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WO2021149822A1 - 人工多能性幹細胞の作製方法 - Google Patents

人工多能性幹細胞の作製方法 Download PDF

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WO2021149822A1
WO2021149822A1 PCT/JP2021/002335 JP2021002335W WO2021149822A1 WO 2021149822 A1 WO2021149822 A1 WO 2021149822A1 JP 2021002335 W JP2021002335 W JP 2021002335W WO 2021149822 A1 WO2021149822 A1 WO 2021149822A1
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WO
WIPO (PCT)
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cells
cell
pluripotent stem
reprogramming factor
medium
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2021/002335
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English (en)
French (fr)
Inventor
剛士 田邊
健太 須藤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
I Peace Inc
Original Assignee
I Peace Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by I Peace Inc filed Critical I Peace Inc
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Priority to US17/759,308 priority patent/US20230053060A1/en
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    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18841—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18843—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to cell technology and relates to a method for producing induced pluripotent stem cells.
  • Induced pluripotent stem (iPS) cells are cells that have two characteristic abilities. One is the ability to transform into all the cells that make up the body. The other is that it has a semi-permanent proliferative ability. Since iPS cells have these two abilities, they can be applied to transplantation therapy without rejection by producing iPS cells from their own somatic cells and converting them into target somatic cells. Therefore, iPS cells are considered to be a promising technology for regenerative medicine.
  • Typical methods for producing iPS cells include a method using a retrovirus / lentivirus and a method using an episomal vector.
  • Somatic cells can be infected with retroviruses and lentiviruses to introduce genes encoding reprogramming factors into the cells.
  • retroviruses and lentiviruses can insert reprogramming factors into the genome of somatic cells, inducing stable intracellular expression of reprogramming factors.
  • the method using retrovirus / lentivirus has the following problems.
  • the insertion of reprogramming factors into the genome of somatic cells damages existing genes and promoters and can cause canceration of the cells.
  • the reprogramming factor inserted on the genome may reactivate after converting iPS cells into somatic cells. Therefore, cells for transplantation derived from iPS cells have a risk of canceration.
  • reactivation of the introduced reprogramming factor is observed in somatic cells, and it has been confirmed that it becomes cancerous (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • the episomal vector is circular DNA and self-amplifies in the nucleus. It has been thought that episomal vectors are not integrated into the genome in principle, but recent studies have shown that fragments of episomal vectors are interspersed into the genome of iPS cells created by episomal. Has been reported. Therefore, there is a problem that the reprogramming gene can remain in the cell. For example, if c-MYC or KLF4 remains in cells, it causes canceration. It costs a lot of money to test whether a reprogramming gene remains in a cell. It is not possible to show that all cells in the transplanted cell pool have no insertion of the episomal plasmid into the genome and no residue.
  • Patent Documents 1 to 4 Since the method using a retrovirus / lentivirus and the method using an episomal vector have the above-mentioned problems, a method for producing iPS cells using RNA has been proposed (for example, Patent Documents 1 to 4). And non-patent document 2).
  • One object of the present invention is to provide an efficient method for producing induced pluripotent stem cells.
  • a method for producing pluripotent stem cells which comprises introducing a reprogramming factor into cells and seeding and culturing the cells into which the reprogramming factor has been introduced at a low concentration.
  • the low concentration may be 0.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less.
  • the low concentration may be a concentration at which 11 or more seeded cells do not come into contact with each other.
  • the low concentration may be 5% or less confluent.
  • the reprogramming factor may be RNA.
  • a reprogramming factor may be introduced into the cells by the lipofection method.
  • a reprogramming factor may be introduced into the cells using a viral vector.
  • the viral vector may be an RNA viral vector.
  • the RNA virus vector may be a Sendai virus vector.
  • the viral vector may be a temperature-sensitive viral vector in which the stability of the viral nucleic acid decreases above a predetermined temperature.
  • the viral vector does not have to contain the viral vector whose stability of the viral nucleic acid does not decrease above a predetermined temperature.
  • the temperature-sensitive viral vector is a Sendai virus vector into which at least one of the temperature-sensitive mutations selected from TS7, TS12, TS13, TS14, and TS15 has been introduced. good.
  • a viral vector having a lower temperature sensitivity than the temperature-sensitive Sendai virus vector into which a temperature-sensitive mutation selected from TS7, TS12, TS13, TS14, and TS15 has been introduced is used. It does not have to be included.
  • a virus having the same or higher temperature sensitivity as the temperature-sensitive Sendai virus vector into which a temperature-sensitive mutation selected from TS7, TS12, TS13, TS14, and TS15 has been introduced may contain a vector.
  • the cells may be cultured at a temperature lower than a predetermined temperature for at least 2 days after the introduction of the reprogramming factor.
  • the cells may be cultured at a predetermined temperature or higher after at least 2 days have passed.
  • cells into which a reprogramming factor has been introduced may be subcultured and cultured at a predetermined temperature or higher.
  • the passage of seeding the cells at a low concentration may be repeated.
  • the passage of seeding the cells at a low concentration of 0.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less may be repeated.
  • the passage of seeding cells at a low concentration at which 11 or more seeded cells do not come into contact with each other may be repeated.
  • pluripotent stem cells it is not necessary to isolate pluripotent stem cells or colonies of pluripotent stem cells by culturing.
  • the culture may be adhesive culture.
  • the culture may be suspension culture.
  • cells into which a reprogramming factor has been introduced may be cultured without cloning.
  • cells into which a reprogramming factor has been introduced may be exfoliated from an incubator, and at least a part of the exfoliated cells may be mixed and seeded.
  • the detached cells may be mixed.
  • cells into which a reprogramming factor has been introduced may be recovered from an incubator, and at least a part of the recovered cells may be mixed and seeded.
  • the recovered cells may be mixed.
  • cells into which a reprogramming factor has been introduced in culturing may be mixed and seeded with cells derived from different single cells.
  • cells into which a reprogramming factor has been introduced may be mixed by subculturing.
  • clones of cells into which a reprogramming factor has been introduced may be mixed by subculturing.
  • the above method for producing pluripotent stem cells does not have to include separating a plurality of colonies formed by cells into which a reprogramming factor has been introduced.
  • a plurality of colonies formed by cells into which a reprogramming factor has been introduced may be mixed with each other.
  • the above method for producing pluripotent stem cells does not have to include cloning a single colony formed by cells into which a reprogramming factor has been introduced.
  • the above method for producing pluripotent stem cells does not have to include picking up colonies formed by cells into which a reprogramming factor has been introduced.
  • cells into which a reprogramming factor has been introduced and which are attached to an incubator may be collected, and at least a part of the collected cells may be seeded in a medium. ..
  • cells into which a reprogramming factor has been introduced may be passaged without distinguishing them according to their gene expression status.
  • cells into which a reprogramming factor has been introduced may be passaged without distinction depending on the degree of reprogramming.
  • the entire cells may be cryopreserved as pluripotent stem cells.
  • the entire peeled cells may be cryopreserved as pluripotent stem cells.
  • the entire cells peeled off with a stripping solution may be cryopreserved as pluripotent stem cells.
  • colonies of pluripotent stem cells may be mixed after culturing.
  • the reprogramming factor is introduced into the cell using a viral vector, and the cell into which the reprogramming factor is introduced is seeded and cultured at a low concentration.
  • a method of inducing pluripotent stem cells and eradicating viral vectors is provided.
  • the low concentration may be 0.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less.
  • the low concentration may be a concentration at which 11 or more seeded cells do not come into contact with each other.
  • the low concentration may be 5% or less confluent.
  • the reprogramming factor may be RNA.
  • a reprogramming factor may be introduced into the cells by the lipofection method.
  • a reprogramming factor may be introduced into the cells using the viral vector.
  • the viral vector may be an RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a Sendai viral vector.
  • the viral vector may be a temperature-sensitive viral vector in which the stability of the viral nucleic acid decreases above a predetermined temperature.
  • the viral vector does not have to contain the viral vector whose stability of the viral nucleic acid does not decrease above a predetermined temperature.
  • the temperature-sensitive viral vector has been introduced with at least one of the temperature-sensitive mutations selected from TS7, TS12, TS13, TS14, and TS15. It may be a viral vector.
  • the temperature of the viral vector is higher than that of the temperature-sensitive Sendai viral vector into which a temperature-sensitive mutation selected from TS7, TS12, TS13, TS14, and TS15 has been introduced. It does not have to contain a less sensitive viral vector.
  • the viral vector is the temperature-sensitive Sendai viral vector into which a temperature-sensitive mutation selected from TS7, TS12, TS13, TS14, and TS15 has been introduced. It may contain viral vectors of equal or greater susceptibility.
  • the cells may be cultured at a temperature below a predetermined temperature for at least 2 days after the introduction of the reprogramming factor.
  • the cells may be cultured at a predetermined temperature or higher after at least 2 days have passed.
  • the cells into which the reprogramming factor has been introduced may be subcultured and cultured at a predetermined temperature or higher.
  • the passage of seeding the cells at a low concentration may be repeated.
  • the passage of seeding the cells at a low concentration of 0.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less may be repeated.
  • the passage of seeding cells at a low concentration at which 11 or more seeded cells do not come into contact with each other may be repeated.
  • the culture may be adhesive culture.
  • the culture may be suspension culture.
  • the reprogramming factor may be cultured without cloning.
  • the cells into which the reprogramming factor has been introduced are exfoliated from the incubator, and at least a part of the exfoliated cells is mixed and seeded. You may.
  • the detached cells may be mixed.
  • cells into which a reprogramming factor has been introduced are recovered from an incubator, and at least a part of the recovered cells is mixed and seeded. You may.
  • the recovered cells may be mixed.
  • cells into which a reprogramming factor has been introduced in culturing may be seeded by mixing cells derived from different single cells.
  • cells into which a reprogramming factor has been introduced may be mixed by subculturing.
  • clones of cells into which a reprogramming factor has been introduced may be mixed by passage.
  • the above method of inducing pluripotent stem cells and erasing viral vectors does not have to include separating a plurality of colonies formed by cells into which a reprogramming factor has been introduced.
  • a plurality of colonies formed by cells into which a reprogramming factor has been introduced may be mixed with each other.
  • the above method of inducing pluripotent stem cells and erasing viral vectors does not have to include cloning a single colony formed by cells into which a reprogramming factor has been introduced.
  • the above method of inducing pluripotent stem cells and erasing viral vectors does not have to include picking up colonies formed by cells into which reprogramming factors have been introduced.
  • cells into which a reprogramming factor has been introduced may be passaged without distinction according to the gene expression state.
  • cells into which a reprogramming factor has been introduced may be passaged without distinction according to the degree of reprogramming.
  • the entire cells may be cryopreserved as pluripotent stem cells.
  • the entire peeled cells may be cryopreserved as pluripotent stem cells.
  • the entire cells peeled off with a stripping solution may be cryopreserved as pluripotent stem cells.
  • the entire cells may be cryopreserved as pluripotent stem cells.
  • colonies of pluripotent stem cells may be mixed after culturing.
  • FIG. It is a graph which shows the measurement result by the flow cytometer which concerns on Example 1.
  • FIG. It is a graph which shows the measurement result by the flow cytometer which concerns on Example 2.
  • FIG. It is a photograph which shows the TRA1-60 positive cell which concerns on Example 2.
  • FIG. It is a graph which shows the measurement result by the flow cytometer which concerns on Example 3.
  • FIG. It is a graph which shows the measurement result by the flow cytometer which concerns on Example 4.
  • FIG. It is a graph which shows the result of PCR which concerns on Example 4.
  • FIG. It is a photograph which shows the TRA1-60 positive cell which concerns on Example 4.
  • FIG. 5 is a photograph of urine-derived cells transfected with RNA encoding GFP according to Example 10.
  • FIG. 5 is a photograph of urine-derived cells into which a reprogramming factor has been introduced according to Example 11.
  • FIG. 5 is a photograph of urine-derived cells into which a reprogramming factor has been introduced according to Example 12. It is a dot plot by a flow cytometer which concerns on Example 13.
  • FIG. 6 is a photograph of urine-derived cells into which a reprogramming factor has been introduced according to Example 14.
  • FIG. 6 is a photograph of urine-derived cells into which a reprogramming factor has been introduced according to Example 14.
  • the method for producing pluripotent stem cells includes introducing a reprogramming factor into the cells and seeding and culturing the cells into which the reprogramming factor has been introduced at a low concentration.
  • Pluripotent stem cells are, for example, iPS cells.
  • the cells into which the reprogramming factor is introduced are not particularly limited, and examples thereof include fibroblasts, blood cells, dental pulp stem cells, keratinocytes, dermal papilla cells, oral epithelial cells, and somatic stem progenitor cells.
  • the cell into which the reprogramming factor is introduced may be a cell contained in urine. Examples of cells contained in urine include bladder epithelial cells.
  • the cells into which the reprogramming factor is introduced may be of human or non-human animal origin.
  • the cells into which the reprogramming factor is introduced may be of one human origin or of multiple human origins.
  • the cell into which the reprogramming factor is introduced may be derived from one non-human animal or may be derived from a plurality of non-human animals.
  • Blood cells are separated from the blood.
  • Blood is, for example, peripheral blood and umbilical cord blood, but is not limited thereto. Blood may be collected from an adult or a minor.
  • an anticoagulant such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), heparin, and biopharmacy standard blood preservation solution A (ACD-A) is used.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • ACD-A biopharmacy standard blood preservation solution A
  • Blood cells are nucleated cells such as mononuclear cells (Monocytes), neutrophils, macrophages, eosinophils, basophils, and lymphocytes, and do not contain erythrocytes, granulocytes, and platelets. Blood cells may be, for example, vascular endothelial progenitor cells, blood stem / progenitor cells, T cells, or B cells. T cells are, for example, ⁇ T cells.
  • Mononuclear cells are separated from blood using a blood cell separation medium, a centrifuge, and the like.
  • a blood cell separation medium a centrifuge, and the like.
  • Ficoll GE Healthcare
  • the method for separating mononuclear cells is as follows.
  • the centrifuge To 5 mL of blood, add 5 mL of PBS to dilute, and layer 5 mL each on a medium for human lymphocyte separation in a tube. At this time, diluted blood is slowly added onto the medium along the tube wall of the tube so as not to disturb the interface.
  • the method for separating mononuclear cells when using vacutainer (registered trademark, BD) as a blood collection tube is as follows.
  • the centrifuge 4 ° C to 42 ° C, preferably 18 ° C.
  • 4 ° C to 42 ° C preferably 18 ° C.
  • 8 mL of blood is collected using a blood collection tube (vacutainer (registered trademark), BD), mixed by inversion, and mixed with an anticoagulant.
  • the balance is then adjusted and the solution is adjusted at 4 ° C to 42 ° C, preferably 18 ° C, 100 ⁇ g to 3000 ⁇ g, preferably 1500 ⁇ g to 1800 ⁇ g with a swing rotor for 1 to 60 minutes, preferably 20 minutes.
  • Centrifuge After centrifugation, the upper layer, which is the plasma layer, is removed and pipetting is performed to suspend the mononuclear cell layer and blood cells attached to the gel to obtain a suspension. Transfer the resulting suspension to another 15 mL tube.
  • 1 mL to 14 mL, preferably 12 mL of PBS is added to the suspension in a 15 mL tube, and the suspension is prepared at 4 ° C to 42 ° C, preferably 18 ° C, 100 ⁇ g to 3000 ⁇ g, preferably 200 ⁇ g.
  • a hemolytic agent PharmLyse (registered trademark), 10-fold concentration, BD
  • BD sterile water
  • the method for separating mononuclear cells from blood is not limited to the above method, and for example, a dialysis membrane may be used to separate mononuclear cells from blood.
  • a pure cell select system for whole blood mononuclear cell concentration (registered trademark, PALL), a purifier for removing blood cells (cellsova E, registered trademark, Asahi Kasei), and a leukapheresis filter for platelet preparation (sepacell PL, registered trademark, Filters such as PLX-5B-SCD, Asahi Kasei) can also be used.
  • Mononuclear cells may be separated using an erythrocyte separating agent capable of separating nucleated cells by gravity sedimentation or centrifugation of erythrocytes.
  • erythrocyte separating agents include HetaSep (registered trademark, STEMCELL Technologies) and HES40 (NIPRO).
  • CTL-UP1 sold by Cellular Technology Limited
  • PBMC-001 of Sanguine Biosciences, or the like may be used as the mononuclear cell.
  • the cryopreserved blood cells may be thawed and used using a cell cryopreservation solution such as Cerbunker 1, Stem Cerbunker GMP grade, and Stem Cerbunker DMSO-free GMP grade (Zenoac).
  • a cell cryopreservation solution such as Cerbunker 1, Stem Cerbunker GMP grade, and Stem Cerbunker DMSO-free GMP grade (Zenoac).
  • thawing mononuclear cells When thawing mononuclear cells, first, 1 mL to 15 mL, preferably 8 mL of a serum-free hematopoietic cell medium (X-VIVO® 10, Ronza) having a known composition was placed in a 15 mL tube and frozen. Place the tube containing the mononuclear cells in a warm bath at 4 ° C to 42 ° C, preferably 37 ° C to begin thawing the mononuclear cells. Then, with a little ice remaining, the tube containing the mononuclear cells is pulled out of the warm bath and the mononuclear cells are transferred to the tube containing the serum-free hematopoietic cell medium of known composition. Of these, 10 ⁇ L of mononuclear cell suspension is stained with trypan blue and counted on a hemocytometer.
  • X-VIVO® 10 serum-free hematopoietic cell medium
  • Blood cells may be isolated based on cell surface markers.
  • Blood stem / progenitor cells are positive for CD34.
  • the T cells are positive for any of CD3, CD4, and CD8.
  • B cells are positive for any of CD10, CD19, and CD20.
  • Macrophages are positive for any of CD11b, CD68, and CD163.
  • Blood stem / progenitor cells, T cells, or B cells are separated from blood cells using, for example, an automatic magnetic cell separator and immunomagnetic beads. Alternatively, pre-separated mononuclear cells may be prepared. However, blood cells that have not been separated based on cell surface markers may be used.
  • CD34-positive cells are stem / progenitor cells and tend to be easily reprogrammed. Further, when iPS cells are prepared using T cells which are CD3 positive cells, the iPS cells derived from the T cells retain the type of TCR recombination, so that they tend to be able to efficiently induce differentiation into T cells.
  • the method for separating CD34-positive cells is as follows.
  • 10 ⁇ L IL-6 (100 ⁇ g / mL), 10 ⁇ L SCF (300 ⁇ g / mL), 10 ⁇ L TPO (300 ⁇ g / mL), 10 ⁇ L FLT3 ligand (300 ⁇ g / mL) in 10 mL serum-free medium (StemSpan H3000, STEMCELL Technologies).
  • 10 ⁇ L of IL-3 (10 ⁇ g / mL) are added to prepare a blood cell medium (blood stem / progenitor cell medium).
  • 1 mL to 6 mL preferably 2 mL of blood cell medium in 1 well of a 6-well plate.
  • 1 mL to 6 mL and 2 mL of PBS are placed in each of the other 5 wells to prevent evaporation of the medium.
  • the 6-well plate is then placed in an incubator at 4 ° C to 42 ° C, preferably 37 ° C for warming.
  • a mononuclear cell suspension containing 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 9 cells, preferably 2 ⁇ 10 7 mononuclear cells was dispensed into a 15 mL tube, and the mononuclear cell suspension was prepared.
  • Centrifuge at 4 ° C to 42 ° C, preferably 4 ° C, 100 ⁇ g to 3000 ⁇ g, preferably 300 ⁇ g for 10 minutes. After centrifugation, the supernatant is removed and the mononuclear cells are suspended in 100 ⁇ L to 1 mL, preferably 300 ⁇ L of column buffer.
