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WO2021033973A1 - Mitf 억제제를 유효성분으로 함유하는 골수-유래 억제세포 저해용 조성물 - Google Patents

Mitf 억제제를 유효성분으로 함유하는 골수-유래 억제세포 저해용 조성물 Download PDF

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Publication number
WO2021033973A1
WO2021033973A1 PCT/KR2020/010480 KR2020010480W WO2021033973A1 WO 2021033973 A1 WO2021033973 A1 WO 2021033973A1 KR 2020010480 W KR2020010480 W KR 2020010480W WO 2021033973 A1 WO2021033973 A1 WO 2021033973A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mdsc
mitf
cancer
inhibitor
activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2020/010480
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
임종석
이아람
임지현
이명석
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sookmyung Womens University SWU
Original Assignee
Sookmyung Womens University SWU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sookmyung Womens University SWU filed Critical Sookmyung Womens University SWU
Publication of WO2021033973A1 publication Critical patent/WO2021033973A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4375—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having nitrogen as a ring heteroatom, e.g. quinolizines, naphthyridines, berberine, vincamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Definitions

  • the present invention relates to a composition for inhibiting myeloid-derived suppressor cells containing a MITF (microphthalmia-associated transcription factor) inhibitor as an active ingredient, and specifically, a bone marrow-derived composition containing an MITF inhibitor as an active ingredient It relates to a composition for alleviating, treating, or preventing lowering of the immune response by inhibitory cells.
  • MITF microphthalmia-associated transcription factor
  • Myeloid cells originate from hematopoietic stem cells. These are the most common hematopoietic stem cells in our body, mainly in bone marrow and lymphatic tissues. Ultimately, they differentiate into macrophages, dendritic cells, and granulocytes, but they do not have a specific hierarchical structure, and myeloid cells with different degrees of differentiation are specifically distributed in various tissues and environments. It has the characteristics of being.
  • MDSCs Myeloid-derived suppressor cells
  • ROS reactive oxygen species
  • RNS reactive nitrogen species
  • ICI immune checkpoint inhibitors
  • CTL-4 cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4
  • PD-1 programmed cell death protein
  • P-L1 programmed cell death ligand 1
  • Immunosuppressive cells in TME that affect the efficacy of ICI treatment include Treg cells, MDSC, TH2 CD4 + cells, CAF (cancer-associated fibroblast) and M2 polarized tumor-associated macrophages (TAM).
  • Treg cells include Treg cells, MDSC, TH2 CD4 + cells, CAF (cancer-associated fibroblast) and M2 polarized tumor-associated macrophages (TAM).
  • TAM tumor-associated macrophages
  • MITF microphthalmia-associated transcription factor
  • LXR Liver X receptor
  • the present inventors have endeavored to develop a formulation that can alleviate the decrease in the immune response of MDSC through MDSC inhibition and improve the therapeutic effect of an anticancer immunotherapy agent.
  • MDSC is activated in the cancer cell microenvironment and the immune response is lowered.
  • the MITF inhibitor can be used to alleviate the decrease in the immune response of MDSC and to use anticancer immunotherapy. , Completed the present invention.
  • IRF4 Interferon regulatory factor 4
  • MDSC myeloid-derived suppressor cell
  • An object of the present invention is to alleviate and treat the reduction of immune response by bone marrow-derived suppressor cells, containing as an active ingredient a microphthalmia-associated transcription factor (MITF) inhibitor that inhibits myeloid-derived suppressor cells. Or to provide a preventive composition.
  • MITF microphthalmia-associated transcription factor
  • Another object of the present invention is to provide an anticancer adjuvant containing an MITF inhibitor as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for inhibiting bone marrow-derived inhibitory cells, comprising administering a MITF inhibitor to an individual in need of inhibition of the bone marrow-derived inhibitory cells.
  • the present invention is a bone marrow-derived suppressor cell (myeloid-derived suppressor cell) containing a microphthalmia-associated transcription factor (MITF) inhibitor as an active ingredient alleviation, treatment or It provides a composition for prevention.
  • MITF microphthalmia-associated transcription factor
  • the present invention provides an anticancer adjuvant containing an MITF inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for inhibiting bone marrow-derived suppressor cells, comprising administering a MITF inhibitor to an individual in need of inhibition of the bone marrow-derived suppressor cells.
  • the present invention provides a method for alleviating or treating lowering of immune response by bone marrow-derived suppressor cells, comprising administering a MITF inhibitor to an individual.
  • the present invention provides a method for preventing lowering of immune response by bone marrow-derived suppressor cells, comprising administering a MITF inhibitor to an individual.
  • the present invention provides a method for treating cancer, comprising administering a MITF inhibitor and an anticancer agent to an individual.
  • the present invention provides a use of MITF for use as a composition for alleviating, treating, or preventing the decrease in immune response by bone marrow-derived suppressor cells.
  • the present invention provides the use of MITF for use as an anticancer adjuvant.
  • MDSC myeloid-derived suppressor cells
  • MITF microphthalmia-associated transcription factor
  • FIG. 1 is a diagram schematically illustrating a method of making a bone marrow-derived bone marrow-derived suppressor cell (MDSC) of a mouse.
  • MDSC bone marrow-derived bone marrow-derived suppressor cell
  • FIG. 2 is a diagram of MDSC after treatment with a tumor cell-conditioned medium (TCCM) with GM-CSF, which is a differentiation inducing factor of MDSC, to cells isolated from the bone marrow of a mouse according to an embodiment of the present invention. It is a diagram confirming changes in differentiation (Fig. 2A) and activity (Fig. 2B).
  • TCCM tumor cell-conditioned medium
  • GM-CSF a differentiation inducing factor of MDSC
  • FIG. 3 is a diagram of a gene (FIG. 3A) and a protein (FIG. 3B) of a microphthalmia-associated transcription factor (MITF) in MDSC after treatment of TCCM with GM-CSF in cells isolated from the bone marrow of a mouse according to an embodiment of the present invention. ) This is a diagram confirming the change in expression.
  • MITF microphthalmia-associated transcription factor
  • FIG. 4 shows the differentiation of MDSC by treatment with GM-CSF and TCCM on cells isolated from the spleen of tumorigenic mice (FIG. 4A) or cells isolated from the bone marrow of mice (FIG. 4B) according to an embodiment of the present invention. It is a diagram confirming the change in inhibition of T cell proliferation of MDSC after inducing activity.
  • Fig. 5 is a diagram confirming changes in MDSC differentiation (Fig. 5A), activity (Fig. 5B) and MITF gene expression (Fig. 5C) in tumorigenic mice.
  • FIG. 6 is a drug that induces the activity of MDSC in cells isolated from the bone marrow of a mouse according to an embodiment of the present invention, after treating IL-18 with GM-CSF for 96 hours (FIGS. 6A and 6B) or according to an embodiment of the invention, after inducing differentiation by treating cells isolated from the bone marrow of a mouse with GM-CSF, IL-18 was treated for 24 hours (Fig. 6C and Fig. 6D), and then differentiation of MDSC (Fig. 6A). And Figure 6C), is a diagram confirming the changes in the activity and gene expression of MITF ( Figure 6B and Figure 6D).
  • FIG. 7 is a drug that induces the activity of MDSC in cells isolated from the bone marrow of a mouse according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7A After treatment with IL-4 with GM-CSF, the differentiation of MDSC (FIG. 7A) and activity (FIG. 7B)
  • FIG. 7C It is a diagram confirming changes in gene expression (FIG. 7C) of MITF.
  • Figure 8 is a drug that induces the activity of MDSC in cells isolated from the bone marrow of a mouse according to an embodiment of the present invention, after treatment with LPS with GM-CSF, differentiation of MDSC (Figure 8A), activity ( Figure 8B) And it is a diagram confirming the change in gene expression (FIG. 8C) of MITF.
  • Figure 9 is a drug that induces the activity of MDSC in cells isolated from the bone marrow of a mouse according to an embodiment of the present invention, simvastatin (Sim), lovastatin (Lovastatin, Lova), provastatin (Pravastatin, Prav), as This is a diagram confirming the change in differentiation of MDSC after treatment with Suvastatin (Rosuvastatin, Rosu) or Atorvastatin (Ator) with GM-CSF.
  • Figure 10 is a drug for inducing the activity of MDSC in cells isolated from the bone marrow of a mouse according to an embodiment of the present invention, after treatment with Simvastatin (Sim) or lovastatin (Lovastatin, Lova) with GM-CSF It is a diagram confirming changes in the activity of (Fig. 10A) and gene expression of MITF (Fig. 10B).
  • Figure 11 is a drug that induces the activity of MDSC after inducing differentiation by treating cells isolated from the bone marrow of a mouse with GM-CSF according to an embodiment of the present invention.
  • Simvastatin Sim
  • lovastatin Lovastatin, Lova
  • provastatin Pravastatin, Prav
  • rosuvastatin Rosu
  • atorvastatin Antor
  • Figure 12 is a drug that induces the activity of MDSC after inducing differentiation by treating cells isolated from the bone marrow of a mouse with GM-CSF according to an embodiment of the present invention, simvastatin (Sim) or lovastatin (Lovastatin, Lova) is a diagram confirming changes in the activity of MDSC (Fig. 12A) and gene expression of MITF (Fig. 12B) after treatment for 24 hours.
  • Sim simvastatin
  • lovastatin Lova
  • FIG. 13 shows the differentiation of MDSC after treatment with ATRA (All-trans retinoic acid) with GM-CSF as a drug that inhibits the activity of MDSC in cells isolated from the bone marrow of a mouse according to an embodiment of the present invention (FIG. 13A ), activity (FIG. 13B) and gene expression of MITF (FIG. 13C) are confirmed.
  • ATRA All-trans retinoic acid
  • FIG. 14 shows the differentiation of MDSC (FIG. 14A ), activity of MDSC, and gene expression of MITF after treatment with GM-CSF with GM-CSF as a MITF inducer in cells isolated from the bone marrow of a mouse according to an embodiment of the present invention (FIG. 14B And 14C), and T cell proliferation inhibition (FIG. 14D) of MDSC.
  • FIG. 15 shows gene expression of MITF (FIG. 15A) and differentiation of MDSC after treatment with GM-CSF with berberine as a MITF inhibitor in cells isolated from the bone marrow of a mouse according to an embodiment of the present invention (FIG. 15B ). ) And activity (FIG. 15C) is a diagram confirming the change.
  • FIG. 16 is a diagram illustrating the distribution of MDSCs expressing MITF in lung cancer and head and neck cancer (H&N cancer) tissues.
  • FIG. 17 shows MDSC activity (FIG. 17A) and MITF gene expression (FIG. 17B) after treating ML-329 with GM-CSF as a MITF inhibitor in cells isolated from the bone marrow of a mouse according to an embodiment of the present invention. It is a figure confirming the change.
  • FIG. 18 shows the differentiation of MDSC (FIG. 18A ), activity, and gene and protein expression of MITF after treating ML-329 with GM-CSF and TCCM in cells isolated from the bone marrow of a mouse according to an embodiment of the present invention ( 18B and 18C) is a diagram confirming the change in inhibition of T cell proliferation (FIG. 18D) of MDSC.
  • FIG. 19 is a diagram illustrating changes in ROS production of MDSC after treatment with ML-329 or berberine (BBR) together with GM-CSF and TCCM in MDSC isolated from the spleen of tumorigenic mice according to an embodiment of the present invention.
  • BBR berberine
  • FIG. 20 shows changes in protein expression of MITF (FIG. 20A), ROS generation of MDSC (FIG. 20B) and inhibition of T cell proliferation (FIG. 20C) in MDSC inhibiting MITF expression according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 20D a diagram confirming changes in protein expression of MITF
  • FIG. 20E a diagram confirming changes in protein expression of MDSC
  • Figure 21 is a method of administering MDSC treated with ML-329 together with GM-CSF and TCCM to tumor-forming mice according to an embodiment of the present invention (Figure 21A), tumor volume change in the tumor-forming mice ( Figure 21B and Fig. 21C)) and changes in the population of MDSCs (Fig. 21D) in the tumor tissues of the tumorigenic mice.
  • the present invention is a composition for alleviating, treating or preventing lowering of the immune response caused by bone marrow-derived suppressor cells (MDSC), containing an MITF (Microphthalmia-associated transcription factor) inhibitor as an active ingredient;
  • the "MITF inhibitor” may include, without limitation, a substance capable of achieving the purpose of inhibiting the activity of MDSC through inhibition of MITF expression or activity.
  • the MITF inhibitor may be a gene expression inhibitor of MITF or a protein activity inhibitor of MITF.
  • the gene expression inhibitor of MITF is an antisense nucleotide complementary to the mRNA of the MITF gene, an aptamer, a small hairpin RNA (shRNA), a small interfering RNA (siRNA), a micro It may be one or more selected from the group consisting of RNA (microRNA, miRNA) and ribozyme, but is not limited thereto.
  • antisense nucleotide is, as defined by the Watson-Click base pair, binds (hybridizes) to the complementary nucleotide sequence of DNA, immature-mRNA, or mature mRNA to interfere with the flow of genetic information from DNA to protein.
  • the nature of antisense nucleotides specific to the target sequence makes them exceptionally multifunctional. Because antisense nucleotides are long chains of monomer units, they can be easily synthesized for target RNA sequences. Many recent studies have demonstrated the usefulness of antisense nucleotides as a biochemical means for studying target proteins (Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544, 1999).
  • antisense nucleotides can be considered as a new type of inhibitor, as there have been many recent advances in the field of oligonucleotide chemistry and nucleotide synthesis showing improved cell adhesion, target binding affinity and nuclease resistance.
  • shRNA refers to a nucleotide consisting of 50-60 single strands, and constitutes a stem-loop structure in vivo.
  • shRNA is an RNA sequence that makes a tight hairpin structure to suppress gene expression through RNA interference (RNAi).
  • RNAi RNA interference
  • the shRNA is generally transduced into cells through a vector containing the U6 promoter to be expressed, and is usually transferred to daughter cells to inhibit gene expression.
  • shRNA hairpin structure is cleaved by an intracellular mechanism to become siRNA and then binds to the RNA-induced silencing complex (RISC). These RISCs bind to and cleave mRNA.
  • shRNA is transcribed by RNA polymerase.
  • small interfering RNA refers to a short double-stranded RNA capable of inducing an RNA interference phenomenon through cleavage of a specific mRNA. It is composed of a sense RNA strand having a sequence homologous to the mRNA of the target gene and an antisense RNA strand having a sequence complementary thereto. Since siRNA can suppress the expression of a target gene, it is provided as an efficient gene knock-down method or as a gene therapy method.
