KR100686685B1

KR100686685B1 - 히스톤 디아세틸라제 억제제를 함유하는 중간엽 줄기세포의골분화유도용 조성물 및 이를 이용한 골분화 증가방법

Info

Publication number: KR100686685B1
Application number: KR1020060050030A
Authority: KR
Inventors: 정진섭; 조현화; 서근택
Original assignee: 주식회사 바이넥스; 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2006-06-02
Filing date: 2006-06-02
Publication date: 2007-02-26
Anticipated expiration: 2024-09-04
Also published as: KR20060079772A

Abstract

본 발명은 히스톤디아세틸라제 (HDAC) 억제제에 의한 중간엽 줄기세포(MSC)의 골분화유도작용및 HDAC 억제제의 처리방법에 대한 것이다.

본 발명에 따르면, HDAC 억제제의 전처리는 중간엽 줄기세포에서 골세포분화유도효과를 현저히 증가시킴을 알 수 있다. 따라서, HDAC 억제제에 의하여 골세포의 분화가 촉진되는 것을 바탕으로 HDAC 억제제를 제조하여 골분화유도제를 이용한 골재생기술개발에 이용할 수 있다.

Description

히스톤 디아세틸라제 억제제를 함유하는 중간엽 줄기세포의 골분화유도용 조성물 및 이를 이용한 골분화 증가방법{Osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells using histone deacetylase inhibitors}

도 1은 중간엽세포에서 HDAC 억제제의 일종인 발프로산 (VPA)의 처리에 의하여 골분화정도를 측정한 결과이다.

도 2는 중간엽 줄기세포에서 VPA의 전처리에 의하여 골세포로의 분화가 촉진됨을 나타낸 결과이다.

도 3은 중간엽 줄기세포에서 VPA 전처치에 의한 지방분화 억제작용을 측정한 결과이다.

도 4는 중간엽 줄기세포에서 골세포로의 분화에 또다른 HDAC 억제제인 트라코스타틴 A (TSA)의 작용과 발프로산 유사 유도체이면서 HDAC 억제작용이 없는 ㅂ발프로미드의 골분화 정도에 대한 효과를 확인한 결과이다.

도 5는 마이크로어레이에 의해 확인된 유전자 발현의 변화를 실시간 PCR로 확인해본 결과이다.

도 6은 중간엽 줄기세포의 증식에 VPA가 미치는 영향을 확인한 결과이다.

도 7은 VPA 전처치한 세포에서 생체 두개골재생능력의 증가를 나타낸 결과이다.

본 발명은 골분화 조절에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 중간엽 줄기세포(MSC)에서 골분화조절 촉진효과가 처음 밝혀진 HDAC 억제제 및 그 유도체 화합물 및 이를 함유하는 골분화 촉진 조성물에 관한 것이다.

염색체의 DNA는 크로마틴이라는 매우 컴팩트한 구조로 되어 있다. 핵내에서의 유전자 발현은 이렇게 꽉찬 뉴크레오좀 입자로부터 접근가능한 뉴크레오좀 입자로의 풀어주는 일단의 단백질 복합체에 의해 일부 제어된다. 이러한 패킹 및 풀림 공정의 메카니즘은 뉴클레오좀 코어를 구성하는 히스톤 단백질의 아세틸화와 탈아세틸화를 포함한다. 하나의 뉴클레오좀 코어 입자는 히스톤 단백질들(H2A, H2B, H3 및 H4)의 옥타머를 함유한다. 아세틸화된 히스톤 단백질은 발현을 위해 전사 인자들이 DNA 주형에 접근할 수 있도록 해준다. 여러 알려진 스테로이드 리셉터 공활성화제들이 이러한 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT) 활성을 가지고 있다. 이에 반해 히스톤 디아세틸라제(histone deacetylases, 이하 HDAC 이라고도 함)는 히스톤 단백질을 탈아세틸화하는 크로마틴 리모델링 인자로서, 전사 억제제의 역할을 할 수 있다.

