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WO2021193853A1 - 新型コロナウイルスの検査方法および検査試薬 - Google Patents

新型コロナウイルスの検査方法および検査試薬 Download PDF

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WO2021193853A1
WO2021193853A1 PCT/JP2021/012663 JP2021012663W WO2021193853A1 WO 2021193853 A1 WO2021193853 A1 WO 2021193853A1 JP 2021012663 W JP2021012663 W JP 2021012663W WO 2021193853 A1 WO2021193853 A1 WO 2021193853A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pcr
sample
solution
mixed solution
coronavirus
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2021/012663
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English (en)
French (fr)
Inventor
慎一郎 小林
四方　正光
健二 二宮
直子 高岡
英明 丸瀬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shimadzu Corp
Original Assignee
Shimadzu Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shimadzu Corp filed Critical Shimadzu Corp
Priority to US17/912,379 priority Critical patent/US20250059613A1/en
Priority to JP2022510682A priority patent/JPWO2021193853A1/ja
Publication of WO2021193853A1 publication Critical patent/WO2021193853A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a method for testing a new type of coronavirus and a kit for carrying out the method.
  • Coronavirus is known to infect all animals including livestock, laboratory animals, pets and wild animals and cause various diseases. Among them, four types of coronavirus that infect humans and two types of severe pneumonia virus that infect from animals are known so far. The coronavirus that causes the common cold is said to account for 10 to 15% of colds and 35% during the epidemic. HCoV-229E and HCoV-OC43 were discovered in these coronaviruses in the 1960s, and two types, HCoV-NL63 and HCoV-HKU1, were discovered in the 2000s.
  • SARS coronavirus discovered in 2002 (hereinafter sometimes referred to as SARS-CoV) is considered to be a natural host of the Greater Horseshoe Bat. SARS-CoV is known to cause severe acute respiratory syndrome and cause serious symptoms in the human body.
  • MERS coronavirus discovered in 2012 (hereinafter sometimes referred to as MERS-CoV) originates from dromedary syndrome and is known to cause severe pneumonia when infected with humans. Both coronaviruses caused a worldwide epidemic and caused many infections.
  • SARS-CoV-2 coronavirus
  • SARS-CoV-2 a new type of coronavirus
  • the first epidemic is said to be in Wuhan City, Hubei province, China, but after that, it became a global epidemic, and the infection continued to spread to Southeast Asia, the Middle East, Europe, and the United States, mainly in East Asia.
  • the outbreak in Brazil in early 2020 spread the infection to all five continents except Antarctica.
  • the new coronavirus has not yet been established for effective prevention and treatment, and in some people it can cause severe pneumonia and, in the worst case, death, but the symptoms are not specific. No. For example, it presents with a wide range of symptoms, from asymptomatic to severe pneumonia and death. Typical symptoms are said to include fever, dry cough, fatigue, sputum, shortness of breath, sore throat, headache, myalgia or arthralgia.
  • the initial symptoms are similar to the common cold and are difficult to distinguish in the early stages of onset, and after a latent period of infection, low-grade fever and cold symptoms may persist for about a week, but the patient's initial symptoms. Symptoms are not limited to fever and cough peculiar to pneumonia, but may also be gastrointestinal and nervous system symptoms such as diarrhea, nausea, headache and general fatigue, making early diagnosis difficult. ing.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Non-Patent Document 1 RNA derived from the virus is purified from a sample containing the RNA virus SARS-CoV-2, and the purified RNA is cDNAd by reverse transcription-polymerist chain reaction (hereinafter, may be referred to as RT-PCR method). It is a method to detect SARS-CoV-2 by amplifying as.
  • the above-mentioned SARS-CoV-2 detection method requires more than 2 hours for RNA extraction and purification, which requires time and labor for purification, which poses a problem in performing multi-sample processing. There is.
  • the inspection for detecting SARS-CoV-2 requires a certain level of skill, it is considered that it will take time to expand the inspection organization.
  • SARS-CoV-2 In the case of SARS-CoV-2, it has been reported that the incubation period before the onset is more than one week and that it causes secondary infection during the incubation period, so it is a quick and accurate test. A method is desired. In view of the worldwide epidemic of SARS-CoV-2, an inspection kit that can easily and accurately inspect SARS-CoV-2 is also desired.
  • An object of the present invention is to provide a method for quickly and inexpensively inspecting the presence or absence of SARS-CoV-2 infection while preventing false negatives, and a kit capable of easily carrying out the method.
  • RT-PCR is usually performed by adding the PCR master mix to the sample treatment solution obtained by extracting virus-derived RNA from the sample.
  • This PCR master mix contains reverse transcription enzymes, DNA polymerases, PCR primers, deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) that serve as substrates for DNA polymerases that extend the PCR primers, and probes for detecting PCR amplification products.
  • dNTPs deoxynucleoside triphosphates
  • a non-specific amplification reaction between the primers may occur after the preparation of the PCR master mix and before the RNA extracted from the sample is added to the PCR master mix. In such a case, , It is possible that the virus inspection accuracy will be affected.
  • the PCR master mix may be left for several hours after its preparation due to the convenience of the detection work, during which time the unintended non-specific amplification reaction is suppressed and the inspection accuracy is improved. It is necessary to maintain.
  • An object of the present invention is to suppress the non-specific amplification reaction to test for the presence or absence of SARS-CoV-2 infection quickly, inexpensively, and with high accuracy, and to easily carry out the method.
  • the present invention A step of obtaining a mixed solution by mixing a sample sample collected from a subject or a mixed solution of the sample sample and a virus storage solution and a sample processing solution containing sodium hydroxide as a main component.
  • the step of incubating the above mixed solution A step of adding a master mix containing a reaction solution, an internal standard substance, a primer, a probe, a reverse transcriptase, and a PCR enzyme to the mixed solution after the incubation to obtain a final mixed solution.
  • the inspection method of the new coronavirus having.
  • the sample treatment solution or the reaction solution contains deoxyyadenocine triphosphate (dATP), deoxyguanosine triphosphate (dGTP), deoxycytidine triphosphate (dCTP), and deoxycytidine triphosphate (dCTP).
  • dATP deoxyyadenocine triphosphate
  • dGTP deoxyguanosine triphosphate
  • dCTP deoxycytidine triphosphate
  • dCTP deoxycytidine triphosphate
  • the present invention relates to a kit for testing a new type of coronavirus having a sample treatment solution containing sodium hydroxide as a main component, a reaction solution, an internal standard substance, a primer, a probe, a reverse transcriptase, and a PCR enzyme.
  • the present invention in the above-mentioned test kit for new coronavirus, relates to a kit for testing new coronavirus, wherein the sample treatment solution or the reaction solution contains dATP, dGTP, dCTP and dTTP.
  • a method for quickly and inexpensively testing for the presence or absence of SARS-CoV-2 infection without purifying the viral RNA contained in the sample while preventing the occurrence of false negatives and a simple method thereof.
  • dNTPs which are substrates for DNA polymerase
  • the reaction solution for preparing the PCR master mix by adding dNTPs to the sample treatment solution instead of the reaction solution, the non-specific amplification reaction between the PCR primers does not occur even after the PCR master mix is prepared, and the sample sample and the sample treatment solution are used. All amplification reactions are initiated by adding the mixture to the PCR master mix. Therefore, the present invention makes it possible to inspect the presence or absence of the new coronavirus in a sample sample with high accuracy.
  • the content of the sample solution containing artificial synthetic RNA, pharyngeal swab, and UTM medium obtained by synthesizing a part of SARS-CoV-2 RNA in the mixed solution (10 ⁇ L) for measurement by 1-step RT-PCR is 1. It is a figure which shows the amplification curve in real-time RT-PCR when changed to 3, 5 and 7 ⁇ L. It is a figure which shows the amplification curve of the real-time RT-PCR about the sample liquid which does not accompany the PCR reaction inhibition by the PCR reaction inhibitor substance in the sample liquid. It is a figure which shows the amplification curve of the real-time RT-PCR about the sample liquid with PCR reaction inhibition by the PCR reaction inhibitor substance in the sample liquid.
  • the RT-PCR method includes a one-step RT-PCR method and a two-step RT-PCR method.
  • the one-step RT-PCR method is preferable from the viewpoint that the reverse transcription reaction and PCR are continuously performed in the same container, so that the operation is simple and contamination between samples is suppressed.
  • a sample sample collected from a subject for determining the presence or absence of infection, or a mixed solution of the sample sample and a medium is used as a sample treatment solution containing sodium hydroxide as a main component.
  • Specimen samples collected from the subject include pharyngeal swab, nasal swab, sputum, bronchial lavage fluid, saliva and the like.
  • the medium contains a virus storage solution and the like.
  • the medium used provides a growth environment for the culture target in culturing microorganisms and biological tissues, and transports viruses such as commercially available UTM medium (manufactured by Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.) and VTM (manufactured by Sugiyamagen Co., Ltd.).
  • UTM medium manufactured by Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.
  • VTM manufactured by Sugiyamagen Co., Ltd.
  • -A storage medium can be preferably used.
  • the sample sample may be mixed with phosphate buffered saline (hereinafter, may be referred to as PBS) or the like in addition to the medium.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the sample sample collected from the subject may not need to be mixed with the medium.
  • the sample treatment solution is an aqueous solution containing sodium hydroxide as a main component, and is added for the purpose of extracting RNA from coronavirus particles.
  • the sample treatment solution is a metal chelating agent such as glycol ether dithiothreitol (hereinafter, may be referred to as EGTA) from the viewpoint of efficiently performing RT-PCR treatment described later and improving test accuracy.
  • EGTA glycol ether dithiothreitol
  • DTT dithiothreitol
  • the volume of the sample solution is 1.0, and the volume ratio of the sample processing solution is set to 1.0.
  • the mixing ratio of the sample solution and the sample processing solution is preferably 0.5 times or more, more preferably 0.8 to 1.3 times, and 0. 9 to 1.1 times is more preferable.
  • the sample solution and the sample processing solution are mixed at the above mixing ratio, but from the viewpoints that a small amount of sample sample can be easily used and that the amount of expensive enzymes used is suppressed to reduce the inspection cost.
  • the volume of the final mixed solution described later is preferably about 25 ⁇ L or less. When the volume of the final mixed solution is 25 ⁇ L or less, it is preferable to obtain a mixed solution by mixing 3 ⁇ L to 5 ⁇ L of the sample solution and 3 ⁇ L to 5 ⁇ L of the sample treatment solution. It is more preferable that the sample solution and the sample processing solution are both 5 ⁇ L.
  • the obtained mixed solution is incubated.
  • the incubation temperature is set as appropriate. From the viewpoint of the speed of the test and the accuracy of the obtained results, the incubation temperature is preferably room temperature to 95 ° C., preferably 80 to 95 ° C., and the incubation time is preferably 3 minutes to 5 minutes.
  • the normal temperature is usually around 25 ° C.
  • a master mix containing a reaction solution, a PCR primer pair, a probe, a reverse transcriptase and a PCR enzyme is added to the mixed solution that has undergone the above incubation step to obtain a final mixed solution.
