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WO2020225346A1 - Bactérie génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de co2 - Google Patents

Bactérie génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de co2 Download PDF

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Publication number
WO2020225346A1
WO2020225346A1 PCT/EP2020/062669 EP2020062669W WO2020225346A1 WO 2020225346 A1 WO2020225346 A1 WO 2020225346A1 EP 2020062669 W EP2020062669 W EP 2020062669W WO 2020225346 A1 WO2020225346 A1 WO 2020225346A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lactate
strain
bacterium
gene
pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2020/062669
Other languages
English (en)
Inventor
Cédric BOISART
Nicolas Chabot
Marion DE LA MARE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Enobraq
Original Assignee
Enobraq
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Enobraq filed Critical Enobraq
Publication of WO2020225346A1 publication Critical patent/WO2020225346A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid

Definitions

  • the invention relates to a bacterium which naturally oxidizes hydrogen and genetically modified to produce lactate from CO2.
  • the invention also relates to a process for producing lactate, or lactic acid, from CO2 using such genetically modified bacteria.
  • Lactic acid finds applications in many industries.
  • lactic acid is used as a precursor of polylactic acid (PLA) which is a fully biodegradable polymer, used for example in food packaging.
  • Lactic acid can also be used as an additive, as an antioxidant, acidifier or flavor enhancer by the food industry.
  • lactic acid is generally used as a bacteriostatic or as a peeling agent.
  • lactic acid relies mainly on the fermentation of carbohydrate, including glucose, lactose, sucrose or maltose. While many bacteria can cause these sugars to convert into lactic acid, only lactic acid bacteria can produce lactic acid exclusively, with other bacteria generally producing a mixture of several organic acids.
  • lactic acid from fermentable sugars, such as glucose or lactose, raises the issue of competition between food and the production of commodities like lactic acid.
  • the inventors have discovered that it is possible to force bacteria which naturally oxidize hydrogen, and capable of producing organic matter from CO2, in a lactate synthesis pathway, possibly to the detriment of 'other synthetic routes.
  • the inventors have discovered that it is possible to promote an endogenous lactate synthesis pathway, which is not or little expressed naturally in the bacterium, by playing on the expression of the gene or genes associated with this synthesis pathway. .
  • the bacteria oxidizing hydrogen can be genetically modified so as to overexpress an endogenous lactate dehydrogenase or a heterologous one, and / or so as to repress the expression of genes involved in a pathway of synthesis of molecules coming from competing with the production of lactate, in order to produce lactate from CO2.
  • the inventors have discovered that the bacterium Cupriavidus necator (also called Hydrogenomonas eutrophus, Alcaligenes eutropha, Ralstonia eutropha, or Wautersia eutropha) can be genetically modified so as to overexpress an endogenous lactate dehydrogenase, by playing on the promoter and / or the number of copies of the gene encoding this lactate dehydrogenase in particular, so as to produce lactate from CO2.
  • Cupriavidus necator also called Hydrogenomonas eutrophus, Alcaligenes eutropha, Ralstonia eutropha, or Wautersia eutropha
  • lactate can be improved by introducing one or more genes expressing a heterologous lactate dehydrogenase and / or by repressing the expression of genes involved in a pathway of synthesis of molecules competing for the production of lactate .
  • the subject of the invention is therefore a bacterium which naturally oxidizes hydrogen and genetically modified to produce lactate from CO2, said bacterium being genetically modified to overexpress at least one gene encoding a lactate dehydrogenase and to inhibit the expression of an operon called lut, said operon comprising genes encoding proteins using lactate lutA, lutB or lutC ..
  • the bacteria can be genetically engineered to overexpress endogenous and / or exogenous lactate dehydrogenase.
  • a subject of the invention is also the use of a bacterium according to the invention for the production of lactate from CO 2, preferably for the production exclusively of L-lactate, or for the production exclusively of D-lactate.
  • the invention also relates to a process for producing lactate from CO2, comprising the steps of
  • Figure 1 shows a bacteria naturally oxidizing hydrogen according to the invention capable of producing lactate from CO2 and H2.
  • Figure 2 shows the different metabolic pathways naturally present in Cupriavidus necator, and in particular, glycolysis and the Calvin cycle.
  • Figure 3 shows the different genetic modifications (overexpression and / or inhibition of gene expression) that can be performed in Cupriavidus necator to promote the production of L-lactate from CO2.
  • Figure 4 shows the different genetic modifications (overexpression and / or inhibition of gene expression) that can be made in Cupriavidus necator to promote the production of D-lactate from CO2.
  • FIG. 5 represents the production of lactate by the bacterium CN0002 from fructose.
  • FIG. 6 represents the production of lactate by the bacterium naturally oxidizing hydrogen CN0002 and genetically modified to produce lactate from CO2.
  • FIG. 7 represents the comparison of cell growth and lactate consumption in two strains of Cupriavidus necator, CN0004 and CN0009, one of which comprises the deletion of the NdD and NdA genes (CN0009).
  • FIG. 8 represents the comparison of cell growth and consumption of lactate in four strains of Cupriavidus necator, with or without deletion of the operons Iut1 and Iut2.
  • the subject of the invention is a bacterium which naturally oxidizes hydrogen, genetically modified to produce lactate from CO2, said bacterium being genetically modified to overexpress at least one gene encoding a lactate dehydrogenase
  • a bacterium "naturally oxidizing hydrogen” denotes a bacterium capable, without prior genetic manipulation, of using gaseous hydrogen as an electron donor and oxygen as an electron acceptor, and capable of fixing carbon dioxide. These bacteria are also called “knallgas” bacteria. Bacteria that naturally oxidize hydrogen need carbon dioxide as a source of carbon and hydrogen as a source of energy.
  • the bacterium naturally oxidizing hydrogen is preferably selected from Ralstonia sp, Cupriavidus sp., Hydrogenobacter sp., Rhodococcus sp., Hydrogenovibrio sp .; Rhodopseudomonas sp., Rhodobacter sp., Aquifex sp., Corynebacterium sp., Nocardia sp., Rhodospirillum sp., Rhizobium sp., Thiocapsa sp., Pseudomonas sp., Hydrogenomonas sp., Hydrogenobacter sp., Hydrogenophilus sp., Hydrogen arriving ., Helicobacter sp., Xanthobacter sp., Hydrogenophaga sp., Bradyrhizobium sp., Alcaligenes sp., Amycolata sp
  • the bacterium is selected from Rhodococcus opacus, Rhodococcus jostii, Hydrogenovibrio marinus, Rhodopseudomonas capsulata, Rhodopseudomonas palustris, Rhodobacter sphaeroides, Aquifex pyrophilus, Aquifex aeolicus, Cupriavidus necator, Cupriavidus metallidurans, Corynebacterium autotrophicum, Nocardia autotrophica, Nocardia opaca, Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas sulfoviridis, Rhodopseudomonas blastica, Rhodopseudomonas sphaeroides, Rhodopseudomonas acidophila Rhodospirillum rubrum, Rhizobium japonicum Thiocapsa roseopersicina, Pseudomona
  • recombinant bacteria and “genetically modified bacteria” are used interchangeably herein and refer to bacteria which have been genetically modified to express or overexpress endogenous nucleotide sequences, to express heterologous (exogenous) nucleotide sequences, or which have an alteration in the expression of an endogenous gene.
  • alteration is meant that the expression of the gene, or level of an RNA molecule or equivalent RNA molecules encoding one or more polypeptides or polypeptide subunits, or the activity of one or more polypeptides or polypeptide subunits is regulated such that expression, level or activity is greater or less than that observed in the absence of this modification.
  • recombinant bacteria and “genetically modified bacteria” refer not only to the particular recombinant bacteria, but also to the progeny or potential progeny of such a bacterium. As some changes may occur in subsequent generations, due to mutation or environmental influences, this offspring may not be identical to the parent cell, but is still included within the scope of the term as used herein.
  • the term “overexpression of a gene” is understood to mean the fact that said gene is more expressed in the bacterium under consideration than in a bacterium not genetically modified to overexpress said gene, leading to a production or greater production of the gene.
  • corresponding protein and more particularly lactate dehydrogenase
  • such overexpression means the expression of an endogenous lactate dehydrogenase, which is little or no expressed in the non-genetically modified bacteria, or the expression of an exogenous lactate dehydrogenase.
  • the bacterium is selected from bacteria which naturally oxidize hydrogen possessing an endogenous lactate dehydrogenase.
  • the bacterium is selected from Cupriavidus sp., Such as Cupriavidus necator, Hydrogenobacter sp., Such as Hydrogenobacter thermophilus, Rhodococcus sp., Such as Rhodococcus opacus, and Pseudomonas sp., Such as Pseudomonas hydrogenothermophila.
  • endogenous or “native” denote a gene which is normally or naturally present in the genome of the bacterium under consideration.
  • exogenous or “heterologous” as used herein with reference to a gene. (nucleotide sequence) designate a gene which is not normally or naturally present in the genome of the bacterium in question.
  • a bacterium possessing an endogenous lactate dehydrogenase it is possible to genetically modify said bacterium, so as to allow overexpression of said gene.