  • 1 mL to 15 mL, preferably 10 mL of column buffer is added to the mononuclear cell suspension in a 15 mL tube to dilute it, and the mixture is diluted at 4 ° C to 42 ° C, preferably 4 ° C, 100 ⁇ g to 1000 ⁇ g. Centrifuge at 300 xg for 1 to 2 hours, preferably 10 minutes. After centrifugation, the supernatant in a 15 mL tube is removed with an ejector, and 10 ⁇ L to 10 mL, preferably 500 ⁇ L of column buffer is added and resuspended.
  • a column for an automatic magnetic cell separation device (MS column, Miltenyi Biotec) is attached to an automatic magnetic cell separation device (MiniMACS Separation Unit, Miltenyi Biotec), and a column buffer of 10 ⁇ L to 10 mL, preferably 500 ⁇ L is put in the column and washed.
  • a column buffer of 10 ⁇ L to 10 mL, preferably 500 ⁇ L is placed in the column, and the column is washed 1 to 10 times, preferably 3 times.
  • the column is then removed from the automatic magnetic cell separator and placed in a 15 mL tube.
  • the column is then filled with 10 ⁇ L to 10 mL, preferably 1000 ⁇ L of column buffer, and the syringe is swiftly pushed to allow CD34-positive cells to drain into a 15 mL tube.
  • a 10 ⁇ L CD34-positive cell suspension is stained with trypan blue and the cell count is counted on a hemocytometer.
  • the CD34-positive cell suspension in a 15 mL tube is centrifuged at 4 ° C to 42 ° C, preferably 4 ° C, 100 ⁇ g to 1000 ⁇ g, preferably 300 ⁇ g for 1 to 2 hours, preferably 10 minutes. .. After centrifugation, remove the supernatant with an ejector.
  • the CD34-positive cells are resuspended in the warmed blood cell medium, and the CD34-positive cells are sprinkled on the culture plate. Then, the CD34-positive cells are cultured at 4 ° C. to 42 ° C., preferably 37 ° C., 1% to 20%, preferably 5% CO 2 for 6 days. During this time, the medium does not have to be exchanged.
  • the method of isolating cells with a marker other than CD34 is the same as the method of isolating CD34-positive cells.
  • RNA is, for example, mRNA.
  • Reprogramming factors introduced into cells include, for example, OCT RNA such as OCT3 / 4, SOX RNA such as SOX2, KLF RNA such as KLF4, and MYC RNA such as c-MYC.
  • OCT RNA such as OCT3 / 4
  • SOX RNA such as SOX2
  • KLF RNA such as KLF4
  • MYC RNA such as c-MYC.
  • reprogramming factor RNA it may be used M 3 O having improved OCT3 / 4.
  • RNAs are LIN28A, FOXH1, LIN28B, GLIS1, p53-dominant negative, p53-P275S, L-MYC, NANOG, DPPA2, DPPA4, DPPA5, ZIC3, BCL-2, E-RAS, TPT1, SALL2. , NAC1, DAX1, TERT, ZNF206, FOXD3, REX1, UTF1, KLF2, KLF5, ESRRB, miR-291-3p, miR-294, miR-295, NR5A1, NR5A2, TBX3, MBD3sh, TH2A, TH2 It may further contain RNA of at least one factor selected from the group. These RNAs are available from TriLink.
  • gene symbol is described here in humans, it is not intended to limit the species by uppercase or lowercase notation. For example, capitalization of all letters does not exclude the inclusion of mouse or rat genes. However, in the examples, the gene symbols are shown according to the species actually used.
  • RNA may be modified with psiduridine ( ⁇ ) or 5-methyluridine (5meU). RNA may be polyadenylated.
  • the reprogramming factor is introduced into cells by, for example, the lipofection method.
  • the lipofection method is a method in which a complex of a negatively charged nucleic acid and a positively charged lipid is formed by electrical interaction, and the complex is incorporated into the cell by endocytosis or membrane fusion. ..
  • the lipofection method has advantages such as less damage to cells, excellent introduction efficiency, easy operation, and less time.
  • the reprogramming factor is introduced into cells cultured using, for example, an RNA transfection reagent.
  • RNA may be introduced into the mononuclear cell immediately after the mononuclear cell is separated from the blood.
  • RNA transfection reagent Lipofectamine Messenger MAX (registered trademark, Thermo Fisher SCIENTIFIC) can be used.
  • RNA transfection reagent for example, Lipofectamine (registered trademark) RNAiMAX (Thermo Fisher SCIENTIFIC), Lipofectamine StemTransfection Reagent (Thermo Fisher SCIENTIFIC), Transfection (ReproCELL), Jet Messenger (Polyplus), Lipofectamin (registered trademark) 2000, Lipofectamin (registered trademark) 3000, NeonTransfection System (Thermo Fisher SCIENTIFIC), Stemfect RNA transfection reagent (Stemfect), NextFect (registered trademark) RNA Transfection Reagent (BiooSientific ), Amaxa (registered product) Human T cell Nucleector (registered product) kit (Lonza, VAPA-1002), Amaxa (registered product) Human CD34 cell Nucleector (
  • a reprogramming factor is introduced into the cell using, for example, a viral vector.
  • the viral vector may be an RNA viral vector.
  • the RNA viral vector may be a Sendai viral vector.
  • the Sendai virus vector may be a temperature-sensitive Sendai virus vector in which the stability of the viral nucleic acid decreases above a predetermined temperature.
  • the viral nucleic acid of the temperature-sensitive Sendai virus vector is stable below a predetermined temperature.
  • the viral nucleic acid may be viral DNA or viral RNA.
  • the viral nucleic acid may be a viral genome. The decrease in the stability of the viral nucleic acid may be at least one of the degradation of the viral nucleic acid and the suppression of the replication or proliferation of the viral nucleic acid.
  • Decreased stability of viral nucleic acids reduces at least one of viral nucleic acid proliferation, viral nucleic acid replication rate, and gene expression levels.
  • the predetermined temperature is, for example, 36.5 ° C or higher and 37.5 ° C or lower, 36.6 ° C or higher and 37.4 ° C or lower, 36.7 ° C or higher, 37.3 ° C or lower, 36.8 ° C or higher and 37.2.
  • the temperature is 36.9 ° C or higher and 37.1 ° C or lower, or 37 ° C.
  • At least one of the viral nucleic acid stability of the temperature-sensitive Sendai virus vector, i.e., growth, replication rate and gene expression level is high below a given temperature and low above a given temperature.
  • the temperature-sensitive Sendai virus vector has a growth rate or gene expression level of 1/2 or less in cells cultured at 37 ° C. as compared with a growth rate or gene expression level in cells cultured at 32 ° C. , 1/3 or less, 1/5 or less, 1/10 or less, or 1/20 or less.
  • Sendai virus encodes N gene, P gene, M gene, F / HN gene, and L gene.
  • the HN protein recognizes sialic acid on the cell surface when Sendai virus attaches to the cell and anchors the virus particles to the cell.
  • the F protein is cleaved and activated by an extracellular protease to catalyze the fusion of the tethered Sendai virus envelope and the cell membrane of the target cell to establish an infection.
  • the L protein, along with its modified protein, the P protein catalyzes the replication of viral nucleic acids in the cytoplasm after infection and transcription from the replicated multi-copy nucleic acids.
  • the Sendai virus vector By deleting the F gene in the Sendai virus vector, it is possible to suppress the production of infectious virus particles from the transgenic cells. Moreover, it is possible to make the Sendai virus vector temperature sensitive by introducing a mutation into at least one of the L gene and the P gene.
  • TS7 L protein Y942H / L1361C / L1558I mutation
  • TS12 P protein D433A / R434A / K437A mutation
  • TS13 P protein D433A / R434A / K437A
  • Mutations and L protein L1558I mutations TS14 (P protein D433A / R434A / K437A mutations and L protein L1361C mutations)
  • TS15 P protein D433A / R434A / K437A mutations and L protein L1361C / L1558I mutations
  • Sendai viral vectors have, for example, G69E, T116A, and A183S mutations in the M protein, A262T, G264R, and K461G mutations in the HN protein, L511F mutations in the P protein, and N1197S in the L protein. It is an F gene deletion ( ⁇ F) type Sendai virus vector having the K1795E mutation, and is a Sendai virus vector into which the above-mentioned TS7, TS12, TS13, TS14, or TS15 mutation has been introduced.
  • the temperature-sensitive mutation of the Sendai virus vector is not limited to these.
  • the Sendai virus vector is, for example, SeV (PM) / TS ⁇ F, SeV18 + / TS ⁇ F, or SeV (HNL) / TS ⁇ F, and is a Sendai virus vector into which the above-mentioned TS7, TS12, TS13, TS14, or TS15 mutation has been introduced.
  • the temperature-sensitive mutation of the Sendai virus vector is not limited to these.
  • the Sendai virus vector introduced into cells may be a combination of a temperature-sensitive Sendai virus vector and a temperature-insensitive Sendai virus vector.
  • the Sendai virus vector introduced into the cell is only the temperature-sensitive Sendai virus vector, and does not have to contain the temperature-insensitive Sendai virus vector.
  • the Sendai virus vector introduced into cells is only a temperature-sensitive Sendai virus vector into which a mutation of TS7, TS12, TS13, TS14, or TS15 has been introduced, and does not have to contain a temperature-insensitive Sendai virus vector.
  • the Sendai virus vector introduced into cells is only the temperature-sensitive Sendai virus vector having the same or higher temperature sensitivity as the temperature-sensitive Sendai virus vector into which the mutation of TS7, TS12, TS13, TS14, or TS15 has been introduced, and the temperature-insensitive Sendai. It does not have to contain a viral vector.
  • the Sendai virus vector introduced into cells is only the Sendai virus vector having the same or higher temperature sensitivity as the temperature sensitive Sendai virus vector into which the mutation of TS7, TS12, TS13, TS14, or TS15 has been introduced, and TS7, TS12, It does not have to contain a Sendai virus vector that is less temperature sensitive than the temperature sensitive Sendai virus vector into which the TS13, TS14, or TS15 mutations have been introduced.
  • the Sendai virus vector introduced into cells carries an arbitrary reprogramming factor.
  • the Sendai virus vector introduced into the cell contains, for example, a temperature-sensitive Sendai virus vector containing KLF RNA, OCT RNA, and SOX RNA in this order and not containing MYC RNA, and MYC RNA containing KLF. RNA, OCT RNA, and SOX RNA-free temperature-sensitive Sendai virus vector.
  • the number, combination, and order of the reprogramming factors loaded on the Sendai virus vector are arbitrary and are not particularly limited.
  • the Sendai virus vector introduced into the cell may contain a Sendai virus vector containing KLF RNA and not containing OCT RNA and SOX RNA.
  • the Sendai virus vector containing KLF RNA and not OCT RNA and SOX RNA may be a temperature-sensitive Sendai virus vector or a temperature-insensitive Sendai virus vector.
  • the Sendai virus vector disappears earlier from the cells into which the Sendai virus vector has been introduced when the temperature-insensitive Sendai virus vector is not introduced.
  • Temperature-sensitive Sendai virus vectors containing KLF RNA, OCT RNA, and SOX RNA have, for example, mutations in G69E, T116A, and A183S in the M protein and mutations in A262T, G264R, and K461G in the HN protein.
  • An F gene-deficient Sendai virus vector having an L511F mutation in the P protein and N1197S and K1795E mutations in the L protein, and having the above-mentioned TS7, TS12, TS13, TS14, or TS15 mutation. It is a virus vector.
  • the temperature sensitive mutation is, for example, TS7 or TS12, or TS12.
  • the temperature sensitive Sendai virus vector containing KLF RNA, OCT RNA, and SOX RNA is, for example, SeV (PM) KOS / TS7 ⁇ F or SeV (PM) KOS / TS12 ⁇ F, or SeV (PM) KOS / TS12 ⁇ F. be.
  • a temperature-sensitive Sendai virus vector containing MYC RNA has, for example, mutations in G69E, T116A, and A183S in M protein, mutations in A262T, G264R, and K461G in HN protein, and L511F mutation in P protein. It is an F gene-deficient Sendai virus vector having N1197S and K1795E mutations in L protein, and is a Sendai virus vector having the above-mentioned TS7, TS12, TS13, TS14, or TS15 mutations.
  • the temperature sensitive mutation is, for example, TS15.
  • Temperature sensitive Sendai virus vectors containing MYC RNA are, for example, SeV (HNL) MYC / TS12 ⁇ F, SeV (HNL) MYC / TS13 ⁇ F, or SeV (HNL) MYC / TS15 ⁇ F, or SeV (HNL) MYC / TS15 ⁇ F. be.
  • Sendai viral vectors containing KLF RNA but not OCT RNA and SOX RNA have, for example, mutations in G69E, T116A, and A183S in the M protein and mutations in A262T, G264R, and K461G in the HN protein. It is an F gene-deficient Sendai virus vector having an L511F mutation in the P protein and an N1197S and K1795E mutation in the L protein.
  • the Sendai virus vector containing KLF RNA and not containing OCT RNA and SOX RNA is, for example, less temperature sensitive than the Sendai virus vector into which the above-mentioned TS7, TS12, TS13, TS14, or TS15 mutation has been introduced, and is predetermined.
  • the KLF gene can be expressed even at temperatures above.
  • the Sendai virus vector containing KLF RNA but not OCT RNA and SOX RNA is, for example, SeV18 + KLF4 / TS ⁇ F.
  • multiple types of Sendai virus vectors are introduced into cells at the same time.
  • multiple types of Sendai virus vectors are introduced into cells at the same time.
  • the multiplicity of infection (MOI) of the Sendai viral vector when infecting cells is, for example, 0.1 or more, 0.3 or more, 0.5 or more, 1.0 or more, 2.0 or more, 3.0 or more. It is 4.0 or more, or 5.0 or more.
  • the MOI is, for example, 100 or less, 90 or less, 80 or less, 70 or less, 60 or less, 50 or less, 40 or less, 30 or less, 20 or less, 10 or less, or 5 or less.
  • the temperature at which cells are infected with the Sendai virus vector is below a predetermined temperature at which the stability of the virus nucleic acid of the temperature-sensitive Sendai virus vector decreases, that is, the temperature at which the virus nucleic acid of the temperature-sensitive Sendai virus vector is stable. It may be above a predetermined temperature.
  • the temperature at which cells are infected with the Sendai virus vector reduces the stability of the viral nucleic acid of the temperature-sensitive Sendai virus vector. It is preferable that the temperature is lower than the predetermined temperature, that is, the temperature at which the viral nucleic acid of the temperature-sensitive Sendai virus vector is stable.
  • the cells into which the reprogramming factor is introduced may be adherently cultured or suspendedly cultured.
  • Somatic cells into which reprogramming factors are introduced are feeder-free using basement membrane matrices such as Matrigel (Corning), CELLstart (registered trademark, Thermo Fisher), Laminin 511 (iMatrix-511, nippi), fibronectin, and vitrotin. It may be cultured.
  • basement membrane matrices such as Matrigel (Corning), CELLstart (registered trademark, Thermo Fisher), Laminin 511 (iMatrix-511, nippi), fibronectin, and vitrotin. It may be cultured.
  • a stem cell medium such as a human ES / iPS medium such as Prime ES Cell Medium (ReproCELL) can be used.
  • the stem cell medium is not limited to this, and various stem cell media can be used.
  • the stem cell medium preferably contains albumin with a reduced fatty acid loading.
  • the stem cell medium is placed in, for example, a dish, well, or tube.
  • the gel medium is, for example, a stem cell medium containing gellan gum at a final concentration of 0.001% by mass to 0.5% by mass, 0.005% by mass to 0.1% by mass, or 0.01% by mass to 0.05% by mass. It is prepared by adding so as to become.
  • Gel media include gellan gum, hyaluronic acid, lambzan gum, dieutan gum, xanthan gum, carrageenan, fucoidan, pectin, pectinic acid, pectinic acid, heparan sulfate, heparan, heparitin sulfate, keratosulfate, chondroitin sulfate, deltaman sulfate, ramnan sulfate, and It may contain at least one polymer compound selected from the group consisting of those salts.
  • the gel medium may contain methyl cellulose. By including methyl cellulose, agglutination between cells is further suppressed.
  • the gel medium is poly (glycerol monomethacrylate) (PGMA), poly (2-hydroxypropylmethacrylate) (PHPMA), Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM), amine terminated, carboxylic acid terminated, maleimide terminated, N-hydroxysuccinimide (N-hydroxysuccinimide).
  • PGMA poly (glycerol monomethacrylate)
  • PPMA poly (2-hydroxypropylmethacrylate)
  • PIPAM Poly (N-isopropylacrylamide)
  • amine terminated carboxylic acid terminated
  • maleimide terminated N-hydroxysuccinimide (N-hydroxysuccinimide).
  • the gel medium may or may not contain a growth factor such as basic fibroblast growth factor (bFGF).
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • the gel medium may contain a growth factor such as bFGF at a low concentration of 400 ⁇ g / L or less, 40 ⁇ g / L or less, or 10 ⁇ g / L or less.
  • the gel medium may or may not contain TGF- ⁇ , or may contain TGF- ⁇ at a low concentration of 600 ⁇ g / L or less, 300 ⁇ g / L or less, or 100 ⁇ g / L or less.
  • the gel medium does not have to be agitated. Further, the gel medium does not have to contain feeder cells.
  • the gel medium may contain at least one substance selected from the group consisting of cadherin, laminin, fibronectin, and vitronectin.
  • a temperature lower than a predetermined temperature at which the stability of the viral nucleic acid of the temperature-sensitive Sendai virus vector decreases that is, a temperature-sensitive Sendai virus.
  • the cells may be cultured at a temperature at which the vector viral nucleic acid is stable. Then, the cells may be cultured at a predetermined temperature or higher.
  • the medium may be changed, for example, once every two days while culturing the cells above a predetermined temperature.
  • At least 2 days, or 2 days or more and 10 days or less for example, 4.0 ° C or higher, 10 ° C or higher, 15 ° C or higher, 20 ° C or higher, 25 ° C or higher, 30 ° C or higher.
  • Cells may be cultured at temperatures below 36.6 ° C, below 36.5 ° C, below 36.0 ° C, below 35.0 ° C, or below 34.0 ° C.
  • the temperature is raised to 36.5 ° C. or higher, 36.6 ° C. or higher, 36.7 ° C. or higher, 36.8 ° C. or higher, 36.9 ° C. or higher, or 37.0 ° C. or higher, 40.0 ° C.
  • the cells may be cultured at a temperature of 39.0 ° C. or lower, or 38.0 ° C. or lower.
  • the temperature may be raised once or stepwise. After raising the temperature, the medium may be changed while culturing the cells, for example once every two days.
  • the temperature-sensitive Sendai virus vector viral nucleic acid becomes less stable than a predetermined temperature, that is, the temperature-sensitive Sendai viral vector viral nucleic acid
  • the cells may be cultured at a stable temperature. After the stem cell-like colonies begin to appear, the cells may be cultured above a predetermined temperature. The medium may be changed, for example, once every two days while culturing the cells above a predetermined temperature.
  • stem cell-like colonies After infecting cells with Sendai virus vector, until stem cell-like colonies begin to appear, for example, 4.0 ° C or higher, 10 ° C or higher, 15 ° C or higher, 20 ° C or higher, 25 ° C or higher, 30 ° C or higher, 31.