  • the reaction solution contains a PCR buffer solution containing a surfactant.
  • the surfactant can be selected from anionic surfactants, cationic surfactants, amphoteric surfactants and nonionic surfactants.
  • anionic surfactants include alkyl sulfates, alkyl ether sulfates, docusates, sulfonate fluorosurfactants, alkylbenzene sulfonates, alkylaryl ether phosphates, alkyl ether phosphates, alkyl carboxylates, lauroyl sarcosine sodium, carboxylate fluoro surfactants, Examples include, but are not limited to, sodium colate and sodium deoxycholate. As the alkyl sulfate, sodium dodecyl sulfate (SDS) and ammonium dodecyl sulfate are preferable, and sodium dodecyl sulfate is more preferable.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • ammonium dodecyl sulfate sodium dodecyl sulfate is more preferable.
  • Sodium dodecyl sulfate is also referred to as sodium lauryl sulfate (SLS).
  • the cationic surfactant include, but are not limited to, ethyltrimethylammonium bromide, hexadecyltrimethylammonium bromide and tetradecyltrimethylammonium bromide.
  • Amphoteric surfactants include, but are not limited to, betaine and alkylamino fatty acid salts.
  • Nonionic surfactants include nonylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40), polyoxyethylene sorbitan monooleate (Tween® 80), and polyoxyethylene pt-octylphenol (Triton X-100 (registered)).
  • the surfactant contained in the reaction solution is preferably a nonionic surfactant, and the concentration is preferably 0.05 to 5% (w / v) in order to efficiently extract the viral RNA. ..
  • the PCR buffer solution contains a mix of KCl, MgCl 2 and deoxyribonucleotide 5'-triphosphate (hereinafter, may be abbreviated as dNTP) from the viewpoint of performing efficient RT-PCR.
  • the dNTP mix is defined as deoxyadenosine triphosphate (hereinafter, may be abbreviated as dATP), deoxyguanosine triphosphate (hereinafter, may be abbreviated as dGTP), deoxycytidine triphosphate (hereinafter, may be abbreviated as dGTP), and deoxycytidine triphosphate (hereinafter, may be abbreviated as dATP).
  • dTTP deoxycytidine triphosphate
  • the PCR buffer solution is not particularly limited, and examples thereof include a phosphate buffer solution, a trishydroxymethylaminomethane (Tris) buffer solution, a borate buffer solution, and a Good buffer solution such as HEPES, which are efficient.
  • Tris-hydrogen buffer is preferable from the viewpoint of performing RT-PCR.
  • concentrations of dNTP, MgCl 2 , KCl and the buffer solution can be appropriately set according to the RT-PCR treatment described later. For example, the concentrations of MgCl 2 of 1.5 mM, KCl of 35 mM, dNTP of 200 ⁇ M and Tris of 10 mM can be exemplified.
  • the dNTP mix may be contained in the sample treatment solution containing sodium hydroxide as a main component instead of the PCR buffer solution constituting the reaction solution.
  • the master mix does not contain dNTPs (dATP, dGTP, dCTP and dTTP), it is possible to suppress the non-specific amplification reaction between primers that may occur after the preparation of the master mix. ..
  • any 1 to 3 types of dNTPs selected from dATP, dGTP, dCTP and dTTP may be added to the PCR buffer solution, and the remaining dNTPs may be contained in the sample treatment solution.
  • any two dNTPs selected from dATP, dGTP, dCTP and dTTP are added to the PCR buffer and the remaining two dNTPs are added to the sample treatment solution.
  • the master mix contains any one to three dNTPs selected from dATP, dGTP, dCTP and dTTP, it can occur after preparation of the master mix and is non-specific between primers. The amplification reaction can be suppressed.
  • the sample treatment solution may contain a dNTP mix in which dTTP is replaced with dUTP (deoxyuridine triphosphate). Since the amplification product in which Deoxyuridine (dU) is incorporated can be decomposed by uracil-N-glycosylase (UNG) treatment, the amplification product containing dU mixed in the PCR reaction solution is subjected to UNG before PCR. It can be degraded to prevent false negatives due to the influence of the preceding PCR amplification product.
  • dNTP mix in which dTTP is replaced with dUTP (deoxyuridine triphosphate).
  • dU Deoxyuridine triphosphate
  • UNG uracil-N-glycosylase
  • Specimen samples collected from subjects include biologically-derived negatively charged substances (eg, certain sugars and dyes) that adsorb to DNA polymerase and biologically-derived positively charged substances (eg, certain proteins, etc.) that adsorb to DNA. ) May be mixed. These negative and positive charges inhibit PCR, making accurate measurements difficult.
  • a substance that neutralizes the PCR inhibitory action of these charged substances by binding to these negatively charged substances and positively charged substances is added to the PCR buffer solution.
  • a gene amplification reagent Ampdirect registered trademark, Shimadzu Corporation
  • Ampdirect Plus registered trademark, Shimadzu Corporation
  • processing for purifying nucleic acid such as solid-phase extraction and liquid-liquid extraction is not required, and it is not necessary to discard the liquid, PCR and the like can be performed with a smaller amount of sample, and such a reagent for gene amplification is used. Is preferred.
  • the internal standard substance includes at least one of the following (1) and (2).
  • the internal standard nucleic acid is a sequence that does not cross-reactivity with primers and probes for detecting SARS-CoV-2 in PCR.
  • the internal standard nucleic acid has a sequence different from that of the nucleic acid derived from SARS-CoV-2 RNA, and is amplified independently of the nucleic acid derived from the virus, and may be either DNA or RNA.
  • the internal standard nucleic acid may be added to a master mix in which RT-PCR is performed, or may be a nucleic acid derived from a sample. Further, in order to improve the amplification efficiency, the chain length of the internal standard nucleic acid is preferably 300 bp or less, more preferably 100 bp or less.
  • the internal standard nucleic acid is DNA
  • the internal standard DNA has a sequence different from the cDNA generated by the reverse transcription reaction from SARS-CoV-2 RNA in PCR, and is independent of the virus-derived cDNA. Is the DNA that is amplified. That is, the internal standard nucleic acid can be used as an index for determining whether or not PCR has proceeded appropriately.
  • an internal standard nucleic acid may be one that does not affect the amplification of the SARS-CoV-2 gene, and even a nucleic acid having an artificially designed sequence may be a sequence derived from another organism. Alternatively, it may be a nucleic acid derived from a sample.
  • Probes are included in the kit of the present invention.
  • a forward primer and a reverse primer for amplifying the sample-derived nucleic acid that do not affect the amplification of the SARS-CoV-2 gene, and an amplification product by the primer pair.
  • a probe for detecting is included in the kit of the present invention.
  • a primer specific to the sequence of the RNA-derived nucleic acid of SARS-CoV-2 can be used, for example, SARS-CoV-2.
  • Primers specific for the sequence of cDNA generated from RNA by reverse transcription reaction can be used. Examples of the primer include the primer pair shown in Table 1 and the primer pair shown in Table 2.
  • the detection target of the exemplified PCR primer pair is two regions of the N (nucleocapsid) gene.
  • N sets N_Sarbeco_F1 (forward, SEQ ID NO: 1) and N_Sarbeco_R1 (reverse, SEQ ID NO: 2) and N set No. 2 NIID_2019-nCOV_N_F2 (forward, SEQ ID NO: 3) and NIID_2019- nCOV_N_R2 (reverse, SEQ ID NO: 4), and in the method of the American Center for Disease Control and Prevention, N1 Forward Primer (SEQ ID NO: 5) and N1 Reverse Primer (SEQ ID NO: 6), and N2 Forward Primer (SEQ ID NO: 7) and N2 Reverse Primer. (SEQ ID NO: 8) is exemplified.
  • the PCR primer pair that amplifies the internal standard nucleic acid is a primer that hybridizes to the internal standard nucleic acid under stringent conditions, and a PCR primer pair that does not hybridize to the SARS-CoV-2-derived nucleic acid is preferable.
  • the stringent condition refers to a condition in which the binding between the template nucleic acid and the primer is specific in the annealing in PCR, which is the step of binding the primer to the template nucleic acid.
  • PCR products are monitored by real-time measurement in RT-PCR described later.
  • the steps of detecting RT-PCR and the RT-PCR product are performed in the same container.
  • Real-time measurement of PCR products is also called real-time PCR.
  • PCR amplification products are usually detected by fluorescence. Fluorescence detection methods include a method using an intercalator fluorescent dye and a method using a fluorescently labeled probe.
  • the intercalating fluorescent dye for example, SYBR® Green I is used.
  • the intercalator fluorescent dye binds to the double-stranded DNA synthesized by PCR and fluoresces when irradiated with excitation light. By measuring this fluorescence intensity, the amount of PCR amplification product produced can be measured.
  • a probe labeled with one or more fluorescent dyes is added.
  • the probe include a hydrolysis probe, Molecular Beacon, and the like.
  • the hydrolysis probe is an oligonucleotide with a fluorescent dye at the 5'end and a quencher at the 3'end.
  • the hydrolyzed probe specifically hybridizes to the template DNA in the PCR annealing step, but the presence of a quencher on the probe suppresses the generation of fluorescence even when irradiated with excitation light.
  • the fluorescent dye is released from the probe and the quencher is used.
  • the suppression of fluorescence generation is released and fluorescence is emitted.
  • the amount of amplification product produced can be measured.
  • the fluorescence labeled on the probe includes FAM (6-carboxyfluorescein), ROX (6-carboxy-X-rhodamine), Cy3 and Cy5 (Cyanine dye), and HEX (4,7, 2', 4', 5', 7'-hexachloro-6-carboxyfluorescein) etc.
  • FAM 6-carboxyfluorescein
  • ROX 6-carboxy-X-rhodamine
  • Cy3 and Cy5 Cy3 and Cy5
  • HEX 4,7, 2', 4', 5', 7'-hexachloro-6-carboxyfluorescein
  • HEX 4,7, 2', 4', 5', 7'-hexachloro-6-carboxyfluorescein
  • examples of the oligonucleotide fluorescently labeled probe that can be used for detecting the PCR amplification product of cDNA derived from SARS-CoV-2 RNA include the probes shown in Table 1 or Table 2.
  • N_Sarbeco_P1 and NIID_2019-nCOV_N_P2 are shown as probes that hybridize to the genes amplified by the N set and N set No. 2 PCR primer pairs shown in Table 1 under stringent conditions, respectively.
  • N_Sarbeco_P1 binds FAM as a fluorescent dye at the 5'end and BHQ1 as a quencher at the 3'end.
  • NIID_2019-nCOV_N_P2 binds ROX as a fluorescent dye at the 5'end and BHQ2 as a quencher at the 3'end.
  • N1 Probe and N2 Probe are shown as probes that hybridize to the genes amplified by the N1 set and N2 set PCR primer pairs shown in Table 2 under stringent conditions, respectively.
  • N1 Probe binds ROX as a fluorescent dye at the 5'end and BHQ2 as a quencher at the 3'end.