  • microRNA refers to a short non-coding RNA consisting of about 22 base sequences. It is known to function as a post-transcriptional regulator in the process of gene expression. By binding complementarily to a target mRNA having a complementary nucleotide sequence, target mRNAs are degraded or translation into proteins is inhibited.
  • the protein activity inhibitor of MITF may be one or more selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics, substrate analogs, aptamers, and antibodies that specifically bind to the MITF protein, but is not limited thereto.
  • peptide mimetics inhibit the activity of the MITF protein by inhibiting the binding domain of the MITF protein.
  • Peptidomimetics may be peptides or non-peptides, and may consist of amino acids linked by non-peptide bonds, such as psi bonds.
  • Peptide mimetics are structured similar to the secondary structural properties of MITF proteins and can mimic the inhibitory properties of large molecules such as antibodies or water-soluble receptors, and can be novel small molecules that can act with equal effects as natural antagonists.
  • the "aptamer” is a single-stranded DNA or RNA molecule, which is highly sensitive to specific chemical or biological molecules by an evolutionary method using an oligonucleotide library called SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment). It can be obtained by separating oligomers that bind with affinity and selectivity.
  • the aptamer can specifically bind to a target and modulate the activity of the target, for example, it can block the function of the target through binding.
  • the "antibody” can effectively inhibit the activity of the MITF protein by specifically and directly binding to the MITF protein.
  • a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used as an antibody that specifically binds to the MITF protein.
  • Antibodies that specifically bind to the MITF protein may be prepared by known methods known to those skilled in the art, and commercially known MITF antibodies may be purchased and used.
  • the antibody can be prepared by injecting an immunogen MITF protein into an external host according to a conventional method known to those skilled in the art. External hosts include mammals such as mice, rats, sheep, and rabbits. Immunogens are injected by intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous injection, and can generally be administered with an adjuvant to increase antigenicity.
  • Antibodies can be isolated by collecting serum showing specific titer and antigen specificity by regularly collecting blood from an external host.
  • the MITF inhibitor may be ML-329 and/or an AMPK activator.
  • the ML-329 is a compound represented by the following [Formula 1], and inhibits the expression of the MITF gene or the activity of the MITF protein, such as transcriptional activity:
  • the AMPK activity promoter may be berberine or Kazinol U, but is not limited thereto.
  • the AMPK activity promoter inhibits the expression of the MITF gene or the activity of the MITF protein, such as transcriptional activity.
  • the "bone marrow-derived suppressor cell” or “MDSC” functions to suppress immunity by inhibiting the activity of cytotoxic T lymphocytes and NK cells. Although it has a pure function of suppressing unnecessary excessive immune reactions such as autoimmunity, there is also a dysfunctional function that causes or worsens disease by suppressing immunity when an immune response is required, or interferes with appropriate treatment.
  • MDSC is highly increased in tumor or cancer patients, which negates the efficacy of cancer vaccines by significantly reducing the effectiveness of cancer vaccine administration. In addition, it contributes to the patient's resistance to the Imuune Checkpoint Inhibitor (ICI), which is used as an anticancer immunotherapy, reducing the effectiveness of the anticancer immunotherapy.
  • ICI Imuune Checkpoint Inhibitor
  • the MDSC of the tumor-bearing individual may have a phenotype of CD11b + Gr1 + PD-L1 + , but is not limited thereto.
  • the tumor is specifically breast cancer, skin or intraocular melanoma, liver cancer, gastric cancer, colon cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, cervical cancer, ovarian cancer, colon cancer, small intestine cancer, rectal cancer , Anal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, small intestine cancer, lymph node cancer, bladder cancer, gallbladder cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue Sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, adenocarcinoma, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, bladder cancer, kidney or ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, central nervous system tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem nerve It may be a glioma or
  • the composition is preferably administered to a subject in need of inhibiting MDSC.
  • the present inventors produced a mouse bone marrow-derived MDSC by treating cells isolated from the bone marrow of a mouse with GM-CSF as a factor for inducing differentiation of MDSC.
  • the present inventors treated the cells isolated from the bone marrow of mice with GM-CSF, which is a differentiation-inducing factor of MDSC, and a tumor cell-conditioned medium (TCCM) cultured with a mouse breast cancer cell line. It was confirmed that the differentiation of MDSC was induced, the activity of MDSC was induced by TCCM, and the expression of the MITF gene and protein was increased in the MDSC in which the activity was induced. In addition, as a result of co-culturing the MDSC and T cells in which the activity was induced by the TCCM, it was confirmed that the number of CD3 + CD8 + T cells was decreased by the MDSC in which the activity was induced. Through the above results, it was confirmed that MDSC was activated in the cancer cell microenvironment to lower the immune response, and that MITF was involved in the activation of MDSC as a target factor for the activation of MDSC.
  • GM-CSF which is a differentiation-inducing factor of MDSC
  • TCCM tumor cell-
  • the present inventors obtained MDSCs from the spleen and tumor sites of tumorigenic mice, and confirmed that high activation and expression of MITF were observed in MDSCs obtained from the tumor sites. In addition, it was confirmed that MDSCs expressing MITF were increased around lung cancer and head and neck cancer tissues. Through the above results, it was confirmed that MDSC was activated in the cancer cell microenvironment, and that MITF was involved in the activation of the MDSC.
  • the present inventors treated drugs that induce MDSC activity, IL-18, IL-4, LPS, or statin-based drugs together with GM-CSF, which is a differentiation-inducing factor of MDSC, in cells isolated from the bone marrow of mice.
  • GM-CSF which is a differentiation-inducing factor of MDSC
  • the present inventors treated IBMX as a MITF inducer together with GM-CSF, which is a differentiation inducing factor of MDSC, to cells isolated from the bone marrow of mice.
  • GM-CSF which is a differentiation inducing factor of MDSC
  • IBMX a differentiation inducing factor of MDSC
  • the present inventors confirmed that MDSC is activated in the cancer cell microenvironment to lower the immune response, and MITF is involved in the activation of MDSC, and that the MITF inhibitor can be used to inhibit MDSC, so that the MITF inhibitor
  • the composition containing as an active ingredient can be usefully used to alleviate the decrease in immune response caused by MDSC and to increase the efficiency of anticancer immunotherapy.
  • composition of the present invention can be preferably formulated as a pharmaceutical composition, including at least one pharmaceutically acceptable carrier in addition to the above-described active ingredients for administration.
  • compositions formulated as liquid solutions, sterilization and biocompatible saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and One or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostatic agents may be added as necessary.
  • composition of the present invention may be prepared using a pharmaceutically suitable and physiologically acceptable adjuvant in addition to the active ingredient, and the adjuvants include excipients, disintegrants, sweetening agents, binders, coating agents, expanding agents, lubricants.
  • the adjuvants include excipients, disintegrants, sweetening agents, binders, coating agents, expanding agents, lubricants.
  • a solubilizing agent such as a lubricant or a flavoring agent may be used.
  • composition of the present invention may be formulated as an injectable formulation such as an aqueous solution, suspension, emulsion, pill, capsule, granule or tablet by additionally adding a diluent, a dispersant, a surfactant, a binder and a lubricant.
  • injectable formulation such as an aqueous solution, suspension, emulsion, pill, capsule, granule or tablet by additionally adding a diluent, a dispersant, a surfactant, a binder and a lubricant.
  • it can be preferably formulated according to disease or ingredient using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA as an appropriate method in the field.
  • composition of the present invention is a conventional intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intrasternal, transdermal, nasal, inhaled, topical, rectal, oral, intraocular or intradermal route. It can be administered in a manner.
  • the composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type of disease, severity, drug activity, Sensitivity to drugs, time of administration, route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or administered in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent, and may be administered single or multiple. It is important to administer an amount capable of obtaining the maximum effect in a minimum amount without side effects in consideration of all the above factors, and this can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the effective amount of the composition according to the present invention may vary depending on the age, sex, and body weight of the patient, and generally 0.1 mg to 100 mg per 1 kg of body weight, more specifically 0.5 mg to 10 mg daily or every other day Alternatively, it can be administered in 1 to 3 times a day. However, since it may increase or decrease according to the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, etc., the dosage amount does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the present invention contains an MITF inhibitor as an active ingredient, anticancer adjuvant;
  • a method of treating cancer comprising administering to the subject an MITF inhibitor and an anticancer agent;
  • the use of MITF inhibitors for use as anticancer adjuvants is provided.
  • the MITF inhibitor may be a gene expression inhibitor of MITF or a protein activity inhibitor of MITF.
  • the gene expression inhibitor of MITF is an antisense nucleotide complementary to the mRNA of the MITF gene, an aptamer, a small hairpin RNA (shRNA), a small interfering RNA (siRNA), a micro It may be one or more selected from the group consisting of RNA (microRNA, miRNA) and ribozyme, but is not limited thereto.
  • the protein activity inhibitor of MITF may be one or more selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics, substrate analogs, aptamers, and antibodies that specifically bind to MITF protein, but is not limited thereto.
  • the MITF inhibitor may be ML-329 and/or an AMPK activator, and specifically, the AMPK activation promoter may be berberine or kazinol U, but is not limited thereto. .
  • the anticancer adjuvant may be administered in combination with an anticancer agent, and the anticancer adjuvant suppresses the activity of MDSC to alleviate the decrease in the immune response caused by MDSC, thereby significantly increasing the effect of the anticancer agent. I can.
  • the anticancer agent may be one or more selected from the group consisting of chemotherapeutic agents, targeted therapeutic agents, antibody therapeutic agents, immunotherapy agents, and hormone therapeutic agents, but is not limited thereto.
  • the chemotherapeutic agent is, for example, an antagonist (e.g., folic acid, purine, and pyrimidine derivatives), an alkylating agent (e.g., nitrogen mustard, nitrosourea, platinum, alkyl sulfonate, hydrazine, triazene, Aziridines, spindle inhibitors, cytotoxic agents, topoisomerase inhibitors and others) or hypomethylating agents (e.g. zebulaline, isothiocyanate, azacytidine (5-azacytidine), 5-fluoro Rho-2'-deoxycytidine, 5,6-dihydro-5-azacytidine and others), but are not limited thereto.
  • an antagonist e.g., folic acid, purine, and pyrimidine derivatives
  • an alkylating agent e.g., nitrogen mustard, nitrosourea, platinum, alkyl sulfonate, hydrazine, triazen
  • the targeted therapeutic agent is an agent specific for an unregulated protein of cancer cells, for example, a tyrosine kinase inhibitor such as Axitinib, Bosutinib, and Cediranib. , Dasatinib, Erlotinib, Imatinib, Gefitinib, Lapatinib, Lestaurtinib, Nilotinib , Semaxanib, Sorafenib, Sunitinib, and Vandetanib, or cyclin-dependent kinase inhibitors such as Alvocidib and Celishic There is a rib (Seliciclib), but is not limited thereto.
  • a tyrosine kinase inhibitor such as Axitinib, Bosutinib, and Cediranib.
  • the antibody therapeutic agent is an antibody preparation that specifically binds to a protein on the surface of cancer cells, for example, Trastuzumab, Rituximab, Tositumomab, and Cetuximab. , Panitumumab, Alemtuzumab, Bevacizumab, Edrecolomab, or Gemtuzumab, but are not limited thereto.
  • the immunotherapeutic agent is an agent designed to induce the subject's own immune system to attack a tumor.
  • Ipilimumab, Avelumab, Nivolumab, or Pembrolizumab is used. However, it is not limited thereto.
  • the hormone therapy is an agent that inhibits the growth of cancer by providing or blocking a hormone in a specific cancer, for example, tamoxifen or diethylstilbestrol, but is not limited thereto.
  • the appropriate dosage of the anticancer agent is already well known in the art, it may be administered according to a standard known in the art according to the condition of each patient.
  • the specific dosage determination is within the level of those skilled in the art, and the daily dosage thereof is, for example, specifically 1 mg/kg/day to 10 g/kg/day, more specifically 10 mg/kg/day to 100 mg It may be /kg/day, but is not limited thereto, and may vary depending on various factors such as age, health status, and complications of the target to be administered.
  • the present inventors have activated MDSC in the microenvironment of cancer cells to lower the immune response, and MITF is involved in the activation of the MDSC, and the MITF inhibitor can be used to inhibit the activity of MDSC. As confirmed, the MITF inhibitor can be used as an anticancer adjuvant in anticancer immunotherapy.
  • the present invention provides a method for inhibiting MDSC, comprising administering a MITF inhibitor to an individual in need of inhibition of MDSC.
  • MITF inhibitor and the MDSC are the same as the description of the composition, and the specific description uses the above, and hereinafter, only the configuration specific to the MDSC inhibition method will be described.
  • the "bone marrow-derived suppressor cell inhibition” or “MDSC inhibition” includes not only inhibiting the activity of MDSC, but also reducing the number of MDSCs. Reducing the number includes not only inhibiting the production of cells, but also killing already produced cells or differentiating them into other cells. In addition, all mechanisms referred to as “inhibition" from a biological point of view are included.
  • the individual requiring inhibition of MDSC may be an individual having a tumor that requires inhibition of MDSC, and the MDSC of the individual having the tumor may have a phenotype of CD11b + Gr1 + PD-L1 + , It is not limited thereto.
  • the tumor is specifically breast cancer, skin or intraocular melanoma, liver cancer, gastric cancer, colon cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, cervical cancer, ovarian cancer, colon cancer, small intestine cancer , Rectal cancer, anal muscle cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, small intestine cancer, lymph adenocarcinoma, bladder cancer, gallbladder cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer , Soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, adenocarcinoma, chronic or acute leukemia, lymphocyte lymphoma, bladder cancer, kidney or ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, central nervous system tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, It may be a brains
  • the present inventors have activated MDSC in the microenvironment of cancer cells to lower the immune response, and MITF is involved in the activation of the MDSC, and the MITF inhibitor can be used to inhibit the activity of MDSC. As confirmed, the MITF inhibitor can be administered to an individual in need of inhibition of MDSC and used for treatment of MDSC-related diseases.
  • MDSC Myeloid-derived suppressor cells
  • Balb / c mice were Saeronbio. It was purchased from Inc. (Republic of Korea). Animal experiments were performed with the approval of the Institutional Ethical Committee of Sookmyung Women's University (SMWU-IACUC-1708-017-02). The thigh bones of 6 to 8-week-old Balb/c mice were excised to separate the bone marrow in the bone, and then treated with RBC lysis buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) to remove red blood cells to obtain cells.