  • ° C or higher 32.0 ° C or higher, 33.0 ° C or higher, 33.1 ° C or higher, 33.2 ° C or higher, 33.3 ° C or higher, 33.4 ° C or higher, 33.5 ° C or higher, 33.6 ° C 33.7 ° C or higher, 33.8 ° C or higher, or 33.9 ° C or higher, less than 37.0 ° C, less than 36.9 ° C, less than 36.8 ° C, less than 36.7 ° C, 36.6 Cells may be cultured at temperatures below ° C., below 36.5 ° C., below 36.0 ° C., below 35.0 ° C., or below 34.0 ° C.
  • the temperature is raised to 36.5 ° C or higher, 36.6 ° C or higher, 36.7 ° C or higher, 36.8 ° C or higher, 36.9 ° C or higher, or 37.0 ° C.
  • cells may be cultured at a temperature of 40.0 ° C. or lower, 39.0 ° C. or lower, or 38.0 ° C. or lower.
  • the temperature may be raised once or stepwise. After raising the temperature, the medium may be changed while culturing the cells, for example once every two days.
  • the cells After infecting the cells with the Sendai virus vector and culturing the cells, the cells are passaged at least once. The passage may be carried out multiple times.
  • the cells When subcultured cells into which a reprogramming factor has been introduced using the Sendai virus vector, the cells are seeded in medium or incubator at low concentrations.
  • the low concentration is, for example, 1 cell / cm 2 or more, 0.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less, 1.25 ⁇ 10 3 cells / cm 2 or less, 0.25 ⁇ 10 3 cells /. It is cm 2 or less, 0.25 ⁇ 10 2 cells / cm 2 or less, or 0.25 ⁇ 10 1 cells / cm 2 or less.
  • low concentration means that 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, or 2 or less cells can come into contact with each other. There is a concentration at which 11 or more cells do not come into contact with each other. In addition, there may be a plurality of cell clusters in which 10 or less cells are in contact with each other. Alternatively, the state where the entire bottom surface of the cell container is covered with cells is defined as 100% confluent, and low concentration means 5% or less confluent, 4% or less confluent, 3% or less confluent, 2% or less confluent, 1% or less confluent, 0.
  • the low concentration is, for example, a concentration at which single cells do not come into contact with each other in the seeded cells.
  • single cells may be seeded in the wells of the well plate.
  • the well plate may be a 12-well plate or a 96-well plate.
  • cells may be cultured at a temperature above a predetermined temperature at which the stability of the viral nucleic acid of the temperature-sensitive Sendai virus vector decreases. After passage, the cells are cultured, for example, at a temperature of 36.5 ° C. or higher and lower than 38.0 ° C. After passage, for example, cells are cultured at a temperature of 36.5 ° C. or higher and lower than 38.0 ° C. until cell-cell adhesion starts, and after cell-cell adhesion starts, a higher temperature until cell-cell adhesion starts. For example, cells may be cultured at a temperature of 37.5 ° C. or higher, 42.0 ° C. or lower, 41.5 ° C. or lower, 41.0 ° C.
  • the temperature is 37.5 ° C or higher, 42.0 ° C or lower, 41.5 ° C or lower, 41.0 ° C or lower, 40.5 ° C or lower, or 40.0 ° C.
  • the cells may be cultured at the following temperatures.
  • the cells into which the reprogramming factor has been introduced are induced into pluripotent stem cells with high efficiency, so that the cells not induced into the stem cells substantially remain. It is not necessary to isolate stem cell-like colonies from cells that have not been induced into stem cells during passage and cryopreservation, as no or less than a few percent remain.
  • cells that have not been induced into stem cells do not substantially remain, or only a few percent or less remain. Therefore, cells into which a reprogramming factor has been introduced are collected at the time of passage. , At least a portion of the collected and mixed cells may be seeded in the medium. In passage, clones of cells into which reprogramming factors have been introduced may be mixed together. In passage, different clones of cells into which reprogramming factors have been introduced may be mixed together. Then, the cells into which the reprogramming factor has been introduced may be collected, and at least a part of the collected and mixed cells may be seeded in a medium and subcultured a plurality of times.
  • the cells into which the reprogramming factor has been introduced may be recovered, and at least a part of the recovered mixed cells may be seeded in a medium and subcultured. In addition, all the collected mixed cells may be seeded in the medium.
  • the cells into which the reprogramming factor has been introduced are collected, and at least a part of the collected and mixed cells is seeded in a medium and subcultured. It refers to passage without distinction according to the expression state. For example, at the time of passage, cells into which a reprogramming factor has been introduced may be seeded in the same incubator without distinguishing by gene expression status. Alternatively, the cells into which the reprogramming factor has been introduced are collected, and at least a part of the collected and mixed cells is seeded in a medium and subcultured. For example, the cells into which the reprogramming factor has been introduced are reprogrammed. It means to pass on without distinguishing by the degree of. For example, at the time of passage, cells into which a reprogramming factor has been introduced may be seeded in the same incubator without distinction according to the degree of reprogramming.
  • the cells into which the reprogramming factor has been introduced are collected, and at least a part of the collected and mixed cells is seeded in a medium and subcultured, for example, the cells into which the reprogramming factor has been introduced are expressed in morphology. It means to succeed without distinction.
  • cells into which a reprogramming factor has been introduced may be seeded in the same incubator without distinguishing by morphology.
  • the cells into which the reprogramming factor has been introduced are collected, and at least a part of the collected and mixed cells is seeded in a medium and subcultured.
  • the cells into which the reprogramming factor has been introduced are sized. It means to succeed without distinction.
  • cells into which a reprogramming factor has been introduced may be seeded in the same incubator without distinction by size.
  • the cells into which the reprogramming factor has been introduced are recovered, and at least a part of the collected and mixed cells is seeded in a medium and subcultured without cloning the cells into which the reprogramming factor has been introduced. It means to succeed. For example, in the case of passage without cloning, it is not necessary to pick up the colonies formed by the cells into which the reprogramming factor has been introduced. For example, when passaged without cloning, it is not necessary to separate multiple colonies formed by cells into which the reprogramming factor has been introduced. For example, at the time of passage, cells forming a plurality of different colonies may be mixed and seeded in the same incubator.
  • colonies may be mixed and seeded in the same incubator.
  • cells into which a reprogramming factor has been introduced are adherently cultured, even if the adherently cultured cells are collected, and at least a part of the collected and mixed cells is seeded in a medium and subcultured. good.
  • cells may be detached from the incubator and at least a portion of the detached and mixed cells may be seeded in the same incubator.
  • cells may be stripped from the incubator with a stripping solution and the whole cells that have been stripped and mixed may be passaged.
  • cells that do not form colonies may be passaged.
  • the cells into which the reprogramming factor has been introduced are suspension-cultured, the entire suspension-cultured cells may be passaged.
  • the entire cells that were adherently cultured may be passaged.
  • the entire cell detached from the incubator may be subcultured with a stripping solution.
  • the entire cells that have been adherently cultured may be cryopreserved as pluripotent stem cells.
  • the entire cells exfoliated from the incubator with the exfoliating solution may be cryopreserved as pluripotent stem cells.
  • the entire suspension-cultured cells may be subcultured.
  • the entire cells in suspension culture may be cryopreserved as pluripotent stem cells.
  • pluripotent stem cells induced by the method according to the present embodiment since the Sendai virus disappears equally, a plurality of formed colonies may be mixed with each other.
  • cells not induced by the stem cells are substantially not retained or only a few percent or less remain, so that they are formed. You may mix multiple colonies.
  • the induced pluripotent stem cells can form flat colonies similar to ES cells and express alkaline phosphatase.
  • the induced pluripotent stem cells can express Nanog, OCT4, SOX2, etc., which are undifferentiated cell mer powers.
  • Induced pluripotent stem cells can express TERT.
  • Induced pluripotent stem cells may exhibit temouth mellase activity.
  • a cytoflow meter which is a cell surface marker indicating that the cells were undifferentiated, such as TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-1, and. This may be done by analyzing whether at least one surface marker selected from SSEA5 is positive.
  • TRA-1-60 is an antigen specific for iPS / ES cells. Since iPS cells can be produced only from the TRA-1-60 positive fraction, TRA-1-60 positive cells are considered to be the species of iPS cells.
  • Example 1 The dish coated with laminin 511 was used as a dish for inducing pluripotent stem cells.
  • peripheral blood mononuclear cells were suspended in a blood medium, and the number of mononuclear cells was measured using a hemocytometer to adjust the number of mononuclear cells in the blood medium. Then, mononuclear cells were two-dimensionally cultured at 37 ° C. for 1 to 7 days on a dish for inducing pluripotent stem cells.
  • CytoTune-iPS2.0 (registered trademark, ID Pharma), which is a Sendai virus vector kit.
  • CytoTune-iPS2.0 contains SeV (PM) hKOS / TS12 ⁇ F, which is a temperature-sensitive Sendai viral vector carrying the KLF4 gene, Oct3 / 4 gene, and SOX2 gene as reprogramming factors, and the temperature at which KLF4 is loaded as the reprogramming factor. It contains the sensitive Sendai viral vector SeV18 + hKLF4 / TS ⁇ F and the temperature sensitive Sendai viral vector SeV (HNL) hC-Myc / TS15 ⁇ F carrying c-MYC as a reprogramming factor.
  • SeV (PM) hKOS / TS12 ⁇ F which is a temperature-sensitive Sendai viral vector carrying the KLF4 gene, Oct3 / 4 gene, and SOX2 gene as reprogramming factors, and the temperature at which KLF4 is loaded as the reprogramming factor.
  • SeV (PM) hKOS / TS12 ⁇ F, SeV18 + hKLF4 / TS ⁇ F, and SeV (HNL) hC-Myc / TS15 ⁇ F were added to mononuclear cells so that the MOI was 5, and a dish for inducing pluripotent stem cells was added.
  • the cells were cultured in an incubator at 37 ° C. Two days after infection, the blood medium was replaced with iPS cell medium. Then, the medium was exchanged once every two days using the iPS cell medium.
  • a stem cell-like cell mass developed. On the 14th day after infection, almost all cells became TRA1-60 positive cells and showed iPS cell-like morphology.
  • triple select a cell stripping agent, was added to the dish and allowed to stand at room temperature for 1 minute, then the cell-containing solution was aspirated and the cell-containing solution was incubated at 37 ° C. for 5 to 10 minutes. .. Then, iPS cell medium was added, and a ROCK inhibitor was further added, and the iPS cell medium containing the cells was collected in a 15 mL tube.
  • the number of cells was measured using a hemocytometer, the concentration of the solution containing the cells was adjusted, and the cells were seeded on a well plate so that the concentration was 0.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less, and the first passage was performed. I made a charge. At this time, 11 or more cells did not come into contact with each other.
  • the Weldish was then placed in an incubator at 37 ° C. and the cells were two-dimensionally cultured. The cells were then passaged each time the cells became 60% to 80% confluent. During the second and subsequent passages, the cells were seeded on the well plate so that the concentration was 0.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less. Also at this time, 11 or more cells did not come into contact with each other.
  • Example 2 SeV (PM) hKOS / TS12 ⁇ F, SeV18 + hKLF4 / TS ⁇ F, and SeV (HNL) hC-Myc / TS15 ⁇ F were added to the two-dimensionally cultured fibroblasts so that the MOI was 5, and pluripotent stem cells were added.
  • the induction dish was placed in an incubator at 34 ° C. and the cells were cultured. Two days after infection, the blood medium was replaced with iPS cell medium. Then, the medium was exchanged once every two days using the iPS cell medium. By 14 days after infection, the culture temperature was gradually increased to 37 ° C and 38 ° C.
  • the weldish was then placed in an incubator and the cells were two-dimensionally cultured. After the cells began to divide, the culture temperature was adjusted to 38 ° C. The cells were then passaged each time the cells became 60% to 80% confluent. During the second and subsequent passages, the cells were seeded on the well plate so that the concentration was 0.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less. Also at this time, 11 or more cells did not come into contact with each other.
  • Example 3 SeV (PM) hKOS / TS12 ⁇ F, SeV18 + hKLF4 / TS ⁇ F, and SeV (HNL) hC-Myc / TS15 ⁇ F were added to the two-dimensionally cultured mononuclear cells so that the MOI was 5, and they were pluripotent.
  • the stem cell-inducing dish was placed in an incubator at 37 ° C., and the cells were cultured. Two days after infection, the blood medium was replaced with iPS cell medium. Then, the medium was exchanged once every two days using the iPS cell medium.
  • a stem cell-like cell mass developed.
  • the cells were two-dimensionally cultured. After the cells began to divide, the culture temperature was raised to 38 ° C. The cells were then passaged each time the cells became 60% to 80% confluent. From the second passage to the fifth passage, the cells were seeded on the well plate so that the concentration was higher than 0.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 so that 11 or more cells adhered to each other. From the 6th passage onward, cells were seeded on a well plate so that the concentration was 0.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less. At this time, 11 or more cells did not come into contact with each other.
  • Example 4 SeV (PM) hKOS / TS12 ⁇ F and SeV (HNL) hC-Myc / TS15 ⁇ F were added to the two-dimensionally cultured mononuclear cells so that the MOI was 5, and a dish for inducing pluripotent stem cells was added.
  • a dish for inducing pluripotent stem cells was added.
  • a stem cell-like cell mass developed. On the 14th day after infection, almost all cells became TRA1-60 positive cells and showed iPS cell-like morphology.
  • triple select a cell stripping agent, was added to the dish and allowed to stand at room temperature for 1 minute, then the cell-containing solution was aspirated and the cell-containing solution was incubated at 37 ° C. for 5 to 10 minutes. .. Then, iPS cell medium was added, and the iPS cell medium containing the cells was collected in a 15 mL tube.
  • the number of cells was measured using a hemocytometer, the concentration of the solution containing the cells was adjusted, and the cells were seeded on a well plate so that the concentration was 0.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less, and the first passage was performed. I made a charge. At this time, 11 or more cells did not come into contact with each other.
  • the Weldish was then placed in an incubator at 37 ° C. and the cells were two-dimensionally cultured. After the cells began to divide, the culture temperature was raised to 38 ° C. The cells were then passaged each time the cells became 60% to 80% confluent. During the second and subsequent passages, the cells were seeded on the well plate so that the concentration was 0.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less. Also at this time, 11 or more cells did not come into contact with each other.
  • SeV (PM) hKOS / TS12 ⁇ F and SeV (HNL) hC-Myc / TS15 ⁇ F were added to the two-dimensionally cultured mononuclear cells so that the MOI was 5, and a dish for inducing pluripotent stem cells was added.
  • a dish for inducing pluripotent stem cells was added.
  • a stem cell-like cell mass developed. On the 14th day after infection, almost all cells became TRA1-60 positive cells and showed iPS cell-like morphology. Fifteen days after infection, triple select, a cell stripping agent, was added to the dish and allowed to stand at room temperature for 1 minute, then the cell-containing solution was aspirated and the cell-containing solution was incubated at 37 ° C. for 5 to 10 minutes. .. Then, iPS cell medium was added, and the iPS cell medium containing the cells was collected in a 15 mL tube.
  • the number of cells was measured using a hemocytometer, the concentration of the solution containing the cells was adjusted, and the cells were seeded on a well plate so that the concentration was 0.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less, and the first passage was performed. I made a charge. At this time, 11 or more cells did not come into contact with each other.
  • the Weldish was then placed in an incubator at 38 ° C. and the cells were two-dimensionally cultured. The cells were then passaged each time the cells became 60% to 80% confluent. During the second and subsequent passages, the cells were seeded on the well plate so that the concentration was 0.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less. Also at this time, 11 or more cells did not come into contact with each other.
  • FIG. 8 shows the results of staining the cells before passage on the 15th day after infection using an anti-Sendai virus antibody and evaluating the Sendai virus remaining in the cells with a flow cytometer.
  • a photograph of cells 15 days after infection is shown in FIG.
  • the cells after one passage were stained with the anti-Sendai virus antibody, and the results of evaluating the Sendai virus remaining in the cells with a flow cytometer are shown in FIG.
  • FIG. 10 the intracellular Sendai virus was almost eliminated in the first passage.
  • a photograph of the cells in the first passage is shown in FIG.
  • Example 6 SeV (PM) hKOS / TS12 ⁇ F, SeV18 + hKLF4 / TS ⁇ F, and SeV (HNL) hC-Myc / TS15 ⁇ F so that the MOI of mononuclear cells cultured three-dimensionally in a polymer-containing blood medium is 5.
  • the cells were cultured by placing the dish for inducing pluripotent stem cells in an incubator at 37 ° C. Two days after infection, the polymer-containing blood medium was replaced with polymer-containing iPS cell medium. Then, the medium was exchanged once every two days using the polymer-containing iPS cell medium.
  • TRA1-60 positive cells On the 14th day after infection.
  • iPS cell-like colonies were formed.
  • the cell mass is collected using a mesh, triple select, which is a cell release agent, is added to the collected cells, and the cells are allowed to stand at room temperature for 5 minutes, and then the solution containing the cells is aspirated to obtain the solution containing the cells.
  • iPS cell medium was added, and the iPS cell medium containing the cells was collected in a 15 mL tube.
  • the number of cells was measured using a hemocytometer, the concentration of the solution containing the cells was adjusted, and the cells were seeded on a well plate so that the concentration was 0.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less, and the first passage was performed. I made a charge. At this time, 11 or more cells did not come into contact with each other.
  • the Weldish was then placed in an incubator at 37 ° C. and the cells were two-dimensionally cultured. The cells were then passaged each time the cells became 60% to 80% confluent. During the second and subsequent passages, the cells were seeded on the well plate so that the concentration was 0.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less. Also at this time, 11 or more cells did not come into contact with each other. The temperature was raised to 38 ° C on the way.
  • Example 7 SeV (PM) hKOS / TS12 ⁇ F and SeV (HNL) hC-Myc / TS15 ⁇ F were added to the two-dimensionally cultured fibroblasts so that the MOI was 5, and a dish for inducing pluripotent stem cells was added. The cells were cultured in an incubator at 34 ° C. Two days after infection, the blood medium was replaced with iPS cell medium. Then, the medium was exchanged once every two days using the iPS cell medium.
  • a stem cell-like cell mass developed. On the 14th day after infection, almost all cells became TRA1-60 positive cells and showed iPS cell-like morphology.
  • triple select a cell stripping agent, was added to the dish and allowed to stand at room temperature for 1 minute, then the cell-containing solution was aspirated and the cell-containing solution was incubated at 37 ° C. for 5 to 10 minutes. .. Then, iPS cell medium was added, and the iPS cell medium containing the cells was collected in a 15 mL tube.
  • the number of cells was measured using a hemocytometer, the concentration of the solution containing the cells was adjusted, and the cells were seeded on a well plate so that the concentration was 0.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less, and the first passage was performed. I made a charge. At this time, 11 or more cells did not come into contact with each other.
  • the well dish was then placed in an incubator at 37 ° C. and the cells were two-dimensionally cultured. The cells were then passaged each time the cells became 60% to 80% confluent. During the second and subsequent passages, the cells were seeded on the well plate so that the concentration was 0.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less. Also at this time, 11 or more cells did not come into contact with each other.
  • FIG. 14 cells were stained with an anti-Sendai virus antibody, and the Sendai virus remaining in the cells was evaluated with a flow cytometer. As a result, the intracellular Sendai virus disappeared after the first passage. Was there. As shown in FIG. 15, no residual Sendai virus was detected in the cells by PCR. A photograph of the obtained TRA1-60 positive cells is shown in FIG.
  • a stem cell-like cell mass was formed.
  • iPS cell medium was added, and the iPS cell medium containing the cells was collected in a 15 mL tube.
  • the number of cells was measured using a hemocytometer, the concentration of the solution containing the cells was adjusted, and the cells were seeded in a well plate at a high concentration so that 11 or more cells adhered to each other, and the first passage was performed. did.