  • N2 Probe binds FAM as a fluorescent dye at the 5'end and BHQ1 as a quencher at the 3'end. In the fluorescent dye at the 5'end of the probe, FAM may be replaced with ROX, or ROX may be replaced with FAM.
  • probes that hybridize to the two regions of the amplified N gene of SARS-CoV-2 bind different fluorescent dyes to each other.
  • an oligonucleotide fluorescently labeled probe that hybridizes to the internal standard nucleic acid under stringent conditions, and a fluorescent dye that binds to the fluorescent probe for SARS-CoV-2 detection.
  • a probe to which different fluorescent dyes bind.
  • the oligonucleotide fluorescently labeled probe used for detecting the PCR amplification product separately detects the PCR amplification product by a plurality of primer pairs because the fluorescent dyes bound to the respective probes are different from each other. can do.
  • the above reverse transcriptase is an enzyme that produces single-stranded complementary DNA (cDNA) using coronavirus RNA as a template.
  • RNA dependence derived from RNA viruses such as Avian Myeloblastosis Virus (AMV), Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) and Human Immunodeficiency Virus (HIV) DNA polymerases as well as variants thereof can be used.
  • AMV Avian Myeloblastosis Virus
  • M-MLV Moloney Murine Leukemia Virus
  • HV Human Immunodeficiency Virus
  • the reverse transcriptase is preferably an enzyme having an activity of 200 U or more.
  • the DNA polymerase that is a PCR enzyme is preferably a thermostable DNA polymerase derived from a thermophilic bacterium, and examples thereof include Taq, Tth, KOD, Pfu, and variants thereof.
  • Hot-start DNA polymerase may be used in view of avoiding non-specific amplification by DNA polymerase.
  • examples of the hot-start DNA polymerase include a DNA polymerase to which an anti-DNA polymerase antibody is bound or a DNA polymerase in which an enzyme active site is heat-sensitively chemically modified, and a DNA polymerase to which an anti-DNA polymerase antibody is bound is preferable.
  • the PCR enzyme is preferably an enzyme having an activity of 3 U or more.
  • a master mix containing a reaction solution, an internal standard substance, a PCR primer pair, a probe, a reverse transcriptase and a PCR enzyme is added to the incubated mixed solution to obtain a final mixed solution.
  • the master mix is preferably added in the range of 14 to 16 ⁇ L.
  • the final mixture obtained is subjected to RT-PCR treatment.
  • the reaction temperature conditions for the reverse transcription reaction in RT-PCR and the PCR conditions are appropriately set.
  • RT-PCR is carried out in a commercially available reaction tube for RT-PCR.
  • the presence or absence of SARS-CoV-2 can be determined in real time by real-time measurement, and rapid testing for the new coronavirus can be performed. It can be performed.
  • the progress of PCR can be confirmed in real time by monitoring the amplification curve of the PCR products using a fluorescent filter corresponding to the fluorescent dye used. If the fluorescence intensity increases with the number of PCR cycles, the presence of SARS-CoV-2 in the sample sample is determined to be positive, while if the fluorescence intensity does not increase in PCR, it is determined to be negative. NS. At this time, if the internal standard substance is added to the master mix, the possibility of false negatives can be easily eliminated if the fluorescence intensity corresponding to the internal standard nucleic acid increases according to the number of PCR cycles. Examples of the internal standard nucleic acid may be those that do not affect the amplification of SARS-CoV-2, and may have sequences derived from other organisms or artificially designed sequences. It may be a sequence derived from a sample.
  • the present invention further tests for a new type of coronavirus having a sample treatment solution containing sodium hydroxide, a reaction solution, an internal standard substance, a PCR primer pair, a probe, a reverse transcriptase and a PCR enzyme.
  • Kits are provided.
  • the above-mentioned test kit makes it possible to efficiently perform the test when a very small amount of sample is collected and the new coronavirus is tested according to each of the above-mentioned steps.
  • the sample treatment solution, reaction solution, internal standard substance, PCR primer pair, probe, reverse transcriptase, and PCR enzyme are as described above.
  • the PCR primer pair preferably contains one or more PCR primer pairs that amplify a nucleic acid derived from SARS-CoV-2 RNA and a PCR primer pair that amplifies an internal standard nucleic acid.
  • PCR primer pairs for amplifying the SARS-CoV-2 gene it is preferable to select primer pairs that hybridize to different DNA sequences in order to improve virus detection accuracy.
  • the oligonucleotide fluorescently labeled probe is provided with a kit capable of individually measuring the PCR amplification product because the fluorescent dyes bound to the respective probes are different from each other.
  • the test kit may contain a sample treatment solution, a reaction solution, an internal standard substance, a PCR primer pair, a probe, a reverse transcriptase, and a PCR enzyme in different containers, but the method for testing the new coronavirus of the present invention. It is preferable to mix each of them in a predetermined amount in advance according to the above procedure because it is possible to avoid the complexity of mixing at the time of inspection.
  • the sample treatment solution may be mixed in one container, and the reaction solution, the internal standard substance, the PCR primer pair, the probe, the reverse transcriptase, and the PCR enzyme may be mixed in a predetermined amount and stored in one container. Further, the reaction solution, the internal standard substance, the PCR primer pair and the probe may be mixed in a predetermined amount to form one container, and the reverse transcriptase and the PCR enzyme may be mixed in a predetermined amount to form another container.
  • a sample treatment solution for example, a sample treatment solution, a reaction solution and an internal standard substance, and a PCR primer mixed in a predetermined amount.
  • Pairs and probes, as well as reverse transcriptase and PCR enzyme mixed in predetermined amounts may be stored independently in separate containers.
  • the presence or absence of SARS-CoV-2 infection can be quickly and easily tested while preventing the occurrence of false negatives.
  • the RT-PCR test has higher detection sensitivity than immunochromatography, so it is asymptomatic for high fever and cough, but even if you are infected with SARS-CoV-2, you can accurately determine the coronavirus in a short time. Inspection can be provided.
  • Example 1 [Adjustment of mixture] The following RT-PCR was performed using artificial synthetic RNA (10,000 copies) in which a part of the genomic RNA of the new coronavirus was synthesized.
  • a sample treatment solution containing sodium hydroxide to 1, 3, 5 or 7 ⁇ L of the sample solution containing the UTM medium (manufactured by Nippon Becton Dickinson Corporation) and the artificial synthetic RNA and the pharyngeal swab, respectively. 9, 7, 5 or 3 ⁇ L was added to bring the total amount to 10 ⁇ L.
  • the above-mentioned mixed solution was mixed with a vortex mixer, incubated at 90 ° C. for 5 minutes in a constant temperature device, and then ice-cooled.
  • Reagent A Reaction solution containing surfactant and PCR buffer
  • Reagent B PCR primer pair and probe reagent C: 250 U reverse transcriptase and 3.125 U PCR enzyme
  • the setting conditions for real-time RT-PCR are as follows. RT-PCR setting conditions Hold at 50 ° C. for 10 minutes and then at 95 ° C. for 1 minute. Then, after holding at 95 ° C. for 5 seconds, the temperature was lowered to 60 ° C. and held for 30 seconds for 45 cycles.
  • FIG. 1 shows the result of plotting the amplification curve of real-time RT-PCR with respect to the number of cycles.
  • the amount of the medium was 3 and 5 ⁇ L, there was not much difference in the rise of the amplification curve as compared with the case where the medium was not added.
  • the SARS-CoV-2 test may handle a sample containing a medium, but if the sample containing the medium is added directly to the reaction solution, it is considered to have an effect on PCR.
  • the test method for the new coronavirus of the present invention eliminates such an influence, and the result of the presence or absence of the new coronavirus can be obtained quickly.
  • Pharyngeal swabs were obtained as sample samples from a plurality of subjects, and each sample sample was mixed with UTM medium to prepare a plurality of sample solutions. To 5 ⁇ L of each sample solution, 5 ⁇ L of a sample treatment solution containing sodium hydroxide was added and mixed with a vortex mixer. The obtained mixed solution was incubated at 90 ° C. for 5 minutes in a constant temperature device, and then ice-cooled.
  • Reagent A Reaction solution containing internal standard DNA (76 bp), surfactant and PCR buffer
  • Reagent B PCR primer pair and probe reagent C: 250 U reverse transcriptase and 3.125 U PCR enzyme
  • PCR primer pairs and probes N1 set and N2 set shown in Table 2
  • an internal standard 15 ⁇ L of the master mix and have different gene amplification regions.
  • a master mix containing a pair of PCR primers for DNA detection and a Cy5-labeled probe was added. Then, the mixture was mixed with a vortex mixer, the PCR tube was set in a real-time PCR device, and PCR was started immediately. RT-PCR was performed under the same conditions as in Example 1.
  • the amplification curve of real-time RT-PCR for the sample solution not accompanied by PCR reaction inhibition by the PCR reaction inhibitor in the sample solution is shown in FIG. 2A.
  • the sample solution is truly negative and does not contain a viral gene.
  • the amplification curve of real-time RT-PCR for the sample solution with PCR reaction inhibition by the PCR inhibitor in the sample solution is shown in FIG. 2B. Since the rise of the amplification curve of the internal standard DNA (IC) is not observed, it is not possible to distinguish whether it is negative (below the detection limit) or false negative. In such a case, reanalysis can prevent the occurrence of false negatives.
  • Example 3 [PCR amplification curve determined to be SARS-CoV-2 positive or negative] Using the sample solution to which the SARS-CoV-2 gene was added or not added, the amplification curve when the virus was positive or negative in real-time RT-PCR was examined. 5 ⁇ L of a sample treatment solution containing sodium hydroxide was added to 5 ⁇ L of a sample solution containing artificial synthetic RNA (10,000 copies) obtained by synthesizing a part of the genomic RNA of the SARS-CoV-2 gene, and mixed with a vortex mixer. .. The obtained mixed solution was incubated at 90 ° C. for 5 minutes in a constant temperature device, and then ice-cooled.
  • Reagent A Reaction solution containing internal standard DNA (76 bp), surfactant and PCR buffer
  • Reagent B PCR primer pair and probe reagent C: 250 U reverse transcriptase and 3.125 U PCR enzyme
  • PCR primer pairs and probes N1 set and N2 set shown in Table 1
  • an internal standard 15 ⁇ L of the master mix and have different gene amplification regions.
  • a master mix containing a pair of PCR primers for DNA detection and a Cy5-labeled probe was added. Then, the mixture was mixed with a vortex mixer, the PCR tube was set in a real-time PCR device, and PCR was started immediately. RT-PCR was performed under the same conditions as in Example 1.
  • Cq Determination Mode Single Threshold Baseline Setting: Baseline Subtracted Curve Fit
  • a Cq value of ⁇ 40 was determined to be positive.
  • FIG. 3A shows an amplification curve when RT-PCR was performed on a sample solution containing the SARS-CoV-2 gene.
  • the rise of the amplification curve of the N1 and N2 regions of the SARS-CoV-2 gene and the internal standard DNA (IC) is observed, indicating that PCR has proceeded appropriately.
  • IC internal standard DNA
  • FIG. 3B shows an amplification curve when RT-PCR was performed on a sample solution containing no SARS-CoV-2 gene.