  • a promoter designates the sequence at the 5 'end of the structural gene in question and which directs the initiation of transcription.
  • the promoters which can be used include constitutive promoters, namely promoters which are active in most cellular states and environmental conditions, as well as inducible promoters which are activated or repressed by stimuli.
  • exogenous physical or chemical which therefore induce a variable level of expression depending on the presence or absence of these stimuli.
  • genetically modify the endogenous promoter for example to remove potential inhibitions of its induction.
  • overexpress an endogenous lactate dehydrogenase by multiplying the number of copies of the gene in the genome of the bacterium, by means of plasmids and / or by introducing nucleotide sequences at other loci on the chromosome (s) of the bacterium. bacteria, etc.
  • the bacterium according to the invention is genetically modified to overexpress endogenous lactate dehydrogenase.
  • the bacterium is genetically modified to overexpress only endogenous L-lactate dehydrogenase or only endogenous D-lactate dehydrogenase.
  • Tables 1 and 2 below list, by way of example, sequences encoding L-lactate dehydrogenase and D-lactate dehydrogenase, respectively, from different bacteria, as well as the corresponding protein sequences. According to the invention, these sequences can be the target of genetic modifications, including multiplication, to lead to a genetically modified bacterium capable of producing lactate from CO2.
  • the bacterium is a Cupriavidus necator bacterium, genetically modified at the level of the promoter associated with the gene (s) encoding endogenous L-lactate dehydrogenase and / or endogenous D-lactate dehydrogenase, in order to promote the expression of one and / or the other gene.
  • Cupriavidus necator has genes encoding an endogenous L-lactate dehydrogenase (Idh) and an endogenous D-lactate dehydrogenase (IdhAI), the expression of which depends on the culture conditions and which is generally almost zero in limitation. of nutrients.
  • this bacterium can advantageously be genetically modified at the level of the nucleotide sequence encoding said promoter, in order to lift this negative regulation and allow the expression of the corresponding genes, even with a limitation of nutrients. It is in particular possible to modify Cupriavidus necator so as to associate the sequence or sequences encoding endogenous L-lactate dehydrogenase and / or D-lactate dehydrogenase with a constitutive promoter or with an inducible promoter.
  • the genes encoding endogenous L-lactate dehydrogenase and / or D-lactate dehydrogenase are modified so as to be under the control of a constitutive (not downregulated) or inducible recombinant promoter. presence of a particular molecule.
  • constitutive promoters such as pLac, pTAC, pJ5 (Gruber et al., 2014), an inducible promoter such as pBAD promoter, inducible to arabinose (Grousseau et al., 2014), the inducible pPHAP promoter in phosphate limitation (Barnard et al. 2015), the pCBBL promoter inducible under autotrophic conditions (Lütte et al., 2012) or the promoter rhamnose inducible pKRrha (Sydow et al., 2017).
  • the bacterium according to the invention is genetically modified to overexpress a gene encoding the expression of a protein having at least 50% homology with SEQ ID No. 1 (sequence of L-lactate Cupriavidus necator H16 dehydrogenase), preferably at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%.
  • the bacterium according to the invention is genetically modified to overexpress a gene encoding the expression of a protein exhibiting at least 50% homology with SEQ ID No. 11 (sequence of a D- Cupriavidus necator H16 lactate dehydrogenase), preferably at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%.
  • the bacterium can be genetically modified to overexpress at least one gene encoding an exogenous, or heterologous, lactate dehydrogenase.
  • the genome of the bacterium is then modified so as to integrate a nucleic acid sequence encoding such an exogenous lactate dehydrogenase.
  • Said nucleic acid sequence may have been introduced into the genome of the bacterium or one of its ancestors, by means of any suitable molecular cloning method.
  • the genome of the bacterium refers to all the genetic material contained in said bacterium, including extrachromosomal genetic material contained for example in plasmids, episomes, synthetic chromosomes, etc.
  • the introduced nucleic acid sequence can be a heterologous sequence, that is to say one which does not exist in the natural state in said bacterium, or a homologous sequence.
  • a transcriptional unit comprising the nucleic acid sequence of interest, placed under the control of one or more promoter (s) and one or more ribosome binding sites, is introduced into the genome of the bacterium.
  • a transcriptional unit also advantageously comprises the usual sequences such as transcriptional terminators, and where appropriate other elements for regulating transcription.
  • a gene encoding an exogenous lactate dehydrogenase can for example be derived from a bacterium, a fungus, a yeast or a mammal.
  • a gene is derived from a bacterium and in particular from E.
  • coli Bacillus coagulans, Pediococcus acidilactici, Streptococcus bovis (Streptococcus equinus), from a lactic acid bacterium, and in particular from Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bulobgaricus, Lactobacillus bulobgaricus, delbrueckii, Lactobacillus plantarum or Lactobacillus pentosus, Lactococcus lactis subsp. lactis.
  • the genes listed in Tables 1 and 2 can also be used to genetically modify a bacterium according to the invention.
  • the sequence of heterologous lactate dehydrogenase used to genetically modify the bacteria according to the invention has at least 50% homology with the sequence of L-lactate dehydrogenase from Pediococcus acidilactici (SEQ ID N ° 2 ), preferably at least 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
  • the sequence of heterologous lactate dehydrogenase used to genetically modify the bacterium according to the invention has at least 50% homology with the sequence of L-lactate dehydrogenase from Streptococcus equinus (Streptococcus bovis) (SEQ ID No. 3), preferably at least 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
  • the sequence of heterologous lactate dehydrogenase used to genetically modify the bacterium according to the invention has at least 50% homology with the sequence of L-lactate dehydrogenase from Bacillus coagulans (SEQ ID N ° 4 ), preferably at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
  • the sequence of heterologous lactate dehydrogenase used to genetically modify the bacterium according to the invention has at least 50% homology with the sequence of L-lactate dehydrogenase from Lactobacillus casei (SEQ ID N ° 5 ), preferably at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
  • the sequence of heterologous lactate dehydrogenase used to genetically modify the bacterium according to the invention has at least 50% homology with the sequence of D-lactate dehydrogenase from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (SEQ ID No. 12), preferably at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
  • the sequence of heterologous lactate dehydrogenase used to genetically modify the bacterium according to the invention has at least 50% homology with the sequence of D-lactate dehydrogenase from Escherichia coli (SEQ ID N ° 13 ), preferably at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
  • the sequence of heterologous lactate dehydrogenase used to genetically modify the bacterium according to the invention has at least 50% homology with the sequence of D-lactate dehydrogenase Bacillus coagulans (SEQ ID No. 14) , preferably at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
  • the bacterium is genetically modified to overexpress at least one gene encoding an L-lactate dehydrogenase (endogenous or heterologous), so as to be able to produce L-lactate.
  • L-lactate dehydrogenase endogenous or heterologous
  • the expression of said gene is advantageously at least partially inhibited, so as to promote the production of L-lactate only.
  • the bacterium can be genetically modified to overexpress at least one gene encoding a D-lactate dehydrogenase (endogenous or heterologous) so as to be able to produce D-lactate.
  • a D-lactate dehydrogenase endogenous or heterologous
  • the expression of said gene is advantageously at least partially inhibited, so as to promote the production of D-lactate only.
  • the term “inhibition of the expression of a gene” is understood to mean the fact that said gene is no longer expressed in the bacterium in question or that its expression is reduced, compared with the wild-type bacterium (not genetically modified for inhibit the expression of the gene), leading to the absence of production of the corresponding protein or to a significant drop in its production, and in particular to a drop greater than 20%, more preferably 30%, 40%, 50%, 60 %, 70%, 80%, 90%.
  • the inhibition may be total, that is to say that the protein encoded by said gene is no longer produced at all.
  • the inhibition of the expression of a gene can in particular be obtained by deletion, mutation, insertion and / or substitution of one or more nucleotides in the gene considered.
  • the inhibition of the expression of the gene is obtained by total deletion of the nucleotide sequence.
  • any method of inhibiting a gene known per se by those skilled in the art and applicable to a bacterium can be used.
  • inhibition of the expression of a gene can be obtained by homologous recombination (Datsenko et al., 2000; Lodish et al., 2000); random or site-directed mutagenesis to modify the expression of a gene and / or the activity of the encoded protein (Thomas et al., 1987); modification of a promoter sequence of the gene to alter its expression (Kaufmann et al., 2011); targeting induces local lesions in the genomes (TILLING); conjugation, etc.
  • RNA interfere refers to any RNAi molecule (eg, single-stranded or double-stranded RNA) which can block the expression of a target gene and / or facilitate degradation. of the corresponding mRNAs.
  • Inhibition of the gene can also be obtained by genomic editing methods which make it possible to directly make genetic modifications to a given genome, via the use of zinc finger nucleases (Kim et al., 1996), of nucleases effectors of the transcription activator type, called "TALEN" (Ousterout et al. 2016), of a system combining Cas9-type nucleases with short grouped and regularly spaced palindromic repeats known as 'CRISPR' (Mali et al., 2013), or meganucleases (Daboussi et al., 2012). Inhibition of the expression of the gene can also be obtained by inactivation of the protein encoded by said gene.
