 to 5% was pointed out as the addition amount.
  • qPCR was carried out in the same manner as in Example 4 (3) except that the primer set for the GAPDH gene, the following FGF7 gene or the VEGFA gene was used as the primer set. Negative control was carried out in the same manner except that the composition was not added.
  • Reference examples include minoxidil (Minoxidil, manufactured by Sigma-Aldrich, Cat. No .: M4145, final concentration 30 ⁇ mol / l) or adenosine (Adenosin, Sigma-Aldrich), which are known as hair growth agents, instead of the above composition.
  • the procedure was carried out in the same manner except that Cat. No .: A9251, final concentration 100 ⁇ mol / l) manufactured by the company was added.
  • FIG. 12 is a graph showing the expression level of the FGF7 gene.
  • the horizontal axis represents the type of sample, and the vertical axis represents the expression level of the FGF7 gene.
  • the expression-promoting activity of the FGF7 gene of the composition of the present invention was considered to be comparable to that of known hair growth agents at the same concentration.
  • FIG. 13 is a graph showing the expression level of the VEGFA gene.
  • the horizontal axis represents the type of sample, and the vertical axis represents the expression level of the VEGFA gene.
  • iMDF1, iMDF2 platelet-depleted megakaryocyte cultures
  • PHT platelets
  • the composition of the present invention has a growth promoting activity of dermal papilla cells and an expression promoting activity of hair growth genes such as FGF7 gene and VEGFA gene. It is known that the proliferation of dermal papilla cells and the induction of expression of hair growth genes are important for hair growth, hair growth and maintenance. Therefore, the composition of the present invention was expected to be usable for hair growth because it promotes these functions in dermal papilla cells.
  • composition> A composition comprising a processed product of megakaryocytes or a culture thereof.
  • Appendix 2 The composition according to Appendix 1, wherein the treated product is an extract of a cell fraction of megakaryocytes or a culture thereof.
  • Appendix 3 The composition according to Appendix 1 or 2, wherein the treated product contains 2000 to 20000 pg of basic fibroblast growth factor (bFGF) per 1 mg of total protein.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • (Appendix 10) The composition according to any one of Supplementary notes 1 to 9, wherein the treated product contains 0 to 1000 pg of bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) per 1 mg of total protein.
  • (Appendix 11) The composition according to any one of Supplementary notes 1 to 10, wherein the treated product contains 0 to 16 pg of amphiregulin (AR) per 1 mg of total protein.
  • (Appendix 12) The composition according to any of Supplementary note 1 to 11, wherein the treated product contains 0 to 60 pg of epidermal growth factor receptor (EGFR) per 1 mg of total protein.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • (Appendix 13) The composition according to any one of Supplementary notes 1 to 12, wherein the treated product contains 0 to 100 pg of hepatocyte growth factor (HGF) per 1 mg of total protein.
  • (Appendix 14) The composition according to any one of Supplementary notes 1 to 13, wherein the treated product contains 0 to 200 pg of insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1) per 1 mg of total protein.
  • (Appendix 15) The composition according to any one of Supplementary note 1 to 14, which has a cell growth promoting activity.
  • (Appendix 16) The composition according to Appendix 15, wherein the cells are mesenchymal stem cells, fibroblasts, keratinocytes, and / or dermal papilla cells.
  • composition according to any one of Supplementary note 1 to 16, which has a function-promoting activity of fibroblasts (Appendix 18) The composition according to Appendix 17, wherein the function of the fibroblasts is the proliferation of fibroblasts and / or the production of extracellular matrix by fibroblasts. (Appendix 19) The composition according to Appendix 18, wherein the extracellular matrix comprises collagen and / or hyaluronic acid. (Appendix 20) The composition according to any one of Supplementary notes 1 to 19, which has a function-promoting activity of keratinocytes.
  • (Appendix 21) The composition according to Appendix 20, wherein the function of the keratinocyte is proliferation of the keratinocyte, differentiation into epidermal cells, and / or induction of a barrier function gene.
  • (Appendix 23) The composition according to any one of Supplementary note 1 to 22, which has a function-promoting activity of dermal papilla cells.
  • (Appendix 24) 23 The composition according to Appendix 23, wherein the function of the dermal papilla cells is the proliferation of dermal papilla cells and / or the induction of a hair growth promoting gene.
  • Appendix 25 The composition according to Appendix 24, wherein the hair growth gene is an FGF7 gene and / or a VEGF gene.
  • Appendix 26 The composition according to any one of Appendix 1 to 25, wherein the culture of megakaryocytes is a culture from which platelets have been removed.
  • Appendix 27 The composition according to any one of Appendix 1 to 26, wherein the megakaryocyte is an immortalized megakaryocyte.
  • Appendix 28 The composition according to Appendix 27, wherein the immortalized megakaryocyte is a megakaryocyte containing an exogenous BMI1 gene, a MYC gene, and a Bcl-xL gene.
  • Appendix 29 The composition according to any one of Appendix 1 to 28, wherein the megakaryocyte is an in vitro-induced megakaryocyte.
  • Appendix 30 The composition according to any one of Appendix 1 to 29, wherein the megakaryocyte is derived from a pluripotent cell.
  • Appendix 31 The composition according to Appendix 30, wherein the pluripotent cells are induced pluripotent stem (iPS) cells.
  • Appendix 32 The processed product is Treat megakaryocytes or their cultures and The treatments are concentration treatment, drying treatment, freezing treatment, freeze-drying treatment, solvent treatment, surfactant treatment, enzyme treatment, protein fraction extraction treatment, sonication treatment, and / or crushing treatment, Appendix 1 to 31.
  • the composition according to any one of. (Appendix 33)
  • the processed product is Platelets are removed from the megakaryocytes or cultures thereof and 32.
  • the composition according to Appendix 32 which treats the megakaryocytes from which the platelets have been removed or a culture thereof.
  • the processed product is Preserving the platelet-depleted megakaryocytes or culture thereof, 33.
  • the composition according to Appendix 33 which treats the preserved megakaryocytes or a culture thereof.
  • the processed product is Preserve the megakaryocytes or cultures thereof and The composition according to Appendix 34, wherein the preserved megakaryocytes or a culture thereof is subjected to a crushing treatment.
  • ⁇ Manufacturing method of composition> (Appendix 36) Including a processing step of processing megakaryocytes or their cultures
  • the treatment in the treatment step is a composition, which is a concentration treatment, a drying treatment, a freezing treatment, a freeze-drying treatment, a solvent treatment, a surfactant treatment, an enzyme treatment, a protein fraction extraction treatment, an ultrasonic treatment, and / or a crushing treatment. Manufacturing method of things.
  • Appendix 37 Including a removal step of removing platelets from the megakaryocytes or a culture thereof. The production method according to Appendix 36, wherein in the treatment step, the megakaryocytes from which the platelets have been removed or a culture thereof is treated.
  • (Appendix 38) Including a preservation step of preserving the megakaryocytes from which the platelets have been removed or a culture thereof.
  • the production method according to Appendix 37 wherein in the treatment step, the preserved megakaryocytes or a culture thereof is treated.
  • (Appendix 39) Including a preservation step of preserving the megakaryocytes or a culture thereof.
  • the production method according to Appendix 38 wherein in the treatment step, the preserved megakaryocytes or a culture thereof is crushed.
  • (Appendix 40) A composition obtained by the production method according to any one of Supplementary note 36 to 39. ⁇ Cell proliferation promoting composition> (Appendix 41) A cell growth-promoting composition comprising the composition according to any one of Supplementary notes 1 to 35.
  • Appendix 42 The cell proliferation-promoting composition according to Appendix 42, wherein the cells are mesenchymal stem cells, fibroblasts, keratinocytes, and / or dermal papilla cells.
  • Method of promoting cell proliferation> Appendix 43
  • Appendix 44 The method for promoting cell proliferation according to Appendix 43, wherein the cells are mesenchymal stem cells, fibroblasts, keratinocytes, and / or dermal papilla cells.
  • Appendix 45 The method for promoting cell growth according to Appendix 43 or 44, wherein the cell growth promoting composition is used in vitro or in vivo.
  • ⁇ Fibroblast function promoting composition> Appendix 46
  • a fibroblast function-promoting composition comprising the composition according to any one of Supplementary notes 1 to 35.
  • Appendix 47 46.
  • the function-promoting composition according to Appendix 46, wherein the function of the fibroblasts is proliferation of fibroblasts and / or production of extracellular matrix by fibroblasts.
  • Appendix 48 The function-promoting composition according to Appendix 47, wherein the extracellular matrix contains collagen and / or hyaluronic acid.
