WO2021172554A1

WO2021172554A1 - ヒト機能性角膜内皮細胞およびその応用

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Publication number: WO2021172554A1
Application number: PCT/JP2021/007490
Authority: WO
Inventors: 木下　茂; 羽室　淳爾; 千恵外園; 盛夫上野; 宗豊戸田
Original assignee: Kyoto Prefectural PUC
Current assignee: Kyoto Prefectural PUC
Priority date: 2020-02-27
Filing date: 2021-02-26
Publication date: 2021-09-02
Anticipated expiration: 2022-08-27
Also published as: JPWO2021172554A1; EP4116411A4; CN115427551A; AU2021225617A1; EP4116411A1; US20230257700A1; KR20220146552A; BR112022017180A2; CA3173725A1

Abstract

臨床治験において、早期臨床効果発現、および長期安定的臨床効果が確認された培養ヒト角膜内皮細胞を特定する細胞形質の検定技術を提供すること。ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜機能を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞を製造する方法であって、角膜内皮前駆細胞を、増殖ストレスなど培養ストレスを極小化し得る培養条件下で増殖および／または分化・成熟させる工程を含む方法を提供する。また、ヒト機能性角膜内皮細胞であって、角膜混濁や水和浮腫の改善、その結果、持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がるような角膜内皮（細胞）機能特性に繋がる機能性蛋白の発現が認められるか、または当該角膜内皮（細胞）機能特性を阻害する蛋白が惹起されないまたは低下している、細胞を提供する。

Description

ヒト機能性角膜内皮細胞およびその応用

　本開示は、ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞、その細胞を含む医薬、その製造法等に関する。

　水疱性角膜症を代表とする角膜内皮障害に対する現在の治療法はドナー角膜を用いた角膜移植術のみであるが、この手術の長期的な臨床結果は不十分である。また、角膜移植後の視力は、角膜不正乱視が誘導されることに起因して患者の満足度の点でも十分ではない。角膜移植患者の約６０％以上は、水疱性角膜症や早期フックス角膜ジストロフィを含む角膜内皮機能不全である。水疱性角膜症の主な原因は白内障手術、緑内障手術、硝子体網膜手術、またはレーザー虹彩切開術等の眼科手術に起因する角膜内皮障害、角膜外傷、偽落屑症候群、およびフックス角膜内皮ジストロフィである。欧米におけるフックス角膜内皮ジストロフィの遺伝的な素因を有する潜在的有病率は約５％以上と報告されている。角膜移植術では、病的な１眼を治療するために１眼のドナー角膜が必要であり、継続的なドナー不足を解決する手段とはならない。全世界的に潜在患者が多数存在することに鑑み、角膜移植技術に比較し、広汎な医療機関で適用できる汎用性と簡便性を持つ革新的医療の提供が、喫緊の課題として全世界で強く望まれている。加えて、細胞注入療法は、角膜移植に随伴する歪みを生じず角膜の正常な形状をもたらし、その結果、長期に亘り良好な視覚機能の回復をもたらす。

　本発明者らは、培養ヒト角膜内皮細胞が培養中の細胞の相転移（線維化、上皮間葉系移行、内皮間葉系移行、老化、脱分化等）により、健康な角膜内皮組織が保持する角膜内皮細胞とは形質を異にする細胞亜集団が夾雑することを世界において初めて見出し、培養中の亜集団を選択的に増殖する技術を考案することで、特定の亜集団、すなわち成熟分化ヒト角膜内皮細胞の機能を十分に有する機能性細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ（エフェクター）細胞とも称する。）が、細胞注入療法に最適な小型で六角形の敷石様形状を形成し、健康な角膜内皮組織が保持する角膜内皮細胞と類似の形質を有することを確認している。

　本開示においては、臨床治験において、早期臨床効果発現、および長期安定的臨床効果が確認された培養ヒト角膜内皮細胞を特定する細胞形質の検定技術を鋭意検討し、世界で初めて同技術の発明を達成した。新たに発明創出した技術に基づき、ミトコンドリア機能を種々の代謝関連酵素で規定することで早期臨床効果発現、および長期安定的臨床効果が担保される培養ヒト角膜内皮細胞を特定、提供する発明を完成させた。
　本開示は、世界で初めて、何時も同じ医療を提供するための絶対要件である安定的生産が可能で、全世界での広汎な適用を可能とするコスト的に格段に安価な製法により均質で小型で移植後高細胞密度角膜内皮組織を長期に亘り再構築する患者にやさしい画期的な医療を提供する。ミトコンドリア依存性の酸化的呼吸が亢進した培養ヒト角膜内皮細胞である。角膜移植においては拒絶応答の起こる患者にも有効であることが判明している。
　また本開示に係る製造法では、細胞質や核において働くＴＣＡ代謝経路に係る酵素による代謝産物、就中、アセチルコエンザイムＡ（ＡｃＣｏＡ）によるヒストンのアセチル化などのエピジェネティックな多遺伝子の活性化が回避されることで、培養細胞の相転移が起きず、代謝リプログラミングがミトコンドリア機能の保持に傾斜するという革新的な発明により、上述の夾雑亜集団細胞の生成が極小化され、汎く角膜内皮機能不全患者の角膜混濁や水和浮腫の改善に極めて長期的に有用な高機能内皮細胞が提供されるものである。

　したがって、本開示は以下を提供する。
（項目１）ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜機能を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞を製造する方法であって、
　（ｂ）角膜内皮前駆細胞を、増殖ストレスなど培養ストレスを極小化し得る培養条件下で増殖および／または分化・成熟させる工程
　を含む、方法。
（項目２）前記ヒト角膜機能は、角膜内皮細胞機能特性を含む、（項目１）に記載の方法。
（項目３）（ａ）ヒト角膜内皮組織由来細胞を脱分化させて前記角膜内皮前駆細胞を得る工程をさらに包含する、（項目１）または（項目２）に記載の方法。
（項目４）ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜機能、就中、角膜内皮細胞機能特性を惹起し得る機能性ヒト角膜内皮細胞を製造する方法であって、ヒト角膜内皮前駆細胞を形質転換が生じる量未満の細胞成長因子の存在下で増殖および／または分化・成熟させる（項目１）～（項目３）のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）前記細胞成長因子は上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む、（項目１）～（項目４）のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）前記形質転換は内皮間葉転換を含む、（項目１）～（項目５）のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）前記増殖および／または分化・成熟させる工程はＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行われる、（項目１）～（項目６）のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）（ｂ）で得られた細胞が、ミトコンドリアにおいてミトコンドリア依存性酸化的リン酸化が増加し、細胞質・核内のアセチルＣｏＡの発現が増加しないこと、並びにアセチルＣｏＡによるヒストンアセチル化を介するエピジェネティックな多遺伝子発現が惹起されていない細胞であることを確認する工程を含む、（項目１）～（項目６）のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）（ｂ）で得られた細胞が、ミトコンドリアにおいて、クエン酸シンターゼ（ＣＳ）、アコニターゼ２（ＡＣＯ２）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ２（ＭＤＨ２）、リンゴ酸酵素３（ＭＥ３）、ＡＣＳＳ１、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ１（ＡＣＡＴ１）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、ＢＣＡＴ２、及び分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ２（ＢＣＫＤＨ２）からなる群から選択される１または複数の代謝関連酵素が発現している細胞であることを確認する工程を含む、（項目１）～（項目８）のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）（ｂ）で得られた細胞が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬＹ）、アコニターゼ１（ＡＣＯ１）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１（ＭＤＨ１）、リンゴ酸酵素１（ＭＥ１）、ＡＣＳＳ２、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ２（ＡＣＡＴ２）、及び／または乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）が発現しない、もしくはほとんど発現しないことを確認する工程を含む、（項目１）～（項目９）のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０Ａ）（ｂ）で得られた細胞におけるＩＤＨ１および／またはＡＣＳＳ２の発現が、非ヒト機能性角膜内皮細胞と比較して減弱している、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０Ｂ）（ｂ）で得られた細胞において、ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬＹ）が発現しない、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０Ｃ）（ｂ）で得られた細胞におけるＩＤＨ２の発現が、非ヒト機能性角膜内皮細胞と比較して増強している、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）（ｂ）で得られた細胞が、角膜混濁や水和浮腫の改善、その結果、持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がるような角膜内皮（細胞）機能特性に繋がるイオンチャンネルおよび／または単カルボン酸輸送体の発現の認められることを確認する工程を含む、（項目１）～（項目１０）のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）（ｂ）で得られた細胞が、ナトリウム／水素交換体１（ＮＨＥ１）並びに／または、アクアポリン1（AQP-1）の発現が亢進していることを確認する工程を含む、（項目１）～（項目１１）のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）（ｂ）で得られた細胞が、重炭酸脱水酵素５Ｂ（ＣＡ５Ｂ）の発現が亢進していることを確認する工程を含む、（項目９）～（項目１０）のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）（ｂ）で得られた細胞が、ＴＣＡ回路などに係る代謝酵素やＡｃｅｔｙｌＣｏＡなどの代謝産物が夾雑相転移細胞の生成に繋がらないように細胞質や核には存在せずに、ミトコンドリアにオルガネラ選択的に局在する特性を有することを確認する工程を含む、（項目１）～（項目１２）のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）前記ヒト機能性角膜内皮細胞が、角膜内皮組織由来細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、角膜内皮から採取した角膜内皮前駆細胞、角膜内皮から採取した細胞、並びにダイレクトプログラミング法で作成される角膜内皮前駆細胞および角膜内皮様細胞からなる群から選択される細胞を起源として作製されたものである、（項目１）～（項目１４）のいずれか一項に記載の方法。

　また以下の発明も提供する。
（項目１６）ヒト機能性角膜内皮細胞であって、角膜混濁や水和浮腫の改善、その結果、持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がるような角膜内皮（細胞）機能特性に繋がる機能性蛋白の発現が認められるか、または当該角膜内皮（細胞）機能特性を阻害する蛋白が惹起されないまたは低下している、細胞。
（項目１７）前記細胞は、ヒト眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞であり、ミトコンドリアにおいて、クエン酸シンターゼ（ＣＳ）、アコニターゼ２（ＡＣＯ２）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ２（ＭＤＨ２）、リンゴ酸酵素３（ＭＥ３）、ＡＣＳＳ１、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ１（ＡＣＡＴ１）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、ＢＣＡＴ２、及び分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ２（ＢＣＫＤＨ２）からなる群から選択される１または複数の代謝関連酵素が発現している、（項目１６）に記載の細胞。
（項目１８）前記細胞は、ヒト眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞であり、ミトコンドリアにおいてミトコンドリア依存性酸化的リン酸化が増加し、または細胞質・核内のアセチルＣｏＡの発現が増加しないこと、並びにアセチルＣｏＡによるヒストンアセチル化を介するエピジェネティックな多遺伝子発現が惹起されていない群から選択される少なくとも１つを含む、（項目１６）または（項目１７）に記載の細胞。
（項目１９）前記細胞はヒト角膜内皮細胞であり、ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬＹ）、アコニターゼ１（ＡＣＯ１）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１（ＭＤＨ１）、リンゴ酸酵素１（ＭＥ１）、ＡＣＳＳ２、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ２（ＡＣＡＴ２）、及び／または乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）が発現しない、または実質的に発現しない、（項目１６）～（項目１８）のいずれか一項に記載の細胞。
（項目２０）前記ヒト機能性角膜内皮細胞において、ナトリウム／水素交換体１（ＮＨＥ１）並びに／または、アクアポリン１（ＡＱＰ－１）の発現が亢進している、（項目１６）～（項目１９）のいずれか一項に記載の細胞。
（項目２１）
　前記ヒト機能性角膜内皮細胞において、重炭酸脱水酵素５Ｂ（ＣＡ５Ｂ）の発現が亢進している、（項目１６）～（項目２０）のいずれか一項に記載の細胞。
（項目２２）前記ヒト機能性角膜内皮細胞が、（ｉ）ＴＣＡ回路などに係る代謝酵素やＡｃｅｔｙｌＣｏＡなどの代謝産物が夾雑相転移細胞の生成に繋がらないように細胞質や核には存在せずに、ミトコンドリアにオルガネラ選択的に局在する特性、（ｉｉ）ミトコンドリアにおけるミトコンドリア依存性酸化的リン酸化の増加、（ｉｉｉ）アセチルＣｏＡによるヒストンアセチル化を介するエピジェネティックな多遺伝子発現の低下（惹起無を含む）、（ｉＶ）ナトリウム／水素交換体１（ＮＨＥ１）および／またはアクアポリン１（ＡＱＰ－１）の発現の亢進、並びに（ｖ）重炭酸脱水酵素５Ｂ（ＣＡ５Ｂ）の発現の亢進からなる群から選択されるすべてを含む、（項目１６）～（項目２１）のいずれか一項に記載の細胞。
（項目２３）内皮間葉系移行が起きていない、または実質的に起きていない、（項目１６）～（項目２２）のいずれか一項に記載の細胞。
（項目２４）
　ヒト眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞であって、内皮間葉系移行が起きていない、または実質的に起きていない、細胞。
（項目２５）前記ヒト機能性角膜内皮細胞は、角膜内皮組織由来細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、角膜内皮から採取した角膜内皮前駆細胞、角膜内皮から採取した細胞、並びにダイレクトプログラミング法で作成される角膜内皮前駆細胞および角膜内皮様細胞からなる群から選択される細胞を起源として作成されたものである、（項目１６）～（項目２４）のいずれか一項に記載の細胞。
（項目２６）（項目１）～（項目１５）のいずれか一項に記載の方法によって製造された細胞および／または請求項１６～２５のいずれか一項に記載の細胞を含む細胞集団。
（項目２７）ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞の品質管理または工程管理の方法であって、前記細胞のミトコンドリアにおいて、クエン酸シンターゼ（ＣＳ）、アコニターゼ２（ＡＣＯ２）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ２（ＭＤＨ２）、リンゴ酸酵素３（ＭＥ３）、ＡＣＳＳ１、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ１（ＡＣＡＴ１）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、ＢＣＡＴ２、及び分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ２（ＢＣＫＤＨ２）からなる群から選択される１または複数の代謝関連酵素が発現していることを確認する工程を含む、方法。
（項目２８）
　前記細胞において細胞質・核内のアセチルＣｏＡの発現、およびアセチルＣｏＡによるヒストンアセチル化を介するエピジェネティックな多遺伝子発現が惹起されていないことを確認する工程をさらに含む、（項目２７）に記載の方法。
（項目２９）前記細胞において、ナトリウム／水素交換体１（ＮＨＥ１）および／またはアクアポリン１（ＡＱＰ－１）の発現が亢進していることを確認する工程をさらに含む、（項目２７）または（項目２８）のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
　前記細胞において、重炭酸脱水酵素５Ｂ（ＣＡ５Ｂ）の発現が亢進していることを確認する工程をさらに含む、（項目２７）～（項目２９）のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞の品質管理もしくは工程管理の方法、またはヒト機能性角膜内皮細胞に混在する角膜内皮非機能性細胞を検出する方法であって、以下：
（１）移植日の位相差画像による外観検査で、線維芽細胞、異物、変色、または他の異常なし
（２）移植日２週間前および／または移植日の細胞数が１．５×１０^６細胞／４５０μＬ（３）細胞生存率がトリパンブルー染色で８５％以上
（４）細胞上清のＥＬＩＳＡによる純度試験で、
　ＰＤＧＦ－ＢＢ：１００ｐｇ／ｍＬ以上
（５）移植日２週間前および／または移植日に採取された細胞上清のＦＡＣＳによる純度試験で、
　ＣＤ１６６^＋＞９９％
　ＣＤ２４^＋＜５％
　ＣＤ２６^＋＜５％
　ＣＤ２００^＋＜５％
　ＣＤ４４^ｈｉｇｈ＜５％
　ＣＤ４４^ｌｏｗ＞９０％
　ＣＤ１０５^－～weak＞９０％
　ＣＤ９０^＋＜５％
（６）エフェクター細胞（Ｅ－ｒａｔｉｏ）＞９０％
（７）移植日２日前のポンプ機能（Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ）：陽性
（８）移植日２日前のバリア機能（ＺＯ－１）：陽性
（９）ＢＳＡ陰性試験で１２５ｎｇ／μＬ未満
（１０）移植日のＥＣＤが１５００細胞／ｍｍ^２以上
（１１）ｍｉＲ１８４の発現
（１２）乳酸産生
（１３）細胞サイズが２５０μｍ未満
の１または複数の項目を確認する工程を含む、方法。
（項目３２）ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞の細胞集団であって、以下：
（１）移植日の位相差画像による外観検査で、線維芽細胞、異物、変色、または他の異常なし
（２）移植日２週間前および／または移植日の細胞数が１．５×１０^６細胞／４５０μＬ（３）細胞生存率がトリパンブルー染色で８５％以上
（４）細胞上清のＥＬＩＳＡによる純度試験で、
　ＰＤＧＦ－ＢＢ：１００ｐｇ／ｍＬ以上
（５）移植日２週間前および／または移植日に採取された細胞上清のＦＡＣＳによる純度試験で、
　ＣＤ１６６^＋＞９９％
　ＣＤ２４^＋＜５％
　ＣＤ２６^＋＜５％
　ＣＤ２００^＋＜５％
　ＣＤ４４^ｈｉｇｈ＜５％
　ＣＤ４４^ｌｏｗ＞９０％
　ＣＤ１０５^－～weak＞９０％
　ＣＤ９０^＋＜５％
（６）エフェクター細胞（Ｅ－ｒａｔｉｏ）＞９０％
（７）移植日２日前のポンプ機能（Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ）：陽性
（８）移植日２日前のバリア機能（ＺＯ－１）：陽性
（９）ＢＳＡ陰性試験で１２５ｎｇ／μＬ未満
（１０）移植日のＥＣＤが１５００細胞／ｍｍ^２以上
（１１）ｍｉＲ１８４の発現
（１２）乳酸産生
（１３）細胞サイズが２５０μｍ未満
の１または複数の項目を充足する、細胞集団。

　また以下の発明も提供する。
（医薬）
（項目Ａ１）ヒト機能性角膜内皮細胞を含む医薬であって、角膜混濁や水和浮腫の改善、その結果、持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がるような角膜内皮（細胞）機能特性に繋がる機能性蛋白の発現が認められるか、または当該角膜内皮（細胞）機能特性を阻害する蛋白が惹起されないまたは低下している、医薬。
（項目Ａ１２）前記細胞は、ヒト眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞であり、ミトコンドリアにおいて、クエン酸シンターゼ（ＣＳ）、アコニターゼ２（ＡＣＯ２）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ２（ＭＤＨ２）、リンゴ酸酵素３（ＭＥ３）、ＡＣＳＳ１、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ１（ＡＣＡＴ１）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、ＢＣＡＴ２、及び分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ２（ＢＣＫＤＨ２）からなる群から選択される１または複数の代謝関連酵素が発現している、（項目Ａ１）に記載の医薬。
（項目Ａ３）前記細胞は、ヒト眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞であり、ミトコンドリアにおいてミトコンドリア依存性酸化的リン酸化が増加し、または細胞質・核内のアセチルＣｏＡの発現が増加しないこと、並びにアセチルＣｏＡによるヒストンアセチル化を介するエピジェネティックな多遺伝子発現が惹起されていない群から選択される少なくとも１つを含む、（項目Ａ１）または（項目Ａ２）に記載の医薬。
（項目Ａ４）　前記細胞はヒト角膜内皮細胞であり、ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬＹ）、アコニターゼ１（ＡＣＯ１）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１（ＭＤＨ１）、リンゴ酸酵素１（ＭＥ１）、ＡＣＳＳ２、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ２（ＡＣＡＴ２）、及び／または乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）が発現しない、または実質的に発現しない、（項目Ａ１）～（項目Ａ３）のいずれか一項に記載の医薬。
（項目Ａ５）前記ヒト機能性角膜内皮細胞において、ナトリウム／水素交換体１（ＮＨＥ１）並びに／または、アクアポリン１（ＡＱＰ－１）の発現が亢進している、（項目Ａ１）～（項目Ａ４）のいずれか一項に記載の細胞。
（項目Ａ６）前記ヒト機能性角膜内皮細胞において、重炭酸脱水酵素５Ｂ（ＣＡ５Ｂ）の発現が亢進している、（項目Ａ１）～（項目Ａ５）のいずれか一項に記載の医薬。
（項目Ａ７）前記ヒト機能性角膜内皮細胞が、（ｉ）ＴＣＡ回路などに係る代謝酵素やＡｃｅｔｙｌＣｏＡなどの代謝産物が夾雑相転移細胞の生成に繋がらないように細胞質や核には存在せずに、ミトコンドリアにオルガネラ選択的に局在する特性、（ｉｉ）ミトコンドリアにおけるミトコンドリア依存性酸化的リン酸化の増加、（ｉｉｉ）アセチルＣｏＡによるヒストンアセチル化を介するエピジェネティックな多遺伝子発現の低下（惹起無を含む）、（ｉＶ）ナトリウム／水素交換体１（ＮＨＥ１）および／またはアクアポリン１（ＡＱＰ－１）の発現の亢進、並びに（ｖ）重炭酸脱水酵素５Ｂ（ＣＡ５Ｂ）の発現の亢進からなる群から選択されるすべてを含む、（項目Ａ１）～（項目Ａ６）のいずれか一項に記載の医薬。
（項目Ａ８）内皮間葉系移行が起きていない、または実質的に起きていない前記細胞を有する、（項目Ａ１）～（項目Ａ７）のいずれか一項に記載の医薬。
（項目Ａ９）ヒト眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞を有する医薬であって、前記細胞が、内皮間葉系移行が起きていない、または実質的に起きていない、医薬。
（項目Ａ１０）前記ヒト機能性角膜内皮細胞は、角膜内皮組織由来細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、角膜内皮から採取した角膜内皮前駆細胞、角膜内皮から採取した細胞、並びにダイレクトプログラミング法で作成される角膜内皮前駆細胞および角膜内皮様細胞からなる群から選択される細胞を起源として作成されたものである、（項目Ａ１）～（項目Ａ９）のいずれか一項に記載の医薬。
（項目Ａ１１）（項目１）～（項目１５）のいずれか一項に記載の方法によって製造された細胞および／または（項目１６）～（項目２５）のいずれか一項に記載の細胞を含む細胞集団を含む医薬。
（項目Ａ１２）ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞の細胞集団を含む医薬であって、前記細胞集団は、以下：
（１）移植日の位相差画像による外観検査で、線維芽細胞、異物、変色、または他の異常なし
（２）移植日２週間前および／または移植日の細胞数が１．５×１０^６細胞／４５０μＬ（３）細胞生存率がトリパンブルー染色で８５％以上
（４）細胞上清のＥＬＩＳＡによる純度試験で、
　ＰＤＧＦ－ＢＢ：１００ｐｇ／ｍＬ以上
（５）移植日２週間前および／または移植日に採取された細胞上清のＦＡＣＳによる純度試験で、
　ＣＤ１６６^＋＞９９％
　ＣＤ２４^＋＜５％
　ＣＤ２６^＋＜５％
　ＣＤ２００^＋＜５％
　ＣＤ４４^ｈｉｇｈ＜５％
　ＣＤ４４^ｌｏｗ＞９０％
　ＣＤ１０５^－～weak＞９０％
　ＣＤ９０^＋＜５％
（６）エフェクター細胞（Ｅ－ｒａｔｉｏ）＞９０％
（７）移植日２日前のポンプ機能（Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ）：陽性
（８）移植日２日前のバリア機能（ＺＯ－１）：陽性
（９）ＢＳＡ陰性試験で１２５ｎｇ／μＬ未満
（１０）移植日のＥＣＤが１５００細胞／ｍｍ^２以上
（１１）ｍｉＲ１８４の発現
（１２）乳酸産生
（１３）細胞サイズが２５０μｍ未満
の１または複数の項目を充足する、医薬。

　本開示において、上述した１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本開示のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解することにより、当業者に認識される。