  • Inhibition of the expression of the gene can also be obtained by deletion, mutation, insertion and / or substitution of one or more nucleotides in the promoter upstream of the gene considered. Inhibition of the expression of the gene can also be obtained by deletion, mutation, insertion and / or substitution of one or more nucleotides in the ribosome binding site upstream of the gene in question.
  • the lut operon hitherto unknown in bacteria naturally oxidizing hydrogen combines genes which have less than 50% identity with the genes of the lut operon of B. subtilis (Chai et al., 2009) known for allow the growth of this bacteria on L-lactate as a carbon source.
  • the genes united in the lut operon have less than 44% identity with those of B. subtilis.
  • Rhodococcus opacus the genes gathered in the lut operon have less than 40% identity with those of B. subtilis.
  • Rhodococcus jostii the genes gathered in the lut operon have less than 40% identity with those of B. subtilis.
  • the genes gathered in the lut operon have less than 37% identity with those of B. subtilis.
  • the genes gathered in the lut operon have less than 55% identity with those of B. subtilis.
  • the genes gathered in the lut operon have less than 43% identity with those of B. subtilis.
  • the genes brought together in the lut operon have less than 42% identity with those of B. subtilis.
  • the genes gathered in the lut operon have less than 42% identity with those of B. subtilis.
  • Table 3 identifies the genes encoding proteins using lactate collected in several bacteria naturally oxidizing hydrogen.
  • inhibiting the expression of the lut operon comprises inhibiting the expression of at least one of the genes lutA, lutB or lutC, preferably at least two genes among the three, more preferably the inhibition of the expression of the three genes lutA, lutB and lutC.
  • the inhibition of the expression of a gene of the lut operon consists of the partial or total deletion of the sequence encoding said gene.
  • Inhibition of expression of the lut operon preferably consists of a deletion of said lut operon.
  • lut operons are found.
  • at least one of the lutA, lutB or lutC genes of one of the lut operons is inhibited.
  • at least one of the lutA, lutB or lutC genes of at least two of the lut operons is inhibited.
  • the expression of at least one of the lutA, lutB or lutC genes of each of the lut operons is inhibited.
  • the expression of at least one of the lut operons is inhibited.
  • the expression of at least two of the lut operons is inhibited.
  • the expression of each of the lut operons is inhibited. This is in particular the case for Cupriavidus necator which comprises two operons Iut1 and Iut2 and where preferably the expression of the two operons Iut1 and Iut2 is inhibited.
  • certain bacteria which naturally oxidize hydrogen and which may be genetically modified according to the invention exhibit a pathway for the synthesis of polyhydroxybutyrate (PHB) from pyruvate. This is particularly the case with Cupriavidus necator ( Figure 2).
  • PHB polyhydroxybutyrate
  • Such a biosynthetic pathway can compete with the lactate synthesis pathway, forcing the consumption of pyruvate in this pathway.
  • such a bacterium is genetically modified to at least partially inhibit the PHB synthesis pathway (FIG. 3).
  • the genetically modified bacterium is Cupriavidus necator, in which the expression of at least one and preferably of the three genes among the genes encoding a phaA (GenBank: CAJ91322.1), a phaB (GenBank: CAJ92574.1) and a phaC (GenBank: CAJ92572.1) is inhibited ( Figure 2).
  • the inventors have discovered that such a bacterium, also genetically modified to overexpress a lactate dehydrogenase, is capable of producing large quantities of lactate in the presence of CO2 as the sole source of carbon, the pyruvate produced not being consumed or little consumed by the route of CO2. PHB production.
  • a gene encoding a phosphoenolpyruvate synthase (EC: 2.7.9.2), which converts pyruvate into phosphoenol pyruvate (PEP ), and / or a pyruvate carboxylase (EC: 6.4.1.1) and / or a pyruvate dehydrogenase complex (EC: 1.2.4.1) and / or a fumarate reductase (EC: 1.3.5.4).
  • the genetically modified bacterium is Cupriavidus necator, in which the expression of at least one gene among the genes encoding a ppsa (GenBank: CAJ93138.1), a pyc (GenBank: CAJ92391.1) , a pdhA (GenBank: CAJ92510.1) and an sdhABCD (GenBank: CAJ93711.1, CAJ93712.1, CAJ93713.1, CAJ93714.1) is inhibited (FIG. 2).
  • acetyl-CoA hydrolase EC: 3.1.2.1
  • a phosphate acetyltransferase EC: 2.3.1.8
  • an Acetate kinase EC: 2.7.2.1
  • a propionate CoA-transferase EC: 2.8.3.1
  • an Acetaldehyde dehydrogenase EC: 1.2. 1.10).
  • the genetically modified bacterium is Cupriavidus necator, in which the expression of at least one gene among the genes encoding an Acetyl-CoA hydrolase (GenBank: CAJ96157.1), a Phosphate acetyltransferase (pta1, pta2) (GenBank: CAJ96416.1, GenBank: CAJ96653.1), an Acetate kinase (ackA, ackA2) (GenBank: CAJ91818.1, GenBank: CAJ96415.1), a Propionate CoA-transferase (GenBank: CAJ93797.1) , a Succinyl-CoA: acetate CoA-transferase (GenBank: CAJ92496.1) and an acetaldehyde dehydrogenase (mhpf) (GenBank: CAJ9291 1.1) is inhibited (FIG.
  • an Acetyl-CoA hydrolase GenBank: CAJ96157.1
  • bacterium also genetically modified to overexpress a lactate dehydrogenase and inhibit the expression of at least one gene of the lut operon is capable of producing large quantities of lactate in the presence of CO2 as the sole source of carbon, the pyruvate produced not being consumed or little consumed by these competitive routes.
  • bacteria which naturally oxidize for hydrogen possess one or more genes encoding a lactate ferri cytochrome C reductase.
  • Such an enzyme is also capable of reducing the level of lactate produced, by converting said lactate into pyruvate.
  • the gene encoding said enzyme is advantageously at least partially inhibited.
  • the invention advantageously proposes to use a genetically modified bacterium according to the invention to produce lactate from CO 2 .
  • a bacterium genetically modified to overexpress an L-lactate dehydrogenase, and where appropriate inhibit a D-lactate dehydrogenase is used to exclusively produce L-lactate.
  • bacteria genetically engineered to overexpress D-lactate dehydrogenase, and optionally inhibit L-lactate dehydrogenase is used to exclusively produce D-lactate.
  • the invention more particularly provides a process for producing lactate from CO 2 , according to which one cultivates, for example in batch, fed-batch or in continuous culture, a genetically modified bacterium according to the invention in the presence of CO 2 and the lactate produced is recovered.
  • a stock solution is added during fermentation to control the pH.
  • the lactic acid is then found in the fermentation medium in the form of a salt (sodium lactate, potassium lactate, calcium lactate or ammonium lactate, alone or as a mixture, depending on the base chosen to regulate the pH of the fermentation medium).
  • the fermentation broth containing the bacteria, the impurities of the fermentation medium (unconsumed proteins and inorganic salts of various kinds) and the lactate salt, is then treated in order to separate them.
  • a separation step can in particular be carried out using a cell separator such as a centrifuge, a microfiltration or ultrafiltration device. After separation, one obtains a concentrated cellular biomass on the one hand and a lactate salt solution on the other.
  • This step of recovering lactic acid from the fermentation medium can in particular be carried out via the extraction of lactic acid as such from the fermentation medium, or by acidification of the medium with sulfuric acid.
  • a purification step by extraction, esterification, distillation or hydrolysis can then be carried out, in order to obtain a lactic acid with a high degree of purity.
  • the source of CO 2 can be pure CO 2 or CO 2 from emissions from factories having industrial processes such as petroleum refineries, cement plants, ammonia production, methanol production. , etc.
  • the CO 2 can also be a fermentation product, a gas enriched in CO 2 , an at least partially purified CO 2 gas, a carbonate or bicarbonate solution, and / or formic acid.
  • the CO 2 content of the total gas can be from 10% to 100%.
  • Such a gas containing CO 2 can be injected directly or via an intermediate CO 2 capture or purification step.
  • the CO 2 purification can be carried out by chemical treatment, for example in the presence of amines, or by enzymatic treatment using, for example, a carbonic anhydrase.
  • the hydrogen source can be a product of the steam reforming of methane, the electrolysis of water or be a co-product (“fatal” hydrogen) of industrial processes such as the chlor-alkali process during the preparation of chlorine or the incineration of waste.
  • the bacteria upstream in particular in the presence of fermentable sugars, such as glucose, fructose or glycerol. It is also possible to cultivate the bacteria in the presence of CO2 and another carbon source during the lactate production step.
  • fermentable sugars such as glucose, fructose or glycerol.
  • Example 1 strain producing lactate CN0001
  • lactate-producing strain CN0001 is produced by a Cupriavidus necator H16 PHB-4 strain (DSM No. 541). This strain does not form poly-b-hydroxy-butyrate (PHB).