  • ⁇ Method of promoting fibroblast function> (Appendix 49) A method for promoting fibroblast function using the fibroblast function promoting composition according to any one of Appendix 46 to 48. (Appendix 50) The method for promoting fibroblast function according to Appendix 50, wherein the fibroblast function promoting composition is used in vitro or in vivo.
  • ⁇ Skin disorder healing promoting composition> (Appendix 51) A composition for promoting healing of skin disorders, which comprises the composition according to any one of Supplementary notes 1 to 35.
  • Appendix 52 The healing-promoting composition according to Appendix 51, wherein the skin disorder is a skin ulcer, pressure ulcer, burn, scar, and / or wound.
  • Appendix 53 A method for promoting healing of skin disorders, which uses the composition for promoting healing of skin disorders according to Appendix 51 or 52.
  • Appendix 54 The method for promoting healing of skin disorders according to Appendix 53, wherein the composition for promoting healing of skin disorders is used in vitro or in vivo.
  • ⁇ Composition promoting function of keratinocytes> Appendix 55
  • a function-promoting composition for keratinocytes which comprises the composition according to any one of Supplementary notes 1 to 35.
  • Appendix 56 The function-promoting composition according to Appendix 55, wherein the function of the keratinocyte is proliferation of the keratinocyte, differentiation into epidermal cells, and / or induction of a barrier function gene.
  • Appendix 57 The function-promoting composition according to Appendix 56, wherein the barrier function gene contains a profilaggrin gene and / or a ceramide synthase gene.
  • Appendix 58 A method for promoting the function of keratinocytes, which comprises the composition for promoting the function of keratinocytes according to any one of Appendix 55 to 57.
  • Appendix 59 The method for promoting the function of keratinocytes according to Appendix 58, wherein the function-promoting composition for keratinocytes is used in vitro or in vivo.
  • ⁇ Function promoting composition of dermal papilla cells> Appendix 60
  • a dermal papilla cell function-promoting composition comprising the composition according to any one of Supplementary notes 1 to 35.
  • Appendix 61 The function-promoting composition according to Appendix 56, wherein the function of the dermal papilla cells is the induction of proliferation and / or hair growth-promoting genes of the dermal papilla cells.
  • Appendix 62 The function-promoting composition according to Appendix 57, wherein the barrier function gene contains a profilaggrin gene and / or a ceramide synthase gene.
  • Method 63 A method for promoting the function of dermal papilla cells, which uses the function-promoting composition for dermal papilla cells according to any one of Appendix 60 to 62.
  • Appendix 64 The method for promoting the function of dermal papilla cells according to Appendix 63, wherein the dermal papilla cell function promoting composition is used in vitro or in vivo.
  • ⁇ Hair growth promoting composition> (Appendix 65) A hair growth promoting composition comprising the composition according to any one of Supplementary notes 1 to 35.
  • ⁇ Hair growth promotion method> (Appendix 66) A method for promoting hair growth using the hair growth promoting composition according to Appendix 65.
  • Appendix 67 The method for promoting hair growth according to Appendix 66, wherein the hair growth promoting composition is used in vitro or in vivo.
  • ⁇ Use of composition> (Appendix 68) A composition comprising a processed product of megakaryocytes or a culture thereof as an active ingredient for use in promoting cell proliferation.
  • the composition of the present invention can promote cell proliferation of, for example, mesenchymal cells, fibroblasts, keratinocytes, hair papilla cells, etc., and also for skin ulcers, pressure ulcers, burns, scars, wounds, etc. It is expected that it can be suitably used for promoting healing of skin disorders, maintaining or improving the barrier function of the skin, hair growth, and the like. Therefore, the present invention is extremely useful in the fields of pharmaceuticals, regenerative medicine, and the like.

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Abstract

細胞由来の生理活性を有する組成物を提供する　本発明の組成物は、巨核球またはその培養物の処理物を含む。

Description

組成物およびその用途
　本発明は、組成物およびその用途に関する。
　再生医療用の治療薬として、間葉系幹細胞等の組織再生を促す細胞を細胞製剤として開発することが試みられている。また、前記組織再生を促す細胞は、成長因子等の生理活性を有するタンパク質を放出することにより、組織再生を促進していると考えられている。
　そこで、本発明は、細胞由来の生理活性を有する組成物を提供することを目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明の組成物は、巨核球またはその培養物の処理物を含む。
　本発明の細胞の増殖促進組成物（以下、「増殖促進組成物」ともいう）は、前記本発明の組成物を含む。
　本発明の線維芽細胞の機能促進組成物は、前記本発明の組成物を含む。
　本発明の皮膚障害の治癒促進組成物は、前記本発明の組成物を含む。
　本発明の角化細胞の機能促進組成物は、前記本発明の組成物を含む。
　本発明の毛乳頭細胞の機能促進組成物は、前記本発明の組成物を含む。
　本発明の発毛促進組成物は、前記本発明の組成物を含む。
　本発明によれば、細胞由来の生理活性を有する組成物を提供できる。
図１は、実施例１における濃縮システムの構成を示す模式図である。 図２は、実施例１における細胞の増殖活性を示すグラフであり、（Ａ）は、増殖活性の相対値を示し、（Ｂ）は、倍加時間を示す。 図３は、実施例２における細胞の増殖活性を示すグラフであり、（Ａ）は、増殖活性の相対値を示し、（Ｂ）は、倍加時間を示す。 図４は、実施例３における線維芽細胞の増殖活性を示すグラフである。 図５は、実施例３におけるＩ型コラーゲンの産出量を示すグラフである。 図６は、実施例３におけるヒアルロン酸の産生量を示すグラフである。 図７は、実施例４における細胞の位相差像を示す写真である。 図８は、実施例４における角化細胞の増殖活性を示すグラフである。 図９は、実施例４におけるＦＬＧ遺伝子の発現量を示すグラフである。 図１０は、実施例４におけるＳＰＴＬＣ１遺伝子の発現量を示すグラフである。 図１１は、実施例５における毛乳頭細胞の増殖活性を示すグラフである。 図１２は、実施例５におけるＦＧＦ７遺伝子の発現量を示すグラフである。 図１３は、実施例５におけるＶＥＧＦＡ遺伝子の発現量を示すグラフである。
＜組成物＞
本発明の組成物は、前述のように、巨核球またはその培養物の処理物を含む。本発明の組成物は、前述のように、巨核球またはその培養物の処理物を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の組成物によれば、例えば、細胞由来の生理活性を有する組成物を提供できる。本発明の組成物によれば、例えば、間葉系細胞、線維芽細胞、角化細胞、毛乳頭細胞等の細胞増殖を促進でき、また、皮膚の潰瘍、褥瘡、火傷、瘢痕、創傷、皮膚の老化等の皮膚障害の治癒促進、皮膚のバリア機能の維持または向上、発毛等に好適に利用できると期待される。
　本発明において、「巨核球」は、生体内においては骨髄中に存在する最大の細胞であり、血小板を放出する細胞および同等の機能を有する細胞を意味する。前記同等の機能を有する細胞は、血小板の産生能を有する細胞を意味する。本発明において、巨核球は、多核化（多倍体化）前の巨核球、すなわち、未成熟な巨核球または増殖期の巨核球でもよいし、多核化後の巨核球（多核化巨核球）でもよい。具体例として、前記巨核球は、例えば、前巨核芽球、巨核芽球、前巨核球、および成熟巨核球のいずれでもよい。前記多核化後の巨核球が有する染色体のセット数は、２セットを超えればよく、具体例として、１６～３２セットである。
　前記巨核球の由来は、特に制限されないが、例えば、ヒトおよび非ヒト動物があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、サル、ゴリラ、チンパンジー、マーモセット等の霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ヒツジ、ウマ、モルモット等があげられる。以下、他の細胞の由来も、同様である。
　本発明において、前記巨核球は、細胞表面マーカーにより特定できる。前記巨核球がヒト由来の場合、前記細胞表面マーカーは、CD41a、CD42aおよびCD42bがあげられる。すなわち、前記巨核球は、CD41a、CD42aおよびCD42bが陽性の細胞である。前記巨核球がヒト由来の場合、前記細胞表面マーカーは、例えば、CD9、CD61、CD62p、CD42c、CD42d、CD49f、CD51、CD110、CD123、CD131、およびCD203cからなる群から選択された少なくとも１つであってもよい。
　前記巨核球は、生体から単離した巨核球でもよいし、多能性細胞等の巨核球より未分化な細胞（以下、「前駆細胞」ともいう）から誘導された巨核球でもよい。前記「巨核球より未分化な細胞」は、前記巨核球への分化能を有する細胞を意味する。
　前記巨核球が生体から単離した巨核球である場合、前記巨核球は、例えば、骨髄中に存在するため、骨髄から単離できる。この場合、前記巨核球は、生体由来の他の細胞を含んでもよい。
　前記巨核球が前駆細胞から誘導された巨核球である場合、前記巨核球は、後述のように、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで誘導できる。この場合、前記巨核球は、前記前駆細胞を含んでもよい。前記前駆細胞は、例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、ＣＤ３４陽性細胞、巨核球・赤芽球前駆細胞（megakaryocyte-erythroid progenitor：MEP）、巨核球前駆細胞等があげられる。前記前駆細胞は、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血等から単離してもよいし、ＥＳ細胞（胚性幹細胞、embryonic stem cells）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells、iPS細胞）、核移植ＥＳ細胞（ntES細胞）、生殖性幹細胞、体性幹細胞、胚性腫瘍細胞等の多能性細胞から誘導してもよい。
　前記巨核球が前駆細胞から誘導された巨核球である場合、前記巨核球は、不死化巨核球が好ましい。前記不死化巨核球は、例えば、他の巨核球の誘導方法により誘導された巨核球と比較して、細胞の分化段階の均質性が高いため、得られた処理物における成分組成の変動を抑制できる。前記不死化巨核球は、例えば、後述のように、前記前駆細胞に、癌遺伝子およびポリコーム遺伝子、または、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、およびアポトーシス抑制遺伝子を導入することにより誘導される巨核球である。
　前記「癌遺伝子」は、生体内で細胞の癌化を誘導可能な遺伝子を意味し、例えば、ｃ－ＭＹＣ、Ｎ－ＭＹＣ、Ｌ－ＭＹＣ等のＭＹＣファミリー遺伝子、ＳＲＣファミリー遺伝子、ＲＡＳファミリー遺伝子、ＲＡＦファミリー遺伝子、ｃ－ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＰＤＧＦＲ（血小板成長因子受容体）、Ａｂｌ（Abelson murine leukemia viral oncogene homolog）等のプロテインキナーゼファミリー遺伝子等があげられる。
　前記「ポリコーム遺伝子」は、ＣＤＫＮ２ａ（サイクリン依存性キナーゼ阻害２Ａ、ＩＮＫ４ａ／ＡＲＦ）を負に制御し、細胞老化を回避するために機能すると知られている遺伝子を意味する（下記参考文献１～３）。具体例として、前記ポリコーム遺伝子は、例えば、BMI1（Polycomb complex protein BMI-1、polycomb group RING finger protein 4 (PCGF4)、RING finger protein 51 (RNF51)）、Mel18（Polycomb group RING finger protein 2）、Ring（Ring Finger Protein）1a/b、Phc（Polyhomeotic Homolog）1/2/3、Cbx（Chromobox）2/4/6/7/8、Ezh2（Enhancer Of Zeste 2 Polycomb Repressive Complex 2 Subunit）、Eed（Embryonic Ectoderm Development）、Suz12（SUZ12 Polycomb Repressive Complex 2 Subunit）、HADC（Histone deacetylases）、Dnmt（DNA (cytosine-5)-methyltransferase）1/3a/3b等があげられる。
参考文献１：小黒秀行ら、「ポリコーム群蛋白複合体による幹細胞の老化制御」、再生医療、２００７年、第６巻、第４号、２６－３２頁
参考文献２：Jesus Gil et.al, “ Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumour suppressor locus: all for one or one for all”, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2007, vol.7, pages 667-677
参考文献３：Soo-Hyun Kim et.al., “ Absence of p16INK4a and truncation of ARF tumor suppressors in chickens”, PNAS, 2003, vol.100, No.1, pages 211-216
　前記「アポトーシス抑制遺伝子」は、細胞のアポトーシスを抑制可能な機能を有する遺伝子を意味し、例えば、BCL2（B-cell lymphoma 2）、Bcl-xL（B-cell lymphoma-extra large）、Survivin（Baculoviral IAP Repeat Containing 5）、MCL1（BCL2 Family Apoptosis Regulator）等があげられる。
　前記不死化巨核球は、外来性のＢＭＩ１遺伝子、ＭＹＣ遺伝子、およびＢｃｌ－ｘＬ遺伝子を含む巨核球であることが好ましい。前記「外来性」は、細胞外から細胞内に導入されたことを意味する。前記外来性の遺伝子は、前記細胞の染色体上に存在してもよいし、核または細胞質内に存在してもよい。前記外来性の遺伝子は、例えば、当該遺伝子の数を測定することにより検出できる。前記遺伝子が常染色体上の遺伝子の場合、前記遺伝子は、各常染色体上に１つ存在するため、１つの細胞には、２つの遺伝子が存在する。このため、前記外来性の遺伝子が存在しないと、前記遺伝子は、１つの細胞において２つ検出される。他方、前記外来性の遺伝子が存在する場合、前記遺伝子は、１つの細胞において３つ以上検出される。この場合、前記外来性の遺伝子は、例えば、プライマーを用いたＰＣＲ、プローブ、またはこれらの組合せ等を用いて検出できる。前記外来性の遺伝子がタグ配列や選択マーカーを有する場合、前記外来性の遺伝子の検出は、前記タグ配列の検出または選択マーカーの検出により実施してもよい。また、前記外来性の遺伝子は、例えば、前記遺伝子から翻訳されるタンパク質に対して、抗体等を用いて検出できる。
　前記巨核球の培養物は、例えば、前記巨核球を培養することにより生産される培養物である。前記巨核球の培養は、例えば、後述のように、培地の存在下、前記巨核球を培養することにより実施できる。
　前記巨核球の培養物は、前記巨核球を培養して得られる物であるため、例えば、細胞成分として、前記巨核球および巨核球から産生される血小板を含む混合物である。前記細胞成分は、細胞および血小板を意味する。前述のように、前記巨核球は、前記巨核球より未分化な細胞より誘導できる。このため、前記巨核球の培養物を生産するための巨核球として、前記巨核球より未分化な細胞より誘導された巨核球を含む場合、前記巨核球の培養物は、前記巨核球より未分化な細胞を含んでもよい。
　本発明において、前記巨核球の培養物は、前記巨核球を培養して得られた培養物そのものでもよいし、前記培養物を加工したものでもよい。前記培養物の加工は、例えば、液体画分の除去、細胞成分画分の抽出、血小板を含む細胞成分の組成の変更等があげられる。前記細胞成分の組成の変更は、例えば、前記混合物における細胞および／または血小板の除去、前記混合物における細胞および／または血小板の抽出、前記混合物への細胞および／または血小板の追加等があげられる。
　前記「血小板」は、血液中の細胞成分の一つであり、CD41aおよびCD42bが陽性である細胞成分を意味する。前記血小板は、例えば、細胞核を有さず、また、前記巨核球と比較して、大きさが小さい。このため、前記血小板と前記巨核球とは、例えば、細胞核の有無および／または大きさにより区別できる。前記血小板は、血栓形成と止血において重要な役割を果たすとともに、損傷後の組織再生や炎症の病態生理にも関与することが知られている。また、前記血小板は、出血等により血小板が活性化されると、その膜上にIntegrin αIIBβ3（glycoprotein IIb/IIIa; CD41aとCD61の複合体）等の細胞接着因子の受容体が発現することが知られている。また、前記血小板が活性化されると、血小板同士が凝集し、血小板から放出される各種の血液凝固因子によってフィブリンが凝固することにより、血栓が形成され、止血が進む。本発明において、前記血小板の由来は、前記巨核球の由来と同じである。