  • amplification of the N1 and N2 regions of the SARS-CoV-2 gene was not observed, but the rise of the amplification curve of the internal standard DNA (IC) was observed, indicating that PCR proceeded appropriately. ..
  • IC internal standard DNA
  • Example 4 [Comparison between the method of the present invention in determining SARS-CoV-2 infection and the method described in the non-patent document "Pathogen Detection Manual 2019-nCoV” (1)] Twenty-five clinical specimens of nasal swab mixed with UTM medium and sputum not mixed with medium were measured by the method of the present invention and the method described in the non-patent document "Pathogen Detection Manual 2019-nCoV", and the determination results were obtained. Compared. The measurement by the method of the present invention was carried out under the same conditions as in Example 3. The dNTP mix was added to the sample treatment solution containing sodium hydroxide in advance.
  • the Cq value ⁇ 40 was determined to be positive, and the N1 region and / or the N2 region of the viral gene was detected.
  • the method of the present invention resulted in 10 positive cases and 15 negative cases, and all cases were in agreement with the method described in the "Pathogen Detection Manual 2019-nCoV" (Fig. 4).
  • the method of the present invention has been shown to give reliable test results. Twice
  • Example 5 [Comparison between the method of the present invention in determining SARS-CoV-2 infection and the method described in the non-patent document "Pathogen Detection Manual 2019-nCoV” (2)] Twenty-two clinical specimens (saliva) not mixed with the medium were measured by the method of the present invention and the method described in the non-patent document "Pathogen Detection Manual 2019-nCoV", and the test results were compared. The measurement by the method of the present invention was carried out under the same conditions as in Example 3. The dNTP mix was added to the sample treatment solution containing sodium hydroxide in advance.
  • the Cq value ⁇ 40 was determined to be positive, and the N1 region and / or the N2 region of the viral gene was detected.
  • the positive concordance rate was 93% (13/14)
  • the negative concordance rate was 100% (8/8)
  • the overall concordance rate was 95% (21/22) (FIG. 5). ).
  • the method of the present invention gives highly reliable test results even when saliva that is not mixed with the medium is used as the sample sample.
  • Example 2 and Example 3 an example in which an internal standard DNA was added to the master mix as an internal standard nucleic acid was shown, but instead of the internal standard DNA, a nucleic acid sequence derived from a sample sample, SARS-CoV- 2 Sequences that do not affect the amplification of genes can be used. That is, in Example 2 and Example 3, the internal standard DNA was not added to the reagent A, and the nucleic acid sequence derived from the sample sample that did not affect the amplification of the SARS-CoV-2 gene was amplified in the reagent B. By adding the primer pair and the probe of, the same effect as in Example 2 and Example 3 can be obtained by using the nucleic acid sequence derived from the sample sample as an internal standard.
  • the dNTPs may be included in the master mix by adding to the reaction solution containing the PCR buffer solution (reagent A), but in Examples 4 and 5, the sample treatment solution added to the sample sample. DNTP was added to. Due to this dNTP arrangement, after preparation of the master mix, this master mix can occur between the time when the master mix is added to the sample treatment solution containing the sample and the time when the amplification of the SARS-CoV-2 gene is started. The specific amplification reaction can be suppressed. dNTPs are hardly degraded during the virus RNA extraction operation by heat-treating the mixture of the sample sample and the sample treatment solution at 90 ° C. for 5 minutes.
  • Step of incubating the above mixture A step of adding a master mix containing a reaction solution, an internal standard substance, a primer, a probe, a reverse transcriptase and a PCR enzyme to the mixed solution after the incubation to obtain a final mixed solution.
  • the RT-PCR test has a higher detection sensitivity than immunochromatography, so even if you are infected but do not have symptoms such as high fever and cough, you can provide a highly sensitive coronavirus test in a short time. can.
  • a kit for testing a new type of coronavirus having a sample treatment solution containing sodium hydroxide as a main component, a reaction solution, an internal standard substance, a primer, a probe, a reverse transcriptase, and a PCR enzyme.
  • sample treatment solution the reaction solution and the internal standard substance, the primer and the probe, and the reverse transcriptase and the PCR enzyme are independently stored in four containers in the above [9].
  • the kit for testing a new type of coronavirus according to any one of [8] to [10], wherein the sample treatment liquid contains dATP, dGTP, dCTP and dUTP.
  • the method of inspecting the presence or absence of SARS-CoV-2 infection can be performed quickly.
  • RT-PCR testing has higher detection sensitivity than immunochromatography, so even those who are infected but do not have symptoms such as high fever and cough can be tested for highly sensitive coronavirus in a short time. be able to.

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Abstract

【課題】SARS-CoV-2の感染の有無を、偽陰性を防止しつつ、迅速かつ安価に検査する方法および当該方法を簡便に実施することができるキットを提供すること。 【解決手段】被験者から採取した検体試料、若しくは前記検体試料と培地との混合液と、水酸化ナトリウムを主成分とする検体処理液とを混合し、混合液を得る工程、 上記混合液を、インキュベーションする工程、 上記インキュベーション後の混合液に、反応液、内部標準物質、プライマー、プローブ、逆転写酵素およびＰＣＲ酵素を含むマスターミックスを添加し、最終混合液を得る工程、 上記最終混合液を逆転写反応処理する工程、および 上記逆転写反応処理によって生成したＤＮＡを鋳型にＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを前記プローブで検出する工程、 を有する新型コロナウイルスの検査方法。

Description

新型コロナウイルスの検査方法および検査試薬
　本発明は、新型コロナウイルスの検査方法、および該方法を実行するためのキットに関する。