  • RBC lysis buffer Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
  • the obtained bone marrow cells were cultured in a 24-well plate at a cell number of 5 ⁇ 10 5 cells/ml in RPMI medium (Invitrogen, Grand Island, NY) containing 10 ng/ml of GM-CSF for 96 hours to differentiate MDSC.
  • RPMI medium Invitrogen, Grand Island, NY
  • GM-CSF GM-CSF
  • mice were injected with a breast cancer cell line to prepare tumor-forming mice, and MDSCs were prepared from the tumor-forming mice.
  • tumors were formed by subcutaneous injection of 100 ⁇ l PBS containing 4T1 cells, which is a mouse breast cancer cell line, to a cell number of 5 ⁇ 10 5 cells/100 ⁇ l to the right flank to 6 to 8-week-old Balb/c mice.
  • the mice were bred in the animal laboratory of Sookmyung Women's University at a temperature of 23.5 ⁇ 1 °C and a humidity of 50 ⁇ 5% in a 12-hour light/dark cycle. After 2 weeks, the tumor, bone marrow and spleen were respectively excised and cells were isolated.
  • FACS Fluorescence-acitivated cell sorting
  • the mouse breast cancer cell line 4T1 cells 10% fetal bovine serum (FBS), 100 units of RPMI medium (Invitrogen, Grand Island, NY) containing 10 ml of 5% CO 2 , 37 °C 3 under conditions Incubated for days to bring the cells to 80% saturation. Then, the culture medium was recovered and concentrated with a 3000 NMWL (nominal molecular weight limit) centrifugal filter (Merck Milipore, Billerica, MA) at 3000 ⁇ g for 20 minutes in a centrifuge maintained at 4°C, and concentrated with a TCCM (tumor cell-conditioned medium). was obtained.
  • FBS fetal bovine serum
  • RPMI medium Invitrogen, Grand Island, NY
  • the obtained TCCM and GM-CSF at a concentration of 10 ng/ml were included in a 24-well plate with a cell number of 5 ⁇ 10 5 cells/ml. It was cultured in RPMI medium for 96 hours to induce differentiation of MDSC. As a control, MDSC induced differentiation with RPMI medium containing GM-CSF was used.
  • the MDSCs induced differentiation were recovered, stained with fluorescence-conjugated anti-CD11b antibody and anti-Gr1 antibody, and then FACS analysis was performed (FIG. 2A).
  • the differentiation-induced MDSC was recovered and qRT-PCR was performed for iNOS, IL-10, and TGF- ⁇ , which are MDSC activity markers.
  • the MDSC induced differentiation was recovered, and total RNA was isolated using TRIzol Reagent Solution (Invitrogen) according to the manufacturer's procedure. Then, qRT-PCR was performed using the isolated total RNA.
  • MITF microphthalmia-associated transcription factor
  • qRT-PCR for MITF was performed in the same manner as described in Example ⁇ 2-1> using the MDSC recovered in Example ⁇ 2-1> to confirm the gene expression of MITF.
  • Primers for MITF were purchased from Bioneer (Fig. 3A).
  • Example ⁇ 2-1> Western blotting was performed using the MDSC recovered in Example ⁇ 2-1> to confirm the protein expression of MITF.
  • the MDSC recovered in Example ⁇ 2-1> was treated with a cell lysis buffer and lysed. Cell lysates were separated by electrophoresis with 10% SDS-PAGE gel, and transferred to a PVDF membrane. Then, after reacting by treating an anti-MITF antibody and an anti-actinin antibody with a primary antibody, an HRP-conjugated secondary antibody is attached to the primary antibody attached to the membrane, and this is enhanced chemiluminescence (PicoEPDTM Western Reagent kit).
  • MITF is a target factor specifically expressed in MDSCs induced by TCCM.
  • MDSC is known to lower the immune response by inhibiting the proliferation and function of T cells. Accordingly, in order to find out whether the immune response is lowered by MDSC in the cancer cell microenvironment, the degree of inhibition of T cell proliferation was confirmed using MDSC treated with a culture medium in which cancer cells were cultured.
  • mice Specifically, cells isolated from the spleen of tumorigenic mice according to the manufacturer's procedure using a MACS cell separation kit (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany) were separated in a 24-well plate with a cell number of 5 ⁇ 10 5 cells/ml. The differentiation and activity of MDSCs were induced by culturing for 24 hours in RPMI medium containing TCCM obtained in Example ⁇ 2-1> and GM-CSF at a concentration of 10 ng/ml.
  • MACS cell separation kit Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany
  • T cells In addition, in order to obtain T cells, the spleens of 6 to 8 week old Balb/c mice were excised and the cells were isolated. Then, after staining using a fluorescently-conjugated anti-CD3 antibody, T cells were isolated using FACS. The separated T cells were stained with 2.5 ⁇ M CFSE for 7 minutes to perform CFSE labeling. 5 ⁇ 10 5 CFSE-labeled CD3 + T cells were stimulated for 2 hours on a plate coated with an anti-CD3 monoclonal antibody and a soluble anti-CD28 monoclonal antibody, and then the cells isolated from the spleen of the tumorigenic mice MDSC obtained by inducing differentiation and activity (FIG.
  • Example ⁇ 2-1> (FIG. 4B) and MDSC recovered in Example ⁇ 2-1> (FIG. 4B) were put in 5 ⁇ 10 5 cells or 10 ⁇ 10 5 cells, and for 3 days Cultured. After 3 days of culture, staining was performed using a fluorescently-conjugated anti-CD8 antibody, and then FACS analysis was performed to measure the degree of proliferation of CD8 + T cells.
  • the antibody was purchased from eBioscience.
  • MDSC is activated in the cancer cell microenvironment to lower the immune response
  • MITF is involved in the activation of MDSC as a target factor for the activation of the MDSC.
  • MDSC in tumorigenic mice was used to confirm its activity and changes in gene expression of MITF.
  • qRT-PCR was performed in the same manner as described in Example ⁇ 2-2> using the recovered CD11b + Gr1 + MDSC to confirm the gene expression of MITF (Fig. 5C).
  • MDSC is activated in the cancer cell microenvironment, and that MITF is involved in the activation of the MDSC.
  • tissue staining was performed on each of 10 samples of tissues around lung cancer and head and neck cancer tissues and correspondingly non-cancer lymph node tissues at Seoul National University Pathology Department (Prof. Yoon Kyung Jeon). Specifically, after fixing the tissue in 4% formaldehyde solution, it was dehydrated in ethanol (70-100%) by concentration and embedded in paraffin. The tissue was sectioned with a microtome (thickness 4 ⁇ m) and stained (H&E) with hematoxylin and eosin. The cross section was observed with an optical microscope (Olympus, Japan) and photographed at x400 magnification.
  • tissue sections were blocked with 3% normal horse serum diluted in PBS for 30 minutes. Block the sections and dilute the appropriate dilution factor (1:100) with CD11b, CD14, MITF antibodies (anti-mouse monoclonal primary antibody (Cat.No 790-4367), Ventana Medical Systems, Oro Valley, AZ) overnight at 4°C. ). After washing the slides with PBS, the avidin-biotin-peroxidase complex (ABC; Vector Laboratories, Burlingame, CA) was washed.
  • ABS avidin-biotin-peroxidase complex
  • the slides were washed, and the peroxidase reaction was developed with diaminobenzidine and peroxide, and aqua- Mounted on a mount (Aqua-Mount) and evaluated under a light microscope (Olympus) ⁇ 400.
  • HPF high power field
  • Example ⁇ 1-1> After obtaining bone marrow cells by the same method as described in Example ⁇ 1-1>, IL-18 at a concentration of 10 or 50 ng/ml in a 24-well plate with a cell number of 5 ⁇ 10 5 cells/ml, And 10 ng/ml of GM-CSF-containing RPMI medium was cultured for 96 hours to induce differentiation of MDSC (FIGS. 6A and 6B ).
  • the differentiation of MDSC was induced by culturing with RPMI medium containing GM-CSF for 96 hours, and IL-18 at a concentration of 10 or 50 ng/ml was added for 24 hours. Treated (Fig. 6C and Fig. 6D).
  • MDSC induced differentiation with RPMI medium containing GM-CSF was used.
  • the differentiation-induced MDSCs were recovered and FACS analysis was performed in the same manner as described in Example ⁇ 2-1> to confirm the differentiation of MDSCs (FIGS. 6A and 6C).
  • Example ⁇ 2-1> the differentiation and activity of MDSC were induced, but 10 ng/ml of IL-4 was treated with a drug that induces the activity.
  • the differentiation-induced MDSC was recovered and FACS analysis was performed in the same manner as described in Example ⁇ 2-1> to confirm the differentiation of MDSC (Fig. 7A).
  • Example ⁇ 2-1> the differentiation and activity of MDSC were induced, but 100 ng/ml of LPS was treated with a drug that induces the activity.
  • the differentiation-induced MDSCs were recovered, and FACS analysis was performed in the same manner as described in Example ⁇ 2-1> to confirm the differentiation of MDSCs (Fig. 8A).
  • Simvastatin a statin-based drug, is known to induce the activity of MDSC by inhibiting the expression of IRF4 (Interferon regulatory factor 4). Accordingly, a statin drug was treated with a drug that induces the activity of MDSC, and after inducing the differentiation of MDSC, the change in gene expression of MITF was confirmed.
  • the differentiation and activity of MDSC are induced, but as drugs that induce the activity, simvastatin (Sim, 0.5 or 1 ⁇ M), lovastatin (Lovastatin, Lova, 0.5 or 1 ⁇ M), Provastatin (Pravastatin, Prav, 5 or 10 ⁇ M), Rosuvastatin (Rosu, 0.5 or 1 ⁇ M), or atorvastatin (Atorvastatin, Ator, 0.05 or 0.1 ⁇ M) were treated (Fig. 9 And FIG. 10).
  • Example ⁇ 1-1> it was cultured with RPMI medium containing GM-CSF for 96 hours to induce differentiation of MDSC, and the statin drug was treated for 24 hours (Fig. 11 and Fig. 12).
  • MDSC was recovered, and the differentiation of MDSCs (Figs. 9 and 11) was confirmed by the same method as described in Examples ⁇ 2-1> and ⁇ 2-2>.
  • the activity of MDSC (FIGS. 10A and 12A) was confirmed in the simvastatin or lovastatin 1 ⁇ M-treated group, and gene expression of MITF (FIGS. 10B and 12B) was confirmed.
  • ATRA all-trans retinoic acid
  • Example ⁇ 1-1> After obtaining bone marrow cells by the same method as described in Example ⁇ 1-1>, ATRA (0.5 or 1 ⁇ M) and 10 ng/ml in a 24-well plate with a cell number of 5 ⁇ 10 5 cells/ml The differentiation of MDSC was induced by incubating for 96 hours in RPMI medium containing GM-CSF at a concentration (FIG. 13).
  • the differentiation-induced MDSCs were recovered and FACS analysis was performed in the same manner as described in Example ⁇ 2-1> to confirm the differentiation of MDSCs (Fig. 13A).
  • IBMX induces the expression of MITF in melanoma cells. Accordingly, in order to examine the effect of the expression or regulation of MITF on MDSC activity, changes in the activity of MDSC treated with IBMX as an MITF expression inducing agent and changes in T cell proliferation by the MDSC were confirmed.
  • Example ⁇ 1-1> after obtaining bone marrow cells by the same method as described in Example ⁇ 1-1>, in a 24-well plate with a cell number of 5 ⁇ 10 5 cells/ml, IBMX at a concentration of 10 ⁇ M and a concentration of 10 ng/ml The differentiation of MDSC was induced by incubating for 96 hours in RPMI medium containing GM-CSF. As a control, MDSC induced differentiation with RPMI medium containing GM-CSF was used.
  • the differentiation-induced MDSCs were recovered, and FACS analysis was performed in the same manner as described in Example ⁇ 2-1> to confirm the differentiation of MDSCs (Fig. 14A).
  • FIG. 14 it was confirmed that the differentiation of MDSC was induced in both the control group and the IBMX-treated group to a similar degree (FIG. 14A).
  • the IBMX treatment group it was confirmed that the gene and protein expression of MITF increased compared to the control group (FIG. 14C), and the activity of MDSC increased (FIG. 14B and FIG. 14C).
  • the activity of MDSC activity was increased to inhibit T cell proliferation (FIG. 14D).
  • Berberine, Kazinol U, and the like are known to inhibit the expression or activity of MITF in melanocytes while being AMPK activators. Accordingly, in order to examine the effect of the regulation of MITF expression or activity on MDSC activity, changes in the activity of MDSC treated with berberine as an MITF inhibitor were confirmed.
  • Example ⁇ 1-1> After bone marrow cells were obtained by the same method as described in Example ⁇ 1-1>, 10 ⁇ M berberine and 10 ng/ml concentration in a 24-well plate with a cell number of 5 ⁇ 10 5 cells/ml The differentiation of MDSC was induced by incubating for 96 hours in RPMI medium containing GM-CSF. As a control, MDSC induced differentiation with RPMI medium containing GM-CSF was used.
  • the MDSC induced differentiation was recovered, and qRT-PCR was performed in the same manner as described in Example ⁇ 2-2> to confirm the expression of MITF (FIG. 15A).
  • FIG. 15 in the case of the berberine-treated group, it was confirmed that the expression of MITF was suppressed by berberine (FIG. 15A), and the differentiation of MDSC was somewhat reduced (FIG. 15B). In addition, in the case of the berberine treatment group, it was confirmed that the activity of MDSC was significantly inhibited compared to the control group (FIG. 15C).
  • ML-329 is known to suppress the expression of MITF by inhibiting the TRPM-1 promoter activity in melanocytes. Accordingly, in order to examine the effect of the regulation of MITF expression or activity on MDSC activity, changes in the activity of MDSC treated with ML-329 as an MITF inhibitor and changes in T cell proliferation by the MDSC were confirmed.
  • Example ⁇ 1-1> After bone marrow cells were obtained by the same method as described in Example ⁇ 1-1>, ML-329 (Cayman Chemical) at a concentration of 0.5 or 1 ⁇ M in a 24-well plate with a cell number of 5 ⁇ 10 5 cells/ml. , Ann Arbor, MI) and 10 ng/ml of GM-CSF-containing RPMI medium was cultured for 96 hours to induce differentiation of MDSC. As a control, MDSC induced differentiation with RPMI medium containing GM-CSF was used. Then, the differentiation-induced MDSC was recovered and qRT-PCR was performed in the same manner as described in Examples ⁇ 2-1> and ⁇ 2-2> to confirm the activity of MDSC (Fig. 17A) and MITF expression. (Fig. 17B).