발프로산 (VPA; 2-propyl-pentanoic acid)은 항경련제로 처음 개발되었으며 현재 다양한 정신과 질환의 치료에 이용되고 있는 단쇄 지방산이다. 이들 질환에 대한 VPA의 작용기전은 잘 알려져 있지 않지만 여러 가지 기전들이 관여하는 것으 로 생각되고 있다 (Johanessen, 2000; Gurvich et al, 2002). VPA는 치료용량에서 히스톤디아세틸라제 (HDAC)를 억제하는 것으로 알려져 있다 (Phiel et al, 2001; Gottlicher et al, 2001). 히스톤의 아미노말단의 아세틸화는 크로마틴의 구조에 영향을 주어 유전자 발현에 영향을 미치는 히스톤 코드를 결정한다 (Strahl et al, 2000). 전사인자복합체로 히스톤 아세틸트란스퍼자레가 작용하여 히스톤이 아세틸화되되면 DNA는 더 개방된 형태를 가지게 되고 이는 일반적으로 유전자의 발현을 증가시키게 된다. 역으로, HDAC에 의한 히스톤의 탈아세틸화는 크로마틴의 구조(conformation)을 폐쇄형으로 전환하여 전사과정의 억제를 유도한다. 따라서, HDAC의 억제는 전사과정을 촉진하게 된다. 그 외에도 VPA는 이노시톨 결핍을 유도하여 신경세포의 성장을 억제하는 것으로 보고되어 있다 (Williams et al, 2002).

HDAC 억제제들이 세포성장을 억제하고 다양한 암세포의 분화를 유도함이 보고되어 (Marks et al, 2001; Cinatl et al, 1996; Blaheta & Cinatl, 2002; Gottlicher et al, 2001) 암치료제로 사용가능성이 제안되었고 실제 임상시험 중이다 (Marks et al, 2001; Kramer et al, 2001; Gore et al, 2000; Cheson et al, 2000). VPA는 또한 배아줄기세포의 심근세포로의 분화를 억제하고 (Na et al, 2003) 인체지방세포의 분화를 억제함이 보고되었다 (Lagace & Nachtigal, 2004).

중간엽 줄기세포(MSC)는 체외에서 쉽게 증식할 수 있으며, 여러 가지 세포형태(지방세포, 연골세포, 근육세포, 뼈세포)로 분화가 가능한 세포이다 [Caplan, A.I. 1991. J. Orthop . Res . 9, 641-650 ; Beresford, J. N., Bennett, J. H., Devlin, C., Leboy, P. S., and Owen, M.E. (1992). J. Cell Sci. 102, 341-351 ; Pittenger, M.F., Mackay, A.M., Beck, S.C., Jaiswal, R. K., Douglas, R., Mosca, J. D., Moorman, M. A., Simonetti, D. W., Craig, S., and Marshak, D. R. (1999). Science 284, 143-147 ; Patricia, A. Z., Min, Z., Hiroshi, M., Jerry H., William, F. J., Adam, J. K., Prosper, B., Peter L. H., and Hedrick M. H. 2001. Tissue engineering . 7, 211-227]. 따라서, 중간엽 줄기세포는 유전자 치료와 세포치료에 있어서 유용한 표적으로 이용될 수 있으며 중간엽 줄기세포의 분화기전에 대한 이해는 다양한 세포의 초기분화를 이해하는데 중요한 역할을 한다 [Banfi, A., Muraglia, A., Dozin, B., Mastrogiacomo, M., Cancedda, R., and Quarto, R. 2000. Exp . Hematology. 28, 707-715].

본 발명에서는 중간엽 줄기세포에서 HDAC 억제제가 중간엽 줄기세포의 골분화과정을 조절할 수 있음을, 특히 분화유도전 전처치만으로도 그 효과를 나타냄을 증명하였다. 따라서, 본 발명은 HDAC 억제제의 골분화 조절작용에 대한 특허이며 이를 이용한 골분화 조절과 골치료제 개발기술에 대한 기반을 제공한다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 HADC 억제제를 함유하는 중간엽 줄기세포(MSC)의 골세포 분화 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 조성물을 함유하는 골유도 관련 골질환의 치료제 개발에 이용하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 조성물을 이용하여 중간엽 줄기세포의 골분화 증가방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 히스톤디아세틸라제(HDAC) 억제제를 유효성분으로 포함하는 중간엽 줄기세포(MSC)의 골분화유도용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 있어서, HDAC 억제제는 히스톤의 탈아세틸화를 억제하는 약제로서 종래 항암제 요법에 많이 사용되어 왔다. 그 예로는 4-페닐부티레이트 및 발프로산과 같은 단쇄 지방산, 수베로일아닐리드 히드록삼산 (SAHA), 피록사미드, 트라코스타틴 A, 옥삼플라틴 및 CHAPS와 같은 하이드록삼산, 트라폭신, 아피시딘 및 뎁시펩티드 (FK-228 또는 FR 901228로도 알려짐)와 같은 환형 테트라펩타이드, 및 MS-275와 같은 벤즈아미드를 포함한다 (Kouraklis G. and Theocharis S., Current Medicinal Chemistry "Histone Deacetylase Inhibitors and Anticancer Therapy", 2002, vol. 2, no. 4, pp. 477-484). 본 발명은 상기 HDAC 억제제의 골세포 분화 촉진제로서의 새로운 용도를 밝혀냈다.