　コロナウイルスは家畜、実験動物、ペット、野生動物などあらゆる動物に感染し、様々な疾患を引き起こすことが知られている。なかでもヒトに感染するコロナウイルスは、風邪症候群の4種類と動物から感染する重症肺炎ウイルスの2種類がこれまで知られている。
　風邪を引き起こすコロナウイルスは、風邪の１０～１５％、流行期には３５％の原因を占めると言われている。これらコロナウイルスは1960年代にHCoV-229EおよびHCoV-OC43が発見され、2000年代に入ってHCoV-NL63およびHCoV-HKU1の2種類が発見された。
　一方、2002年に発見されたSARSコロナウイルス(以下、SARS-CoVと称する場合がある)はキクガシラコウモリが自然宿主であると考えられている。SARS-CoVは重症急性呼吸器症候群を引き起し、人体に重篤な症状をもたらすことが知られている。また2012年に発見されたMERSコロナウイルス (以下、MERS-CoVと称する場合がある) はヒトコブラクダを感染源としており、ヒトに感染すると重症肺炎を引き起こすことが知られている。いずれのコロナウイルスも世界的な流行を引き起し、多くの感染者を出した。
　さらに2019年の末には新たに新型コロナウイルス (以下、SARS-CoV-2と称する場合がある)が急性呼吸器疾患を引き起こすことが判明した。初発流行地は中国湖北省武漢市とされているが、その後、世界的な流行となり、東アジアを中心に東南アジア、中東、ヨーロッパ、アメリカなど感染拡大が続いた。2020年初頭にブラジルで感染者が出たことで、南極大陸を除く5大陸全てに感染が拡大した
　新型コロナウイルスは未だ、その有効な予防方法および治療方法が確立されておらず、また人によっては重篤な肺炎症状を引き起こし、最悪の場合は死に至る場合があるが、その症状は特異的ではない。例えば、症状がない場合から重症の肺炎、死亡まで幅広い症状を示す。典型的な症状としては発熱、空咳、疲労、喀痰、息切れ、咽頭痛、頭痛、筋肉痛または関節痛等があると言われている。
　初期症状は、風邪とそっくりであるために、発症早期の段階では区別が困難であり、感染から潜伏期間を経た後に、微熱発熱および風邪症状が約1週間続く場合があるが、患者の当初の症状は、肺炎に特有の発熱および咳だけとは限らず、下痢、吐き気、頭痛および全身のだるさなど、消化器系および神経系の症状の場合もあり、早期の診断を難しくしているとされている。
　したがって、SARS-CoV-2に感染したかどうかの判定を行うための迅速な検査方法の確立が求められている。なかでもポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと称する場合がある）を利用するＰＣＲ法はごく微量の核酸を増幅し、高感度の検出を行うことが可能であることから、ウイルスのような微生物の検出には適した方法である。
　国立感染症研究所からはSARS-CoV-2の検出方法として、ＰＣＲ法で検出する方法を公表している（非特許文献１）。当該方法は、ＲＮＡウイルスであるSARS-CoV-2を含む検体からウイルス由来のＲＮＡを精製し、精製したＲＮＡを逆転写－ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と称する場合がある）によりｃＤＮＡとして増幅し、SARS-CoV-2を検出する方法である。
国立感染症研究所　病原体検出マニュアル 2019-nCoV
　しかし、上記SARS-CoV-2の検出方法は、ＲＮＡの抽出および精製のために２時間以上の時間を要するため、精製に時間および手間がかかり、多検体処理を行う上での課題となっている。また、SARS-CoV-2を検出するための検査にはある程度の熟練度が必要とされることから、検査機関の拡充に時間を要すると考えられる。
　SARS-CoV-2の場合は、発症前の潜伏期間が１週間以上にわたること、および、その潜伏期間中も２次感染を引き起こすことが報告されていることから、迅速な方法で精度の高い検査方法が望まれている。またSARS-CoV-2の世界的な流行に鑑み、簡便に高精度なSARS-CoV-2の検査が行える検査キットも望まれている。
　さらに、感染の拡大を防止するためには、検査において、検体に実際にSARS-CoV-2が含まれているにも関わらず、該ウイルスが検出されない偽陰性の判定となることを避けることが重要である。しかしながら、検体を構成する、ウイルスの保存液および／または輸送液の中に、例えば、逆転写酵素および／またはＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を阻害する物質が混入していると、ＲＴ－ＰＣＲの反応が進行せず、検体にSARS-CoV-2が含まれていたとしても、偽陰性の判定が導かれる可能性がある。このため、偽陰性を防ぐことのできる検査キットが望まれている。ここでいう、陰性とはPCR法による検出限界以下のことである。
　本発明の目的は、SARS-CoV-2の感染の有無を、偽陰性を防止しつつ、迅速かつ安価に検査する方法および当該方法を簡便に実施することができるキットを提供することである。
　SARS-CoV-2の検査においては、通常、検体からウイルス由来のＲＮＡを抽出した検体処理液に対してPCRマスターミックスを添加し、ＲＴ－ＰＣＲが行われる。このPCRマスターミックスは、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、PCRプライマー、前記PCRプライマーを伸長させるDNAポリメラーゼの基質となるデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄNTPｓ）およびPCR増幅産物を検出するためのプローブを含む。PCRマスターミックスにおいては、PCRマスターミックスの調製後、検体から抽出されたＲＮＡをPCRマスターミックスに添加する前に、前記プライマー同士による非特異的増幅反応が起こる場合があり、このような場合には、ウイルスの検査精度に影響が出ることが考えられる。特にSARS-CoV-2検出工程において、検出作業の都合により、PCRマスターミックスを、その調製後数時間にわたって放置することもあり、この間に意図されない前記非特異的増幅反応を抑制し、検査精度を維持することが必要である。
　本発明の目的は、前記非特異的増幅反応を抑制することにより、SARS-CoV-2の感染の有無を、迅速かつ安価に、高精度で検査する方法および当該方法を簡便に実施することができるキットを提供することである。
　すなわち、本発明は、
被験者から採取した検体試料、若しくは前記検体試料とウイルス保存液等との混合液と、水酸化ナトリウムを主成分とする検体処理液とを混合し混合液を得る工程、
上記混合液を、インキュベーションする工程、
上記インキュベーション後の混合液に、反応液、内部標準物質、プライマー、プローブ、逆転写酵素、およびＰＣＲ酵素を含むマスターミックスを添加し最終混合液を得る工程、
上記最終混合液を逆転写反応処理する工程、および
上記逆転写反応処理によって生成したＤＮＡを鋳型にＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを前記プローブで検出する工程、
を有する新型コロナウイルスの検査方法に関する。
　さらに本発明は、
上記の新型コロナウイルスの検査方法において、前記検体処理液または前記反応液が、ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｄATP）、ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｄGTP）、ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｄCTP）およびｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｄTTP）を含む、新型コロナウイルスの検査方法に関する。
　さらに本発明は、
水酸化ナトリウムを主成分とする検体処理液、反応液、内部標準物質、プライマー、プローブ、逆転写酵素、およびＰＣＲ酵素を有する新型コロナウイルスの検査用キットに関する。
　さらに本発明は、
上記の新型コロナウイルスの検査用キットにおいて、前記検体処理液または前記反応液が、ｄATP、ｄGTP、ｄCTPおよびｄTTPを含む、新型コロナウイルスの検査用キットに関する。
　本発明によれば、検体に含まれるウイルスＲＮＡを精製することなく、SARS-CoV-2の感染の有無を、偽陰性の発生を防止しつつ、迅速かつ安価に検査する方法および当該方法を簡便に実施できるキットを提供することができる。
　通常、DNAポリメラーゼの基質となるｄNTPｓは、PCRマスターミックスを調製するための反応液に加える。しかしながら本発明によれば、前記反応液に代えて検体処理液にｄNTPｓを加えることにより、PCRマスターミックス調製後もＰＣＲプライマー同士による非特異的増幅反応は起こらず、検体試料と検体処理液との混合液をPCRマスターミックスに添加することによりすべての増幅反応が開始される。このため本発明は、検体試料中の新型コロナウイルスの存在の有無を、高精度で検査することを可能とする。
１ステップＲＴ－ＰＣＲによる測定のための混合液（１０μＬ）における、SARS-CoV-2 ＲＮＡの一部を合成した人工合成ＲＮＡ、咽頭ぬぐい液およびＵＴＭ培地を含む試料液の含有量を、１、３、５および７μＬと変化させた場合のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにおける増幅曲線を示す図である。 試料液中のPCR反応阻害物質によるPCR反応阻害を伴わない試料液に関するリアルタイムＲＴ-ＰＣＲの増幅曲線を示す図である。 試料液中のPCR反応阻害物質によるPCR反応阻害を伴う試料液に関するリアルタイムＲＴ-ＰＣＲの増幅曲線を示す図である。 陽性であると判定される試料液に関するリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応の増幅曲線を示す図である。 陰性（検出限界以下）であると判定される試料液に関するリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ反応の増幅曲線を示す図である。 検体として鼻腔拭い液および喀痰（２５例）を、病原体検出マニュアル 2019-nCoV（非特許文献１）に記載の方法および本発明の方法で検査した結果を示す図である。 検体として唾液（２２例）を、病原体検出マニュアル 2019-nCoV（非特許文献１）に記載の方法および本発明の方法で検査した結果を示す図である。
　コロナウイルスの特徴の一つは、そのゲノムがＤＮＡではなくＲＮＡであることである。したがってＰＣＲ法を適用する場合も、ＲＴ-ＰＣＲ法が有効である。ＲＴ-ＰＣＲ法には１ステップＲＴ-ＰＣＲ法と２ステップＲＴ-ＰＣＲ法がある。１ステップＲＴ-ＰＣＲ法は、逆転写反応とＰＣＲを同一の容器内で連続して行うため、操作が簡便であり、サンプル間のコンタミネーションが抑制される観点から好ましい。
　本発明の新型コロナウイルスの検査方法は、感染の有無を判定するための被験者から採取した検体試料、若しくは前記検体試料と培地との混合液を、水酸化ナトリウムを主成分とする検体処理液と混合する工程を含む。被験者から採取する検体試料としては、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、気管支洗浄液、唾液などが挙げられる。前記培地はウイルス保存液等を含む。
　使用する培地は、微生物および生物組織の培養において、培養対象に生育環境を提供するものであり、市販のＵＴＭ培地（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）およびＶＴＭ（スギヤマゲン株式会社製）等のウイルス輸送・保存培地が好適に使用できる。上記検体試料は、培地以外に、リン酸緩衝食塩水（以下、ＰＢＳと称する場合がある）などと混合してもよい。また、被験者から採取する上記検体試料は、培地と混合する必要のない場合もある。
　上記検体処理液は水酸化ナトリウムを主成分とする水溶液であり、コロナウイルス粒子からＲＮＡを抽出する目的で添加される。検体処理液は、水酸化ナトリウム以外に、後述するＲＴ-ＰＣＲ処理を効率的に行い、検査精度を高める観点から、グリコールエーテルジアミン四酢酸（以下、ＥＧＴＡと称する場合がある）等の金属キレート剤および／またはジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと称する場合がある）等の還元剤を含んでもよい。
　検体試料、若しくは前記検体試料と培地との混合液（以下、両者を合わせて試料液と称する場合がある）と検体処理液は、試料液の体積を１．０として、検体処理液を体積比で０．４～２．３倍の割合で混合し、混合液を得る。前記体積比で混合した前記混合液を得ることにより、コロナウイルスのゲノムＲＮＡが適切に抽出され、逆転写反応およびＰＣＲが適切に進行すると考えられる。試料液と検体処理液の混合割合は、試料液の体積を１．０として、検体処理液を体積比で０．５倍以上が好ましく、０．８～１．３倍がより好ましく、０．９～１．１倍がさらに好ましい。
　試料液と検体処理液とは上記混合比で混合されることが好ましいが、少量の検体試料で簡便に対応できること、および高価な酵素類の使用量を抑えて検査コストを低減するという観点から、後述する最終混合液の体積は、概ね２５μＬ以下であることが好ましい。最終混合液の体積を２５μＬ以下にする場合、試料液の３μＬ～５μＬと、検体処理液を３μＬ～５μＬとを混合して混合液を得ることが好ましい。試料液および検体処理液は、いずれも５μＬであることがより好ましい。
　得られた上記混合液はインキュベーションされる。インキュベーション温度は、適宜設定される。検査の迅速性および得られる結果の精度の観点から、インキュベーション温度は常温～９５℃であり、好ましくは８０～９５℃であり、またインキュベーション時間は３分間～５分間が好ましい。なお常温とは通常２５℃前後である。