　本発明において、前記処理物は、前記巨核球から調製してもよいし、前記巨核球の培養物から調製してもよい。また、前記巨核球の培養物から調製する場合、前記巨核球の培養物は加工されてもよい。具体例として、前記処理物は、例えば、前記巨核球またはその培養物の細胞画分または液体画分の処理物でもよいし、前記巨核球またはその培養物を加工した加工物の処理物でもよい。前記処理物の調製における処理は、特に制限されず、例えば、濃縮処理、分離処理または精製処理等の細胞成分の密度を変更する処理；乾燥処理、凍結処理、凍結乾燥処理、溶媒処理、界面活性剤処理、酵素処理、タンパク質画分抽出処理等の細胞の成分を抽出する抽出処理；磨砕処理、粉砕処理等の破砕処理；等があげられる。前記処理物の具体例としては、例えば、前記巨核球またはその培養物の濃縮物、乾燥物、凍結物、凍結乾燥物、溶媒処理物、界面活性剤処理物、酵素処理物、タンパク質分画物、超音波処理物等の抽出物；磨砕処理物、粉砕処理物等の破砕処理物；前記巨核球またはその培養物の細胞画分の濃縮物、乾燥物、凍結物、凍結乾燥物、溶媒処理物、界面活性剤処理物、酵素処理物、タンパク質分画物、超音波処理物の抽出物；磨砕処理物、粉砕処理物等の破砕処理物；等があげられる。前記処理物は、１種類の処理物から構成されてもよいし、２種類以上の処理物の混合物でもよい。前記混合物は、特に制限されず、任意の処理物の組み合わせおよび比率で混合した混合物とすることができる。
　前記処理物は、例えば、１以上の成長因子および成長因子受容体の少なくとも一方を含む。また、前記処理物は、例えば、細胞の増殖促進活性等の生理活性を有する。さらに、前記処理物は、例えば、前述のように、前記巨核球またはその培養物を処理することにより製造できる。このため、本発明において、前記処理物は、例えば、下記条件（１）～（３）を用いて規定できる。前記処理物は、例えば、下記条件（１）～（３）のいずれかにより規定されてもよいし、複数の条件により規定されてもよいし、全ての条件により規定されてもよい。具体例として、前記処理物は、例えば、条件の組合せにより規定できる。
（条件）
（１）成長因子および／または成長因子受容体の含有量；
（２）処理物の生理活性；
（３）処理物の製造方法
（条件の組合わせ）
条件（１）、（２）、または（３）；
条件（１）および（２）、条件（１）および（３）、または条件（２）および（３）；
条件（１）、（２）、および（３）
（１）条件（１）
　条件（１）は、前述のように、成長因子および／または成長因子受容体の含有量に関する条件である。前記条件（１）は、前記成長因子の含有量または前記成長因子受容体の含有量を規定してもよいし、前記成長因子の含有量および前記成長因子受容体の含有量を規定してもよい。また、前記条件（１）の規定に用いる成長因子は、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。前記条件（１）の規定に用いる成長因子受容体は、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。
　前記条件（１）において、前記成長因子は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－１（ＩＧＦＢＰ－１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－２（ＩＧＦＢＰ－２）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－３（ＩＧＦＢＰ－３）、インスリン様増殖因子結合タンパク質－６（ＩＧＦＢＰ－６）、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、内分泌腺由来血管内皮増殖因子（ＥＧ－ＶＥＧＦ）、分化増殖因子－１５（ＧＤＦ－１５）、アンフィレグリン（ＡＲ）、骨形成タンパク質－５（ＢＭＰ－５）、骨形成タンパク質－７（ＢＭＰ－７）、肝臓増殖因子（ＨＧＦ）、ＴＧＦβ１（トランスフォーミング成長因子β１）等があげられる。
　前記条件（１）において、前記成長因子受容体は、幹細胞因子受容体（ＳＣＦＲ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）等があげられ
　前記含有量は、例えば、前記処理物における各成長因子および各成長因子受容体の重量でもよいし、前記処理物の総タンパク質の重量に対する各成長因子および各成長因子受容体の重量（総タンパク質あたりの含有量）でもよいが、後者が好ましい。
　前記総タンパク質の重量は、例えば、ＢＣＡタンパク質定量法により決定できる。前記ＢＣＡタンパク質定量法は、１価の銅イオンと、２分子のビシンコニン酸との配位結合を利用したタンパク質の定量方法である。前記ＢＣＡタンパク質定量法に供するサンプルは、例えば、還元剤および／または銅イオンのキレート剤を含まないことが好ましい。前記ＢＣＡタンパク質定量法は、下記参考文献４に準じて実施でき、例えば、市販のキット等を用いてもよい。前記ＢＣＡタンパク質定量法のキットとしては、Pierce（商標） BCA Protein Assay Kit（Thermo Fisher Scientific社製）等が利用できる。
参考文献４：長谷　俊治ら、「やさしい原理からはいるタンパク質科学実験法1 タンパク質をつくる 抽出・精製と合成」、化学同人、2008年12月13日
　前記処理物における総タンパク質濃度は、例えば、処理に供する細胞数と、処理物における溶媒の体積により適宜設定できる。前記処理物における総タンパク質濃度は、例えば、前記処理に供する細胞数を増加させる、前記処理物における溶媒の体積を低減する、または前記巨核球から抽出することにより、前記処理物における総タンパク質濃度を相対的に高くできる。また、前記処理物における総タンパク質濃度は、例えば、前記処理に供する細胞数を低減する、前記処理物における溶媒の体積を増加させる、または前記巨核球の培養物から抽出することにより、前記処理物における総タンパク質濃度を相対的に低くできる。具体例として、前記処理に供する細胞数が１×１０８細胞であり、前記処理物における溶媒の体積が１００μｌの場合、前記処理物における総タンパク質濃度は、例えば、０．１～２００ｍｇ／ｍｌである。前記溶媒は、例えば、後述の水性溶媒である。
　前記成長因子および成長因子受容体の重量は、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により決定できる。前記サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、下記参考文献５に準じて実施でき、例えば、市販のキット等を用いてもよい。前記サンドイッチＥＬＩＳＡ法のキットとしては、Quantibody（登録商標） Human Growth Factor Array 1（RayBiotech社製）等が利用できる。
参考文献５：生物化学的測定研究会編集、「免疫測定法　基礎から先端まで」、講談社、２０１４年１２月２０日
　前記処理物における前記成長因子の含有量および成長因子受容体の含有量としては、例えば、以下の例が挙げられる。
　前記成長因子がｂＦＧＦの場合、前記処理物は、例えば、総タンパク質１ｍｇあたり、２０００～２００００ｐｇ、５０００～２００００ｐｇ、または１００００～２００００ｐｇのｂＦＧＦを含む。前記処理物は、例えば、ｂＦＧＦを含有することにより、後述のように、細胞増殖の促進活性を示す。
前記成長因子がＩＧＦＢＰ－１の場合、前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～２００ｐｇ、０．０１～２００ｐｇ、０．０１～１００ｐｇ、または０．０１～５０ｐｇのＩＧＦＢＰ－１を含む。
前記成長因子がＩＧＦＢＰ－２の場合、前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、８０００～８００００ｐｇ、１００００～８００００ｐｇ、または２００００～８００００ｐｇのＩＧＦＢＰ－２を含む。
前記成長因子がＰＩＧＦの場合、前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、１～６０ｐｇ、１～３０ｐｇ、または１～２０ｐｇのＰＩＧＦを含む。
前記成長因子がＶＥＧＦの場合、前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２０～８００ｐｇ、２０～６００ｐｇ、または２０～４００ｐｇのＶＥＧＦを含む。
前記成長因子がＧＤＦ－１５の場合、前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、１０００～１００００ｐｇ、１０００～５０００ｐｇ、または２０００～５０００ｐｇのＧＤＦ－１５を含む。
前記成長因子がＡＲの場合、前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～１６ｐｇ、０．０１～１６ｐｇ、０．１～１６ｐｇ、または１～１６ｐｇのＡＲを含む。
前記成長因子がＨＧＦの場合、前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～１００ｐｇ、０．０１～１００ｐｇ、０．０１～５０ｐｇ、または０．０１～３０ｐｇのＨＧＦを含む。
前記成長因子がＢＭＰ－７の場合、前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～１０００ｐｇ、０．０１～１０００ｐｇのＢＭＰ－７を含む。
前記成長因子受容体がＳＣＦＲの場合、前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２００～２０００ｐｇ、３００～１５００ｐｇ、または４００～１０００ｐｇのＳＣＦＲを含む。
前記成長因子受容体がＥＧＦＲの場合、前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～６０ｐｇ、０．０１～６０ｐｇ、１～５０ｐｇ、１～４５ｐｇ、または１０～４０ｐｇのＥＧＦＲを含む。
前記成長因子受容体がＶＥＧＦＲ２の場合、前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２０～４００ｐｇ、５０～３５０ｐｇ、または１００～３００ｐｇのＶＥＧＦＲ２を含む。
　前記条件（１）は、前述のように、１または２種類以上の成長因子の含有量で規定してもよいし、１または２種類以上の成長因子受容体の含有量で規定してもよいし、これらの含有量を任意に組合わせて規定してもよい。この場合、前記条件（１）は、例えば、下記条件（Ａ１）～（Ａ９）および（Ｂ１）～（Ｂ３）からなる群から選択された少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の条件で規定される。具体例として、前記成長因子の含有量および／または成長因子受容体の含有量の組合せとしては、下記の組合せが例示できる。
（成長因子の含有量および／または成長因子受容体の含有量の組合せ）
（Ａ１）～（Ａ９）および（Ｂ１）～（Ｂ３）のいずれか１つの条件：
（Ａ１）ｂＦＧＦの含有量、（Ａ２）ＩＧＦＢＰ－１の含有量、（Ａ３）ＩＧＦＢＰ－２の含有量、（Ａ４）ＰＩＧＦの含有量、（Ａ６）ＶＥＧＦの含有量、（Ａ６）ＧＤＦ－１５の含有量、（Ａ７）ＡＲの含有量、（Ａ８）ＨＧＦの含有量、（Ａ９）ＢＭＰ－７の含有量、（Ｂ１）ＳＣＦＲの含有量、（Ｂ２）ＥＧＦＲの含有量、または（Ｂ３）ＶＥＧＦＲ２の含有量；
（Ａ１）～（Ａ９）および（Ｂ１）～（Ｂ３）のいずれか２つの条件：
（Ａ１）および（Ａ２）、（Ａ１）および（Ａ３）、（Ａ１）および（Ａ４）、（Ａ１）および（Ａ５）、（Ａ１）および（Ａ６）、（Ａ１）および（Ａ７）、（Ａ１）および（Ａ８）、（Ａ１）および（Ａ９）、（Ａ１）および（Ｂ１）、（Ａ１）および（Ｂ２）、（Ａ１）および（Ｂ３）、
（Ａ２）および（Ａ３）、（Ａ２）および（Ａ４）、（Ａ２）および（Ａ５）、（Ａ２）および（Ａ６）、（Ａ２）および（Ａ７）、（Ａ２）および（Ａ８）、（Ａ２）および（Ａ９）、（Ａ２）および（Ｂ１）、（Ａ２）および（Ｂ２）、（Ａ２）および（Ｂ３）、
（Ａ３）および（Ａ４）、（Ａ３）および（Ａ５）、（Ａ３）および（Ａ６）、（Ａ３）および（Ａ７）、（Ａ３）および（Ａ８）、（Ａ３）および（Ａ９）、（Ａ３）および（Ｂ１）、（Ａ３）および（Ｂ２）、（Ａ３）および（Ｂ３）、
（Ａ４）および（Ａ５）、（Ａ４）および（Ａ６）、（Ａ４）および（Ａ７）、（Ａ４）および（Ａ８）、（Ａ４）および（Ａ９）、（Ａ４）および（Ｂ１）、（Ａ４）および（Ｂ２）、（Ａ４）および（Ｂ３）、
（Ａ５）および（Ａ６）、（Ａ５）および（Ａ７）、（Ａ５）および（Ａ８）、（Ａ５）および（Ａ９）、（Ａ５）および（Ｂ１）、（Ａ５）および（Ｂ２）、（Ａ５）および（Ｂ３）、
（Ａ６）および（Ａ７）、（Ａ６）および（Ａ８）、（Ａ６）および（Ａ９）、（Ａ６）および（Ｂ１）、（Ａ６）および（Ｂ２）、（Ａ６）および（Ｂ３）、
（Ａ７）および（Ａ８）、（Ａ７）および（Ａ９）、（Ａ７）および（Ｂ１）、（Ａ７）および（Ｂ２）、（Ａ７）および（Ｂ３）、
（Ａ８）および（Ａ９）、（Ａ８）および（Ｂ１）、（Ａ８）および（Ｂ２）、（Ａ８）および（Ｂ３）、
（Ａ９）および（Ｂ１）、（Ａ９）および（Ｂ２）、（Ａ９）および（Ｂ３）、
（Ｂ１）および（Ｂ２）、（Ｂ１）および（Ｂ３）、または
（Ｂ２）および（Ｂ３）。
　前記総タンパク質あたりの含有量は、例えば、本発明の組成物の用途に応じて、前記成長因子および成長因子受容体以外の他のタンパク質を追加または除去することにより、調整してもよい。前記他のタンパク質は、例えば、前記成長因子および成長因子受容体の活性に影響を与えないタンパク質があげられ、具体例として、ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン、ヒトガンマグロブリン等のガンマグロブリン等があげられる。前記タンパク質の除去は、例えば、カラムを用いた除去、抗体を用いた除去等があげられる。
（２）条件（２）
　条件（２）は、前述のように、処理物の生理活性に関する条件である。前記条件（２）において、前記処理物の生理活性は、例えば、細胞、組織、または臓器の機能を調節する活性を意味する。前記細胞の機能は、例えば、増殖、分化、遺伝子発現の誘導または抑制、タンパク質、糖鎖等の生体高分子の発現の誘導または抑制等があげられる。
　前記処理物の生理活性は、例えば、細胞の増殖促進活性、線維芽細胞の機能促進活性、角化細胞の機能促進活性、毛乳頭細胞の機能促進活性等があげられる。前記細胞の増殖促進活性において、前記細胞は、特に制限されず、例えば、間葉系幹細胞、線維芽細胞、表皮角化細胞等の角化細胞、頭皮毛乳頭細胞等の毛乳頭細胞等があげられる。前記処理物は、例えば、１つの活性を有してもよいし、複数の活性を有してもよい。
　前記間葉系幹細胞は、自己複製能を有し、骨、軟骨、および脂肪細胞への分化能を有する細胞である。前記間葉系幹細胞は、細胞表面マーカーにより特定できる。前記間葉系幹細胞は、例えば、CD73、CD90、およびCD105陽性、ならびにCD14、CD34およびCD45陰性である。
　前記線維芽細胞は、皮膚、肺、心臓といった臓器の結合組織を構成する一細胞であり、線維成分（コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸等の細胞外マトリックス成分）を供給する細胞である。前記線維芽細胞は、細胞表面マーカーにより特定できる。前記線維芽細胞は、例えば、ビメンチン、CD90、TE-7抗体陽性である。
　前記角化細胞は、表皮細胞のうち、角質化能力を有する細胞であり、表皮の基底層で分裂し、表皮形成に寄与する細胞である。前記角化細胞は、細胞表面マーカーにより特定できる。前記角化細胞は、例えば、アンドロゲン受容体、サイトケラチン陽性である。前記角化細胞は、表皮角化細胞が好ましい。
　前記毛乳頭細胞は、毛包基部において、毛乳頭内に存在する細胞であり、発毛の誘導および維持に重要な細胞である。前記毛乳頭細胞は、細胞表面マーカーおよび／または遺伝子発現により特定できる。前記毛乳頭細胞は、例えば、アルカリフォスファターゼ陽性；SOX2遺伝子、WIF1遺伝子、Noggin遺伝子、BMP4遺伝子、VCAN遺伝子陽性；である。前記毛乳頭細胞は、頭皮毛乳頭細胞が好ましい。
　前記細胞の増殖促進活性は、例えば、本発明の組成物を添加しない以外は同様の対照群と比較して、細胞の増殖能が向上していればよく、例えば、開始時より、細胞の増殖能が低下していてもよい。この場合、前記「増殖促進活性」は、例えば、増殖活性の低下の抑制ということもできる。具体例として、前記間葉系幹細胞は、継代を行なう毎に増殖活性が低下する。本発明の組成物によれば、前記間葉系幹細胞の増殖活性の低下を抑制できるため、例えば、本発明の組成物は、増殖促進活性を示すといえる。前記細胞の増殖促進活性は、例えば、対象の細胞が増殖する培養条件下で測定できる。前記培養条件は、例えば、前記細胞の種類に応じて、適宜設定できる。具体例として、前記細胞として間葉系幹細胞を用いる場合、前記細胞の増殖活性は、例えば、ヒト由来間葉系幹細胞を、増殖培地の存在下、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養することにより測定できる。前記間葉系幹細胞の増殖活性は、例えば、後述の実施例１に基づき測定できる。また、前記細胞として線維芽細胞を用いる場合、前記細胞の増殖活性は、例えば、ヒト由来線維芽細胞を、増殖培地の存在下でｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養することにより測定できる。前記線維芽細胞の増殖活性は、例えば、後述の実施例３に基づき測定できる。前記細胞として角化細胞を用いる場合、前記細胞の増殖活性は、例えば、ヒト由来表皮角化細胞を、増殖培地の存在下でｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養することにより測定できる。前記角化細胞の増殖活性は、例えば、後述の実施例４に基づき測定できる。前記細胞として毛乳頭細胞を用いる場合、前記細胞の増殖活性は、例えば、ヒト由来頭髪毛乳頭細胞を、増殖培地の存在下でｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養することにより測定できる。前記毛乳頭細胞の増殖活性は、例えば、後述の実施例５に基づき測定できる。
　前記線維芽細胞の機能促進活性は、例えば、本発明の組成物を添加しない以外は同様の対照群と比較して、線維芽細胞の機能が向上していればよい。前記線維芽細胞の機能は、例えば、前記線維芽細胞の増殖および線維芽細胞による細胞外マトリックスの産生のいずれの意味でもよい。前記細胞外マトリックスは、例えば、Ｉ型コラーゲン等のコラーゲン類、エラスチン等の線維性物質；ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等のグリコサミノグリカンやプロテオグリカン、インテグリン、フィブロネクチン、ラミニンといった細胞接着性タンパク質等の基質性物；等があげられる。前記線維芽細胞の機能は、例えば、後述の実施例３に基づき測定できる。
　前記角化細胞の機能促進活性は、例えば、本発明の組成物を添加しない以外は同様の対照群と比較して、角化細胞の機能が向上していればよい。前記角化細胞の機能は、例えば、前記角化細胞の増殖、表皮細胞への分化、およびバリア機能遺伝子の誘導のいずれの意味でもよい。前記バリア機能遺伝子は、例えば、皮膚のバリア機能を維持するために機能する遺伝子を意味し、具体例として、プロフィラグリン遺伝子（ＦＬＧ）、セラミド合成酵素遺伝子（serine palmitoyltransferase long chain base subunit 1：ＳＰＴＬＣ１）等があげられる。前記プロフィラグリン遺伝子として、ヒト由来プロフィラグリン遺伝子は、例えば、GenbankにAccession No.：NM_002016.2で登録されている塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。前記セラミド合成酵素遺伝子として、ヒト由来セラミド合成酵素遺伝子は、例えば、GenbankにAccession No.：NM_001281303.2で登録されている塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。前記角化細胞の機能は、例えば、後述の実施例４に基づき測定できる。
　前記毛乳頭細胞の機能促進活性は、例えば、本発明の組成物を添加しない以外は同様の対照群と比較して、毛乳頭細胞の機能が向上していればよい。前記毛乳頭細胞の機能は、例えば、前毛乳頭細胞の増殖および発毛促進遺伝子の誘導のいずれの意味でもよい。前記発毛促進遺伝子は、例えば、発毛、毛の成長または維持に機能する遺伝子を意味し、具体例として、ＦＧＦ７（fibroblast growth factor 7）遺伝子および血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor、ＶＥＧＦ）遺伝子等があげられる。前記ＶＥＧＦは、例えば、ＶＥＧＦＡ等があげられる。前記ＦＧＦ７遺伝子として、ヒト由来プロＦＧＦ７遺伝子は、例えば、GenbankにAccession No.：NM_002009.4で登録されている塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。前記ＶＥＧＦＡ遺伝子として、ヒト由来ＶＥＧＦＡ遺伝子は、例えば、GenbankにAccession No.：NM_001025366.3で登録されている塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。前記毛乳頭細胞の機能は、例えば、後述の実施例５に基づき測定できる。
（３）条件（３）
　条件（３）は、前述のように、処理物の製造方法に関する条件である。本発明の組成物における処理物の製造方法については、後述の本発明の組成物の製造方法の説明を援用できる。
　本発明の組成物は、例えば、後述の本発明の組成物の製造方法により製造できる。