본 발명의 조성물에 있어서, 바람직하게는 상기 HDAC 억제제는 하기 화학식 1의 발프로산(valproic acid) 또는 그 유도체인 것을 특징으로 하는 골분화유도용 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

발프로산(valproic acid, VPA)는 2-프로필펜타노익산 [(CH₃CH₂CH₂)₂CHCOOH]으로서 지난 수십년간 정신질환치료에서 안정제와 간질치료를 위한 항경련제로 사용되어 왔으며, 일일 400-1000 mg의 용량으로 사용되어 왔다 (Johannessen CU. MNeurochem Int 200037: 103-110; Gurvich N, Klein PS. Pharmacol Ther 200296: 45-66. ). 본 발명은 이러한 발프로산뿐만 아니라 생체 또는 시험관 내에서 HDAC 억제효능을 나타내는 그 유도체를 포함한다. 상기 유도체는 약제학적으로 허용가능한 각종 무기염 또는 유기염을 포함한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 바람직하게는 상기 발프로산 또는 그 유도체는 1-4 mM 농도로, 더욱 바람직하게는 2-4 mM 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 한다. 농도가 너무 낮으면 효과를 나타내지 않으며, 농도가 너무 높으면 독성을 가지게 되므로 세포의 종류에 따라 적정한 농도를 확인해야 한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 HDAC 억제제는 하기 화학식 1의 트라코스타틴(trichostatin) 또는 그 유도체인 것을 특징으로 하는 골분화유도용 조성물을 제공한다:

[화학식 2]