  • PHB poly-b-hydroxy-butyrate
  • a plasmid carrying Cupriavidus necator L-lactate dehydrogenase (Idh, EC: 1.1.1.27) under an arabinose-inducible promoter is cloned in one step in vitro using the In-Fusion® assembly protocol (Clontech).
  • the oligonucleotides are synthesized and purified (desalted) by Eurofins Genomics.
  • the Idh gene is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 PHB-4 strain using oligonucleotides 1 (5 'GGATCCAAAC TCGAGTAAGG ATCTCC 3') and 2 (5 'ATGTATATCT CCTTCTTAAA AGATCTTTTG AATTCC 3') and of the Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer enzyme (New England Biolabs, Evry, France).
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the backbone plasmid pJM3 (Müller et al., 2013) derived from the plasmid pBBR1-MCS2 (Kovach et al, 1995), containing a pBAD promoter from Escherichia coli, is amplified using oligonucleotides 3 (5 ′ GAAGGAGATA TACATATGAA GATCTCCCTC ACCAGCG 3 ') and 4 (5' CTCGAGTTTG GATCCTCAGG CCGTGGGGAC GGC 3 ') and the Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix enzyme (New England Biolabs, Evry, France).
  • the PCR product is digested with the Dpnl enzyme (New England Biolabs, Evry, France): 1 ⁇ l of Dpnl is added to 50 ⁇ L of PCR product, then incubated for 15-60 min at 37 ° C, the enzyme is then inactivated for 10 min at 80 ° C.
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the pBBAD-ldh plasmid is inserted into the Cupriavidus necator H16 PHB-4 strain by electroporation (protocol adapted from Taghavi et al., 1994).
  • Cupriavidus necator cells are cultured in TSB medium containing 27.5 g / L of tryptic soy broth (TSB, Becton Dickinson, Sparks, Maryland, USA, 3ml in 10ml tubes) and incubated overnight at 30 ° C with vigorous shaking. .
  • 1 ml of the culture is transferred into a 250 ml Erlenmeyer flask containing 25 ml of TSB medium and incubated at 30 ° C., 200 rpm until an OD 600 nm of 0.5-0.6 is reached.
  • the cells are then harvested. and washed twice with 25mL of cold wash buffer (10% glycerol, 90% water [vol / vol]).
  • the cells made by this electro-competent process are then concentrated in the washing solution in order to obtain an OD 600 nm of 50 and aliquoted by 150 ⁇ L.
  • the Cupriavidus necator H16 PHB-4 pJM3-ldh strain is recovered and named CN0001. Genetic modifications are validated by sequencing.
  • the minimum medium A used contains: NaH2PO4, 4.0 g / L; Na 2 HP0 4 , 4.6 g / L; K 2 S0 4 , 0.45 g / L; MgS0 4 0.39 g / L, CaCl 2 , 0.062 g / L; NH 4 CI 0.05% (w / v), trace elements, 1 ml / L (FeS0 4 -7H 2 0.15 g / L; MnS0 4 H 2 0, 2.4 g / L; ZnS0 4 -7H 2 0, 2.4 g / L; -5H20 CUS0 4, 0.48 g / L HCl 0, 1 M).
  • the minimum medium B used contains per liter: MgS0 4 , 7H 2 0, 0.75 g; phosphate (Na 2 HP0 4 , 12H 2 0, 1, 5g; KH 2 P0 4 , 0.25 g); nitrilotriacetic acid, 0.285g; ammonium iron citrate (III), 0.9 g; CaCl 2 , 0.015 g; trace of elements (H 3 BO 3 , 0.45 mg; CoCl 2 , 6H 2 0, 0.3 mg; ZnS0 4 , 7H 2 0, 0, 15 mg; MnCl 2 , 4H 2 0, 0.045 mg; Na 2 Mo0 4 , 2H 2 0, 0.045 mg; NiCl 2 , 6H 2 0, 0.03 mg; CuS0 4 , 0.015 mg); kanamycin, 0.1 g.
  • Precultures An isolated colony of strain CN0001 is used to inoculate the first culture which is cultured for 24 h with 10 mL of TSB containing 10 pg / mL of gentamycin and 200 ⁇ g / ml kanamycin, in a 100 ml baflé Erlenmeyer flask. Two other propagation steps are carried out for 12 h each (25 ml_ and 300 ml_ of minimum medium A, respectively in Erlenmeyer flasks of 250 ml_ and 3 L). Each culture is grown at 30 ° C and stirred at 100 rpm in an incubator. This preculture is used to inoculate the stage of culture in bioreactors.
  • the culture of strain CN0001 in fed-batch is carried out in three phases.
  • the first phase consists of a phase of controlled growth on fructose to reach 0.9 g / L of biomass at a specific growth rate of 0.16 h 1 .
  • the second phase is carried out to allow the adaptation of the cellular metabolism to the gaseous substrates. It is started by a flow of 0.22 L / min of a commercial mixture of H2 / O2 / CO2 / N2 (mol%: 60: 2: 10:28, Air Liquide, Paris, France).
  • the third phase consists of a nitrogen limited growth on gaseous substrates coupled with the production of lactate.
  • This phase is initiated by the addition of 1 g / L of L-arabinose to induce the expression of lactate dehydrogenase.
  • Nitrogen is supplied from a solution of 56 g / L of NH3, to control a residual specific growth rate of 0.02 h 1 .
  • This culture is carried out in 1.4 L BDCU B. Braun bioreactors. The temperature is regulated to 30 ° C and the pH to 7.0 by the addition of a 2.5 M KOH solution.
  • the fermentation supernatant is analyzed by HPLC-UV-RI chromatography.
  • the regularly sampled fermentation must (1 mL) is first centrifuged for 10 min at 10,000 g. Then, it is filtered through 0.45 ⁇ m (Minicart RC4, Sartorius).
  • the HPLC system used is a Thermo Scientific UltiMate 3000 HPLC, coupled to a refractometer and UV detector (210 nm). 10 ⁇ l of each sample is injected onto an Aminex HPX-87H H + column, 300 mm ⁇ 7.8 mm (Biorad).
  • the eluent is an aqueous solution of 4 mM sulfuric acid.
  • the flow rate is set at 0.5 ml / min.
  • the oven temperature is 45 ° C. Isocratic elution is performed. Quantification is carried out using an appropriate standard range. If necessary, the samples are diluted.
  • the CN0001 strain produces under these culture conditions from 5 to 100 mg / L of lactate.
  • Example 2 Construction of a bacterium naturally oxidizing hydrogen, Cupriavidus necator and genetically modified to plasmidly overexpress an endogenous lactate dehydrogenase and to produce lactate from C0 2 (CN0002).
  • a plasmid carrying Cupriavidus necator L-lactate dehydrogenase (Idh, EC: 1.1.1.27) under an arabinose-inducible promoter is cloned in one step in vitro using the In-Fusion® assembly protocol (Clontech).
  • the oligonucleotides are synthesized and purified (desalted) by Eurofins Genomics.
  • the Idh gene (GenBank: CAJ91814.1) is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 PHB-4 strain using oligonucleotide oligonucleotides 7 (5 'AAGGAGATAT ACATATGAAG ATCTCCCTCA CCAGCG 3') and 8 (5 'ACTCGAGTTT GGATCCTCAG GCCGTGGGGA CGGC 3') and Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer enzyme (New England Biolabs, Evry, France).
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the backbone plasmid pBADTrfp (Bi et al., 2013) derived from the plasmid pBBR1-MCS (Kovach et al., 1995), containing a pBAD promoter from Escherichia coli, is digested with the restriction enzymes BamHI-HF and Ndel (New England Biolabs, Evry, France) in order to remove the sequence encoding the RFP protein.
  • the 5247 base pair DNA fragment containing the pBBR1 origin of replication, the selection gene (kan) and the pBAD promoter is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • n-fusion In vitro assembly by n-fusion is carried out with the two fragments in order to obtain the plasmid pBAD-ldh (cn).
  • 5 ⁇ l of the construct is transformed into chemocompetent Escherichia coli Stellar TM (Clontech) cells.
  • the transformants are selected on a LB / Agar medium (Tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, NaCl 5 g / L, Sigma-Aldrich, agar 20 g / L) containing 25 pg / mL of kanamycin (Gibco TM).
  • the selection of positive clones is carried out by PCR on colonies using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 9 (5 'CGAAGGTGAG CCAGTGTGAC TC 3') and 10 (5 'CCTGTCGATC CTGCCCAACT AC 3 ').
  • the NucleoSpin® Plasmid kit (Macherey-Nagel)
  • the correct insertion of the l.ldh gene is confirmed by sequencing (Eurofins Genomic) with oligonucleotides 9 and 11 (5 'CATTGATTAT TTGCACGGCG TCAC 3 ').
  • Plasmid pBAD-1.ldh (cn) is inserted into an electrocompetent strain Escherichia coli S17-1 by electroporation using a Gene Peurer electroporator, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
  • the selection of the positive clones is carried out by PCR on a colony using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 9 and 10.
  • the clone of interest is isolated on LB / agar medium (Tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, NaCl 5 g / L, Sigma-Aldrich, agar 20 g / L) containing 25 pg / mL of kanamycin and incubated overnight at 37 ° C.