　本発明の組成物は、例えば、後述するように、細胞の増殖促進組成物、線維芽細胞の機能促進組成物、角化細胞の機能促進組成物、毛乳頭細胞の機能促進組成物等として使用できる。また、本発明の組成物は、上述の活性から、例えば、皮膚障害の治癒促進組成物、発毛促進組成物として好適に使用できると期待される。本発明の使用方法については、後述の細胞の増殖促進組成物、線維芽細胞の機能促進組成物、角化細胞の機能促進組成物、および毛乳頭細胞の機能促進組成物の説明を援用できる。また、本発明の組成物は、例えば、膝関節損傷、腱損傷、または靭帯損傷の修復；潰瘍、褥瘡、火傷、瘢痕、または創傷の治療；皮膚質感改善；増毛；および／または美肌；等に使用できる。
＜組成物の製造方法＞
　本発明の組成物の製造方法（以下、「製造方法」ともいう）は、巨核球またはその培養物を処理する処理工程を含む。本発明の製造方法は、前記処理工程を含むことが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の製造方法によれば、本発明の組成物を製造できる。本発明の製造方法は、前記本発明の組成物の説明を援用できる。
　本発明の製造方法において、前記処理工程における処理対象は、巨核球またはその培養物である。このため、本発明の製造方法は、前記処理工程に先立ち、巨核球より未分化な細胞から前記巨核球を誘導する巨核球誘導工程および／または前記巨核球の培養物を生産する生産工程を含んでもよい。
　前記巨核球誘導工程において、前記巨核球の誘導方法は、特に制限されず、公知の誘導方法により実施できる。具体例として、前記巨核球の誘導方法は、例えば、国際公開第２０１１／０３４０７３号（米国特許出願公開2012/0238023号公報）、国際公開２０１２／１５７５８６号（米国特許出願公開2014/0127815号公報）、国際公開第２０１４／１２３２４２号（米国特許出願公開2016/0002599号公報）等の不死化巨核球の誘導方法；下記参考文献６に記載された巨核球の誘導方法；等を参照でき、ここに本明細書の一部を構成するものとして援用する。具体例として、前記巨核球誘導工程では、例えば、前記巨核球より未分化な細胞に、前記癌遺伝子および前記ポリコーム遺伝子を強制発現させてもよい。これにより、前記巨核球誘導工程では、例えば、無限に増殖する不死化巨核球を得ることができる。さらに、例えば、前記不死化巨核球の前記強制発現を解除することにより、前記不死化巨核球を多核化巨核球に誘導し、血小板を産生させることができる。また、前記巨核球誘導工程では、例えば、前記巨核球前駆細胞に前記アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させてもよい。これにより、前記巨核球誘導工程では、前記不死化巨核球を得ることができる。さらに、例えば、前記不死化巨核球の前記強制発現を解除することにより、前記不死化巨核球から多核化巨核球を誘導し、血小板を産生させることができる。
参考文献６：Ann-Kathrin Borger et.al., “Generation of HLA-Universal iPSC-Derived Megakaryocytes and Platelets for Survival Under Refractoriness Conditions”, Mol. Med., 2016, vol. 22, pages 274-288
　前記巨核球誘導工程では、例えば、前記癌遺伝子、前記ポリコーム遺伝子、および前記アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させてもよい。この場合、前記癌遺伝子、前記ポリコーム遺伝子、および前記アポトーシス抑制遺伝子の強制発現は、同時に行なってもよいし、別個に行なってもよい。具体例として、前記巨核球誘導工程では、前記癌遺伝子および前記ポリコーム遺伝子を強制発現後、前記強制発現を解除し、つぎに、前記アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させてもよいし、前記癌遺伝子、前記ポリコーム遺伝子、および前記アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させてもよいし、前記癌遺伝子および前記ポリコーム遺伝子を強制発現させ、さらに、前記アポトーシス抑制遺伝子を発現させてもよい。これにより、前記巨核球誘導工程では、前記不死化巨核球を得ることができる。さらに、例えば、前記不死化巨核球の前記強制発現を解除することにより、前記不死化巨核球から多核化巨核球を誘導し、血小板を産生させることができる。
　前記巨核球誘導工程は、例えば、各遺伝子の導入効率を向上できることから、前記巨核球より未分化な細胞に、癌遺伝子およびポリコーム遺伝子を強制発現させる第１の発現工程と、前記未分化な細胞において、Ｂｃｌ－ｘＬ遺伝子等のアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させる第２の発現工程と、前記強制発現を全て解除する解除工程とを含むことが好ましい。
　各遺伝子の強制発現および強制発現の解除は、例えば、国際公開第２０１１／０３４０７３号、国際公開第２０１２／１５７５８６号、国際公開第２０１４／１２３２４２号または下記参考文献７に記載された方法等の公知の方法、またはそれに準ずる方法で実施でき、ここに本明細書の一部を構成するものとして援用する。具体例として、各遺伝子の強制発現および強制発現の解除は、例えば、薬剤応答性の遺伝子発現誘導システムを用いて実施できる。前記遺伝子発現誘導システムは、例えば、Ｔｅｔ－ｏｎ（登録商標）システム、Ｔｅｔ－ｏｆｆ（登録商標）システム等があげられる。前記Ｔｅｔ－ｏｎシステムを用いる場合、例えば、前記強制発現する工程では、テトラサイクリン、ドキシサイクリン等の遺伝子発現を誘導する薬剤の存在下、培養を実施し、前記強制発現を解除する工程では、前記薬剤の非存在下で、前記培養を実施する。
参考文献７：Nakamura S et al, “Expandable megakaryocyte cell lines enable clinically applicable generation of platelets from human induced pluripotent stem cells.”, Cell Stem Cell, 2014, vol.14, No.4, pages 535-548
　つぎに、前記生産工程では、前記巨核球の培養物を生産する。前記生産工程は、例えば、培地の存在下、前記巨核球を培養することにより実施できる。前記巨核球の培養は、例えば、フィーダ細胞上で実施してもよいし、フィーダ細胞なしで実施してもよい。前記巨核球は、例えば、浮遊培養できるため、前記フィーダ細胞なしで培養できる。前記巨核球の培養物は、例えば、前記血小板を含む。
　前記巨核球の培養条件は、特に制限されず、前記巨核球の通常の培養条件を採用できる。具体例として、培養温度は、例えば、約３５～約４２℃、約３６～約４０℃、約３７～約３９℃である。ＣＯ２濃度は、例えば、約５～約１５％である。Ｏ２濃度は、例えば、約１５～約２５％、約２０％である。培養期間は、特に制限されず、例えば、約１日～約２週間、約４～約８日である。
　前記培地は、特に制限されず、例えば、前記巨核球から血小板が産生するのに好適な公知の培地およびそれに準ずる培地があげられる。具体例として、前記培地は、例えば、動物細胞の培養に用いる培地を基礎培地として調製することができる。前記基礎培地は、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle’s Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco’s modified Eagle’s Medium（DMEM）、Ham’s F12培地、RPMI1640培地、Fischer’s培地、Neurobasal（登録商標） Medium（Thermo Fisher Scientific社製）等の単独培地またはこれらの混合培地があげられる。前記培地は、例えば、血清または血漿を含んでもよいし、これらを含まない無血清培地でもよい。前記血清および血漿の由来は、前記巨核球の由来と同じ由来であることが好ましい。具体例として、前記巨核球がヒト由来である場合、前記血清および血漿は、それぞれ、ヒト由来であることが好ましい。
　前記培地は、例えば、他の成分を含んでもよい。前記他の成分は、特に制限されず、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、モノチオグリセロール（ＭＴＧ）、脂質、アミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン）、アスコルビン酸、ヘパリン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカイン等があげられる。前記他の成分は、例えば、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。前記サイトカインは、例えば、血球系細胞の分化を促進する物質であり、具体例として、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、各種ＴＰＯ様作用物質、Stem Cell Factor（SCF）、ITS（インスリン－トランスフェリン－セレナイト）サプリメント、ADAM阻害剤、FLT阻害剤、WNT阻害剤、ROCK阻害剤、芳香族炭化水素受容体（AhR）阻害剤等があげられる。前記培地は、例えば、血清、インスリン、トランスフェリン、セリン、チオールグリセロール、アスコルビン酸、ＴＰＯを含むIMDM培地が好ましい。前記培地は、例えば、さらにSCFを含んでいてもよく、さらにヘパリンを含んでいてもよい。前記他の成分の濃度は、特に制限されない。前記TPOの濃度は、例えば、約10ng/ml～約200ng/ml、約50ng/ml～約100ng/mlである。前記SCFの濃度は、例えば、約10ng/ml～約200ng/ml、約50ng/mlである。前記ヘパリンの濃度は、例えば、約10U/ml～約100U/ml、約25U/mlである。前記培地は、例えば、さらに、ホルボールエステル（例えば、ホルボール-12-ミリスタート-13-アセタート；PMA）を含んでもよい。
　つぎに、前記処理工程では、前記巨核球またはその培養物を処理する。前記処理工程では、例えば、前記巨核球またはその培養物が含有する細胞の細胞膜を破壊することにより、タンパク質を抽出する。具体例として、前記処理工程における処理は、特に制限されず、例えば、濃縮処理等の細胞成分の密度を変更する処理；乾燥処理、凍結処理、凍結乾燥処理、溶媒処理、界面活性剤処理、酵素処理、タンパク質画分抽出処理、超音波処理等の細胞の成分を抽出する抽出処理；磨砕処理、粉砕処理等の破砕処理；等があげられる。前記処理工程において実施する処理は、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。また、前記処理工程では、前記処理を１回実施してもよいし、２回以上実施してもよい。
　前記濃縮処理は、例えば、前記巨核球またはその培養物を、遠心等することにより実施できる。前記遠心の条件は、例えば、細胞または血小板を沈殿させる条件を採用できる。前記乾燥処理は、例えば、前記巨核球またはその培養物に対してドライスプレー、ドラムドライヤー等で乾燥させることにより実施できる。前記凍結乾燥処理は、例えば、凍結乾燥機を用いて実施できる。前記溶媒処理において、前記溶媒は、例えば、フェノール、クロロホルム等の有機溶媒；水、生理的食塩水、緩衝液等の水性溶媒；である。前記溶媒として水性溶媒を用いる場合、前記溶媒処理は、例えば、後述の界面活性剤処理、酵素処理、および／または超音波処理と併用することが好ましい。前記溶媒処理は、例えば、前記巨核球またはその培養物を、前記溶媒と混合することにより実施できる。前記界面活性剤処理において、前記界面活性剤は、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等のイオン系界面活性剤；NP-40、Triton X-100、Tween 20、n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside等の非イオン系界面活性剤；CHAPS等の両性イオン界面活性剤；等があげられる。前記界面活性剤の濃度は、例えば、前記巨核球またはその培養物における細胞成分の細胞膜を破壊可能な濃度である。前記界面活性剤処理は、例えば、水性溶媒の存在下、前記巨核球またはその培養物を、前記界面活性剤と接触させることにより実施できる。前記界面活性剤との接触は、例えば、約０～約１０℃で実施する。前記水性溶媒は、例えば、水、生理的食塩水、緩衝液等があげられる。前記酵素処理における酵素は、例えば、ペプチダーゼ、プロテアーゼ等があげられる。前記酵素処理は、例えば、前記水性溶媒の存在下、前記巨核球またはその培養物を、前記酵素と接触させることにより実施できる。前記酵素処理の条件は、例えば、前記酵素が活性を示す条件である。前記タンパク質画分抽出処理は、例えば、前記巨核球またはその培養物に対して、浸透圧ショック、凍結融解等を行なうことにより実施できる。前記超音波処理は、例えば、超音波発生装置を用いて実施できる。前記超音波処理の条件は、例えば、細胞を破砕する条件を使用できる。
　各種処理における処理条件および処理時間は、例えば、前記処理の種類に応じて適宜決定できる。また、前記処理工程では、例えば、前記水性溶媒の量を調整することにより、前記処理物における総タンパク質の濃度を調整できる。
　前記巨核球またはその培養物は、前記処理に先立ち、加工（前処理）を実施してもよい。この場合、前記巨核球の培養物としては、前記巨核球を培養して得られた培養物そのものを用いてもよいし、前記混合物を加工したものでものを用いてもよい。前記培養物の加工は、例えば、液体画分の除去、細胞成分画分の抽出、血小板を含む細胞成分の組成の変更等があげられる。前記細胞成分の組成の変更は、例えば、前記混合物における細胞および／または血小板の除去、前記混合物における細胞および／または血小板の抽出、前記混合物への細胞および／または血小板の追加等があげられる。
　本発明の製造方法が前記前処理を含む場合、本発明の製造方法は、前記巨核球またはその培養物から血小板を除去する除去工程を含んでもよい。この場合、前記処理工程では、前記巨核球またはその培養物として、前記血小板が除去された巨核球もしくはその培養物、または除去された血小板を用いて処理を実施する。前記血小板放出後の巨核球は、例えば、ｂＦＧＦの含有量が高い。このため、本発明の製造方法は、例えば、前記血小板を除去することにより、ｂＦＧＦの含有量が高い組成物を製造できる。前記血小板の除去により、前記血小板と、その他の細胞分画とを分離することができる。このため、前記除去工程は、例えば、血小板の分離工程または血小板と他の細胞成分との分離工程ということもできる。前記除去工程において、前記巨核球の培養物からの血小板の分離方法は、例えば、国際公開第２０１７／０６５２８０号公報（米国特許出願公開2018/282697号公報）に記載された方法等の公知の方法、またはそれに準ずる方法で実施でき、ここに本明細書の一部を構成するものとして援用する。
　前記除去工程における血小板の除去率（分離率）は、例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上である。前記血小板の除去率は、例えば、６０～９０％である。
　本発明の製造方法は、前記巨核球もしくはその培養物、前記血小板が除去された巨核球もしくはその培養物、または除去された血小板を保存する保存工程を有してもよい。前記保存工程における保存は、例えば、冷蔵保存（約１～約１０℃）、冷凍保存（約－２００～約－４℃）があげられる。前記保存工程における保存期間は、特に制限されない。前記保存工程は、例えば、前記処理工程における凍結処理を兼ねられることから、冷凍保存が好ましい。
　本発明の製造方法は、一例として、下記のように実施できる。ただし、本発明は、以下の例示に何ら制限されない。まず、前記巨核球またはその培養物を含む培地について、遠心により濃縮処理を行ない、細胞成分を濃縮する。前記遠心処理は、例えば、前記細胞成分が沈殿する条件である。具体例として、前記遠心処理は、例えば、１０００～３０００×ｇで、５～２０分遠心することに実施できる。つぎに、遠心後に沈殿物を回収し、得られた沈殿物を急速凍結することで凍結処理する。前記凍結処理は、例えば、前記沈殿物を液体窒素等の液化ガスと接触させることにより実施できる。さらに、凍結後の沈殿物を、前記界面活性剤を含む水性溶媒で溶解させることにより、界面活性剤処理する。得られた溶液について、遠心し、夾雑物を沈殿させる。前記遠心処理は、例えば、細胞膜等の夾雑物が沈殿する条件である。具体例として、前記遠心処理は、例えば、１００００～２００００×ｇで、３～１０分間遠心することにより実施できる。前記遠心後、タンパク質は上清に存在するため、上清をタンパク質分画として回収することにより、前記処理物を得ることできる。
＜製造方法で得られる組成物＞
　本発明の組成物（以下、「第２の組成物」ともいう）は、前記本発明の製造方法で得られる。本発明の第２の組成物は、前記本発明の製造方法で得られることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の第２の組成物によれば、例えば、生理活性を有する組成物を提供できる。本発明の第２の組成物によれば、例えば、細胞増殖を促進できる。本発明の第２の組成物は、前記本発明の組成物および製造方法の説明を援用できる。
＜細胞の増殖促進組成物＞
　本発明は、他の例において、細胞の増殖を促進可能な組成物を提供する。本発明の細胞の増殖促進組成物は、前述のように、本発明の組成物を含むことを特徴とする。本発明の増殖促進組成物は、本発明の組成物を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の増殖促進組成物によれば、細胞、特に、間葉系幹細胞の増殖を促進できる。本発明の増殖促進組成物は、前記本発明の組成物および製造方法の説明を援用できる。
　本発明の増殖促進組成物は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用してもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで使用してもよい。
　本発明の増殖促進組成物をｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、細胞、組織、器官等があげられ、前記細胞は、例えば、生体から採取した細胞、培養細胞等があげられる。
　本発明の増殖促進組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、ヒト、またはヒトを除く非ヒト動物があげられる。前記非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ウマ、ネコ、ヤギ、サル、モルモット等があげられる。
　本発明の増殖促進組成物の使用条件（投与条件）は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類等に応じて、投与形態、投与時期、投与量等を適宜設定できる。
　本発明の増殖促進組成物をｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する場合、本発明の増殖促進組成物は、例えば、対象とする細胞の培地に添加することで使用できる。前記培地における本発明の増殖促進組成物由来の総タンパク質の終濃度は、１０～１０００μｇ／ｍｌ、１０～５００μｇ／ｍｌ、１０～３２０μｇ／ｍｌ、１０～３００μｇ／ｍｌ、または２０～３００μｇ／ｍｌである。
　本発明の増殖促進組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、例えば、投与対象の種類、症状、年齢、投与方法等により適宜決定できる。具体例として、ヒトに投与する場合、１日あたりの増殖促進組成物の投与量は、前記増殖促進組成物由来の総タンパク質量の合計は、特に制限されず、例えば、その用途に応じて適宜設定できる。１日あたりの投与回数は、例えば、１～５回、１～３回、１回または２回である。
　本発明の増殖促進組成物の投与形態は、特に制限されない。本発明の増殖促進組成物をｉｎ　ｖｉｖｏで投与する場合、経口投与でもよいし、非経口投与でもよい。前記非経口投与は、例えば、静脈注射（静脈内投与）、筋肉注射（筋肉内投与）、経皮投与、皮下投与、皮内投与、経腸投与、直腸投与、経膣投与、経鼻投与、経肺投与、腹腔内投与、局所投与等があげられる。
　本発明の増殖促進組成物の剤型は、特に制限されず、例えば、前記投与形態に応じて適宜決定できる。前記剤型は、例えば、液体状または固体状があげられる。
　本発明の増殖促進組成物は、例えば、必要に応じて、添加剤を含んでもよい。前記添加剤は、薬学的に許容可能な添加剤または薬学的に許容可能な担体であることが好ましい。
＜線維芽細胞の機能促進組成物＞
　本発明は、他の例において、線維芽細胞の機能を促進可能な組成物を提供する。本発明の線維芽細胞の機能促進組成物は、前述のように、前記本発明の組成物を含む。本発明の線維芽細胞の機能促進組成物は、前記本発明の組成物を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の線維芽細胞の機能促進組成物によれば、線維芽細胞の機能を促進できる。本発明の線維芽細胞の機能促進組成物は、前記本発明の組成物、製造方法、および増殖促進組成物の説明を援用できる。
　本発明の線維芽細胞の機能促進組成物は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用してもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで使用してもよい。
　本発明の線維芽細胞の機能促進組成物をｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する場合、本発明の線維芽細胞の機能促進組成物は、例えば、対象とする線維芽細胞の培地に添加することで使用できる。本発明の線維芽細胞の機能促進組成物によれば、例えば、前記線維芽細胞の機能促進組成物を含む培地で、前記線維芽細胞を維持することにより、前記線維芽細胞の増殖および／または線維芽細胞による細胞外マトリックスの産生を促進できる。前記培地における本発明の線維芽細胞の機能促進組成物の総タンパク質の終濃度は、１０～１０００μｇ／ｍｌ、１０～５００μｇ／ｍｌ、または１０～３００μｇ／ｍｌである。