　上記インキュベーションの工程を経た混合液に、反応液、ＰＣＲプライマー対、プローブ、逆転写酵素およびＰＣＲ酵素を含むマスターミックスを添加し、最終混合液を得る。反応液は界面活性剤を含むＰＣＲ緩衝液を含有する。界面活性剤は、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤および非イオン界面活性剤から選択することができる。
　陰イオン界面活性剤としては、アルキルサルフェート、アルキルエーテルサルフェート、ドキュセート、スルホネートフルオロ界面活性剤、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルアリールエーテルホスフェート、アルキルエーテルホスフェート、アルキルカルボキシレート、ラウロイルサルコシンナトリウム、カルボキシレートフルオロ界面活性剤、コール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。アルキルサルフェートとしては、ドデシル硫酸ナトリウム（Sodium Dodecyl Sulfate、ＳＤＳ）およびドデシル硫酸アンモニウムが好ましく、ドデシル硫酸ナトリウムがより好ましい。ドデシル硫酸ナトリウムは、ラウリル硫酸ナトリウム（Sodium Lauryl Sulfate、ＳＬＳ）とも称される。陽イオン界面活性剤としては、エチルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドおよびテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドなどが挙げられるが、これらに限定されない。両性界面活性剤としては、例えば、ベタインおよびアルキルアミノ脂肪酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。非イオン界面活性剤としては、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ－４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）、ポリオキシエチレンｐ－ｔ－オクチルフェノール（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（登録商標））などが挙げられるが、これらに限定されない。反応液に含まれる界面活性剤としては、好ましくは、非イオン界面活性剤であり、ウイルスＲＮＡを効率よく抽出するために、濃度は０.０５～５％（w/v）であることが好ましい。
　前記ＰＣＲ緩衝液は、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２およびｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ５'－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（以下、ｄＮＴＰと略する場合がある）ミックスを含むことが効率的なＲＴ－ＰＣＲを行う観点から好ましい。なお、ｄＮＴＰミックスとは、予めｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（以下、ｄＡＴＰと略する場合がある）、ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（以下、ｄＧＴＰと略する場合がある）、ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（以下、ｄＣＴＰと略する場合がある）およびｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（以下、ｄＴＴＰと略する場合がある）を所定濃度で混合した水溶液である。また前記ＰＣＲ緩衝液としては、特に限定されないが、リン酸緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＨＥＰＥＳなどのグッド（Ｇｏｏｄ）緩衝液が挙げられるが、効率的なＲＴ－ＰＣＲを行う観点からトリス塩酸緩衝液が好ましい。ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌおよび緩衝液の濃度については、後述するＲＴ-ＰＣＲ処理に応じて、適宜設定することができる。例えば、ＭｇＣｌ２が１.５ｍＭ、ＫＣｌが３５ｍＭ、ｄＮＴＰがそれぞれ２００μＭおよびトリスが１０ｍＭの濃度が例示できる。
　ｄＮＴＰミックスは、前記反応液を構成する前記ＰＣＲ緩衝液に代えて、水酸化ナトリウムを主成分とする前記検体処理液に含ませてもよい。この場合、前記マスターミックスはｄＮＴＰｓ（ｄATP、ｄGTP、ｄCTPおよびｄTTP）を含まないので、マスターミックスの調製後に生じ得る、プライマー同士による非特異的増幅反応を抑えることができる。　　　　　　
　ｄATP、ｄGTP、ｄCTPおよびｄTTPから選択される任意の１～３種のｄＮＴＰを前記ＰＣＲ緩衝液に加え、残りのｄＮＴＰを前記検体処理液に含ませてもよい。好ましくは、ｄATP、ｄGTP、ｄCTPおよびｄTTPから選択される任意の２種のｄＮＴＰを前記ＰＣＲ緩衝液に加え、残りの２種のｄＮＴＰを前記検体処理液に加える。このように、前記マスターミックスが、ｄATP、ｄGTP、ｄCTPおよびｄTTPから選択される任意の１～３種のｄＮＴＰを含む場合であっても、マスターミックスの調製後に生じ得る、プライマー同士による非特異的増幅反応を抑えることができる。
　先行するＰＣＲからのＰＣＲ産物のキャリーオーバーを防ぐため、ｄTTPをｄＵＴＰ（ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に代えたｄＮＴＰミックスを前記検体処理液に含ませてもよい。Ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（ｄＵ）が取り込まれた増幅産物は、ｕｒａｃｉｌ-Ｎ-ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）処理により分解することができるため、ＰＣＲ反応液中に混入した、ｄＵを含む増幅産物を、ＰＣＲの前にＵＮＧにより分解し、先行するＰＣＲの増幅産物の影響による偽陰性を防ぐことができる。
　被験者から採取した検体試料には、ＤＮＡポリメラーゼに吸着する生体由来の負電荷物質（例えば、ある種の糖および色素等）およびＤＮＡに吸着する生体由来の正電荷物質（例えば、ある種のタンパク質等）が混入する場合がある。これらの負電荷物質および正電荷物質はＰＣＲを阻害するため、正確な測定を困難にする。このＰＣＲ阻害の問題に対応するため、前記ＰＣＲ緩衝液には、これらの負電荷物質および正電荷物質に結合することにより、これらの電荷物質によるＰＣＲ阻害作用を中和する物質が加えられる。前記ＰＣＲ緩衝液として、遺伝子増幅用試薬Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（登録商標、島津製作所）またはＡｍｐｄｉｒｅｃｔ　Ｐｌｕｓ（登録商標、島津製作所）を使用することができる。固相抽出および液液抽出等の核酸を精製する処理が不要となり、液を廃棄する必要もなくなるため、より少量の試料でＰＣＲなどを行うことができるという観点から、このような遺伝子増幅用試薬の使用が好ましい。
　本発明において、内部標準物質は、次の（１）と（２）の少なくともいずれかを含む。（１）内部標準核酸および（２）内部標準核酸のPCRによる増幅に必要なプライマー対およびプローブのセット。本発明において、内部標準核酸は、ＰＣＲにおいて、SARS-CoV-2を検出するためのプライマーおよびプローブと交差反応を起こさない配列である。前記内部標準核酸は、SARS-CoV-2 ＲＮＡ由来の核酸とは異なる配列を有し、前記ウイルス由来の核酸とは独立して増幅される核酸であり、ＤＮＡおよびRNAのいずれでもよい。前記内部標準核酸は、ＲＴ－ＰＣＲを実行するマスターミックスに添加されてもよいし、検体由来の核酸であってもよい。また、増幅効率をよくするために、前記内部標準核酸の鎖長は３００bp以下が好ましく、１００ｂｐ以下がより好ましい。例えば、前記内部標準核酸がＤＮＡである場合、内部標準DNAは、ＰＣＲにおいて、SARS-CoV-2 ＲＮＡから逆転写反応により生成したｃＤＮＡとは異なる配列を有し、前記ウイルス由来ｃＤＮＡとは独立して増幅されるＤＮＡである。すなわち内部標準核酸は、ＰＣＲが適切に進行したか否かを判断するための指標として用いることができる。ＰＣＲにおいて、内部標準核酸が増幅される場合には、ＰＣＲが適切に進行したことが示されるが、増幅されない場合には、ＰＣＲそのものが進行しなかったことが示される。このため、検体試料にSARS-CoV-2が含まれているにも関わらず、SARS-CoV-2遺伝子が検出されないという誤判定（偽陰性）を避けることができる。内部標準核酸の例としては、SARS-CoV-2遺伝子の増幅に影響を及ぼさないものであればよく、人工的に設計された配列を持つ核酸であっても、他の生物由来の配列であっても、また検体由来の核酸であってもよい。かかる内部標準核酸をマスターミックスに添加する場合、SARS-CoV-2遺伝子の増幅に影響を及ぼさない核酸のＰＣＲによる増幅のためのフォーワードプライマーおよびリバースプライマーならびに当該プライマー対による増幅産物を検出するためのプローブが、本発明のキット中に含まれる。かかる内部標準核酸として、検体由来の核酸を利用する場合、SARS-CoV-2遺伝子の増幅に影響を及ぼさない検体由来の核酸の増幅のためのフォーワードプライマーおよびリバースプライマーならびに当該プライマー対による増幅産物を検出するためのプローブが、本発明のキット中に含まれる。
　本発明において、目的遺伝子を増幅するＰＣＲプライマー対（フォワードおよびリバース）は、SARS-CoV-2のRNA由来の核酸の配列に特異的なプライマーを使用することができ、例えば、SARS-CoV-2 ＲＮＡから逆転写反応により生成したｃＤＮＡの配列に特異的なプライマーを使用することができる。プライマーとしては、表１に記載のプライマー対および表２に記載のプライマー対が例示される。例示されたＰＣＲプライマー対の検出対象は、Ｎ（Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ）遺伝子の２領域である。国立感染症症研究所の方法では、ＮセットのN_Sarbeco_F1（フォワード、配列番号１）およびN_Sarbeco_R1（リバース、配列番号２）ならびにＮセット No.2のNIID_2019-nCOV_N_F2（フォワード、配列番号３）およびNIID_2019-nCOV_N_R2（リバース、配列番号４）、またアメリカ疾病対策予防センターの方法では、N1 Forward Primer（配列番号５）およびN1 Reverse Primer（配列番号６）、ならびにN2 Forward Primer（配列番号７）およびN2 Reverse Primer（配列番号８）が例示される。内部標準核酸を増幅するＰＣＲプライマー対は、内部標準核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズするプライマーであって、前記SARS-CoV-2由来の核酸にはハイブリダイズしないＰＣＲプライマー対が好ましい。前記ストリンジェントな条件とは、鋳型核酸にプライマーが結合するステップであるＰＣＲにおけるアニーリングにおいて、鋳型核酸とプライマーとの結合が特異的である条件をいう。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　検査の迅速性の観点から、後述するＲＴ－ＰＣＲにおいて、ＰＣＲ産物はリアルタイム測定によりモニターされる。該リアルタイム測定を行う場合、ＲＴ－ＰＣＲおよび該ＲＴ－ＰＣＲ産物を検出する工程は同一容器内で行われる。ＰＣＲ産物のリアルタイム測定は、リアルタイムＰＣＲとも呼ばれる。リアルタイムＰＣＲでは、通常ＰＣＲ増幅産物を蛍光により検出する。蛍光検出方法には、インターカレーター性蛍光色素を用いる方法および蛍光標識プローブを用いる方法がある。インターカレーター性蛍光色素としては、例えばＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉが使用される。インターカレーター性蛍光色素は、ＰＣＲによって合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、ＰＣＲ増幅産物の生成量を測定することができる。
　ＰＣＲ増幅産物を蛍光検出するため、本発明の新型コロナウイルスの検査方法では、１種または２種以上の蛍光色素で標識されたプローブを添加する。プローブの例としては、加水分解プローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎなどが挙げられる。加水分解プローブは、５'末端が蛍光色素で、また３'末端がクエンチャー物質で修飾されたオリゴヌクレオチドである。加水分解プローブは、ＰＣＲのアニーリングステップで鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。その後の伸長反応ステップで、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのもつ５'→３'エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型ＤＮＡにハイブリダイズした加水分解プローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる蛍光の発生の抑制が解除されて蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量を測定することができる。