  • the weldish was then placed in an incubator and the cells were two-dimensionally cultured. The cells were then passaged each time the cells became 60% to 80% confluent. During the second and subsequent passages, the cells were seeded on the well plate at a high concentration so that 11 or more cells adhered to each other.
  • the cells were stained with an anti-Sendai virus antibody, and the Sendai virus remaining in the cells was evaluated with a flow cytometer. As shown in FIG. 17, the Sendai virus continued to remain in the cells even after repeated passages.
  • a stem cell-like cell mass was formed. 14 days after infection, the cell mass was collected using a mesh, triple select, which is a cell release agent, was added to the collected cells, and the cells were allowed to stand at room temperature for 5 minutes, and then the solution containing the cells was aspirated to obtain the cells. The solution containing was incubated at 37 ° C. for 5 to 10 minutes. Then, iPS cell medium was added, and the iPS cell medium containing the cells was collected in a 15 mL tube.
  • the number of cells was measured using a hemocytometer, the concentration of the solution containing the cells was adjusted, and the cells were seeded in a well plate at a high concentration so that 11 or more cells adhered to each other, and the first passage was performed. did.
  • the Weldish was then placed in an incubator at 37 ° C. and the cells were two-dimensionally cultured. The cells were then passaged each time the cells became 60% to 80% confluent. During the second and subsequent passages, the cells were seeded on the well plate at a high concentration so that 11 or more cells adhered to each other. The temperature was raised to 38 ° C on the way.
  • the Sendai virus continued to remain in the cells even after 9 passages. .. After the infection, the dish for inducing pluripotent stem cells was placed in an incubator at 34 ° C., and even when pluripotent stem cells were induced under the same conditions, the Sendai virus remained in the cells.
  • a stem cell-like cell mass was formed. 14 days after infection, the cell mass was collected using a mesh, triple select, which is a cell release agent, was added to the collected cells, and the cells were allowed to stand at room temperature for 5 minutes, and then the solution containing the cells was aspirated to obtain the cells. The solution containing was incubated at 37 ° C. for 5 to 10 minutes. Then, iPS cell medium was added, and the iPS cell medium containing the cells was collected in a 15 mL tube.
  • the number of cells was measured using a hemocytometer, the concentration of the solution containing the cells was adjusted, and the cells were seeded in a well plate at a high concentration so that 11 or more cells adhered to each other, and the first passage was performed. did.
  • the Weldish was then placed in an incubator at 37 ° C. and the cells were two-dimensionally cultured. After the cells began to divide, the culture temperature was raised to 38 ° C. The cells were then passaged each time the cells became 60% to 80% confluent. During the second and subsequent passages, the cells were seeded on the well plate at a high concentration so that 11 or more cells adhered to each other. The temperature was raised to 38 ° C on the way.
  • the cells were stained with an anti-Sendai virus antibody, and the Sendai virus remaining in the cells was evaluated with a flow cytometer. As shown in FIG. 19, the Sendai virus continued to remain in the cells even after repeated passages.
  • a stem cell-like cell mass was formed.
  • the Weldish was then placed in an incubator at 38 ° C. and the cells were two-dimensionally cultured. The cells were then passaged each time the cells became 60% to 80% confluent. During the second and subsequent passages, the cells were seeded on the well plate at a high concentration so that 11 or more cells adhered to each other.
  • DMEM containing 10% FBS was prepared as a medium for fibroblasts. Fibroblasts were suspended in a human adult-derived fibroblast medium to obtain a fibroblast suspension.
  • a 6-well dish To 1 well of a 6-well dish, 1.5 mL of PBS and 4.8 ⁇ L of a mixture of silk moth-derived laminin (iMatrix-511 silk, Nippi) were added, and the dish was placed in an incubator at 37 ° C. for 1 hour. Next, the mixture of PBS and laminin was removed from the wells using an ejector, and 1.5 mL of a fibroblast suspension was added to one well. The number of fibroblasts in 1 well was 2.0 ⁇ 10 5 cells from 0.5 ⁇ 10 5. Then, the fibroblasts were cultured for 1 day in an incubator at 37 ° C.
  • a mixture of silk moth-derived laminin iMatrix-511 silk, Nippi
  • the amount of medium exchanged was also 1.5 mL.
  • Tube A and tube B were prepared, and a mixture of OCT4 RNA, SOX2 RNA, KLF4 RNA, and C-MYC RNA (100 ng / ⁇ L) was added to 125 ⁇ L PBS in tube A from 0.1 ⁇ L to 100 ⁇ L. .. 0.1 ⁇ L to 100 ⁇ L of lipofection reagent was added to 125 ⁇ L of PBS in tube B.
  • the solution in tube A and the solution in tube B were mixed, the mixture was left at room temperature for 10 minutes, and the entire mixture was added to the medium in 1 well.
  • the dishes were then placed in an incubator at 37 ° C. for 1 day to transfect the cells with RNA. After that, RNA transfection by the same procedure was repeated 11 times.
  • the concentration of the solution containing the cells was adjusted and the cells were seeded on a laminin-coated well plate so that the concentration was 0.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less. I took over. At this time, 11 or more cells did not come into contact with each other.
  • the Weldish was then placed in an incubator at 37 ° C. and the cells were two-dimensionally cultured. The cells were then passaged only once when the cells became 60% to 80% confluent. During the second and subsequent passages, the cells were seeded on the well plate so that the concentration was 0.25 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less. At this time, 11 or more cells did not come into contact with each other.
  • Example 9 300 mL of urine from a healthy subject was collected, 6 urine was dispensed into a 50 mL falcon tube, and the tube was centrifuged at 400 G for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed from the tube, 30 mL of PBS was placed in the tube, and the tube was centrifuged at 400 G for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed from the tube, 30 mL of primary medium was placed in the tube and the tube was centrifuged at 400 G for 5 minutes.
  • the primary medium was DMEM / Ham's F12 (Gibco, 11320-033), fetal bovine serum (Gibco, 10437028, final concentration 10%), SingleQuots Kit CC-4127 REGM (Lonza, 1/1000 amount), and Prepared by adding Antibiotic-Antimycotic (Gibco, 15240062, 1/100 amount). After centrifugation, the supernatant was removed from the tube, the cells were suspended in 1 mL of primary medium, the cells were seeded in 1 well of a gelatin-coated 24-well plate, and the cells were incubated in a 37 ° C. incubator.
  • the primary medium was added to a 300 ⁇ L well, and from the 3rd day onward, the medium was replaced with a medium for epithelial cells.
  • the medium for epithelial cells was prepared by adding SingleQuots Kit CC-4127 REGM (Lonza) to the renal epithelial cell basal medium (Lonza).
  • a microscopic image of the cells after expanded culture for 6 days is shown in FIG. The cells were subcultured for the first time on the 7th day after seeding, and the cells were further expanded and cultured, and the cells were subcultured for the second time on the 7th day from the first passage.
  • a microscopic image of the cells 6 days after the 2nd passage is shown in FIG.
  • Example 10 The dish coated with laminin 511 was used as a dish for inducing pluripotent stem cells.
  • the urine-derived cells prepared in Example 9 were seeded in a dish for inducing pluripotent stem cells at a low concentration and incubated at 37 ° C.
  • the medium used was a medium for epithelial cells.
  • a mixture of transfection reagent and RNA encoding green fluorescent protein (GFP) was added to the medium, the medium was exchanged using the medium, and the medium was incubated at 37 ° C.
  • a microscopic image of the cells the next day is shown in FIG. Expression of GFP was observed, indicating that urine-derived cells can be transfected.
  • Example 11 The dish coated with laminin 511 was used as a dish for inducing pluripotent stem cells.
  • the urine-derived cells prepared in Example 9 were seeded in a dish for inducing pluripotent stem cells at a low concentration and incubated at 37 ° C.
  • the medium used was a medium for epithelial cells.
  • the next day prepare the tubes A and tubes B, M 3 O of RNA of PBS 125 ⁇ L in the tube A, SOX2 RNA of, KLF4 of RNA, C-MYC of RNA, and RNA mixtures of LIN28 (100ng / ⁇ L) It was added 10 2 [mu] L from 0.1 [mu] L.
  • RNAs were substantially concentrated and purified into single-stranded RNA by HPLC.
  • the ratio of the absorbance of RNA at 260 nm to 280 nm was 1.71 to 2.1, confirming that the protein was substantially free of contamination.
  • dot blot analysis was performed using the anti-double-stranded RNA antibody J2, 90% or more of the double-stranded RNA was removed. 0.1 ⁇ L to 100 ⁇ L of lipofection reagent was added to 125 ⁇ L of PBS in tube B.
  • the solution in tube A and the solution in tube B are mixed, the mixed solution is left at room temperature for 10 minutes, and the entire mixed solution is added to the transfection medium without using B18R or the like, and the transfection medium is added.
  • the medium was exchanged using the transfection medium and incubated at 37 ° C. Transfection was performed once daily for 10 days. Observation was performed on days 1, 5, 7, and 14 after cell seeding. As shown in FIG. 26, it was confirmed that the cell morphology changed like ES cells as the day progressed.
  • Example 12 Similar to Example 11, urine-derived cells were transfected for 10 days. From the 11th day after seeding the cells, the cells were cultured in a stem cell medium (StemFit, Ajinomoto), and on the 14th day, all the cells were peeled from the dish, and some of the collected and mixed cells were seeded in the medium. And succeeded. At the time of passage, the colonies were not picked up, the entire cells on the dish were collected, and 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 5 cells were seeded on the dish. A microscopic image of the cells 6 days after passage is shown in FIG. ES cell-like cells were confirmed.
  • Example 13 Similar to Example 11, urine-derived cells were transfected for 10 days. The cells were seeded, the cells were cultured in a stem cell medium (StemFit, Ajinomoto) from the 11th day, the cells were peeled from the dish on the 14th day, and some cells were analyzed by flow cytometry. FIG. 28 (a) ), It was confirmed that it was TRA-1-60 positive. Further, when the cells detached from the dish were subcultured on the 14th day and analyzed by flow cytometry 7 days later, it was confirmed that they were TRA-1-60 positive as shown in FIG. 28 (b). rice field.
  • stem cell medium Stema
  • FIG. 28 (b) rice field.
  • Example 14 Similar to Example 11, urine-derived cells were transfected for 10 days. From the 11th day after seeding the cells, the cells were cultured in a stem cell medium (StemFit, Ajinomoto), and on the 14th day, all the cells were peeled from the dish, and a part of the peeled and mixed cells was seeded and subcultured. did. StemFit® was used as the medium after passage. Seven days after passage, cells were fixed and stained with anti-OCT3 / 4 antibody and anti-NANOG antibody. In addition, chemical staining of nuclei with Hoechst® was also performed. As a result, as shown in FIG.
  • FIG. 29 (d) shows a photograph of cells stained with an anti-OCT3/4 antibody, a photograph of cells stained with an anti-NANOG antibody, and a photograph of cells stained with Hoechst (registered trademark). And, it is a composite photograph.
  • Example 17 Similar to Example 11, urine-derived cells were transfected for 10 days. From the 11th day after seeding the cells, the cells were cultured in a stem cell medium (StemFit, Ajinomoto), and on the 14th day, all the cells were peeled from the dish using Triple Select, and some of the peeled and mixed cells were peeled off. The cells were seeded in a medium and subcultured. StemFit® was used as the medium after passage. Seven days after passage, cells were fixed and stained with anti-LIN28 antibody. In addition, chemical staining of nuclei with Hoechst® was also performed. As a result, as shown in FIG.
  • FIG. 30 (d) is a photograph obtained by synthesizing a photograph of cells stained with an anti-LIN28 antibody and a photograph of cells stained with Hoechst (registered trademark).

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Abstract

本開示によれば、細胞にリプログラミング因子を導入することと、リプログラミング因子を導入された細胞を低濃度で播種して培養することと、を含む、多能性幹細胞の作製方法が提供される。

Description

人工多能性幹細胞の作製方法
　本発明は、細胞技術に関し、人工多能性幹細胞の作製方法に関する。
　人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞とは、二つの特徴的な能力を有する細胞である。一つは、体を構成するあらゆる細胞へと変化することができる能力である。もう一つは、半永久的な増殖能を有することである。ｉＰＳ細胞はこの二つの能力を有するため、自己の体細胞からｉＰＳ細胞を作製し、目的の体細胞へ変化させることで、拒絶反応のない移植治療へと応用することができる。そのためｉＰＳ細胞は、再生医療の有力な技術になると考えられている。
　ｉＰＳ細胞の誕生から現在までに、数多くのその作製方法が確立された。代表的なｉＰＳ細胞の作製方法としては、レトロウイルス／レンチウイルスを用いた方法、及びエピソーマルベクターを用いた方法が挙げられる。
　レトロウイルス／レンチウイルスを用いた方法について説明する。体細胞をレトロウイルスやレンチウイルスに感染させて、リプログラミング因子をコードしている遺伝子を細胞内に導入することができる。さらに、レトロウイルスやレンチウイルスは、体細胞のゲノムにリプログラミング因子を挿入することができ、リプログラミング因子の細胞内での安定的な発現を誘導する。
　しかし、レトロウイルス／レンチウイルスを用いた方法には、以下の問題点がある。まず、体細胞のゲノムへのリプログラミング因子の挿入は、既存の遺伝子やプロモーターを傷つけるため、細胞の癌化の原因になり得る。また、ゲノム上に挿入されたリプログラミング因子は、ｉＰＳ細胞を体細胞に変化させた後に再度活性化するおそれがある。そのため、ｉＰＳ細胞由来の移植用細胞には癌化のリスクがある。実際、マウスモデルにおいては、導入されたリプログラミング因子の再活性化が体細胞で見られ、癌化することが確認されている（例えば、非特許文献１参照。）。
　エピソーマルベクターは環状ＤＮＡであり、核内で自己増幅する。エピソーマルベクターは、原理的にはゲノムに組み込まれないと考えられてきたが、最近の研究では、エピソーマルで作成されたｉＰＳ細胞のゲノム上に、エピソーマルベクターの断片が散在して挿入されることが報告されている。そのため、リプログラミング遺伝子が細胞内に残存しうるという問題がある。例えばｃ－ＭＹＣやＫＬＦ４が細胞内に残存すると、癌化の原因になる。リプログラミング遺伝子が細胞内に残存しているか否かを検査するには膨大な費用が必要である。移植細胞プール中の全ての細胞にエピソーマルプラスミドのゲノムへの挿入がなく、残存がないことを示すことは不可能である。
　レトロウイルス／レンチウイルスを用いた方法、及びエピソーマルベクターを用いた方法には、上述した問題があるため、ＲＮＡを用いたｉＰＳ細胞の作製方法が提案されている（例えば、特許文献１から４及び非特許文献２参照。）。
国際公開第２０００／７００７０号 国際公開第２０１０／００８０５４号 国際公開第２０１２／０２９７７０号 国際公開第２０１５／０４６２２９号
Nature 448, 313-317 Nature Biotechnol 26(3): 313-315, 2008.