　本発明の線維芽細胞の機能促進組成物における投与対象および投与条件は、前記本発明の増殖促進組成物における投与対象および投与条件の説明を援用できる。
＜皮膚障害の治癒促進組成物＞
　本発明は、他の例において、皮膚障害の治癒促進に使用しうる組成物を提供する。本発明は、本発明の皮膚障害の治癒促進組成物（以下、「治癒促進組成物」ともいう）は、前述のように、前記本発明の組成物を含む。本発明の治癒促進組成物は、前記本発明の組成物を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の治癒促進組成物によれば、皮膚障害の治癒を促進できると期待される。本発明の治癒促進組成物は、前記本発明の組成物、製造方法、および増殖促進組成物の説明を援用できる。
　本発明において、前記皮膚障害は、例えば、皮膚に対する傷、ダメージ等が生じた状態、すなわち、正常な皮膚組織の構造が損なわれた、または破壊された状態を意味し、具体例として、皮膚の潰瘍、褥瘡、火傷、瘢痕、創傷、皮膚の老化等があげられる。
　本発明の治癒促進組成物は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用してもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで使用してもよい。
　本発明の治癒促進組成物をｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する場合、本発明の治癒促進組成物は、例えば、対象とする細胞の培地に添加することで使用できる。前記培地における本発明の治癒促進組成物の総タンパク質の終濃度は、１０～１０００μｇ／ｍｌ、１０～５００μｇ／ｍｌ、または１０～３００μｇ／ｍｌである。
　本発明の治癒促進組成物における投与対象および投与条件は、前記本発明の増殖促進組成物における投与対象および投与条件の説明を援用できる。本発明の治癒促進組成物は、皮下または経皮投与可能な剤型で用いることが好ましい。
＜角化細胞の機能促進組成物＞
　本発明は、他の例において、角化細胞の機能を促進可能な組成物を提供する。本発明の角化細胞の機能促進組成物は、前述のように、前記本発明の組成物を含む。本発明の角化細胞の機能促進組成物は、前記本発明の組成物を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の角化細胞の機能促進組成物によれば、角化細胞の機能を促進できる。本発明の角化細胞の機能促進組成物は、前記本発明の組成物、製造方法、および増殖促進組成物の説明を援用できる。
　本発明の角化細胞の機能促進組成物は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用してもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで使用してもよい。
　本発明の角化細胞の機能促進組成物をｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する場合、本発明の角化細胞の機能促進組成物は、例えば、対象とする角化細胞の培地に添加することで使用できる。本発明の角化細胞の機能促進組成物は、例えば、前記角化細胞を維持する際に使用する維持培地に添加してもよいし、前記角化細胞を表皮細胞等の上皮系の細胞に分化させる分化培地に添加してもよいし、前記維持培地および前記分化培地の両者に添加してもよい。本発明の角化細胞の機能促進組成物によれば、例えば、前記角化細胞の機能促進組成物を含む培地で、前記角化細胞を維持することにより、前記角化細胞の増殖、表皮細胞への分化、および／またはバリア機能遺伝子の誘導を促進できる。前記培地における本発明の角化細胞の機能促進組成物の総タンパク質の終濃度は、１０～１０００μｇ／ｍｌ、１０～５００μｇ／ｍｌ、または１０～３００μｇ／ｍｌである。
　本発明の角化細胞の機能促進組成物における投与対象および投与条件は、前記本発明の増殖促進組成物における投与対象および投与条件の説明を援用できる。
　本発明の角化細胞の機能促進組成物は、前述のように、角化細胞を表皮細胞等の上皮系細胞への分化を促進する。このため、本発明の角化細胞の機能促進組成物は、例えば、皮膚の人工培養における添加剤として好適に使用できると期待される。また、本発明の角化細胞の機能促進組成物は、前述のように、線維芽細胞の機能促進活性を示す。このため、本発明の角化細胞の機能促進組成物は、例えば、角化細胞および線維芽細胞の機能促進活性により、皮膚組織のターンオーバーを促進することで、老化皮膚の再生に好適に使用できると期待される。したがって、本発明の角化細胞の機能促進組成物は、例えば、化粧料等の皮膚外用組成物、皮下投与のための注射剤等として好適に使用できると期待される。
＜毛乳頭細胞の機能促進組成物＞
　本発明は、他の例において、毛乳頭細胞の機能を促進可能な組成物を提供する。本発明の毛乳頭細胞の機能促進組成物は、前述のように、前記本発明の組成物を含む。本発明の毛乳頭細胞の機能促進組成物は、前記本発明の組成物を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の毛乳頭細胞の機能促進組成物によれば、角化細胞の機能を促進できる。本発明の毛乳頭細胞の機能促進組成物は、前記本発明の組成物、製造方法、および増殖促進組成物の説明を援用できる。
　本発明の毛乳頭細胞の機能促進組成物は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用してもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで使用してもよい。
　本発明の毛乳頭細胞の機能促進組成物をｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する場合、本発明の毛乳頭細胞の機能促進組成物は、例えば、対象とする毛乳頭細胞の培地に添加することで使用できる。本発明の毛乳頭細胞の機能促進組成物によれば、例えば、前記毛乳頭細胞の機能促進組成物を含む培地で、前記毛乳頭細胞を維持することにより、前記毛乳頭細胞の増殖および／または発毛促進遺伝子の誘導を促進できる。前記培地における本発明の毛乳頭細胞の機能促進組成物の総タンパク質の終濃度は、１０～１０００μｇ／ｍｌ、１０～５００μｇ／ｍｌ、または１０～３００μｇ／ｍｌである。
　本発明の毛乳頭細胞の機能促進組成物における投与対象および投与条件は、前記本発明の増殖促進組成物における投与対象および投与条件の説明を援用できる。
＜発毛促進組成物＞
　本発明は、他の例において、発毛を促進しうる組成物を提供する。本発明の発毛促進組成物は、前述のように、前記本発明の組成物を含む。本発明の発毛促進組成物は、前記本発明の組成物を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の発毛促進組成物によれば、毛乳頭細胞の機能が促進されるため、発毛を促進できると期待される。本発明の毛乳頭細胞の機能促進組成物は、前記本発明の組成物、製造方法、および増殖促進組成物の説明を援用できる。
　本発明において、「発毛促進」は、毛がない状態から毛が生じる可能性を増強（増加、上昇）すること、毛の成長（例えば、毛の長さおよび／または太さの成長）の促進、および／または毛の脱毛の低減（抑制、低下）を意味する。
　本発明の発毛促進組成物は、例えば、脱毛の予防、抑制、または防止に用いてもよい。この場合、本発明の発毛促進組成物は、例えば、脱毛の予防、抑制、または防止組成物ということもできる。
　本発明の発毛促進組成物は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用してもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで使用してもよい。
　本発明の発毛促進組成物をｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する場合、本発明の発毛促進組成物は、例えば、対象とする毛乳頭細胞の培地に添加することで使用できる。本発明の発毛促進組成物によれば、例えば、前記本発明の組成物を含む培地で、前記毛乳頭細胞を維持することにより、前記毛乳頭細胞の増殖および／または発毛促進遺伝子の誘導を促進でき、これにより発毛が促進されると期待される。前記培地における本発明の発毛促進組成物の総タンパク質の終濃度は、１０～１０００μｇ／ｍｌ、１０～５００μｇ／ｍｌ、または１０～３００μｇ／ｍｌである。
　本発明の発毛促進組成物における投与対象および投与条件は、前記本発明の増殖促進組成物および後述の発毛促進方法における投与対象および投与条件の説明を援用できる。
＜細胞の増殖促進方法＞
　本発明の細胞の増殖促進方法（以下、「増殖促進方法」ともいう）は、前記本発明の細胞の増殖促進組成物を使用する。本発明の増殖促進方法は、前記本発明の増殖促進組成物を使用することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の増殖促進方法によれば、細胞、特に、間葉系幹細胞の増殖を促進できる。本発明の増殖促進方法は、前記本発明の組成物、製造方法、増殖促進組成物、および分化促進組成物の説明を援用できる。
　本発明の増殖促進方法は、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで実施してもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで実施してもよい。
　本発明の増殖促進方法をｉｎ　ｖｉｔｒｏで実施する場合、本発明の増殖促進方法は、例えば、前記増殖促進組成物の存在下、細胞を培養する培養工程を含む。本発明の増殖促進組成物の投与対象および投与条件は、例えば、本発明の増殖促進組成物における投与対象および投与条件の説明を援用できる。
＜線維芽細胞の機能促進方法＞
　本発明は、他の例において、線維芽細胞の機能を促進可能な方法を提供する。本発明の線維芽細胞の機能促進方法は、前記本発明の組成物を使用する。本発明の線維芽細胞の機能促進方法は、前記本発明の組成物を使用することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の線維芽細胞の機能促進方法によれば、線維芽細胞の機能を促進できる。本発明の線維芽細胞の機能促進方法は、前記本発明の組成物、製造方法、増殖促進組成物、および線維芽細胞の機能促進組成物の説明を援用できる。
　本発明の線維芽細胞の機能促進方法は、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで実施してもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで実施してもよい。
　本発明の線維芽細胞の機能促進方法をｉｎ　ｖｉｔｒｏで実施する場合、本発明の線維芽細胞の機能促進方法は、例えば、前記組成物の存在下、線維芽細胞を培養する培養工程を含む。前記本発明の組成物の投与対象および投与条件は、例えば、本発明の増殖促進組成物における投与対象および投与条件の説明を援用できる。
＜皮膚障害の治癒促進方法＞
　本発明は、他の例において、皮膚障害の治癒促進に使用しうる方法を提供する。本発明の皮膚障害の治癒促進方法（以下、「治癒促進方法」ともいう）は、前記本発明の組成物を使用する。本発明の治癒促進方法は、前記本発明の組成物を使用することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の治癒促進方法によれば、皮膚障害の治癒を促進できると期待される。本発明の治癒促進方法は、前記本発明の組成物、製造方法、増殖促進組成物、および皮膚障害の治癒促進組成物の説明を援用できる。
　本発明の皮膚障害の治癒促進方法は、例えば、皮膚障害の治療方法または処置方法ということもできる。
　本発明の治癒促進方法は、例えば、対象に、前記本発明の組成物を投与する投与工程を含んでもよい。前記対象は、例えば、皮膚障害が生じている患者、皮膚障害の可能性がある患者等があげられる。
　本発明の治癒促進方法は、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで実施してもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで実施してもよい。
　本発明の治癒促進方法をｉｎ　ｖｉｔｒｏで実施する場合、本発明の治癒促進方法は、例えば、前記組成物の存在下、角化細胞、線維芽細胞等の皮膚に関連する細胞を培養する培養工程を含む。前記本発明の組成物の投与対象および投与条件は、例えば、本発明の増殖促進組成物における投与対象および投与条件の説明を援用できる。
＜角化細胞の機能促進方法＞
　本発明は、他の例において、角化細胞の機能を促進可能な方法を提供する。本発明の角化細胞の機能促進方法は、前記本発明の組成物を使用する。本発明の角化細胞の機能促進方法は、前記本発明の組成物を使用することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の角化細胞の機能促進方法によれば、角化細胞の機能を促進できる。本発明の角化細胞の機能促進方法は、前記本発明の組成物、製造方法、増殖促進組成物、および角化細胞の機能促進組成物の説明を援用できる。
　本発明の角化細胞の機能促進方法は、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで実施してもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで実施してもよい。
　本発明の角化細胞の機能促進方法をｉｎ　ｖｉｔｒｏで実施する場合、本発明の角化細胞の機能促進方法は、例えば、前記組成物の存在下、角化細胞を培養する培養工程を含む。前記本発明の組成物の投与対象および投与条件は、例えば、本発明の増殖促進組成物における投与対象および投与条件の説明を援用できる。
＜毛乳頭細胞の機能促進方法＞
　本発明は、他の例において、毛乳頭細胞の機能を促進可能な方法を提供する。本発明の毛乳頭細胞の機能促進方法は、前記本発明の組成物を使用する。本発明の毛乳頭細胞の機能促進方法は、前記本発明の組成物を使用することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の毛乳頭細胞の機能促進方法によれば、毛乳頭細胞の機能を促進できる。本発明の毛乳頭細胞の機能促進方法は、前記本発明の組成物、製造方法、増殖促進組成物、および毛乳頭細胞の機能促進組成物の説明を援用できる。
　本発明の毛乳頭細胞の機能促進方法は、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで実施してもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで実施してもよい。
　本発明の毛乳頭細胞の機能促進方法をｉｎ　ｖｉｔｒｏで実施する場合、本発明の毛乳頭細胞の機能促進方法は、例えば、前記組成物の存在下、毛乳頭細胞を培養する培養工程を含む。前記本発明の組成物の投与対象および投与条件は、例えば、本発明の増殖促進組成物における投与対象および投与条件の説明を援用できる。
＜発毛促進方法＞
　本発明は、他の例において、発毛の促進しうる方法を提供する。本発明の発毛促進方法は、前記本発明の組成物を使用する。本発明の発毛促進方法は、前記本発明の組成物を使用することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の発毛促進方法によれば、発毛を促進できると期待される。本発明の発毛促進方法は、前記本発明の組成物、製造方法、増殖促進組成物、および発毛促進組成物の説明を援用できる。
　本発明の発毛促進方法は、例えば、脱毛症もしくは薄毛の治療方法または処置方法ということもできる。また、本発明の発毛促進方法は、例えば、脱毛の予防、抑制、または防止に用いてもよい。この場合、本発明の発毛促進方法は、例えば、脱毛の予防、抑制、または防止方法ということもできる。
　本発明の発毛促進方法は、例えば、対象に、前記本発明の組成物を投与する投与工程を含んでもよい。前記対象は、例えば、脱毛症が生じている患者、脱毛症の可能性がある患者等があげられる。前記脱毛症の患者は、例えば、男性型脱毛症、女性型脱毛症、抗がん剤治療後の脱毛症等の患者があげられる。前記脱毛の可能性がある患者は、例えば、抗がん剤治療前の患者、遺伝的な脱毛症であり、脱毛が始まる前の患者等があげられる。
　本発明の発毛促進方法は、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで実施してもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで実施してもよい。
　本発明の発毛促進方法をｉｎ　ｖｉｔｒｏで実施する場合、本発明の発毛促進方法は、例えば、前記組成物の存在下、毛乳頭細胞等の発毛に関連する細胞を培養する培養工程を含む。前記本発明の組成物の投与対象および投与条件は、例えば、本発明の増殖促進組成物における投与対象および投与条件の説明を援用できる。
＜組成物の使用＞
　本発明は、細胞の増殖促進のために使用するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物またはその使用である。また、本発明は、線維芽細胞の機能促進のために使用するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物またはその使用である。本発明は、皮膚障害の治癒促進のために使用するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物またはその使用である。本発明は、角化細胞の機能促進のために使用するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物またはその使用である。本発明は、毛乳頭細胞の機能促進のために使用するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物またはその使用である。本発明は、発毛促進のために使用するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物またはその使用である。本発明は、細胞の増殖促進組成物を製造するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物の使用である。また、本発明は、線維芽細胞の機能促進組成物を製造するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物の使用である。本発明は、皮膚障害の治癒促進組成物を製造するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物の使用である。本発明は、角化細胞の機能促進組成物を製造するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物の使用である。本発明は、毛乳頭細胞の機能促進組成物を製造するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物の使用である。本発明は、発毛促進組成物を製造するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物の使用である。
　以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。
［実施例１］
　本発明の組成物を製造し、成長因子および成長因子受容体を含むこと、細胞の増殖促進活性を有することを確認した。
（１）不死化巨核球細胞の作製
　不死化巨核球は、以下の手順で作製した。
（１－１）iPS細胞からの造血前駆細胞の調製
　ヒトiPS細胞（TKDN SeV2およびNIH5：センダイウイルスを用いて樹立されたヒト胎児皮膚繊維芽細胞由来iPS細胞）から、下記参考文献８に記載の方法に従って、血球細胞への分化培養を実施した。具体的には、ヒトES/iPS細胞コロニーを20ng/ml VEGF（R&D SYSTEMS社製）存在下でC3H10T1/2フィーダ細胞と１４日間共培養して造血前駆細胞（Hematopoietic Progenitor Cells；HPC）を作製した。培養条件は、３７℃、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２で実施した（特に記載がない限り、以下同条件）。
参考文献８：Takayama N. et al., “Transient activation of c-MYC expression is critical for efficient platelet generation from human induced pluripotent stem cells”, J. Exp. Med., 2010, vo.13, pages 2817-2830
（１－２）遺伝子導入システム
　遺伝子導入システムは、レンチウイルスベクターシステムを利用した。レンチウイルスベクターは、Tetracycline制御性のTet-on（登録商標）遺伝子発現誘導システムベクターである。LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G（下記参考文献９）のmOKSカセットをc-MYC、BMI1、またはBCL-xLに組み替えることで作製した。c-MYC、BMI1、またはBCL-xLが導入されたベクターを、それぞれ、LV-TRE-c-Myc-Ubc-tTA-I2G、LVTRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G、およびLV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2Gとした。c-MYC、BMI1、およびBCL-xLウイルスは、293T細胞へ前記レンチウイルスベクターで遺伝子導入することにより作製した。得られたウイルスを目的の細胞に感染させることによって、c-MYC、BMI1、およびBCL-xL遺伝子が目的の細胞のゲノム配列に導入される。安定的にゲノム配列に導入されたこれらの遺伝子は、培地にドキシサイクリン（clontech#631311）を加えることによって強制発現させることができる。