  • bone marrow cells were obtained by the same method as described in Example ⁇ 1-1>, and then the number of cells was 5 ⁇ 10 5 cells/ml.
  • a 24-well plate 96 with RPMI medium containing 0.5, 1 or 2 ⁇ M concentration of ML-329 (Cayman Chemical), TCCM obtained in Example ⁇ 2-1>, and 10 ng/mL concentration of GM-CSF. Differentiation of MDSC was induced by incubation for a period of time. As a control, MDSC induced differentiation with RPMI medium containing GM-CSF was used.
  • Figs. 17 and 18 in the case of the ML-329 treatment group, it was confirmed that MITF expression was inhibited by ML-329 and the activity of MDSC was inhibited (FIGS. 17A and 17B ).
  • MDSC activity by TCCM is inhibited (FIGS. 18B and 18C)
  • MITF expression is inhibited (FIG. 18C)
  • T cell proliferation is increased by inhibition of MDSC activity by ML-329. It was confirmed (Fig. 18D).
  • MDSC is known to inhibit various processes from proliferation to function of T cells by making reactive oxygen species (ROS) or reactive nitrogen species (RNS). Accordingly, in order to examine the effect of the regulation of MITF expression or activity on MDSC activity, changes in ROS production were confirmed in MDSC treated with berberine or ML-329 as an MITF inhibitor.
  • ROS reactive oxygen species
  • RNS reactive nitrogen species
  • MDSC was isolated from the spleen of the tumorigenic mouse of Example ⁇ 1-2>, berberine at a concentration of 10 ⁇ M or ML-329 at a concentration of 1 ⁇ M, TCCM and 10 obtained in Example ⁇ 2-1>
  • the differentiation of MDSC was induced by incubating for 48 hours in RPMI medium containing GM-CSF at a concentration of ng/ml.
  • the MDSCs were collected and dispensed at 1 ⁇ 10 5 cells, and LPS was treated at a concentration of 100 ng/ml for 24 hours.
  • the ROS inhibitor NAC N-acetyl-cysteine
  • DCF-DA was added and reacted at 37° C. for 30 minutes, and the degree of ROS production was measured by flow cytometry.
  • ROS production by MDSC was inhibited in the case of berberine or ML-329 treatment group, and ROS was strongly inhibited when ROS inhibitor was treated together.
  • RNA interference RNA interference
  • CRISPR CRISPR
  • a CRISPR vector specifically pLentiCRISPR-E vector
  • pLentiCRISPR-E vector was added to the bone marrow cells of 1 ⁇ 10 6 cells/ml.
  • the sgRNA was cloned; MITF gRNA FW oligo: 5'-CACCGTAAGGACTTCCATCGGCACC-3' (SEQ ID NO: 1), MITF gRNA RV oligo: 5'-AAACGGTGCCGATGGAAGTCCTTAC-3' (SEQ ID NO: 2).
  • non-target control gRNA was cloned into the pLentiCRISPR-E vector; non-target control sgRNA: 5'-CACCGGTATTACTGATATTGGTGGG-3' (SEQ ID NO: 3).
  • the cloned construct was transfected using lipofectamine according to the manufacturer's procedure. After 24 hours of transfection, the differentiation of MDSC was induced by incubating with RPMI medium containing TCCM obtained in Example ⁇ 2-1> and 10 ng/ml of GM-CSF for 72 hours. 72 hours after transfection, MDSC was recovered, and the method described in ⁇ 2-2> and Western blotting were performed to confirm the expression of MITF and MDSC activity (FIG. 20A). In addition, the degree of ROS production by MDSC was measured by the same method as described above (Fig. 20B), and the degree of T cell proliferation by MDSC was measured by the same method as described in Example ⁇ 2-3> ( Figure 20C).
  • MITF plasmid DNA (Addgene, Cambridge, MO) was transfected into bone marrow cells having a cell number of 1 ⁇ 10 6 cells/ml using lipofectamine according to the manufacturer's procedure. After 24 hours of transfection, the differentiation of MDSC was induced by incubating for 72 hours in RPMI medium containing 10 ng/ml of GM-CSF. Three days after transfection, MDSCs were recovered and the expression of MITF (FIG. 20D) and the degree of T cell proliferation by MDSC (FIG. 20E) were measured as described above.
  • FIG. 20A it was confirmed that MITF expression and MDSC activity were inhibited in MDSC using MITF shRNA and CRISPR technology (FIG. 20A), and ROS generation by MDSC was inhibited by inhibition of MITF expression ( 20B), it was confirmed that T cell inhibition by MDSC was alleviated (FIG. 20C). On the other hand, it was confirmed that in the MDSC overexpressing MITF, contrary results appeared (FIGS. 20D and 20E).
  • Example 7> it was confirmed that the MDSC activity was inhibited by the MITF inhibitor. Accordingly, in order to examine the effect of the decrease in MDSC activity in tumorigenic mice, changes in tumor growth were confirmed after administering MDSCs whose activity was decreased by MITF inhibitors to tumorigenic mice.
  • MDSC was isolated from the spleen of tumor-forming mice prepared by the same method as described in Example ⁇ 1-2>. Then, in the same manner as in Example ⁇ 7-2>, 1 ⁇ M concentration of ML-329, TCCM obtained in Example ⁇ 2-1>, and 10 ng/mL concentration of GM-CSF were included. The differentiation of MDSC was induced by incubating for 48 hours with the prepared RPMI medium. After 48 hours, the MDSC + 4T1-luc (5 ⁇ 10 4 + 2.5 ⁇ 10 5 /100 ⁇ l) was injected subcutaneously on the left flank of the mouse.
  • the composition containing the MITF inhibitor can be administered to an individual in need of inhibition of MDSC, such as a tumor-bearing individual, and can be usefully used to alleviate the decrease in immune response caused by MDSC.
  • the composition containing the MITF inhibitor can be used in combination with an anticancer agent, such as an anticancer immunotherapy agent, to increase the efficiency of anticancer immunotherapy.
  • the present invention relates to a composition for inhibiting myeloid-derived suppressor cells (MDSC) containing a microphthalmia-associated transcription factor (MITF) inhibitor as an active ingredient, wherein the composition containing the MITF inhibitor as an active ingredient
  • MDSC myeloid-derived suppressor cells
  • MITF microphthalmia-associated transcription factor

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Abstract

본 발명은 MITF(microphthalmia-associated transcription factor) 억제제를 유효성분으로 함유하는 골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSC) 저해용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 암세포 미세환경에서 MDSC가 활성화되어 면역반응이 저하되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하며, 상기 MITF의 억제제를 이용하여 MDSC를 저해할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 MITF 억제제를 유효성분으로 함유하는 조성물을 MDSC에 의한 면역반응 저하를 완화하고, 항암 면역치료 효율을 증대하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Description

MITF 억제제를 유효성분으로 함유하는 골수-유래 억제세포 저해용 조성물
본 발명은 MITF(microphthalmia-associated transcription factor) 억제제를 유효성분으로 함유하는 골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cell) 저해용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 MITF 억제제를 유효성분으로 함유하는 골수-유래 억제세포에 의한 면역반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
골수성 세포(myeloid cells)는 조혈모줄기세포(hematopoietic stem cell)에서 기원한다. 이는 우리 몸에 가장 많이 존재하는 조혈모세포로, 골수 및 림프 조직에 주로 존재한다. 최종적으로는 대식세포(macrophage), 수지상세포(dendritic cell) 그리고 과립구(granulocyte)로 분화하나, 이들은 특정 계층 구조를 띄지 않고 다양한 단계의 분화도를 가진 골수성 세포가 조직과 환경에 특이적으로 다양하게 분포되는 특징을 가지고 있다.
골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSC)는 골수성 세포 중에서 면역반응 억제 작용을 가진 세포들로서, 매우 광범위한 미분화 골수성 세포를 포함하는 세포군이다. MDSC는 여러 전사 인자들을 통해 활성화가 매개되고, 그 결과 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이나 활성질소종(reactive nitrogen species, RNS)이 생산되어 T 세포의 증식에서부터 기능까지 다양한 과정을 저해하여 T 세포를 효과적으로 억제하는 것으로 알려져 있다. 이러한 MDSC의 작용이 자가면역반응을 억제하는 점에서는 유익하지만, MDSC의 축적으로 면역 억제 환경이 지속되면 생체가 지속적으로 알러젠 및/또는 바이러스 감염에 노출되고, 이를 인해 만성 염증이 나타날 수 있다. 생체가 효과적인 면역반응을 할 수 없게 되면 만성 염증 시 조직 손상이 일어나게 될 수 있다. 또한, MDSC는 암세포 미세환경(tumor microenvironment, TME)에서 종양 세포의 침입 및 전이를 보조하는 것이 확인되었다.
이러한 MDSC의 기능과 작용 기전에 대한 연구를 바탕으로 최근에는 이들의 조절을 통해 새로운 암 치료법을 개발하고자 하는 노력이 가속화되고 있다. 대표적으로 젬시타빈(Gemcitabine) 및 5-플루오로우라실(5-fluorouracil, 5-FU)은 MDSC를 직접적으로 감소시키는 화학요법제로 알려져 있다.
또한, MDSC의 빈도 및 기능이 최근 임상에서 항암면역치료제로 활발하게 사용되고 있는 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor, ICI)에 대한 환자의 내성에 기여하는 것이 알려지면서, MDSC의 중요성이 강조되고 있다. ICI는 암세포에 의한 T 세포의 억제를 막아줌으로써 암 환자의 항암 면역반응을 향상시킨다. 실제로 CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) 및 PD-1(programmed cell death protein) 및 PD-L1(programmed cell death ligand 1)을 표적으로 하는 다양한 항체들이 악성흑색종, 편평비소세포폐암 및 신장암 등의 치료 목적으로 허가된 바 있다. 그러나 최대 80%에 달하는 많은 환자들이 이러한 치료법에 반응하지 않는 것으로 알려져 있고, 그 주된 원인으로 TME를 구성하는 면역억제세포들 때문이라고 추정되고 있다. ICI 치료 효능에 영향을 주는 TME에서의 면역억제세포들은 Treg 세포, MDSC, TH2 CD4+ 세포, CAF(cancer-associated fibroblast) 및 M2로 분극된 TAM(tumor-associated macrophage)이 잘 알려져 있다. 특히, MDSC를 결핍시키면 항암면역반응이 증강되어 ICI에 대하여 내재되어 있던 저항성이 극복된다는 결과들이 보고되면서, MDSC를 ICI 치료에서의 중요한 예후인자로서 사용할 수 있음이 강조되고 있다.
한편, ICI에 대한 비반응 또는 낮은 반응성을 극복하기 위해 최근 다른 종류의 ICI와 조합하여 병용 치료하는 방법이 시도되고 있으며, 이 경우 단일치료(monotherapy)에 비해 임상적 이득이 의미 있게 높아짐이 보고되었다. 또한, 항-CTLA4와 항-PD-1의 병용, 항-PD-1과 IL-2R 작용제(agonist)의 병용, VEGF 억제제 또는 케모카인(chemokine) 조절제와 ICI의 병용, 항-CTLA4와 CTL 치료제의 병용 등이 임상 연구되고 있다. 나아가 방사선 치료와 함께 ICI를 투여하거나, ICI와 저농도의 다양한 기존 화학요법제 또는 표적 항암제를 병용하여 T 세포의 활성화와 종양으로의 침투를 유도함으로써, 치료반응을 높이고 항암면역반응의 효과를 상승시키기 위한 다양한 시도들도 이루어지고 있다.
MITF(microphthalmia-associated transcription factor)는 헬릭스-루프-헬릭스 루신 지퍼(Helix-loop-helix leucine zipper)를 함유한 전사인자로서 멜라노사이트(Melanocyte)와 멜라노마(Melanoma)의 생존과 분화를 조절하며 멜라닌 형성 기전에 관여하는 것으로 알려져 있다. MITF에 대한 연구 결과는 최근에 보고되기 시작했는데, LXR(Liver X receptor)이 활성화되면 MITF의 분해를 촉진하여 멜라닌합성(Melanogenesis)이 저해된다는 것이 알려져 있으나, MDSC에서 MITF의 역할에 대해서는 아직 밝혀진 바 없다.
이에 본 발명자들은 MDSC 저해를 통한 MDSC의 면역반응 저하를 완화하고, 항암면역치료제의 치료 효과를 향상시킬 수 있는 제제를 개발하기 위해 노력한 결과, 암세포 미세환경에서 MDSC가 활성화되어 면역반응이 저하되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하며, 상기 MITF의 억제제를 이용하여 MDSC를 저해할 수 있음을 확인한 것에 기초하여 상기 MITF 억제제를 MDSC의 면역반응 저하의 완화 및 항암 면역 치료에 이용할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
국제 공개특허 제2013-082591호
국제 공개특허 제2011-116299호
대한민국 등록특허 제1902355호
대한민국 등록특허 제1826753호
[비특허문헌]
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본 발명의 목적은 골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cell)를 저해하는 MITF(microphthalmia-associated transcription factor) 억제제를 유효성분으로 함유하는, 골수-유래 억제세포에 의한 면역반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 MITF 억제제를 유효성분으로 함유하는, 항암 보조제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 MITF 억제제를 골수-유래 억제세포의 저해가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골수-유래 억제세포 저해방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 MITF(microphthalmia-associated transcription factor) 억제제를 유효성분으로 함유하는, 골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cell)에 의한 면역반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 MITF 억제제를 유효성분으로 함유하는, 항암 보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은 MITF 억제제를 골수-유래 억제세포의 저해가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골수-유래 억제세포 저해방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 MITF 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골수-유래 억제세포에 의한 면역반응 저하의 완화 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 MITF 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골수-유래 억제세포에 의한 면역반응 저하의 예방 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 MITF 억제제 및 항암제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 골수-유래 억제세포에 의한 면역반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 조성물로 사용하기 위한 MITF의 용도를 제공한다.
아울러, 본 발명은 항암 보조제로 사용하기 위한 MITF의 용도를 제공한다.