　リプログラミング因子の導入方法に限定されずに、リプログラミング因子を効率的に体細胞に導入する方法が求められている。本発明は、人工多能性幹細胞の効率的な作製方法を提供することを目的の一つとする。
　本発明の態様によれば、細胞にリプログラミング因子を導入することと、リプログラミング因子を導入された細胞を低濃度で播種して培養することと、を含む、多能性幹細胞の作製方法が提供される。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、低濃度が、０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下であってもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、低濃度が、播種した１１個以上の細胞同士が接触しない濃度であってもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、低濃度が、５％以下コンフルエントであってもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、リプログラミング因子がＲＮＡであってもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、細胞にリポフェクション法によりリプログラミング因子を導入してもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、細胞にウイルスベクターを用いてリプログラミング因子を導入してもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、ウイルスベクターがＲＮＡウイルスベクターであってもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、ＲＮＡウイルスベクターがセンダイウイルスベクターであってもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、ウイルスベクターが、所定の温度以上でウイルス核酸の安定性が低下する温度感受性ウイルスベクターであってもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、ウイルスベクターが、所定の温度以上でウイルス核酸の安定性が低下しないウイルスベクターを含まなくともよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、温度感受性ウイルスベクターが、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、及びＴＳ１５から選択される少なくともいずれかの温度感受性変異を導入されているセンダイウイルスベクターであってもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、ウイルスベクターが、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、及びＴＳ１５から選択される温度感受性変異を導入されている温度感受性センダイウイルスベクターより温度感受性が低いウイルスベクターを含まなくともよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、ウイルスベクターが、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、及びＴＳ１５から選択される温度感受性変異を導入されている温度感受性センダイウイルスベクターと温度感受性が同じ以上のウイルスベクターを含んでいてもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、リプログラミング因子を導入後、少なくとも２日、所定の温度未満で細胞を培養してもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、少なくとも２日経過後、所定の温度以上で細胞を培養してもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、培養することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞を継代し、所定の温度以上で培養してもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、細胞を低濃度で播種する継代を繰り返してもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下の低濃度で細胞を播種する継代を繰り返してもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、播種した１１個以上の細胞同士が接触しない低濃度で細胞を播種する継代を繰り返してもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、培養することにおいて、多能性幹細胞又は多能性幹細胞のコロニーを単離しなくともよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、培養が接着培養であってもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、培養が浮遊培養であってもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、培養することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞をクローニングせずに培養してもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、培養することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞を培養器から剥離し、剥離した細胞の少なくとも一部を混合して播種してもよい。剥離された細胞は、混じり合っていてもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、培養することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞を培養器から回収し、回収した細胞の少なくとも一部を混合して播種してもよい。回収された細胞は、混じり合っていてもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、培養することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーのそれぞれをピックアップしなくともよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、培養することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞であって、異なるシングルセル由来の細胞どうし混合して播種してもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、継代することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞どうしを混合してもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、継代することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞のクローンどうしを混合してもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、継代することにおいて、細胞をクローニングしなくともよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーを互いに分離することを含まなくともよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーを互いに混合してもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する単一のコロニーをクローニングすることを含まなくともよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、リプログラミング因子を導入された細胞が形成するコロニーをピックアップすることを含まなくともよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、リプログラミング因子を導入された細胞であって、培養器に付着している細胞を回収し、回収した細胞の少なくとも一部を培地に播種してもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、リプログラミング因子を導入された細胞を遺伝子発現状態で区別することなく継代してもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、リプログラミング因子を導入された細胞をリプログラミングの程度で区別することなく継代してもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、培養することの後、細胞全体を多能性幹細胞として凍結保存してもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、培養することの後、剥がした細胞全体を多能性幹細胞として凍結保存してもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、培養することの後、剥離液で剥がした細胞全体を多能性幹細胞として凍結保存してもよい。
　上記の多能性幹細胞の作製方法において、培養することの後、多能性幹細胞のコロニーどうしを混合してもよい。
　また、本発明の態様によれば、細胞にウイルスベクターを用いてリプログラミング因子を導入することと、リプログラミング因子を導入された細胞を低濃度で播種して培養することと、を含む、多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法が提供される。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、低濃度が、０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下であってもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、低濃度が、播種した１１個以上の細胞同士が接触しない濃度であってもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、低濃度が、５％以下コンフルエントであってもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、リプログラミング因子がＲＮＡであってもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、細胞にリポフェクション法によりリプログラミング因子を導入してもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、細胞にウイルスベクターを用いてリプログラミング因子を導入してもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、ウイルスベクターがＲＮＡウイルスベクターであってもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、ＲＮＡウイルスベクターがセンダイウイルスベクターであってもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、ウイルスベクターが、所定の温度以上でウイルス核酸の安定性が低下する温度感受性ウイルスベクターであってもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、ウイルスベクターが、所定の温度以上でウイルス核酸の安定性が低下しないウイルスベクターを含まなくともよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、温度感受性ウイルスベクターが、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、及びＴＳ１５から選択される少なくともいずれかの温度感受性変異を導入されているセンダイウイルスベクターであってもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、ウイルスベクターが、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、及びＴＳ１５から選択される温度感受性変異を導入されている温度感受性センダイウイルスベクターより温度感受性が低いウイルスベクターを含まなくともよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、ウイルスベクターが、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、及びＴＳ１５から選択される温度感受性変異を導入されている温度感受性センダイウイルスベクターと温度感受性が同じ以上のウイルスベクターを含んでいてもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、リプログラミング因子を導入後、少なくとも２日、所定の温度未満で細胞を培養してもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、少なくとも２日経過後、所定の温度以上で細胞を培養してもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、培養することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞を継代し、所定の温度以上で培養してもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、細胞を低濃度で播種する継代を繰り返してもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下の低濃度で細胞を播種する継代を繰り返してもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、播種した１１個以上の細胞同士が接触しない低濃度で細胞を播種する継代を繰り返してもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、培養することにおいて、多能性幹細胞又は多能性幹細胞のコロニーを単離しなくともよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、培養が接着培養であってもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、培養が浮遊培養であってもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、培養することにおいて、リプログラミング因子をクローニングせずに培養してもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、培養することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞を培養器から剥離し、剥離した細胞の少なくとも一部を混合して播種してもよい。剥離された細胞は、混じり合っていてもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、培養することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞を培養器から回収し、回収した細胞の少なくとも一部を混合して播種してもよい。回収された細胞は、混じり合っていてもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、培養することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーのそれぞれをピックアップしなくともよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、培養することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞であって、異なるシングルセル由来の細胞どうし混合して播種してもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、継代することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞どうしを混合してもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、継代することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞のクローンどうしを混合してもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、継代することにおいて、細胞をクローニングしなくともよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーを互いに分離することを含まなくともよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーを互いに混合してもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する単一のコロニーをクローニングすることを含まなくともよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、リプログラミング因子を導入された細胞が形成するコロニーをピックアップすることを含まなくともよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、リプログラミング因子を導入された細胞であって、培養器に付着している細胞を回収し、回収した細胞の少なくとも一部を培地に播種してもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、リプログラミング因子を導入された細胞を遺伝子発現状態で区別することなく継代してもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、リプログラミング因子を導入された細胞をリプログラミングの程度で区別することなく継代してもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、培養することの後、細胞全体を多能性幹細胞として凍結保存してもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、培養することの後、剥がした細胞全体を多能性幹細胞として凍結保存してもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、培養することの後、剥離液で剥がした細胞全体を多能性幹細胞として凍結保存してもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、培養することの後、細胞全体を多能性幹細胞として凍結保存してもよい。
　上記の多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法において、培養することの後、多能性幹細胞のコロニーどうしを混合してもよい。
　本発明によれば、人工多能性幹細胞の効率的な作製方法を提供可能である。
実施例１に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 実施例２に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 実施例２に係るＴＲＡ１－６０陽性細胞を示す写真である。 実施例３に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 実施例４に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 実施例４に係るＰＣＲの結果を示すグラフである。 実施例４に係るＴＲＡ１－６０陽性細胞を示す写真である。 実施例５に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 実施例５に係るインフェクションから１５日目の細胞を示す写真である。 実施例５に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 実施例５に係る継代１回目の細胞を示す写真である。 実施例６に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 実施例６に係るＴＲＡ１－６０陽性細胞を示す写真である。 実施例７に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 実施例７に係るＰＣＲの結果を示すグラフである。 実施例７に係るＴＲＡ１－６０陽性細胞を示す写真である。 比較例１に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 比較例２に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 比較例３に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 比較例４に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 実施例８に係るＰＣＲの結果を示すグラフである。 実施例８に係るＴＲＡ１－６０陽性細胞を示す写真である。 実施例９に係る尿由来の細胞の写真である。 実施例９に係る尿由来の細胞の写真である。 実施例１０に係る、ＧＦＰをコードするＲＮＡをトランスフェクトされた尿由来の細胞の写真である。 実施例１１に係る、リプログラミング因子を導入された尿由来の細胞の写真である。 実施例１２に係る、リプログラミング因子を導入された尿由来の細胞の写真である。 実施例１３に係る、フローサイトメーターによるドットプロットである。 実施例１４に係る、リプログラミング因子を導入された尿由来の細胞の写真である。 実施例１４に係る、リプログラミング因子を導入された尿由来の細胞の写真である。
　以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお以下の示す実施形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
　実施形態に係る多能性幹細胞の作製方法は、細胞にリプログラミング因子を導入することと、リプログラミング因子を導入された細胞を低濃度で播種して培養することと、を含む。多能性幹細胞は、例えば、ｉＰＳ細胞である。
　リプログラミング因子を導入される細胞は特に限定されないが、例としては、繊維芽細胞、血液細胞、歯髄幹細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、口腔上皮細胞、及び体性幹前駆細胞等が挙げられる。リプログラミング因子を導入される細胞は、尿に含まれる細胞であってもよい。尿に含まれる細胞の例としては、膀胱上皮細胞が挙げられる。リプログラミング因子を導入される細胞は、ヒト由来であってもよいし、非ヒト動物由来であってもよい。リプログラミング因子を導入される細胞は、一人のヒト由来であってもよいし、複数人のヒト由来であってもよい。リプログラミング因子を導入される細胞は、一匹の非ヒト動物由来であってもよいし、複数匹の非ヒト動物由来であってもよい。
　血液細胞は、血液から分離される。血液は、例えば末梢血及び臍帯血であるが、これらに限定されない。血液は、成年から採取されてもよいし、未成年から採取されてもよい。採血の際には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヘパリン、及び生物学的製剤基準血液保存液Ａ液（ＡＣＤ－Ａ）液等の抗凝固剤を用いる。
　血液細胞は、例えば、単核球細胞（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、好中球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、及びリンパ球等の有核細胞であり、赤血球、顆粒球、及び血小板を含まない。血液細胞は、例えば血管内皮前駆細胞、血液幹・前駆細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、例えばαβＴ細胞である。
　単核球細胞は、血液細胞の分離用媒体、及び遠心分離装置等を用いて、血液から分離される。血液細胞の分離用媒体としてＦｉｃｏｌｌ（ＧＥヘルスケア）を使用する場合の、単核球細胞の分離方法は、以下のとおりである。
　低温では単核球細胞の分離精度が悪くなる傾向にあるため、遠心機を４℃から４２℃好ましくは１８℃に設定する。成年又は未成年のヒトから１０μＬから５０ｍＬの血液を採血し、血液が固まらないように血液にＥＤＴＡを含むキレート剤を加えて優しく混ぜる。また、ヒトリンパ球分離用の媒体（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＲＥＭＩＵＭ、ＧＥヘルスケアジャパン）を５ｍＬずつ２本の１５ｍＬチューブに分注する。５ｍＬの血液に対して５ｍＬのＰＢＳを加えて希釈し、チューブ中のヒトリンパ球分離用の媒体の上に５ｍＬずつ重層する。この時、界面を乱さないように、希釈血液をチューブの管壁を伝わらせてゆっくりと媒体上に加える。
　チューブ中の溶液を、１０×ｇから１０００×ｇ、好ましくは４００×ｇで、４℃から４２℃好ましくは１８℃で５分から２時間、好ましくは３０分間遠心する。遠心後、チューブ中に白く濁った中間層が現れる。この白く濁った中間層は、単核球細胞を含んでいる。チューブ中の白く濁った中間層をピペットマンでゆっくりと回収し、新しい１５ｍＬチューブに移す。この際、下層は吸い取らないようにする。白く濁った中間層は、１本のチューブより１ｍＬ程度回収できる。２本分の中間層をまとめて１本のチューブに移す。
　回収した単核球細胞に対し、１ｍＬから４８ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、溶液をさらに１０×ｇから１０００×ｇ、好ましくは２００×ｇ、４℃から４２℃、好ましくは１８℃で１分から６０分、好ましくは１０分間遠心する。その後、アスピレータを用いて溶液の上清を吸引して除去し、１ｍＬから１２ｍＬ、好ましくは３ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を加えて懸濁し、単核球細胞懸濁液を得る。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。
　採血管としてバキュテイナ（登録商標、ＢＤ）を使用する場合の、単核球細胞の分離方法は、以下のとおりである。
　低温では単核球細胞の分離精度が悪くなる傾向にあるため、遠心機を４℃から４２℃、好ましくは１８℃に設定する。成年又は未成年のヒトから、採血管（バキュテイナ（登録商標）、ＢＤ）を用いて８ｍＬ採血し、転倒混和して抗凝固剤と混和する。その後、バランスを調整し、溶液を４℃から４２℃、好ましくは１８℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは１５００×ｇから１８００×ｇでスイングロータで１分から６０分、好ましくは２０分間遠心する。遠心後、血漿層である上層を取り除き、ピペッティングして単核球層とゲルに張り付いている血球を懸濁して懸濁液を得る。得られた懸濁液を、別の１５ｍＬチューブに移す。
　１５ｍＬチューブの懸濁液に１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、懸濁液を４℃から４２℃、好ましくは１８℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは２００×ｇで１分から６０分、好ましくは５分間遠心する。遠心後、上清をアスピレータで除去する。また、溶血剤（ＰｈａｒｍＬｙｓｅ（登録商標）、１０倍濃度、ＢＤ）を滅菌水で１倍濃度に希釈する。１５ｍＬチューブ中のペレットをタッピングでほぐし、１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１ｍＬの溶血剤を加える。その後、室温で遮光し、１分間から６０分間、好ましくは１分間溶液を静置する。
　次に、１５ｍＬチューブに１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、４℃から４２℃、好ましくは室温で、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは２００×ｇで１分から６０分、５分間遠心する。遠心後、上清をアスピレータで除去し、１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは３ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を加えて懸濁し、単核球細胞懸濁液を得る。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。