  • the conjugation between the Escherichia coli S17-1 cells and those of the Cupriavidus necator H16 PHB-4 strain is carried out as follows:
  • the Cupriavidus necator cells are cultured in 3 mL of TSB medium containing 27.5 g / L of tryptic soy broth (TSB, Becton Dickinson, Sparks, Maryland, USA) and incubated for 20 h at 30 ° C. with vigorous shaking.
  • the Escherichia coli cells are cultured in 3 mL of LB medium (Tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, NaCl 5 g / L, Sigma-Aldrich) containing 25 pg / mL of kanamycin and incubated overnight at 37 ° C with vigorous stirring.
  • the optical density (OD 600 nm ) is measured for each culture and the equivalent of 1 OD of cells are transferred to a 1.5 ml tube and centrifuged (5 minutes, 3000 rpm). The supernatant is removed and the cells are washed in 1 ml of PBS (Sigma-Aldrich). The washing is repeated a second time. 50 ⁇ L of the Cupriavidus necator cell suspension and 50 ⁇ L of the Escherichia coli cell suspension are taken and mixed in a 1.5 mL tube. This mixture is deposited in the form of a drop on a non-selective LB / Agar medium containing 2% fructose and incubated for 6 hours at 30 ° C.
  • the cells are then scraped and resuspended in 1 ml of PBS. This suspension is diluted to 1: 1000th and 100 ⁇ l of this dilution are spread on selective LB / Agar medium containing 2% fructose, 300 ⁇ g / ml of kanamycin and 10 ⁇ g / ml of gentamycin (Sigma-Aldrich). The cells are incubated for 24 hours at 30 ° C. Isolated clones are taken, streaked on the same selective medium and incubated for 24 hours at 30 ° C.
  • the selection of the clones containing the plasmid pBAD-ldh (cn) is carried out by PCR on a colony using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 9 and 10.
  • the Cupriavidus necator H 16 PHB-4 pBAD-ldh (cn) strain is recovered and named CN0002. Genetic modifications are validated by sequencing.
  • Example 3 Production of lactate from Fructose by Erlenmeyer culture of a bacteria naturally oxidizing hydrogen, Cupriavidus necator, genetically modified (CN0002)
  • strain CN0002 Cupriavidus necator H 16 PHB-4 pBAD -Idh
  • C. necator's LDH lactate dehydrogenase
  • This strain is naturally resistant to gentamycin and carries plasmid resistance to kanamycin.
  • the rich medium consisted of 27.5% (w / v) soybean trypticase broth (TSB, Becton Dickinson, France).
  • the minimum medium used for the cultures in Erlenmeyer flasks contained: 4.0 g / L of NaH 2 P0 4 2H 2 0; 4.6 g / L of Na 2 HP0 4 12H 2 0; 0.45 g / LK 2 S0 4 ; 0.39 g / L MgS0 4 7H 2 0; 0.062 g / L of CaCl 2 2H 2 0 and 1 ml / L of trace element solution.
  • the trace element solution contained: 15 g / L FeS0 4 7H 2 0; 2.4 g / l MnS0 4 H 2 0; 2.4 g / L of ZnS0 4 7H 2 0 and 0.48 g / L of CuS0 4 5H 2 0 in 0.1 M HCl.
  • Fructose (20 g / L) was used as a carbon source.
  • NhUCI 0.5 g / L
  • Inoculation chain A clone of strain CN0002 subcultured from a culture plate was first cultured for 8 h in 5 mL of medium rich with gentamycin (10 pg / mL) and kanamycin (200 pg / mL) (depending on the strain), in culture tubes, at 30 ° C. with stirring (200 rpm). This first preculture was used to inoculate the second preculture at an initial ⁇ qboo of 0.05 in 25 mL of MMR medium in 250 mL baffled Erlenmeyer flasks which were incubated for 20 h at 30 ° C, 200 rpm.
  • This second preculture was used to inoculate the Erlenmeyer culture in 50 mL of MMR medium in the presence of gentamycin (10 pg / mL) and kanamycin (200 pg / mL) (depending on the strain).
  • the initial target DC> 600 was 0.05.
  • the heterotrophic culture was carried out in a volume of MMR of 50 mL in baffled Erlenmeyer flasks of 500 mL, at a temperature of 30 ° C. and stirring at 200 rpm. A growth phase lasting 20 hours was carried out until a biomass of 1 g / L was obtained. After this first phase of growth, a modification of the aeration is carried out (2% air or 0.4% of C> 2), induction of the LDH promoter is carried out by adding 1 g / L of 'arabinose (depending on the strain) which leads to a lactate production phase lasting 120 h.
  • Example 4 Production of lactate from CO2 by fermentation of a bacteria naturally oxidizing hydrogen, Cupriavidus necator, genetically modified (CN0002).
  • strain CN0002 Cupriavidus necator H 16 PHB-4 pBAD -Idh
  • C. necator's LDH lactate dehydrogenase
  • This strain is naturally resistant to gentamycin and carries plasmid resistance to kanamycin.
  • the rich medium consisted of 27.5% (w / v) soybean trypticase broth (TSB, Becton Dickinson, France).
  • the minimum medium used for the cultures in Erlenmeyer flasks contained: 4.0 g / L of NaH 2 P0 4 2H 2 0; 4.6 g / L of Na 2 HP0 4 12H 2 0; 0.45 g / LK 2 S0 4 ; 0.39 g / L MgS0 4 7H 2 0; 0.062 g / L of CaCl 2 2H 2 0 and 1 ml / L of trace element solution.
  • the trace element solution contained: 15 g / L FeS0 4 7H 2 0; 2.4 g / l MnS0 4 H 2 0; 2.4 g / L of ZnS0 4 7H 2 0 and 0.48 g / L of CuS0 4 5H 2 0 in 0.1 M HCl.
  • Fructose (20 g / L) was used as a carbon source.
  • NH 4 CI (0.5 g / L) was used as the nitrogen source to achieve a biomass concentration of approximately 1 g / L. 0.04 g / L of NaOH was added.
  • the minimum medium used in the bioreactor for gas fermentations consisted of: 0.29 g / L of NitriloTriAcetic acid; 0.09 g / L of ferric ammonium citrate; 0.75 g / L MgS0 4 7H 2 0; 0.015 g / L of CaCl 2 2H 2 0 and 1.5 ml / L of trace element solution.
  • the composition of the trace element solution was: 0.3 g / L of H 3 BO 3 ; 0.2 g / L of CoCl 2 6H 2 0; 0.1 g / L ZnS0 4 7H 2 0; 0.03 g / L MnCl 2 4H 2 0; 0.03 g / L of Na 2 Mo0 4 2H 2 0; 0.02 g / L of NiCl 2 6H 2 0; 0.01 g / L CuS0 4 5H 2 0. (NH 4 ) 2 S0 4 (1.6 g / L) was used as the nitrogen source to achieve a biomass concentration of approximately 2.5 g / L. The pH was adjusted to 7 with 2.5 M KOH.
  • Inoculation chain A clone of strain CN0002 subcultured from a culture plate was first cultured for 24 h in 5 mL of TSB medium with gentamycin (10 mg / L) and kanamycin (50 mg / L) (depending on the strain), in 50 mL baffled Erlenmeyer flasks, at 30 ° C. with stirring (110 rpm). The culture medium was then centrifuged for 10 min at 1900 g.
  • the cells were resuspended in 5 mL of MMR medium, and were used to inoculate the 45 mL of MMR medium with 5.5 ⁇ g / mL gentamycin and 100 ⁇ g / mL kanamycin in 500 mL baffled Erlenmeyer flasks which were incubated for 20-24 h at 30 ° C, 1 10 rpm.
  • the culture medium was centrifuged for 5 min at 4000 g and the cells were resuspended in 30 mL of FAME medium, and were used to inoculate the 300 mL of FAME medium with 100 mg / L of kanamycin in the gas bioreactor.
  • the initial target ⁇ qboo was 0.2.
  • Gas bioreactor Autotrophic culture was carried out in a gas bioreactor with a working volume of 330 mL.
  • the temperature was set at 30 ° C., the pH at 7.
  • the pressure and the stirring speed were defined according to the needs of the culture.
  • the gas flow rates were controlled individually (C0 2 , H 2 , air).
  • a gas analyzer was used for the analysis of the outlet gases (% 0 2 and C0 2 ) and a volumeter to measure the total outlet gas flow rates. After 53 hours of growth, approximately 3 g / L of biomass was reached, the dissolved oxygen concentration fell to 0 and 160 mg / L of lactate was produced.
  • Example 5 Construction and evaluation of a genetically modified strain of Cupriavidus necator in which a heterologous lactate dehydrogenase from Streptococcus bovis is overexpressed (CN0003).
  • lactate-producing strain CN0003 is produced by a Cupriavidus necator H16 PHB-4 strain (DSM No. 541). This strain does not form poly-b-hydroxy-butyrate (PHB).