본 발명자들은 암세포 미세환경에서 골수-유래 억제세포(Myeloid-derived suppressor cell, MDSC)가 활성화되어 면역반응이 저하되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)가 관여하며, 상기 MITF의 억제제를 이용하여 MDSC를 저해할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 MITF 억제제를 유효성분으로 함유하는 조성물을 MDSC에 의한 면역반응 저하를 완화하고, 항암 면역치료 효율을 증대하는데 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 마우스의 골수유래 골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cell, MDSC) 제작방법을 모식화한 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 분화 유도 인자인 GM-CSF와 함께 암세포를 배양한 배지(tumor cell-conditioned medium; TCCM)를 처리한 후 MDSC의 분화(도 2A) 및 활성(도 2B) 변화를 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 GM-CSF와 함께 TCCM을 처리한 후 MDSC에서 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)의 유전자(도 3A) 및 단백질(도 3B) 발현 변화를 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 종양형성 마우스의 비장에서 분리한 세포(도 4A) 또는 마우스의 골수에서 분리한 세포(도 4B)에 GM-CSF와 함께 TCCM을 처리하여 MDSC의 분화 및 활성을 유도한 후, MDSC의 T 세포 증식 억제 변화를 확인한 도이다.
도 5는 종양 형성 마우스에서 MDSC의 분화(도 5A), 활성(도 5B) 및 MITF 유전자 발현(도 5C) 변화를 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 활성을 유도하는 약물로 IL-18을 GM-CSF와 함께 96시간 처리한 후(도 6A 및 도 6B) 또는 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 GM-CSF을 처리하여 분화를 유도한 이후 IL-18을 24시간 동안 처리한 후(도 6C 및 도 6D), MDSC의 분화(도 6A 및 도 6C), 활성 및 MITF의 유전자 발현(도 6B 및 도 6D) 변화를 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 활성을 유도하는 약물로 IL-4를 GM-CSF와 함께 처리한 후 MDSC의 분화(도 7A), 활성(도 7B) 및 MITF의 유전자 발현(도 7C) 변화를 확인한 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 활성을 유도하는 약물로 LPS를 GM-CSF와 함께 처리한 후 MDSC의 분화(도 8A), 활성(도 8B) 및 MITF의 유전자 발현(도 8C) 변화를 확인한 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 활성을 유도하는 약물로 심바스타틴(Simvastatin, Sim), 로바스타틴(Lovastatin, Lova), 프로바스타틴(Pravastatin, Prav), 로수바스타틴(Rosuvastatin, Rosu), 또는 아토바스타닌(Atorvastatin, Ator)을 GM-CSF와 함께 처리한 후 MDSC의 분화 변화를 확인한 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 활성을 유도하는 약물로 심바스타틴(Simvastatin, Sim) 또는 로바스타틴(Lovastatin, Lova)을 GM-CSF와 함께 처리한 후 MDSC의 활성(도 10A) 및 MITF의 유전자 발현(도 10B) 변화를 확인한 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 GM-CSF를 처리하여 분화를 유도한 이후, MDSC의 활성을 유도하는 약물로 심바스타틴(Simvastatin, Sim), 로바스타틴(Lovastatin, Lova), 프로바스타틴(Pravastatin, Prav), 로수바스타틴(Rosuvastatin, Rosu), 또는 아토바스타닌(Atorvastatin, Ator)을 24시간 동안 처리한 후 MDSC의 분화 변화를 확인한 도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 GM-CSF를 처리하여 분화를 유도한 이후, MDSC의 활성을 유도하는 약물로 심바스타틴(Simvastatin, Sim) 또는 로바스타틴(Lovastatin, Lova)을 24시간 동안 처리한 후 MDSC의 활성(도 12A) 및 MITF의 유전자 발현(도 12B) 변화를 확인한 도이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 활성을 억제하는 약물로 ATRA(All-trans retinoic acid)를 GM-CSF와 함께 처리한 후 MDSC의 분화(도 13A), 활성(도 13B) 및 MITF의 유전자 발현(도 13C) 변화를 확인한 도이다.
도 14는 본 발명의 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MITF 유도제로 IBMX를 GM-CSF와 함께 처리한 후 MDSC의 분화(도 14A), MDSC의 활성 및 MITF의 유전자 발현(도 14B 및 14C), 및 MDSC의 T 세포 증식 억제(도 14D) 변화를 확인한 도이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MITF 억제제로 베르베린(Berberine)을 GM-CSF와 함께 처리한 후 MITF의 유전자 발현(도 15A), MDSC의 분화(도 15B) 및 활성(도 15C) 변화를 확인한 도이다.
도 16은 폐암 및 두경부암(H&N cancer) 조직에서 MITF를 발현하는 MDSC의 분포를 확인한 도이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MITF 억제제로 ML-329를 GM-CSF와 함께 처리한 후 MDSC의 활성(도 17A) 및 MITF의 유전자 발현(도 17B) 변화를 확인한 도이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스의 골수에서 분리한 세포에 ML-329를 GM-CSF 및 TCCM과 함께 처리한 후 MDSC의 분화(도 18A), 활성 및 MITF의 유전자 및 단백질 발현(도 18B 및 도 18C), MDSC의 T 세포 증식 억제(도 18D) 변화를 확인한 도이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따라 종양형성 마우스의 비장에서 분리한 MDSC에 ML-329 또는 베르베린(BBR)을 GM-CSF 및 TCCM과 함께 처리한 후 MDSC의 ROS 생성 변화를 확인한 도이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따라 MITF 발현을 억제한 MDSC에서 MITF의 단백질 발현(도 20A), MDSC의 ROS 생성(도 20B) 및 T 세포 증식 억제(도 20C) 변화를 확인하고, 본 발명의 일 실시예에 따라 MITF를 과발현한 MDSC에서 MITF의 단백질 발현(도 20D) 및 MDSC의 T 세포 증식 억제(도 20E) 변화를 확인한 도이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따라 종양 형성 마우스에 ML-329를 GM-CSF 및 TCCM과 함께 처리한 MDSC를 투여하는 방법(도 21A), 상기 종양 형성 마우스에서 종양 부피 변화(도 21B 및 도 21C)) 및 상기 종양 형성 마우스의 종양 조직에서 MDSC의 population 변화(도 21D)를 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 MITF(Microphthalmia-associated transcription factor) 억제제를 유효성분으로 함유하는, 골수-유래 억제세포(Myeloid-derived suppressor cell, MDSC)에 의한 면역반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 조성물; MITF 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, MDSC에 의한 면역반응 저하의 완화, 치료 또는 예방 방법; MDSC에 의한 면역반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 조성물로 사용하기 위한 MITF 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명에서, 상기 "MITF 억제제"는 MITF 발현 또는 활성 억제를 통해 MDSC의 활성을 억제하는 목적을 달성할 수 있는 물질을 제한 없이 포함할 수 있다. 구체적으로, MITF 억제제는 MITF의 유전자 발현 억제제 또는 MITF의 단백질 활성 억제제일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 MITF의 유전자 발현 억제제는 MITF 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 앱타머, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA, shRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 마이크로 RNA(microRNA, miRNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "안티센스 뉴클레오타이드"는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오타이드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오타이드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오타이드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오타이드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오타이드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오타이드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.
상기 "짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA)" 또는 "shRNA"는 단일 가닥으로 50-60개로 구성된 뉴클레오타이드를 의미하며, in vivo에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루고 있다. 즉, shRNA는 RNA간섭(RNA interference; RNAi)을 통해 유전자 발현을 억제하기 위한 타이트한 헤어핀 구조를 만드는 RNA 서열이다. 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 15-30개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성한다. shRNA는 일반적으로 발현되도록 하기 위하여 U6 프로모터를 포함하는 벡터를 통해 세포 내로 형질도입되며 대개 딸세포로 전달되어 유전자 발현억제가 유전되도록 한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 기작에 의하여 절단되어 siRNA가 된 후 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합한다. 이들 RISC는 mRNA에 결합하여 이를 절단한다. shRNA는 RNA 폴리머레이즈(polymerase)에 의해 전사된다.
상기 "작은 간섭 RNA(small interfering RNA)" 또는 "siRNA"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNA간섭 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.
상기 "마이크로 RNA(microRNA)" 또는 "miRNA"는 약 22개의 염기서열로 이루어진 짧은 non-coding RNA를 의미한다. 유전자의 발현 과정에서 전사 후 조절인자(post-transcriptional regulator)로서 기능을 한다고 알려져 있다. 상보적인 염기 서열을 가진 표적(target) mRNA에 상보적으로 결합함으로써 표적 mRNA들을 분해시키거나 단백질로 번역되는 것을 억제한다.
또한, 상기 MITF의 단백질 활성 억제제는 MITF 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질 유사체, 앱타머, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "펩티드 모방체(peptide mimetics)"는 MITF 단백질의 결합 도메인을 억제하여 MITF 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 펩티드 모방체는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, "구조적으로 강제된(conformationally constrained)" 펩티드, 사이클릭 모방체(cyclic mimetics), 적어도 하나의 엑소사이클릭 도메인(exocyclic domain), 결합 부분(결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 모방체일 수 있다. 펩티드 모방체는 MITF 단백질의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체 또는 수용성 수용체와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며, 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다.
상기 "앱타머(aptamer)"는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다. 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적의 기능을 차단할 수 있다.
상기 "항체"는 MITF 단백질에 특이적이고 직접적으로 결합하여 MITF 단백질의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 MITF 단백질에 특이적으로 결합하는 항체로는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 사용할 수 있다. 상기 MITF 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며, 상업적으로 알려진 MITF 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 MITF 단백질을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 랫트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근육 내,복강 내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여할 수 있다. 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형성된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리할 수 있다.
또한, 상기 MITF 억제제는 ML-329 및/또는 AMPK 활성촉진제(activator)일 수 있다. 구체적으로, 상기 ML-329는 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물로, MITF 유전자의 발현 또는 MITF 단백질의 활성, 예컨대 전사활성을 억제한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2020010480-appb-I000001
또한, 상기 AMPK 활성촉진제는 베르베린(Berberine) 또는 카지놀 U(Kazinol U)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 AMPK 활성촉진제는 MITF 유전자의 발현 또는 MITF 단백질의 활성, 예컨대 전사활성을 억제한다.
본 발명에서, 상기 "골수-유래 억제세포" 또는 "MDSC"는 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocyte), NK 세포의 활성을 저해함으로써 면역을 억제하는 기능을 한다. 자가면역과 같이 불필요한 과도한 면역반응을 억제하는 순기능이 있지만, 면역반응이 필요한 상황에서 면역을 억제하여 질병을 발생시키거나 악화시키거나 또는 적절한 치료를 방해하는 역기능도 있다. 예컨대, MDSC는 종양 또는 암 환자에서 많이 증가되어 있는데, 이는 암 백신 투여의 효과를 현저히 감소시킴으로써 암 백신의 효능을 무력화시킨다. 또한, 항암 면역 치료제로 사용되고 있는 면역관문억제제(Imuune Checkpoint Inhibitor, ICI)에 대한 환자의 내성에 기여하여 항암면역치료제의 효율을 떨어뜨린다. 이러한 상황, 구체적으로 종양을 갖는 개체의 MDSC의 수를 효과적으로 감소시키거나, MDSC의 활성을 효과적으로 억제시킨다면 MDSC에 의한 면역반응 저하를 막아 암 백신 또는 항암 면역 치료제의 효능을 증대시킬 수 있고, 암 치료를 원활하고 효과적으로 수행할 수 있게 될 것이다.
상기 종양을 갖는 개체의 MDSC는 표현형이 CD11b+Gr1+PD-L1+인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 종양은 구체적으로 유방암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 간암, 위암, 결장암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 선암종, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 조성물은 MDSC를 저해할 필요가 있는 개체에 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 분화 유도 인자로 GM-CSF를 처리하여 마우스 골수유래 MDSC를 제작하였다.
또한, 본 발명자들은 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 분화 유도 인자인 GM-CSF와 함께 마우스 유방암 세포주를 배양한 배지(tumor cell-conditioned medium; TCCM)를 처리한 결과, GM-CSF에 의해 MDSC의 분화가 유도되고, TCCM에 의해 MDSC의 활성이 유도되며, 상기 활성이 유도된 MDSC에서 MITF의 유전자 및 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 상기 TCCM에 의해 활성이 유도된 MDSC와 T 세포를 공동배양한 결과, 활성이 유도된 MDSC에 의해 CD3+CD8+ T 세포 수가 감소하는 것을 확인하였다. 상기의 결과를 통해 암세포 미세환경에서 MDSC가 활성화되어 면역반응이 저하되고, MITF가 상기 MDSC의 활성화의 표적 인자로서 MDSC의 활성화에 관여하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 종양 형성 마우스의 비장 및 종양 부위에서 MDSC를 획득하였고, 상기 종양 부위에서 얻은 MDSC에서 높은 활성화 및 MITF의 발현이 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 폐암 및 두경부암 조직 주변에서 MITF를 발현하는 MDSC가 증가되어 있는 것을 확인하였다. 상기의 결과를 통해 암세포 미세환경에서 MDSC가 활성화되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 분화 유도 인자인 GM-CSF와 함께 MDSC 활성을 유도하는 약물들, IL-18, IL-4, LPS 또는 스타틴(Statin) 계열 약물들을 처리한 결과, GM-CSF에 의해 MDSC의 분화가 유도되고, 상기 MDSC 활성 유도 약물들에 의해 MDSC의 활성이 유도되며, 상기 활성이 유도된 MDSC에서 MITF의 유전자 및 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 분화 유도 인자인 GM-CSF와 함께 MDSC 활성을 억제하는 약물로 ATRA(all-trans retinoic acid)를 처리한 결과, GM-CSF에 의해 MDSC의 분화가 유도되고, 상기 MDSC 활성 억제 약물에 의해 MDSC의 활성이 억제되며, 상기 활성이 억제된 MDSC에서 MITF의 유전자 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 상기의 결과를 통해 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 마우스의 골수에서 분리한 세포에 MDSC의 분화 유도 인자인 GM-CSF와 함께 MITF 유도제로 IBMX를 처리한 결과, GM-CSF에 의해 MDSC의 분화가 유도되고, IBMX에 의해 MITF의 발현이 증가하며, 이때 MDSC가 활성화되는 것을 확인하였다. 반면, 마우스의 골수 또는 비장에서 분리한 세포에 MDSC의 분화 유도 인자인 GM-CSF와 함께 MITF 억제제로 베르베린(Berberine) 또는 ML-329를 처리한 결과, GM-CSF에 의해 MDSC의 분화가 유도되나, 상기 MITF 억제제에 의해 MITF 발현이 감소하고, 이때 MDSC의 활성이 억제되는 것을 확인하였다. 또한, MDSC에서 MITF 발현을 억제한 결과, MDSC의 활성이 억제되는 것을 확인하였다. 아울러, 본 발명의 일 실시예에서 제작한 종양 형성 마우스에 ML-329를 사전 처리한 MDSC를 투여한 결과, 면역반응이 증진되어 종양 성장이 억제되고 종양 부위에서 MDSC의 침입 정도가 약화되는 것을 확인하였다. 상기의 결과를 통해 MITF의 억제제를 이용하여 MDSC의 활성을 저해할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명자들은 암세포 미세환경에서 MDSC가 활성화되어 면역반응이 저하되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하며, 상기 MITF의 억제제를 이용하여 MDSC를 저해할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 MITF 억제제를 유효성분으로 함유하는 조성물을 MDSC에 의한 면역반응 저하를 완화하고, 항암 면역치료 효율을 증대하는데 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 100 mg, 보다 구체적으로 0.5 mg 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 MITF 억제제를 유효성분으로 함유하는, 항암 보조제; MITF 억제제 및 항암제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법; 항암 보조제로 사용하기 위한 MITF 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명에서, 상기 MITF 억제제는 MITF의 유전자 발현 억제제 또는 MITF의 단백질 활성 억제제일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 MITF의 유전자 발현 억제제는 MITF 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 앱타머, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA, shRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 마이크로 RNA(microRNA, miRNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 MITF의 단백질 활성 억제제는 MITF 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질 유사체, 앱타머, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 MITF 억제제는 ML-329 및/또는 AMPK 활성촉진제(activator)일 수 있고, 구체적으로 상기 AMPK 활성촉진제는 베르베린(Berberine) 또는 카지놀 U(Kazinol U)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 항암 보조제는 항암제와 병용 투여될 수 있고, 상기 항암 보조제는 MDSC의 활성을 억제하여 MDSC에 의한 면역반응 저하를 완화함으로써, 항암제의 효과를 유의적으로 상승시키는 항암 보조 효과를 나타낼 수 있다.