図１は、ＣＤ４４を介するミトコンドリアのエネルギー代謝制御作用を表す概念図である。図２は、本開示の一実施形態に係る機能性ヒト角膜内皮細胞（規格細胞）における各種臨床効果の作用機序を示す概念図である。図３は、本開示の一実施形態に係る機能性ヒト角膜内皮細胞の製造方法を変更した場合に及ぼされる影響を調べた結果を示すグラフである。図４は、体性（幹）細胞からの脱分化経路による本開示の一実施形態に係る分化成熟・機能性ヒト角膜内皮細胞の誘導を示す概念図である。図５は、分化とＥＭＴを含む相転移を並行して起こさせた場合に生じる拮抗作用を示す概念図である。図６は、本開示の一実施形態において、本開示の機能性ヒト角膜内皮細胞を製造する際に添加するＥＧＦ濃度を非添加（－）、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、または５ｎｇ／ｍＬとした場合におけるＰ２での細胞写真である。図７は、本開示の一実施形態において、本開示の機能性ヒト角膜内皮細胞を製造する際に添加するＥＧＦ濃度を非添加（－）または０．５ｎｇ／ｍＬとした場合におけるＰ３でのＦＡＣＳ結果である。図８は、本開示の一実施形態において、本開示の機能性ヒト角膜内皮細胞を製造する際に添加するＥＧＦ濃度を１ｎｇ／ｍＬまたは５ｎｇ／ｍＬとした場合におけるＰ３でのＦＡＣＳ結果である。図９は、本開示の一実施形態において、本開示の機能性ヒト角膜内皮細胞を製造する際に添加するＥＧＦ濃度を非添加（－）または０．５ｎｇ／ｍＬとした場合におけるＰ４でのＦＡＣＳ結果である。図１０は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞を製造する際に添加するＥＧＦ濃度を１ｎｇ／ｍＬまたは５ｎｇ／ｍＬとした場合におけるＰ４でのＦＡＣＳ結果である。図１１は、本開示の一実施形態において、本開示の機能性ヒト角膜内皮細胞を製造する際に初代培養時からＥＧＦを添加した場合の効果を調べるために、Ｐ０で非添加（－）または０．５ｎｇ／ｍＬとした場合のＦＡＣＳ結果である。図１２は、本開示の一実施形態において、本開示の機能性ヒト角膜内皮細胞を製造する際に初代培養時からＥＧＦを添加した場合の効果を調べるために、Ｐ０で非添加（－）、かつＰ１で非添加（－）または０．５ｎｇ／ｍＬとした場合のＦＡＣＳ結果である。図１３は、本開示の一実施形態において、本開示の機能性ヒト角膜内皮細胞を製造する際に初代培養時からＥＧＦを添加した場合の効果を調べるために、Ｐ０で０．５ｎｇ／ｍＬ、かつＰ１で非添加（－）または０．５ｎｇ／ｍＬとした場合のＦＡＣＳ結果である。図１４は、本開示の一実施形態において、本開示の機能性ヒト角膜内皮細胞を製造する際に初代培養時からＥＧＦを添加した場合の効果を調べるために、Ｐ０で非添加（－）、かつＰ２で非添加（－）または０．５ｎｇ／ｍＬとした場合のＦＡＣＳ結果である。図１５は、ｍｉＲ３７８、ｍｉＲ１４６、ｍｉＲ３４、ｍｉＲ１８４の細胞内での遺伝子変動を測定するための場合分けを示す模式図である。図１６は、ＥＧＦありなし、及びＹ２７６３２ありなしのそれぞれの場合でのＦＡＣＳ測定および写真評価結果を示す表である。図１７は、ＥＧＦありなし、及びＹありなしの場合のｍｉＲ１８４遺伝子発現変動の結果を示すグラフである。図１８は、ＥＧＦありなし、及びＹありなしの場合のｍｉＲ３４ａ－５ｐ遺伝子発現変動の結果を示すグラフである。図１９は、代謝産物の階層性の例を示す模式図である。図２０は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞（目的細胞）と、そうではない細胞（非目的細胞）との代謝産物特性を確認した結果を示すグラフである。図２１は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞（目的細胞）と、そうではない細胞（非目的細胞）との代謝産物特性を確認した結果を示すグラフである。図２２は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞（目的細胞）と、そうではない細胞（非目的細胞）との代謝産物特性を確認した結果を示すグラフである。図２３は、本開示の一実施形態において、各種添加物の効果を試験するための各培養条件を示す表である。図２４は、図２３の条件１および２でのＣＴ０９　Ｐ５の細胞写真である。図２５は、図２３の条件３および４でのＣＴ０９　Ｐ５の細胞写真である。図２６は、図２３の条件５でのＣＴ０９　Ｐ５の細胞写真である。図２７は、図２３の条件１および２でのＦＡＣＳ結果である。図２８は、図２３の条件３および４でのＦＡＣＳ結果である。図２９は、図２３の条件５でのＦＡＣＳ結果である。図３０は、ＥＬＩＳＡ　ＰＤＧＦ－ｂｂおよびＩＬ－８のＣＴ０９　Ｐ４およびＰ５の培養上清・サンプルリストである。図３１は、本開示の一実施形態において、ＰＤＧＦ－ｂｂを添加物で分類した結果を示すグラフである。図３２は、本開示の一実施形態において、ＰＤＧＦ－ｂｂを週で分類した結果を示すグラフである。図３３は、本開示の一実施形態において、ＩＬ－８を添加物で分類した結果を示すグラフである。図３４は、本開示の一実施形態において、ＩＬ－８を週で分類した結果を示すグラフである。図３５は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞におけるミトコンドリア呼吸能を調べた結果である。図３６は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞におけるミトコンドリア呼吸能を調べた結果である。図３７は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞におけるミトコンドリア呼吸能を調べた結果である。図３８は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞に対するＲＯＣＫ阻害剤の添加の影響を調べるためのドナー情報を示す表である。図３９は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞に対するＲＯＣＫ阻害剤の添加の影響を調べるための培養条件を示す表である。図４０は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞に対するＲＯＣＫ阻害剤の添加の影響を調べるための添加物と上清回収の時期を示す表である。図４１は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞に対するＲＯＣＫ阻害剤の添加の影響を調べたＦＡＣＳ結果をまとめた表である。図４２は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞に対するＲＯＣＫ阻害剤の添加の影響を調べた細胞写真である。図４３は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞に対するＲＯＣＫ阻害剤の添加の影響を調べたＦＡＣＳ結果である。図４４は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞に対するＲＯＣＫ阻害剤の添加の影響を調べたＦＡＣＳ結果である。図４５は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞に対するＲＯＣＫ阻害剤の添加の影響を調べたＦＡＣＳ結果である。図４６は、本開示の一実施形態における＃１９０７１９の培養上清中のＥＬＩＳＡ　ＰＤＧＦ－ｂｂ測定結果（項目ごと）を示すグラフである。図４７は、本開示の一実施形態における＃１９０３１８の培養上清中のＥＬＩＳＡ　ＰＤＧＦ－ｂｂ測定結果（項目ごと）を示すグラフである。図４８は、本開示の一実施形態における＃１９０７１９の培養上清中のＥＬＩＳＡ　ＰＤＧＦ－ｂｂ測定結果（週ごと）を示すグラフである。図４９は、本開示の一実施形態における＃１９０３１８の培養上清中のＥＬＩＳＡ　ＰＤＧＦ－ｂｂ測定結果（週ごと）を示すグラフである。図５０は、本開示の一実施形態における＃１９０７１９の培養上清中のＥＬＩＳＡ　ＩＬ－８測定結果（週ごと）を示すグラフである。図５１は、本開示の一実施形態における＃１９０３１８の培養上清中のＥＬＩＳＡ　ＩＬ－８測定結果（週ごと）を示すグラフである。図５２は、本開示の一実施形態における＃１９０８０２の培養上清中のＥＬＩＳＡ　ＰＤＧＦ－ｂｂおよびＩＬ－８測定結果（項目ごと）を示すグラフである。図５３は、＃１９０３１８の培養上清中のサイトカイン測定（Ｂｉｏ　Ｐｌｅｘ）の結果（項目ごと）を示すグラフである。図５４は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞に対するＲＯＣＫ阻害剤の添加の影響を調べるための添加物の条件を示す表である。図５５は、本開示の一実施形態における＃１９０７１９のＲＯＣＫ阻害剤のありなしでのＰ４での細胞写真である。図５６は、本開示の一実施形態における＃１９０７１９のＲＯＣＫ阻害剤のありなしでのＰ４でのＦＡＣＳ結果である。図５７は、本開示の一実施形態における＃１９０７１９のＲＯＣＫ阻害剤のありなしでのＰ４でのＦＡＣＳ結果である。図５８は、本開示の一実施形態におけるＥＬＩＳＡでのＰＤＧＦ－ｂｂおよびＩＬ－８の項目ごとの結果を示すグラフである。図５９は、本開示の一実施形態におけるＥＬＩＳＡでのＰＤＧＦ－ｂｂおよびＩＬ－８の週ごとの結果を示すグラフである。図６０は、本開示の一実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤による接着増強が本開示の細胞製造に関係するかどうかを調べた結果の細胞写真である。図６１は、本開示の一実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤による接着増強が本開示の細胞製造に関係するかどうかを調べた結果の細胞写真である。図６２は、本開示の一実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤による接着増強が本開示の細胞製造に関係するかどうかを調べた結果の細胞写真である。図６３は、本開示の一実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤による接着増強が本開示の細胞製造に関係するかどうかを調べた結果の細胞写真である。図６４は、代謝産物によるEpigenetics制御と細胞老化や細胞分化の破綻について表した模式図である。図６５は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞（分化成熟細胞）において発現する酵素リストである。図６６は、本開示の一実施形態におけるＤＡＶＩＤ解析のためのＨＣＥＣの培養条件を示す模式図である。図６７は、本開示の一実施形態におけるＤＡＶＩＤ解析のためのＨＣＥＣのＰ１でのＦＡＣＳ結果である。図６８は、本開示の一実施形態におけるＤＡＶＩＤ解析のためのＨＣＥＣのＰ４でのＦＡＣＳ結果である。図６９は、本開示の一実施形態におけるＤＡＶＩＤ解析のためのＨＣＥＣのＰ４での細胞写真である。図７０は、本開示の一実施形態におけるプロテオミクスのＤＡＶＩＤ解析のための手順である。図７１は、本開示の一実施形態における３群解析の結果である。図７２は、本開示の一実施形態におけるＧＯＴＥＲＭ解析の結果である。図７３は、本開示の一実施形態におけるＤＡＶＩＤ解析後のミトコンドリアに関する比較結果を示す表である。図７４は、本開示の一実施形態におけるＤＡＶＩＤ解析後のミトコンドリアに関する比較のクラスタリング結果を示す表である。図７５は、本開示の一実施形態におけるＤＡＶＩＤ解析後のミトコンドリアに関する比較のクラスタリング結果を示す表である。図７６は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞（規格細胞）と非規格細胞との代謝経路に係る酵素や基質のタンパク発現強度を比較した模式図である。図７７は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞（規格細胞）と非規格細胞との代謝経路に係る酵素や基質のタンパク発現強度を比較した模式図である。図７８は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞（規格細胞）と非規格細胞との代謝経路に係る酵素や基質のタンパク発現強度を比較した模式図である。図７９は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞（規格細胞）と非規格細胞との代謝経路に係る酵素や基質のタンパク発現強度を比較した模式図である。図８０は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞（規格細胞）と非規格細胞との代謝経路に係る酵素や基質のタンパク発現強度を比較した模式図である。図８１は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞（規格細胞）と非規格細胞との代謝経路に係る酵素や基質のタンパク発現強度を比較した模式図である。図８２は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞（規格細胞）と非規格細胞との代謝経路に係る酵素や基質のタンパク発現強度を比較した模式図である。図８３は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞（規格細胞）と非規格細胞との代謝経路に係る酵素や基質のタンパク発現強度を比較した模式図である。図８４は、本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞（規格細胞）と非規格細胞との代謝経路に係る酵素や基質のタンパク発現強度を比較するために用いた抗原リストである。図８５は、本開示の一実施形態において、イオンチャンネル　単カルボン酸輸送体系を調べるための細胞染色結果を示す写真である。図８６は、本開示の一実施形態において、イオンチャンネル　単カルボン酸輸送体系を調べるための細胞染色結果を示す写真である。図８７は、本開示の一実施形態において、イオンチャンネル　単カルボン酸輸送体系を調べるための細胞染色結果を示す写真である。図８８は、本開示の一実施形態において、イオンチャンネル　単カルボン酸輸送体系を調べるための細胞染色結果を示す写真である。図８９は、本開示の一実施形態における＃１９０７１９（規格細胞）のＰ２でのＦＡＣＳ結果と細胞内ｐＨを示すグラフである。図９０は、本開示の一実施形態における＃１９０７１９（規格細胞）のＰ２での細胞写真である。図９１は、本開示の一実施形態における＃１９０８０２（非規格細胞）のＰ３でのＦＡＣＳ結果と細胞内ｐＨを示すグラフである。図９２は、本開示の一実施形態における＃１９０８０２（非規格細胞）のＰ３での細胞写真である。図９３は、本開示の一実施形態において、＃１９０７１９（規格細胞）と＃１９０８０２（非規格細胞）との細胞内ｐＨを比較した結果を示すグラフである。図９４は、本開示の一実施形態において、添加物の効果を調べた結果を示すＦＡＣＳと細胞写真である。図９５は、本開示の一実施形態において、添加物の効果を調べるための培養条件を示す模式図である。図９６は、本開示の一実施形態において、各培養条件での細胞でのＦＡＣＳ結果である。図９７は、本開示の一実施形態において、各培養条件での細胞でのＦＡＣＳ結果である。図９８は、本開示の一実施形態において、各培養条件での細胞でのＦＡＣＳ結果である。図９９は、本開示の一実施形態において、各培養条件での細胞におけるサイトカイン測定結果を示すグラフである。図１００は、各培養条件での細胞におけるサイトカイン測定結果を示すグラフである。図１０１は、ミトコンドリアの酸化的リン酸化呼吸の亢進を説明する模式図である。図１０２は、本開示の一実施形態におけるミトンドリアの酸化的リン酸化呼吸の亢進を示すグラフである。図１０３は、ミトコンドリアの酸化的リン酸化呼吸の亢進と臨床の薬理効果との関連性を示す模式図である。図１０４は、体性（幹）細胞からの脱分化経路による分化成熟・機能性ヒト角膜内皮細胞の誘導を示す模式図である。図１０５は、細胞内ｐＨによりミトコンドリア機能が左右され、細胞の分化・脱分化状態が規定されることを説明する概念図である。図１０６は、本開示の一実施形態における＃ＣＲ０４（規格細胞）のＰ３でのＦＡＣＳ結果とその写真である。図１０７は、本開示の一実施形態において、イオンチャンネルの選択的発現を細胞の免疫染色によって確認した結果である。図１０８は、本開示の一実施形態において、非規格細胞におけるヒストンのアセチル化亢進を示す結果である。図１０９は、本開示の一実施形態において、規格細胞と非規格細胞とにおける免疫ブロッティングの結果である。図１１０は、本開示の一実施形態における＃１９１２２４Ｓ（規格細胞）のＰ４でのＦＡＣＳ結果とその写真である。図１１１は、本開示の一実施形態における＃２００３１３（非規格細胞）のＰ１でのＦＡＣＳ結果とその写真である。図１１２は、本開示の一実施形態における＃１９１２２４Ｓ（規格細胞）のＰ４でのＦＡＣＳ結果とその写真である。図１１３は、本開示の一実施形態における＃１９１２２４Ｓ（規格細胞）のＰ４でのＦＡＣＳ結果とその写真である。図１１４は、本開示の一実施形態におけるＨＡＴ／ＨＤＡＣ活性の測定結果を示すグラフである。

　以下、本開示の実施の形態について詳細に説明する。なお、同様な内容については繰り返しの煩雑を避けるために、適宜説明を省略する。また、本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「a」、「an」、「the」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。従って、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

　最初に本開示において使用される用語および一般的な技術を説明する。

　本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。

　本明細書において「角膜内皮」および「ヒト角膜内皮」は、当該分野で用いられる通常の意味で用いられる。角膜とは、眼を構成する層状の組織の一つであり透明であり、最も外界に近い部分に位置する。角膜は、ヒトでは外側（体表面）から順に５層でできているとされ、外側から角膜上皮、ボーマン膜（外境界線）、固有層、デスメ膜（内境界線）、および角膜内皮で構成される。特に、特定しない限り、上皮および内皮以外の部分は「角膜実質」とまとめて称することがあり、本明細書でもそのように称する。

　本明細書では、角膜内皮組織に由来する細胞を「角膜内皮組織由来細胞」という。また、分化することで、角膜内皮細胞になる細胞を総括して「角膜内皮前駆細胞」という。

　本明細書において「ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜機能を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞」とは、ヒトの眼前房内に注入した際に、ヒト角膜機能（ヒトについていう場合は「ヒトヒト角膜機能」といい、特に制限するものではないが、本明細書において単に「ヒト角膜機能」という）を惹起する能力を有する、角膜の機能を惹起する能力を有する細胞である。「ヒト角膜機能を惹起し得る」とは、角膜内皮機能特性を惹起し得る（例えば、角膜混濁や水和浮腫の改善その結果持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がるような効能を有する等）を包含し得る。

　本明細書において「ヒトの眼前房内への注入時に角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞」とは、ヒトの眼前房内に注入した際に、角膜内皮機能特性（ヒトについていう場合は「ヒト角膜内皮機能特性」といい、特に制限するものではないが、本明細書において単に「角膜内皮機能特性」という）を発現する能力を有する、角膜内皮の機能性を有する細胞である。代表的な機能としては、角膜混濁や水和浮腫の改善その結果持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がるような効能を有するものを示す。特に省略していう場合は「本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞」ともいう。ヒト細胞についていうときは、「ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞」という。本開示はおもにヒトの角膜細胞に関連するものであることから、特に断らない限りヒト細胞をいうことが理解される。本明細書において、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞は、そのままの状態で角膜内皮機能特性を有する「機能性成熟分化角膜内皮細胞」および機能を一部欠くものの同様に使用されまたは注入後に機能性成熟分化角膜内皮細胞と同等の機能を発揮する「中程度分化角膜内皮細胞」を包含する。

　本明細書において「角膜内皮（細胞）機能特性」とは、角膜内皮組織に存在する角膜内皮細胞が正常な状態で有する視機能保持に有用な（細胞）機能特性をいう。なお、本明細書において、角膜内皮細胞機能特性と、角膜内皮機能特性とは、同じ意義を有し、invitroの議論においては多くの場合において前者を示す。

　本明細書において「機能性成熟分化角膜内皮細胞」とは、健常なヒト角膜内皮組織に存在する成熟分化角膜内皮細胞およびその機能（代表的には、上記角膜内皮（細胞）機能特性）を有する任意の細胞を指し、ヒトの細胞の場合、機能性成熟分化ヒト角膜内皮細胞という。特に、角膜内（細胞）皮機能特性は、小型で六角形の敷石様形状を形成しミトコンドリア機能によるエネルギー代謝系を利用すること、並びに、角膜混濁や水和浮腫の改善その結果持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がるような形質を保持することで確認され、注入したとき（例えば、ヒトの眼前房内に）に、治療効果を有し得るかどうかで判定をすることができるが、それに限定されず、角膜内皮機能特性は、サロゲートマーカーを指標に判定することもできる。そのようなサロゲートマーカーとしては、（１）内皮ポンプ・バリア機能の保持、（Ｃｌａｕｄｉｎ発現を含む）（２）特定のラミニンに対する接着・結合性、（３）分泌サイトカインプロファイル、（４）産生するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）プロファイル、（５）産生する代謝産物プロファイル、（６）角膜混濁や水和浮腫の改善その結果持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がるような上述の角膜内皮（細胞）機能特性に繋がるイオンチャンネル、単カルボン酸輸送体の発現、（７）相転移細胞の生成に繋がるＴＣＡ回路などに係る代謝酵素が細胞質や核には存在せずに、ミトコンドリアにオルガネラ選択的に局在する特性、（８）インビトロ培養時の飽和細胞密度、（９）培養時に得られる細胞の空間的大きさやその分布、（１０）マウス角膜に対する液体窒素低温凍結損傷後に細胞注入した場合の細胞維持の１０種類のいずれかもしくはその組み合わせで判定することもできる。

　（１）内皮ポンプ・バリア機能の保持の判定は、例えば、角膜内皮に通常使用されるポンプ機能測定法、バリア機能測定法を用いて判定することができる。このような判定は、シート形態の場合に利用されるＵssing　chamberを用いて　Wigham　C,　Hodson　S.　:　Current　Eye　Research,　1,　37-41,1981、Hodson　S,　Wigham　C.　:　J　Physiol.,　342:409-419,1983、Hatou　S.,　Yamada　M.,　Akune　Y.,　　Mochizuki　H.,　Shiraishi　A.,　Joko　T.,　Nishida　T.,　Tsubota　K.　:Investigative　Ophthlmology　&　Visual　Science,　51,　3935-3942,　2010に記載の方法を応用した技術が挙げられる。Claudin発現は、当該分野で公知の手法、例えば、免疫学的手法を用いて確認することができるClaudin発現は当該分野で公知の任意の免疫学的手法を用いて確認することができる。ただし、本開示の細胞は、懸濁液中で注入されることが想定されることから、その場合、好ましくは、Claudin発現または（２）～（１０）のいずれかまたはその組み合わせを応用して角膜内皮機能を評価することができる。

　（２）特定のラミニンに対する接着・結合性に関する判定には、ラミニン５１１（α５鎖、β１鎖、γ鎖１の複合体）、ラミニン５２１（α５鎖、β２鎖、γ鎖１の複合体）またはその機能性フラグメント（例えば、ラミニン５１１－Ｅ８フラグメント）に対する接着性および/またはこれに対するインテグリン（例えば、α３β１、α６β１等）の発現の上昇を指標に判定することができる。そのような手法は細胞接着アッセイによって実施することができる。

　ここで、ラミニンα鎖について、「α５鎖」（ＬＡＭＡ５）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＡ５；ＫＩＡＡ１９０７などと称する。ヒトＬＡＭＡ５は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_005560およびNP_005551に登録されている。OMIMは601033とのアクセッション番号で同定される。ラミニンβ鎖について、「β１鎖」（ＬＡＭＢ１）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質・ラミニンのサブユニットの１つであり、ＬＡＭＢ１；ＣＬＭ；ＬＩＳ５などと称する。ヒトＬＡＭＢ１は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_002291およびNP_002282に登録されている。ＯＭＩＭは150240とのアクセッション番号で同定される。また、「β２鎖」（ＬＡＭＢ２）(laminin　S)とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質（ラミニン）のサブユニットの１つであり、ＬＡＭＢ２；ＬＡＭＳ；ＮＰＨＳ５などと称する。ヒトＬＡＭＢ２は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_002292およびNP_002283に登録されている。ＯＭＩＭは150325とのアクセッション番号で同定される。ラミニンγ鎖について、「γ１鎖」（ＬＡＭＣ１）とは、細胞外マトリックスにある細胞接着分子のタンパク質（ラミニン）のサブユニットの１つであり、ＬＡＭＣ１；ＬＡＭＢ２などと称する。ヒトＬＡＭＣ１は、それぞれ遺伝子およびタンパク質の配列がNCBI登録番号のNM_002293およびNP_002284に登録されている。OMIMは150290とのアクセッション番号で同定される。

　（３）分泌サイトカインプロファイルの判定は、本明細書において別の箇所において説明される「血清」または「前房水」のサイトカインプロファイルの産生レベルを測定することで実施することができる。このようなサイトカインにはＲＡＮＴＥＳ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＩＰ－１０、ＭＩＰ－１ｂ、ＶＥＧＦ、ＥＯＴＡＸＩＮ、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－０、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＦＧＦｂａｓｉｃ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＩ、ＩＦＮ－γ、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１ａ、ＴＮＦ－α等が含まれるがそれらに限定されない。具体的には、サイトカインの統合解析のためのＢｉｏ－Ｐｌｅｘ等のサイトカイン測定キットおよび解析システムを用いて解析することができる。

　（４）産生するマイクロRNA(miRNA)プロファイルの判定は、本明細書において別の箇所において説明される「ｍｉＲＮＡプロファイル」の解析手法を用いて測定することができる。例えば、マイクロＲＮＡ発現プロファイルの分析方法を用いて実現することができ、例えば、Ｔｏｒａｙの「３Ｄ－Ｇｅｎｅ」ヒトｍｉＲＮＡオリゴチップ（ｍｉＲＢａｓｅ　ｖｅｒｓｉｏｎ　１７）を用いて実施することができる。組織および細胞の両方の試料から取得した全ＲＮＡを、例えば、ｍｉＲＣＵＲＹ　ＬＮＡ（登録商標）ｍｉｃｒｏＲＮＡ　Ｐｏｗｅｒ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔｓ　（Ｅｘｉｑｏｎ，　Ｖｅｄｂａｅｋ，　Ｄｅｎｍａｒｋ）などのキットを使用してＨｙ５等の標識で標識したものと、上清から取得した全ｍｉＲＮＡを標識したものとを調製する。標識したマイクロＲＮＡを、別々にマイクロＲＮＡチップの表面にハイブリダイズさせ、適切な条件（例えば、１６時間３２°Ｃで）インキュベートする。このマイクロＲＮＡチップを、オゾンを含まない環境において洗浄および乾燥した後、３Ｄ－Ｇｅｎｅ　ｓｃａｎｎｅｒ　３０００　（Ｔｏｒａｙ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．，　Ｔｏｋｙｏ，　ＪＡＰＡＮ）のようなスキャナを使用してスキャンを行い、３Ｄ－Ｇｅｎｅ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　（Ｔｏｒａｙ）を使用して解析することができる。

　（５）産生する代謝産物プロファイルは、例えば、細胞内代謝物の代謝抽出物を、Internal　Standard　Solution　(Human　Metabolome　Technologies;　HMT,　Inc.,　Tsuruoka,　Japan)などの内部標準試薬を含有するメタノールを有するｃHCEC培養容器から調製する。培地を置換し、細胞抽出物を処理し、CE-MS分析を行い代謝物を解析する。メタボローム解析は、Soga,　et　al.　(Soga,　D.　et　al.,　T.　Soga,　et　al.,　Anal.Chem.　2002;　74:　2233-2239　Anal.Chem.　2000;　72:　1236-1241;　T.　Soga,　et　al.,　J.　Proteome　Res.　2003;　2:　488-494)によって開発された方法に従って、測定することができ、適宜自動統合ソフトウェア　(それぞれMasterHands,　Keio　University,　Tsuruoka,　Japan　(M.　Sugimoto,　et　al.,　Metabolomics,　2009;　6:　78-95)　および　MassHunter　Quantitative　Analysis　B.04.00,　Agilent　Technologies,　Santa　Clara,　CA,　USA)を用いて解析する。CEにおけるMTおよびTOFMSによって測定されたm/z　値に基いて、HMT代謝物データベースから、仮定的な代謝物によってピークをアノテーションし、標準化して計算する。階層クラスター分析（ＨＣＡ）および主成分分析（ＰＣＡ）を行い、メタボローム測定を行うことができる。

　（６）角膜混濁や水和浮腫の改善その結果持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がるような上述の角膜内皮（細胞）機能特性に繋がるイオンチャンネル、単カルボン酸輸送体の発現は、本明細書に記載されるかまたは公知の任意の手法を用いて測定することができる。例えば、実施例に記載されるように、角膜組織から得られた細胞を、固定し、特異的抗体を用いて免染することで、蛍光顕微鏡等で観察することで、測定することができる。このほか、イオンチャネルや単カルボン酸輸送体の機能を測定することで、これらの発現を測定することもできる。

　（７）相転移細胞の生成に繋がるＴＣＡ回路などに係る代謝酵素が細胞質や核には存在せずに、ミトコンドリアにオルガネラ選択的に局在する特性もまた、本明細書に記載されるかまたは公知の任意の手法を用いて測定することができる。例えば、ＤＡＶＩＤ解析などを応用して、ミトコンドリアにオルガネラ選択的に代謝酵素が局在することを観察することができるが、これに限定されない。

　（８）インビトロ培養時の飽和細胞密度は、本明細書に記載される適宜の培養条件を用いて、細胞密度を測定することで判定することができ、細胞の大きさと並行して測定されることもあり、倒立顕微鏡システム(例えば、CKX41,　Olympus,Tokyo,　Japan)によって、BZ　X-700顕微鏡システム(Keyence,　Osaka,　Japan)等の画像取得システムを含む機器を用いて撮影位相差顕微鏡画像を取得し、細胞計数ソフトウェア（例えば、BZ-H3C　Hybrid細胞計数ソフトウェア(Keyence)）等を用いて定量することができる。本開示において好ましい飽和細胞密度は本明細書の他の箇所に記載されている。

　（９）培養時に得られる細胞の空間的大きさやその分布は、本明細書に記載される適宜の培養条件を用いて、細胞の写真を撮影し任意のソフトウェア等で測定したりして、細胞の空間的大きさやその分布を測定することで判定することができ、BZ-H3C　Hybrid細胞計数ソフトウェア(Keyence)等の粗画像処理ソフトウェアによって実現することができる。本開示において好ましい細胞の空間的大きさやその分布は本明細書の他の箇所に記載されている。

　（１０）マウス角膜に対する液体窒素低温凍結損傷後に細胞注入した場合の細胞維持の判定は、マウスモデルを作製することにより実施することができる。具体的には、適切なマウス（例えば、BALB/c）の角膜の中央領域（例えば、２ｍｍ）を低温損傷により前処理し内皮細胞を取り除いてモデルを作製する。そしてそのモデルの眼前房に、判定すべき細胞を注入し、角膜透明性の特徴を臨床的に観察し、角膜の厚さをパキメータにより評価し、ＨＣＥＣの接着をヒト核染色により病理組織学的に検査してその細胞が機能を有するかどうかを確認する。

　角膜内皮組織に由来（角膜内皮組織の脱分化で得られる細胞も含む）したものではない細胞（例えば、幹細胞（例えば、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等から角膜内皮前駆細胞、角膜内皮細胞への成熟分化をさせて生産した細胞）は、本開示に記述する角膜内皮機能特性を有する限りにおいて本開示のヒトの眼前房内への注入時に角膜内皮機能特性を惹起し得る機能性角膜内皮細胞または機能性成熟分化角膜内皮細胞の範囲に入る。本明細書において示される説明や実験においては、本開示のヒト機能性成熟分化角膜内皮細胞は、「ヒト機能性成熟分化角膜内皮細胞」、「機能性成熟分化ヒト角膜内皮細胞」、「機能性細胞」、「目的細胞」、「規格細胞」等とも称されることがあるが、いずれも同義で使用される。