트라코스타틴(trichostatin, TSA)은 7-(4-(디메틸아미노)페닐)-n-히드록시- 4,6-디메틸-7-옥소-2,4-헵타디엔아미드(7-(4-(dimethylamino)phenyl)-n-hydroxy- 4,6-dimethyl-7-oxo-2,4-heptadienamide (C₁₇H₂₂N₂O₃)로서, 스트렙토마이세스(Streptomyces.)에서 분리된 히스톤디아세틸라제 억제제이다. 본 발명은 이러한 트라코스타틴뿐만 아니라 생체 또는 시험관내에서 HDAC 억제효능을 나타내는 그 유도체를 포함한다. 상기 유도체는 약제학적으로 허용가능한 각종 무기염 또는 유기염을 포함한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 바람직하게는 상기 트라코스타틴 또는 그 유도체는 300-900 μM 농도로, 더 바람직하게는 500-800μM 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 한다. 농도가 너무 낮으면 효과를 보기 어렵고, 농도가 너무 높으면 독성을 가지게 되므로 세포의 종류에 따라 적정한 농도를 확인해야 한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 중간엽 줄기세포 (MSC)에 임의의 약제를 처리하는 단계 및 상기 중간엽 줄기세포 (MSC)에서 골세포 분화 정도를 측정하는 단계를 포함하는 골세포 분화 조절기능을 갖는 HDAC 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에서, 바람직하게는 상기 제1단계에서는 지방조직 및 골수에서 인체의 중간엽 줄기세포를 분리배양하고 이를 다중(6, 12, 24, 46, 또는 96 등) well 배양용기에 배양하고 HDAC 억제제가 있거나 없는 상태에서 골분화를 유도하며, 제2단계에서는 alizarin S 염색과 같은 방법을 통하여 골분화정도를 측정하여 HDAC 억제제의 효과를 측정한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지방 또는 골수로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계, 분리된 중간엽 줄기세포의 분화유도전 HDAC 억제제로 전처리하는 단계, 및 전처리된 중간엽 줄기세포를 골분화유도배지에서 배양하는 단계를 포함하는 기질 줄기세포의 골분화 증가방법를 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 바람직하게는 상기 HDAC 억제제는 발프로산 또는 트라코스타틴인 것을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 상기 HDAC 억제제는 발프로산의 경우 1-3 mM 또는 트라코스타틴의 경우 300-800 μM의 농도 범위로 함유되어 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 골분화유도배지는 당업계에서 골분화에 통상 사용되는 배지일 수 있으나, 바람직하게는 8~12% FBS, 48∼52 ㎍/㎖ 아스코르브산, 1.3∼1.7 mg/ml β-글리세로포스페이트, 0.8∼1.2 x10^-8M 덱사메타손을 포함한 α-MEM배지인 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 동물혈청 대신 8~12% 인간혈청을 포함한 동일조성의 α-MEM배지를 특징으로 한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명에 따라 시험관내에서(in vitro) 골분화된 중간엽 줄기세포(MSC)를 유효성분으로 함유하는 세포 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 시험관내(in vitro)에서 HDAC 억제제로 전처치된 중간엽 줄기세포는 각종 세포 치료방법에 이용될 수 있다.[Lee JA, Parrett BM, Conejero JA, Laser J, Chen J, Kogon AJ, Nanda D, Grant RT, Breitbart AS. 2003. Ann Plast Surg. 50(6):610-7.] 이 경우 시험관내에서 HDAC 억제제로 처리된 세포를 분화유도없이 콜라겐이나 히드록시아파타이트 스캐폴드 등 다양한 생체보조제와 혼합하여 외과수술적으로 골조직에 이식할 수 있다. 본 발명의 세포 치료용 조성물은 상기 골분화된 중간엽 줄기세포 외에 보조성분으로서 콜라겐이나 골지지체 등을 더 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물 중 분화된 줄기세포는 질병의 유형, 투여경로, 환자의 나이 및 성, 및 질병의 정도에 따라 변할 수 있으나, 바람직하게는 평균 성인의 경우 1-5 x 10⁷cell/cm³ 스캐폴드를 투여한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 세포 치료용 조성물은 골질환 치료용으로 사용되는 것을 특징으로 한다. 여기서, 골질환이란 골분화 및 재생을 필요로 하는 골에 관련된 질환을 의미하며, 골절등 외상성 골손상 및 수술후 발생한 골결손을 포함한다. 본 발명의 조성물은 골분화유도를 통해 상기 골질환을 치료할 수 있다.

구체적으로, 본 발명에서는 지방조직 및 골수에서 분리배양한 중간엽 줄기세포에서 VPA는 농도에 의존적으로 골분화를 증가시켰고 지방분화는 억제하였다. 분화유도전 2일이나 4일간의 전처치에 의해서도 중간엽 줄기세포의 분화능에 대해 동일한 효과가 관찰되었다. VPA는 2 mM이상의 농도에서 중간엽 줄기세포의 증식을 억제하였다. 히스톤디아세틸라제 (HDAC) 의 다른 억제제인 트라코스타틴 A (TSA) 도 중간엽 줄기세포의 골분화를 증가시켰으나 VPA와 구조적으로 유사하나 HDAC의 억제작용이 없는 발프로미드는 골분화에 유의한 효과가 관찰되지 않았다.

마이크로어레이를 이용한 유전자 발현분석결과 VPA 처리한 세포에서 다양한 유전자의 발현변화가 관찰되었으며 특히 BMP-2, Runx2 등의 골분화 유도에 관여하는 유전자의 mRNA 수준이 증가하였고 이를 실시간 PCR로 재확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 지방과 골수로부터 중간엽 줄기세포의 분리