상기 항암제는 화학치료제, 타겟화된 치료제, 항체 치료제, 면역치료제 및 호르몬 치료제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학치료제는 예를 들어, 대사길항물질(예를 들어, 폴산, 푸린, 및 피리미딘 유도체), 알킬화제(예를 들어, 질소 머스타드, 니트로소우레아, 백금, 알킬 설포네이트, 히드라진, 트리아젠, 아지리딘, 방추체 저해제, 세포독성제, 토포이소머라제 억제제 및 기타) 또는 저메틸화제(예를 들어, 제불라린, 이소티오시아네이트, 아자시티딘(5-아자시티딘), 5-플루오로-2'-데옥시시티딘, 5,6-디하이드로-5-아자시티딘 및 기타)가 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 타겟화된 치료제는 암 세포의 조절되지 않는 단백질에 대해 특이적인 제제로 예를 들어, 티로신 키나제 억제제, 예를 들어 악시티니브(Axitinib), 보수티니브(Bosutinib), 세디라니브(Cediranib), 다사티니브(Dasatinib), 에르로티니브(Erlotinib), 이마티니브(Imatinib), 게피티니브(Gefitinib), 라파티니브(Lapatinib), 레스타우르티니브(Lestaurtinib), 닐로티니브(Nilotinib), 세막사니브(Semaxanib), 소라페니브(Sorafenib), 수니티니브(Sunitinib), 및 반데타니브(Vandetanib), 또는 시클린-의존성 키나제 억제제, 예를 들어 알보시디브(Alvocidib) 및 셀리시크리브(Seliciclib)가 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항체 치료제는 암 세포의 표면 상에서 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 제제로 예를 들어, 트라스투주맙(Trastuzumab), 리툭시맙(Rituximab), 토시투모맙(Tositumomab), 세툭시맙(Cetuximab), 파니투무맙(Panitumumab), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 베바시주맙(Bevacizumab), 에드레콜로맙(Edrecolomab) 또는 겜투주맙(Gemtuzumab)이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 면역 치료제는 종양을 공격하기 위해 피검체의 자체 면역계를 유도하도록 설계된 제제로 예를 들어, 이필리루맙(Ipilimumab), 아벨루맙(Avelumab), 니볼루맙(Nivolumab) 또는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab)이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 호르몬 치료제는 특정 암에서 호르몬을 제공하거나 차단함으로써 암의 성장을 억제하는 제제로 예를 들어, 타목시펜(Tamoxifen) 또는 디에틸스틸베스테롤(diethylstilbestrol)이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항암제의 적절한 투여량은 이미 당업계에 널리 알려져 있으므로, 각 환자의 상태에 따라 당업계에 알려진 기준에 의해 투여할 수 있다. 구체적인 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 구체적으로는 1 mg/kg/일 내지 10 g/kg/일, 더 구체적으로는 10 mg/kg/일 내지 100 mg/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 암세포 미세환경에서 MDSC가 활성화되어 면역반응이 저하되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하며, 상기 MITF의 억제제를 이용하여 MDSC의 활성을 억제할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 MITF 억제제를 항암 면역치료의 항암 보조제로 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 MITF 억제제를 MDSC의 저해가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, MDSC 저해방법을 제공한다.
상기 MITF 억제제 및 MDSC에 대한 구체적인 설명은 상기 조성물에 대한 설명과 동일한 바, 구체적인 설명은 상기 내용을 원용하고, 이하에서는 MDSC 저해방법에 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.
본 발명에서, 상기 "골수-유래 억제세포 저해" 또는 "MDSC 저해"는 MDSC의 활성을 억제시키는 것뿐만 아니라, MDSC의 수를 감소시키는 것까지도 포함한다. 수를 감소시키는 것은 세포의 생성을 억제하는 것뿐만 아니라, 이미 생성된 세포를 사멸시키거나 다른 세포로 분화시키는 것도 포함한다. 그 외에도 생물학적 관점에서 "저해"라고 지칭되고 있는 모든 매커니즘이 포함된다.
본 발명에서, 상기 MDSC의 저해가 필요한 개체는 구체적으로 MDSC의 저해가 필요한 종양을 갖는 개체일 수 있고, 상기 종양을 갖는 개체의 MDSC는 표현형이 CD11b+Gr1+PD-L1+인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 종양은 구체적으로 유방암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 간암, 위암, 결장암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 선암종, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 암세포 미세환경에서 MDSC가 활성화되어 면역반응이 저하되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하며, 상기 MITF의 억제제를 이용하여 MDSC의 활성을 억제할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 MITF 억제제를 MDSC의 저해가 필요한 개체에 투여하여 MDSC 관련 질환 치료에 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSC) 제작
<1-1> 마우스 골수유래 MDSC 제작
Balb/c 마우스의 골수(bone marrow, BM)로부터 도 1의 모식도와 같이 골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSC)를 제작하였다.
구체적으로, 6 내지 8주령 된 Balb/c 마우스는 Saeronbio. Inc.(Republic of Korea)에서 구입하였다. 동물실험은 Institutional Ethical Committee of Sookmyung Women’s University (SMWU-IACUC-1708-017-02)의 승인을 받아 수행하였다. 6 내지 8주령 된 Balb/c 마우스의 넙적다리뼈를 적출하여 뼈 안의 골수를 분리한 뒤, RBC lysis buffer(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 처리하여 적혈구를 제거하여 세포를 얻었다. 얻어진 골수세포를 5×105 cells/㎖의 세포 수로 24-웰 플레이트에서 10 ng/㎖ 농도의 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지(Invitrogen, Grand Island, NY)로 96시간 동안 배양하여 MDSC의 분화를 유도하였다.
<1-2> 종양 형성 마우스에서의 MDSC 제작
Balb/c 마우스에 유방암 세포주를 주사하여 종양 형성 마우스를 제작하고, 상기 종양 형성 마우스로부터 MDSC를 제작하였다.
구체적으로 6 내지 8주령 된 Balb/c 마우스에 마우스 유방암 세포주인 4T1 세포를 5×105 cells/100 ㎕ 의 세포 수로 포함하는 100 ㎕ PBS를 오른쪽 옆구리 쪽에 피하 주사하여 종양을 형성하였다. 상기 마우스는 12시간 명/암 주기에서 온도 23.5 ± 1℃, 습도 50 ± 5%의 숙명여자대학교 동물 실험실에서 사육하였다. 2주 뒤 종양, 골수 및 비장을 각각 적출하여 세포를 분리하였다. 그 다음, 형광 결합된 항-CD11b 항체, 항-Gr1 항체 및 MDSC 활성 마커인 PD-L1 항체를 이용하여 염색한 후, FACS(Fluorescence-acitivated cell sorting) 분석을 수행하여 MDSC의 분화 및 활성을 확인하였다. 상기 항체는 eBioscience (San Diago, CA)에서 구입하였다.
<실시예 2> 암세포 미세환경에서 MDSC에 의한 면역반응 저하 확인
<2-1> 암세포 미세환경에서 MDSC 활성 확인
암세포 미세환경에서 MDSC에 의해 면역반응이 저하되는지 알아보기 위하여, 암세포를 배양한 배지를 처리한 MDSC의 활성을 확인하였다.
구체적으로, 마우스 유방암 세포주인 4T1 세포를 10% 소태아혈청(FBS), 100 unit 항생제-항균제를 함유하는 RPMI 배지(Invitrogen, Grand Island, NY) 10 ml로 5% CO2, 37℃ 조건 하에서 3일 동안 배양하여 세포가 80% 포화 상태가 되도록 하였다. 그 다음, 배양 배지를 회수하고 4℃로 유지된 centrifuge에 3000 ×g로 20분간 3000 NMWL(nominal molecular weight limit) centrifugal filter (Merck Milipore, Billerica, MA)로 농축하여 TCCM(tumor cell-conditioned medium)을 획득하였다. 상기 <실시예 1>에서 개시된 방법과 동일한 방법으로 골수세포 얻은 후, 5×105 cells/㎖의 세포 수로 24-웰 플레이트에서 상기 획득한 TCCM 및 10 ng/㎖ 농도의 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 96시간 동안 배양하여 MDSC의 분화를 유도하였다. 대조군으로 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 분화를 유도한 MDSC를 이용하였다.
MDSC의 분화를 확인하기 위하여, 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 형광 결합된 항-CD11b 항체 및 항-Gr1 항체로 염색한 후, FACS 분석을 수행하였다(도 2A).
또한, MDSC의 활성을 확인하기 위하여, 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 MDSC의 활성 마커인 iNOS, IL-10 및 TGF-β에 대한 qRT-PCR을 수행하였다. 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하고 TRIzol Reagent Solution(Invitrogen)을 사용하여 제조사의 절차에 따라 총 RNA를 분리하였다. 그 다음, 분리한 총 RNA를 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다. M-MLV 역전사 키트(Promega, Madison, WI)와 oligo-(dT) 프라이머와 dNTP(Bioneer, Daejeon, Republic of Korea)를 사용하여 제조사의 절차에 따라 분리한 총 RNA를 역전사하고, ABI Real-time PCR 7500 시스템에서 iNOS, IL-10, TGF-β 및 cyclophilin에 대한 프라이머 및 SYBR Green PCR Master Mix (Applied Bosystems, Foster City, CA)를 이용하여 제조사의 절차에 따라 정량적 PCR을 수행하였다. 이때 대조군으로 cyclophilin을 사용하였다. iNOS, IL-10, TGF-β 및 cyclophilin에 대한 프라이머는 Bioneer에서 구입하였다. 상기 실험은 3번 반복 수행하였다(도 2B).
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 대조군(GM-CSF) 및 TCCM 처리군(GM+TCCM) 모두 유사한 정도로 MDSC의 분화가 유도됨을 확인하였다(도 2A). 반면, TCCM 처리군(GM+TCCM)의 경우 MDSC의 활성 마커인 iNOS, IL-10 및 TGF-β의 발현이 대조군에 비해 높게 나타나므로, TCCM에 의해 MDSC의 활성이 유도됨을 확인하였다(도 2B).
<2-2> 암세포 미세환경에서 활성화된 MDSC의 MITF 발현 증가 확인
상기 실시예 <2-1>의 TCCM에 의해 활성이 유도된 MDSC에서 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)의 유전자 및 단백질 발현 변화를 확인하였다.
구체적으로, MITF의 유전자 발현을 확인하기 위하여 상기 실시예 <2-1>에서 회수한 MDSC를 이용하여 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 MITF에 대한 qRT-PCR을 수행하였다. MITF에 대한 프라이머는 Bioneer에서 구입하였다(도 3A).
또한, MITF의 단백질 발현을 확인하기 위하여 상기 실시예 <2-1>에서 회수한 MDSC를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다. 이를 위해 상기 실시예 <2-1>에서 회수한 MDSC에 세포 용해 버퍼를 처리하여 용해하였다. 세포 용해물을 10% SDS-PAGE 겔로 전기영동하여 분리하고, PVDF 멤브레인에 옮겼다. 그 다음, 일차 항체로 항-MITF 항체 및 항-액티닌(actinin) 항체를 처리하여 반응시킨 후, 상기 막에 붙은 일차 항체에 HRP-접합 이차 항체를 붙이고, 이를 enhanced chemiluminescence(PicoEPD™ Western Reagent kit, ELPIS-Biotech, Daejeon, Republic of Korea)을 이용하여 LAS-3000 imaging system (FUJIFILM Corporation, Tokyo, Japan)으로 분석하였다. 액티닌은 대조 단백질로 사용하였다(도 3B). 또한, MDSC의 활성을 확인하기 위하여 일차 항체로 항-Arg1 항체 및 항-pSTAT3 항체를 처리하여 상기에 기재된 바와 같이 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, TCCM 처리군(GM+TCCM)의 경우 대조군(GM-CSF)에 비해 MITF의 유전자 발현(도 3A) 및 단백질 발현(도 3B)이 증가하고, Arg1 및 STAT3 인산화가 증가하는 것으로 나타나므로, MITF가 TCCM에 의해 활성이 유도된 MDSC에서 특이적으로 발현되는 표적 인자임을 확인하였다.
<2-3> 암세포 미세환경에서 MDSC에 의한 면역반응 저하 확인
MDSC는 T 세포의 증식 및 기능을 억제하여 면역반응을 저하하는 것으로 알려져 있다. 이에 암세포 미세환경에서 MDSC에 의해 면역반응이 저하되는지 알아보기 위하여, 암세포를 배양한 배지를 처리한 MDSC를 이용하여 T 세포 증식 억제 정도를 확인하였다.