　本明細書において、「角膜内皮非機能性細胞」とは、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞（すなわち、「機能性成熟分化角膜内皮細胞」以外の細胞であり、「非目的細胞」、「不合格細胞」、「目的外細胞」、「非機能性細胞」、「非規格細胞」などと称することがある。

　本明細書において、「細胞指標」とは、ある細胞が、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞、（例えば機能性成熟分化角膜内皮細胞）であることを示す任意の指標をいい、成熟分化ヒト角膜内皮およびその機能を有する任意の細胞の有する特性であるため、「機能性細胞指標」ともいう。その具体的な特性は「細胞機能特性」ともいう。

　本明細書において「培養ストレスを極小化し得る培養条件」とは、増殖ストレスなどの細胞に係る培養時のストレスが、最小化（極小化）し得る任意の培養条件をいう。「培養ストレス」は、位相差顕微鏡による観察で相転移を生じた大型で異形の細胞の混在が５～２０％以上認められるか、ならびに、もしくは、培養３０日目以降４０日目までの細胞密度が１０００個・ｍｍ^２水準を下回るか否かを指標に測定することができ、あるドナーについて予備的実験でその指標で培養ストレスが極小化され得ることが判明したならば、その条件を実際の細胞の調製及び投与の際に適用することができる。このような培養条件は、例えば、細胞成長因子、例えば、上皮成長因子の量を形質転換が生じる量未満にして培養することで達成することができるが、これに限定されない。この量はドナーの年齢によっても、また細胞播種時の細胞密度によっても成長因子の添加濃度などによって変動し得るが、当業者は、入手し得る種々の情報や、ドナーの情報等を考慮し、このような条件（例えば、量等）を確定することができる。

　本明細書において「形質転換」とは、細胞の形質が正常ではない状態に変化することをいい、正常細胞が無制限に分裂を行うようになる、つまりがん化の意味、または化生の中で特にダイナミックなもの（幹細胞まで脱分化したり組織の基本形の壁を越えて変化したりするもの）の意味を含む。形質転換の例としては、ＥＭＴ，線維化、上皮間葉系移行、老化、脱分化、内皮間葉系移行等のような細胞状態相転移(CST)を挙げることができる。角膜内皮細胞は、しばしば上皮間葉相転移のような形質転換を起こし、機能性成熟分化角膜内皮細胞でなくなることが多い。あるいは、形質転換は、内皮間葉系移行を含む。本開示の製造方法には、このような上皮間葉系移行または内皮間葉系移行の生じた細胞でも、脱分化後、成熟分化させることで、機能性成熟分化角膜内皮細胞に変換させることができる製造法を含む。

　本明細書において「形質転換が生じる量未満」とは、細胞成長因子などについて言及するとき、対象となる角膜内皮細胞の形質転換（例えば、内皮間葉系移行）が生じる量より少ないまたは全くない量をいう。形質転換が生じる量未満の細胞成長因子を使用する場合、増殖ストレスによる内皮間葉系移行を含む形質転換を惹起しないことが特徴である。例えば、細胞成長因子としてＥＧＦを用いる場合には、形質転換が生じる量未満の量としては、約１ｎｇ／ｍＬ未満、好ましくは約０．５ｎｇ／ｍＬ未満、さらに好ましくは０ｎｇ／ｍＬである。

　本明細書において「内皮間葉系移行」（EndMT）とは、内皮細胞が間葉系細胞へと形質転換することをいう。

　本明細書では、「上皮間葉相転移」（ＥＭＴ；上皮間葉転換ともいう）とは、上皮細胞がその細胞極性や周囲細胞との細胞接着機能を失い、遊走、浸潤能を得ることで間葉系様の細胞へと変化するプロセスをいう。

　本明細書において「細胞成長因子」とは、動物の体内において、特定の細胞の成長、増殖を促すタンパク質の総称であり、「増殖因子」、「細胞増殖因子」と時に同義である。上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦなど）が挙げられる。本開示では、培養中に細胞に増殖ストレスと呼称される細胞ストレスを与える成長因子を加えないことが特徴のひとつであり得る。添加濃度、添加時間、添加時期によりストレスの強度は変動する。

　ここで、本明細書において使用され得る各種試料や製造方法における出発細胞としては、機能性成熟分化角膜内皮細胞または目的とする細胞またはそれに由来する物質であって遺伝子発現を可能にするものを含むと考えられる試料であればよく、例えば、角膜内皮から直接単離した細胞（角膜内皮組織由来細胞ともいう）あるいは分化することで角膜内皮様の機能を有するようになった細胞を用いることができる。角膜内皮組織由来細胞は公知の方法により取得することができる（Koizumi　N,　Okumura　N,　Kinoshita　S.,　Experimental　Eye　Research.　2012;95:60-7.）。好ましくは、角膜内皮のドナーから得ら
れた細胞等を細胞試料として用いることができる。また、インビトロで分化誘導された、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞または機能性成熟分化角膜内皮細胞を含む培養細胞を試料として用いることができる。インビトロにおける本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞または機能性成熟分化角膜内皮細胞への分化誘導は、公知のＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、骨髄間質細胞等の細胞を出発材料として、公知の方法、例えば、AMED法等による分化させる＜Ueno　M,　Matsumura　M,　Watanabe　K,　Nakamura　T,　Osakada　F,　Takahashi　M,　Kawasaki　H,　Kinoshita　S,　Sasai　Y:,　Proc　Natl　Acad　Sci　USA.　103(25):　9554-9559,　2006．＞処理を行うことにより実施することができる。

　本明細書で用いられる場合、代表的には、ＣＤ４４陰性～弱陽性ＣＤ２４陰性ＣＤ２６陰性である、ｍｉＲＮＡの「高発現」、「中発現」および「低発現」等の表現は、細胞の発現強度を相対的に表現する際に用いられる。なお、「中発現」はない場合もあり、その場合、「高発現」および「低発現」でそれぞれの細胞を識別することができる。

　本明細書において「細胞の大きさ」は、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞の一つの細胞指標であり、当該分野で慣用される技術によって測定される。細胞の大きさは、例えば、細胞面積によって表現される。本明細書において「細胞面積」は、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞の一つの細胞指標であり、細胞の写真を撮影し任意のソフトウェア等で測定することができる。このような測定手法としては、例えば、BZ-H3C　Hybrid細胞計数ソフトウェア(Keyence)等の画像処理ソフトウェアを利用する方法が挙げられる。その平均値は「平均細胞面積」という。通常は算術平均が用いられる。

　本明細書において「細胞の密度」、「（平均）細胞密度」は、一定面積に存在する細胞の数で表示される細胞の指標であり、当該分野で慣用される任意の技術によって測定される。細胞集団の平均密度は、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞または機能性成熟分化角膜内皮細胞の一つの細胞指標である。平均としては通常は算術平均が用いられる。細胞の大きさと並行して測定されることもあり、倒立顕微鏡システム(例えば、CKX41,　Olympus,　Tokyo,　Japan)によって、BZ　X-700顕微鏡システム(Keyence,　Osaka,　Japan)等の画像取得システムを含む機器を用いて撮影位相差顕微鏡画像を取得し、細胞計数ソフトウェア（例えば、BZ-H3C　Hybrid細胞計数ソフトウェア(Keyence)）等を用いて定量することができる。細胞密度は、飽和細胞培養（（培養）コンフルエントともいい、本明細書では飽和細胞培養と（培養）コンフルエントとは同じ意味で使用される。）時におけるものを指標とすることのほか、播種する際の密度も本開示の製造方法において目安として使用される。また、細胞密度は、注入後の治療成績の指標としても使用され得る。

　本明細書において「細胞代謝産物」とは、細胞が生成する任意の代謝産物をいい、「細胞代謝産物（該産物）の関連生体物質」とは、細胞代謝産物に関連する任意の生体物質（例えば、その代謝産物を合成する酵素、代謝する酵素、シグナル伝達経路に関連するタンパク質等）をいい、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞または機能性成熟分化角膜内皮細胞の一つの細胞指標である。代謝産物としては、例えば、ミトコンドリア系におけるエネルギー代謝系の産物、グルタチオン代謝系産物、メチオニン代謝回路産物、脂質代謝産物、ペントースリン酸経路産物、トリカルボキシル酸（ＴＣＡ）回路代謝産物、解糖系代謝産物等に関連する任意の産物が含まれ、特に、ＴＣＡ回路代謝産物、解糖系代謝産物が重要である。細胞代謝産物および該産物の関連生体物質としては、例えば、コハク酸、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、グリセロール３－ホスフェート、Ｇｌｕ、乳酸、アルギノコハク酸、キサンチン、Ｎ－カルバモイルアスパラギン酸、イソクエン酸、ｃｉｓ―アコニット酸、クエン酸Ａｌａ、３－ホスホグリセリン酸、ヒドロキシプロリン、リンゴ酸、尿酸、ベタイン、葉酸、Ｇｌｎ、２－オキソイソ吉草酸、ピルビン酸、Ｓｅｒ、ヒポキサンチン、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、コリン、Ｔｙｒ、尿素、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、カルノシン、Ａｓｐ、オルニチン、Ａｒｇ、クレアチン、２－ヒドロキシグルタミン酸、β－Ａｌａ、シトルリン、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、クレアチニン、Ｈｉｓ、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシンを挙げることができる。

　本開示の細胞の検出、同定、品質管理等は、マーカーとなる物質に結合する物質や相互作用分子を用いることによって実現することができる。本開示の関連において、マーカーとなる物質に「結合する物質」または「相互作用分子」は、少なくとも一時的にマーカーとなる物質（例えば、ＣＤ４４）等の分子に結合し、そして好ましくは、結合したことを表示しうる（例えば標識されるか標識可能な状態である）、分子または物質である。ＣＤ４４等の分子に結合する物質はＣＤ４４等の分子のリガンドであってもよく、その例としては、抗体、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、低分子量分子（ＬＭＷ）、結合性ペプチド、アプタマー、リボザイムおよびペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）等を挙げることができ、例えばＣＤ４４等の分子に対して向けられる、結合性タンパク質または結合性ペプチド、並びにＣＤ４４等の分子の遺伝子に対して向けられる核酸も含まれる。本明細書において、ＣＤ４４等の分子について「結合性タンパク質」または「結合性ペプチド」とは、ＣＤ４４等の分子に結合する種類のタンパク質またはペプチドを指し、そしてＣＤ４４等の分子に対して指向されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、抗体フラグメントおよびタンパク質骨格を含むがこれらに限定されない。

　本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（RNAなど））の「低下」、「減少」または「抑制」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における低下、減少、または減少させる活性をいう。減少のうち活性、発現産物等が検出限界未満になる場合、特に区別して「消失」ということがある。本明細書では、「消失」は「低下」、「減少」または「抑制」に包含される。また、「低下」とは、何らかの遺伝子などがすでに発現している状態からその量または効果などが減少することだけではなく、発現を何ら惹起させないことも含む。

　本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（RNAなど））の「増加」または「活性化」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における増加または増加させる活性をいう。「増加」には、比較前の状態で特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果が存在している場合（既に存在する量が相対的に増加すること）の他、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果が存在していない場合に、惹起されること（無から有）も包含される。

　本明細書において「ミトコンドリア依存性酸化的リン酸化」とは、「ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳ」とも呼ばれ、の呼吸活性に依存した酸化的リン酸化の反応をいう。「ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳ」に関連する反応は、細胞内代謝の状態を解析する細胞外フラックスアナライザーは，ＯＸＰＨＯＳ活性の指標である酸素消費速度（ＯＣＲ）および解糖活性の指標である細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を計測することができる

　本明細書において「細胞質・核内のアセチルＣｏＡの発現」とは、細胞質・核内でアセチルＣｏＡが発現することをいう。本明細書では、公知の蛋白発現を解析する任意の手法や抗体を用いる細胞免疫染色によりアセチルＣｏＡの発現を測定することができる。

　本明細書において「アセチルＣｏＡによるヒストンアセチル化を介するエピジェネティックな多遺伝子発現」とは、アセチルＣｏＡによってヒストンがアセチル化することで、多種の遺伝子の発現が調節されることをいう。これらの多遺伝子の発現で細胞の相転移CSTが引き起こされる。本明細書では、例えば、CellMetab. 2015 Mar 3;21(3):349-50.、TrendsinCell Biology, June 2017, Vol.27, No.6、およびSheikhet al. Nature Rev. Genetics,2019に開示されるような手法でエピジェネティックな多遺伝子発現を測定することができ、また代謝産物によるEpigenetics制御と細胞老化や細胞分化の破綻については
図６４の模式図のように考えることができる。

　本明細書において「角膜混濁や水和浮腫の改善、その結果、持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がるような角膜内皮（細胞）機能特性に繋がる機能性蛋白」とは、「角膜内皮（細胞）機能特性関連機能性蛋白」または「（本開示の）機能性蛋白」ともいい、角膜混濁や水和浮腫の改善、その結果、持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がる機能を有する任意の蛋白をいい、ＡＱＰ１、Ｎａ－ＫＡＴＰａｓｅ、ＮＨＥ１等の本明細書において記載される任意の蛋白の他、他の蛋白も包含することが理解される。機能性蛋白には、例えば、ナトリウム／水素交換体１（ＮＨＥ１）および／またはアクアポリン１（ＡＱＰ－１）や、重炭酸脱水酵素５Ｂ（ＣＡ５Ｂ）（発現が亢進）の他、ミトコンドリアにおける、クエン酸シンターゼ（ＣＳ）、アコニターゼ２（ＡＣＯ２）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ２（ＭＤＨ２）、リンゴ酸酵素３（ＭＥ３）、ＡＣＳＳ１、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ１（ＡＣＡＴ１）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、ＢＣＡＴ２、及び分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ２（ＢＣＫＤＨ２）等、も包含されることが理解される。

　また、「機能性蛋白」の「発現」には、「機能性蛋白」が発現することに加え、ミトコンドリアにおいてミトコンドリア依存性酸化的リン酸化が増加し、もしくは、細胞質・核内のアセチルＣｏＡの発現、並びにＡｃＣｏＡによるヒストンアセチル化を介するエピジェネティックな多遺伝子発現が惹起されていないことも包含される。

　加えて、「機能性蛋白」の「発現」には、「機能性蛋白」が発現することに加え、「機能性蛋白」とは逆の機能を有する蛋白の発現の低下または惹起されないことも包含され、そのようなものには、ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬＹ）、アコニターゼ１（ＡＣＯ１）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１（ＭＤＨ１）、リンゴ酸酵素１（ＭＥ１）、ＡＣＳＳ２、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ２（ＡＣＡＴ２）、及び／または乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）が発現しない、もしくはほとんど発現しないことなどが包含される。

　ここで、実質的にまたはほとんど「発現しない」とは、本開示の発明において使用されるとき、ヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るかどうかで判定することができる。

　以上から、「角膜混濁や水和浮腫の改善、その結果、持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がるような角膜内皮（細胞）機能特性に繋がる機能性蛋白の発現が認められる」は、「角膜混濁や水和浮腫の改善、その結果、持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がるような角膜内皮（細胞）機能特性に繋がる機能性蛋白の発現が認められるか、または当該角膜内皮（細胞）機能特性を阻害する蛋白が惹起されないまたは低下している」と表現されることもあり得る。

　本開示において、「Ｒｈｏキナーゼ」または「ＲＯＣＫ」（Rho-associated coiled-coil forming kinase：Rho結合キナーゼ）とは、Ｒｈｏの活性化に伴い活性化されるセリン／スレオニンキナーゼを意味する。例えば、ＲＯＫα（ＲＯＣＫ－ＩＩ：Leung,　T.　et　al.,　J.Biol.Chem.,　270,　29051-29054,　1995）、ｐ１６０ＲＯＣＫ（ＲＯＫβ、ＲＯＣＫ－Ｉ：Ishizaki,　T.　et　al.,　The　EMBO　J.,　15(8),　1885-1893,　1996）およびその他のセリン／スレオニンキナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。

　ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏキナーゼ阻害剤ともいう）としては、下記文献：米国特許４６７８７８３号、特許第３４２１２１７号、国際公開第９５／２８３８７、国際公開９９／２０６２０、国際公開９９／６１４０３、国際公開０２／０７６９７６、国際公開０２／０７６９７７、国際公開第２００２／０８３１７５、国際公開０２／１００８３３、国際公開０３／０５９９１３、国際公開０３／０６２２２７、国際公開２００４／００９５５５、国際公開２００４／０２２５４１、国際公開２００４／１０８７２４、国際公開２００５／００３１０１、国際公開２００５／０３９５６４、国際公開２００５／０３４８６６、国際公開２００５／０３７１９７、国際公開２００５／０３７１９８、国際公開２００５／０３５５０１、国際公開２００５／０３５５０３、国際公開２００５／０３５５０６、国際公開２００５／０８０３９４、国際公開２００５／１０３０５０、国際公開２００６／０５７２７０、国際公開２００７／０２６６６４などに開示された化合物があげられる。かかる化合物は、それぞれ開示された文献に記載の方法により製造することができる。具体例として、１－（５－イソキノリンスルホニル）ホモピペラジンまたはその塩（たとえば、ファスジル（１－（５－イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン））、（＋）－トランス－４－（１－アミノエチル）－１－（４－ピリジルカルバモイル）シクロヘキサン（（Ｒ）－（＋）－トランス－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド）またはその塩（たとえば、Ｙ－２７６３２（（Ｒ）－（＋）－トランス－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）など）などがあげられ、これらの化合物は、市販品（和光純薬株式会社、旭化成ファーマ等）を好適に用いることもできる。本明細書においてＲＯＣＫ阻害剤は、培養ヒト角膜内皮細胞を増殖および／または分化・成熟させる工程において特に用いられる。一つの実施形態では、脱分化させて角膜内皮前駆細胞を得る工程においてはＲＯＣＫ阻害剤が使用されないこともある。また、理論に束縛されることを望まないが、ＲＯＣＫ阻害剤は、脱分化または分化・成熟させる対象となる角膜内皮細胞または角膜内皮前駆細胞などの継代数、またはその由来となるドナー年齢などの細胞固有の性質に応じて、脱分化させて角膜内皮前駆細胞を得る工程において使用してもよく、使用しなくてもよい。例えば、一例を述べると、継代数が少ない場合（例えば、継代数が１、２または３程度の場合）および／または若いドナー由来の細胞の場合は、増殖および／または分化・成熟させる工程のみに使用してもよく、継代数が多い場合（例えば、継代数が４、５、６等）は、ＲＯＣＫ阻害剤を、細胞播種時において使用することとすることもできる。このように、一定の実施形態では、増殖および／または分化・成熟させる工程のみにＲＯＣＫ阻害剤を用いるだけで、全期間ＲＯＣＫ阻害剤を付与した場合に匹敵するレベルの細胞を得ることができることを見出したことは、本開示における一つの成果でありうる。

　（好ましい実施形態）
　以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。

　なお、本明細書では、下記の種々の局面においては、国際公開２０１７／１４１９２６を適宜参酌して援用する。従って、適切な場合、ＷＯ２０１７／１４１９２６の内容は、本明細書において参考として援用されることが理解される。

　（ヒトの眼前房内への移入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞）
　本開示の一局面において、本開示は、角膜混濁や水和浮腫の改善、その結果、持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がるような角膜内皮（細胞）機能特性に繋がる機能性蛋白の発現が認められるか、または当該角膜内皮（細胞）機能特性を阻害する蛋白が惹起されないまたは低下している、ヒト機能性角膜内皮細胞を提供する。このような機能性蛋白の発現または蛋白の惹起がされないまたは低下されることは、本明細書の開示に従って、本実施例の例示に鑑み、当業者が適宜実施することができる。本開示では、角膜混濁や水和浮腫の改善、その結果、持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がるような角膜内皮（細胞）機能特性に繋がる機能性蛋白の発現が認められるか、または当該角膜内皮（細胞）機能特性を阻害する蛋白が惹起されないまたは低下している、ヒト機能性角膜内皮細胞は、「角膜混濁や水和浮腫の改善、その結果、持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がるような角膜内皮（細胞）機能特性に繋がる機能性蛋白の発現が認められる、ヒト機能性角膜内皮細胞」と表現されることもあるが、これらは特に注釈を入れない限り同義である。

　一実施形態では、本開示は、ヒト眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞であって、（ｉ）ミトコンドリアにおいてミトコンドリア依存性酸化的リン酸化の増加、（ｉｉ）細胞質・核内のアセチルＣｏＡの発現が増加しないこと、および（ｉｉｉ）アセチルＣｏＡによるヒストンアセチル化を介するエピジェネティックな多遺伝子発現の低下からなる群から選択される少なくとも１つを含む、細胞が提供される。この場合、アセチルＣｏＡの発現の増加は、非機能性角膜内皮細胞において発現していなかったものが発現することも含み、またエピジェネティックな多遺伝子発現の低下とは、なんら惹起しないことも含む。また本開示の一実施形態において、このような細胞は、（ｉ）ミトコンドリアにおいてミトコンドリア依存性酸化的リン酸化の増加、（ｉｉ）ミトコンドリア内においてアセチルＣｏＡの発現がオルガネラ選択的に起こり、細胞質・核内のアセチルＣｏＡの発現の生じないこと、（ｉｉｉ）角膜混濁や水和浮腫の改善その結果持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がるような上述の角膜内皮（細胞）機能特性に繋がるイオンチャンネル、単カルボン酸輸送体の発現および（ｉｖ）相転移細胞の生成に繋がるＴＣＡ回路などに係る代謝酵素が細胞質や核には存在せずに、ミトコンドリアにオルガネラ選択的に局在する特性、就中、アセチルＣｏＡによるヒストンアセチル化を介するエピジェネティックな多遺伝子発現の低下もしくは起きないこと、からなる群から選択されるすべてを含むこともできる。

　本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞は、内皮間葉転換が起きておらず、または実質的に起きていない。

　また本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞は、ミトコンドリアにおいて、クエン酸シンターゼ（ＣＳ）、アコニターゼ２（ＡＣＯ２）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ２（ＭＤＨ２）、リンゴ酸酵素３（ＭＥ３）、ＡＣＳＳ１、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ１（ＡＣＡＴ１）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、ＢＣＡＴ２、及び分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ２（ＢＣＫＤＨ２）からなる群から選択される１または複数の代謝関連酵素が発現しており、他の実施形態においてはこの細胞では、ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬＹ）、アコニターゼ１（ＡＣＯ１）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１（ＭＤＨ１）、リンゴ酸酵素１（ＭＥ１）、ＡＣＳＳ２、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ２（ＡＣＡＴ２）、及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）からなる群から選択される少なくとも１つの酵素が発現しておらず、または実質的に発現していない。

　また本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞は、ナトリウム／水素交換体１（ＮＨＥ１）および／またはアクアポリン１（ＡＱＰ－１）の発現が亢進しており、他の実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞は、重炭酸脱水酵素５Ｂ（ＣＡ５Ｂ）の発現が亢進している。

　また本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞は、角膜内皮組織由来細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、角膜内皮から採取した角膜内皮前駆細胞、角膜内皮から採取した細胞、並びにダイレクトプログラミング法で作成される角膜内皮前駆細胞および角膜内皮様細胞からなる群から選択される細胞を起源として作成されることもできる。

　さらに、本開示の一実施形態において、ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞の品質管理もしくは工程管理の方法、またはヒト機能性角膜内皮細胞に混在する角膜内皮非機能性細胞を検出する方法であって、以下：
（１）移植日の位相差画像による外観検査で、線維芽細胞、異物、変色、または他の異常なし
（２）移植日２週間前および／または移植日の細胞数が１．５×１０^６細胞／４５０μＬ
（３）細胞生存率がトリパンブルー染色で８５％以上
（４）細胞上清のＥＬＩＳＡによる純度試験で、
　ＰＤＧＦ－ＢＢ：１００ｐｇ／ｍＬ以上
（５）移植日２週間前および／または移植日に採取された細胞上清のＦＡＣＳによる純度試験で、
　ＣＤ１６６^＋＞９９％
　ＣＤ２４^＋＜５％
　ＣＤ２６^＋＜５％
　ＣＤ２００^＋＜５％
　ＣＤ４４^ｈｉｇｈ＜５％
　ＣＤ４４^ｌｏｗ＞９０％
　ＣＤ１０５^－～weak＞９０％
　ＣＤ９０^＋＜５％
（６）エフェクター細胞（Ｅ－ｒａｔｉｏ）＞９０％
（７）移植日２日前のポンプ機能（Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ）：陽性
（８）移植日２日前のバリア機能（ＺＯ－１）：陽性
（９）ＢＳＡ陰性試験で１２５ｎｇ／μＬ未満
（１０）移植日のＥＣＤが１５００細胞／ｍｍ^２以上
（１１）ｍｉＲ１８４の発現
（１２）乳酸産生
（１３）細胞サイズが２５０μｍ未満
の１または複数の項目を確認する工程を含む、方法を提供する。

　また他の実施形態においては、ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞の細胞集団であって、以下：
（１）移植日の位相差画像による外観検査で、線維芽細胞、異物、変色、または他の異常なし
（２）移植日２週間前および／または移植日の細胞数が１．５×１０^６細胞／４５０μＬ（３）細胞生存率がトリパンブルー染色で８５％以上
（４）細胞上清のＥＬＩＳＡによる純度試験で、
　ＰＤＧＦ－ＢＢ：１００ｐｇ／ｍＬ以上
（５）移植日２週間前および／または移植日に採取された細胞上清のＦＡＣＳによる純度試験で、
　ＣＤ１６６^＋＞９９％
　ＣＤ２４^＋＜５％
　ＣＤ２６^＋＜５％
　ＣＤ２００^＋＜５％
　ＣＤ４４^ｈｉｇｈ＜５％
　ＣＤ４４^ｌｏｗ＞９０％
　ＣＤ１０５^－～weak＞９０％
　ＣＤ９０^＋＜５％
（６）エフェクター細胞（Ｅ－ｒａｔｉｏ）＞９０％
（７）移植日２日前のポンプ機能（Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ）：陽性
（８）移植日２日前のバリア機能（ＺＯ－１）：陽性
（９）ＢＳＡ陰性試験で１２５ｎｇ／μＬ未満
（１０）移植日のＥＣＤが１５００細胞／ｍｍ^２以上
（１１）ｍｉＲ１８４の発現
（１２）乳酸産生
（１３）細胞サイズが２５０μｍ未満
の１または複数の項目を充足する、細胞集団を提供し、この場合、（１）～（１３）のすべての項目を充足する細胞集団とすることもできる。

　なお、実際の運用においては、すべての項目を採用する必要は必ずしもなく、品質規格としては、（１）～（１３）のいくつかを採用するだけでもよい。

　例えば、（３）、（５）のうち　ＣＤ４４^ｈｉｇｈ＜５％、　ＣＤ４４^ｌｏｗ＞９０％、　ＣＤ１０５^－～weak＞９０％、ＣＤ９０^＋＜５％；（６）、（１１）、（１２）、（１３）を品質規格として採用することができる。

　また、（１）～（１３）をすべて採用する実施形態は、例えば、何らかの事故が起こり細胞の同一性を担保できなくなった時の生物学的同等性の試験を行う際に採用されることができる。

　加えて、（１）～（１３）に加えて、または代替的に、本明細書において開示された１または複数の他の評価項目を試験に加えることができる。
　このように、本開示は、臨床で極めて優れた効果を示す培養ヒト角膜内皮細胞を作出した上で、その細胞を同定できる技術も明確にしたという点で、極めて有用性の高い技術を提供するものといえる。