부산대학병원에서 대퇴골치환술과 지방제거수술을 시행한 환자에서 얻은 지방과 골수로부터 기질 줄기세포를 분리하였다. 골수에서 기질 줄기세포를 분리하기 위하여 골수에 Ficoll을 첨가하고 3500rpm에서 30분간 원심분리를 해준 후 단핵세포층(mononuclear cell layer)인 상층액을 HBSS로 씻어준다. 원심분리 후 피브로넥틴이 코팅된 배양용기에서 58% 저 포도당 DMEM, 40% MCDB-201 or F-12, 1x ㅇ이인슐린-트란스페린-셀레늄, 1x 리놀레인산 (linoleic acid)-BSA, 10^-8 M 덱사메타손, 10^-4 M 아스코르브산 2-포스페이트, 100 U 페니실린, 1,000 U 스트렙토마이신, 2% FCS, 10 ng/ml EGF (Daewoong 제약)로 이루어진 배양용액에서 배양한다. 분리된 세포들을 dish에 plating해서 24시간 후 부착되지 않은 세포를 제거해준다. 지방조직으로부터 기질줄기세포를 분리하기 위하여 성형외과에서 피하지방제거술을 시행한 환자에서 지방조직을 얻는다. 분리한 지방조직을 HBSS로 씻어준 후 핀셋과 가위를 이용하여 지방조직을 얇게 자른 다음 0.075% 콜라게나제를 37^oC에서 30분간 처리한다. 원심분리 후 pellet에 58% 조포도당 DMEM, 40% MCDB-201 or F-12, 1x 인 슐린-트란스페린-셀레늄, 1x 리놀레인산 (linoleic acid)-BSA, 10^-8 M 덱사메타손, 10^-4 M 아스코르브산 2-포스페이트, 100 U 페니실린, 1,000 U 스트렙토마이신, 2% FCS, 10 ng/ml EGF (Sigma Chemical Co)로 이루어진 배지를 넣어줘서 재현탁시킨 후, 100㎛ 나일론 메쉬에 통과시킨 후. 분리된 세포들을 디쉬에 도말해서 24시간 후 부착되지 않은 세포를 제거해준다. 상기와 같이 분리된 중간엽 줄기세포 표면항원의 발현의 변화를 유세포분석을 통하여 확인한 결과, 인간혈청 또는 소태아혈청으로 배양한 중간엽 줄기세포사이에 표면항원의 발현상의 유의한 차이를 나타내지 않았다(선 출원된 한국특허출원 제2004-24900호 참조).

실시예 2: 중간엽 줄기세포에서 VPA 에 의한 골분화증가 및 지방분화억제작용

VPA의 골분화에 대한 효과를 검정하기 위하여 지방기질세포와 골수기질세포(중간엽 줄기세포)를 분화초기 3일동안 0.5에서 3 mM의 발프로산으로 처리하였다. 골분화유도는 골분화유도배지(10% FBS 또는 인간혈청, 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 1.5 mg/ml β-글리세로포스페이트, 10^-8M 덱사메타손을 포함한 α-MEM배지)에서 배양하였다. 지방기질세포와 골수기질세포에 각각 VPA를 0.5, 1, 2, 3mM로 3일 처리한 후 비교할 대조군(VPA를 처리하지 않은 세포)과 같이 골분화배지를 첨가하여 일주일간 분화를 유도시킨 후 분화의 정도를 대조군과 비교하여 사진을 찍었다. 도 1은 중간엽세포에서 HDAC 억제제의 일종인 발프로산 (VPA)의 처리에 의하여 골분화정도를 측정한 결과이다. 세포가 골세포로 분화되면 세포표면에 석회질(calcium carbonate)이 생기고 이것은 알리자린 레드 S에 의해 붉은색으로 염색이 된다. 도 1로 부터 대조군에 비해서 지방기질세포와 골수기질세포에 각각 VPA를 0.5, 1, 2, 3mM을 처리한 세포가 control에 비해 골분화가 촉진됨을 알 수 있다.

뼈세포로 분화를 유도시에는 10% FBS 또는 인간혈청, 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 1.5 mg/ml β-글리세로포스페이트, 10^-8M 덱사메타손을 포함한 α-MEM배지에 2주일간 배양한다. 뼈세포로의 분화는 알리자린 레드 S 염색을 통해(Lee DH, Kang SK, Lee RH et al. J Cell Physiol 2004;198:91-99) 확인한다. VPA는 농도 의존적으로 골분화의 촉진효과를 나타내었다. 이러한 VPA의 효과가 전처치에 의해서도 동일하게 나타나는지를 확인하기 위하여 1 mM의 VPA를 1, 2, 또는 4일동안 전처치한 결과 전처치 기간에 따라 골분화정도가 증가함을 확인할 수있었다. 도 2는 중간엽 줄기세포에서 VPA의 전처치에 의하여 골세포로의 분화가 촉진됨을 나타낸 결과이다. 도 2 에서는 같은 농도의 VPA 1mM을 지방기질세포와 골수기질세포에 처리를 하는데 처리하는 기간에 따라서 골분화 촉진에 영향을 주는지를 알아본 실험이다. 그래서 처리기간을 1, 2, 또는 4일로 정한후 각각을 골분화유도배지에서 분화정도를 확인하였다. 그 결과 동일하게 VPA 1mM을 처리한후 전처리 기간에 따라 분화정도의 차이를 보이는 것을 확인할수 있었다.