参考文献９：Kobayashi, T.et al., “Generation of rat pancreas in mouse by interspecific blastocyst injection of pluripotent stem cells.”, Cell, 2010, vol.142, No.5, pages 787-799
（１－３）造血前駆細胞へのc-MYCおよびBMI1ウイルスの感染
　予めC3H10T1/2フィーダ細胞を播種した6 well plate上に、前記（１－１）の方法で得られたHPCを5×104cells/wellとなるように播種し、BMI1ウイルスおよびc-MYCウイルスを用いたレンチウイルス法にてc-MYCおよびBMI1を強制発現させた。このとき、細胞株１種類につき6 wellずつ使用した。具体的には、それぞれMOI（multiplicity of infection）20となるように培地中にウイルス粒子を添加し、スピンインフェクション（32℃、900rpm、６０分間遠心）で感染させた。前記スピンインフェクションは、１２時間おきに２回実施した。培地は、基本培地（15% Fetal Bovine Serum (GIBCO)、1% Penicillin-Streptomycin-Glutamine (GIBCO)、1% Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS-G) (GIBCO)、0.45 mmol/l 1-Thioglycerol (Sigma-Aldrich)、50μg/ml L-Ascorbic Acid (Sigma-Aldrich)を含有するIMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium) (Sigma-Aldrich)）に、50 ng/ml Human thrombopoietin (TPO)(R&D SYSTEMS)、50 ng/ml Human Stem Cell Factor (SCF) (R&D SYSTEMS)および2μg/ml Doxycycline (Dox、clontech #631311)となるようにそれぞれを添加した培地（以下、分化培地）に、さらに、Protamineを最終濃度が10 μg/mlとなるように添加した培地を用いた。
（１－４）巨核球自己増殖株の作製および維持培養
　前記（１－３）の方法でc-MYCおよびBMI1ウイルスの感染を実施した日を感染0日目として、以下の通り、c-MYC遺伝子およびBMI1遺伝子が導入されたHPCを培養することで、巨核球自己増殖株をそれぞれ作製した。c-MYC遺伝子およびBMI1遺伝子の強制発現は、培地に1μg/ml DOXとなるようにDOXを添加することにより実施した。
・感染２日目～感染１１日目
　感染２日目に、ピペッティングにて上記の方法で得られたウイルス感染済み血球細胞を回収し、1200rpm、５分間遠心操作を行って上清を除去した後、新しい分化培地で懸濁して新しいC3H10T1/2フィーダ細胞上に播種した(6well plate)。感染９日目に同様の操作をすることによって継代を実施した。前記再播種時は、細胞数を計測後、1×105 cells/2ml/wellとなるようにC3H10T1/2フィーダ細胞上に播種した(6well plate)。
・感染１２日目～感染１３日目
　感染２日目と同様の操作を実施した。細胞数を計測後3×105 cells/10ml/100mm dishとなるように、C3H10T1/2フィーダ細胞上に播種した(100mm dish)。
・感染１４日目
　ウイルス感染済み血球細胞を回収し、細胞1.0×105個あたり、抗ヒトCD41a-APC抗体(BioLegend)、抗ヒトCD42b-PE抗体(eBioscience)、および抗ヒトCD235ab-pacific blue（BioLegend）抗体を、それぞれ2μl、1μl、および1μlを用いて、前記血球細胞と抗体とを反応させた。前記反応後、FACS Verse（商標）（BD Biosciences）を用いて解析した。感染１４日目において、CD41a陽性率が５０%以上である細胞を、巨核球自己増殖株とした。
（１－５）巨核球自己増殖株へのBCL-xLウイルス感染
　前記感染１４日目の巨核球自己増殖株に、BCL-xLウイルスを用いたレンチウイルス法にてBCL-xLを遺伝子導入した。MOI 10になるように培地中にウイルス粒子を添加し、スピンインフェクション（32℃、900rpm、６０分間遠心）で感染させた。BCL-xL遺伝子の強制発現は、培地に1μg/ml DOXとなるようにDOXを添加することにより実施した。
（１－６）巨核球不死化株の作成および維持培養
・感染１４日目～感染１８日目
　前記（１－５）の方法で得られたBCL-xL遺伝子を導入した巨核球自己増殖株を回収し、1200rpm、5分間遠心操作を行った。前記遠心後、沈殿した細胞を新しい分化培地で懸濁した後、新しいC3H10T1/2フィーダ細胞上に2×105cells/2ml/wellとなるように播種した（6well plate）。
・感染１８日目：継代
　BCL-xL遺伝子を導入後の巨核球自己増殖株を回収し、細胞数を計測後、3×105 cells/10ml/100mm dishとなるように播種した。
・感染２４日目：継代
　BCL-xL遺伝子を導入後の巨核球自己増殖株を回収し、細胞数を計測後、1×105 cells/10ml/100mm dishとなるように播種した。以後、４－７日毎に同様にして継代を行い、維持培養を行った。なお、継代時には、新たな分化培地に懸濁の上、播種した。
　感染２４日目にBCL-xLを遺伝子導入した巨核球自己増殖株を回収し、細胞1.0×105個あたり、抗ヒトCD41a-APC抗体(BioLegend)、抗ヒトCD42b-PE抗体(eBioscience)、および抗ヒトCD235ab-Pacific Blue（Anti-CD235ab-PB; BioLegend）抗体を、それぞれ、2μl、1μl、および1μlを用いて、免疫染色した後にFACS Verse（商標）を用いて解析した。そして、感染２４日目において、CD41a陽性率が50%以上である株を不死化巨核球細胞株とした。感染後２４日以上増殖することができたこれらの細胞を、不死化巨核球細胞株SeV2-MKCLおよびNIH5-MKCLとした。
　得られたSeV2-MKCLおよびNIH5-MKCLを、10cmディッシュ（10ml/ディッシュ）で静置培養した。培地は、IMDMを基本培地として、以下の成分を加えた（濃度は終濃度）。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２とした。
FBS（シグマ#172012 lot.12E261）15％
L-Glutamin (Gibco #25030-081) 2mmol/l
ITS (Gibco #41400-045) 100倍希釈
MTG (monothioglycerol, sigma #M6145-25ML) 450μmol/l
アスコルビン酸(sigma #A4544) 50μg/ml
Puromycin (sigma #P8833-100MG) 2μg/ml
SCF (和光純薬#193-15513) 50ng/ml
TPO様作用物質200ng/ml
（２）巨核球の培養物の生産
　DOXを含まない培地で培養することで強制発現を解除した。具体的には、前記（１）の方法で得た不死化巨核球細胞株（SeV2-MKCLおよびNIH5-MKCL）を、PBS(-)で2度洗浄し、下記血小板生産培地に懸濁した。細胞の播種密度は、1.0×105 cells/mlとした。
　前記血小板生産培地は、IMDMを基本培地として、以下の成分を加えた（濃度は、終濃度）。
human plasmＡ６％
L-Glutamin (Gibco #25030-081) 4mmol/l
ITS (Gibco #41400-045) 100倍希釈
MTG (monothioglycerol, sigma #M6145-25ML) 450μmol/l
アスコルビン酸 (sigma #A4544) 50μg/ml
SCF (和光純薬#193-15513) 50ng/ml
TPO様作用物質200ng/ml
ADAM阻害剤15μmol/l
GNF351（Calbiochem #182707）500nmol/LY39983（Chemscene LLC #CS-0096）500nmol/l
Urokinase 5U/ml
低分子heparin（SANOFI、クレキサン）1U/ml
　そして、前記血小板生産培地存在下で６日間培養して、血小板を産生させることにより、巨核球の培養物を生産させた。
（３）精製血小板の製造
　前記（２）で得られた巨核球の培養物について、以下の手順で、血小板を製造（精製）した。なお、同様の精製を２回実施した。
（３－１）巨核球の培養物の濃縮
　前記（２）で得られた巨核球の培養物について、培養物バッグに導入した。そして、前記培養物バッグについて、図１のように、濃縮システムに接続した。図１において、洗浄保存液バッグ１および２は、洗浄保存液を含む。前記洗浄保存液は、ビカネイト輸液（ビカーボン輸液、大塚製薬社製）に２０％ＡＣＤおよび2.5％ヒト血清アルブミンを添加し、ＮａＯＨでｐＨ7.2に調整したものを使用した。そして、下記表１にしたがって、中空糸膜（プラズマフローＯＰ、旭化成メディカル社製）を用いて、前記巨核球の培養物を濃縮し、得られた巨核球の培養物の濃縮液を貯蔵バッグに回収した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（３－２）血小板の遠心分離
　まず、無菌接合装置を用いて、ACP215ディスポーザブルセットの廃液バッグを回収用バッグに置換した。前記回収用バッグは、ハイカリックＩＶＨバック（テルモ　HC-B3006A）を用いた。つぎに、前記巨核球の培養物の濃縮液に対して10％量のACD-A液（テルモ社製）を添加した。前記添加後、ACD-A液を添加した濃縮液を、細胞バッグに注入した。前記細胞バッグは、ハイカリックIVHバック（テルモ　HC-B3006A）を用いた。
　つぎに、無菌接合装置を用いて、ACD-A液を添加した培養物を含む細胞バッグをACP215ディスポーザブルセットに接合した。そして、ACP215をサービスモードで立ち上げ、回転数を2500rpm（350×g）にセットした。ACP215をスタートさせ、前記細胞バッグ中の培養物を約100ml/minで分離ボウルに導入した。前記分離ボウルより流出する液体成分は、回収バッグに回収した。前記細胞バッグ中の培養物の全量を分離ボウルに導入後、さらに500mlの洗浄保存液を前記分離ボウルに導入した。前記分離ボウルに前記洗浄保存液を導入後、遠心を止めてチューブシーラーを用いて回収液（血小板を含む回収された液体成分）を含む回収バッグを切り離した。
　新しいACP215ディスポーザブルセットに、前記無菌接合装置を用いて回収液（血小板を含む）を含んだ回収バッグを接合した。ACP215を通常モードで立ち上げた。プログラム設定はWPCを選択し、機器の指示に従い、前記回収バッグを接合したACP215ディスポーザブルセットをセットした。なお、回収液を含んだ回収バッグはスタンドに設置した。
　つぎに、ACP215の遠心速度を5000rpm（1398.8×g）に変更し、遠心をスタートさせた。前記分離ボウルへ前記回収液が導入され始めたとき、自動注入から手動注入に変更した。具体的には、前記回収液を約100ml/minの導入速度で前記分離ボウルに導入した。前記回収液全量を分離ボウルに添加後、さらに500mlの洗浄保存液を追加した。
（３－３）血小板の洗浄
　洗浄は、ACP215のプログラムに従って、2000mlの前記洗浄保存液で洗浄した。
（３－４）血小板の回収
　ACP215のプログラムに従って、200mlの洗浄済み血小板を血小板製剤バッグに回収した。
（３－５）血小板の分離
　前記血小板製剤バッグについて、前記中空糸膜を用いて、常法により血小板を分離し、回収用バッグに回収した。
（４）抽出物の製造
　前記巨核球またはその培養物としては、前記（１）の方法で得た不死化巨核球細胞株、前記（３－５）で得られた血小板製剤バッグに回収した血小板、および排液バッグに回収された血小板が除去された巨核球の培養物（以下、まとめて「原材料」ともいう）を用いた。血小板が除去された巨核球の培養物については、別個に調製した４サンプルを用いた（血小板除去巨核球培養物１～４）。
　各原材料について、洗浄液で２回洗浄した。前記洗浄液は、ビカネイト輸液に約２０（v/v）％になるようにACD-A液を添加後、NaOHを添加して、pHを７．０～７．４の範囲に調整したものを用いた。前記洗浄後、各原材料を、２０００×ｇ、１０分、室温（約２５℃）の条件で遠心した。前記遠心後、沈殿物を回収し、液体窒素を用いて、前記沈殿物を凍結した。つぎに、凍結した沈殿物に、細胞溶解バッファーを添加し、５０ｒｐｍ、４℃で３０分間振盪することにより溶解した。前記細胞溶解バッファーは、市販の細胞溶解バッファー（2× Cell Lysis Buffer、RayBiotech社製、Cat.No.: AA-LYS）に、プロテアーゼインヒビターカクテル（Protease Inhibitor Cocktail 、RayBiotech社製、Cat.No.: AA-PI）を添加したものを用いた。
　得られた溶解液について、１４０００×ｇ、５分間、４℃の条件で遠心した。前記遠心後、上清を、実施例の処理物として回収した。各原材料から得られた処理物について、Pierce（商標） BCA Protein Assay Kit（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、総タンパク質濃度を測定した。この結果、不死化巨核球細胞株を用いた場合、２．２×１０７細胞から、２．６０４ｍｇの総タンパク質が抽出された。また、血小板を用いた場合、２．５×１０８細胞から、１．１８７ｍｇの総タンパク質が抽出された。さらに、血小板除去巨核球培養物１～４を用いた場合、１．９７×１０８細胞、５．２５×１０８細胞、３．６４×１０８細胞、６．２２×１０８細胞から、それぞれ、２．８、５．９４４、３．６、および４．４９６ｍｇの総タンパク質が抽出された。そして、総タンパク質濃度を、５ｍｇ／ｍｌに調整した後、各処理物について、Quantibody（登録商標） Human Growth Factor Array 1（RayBiotech社製）を用いて、成長因子（ｂＦＧＦ、ＩＧＦＢＰ－１、ＩＧＦＢＰ－２、ＰＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＧＤＦ－１５、ＡＲ、ＢＭＰ－７、ＨＧＦ）および成長因子受容体（ＳＣＦＲ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２）の濃度を測定した。これらの結果を下記表２に示す。なお、下記表２は、総タンパク質５ｍｇあたりの濃度ということもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（５）細胞の増殖促進活性の確認
　ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞を、１０ｃｍディッシュに、２．４～４．８×１０５細胞／１０ｍｌ　培地／ディッシュとなるように播種した。なお、前記間葉系幹細胞としては、市販のヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（Takara Bio社製、Cat. No.: C-12977）を２回継代培養した後に、回収した細胞を用いた。前記培地は、間葉系幹細胞増殖培地2（Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2、Takara Bio社製、Cat. No.: C-28009）に、血小板除去巨核球培養物２から調製した組成物を凍結後、溶解したものを添加した。前記組成物は、培地における前記組成物由来の総タンパク質濃度が、所定濃度（０、１２５、２５０、または５００μｇ／ｍｌ）となるように添加した。なお、前記培地は、維持培地である。
　前記播種後、前記間葉系幹細胞を３日間、３７℃、５％ＣＯ２の湿潤下で培養した。前記培養後、前記間葉系幹細胞を回収し、同様の条件で播種し、再度３日間、３７℃、５％ＣＯ２の湿潤下で培養した。つぎに、前記培養後の間葉系細胞を回収し、細胞数をカウントした。そして、前記播種時の細胞数を基準（１）とした際の回収時の細胞数の相対値を算出し、これを増殖活性の相対値とした。また、前記播種時の細胞数と、前記回収時の細胞数に基づき、細胞が一回増殖するために必要な時間（倍加時間）を算出した。これらの結果を図２に示す。
　図２は、細胞の増殖活性を示すグラフである。図２において、（Ａ）は、増殖活性を示し、（Ｂ）は、倍加時間を示す。図２（Ａ）において、横軸は、前記組成物由来の総タンパク質濃度を示し、縦軸は、増殖活性の相対値を示す。図２（Ｂ）において、横軸は、前記組成物由来の総タンパク質濃度を示し、縦軸は、倍加時間を示し、図中の数値は、倍加時間を示す。図２（Ａ）に示すように、本発明の組成物を添加した場合、前記組成物由来の総タンパク質濃度依存的に、間葉系幹細胞の増殖活性が増加した。また、図示していないが、前記組成物を添加していない間葉系幹細胞において、３回目の継代後の倍加時間は、２１時間であった。図２（Ｂ）に示すように、本発明の組成物を添加しない場合、間葉系幹細胞の倍加時間は、約１．５倍に延伸した。これに対して、図２（Ｂ）に示すように、本発明の組成物を添加した場合、前記組成物由来の総タンパク質濃度依存的に、間葉系幹細胞が一回増殖するために必要な時間が短縮した。また、本発明の組成物が未添加の培地で培養した場合、間葉系幹細胞は、継代回数を得ると倍加時間が延びた。これに対して、本発明の組成物を添加した場合、前記倍加時間の伸びがほぼ抑制された。このため、本発明の組成物は、細胞の増殖促進活性を示すこと、および増殖活性の低下を抑制できることがわかった。
［実施例２］
　本発明の組成物が、細胞の増殖促進活性を有することを確認した。
　前記間葉系幹細胞として、２回継代培養した後、回収して凍結保存した。前記凍結保存した細胞を解凍後、１回継代培養した細胞を用い、前記維持培地における前記組成物由来の総タンパク質濃度を、所定濃度（０、０．２、１．３、３１．３、６２．５、または１２５μｇ／ｍｌ）となるように添加した以外は、前記実施例１（５）と同様にして、増殖活性および倍加時間を算出した。これらの結果を図３に示す。
　図３は、細胞の増殖活性を示すグラフである。図３において、（Ａ）は、増殖活性を示し、（Ｂ）は、倍加時間を示す。図３（Ａ）において、横軸は、前記組成物由来の総タンパク質濃度を示し、縦軸は、増殖活性の相対値を示す。図３（Ｂ）において、横軸は前記組成物由来の総タンパク質濃度を示し、縦軸は、倍加時間を示す。図３（Ａ）に示すように、本発明の組成物を添加した場合、前記組成物由来の総タンパク質濃度依存的に、間葉系幹細胞の増殖活性が増加し、特に、総タンパク質濃度が３１．３μｇ／ｍｌ以上である場合、顕著に、間葉系幹細胞の増殖活性が増加した。また、図示していないが、前記組成物を添加していない間葉系幹細胞において、３回目の継代後の倍加時間は、１７時間であった。図３（Ｂ）に示すように、本発明の組成物を添加しない場合、間葉系幹細胞の倍加時間は、約１．５倍に延伸した。これに対して、図３（Ｂ）に示すように、本発明の組成物を添加した場合、前記組成物由来の総タンパク質濃度依存的に、間葉系幹細胞が一回増殖するために必要な時間が短縮し、特に、総タンパク質濃度が３１．３μｇ／ｍｌ以上である場合、顕著に、間葉系幹細胞が一回増殖するために必要な時間が短縮した。また、本発明の組成物が未添加の培地で培養した場合、間葉系幹細胞は、継代回数を得ると倍加時間が延びた。これに対して、本発明の組成物を添加した場合、前記倍加時間の伸びがほぼ抑制され、この効果は、前記組成物由来の総タンパク質濃度を３１．３μｇ／ｍｌ以上とした場合、顕著であった。このため、本発明の組成物は、細胞の増殖促進活性を示すこと、および増殖活性の低下を抑制できることがわかった。
［実施例３］
　本発明の組成物が、線維芽細胞の機能促進活性を有することを確認した。
（１）線維芽細胞の培養
　正常ヒト皮膚繊維芽細胞（nHDF、KURABO社製、Cat. No.: KF-4109）は、増殖培地を用いてＴ－７５フラスコ（Sumilon社製）に起眠し、ＣＯ２インキュベーターで所定の培養条件（５％ＣＯ２、３７℃、湿潤条件下、以下、同様。）内で培養した。前記増殖培地は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Sigma-Aldrich社製、Cat. No.: 172012）および１％ペニシリン・ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific社製、Cat. No.: 15140-122）含有のＤＭＥＭ培地（nacalai tesque社製、Cat. No.: 08456-65）とした。前記培養において、培地交換は１～２日おきに行った。８０％程度のコンフルエントに到達した時点で、前記細胞を回収し、その後の試験に用いた。前記細胞の継代は、以下の通り実施した。まず、前記細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（－／－）（nacalai tesque社製、、Cat. No.: 14249-95）で洗浄後、剥離液（2.5 g/l-Trypsin/1 mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red (0.25% Trypsin-EDTA)、Thermo Fisher Scientific社製、Cat. No.: 32777-44）を用いて細胞を剥離し、増殖培地を加えてトリプシンを中和した。つぎに、細胞懸濁液を１５ｍｌ遠心管に回収し、遠心機（多目的冷却遠心機、TOMY社製、Cat. No.: CAX-571）を用いて、遠心（室温、1000 rpm、5分間）した。前記遠心後、上清を除き、新たに増殖培地を加えて細胞を撹拌し、トリパンブルー法で生細胞数のカウントを行った。前記増殖培地を用いて、目的の細胞濃度に調整し、その後の試験で用いる培養器に播種した。
（２）線維芽細胞の細胞増殖促進活性の確認