　他の局面において、本開示は、ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞（本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞ともいう。）を提供する。本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞は、成熟分化角膜内皮の角膜内皮機能特性を有するものであり、細胞注入治療（例えば、ヒトの眼前房内への注入時に角膜内皮機能特性を惹起し得る）においても効果を奏するものであることから、代表的には、ヒトの眼前房内への注入時に角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞ということができる。本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞は機能性成熟分化角膜内皮細胞のほか、中程度分化角膜内皮細胞を含みうる。本開示の機能性成熟分化角膜内皮細胞は、角膜内皮機能を発揮する成熟分化した細胞であり、注入に最適な亜集団であるエフェクター細胞が小型で六角形の敷石様形状を形成しミトコンドリア機能によるエネルギー代謝系を利用する。

　従来「培養角膜内皮細胞」または「培養ヒト角膜内皮細胞」との名称の細胞が報告されているが、これらが複数の亜集団から構成されていることは知られておらず、これを明らかにし、その中で特に細胞注入療法に最適な亜集団が存在することも知られていなかったことから、本開示の意義は大きい。特に、本開示の開示前は、再生医療に随伴する細胞の不均質性に係る課題自体がヒト角膜内皮細胞においては明確には認識されておらず、このような課題を見出し解決したことの意義は大きい。ヒト角膜内皮細胞（HCEC）は、インビボでは細胞分裂することができず細胞周期のＧ１期で停止しているものの、増殖能は依然保持しているとされているが、近年の研究から、HCECを長期間培養することは大変困難であると理解されていたからである。

　本開示の応用例として、特に、高品質で核型異常を示さず免疫拒絶応答を惹起しない「アロ」機能性成熟分化ヒト角膜内皮細胞を懸濁液として用いて前房内注入による角膜内皮機能の再生を可能とするという点で注目される。本開示の細胞を用いた医療技術では、特に、若年者ドナー由来の角膜内皮細胞を、生体外で拡大培養、増幅後、細胞懸濁液を水疱性角膜症患者の前房内に注入する治療を可能とするものであり、ヒト幹細胞を用いる臨床研究に関する指針に基づく臨床研究において、ヒト適用においての安全性、臨床ＰＯＣが本開示により実証・確立されたものである。

　本開示の細胞を提供することができた経緯の一つとして、注入治療に用いる細胞は不均質細胞亜集団の混合物であること、および治療に使用され得る「ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞」はその一部に限定されることを見出したことがある。

　本開示において、角膜内皮細胞では、核型異常は亜集団選択的に生じ、亜集団選択的に反応する自己抗体が存在することも判明した。本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞は、特に、機能性成熟分化角膜内皮細胞ではかかる異常はなく、他亜集団に比較し、免疫拒絶反応に係るＨＬＡクラスＩ抗原は他亜集団より相対的に低発現で、従来、細胞マーカーではないかとこれまで想定されていたＣＤ２００抗原の発現が陰性であることも判明した。非目的細胞では細胞老化に係るサイトカイン（ＳＡＳＰ関連タンパク質）産生が高いことも判明した。

　本開示の開示前は、再現性の良い培養手段が限られていたため、線維化や細胞老化、上皮間葉系移行（ＥＭＴ）、内皮間葉系移行などのような細胞状態相転移（ＣＳＴ）がなく核型異数性のない培養ヒト角膜内皮細胞をインビトロで増殖しようとする試みは、その細胞特性に関する知見ならびに細胞集団が複数の亜集団から構成されるのか、培養条件により産生される細胞集団が安定的公正を示すかなどに関する知見・報告が全くなく、そうした視点での解析すら行われていなかったため、著しく困難であった。

　培養ＨＣＥＣは、ＣＳＴを起こして老化表現型、ＥＭＴおよび線維芽細胞形態に向かう傾向がある。本発明者らは、移入細胞として不適切なこれら培養夾雑細胞を識別する明確な細胞表面マーカーを同定し、非機能性ヒト角膜内皮組織の再構築に適用可能であるＨＣＥＣ集団を規定することを可能にした。
　なお、本開示では、必要に応じて、適宜ＷＯ2017/141926に記載されている細胞マーカーを用いることができる。

　一つの実施形態では、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞は、本明細書において規定される細胞指標の角膜発現特性を有する。

　本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞が有し得る細胞指標には、細胞表面マーカー（ＣＤマーカー等）、細胞産物特性、細胞形態指標、細胞の遺伝子特性などが含まれ、具体的には、細胞表面マーカー（ＣＤマーカー等）；タンパク質性産物および該産物の関連生体物質の特性；ＳＡＳＰ関連タンパク質の発現特性；ｍｉＲＮＡ（例えば、細胞内ｍｉＲＮＡ、分泌型ｍｉＲＮＡ等）の発現；エキソゾームの特性；細胞代謝産物および該産物の関連生体物質の発現特性；細胞の大きさ；細胞の密度および自己抗体反応性細胞の存在を含みうる。本開示の機能性成熟分化角膜内皮細胞は、その細胞指標が、特定の範囲またはレベルの細胞機能特性またはその組み合わせを示す。したがって、特定の細胞指標の特定の範囲またはレベルの細胞機能特性またはその組み合わせを定めることにより、本開示の機能性成熟分化角膜内皮細胞かどうかを判定することができる。本開示の機能性成熟分化角膜内皮細胞に特有の特定の範囲またはレベルの細胞機能特性またはその組み合わせについては、本開示で初めて同定されたものであり、これにより種々の細胞の亜集団を特定することができ、品質管理や品質検定をすることができるようになり、ひいては、効果の高い治療を達成することが可能となった。以下に、これらの細胞指標およびその特定の範囲またはレベルの細胞機能特性またはその組み合わせについて、具体的に詳細に説明する。

　特定の実施形態では、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞は、ＣＤ１６６陽性およびＣＤ１３３陰性を含む細胞機能特性を有する。さらなる細胞機能特性として重要なものにＣＤ４４の発現特性があり、その発現強度は好ましくは、ＣＤ４４陰性～中陽性、より好ましくは、ＣＤ４４陰性～弱陽性、さらに好ましくは、ＣＤ４４陰性を挙げることができるが、それに限定されない。本開示では、角膜内皮細胞または角膜内皮様に分化させた細胞において機能性かどうかを確認するために、ＣＤ１６６陽性およびＣＤ１３３陰性であることを確認することによって、機能性かどうかを確認することができることを見出した。これに加えて、ＣＤ４４についてもその発現が低い（ＣＤ４４陰性～中陽性、好ましくは、ＣＤ４４陰性～弱陽性）ことを確認することで、機能性かどうかをより高い精度で見出すことができた。

　したがって、好ましい実施形態では、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞は、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ１３３陰性およびＣＤ４４陰性～弱陽性を含む細胞機能特性を有する。理論に束縛されることを望まないが、これらの３つの細胞マーカーを有することによって、角膜内皮細胞または角膜内皮様に分化させた細胞において、高い品質の機能性を有する機能性成熟分化角膜内皮細胞であることが確認された。このような機能性は、臨床研究の結果において、短期間（例えば、１か月程度）で、角膜内皮細胞検査(スペキュラ)の値で見ると約１０００（個／ｍｍ^２）を超えるレベル、約２０００（個／ｍｍ^２）を超えるレベル、好ましくは約２３００（個／ｍｍ^２）を超えるレベル、さらに好ましくは約２５００（個／ｍｍ^２）を超えるレベル、場合によっては約３０００（個／ｍｍ^２）を超えるレベルという高いレベルの治療効果が達成されることが示されている。

　さらに好ましくは、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞は、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ１３３陰性およびＣＤ４４陰性を含む細胞機能特性を有する。理論に束縛されることを望まないが、ＣＤ４４陰性細胞にさらに限定することによって、増殖能等が高度に担保された品質の高い細胞（本明細書では「高品質」の機能性成熟分化角膜内皮細胞ということがある。）をより適切に提供することができる。「高品質」の機能性成熟分化角膜内皮細胞は、より安定し、改善された角膜内皮機能特性を有する。

　別の実施形態では、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞は、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ１３３陰性およびＣＤ２００陰性を含む細胞機能特性を有する。従来ＣＤ２００については、ＣＤ２００陽性が角膜内皮細胞の特性であるといわれてきたが、本開示において亜集団ごとに詳細に検討することにより、ＣＤ２００陽性細胞は移入には適さないＣＳＴを有する大型細胞であることが判明するとともに、ＣＤ２００陰性がヒトの眼前房内への移入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得る機能性角膜内皮細胞の特性であることを見出した。このような特性については、従来の知見では予想できなかったことであり、本開示において亜集団を丹念に分析した結果であるともいえる。

　別の実施形態では、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞は、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ１３３陰性、ＣＤ４４陰性～ＣＤ４４弱陽性およびＣＤ９０陰性～弱陽性を含む細胞機能特性を有する。これによりさらに細胞の同質性を担保することができる。あるいは、細胞表面抗原は、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ１３３陰性、およびＣＤ４４陰性～中陽性、ＣＤ９０陰性表現型を含む。別の実施形態において、細胞葉面抗原は、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ１３３陰性、およびＣＤ４４陰性～ＣＤ４４弱陽性表現型を含み、あるいは、細胞は、ＣＤ４４陰性～ＣＤ４４弱陽性表現型を含む細胞表面抗原を発現する。

　本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞は、さらに追加の細胞機能特性を有し得る。このような細胞機能特性としては、ＣＤ９０陰性（ＣＤ９０陰性～弱陽性）、ＣＤ１０５陰性～弱陽性、ＣＤ２４陰性、ＣＤ２６陰性、ＬＧＲ５陰性、ＳＳＥＡ３陰性、ＭＨＣ１弱陽性（特に、相転移細胞に比較して弱陽性である。）、ＭＨＣ２陰性、ＰＤＬ１陽性、ＺＯ－１陽性、Ｎａ^＋Ｋ^＋／ＡＴＰａｓｅ陽性、Ｃｌａｕｄｉｎ１０陽性などの発現特性のうち、一つまたはそれより多くの発現特性を含みうるが、これらに限定されない。あるいは、群は、ＣＤ１０５陰性～弱陽性、ＣＤ２４陰性、ＣＤ２６陰性、ＬＧＲ５陰性、ＳＳＥＡ３陰性、ＭＨＣ１弱陽性、ＭＨＣ２陰性、ＺＯ－１陽性、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ陽性からなる群であってもよい。

　本明細書において、ＣＤマーカー等の細胞指標のマーカーの発現の強度は、発現が実質的にないものを陰性（－と表示することがある。また、－と±とを分ける場合はいずれも含む）と表示する。ここで、陰陽性（dull　Positive）は本明細書では陰性に包含する。陰性ではないもの、すなわち発現が有意に観察されるものを陽性（すなわち、＋と－との２分類で表示する場合は＋と表示することがある。）で表す。特に発現レベルを区別する場合、その強度を３段階に分類し、弱陽性、中陽性、強陽性で識別する。ＦＡＣＳ測定の結果グラフの表示等の関係から、これらは、＋の個数で表示することもあり、弱陽性、中陽性、強陽性はそれぞれ、＋、＋＋、＋＋＋で表示されることもあるが、これらは同義である。この場合、「弱陽性」「中陽性」「強陽性」として区別することができる。区別しない場合は、単に陽性といってもよい。弱陽性には満たない場合通常は陰性という。これらのレベルの強度は、当該分野で慣用される通りに用いられる。これらのレベルは、相対的なものであり、以下のように定義する。例えば、「－」は発現が実質的にみられないものを指す。発現が認められるものは、弱陽性、中陽性、強陽性の三段階に分類する。ＦＡＣＳ分離の際に、シグナルは陰性、弱陽性、中陽性、強陽性に等級づけることができる。

　具体的なレベルは、ＦＡＣＳにおけるシグナル強度の表示に関して、陰性、陰陽性、弱陽性、中陽性、強陽性の表示について、平均蛍光シグナル強度（ＭＦＩ）を用いて識別することができる。細胞の分布をヒストグラムで表示して、相対的に判断して陰性、陰陽性、弱陽性、中陽性、強陽性を表示することができるが、さらに具体的な測定値についての判断基準を説明すると、具体的には以下のようなレベルが例示される。

　本明細書では、ＣＤマーカー等の細胞指標のマーカーの発現の強度は代表的に、標識の蛍光の種類、機器設定により蛍光強度が異なるため、以下の条件：PE-Cy　7　標識抗ヒトCD44抗体（BD　Biosciences）を使用して、FACS　Canto　II　の　Blue　laser　の　Area　Scaling　Factor　を0.75、PE-Cy　7　のvoltage　を　495　に設定した場合の弱の蛍光強度範囲はおよそ3800未満、中の蛍光強度範囲はおよそ3800以上～27500未満、強の蛍光強度範囲はおよそ27500以上である。尚、本明細書の実施例において、この設定での陰性対照（アイソタイプコントロール）の平均蛍光強度はおよそ50であった。（55±25の範囲、細胞ロットにより同じ設定でも多少ずれることがあるが、当業者はこれらのずれを理解して実施することができる。）。したがって、「弱の蛍光強度範囲はおよそ3800未満、中の蛍光強度範囲はおよそ3800以上～27500未満、強の蛍光強度範囲はおよそ27500以上である。」からすると、陰性対照（アイソタイプコントロール）の平均蛍光強度PE-Cy　7:　約50　[33～80程度]であるため、弱：＜76倍、中：76～550倍、強＞550倍となる。陰性対照（アイソタイプコントロール）について同じ染色強度パターンであれば陰性であり、少しでもシフトすれば陽性と判断する。

　本明細書において使用される場合、他の設定値としては以下を挙げることができる：
・Area　Scaling　Factor:　FSC=0.5、Blue　laser=　0.75、Red　laser=0.8
・voltage:　FSC=270、SSC=400、FITC=290、PE=290、PerCP-Cy　5.5=410、PE-Cy　7=495、APC=430
・陰性対照（アイソタイプコントロール）の平均蛍光強度としては、以下を挙げることができる。
FITC:　約130　[65～225程度]
PE:　約120　[73～204程度)]
PerCP-Cy5.5:　約120　[74～191程度]
PE-Cy　7:　約50　[33～80程度]
APC:　約110　[67～196程度]。

　なお、このような細胞のマーカーの強度は、蛍光活性化細胞分類及び免疫組織化学など（これらに限定されるものではない）の技術によって容易に評価できる。上記のマーカー及びそれらの発現レベルに関して、「陰性」はマーカーの発現が欠如している又はそのレベルが著しく低いことを意味し、「陽性」は発現が顕著であることを意味する。細胞マーカーの「陰性」から「陽性」への移行は、欠如している発現又は低レベルの発現から高レベル又は著しいレベルの発現への変化を示す。「弱陽性」という用語は弱い発現すなわち低レベルの発現を意味し「低発現」と表示されることもあり、「中陽性」とは容易に検出できる中レベルの発現を意味するため「中発現」と表現されることもあり、「強陽性」は発現が顕著でありきわめて容易に検出できる強い発現すなわち高レベルの発現を意味し、「高発現」と表示されることもある。この場合、「弱陽性」から「中陽性」）、「中陽性」から「強陽性」又は「強陽性」から「中陽性」、「中陽性」から「弱陽性」への発現の移行は、容易に確認できる。例えば、非目的細胞はＣＤ４４強陽性を示し、前駆細胞はＣＤ４４中陽性を示し、本開示の機能性成熟分化角膜内皮細胞はＣＤ４４陰性またはＣＤ４４弱陽性を示す。例えば実施例で示されているように、２つ以上の細胞表面マーカー等を用いて細胞を亜集団等に分類することができる。

　本開示で使用される更なる細胞指標には、ＭＨＣ－１、ＭＨＣ－２の発現強度が含まれるが、いずれも免疫拒絶がないことに関連するものである。本開示は臨床的に、細胞注入治療に使用されることから、免疫拒絶反応がないか、低いことが好ましい。

　本開示で使用される更なる細胞指標には、ＺＯ－１、Ｎａ^＋Ｋ^＋／ＡＴＰａｓｅが含まれる。これらはヒト角膜内皮細胞の機能性を示すために密接に関連する特性であることから、これらはいずれも正常に明確に発現していること（＋）が好ましい。

　本開示が提供する本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞は、革新的な治療法の臨床応用を可能とするものであるところ、品質管理することが必要であり、そのための信頼度の高い方法が必要とされる。細胞相転移（ＣＳＴ）および核型異常（異数性）を起こさない機能性成熟分化角膜内皮細胞の識別および品質管理が、本開示で提供され得る。

　一つの実施形態では、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞は、特定のサイトカインやその関連物質について機能性に特異的な特性を有し得る。そのような特性としては、例えば、ＰＤＧＦ－ＢＢ高産生、ＩＬ－８低産生、ＭＣＰ－１低産生、ＴＮＦ－α高産生、ＩＦＮγ高産生、およびＩＬ－１Ｒアンタゴニスト高産生、ＶＥＧＦ低産生等を挙げることができるがこれらに限定されない。好ましい指標としては、炎症性の細胞等他を攻撃する状態を反映する場合のサイトカインレベルは好ましくなく、正常状態である場合の状態を反映するサイトカインレベルが好ましい。

　本開示の細胞は、使用前に品質検定を行ったとき、以下のような基準を満たしていることが好ましい。

　ここで外観試験は、六角形の敷石様形状であることや線維化していないことを確認することなどを含む。

　本開示では、品質規格としては、以下の表のような基準を満たすことが一例として挙げられる。

　本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞は、その細胞面積が少ないこと、すなわち小さな細胞であることが好ましい。本開示において、細胞面積は、通常ＰＢＳ処理した細胞を画像化した条件での細胞面積で評価される。すなわち、本明細書では、ハイブリッドセルカウントの測定値は、ＰＢＳ処理した細胞で画像を取得しているため、細胞間に間隙ができている状態の面積で測定される。すなわち、培養液中飽和細胞培養（コンフルエント）時のタイトジャンクションが形成された成熟分化の状態よりは細胞面積が低い値で測定されることになる。機能性細胞は１細胞あたりの面積が小さく、培養における細胞密度が最も高くなることで、品質が高いことが本開示で判明している。これは、正常角膜内皮組織の内皮細胞と同じ水準の細胞面積、細胞密度のレベルあるいはこれを超えるレベルであるといえる。ＰＢＳ処理した細胞の好ましい飽和細胞培養（コンフルエント）時の細胞面積としては、その細胞集団の平均または個々の細胞が約２５０μｍ^２以下を挙げることができ、より好ましくは、約２４５μｍ^２以下、約２４０μｍ^２以下、約２３５μｍ^２以下、約２３０μｍ^２以下、約２２５μｍ^２以下、約２２０μｍ^２以下、約２１５μｍ^２以下、約２１０μｍ^２以下、約２０５μｍ^２以下、約２００μｍ^２以下等を挙げることができる。他方、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞の好ましい細胞面積として実現した値としては、例えば、約１５０μｍ^２以上、約１５５μｍ^２以上、約１６０μｍ^２以上、約１６５μｍ^２以上、約１７０μｍ^２以上、約１７５μｍ^２以上、約１８０μｍ^２以上等を挙げることができるがこれらに限定されない。細胞面積は当該分野で公知の任意の手法で測定することができるが、代表的な例として、位相差顕微鏡画像を用いた測定法があり、ここでは、倒立顕微鏡システム(CKX41,　olympus,Tokyo,　Japan)等の市販のシステムを用いて
撮影することができる。また、面積分布測定のためには、例えば、対象となる細胞をPBS　(-)で３回洗浄する等して測定しやすい前処理を行った後、位相差顕微鏡画像を例えば、BZ　X-700顕微鏡システム(Keyence,　Osaka,　Japan)等の市販のシステムを用いて取得することができる。また、面積分布はBZ-H3C　Hybrid細胞計数ソフトウェア(Keyence)等の市販のソフトウェアを用いて定量することができる。

　したがって、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞は、細胞の大きさ；細胞の密度および自己抗体反応性細胞の存在からなる群より選択される少なくとも１つの細胞指標において、上記好ましい数値を有していることが有利である。

　本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞は、本明細書において説明される、細胞表面マーカー；タンパク質性産物および該産物の関連生体物質；ＳＡＳＰ関連タンパク質；細胞内または分泌型ｍｉＲＮＡ；エキソゾーム；アミノ酸を含む細胞代謝産物および該産物の関連生体物質；細胞の大きさ；細胞の密度および自己抗体反応性細胞の存在からなる群より選択される少なくとも一つの細胞指標において、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞（すなわち、機能性成熟分化角膜内皮細胞および中程度分化角膜内皮細胞を含む）に相同する細胞機能特性、好ましくは、機能性成熟分化角膜内皮細胞に相当する細胞機能特性を有することが好ましい。本開示において好ましい細胞指標としては、例えば、本明細書の各指標に関する説明において記載される具体的な数値や範囲、レベルが任意に採用され、それらの組合せも採用され得る。ある候補細胞がこれらの細胞指標について、本明細書に規定された本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞、好ましくは機能性成熟分化角膜内皮細胞が有するべき値を有する場合、その候補細胞は、ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を発現する中程度分化角膜内皮細胞であるまたは機能性成熟分化角膜内皮細胞と判定される。また、上記に列挙したような細胞指標での判定に加えて、または並行して、以下のような指標も参照できる。特に、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞の機能は、小型で六角形の敷石様形状を形成しミトコンドリア機能によるエネルギー代謝系を利用することで確認され、注入したとき（例えば、眼前房内に）に、治療効果を有し得るかどうかで判定をすることができる。更に、限定されず、サロゲートマーカー的な指標も有効である。そのような指標としては、（１）内皮ポンプ・バリア機能の保持、（Claudin発現を含む）の陽性（２）ラミニン511、あるいはそのフラグメントE8に対する高接着・結合性、（３）分泌サイトカインプロファイル、PDGFｂｂ、TNFα、IFNγ、IL-1受容体アンタゴニストの産生量が基準値以上であること（４）産生するマイクロRNA(miRNA)プロファイルによる規定（５）産生する代謝産物プロファイルによる規定、（６）角膜混濁や水和浮腫の改善その結果持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がるような上述の角膜内皮（細胞）機能特性に繋がるイオンチャンネル、単カルボン酸輸送体の発現、（７）相転移細胞の生成に繋がるＴＣＡ回路などに係る代謝酵素が細胞質や核には存在せずに、ミトコンドリアにオルガネラ選択的に局在する特性、（８）インビトロ培養時の飽和細胞密度、（９）培養時に得られる細胞の空間的大きさやその分布、（１０）マウス角膜に対する液体窒素低温凍結損傷後に細胞注入した場合の角膜内皮面への接着性の１０種類のいずれかもしくはその組み合わせを指標とすることもできる。特に、理論に束縛されることを望まないが、タンパク質性産物または該産物の関連生体物質によって、おおよそのＣＳＴ細胞かどうかを判別することができ、ｍｉＲＮＡにより、目的外細胞を一部または全部除去することができ、細胞代謝産物または該産物の関連生体物質によって、中程度分化角膜内皮細胞と機能性成熟分化角膜内皮細胞とを区別することができ、より品質の高い機能性角膜内皮細胞を培養物中において選択的に増殖することができるからである。

　好ましい実施形態では、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞、特に、成熟分化角膜内皮細胞は核型異常を有しない。cHCECを細胞注入再生医薬に適用する上での最も大きな障害は、Miyaiらによって示されたように、cHCECは、多くの場合、数代の継代で培養中に異数性を示すことである(Miyai　T,　et　al.,　Mol　Vis.　2008;　14:942-50)。cHCECにおいて観察される異数性は、細胞分裂に起因して培養中に誘導される。ここで、本発明者らは、cHCECにおける異数性の有無が、cHCEC中で優勢な特定の細胞亜集団に密接に関連するという新たな知見を提供する。本発明者らは、核型異常のない特定の細胞亜集団は、角膜組織中に存在する機能性成熟分化角膜内皮細胞と表面発現型の特定のパターンに並行して現れることを見出した。核型異常のない機能性成熟分化角膜内皮細胞からほとんどなる細胞亜集団を選択的に増殖させる洗練した培養条件の確立に成功し、これによって水疱性角膜症等の角膜内皮障害の処置のために機能性成熟分化角膜内皮細胞を細胞懸濁液の形態で前房に注入することによる安全で安定した再生医薬を提供することができるようになった。このように、本開示では、これまで明らかではなかった、核型異常は亜集団選択的に生じることを見出した。そして、本開示の技術を用いることによって、核型異常を実質的に起こさない亜集団を選択することができるようになった。

　別の局面において、本開示は、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞、特に機能性成熟分化角膜内皮細胞を含む、細胞集団を提供する。

　本開示の細胞集団は、その平均細胞密度が、飽和細胞培養（コンフルエント）時に少なくとも約１５００個／ｍｍ^２以上、少なくとも約１６００個／ｍｍ^２以上、少なくとも約１７００個／ｍｍ^２以上、少なくとも約１８００個／ｍｍ^２以上、少なくとも約１９００個／ｍｍ^２以上、あるいは少なくとも約２０００個／ｍｍ^２以上であることが好ましい。本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞を含む細胞集団は、細胞の大きさが小さいため、その密度が相当程度高く提供されることが理解される。細胞密度は高品質な角膜内皮機能特性に伴って見出される特徴であり、逆にこのような細胞密度を測定することで品質の高い機能性成熟分化角膜内皮細胞を選択する一つの指標として用いることができる。細胞密度は、細胞面積と直接関連する数値であるから、細胞面積を当該分野で公知の任意の手法で測定することで、同様に算定することができる。上述したように、代表的な例として、位相差顕微鏡画像を用いた測定法があり、ここでは、倒立顕微鏡システム(CKX41,　Olympus,Tokyo,　Japan)等の市販のシステムを用いて撮影することができる。また、面積分布測定のためには、例えば、対象となる細胞をPBS(-)で３回洗浄する等して測定しやすい前処理を行った後、位相差顕微鏡画像を例えば、BZ　X-700顕微鏡システム(Keyence,　Osaka,　Japan)等の市販のシステムを用いて取得することができる。また、面積分布はBZ-H3C　Hybrid細胞計数ソフトウェア(Keyence)等の市販のソフトウェアを用いて定量することができる。

　好ましい実施形態では、本開示の細胞集団の平均細胞密度は、少なくとも約２１００個／ｍｍ^２以上、少なくとも約２２００個／ｍｍ^２以上、少なくとも約２３００個／ｍｍ^２以上、少なくとも約２４００個／ｍｍ^２以上、少なくとも約２５００個／ｍｍ^２以上であるがこれらに限定されない。上限としては、任意の実現可能な数値を挙げることできるが、例えば、約３０００個／ｍｍ^２以上、約３１００個／ｍｍ^２、約３２００個／ｍｍ^２、約３３００個／ｍｍ^２、約３４００個／ｍｍ^２、約３５００個／ｍｍ^２、約３６００個／ｍｍ^２、約３７００個／ｍｍ^２、約３８００個／ｍｍ^２、約３９００個／ｍｍ^２、約４０００個／ｍｍ^２等でも上限として実現可能である。これらの上限下限の任意の組合せが、本開示の細胞集団の好ましい細胞密度範囲として使用されることが理解される。