동일한 방법으로 지방분화정도에 대한 VPA의 효과를 관찰한 결과 억제정도는 크지 않았으나 농도의존적으로 지방분화정도가 억제됨이 확인되었다. 지방세포로 분화를 유도할때는 1%FCS, 10^-7M 덱사메타손, 6 ng/ml 인슐린을 포함한 α-MEM배지 에 3주일간 배양한다. 지방세포를 오일레드(Oil red) O로 염색하여 확인한다. 도 3은 중간엽 줄기세포에서 VPA전처치에 의한 지방분화억제작용을 측정한 결과이다. 도 3에서는 골분화이외의 지방으로의 분화능을 도 1과 같은 방법으로 실험한 결과 지방으로의 분화는 골분화의 결과와는 반대로 지방분화를 억제하는 것으로 확인하였습니다. 실험은 지방기질세포와 골수기질세포에 각각 VPA를 0.25, 0.5, 1, 2, 3mM로 3일 처리한 후 비교할 대조군(VPA를 처리하지 않은 세포)과 같이 지방분화배지를 첨가하여 일주일간 분화를 유도시킨 후 분화의 정도를 대조군과 비교하여 찍은 사진이다. 세포가 골세포로 분화되면 세포표면에 지질 방울(lipid drop)이 생기고 이것은 오일레드 O 에 의해 염색이 된다. 즉 그림에서 보면 대조군에 비해서 지방기질세포와 골수기질세포에 각각 VPA를 0.5, 1, 2, 3mM을 처리한 세포가 대조군에 비해 지방분화가 억제됨을 알 수 있다.

실시예 3: 중간엽 줄기세포에서 HDAC 억제제인 트라코스타틴에 의한 골분화 증가작용

VPA에 의한 골분화증가가 HDAC의 억제와 관계있는지를 확인하기 위하여 ㅂ바발프로산의 유사 유도체며 HDAC 억제효과가 없는 발프로미드와 또 다른 HDAC 억제제인 트라코스타틴의 효과를 실시예 2와 동일한 방법으로 관찰하였다. 지방기질세포와 골수기질세포에 각각 트라코스타틴을 75, 150, 300, 500 nM과 발프로미드 0.5, 1, 2, 3 mM을 3일 전처리한 후 골분화 유도 배지에서 골분화를 유도 한 후 골분화정도를 관찰하였다. 그결과 트라코스타틴 전처치시 지방기질세포에서 골분화능을 농도의존적으로 증가하였으나 발프로미드는 유의한 효과를 나타내지 못하였 다. 도 4은 중간엽 줄기세포에서 골세포로의 분화에 또다른 HDAC 억제제인 트라코스타틴 A (TSA)의 작용과 발프로산 유사 유도체이면서 HDAC 억제작용이 없는 ㅂ바발프로미드의 골분화 정도에 대한 효과를 확인한 결과이다. 도 4에서는 트라코스타틴 A (TSA)를 75,150,300,500nm로 처리했을 때 농도 의존적으로 골분화가 촉진되었으나, 발프로미드 0.5,1,2,3mM를 처리했을 때는 별다른 효과를 확인할 수 없었다. 이결과로 부터 HDAC 억제제인 트라코스타틴 A (TSA)와 발프로산과 비슷한 골분화를 촉진하는 것으로 보아 HDAC가 골분화 유도시에 중요한 작용을 할 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 4: VPA 전처리에 의해 발현변화되는 유전자중 골분화유도작용을 나타내는 유전자