  • PHB poly-b-hydroxy-butyrate
  • a plasmid carrying L-lactate dehydrogenase (Idh, EC: 1.1.1.27) from Streptococcus bovis (ATCC 33317) under an arabinose-inducible promoter is cloned in a step in vitro via the In-Fusion® assembly protocol (Clontech ).
  • the oligonucleotides are synthesized and purified (desalted) by Eurofins Genomics.
  • the Idh gene (GenBank: KFN85486.1) is recoded according to the codon usage bias described for Cupriavidus necator H16 and synthesized in vitro (GenScript®). It is amplified by PCR using oligonucleotides 12 (5 'AAGGAGATAT ACATATGACC GCGACCAAGC AGCAC 3') and 13 (5 'ACTCGAGTTT GGATCCTCAG TTCTTGCAGG CCGACGCGA 3') and the enzyme Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer England Biolabs, Evry, France). The PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the backbone plasmid pBADTrfp (Bi et al., 2013) derived from the plasmid pBBR1-MCS (Kovach et al., 1995), containing a pBAD promoter from Escherichia coli, is digested with the restriction enzymes BamHI-HF and Ndel (New England Biolabs, Evry, France) in order to remove the sequence encoding the RFP protein.
  • the 5247 base pair DNA fragment containing the origin of replication pBBR1, the selection gene (kan) and the pBAD promoter is purified on gel with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • n-fusion In vitro assembly by n-fusion is carried out with the two fragments in order to obtain the plasmid pBAD-ldh (sb).
  • 5 ⁇ l of the construct is transformed into chemo-competent Escherichia coli Stellar TM (Clontech) cells.
  • the transformants are selected on an LB / Agar medium (Tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, NaCl 5 g / L, Sigma-Aldrich, agar 20 g / L) containing 25 pg / mL of kanamycin (Gibco TM) .
  • the pBAD-ldh (sb) plasmid is inserted into an electrocompetent strain Escherichia coli S17-1 by electroporation using a Gene Peurer electroporator, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
  • the selection of the positive clones is carried out by PCR on colonies using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 9 and 14.
  • the clone of interest is isolated on LB / agar medium (Tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, NaCl 5 g / L, Sigma-Aldrich, agar 20 g / L) containing 25 pg / mL kanamycin and incubated overnight at 37 ° C.
  • the Cupriavidus necator cells are cultured in 3 mL of TSB medium containing 27.5 g / L of tryptic soy broth (TSB, Becton Dickinson, Sparks, Maryland, USA) and incubated for 20 h at 30 ° C. with vigorous stirring.
  • the Escherichia coli cells are cultured in 3 mL of LB medium (Tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, NaCl 5 g / L, Sigma-Aldrich) containing 25 pg / mL of kanamycin and incubated overnight at 37 ° C with vigorous stirring.
  • the optical density (OD 600 nm ) is measured for each culture and the equivalent of 1 OD of cells is transferred to a 1.5 ml tube and centrifuged (5 minutes, 3000 rpm). The supernatant is removed and the cells are washed in 1 ml of PBS (Sigma-Aldrich). The washing is repeated a second time. 50 ⁇ L of the Cupriavidus necator cell suspension and 50 ⁇ L of the Escherichia coli cell suspension are taken and mixed in a 1.5 ml tube. This mixture is deposited in the form of a drop on a non-selective LB / Agar medium containing 2% fructose and incubated for 6 hours at 30 ° C.
  • the cells are then scraped and resuspended in 1 ml of PBS. This suspension is diluted 1: 1000th and 100 ⁇ l of this dilution are spread on selective LB / Agar medium containing 2% fructose, 300 ⁇ g / ml of kanamycin and 10 ⁇ g / ml of gentamycin (Sigma-Aldrich). The cells are incubated for 24 hours at 30 ° C. Isolated clones are taken, streaked on the same selective medium and incubated. 24 hours at 30 ° C.
  • the selection of the clones containing the plasmid pBAD-Idh (sb) is carried out by PCR on a colony using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 9 and 14.
  • the Cupriavidus necator H 16 PHB-4 pBAD-ldh (sb) strain is recovered and named CN0003.
  • strain CN0003 in fructose The production of lactate on fructose of the Cupriavidus necator H 16 strain PHB-4 pBAD-ldh (sb) (CN0003) was evaluated according to the method described in Example 3. Under these culture conditions , strain CN0003 produces 1 g / L of lactate after 140 h of culture.
  • Example 6 Construction of a genetically modified Cupriavidus necator strain in which a polyhydroxybutyrate (PHB) biosynthetic pathway is deleted and in which an endogenous lactate dehydrogenase is overexpressed (CN0004).
  • PHB polyhydroxybutyrate
  • Cupriavidus necator H16 (ATCC 17699) strain is used.
  • the deletion of the polyhydroxybutyrate (PHB) biosynthetic pathway operon is inhibited by insertion of endogenous lactate dehydrogenase.
  • PHB polyhydroxybutyrate
  • a plasmid carrying L-lactate dehydrogenase from Cupriavidus necator (Idh, EC: 1.1.1.27) under inducible promoter pLac as well as the sequences of the upstream and downstream areas of homology of the phaCAB operon is cloned in a step in vitro via the NEBuilder ® HiFi DNA Assembly Cloning protocol (New England Biolabs, Evry, France).
  • the oligonucleotides are synthesized and purified (desalted) by Eurofins Genomics.
  • the Idh gene is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 strain using oligonucleotides 15 (5 'AGACAATCAA ATC TTTACAC TTTATGCTTC CGGCTCGTAT GTTGTGTGGA ATTGTGAGCG GATAACAATT TCACATCCCCGC AAGATAGCG GATAACAATT TCACATCCCCGC AAGATAGCG GATAACAATT TCACATCCCGC AAGATAGCG GATAACAATT TCACATCCCCGC AAGATAGCG GATAACAATT TCACATCCCGC AAGATAGCG GATAACAATT TCACATCCCCGC AAGATAGCG GATAACAATT TCACATCCCGC AAGATAGCG GATAACAATT TCACATCCCGAC 3' with 5 'zone) covering 13 base pairs with the 3 'end of the region of homology upstream of the phaCAB operon and the pLac promoter sequence from pJQ200mp18 (Quandt and Hynes, 1993) and 16 (5'
  • the sequence of the homology zone upstream of the phaCAB operon is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 strain using oligonucleotides 17 (5 'GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGGGTCG CTTCTACTCC TATCG 3') exhibiting in 5 'an overlap area of 25 base pairs with the 3' end of the plasmid pJQ200mpTet and 18 (5 'CATAAAGTGT AAAGATTTGA TTGTCTCTCT GCC 3') presenting in 5 'a 13 base pair overlap area with the 5' end of the pLac promoter sequence and of the KOD Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) with 5% DMSO.
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the sequence of the downstream homology zone of the phaCAB operon is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 strain using oligonucleotides 19 (5 'CCCCACGGCC TGACCTGCCG GCCTGGTTCA ACC 3') exhibiting in 5 ' an overlap zone of 13 base pairs with the 3 'end of the sequence of the Idh gene of the Cupriavidus necator H 16 and 20 strain (5' TACGAATTCG AGCTCGGTAC CCGGGTTCTG GATGTCGATG AAGGCCTG 3 ') exhibiting in 5' an overlap zone of 25 base pairs with the 5 'end of the plasmid pJQ200mpTet and the KOD Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) with 5% DMSO.
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the backbone plasmid pJQ200mpTet is a derivative of the plasmid pJQ200mp18 (Quandt and Hynes, 1993) where the gene for resistance to gentamycin has been replaced by the gene for resistance to tetracycline.
  • the backbone plasmid pJQ200mpTet is cut with the restriction enzyme BamHI-HF (New England Biolabs, Evry, France). The digestion product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the transformants are selected on an LB / Agar medium (Tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, NaCl 5 g / L, Sigma-Aldrich, agar 20 g / L) containing 15 ⁇ g / mL of tetracycline.
  • the selection of positive clones is carried out by PCR on colony using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 22 (5 'CATGCAAAGT GCCGGCCAGG 3') and 23 (5 'CTGCACGAAC ATGGTGCTGG CT 3 ').
  • Plasmid pJQ200mp-AphaCABQpLac L-ldh is inserted into an electrocompetent strain Escherichia coli S17-1 by electroporation using a Geneuterer electroporator, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
  • the selection of the positive clones is carried out by PCR on colonies using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) TM) and oligonucleotides 22 and 23.
  • the clone of interest is isolated on LB / agar medium. (Tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, NaCl 5 g / L, Sigma-Aldrich, agar 20 g / L) containing 15 pg / mL of tetracycline and incubated overnight at 37 ° C.
  • the conjugation between the Escherichia coli S17-1 cells and those of the Cupriavidus necator H16 strain (ATCC 17699) was adapted from the protocol of Lenz et al., 1994.
  • the sucrose selection method (15% sucrose used) with SacB made it possible to precisely delete the phaCAB operon and insert pLac L-ldh into it.
  • the clones are validated by a PCR on colony using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) TM) and oligonucleotides 22 and 23.