　このような細胞密度または細胞面積の特徴は、ハイブリッドセルカウント法による培養細胞の位相差像定量化技術による培養最終細胞産物の治験適用適合性評価に応用することができる。本開示の機能性成熟分化角膜内皮細胞は1細胞あたりの面積が小さく、培養における細胞密度が最も高くなることが判明している。本開示の製造法で作製した培養ヒト角膜内皮細胞でも実施例において例示されるように細胞面積は216μｍ²、細胞密度は2582個/ｍｍ²と正常角膜内皮組織の内皮細胞と同じ水準の細胞面積、細胞密度を示している。

　一つの実施形態において、本開示の細胞集団は、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞が、天然に存在する比率よりも高められた比率で存在することが特徴である。角膜内皮機能特性を惹起し得る細胞の比率が、天然に存在する比率よりも高い細胞集団を提供することによって、天然に入手可能な角膜内皮細胞の集団を用いるよりも効果の高い治療を提供することができるからである。このような角膜内皮機能特性を惹起し得る細胞の比率を高めることができるのは、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞（例えば、機能性成熟分化角膜内皮細胞または中程度分化角膜内皮細胞）を数多くの亜集団を特定し選抜することができる技術が提供されたからである。

　好ましい実施形態では、本開示の細胞集団における少なくとも５％以上の、約１０％以上の、約１５％以上の、約２０％以上の、約２５％以上の、約３０％以上の、約３５％以上の、約４０％以上の、約４５％以上の、約５０％以上の、約５５％以上の、約６０％以上の、約６５％以上の、約７０％以上の、約７５％以上の、約８０％以上の、約８５％以上の、約９０％以上の、約９５％以上の、約９８％以上の、約９９％以上の細胞が本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞であることが有利である。ここで、これらの細胞集団に含まれる細胞は、本明細書に記載の角膜内皮細胞機能特性を有し得る。例えば、これらの細胞集団に含まれる細胞としては、ＣＤ１６６陽性およびＣＤ１３３陰性を含む細胞機能特性を含み、必要に応じてＣＤ４４陰性～中陽性を有するものが選抜される。本開示の細胞集団が効果を奏する理由としては、理論に拘束されることを望まないが、一定程度の本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞が含まれることにより、その細胞集団を被験体に注入した際に、良好な治療効果または予防効果が示されるからである。好ましい実施形態では、本開示の細胞集団は、約７０％以上の細胞が本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞であることが有利である。このレベルの本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞の存在により、角膜細胞注入治療の成功の目安とされる細胞密度（例えば、約２３００細胞／ｍｍ^２）を達成することができるからである。さらに好ましい実施形態では、本開示の細胞集団は、約９０％以上の細胞が本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞であることが有利である。このレベルの本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞の存在比を達成しようとした場合は、偶然の手法ではできず、細胞亜集団をきっちりと確実に識別し分離することができる技術および情報を確立することが必要であるからであり、従来の技術ではこのようなことは大凡不可能であったといえるからである。なお、角膜細胞注入治療の成功の目安とされる細胞密度は、細胞集団を注入した後にヒトの角膜内皮面に生着した細胞の平均細胞密度を測定することによって、算定することができる。そのような細胞密度は、少なくとも約１０００個／ｍｍ^２以上であり、好ましくは少なくとも約１１００個／ｍｍ^２以上、好ましくは少なくとも約１２００個／ｍｍ^２以上、好ましくは少なくとも約１３００個／ｍｍ^２以上、好ましくは少なくとも約１４００個／ｍｍ^２以上、好ましくは少なくとも約１５００個／ｍｍ^２以上、好ましくは少なくとも約１６００個／ｍｍ^２以上、好ましくは少なくとも約１７００個／ｍｍ^２以上、好ましくは少なくとも約１８００個／ｍｍ^２以上、好ましくは少なくとも約１９００個／ｍｍ^２以上、好ましくは少なくとも約２０００個／ｍｍ^２以上、好ましくは少なくとも約２２００個／ｍｍ^２以上、好ましくは少なく
とも約２３００個／ｍｍ^２以上、好ましくは少なくとも約２４００個／ｍｍ^２以上、好ましくは少なくとも約２５００個／ｍｍ^２以上、好ましくは少なくとも約２６００個／ｍｍ^２以上、好ましくは少なくとも約２７００個／ｍｍ^２以上、好ましくは少なくとも約２８００個／ｍｍ^２以上、好ましくは少なくとも約２９００個／ｍｍ^２以上、好ましくは少なくとも約３０００個／ｍｍ^２以上でありうる。

　さらに好ましい実施形態では、本開示の細胞集団は、機能性成熟分化角膜内皮細胞の比率が、天然に存在する比率よりも高められた比率で存在することが特徴である。機能性成熟分化角膜内皮細胞は、そのまま眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を発現するというものであり、高品質の細胞の比率が、天然に存在する比率よりも高い細胞集団を提供することによって、天然に入手可能な角膜内皮細胞の集団を用いるよりもさらに効果の高い治療を提供することができるからである。このような高品質な機能性が付与された細胞の比率を高めることができるのは、本開示の機能性成熟分化角膜内皮細胞を数多くの亜集団において特定し選抜することができる技術が提供されたからである。

　好ましい実施形態では、本開示の細胞集団における少なくとも５％以上の、約１０％以上の、約１５％以上の、約２０％以上の、約２５％以上の、約３０％以上の、約３５％以上の、約４０％以上の、約４５％以上の、約５０％以上の、約５５％以上の、約６０％以上の、約６５％以上の、約７０％以上の、約７５％以上の、約８０％以上の、約８５％以上の、約９０％以上の、約９５％以上の、約９８％以上の、約９９％以上の細胞が機能性成熟分化角膜内皮細胞であることが有利である。このような機能性成熟分化角膜内皮細胞の比率は、本明細書において「Ｅ－ｒａｔｉｏ」（「Ｅ比」ともいう）と表示することがある。Ｅ－ｒａｔｉｏの算出方法は本明細書の他の箇所に記載されている。ここで、これらの細胞集団に含まれる細胞は、本明細書に記載の角膜内皮細胞機能特性を有し得る。例えば、これらの細胞集団に含まれる細胞としては、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ１３３陰性およびＣＤ４４陰性～弱陽性（好ましくは、ＣＤ４４陰性）を有するものが選抜される。あるいは、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ１３３陰性およびＣＤ２００陰性の細胞が選抜され得る。さらに品質を高めた本開示の細胞集団が効果を奏する理由としては、理論に拘束されることを望まないが、一定程度の機能性成熟分化角膜内皮細胞が含まれることにより、なお一層、その細胞集団を被験体に注入した際に、良好な治療効果または予防効果が示されるからである。好ましい実施形態では、本開示の細胞集団は、約４０％以上の細胞が機能性成熟分化角膜内皮細胞であることが有利である。このレベルの機能性細胞の存在により、角膜細胞注入治療の成功の目安とされる高い品質の細胞密度（例えば、角膜内皮面に生着した細胞で約１０００細胞／ｍｍ^２以上、好ましくは約２０００細胞／ｍｍ^２、通常約２３００細胞／ｍｍ^２）をより確実に達成することができるからである。さらに好ましい実施形態では、本開示の細胞集団は、少なくとも約７０％以上の、より好ましくは少なくとも８０％以上の、さらにより一層好ましくは少なくとも約９０％以上の細胞が機能性成熟分化角膜内皮細胞であることが有利である。このレベルの機能性細胞の存在比を達成しようとした場合は、偶然の手法ではできず、細胞亜集団をきっちりと確実に識別し分離することができる技術および情報を確立することが必要であるからであり、従来の技術ではこのようなことは大凡不可能であったといえるからである。なお、発明の技術を用いることにより、機能性成熟分化角膜内皮細胞の比率は、さらに高めることができ、例えば、少なくとも約９５％以上の、少なくとも約９６％以上の、少なくとも約９７％以上の、少なくとも約９８％以上の、少なくとも約９９％以上の細胞が機能性成熟分化角膜内皮細胞である細胞集団も提供することができる。そして、このような機能性成熟分化角膜内皮細胞を含む細胞集団が提供されることにより約２３００細胞／ｍｍ^２を超える（例えば、約３０００細胞／ｍｍ^２）ような治療成績を注入後１か月もたたないうちに達成することができることも実証されており、従来にない迅速かつ高品質な治療技術が提供されているといえる。

　一つの実施形態において、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞（機能性成熟分化角膜内皮細胞を含む）または細胞集団は、他亜集団に比較し、免疫拒絶反応に係るＨＬＡクラスＩ抗原や細胞変性関連抗原の発現が低いことも特徴である。また、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞、特に機能性成熟分化角膜内皮細胞は他亜集団でみられる自己抗体が存在しないことから、免疫学的にも安定な細胞であるといえる。

　別の局面では、本開示は、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞または細胞集団を含む製品を提供する。このような製品は、どのような形態でもよく、例えば、ヒトに投与するために調製される細胞加工製品等を指すがこれらに限定されない。このような細胞製品は、好ましくは、目的外の形質転換を起こしていないことや、細胞・組織が産生する生理活性物質による影響もないかまたは少ないこと、正常な細胞又は組織への影響もないかまたは少ないこと、異所性組織を形成する可能性がないかまたは少ないこと、望ましくない免疫反応が生じる可能性がないかまたは少ないこと、腫瘍形成及びがん化の可能性がないかまたは少ないこと、遺伝子導入が行われている場合には、遺伝子治療用製品指針に定める安全性評価がなされていること、および一般毒性試験等をクリアしていることが望ましい。

　別の局面では、本開示は、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞、機能性成熟分化角膜内皮細胞または細胞集団を培地交換により継代することを包含する該細胞または細胞集団の保存方法を提供する。ここで、この培地交換により、細胞機能特性が維持保存されることが本開示で解明された。ここで使用される培地は、任意の培地を用いることができるが、好ましくは、本明細書において説明される細胞の製法に用いられる成分や培地を用いることが有利である。

　別の実施形態では、本開示は、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞、機能性成熟分化角膜内皮細胞または細胞集団の保存方法を実施する工程を含む、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞、機能性成熟分化角膜内皮細胞または細胞集団の送達方法を提供する。

　なお、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞、機能性成熟分化角膜内皮細胞を分取する手順としてソーティングが代表的に挙げられるが、それ以外の方法として、例えば、目的細胞と非目的細胞の細胞特性の差を活用しての非目的細胞に選択的なアポトーシス誘導（miRNAスイッチ法）や壊死誘導（グルコース飢餓など）による方法を用いることができる。しかしながら、本開示では、通常、本開示の製法により本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞または機能性成熟分化角膜内皮細胞の純度を高めることがなされる。

　一つの実施形態では、本開示は、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞または細胞集団を含む細胞バンクを提供する。細胞バンクは、研究等を通じて生み出されたあるいは収集された「細胞」（通常培養細胞）を預かり、それを他の研究者や事業者に提供するための機関またはシステムをいう。

　別の局面において、本開示は、ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜組織機能（特に、ヒト角膜内皮機能特性）を惹起し得る機能性角膜内皮細胞（本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞）または機能性成熟分化角膜内皮細胞を含む医薬を提供する。本開示の医薬において使用される細胞は、本明細書の他の箇所にも記載されている任意の細胞を含むことができる。本開示は、他の治療評価項目、例えば、角膜厚、視力等でも顕著に改善するものであり、例えば、角膜厚の評価を見ても、従来法に比べ早期に治療効果が達成され、Ｅ－ｒａｔｉｏを上昇し、十分に角膜厚が減少しており、顕著な改善が見られている。本開示の医薬は、他の項目、例えば、視力、実質浮腫およびこれらの合計スコアでも、顕著に改善するものであり、また、重篤な有害事象は観察されず、非重篤な有害事象もほとんど観察されず、良好な治療結果を提供するものであると理解される。本開示の医薬は、水疱性角膜症等の角膜に障害を有する患者を対象とした培養角膜内皮細胞注入を行うことができる。

　１つの具体的な実施形態では、本開示の医薬は、角膜内皮機能障害、角膜内皮障害または角膜内皮疾患の処置のためのものである。このような角膜内皮機能障害、角膜内皮障害または角膜内皮疾患としては、角膜内皮障害Grade3と角膜内皮障害Grade4(代表的に、水疱性角膜症）（例えば、フックス角膜内皮ジストロフィ、PEX-BK（pseudoexfoliation　bullous　keratopathy；偽落屑症候群に伴う水疱性角膜症）、レーザー虹彩切開術後水疱性角膜症、白内障手術術後水疱性角膜症（偽水晶体眼または無水晶体水疱性角膜症）、緑内障術後水疱性角膜症、外傷後の水疱性角膜症、原因不明の多重手術後の水疱性角膜症、角膜移植後の移植片不全、先天遺伝性角膜内皮ジストロフィ、先天性前房隅角形成不全症候群等）とからなる群より選択される少なくとも一つを含むがこれらに限定されない。本明細書において使用されるグレードシステムは、Japanese　Journal　of　Ophthalmology　118:　81-83,2014に基づいた角膜内皮疾患の重症度分類に基づく。例えば、水疱性角膜症の一例としてレーザー虹彩切開術後水疱性角膜症があるが、緑内障治療薬のみでは眼圧コントロールが難しい患者の虹彩にレーザーで穴を開け、房水の流れを良くする手術であるが、その流水が角膜内皮に当たって、内皮が損傷すると考えられており、本開示の医薬は著効を示すと考えられる。フックス角膜ジストロフィについては、先天性の遺伝子疾患で、欧米では４０～５０歳以上の４～５％が罹患していると言われており、角膜中央の内皮が脱落して混濁を呈し、欧米での角膜移植の原因のトップを占めている。本開示の医薬はフックス角膜ジストロフィにも著効を示すと考えられる。また、ＭｕｌｔｉｐｌｅＯＰ－ＢＫと呼ばれる原因不明の多重手術後の水疱性角膜症にも有効である。このような多重手術としては、代表的に網膜硝子体手術と白内障＋眼内レンズ挿入を同時に行う手術で、通常「トリプル手術」と言われている術後などを挙げることができる。
　本開示の医薬は、任意の形態で被験体に投与することができるが、好ましい実施形態では、本開示の医薬に含まれる細胞は前房内投与されることが望ましい。培養角膜内皮細胞を前房内に注入する技術が確立されており、理論に拘束されることを望まないが、前房内注入により角膜内皮を再生させるという概念は、（１）低侵襲性で、（２）人工材料を用いず、（３）若年者由来の老化の少ない高機能性の角膜内皮細胞をマスター細胞として用いることが可能であるからである。また、前房内注入することによって、角膜内皮機能再生が最も効率よく行われるからであり、また、生体外で培養拡大後、細胞懸濁液を（水疱性角膜症等の）患者の前房内に注入することは、ヒト幹細胞を用いる臨床研究に関する指針に基づく研究（偵察・探索臨床研究）により、ヒト適用においての安全性、臨床POCは確立していることが本開示の過程において明らかになっているからである。

　本開示の医薬は、細胞の他に、さらなる薬剤とともに投与されてもよい。このようなさらなる薬剤としては、眼科治療において通常使用される薬剤（例えば、ステロイド剤、抗生物質、抗菌物質、NSAID）が使用され得る。このようなさらなる薬剤は、医薬として本開示の細胞医薬に含まれていてもよく、あるいは、別途投与される形態で提供されてもよい。別途提供または投与される形態の場合、キットや組合せ薬剤として提供される。キットや組合せ薬剤として使用される場合は、その使用方法を記した添付書類等が組み合わされてもよい。

　尚、「さらなる薬剤」に関していえば、本細胞注入に代わり、此処に詳述した細胞の産生物を単独もしくは当該細胞と共に注入することも可能であり、本開示には当該投与に適した細胞やその産生物も含まれる。

　本開示の医薬、医薬組成物または剤（治療剤もしくは予防剤等）はキットとして提供することができる。特定の実施形態では、本開示は、本開示の細胞または医薬の1以上の成分が充填された、1以上の容器を含む、薬剤パックまたはキットを提供する。場合によって、このような容器に付随して、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形で、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す情報を示すことも可能である。

　本開示の医薬は、さらに、細胞注入ビヒクルを含んでいてもよい。このような細胞注入ビヒクルは、本開示の細胞と混合されて提供されてもよく、あるいは、別々に提供されてもよい。別途提供または投与される形態の場合、キットや組合せ薬剤として提供される。キットや組合せ薬剤として使用される場合は、その使用方法を記した添付書類等が組合せされてもよい。

　本明細書において「キット」とは、通常2つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬、抗体、標識、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、検査薬、診断薬、治療薬、抗体等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。

　本明細書において「指示書」は、本開示を使用する方法を医師または他の使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本開示の検出方法、診断薬の使い方、または医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位として、眼球または前房への投与（例えば、注射などによる）することを指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本開示が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（FDA）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（label）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。

　本明細書において使用される「細胞注入ビヒクル」は、細胞を維持することができる限りどのような液でも用いることができ、眼潅流液等として用いられるものが含まれる。細胞注入ビヒクルとして使用されるものとしては、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、その添加物追加形態、ＯＰｅｇｕａｒｄ－ＭＡ、ＯＰｅｇｕａｒｄ＋Ｆ等を挙げることができる。発明で用いられる細胞注入ビヒクルはさらに、アルブミン、アスコルビン酸および乳酸の少なくとも一つを含んでいてもよい。
　本明細書において得られた知見をもとにして、代謝産物等を指標として、患者を層別化し、層別化された患者の病態に応じて本開示の細胞を適宜調製し、適切な治療を行うことができる。

　（ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜内皮細胞機能特性を発現し得るヒト機能性角膜内皮細胞の製造方法）
　一つの局面において、本開示は、ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜機能を惹起し得る機能性ヒト角膜内皮細胞を製造する方法であって、（ｂ）前記角膜内皮前駆細胞を、増殖ストレスなど培養ストレスを極小化し得る培養条件下で増殖および／または分化・成熟させる工程とを含む、方法を提供する。

　別の局面において、ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞を製造する方法であって、（ａ）ヒト角膜内皮組織由来細胞を脱分化させて角膜内皮前駆細胞を得る工程と、（ｂ）前記角膜内皮前駆細胞を、増殖ストレスなど培養ストレスを極小化し得る培養条件下で増殖および／または分化・成熟させる工とを含む、方法を提供する。

　さらに別の局面において、ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞を製造する方法であって、（ａ）ヒト角膜内皮組織由来細胞を脱分化させて角膜内皮前駆細胞を得る工程と、（ｂ）前記角膜内皮前駆細胞を、形質転換が生じる量未満の細胞成長因子の存在下で増殖および／または分化・成熟させる工程とを含む、方法を提供する。

　さらに他の局面においては、ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞を製造する方法であって、角膜内皮前駆細胞を、形質転換が生じる量未満の細胞成長因子の存在下で増殖および／または分化・成熟させる工程を含む、方法を提供する。

　好ましい実施形態では、ヒト角膜機能は、角膜内皮細胞機能特性を含み、さらに好ましくは、ヒト角膜機能は、角膜内皮細胞機能特性である。

　本開示の一実施形態において、ＣＤ４４抗原の発現強度が本開示のヒト機能性角膜内皮細胞の機能を左右する。ＣＤ４４を介するミトコンドリアのエネルギー代謝制御作用については、図１のように考えることができる。

　例えば、下記代謝関連酵素のミトコドリア局在で規定した早期臨床効果発現、長期安定的臨床効果の確認された培養ヒト角膜内皮細胞が本開示の細胞の一例である：

　本開示の一実施形態において、臨床効果に繋がる培養ヒト角膜内皮細胞の機能特性については、図２に示すとおり、規格細胞においては臨床効果につながる細胞機能として、ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳが活性され、カチオン・アニオン平衡や細胞内ｐＨが維持されることにより、水排出機能が高まり、角膜混濁改善、水和浮腫改善、角膜内皮細胞小型化、内皮組織の細胞高密度化につながる。

　本開示の一つの好ましい実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞を作成する際には、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）を培養液中に連続して添加する培養方法とすることができ、あるいは、脱分化時または培養早期にはＲＯＣＫ阻害剤は添加せず、増殖および／または分化・成熟させる工程にのみＲＯＣＫ阻害剤を存在させることで品質の高い規格細胞または品質の高い規格細胞の純度が高い細胞集団を生産することができる。また他の実施形態において、ＴＧＦ－β阻害剤（例えば、ＳＢ－４３１５４２）を、培養液中に添加しない培養方法とすることもできる。一つの実施形態では、亜集団レベルでの解析結果より、ＴＧＦ－β作用を抑制しない方が細胞形質が良いことがわかっている。また他の実施形態において、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤（例えば、ＳＢ２０３５８０）を、培養液中に添加しなかったり、培養の最終成熟工程にのみ添加する培養方法とすることもできる。一つの実施形態では、亜集団レベルでの解析結果より、細胞ストレスのかからない条件下ではｐ３８ＭＡＰキナーゼを抑制しない方が細胞形質が良いことがわかっている。
　本開示で有用な点の一つとしては、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤、および／あるいは、ＥＧＦなどの試薬をミニマムに使用することで、経済的に低価格において、使用した場合に匹敵する品質の細胞を提供しうることを見出した点が挙げられる。
　また、インビトロの製法で、生体組織で得られるレベルの細胞を入手することができるようになったことで、生体組織の細胞における品質を推測できるようになった点も有用な点でありうる。
　非限定的な好ましい実施形態では、理論に束縛されることを望まないが、ＴＧＦ－β阻害剤（例えば、ＳＢ－４３１５４２）についていえば、培養期間を通じて非添加であることが好ましい。
　非限定的な好ましい実施形態では、理論に束縛されることを望まないが、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤（例えば、ＳＢ２０３５８０）についていえば、培養期間を通じて非添加でもよく、培養最終の２８－３５日の段階でのみ添加する形態でもよい。

　また本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞を作成する際には、ヒト間葉系幹細胞馴化培地を用いないとすることもできる。これは、万人規模の医療展開の場合にヒトＭＳＣのドナー差／ロット差が障壁となり、含有ＳＡＳＰが品質を不安定化させ、ｍｉＲがパラクリン的に相転移を抑制するがロット差が大きいためである。　非限定的な好ましい実施形態では、理論に束縛されることを望まないが、ヒト間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ－ＣＭ）を培養期間全体にわたって非添加で十分であることが理解され得る。

　また本開示の一実施形態において、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞を作成する際には、細胞成長因子の一種であるＥＧＦを非添加とすることもでき、これにより安定的な目的細胞の生産をすることができる。また、Ｐ５など長期継代時にも目的細胞を高収率で得ることができる。一つの実施形態では、本開示の培養方法（製造方法）では、培養期間を通じてＥＧＦを使用しないことが好ましい。別の実施形態では、培養初期（例えば、７日以内等）のみに添加する培養方法を用いてもよい。一つの代替的な実施形態では、ＥＧＦの濃度を培養ストレスが生じない程度の濃度で使用してもよいことが理解される。

　本開示の一実施形態において、以上のように製造方法を変更したとしても、遺伝子発現変化の網羅的検索やフラックスアナライザーを用いるミトコンドリア呼吸機能の検定などの結果、培養ヒト角膜内皮細胞機能に影響を及ぼす変化は認めることはなかった（図３）。

　本開示の一実施形態において、体性（幹）細胞からの脱分化経路による分化成熟・機能性ヒト角膜内皮細胞の誘導は図４のようにして行うことができる。この方法によれば、増殖性・継代可能数が、若年者ドナーでＰ６：８３，０００倍水準であり、１眼から約１０，０００眼分を得ることができ、ドナー年齢幅が拡大し、壮年者ドナーでもＰ４で１眼から約６００眼分を得ることができる。また、良好な細胞形態・形状の維持、高密度の維持、細胞面積約２００ｍｍ，分布小を達成することができる。

　本開示の一実施形態において、理論に束縛されることを望まないが、図５に示すような製法は、分化とEMTを含む相転移を並行して起こさせるものであるため拮抗作用による不都合が生じ得るところ、本開示のように、角膜内皮前駆細胞を、増殖ストレスなど培養ストレスを極小化し得る培養条件下で増殖および／または分化・成熟させる工程および／または増殖および／または分化・成熟させる工程は調節された微量の細胞成長因子の存在下で行うことによって、形質転換による分化作用に対する拮抗作用による副作用を解決することができる。

　本開示の一実施形態においては、形質転換は内皮間葉系移行を含み、増殖および／または分化・成熟させる工程はＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行われることもできる。

　また本開示の一実施形態において、増殖および／または分化・成熟させる工程後に得られた候補細胞において、（ｉ）ＴＣＡ回路などに係る代謝酵素やＡｃｅｔｙｌＣｏＡなどの代謝産物が夾雑相転移細胞の生成に繋がらないように細胞質や核には存在せずに、ミトコンドリアにオルガネラ選択的に局在する特性を有する（ｉｉ）ミトコンドリアにおいてミトコンドリア依存性酸化的リン酸化の増加、（ｉｉｉ）アセチルＣｏＡによるヒストンアセチル化を介するエピジェネティックな多遺伝子発現の低下（惹起無を含む）、（ｉＶ）ナトリウム／水素交換体１（ＮＨＥ１）および／またはアクアポリン１（ＡＱＰ－１）の発現の亢進、並びに（ｖ）重炭酸脱水酵素５Ｂ（ＣＡ５Ｂ）の発現が亢進することからなる群から選択される少なくとも１つの特徴を確認し、該特徴を少なくとも１つ含む場合、該候補細胞が該ヒト機能性角膜内皮細胞であると同定する工程をさらに含むこともできる。

　本開示では、細胞内ｐＨの制御に係る細胞の発現するイオンチヤンネルCarbonic Anhydrase(CA)、ＮＨＥ－１や単カルボン酸〔ピルビン酸、乳酸などの代謝産物〕の細胞内輸送体発現や角膜混濁、水和浮腫の軽減など臨床効果に直結する水の排出に係るＡＱＰ１発現亢進などの形質で規定した細胞が提供されることが一つの特徴であり得る。これらの特徴を有することの結果として、細胞内ｐＨ、結果として、細胞の大きさの規定、ミトコンドリア機能の制御に係る機能が精緻に規定された細胞が本開示において提供される。

　したがって、本開示の一実施形態において、増殖および／または分化・成熟させる工程後に得られた候補細胞のミトコンドリアにおいて、クエン酸シンターゼ（ＣＳ）、アコニターゼ２（ＡＣＯ２）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ２（ＭＤＨ２）、リンゴ酸酵素３（ＭＥ３）、ＡＣＳＳ１、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ１（ＡＣＡＴ１）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、ＢＣＡＴ２、及び分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ２（ＢＣＫＤＨ２）からなる群から選択される１または複数の代謝関連酵素が発現しているかどうかを確認し、該発現が確認された場合、該候補細胞をヒト機能性角膜内皮細胞であると同定する工程をさらに含むこともできる。

　また本開示の他の一実施形態において、増殖および／または分化・成熟させる工程後に得られた候補細胞において、ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬＹ）、アコニターゼ１（ＡＣＯ１）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１（ＭＤＨ１）、リンゴ酸酵素１（ＭＥ１）、ＡＣＳＳ２、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ２（ＡＣＡＴ２）、及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）からなる群から選択される少なくとも１つの酵素が発現しているかどうかを確認し、該酵素が発現しない、または実質的に発現していない場合、該候補細胞をヒト機能性角膜内皮細胞と同定する工程をさらに含むこともできる。