　前記細胞は、５×１０３細胞／０．１ｍｌ／ｗｅｌｌの密度で９６ウェルプレート（Sumilon社製、Cat. No.: MS-8096F）に播種し、前述の培養条件で１日間培養した。前記培養後、所定濃度（各被験物質処理濃度：0.5%、1%、2.5%、5%、10%）となるように、前記血小板除去巨核球培養物（ＭＤＦ）または血小板（ＰＬＴ）から調製した組成物（総タンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌ、実施例４および５においても同様）を含むＤＭＥＭ培地に培地交換した。このため、各培養液における前記組成物に由来する総タンパク質の濃度は、２５μｇ／ｍｌ（０．５％）、５０μｇ／ｍｌ（１％）、１２５μｇ／ｍｌ（２．５％）、２５０μｇ／ｍｌ（５％）、および５００μｇ／ｍｌ（１０％）となる（以下、同様）。なお、血小板除去巨核球培養物から調製した組成物は、２種類用いた（ｉＭＤＦ１、ｉＭＤＦ２）。前記培地交換後、４８時間培養した。
　前記培養後、各ウェルの細胞について、WST-8法により生細胞数を測定することにより、増殖活性を測定した。まず、発色試薬（Cell Count Reagent SF、nacalai tesque社製、Cat. No.: 07553-15）を１０％含有するＤＭＥＭ培地に培地交換し、前記培養条件でインキュベートした。前記インキュベート開始後３０分後から９０分後までの６０分間における吸光度（４５０ｎｍ）の変化量をプレートリーダー（Varioskan Flash、Thermo Fisher Scientific社製、Cat. No.: 5250040）を用いて測定した（各群ｎ＝３）。ネガティブコントロール（ＮＣ）は、前記組成物を添加しなかった以外は同様にして実施した。ポジティブコントロール（ＦＢＳ）は、前記組成物に代えて、１％または１０％となるようにＦＢＳを添加した以外は同様にして実施した。さらに、参考例（ＡＳＡ、Ｍｅｓ）は、前記組成物に代えて、コラーゲン産生促進活性を有するＬ－アスコルビン酸（L-Ascorbic Acid（ＡＳＡ）、Fujifilm-Wako社製、Cat. No.: 013-19641）を２ｍｍｏｌ／ｌとなるように添加し、またはヒアルロン酸産生促進活性を有するＮ－メチル－Ｌ－セリン（N-Methyl-L-serine（MeS）、Sigma-Aldrich社製、Cat. No.: 73156）を１０ｍｍｏｌ／ｌとなるように添加した以外は同様にして実施した。また、ネガティブコントロールにおける細胞生存率を１００％として、各サンプルの細胞生存率を相対的な増殖活性値とした。そして、ネガティブコントロールと比較するStudent’s T-test（両側検定, 対応無し）において、ｐ値が、０．０５未満のものを有意と判定した。これらの結果を図４に示す。
　図４は、線維芽細胞の増殖活性を示すグラフである。図４において、横軸は、サンプルの種類および濃度を示し、縦軸は、細胞生存率（増殖活性）を示す。図４に示すように、前記血小板除去巨核球培養物（iMDF1、iMDF2）または血小板（PLT、PLTMax Human Platelet Lysate、EMD Millipore社製、Cat. No.: SCM141）から調製した組成物のいずれを添加した場合においても、濃度依存的に細胞増殖促進効果が認められた。また、本発明の組成物の細胞増殖促進活性は、同一濃度の場合、ＦＢＳより高いと考えられた。
（３）細胞外マトリックスの産生促進活性の確認
　前記実施例３（２）の４８時間培養後、各ウェルの培養上清を回収し、後述のＩ型コラーゲンおよびヒアルロン酸産生促進試験に用いるまで、－８０℃で保存した。
　つぎに、前記培養上清（各群ｎ＝３）中のＩ型コラーゲン量を、Ｉ型コラーゲン測定キット（Human Collagen type I, ELISA kit (without pepsin)、ACEL社製、Cat. No.: EC1-E105）を用いて測定した。また、前記培養上清中のヒアルロン酸量を、ヒアルロン酸測定キット（Hyaluronan DuoSet ELISA、R&D Systems社製、Cat. No.: DY3614）を用いて測定した。各キットを用いた測定方法は、添付のプロトコルに従った。ネガティブコントロール（ＮＣ）は、前記組成物を添加しなかった以外は同様にして実施した。ＦＢＳ添加群（ＦＢＳ）については、前記実施例３（２）と同様にして実施した。ポジティブコントロール（ＡＳＡまたはＭｅｓ）は、Ｉ型コラーゲン測定に用いるサンプルについては、前記組成物に代えて、コラーゲン産生促進活性を有するＬ－アスコルビン酸（L-Ascorbic Acid（ＡＳＡ）、Fujifilm-Wako社製、Cat. No.: 013-19641）を２ｍｍｏｌ／ｌとなるように添加し、ヒアルロン酸測定に用いるサンプルについては、前記組成物に代えて、ヒアルロン酸産生促進活性を有するＮ－メチル－Ｌ－セリン（N-Methyl-L-serine（MeS）、Sigma-Aldrich社製、Cat. No.: 73156）を１０ｍｍｏｌ／ｌとなるように添加した以外は同様にして実施した。そして、ネガティブコントロールと比較するStudent’s T-test（両側検定, 対応無し）において、ｐ値が、０．０５未満のものを有意と判定した。これらの結果を図５および図６に示す。
　図５は、Ｉ型コラーゲンの産出量を示すグラフである。図５において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、Ｉ型コラーゲンの産生量を示す。なお、図中のＡＳＡの数値は、参考例（ＡＳＡ）におけるコラーゲン産生量（μｇ／ｍｌ）を示す。図５に示すように、前記血小板除去巨核球培養物または血小板から調製した組成物のいずれを添加した場合においても、濃度依存的にＩ型コラーゲンの産生量の増加が認められた。前記実施例３（２）の細胞増殖促進活性の結果と比較すると、前記Ｉ型コラーゲンの産生促進活性は、細胞増殖促進活性によるものと推定された。
　つぎに、図６は、ヒアルロン酸の産生量を示すグラフである。図６において、横軸は、サンプルの種類および濃度を示し、縦軸は、ヒアルロン酸の産生量を示す。図６に示すように、前記血小板除去巨核球培養物または血小板から調製した組成物のいずれを添加した場合においても、濃度依存的にヒアルロン酸の産生量の増加が認められた。前記細胞増殖促進活性と比較すると、前記ヒアルロン酸の産生促進活性は、細胞増殖促進活性と独立した活性、すなわち、本発明の組成物が、線維芽細胞に作用し、ヒアルロン酸の産生を促進していると推定された。
　以上のことから、本発明の組成物が、線維芽細胞の増殖促進活性、Ｉ型コラーゲンおよびヒアルロン酸等の細胞外マトリックス成分の産生促進活性を有することがわかった。前記線維芽細胞は、皮膚等に障害が生じた場合に、障害部位に遊走し、細胞分裂および細胞外マトリックス成分の分泌を通じて、障害部位の治癒に貢献する。本発明の組成物は、線維芽細胞におけるこれらの機能を促進することから、皮膚障害の治癒を促進しうると期待された。
［実施例４］
　本発明の組成物が、角化細胞の機能促進活性を有することを確認した。
（１）角化細胞の培養
　正常ヒト表皮角化細胞（nHEK、KURABO社製、Cat. No.: KK-4109）は、増殖培地を用いてＴ－７５フラスコ（Sumilon社製）に起眠し、ＣＯ２インキュベーターで所定の培養条件（５％ＣＯ２、３７℃、湿潤条件下、以下、同様。）内で培養した。前記増殖培地は、Humedia-KG2培地（KURABO社製、Cat. No.: KK-2150S）とした。前記培養において、培地交換は１～２日おきに行った。８０％程度のコンフルエントに到達した時点で、前記細胞を回収し、その後の試験に用いた。前記細胞の継代は、以下の通り実施した。まず、前記細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（－／－）（nacalai tesque社製、、Cat. No.: 14249-95）で洗浄後、剥離液（2.5 g/l-Trypsin/1 mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red (0.25% Trypsin-EDTA)、Thermo Fisher Scientific社製、Cat. No.: 32777-44）を用いて細胞を剥離し、増殖培地を加えてトリプシンを中和した。つぎに、細胞懸濁液を１５ｍｌ遠心管に回収し、遠心機（多目的冷却遠心機、TOMY社製、Cat. No.: CAX-571）を用いて、遠心（室温、1000 rpm、5分間）した。前記遠心後、上清を除き、新たに増殖培地を加えて細胞を撹拌し、トリパンブルー法で生細胞数のカウントを行った。前記増殖培地を用いて、目的の細胞濃度に調整し、その後の試験で用いる培養器に播種した。
（２）角化細胞の細胞増殖促進活性の確認
　前記細胞は、１×１０３細胞／０．１ｍｌ／ｗｅｌｌの密度で９６ウェルプレート（Sumilon社製、Cat. No.: MS-8096F）に播種し、前述の培養条件で１日間培養した。前記培養後、所定濃度（各被験物質処理濃度：0.5%、1%、2.5%、5%、10%）となるように、前記血小板除去巨核球培養物（iMDF1、iMDF2）または血小板（PLT）から調製した組成物を含む維持培地（Humedia-KB2、KURABO社製、Cat. No.: KK-2350S）に培地交換した。なお、血小板除去巨核球培養物から調製した組成物は、２種類用いた。前記培地交換後、４８時間培養した。
　前記培養後、各ウェルの細胞について、位相差顕微鏡（OLYMPUS社製、Cat. No.: CKX53）を用いて各細胞の形態を観察した。また、各ウェルの細胞について、前記実施例３（２）と同様にして、吸光度（４５０ｎｍ）の変化量を測定した（各群ｎ＝３）。ネガティブコントロール（ＮＣ）は、前記組成物を添加しなかった以外は同様にして実施した。ポジティブコントロール（添加剤）は、前記組成物を含む維持培地に代えて、前記増殖培地を用いた以外は同様にして実施した。さらに、参考例（ＪＴＣまたはＮＡ）は、前記組成物に代えて、ＦＬＧ遺伝子の発現促進活性を有するJTC-801（JTC、Sigma-Aldrich社製、Cat. No.: J3955、終濃度１００ｎｍｏｌ／ｌ）またはＳＰＴＬＣ１遺伝子の発現促進活性を有するNicotinamide（NA、Sigma-Aldrich社製、Cat. No.: N0636-100G、終濃度３０μｍｏｌ／ｌ）を添加した以外は同様にして実施した。また、ネガティブコントロールにおける細胞生存率を１００％として、各サンプルの細胞生存率を相対的な増殖活性値とした。そして、ネガティブコントロールと比較するStudent’s T-test（両側検定, 対応無し）において、ｐ値が、０．０５未満のものを有意と判定した。これらの結果を図７および図８に示す。
　図７は、各ウェルの細胞の位相差像を示す写真である。なお、前記血小板除去巨核球培養物（iMDF1、iMDF2）または血小板（PLT）から調製した組成物の添加群については、１０％添加群の例を代表例として示している。図７に示すように、ネガティブコントロールでは、角化細胞の境界は明確であり、上皮（表皮）層の細胞（表皮細胞）への分化は認められなかった。他方、前記血小板除去巨核球培養物（iMDF1、iMDF2）または血小板（PLT）から調製した組成物では、角化細胞がプレート上で伸展し、細胞境界が不明瞭化していた。これは、角化細胞が、上皮（表皮）層の細胞（表皮細胞）へと分化していることによる。また、前記血小板除去巨核球培養物（iMDF1、iMDF2）または血小板（PLT）から調製した組成物では、濃度依存的に、上皮（表皮）層の細胞の割合が増加し、特に、前記血小板除去巨核球培養物（iMDF1、iMDF2）を用いた場合に、顕著に増加が見られた。これらの結果から、本発明の組成物は、角化細胞の上皮層への細胞分化を促進することがわかった。
　図８は、角化細胞の増殖活性を示すグラフである。図８において、横軸は、サンプルの種類および濃度を示し、縦軸は、細胞生存率（増殖活性）を示す。図８に示すように、前記血小板除去巨核球培養物（iMDF1、iMDF2）または血小板（PLT）から調製した組成物のいずれを添加した場合においても、細胞増殖促進効果が認められた。また、本発明の組成物の細胞増殖促進活性は、同一濃度の場合、ＦＢＳより高いと考えられた。
（３）バリア機能遺伝子の誘導促進活性の確認
　５×１０４細胞／０．５ｍｌ／ｗｅｌｌの密度で２４ウェルプレート（Sumilon社製、Cat. No.: MS-8024）に播種した以外は、前記実施例４（２）と同様に角化細胞を培養した。前記培養後、ＲＮＡ抽出キット（RNeasy 96 Kit、QIAGEN社製、Cat. No.: 74181）を用いて、細胞からTotal RNAの回収および精製を行った。ＲＮＡの抽出は、キットに添付のプロトコルに従った。得られた精製ＲＮＡは、分光光度計（NanoDrop One、Thermo Fisher Scientific社製、Cat. No.: ND-ONE-W）を用いて濃度を測定するとともに、A260/A280により純度を確認し、逆転写反応に用いるまで、－８０℃で保存した。
　前記精製ＲＮＡから逆転写キット（QuantiTect Reverse Transcription Kit、QIAGEN社製）を用いて、cDNAを合成した。逆転写反応は、キットに添付のプロトコルに従った。得られたｃＤＮＡは、－３０℃で保存した。つぎに、得られたｃＤＮＡ、下記ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＦＬＧ遺伝子またはＳＰＴＬＣ１遺伝子用のプライマーセットおよびｑＰＣＲキット（TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)、Takara社製、Cat. No.: RR820A）を用いて、定量的ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応は、９５℃、３０秒で加熱処理後、９５℃、５秒、６０℃、３０秒を１サイクルとして４０サイクル実施後、得られたＰＣＲ産物を解離させた。前記ｑＰＣＲは、ｑＰＣＲ装置（LightCycler 96 Instrument、Roche社製、Cat. No.: 05815916001）を用いて実施した。ネガティブコントロール（ＮＣ）は、前記組成物を添加しなかった以外は同様にして実施した。ポジティブコントロール（ＪＴＣまたはＮＡ）は、ＦＬＧ遺伝子の発現測定に用いるサンプルについては、前記組成物に代えて、ＦＬＧ遺伝子の発現促進活性を有するJTC-801（JTC、Sigma-Aldrich社製、Cat. No.: J3955）を１００ｎｍｏｌ／ｌとなるように添加し、ＳＰＴＬＣ１遺伝子の発現測定に用いるサンプルについては、前記組成物に代えて、ＳＰＴＬＣ１遺伝子の発現促進活性を有するNicotinamide（NA、Sigma-Aldrich社製、Cat. No.: N0636-100G）を３０μｍｏｌ／ｌとなるように添加した以外は同様にして実施した。また、ネガティブコントロールおよびポジティブコントロールでは、添加剤を添加した群を準備し、同様に実施した。得られた測定データからΔΔＣｔ法により、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量で補正した各遺伝子の発現量を算出し、さらに、ネガティブコントロールの発現量を１とした相対的発現量を算出した。ネガティブコントロールと比較し、Student’s T-test（両側検定, 対応無し）においてｐ値が、０．０５未満のものを有意と判定した。これらの結果を、図９および図１０に示す。
・ＧＡＰＤＨ遺伝子用プライマーセット
　フォワードプライマー（配列番号１）
　　5'-CATCCCTGCCTCTACTGGCGCTGCC-3'
　リバースプライマー（配列番号２）
　　5'-CCAGGATGCCCTTGAGGGGGCCCTC-3'
・ＦＬＧ遺伝子用プライマーセット
　フォワードプライマー（配列番号３）
　　5'-TCGGCAAATCCTGAAGAATCCAGA-3'
　リバースプライマー（配列番号４）
　　5'-GCTTGAGCCAACTTGAATACCATCAG-3'
・ＳＰＴＬＣ１遺伝子用プライマーセット
　フォワードプライマー（配列番号５）
　　5'-ACAAAGCAAGAATCTTCCTGGAGGAAAGCC-3'
　リバースプライマー（配列番号６）
　　5'-AAACCTCCAATAGAAGCAAGTGCATTCTCC-3'
　図９は、ＦＬＧ遺伝子の発現量を示すグラフである。図９において、横軸は、サンプルの種類および濃度を示し、縦軸は、ＦＬＧ遺伝子の発現量を示す。図９に示すように、前記血小板除去巨核球培養物（iMDF1、iMDF2）または血小板（PLT）から調製した組成物のいずれを添加した場合においても、ＦＬＧ遺伝子の発現促進効果が認められた。また、本発明の組成物のＦＬＧ遺伝子の発現促進活性は、同一濃度の場合、ポジティブコントロールのJTC801より高いと考えられた。
　つぎに、図１０は、ＳＰＴＬＣ１遺伝子の発現量を示すグラフである。図１０において、横軸は、サンプルの種類および濃度を示し、縦軸は、ＳＰＴＬＣ１遺伝子の発現量を示す。図１０に示すように、前記血小板除去巨核球培養物（iMDF1、iMDF2）または血小板（PLT）から調製した組成物のいずれを添加した場合においても、ＳＰＴＬＣ１遺伝子の発現促進効果が認められた。また、本発明の組成物のＳＰＴＬＣ１遺伝子の発現促進活性は、同一濃度の場合、ポジティブコントロールのニコチンアミド（NA）より高いと考えられた。
　以上のことから、本発明の組成物が、角化細胞の増殖促進活性、表皮細胞への分化促進、およびＦＬＧ遺伝子、ＳＰＴＬＣ１遺伝子等のバリア機能遺伝子の発現促進活性を有することがわかった。前記角化細胞の増殖、表皮細胞への分化、およびバリア機能遺伝子の発現誘導は、皮膚組織およびそのバリア機能の維持において重要であることが知られている。このため、本発明の組成物は、角化細胞におけるこれらの機能を促進することから、皮膚機能の維持、皮膚のバリア機能の維持等の整肌の維持に使用できると期待された。
［実施例５］
　本発明の組成物が、毛乳頭細胞の機能促進活性を有することを確認した。
（１）毛乳頭細胞の培養
　ヒト頭髪毛乳頭細胞（HFDPC、 TOYOBO社製、Cat. No.: CA60205a）は、増殖培地を用いてＴ－７５フラスコ（Sumilon社製）に起眠し、ＣＯ２インキュベーターで所定の培養条件（５％ＣＯ２、３７℃、湿潤条件下、以下、同様。）内で培養した。前記増殖培地は、毛乳頭細胞増殖培地（PCGM、TOYOBO社製、Cat. No.: TMTPGM-250S）に添付の添加剤を添加したものとした。前記培養において、培地交換は１～２日おきに行った。８０％程度のコンフルエントに到達した時点で、前記細胞を回収し、その後の試験に用いた。前記細胞の継代は、以下の通り実施した。まず、前記細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（－／－）（nacalai tesque社製、、Cat. No.: 14249-95）で洗浄後、剥離液（2.5 g/l-Trypsin/1 mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red (0.25% Trypsin-EDTA)、Thermo Fisher Scientific社製、Cat. No.: 32777-44）を用いて細胞を剥離し、増殖培地を加えてトリプシンを中和した。つぎに、細胞懸濁液を１５ｍｌ遠心管に回収し、遠心機（多目的冷却遠心機、TOMY社製、Cat. No.: CAX-571）を用いて、遠心（室温、1000 rpm、5分間）した。前記遠心後、上清を除き、新たに増殖培地を加えて細胞を撹拌し、トリパンブルー法で生細胞数のカウントを行った。前記増殖培地を用いて、目的の細胞濃度に調整し、その後の試験で用いる培養器に播種した。
（２）毛乳頭細胞の細胞増殖促進活性の確認
　前記細胞は、５×１０３細胞／０．１ｍｌ／ｗｅｌｌの密度で９６ウェルプレート（Sumilon社製、Cat. No.: MS-8096F）に播種し、前述の培養条件で１日間培養した。前記培養後、所定濃度（各被験物質処理濃度：0.5%、1%、2.5%、5%、10%）となるように、前記血小板除去巨核球培養物（iMDF1、iMDF2）または血小板（PLT）から調製した組成物を含む毛乳頭細胞増殖培地に培地交換した。なお、血小板除去巨核球培養物から調製した組成物は、２種類用いた。前記培地交換後、４８時間培養した。
　前記培養後、各ウェルの細胞について、前記実施例３（２）と同様にして、吸光度（４５０ｎｍ）の変化量を測定した（各群ｎ＝３）。ネガティブコントロール（ＮＣ）は、前記組成物を添加しなかった以外は同様にして実施した。ポジティブコントロール（添加剤）は、前記添加剤を含む毛乳頭細胞増殖培地を用いた以外は同様にして実施した。参考例（ＭｘまたはＡｄ）は、前記組成物に代えて、発毛剤として知られているミノキシジル（Minoxidil（Mx）、Sigma-Aldrich社製、Cat. No.: M4145、終濃度３０μｍｏｌ／ｌ）またはアデノシン（Adenosine（Ad）、Sigma-Aldrich社製、Cat. No.: A9251、終濃度１００μｍｏｌ／ｌ）を添加した以外は同様にして実施した。また、ネガティブコントロールにおける細胞生存率を１００％として、各サンプルの細胞生存率を相対的な増殖活性値とした。そして、ネガティブコントロールと比較するStudent’s T-test（両側検定, 対応無し）において、ｐ値が、０．０５未満のものを有意と判定した。これらの結果を図１１に示す。
　図１１は、毛乳頭細胞の増殖活性を示すグラフである。図１１において、横軸は、サンプルの種類および濃度を示し、縦軸は、細胞生存率（増殖活性）を示す。図１１に示すように、前記血小板除去巨核球培養物（iMDF1、iMDF2）または血小板（PLT）から調製した組成物のいずれを添加した場合においても、細胞増殖促進効果が認められた。また、２．５～５％が添加量として指摘であることが示唆された。
（３）発毛促進遺伝子の誘導促進活性の確認
　２．５×１０４細胞／０．５ｍｌ／ｗｅｌｌの密度で２４ウェルプレート（Sumilon社製、Cat. No.: MS-8024）に播種した以外は、前記実施例５（２）と同様に毛乳頭細胞を培養した。前記培養後、前記実施例４（３）と同様にして、ｃＤＮＡを合成した。