VPA에 의한 골분화유도기전을 밝히기 위하여 마이크로어레이 분석을 실시하였다. 47,000 이상의 전사체를 인식하는 cDNA 마이크로어레이인 Affymetrix U133 PLUS 2.0를 사용하여 Affymetrix사의 프로토콜에 따라 VPA전처리에 의해 발현변화하는 유전자를 분석하였다. 중간엽 줄기세포와 VPA를 처리한 중간엽 줄기세포의 mRNA를 이용하여 마이크로어레이로 분석한 결과 중간엽 줄기세포에 비해서 VPA를 처리한 중간엽 줄기세포 유전자들이 증가하거나 감소한 유전자들을 기능별로 정리해 보았다. 표 1 및 2는 VPA에 의해 발현이 조절되는 유전자의 기능별 분류을 제시한 결과이다.

[표 1]

hATSC 에서 발프로산에 의하여 하향조절된 유전자의 기능적 분류

[표 2]

hATSC 에서 발프로산에 의하여 상향조절된 유전자의 기능적 분류

마이크로어레이 분석결과 골분화에 관여하는 BMP-2, Runx2, 오스테오폰틴(osteopontin) 등의 발현이 현저히 증가하였고 세포주기에 관여하는 유전자의 발현감소가 관찰되었다. 이러한 유전자의 발현변화를 확인하기 위하여 실시간 PCR로 분석한 결과 BMP-2와 Runx2의 발현이 30배및 4배 증가됨이 확인되었다. 도 5는 마 이크로어레이에 의해 확인된 유전자 발현의 변화를 실시간 PCR로 확인해본 결과이다. LightCycler(Roche)를 이용하여 Roche에서 제공하는 LightCycler Software Version 3의 프로토콜에 따라 실험하였다.(Rajeevan MS, Ranamukhaarachchi DG, Vernon SD, Unger ER: Methods 2001;25:443-451) 도 5a의 그림은 BMP-2, Runx2의 발현 정도를 분석하기 위해서 먼저 같은 양의 cDNA을 가지고 분석해야함으로, 중간엽 줄기세포와 VPA를 처리한 중간엽 줄기세포의 total RNA에서 만들어진 각각의 cDNA의 양을 확인하기위해서 β-액틴 (세포에 존재하는 유전자, house keeping gene) 프라이머를 이용해서 cDNA양을 비교하였다. 그 결과 1/10000로 희석한 두 시료(중간엽 줄기세포와 VPA를 처리한 중간엽 줄기세포의 총 RNA)의 cDNA양이 일치하는 것으로 확인하였다. 도 5b는 a의 결과를 토대로 Runx2유전자의 발현 정도를 확인해본 결과로 VPA를 처리한 중간엽 줄기세포의 1/10000로 희석한 Runx2유전자발현이 중간엽 줄기세포의 1/10000로 희석한 Runx2 유전자 발현보다 높은 것으로 보아 마이크로어레이 분석결과를 뒷받침하는 결과로서 VPA를 처리한 중간엽 줄기세포에서는 Runx2유전자의 발현을 증가시키는 것으로 확인할 수 있었다. 도 5c는 a의 결과를 토대로 BMP-2유전자의 발현 정도를 확인해본 결과로 VPA를 처리한 중간엽 줄기세포의 1/10000로 희석한 BMP-2유전자발현이 중간엽 줄기세포의 1/10000로 희석한 BMP-2 유전자발현보다 높은 것으로 보아 마이크로어레이 분석결과를 뒷받침하는 결과로서 VPA를 처리한 중간엽 줄기세포에서는 BMP-2유전자의 발현을 증가시키는 것으로 확인할 수 있었다.

실시예 5: VPA 전처리에 의한 세포증식에 대한 작용

VAP전처치가 지방기질세포의 증식능에 영향을 미치는 지를 측정하였다. 지방기질세포를 낮은 농도(5103 cells/well)의 세포에 VPA 1, 2, 3 mM을 처리한후, 48시간 이후에 트립신/EDTA를 처리하여 단일세포로 분리한 후 현미경에서 헤마사이토미터를 이용하여 세포의 수를 측정하였다. 도 7은 중간엽 줄기세포의 증식에 VPA의 미치는 영향을 확인한 결과이다. 도 7에서 대조군과 VPA 1,2,3 mM을 처리한 지방기질세포의 증식능을 위에서 서술한방법으로 세포수를 측정한 후 세포의 수를 퍼센트로 나타내었다. 그 결과 VPA전처치는 농도의존적으로 세포의 증식능을 유의하게 억제함이 관찰되었다.