　さらに、他の実施形態において、増殖および／または分化・成熟させる工程後に得られた候補細胞において、ナトリウム／水素交換体１（ＮＨＥ１）および／または水チヤンネルであるアクアポリン１（ＡＱＰ－１）の発現が亢進しているかどうかを確認し、該亢進が確認される場合、該候補細胞をヒト機能性角膜内皮細胞と同定する工程をさらに含むこともでき、別の実施形態においては、増殖および／または分化・成熟させる工程後に得られた候補細胞において、重炭酸脱水酵素５Ｂ（ＣＡ５Ｂ）の発現が亢進しているかどうかを確認し、該亢進が確認される場合、該候補細胞をヒト機能性角膜内皮細胞と同定する工程をさらに含むこともできる。

　また本開示の一実施形態において、ヒト機能性角膜内皮細胞が、角膜内皮組織由来細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、角膜内皮から採取した角膜内皮前駆細胞、角膜内皮から採取した細胞、並びにダイレクトプログラミング法で作成される角膜内皮前駆細胞および角膜内皮様細胞からなる群から選択される細胞を起源として作製されたものであるかどうかを確認する工程をさらに有することもでき、他の実施形態においては、角膜内皮前駆細胞を、角膜内皮組織由来細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、角膜内皮から採取した角膜内皮前駆細胞、角膜内皮から採取した細胞、並びにダイレクトプログラミング法で作成される角膜内皮前駆細胞および角膜内皮様細胞からなる群から選択される細胞を起源として作製する工程を包含することもできる。

　本明細書において「角膜内皮組織由来細胞または角膜内皮前駆細胞」とは、本明細書において別の箇所で定義されるように、それぞれ、角膜内皮組織に由来する細胞および脱分化工程を経て分化することで、本開示の角膜内皮特性具備機能性細胞または機能性成熟分化角膜内皮細胞になる細胞を指すが、これらには、ドナーの角膜内皮から入手した細胞の他、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等から角膜内皮細胞様に分化させた細胞、角膜内皮細胞に分化する前の前駆細胞等任意の細胞を含み、本明細書で定義される中程度分化角膜内皮細胞も含まれる。

　本開示の製造方法において、使用され得る出発材料としての角膜内皮組織由来細胞は、生体から採取したものであり、あるいは、使用され得る出発材料は、角膜内皮前駆細胞、例えば、幹細胞もしくは前駆細胞から分化させたものであってもよい。このような分化させた細胞は、例えば、種々の幹細胞（例として、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、受精卵、体性幹細胞）から分化させた細胞を含みうるがこれらに限定されない。したがって、具体的な実施形態では、本開示において使用される（出発材料としての）角膜内皮組織由来細胞または角膜内皮前駆細胞は、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、角膜内皮から採取した角膜内皮前駆細胞、角膜内皮から採取した角膜内皮細胞、ならびにダイレクトプログラミング法で作成される角膜内皮前駆細胞および角膜内皮様細胞等を挙げることができるがこれらに限定されない。ここで、多能性幹細胞としては、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等を挙げることができるがそれらに限定されない。したがって、本開示において使用される（出発材料としての）角膜内皮細胞またはその前駆細胞は、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等から、角膜内皮様に分化させることによって調製される細胞を含むことが理解される。誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等から、角膜内皮様に分化させる技術は当該分野において公知であり、例えば、ＡＭＥＤ法（Ｕｅｎｏら上述）、ＷＯ２０１３／０５１７２２（慶應義塾）等を挙げることができるがそれらに限定されない。

　角膜内皮様に分化させていない細胞を用いる場合は、角膜内皮様に分化または成熟分化させる工程を包含することが好ましい。

　（品質管理）
　本開示の一実施形態において、ヒトの眼前房内への細胞注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞の品質管理または工程管理の方法であって、前記細胞のミトコンドリアにおいて、クエン酸シンターゼ（ＣＳ）、アコニターゼ２（ＡＣＯ２）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ２（ＭＤＨ２）、リンゴ酸酵素３（ＭＥ３）、ＡＣＳＳ１、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ１（ＡＣＡＴ１）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、ＢＣＡＴ２、及び分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ２（ＢＣＫＤＨ２）からなる群から選択される１または複数の代謝関連酵素が発現していることを確認する工程を含むこともできる。この場合、ヒト機能性角膜内皮細胞において細胞質・核内のアセチルＣｏＡの発現、およびアセチルＣｏＡによるヒストンアセチル化を介するエピジェネティックな多遺伝子発現が惹起されていないことを確認する工程をさらに含むこともできる。

　また、他の一実施形態において、品質管理を行う際に、ヒト機能性角膜内皮細胞において、ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬＹ）、アコニターゼ１（ＡＣＯ１）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１（ＭＤＨ１）、リンゴ酸酵素１（ＭＥ１）、ＡＣＳＳ２、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ２（ＡＣＡＴ２）、及び／または乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）が発現していない、または実質的に発現していないことを確認する工程をさらに含むこともでき、他の実施形態においては、ヒト機能性角膜内皮細胞において、ナトリウム／水素交換体１（ＮＨＥ１）および／またはアクアポリン１（ＡＱＰ－１）、または重炭酸脱水酵素５Ｂ（ＣＡ５Ｂ）の発現が亢進していることを確認する工程をさらに含むこともできる。また、他の実施形態においては、品質管理を行う際に、ヒト機能性角膜内皮細胞において、細胞内ｐＨを測定する工程を含むこともできる。

　（他の実施の形態）
　本開示の１つまたは複数の態様に係る判定方法および解析方法について、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、この実施の形態に限定されるものではない。本開示の趣旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を本実施の形態に施したものや、異なる実施の形態における構成要素を組み合わせて構築される形態も、本開示の１つまたは複数の態様の範囲内に含まれてもよい。

　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。

　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

　以下に、実施例を用いて、本開示をより詳細に説明するが、本開示はこれらの実施例に限定されるものではない。

　以下に、本開示において用いる実験手法および材料について説明する。なお、本実施形態において、以下の実験手法を用いているが、これら以外の実験手法を用いても、同様の結果を得ることができる。

　以下の実施例では、ヘルシンキ宣言などの医療的な倫理規定、ＧＣＨなどの規則、ならびに、京都府立医科大学その他で規定される規定を遵守し、発明者が所属する組織に関係する倫理委員会の承認のもとで行った。必要なインフォームドコンセントを取得した上で以下の実験を行った。

　（実施例１：Ｉ．添加ＥＧＦ濃度の検討実験）
　本実施例では、機能性ヒト角膜内皮細胞の製造において、使用する上皮成長因子（ＥＧＦ）の濃度についての検討を行った。以下に詳細を示す。

　（方法および材料）
　ドナー情報は#202、ABG-404OSCN/ODCN（右目左目）、年齢64、内皮細胞密度（ECD）= 3104/3070、死因（COD）:Metastatic Neuroendocrine　Carcinoma of the Uterus、D-P （角膜ドナーの死亡後、角膜を保存液に入れるまでの時間）=12:15、D-C（角膜ドナーの死亡後、細胞培養に入るまでの時間）=8Dである。
　添加ＥＧＦの濃度は、以下の培養条件において、検討した。詳細は以下のとおりである。
0+Y, SB2,EGF,Asc（アスコルビン酸）で培養
↓
P1 +Y, SB2,EGF,Ascで培養
↓
P2 EGF(-), 0.5ng/mL,1 ng/mL, 5 ng/mLの4通りで培養(+Y, SB2, Asc)
↓ P2それぞれの条件から継代
P3 EGF(-),0.5ng/mL, 1 ng/mL, 5 ng/mLの4通りで培養(+Y, SB2, Asc)
↓ P3それぞれの条件から継代
P4 EGF(-),0.5ng/mL, 1 ng/mL, 5 ng/mLの4通りで培養(+Y, SB2, Asc)
＊剥離時のトリプシン（TrypLE、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）濃度x10、播種細胞数ECD800
　（以上、Ｐは継代数を示す。）

　培養条件は以下のとおりである。
　SB2,EGF,Ascは、それぞれ、ＳＢ２０３５８０、上皮細胞成長因子、アスコルビン酸を意味する。表皮成長因子は和光純薬工業株式会社（大阪、日本）から購入し、ＳＢ２０３５８０（ＳＢ２）はケイマンケミカル（アンアーバー、ミシガン州）から入手した。ダルベッコの改良イーグル中高グルコース（ＤＭＥＭＨＧ）およびウシ胎児血清はギブコ・インダストリーズ社（ラングリー、ＯＫ）から入手し、プラスチック培養プレートはコーニングから入手した。異なる指示がない限り、他のすべての化学物質は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｎｃ．（ミズーリ州セントルイス）から購入した。
　EGF(-),0.5ng/mL, 1 ng/mL, 5 ng/mLは、上記SB2, EGF, Ascにそれぞれの濃度のＥＧＦを加えたもの、または加えないものである。

　（結果）
　Ｐ２のＤ４１での４つの写真を図６に示した。またＰ３～Ｐ４でのＦＡＣＳの結果を図７～図１０に示した。
　これらの結果から、理論に束縛されることを望まないが、顕微鏡観察での細胞形状、および細胞表面ＣＤ抗原形質の両面から判断して、Ｐ２－Ｐ４のどの継代時でもＥＧＦ非添加が望ましいことがわかった。また、成長因子ＥＧＦ非添加での増殖ストレス解除の意義として、本開示のヒト機能性角膜内皮細胞を作成する際にＥＧＦ非添加とすると、ＥＭＴを含む細胞相転移ＣＳＴが解除され細胞老化回路が回避され成熟分化細胞が効率よく製造されることが考えられる。

　（実施例２：ＩＩ．初代培養時からのＥＧＦ添加効果）
　次に、初代培養時におけるＥＧＦの添加の与える影響について調べた。以下に詳細を示す。

　（方法および材料）
　次に、Ｐ０初代培養時からＥＧＦを添加した場合の効果を調べた。
　ドナー情報は、#214、ABS-355OSCN/ODCN、NancyY(+)、年齢 18、内皮細胞密度（ECD）= 3571 / 3401、死因: Multitrauma 2’ MVA、D-P= 12:32、D-C = 7Dである。
　また培養条件等は以下のとおりである。
P0 2眼まとめてEGF(-),0.5ng/mLの2通りで培養(+Y, SB2, Asc)
↓ P0それぞれの条件から継代
P1 EGF(-),0.5ng/mLの2通りで培養(+Y, SB2, Asc)
↓ P1それぞれの条件から継代
P2 EGF(-),0.5ng/mLの2通りで培養(+Y, SB2, Asc)
＊剥離時のTrypLE濃度x10、播種時ECD800

　Y, SB2,Ascは、それぞれ、Ｙ２７６３２、ＳＢ２０３５８０、アスコルビン酸を意味する。Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤Ｙ－２７６３２（Ｙ）および表皮成長因子は和光純薬工業株式会社（大阪、日本）から購入し、ＳＢ２０３５８０（ＳＢ２）はケイマンケミカル（アンアーバー、ミシガン州）から入手した。ダルベッコの改良イーグル中高グルコース（ＤＭＥＭＨＧ）およびウシ胎児血清はギブコ・インダストリーズ社（ラングリー、ＯＫ）から入手し、プラスチック培養プレートはコーニングから入手した。異なる指示がない限り、他のすべての化学物質は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｎｃ．（ミズーリ州セントルイス）から購入した。
　EGF(-),0.5ng/mLは、上記Y, SB2, Ascにそれぞれの濃度のＥＧＦを加えたもの、また
は加えないものである。具体的に記載したもの以外は実施例１に準ずる。

　(結果）
　またＰ０～Ｐ２でのＦＡＣＳの結果を図１１～図１４に示した。理論に束縛されることを望まないが、本開示の角膜内皮細胞は、ＥＧＦ非添加の場合にその比率が上昇することから、ＥＧＦの非添加の場合（または濃度が低い場合）には、培養ストレスが減少し、より好ましい細胞が製造されることが理解され、ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜機能を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞の製造には、好ましいことが理解される。

　したがって、これらからも、本開示において、角膜内皮前駆細胞を、増殖ストレスなど培養ストレスを極小化し得る培養条件下で増殖および／または分化・成熟させることが規格細胞割合の高い培養のためには重要であることが理解される。

　（実施例３：III．EGF非添加のmIR発現での検定、ＲＯＣＫ阻害剤の添加効果）
　本実施例では、EGF非添加の細胞規格をmIR発現で検定し得るかどうかを試験し、また、ＲＯＣＫ阻害剤の添加効果についても検証した。

　（材料および方法）
　図１５のように場合分けし、ｍｉＲ３７８、ｍｉＲ１４６、ｍｉＲ３４、ｍｉＲ１８４の細胞内での遺伝子変動を測定した。
　ＲＯＣＫ阻害剤としてはＹ２７６３２を使用した。
　培養条件は、実施例１および２に準ずる。

　（結果）
　FACS測定および写真評価結果を図１６に示した。その結果、年齢差の影響がY＋/-に重層していることがわかった。

　qRT-PCRによるEGFありなし、及びYありなしの場合のｍｉＲ１８４、ｍｉＲ３４、ｍｉＲ３７８、ｍｉＲ１４６遺伝子発現変動の結果を図１７および図１８に示した。

　この結果、理論に束縛されることを望まないが、miR184は、（１）細胞内CD44遺伝子発現量と逆比例関係である、（２）壮年より若年で発現量増加、（３）ＲＯＣＫ阻害剤非添加よりＲＯＣＫ阻害剤添加で発現量増加、（４）EGF添加よりEGF非添加で発現量増加、ということがわかった。

　また、理論に束縛されることを望まないが、miR34a-5pは、（１）同一ドナー内では細
胞内CD44遺伝子発現量と逆比例関係であるが、ドナーを超えた比較ではCD44との対比は逆転する可能性を示唆、（２）壮年より若年で発現量変化なし、（３）ＲＯＣＫ阻害剤非添加よりＲＯＣＫ阻害剤添加で発現量増加、（４）EGF添加よりEGF非添加で発現量増加、ということがわかった。

　この結果から、理論に束縛されることを望まないが、EGF非添加が望ましいことは細胞特性指標のmiR184, 34a発現強度からも確認できた。またＲＯＣＫ阻害剤を添加することによりmiR184および34aの発現量が増加することが確認できた。

　これらからも、本開示において、角膜内皮前駆細胞を、増殖ストレスなど培養ストレスを極小化し得る培養条件下で増殖および／または分化・成熟させることが重要であることが理解される。

　（実施例４：IV．EGF非添加時の細胞機能特性代謝産物による検定、ＲＯＣＫ阻害剤の添加効果）
　続いて、EGF非添加の本開示の細胞の細胞機能特性代謝産物の検定を行った。また、ＲＯＣＫ阻害剤の添加効果も判定した。

　（材料および方法）
　本実施例では、ヒト機能性角膜内皮細胞の代謝産物特性と非目的細胞の代謝産物特性と差異を確認した。
　（代謝産物検定）
　培地中の代謝産物の測定
　培養上清（CS）の代謝物の測定用に、20μLのCSおよび内部標準溶液1（H3304-1002;HumanMetabolome Technologies、Inc.、Yamagata、Japan）を含む80μLMilli-Q（Merck1 KGaA、ドイツ、ダルムシュタット）を完全に混合した。陽イオン化合物は、CE飛行時間型質量分析（CE-TOFMS）のポジティブモードで測定し、陰イオン化合物は、CEタンデムMS（CE-MS/MS）のポジティブモードとネガティブモードで測定した。階層的クラスター分析（HCA）は、独自のソフトウェアである「PeakStat」を使用して実行した。値の違いは、スチューデントのt検定または一元配置分散分析（ANOVA）とボンフェローニの事後検定（GraphPadPrism6.0、GraphPadソフトウェア）を使用して統計的に分析した。<0.05のp値を統計的に有意とみなした。
　ＲＯＣＫ阻害剤の添加効果については、実施例３に準じて行った。

　（結果）
　代謝産物の階層性の例を図１９に示した。
　また、本開示が目的とするヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜機能を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞（目的細胞）と、そうではない細胞（非目的細胞）との代謝産物特性を確認した結果を図２０～図２２に示した。

　その結果、目的細胞はLactic Acid やL/P（乳酸／ピルビン酸）比の増加が乏しいことがわかり、これは嫌気的解糖活性が低いことを示す。また目的細胞はGlnが増加する一方で、Gluはあまり増加しないことがわかり、これはGlutaminonysisよりGln合成経路を亢進させることを示す。

　また目的細胞はＢＣＡＡが顕著に低値を示すことがわかり、これはＢＣＡＡ依存性が高い代謝であることがわかる。

　さらにＥＧＦの添加量が少なくなると目的細胞の特徴の一つである分岐鎖アミノ酸（Ｉｌｅ，Ｌｅｕ）の産生量が低下することがわかり、これにより目的細胞含量が増えることがわかった。

　理論に束縛されることを望まないが、以上の結果から、ＥＧＦ添加により培養内皮細胞の代謝産物は非目的細胞プロファイルを示すことがわかった。

　また、ＥＧＦの添加量が少ない方が、Ｌａｃｔｉｃ　ＡｃｉｄやＬ／Ｐ比の増加が乏しいことから、嫌気的解糖活性が低い目的細胞の含量が増え、すなわち、ＥＧＦ添加によって培養内皮細胞は嫌気的解糖活性が高い非目的細胞プロファイルを示すことがわかった。

　（実施例５：Ｖ．各種添加物の効果）
　本実施例では、各種添加物の効果を試験した。以下に詳述する。
Ｖ－１．ｐ３８　ＭＡＰＫ阻害剤（ＳＢ２０３５８０）非存在の新培養法での製品の評価
　本実施例では、ｐ３８　ＭＡＰＫ阻害剤であるＳＢ２０３５８０を加えない手法（ＳＢ２－ともいう。）について試験した。

　（材料および方法）
　ＳＢ２－の新培養法で製品を評価するため、ロットCT09 P5を用いて添加物の効果を検定した。まずＣＴ０９　Ｐ４（ＦＢＳロット検定用細胞余り）を用いて、継代前日に培養上清を回収し（Ｄａｙ４２）、その後ＣＴ０９　Ｐ５にＥＣＤ４００で継代（１８１２１９）し、Ｎａｎｃｙ培地（ＦＢＳ＃１６５２７９４、アスコルビン酸含）で図２３に示す１～５の条件で培養した（各６ウェルプレート２ウェル）。１週目から５週目までは培養上清を回収し、Ｄａｙ３４（１９０１２２）で１ウェルをＦＡＣＳ測定し、培養上清はＩＬ－８，ＰＤＧＦ－ｂｂをＥＬＩＳＡで測定した。

　また実験条件については、図３０に、ＥＬＩＳＡ　ＰＤＧＦ－ｂｂおよびＩＬ－８のＣＴ０９　Ｐ４、Ｐ５の培養上清・サンプルリストを示した。

　（結果）
　各条件でのＣＴ０９　Ｐ５の写真を図２４～図２６に、またＤａｙ３４でのＦＡＣＳの結果を図２７～図２９にそれぞれ示した。
　またＥＬＩＳＡ　ＰＤＧＦ－ｂｂおよびＩＬ－８のＣＴ０９　Ｐ４、Ｐ５の培養上清・サンプルリストを図３０に示した。ＰＤＧＦ－ｂｂを添加物で分類した結果を図３１に、週で分類した結果を図３２に、それぞれ示した。またＩＬ－８を添加物で分類した結果を図３３に、週で分類した結果を図３４に、それぞれ示した。
　以上の結果から、理論に束縛されることを望まないが、添加物の効果について、総合的に見てＳＢ４、ＥＧＦなし、Ｙ　１０日目から、ＳＢ２非添加または培養最終期のみの添加が望ましいことがわかった。

Ｖ－２．ミトコンドリア呼吸能
　本実施例では、ミトコンドリア呼吸能を調べた。

（材料および方法）
　角膜内皮細胞（ＨＣＥＣ）をSightLife（Seattle、WA、USA）が提供したドナー角膜から入手し、そのＨＣＥＣを公開されているプロトコル（Toda M,UenoM, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci.2017;58:2011）にいくつかの修正を加えた方法で培養した。２～５代のＨＣＥＣをすべての実験に使用した。ＣＳＴを含むＳＰは、低細胞密度で継代培養した。ｃＨＣＥＣのＳＰは、位相差顕微鏡画像とフローサイトメトリー法を用いて、細胞表面マーカー（ＣＤ２４、４４、１０５、１６６）によって特定した。

　（結果）
　その結果を図３５～図３７に示した。
　以上の結果から、規格細胞ではミトコンドリア呼吸能が高いことがわかった。またＥＧＦ添加は規格細胞比率を低下させるが、これに対応してミトコンドリア呼吸能が低下し、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）が低下することもわかった。

　（実施例６：ＶＩ．ＲＯＣＫ阻害剤の添加）
　本実施例では、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ２７６３２）の添加について、ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜機能を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞（目的細胞）産生に与える効果を調べた。

　（材料および方法）
　ドナー情報を図３８に示す。培養の条件については、＃１９０７１９ではＰ１，Ｐ２でＹ添加時期の検討を行い、＃１９０８０２ではＰ１でＹ添加時期の検討を行うため、図３９に示した条件で各１ｗ～５ｗの培養上清を回収した。また#190318ではP1,P2で図４０に示した条件で培養上清を回収した。

　（結果）
　ＦＡＣＳ結果を図４１および図４３～図４５に、培養細胞写真を図４２に示した。この結果から、３つの実験のいずれにおいてもＲＯＣＫ阻害剤を培養開始後１０日目に添加したほうが規格細胞の割合は高くなっていた。理論に束縛されることを望まないが、この結果から、増殖および／または分化・成熟させる工程において、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することが好ましいことが理解される。これらからも、本開示において、角膜内皮前駆細胞を得るために不可欠な効率よい分化が誘導されることが判明した。

　また#190719の培養上清中のELISAPDGF-bb測定結果（項目ごと）を図４６に示した。この結果、Ｐ１およびＰ２の２つの実験のいずれにおいても、ＲＯＣＫ阻害剤を培養開始後１０日目に添加しても成熟規格細胞の規格の一つのＰＤＧＦは分化から成熟期に至り高くなっており、本培養条件下では高価なＹを接着目的で、培養初日から添加することは無意味なことが示された。分化の時期に添加する方が脱分化を阻害しないためと考えられる。またＰ１では、４ｗでピークとなり、５ｗでやや低下することもわかった。

　また#190318の培養上清中のELISAPDGF-bb測定結果（項目ごと）を図４７に示した。この結果、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２を添加しない方法では、３ｗでＰＤＧＦ高値となり、分化の早期誘導を示すことがわかった。

　また＃１９０７１９の培養上清中のＥＬＩＳＡ　ＰＤＧＦ－ｂｂ測定結果（週ごと）を図４８に、＃１９０３１８の培養上清中のＥＬＩＳＡ　ＰＤＧＦ－ｂｂ測定結果（週ごと）を図４９に、それぞれ示した。この結果、理論に束縛されることを望まないが、＃１９０７１９のＰ１，Ｐ２ではＹ２７６３２添加でＰＤＧＦ高値に、またＰ１増殖期はやや低値になることがわかった。理論に束縛されることを望まないが、またＰＤＧＦはＳＢ２０３５８０の有無とはほぼ関係なく、独立因子であることもわかった。

　また＃１９０７１９の培養上清中のＥＬＩＳＡ　ＩＬ－８測定結果（項目ごと）を図５０に示した。この結果、Ｐ１およびＰ２の２つの実験のいずれにおいても、ＲＯＣＫ阻害剤を培養開始後１０日目に添加しても、成熟規格細胞の規格の一つのＩＬ８は分化から成熟期に至り最も低くなっていた。またＰ１では増殖期は高値であり、分化が進むと低値となり、Ｐ２でも分化が進むと低値となることもわかった。

　また＃１９０３１８の培養上清中のＥＬＩＳＡ　ＩＬ－８測定結果（週ごと）を図５１に示した。この結果、ＩＬ－８はＳＢ２の有無にほぼ依存的に変動することがわかった。

　また＃１９０８０２の培養上清中のＥＬＩＳＡ　ＰＤＧＦ－ｂｂおよびＩＬ－８測定結果（項目ごと）を図５２に示した。この結果、ＰＤＧＦはＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２）による分化誘導に依存的に増加すること、またＩＬ－８はｐ３８　ＭＡＰＫ阻害剤（ＳＢ２０３５８０）に依存的に減少することがわかった。

　また＃１９０３１８の培養上清中のサイトカイン測定（Ｂｉｏ　Ｐｌｅｘ）の結果（項目ごと）を図５３に示した。その結果、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＭＩＰ－１ｂの３つともｐ３８　ＭＡＰＫ阻害剤（ＳＢ２０３５８０）に依存的であることがわかった。

　これらからも、本開示において、角膜内皮前駆細胞を得るために不可欠な効率よい分化が誘導されることが判明した。

　（実施例７：ＶＩＩ．ＲＯＣＫ阻害剤の添加）
　本実施例でも、実施例6に続き、ＲＯＣＫ阻害剤に関する条件をさらに調べた。以下に詳述する。

　（材料および方法）
　＃１９０７１９のＰ４を用いて１～５ｗで培養上清を回収してＲＯＣＫ阻害剤の有無による違いを調べた。添加物の条件を図５４に示した。ドナー情報は、#190719S/D、AEB-301、OSCN/ODCN、Age= 40 / Gender = M、ECD = 3448 / 3289、COD:BleomycinLung Toxicity 2/2 ChemoTreatments、D-P = 11:28、D-C = 8Dである。

　（結果）
　ＤＡＹ３５の写真を図５５に、ＦＡＣＳ結果を図５６及び図５７に、それぞれ示した。またＥＬＩＳＡでのＰＤＧＦ－ｂｂおよびＩＬ－８の項目ごとの結果を図５８に、週ごとの結果を図５９に、それぞれ示した。

　以上の結果、３群比較の実験においても、ＲＯＣＫ阻害剤を培養開始時に３日間添加しても、成熟規格細胞はＦＡＣＳでまったく検出されなかった。また規格の一つであるＰＤＧＦは低値であり、規格基準値を満足しないことがわかった。ＩＬ－８についても規格より高値となり、これは分化の時期に添加する必要性を示す。

　以上から、一つの実施形態では、増殖および／または分化・成熟させる工程において、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することが好ましいことが理解される。

　（実施例８：ＶＩＩＩ．ＲＯＣＫ阻害剤による接着増強）
　次に、ＲＯＣＫ阻害剤の接着増強に関する試験を行った。ＲＯＣＫ阻害剤による接着増強が規格細胞製造に関係するかどうかを調べるため、以下の条件で培養された細胞をＰ０においてＹ添加またはＹ非添加で比較検証した。

　(材料および方法）
　AEM-510(62Y,Male)、ECD ODCN :3058、OSCN : 3058を用いて、1/30に4℃で保存し、1/31 10:00に角膜処理を行い、10:45にODコラゲナーゼ処理を開始し、11:05にOSコラゲナーゼ処理を開始した。その後、14:45から播種を開始し、ODではY-,A（アスコルビン酸）+で、OSではY+,A+で培養した。2/4 10:00に培地交換し、両眼：Y+,A+、写真撮影(位相差x4, x10)を行った。

　（結果）
　その結果を図６０～図６３に示した。この実施例で示した実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２は細胞播種後、確かに培養器への接着を亢進するものの、４日目以降に初めてＹ２７６３２を添加しても培養１４日目に差異はまったく認められないことから、増殖および／または分化・成熟させる工程において、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することでも、規格細胞が提供され得ることが理解される。