　前記蛍光色素の例としては、プローブに標識する蛍光としては、ＦＡＭ（6-carboxyfluorescein）、ＲＯＸ（6-carboxy-X-rhodamine）、Ｃｙ３およびＣｙ５（Cyanine系色素）、ならびにＨＥＸ（4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxyfluorescein）などが使用できる。前記クエンチャーの例としては、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ、登録商標）１、ＢＨＱ２、ＭＧＢ－Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）およびＤＡＢＣＹＬなどが挙げられる。
　本発明において、SARS-CoV-2 ＲＮＡに由来するｃＤＮＡのＰＣＲ増幅産物の検出のために使用することのできるオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブとしては、表１または表２に記載のプローブが例示される。表１に記載のＮセットおよびＮセットNo.2のＰＣＲプライマー対により増幅された遺伝子にストリンジェントな条件でハイブリダイズするプローブとして、それぞれN_Sarbeco_P1およびNIID_2019-nCOV_N_P2が示される。N_Sarbeco_P1は、５'末端の蛍光色素としてＦＡＭおよび３'末端のクエンチャー物質としてＢＨＱ１が結合する。NIID_2019-nCOV_N_P2は、５'末端の蛍光色素としてＲＯＸおよび３'末端のクエンチャー物質としてＢＨＱ２が結合する。表２に記載のＮ１セットおよびＮ２セットのＰＣＲプライマー対により増幅された遺伝子にストリンジェントな条件でハイブリダイズするプローブとして、それぞれN1 ProbeおよびN2 Probeが示される。N1 Probeは、５'末端の蛍光色素としてＲＯＸおよび３'末端のクエンチャー物質としてＢＨＱ２が結合する。N2 Probeは、５'末端の蛍光色素としてＦＡＭおよび３'末端のクエンチャー物質としてＢＨＱ１が結合する。なお、上記のプローブの５'末端の蛍光色素は、ＦＡＭをＲＯＸと置き換えてもよく、またＲＯＸをＦＡＭと置き換えてもよい。さらに他の蛍光色素を使用することもできるが、SARS-CoV-2の増幅されたＮ遺伝子の２領域に対してハイブリダイズするプローブは、相互に異なる蛍光色素を結合する。
　内部標準核酸のＰＣＲ増幅産物を検出するためには、内部標準核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブであって、SARS-CoV-2検出用蛍光プローブに結合する蛍光色素とは異なる蛍光色素が結合するプローブが好ましい。表１に記載された２種のSARS-CoV-2検出用蛍光プローブが使用される場合、内部標準核酸検出用蛍光プローブの蛍光色素としてはＣｙ５が例示されるが、これに限定されるわけではない。このように、本発明において、ＰＣＲ増幅産物の検出に使用するオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブは、それぞれのプローブに結合する蛍光色素が相互に異なることにより、複数のプライマー対によるＰＣＲ増幅産物を分別して検出することができる。
　上記逆転写酵素は、コロナウイルスのＲＮＡを鋳型として、１本鎖の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成する酵素である。例えばトリ骨髄芽球症ウイルス（Avian Myeloblastosis Virus、AMV）、モロニーマウス白血病ウイルス（Moloney Murine Leukemia Virus、M-MLV）およびヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus、HIV）などのＲＮＡウイルス由来のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼならびにこれらの変異体を使用することができる。逆転写酵素は２００Ｕ以上の活性を有する酵素が好ましい。
　ＰＣＲ酵素であるＤＮＡポリメラーゼは、好熱性細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましく、例えば、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、ＫＯＤ、Ｐｆｕおよびこれらの変異体が挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼによる非特異的増幅を避けるという観点から、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい。ホットスタートＤＮＡポリメラーゼとしては、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体が結合したＤＮＡポリメラーゼまたは酵素活性部位を熱感受性化学修飾したＤＮＡポリメラーゼが挙げられ、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体が結合したＤＮＡポリメラーゼが好ましい。ＰＣＲ酵素は３Ｕ以上の活性を有する酵素が好ましい。
　反応液、内部標準物質、ＰＣＲプライマー対、プローブ、逆転写酵素およびＰＣＲ酵素を含むマスターミックスを、インキュベーションされた前記混合液に添加し、最終混合液を得る。最終混合液の体積を概ね２５μＬ以下にする場合、マスターミックスは１４～１６μＬの範囲で添加することが好ましい。
　得られた最終混合液はＲＴ-ＰＣＲ処理が行われる。ＲＴ－ＰＣＲにおける逆転写反応の反応温度条件、およびＰＣＲ条件（温度、時間およびサイクル数）は適宜設定される。またＲＴ-ＰＣＲは市販のＲＴ-ＰＣＲ用反応チューブで実施される。
　上記ＲＴ-ＰＣＲ処理により増幅されたＲＮＡを、標識された前記蛍光標識プローブを用いて検出することにより、リアルタイム測定によりリアルタイムでSARS-CoV-2の有無を判定し、新型コロナウイルスの迅速な検査を行うことができる。
　ＰＣＲ産物のリアルタイム測定は、使用する蛍光色素に対応した蛍光フィルターを用いてＰＣＲ産物の増幅曲線をモニターすることで、ＰＣＲの進行状況をリアルタイムで確認することができる。ＰＣＲサイクル数に応じて蛍光強度が増加する場合には、検体試料におけるSARS-CoV-2の存在が陽性であると判定され、一方、ＰＣＲにおいて蛍光強度が増加しない場合は陰性であると判定される。この時、内部標準物質を上記マスターミックスに添加しておくと、ＰＣＲサイクル数に応じて上記内部標準核酸に対応する蛍光強度が増加すれば、偽陰性の可能性を排除しやすくなる。前記内部標準核酸の例としては、SARS-CoV-2の増幅に影響を及ぼさないものであればよく、他の生物由来の配列、若しくは人工的に設計された配列を持つものであっても、検体由来の配列であってもよい。
　上記方法を効率的に行うために、本発明はさらに、水酸化ナトリウムを含む検体処理液、反応液、内部標準物質、ＰＣＲプライマー対、プローブ、逆転写酵素およびＰＣＲ酵素を有する新型コロナウイルスの検査用キットを提供する。上記検査用キットは、ごく少量の検体を採取し、上述した各工程に従って新型コロナウイルスの検査をする場合に、効率的に検査を行うことを可能とする。検体処理液、反応液、内部標準物質、ＰＣＲプライマー対、プローブ、逆転写酵素、およびＰＣＲ酵素は上述の通りである。
　前記ＰＣＲプライマー対は、SARS-CoV-2 ＲＮＡに由来する核酸を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対および内部標準核酸を増幅するＰＣＲプライマー対を含むことが好ましい。SARS-CoV-2遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマー対が２以上含まれる場合は、ウイルス検出精度を向上させるため、それぞれが異なるＤＮＡ配列にハイブリダイズするプライマー対を選択することが好ましい。
　前記オリゴヌクレオチド蛍光標識プローブは、それぞれのプローブに結合する蛍光色素が相互に異なることにより、ＰＣＲ増幅産物を個別に測定することができるキットが提供される。
　上記検査用キットは、検体処理液、反応液、内部標準物質、ＰＣＲプライマー対、プローブ、逆転写酵素およびＰＣＲ酵素をそれぞれ異なる容器に収納してもよいが、本発明の新型コロナウイルスの検査方法の手順に則り、それぞれを適宜、所定の量で予め混合しておく方が、検査の際の混合の煩雑さを避けることができるため好ましい。
　例えば、検体処理液を一つの容器に、反応液、内部標準物質、ＰＣＲプライマー対、プローブ、逆転写酵素およびＰＣＲ酵素を、それぞれ所定量で混合して一つの容器に収納してもよい。また、反応液、内部標準物質、ＰＣＲプライマー対およびプローブをそれぞれ所定量で混合して一つの容器とし、逆転写酵素およびＰＣＲ酵素をそれぞれ所定量で混合して別の容器としてもよい。
　検査の際の混合の煩雑さと保存安定性の観点から、２～４個の容器にこれらを分配することが好ましく、例えば、検体処理液、反応液および内部標準物質、所定量で混合したＰＣＲプライマー対およびプローブ、ならびに所定量で混合した逆転写酵素およびＰＣＲ酵素を、それぞれ独立して別個の容器に収納してもよい。
　本発明の新型コロナウイルスの検査方法および検査用キットを用いることにより、SARS-CoV-2の感染の有無を、偽陰性の発生を防止しつつ、迅速かつ簡便に検査することができる。RT-PCR検査は、イムノクロマトに比べて検出感度が高いため、高熱および咳などについて無症状であるが、SARS-CoV-2感染者である場合についても、短時間で精度よく判定できるコロナウイルスの検査を提供することができる。
［実施例］
　次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらによって限定されない。
［実施例１］
〔混合液の調整〕
　新型コロナウイルスのゲノムＲＮＡの一部を合成した人工合成ＲＮＡ(１０，０００コピー)を用いて以下のＲＴ-ＰＣＲを行った。ＰＣＲチューブにおいて、ＵＴＭ培地（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）ならびに上記人工合成ＲＮＡおよび咽頭ぬぐい液を含む試料液の１、３、５または７μＬに対して、水酸化ナトリウムを含む検体処理液をそれぞれ９、７、５または３μＬ添加して、合計量を１０μＬとした。
　上記得られた混合液をボルテックスミキサーで混合し、恒温装置で９０℃、５分間のインキュベーションを行った後、氷冷した。
　試薬Ａの６．５μＬ、試薬Ｂの６．５μＬおよび試薬Ｃの２μＬをボルテックスミキサーで混合し、マスターミックスとした。試薬Ａ、試薬Ｂおよび試薬Ｃの組成は以下の通りである。
試薬Ａ：界面活性剤およびＰＣＲ緩衝液を含有する反応液
試薬Ｂ：ＰＣＲプライマー対およびプローブ
試薬Ｃ：２５０Ｕの逆転写酵素および３．１２５ＵのＰＣＲ酵素
　上記インキュベーション後の混合液１０μLの入ったＰＣＲチューブに、上記のマスターミックス１５μLを添加した。その後、 ボルテックスミキサーで混合し、ＰＣＲチューブをリアルタイムＰＣＲ装置にセットして直ちにＰＣＲを開始した。
　リアルタイムＲＴ-ＰＣＲの設定条件は以下の通りである。
ＲＴ-ＰＣＲ設定条件
５０℃で１０分保持後、９５℃で１分保持する。その後、９５℃で５秒保持した後に６０℃まで降温して３０秒保持するサイクルを４５サイクル実施した。
　リアルタイムＲＴ-ＰＣＲの増幅曲線をサイクル数に対してプロットした結果が図１である。培地の量が３および５μＬでは、培地を添加しない場合と比較して増幅曲線の立ち上がりにあまり差が見られなかった。
　上記の結果からSARS-CoV-2の検査では、培地を含む試料を扱うことがあるが、培地を含む試料を直接反応液に添加した場合、ＰＣＲに対して影響を与えると考えられる。本発明の新型コロナウイルスの検査方法はこのような影響を排除し、迅速に新型コロナウイルスの有無の結果を得ることができる。
［実施例２］
〔ウイルス遺伝子検出における偽陰性の確認〕
　複数の被験者から検体試料として咽頭ぬぐい液を取得し、各検体試料に関し、ＵＴＭ培地を混合して複数の試料液を調製した。各試料液５μＬに対して水酸化ナトリウムを含む検体処理液５μＬを添加し、ボルテックスミキサーで混合した。得られた混合液を、恒温装置で９０℃、５分間のインキュベーションを行った後、氷冷した。
　試薬Ａの６．５μＬ、試薬Ｂの６．５μＬおよび試薬Ｃの２μＬをボルテックスミキサーで混合し、マスターミックスとした。試薬Ａ、試薬Ｂならびに試薬Ｃの組成は以下の通りである。
試薬Ａ：内部標準ＤＮＡ（７６ｂｐ）、界面活性剤およびＰＣＲ緩衝液を含有する反応液
試薬Ｂ：ＰＣＲプライマー対およびプローブ
試薬Ｃ：２５０Ｕの逆転写酵素および３．１２５ＵのＰＣＲ酵素
　上記インキュベーション後の混合液１０μLの入ったＰＣＲチューブに、上記マスターミックス１５μLであって、遺伝子増幅領域の異なる２種類のＰＣＲプライマー対およびプローブ（表２に記載のＮ１セットおよびＮ２セット）ならびに内部標準ＤＮＡ検出用のＰＣＲプライマー対およびＣｙ５標識プローブを含むマスターミックスを添加した。その後、 ボルテックスミキサーで混合し、ＰＣＲチューブをリアルタイムＰＣＲ装置にセットして直ちにＰＣＲを開始した。ＲＴ-ＰＣＲは実施例１と同一の条件下で行った。