실시예 6: VPA 전처치한 세포에 의한 생체( in vivo ) 골분화능의 증가

VPA로 처리한 중간엽 줄기세포가 생체에서 뼈의 재생을 촉진하는지를 확인하기위하여 생쥐의 두개골결손 (4mm 결손) model에 콜라겐콜라겐질세포 및 VPA로 전처치한 지방 기질세포를 첨가하여 뼈의 재생을 평가한 결과 VPA 처리한 지방기질세포에서 뼈의 생성이 현저히 증가함이 확인되었다. 대조군인 중간엽 줄기 세포와 이틀간 1 mM VPA를 처리한 중간엽 줄기 세포를 직경 4mm, 두께 1mm의 크기로 자른 콜라겐에 각각 1×10⁶cells/10㎕ 무혈청 α-MEM이 되게 심고 이것을 30분간 배양하였다. 이 배양한 것을 생쥐의 두개골 결손 (4mm 결손) 모델에 이식을 한 후 면역반응을 억제하기 위해서 이틀 간격으로 10㎎/㎏의 사이클로스포린을 투여하였다. 이식 5주 후 생쥐를 희생하여 두개골을 분리하고 분리한 두개골을 탈칼슘화 하여 ㅍ파라핀에 임베딩하였다. 이것을 10㎛ 두께로 자른 후 헤마톡실린과 이오신 염색을 실시 하여 뼈 재생 여부를 확인 하였다. 도 8은 VPA로 처리한 지방기질세포가 생체에서 뼈의 재생을 촉진하는 것을 보여주는 그림이다. 화살표는 이식한 지방기질세포에서 형성된 뼈조직을 표시한다. 중간엽 줄기세포만 이식한 경우보다 VPA로 처리한 지방기질세포가 생쥐의 두개골 결손에 있어서 뼈의 재생을 촉진하는 것을 알 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 인체 중간엽 줄기세포 (MSC 포함)에서 HDAC 억제제는 골세포로의 분화를 현저히 촉진하는 효과를 보임을 알 수 있다. 따라서, 이들 약물에 의해 골세포로의 분화가 촉진되는 기전을 바탕으로 HDAC 억제제를 제조하여 골질환치료제 개발에 이용할 수 있다. 즉, 본 발명은 HDAC 억제약물이 골재생 및 골관련 질환의 치료에서의 용도를 제공할 수 있다.

Claims

히스톤디아세틸라제 (HDAC) 억제제를 유효성분으로 포함하는, 중간엽 줄기세포(MSC)를 인 비트로에서 골세포로 분화시키기 위한 골분화유도용 조성물로서, 상기 히스톤디아세틸라제 억제제는 하기 화학식 2의 트라코스타틴인 것을 특징으로 하는 골분화유도용 조성물:

[화학식 2]
제1항에 있어서, 상기 트라코스타틴은 300-900 μM 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 골분화유도용 조성물.
지방 또는 골수로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계, 분리된 중간엽 줄기세포의 분화유도전 히스톤디아세틸라제 억제제로 전처리하는 단계, 및 전처리된 중간엽 줄기세포를 골분화 유도배지에서 배양하는 단계를 포함하는 기질 줄기세포의 골분화 증가방법으로서, 상기 히스톤디아세틸라제 억제제는 트라코스타틴인 것을 특징으로 하는 기질 줄기세포의 골분화 증가방법.
제3항에 있어서, 상기 트라코스타틴은 300-800 μM의 농도 범위로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 골분화 증가방법.
제3항에 있어서, 상기 골분화 유도배지는 8~12 부피% FBS 또는 인간혈청, 48∼52 ㎍/㎖ 아스코르브산, 1.3∼1.7 mg/ml β-글리세로포스페이트, 0.8∼1.2 x10^-8M 덱사메타손을 포함한 α-MEM배지인 것을 특징으로 하는 골분화 증가방법.
시험관 내에서 (in vitro) 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따라 골분화된 중간엽 줄기세포(MSC)를 유효성분으로 함유하는 골결손증 치료용 조성물.