구체적으로, 종양형성 마우스의 비장에서 MACS cell separation kit(Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany)를 이용하여 제조사의 절차에 따라 분리한 세포를 5×105 cells/㎖의 세포 수로 24-웰 플레이트에서 상기 실시예 <2-1>에서 획득한 TCCM 및 10 ng/㎖ 농도의 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 24시간 동안 배양하여 MDSC의 분화 및 활성을 유도하였다.
또한, T 세포를 얻기 위해, 6 내지 8주령 된 Balb/c 마우스의 비장을 적출하여 세포를 분리하였다. 그 다음, 형광 결합된 항-CD3 항체를 이용하여 염색한 후, FACS를 이용하여 T 세포를 분리하였다. 분리한 T 세포를 2.5 μM CFSE로 7 분간 염색하여 CFSE 표지(Labeling)을 수행하였다. 5×105 개의 CFSE 표지된 CD3+ T 세포를 항-CD3 단일 클론 항체 및 가용성 항-CD28 단일 클론 항체로 코팅한 플레이트에서 2시간 동안 자극한 후, 상기 종양형성 마우스의 비장에서 분리한 세포의 분화 및 활성을 유도하여 획득한 MDSC(도 4A) 및 상기 실시예 <2-1>에서 회수한 MDSC(도 4B)를 5×105 세포 수 또는 10×105 세포 수로 넣어주고, 3일 동안 배양하였다. 배양 3일 후 형광 결합된 항-CD8 항체를 이용하여 염색한 후, FACS 분석을 수행하여 CD8+ T 세포의 증식 정도를 측정하였다. 상기 항체는 eBioscience사에서 구입하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, TCCM 처리군(GM+TCCM)과 T 세포를 공동배양할 경우 대조군(GM-CSF)과 공동배양한 경우에 비해 CD3+CD8+ T 세포 수가 감소하므로, TCCM에 의해 활성이 유도된 MDSC가 T 세포 증식을 억제함을 확인하였다.
상기 결과를 통해 암세포 미세환경에서 MDSC가 활성화되어 면역반응을 저하하고, MITF가 상기 MDSC의 활성화의 표적 인자로서 MDSC의 활성화에 관여하는 것을 알 수 있다.
<실시예 3> 종양 형성 마우스의 MDSC에서의 활성 및 MITF 발현 확인
종양 형성 마우스에서 MDSC가 활성화되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하는지 알아보기 위하여, 종양 형성 마우스에서의 MDSC를 이용하여 이의 활성 및 MITF의 유전자 발현 변화를 확인하였다.
구체적으로, MDSC의 활성을 확인하기 위하여 상기 실시예 <1-2>에 개시된 방법과 동일한 방법으로 종양 형성 마우스의 비장 및 종양 각각에서 세포를 분리한 후 FACS 분석을 수행하였다(도 5A). 또한, 상기 FACS sorter로 CD11b+Gr1+ MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 qRT-PCR을 수행하였다(도 5B). 대조군으로는 분리(sorting)하기 전의 종양 형성 마우스의 비장을 이용하였다.
또한, MITF의 유전자 발현을 확인하기 위하여, 상기 회수한 CD11b+Gr1+ MDSC를 이용하여 상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 qRT-PCR을 수행하였다(도 5C).
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 종양 형성 마우스의 비장 및 종양 부위에서 얻은 MDSC는 대조군에 비해 활성화된 형태를 띠고(도 5A 및 도 5B), MITF의 유전자 발현이 증가해 있음을 확인하였다(도 5C). 특히, 종양 부위에서 얻은 MDSC가 비장 부위에서 얻은 것에 비해 활성화가 더 많이 되어 있고, MITF의 발현이 현저히 높게 나타나는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해 암세포 미세환경에서 MDSC가 활성화되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하는 것을 알 수 있다.
<실시예 4> 종양 조직에서 MDSC 및 MITF 발현 확인
종양 조직에서 MDSC가 활성화되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하는지 알아보기 위하여, 종양 조직에서 MDSC 및 MITF의 발현 변화를 확인하였다.
구체적으로, 폐암과 두경부암 조직 주변과 그에 상응하는 암이 없는 림프절 부위 조직 10 샘플 각각에 대하여 서울대학교 병리학 교실(Prof. Yoon Kyung Jeon)에서 조직염색을 수행하였다. 구체적으로, 조직을 4 % 포름 알데히드 용액에 고정시킨 후, 농도별 에탄올(70-100 %)에서 탈수시키고 파라핀에 끼워 넣었다. 조직을 마이크로톰으로 절편화하고(두께 4 μm) 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색(H&E)하였다. 광학 현미경(Olympus, Japan)으로 단면을 관찰하고 ×400 배율로 촬영하였다. IHC(immunohistochemistry)의 경우 조직 절편을 PBS로 희석한 3% 정상 말 혈청으로 30 분간 차단하였다. 절편을 블로킹하고 4℃에서 밤새 CD11b, CD14, MITF 항체(항-마우스 단일클론 일차항체(Cat. No 790-4367), Ventana Medical Systems, Oro Valley, AZ)와 함께 적절한 희석 배수(1:100 희석)에서 반응시켰다. 슬라이드를 PBS로 세척한 후, 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 복합체 (ABC; Vector Laboratories, Burlingame, CA를 세척하였다. 슬라이드를 세척하고, 퍼옥시다아제 반응을 디아미노벤지딘 및 퍼옥사이드로 전개시키고, 아쿠아-마운트(Aqua-Mount)에 장착하여 광학 현미경 (Olympus) 하에서 ×400 배율로 평가하였다. 암조직과 림프절 조직에서 고배율시야(High Power Field, HPF)내에서 MITF+/CD11b+/CD14+인 MDSC의 수는 삼중양성인 세포들을 각각 세 군데 임의의 고배율시야내에서 count된 것의 평균값으로 표현하였다.
그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 종양 주변 조직에서 MITF로 염색된 MDSC의 분포가 뚜렷한 반면, 종양이 없는 림프절 부위 조직에서는 MITF로 염색된 MDSC가 거의 관찰되지 않음을 확인하였다.
상기 결과를 통해 암 주변에서 MDSC가 활성화되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하는 것을 알 수 있다.
<실시예 5> 활성을 유도한 MDSC에서 MITF 발현 증가 확인
MITF와 MDSC의 상관성을 알아보기 위하여, MDSC의 활성을 유도하는 약물을 처리한 후 MITF 발현 변화를 확인하였다.
<5-1> IL-18로 활성 유도한 MDSC에서 MITF 발현 증가 확인
MDSC의 활성을 유도하는 약물로 IL-18을 처리하고 MDSC의 분화를 유도한 후, MITF의 유전자 발현 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에서 개시된 방법과 동일한 방법으로 골수세포 얻은 후, 5×105 cells/㎖의 세포 수로 24-웰 플레이트에서 10 또는 50 ng/㎖ 농도의 IL-18, 및 10 ng/㎖ 농도의 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 96시간 동안 배양하여 MDSC의 분화를 유도하였다(도 6A 및 도 6B). 또한 상기 실시예 <1-1>에 기재된 방법에 따라 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 96시간 동안 배양하여 MDSC의 분화를 유도하고, 10 또는 50 ng/㎖ 농도의 IL-18을 24시간 동안 처리하였다(도 6C 및 도 6D). 대조군으로 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 분화를 유도한 MDSC를 이용하였다.
상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 FACS 분석을 수행하여 MDSC의 분화를 확인하였다(도 6A 및 도 6C).
또한, 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1> 및 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 qRT-PCR을 수행하여 MDSC의 활성을 확인하고, MITF의 유전자 발현을 확인하였다(도 6B 및 도 6D).
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 IL-18 처리군 모두 유사한 정도로 MDSC의 분화가 유도됨을 확인하였다(도 6A 및 도 6C). 반면, IL-18 처리군의 경우 MDSC의 활성이 증가하고, MITF의 유전자 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 6B 및 도 6D).
<5-2> IL-4로 활성 유도한 MDSC에서 MITF 발현 증가 확인
MDSC의 활성을 유도하는 약물로 IL-4를 처리하고 MDSC의 분화를 유도한 후, MITF의 유전자 발현 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법에 따라 MDSC의 분화 및 활성을 유도하되, 활성을 유도하는 약물로 10 ng/㎖의 IL-4를 처리하였다.
상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 FACS 분석을 수행하여 MDSC의 분화를 확인하였다(도 7A).
또한, 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1> 및 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 MDSC의 활성을 확인하고(도 7B), MITF의 유전자 발현을 확인하였다(도 7C).
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 IL-4 처리군 모두 MDSC의 분화가 유도됨을 확인하였다(도 7A). 반면, IL-4 처리군의 경우 IL-4에 의해 MDSC의 활성화가 유도되고(도 7B), 대조군과 비교하여 MITF의 유전자 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 7C).
<5-3> LPS로 활성 유도한 MDSC에서 MITF 발현 증가 확인
MDSC의 활성을 유도하는 약물로 LPS를 처리하고 MDSC의 분화를 유도한 후, MITF의 유전자 발현 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법에 따라 MDSC의 분화 및 활성을 유도하되, 활성을 유도하는 약물로 100 ng/㎖의 LPS를 처리하였다.
상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 FACS 분석을 수행하여 MDSC의 분화를 확인하였다(도 8A).
또한, 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1> 및 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 MDSC의 활성을 확인하고(도 8B), MITF의 유전자 발현을 확인하였다(도 8C).
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 LPS 처리군 모두 MDSC의 분화가 유도됨을 확인하였다(도 8A). 반면, LPS 처리군의 경우 LPS에 의해 MDSC의 활성화가 유도되고(도 8B), 대조군과 비교하여 MITF의 유전자 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 8C).
<5-4> 스타틴(Statin) 계열 약물로 활성 유도한 MDSC에서 MITF 발현 증가 확인
스타틴(Statin) 계열 약물인 심바스타틴(Simvastatin)은 IRF4(Interferon regulatory factor 4)의 발현을 억제하여 MDSC의 활성을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이에 MDSC의 활성을 유도하는 약물로 스타틴 계열 약물을 처리하고 MDSC의 분화를 유도한 후, MITF의 유전자 발현 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법에 따라 MDSC의 분화 및 활성을 유도하되, 활성을 유도하는 약물로 심바스타틴(Sim, 0.5 또는 1 μM), 로바스타틴(Lovastatin, Lova, 0.5 또는 1 μM), 프로바스타틴(Pravastatin, Prav, 5 또는 10 μM), 로수바스타틴(Rosuvastatin, Rosu, 0.5 또는 1 μM), 또는 아토바스타틴(Atorvastatin, Ator, 0.05 또는 0.1 μM)을 처리하였다(도 9 및 도 10).
또한, 상기 실시예 <1-1>에 기재된 방법에 따라 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 96시간 동안 배양하여 MDSC의 분화를 유도하고, 상기 스타틴 계열 약물을 24시간 동안 처리하였다(도 11 및 도 12).
그 다음, 상기 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1> 및 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 MDSC의 분화(도 9 및 도 11)를 확인하였다. 또한, 심바스타틴 또는 로바스타틴 1 μM 처리군에서 MDSC의 활성(도 10A 및 도 12A)을 확인하고, MITF의 유전자 발현(도 10B 및 도 12B)을 확인하였다.
그 결과, 도 9 내지 도 12에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 스타틴 계열 약물 처리군 모두 유사한 정도로 MDSC의 분화가 유도됨을 확인하였다(도 9 및 도 11). 반면, 스타틴 계열 약물 처리군의 경우 MDSC의 분화 초기부터 스타틴 계열 약물 처리한 경우(도 10) 및 이미 분화된 MDSC에 스타틴 계열 약물을 처리한 경우(도 12) 모두 스타틴 계열 약물에 의해 MDSC의 활성화가 유도되고(도 10A 및 도 12A), 대조군과 비교하여 MITF의 유전자 발현(도 10B 및 도 12B)이 증가하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해 활성이 유도된 MDSC에서 MITF의 발현이 증가하는 것을 확인하였으므로, MDSC의 활성화에 MITF가 관여하는 것을 알 수 있다.
<실시예 6> 활성을 억제한 MDSC에서 MITF 발현 감소 확인
ATRA(all-trans retinoic acid)는 MDSC의 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 이에 MITF와 MDSC의 상관성을 알아보기 위하여, MDSC의 활성을 억제하는 약물로 ATRA를 처리한 후 MITF 발현 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에 개시된 방법과 동일한 방법으로 골수세포 얻은 후, 5×105 cells/㎖의 세포 수로 24-웰 플레이트에서 ATRA(0.5 또는 1 μM) 및 10 ng/㎖ 농도의 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 96시간 동안 배양하여 MDSC의 분화를 유도하였다(도 13).
상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 FACS 분석을 수행하여 MDSC의 분화를 확인하였다(도 13A).
또한, 상기 ATRA 1 μM을 처리하고 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1> 및 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 qRT-PCR을 수행하여 MDSC의 활성을 확인하였다(도 13B), MITF의 유전자 발현을 확인하였다(도 13C).
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 ATRA 처리군 모두 유사한 정도로 MDSC의 분화가 유도됨을 확인하였다(도 13A). 반면 ATRA 처리군의 경우 ATRA에 의해 MDSC의 활성화가 억제되고(도 13B), 대조군과 비교하여 MITF의 유전자 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 13C).
상기 결과를 통해 활성이 억제된 MDSC에서 MITF의 발현이 감소하는 것을 확인하였으므로, MDSC의 활성화에 MITF가 관여하는 것을 알 수 있다.
<실시예 7> MITF 조절에 의한 MDSC 활성 변화 확인
<7-1> MITF 유도제에 의한 MDSC의 활성 증가 확인
흑색종 세포에서 IBMX가 MITF의 발현을 유도하는 것이 알려져 있다. 이에, MITF의 발현 또는 활성 조절이 MDSC 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, MITF 발현 유도제로 IBMX를 처리한 MDSC의 활성 변화 및 상기 MDSC에 의한 T 세포 증식 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에서 개시된 방법과 동일한 방법으로 골수세포 얻은 후, 5×105 cells/㎖의 세포 수로 24-웰 플레이트에서 10 μM 농도의 IBMX 및 10 ng/㎖ 농도의 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 96시간 동안 배양하여 MDSC의 분화를 유도하였다. 대조군으로 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 분화를 유도한 MDSC를 이용하였다.
상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 FACS 분석을 수행하여 MDSC의 분화를 확인하였다(도 14A).