　（実施例９：ＩＸ．ミトコンドリアから核への情報伝達によるエピゲノム制御）
　本実施例では、ミトコンドリアから核への情報伝達によるエピゲノム制御を調べた。
　ミトコンドリアから核への情報伝達によるエピゲノム制御については、Cell Metab. 2015 Mar 3;21(3):349-50.、Trends inCell Biology,June2017, Vol.27, No.6、およびSheikh et al. Nature Rev. Genetics,2019などに詳しく、代謝産物によるEpigenetics制御と細胞老化や細胞分化の破綻については図６４の模式図のように考えることができる。またオルガネラ局在の酵素としては図６５のものが考えられ、上述の脱分化前駆細胞で発現するアイソザイムは細胞質、核に存在することで核内移行ＡｃＣｏＡを介してヒストンのアセチル化を行う。

　本実施例においては、代謝酵素などのタンパク発現が規格細胞と相転移を起こした非規格細胞との間で顕著に異なることを検証し、アイソザイムのオルガネラ選択的局在の明確な差を示すことができた。

　（材料および方法）
　いわゆるＤＡＶＩＤ解析を行った。以下に手順を示す。
　（ＨＣＥＣ）
　まずＨＣＥＣは、公開されているプロトコルにいくつかの修正を加えた手法に従って培養した。ＣＥＣを含むデスメ膜をドナー角膜から剥がし、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＡ（RocheApplied Science、Penzberg、Germany）で３７℃で２時間消化した。単一のドナー角膜から得られたＨＣＥＣを、Ｉ型コラーゲンコーティング６ウェルプレート（Corning,Inc.,Corning,NY）の１ウェルに播種した。培地は公開されたプロトコルに従って調製した。ＨＣＥＣがコンフルエンスに達したときに、３７℃で１２分間、１０×ＴｒｙｐＬ　Ｓｅｌｅｃｔ（ThermoFisherScientific, Inc., Waltham, MA）処理で収穫した後に継代した。２～３代のＨＣＥＣをすべての実験に使用したドナー情報は、#184、ABF-956OSCN/ODCN、Age= 11、Gender = Female、ECD = 3207/3588と、#225、ABZ-612 OSCN/ODCN、Age= 27、Gender =Male、ECD = 3195 / 3425である。また培養条件は図６６に示したとおりである。Ｐ１とＰ４でのＦＡＣＳ結果を図６７及び図６８に、また各細胞写真を図６９に、それぞれ示した。

　（培養ヒト角膜内皮細胞（ｃＨＣＥＣｓ）　継代・細胞懸濁液の調製）
　顕微鏡写真以外の作業はすべて安全キャビネット内で行い、培養室に入る際は手をきれいに洗い、マスク・手袋を着用した。
　予めＰＢＳ（－）、培地（Ｎａｎｃｙ　ｍｅｄｉｕｍ）を３７℃で温め、添加試薬（グレーのボックス）を常温に戻しておいた。培養中の細胞を取り出し、ロット番号を確認し、位相差顕微鏡下にて細胞を観察した。位相差顕微鏡用カメラにて４０倍（２４－ｗｅｌｌ：１箇所，１２－ｗｅｌｌ：１箇所，６－ｗｅｌｌ：２箇所，Ｔ－２５：３箇所）と１００倍（２４－ｗｅｌｌ：２箇所，１２－ｗｅｌｌ：２箇所，６－ｗｅｌｌ：３箇所，Ｔ－２５：３箇所）の写真を撮影した。細胞を安全キャビネット内に入れ、ピペットマンまたはディスポピペットを用いて培養上清をチューブ（１．５－ｍＬまたは１５－ｍＬ）に回収した。ＰＢＳ（－）（２４－ｗｅｌｌ：５００ｍＬ，１２－ｗｅｌｌ：１ｍＬ，６－ｗｅｌｌ：２．５ｍＬ，Ｔ－２５：７ｍＬ）を注入し（１回目）、培養容器を軽く揺らしウェル内を洗浄した。ウェル内のＰＢＳ（－）をディスポピペットで取り除き、ＰＢＳ（－）（２４－ｗｅｌｌ：５００ｍＬ，１２－ｗｅｌｌ：１ｍＬ，６－ｗｅｌｌ：２．５ｍＬ，Ｔ－２５：７ｍＬ）を注入し（２回目）、培養容器を軽く揺らしウェル内を洗浄した。ウェル内のＰＢＳ（－）をディスポピペットで取り除き、ＰＢＳ（－）（２４－ｗｅｌｌ：５００ｍＬ，１２－ｗｅｌｌ：１ｍＬ，６－ｗｅｌｌ：２．５ｍＬ，Ｔ－２５：７ｍＬ）を注入した（３回目）。タイマー１０分をスタートさせ、位相差顕微鏡用カメラにて４０倍（２４－ｗｅｌｌ：１箇所，１２－ｗｅｌｌ：１箇所，６－ｗｅｌｌ：２箇所，Ｔ－２５：３箇所）と１００倍（２４－ｗｅｌｌ：２箇所，１２－ｗｅｌｌ：２箇所，６－ｗｅｌｌ：３箇所，Ｔ－２５：３箇所）の写真を撮影した。ＣＯ_２インキュベーターにて１０分間（タイマーが鳴るまで）静置した。恒温槽中でＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（１０×）を３７℃で温め、タイマー１０分が経過する前に安全キャビネット内においた。ＰＢＳ（－）でＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（１０×）を（５×）に希釈し（１：１希釈）、ディスポピペットでＰＢＳ（－）を取り除き、Ｐ－１０００で完全に除去した。ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（５×）を注入し（２４－ｗｅｌｌ：２００ｍＬ，１２－ｗｅｌｌ：４００ｍＬ，６－ｗｅｌｌ：１ｍＬ，Ｔ－２５：２．５ｍＬ）、ＣＯ_２インキュベーターにて１５分間静置した。位相差顕微鏡にて全体の半分以上の細胞が丸くなってきているか確認し、タッピングして細胞を底面から剥離した。丸い細胞が全体の半分に満たない場合は再度ＣＯ_２インキュベーターにて２～５分間静置した（ＴｒｙｐＬＥによる酵素処理時間の最大を計２０分とし、丸い細胞が全体の半分を満たない場合であっても計２０分を経過時点で次の工程に用いた）。
　続いて、安全キャビネット内に入れ、Ｐ－１０００チップにて吸引と底面への吐出を繰り返して細胞を剥離し、１．５－ｍＬプロテオセーブチューブあるいは１５－ｍＬチューブに回収した。ここでは安全キャビネットのライトを点けてもよい。Ｐ－１０００を用いて、１ウェルあたり回収した培養上清（２４－ｗｅｌｌ：２００ｍＬ，１２－ｗｅｌｌ：４００ｍＬ，６－ｗｅｌｌ：１ｍＬ，Ｔ－２５：２．５ｍＬ）を添加してウェルを洗いこみ、２１のチューブに回収した。遠心機にて遠心し（３００×ｇ；ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　＃５４５２００００３４卓上遠心機では２，１００ｒｐｍ　３分、ＴＯＭＹ　＃ＬＣ－２２０チューブ遠心機では１，２００ｒｐｍ　５分）、Ｐ－１０００チップ（ロング）に付け替えて、上清を除去した。新しいチップに交換し、回収した培地を１ウェル当たり（２４－ｗｅｌｌ：１００ｍＬ，１２－ｗｅｌｌ：２００ｍＬ，６－ｗｅｌｌ：５００ｍＬ，Ｔ－２５：１ｍＬ）添加し、細胞を懸濁した。遠心機にて遠心し（３００×ｇ；ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　＃５４５２００００３４卓上遠心機では２，１００ｒｐｍ　３分、ＴＯＭＹ　＃ＬＣ－２２０チューブ遠心機では１，２００ｒｐｍ　３分）、Ｐ－１０００チップ（ロング）に付け替えて、上清を除去した。新しいチップに交換し、回収した培地を１ウェル当たり（２４－ｗｅｌｌ：２００ｍＬ，１２－ｗｅｌｌ：４００ｍＬ，６－ｗｅｌｌ：１ｍＬ，Ｔ－２５：２．５ｍＬ）添加し、細胞を懸濁した。Ｐ－２０にチップをつけ、細胞懸濁液から１０ｍＬを速やかに抜き取り、計測用９６－ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（ＦＡＬＣＯＮ：３５５９１，９６－ｗｅｌｌアッセイプレートＵ底蓋なし非滅菌ポリスチレン）に入れた。細胞懸濁液から１０ｍＬにトリパンブルー１０ｍＬを加え、ピペッティングにより混合し、１０ｍＬ取って血球計算盤にて生細胞数をカウントした。
　細胞数計算
　生細胞数（カウント値）÷＿＿＿＿（区画数）×２×１０^４＝生細胞数（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）
　生細胞数（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）×懸濁液量（ｍＬ）＝総生細胞数（ｃｅｌｌｓ）

　ＦＡＣＳ解析を行う場合は、１６×１０^４ｃｅｌｌｓ（抗体１種類＋Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ）をプロテオセーブチューブに分注して、残りを継代した。ＦＡＣＳは抗体１種類につき８×１０^４ｃｅｌｌｓ必要とした。継代はEndothelialCell Density（ＥＣＤ：ｃｅｌｌｓ／ｍｍ^２）４００（１９１００１時点）で播種した（２４－ｗｅｌｌ：７．６×１０^４ｃｅｌｌｓ，１２－ｗｅｌｌ：１５．２×１０^４ｃｅｌｌｓ，６－ｗｅｌｌ：３８×１０^４ｃｅｌｌｓ，Ｔ－２５：１００×１０^４ｃｅｌｌｓ）。
　（培地の調整）
　使用する量の培地＋α（２４－ｗｅｌｌ：５００ｍＬ，１２－ｗｅｌｌ：１ｍＬ，６－ｗｅｌｌ：２．５ｍＬ，Ｔ－２５：７ｍＬ）を適したチューブに取り、添加試薬（培地液量に対して各１／１０００量）を加えた。添加試薬は光に弱いため、調整時・培地交換時は安全キャビネットのライトは消した。プレートを縦横に揺らして細胞を均一に播き、ＣＯ_２インキュベーターにて培養した。

　（ＦＡＣＳ測定）
〈必要な試薬類〉
□ｃＨＣＥＣ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ（ＦＡＣＳ抗体１種類＋Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＣ）で１６×１０^４　ｃｅｌｌｓ必要）
□ＦＡＣＳ　Ｂｕｆｆｅｒ（＋ＮａＮ_３）
　ＢＳＡ（グロブリンフリー）０．５％／ＮａＮ_３　０．０５％／１×ＰＢＳ　１００ｍＬ
　ＦＡＣＳ　Ｂｕｆｆｅｒ（－ＮａＮ_３）
　ＢＳＡ（グロブリンフリー）０．５％／１×ＰＢＳ　１００ｍＬ
　ＦＡＣＳ用抗体（ｅｘ．ＣＤ９０－ＦＩＴＣ／ＣＤ１６６－ＰＥ／ＣＤ２４－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５／ＣＤ４４－ＰＥ－Ｃｙ７／ＣＤ１０５－ＡＰＣ）
　セルストレーナー
　氷箱

〈ＦＡＣＳの測定〉
　ＦＡＣＳを立ち上げ、抗体溶液（以下遮光、ｏｎ　ｉｃｅ）を以下のように調整した。抗原　　　　蛍光色素　　　　　　　　容量（μＬ）　×サンプル種類＋α（μＬ）
ＣＤ９０　　ＦＩＴＣ　　　　　　　　４
ＣＤ１６６　ＰＥ　　　　　　　　　　４
ＣＤ２４　　ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５　１
ＣＤ４４　　ＰＥ－Ｃｙ７　　　　　　０．２５
ＣＤ１０５　ＡＰＣ　　　　　　　　　１
ＦＡＣＳ　Ｂｕｆｆｅｒ（＋ＮａＮ_３）　９．７５　（ｔｏｔａｌ　ｖｏｌ．２０μＬ）
　サンプルが複数ある場合は、＋αの溶液を調整した。
　細胞懸濁液を２５０×ｇ（１，８００ｒｐｍ）、２分、４℃で遠心を行い、Ｐ－２００を用いて上清を除き、４×１０^６　ｃｅｌｌｓ／ｍＬに濃度を合わせてＦＡＣＳ　Ｂｕｆｆｅｒ（＋ＮａＮ３）で懸濁した。懸濁液が３０μＬに満たない場合は３０μＬで懸濁して２０μＬを反応に、１０μＬをＮＣとして使用した。
　抗体溶液２０μＬと懸濁液２０μＬをピペッティングでよく混ぜ、チューブにアルミを巻いて遮光、４℃、ローテーターで２時間（ｍａｘ　４時間まで）回転させた。２５０×ｇ（１，８００ｒｐｍ）、２分、４℃で遠心を行い、上清を捨て、ＦＡＣＳ　Ｂｕｆｆｅｒ（＋ＮａＮ３）１００μＬで洗浄した。２５０×ｇ（１，８００ｒｐｍ）、２分、４℃で遠心を行い、上清を捨て、ＦＡＣＳ　Ｂｕｆｆｅｒ（－ＮａＮ３）３５０μＬで懸濁して、セルストレーナーを通して５－ｍＬチューブへ移した。ＮＣは、最初の懸濁液の残りすべてを計３５０μＬになるようにＦＡＣＳ　Ｂｕｆｆｅｒ（－ＮａＮ３）で懸濁して、セルストレーナーを通して５－ｍＬチューブへ移した。ＦＡＣＳ測定の間も、サンプルは遮光、ｏｎ　ｉｃｅにしておき、ＦＡＣＳのレーザーの値、ターゲットセルの範囲を決め、ファイルを作成した（Ｂｏｏｋを開く⇒Ｓｙｒｉｎｇｅ開く⇒緑⇒Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ　ｔａｂ：Ｌａｓｅｒ⇒Ａｒｅａ　ｓｃａｌｉｎｇ　ｆｏｒ　ＨＣＥＣ　ｌａｂｅｌに従う：ＦＳＣ　０．５／Ｂｌｕｅ　０．７５／Ｒｅｄ　０．８０）。ＮＣをＳＩＴにセットして少し流し（Ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ：ｍｅｄｉｕｍにセット、Ａｃｑｕｉｒｅ　ｄａｔａ　５秒⇒サンプルをＳＩＴから外してｏｎ　ｉｃｅ）、蛍光のパラメーターグラフとターゲットセルの範囲をチェックした。パラメーター：１０２～１０３の間にピークが来るか確認し、ずれている場合は流れている間にパラメーターの数値を上下させてＲｅｓｔａｒｔで確認して調整を行った。サンプルを流したときにピークがグラフ外へ出ると、グラフ外のピークが最大値１０５にすべて換算されてしまうので、それを超えないように調整が必要。ターゲットセル：死細胞や細胞の塊を測定範囲に入れないように調整した。ＮＣ、サンプルの順に流した（Ａｃｑｕｉｒｅ　ｄａｔａ⇒Ｒｅｃｏｒｄ　ｄａｔａ⇒１０，０００　ｅｖｅｎｔｓ　ｏｒ　５　ｍｉｎ⇒（ａｆｔｅｒ　５　ｍｉｎ）　Ｓｔｏｐ　Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ⇒Ｓｔｏｐ　ａｃｑｕｉｒｅ）。サンプルを流し終えたらＦＡＣＳシャットダウンの手順を行った。
　液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）による複合プロテオミクス
　継代４のｃＨＣＥＣの細胞ライセートを、プロテオーム分析に使用した。９３．９％の比率（エフェクター比＝Ｅ比、ｎ＝３）でＣＤ４４－／＋成熟分化ｃＨＣＥＣ　ＳＰを含む高品質（ＨＱ）ｃＨＣＥＣ、および７３．８％の比率（ｎ＝３）でＣＤ４４＋＋／＋＋＋未成熟ｃＨＣＥＣ　ＳＰを含む低品質（ＬＱ）ｃＨＣＥＣを、分析した。ＨＱ　ｃＨＣＥＣまたはＬＱ　ｃＨＣＥＣそれぞれの３アリコートからの細胞ライセートを乾燥させ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ５８．０）、１２ｍｍｏｌ／Ｌ　デオキシコール酸ナトリウムおよび１２ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム中で再構成させた。１０分間１００℃での２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ジチオスレイトールでの還元、および４５分間周囲温度での５０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ヨードアセトアミドでのアルキル化の後、６時間にわたり３７℃でｓｈａｋｉｎｇ　ａｔ　１０００ｒｐｍで振盪しながら、タンパク質を固定化トリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で消化した。デオキシコール酸ナトリウムの除去後、得られたペプチドを、Ｏａｓｉｓ　ＨＬＢ　ｍ－溶出プレート（Ｗａｔｅｒｓ）によって脱塩し、質量分析に供した。ペプチドを、Ｕｌｔｉ－　Ｍａｔｅ　３０００　ＲＳＬＣナノフローＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と組み合わせたＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ－Ｖｅｌｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって分析した。タンパク質の同定および定量分析を、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェアで行った。ＭＳ／ＭＳスペクトルを、ペプチド同定フィルターおよびタンパク質同定フィルターの両方について偽発見率１％に設定してＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ内のホモサピエンスタンパク質データベースに対して検索した。「Ｒａｚｏｒ　ｕｎｉｑｕｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ」のみを、相対的タンパク質濃度の計算に使用した。タンパク質の複合分析について、検出された全てのピークを、１．０～１０４にメジアン値を補正することによって標準化した。
　（ＬＣ／ＭＳデータセット分析）
　ＬＣ／ＭＳデータセットは、総計４６４１種のタンパク質からなり、これは、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ　２．２ソフトウェアを使用することによって得られた。存在量比が計算できないデータを除去した後、本発明者らは、ウェブベースのプログラムであるＤＡＶＩＤ　ｖ６．８（Ｔｈｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ　ｆｏｒ　Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，　Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；　ｈｔｔｐｓ：／／ｄａｖｉｄ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ）によって残りのデータを分析した。最終的に、４３１５種の遺伝子になり、その後の分析のために、各々、固有のＤＡＶＩＤ遺伝子ＩＤを与えた。遺伝子発現分析に関しては、本発明者らは、２群間の統計的Ｐ値および変化倍率を計算し、ボルケーノプロットを描画し、ＨＱ　ｃＨＣＥＣおよびＬＱ　ｃＨＣＥＣで異なって発現された遺伝子を抽出した。着目した遺伝子ならびにｃＨＣＥＣ代謝に関連することが示唆される関連遺伝子／経路のさらなる調査は、ＤＡＶＩＤおよびそのオプション「ＢＩＯＣＡＲＴＡ」および「ＫＥＧＧ＿ＰＡＴＨＷＡＹ」を使用することによって実行した。BioCarta（https://cgap.nci.nih.gov/Pathways/BioCarta_Pathways）またはKEGG（KyotoEncyclopediaofGenes and Genomes; https://www.genome.jp/kegg/）の元のデータベースを参照して、図中の参照遺伝子／経路はわずかに変更した。遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析については、存在比率（ＬＱ／ＨＱ）の範囲に基づいてデータを３つのグループに分割し、各グループに「ＧＯＴＥＲＭ＿ＤＩＲＥＣＴ」オプションを使用してＤＡＶＩＤで分析した。ＧＯの結果をＰ値でソートし、各グループの上位１０位のＧＯ用語を表示した。ＬＣ／ＭＳデータ解析では、ＨＱとＬＱ　ｃＨＣＥＣの違いの有意性は、Ｆ検定による確認後、スチューデントまたはウェルチのｔ検定によって評価した。

　（プロテオミクスのＤＡＶＩＤ解析）
　続いて、プロテオミクスのＤＡＶＩＤ解析を以下の順に行った（図７０）。
（１）３群解析
（２）ｒａｔｉｏ　２７越えのものの解析
（３）ＧＯＴＥＲＭのみの解析
（４）ＤＡＶＩＤ解析後のミトコンドリアに関する比較

　（１）３群解析
　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ数４６４１個について、Ａｂｕｎｄａｎｃｅ　Ｒａｔｉｏ：（２２５）相転移非規格細胞ＬＱ／（１８４）規格細胞ＨＱのない３２３個は除外した（３２３個）。残りの４３１８個のＰｒｏｔｅｉｎｓをＡｂｕｎｄａｎｃｅ　Ｒａｔｉｏ：ＬＱ／ＨＱを基に群に分けた（一つでもデータがあれば、解析対象）。
　３群わけは以下の表のとおりとなった。

　（２）ｒａｔｉｏ　２７越えのものの解析
　次に、ｒａｔｉｏ　２７越えのものを解析した。図７１においてＡｂｕｎｄａｎｃｅ　Ｒａｔｉｏ：ＬＱ／ＨＱが２７を超えている２つについてＤＡＶＩＤ解析をしたところ、結果はｃｌｕｓｔｅｒ　０であった。ＫＥＧＧ　ＰＡＴＨＷＡＹで調べると、Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍがあがった。ＫＥＧＧ　ＰＡＴＨＷＡＹのＮｉｔｒｏｇｅｎ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍに含まれている遺伝子（１７個）と今回解析にかけたタンパク（４６４１個）とで共通するものを探し、７つ（ＣＡ１２，ＣＡ２，ＣＡ３，ＣＡ５Ｂ，ＧＬＵＤ１，ＧＬＵＤ２，ＧＬＵＬ）をピックアップした。これらを更にＤＡＶＩＤにかけ、ＫＥＧＧ　ＰＡＴＨＷＡＹ（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）を探し、確認した。

　（３）ＧＯＴＥＲＭのみの解析
　次にＧＯＴＥＲＭのみの解析を行った。ＤＡＶＩＤ解析では、５０ほどのデータベースを使い解析ができ、ＤＡＶＩＤ推奨（Ｄｅｆａｕｌｔｓ）の解析では、そのうちの１０ほど（例えば、ＵＰ＿ＫＥＹＷＯＲＤ、ＫＥＧＧ＿ＰＡＴＨＷＡＹ、ＩＮＴＥＲＰＲＯなど）を使うこととなっており（ＧＯＴＥＲＭも含まれている）、今回はその中の３つ（ＧＯＴＥＲＭ＿ＢＰ＿ＤＩＲＥＣＴ，ＧＯＴＥＲＭ＿ＣＣ＿ＤＩＲＥＣＴ，ＧＯＴＥＲＭ＿ＭＦ＿ＤＩＲＥＣＴ）のＧＯＴＥＲＭのみを使った解析をした。Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓ（ＢＰ）：細胞内での機能。Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ（ＣＣ）：細胞の構成要素。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（ＭＦ）：分子の機能。その結果を図７２に示した。

　（４）ＤＡＶＩＤ解析後のミトコンドリアに関する比較
　続いて、ＤＡＶＩＤ解析後のミトコンドリアに関する比較を行った。
　AbundanceRatio:LQ/ HQ0.5-0.2のグループ(398個)のAnnotation Cluster1(EnrichmentScore:72.73354929082193)では、ミトコンドリアに関するものが多かった(図７３)。そこでPATHWAYをもう少し確認するため、398個を再びDAVIDで解析し、GOTERM,PASTHWAY,PROTEINDOMAINSの項目のうち、DAVIDのDefaultsで選ばれている項目でクラスタリングした（図７４）。クラスタリングした結果から調べるpathwayを選択した（図７５）。pathwayを調べGenesのグラフを書き入れた。更に、代謝経路上関心のある経路をKEGGPathwayで検索図示し〔太字〕、相転移非規格細胞と規格細胞の代謝経路に係る酵素や基質のタンパク発現強度を比較した（図７６～図８３）。

　（実施例１０：Ｘ．イオンチャンネル　単カルボン酸輸送体系細胞免染）
　本実施例では、イオンチャンネル　単カルボン酸輸送体系について調べた。

　（材料および方法）
　以下のドナーの角膜組織から得られた細胞を免染した。また使用抗体データは図８４に示した。
#190802S/D、ACW-134OSCN/ODCN、年齢28/ 性別：女性、ECD = 3003 / 3021、死因: ESRDD-P = 08:57、D-C=5D
　免疫染色結果は以下の表のとおりであった。

　１は規格細胞、２は相転移非規格細胞、かつEGF添加培養である。いずれもDay 0-41, 42 または 43まで培養後、実験に使用した。いずれの細胞もそれぞれ200倍で画像取得し、2箇所ずつ染色した。
　ImmunofluorescentStainingof cHCECs (24-well plate)を行うに際して、以下のものを準備した。
□固定液 (-30℃氷冷特級メタノール(nacalai#21915-35) or RTに戻した4% PFA/リン酸緩衝液 (wako #163-20145))
□PBS (-)
□PBS(-)/0.2%TritonX-100(0.5 mL × wells × 1.1 = mL)
□1%BSA/PBS(-)(BSA: EIA/RIA grade, nacalai #01281084) (BSA g / PBS(-) mL)
□一次抗体(Isotypecontrol含む)
□蛍光標識二次抗体
□DAPI (同人化学,wako#340-07971)

　また手順は以下のとおりである。すべての容量は24-well plate 1-well当たりで行った。
　まず、細胞の培養上清を除き、PBS(-) 0.5 mLで洗浄した(1回)。固定液を0.5 mL加え、１５分室温で静置した(MeOHの場合は-30℃)。PBS(-)/0.2%TritonX-100を0.5mL加え、１５分室温でインキュベートした。溶液を除き、1%BSA/PBS(-) を0.5 mL加え、６０分室温でブロッキングした。溶液を除き、一次抗体を1%BSA/PBS(-)で希釈し、0.3 mL加えて４℃でインキュベートO/Nした。PBS(-)0.5 mLで5分間洗浄した(3回)。溶液を除き、蛍光標識二次抗体を1%BSA/PBS(-) で希釈し、0.3mL加えて室温で６０分以上インキュベートした。PBS(-)0.5 mLで5分間洗浄した (1回)。溶液を除き、DAPIをPBS(-)で200倍希釈し、0.3 mL加えて室温で５～１５分インキュベートした。PBS(-)0.5mLで5分間洗浄した (2回)。PBS(-) 0.5 mLを加え、蛍光顕微鏡で観察した。

　（結果）
　その結果を図８５～図８８に示した。その結果、ＡＴＰ１Ａ１（Ｎａ＋ＫＬＡＴＰａｓｅ）およびＡＱＰ１は、規格細胞で細胞膜に高発現しているが、非規格細胞では発現していないことが分かった。ＳＬＣ４Ａ１１、ＮＨＥ１、ＳＬＣ２５Ａ４２についても同様であった。以上から、理論に束縛されることを望まないが、単カルボン酸輸送体のオルガネラ選択的局在が明らかになった。以上から、角膜混濁や水和浮腫の改善、その結果、持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がるような角膜内皮（細胞）機能特性に繋がる機能性蛋白の発現が、規格細胞では認められることが理解される。

　（実施例１１：ＸＩ．輸送体ＳＬＣファミリータンパク）
　次に、本実施例では、どのような輸送体ＳＬＣファミリータンパクの発現が規格細胞でみられるか観察した。以下に詳述する。

　（材料および方法）
　本実施例では、輸送体ＳＬＣファミリータンパクについて、発現について実験を行った。
　ＣＤ４４－／＋（成熟）主構成ｃＨＣＥＣまたはＣＤ４４＋＋／＋＋＋細胞状態転移（ＣＳＴ）主構成ｃＨＣＥＣのいずれかについて、各々３つの検体を対象に液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）による細胞溶解物についての統合プロテオミクス解析を行った。細胞培養の条件などは、上記実施例に記載したものに準じる。
　カチオン／アニオン輸送体（イオン輸送体）、単カルボン酸輸送体および溶質キャリア（ＳＬＣ）ファミリータンパク質の発現パターンならびに炭酸脱水素酵素（ＣＡ）を検定した。
　ＭＳ／ＭＳスペクトルをヒトタンパク質配列データベース（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）に対して、ＭａｓｃｏｔまたはＳＥＱＵＥＳＴ検索エンジンを用いて、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ　２．２ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて解析した。