  • selection positive clones among the clones sensitive to tetracycline is carried out by PCR on a colony using the enzyme Kod Xtreme TM Hot Start DNA Polymerase (Novagen) (KrauBe et al., 2009) and oligonucleotides 76 (5 'CTGCATGTTC ATGAACTGCG AC 3 ') and 77 (5' CGACGCGTCA ACCATGTTCG 3 ').
  • the Cupriavidus necator H16 AphaCABQpLac_L-ldhc .necat o r strain is recovered and named CN0004.
  • the genetic modifications are validated by sequencing using oligonucleotides 78 (5 'GTACCTTGCC GACATCTATG C 3'), 79 (5 'GCTGCTTGCA TCACGGACTT G 3'), 10, 77 and 76.
  • Example 7 Construction of a genetically modified Cupriavidus necator strain in which a polyhydroxybutyrate (PHB) biosynthetic pathway is deleted, an endogenous lactate dehydrogenase is overexpressed and in which a pyruvate carboxylase is deleted (CN0005)
  • PHB polyhydroxybutyrate
  • a plasmid carrying the sequences of the upstream and downstream regions of homology of the gene encoding the pyruvate carboxylase (pyc) of Cupriavidus necator is cloned in one step in vitro using the NEBuilder ® HiFi DNA Assembly Cloning protocol (New England Biolabs, Evry, France).
  • the oligonucleotides are synthesized and purified (desalted) by Eurofins Genomics.
  • the sequence of the region of homology upstream of the gene encoding pyc is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 strain using oligonucleotides 25 (5 ′ AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACCGCAT GGCCAAGGTG GAAGAG 3 ′) exhibiting in 5 'an overlap zone of 25 base pairs with the 3' end of the plasmid pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) and 26 (5 'TGCCGGCCAA CGTCACATGG GATGCAGGGA AGCGAAC 3') exhibiting at 5 'an overlap zone of 15 pairs of bases with the 5 'end of the region of downstream homology of the gene encoding pyc and the KOD Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) with 5% DMSO.
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the sequence of the region of downstream homology of the gene encoding pyc is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 strain using oligonucleotides 27 (5 'TCCCTGCATC CCATGTGACG TTGGCCGGCA GGG 3') exhibiting in 5 ' a zone of overlap of 15 base pairs with the 3 'end of the region of homology upstream of the gene encoding pyc and 28 (5' ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCCCCGG GCTGATAGTT CTTCAACACC AGCAGTC 3 ') exhibiting at 5' a zone of overlap of 31 base pairs with the 5 'end of the plasmid pL03 and the KOD Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) with 5% DMSO.
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the backbone plasmid pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) is cut by the restriction enzyme Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France).
  • the digestion product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the selection of positive clones is carried out by PCR on a colony using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 51 and 80 (5 'AATGGGACGT GCGAGTCCAT CC 3').
  • oligonucleotides 51 and 80 5 'AATGGGACGT GCGAGTCCAT CC 3'.
  • the deletion of the pyc gene is confirmed by sequencing (Eurofins genomic) with the oligonucleotides 29 (5 'GCAAACAAAC CACCGCTGGT 3'), 30 (5 'CGCCATATCG GATGCCGTTC 3 ') and 31 (5' TAGCAGCACG CCATAGTGAC TG 3 ').
  • Plasmid pL03-Apyc is inserted into an electrocompetent strain Escherichia coli S17-1 by electroporation using a Gene Peurer electroporator, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
  • the selection of the positive clones is carried out by PCR on a colony using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 51 and 80.
  • the clone of interest is isolated on LB / agar medium (Tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, NaCl 5 g / L, Sigma-Aldrich, agar 20 g / L) containing 15 pg / mL of tetracycline and incubated overnight at 37 ° C.
  • the conjugation between the Escherichia coli S17-1 cells and those of the strain CN0004 was adapted from the protocol of Lenz et al., 1994.
  • the selection method using sucrose (15% sucrose used) with SacB made it possible to precisely delete the gene encoding pyc.
  • the clones are validated by a PCR on colony using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 51 and 80.
  • selection of the clones positive among the clones sensitive to tetracycline is carried out by PCR on a colony using the Kod Xtreme TM Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) and oligonucleotides 81 (5 'CCATTTGCCC AATACGACTA GC 3') and 30.
  • the Cupriavidus necator H16 Apyc AphaCABQpLac_L-ldh C.necator strain is recovered and named CN0005. Genetic modifications are validated by sequencing.
  • Example 8 Construction of a genetically modified Cupriavidus necator strain in which a polyhydroxybutyrate (PHB) biosynthetic pathway is deleted, an endogenous lactate dehydrogenase is overexpressed and in which a pyruvate dehydrogenase is deleted (CN0006)
  • PHB polyhydroxybutyrate
  • CN0006 Strain and genetic constructions The construction of the lactate producing strain CN0006 is carried out according to the following protocol:
  • a plasmid carrying the sequences of the upstream and downstream zones homology of the gene encoding the E1 component of pyruvate dehydrogenase (pdhA2) of Cupriavidus necator is cloned in one step via the in vitro assembly protocol NEBuilder ® HiFi DNA Cloning Assembly ( New England Biolabs, Evry, France).
  • the oligonucleotides are synthesized and purified (desalted) by Eurofins Genomics.
  • the sequence of the region of homology upstream of the gene encoding pdhA2 is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H 16 strain using oligonucleotides 32 (5 ′ TCCTTTAATT CGAGCTCGGT ACCCGGGTGC GTAATCCACT TCCAG 3 ′) exhibiting in 5 'an overlap zone of 22 base pairs with the 3' end of the plasmid pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) and 33 (5 'CCCATCGTTC ACACGGCAAG TCTCCGTTAA GGAATTC 3') presenting in 5 'an overlap zone of 11 pairs bases with the 5 'end of the region of downstream homology of the gene encoding pdhA2 and of the KOD Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) with 5% DMSO.
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the sequence of the region of downstream homology of the gene encoding pdhA2 is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 strain using oligonucleotides 34 (5 ′ GACTTGCCGT GTGAACGATG GGCCATCGGG CA 3 ′) exhibiting in 5 ′ a zone of overlap of 11 base pairs with the 3 'end of the region of upstream homology of the gene coding for pdhA2 and 35 (5' TAAGGATCCG GCGCGCCCCC GGGTTGAGCA GGATCACGTC GATCC 3 ') having in 5' a zone of overlap of 22 base pairs with the 5 'end of the plasmid pL03 and the KOD Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) with 5% DMSO.
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the backbone plasmid pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) is cut by the restriction enzyme Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France).
  • the digestion product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the selection of the positive clones is carried out by PCR on colonies using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 29 and 82 (5 'ATGTCCTGGA TTGCGCAGAT C 3').
  • the deletion of the pdhA2 gene is confirmed by sequencing (Eurofins genomic) with the oligonucleotides 36 (5 'TAATCCACTT CCAGCGCGAT AAG 3'), 37 (5 'CCTGAAGTCT CCGCGATAAC 3'), 38 (5 'GTTCATGAAGCC AC ACCGAG 3 ') and 29.
  • Plasmid pL03-ApdhA2 is inserted into an electrocompetent strain Escherichia coli S17-1 by electroporation using a Gene Peurer electroporator, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
  • the selection of the positive clones is carried out by PCR on a colony using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 29 and 82.
  • the clone of interest is isolated on LB / agar medium (Tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, NaCl 5 g / L, Sigma-Aldrich, agar 20 g / L) containing 15 pg / mL of tetracycline and incubated overnight at 37 ° C.
  • the conjugation between the Escherichia coli S17-1 cells and those of the strain CN0004 was adapted from the protocol of Lenz et al., 1994.
  • the selection method using sucrose (15% sucrose used) with SacB made it possible to precisely delete the gene encoding pdhA2.
  • the clones are validated by a PCR on colony using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 29 and 82.
  • selection of the clones positive among tetracycline-sensitive clones is carried out by colony PCR using the Kod Xtreme TM Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen).
  • the Cupriavidus necator H 16 ApdhA2 AphaCABQpLac_L-ldhc .necat o r strain is recovered and named CN0006. Genetic modifications are validated by sequencing.
  • Example 9 Construction of a genetically modified Cupriavidus necator strain in which a polyhydroxybutyrate (PHB) biosynthetic pathway is deleted, an endogenous lactate dehydrogenase is overexpressed and in which a phosphate acetyltransferasee and an acetate kinase phosphoenolpyruvate synthase are deleted (CN0007)
  • PHB polyhydroxybutyrate
  • a plasmid carrying the sequences of the upstream and downstream regions of homology of the operon encoding the acetate kinase (ackA) and phosphotransacetylase (pta1) genes of Cupriavidus necator is cloned in one step in vitro via the NEBuilder ® HiFi assembly protocol DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France).
  • the oligonucleotides are synthesized and purified (desalted) by Eurofins Genomics.