또한, 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1> 및 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 qRT-PCR 및 웨스턴 블럿팅을 수행하여 MDSC의 활성을 확인하고(도 14B 및 도 14C), MITF의 유전자 발현 및 단백질 발현(도 14C)을 확인하였다.
또한, 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 실시예 <2-3>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 T 세포 증식 억제 정도를 확인하였다(도 14D).
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 IBMX 처리군 모두 유사한 정도로 MDSC의 분화가 유도됨을 확인하였다(도 14A). 반면, IBMX 처리군의 경우 대조군과 비교하여 MITF의 유전자 및 단백질 발현이 증가하고(도 14C), MDSC의 활성이 증가하는 것을 확인하였다(도 14B 및 도 14C). 또한, IBMX 처리군의 경우 MDSC 활성의 활성이 증가하여 T 세포 증식이 억제되는 것을 확인하였다(도 14D).
<7-2> MITF 억제제에 의한 MDSC 활성 저해 확인
베르베린(Berberine), 카지놀 U(Kazinol U) 등은 AMPK 활성촉진제(AMPK activator)이면서 멜라닌 세포에서 MITF의 발현 또는 활성을 억제하는 것이 알려져 있다. 이에 MITF의 발현 또는 활성 조절이 MDSC 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, MITF 억제제로 베르베린을 처리한 MDSC의 활성 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에 개시된 방법과 동일한 방법으로 골수세포 얻은 후, 5×105 cells/㎖의 세포 수로 24-웰 플레이트에서 10 μM 농도의 베르베린 및 10 ng/㎖ 농도의 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 96시간 동안 배양하여 MDSC의 분화를 유도하였다. 대조군으로 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 분화를 유도한 MDSC를 이용하였다.
상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 qRT-PCR을 수행하여 MITF의 발현을 확인하였다(도 15A).
또한, 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 FACS 분석을 수행하여 MDSC의 분화를 확인하였다(도 15B).
또한, 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 qRT-PCR을 수행하여 MDSC의 활성을 확인하였다(도 15C).
그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 베르베린 처리군의 경우 베르베린에 의해 MITF의 발현이 억제되고(도 15A), MDSC의 분화가 다소 감소하는 것을 확인하였다(도 15B). 또한, 베르베린 처리군의 경우 대조군과 비교하여 MDSC의 활성이 유의적으로 저해되는 것을 확인하였다(도 15C).
또한, ML-329는 멜라닌 세포에서 TRPM-1 프로모터 활성을 억제하여 MITF의 발현을 억제하는 것이 알려져 있다. 이에 MITF의 발현 또는 활성 조절이 MDSC 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, MITF 억제제로 ML-329를 처리한 MDSC의 활성 변화 및 상기 MDSC에 의한 T 세포 증식 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에 개시된 방법과 동일한 방법으로 골수세포 얻은 후, 5×105 cells/㎖의 세포 수로 24-웰 플레이트에서 0.5 또는 1 μM 농도의 ML-329(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) 및 10 ng/㎖ 농도의 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 96시간 동안 배양하여 MDSC의 분화를 유도하였다. 대조군으로 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 분화를 유도한 MDSC를 이용하였다. 그 다음, 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1> 및 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 qRT-PCR을 수행하여 MDSC의 활성(도 17A) 및 MITF 발현을 확인하였다(도 17B).
또한, TCCM에 의한 MDSC 활성 유도에 있어서 ML-329의 효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예 <1-1>에 개시된 방법과 동일한 방법으로 골수세포 얻은 후, 5×105 cells/㎖의 세포 수로 24-웰 플레이트에서 0.5, 1 또는 2 μM 농도의 ML-329(Cayman Chemical), 상기 실시예 <2-1>에서 획득한 TCCM 및 10 ng/㎖ 농도의 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 96시간 동안 배양하여 MDSC의 분화를 유도하였다. 대조군으로 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 분화를 유도한 MDSC를 이용하였다. 그 다음, 상기 분화 유도한 MDSC를 회수하여 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 FACS 분석을 수행하여 MDSC의 분화를 확인하고(도 18A), qRT-PCR을 수행하여 MDSC의 활성 정도를 측정하였다(도 18B). 또한, 상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 qRT-PCR 및 웨스턴 블럿팅을 수행하여 MITF 발현을 확인하였다(도 18C). 또한, 상기에서 획득한 MDSC를 이용하여 상기 실시예 <2-3>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 T 세포 증식 억제 정도를 확인하였다(도 18D).
그 결과, 도 17 및 도 18에 나타낸 바와 같이, ML-329 처리군의 경우 ML-329에 의해 MITF 발현이 억제되고 MDSC의 활성이 저해되는 것을 확인하였다(도 17A 및 도 17B). 또한, ML-329 처리군의 경우 TCCM에 의한 MDSC 활성이 저해되고(도 18B 및 도 18C), MITF 발현이 저해되며(도 18C), ML-329에 의한 MDSC 활성 저해로 T 세포 증식이 증가하는 것을 확인하였다(도 18D).
또한, MDSC는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이나 활성질소종(reactive nitrogen species, RNS)을 만들어 T 세포의 증식에서부터 기능까지 다양한 과정을 저해하는 것으로 알려져 있다. 이에, MITF의 발현 또는 활성 조절이 MDSC 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, MITF 억제제로 베르베린 또는 ML-329를 처리한 MDSC에서 ROS 생성 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-2>의 종양형성 마우스의 비장에서 MDSC를 분리하여 10 μM 농도의 베르베린 또는 1 μM 농도의 ML-329, 상기 실시예 <2-1>에서 획득한 TCCM 및 10 ng/㎖ 농도의 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 48시간 동안 배양하여 MDSC의 분화를 유도하였다. 상기 MDSC를 수집하여 1×105 세포 수로 분주하고, LPS를 100 ng/ml 농도로 24시간 동안 처리하였다. 이때 ROS 저해제인 NAC(N-acetyl-cysteine)을 처리/무처리하였다. 24시간 후에 DCF-DA를 넣어 37℃에서 30분간 반응하고, 유세포분석기로 ROS 생성 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, 베르베린 또는 ML-329 처리군의 경우 MDSC에 의한 ROS 생성이 저해되는 것을 확인하였고, ROS 저해제를 함께 처리한 경우 ROS가 강력하게 저해되는 것을 확인하였다.
아울러, RNA간섭(RNA interference, RNAi) 및 CRISPR 기술을 이용하여 MDSC에서 MITF의 발현을 억제한 후, MDSC에 의한 ROS 생성 및 T 세포 증식 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에 개시된 방법과 동일한 방법으로 골수세포를 얻은 후, 1×106 cells/㎖의 세포 수의 골수세포에 CRISPR 벡터, 구체적으로 pLentiCRISPR-E 벡터에 다음의 sgRNA를 클로닝하였다; MITF gRNA FW oligo: 5'-CACCGTAAGGACTTCCATCGGCACC-3'(서열번호 1), MITF gRNA RV oligo: 5'-AAACGGTGCCGATGGAAGTCCTTAC-3'(서열번호 2). 또한, 대조군은 pLentiCRISPR-E 벡터에 다음의 non-target control gRNA를 클로닝하였다; non-target control sgRNA: 5'-CACCGGTATTACTGATATTGGTGGG-3'(서열번호 3). 상기 클로닝한 컨스트럭트를 리포펙타민(lipofectamine)을 이용하여 제조사의 절차에 따라 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후 상기 실시예 <2-1>에서 획득한 TCCM 및 10 ng/㎖ 농도의 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 72시간 동안 배양하여 MDSC의 분화를 유도하였다. 형질감염 72시간 후, MDSC를 회수하여 상기 <2-2>에 기재된 방법과 웨스턴 블럿팅을 수행하여 MITF의 발현 및 MDSC 활성을 확인하였다(도 20A). 또한, 상기에 기재된 방법과 동일한 방법으로 MDSC에 의한 ROS 생성 정도를 측정하고(도 20B), 상기 실시예 <2-3>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 MDSC에 의한 T 세포 증식 정도를 측정하였다(도 20C).
또한, 비교군으로 MIFT가 과발현된 MDSC에 의한 T 세포 증식 정도를 측정하였다. 구체적으로, 상기 1×106 cells/㎖의 세포 수의 골수세포에 MITF plasmid DNA(Addgene, Cambridge, MO)를 리포펙타민을 이용하여 제조사의 절차에 따라 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후 10 ng/㎖ 농도의 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 72시간 동안 배양하여 MDSC의 분화를 유도하였다. 형질감염 3일 후, MDSC를 회수하여 상기와 같이 MITF의 발현(도 20D) 및 MDSC에 의한 T 세포 증식 정도(도 20E)를 측정하였다.
그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이, MITF shRNA 및 CRISPR 기술을 이용하여 MDSC에서 MITF의 발현 및 MDSC 활성이 억제되는 것을 확인하였고(도 20A), MITF 발현 억제로 MDSC에 의한 ROS 생성이 억제되고(도 20B), MDSC에 의한 T 세포 저해가 완화되는 것을 확인하였다(도 20C). 반면, MITF가 과발현된 MDSC에서는 상반된 결과가 나타나는 것을 확인하였다(도 20D 및 도 20E).
상기의 결과를 통해 MITF의 발현 또는 활성을 억제하여 MDSC의 활성을 저해할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 8> 종양 형성 마우스에서 MDSC 활성 저하에 의한 면역반응 증진 효과 확인
상기 <실시예 7>을 통해 MITF 억제제에 의해 MDSC 활성이 저해되는 것을 확인하였다. 이에, 종양 형성 마우스에서 MDSC 활성 저하에 의한 효과를 알아보기 위하여, 종양 형성 마우스에 MITF 억제제에 의해 활성이 저하된 MDSC를 투여한 후 종양 성장 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 제작한 종양 형성 마우스의 비장에서 MDSC를 분리하였다. 그 다음, 상기 실시예 <7-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 1 μM 농도의 ML-329, 상기 실시예 <2-1>에서 획득한 TCCM 및 10 ng/㎖ 농도의 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 48시간 동안 배양하여 MDSC의 분화를 유도하였다. 48시간 후 상기 MDSC + 4T1-luc(5×104 + 2.5×105/100 μl)를 함께 마우스의 왼쪽 옆구리 쪽의 피하에 주입하였다. 실험 종료 시점까지 지속적으로 vernier caliper로 종양 부피를 측정하였고(종양 부피 = a2×b/2 mm3)(a = 종양 너비, b = 종양 높이)(도 21B), IVIS(In vivo imaging system) 분석을 수행하였다(도 21C). 또한, 2주 뒤에 종양 조직에서 MDSC의 population을 항-CD11b 항체, 항-Gr1 항체, 항-CD45 항체를 이용하여 염색한 후, FACS 분석을 수행하여 확인하였다(도 21D). 대조군은 ML-329가 불포함되고, TCCM 및 GM-CSF가 포함된 RPMI 배지로 배양한 MDSC를 주입하였다.
그 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이, ML-329를 사전에 처리한 MDSC의 경우 ML-329에 의해 MDSC 활성이 저하되고, 이로 인해 종양 형성 마우스에서 면역반응이 증진되어 종양 성장이 억제되고 종양 부위에서 MDSC의 침입 정도가 약화되는 것을 확인하였다(도 21B 내지 도 21D).
상기 <실시예 1> 내지 <실시예 8>을 통해 암세포 미세환경에서 MDSC가 활성화되어 면역반응이 저하되고, 상기 MDSC의 활성화에 MITF가 관여하며, 상기 MITF의 억제제를 이용하여 MDSC의 활성을 억제할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 MITF 억제제를 포함하는 조성물을 MDSC의 저해가 필요한 개체, 예컨대 종양을 갖는 개체에 투여하여 MDSC에 의한 면역반응 저하를 완화하는데 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 상기 MITF 억제제를 포함하는 조성물을 항암제, 예컨대 항암면역치료제와 병용 투여하여 항암 면역치료 효율을 증대하는 보조요법으로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명은 MITF(microphthalmia-associated transcription factor) 억제제를 유효성분으로 함유하는 골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSC) 저해용 조성물에 관한 것으로, 상기 MITF 억제제를 유효성분으로 함유하는 조성물은 MDSC의 활성을 저해하여 MDSC에 의한 면역반응 저하를 완화하고, 항암 면역치료 효율을 증대하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (19)

  1. MITF(microphthalmia-associated transcription factor) 억제제를 유효성분으로 함유하는, 골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cell; MDSC)에 의한 면역반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 MITF 억제제는 MITF의 유전자 발현 억제제 또는 MITF의 단백질 활성 억제제인 것을 특징으로 하는, MDSC에 의한 면역반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 MITF의 유전자 발현 억제제는 MITF 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 앱타머, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA, shRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 마이크로 RNA(microRNA, miRNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, MDSC에 의한 면역반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 조성물.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 MITF의 단백질 활성 억제제는 MITF 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질 유사체, 앱타머, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, MDSC에 의한 면역반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 MITF 억제제는 ML-329 및 AMPK 활성촉진제(activator)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, MDSC에 의한 면역반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 AMPK 활성촉진제는 베르베린(Berberine) 또는 카지놀 U(Kazinol U)인 것을 특징으로 하는, MDSC에 의한 면역반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 MDSC는 종양을 갖는 개체의 MDSC인 것을 특징으로 하는, MDSC에 의한 면역반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 종양을 갖는 개체의 MDSC는 표현형이 CD11b+Gr1+PD-L1+인 것을 특징으로 하는, MDSC에 의한 면역반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 조성물.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 종양은 유방암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 간암, 위암, 결장암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 선암종, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, MDSC에 의한 면역반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 조성물.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 MDSC를 저해할 필요가 있는 개체에 투여하기 위한 것을 특징으로 하는, MDSC에 의한 면역반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 조성물.
  11. MITF 억제제를 유효성분으로 함유하는, 항암 보조제.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 보조제는 항암제와 병용 투여되는 것을 특징으로 하는, 항암 보조제.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 항암제는 화학치료제, 타겟화된 치료제, 항체 치료제, 면역치료제 및 호르몬 치료제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 항암 보조제.
  14. MITF 억제제를 MDSC의 저해가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, MDSC 저해방법.
  15. MITF 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, MDSC에 의한 면역반응 저하의 완화 또는 치료 방법.
  16. MITF 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, MDSC에 의한 면역반응 저하의 예방 방법.
  17. MITF 억제제 및 항암제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법.
  18. MDSC에 의한 면역반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용 조성물로 사용하기 위한 MITF 억제제의 용도.
  19. 항암 보조제로 사용하기 위한 MITF 억제제의 용도.
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