　（結果）
　規格細胞と非規格細胞との間の輸送体ＳＬＣファミリータンパクの存在比率

　上述の結果から、ＣＳＴ　ｃＨＣＥＣでは、ニコチン酸およびニコチンアミド代謝物に関連する酵素が最も上方制御されており、他方で、エクトヌクレオチドピロホスファターゼのみが、成熟ｃＨＣＥＣで上方制御されていた。興味深いことに、グルタミン酸－アンモニアリガーゼ（ＧＬＵＬ）の発現が、ＣＳＴ　ｃＨＣＥＣで上昇していたのに対して、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ１，２（ＧＬＵＤ１，２）およびグルタミナーゼ２（ＧＬＳ２）は発現が減少していた。統合プロテオミクスによって、カチオン／アニオン輸送体（イオン輸送体）、単カルボン酸輸送体（ＭＣＴ）および溶質キャリア（ＳＬＣ）ファミリータンパク質の発現パターンならびに炭酸脱水素酵素（ＣＡ）が、成熟ｃＨＣＥＣ（目的細胞）とＣＳＴｃＨＣＥＣ（非目的細胞）とでオルガネラ選択的な局在発現を示していることが観察された。

　（実施例１２：ＸＩＩ．細胞内pH測定）
　本実施例では、細胞内ｐＨとの関係を目的細胞について調べた。以下に詳述する。

　（材料および方法）
　続いて、細胞内pHを測定した。ドナー情報は以下のとおりである。Lot#190802P3:　#190802S/D、ACW-134OSCN/ODCN、年齢28 /性別女性、内皮細胞密度ECD = 3003 / 3021、死因: ESRD、D-P =08:57、D-C = 5D

　（細胞内pH測定）
　細胞の形態を示す位相差顕微鏡写真と細胞表面CD抗原発現プロファイルでの亜集団解析並びにpH測定を行った。

　培養ヒト角膜内皮細胞の細胞内ｐHは細胞の大きさやミトコンドリア機能を規定すると考えられる。以下、培養条件で規格細胞と相転移非規格細胞を作成しpHを検定し、CD44－の規格細胞の細胞内ｐHがCD44++/+++の相転移非規格細胞よりも低いことを検証した。

　（cHCECs細胞内pH測定方法）
　（調整試薬）
　HEPES buffer (153mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mMglucose, 20 mM HEPES, pH7.4)
　Calibration buffer(130 mM KCl, 10 mMNaCl, 1 mM MgSO4, 10 mM Na-MOPS)…pH6.6/7.0/7.2/7.4/7.8/8.2
　2 mg/mLNigercin/EtOHストック溶液…分注して-30℃保存
　1 mM BCECF-AM/DMSO溶液 (同人化学B221: 50 mg/tubeに72.612 mL DMSOを添加・混合し、分注して-30℃保存)

　（準備物）
　黒色平底96-wellプレート(Thermo Fisher: 237105 蓋つき個包装、未処理)
　回収できる細胞数を検討しておく (1×105 cells/sample; calibrationに6 samples使
用するので最低7~8×10⁵cells用意した)
　pHi測定試薬(HEPES,1 mM BCECF-AM/DMSO, 2 mg/mL Nigercin/EtOH)
　cHCECs剥離関連試薬(PBS,TrypLE/PBS)

　（方法）
　（細胞浮遊液（測定したい細胞）の調製）
　位相差顕微鏡用カメラで細胞を撮影し、ヒト培養角膜内皮細胞をPBS(-) (位相差顕微鏡用カメラで細胞を撮影)、5×TrypLE/PBS(-) にて剥離した。

　細胞数をカウントし（実数値: cells/mL, total cells/ mL）、1.5-mLプロテオセーブチューブ1本中に2-10×10⁵cells/1mLHEPESになるようにHEPES Buffer に懸濁した。1 mM BCECF-AM/DMSOを1 mLあたり5 mL 添加し(finalconc. 5mM)（実数値: cells/mL× 本）、培養室の37℃ 5%CO2インキュベータにて30分間反応させた。実験台に移り、300×g(1,867 rpm:eppendorf centrifuge5418) 3 min遠心し、上清を取り除き、HEPES buffer 200 mLにて細胞ペレットを懸濁した(wash1回目)。300×g (1,867rpm) 3 min遠心し、上清を取り除き、2×10⁵ cells/mL HEPESになるようにHEPESBufferに懸濁し、15-mLチューブにすべてを合わせた(ex.8×10⁵ cells/4 mL HEPESにする)。この細胞浮遊液から細胞を500mL/1.5-mLプロテオセーブチューブへ分取した(ex.全量8×10⁵ cells/4 mLHEPESの場合2本)。分取前には細胞浮遊液が均一になるように混ぜた(分取した後に、キャリブレーション用細胞浮遊液準備へ進んだ)。300×g(1,867rpm) 3 min遠心し(wash 2回目)、上清を捨て、細胞PelletをHEPES buffer 500 mLに懸濁した。

　（キャリブレーション用細胞浮遊液調製）
　キャリブレーション用緩衝液を準備し、細胞浮遊液から細胞を500 mL/1.5-mLプロテオセーブチューブへ6本分取した。300×g (1,867 rpm) 3 min遠心し(wash 2回目)、上清を捨て、細胞Pelletを各pH液500mLで懸濁した。2mg/mL Nigercin/EtOH を500 mLあたり2.5mL 添加し(final conc. 10 mg/mL)、10分室温にてインキュベートした。このキャリブレーション用細胞浮遊液と細胞浮遊液とを150mL/well(96-wellplate)、3-wellずつ加えた。

　（測定）
　蛍光プレートリーダー (GloMax Explorer, Promega) を使用し、励起500 nm・蛍光波長530 nmにて測定した(GloMaxでは励起Blue(475nm)、蛍光フィルタ500-550nmに設定)。

　（結果）
　結果を図８９～図９３に示す。

　（実施例１３：ＸＩＩＩ．添加物の効果）
　本実施例では、添加物の効果をさらに調べた。以下に詳述する。
　（材料および方法）
　P3 T-251枚を24wpに継代して使用 (=P4)した。C37、ABH-096 OSCN/ODCN、Age = 26Y /ECD = 3255 / 3137、COD:Trauma、D-P= 17:57 / D-C = 8D

　（結果）
　結果を図９４～図１００に示した。測定項目のうち、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-17、basic FGF、IFN-g、MIP-1a、MIP-1b、TNF-a、VEGFについては検出限界以下となった。

　以上の実施例１～１３によれば、角膜内皮前駆細胞を、増殖ストレスなど培養ストレスを極小化し得る培養条件下で増殖および／または分化・成熟させることが重要であることが理解される。また、角膜混濁や水和浮腫の改善、その結果、持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がるような角膜内皮（細胞）機能特性に繋がる機能性蛋白の発現が、規格細胞では認められることが理解される。加えて、好ましい実施形態では、増殖および／または分化・成熟させる工程において、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することが好ましいことが理解される。

（実施例１４：酸化的リン酸化呼吸の増加）
　図１で説明したとおり、非規格細胞でＭｉｒ３４ａ発現が低下し、結果、ミトンドリアの解糖系が亢進する。そこで、強制的にｍｉＲ４３ａのmimicsを細胞内導入し、ｍｉＲ４３ａの発現を高めたところ、酸化的リン酸化呼吸が高まることを確認した（図１０１、図１０２）。

　ミトコンドリアの酸化的リン酸化呼吸ＯＸＰＨＯＳが高まると、角膜実質の水分が排出されることで臨床の薬理効果につながる（図１０３）。また増殖性の未分化細胞を増やし、その後分化させることで薬理効果に優れる規格細胞、高品質細胞を生産することができる（図１０４）。

　本開示の細胞が成熟分化細胞となるか、または脱分化状態となるかは、細胞内ｐＨによりミトコンドリア機能が左右されることに起因すると考えられる（図１０５）。
　本開示の角膜内皮細胞は余分な水を角膜実質より前房側に排泄し角膜実質を透明に保つために機能する。そのため、臨床効果として評価される角膜混濁軽減・透明化、角膜肥厚の非薄化などを挙げることができる。また、細胞注入医療適格細胞ではミトコンドリアのＯＸＰＨＯＳが亢進し、内皮細胞内に実質側から前房側への乳酸の濃度勾配が形成され、結果、浸透圧によりＡＱＰ１チャンネルを介する水排出を促進する。したがって、細胞機能特性評価としては、ミトコンドリア酸化的リン酸化機能、ＡＱＰ１チャンネル発現などを挙げることができる。そして、上記のとおり、細胞内ｐＨが脱分化抑制性ｍｉＲ３４ａの低下を抑制し、ＣＤ４４の発現を抑制し、ミトコンドリアのＯＸＰＨＯＳを維持するため、細胞機能特性評価として、細胞内ｍｉｒ３４ａ、ＣＤ４４の発現低下などを挙げることができる。細胞内カチオン・アニオン平衡が細胞内ｐＨを７．０～７．２の中性域に維持することでミトコンドリアのＯＸＰＨＯＳを高水準に維持する。細胞機能特性評価としては、Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ（ＡＴ１Ｐ１）、ＮBCe1（重炭酸イオンチヤンネル）、ＮHE1(Na+,H+交換イオンチャンネル)、ＭＣＴ４（乳酸輸送体：前房水側に放出）、ＳＬＣ４Ａ１１などを挙げることができる。また最終製品適格細胞への非適格細胞の混在の機能的評価法として、細胞内カチオン・アニオン平衡が細胞内ｐＨをアルカリ域に偏奇させることを確認する手法が考えられ、細胞機能特性評価として、ヒストンのアセチル化の有無、ミトコンドリア機能異常などを確認できる。

（実施例１５：細胞の免疫染色）
　実施例１０では、プロテオミクスの結果をもとにイオンチャンネルおよび／または単カルボン酸輸送体系について確認しているが、本実施例では、イオンチャンネルの選択的発現を細胞の免疫染色によって確認した。

　ＦＡＣＳ＋イオンチャネル系分子免疫染色結果
（Ｌｏｔ＃ＣＲ０４＿Ｐ３：ドナー情報）
＃ＣＲ０４
ＯＲＬ２００２－３１４　ＬＣＮ／ＲＣＮ
・年齢＝１２／性別＝男性
・ＥＣＤ＝３５４６／３４６０
・死因：Ｂｌｕｎｔ　ｈｅａｄ　ｔｒａｕｍａ
・Ｄ－Ｐ＝６：４２
・Ｄ－Ｃ＝－－Ｄ

　ＦＡＣＳ測定結果
（Ｌｏｔ＃ＣＲ０４＿Ｄａｙ４１）
　ＣＰＣによってＥＣＤ８００～９００で播種後、Ｄａｙ２にて御車へ
その後Ｄａｙ４１まで培養し、５ｘＴｒｙｐＬＥ　ｓｅｌｅｃｔで剥離し、ＦＡＣＳに使用した。培養条件は以下の表のとおりである。

　また４１日目の写真を図１０６に示した。

　さらに、免疫染色については、上記のようにＤａｙ４１まで培養した後に実験に使用し、２００倍で画像取得した。使用抗体は以下の表のとおりである。

　その結果、ＡＴＰ１Ａ１は細胞膜局在し、ＮＨＥ１は細胞内局在し、一部で細胞膜にも局在し、ＡＱＰ１は細胞膜局在し、ＮＢＣｅ１は細胞膜局在し、ＡＥ２は細胞内・細胞膜局在し、Ａｃｅｔｙｌ－Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｈ３は低発現となった。この結果をまとめたものを図１０７に示した。

（実施例１６：非規格細胞におけるヒストンのアセチル化亢進）
　本実施例では、非規格細胞がなぜ生成するかについて確認した。図１０８に示したとおり、細胞内ｐＨがミトコンドリアのＧｌｙｃoｌｙｓｉｓを亢進し、ミトコンドリアから核へ移送されるＣｉｔｒａｔｅが核内に局在するＡＣＬＹ、ＡＣＳＳ２によってヒストンをアセチル化し、ミトコンドリアＭａｔｒｉｘ構成タンパク組成を変えることが示唆された。

（実施例１７：規格細胞と非規格細胞の比較）
　本実施例では、規格細胞と非規格細胞（ＣＳＴ細胞）における特定のタンパク質の発現を比較した。規格細胞として＃１９１２２４Ｓ　Ｐ４　Ｄａｙ４６（＋Ｙ）を、非規格細胞として＃２００３１３　Ｐ１　Ｄａｙ７４（＋ＳＢ４、ＥＧＦ）を用いた。結果を図１０９～図１１１に示した。

　また非規格細胞でヒストンアセチル化が亢進する理由の１つとして、規格細胞ではヒストン脱アセチル化酵素活性が低下していることを確認するため、規格細胞および非規格細胞でＨＡＴ／ＨＤＡＣ活性を測定した。ＨＡＴ／ＨＤＡＣ活性の測定は以下のとおりに行った。

　ドナーとして以下のＬｏｔ＃１９１２２４Ｓ＿Ｐ４を用いた。
　＃１９１２２４Ｓ
　ＡＥＮ－０２４　ＯＳＣＮ
　年齢＝２９／性別＝男性
　ＥＣＤ＝２９４１
　死因：Ａｃｕｔｅ　Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　Ｄｉｓｔｒｅｓｓ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ
　Ｄ－Ｐ＝０７：３２
　Ｄ－Ｃ＝７Ｄ

　培養条件は以下の表のとおりとした。

　１についてはＥＣＤ４００、２についてはＥＣＤ８００（非規格細胞からの継代）で播種後、Ｄａｙ４２まで培養した。
それぞれ１ｗｅｌｌをＦＡＣＳ：５ｘＴｒｙｐＬＥ　ｓｅｌｅｃｔで剥離し、実験に使用した（ｍｉＲＮＡ発現測定用と同サンプル）。また１ｗｅｌｌを核タンパク抽出し、細胞を直接ＮｕｃｌｅａｒＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで回収した。結果を図１１２～図１１４に示した。

　ミトコンドリア呼吸系の基質要求性は規格細胞に比較して、ＣＳＴ細胞ではａｎａｐｌｅｒｏｓｉｓが亢進すること、規格細胞ではミトコンドリア内の分岐鎖アミノ酸代謝に係るＢＣＡＴ２やＢＣＫＤＨの亢進が確認された。興味あることに、ＴＣＡ経路に係るミトコンドリア偏在代謝酵素ＣＳ，ＡＣＯ２，ＩＤＨ２，ＭＤＨ２，ＭＥ３やＡｃｅｔｙｌＣｏＡ産生に係るＡＣＳＳ１，ＡＣＡＴ１は全て規格細胞で亢進し、細胞質に遍在するＩｓｏｚｙｍｅｓであるＡＣＬＹ，ＡＣＯ１，ＩＤＨ１，ＭＤＨ１，ＭＥ１や細胞質や核内のＡｃｅｔｙｌＣｏＡ産生に係るＡＣＳＳ２，ＡＣＡＴ２は非適格細胞であるＣＳＴ細胞で発現が亢進していた。このことは、培養ストレスという環境因子の影響下で細胞質や核内のＡｃｅｔｙｌＣｏＡがＥｐｉｇｅｎｅｔｉｃにヒストンのアセチル化に係りＣＳＴ細胞の形質発現を制御している可能性を示唆する。脱分化細胞の分化破綻に核局在ＡｃｅｔｙｌＣｏＡの偏在が重要な役割をしていると考えられる。

　（注記）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０２０年２月２７日に出願された特願２０２０－３２１３９に対して優先権主張をするものであり、その内容はその全体があたかも本願の内容を構成するのと同様に参考として援用される。

　本開示は、角膜内皮再生医療に関する医療産業およびその周辺産業において利用可能性が見出される。

Claims

　ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜機能を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞を製造する方法であって、
　（ｂ）角膜内皮前駆細胞を、増殖ストレスなど培養ストレスを極小化し得る培養条件下で増殖および／または分化・成熟させる工程
　を含む、方法。
　前記ヒト角膜機能は、角膜内皮細胞機能特性を含む、請求項１に記載の方法。
　（ａ）ヒト角膜内皮組織由来細胞を脱分化させて前記角膜内皮前駆細胞を得る工程をさらに包含する、請求項１または２に記載の方法。
　ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜機能、就中、角膜内皮細胞機能特性を惹起し得る機能性ヒト角膜内皮細胞を製造する方法であって、ヒト角膜内皮前駆細胞を形質転換が生じる量未満の細胞成長因子の存在下で増殖および／または分化・成熟させる請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
　前記細胞成長因子は上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
　前記形質転換は内皮間葉転換を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
　前記増殖および／または分化・成熟させる工程はＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行われる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
　（ｂ）で得られた細胞が、ミトコンドリアにおいてミトコンドリア依存性酸化的リン酸化が増加し、細胞質・核内のアセチルＣｏＡの発現が増加しないこと、並びにアセチルＣｏＡによるヒストンアセチル化を介するエピジェネティックな多遺伝子発現が惹起されていない細胞であることを確認する工程を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
　（ｂ）で得られた細胞が、ミトコンドリアにおいて、クエン酸シンターゼ（ＣＳ）、アコニターゼ２（ＡＣＯ２）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ２（ＭＤＨ２）、リンゴ酸酵素３（ＭＥ３）、ＡＣＳＳ１、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ１（ＡＣＡＴ１）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、ＢＣＡＴ２、及び分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ２（ＢＣＫＤＨ２）からなる群から選択される１または複数の代謝関連酵素が発現している細胞であることを確認する工程を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
　（ｂ）で得られた細胞が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬＹ）、アコニターゼ１（ＡＣＯ１）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１（ＭＤＨ１）、リンゴ酸酵素１（ＭＥ１）、ＡＣＳＳ２、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ２（ＡＣＡＴ２）、及び／または乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）が発現しない、もしくはほとんど発現しないことを確認する工程を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
（ｂ）で得られた細胞が、角膜混濁や水和浮腫の改善、その結果、持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がるような角膜内皮（細胞）機能特性に繋がるイオンチャンネルおよび／または単カルボン酸輸送体の発現の認められることを確認する工程を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
　（ｂ）で得られた細胞が、ナトリウム／水素交換体１（ＮＨＥ１）並びに／または、アクアポリン１（ＡＱＰ－１）の発現が亢進していることを確認する工程を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
　（ｂ）で得られた細胞が、重炭酸脱水酵素５Ｂ（ＣＡ５Ｂ）の発現が亢進していることを確認する工程を含む、請求項９～１０のいずれか一項に記載の方法。
　（ｂ）で得られた細胞が、ＴＣＡ回路などに係る代謝酵素やＡｃｅｔｙｌＣｏＡなどの代謝産物が夾雑相転移細胞の生成に繋がらないように細胞質や核には存在せずに、ミトコンドリアにオルガネラ選択的に局在する特性を有することを確認する工程を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
　前記ヒト機能性角膜内皮細胞が、角膜内皮組織由来細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、角膜内皮から採取した角膜内皮前駆細胞、角膜内皮から採取した細胞、並びにダイレクトプログラミング法で作成される角膜内皮前駆細胞および角膜内皮様細胞からなる群から選択される細胞を起源として作製されたものである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
　ヒト機能性角膜内皮細胞であって、角膜混濁や水和浮腫の改善、その結果、持続的に長期に亘り角膜内皮組織細胞密度を保持させ、視力改善に繋がるような角膜内皮（細胞）機能特性に繋がる機能性蛋白の発現が認められるか、または当該角膜内皮（細胞）機能特性を阻害する蛋白が惹起されないまたは低下している、細胞。
　前記細胞は、ヒト眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞であり、ミトコンドリアにおいて、クエン酸シンターゼ（ＣＳ）、アコニターゼ２（ＡＣＯ２）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ２（ＭＤＨ２）、リンゴ酸酵素３（ＭＥ３）、ＡＣＳＳ１、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ１（ＡＣＡＴ１）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、ＢＣＡＴ２、及び分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ２（ＢＣＫＤＨ２）からなる群から選択される１または複数の代謝関連酵素が発現している、請求項１６に記載の細胞。
　前記細胞は、ヒト眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞であり、ミトコンドリアにおいてミトコンドリア依存性酸化的リン酸化が増加し、または細胞質・核内のアセチルＣｏＡの発現が増加しないこと、並びにアセチルＣｏＡによるヒストンアセチル化を介するエピジェネティックな多遺伝子発現が惹起されていない群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１６または１７に記載の細胞。
　前記細胞はヒト角膜内皮細胞であり、ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬＹ）、アコニターゼ１（ＡＣＯ１）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１（ＭＤＨ１）、リンゴ酸酵素１（ＭＥ１）、ＡＣＳＳ２、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ２（ＡＣＡＴ２）、及び／または乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）が発現しない、または実質的に発現しない、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の細胞。
　前記ヒト機能性角膜内皮細胞において、ナトリウム／水素交換体１（ＮＨＥ１）並びに／または、アクアポリン１（ＡＱＰ－１）の発現が亢進している、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の細胞。
　前記ヒト機能性角膜内皮細胞において、重炭酸脱水酵素５Ｂ（ＣＡ５Ｂ）の発現が亢進している、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の細胞。
　前記ヒト機能性角膜内皮細胞が、（ｉ）ＴＣＡ回路などに係る代謝酵素やＡｃｅｔｙｌＣｏＡなどの代謝産物が夾雑相転移細胞の生成に繋がらないように細胞質や核には存在せずに、ミトコンドリアにオルガネラ選択的に局在する特性、（ｉｉ）ミトコンドリアにおけるミトコンドリア依存性酸化的リン酸化の増加、（ｉｉｉ）アセチルＣｏＡによるヒストンアセチル化を介するエピジェネティックな多遺伝子発現の低下（惹起無を含む）、（ｉＶ）ナトリウム／水素交換体１（ＮＨＥ１）および／またはアクアポリン１（ＡＱＰ－１）の発現の亢進、並びに（ｖ）重炭酸脱水酵素５Ｂ（ＣＡ５Ｂ）の発現の亢進からなる群から選択されるすべてを含む、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の細胞。
　内皮間葉系移行が起きていない、または実質的に起きていない、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の細胞。
　ヒト眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞であって、内皮間葉系移行が起きていない、または実質的に起きていない、細胞。
　前記ヒト機能性角膜内皮細胞は、角膜内皮組織由来細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、角膜内皮から採取した角膜内皮前駆細胞、角膜内皮から採取した細胞、並びにダイレクトプログラミング法で作成される角膜内皮前駆細胞および角膜内皮様細胞からなる群から選択される細胞を起源として作成されたものである、請求項１６～２４のいずれか一項に記載の細胞。
　請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法によって製造された細胞および／または請求項１６～２５のいずれか一項に記載の細胞を含む細胞集団。
　ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞の品質管理または工程管理の方法であって、前記細胞のミトコンドリアにおいて、クエン酸シンターゼ（ＣＳ）、アコニターゼ２（ＡＣＯ２）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ２（ＭＤＨ２）、リンゴ酸酵素３（ＭＥ３）、ＡＣＳＳ１、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ１（ＡＣＡＴ１）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、ＢＣＡＴ２、及び分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ２（ＢＣＫＤＨ２）からなる群から選択される１または複数の代謝関連酵素が発現していることを確認する工程を含む、方法。
　前記細胞において細胞質・核内のアセチルＣｏＡの発現、およびアセチルＣｏＡによるヒストンアセチル化を介するエピジェネティックな多遺伝子発現が惹起されていないことを確認する工程をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
　前記細胞において、ナトリウム／水素交換体１（ＮＨＥ１）および／またはアクアポリン１（ＡＱＰ－１）の発現が亢進していることを確認する工程をさらに含む、請求項２７または２８のいずれか一項に記載の方法。
　前記細胞において、重炭酸脱水酵素５Ｂ（ＣＡ５Ｂ）の発現が亢進していることを確認する工程をさらに含む、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
　ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞の品質管理もしくは工程管理の方法、またはヒト機能性角膜内皮細胞に混在する角膜内皮非機能性細胞を検出する方法であって、以下：
（１）移植日の位相差画像による外観検査で、線維芽細胞、異物、変色、または他の異常なし
（２）移植日２週間前および／または移植日の細胞数が１．５×１０^６細胞／４５０μＬ（３）細胞生存率がトリパンブルー染色で８５％以上
（４）細胞上清のＥＬＩＳＡによる純度試験で、
　ＰＤＧＦ－ＢＢ：１００ｐｇ／ｍＬ以上
（５）移植日２週間前および／または移植日に採取された細胞上清のＦＡＣＳによる純度試験で、
　ＣＤ１６６^＋＞９９％
　ＣＤ２４^＋＜５％
　ＣＤ２６^＋＜５％
　ＣＤ２００^＋＜５％
　ＣＤ４４^ｈｉｇｈ＜５％
　ＣＤ４４^ｌｏｗ＞９０％
　ＣＤ１０５^－～weak＞９０％
　ＣＤ９０^＋＜５％
（６）エフェクター細胞（Ｅ－ｒａｔｉｏ）＞９０％
（７）移植日２日前のポンプ機能（Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ）：陽性
（８）移植日２日前のバリア機能（ＺＯ－１）：陽性
（９）ＢＳＡ陰性試験で１２５ｎｇ／μＬ未満
（１０）移植日のＥＣＤが１５００細胞／ｍｍ^２以上
（１１）ｍｉＲ１８４の発現
（１２）乳酸産生
（１３）細胞サイズが２５０μｍ未満
の１または複数の項目を確認する工程を含む、方法。
　ヒトの眼前房内への注入時にヒト角膜内皮機能特性を惹起し得るヒト機能性角膜内皮細胞の細胞集団であって、以下：
（１）移植日の位相差画像による外観検査で、線維芽細胞、異物、変色、または他の異常なし
（２）移植日２週間前および／または移植日の細胞数が１．５×１０^６細胞／４５０μＬ
（３）細胞生存率がトリパンブルー染色で８５％以上
（４）細胞上清のＥＬＩＳＡによる純度試験で、
　ＰＤＧＦ－ＢＢ：１００ｐｇ／ｍＬ以上
（５）移植日２週間前および／または移植日に採取された細胞上清のＦＡＣＳによる純度試験で、
　ＣＤ１６６^＋＞９９％
　ＣＤ２４^＋＜５％
　ＣＤ２６^＋＜５％
　ＣＤ２００^＋＜５％
　ＣＤ４４^ｈｉｇｈ＜５％
　ＣＤ４４^ｌｏｗ＞９０％
　ＣＤ１０５^－～weak＞９０％
　ＣＤ９０^＋＜５％
（６）エフェクター細胞（Ｅ－ｒａｔｉｏ）＞９０％
（７）移植日２日前のポンプ機能（Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ）：陽性
（８）移植日２日前のバリア機能（ＺＯ－１）：陽性
（９）ＢＳＡ陰性試験で１２５ｎｇ／μＬ未満
（１０）移植日のＥＣＤが１５００細胞／ｍｍ^２以上
（１１）ｍｉＲ１８４の発現
（１２）乳酸産生
（１３）細胞サイズが２５０μｍ未満
の１または複数の項目を充足する、細胞集団。