　血液から単核球細胞を分離する方法は、上記の方法に限られず、例えば、透析膜を使用して、血液から単核球を分離してもよい。また、全血単核球濃縮用ピュアセルセレクトシステム（登録商標、ＰＡＬＬ）、血球細胞除去用浄化器（セルソーバＥ、登録商標、旭化成）、及び血小板製剤用白血球除去フィルター（セパセルＰＬ、登録商標、ＰＬＸ－５Ｂ－ＳＣＤ、旭化成）等のフィルターも使用可能である。
　単核球細胞は、赤血球を重力沈降又は遠心分離することにより有核細胞を分離することが可能な赤血球分離剤を用いて分離されてもよい。赤血球分離剤の例としては、ＨｅｔａＳｅｐ（登録商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＨＥＳ４０（ＮＩＰＲＯ）が挙げられる。
　また、単核球細胞としては、Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｉｍｉｔｅｄ社から販売されているＣＴＬ－ＵＰ１や、Ｓａｎｇｕｉｎｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＰＢＭＣ－００１等を使用してもよい。
　あるいは、血液細胞としては、セルバンカー１、ステムセルバンカー　ＧＭＰグレード、及びステムセルバンカー　ＤＭＳＯフリー　ＧＭＰグレード（ゼノアック）等の細胞凍結保存液を用いて凍結保存された血液細胞を解凍して用いてもよい。
　単核球細胞を解凍する際には、まず、１５ｍＬチューブに１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは８ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を入れておき、凍結した単核球細胞の入ったチューブを４℃から４２℃、好ましくは３７℃の温浴槽にいれて、単核球細胞を溶かし始める。その後、少し氷が残っている状態で、単核球細胞の入ったチューブを温浴槽から引きあげ、単核球細胞を既知組成無血清造血細胞培地の入ったチューブに移す。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。
　血液細胞は、細胞表面マーカーに基づいて分離されてもよい。血液幹・前駆細胞は、ＣＤ３４が陽性である。Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８のいずれかが陽性である。Ｂ細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０のいずれかが陽性である。マクロファージはＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８、ＣＤ１６３のいずれかが陽性である。血液幹・前駆細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞は、例えば、自動磁気細胞分離装置及び免疫磁気ビーズを用いて、血液細胞から分離される。あるいは、予め分離された単核球細胞を用意してもよい。ただし、細胞表面マーカーに基づいて分離されていない血液細胞を用いてもよい。
　ＣＤ３４陽性細胞は、幹・前駆細胞であり、リプログラミングされやすい傾向にある。また、ＣＤ３陽性細胞であるＴ細胞を用いてｉＰＳ細胞を作製すると、Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞はＴＣＲリコンビネーションの型を保持しているので、Ｔ細胞に効率的に分化誘導できる傾向にある。
　ＣＤ３４陽性細胞の分離方法は、以下のとおりである。
　１０ｍＬの無血清培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ　Ｈ３０００、ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、１０μＬのＩＬ－６（１００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＳＣＦ（３００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＴＰＯ（３００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＦＬＴ３リガンド（３００μｇ／ｍＬ）、及び１０μＬのＩＬ－３（１０μｇ／ｍＬ）を加えて血球培地（血液幹・前駆細胞培地）を調製する。
　６ウェルプレートの１ウェルに１ｍＬから６ｍＬ、好ましくは２ｍＬの血球培地を入れる。また、培地の蒸発を防ぐために、他の５ウェルのそれぞれに１ｍＬから６ｍＬ、２ｍＬのＰＢＳを入れる。その後、６ウェルプレートを４℃から４２℃、好ましくは３７℃のインキュベーターに入れて温める。
　２０ｍＬのＰＢＳに対し、１０μＬから１ｍＬ、好ましくは８０μＬのＥＤＴＡ（５００ｍｍｏｌ／Ｌ）及び１０μＬから１ｍＬ、好ましくは２００μＬのＦＢＳを加えたカラムバッファを用意する。１×１０４から１×１０９個、好ましくは２×１０７個の単核球細胞を含有する単核球細胞懸濁液を１５ｍＬチューブに分注し、単核球細胞懸濁液を、４℃から４２℃、好ましくは４℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは３００×ｇで１０分間遠心する。遠心後、上清を除き、単核球細胞を１００μＬから１ｍＬ、好ましくは３００μＬのカラムバッファで懸濁する。
　１５ｍＬチューブ中の単核球細胞懸濁液に、１０μＬから１ｍＬ、好ましくは１００μＬのＦｃＲブロッキング試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）及び１０μＬから１ｍＬ、好ましくは１００μＬのＣＤ３４マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を加える。ＦｃＲブロッキング試薬は、マイクロビーズ標識の特異性を高めるために用いられる。その後、単核球細胞懸濁液を混和して、４℃から４２℃、好ましくは４℃で１分から２時間、好ましくは３０分間静置する。
　次に、１５ｍＬチューブ中の単核球細胞懸濁液に１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは１０ｍＬのカラムバッファを加えて希釈し、４℃から４２℃、好ましくは４℃、１００×ｇから１０００×ｇ、好ましくは３００×ｇで１分から２時間、好ましくは１０分間遠心する。遠心後、１５ｍＬチューブ中の上清をアスピレータで除き、１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは５００μＬのカラムバッファを加えて再懸濁する。
　自動磁気細胞分離装置用のカラム（ＭＳカラム、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を自動磁気細胞分離装置（ＭｉｎｉＭＡＣＳ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｕｎｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）に取り付け、カラムに１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは５００μＬのカラムバッファを入れて洗浄する。次に、単核球細胞をカラムに入れる。さらに、カラムに１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは５００μＬのカラムバッファを入れて、カラムを１回から１０回、好ましくは３回洗浄する。その後、カラムを自動磁気細胞分離装置から外し、１５ｍＬチューブに入れる。次に、カラムに１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは１０００μＬのカラムバッファを入れ、速やかにシリンジを押してＣＤ３４陽性細胞を１５ｍＬチューブに流出させる。
　１０μＬのＣＤ３４陽性細胞懸濁液をトリパンブルーで染めて、細胞数を血球計算版でカウントする。また、１５ｍＬチューブ中のＣＤ３４陽性細胞懸濁液を、４℃から４２℃、好ましくは４℃、１００×ｇから１０００×ｇ、好ましくは３００×ｇで１分から２時間、好ましくは１０分間遠心する。遠心後、上清をアスピレータで除く。さらに、温めておいた血球培地でＣＤ３４陽性細胞を再懸濁し、ＣＤ３４陽性細胞を培養プレートにまく。その後、４℃から４２℃、好ましくは３７℃、１％から２０％、好ましくは５％ＣＯ２でＣＤ３４陽性細胞を６日間培養する。この間、培地交換はしなくてもよい。
　ＣＤ３４以外のマーカーで細胞を単離する方法は、ＣＤ３４陽性細胞を単離する方法と同様である。
　細胞に導入されるリプログラミング因子は、例えば、ＲＮＡである。ＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡである。細胞に導入されるリプログラミング因子は、例えば、ＯＣＴ３／４等のＯＣＴのＲＮＡ、ＳＯＸ２等のＳＯＸのＲＮＡ、ＫＬＦ４等のＫＬＦのＲＮＡ、及びｃ－ＭＹＣ等のＭＹＣのＲＮＡを含む。リプログラミング因子ＲＮＡとして、ＯＣＴ３／４を改良したＭ３Ｏを使用してもよい。また、リプログラミング因子ＲＮＡは、ＬＩＮ２８Ａ、ＦＯＸＨ１、ＬＩＮ２８Ｂ、ＧＬＩＳ１、ｐ５３－ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｎｅｇａｔｉｖｅ、ｐ５３－Ｐ２７５Ｓ、Ｌ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５、ＺＩＣ３、ＢＣＬ－２、Ｅ－ＲＡＳ、ＴＰＴ１、ＳＡＬＬ２、ＮＡＣ１、ＤＡＸ１、ＴＥＲＴ、ＺＮＦ２０６、ＦＯＸＤ３、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、ＥＳＲＲＢ、ｍｉＲ－２９１－３ｐ、ｍｉＲ－２９４、ｍｉＲ－２９５、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＴＢＸ３、ＭＢＤ３ｓｈ、ＴＨ２Ａ、ＴＨ２Ｂ、及びＰ５３ＤＤからなる群から選択される少なくとも一つの因子のＲＮＡをさらに含んでいてもよい。これらのＲＮＡは、ＴｒｉＬｉｎｋから入手可能である。なお、ここでは遺伝子記号はヒトで記載しているが、大文字・小文字表記によって、種を制限することを意図するものではない。例えば、全て大文字表記していても、マウス又はラットの遺伝子を含むことを排除するものではない。ただし、実施例においては、実際に使用した生物種に則って、遺伝子記号を表記している。
　ＲＮＡは、プソイドウリジン（Ψ）又は５－メチルウリジン（５ｍｅＵ）で修飾されていてもよい。ＲＮＡは、ポリアデニル化されていてもよい。
　リプログラミング因子は、例えば、リポフェクション法により細胞に導入される。リポフェクション法とは、陰性荷電物質である核酸と、陽性荷電脂質と、の複合体を、電気的な相互作用により形成し、複合体をエンドサイトーシスや膜融合により細胞内に取り込ませる方法である。リポフェクション法は、細胞へのダメージが少なく、導入効率に優れており、操作が簡便であり、時間がかからない等の利点を有する。
　リプログラミング因子は、例えば、ＲＮＡトランスフェクション試薬を用いて培養されている細胞に導入される。例えば、細胞が単核球である場合、血液から単核球を分離した直後に、単核球にＲＮＡを導入してもよい。
　ＲＮＡトランスフェクション試薬としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（登録商標、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）が使用可能である。あるいは、ＲＮＡトランスフェクション試薬としては、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＳｔｅｍＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、ＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｕｓ）、ｍＲＮＡ－Ｉｎ（ＭＴＩ－ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ）、Ｓｔｅｍｆｅｃｔ　ＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ）、Ｊｅｔ　Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ　　（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）３０００、ＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、Ｓｔｅｍｆｅｃｔ　ＲＮＡ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍｆｅｃｔ）、ＮｅｘｔＦｅｃｔ（登録商標）ＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏｏＳｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ　Ｔ　ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ－１００２）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ　ＣＤ３４　ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ－１００３）、及びＲｅｐｒｏＲＮＡ（登録商標）トランスフェクション試薬（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等のリポフェクション試薬を利用してもよい。
　あるいは、細胞には、例えば、ウイルスベクターを用いてリプログラミング因子を導入する。ウイルスベクターは、ＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターは、センダイウイルスベクターであってもよい。センダイウイルスベクターは、所定の温度以上でウイルス核酸の安定性が低下する温度感受性センダイウイルスベクターであってもよい。温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸は、所定の温度未満で安定である。ウイルス核酸は、ウイルスＤＮＡであってもよいし、ウイルスＲＮＡであってもよい。ウイルス核酸はウイルスゲノムであってもよい。ウイルス核酸の安定性の低下とは、ウイルス核酸が分解すること、及びウイルス核酸の複製又は増殖が抑制されることと、の少なくとも一方であってもよい。ウイルス核酸の安定性が低下すると、ウイルス核酸の増殖、ウイルス核酸の複製速度及び遺伝子発現レベルの少なくとも一方が低下する。所定の温度とは、例えば、３６．５℃以上３７．５℃以下、３６．６℃以上３７．４℃以下、３６．７℃以上、３７．３℃以下、３６．８℃以上３７．２℃以下、３６．９℃以上３７．１℃以下、あるいは３７℃である。温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性、すなわち、増殖、複製速度及び遺伝子発現レベルの少なくとも一方は、所定の温度未満で高く、所定の温度以上で低くなる。例えば、温度感受性センダイウイルスベクターは、３２℃で培養されている細胞における増殖速度又は遺伝子発現レベルと比較して、３７℃で培養されている細胞における増殖速度又は遺伝子発現レベルが、１／２以下、１／３以下、１／５以下、１／１０以下、あるいは１／２０以下である。
　センダイウイルスは、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ／ＨＮ遺伝子、及びＬ遺伝子をコードする。ＨＮタンパク質は、センダイウイルスが細胞に付着する際に細胞表面のシアル酸を認識してウイルス粒子を細胞に繋留させる。Ｆタンパク質は、細胞外のプロテアーゼにより切断活性化されて、繋留されているセンダイウイルスのエンベロープと標的細胞の細胞膜の融合を触媒して感染を成立させる。Ｌタンパク質は、その修飾タンパク質であるＰタンパク質とともに、感染後に細胞質でウイルス核酸の複製と複製された多コピーの核酸からの転写を触媒する。
　センダイウイルスベクターにおいてＦ遺伝子を欠失させることにより、遺伝子導入細胞から感染可能なウイルス粒子が産生されることを抑制することが可能である。また、Ｌ遺伝子及びＰ遺伝子の少なくとも一方に変異を導入することにより、センダイウイルスベクターを温度感受性にすることが可能である。
　センダイウイルスの温度感受性（ＴＳ）変異の例としては、ＴＳ７（Ｌタンパク質のＹ９４２Ｈ／Ｌ１３６１Ｃ／Ｌ１５５８Ｉ変異）、ＴＳ１２（Ｐタンパク質のＤ４３３Ａ／Ｒ４３４Ａ／Ｋ４３７Ａ変異）、ＴＳ１３（Ｐタンパク質のＤ４３３Ａ／Ｒ４３４Ａ／Ｋ４３７Ａ変異及びＬタンパク質のＬ１５５８Ｉ変異）、ＴＳ１４（Ｐタンパク質のＤ４３３Ａ／Ｒ４３４Ａ／Ｋ４３７Ａ変異及びＬタンパク質のＬ１３６１Ｃ変異）、ＴＳ１５（Ｐタンパク質のＤ４３３Ａ／Ｒ４３４Ａ／Ｋ４３７Ａ変異及びＬタンパク質のＬ１３６１Ｃ／Ｌ１５５８Ｉ変異）等が挙げられる。
　センダイウイルスベクターは、例えば、Ｍタンパク質にＧ６９Ｅ、Ｔ１１６Ａ、及びＡ１８３Ｓの変異を有し、ＨＮタンパク質にＡ２６２Ｔ、Ｇ２６４Ｒ、及びＫ４６１Ｇの変異を有し、Ｐタンパク質にＬ５１１Ｆ変異を有し、Ｌタンパク質にＮ１１９７Ｓ及びＫ１７９５Ｅ変異を有するＦ遺伝子欠失（ΔＦ）型センダイウイルスベクターであって、上記のＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入したセンダイウイルスベクターである。ただし、センダイウイルスベクターの温度感受性変異は、これらに限定されない。
　センダイウイルスベクターは、例えば、ＳｅＶ（ＰＭ）／ＴＳΔＦ、ＳｅＶ１８＋／ＴＳΔＦ、又はＳｅＶ（ＨＮＬ）／ＴＳΔＦであって、上記のＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入したセンダイウイルスベクターである。ただし、センダイウイルスベクターの温度感受性変異は、これらに限定されない。
　細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、温度感受性センダイウイルスベクターと温度非感受性センダイウイルスベクターとの組み合わせであってもよい。あるいは、細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、温度感受性センダイウイルスベクターのみであり、温度非感受性センダイウイルスベクターを含まなくともよい。例えば、細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入した温度感受性センダイウイルスベクターのみであり、温度非感受性センダイウイルスベクターを含まなくともよい。例えば、細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入した温度感受性センダイウイルスベクターと同じ以上温度感受性を有するセンダイウイルスベクターのみであり、温度非感受性センダイウイルスベクターを含まなくともよい。例えば、細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入した温度感受性センダイウイルスベクターと同じ以上温度感受性を有するセンダイウイルスベクターのみであり、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入した温度感受性センダイウイルスベクターより温度感受性が低いセンダイウイルスベクターを含まなくともよい。
　細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、任意のリプログラミング因子を搭載する。細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、例えば、ＫＬＦのＲＮＡ、ＯＣＴのＲＮＡ、及びＳＯＸのＲＮＡをこの順序で含み、ＭＹＣのＲＮＡを含まない温度感受性センダイウイルスベクターと、ＭＹＣのＲＮＡを含み、ＫＬＦのＲＮＡ、ＯＣＴのＲＮＡ、及びＳＯＸのＲＮＡを含まない温度感受性センダイウイルスベクターと、の組み合わせである。ただし、センダイウイルスベクターに搭載するリプログラム因子の数、組み合わせ、及び順序は任意であり、特に限定されない。
　細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、ＫＬＦのＲＮＡを含み、ＯＣＴのＲＮＡ及びＳＯＸのＲＮＡを含まないセンダイウイルスベクターを含んでいてもよい。ＫＬＦのＲＮＡを含み、ＯＣＴのＲＮＡ及びＳＯＸのＲＮＡを含まないセンダイウイルスベクターは、温度感受性センダイウイルスベクターであってもよいし、温度非感受性センダイウイルスベクターであってもよい。ただし、本発明者らの知見によれば、温度非感受性センダイウイルスベクターを導入しないほうが、センダイウイルスベクターを導入された細胞から早期にセンダイウイルスベクターが消滅する。
　ＫＬＦのＲＮＡ、ＯＣＴのＲＮＡ、及びＳＯＸのＲＮＡを含む温度感受性センダイウイルスベクターは、例えば、Ｍタンパク質にＧ６９Ｅ、Ｔ１１６Ａ、及びＡ１８３Ｓの変異を有し、ＨＮタンパク質にＡ２６２Ｔ、Ｇ２６４Ｒ、及びＫ４６１Ｇの変異を有し、Ｐタンパク質にＬ５１１Ｆ変異を有し、Ｌタンパク質にＮ１１９７Ｓ及びＫ１７９５Ｅ変異を有するＦ遺伝子欠失型センダイウイルスベクターであって、上記のＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を有するセンダイウイルスベクターである。温度感受性変異は、例えばＴＳ７又はＴＳ１２、あるいはＴＳ１２である。
　ＫＬＦのＲＮＡ、ＯＣＴのＲＮＡ、及びＳＯＸのＲＮＡを含む温度感受性センダイウイルスベクターは、例えば、ＳｅＶ（ＰＭ）ＫＯＳ／ＴＳ７ΔＦ又はＳｅＶ（ＰＭ）ＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦであり、あるいはＳｅＶ（ＰＭ）ＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦである。
　ＭＹＣのＲＮＡを含む温度感受性センダイウイルスベクターは、例えば、Ｍタンパク質にＧ６９Ｅ、Ｔ１１６Ａ、及びＡ１８３Ｓの変異を有し、ＨＮタンパク質にＡ２６２Ｔ、Ｇ２６４Ｒ、及びＫ４６１Ｇの変異を有し、Ｐタンパク質にＬ５１１Ｆ変異を有し、Ｌタンパク質にＮ１１９７Ｓ及びＫ１７９５Ｅ変異を有するＦ遺伝子欠失型センダイウイルスべクターであって、上記のＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を有するセンダイウイルスベクターである。温度感受性変異は、例えばＴＳ１５である。
　ＭＹＣのＲＮＡを含む温度感受性センダイウイルスベクターは、例えば、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ＭＹＣ／ＴＳ１２ΔＦ、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ＭＹＣ／ＴＳ１３ΔＦ、又はＳｅＶ（ＨＮＬ）ＭＹＣ／ＴＳ１５ΔＦであり、あるいはＳｅＶ（ＨＮＬ）ＭＹＣ／ＴＳ１５ΔＦである。
　ＫＬＦのＲＮＡを含み、ＯＣＴのＲＮＡ及びＳＯＸのＲＮＡを含まないセンダイウイルスベクターは、例えば、Ｍタンパク質にＧ６９Ｅ、Ｔ１１６Ａ、及びＡ１８３Ｓの変異を有し、ＨＮタンパク質にＡ２６２Ｔ、Ｇ２６４Ｒ、及びＫ４６１Ｇの変異を有し、Ｐタンパク質にＬ５１１Ｆ変異を有し、Ｌタンパク質にＮ１１９７Ｓ及びＫ１７９５Ｅ変異を有するＦ遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである。ＫＬＦのＲＮＡを含み、ＯＣＴのＲＮＡ及びＳＯＸのＲＮＡを含まないセンダイウイルスベクターは、例えば、上記のＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入したセンダイウイルスベクターより温度感受性が弱く、所定の温度以上でもＫＬＦ遺伝子を発現可能である。
　ＫＬＦのＲＮＡを含み、ＯＣＴのＲＮＡ及びＳＯＸのＲＮＡを含まないセンダイウイルスベクターは、例えば、ＳｅＶ１８＋ＫＬＦ４／ＴＳΔＦである。
　複数種類のセンダイウイルスベクターを細胞に導入する際には、例えば、複数種類のセンダイウイルスベクターを同時に細胞に導入する。あるいは、ある種類のセンダイウイルスベクターを細胞に導入してから、４８時間以内、３６時間以内、２４時間以内、１８時間以内、１２時間以内、１０時間以内、８時間以内、６時間以内、３時間以内、２時間以内、あるいは１時間以内に、全ての種類のセンダイウイルスベクターを細胞に導入することが好ましい。
　細胞を感染させる際のセンダイウイルスベクターの感染多重度（ＭＯＩ）は、例えば、０．１以上、０．３以上、０．５以上、１．０以上、２．０以上、３．０以上、４．０以上、又は５．０以上である。また、ＭＯＩは、例えば、１００以下、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下、又は５以下である。
　細胞をセンダイウイルスベクターに感染させる際の温度は、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性が低下する所定の温度未満、つまり、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸が安定である温度であってもよいし、所定の温度以上であってもよい。センダイウイルスベクターが温度感受性センダイウイルスベクターのみであり、温度非感受性センダイウイルスベクターを含まない場合、細胞をセンダイウイルスベクターに感染させる際の温度は、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性が低下する所定の温度より低い温度、つまり、つまり、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸が安定である温度であることが好ましい。
　リプログラミング因子を導入される細胞は、接着培養されていてもよいし、浮遊培養されていてもよい。
　リプログラミング因子を導入される体細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１、ｎｉｐｐｉ）、ファイブロネクチン、及びビトロチン等の基底膜マトリックスを用いて、フィーダーフリーで培養されていてもよい。
　リプログラミング因子を導入される細胞が培養される培地としては、例えば、Ｐｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ(ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ)等のヒトＥＳ／ｉＰＳ培地等の幹細胞培地を使用可能である。
　ただし、幹細胞培地は、これに限定されず、種々の幹細胞培地が使用可能である。例えばＰｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｒｅｐｒｏｓｔｅｍ、ＲｅｐｒｏＦＦ、ＲｅｐｒｏＦＦ２、ＲｅｐｒｏＸＦ（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）、ｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ２、ＴｅＳＲＥ８、ＲｅｐｒｏＴｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）Ｈｕｍａｎ　ＥＳ／ｉＰＳ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｒｃｋ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ　（登録商標）ＸＦ／ＦＦ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　Ｈｕｍａｎ　ｉＰＳ　ａｎｄ　ＥＳ　Ｃｅｌｌｓ、Ｐｌｕｒｉｔｏｎ　ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）、Ｓｔｅｍｆｉｔ　ＡＫ０２Ｎ、Ｓｔｅｍｆｉｔ　ＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）、ＥＳＣ－Ｓｕｒｅ（登録商標）ｓｅｒｕｍ　ａｎｄ　ｆｅｅｄｅｒ　ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｈＥＳＣ／ｉＰＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ　ＳｔｅｍＣｅｌｌ）、Ｌ７（登録商標）ｈＰＳＣ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　（ＬＯＮＺＡ）、及びＰｌｕｒｉＱ（ＭＴＩ－ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ）等を利用してもよい。幹細胞培地は、脂肪酸担持量が低減されたアルブミンを含有していると好ましい。幹細胞培地は、例えば、ディッシュ、ウェル、又はチューブ等に入れられる。
　細胞を浮遊培養あるいは三次元培養する場合、例えば、ゲル培地が使用される。ゲル培地は、例えば、幹細胞培地にジェランガムを終濃度が０．００１質量％から０．５質量％、０．００５質量％から０．１質量％、あるいは０．０１質量％から０．０５質量％となるよう添加することにより調製される。