　上述のとおり準備した複数の試料液のうち、試料液中のPCR反応阻害物質によるPCR反応阻害を伴わない試料液に関するリアルタイムＲＴ-ＰＣＲの増幅曲線を図２Ａに示す。SARS-CoV-2遺伝子のＮ１およびＮ２領域の増幅は認められないが、内部標準ＤＮＡ（ＩＣ）の増幅曲線の立ち上がりが観察されることから、ＰＣＲは適切に進行したことが示される。その結果、試料液にウイルス遺伝子が含まれない真陰性であると判定される。上述の複数の試料液のうち、試料液中のPCR阻害物質によるPCR反応阻害を伴う試料液に関するリアルタイムＲＴ-ＰＣＲの増幅曲線を図２Bに示す。内部標準ＤＮＡ（ＩＣ）の増幅曲線の立ち上がりが認められないことから、陰性（検出限界以下）であるのか、または偽陰性であるのかの識別ができない。このような場合には、再分析を行うことにより、偽陰性の発生を防止することができる。
［実施例３］
〔ＳARS-CoV-2陽性または陰性と判定されるＰＣＲ増幅曲線〕
　ＳARS-CoV-2遺伝子を添加または無添加とした試料液を用いて、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにおいてウイルス陽性または陰性と判定される場合の増幅曲線を検討した。ＳARS-CoV-2遺伝子のゲノムＲＮＡの一部を合成した人工合成ＲＮＡ（１０，０００コピー）を含む試料液５μＬに対して水酸化ナトリウムを含む検体処理液５μＬを添加し、ボルテックスミキサーで混合した。得られた混合液を、恒温装置で９０℃、５分間のインキュベーションを行った後、氷冷した。
　試薬Ａの６．５μＬ、試薬Ｂの６．５μＬおよび試薬Ｃの２μＬをボルテックスミキサーで混合し、マスターミックスとした。試薬Ａ、試薬Ｂおよび試薬Ｃの組成は以下の通りである。
試薬Ａ：内部標準ＤＮＡ（７６ｂｐ）、界面活性剤およびＰＣＲ緩衝液を含有する反応液
試薬Ｂ：ＰＣＲプライマー対およびプローブ
試薬Ｃ：２５０Ｕの逆転写酵素および３．１２５ＵのＰＣＲ酵素
　上記インキュベーション後の混合液１０μLの入ったＰＣＲチューブに、上記マスターミックス１５μLであって、遺伝子増幅領域の異なる２種類のＰＣＲプライマー対およびプローブ（表１に記載のＮ１セットおよびＮ２セット）ならびに内部標準ＤＮＡ検出用のＰＣＲプライマー対およびＣｙ５標識プローブを含むマスターミックスを添加した。その後、 ボルテックスミキサーで混合し、ＰＣＲチューブをリアルタイムＰＣＲ装置にセットして直ちにＰＣＲを開始した。ＲＴ-ＰＣＲは実施例１と同一の条件下で行った。測定にはCFX96 Touch Deep Well リアルタイムPCR解析システム（Bio-Rad社）を使用し、Cq値（増幅曲線が閾値線（Threshold Line）と交差するサイクル数）解析設定を以下の通りとした。
Cq Determination Mode：Single Threshold
Baseline Setting：Baseline Subtracted Curve Fit
ここで、Ｃｑ値≦４０を陽性と判定した。
　ＳARS-CoV-2遺伝子を含む試料液に対してＲＴ－ＰＣＲを行った場合の増幅曲線を図３Ａに示す。この場合、SARS-CoV-2遺伝子のＮ１およびＮ２領域ならびに内部標準ＤＮＡ（ＩＣ）の増幅曲線の立ち上がりが観察されることから、ＰＣＲは適切に進行したことが示される。その結果、試料液にウイルス遺伝子が含まれる陽性であると判定される。
　ＳARS-CoV-2遺伝子を含まない試料液に対してＲＴ－ＰＣＲを行った場合の増幅曲線を図３Ｂに示す。この場合、SARS-CoV-2遺伝子のＮ１およびＮ２領域の増幅は認められないが、内部標準ＤＮＡ（ＩＣ）の増幅曲線の立ち上がりが観察されることから、ＰＣＲは適切に進行したことが示される。その結果、試料液にウイルス遺伝子が含まれない陰性（検出限界以下）であると判定される。
［実施例４］
〔SARS-CoV-2感染の判定における本発明の方法と非特許文献「病原体検出マニュアル2019-nCoV」に記載の方法との比較（１）〕
　ＵＴＭ培地と混合した鼻腔拭い液および培地と混合していない喀痰の臨床検体２５例について、本発明の方法および非特許文献「病原体検出マニュアル2019-nCoV」に記載の方法で測定し、判定結果を比較した。本発明の方法による測定は、実施例３と同一の条件下で行った。なお、ｄＮＴＰミックスは、予め水酸化ナトリウムを含む検体処理液に添加した。
　本発明の方法では、Ｃｑ値≦４０を陽性と判定し、ウイルス遺伝子のＮ１領域および／またはＮ２領域を検出した。その結果、本発明の方法では、陽性１０例および陰性１５例となり、　「病原体検出マニュアル 2019-nCoV」に記載の方法と全例が一致した（図４）。このように、本発明の方法は、信頼性の高い検査結果を与えることが示された。　
［実施例５］
〔SARS-CoV-2感染の判定における本発明の方法と非特許文献「病原体検出マニュアル2019-nCoV」に記載の方法との比較（２）〕
　培地と混合していない臨床検体（唾液）２２例について、本発明の方法および非特許文献「病原体検出マニュアル2019-nCoV」に記載の方法で測定し、検査結果を比較した。本発明の方法による測定は、実施例３と同一の条件下で行った。なお、ｄＮＴＰミックスは、予め水酸化ナトリウムを含む検体処理液に添加した。
　本発明の方法では、Ｃｑ値≦４０を陽性と判定し、ウイルス遺伝子のＮ１領域および／またはＮ２領域を検出した。その結果、両方法において、陽性一致率は９３％（１３／１４）および陰性一致率は１００％（８／８）であり、全体一致率は９５％（２１／２２）となった（図５）。このように、本発明の方法は、培地と混合していない唾液を検体試料とする場合であっても、信頼性の高い検査結果を与えることが示された。
　実施例２および実施例３では、内部標準核酸として内部標準ＤＮＡをマスターミックスに添加する例を示したが、当該内部標準ＤＮＡに代えて、検体試料由来の核酸配列であって、SARS-CoV-2遺伝子の増幅に影響を及ぼさない配列を使用することができる。即ち、実施例２および実施例３において、試薬Ａには内部標準ＤＮＡを添加せず、試薬Ｂにおいて、SARS-CoV-2遺伝子の増幅に影響を及ぼさない検体試料由来の核酸配列の増幅のためのプライマー対およびプローブを添加することにより、検体試料由来の核酸配列を内部標準として用いて、実施例２および実施例３と同様の効果を得ることができる。
　ｄＮＴＰｓは、ＰＣＲ緩衝液を含む反応液（上記試薬Ａ）に加えることにより上記マスターミックスに含ませてもよいが、実施例４および実施例５では、検体試料に対して添加する前記検体処理液にｄＮＴＰを加えた。このｄＮＴＰ配置により、マスターミックスの調製後、このマスターミックスを、検体試料を含む前記検体処理液に添加し、SARS-CoV-2遺伝子の増幅を開始するまでの間に生じ得る、プライマー同士による非特異的増幅反応を抑えることができる。ｄＮＴＰｓは、検体試料と検体処理液との混合物を９０℃、５分間加熱処理することによるウイルスＲＮＡ抽出操作中にほとんど分解しない。
［態様］
　上述した例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
［１］被験者から採取した検体試料、若しくは前記検体試料と培地との混合液と、水酸化ナトリウムを主成分とする検体処理液とを混合し、混合液を得る工程、
上記混合液をインキュベーションする工程、
上記インキュベーション後の混合液に、反応液、内部標準物質、プライマー、プローブ、逆転写酵素およびＰＣＲ酵素を含むマスターミックスを添加し、最終混合液を得る工程、
上記最終混合液を逆転写反応処理する工程、および
上記逆転写反応処理によって生成したＤＮＡを鋳型にＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを前記プローブで検出する工程、
を有する新型コロナウイルスの検査方法。
　上記［１］の発明によれば、SARS-CoV-2の感染の有無を迅速かつ安価に検査する方法を提供することができる。またRT-PCR検査は、イムノクロマトに比べて検出感度が高いため、感染しているが高熱および咳などの症状の出ていない方の場合にも、短時間で高感度なコロナウイルスの検査を提供できる。
［２］前記マスターミックスの量が１４μＬから１６μＬである、前記［１］に記載の新型コロナウイルスの検査方法。
［３］前記最終混合液が２４μＬから２６μＬである、前記［１］または［２］に記載の新型コロナウイルスの検査方法。
［４］前記インキュベーションを常温から９５℃で、３分間から５分間行う、前記［１］から［３］のいずれかに記載の新型コロナウイルスの検査方法。
［５］前記検体処理液が、さらにグリコールエーテルジアミン四酢酸とジチオトレイトールの少なくともいずれか一つを含む、前記［１］から［４］のいずれかに記載の新型コロナウイルスの検査方法。
［６］前記検体処理液または前記反応液が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを含む、前記［１］から［５］のいずれかに記載の新型コロナウイルスの検査方法。
［７］前記検体処理液が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄUＴＰを含む、前記［１］から［５］のいずれかに記載の新型コロナウイルスの検査方法。
［８］水酸化ナトリウムを主成分とする検体処理液、反応液、内部標準物質、プライマー、プローブ、逆転写酵素およびＰＣＲ酵素を有する新型コロナウイルスの検査用キット。
［９］２～４個の容器からなる、前記[８]に記載の新型コロナウイルスの検査用キット。
［１０］前記検体処理液、前記反応液および前記内部標準物質、前記プライマーおよび前記プローブ、ならびに前記逆転写酵素および前記ＰＣＲ酵素を、それぞれ独立して４つの容器に収納した、前記［９］に記載の新型コロナウイルスの検査用キット。
［１１］前記検体処理液または前記反応液が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを含む、［８］から［１０］のいずれかに記載の新型コロナウイルスの検査用キット。
［１２］前記検体処理液が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄUＴＰを含む、［８］から［１０］のいずれかに記載の新型コロナウイルスの検査用キット。
　上記［８］から［１２］の発明によれば、SARS-CoV-2の感染の有無を検査する方法を迅速に行うことができる。またRT-PCR検査は、イムノクロマトに比べて検出感度が高いため、感染しているが高熱および咳などの症状の出ていない方の場合にも、短時間で高感度なコロナウイルスの検査を行うことができる。

Claims (12)

  1. 被験者から採取した検体試料、および／または前記検体試料と培地との混合液と、水酸化ナトリウムを主成分とする検体処理液とを混合し、混合液を得る工程、
    上記混合液を、インキュベーションする工程、
    上記インキュベーション後の混合液に、反応液、内部標準物質、プライマー、プローブ、逆転写酵素およびＰＣＲ酵素を含むマスターミックスを添加し、最終混合液を得る工程、
    上記最終混合液を逆転写反応処理する工程、および
    上記逆転写反応処理によって生成したＤＮＡを鋳型にＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを前記プローブで検出する工程、
    を有する新型コロナウイルスの検査方法。
  2. 前記マスターミックスの量が１４μＬから１６μＬである、請求項１に記載の新型コロナウイルスの検査方法。
  3. 前記最終混合液が２４μＬから２６μＬである、請求項１または２に記載の新型コロナウイルスの検査方法。
  4. 前記インキュベーションを常温から９５℃で、３分間から５分間行う、請求項１から３のいずれか１項に記載の新型コロナウイルスの検査方法。
  5. 前記検体処理液が、さらにグリコールエーテルジアミン四酢酸とジチオスレイトールの少なくともいずれか一つを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の新型コロナウイルスの検査方法。
  6. 前記検体処理液または前記反応液が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の新型コロナウイルスの検査方法。
  7. 前記検体処理液が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄUＴＰを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の新型コロナウイルスの検査方法。
  8. 水酸化ナトリウムを主成分とする検体処理液、反応液、内部標準物質、プライマー、プローブ、逆転写酵素およびＰＣＲ酵素を有する新型コロナウイルスの検査用キット。
  9. ２～４個の容器からなる、請求項８に記載の新型コロナウイルスの検査用キット。
  10. 前記検体処理液、前記反応液および前記内部標準物質、前記プライマーおよび前記プローブ、ならびに前記逆転写酵素および前記ＰＣＲ酵素を、それぞれ独立して４つの容器に収納した、請求項９に記載の新型コロナウイルスの検査用キット。
  11. 前記検体処理液または前記反応液が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを含む、請求項８～１０のいずれか１項に記載の新型コロナウイルスの検査用キット。
  12. 前記検体処理液が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄUＴＰを含む、請求項８～１０のいずれか１項に記載の新型コロナウイルスの検査用キット。
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