　つぎに、プライマーセットとして、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子、下記ＦＧＦ７遺伝子またはＶＥＧＦＡ遺伝子用のプライマーセットを用いた以外は、前記実施例４（３）と同様にして、ｑＰＣＲを実施した。ネガティブコントロールは、前記組成物を添加しなかった以外は同様にして実施した。参考例は、前記組成物に代えて、発毛剤として知られているミノキシジル（Minoxidil、Sigma-Aldrich社製、Cat. No.: M4145、終濃度３０μｍｏｌ／ｌ）またはアデノシン（Adenosin、Sigma-Aldrich社製、Cat. No.: A9251、終濃度１００μｍｏｌ／ｌ）を添加した以外は同様にして実施した。得られた測定データからΔΔＣｔ法により、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量で補正した各遺伝子の発現量を算出し、さらに、ネガティブコントロールの発現量を１とした相対的発現量を算出した。ネガティブコントロールと比較し、Student’s T-test（両側検定, 対応無し）においてｐ値が、０．０５未満のものを有意と判定した。これらの結果を、図１２および図１３に示す。
・ＦＧＦ７遺伝子用プライマーセット
　フォワードプライマー（配列番号７）
　　5'-TCTGTCGAACACAGTGGTACCTGAG-3'
　リバースプライマー（配列番号８）
　　5'-GCCACTGTCCTGATTTCCATGA-3'
・ＶＥＧＦＡ遺伝子用プライマーセット
　フォワードプライマー（配列番号９）
　　5'-AAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCG-3'
　リバースプライマー（配列番号１０）
　　5'-CTTGTCACATCTGCAAGTACGTTCG-3'
　図１２は、ＦＧＦ７遺伝子の発現量を示すグラフである。図１２において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、ＦＧＦ７遺伝子の発現量を示す。図１２に示すように、前記血小板除去巨核球培養物（iMDF1、iMDF2）から調製した組成物を添加した場合、ＦＧＦ７遺伝子の発現促進効果が認められた。また、本発明の組成物のＦＧＦ７遺伝子の発現促進活性は、同一濃度の場合、公知の発毛剤と同程度と考えられた。
　つぎに、図１３は、ＶＥＧＦＡ遺伝子の発現量を示すグラフである。図１３において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、ＶＥＧＦＡ遺伝子の発現量を示す。図１３に示すように、前記血小板除去巨核球培養物（iMDF1、iMDF2）または血小板（PLT）から調製した組成物を添加した場合、ＶＥＧＦＡ遺伝子の発現促進効果が認められた。また、本発明の組成物のＶＥＧＦＡ遺伝子の発現促進活性は、同一濃度の場合、公知の発毛剤と同程度と考えられた。
　以上のことから、本発明の組成物が、毛乳頭細胞の増殖促進活性、およびＦＧＦ７遺伝子、ＶＥＧＦＡ遺伝子等の発毛遺伝子の発現促進活性を有することがわかった。前記毛乳頭細胞の増殖および発毛遺伝子の発現誘導は、発毛、毛の成長および維持において重要であることが知られている。このため、本発明の組成物は、毛乳頭細胞におけるこれらの機能を促進することから、発毛に使用できると期待された。
　以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
　この出願は、２０１９年１２月１３日に出願された日本出願特願２０１９－２２５９５９を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
＜付記＞
　上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
＜組成物＞
（付記１）
巨核球またはその培養物の処理物を含む、組成物。
（付記２）
前記処理物は、巨核球またはその培養物の細胞画分の抽出物である、付記１記載の組成物。
（付記３）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２０００～２００００ｐｇの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む、付記１または２記載の組成物。
（付記４）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、８０００～８００００ｐｇのインスリン様増殖因子結合タンパク質－２（ＩＧＦＢＰ－２）を含む、付記１から３のいずれかに記載の組成物。
（付記５）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、１～６０ｐｇの胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）を含む、付記１から４のいずれかに記載の組成物。
（付記６）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２００～２０００ｐｇの幹細胞因子受容体（ＳＣＦＲ）を含む、付記１から５のいずれかに記載の組成物。
（付記７）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２０～８００ｐｇの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む、付記１から６のいずれかに記載の組成物。
（付記８）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２０～４００ｐｇの血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）を含む、付記１から７のいずれかに記載の組成物。
（付記９）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、１０００～１００００ｐｇの分化増殖因子－１５（ＧＤＦ－１５）を含む、付記１から８のいずれかに記載の組成物。
（付記１０）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～１０００ｐｇの骨形成タンパク質－７（ＢＭＰ－７）を含む、付記１から９のいずれかに記載の組成物。
（付記１１）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～１６ｐｇのアンフィレグリン（ＡＲ）を含む、付記１から１０のいずれかに記載の組成物。
（付記１２）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～６０ｐｇの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を含む、付記１から１１のいずれかに記載の組成物。
（付記１３）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～１００ｐｇの肝臓増殖因子（ＨＧＦ）を含む、付記１から１２のいずれかに記載の組成物。
（付記１４）
前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～２００ｐｇのインスリン様増殖因子結合タンパク質－１（ＩＧＦＢＰ－１）を含む、付記１から１３のいずれかに記載の組成物。
（付記１５）
細胞の増殖促進活性を有する、付記１から１４のいずれかに記載の組成物。
（付記１６）
前記細胞は、間葉系幹細胞、線維芽細胞、角化細胞、および／または毛乳頭細胞である、付記１５記載の組成物。
（付記１７）
線維芽細胞の機能促進活性を有する、付記１から１６のいずれかに記載の組成物。
（付記１８）
前記線維芽細胞の機能は、線維芽細胞の増殖および／または線維芽細胞による細胞外マトリックスの産生である、付記１７記載の組成物。
（付記１９）
前記細胞外マトリックスは、コラーゲンおよび／またはヒアルロン酸を含む、付記１８記載の組成物。
（付記２０）
角化細胞の機能促進活性を有する、付記１から１９のいずれかに記載の組成物。
（付記２１）
前記角化細胞の機能は、角化細胞の増殖、表皮細胞への分化、および／またはバリア機能遺伝子の誘導である、付記２０記載の組成物。
（付記２２）
前記バリア機能遺伝子は、プロフィラグリン遺伝子および／またはセラミド合成酵素遺伝子を含む、付記２１記載の組成物。
（付記２３）
毛乳頭細胞の機能促進活性を有する、付記１から２２のいずれかに記載の組成物。
（付記２４）
前記毛乳頭細胞の機能は、毛乳頭細胞の増殖および／または発毛促進遺伝子の誘導である、付記２３記載の組成物。
（付記２５）
前記発毛遺伝子は、ＦＧＦ７遺伝子および／またはＶＥＧＦ遺伝子である、付記２４記載の組成物。
（付記２６）
前記巨核球の培養物は、血小板が除去された培養物である、付記１から２５のいずれかに記載の組成物。
（付記２７）
前記巨核球は、不死化巨核球である、付記１から２６のいずれかに記載の組成物。
（付記２８）
前記不死化巨核球は、外来性のＢＭＩ１遺伝子、ＭＹＣ遺伝子、およびＢｃｌ－ｘＬ遺伝子を含む巨核球である、付記２７記載の組成物。
（付記２９）
前記巨核球は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで誘導された巨核球である、付記１から２８のいずれかに記載の組成物。
（付記３０）
前記巨核球は、多能性細胞由来である、付記１から２９のいずれかに記載の組成物。
（付記３１）
前記多能性細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、付記３０記載の組成物。
（付記３２）
前記処理物は、
　巨核球またはその培養物を処理し、
　前記処理は、濃縮処理、乾燥処理、凍結処理、凍結乾燥処理、溶媒処理、界面活性剤処理、酵素処理、タンパク質分画抽出処理、超音波処理、および／または破砕処理である、付記１から３１のいずれかに記載の組成物。
（付記３３）
前記処理物は、
　前記巨核球またはその培養物から血小板を除去し、
　前記血小板が除去された巨核球またはその培養物を処理する、付記３２記載の組成物。
（付記３４）
前記処理物は、
　前記血小板が除去された巨核球またはその培養物を保存し、
　前記保存された巨核球またはその培養物を処理する、付記３３記載の組成物。
（付記３５）
前記処理物は、
　前記巨核球またはその培養物を保存し、
　前記保存された巨核球またはその培養物を破砕処理する、付記３４記載の組成物。
＜組成物の製造方法＞
（付記３６）
巨核球またはその培養物を処理する処理工程を含み、
前記処理工程における処理は、濃縮処理、乾燥処理、凍結処理、凍結乾燥処理、溶媒処理、界面活性剤処理、酵素処理、タンパク質分画抽出処理、超音波処理、および／または破砕処理である、組成物の製造方法。
（付記３７）
前記巨核球またはその培養物から血小板を除去する除去工程を含み、
前記処理工程では、前記血小板が除去された巨核球またはその培養物を処理する、付記３６記載の製造方法。
（付記３８）
前記血小板が除去された巨核球またはその培養物を保存する保存工程を含み、
前記処理工程では、前記保存された巨核球またはその培養物を処理する、付記３７記載の製造方法。
（付記３９）
前記巨核球またはその培養物を保存する保存工程を含み、
前記処理工程では、前記保存された巨核球またはその培養物を破砕処理する、付記３８記載の製造方法。
（付記４０）
付記３６から３９のいずれかに記載の製造方法で得られる、組成物。
＜細胞の増殖促進組成物＞
（付記４１）
付記１から３５のいずれかに記載の組成物を含む、細胞の増殖促進組成物。
（付記４２）
前記細胞は、間葉系幹細胞、線維芽細胞、角化細胞、および／または毛乳頭細胞である、付記４２記載の細胞の増殖促進組成物。
＜細胞の増殖促進方法＞
（付記４３）
付記４１または４２記載の細胞の増殖促進組成物を使用する、細胞の増殖促進方法。
（付記４４）
前記細胞は、間葉系幹細胞、線維芽細胞、角化細胞、および／または毛乳頭細胞である、付記４３記載の細胞の増殖促進方法。
（付記４５）
前記細胞の増殖促進組成物を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで使用する、付記４３または４４記載の細胞の増殖促進方法。
＜線維芽細胞の機能促進組成物＞
（付記４６）
付記１から３５のいずれかに記載の組成物を含む、線維芽細胞の機能促進組成物。
（付記４７）
前記線維芽細胞の機能は、線維芽細胞の増殖および／または線維芽細胞による細胞外マトリックスの産生である、付記４６記載の機能促進組成物。
（付記４８）
前記細胞外マトリックスは、コラーゲンおよび／またはヒアルロン酸を含む、付記４７記載の機能促進組成物。
＜線維芽細胞の機能促進方法＞
（付記４９）
付記４６から４８のいずれかに記載の線維芽細胞の機能促進組成物を使用する、線維芽細胞の機能促進方法。
（付記５０）
前記線維芽細胞の機能促進組成物を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで使用する、付記５０記載の線維芽細胞の機能促進方法。
＜皮膚障害の治癒促進組成物＞
（付記５１）
付記１から３５のいずれかに記載の組成物を含む、皮膚障害の治癒促進組成物。
（付記５２）
前記皮膚障害は、皮膚の潰瘍、褥瘡、火傷、瘢痕、および／または創傷である、付記５１記載の治癒促進組成物。
＜皮膚障害の治癒促進方法＞
（付記５３）
付記５１または５２記載の皮膚障害の治癒促進組成物を使用する、皮膚障害の治癒促進方法。
（付記５４）
前記皮膚障害の治癒促進組成物を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで使用する、付記５３記載の皮膚障害の治癒促進方法。
＜角化細胞の機能促進組成物＞
（付記５５）
付記１から３５のいずれかに記載の組成物を含む、角化細胞の機能促進組成物。
（付記５６）
前記角化細胞の機能は、角化細胞の増殖、表皮細胞への分化、および／またはバリア機能遺伝子の誘導である、付記５５記載の機能促進組成物。
（付記５７）
前記バリア機能遺伝子は、プロフィラグリン遺伝子および／またはセラミド合成酵素遺伝子を含む、付記５６記載の機能促進組成物。
＜角化細胞の機能促進方法＞
（付記５８）
付記５５から５７のいずれかに記載の角化細胞の機能促進組成物を使用する、角化細胞の機能促進方法。
（付記５９）
前記角化細胞の機能促進組成物を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで使用する、付記５８記載の角化細胞の機能促進方法。
＜毛乳頭細胞の機能促進組成物＞
（付記６０）
付記１から３５のいずれかに記載の組成物を含む、毛乳頭細胞の機能促進組成物。
（付記６１）
前記毛乳頭細胞の機能は、毛乳頭細胞の増殖および／または発毛促進遺伝子の誘導である、付記５６記載の機能促進組成物。
（付記６２）
前記バリア機能遺伝子は、プロフィラグリン遺伝子および／またはセラミド合成酵素遺伝子を含む、付記５７記載の機能促進組成物。
＜毛乳頭細胞の機能促進方法＞
（付記６３）
付記６０から６２のいずれかに記載の毛乳頭細胞の機能促進組成物を使用する、毛乳頭細胞の機能促進方法。
（付記６４）
前記毛乳頭細胞の機能促進組成物を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで使用する、付記６３記載の毛乳頭細胞の機能促進方法。
＜発毛促進組成物＞
（付記６５）
付記１から３５のいずれかに記載の組成物を含む、発毛促進組成物。
＜発毛促進方法＞
（付記６６）
付記６５記載の発毛促進組成物を使用する、発毛促進方法。
（付記６７）
前記発毛促進組成物を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで使用する、付記６６記載の発毛促進方法。
＜組成物の使用＞
（付記６８）
細胞の増殖促進のために使用するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物。
（付記６９）
線維芽細胞の機能促進のために使用するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物。
（付記７０）
皮膚障害の治癒促進のために使用するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物。
（付記７１）
角化細胞の機能促進のために使用するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物。
（付記７２）
毛乳頭細胞の機能促進のために使用するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物。
（付記７３）
発毛促進のために使用するための、巨核球またはその培養物の処理物を有効成分として含む、組成物。
　以上のように、本発明によれば、細胞由来の生理活性を有する組成物を提供できる。また、本発明の組成物は、例えば、間葉系細胞、線維芽細胞、角化細胞、毛乳頭細胞等の細胞増殖を促進でき、また、皮膚の潰瘍、褥瘡、火傷、瘢痕、創傷等の皮膚障害の治癒促進、皮膚のバリア機能の維持または向上、発毛等に好適に利用できると期待される。このため、本発明は、医薬分野、再生医療分野等において極めて有用である。

 

Claims (34)

  1. 巨核球またはその培養物の処理物を含む、組成物。
  2. 前記処理物は、巨核球またはその培養物の細胞画分の抽出物である、請求項１記載の組成物。
  3. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２０００～２００００ｐｇの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む、請求項１または２記載の組成物。
  4. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、８０００～８００００ｐｇのインスリン様増殖因子結合タンパク質－２（ＩＧＦＢＰ－２）を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、１～６０ｐｇの胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２００～２０００ｐｇの幹細胞因子受容体（ＳＣＦＲ）を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２０～８００ｐｇの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、２０～４００ｐｇの血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、１０００～１００００ｐｇの分化増殖因子－１５（ＧＤＦ－１５）を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～１６ｐｇのアンフィレグリン（ＡＲ）を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～６０ｐｇの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～１００ｐｇの肝臓増殖因子（ＨＧＦ）を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記処理物は、総タンパク質１ｍｇあたり、０～２００ｐｇのインスリン様増殖因子結合タンパク質－１（ＩＧＦＢＰ－１）を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 細胞の増殖促進活性を有する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 前記細胞は、間葉系幹細胞、線維芽細胞、角化細胞、および／または毛乳頭細胞である、請求項１４記載の組成物。
  16. 線維芽細胞の機能促進活性を有する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記線維芽細胞の機能は、線維芽細胞の増殖および／または線維芽細胞による細胞外マトリックスの産生である、請求項１６記載の組成物。
  18. 角化細胞の機能促進活性を有する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記角化細胞の機能は、角化細胞の増殖、表皮細胞への分化、および／またはバリア機能遺伝子の誘導である、請求項１８記載の組成物。
  20. 毛乳頭細胞の機能促進活性を有する、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 前記毛乳頭細胞の機能は、毛乳頭細胞の増殖および／または発毛促進遺伝子の誘導である、請求項２０記載の組成物。
  22. 前記巨核球は、不死化巨核球である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記巨核球は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで誘導された巨核球である、請求項１から２２のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞の増殖促進組成物。
  25. 前記細胞は、間葉系幹細胞である、請求項２４記載の細胞の増殖促進組成物。
  26. 請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物を含む、線維芽細胞の機能促進組成物。
  27. 前記線維芽細胞の機能は、線維芽細胞の増殖および／または線維芽細胞による細胞外マトリックスの産生である、請求項２６記載の機能促進組成物。
  28. 請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物を含む、皮膚障害の治癒促進組成物。
  29. 前記皮膚障害は、皮膚の潰瘍、褥瘡、火傷、瘢痕、および／または創傷である、請求項２８記載の治癒促進組成物。
  30. 請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物を含む、角化細胞の機能促進組成物。
  31. 前記角化細胞の機能は、角化細胞の増殖、表皮細胞への分化、および／またはバリア機能遺伝子の誘導である、請求項３０記載の機能促進組成物。
  32. 請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物を含む、毛乳頭細胞の機能促進組成物。
  33. 前記毛乳頭細胞の機能は、毛乳頭細胞の増殖および／または発毛促進遺伝子の誘導である、請求項３２記載の機能促進組成物。
  34. 請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物を含む、発毛促進組成物。
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