　ゲル培地は、ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の高分子化合物を含んでいてもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。メチルセルロースを含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。
　あるいは、ゲル培地は、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA）、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくの温度感受性ゲルを含んでいてもよい。
　ゲル培地は、例えば、ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）等の成長因子を含んでいてもよいし、含まなくともよい。あるいは、ゲル培地は、ｂＦＧＦ等の成長因子を、４００μｇ／Ｌ以下、４０μｇ／Ｌ以下、あるいは１０μｇ／Ｌ以下の低濃度で含んでいてもよい。
　また、ゲル培地は、ＴＧＦ－βを含んでいてもよいし、含まないか、ＴＧＦ－βを６００μｇ／Ｌ以下、３００μｇ／Ｌ以下、あるいは１００μｇ／Ｌ以下の低濃度で含んでいてもよい。
　ゲル培地は、撹拌されなくともよい。また、ゲル培地は、フィーダー細胞を含まなくともよい。
　ゲル培地は、カドヘリン、ラミニン、フィブロネクチン、及びビトロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種の物質を含んでいてもよい。
　細胞をセンダイウイルスベクターに感染させた後、少なくとも２日、あるいは２日以上１０日以下、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性が低下する所定の温度より低い温度、つまり、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸が安定である温度で細胞を培養してもよい。その後、所定の温度以上で細胞を培養してもよい。所定の温度以上で細胞を培養する間、例えば２日に１回、培地を交換してもよい。
　細胞をセンダイウイルスベクターに感染させた後、少なくとも２日、あるいは２日以上１０日以下、例えば、４．０℃以上、１０℃以上、１５℃以上、２０℃以上、２５℃以上、３０℃以上、３１．０℃以上、３２．０℃以上、３３．０℃以上、３３．１℃以上、３３．２℃以上、３３．３℃以上、３３．４℃以上、３３．５℃以上、３３．６℃以上、３３．７℃以上、３３．８℃以上、あるいは３３．９℃以上であり、３７．０℃未満、３６．９℃未満、３６．８℃未満、３６．７℃未満、３６．６℃未満、３６．５℃未満、３６．０℃以下、３５．０℃以下、あるいは３４．０℃以下の温度で細胞を培養してもよい。その後、温度を上昇させ、３６．５℃以上、３６．６℃以上、３６．７℃以上、３６．８℃以上、３６．９℃以上、あるいは３７．０℃以上であり、４０．０℃以下、３９．０℃以下、あるいは３８．０℃以下の温度で細胞を培養してもよい。温度は１回で上げてもよいし、段階的に上げてもよい。温度を上昇させた後、細胞を培養する間、例えば２日に１回、培地を交換してもよい。
　細胞をセンダイウイルスベクターに感染させた後、幹細胞様のコロニーが現れ始めるまで、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性が低下する所定の温度未満、つまり、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸が安定である温度で細胞を培養してもよい。幹細胞様のコロニーが現れ始めた後、所定の温度以上で細胞を培養してもよい。所定の温度以上で細胞を培養する間、例えば２日に１回、培地を交換してもよい。
　細胞をセンダイウイルスベクターに感染させた後、幹細胞様のコロニーが現れ始めるまで、例えば、４．０℃以上、１０℃以上、１５℃以上、２０℃以上、２５℃以上、３０℃以上、３１．０℃以上、３２．０℃以上、３３．０℃以上、３３．１℃以上、３３．２℃以上、３３．３℃以上、３３．４℃以上、３３．５℃以上、３３．６℃以上、３３．７℃以上、３３．８℃以上、あるいは３３．９℃以上であり、３７．０℃未満、３６．９℃未満、３６．８℃未満、３６．７℃未満、３６．６℃未満、３６．５℃未満、３６．０℃以下、３５．０℃以下、あるいは３４．０℃以下の温度で細胞を培養してもよい。幹細胞様のコロニーが現れ始めた後、温度を上昇させ、３６．５℃以上、３６．６℃以上、３６．７℃以上、３６．８℃以上、３６．９℃以上、あるいは３７．０℃以上であり、４０．０℃以下、３９．０℃以下、あるいは３８．０℃以下の温度で細胞を培養してもよい。温度は１回で上げてもよいし、段階的に上げてもよい。温度を上昇させた後、細胞を培養する間、例えば２日に１回、培地を交換してもよい。
　細胞をセンダイウイルスベクターに感染させ、細胞を培養した後、細胞を少なくとも１回継代する。継代は複数回実施してもよい。センダイウイルスベクターを用いてリプログラミング因子を導入された細胞を継代する際、細胞は低濃度で培地あるいは培養器に播種される。ここで、低濃度とは、例えば、１ｃｅｌｌ／ｃｍ２以上であり、０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、１．２５×１０3ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、０．２５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、０．２５×１０２ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、あるいは０．２５×１０１ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下である。あるいは、低濃度とは、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、あるいは２個以下の細胞同士が接触可能であり、１１個以上の細胞同士が接触しない濃度である。なお、１０個以下の細胞同士が接触した細胞塊が複数あってもよい。あるいは、細胞容器底面全体が細胞で覆われた状態を１００％コンフルエントとして、低濃度とは、５％以下コンフルエント、４％以下コンフルエント、３％以下コンフルエント、２％以下コンフルエント、１％以下コンフルエント、０．５％以下コンフルエント、０．１％以下コンフルエント、０．０５％以下コンフルエント、あるいは０．０１％以下コンフルエントである。またあるいは、低濃度とは、例えば、播種された細胞においてシングルセル同士が接触しない濃度である。例えば、ウェルプレートのウェルに、シングルセルを播種してもよい。ウェルプレートは、１２ウェルプレートや９６ウェルプレートであってもよい。本発明者らの知見によれば、リプログラミング因子を導入された細胞を継代する際、低濃度で細胞を培地に播種することにより、細胞から誘導される多能性幹細胞におけるセンダイウイルスの残存を抑制することが可能である。誘導される多能性幹細胞において、センダイウイルスが残存する細胞の割合は、例えば４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下あるいは０％である。
　継代後、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性が低下する所定の温度以上で細胞を培養してよい。継代後、例えば、３６．５℃以上３８．０℃未満の温度で細胞を培養する。継代後、例えば、細胞間接着が開始するまで３６．５℃以上３８．０℃未満の温度で細胞を培養し、細胞間接着が開始した後、細胞間接着が開始するまでより高い温度、例えば、３７．５℃以上であり、４２．０℃以下、４１．５℃以下、４１．０℃以下、４０．５℃以下、あるいは４０．０℃以下の温度で細胞を培養してもよい。継代後、細胞間接着が開始する前から、３７．５℃以上であり、４２．０℃以下、４１．５℃以下、４１．０℃以下、４０．５℃以下、あるいは４０．０℃以下の温度で細胞を培養してもよい。
　従来、細胞にリプログラミング因子を導入し、多能性幹細胞に誘導する際には、幹細胞に誘導されなかった細胞が多数残存するため、幹細胞様コロニーを幹細胞に誘導されなかった細胞から単離する必要があった。具体的には、顕微鏡等で観察しながら、幹細胞様コロニーをピペットでピックアップして継代する必要があった。これに対し、本実施形態に係る方法によれば、リプログラミング因子を導入された細胞は、高い効率で多能性幹細胞に誘導されることから、幹細胞に誘導されなかった細胞が実質的に残存しないか、数％以下しか残存しないため、継代及び凍結保存の際に、幹細胞様コロニーを幹細胞に誘導されなかった細胞から単離しなくともよい。
　本実施形態に係る方法によれば、幹細胞に誘導されなかった細胞が実質的に残存しないか、数％以下しか残存しないため、継代に際に、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種してもよい。継代することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞のクローンどうしを混合してもよい。継代することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞の異なるクローンどうしを混合してもよい。その後、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代することを、複数回実施してもよい。幹細胞が樹立するまで、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収した混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代してもよい。なお、回収した混じり合った細胞の全てを培地に播種してもよい。
　ここで、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、リプログラミング因子を導入された細胞を、遺伝子発現状態で区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、リプログラミング因子を導入された細胞を、遺伝子発現状態で区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。あるいは、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、リプログラミング因子を導入された細胞を、リプログラミングの程度で区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、リプログラミング因子を導入された細胞を、リプログラミングの程度で区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。
　あるいは、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、リプログラミング因子を導入された細胞を、形態で区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、リプログラミング因子を導入された細胞を、形態で区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。あるいは、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、リプログラミング因子を導入された細胞を、大きさで区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、リプログラミング因子を導入された細胞を、大きさで区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。
　またあるいは、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、リプログラミング因子を導入された細胞をクローニングすることなく継代することをいう。例えば、クローニングすることなく継代する場合、リプログラミング因子を導入された細胞が形成するコロニーをピックアップしなくともよい。例えば、クローニングすることなく継代する場合、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーを互いに分離しなくともよい。例えば、継代時に、複数の異なるコロニーを形成した細胞同士を混合して、同じ培養器に播種してもよい。また、例えば、クローニングすることなく継代する場合、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する単一のコロニーをクローニングしなくともよい。例えば、継代時に、コロニーどうしを混合して、同じ培養器に播種してもよい。
　例えば、リプログラミング因子を導入された細胞が接着培養されている場合、接着培養されている細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代してもよい。例えば、継代時に、培養器から細胞を剥離し、剥離して混じり合った細胞の少なくとも一部を同じ培養器に播種してもよい。例えば、剥離液で培養器から細胞を剥がし、剥がして混じり合った細胞全体を継代してもよい。例えば、コロニーを形成していない細胞を継代してもよい。リプログラミング因子を導入された細胞が浮遊培養されている場合、浮遊培養されている細胞全体を継代してもよい。
　例えば、リプログラミング因子を導入されたが接着培養されている場合、接着培養されている細胞全体を継代してもよい。例えば、剥離液で培養器から剥がれた細胞全体を継代してもよい。また、リプログラミング因子を導入された細胞が多能性幹細胞に誘導された後、接着培養されている細胞全体を、多能性幹細胞として凍結保存してもよい。例えば、剥離液で培養器から剥がれた細胞全体を多能性幹細胞として凍結保存してもよい。
　リプログラミング因子を導入された細胞が浮遊培養されている場合、浮遊培養されている細胞全体を継代してもよい。また、リプログラミング因子を導入された細胞が多能性幹細胞に誘導された後、浮遊培養されている細胞全体を、多能性幹細胞として凍結保存してもよい。
　本実施形態に係る方法で誘導された多能性幹細胞においては、センダイウイルスが等しく消滅するので、形成された複数のコロニーどうしを混ぜてもよい。本実施形態に係る方法で誘導された多能性幹細胞の複数のコロニーにおいては、いずれにおいても、幹細胞に誘導されなかった細胞が実質的に残存しないか、数％以下しか残存しないため、形成された複数のコロニーどうしを混ぜてもよい。
　誘導された多能性幹細胞は、ＥＳ細胞に類似する肩平なコロニーを形成し、アルカリホスファターゼを発現し得る。誘導された多能性幹細胞は、未分化細胞マー力一であるＮａｎｏｇ、ＯＣＴ４、及びＳＯＸ２等を発現し得る。誘導された多能性幹細胞は、ＴＥＲＴを発現し得る。誘導された多能性幹細胞は、テ口メラーゼ活性を示し得る。
　また、細胞が多能性幹細胞に誘導されたか否かは、サイトフローメータで、未分化であることを示す細胞表面マーカーであるＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＳＳＥＡ－１、及びＳＳＥＡ５から選択される少なくとも一つの表面マーカーが陽性であるか否かを分析することにより行ってもよい。ＴＲＡ－１－６０は、ｉＰＳ／ＥＳ細胞に特異的な抗原である。ｉＰＳ細胞はＴＲＡ－１－６０陽性画分からのみできることから、ＴＲＡ－１－６０陽性細胞はｉＰＳ細胞の種と考えられる。
　（実施例１）
　ラミニン５１１をコートしたディッシュを、多能性幹細胞誘導用のディッシュとした。また、末梢血単核球細胞を血液培地に懸濁し、血球計算版を用いて単核球細胞の数を測定して、血液培地における単核球細胞数を調整した。その後、単核球細胞を、３７℃で１日間から７日間、多能性幹細胞誘導用のディッシュ上で二次元培養した。
　センダイウイルスベクターキットであるＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ２．０（登録商標、ＩＤファーマ）を用意した。ＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ２．０は、リプログラミング因子としてＫＬＦ４遺伝子、ＯＣＴ３／４遺伝子、及びＳＯＸ２遺伝子を搭載する温度感受性センダイウイルスベクターであるＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、リプログラミング因子としてＫＬＦ４を搭載する温度感受性センダイウイルスベクターであるＳｅＶ１８＋ｈＫＬＦ４／ＴＳΔＦと、リプログラミング因子としてｃ－ＭＹＣを搭載する温度感受性センダイウイルスベクターであるＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、を含む。
　単核球細胞に、ＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、ＳｅＶ１８＋ｈＫＬＦ４／ＴＳΔＦと、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、をＭＯＩが５になるよう添加し、多能性幹細胞誘導用のディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を培養した。インフェクションから２日後、血液培地をｉＰＳ細胞培地に交換した。その後、ｉＰＳ細胞培地を用いて培地交換を２日に１回行った。
　インフェクションから８日後、幹細胞様の細胞塊が生じた。インフェクションから１４日目にほぼ全ての細胞がＴＲＡ１－６０陽性細胞となり、ｉＰＳ細胞様の形態を示した。インフェクションから１４日後、ディッシュに細胞剥離剤であるトリプルセレクトを添加し、室温で１分静置してから、細胞を含む溶液を吸引し、細胞を含む溶液を３７℃で５分から１０分インキュベートした。その後、ｉＰＳ細胞培地を添加し、さらにＲＯＣＫ阻害剤を添加して、細胞を含むｉＰＳ細胞培地を１５ｍＬチューブに回収した。血球計算版を用いて細胞数を測定し、細胞を含む溶液の濃度を調整し、濃度が０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるよう細胞をウェルプレートに播種して１回目の継代をした。この際、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。次に、ウェルディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。その後、細胞が６０％から８０％コンフルエントになるごとに細胞を継代した。２回目以降の継代時も、濃度が０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるよう細胞をウェルプレートに播種した。この際も、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。
　図１に示すように、抗センダイウイルス抗体を用いて細胞を染色し、細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価したところ、継代８回目で、細胞内のセンダイウイルスはほぼ消滅した。
　（実施例２）
　二次元培養されている繊維芽細胞に、ＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、ＳｅＶ１８＋ｈＫＬＦ４／ＴＳΔＦと、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、をＭＯＩが５になるよう添加し、多能性幹細胞誘導用のディッシュを３４℃のインキュベーターに収容して、細胞を培養した。インフェクションから２日後、血液培地をｉＰＳ細胞培地に交換した。その後、ｉＰＳ細胞培地を用いて培地交換を２日に１回行った。インフェクションから１４日までに、培養温度を３７℃、３８℃に段階的に上げた。
　インフェクションから１０日後、幹細胞様の細胞塊が生じた。インフェクションから１４日目にほぼ全ての細胞がＴＲＡ１－６０陽性細胞となり、ｉＰＳ細胞様の形態を示した。インフェクションから１４日後、ディッシュに細胞剥離剤であるトリプルセレクトを添加し細胞を含む溶液を３７℃で５分から１０分インキュベートした。その後、ｉＰＳ細胞培地を添加し、細胞を含むｉＰＳ細胞培地を１５ｍＬチューブに回収した。血球計算版を用いて細胞数を測定し、細胞を含む溶液の濃度を調整し、濃度が０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるよう細胞をウェルプレートに播種して１回目の継代をした。この際、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。次に、ウェルディッシュをインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。細胞が分裂し始めてから、培養温度を３８℃にした。その後、細胞が６０％から８０％コンフルエントになるごとに細胞を継代した。２回目以降の継代時も、濃度が０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるよう細胞をウェルプレートに播種した。この際も、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。
　図２に示すように、抗センダイウイルス抗体を用いて継代を１回のみ行った細胞を染色し、細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価したところ、細胞内のセンダイウイルスはほぼ消滅していた。得られたＴＲＡ１－６０陽性細胞の写真を図３に示す。
　（実施例３）
　二次元培養されている単核球細胞に、ＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、ＳｅＶ１８＋ｈＫＬＦ４／ＴＳΔＦと、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、をＭＯＩが５になるよう添加し、多能性幹細胞誘導用のディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を培養した。インフェクションから２日後、血液培地をｉＰＳ細胞培地に交換した。その後、ｉＰＳ細胞培地を用いて培地交換を２日に１回行った。
　インフェクションから８日後、幹細胞様の細胞塊が生じた。インフェクションから１４日後、ディッシュに細胞剥離剤であるトリプルセレクトを添加し、室温で１分静置してから、細胞を含む溶液を吸引し、細胞を含む溶液を３７℃で５分から１０分インキュベートした。その後、ｉＰＳ細胞培地を添加し、細胞を含むｉＰＳ細胞培地を１５ｍＬチューブに回収した。細胞を含む溶液の濃度を調整し、１１個以上の細胞同士が接着するよう、濃度が０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２より高くとなるように細胞をウェルプレートに播種して１回目の継代をした。次に、ウェルディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。細胞が分裂し始めてから、培養温度を３８℃に上げた。その後、細胞が６０％から８０％コンフルエントになるごとに細胞を継代した。継代２回目から継代５回目も、１１個以上の細胞同士が接着するよう、濃度が０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２より高くとなるように細胞をウェルプレートに播種した。継代６回目以降は、濃度が０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるよう細胞をウェルプレートに播種した。この際、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。
　図４に示すように、抗センダイウイルス抗体を用いて細胞を染色し、細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価したところ、６回目の継代の前までは、細胞内にセンダイウイルスが残存していた。しかし、濃度が０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるよう細胞をウェルプレートに播種した継代６回目以降は、細胞内のセンダイウイルスは急激に消滅した。
　（実施例４）
　二次元培養されている単核球細胞に、ＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、をＭＯＩが５になるよう添加し、多能性幹細胞誘導用のディッシュを３４℃のインキュベーターに収容して、細胞を培養した。インフェクションから２日後、血液培地をｉＰＳ細胞培地に交換した。その後、ｉＰＳ細胞培地を用いて培地交換を２日に１回行った。途中から、温度を３７℃、３８℃に段階的に上げた。
　インフェクションから８日後、幹細胞様の細胞塊が生じた。インフェクションから１４日目にほぼ全ての細胞がＴＲＡ１－６０陽性細胞となり、ｉＰＳ細胞様の形態を示した。インフェクションから１４日後、ディッシュに細胞剥離剤であるトリプルセレクトを添加し、室温で１分静置してから、細胞を含む溶液を吸引し、細胞を含む溶液を３７℃で５分から１０分インキュベートした。その後、ｉＰＳ細胞培地を添加し、細胞を含むｉＰＳ細胞培地を１５ｍＬチューブに回収した。血球計算版を用いて細胞数を測定し、細胞を含む溶液の濃度を調整し、濃度が０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるよう細胞をウェルプレートに播種して１回目の継代をした。この際、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。次に、ウェルディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。細胞が分裂し始めてから、培養温度を３８℃に上げた。その後、細胞が６０％から８０％コンフルエントになるごとに細胞を継代した。２回目以降の継代時も、濃度が０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるよう細胞をウェルプレートに播種した。この際も、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。
　図５に示すように、抗センダイウイルス抗体を用いて継代を１回のみ行った細胞を染色し、細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価したところ、細胞内のセンダイウイルスは消滅していた。図６に示すように、ＰＣＲによっても、細胞に残存するセンダイウイルスは検出されたなかった。従来のように、１１個以上の細胞同士が接着する高い濃度で細胞を播種した場合は、細胞にセンダイウイルスが残存していた。得らえたＴＲＡ１－６０陽性細胞の免疫染色写真を図７に示す。
　（実施例５）
　二次元培養されている単核球細胞に、ＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、をＭＯＩが５になるよう添加し、多能性幹細胞誘導用のディッシュを３４℃のインキュベーターに収容して、細胞を培養した。インフェクションから２日後、血液培地をｉＰＳ細胞培地に交換した。その後、ｉＰＳ細胞培地を用いて培地交換を２日に１回行った。途中から、温度を３８℃に上げた。
　インフェクションから８日後、幹細胞様の細胞塊が生じた。インフェクションから１４日目にほぼ全ての細胞がＴＲＡ１－６０陽性細胞となり、ｉＰＳ細胞様の形態を示した。インフェクションから１５日後、ディッシュに細胞剥離剤であるトリプルセレクトを添加し、室温で１分静置してから、細胞を含む溶液を吸引し、細胞を含む溶液を３７℃で５分から１０分インキュベートした。その後、ｉＰＳ細胞培地を添加し、細胞を含むｉＰＳ細胞培地を１５ｍＬチューブに回収した。血球計算版を用いて細胞数を測定し、細胞を含む溶液の濃度を調整し、濃度が０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるよう細胞をウェルプレートに播種して１回目の継代をした。この際、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。次に、ウェルディッシュを３８℃のインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。その後、細胞が６０％から８０％コンフルエントになるごとに細胞を継代した。２回目以降の継代時も、濃度が０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるよう細胞をウェルプレートに播種した。この際も、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。
　抗センダイウイルス抗体を用いて、インフェクションから１５日目、継代をする前の細胞を染色し、細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価した結果を図８に示す。また、インフェクションから１５日目の細胞の写真を図９に示す。抗センダイウイルス抗体を用いて、継代を１回した後の細胞を染色し、細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価した結果を図１０に示す。図１０に示すように、継代１回目で、細胞内のセンダイウイルスはほぼ消滅した。継代１回目の細胞の写真を図１１に示す。
　（実施例６）
　ポリマー含有血液培地中で三次元培養されている単核球細胞に、ＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、ＳｅＶ１８＋ｈＫＬＦ４／ＴＳΔＦと、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、をＭＯＩが５になるよう添加し、多能性幹細胞誘導用のディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を培養した。インフェクションから２日後、ポリマー含有血液培地をポリマー含有ｉＰＳ細胞培地に交換した。その後、ポリマー含有ｉＰＳ細胞培地を用いて培地交換を２日に１回行った。
　インフェクションから１４日後、幹細胞様の細胞塊が生じた。インフェクションから１４日目にほぼ全ての細胞がＴＲＡ１－６０陽性細胞となった。なお、得られたＴＲＡ１－６０陽性細胞の一部を培養器に播種して二次元培養したところ、ｉＰＳ細胞様のコロニーが形成された。また、メッシュを使って細胞塊を回収し、回収された細胞に細胞剥離剤であるトリプルセレクトを添加し、室温で５分静置してから、細胞を含む溶液を吸引し、細胞を含む溶液を３７℃で５分から１０分インキュベートした。その後、ｉＰＳ細胞培地を添加し、細胞を含むｉＰＳ細胞培地を１５ｍＬチューブに回収した。血球計算版を用いて細胞数を測定し、細胞を含む溶液の濃度を調整し、濃度が０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるよう細胞をウェルプレートに播種して１回目の継代をした。この際、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。次に、ウェルディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。その後、細胞が６０％から８０％コンフルエントになるごとに細胞を継代した。２回目以降の継代時も、濃度が０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるよう細胞をウェルプレートに播種した。この際も、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。途中で温度を３８℃に上げた。
　抗センダイウイルス抗体を用いて、継代を２回した細胞を染色し、細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価したところ、図１２に示すように、細胞内のセンダイウイルスはほぼ消滅した。継代を２回した細胞の写真を図１３に示す。
　（実施例７）
　二次元培養されている線維芽細胞に、ＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、をＭＯＩが５になるよう添加し、多能性幹細胞誘導用のディッシュを３４℃のインキュベーターに収容して、細胞を培養した。インフェクションから２日後、血液培地をｉＰＳ細胞培地に交換した。その後、ｉＰＳ細胞培地を用いて培地交換を２日に１回行った。
　インフェクションから８日後、幹細胞様の細胞塊が生じた。インフェクションから１４日目にほぼ全ての細胞がＴＲＡ１－６０陽性細胞となり、ｉＰＳ細胞様の形態を示した。インフェクションから１４日後、ディッシュに細胞剥離剤であるトリプルセレクトを添加し、室温で１分静置してから、細胞を含む溶液を吸引し、細胞を含む溶液を３７℃で５分から１０分インキュベートした。その後、ｉＰＳ細胞培地を添加し、細胞を含むｉＰＳ細胞培地を１５ｍＬチューブに回収した。血球計算版を用いて細胞数を測定し、細胞を含む溶液の濃度を調整し、濃度が０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるよう細胞をウェルプレートに播種して１回目の継代をした。この際、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。その後、ウェルディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。その後、細胞が６０％から８０％コンフルエントになるごとに細胞を継代した。２回目以降の継代時も、濃度が０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるよう細胞をウェルプレートに播種した。この際も、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。
　図１４に示すように、抗センダイウイルス抗体を用いて細胞を染色し、細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価したところ、１回目の継代の後、細胞内のセンダイウイルスは消滅していた。図１５に示すように、ＰＣＲによっても、細胞に残存するセンダイウイルスは検出されたなかった。得られたＴＲＡ１－６０陽性細胞の写真を図１６に示す。
　（比較例１）
　二次元培養されている繊維芽細胞に、ＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、ＳｅＶ１８＋ｈＫＬＦ４／ＴＳΔＦと、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、をＭＯＩが５になるよう添加し、多能性幹細胞誘導用のディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を培養した。インフェクションから２日後、血液培地をｉＰＳ細胞培地に交換した。その後、ｉＰＳ細胞培地を用いて培地交換を２日に１回行った。インフェクションから１４日までに、培養温度を３７℃に上げた。
　インフェクションから１０日後、幹細胞様の細胞塊が生じた。インフェクションから１４日後、ディッシュに細胞剥離剤であるトリプルセレクトを添加し細胞を含む溶液を３７℃で５分から１０分インキュベートした。その後、ｉＰＳ細胞培地を添加し、細胞を含むｉＰＳ細胞培地を１５ｍＬチューブに回収した。血球計算版を用いて細胞数を測定し、細胞を含む溶液の濃度を調整し、１１個以上の細胞同士が接着するように高い濃度で細胞をウェルプレートに播種して１回目の継代をした。次に、ウェルディッシュをインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。その後、細胞が６０％から８０％コンフルエントになるごとに細胞を継代した。２回目以降の継代時も、１１個以上の細胞同士が接着するように高い濃度で細胞をウェルプレートに播種した。
　抗センダイウイルス抗体を用いて細胞を染色し、細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価したところ、図１７に示すように、継代を繰り返しても、センダイウイルスが細胞に残り続けた。
　（比較例２）
　ポリマー含有血液培地中で三次元培養されている単核球細胞に、ＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、ＳｅＶ１８＋ｈＫＬＦ４／ＴＳΔＦと、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、をＭＯＩが５になるよう添加し、多能性幹細胞誘導用のディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を培養した。インフェクションから２日後、ポリマー含有血液培地をポリマー含有ｉＰＳ細胞培地に交換した。その後、ポリマー含有ｉＰＳ細胞培地を用いて培地交換を２日に１回行った。
　インフェクションから１０日後、幹細胞様の細胞塊が生じた。インフェクションから１４日後、メッシュを使って細胞塊を回収し、回収された細胞に細胞剥離剤であるトリプルセレクトを添加し、室温で５分静置してから、細胞を含む溶液を吸引し、細胞を含む溶液を３７℃で５分から１０分インキュベートした。その後、ｉＰＳ細胞培地を添加し、細胞を含むｉＰＳ細胞培地を１５ｍＬチューブに回収した。血球計算版を用いて細胞数を測定し、細胞を含む溶液の濃度を調整し、１１個以上の細胞同士が接着するように高い濃度で細胞をウェルプレートに播種して１回目の継代をした。次に、ウェルディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。その後、細胞が６０％から８０％コンフルエントになるごとに細胞を継代した。２回目以降の継代時も、１１個以上の細胞同士が接着するように高い濃度で細胞をウェルプレートに播種した。途中で温度を３８℃に上げた。
　抗センダイウイルス抗体を用いて細胞を染色し、細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価したところ、図１８に示すように、継代を９回しても、センダイウイルスが細胞に残り続けた。インフェクション後、多能性幹細胞誘導用のディッシュを３４℃のインキュベーターに収容し、その他は同条件で多能性幹細胞を誘導した場合も、細胞にセンダイウイルス残り続けた。
　（比較例３）
　ポリマー含有血液培地中で三次元培養されている単核球細胞に、ＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、ＳｅＶ１８＋ｈＫＬＦ４／ＴＳΔＦと、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、をＭＯＩが５になるよう添加し、多能性幹細胞誘導用のディッシュを３４℃のインキュベーターに収容して、細胞を培養した。インフェクションから２日後、ポリマー含有血液培地をポリマー含有ｉＰＳ細胞培地に交換した。その後、ポリマー含有ｉＰＳ細胞培地を用いて培地交換を２日に１回行った。途中から、温度を３７℃に上げ、さらに３８℃に上げた。
　インフェクションから１０日後、幹細胞様の細胞塊が生じた。インフェクションから１４日後、メッシュを使って細胞塊を回収し、回収された細胞に細胞剥離剤であるトリプルセレクトを添加し、室温で５分静置してから、細胞を含む溶液を吸引し、細胞を含む溶液を３７℃で５分から１０分インキュベートした。その後、ｉＰＳ細胞培地を添加し、細胞を含むｉＰＳ細胞培地を１５ｍＬチューブに回収した。血球計算版を用いて細胞数を測定し、細胞を含む溶液の濃度を調整し、１１個以上の細胞同士が接着するように高い濃度で細胞をウェルプレートに播種して１回目の継代をした。次に、ウェルディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。細胞が分裂し始めてから、培養温度を３８℃に上げた。その後、細胞が６０％から８０％コンフルエントになるごとに細胞を継代した。２回目以降の継代時も、１１個以上の細胞同士が接着するように高い濃度で細胞をウェルプレートに播種した。途中で温度を３８℃に上げた。
　抗センダイウイルス抗体を用いて細胞を染色し、細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価したところ、図１９に示すように、継代を繰り返しても、センダイウイルスが細胞に残り続けた。
　（比較例４）
　二次元培養されている単核球細胞に、ＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、をＭＯＩが５になるよう添加し、多能性幹細胞誘導用のディッシュを３４℃のインキュベーターに収容して、細胞を培養した。インフェクションから２日後、血液培地をｉＰＳ細胞培地に交換した。その後、ｉＰＳ細胞培地を用いて培地交換を２日に１回行った。途中から、温度を３７℃に上げ、さらに温度を３８℃に上げた。
　インフェクションから８日後、幹細胞様の細胞塊が生じた。インフェクションから１４日後、ディッシュに細胞剥離剤であるトリプルセレクトを添加し、室温で１分静置してから、細胞を含む溶液を吸引し、細胞を含む溶液を３７℃で５分から１０分インキュベートした。その後、ｉＰＳ細胞培地を添加し、細胞を含むｉＰＳ細胞培地を１５ｍＬチューブに回収した。血球計算版を用いて細胞数を測定し、細胞を含む溶液の濃度を調整し、１１個以上の細胞同士が接着するように高い濃度で細胞をウェルプレートに播種して１回目の継代をした。次に、ウェルディッシュを３８℃のインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。その後、細胞が６０％から８０％コンフルエントになるごとに細胞を継代した。２回目以降の継代時も、１１個以上の細胞同士が接着するように高い濃度で細胞をウェルプレートに播種した。
　抗センダイウイルス抗体を用いて、継代を９回した細胞を染色し、細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価したところ、図２０に示すように、センダイウイルスが細胞に残っていた。
　（実施例８）
　１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを線維芽細胞用培地として用意した。ヒトの成人由来の線維芽細胞用培地に、線維芽細胞を懸濁して、線維芽細胞懸濁液を得た。
　６ウェルディッシュの１ウェルに対して、１．５ｍＬのＰＢＳと４．８μＬのカイコ由来ラミニン（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ、ニッピ）の混合液を加え、３７℃のインキュベーター中にディッシュを１時間置いた。次に、アスピレータを用いてＰＢＳとラミニンの混合液をウェルから除去し、１ウェルに１．５ｍＬの線維芽細胞懸濁液を加えた。１ウェルにおける線維芽細胞の数は、０．５×１０５から２．０×１０５個であった。その後、３７℃のインキュベーター中で線維芽細胞を１日間培養した。
　次に、培地を幹細胞誘導培地に交換した。交換した培地の量も１．５ｍＬであった。
　チューブＡとチューブＢを用意し、チューブＡ中の１２５μＬのＰＢＳにＯＣＴ４のＲＮＡ、ＳＯＸ２のＲＮＡ、ＫＬＦ４のＲＮＡ、及びＣ－ＭＹＣのＲＮＡの混合物（１００ｎｇ／μＬ）を０．１μＬから１００μＬ加えた。チューブＢ中の１２５μＬのＰＢＳに０．１μＬから１００μＬのリポフェクション試薬を加えた。次に、チューブＡ中の溶液とチューブＢ中の溶液を混合し、混合液を１０分間室温で放置し、全量の混合液を１ウェル中の培地に加えた。その後、３７℃のインキュベーター中にディッシュを１日間置いて、細胞にＲＮＡをトランスフェクトした。以後、同様の手順によるＲＮＡトランスフェクションを１１回繰り返した。
　１１回目のＲＮＡトランスフェクションの翌日、細胞を含む溶液の濃度を調整し、濃度が０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるよう細胞をラミニンでコートされたウェルプレートに播種して１回目の継代をした。この際、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。次に、ウェルディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。その後、細胞が６０％から８０％コンフルエントになったときに細胞を１回のみ継代した。２回目以降の継代時も、濃度が０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるよう細胞をウェルプレートに播種した。この際、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。
　図２１に示すように、１回目の継代から１日目で、リプログラミング因子が細胞からほぼ消滅し、１回目の継代から２日目で、リプログラミング因子が細胞から完全に消滅した。インフェクションから１０日目にほぼ全ての細胞がＴＲＡ１－６０陽性細胞となり、ｉＰＳ細胞様の形態を示した。ＴＲＡ１－６０陽性細胞の免疫染色写真を図２２に示す。
　（実施例９）
　健常者の尿を３００ｍＬ採取し、５０ｍＬファルコンチューブに６本ずつ尿を分注して、４００Ｇで５分間、チューブを遠心した。遠心後、チューブから上清を除き、３０ｍＬのＰＢＳをチューブに入れ、４００Ｇで５分間、チューブを遠心した。遠心後、チューブから上清を除き、３０ｍＬのプライマリー培地をチューブに入れ、４００Ｇで５分間、チューブを遠心した。プライマリー培地は、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ'ｓ　Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、１１３２０－０３３）に、ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、１０４３７０２８、終濃度１０％）、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ　Ｋｉｔ　ＣＣ－４１２７　ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ、１０００分の１量）、及びＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｇｉｂｃｏ、１５２４００６２、１００分の１量）を添加して調製した。遠心後、チューブから上清を除き、１ｍＬのプライマリー培地で細胞を懸濁し、ジェラチンコートした２４ウェルプレートの１ウェルに細胞を播種し、３７℃のインキュベーターで細胞をインキュベートした。細胞播種後２日間はプライマリー培地を３００μＬウェルに添加し、３日目以降からは上皮細胞用培地を用いて培地交換した。上皮細胞用培地は、腎上皮細胞基本培地（Ｌｏｎｚａ）にＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ　Ｋｉｔ　ＣＣ－４１２７　ＲＥＧＭ　（Ｌｏｎｚａ）を添加して調製した。６日間拡大培養した後の細胞の顕微鏡画像を図２３に示す。播種から７日目に細胞を１回目の継代をし、さらに細胞を拡大培養し、１回目の継代から７日目に細胞を２回目の継代をした。２回目の継代から６日目の細胞の顕微鏡画像を図２４に示す。
　（実施例１０）
　ラミニン５１１をコートしたディッシュを、多能性幹細胞誘導用のディッシュとした。多能性幹細胞誘導用のディッシュに、実施例９で用意した尿由来の細胞を低濃度で播種し、３７℃でインキュベートした。培地は上皮細胞用培地を用いた。翌日、トランスフェクション試薬と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＲＮＡとの混合物を培地に添加し、当該培地を用いて培地交換を行い、３７℃でインキュベートした。その翌日の細胞の顕微鏡画像を図２５に示す。ＧＦＰの発現が認められたことから、尿由来の細胞にトランスフェクションを行えることが示された。
　（実施例１１）
　ラミニン５１１をコートしたディッシュを、多能性幹細胞誘導用のディッシュとした。多能性幹細胞誘導用のディッシュに、実施例９で用意した尿由来の細胞を低濃度で播種し、３７℃でインキュベートした。培地は上皮細胞用培地を用いた。翌日、チューブＡとチューブＢを用意し、チューブＡ中の１２５μＬのＰＢＳにＭ３ＯのＲＮＡ、ＳＯＸ２のＲＮＡ、ＫＬＦ４のＲＮＡ、Ｃ－ＭＹＣのＲＮＡ、及びＬＩＮ２８のＲＮＡの混合物（１００ｎｇ／μＬ）を０．１μＬから１０２μＬ加えた。また、これらのＲＮＡは、ＨＰＬＣで実質的に１本鎖ＲＮＡに濃縮精製されていた。ＲＮＡの２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度の比（Ａ２６０／Ａ２８０）は、１．７１から２．１であり、タンパク質が実質的に混入していないことが確認された。また、抗２本鎖ＲＮＡ抗体Ｊ２を用いてドットブロット分析したところ、２本鎖ＲＮＡは９０％以上除去されていた。チューブＢ中の１２５μＬのＰＢＳに０．１μＬから１００μＬのリポフェクション試薬を加えた。次に、チューブＡ中の溶液とチューブＢ中の溶液を混合し、混合液を１０分間室温で放置し、全量の混合液を、Ｂ１８Ｒ等を利用せずトランスフェクション用培地に添加し、当該トランスフェクション用培地を用いて培地交換を行い、３７℃でインキュベートした。トランスフェクションは１０日間、１日に１回行った。細胞播種後、１、５、７、１４日目に観察を行った。図２６に示すように、日が進むにつれてＥＳ細胞様に細胞の形態が変化したことが認められた。
　（実施例１２）
　実施例１１と同様に、尿由来の細胞にトランスフェクションを１０日間行った。細胞を播種して１１日目から幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ、味の素）で細胞を培養し、１４日目に全ての細胞をディッシュから剥がし、回収して混じり合った細胞の一部を培地に播種して継代した。継代の際には、コロニーをピックアップせず、ディッシュ上の細胞全体を回収し、１×１０２個から１×１０５個の細胞をディッシュに播種した。継代してから６日目の細胞の顕微鏡画像を図２７に示す。ＥＳ細胞様の細胞が確認された。
　（実施例１３）
　実施例１１と同様に、尿由来の細胞にトランスフェクションを１０日間行った。細胞を播種して１１日目から幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ、味の素）で細胞を培養し、１４日目に細胞をディッシュから剥がし、一部の細胞をフローサイトメトリーで分析したところ、図２８（ａ）に示すように、ＴＲＡ－１－６０陽性であることが確認された。また、１４日目にディッシュから剥がされた細胞を継代し、７日後にフローサイトメトリーで分析したところ、図２８（ｂ）に示すように、ＴＲＡ－１－６０陽性であることが確認された。
　（実施例１４）
　実施例１１と同様に、尿由来の細胞にトランスフェクションを１０日間行った。細胞を播種して１１日目から幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ、味の素）で細胞を培養し、１４日目に全ての細胞をディッシュから剥がし、剥がして混じり合った細胞の一部を播種して継代した。継代後の培地にはＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）を用いた。継代してから７日後、細胞を固定し、抗ＯＣＴ３／４抗体及び抗ＮＡＮＯＧ抗体を用いて、細胞を染色した。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ（登録商標）による核の化学染色も行った。その結果、図２９に示すように、多能性幹細胞の特異的マーカーであるＯＣＴ３／４及びＮＡＮＯＧの発現が細胞核で確認された。したがって、尿由来の細胞から、ＲＮＡを利用して多能性幹細胞を誘導できることが示された。なお、図２９（ｄ）は、抗ＯＣＴ３／４抗体を用いて染色した細胞の写真と、抗ＮＡＮＯＧ抗体を用いて染色した細胞の写真と、Ｈｏｅｃｈｓｔ（登録商標）を用いて染色した細胞の写真と、を合成した写真である。
　（実施例１７）
　実施例１１と同様に、尿由来の細胞にトランスフェクションを１０日間行った。細胞を播種して１１日目から幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ、味の素）で細胞を培養し、１４日目にトリプルセレクトを用いて全ての細胞をディッシュから剥がし、剥がして混じり合った細胞の一部を培地に播種して継代した。継代後の培地にはＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）を用いた。継代してから7日後、細胞を固定し、抗ＬＩＮ２８抗体を用いて、細胞を染色した。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ（登録商標）による核の化学染色も行った。その結果、図３０に示すように、多能性幹細胞の特異的マーカーであるＬＩＮ２８の発現が細胞核で確認された。したがって、尿由来の細胞から、ＲＮＡを利用して多能性幹細胞を誘導できることが示された。なお、図３０（ｄ）は、抗ＬＩＮ２８抗体を用いて染色した細胞の写真と、Ｈｏｅｃｈｓｔ（登録商標）を用いて染色した細胞の写真と、を合成した写真である。

Claims (26)

  1. 　細胞にリプログラミング因子を導入することと、
    　前記リプログラミング因子を導入された細胞を低濃度で播種して培養することと、
    　を含む、多能性幹細胞の作製方法。
  2. 　前記低濃度が、０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記低濃度が、播種した１１個以上の前記細胞同士が接触しない濃度である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記低濃度が、５％以下コンフルエントである、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記リプログラミング因子がＲＮＡである、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記細胞にリポフェクション法により前記リプログラミング因子を導入する、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記細胞にウイルスベクターを用いて前記リプログラミング因子を導入する、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記ウイルスベクターが、所定の温度以上でウイルス核酸の安定性が低下する温度感受性ウイルスベクターである、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記ウイルスベクターが、前記所定の温度以上でウイルス核酸の安定性が低下しないウイルスベクターを含まない、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記リプログラミング因子を導入後、少なくとも２日、前記所定の温度未満で前記細胞を培養する、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 　前記培養することにおいて、前記リプログラミング因子を導入された細胞を継代し、前記所定の温度以上で培養する、請求項８から１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　前記培養することにおいて、多能性幹細胞又は多能性幹細胞のコロニーを単離しない、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　前記培養することにおいて、前記リプログラミング因子を導入された細胞をクローニングしない、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　前記培養することにおいて、前記リプログラミング因子を導入された細胞を培養器から剥離し、剥離した細胞の少なくとも一部を混合して播種する、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　前記培養することにおいて、前記リプログラミング因子を導入された細胞を培養器から回収し、回収した細胞の少なくとも一部を混合して播種する、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　前記培養することにおいて、前記リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーのそれぞれをピックアップしない、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
  17. 　前記培養することにおいて、前記リプログラミング因子を導入された細胞であって、異なるシングルセル由来の細胞どうし混合して播種する、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
  18. 　前記培養することの後、細胞全体を前記多能性幹細胞として凍結保存する、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 　前記培養することの後、剥がした細胞全体を前記多能性幹細胞として凍結保存する、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 　前記培養が接着培養である、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 　前記培養が浮遊培養である、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
  22. 　前記培養することの後、多能性幹細胞のコロニーどうしを混合する、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 　前記リプログラミング因子を導入された細胞が、血液細胞、線維芽細胞、又は尿に含まれる細胞由来である、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 　細胞にウイルスベクターを用いてリプログラミング因子を導入することと、
    　前記リプログラミング因子を導入された細胞を低濃度で播種して培養することと、
    　を含む、多能性幹細胞を誘導し、ウイルスベクターを消す方法。
  25. 　前記リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーを互いに混合する、請求項２４に記載の方法。
  26. 　前記リプログラミング因子を導入された細胞が形成するコロニーをピックアップすることを含まない、請求項２４又は２５に記載の方法。
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