  • the sequence of the region of homology upstream of the gene encoding pta1 is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 strain using oligonucleotides 39 (5 ′ TCCTTTAATT CGAGCTCGGT ACGTGTCCAA TGAGATGACA GCACG 3 ′) exhibiting in 5 'an overlap zone of 22 base pairs with the 3' end of the plasmid pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) and 40 (5 'TGTAGCGGTG GTGCGTCAGG GTCGTCGGTG 3') exhibiting at 5 'an overlap zone of 11 pairs of bases with the 5 'end of the region of downstream homology of the gene encoding ackA and the KOD Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) with 5% DMSO.
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the sequence of the region of downstream homology of the gene encoding ackA is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 strain using oligonucleotides 41 (5 ′ ACCCTGACGC ACCACCGCTA CAGCCGACCA AG 3 ′) exhibiting in 5 ′ a zone of overlap of 11 base pairs with the 3 'end of the region of homology upstream of the gene coding for pta1 and 42 (5' TAAGGATCCG GCGCGCCCCC GGGCTGATAC GTTCACGCAT AGTGGTC 3 ') having in 5' a zone of overlap of 22 base pairs with the 5 'end of the plasmid pL03 and the KOD Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) with 5% DMSO.
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the backbone plasmid pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) is cut by the restriction enzyme Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France).
  • the digestion product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the selection of the positive clones is carried out by PCR on a colony using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 29 and 43 (5 'GACTTCCGGC AGGTCATGC 3').
  • the deletion of the ackA-pta1 operon is confirmed by sequencing (Eurofins genomic) with oligonucleotides 43, 44 (5 'CAGTTGTTGC GCTGCAGTCA T 3'), 45 (5 'GCCAAGCCGG AACGCGTC 3') and 46 (5 'GATGGTGGCA CGATGTTCAC 3').
  • Plasmid pL03-Apta1-ackA is inserted into an electrocompetent strain Escherichia coli S17-1 by electroporation using a Geneuterer electroporator, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
  • the selection of positive clones is carried out by PCR on colonies using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 29 and 43.
  • the clone of interest is isolated on LB / agar medium (Tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, NaCl 5 g / L, Sigma-Aldrich, agar 20 g / L) containing 15 pg / mL of tetracycline and incubated overnight at 37 ° C.
  • the conjugation between the Escherichia coli S17-1 cells and those of the strain CN0004 was adapted from the protocol of Lenz et al., 1994.
  • the method of selection with sucrose (15% of sucrose used) with SacB made it possible to precisely delete the 'pta1-ackA operon.
  • the clones are validated by a PCR on a colony using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 29 and 43.
  • the selection of the clones positive among the tetracycline-sensitive clones is carried out by PCR on a colony using the Kod Xtreme TM Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) and oligonucleotides 44 and 83 (5 'CAGAACTGGC TGTTCTCGGA C 3').
  • the Cupriavidus necator H16 Apta1-ackA AphaCABQpLac_L-ldhc .necat o r strain is recovered and named CN0007. Genetic modifications are validated by sequencing.
  • Example 10 Construction of a genetically modified Cupriavidus necator strain in which a polyhydroxybutyrate (PHB) biosynthetic pathway is deleted, an endogenous lactate dehydrogenase is overexpressed and in which a ferricytochrome C lactate reductase is deleted (CN0008)
  • PHB polyhydroxybutyrate
  • lactate-producing strain CN0008 The construction of the lactate-producing strain CN0008 is carried out according to the following protocol: A plasmid carrying the sequences of the regions of homology upstream and downstream of the active site of L-Lactate cytochrome c reductase (NdD, 1.1.2.3) of Cupriavidus necator is cloned in one step in vitro using the NEBuilder ® HiFi assembly protocol DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). The oligonucleotides are synthesized and purified (desalted) by Eurofins Genomics.
  • the sequence of the region of homology upstream of the gene encoding NdD is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 strain using oligonucleotides 47 (5 'CCTGCAGGTC GACTCTAGAG AGCAATTGCT CCGCCATCAG C 3') exhibiting in 5 'an overlap area of 20 base pairs with the 3' end of the plasmid pJQ200mpTet and 48 (5 'AGTCGATGGC CACTTGGCGG CGCAAGGTAC 3') having in 5 'a overlap area of 10 base pairs with the 5' end of the region of downstream homology of the gene encoding NdD and of the KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) enzyme with 5% DMSO.
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the sequence of the region of downstream homology of the gene encoding NdD is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 strain using oligonucleotides 49 (5 'CCGCCAAGTG GCCATCGACT TGTTGCAGGC 3') having a 5 ' overlap zone of 10 base pairs with the 3 'end of the region of homology upstream of the gene encoding NdD and 50 (5' ATTCGAGCTC GGTACCCGGG CAAAGGCTGC GTCCAGCCAG 3 ') exhibiting at 5' a zone of overlap of 20 pairs of bases with the 5 'end of the plasmid pJQ200mpTet and the KOD Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) with 5% DMSO.
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the backbone plasmid pJQ200mpTet is a derivative of the plasmid pJQ200mp18 (Quandt and Hynes, 1993) where the gene for resistance to gentamycin has been replaced by the gene for resistance to tetracycline.
  • the backbone plasmid pJQ200mpTet is cut with the restriction enzyme BamHI-HF (New England Biolabs, Evry, France). The digestion product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the selection of the positive clones is carried out by PCR on a colony using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 24 and 86 (5 'GACAACCTGA TGGTGCACAA GG 3').
  • the deletion of the NdD gene is confirmed by sequencing (Eurofins genomic) with oligonucleotides 24, 51 (5 'TGCAAGGCGA TTAAGTTGGG TAACG 3') and 52 (5 'GAACAGCTGC ACGCCGAG 3').
  • Plasmid pJQ200mpTet -AlldD is inserted into an electrocompetent strain Escherichia coli S17-1 by electroporation using a Gene Peurer electroporator, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
  • the selection of the positive clones is carried out by PCR on a colony using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 24 and 86.
  • the clone of interest is isolated on LB / agar medium (Tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, NaCl 5 g / L, Sigma-Aldrich, agar 20 g / L) containing 15 pg / mL of tetracycline and incubated overnight at 37 ° C.
  • the conjugation between the Escherichia coli S17-1 cells and those of the strain CN0004 was adapted from the protocol of Lenz et al., 1994.
  • the selection method using sucrose (15% sucrose used) with SacB made it possible to precisely delete the gene encoding NdD.
  • the clones are validated by a PCR on colony using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 24 and 86.
  • selection of the clones positive among the clones sensitive to tetracycline is carried out by PCR on a colony using the enzyme Kod Xtreme TM Hot Start DNA Polymerase (Novagen)) and oligonucleotides 52 and 87 (5 'CACATTGCGT CGCTGACATT G 3').
  • the Cupriavidus necator H16 AlldD AphaCABQpLac_L-ldhc . ⁇ cafo / - strain is recovered and named CN0008.
  • the genetic modifications are validated by sequencing using oligonucleotides 88 (5 'AGCTGTTGCA CACCAGGCGA C 3'), 89 (5 'CATTGCCATA TCGCGCGAGA TC 3'), 90 (5 'CT ATCGAT CAT GT CAGCT CTT CAT G 3') and 91 (5 '
  • Example 11 Construction of a genetically modified Cupriavidus necator strain in which a polyhydroxybutyrate (PHB) biosynthetic pathway is deleted, an endogenous lactate dehydrogenase is overexpressed and in which two lactate ferricytochrome C reductases are deleted (CN0009)
  • PHB polyhydroxybutyrate
  • a plasmid carrying the sequences of the upstream and downstream areas of homology of the gene encoding L-Lactate cytochrome reductase (NdA) from Cupriavidus necator is cloned in one step in vitro using the NEBuilder ® HiFi DNA Assembly Cloning protocol (New England Biolabs, Evry, France).
  • the oligonucleotides are synthesized and purified (desalted) by Eurofins Genomics.
  • sequence of the region of homology upstream of the gene encoding NdA is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 strain using oligonucleotides 53 (5 'CCTGCAGGTC GACTCTAGAG GATCCGCAAG ACGGTTTATC TCTCGGTC 3') exhibiting in 5 'a 25 base pair overlap area with the 3' end of the plasmid pJQ200mpTet and 54 (5 'GACGCTATCA CATGGGAACT CCCTTGAAAA
  • AAACAAAAAG CTGC 3 ' exhibiting at 5' a zone of overlap of 10 base pairs with the 5 'end of the region of downstream homology of the gene encoding NdA and of the KOD Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) with 5% DMSO.
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the sequence of the region of downstream homology of the gene coding for NdA is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 strain using oligonucleotides 55 (5 'AGTTCCCATG TGATAGCGTC TATGAGGCGT C 3') exhibiting in 5 ' a zone of overlap of 10 base pairs with the 3 'end of the region of homology upstream of the gene coding for NdA and 56 (5' ATTCGAGCTC GGTACCCGGG GATCGAGGAA ATCGGCTGCG TAGG 3 ') having in 5' a zone of overlap of 24 base pairs with the 5 'end of the plasmid pJQ200mpTet and the KOD Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) with 5% DMSO.
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the backbone plasmid pJQ200mpTet is a derivative of the plasmid pJQ200mp18 (Quandt and Hynes, 1993) where the gene for resistance to gentamycin has been replaced by the gene for resistance to tetracycline.
  • the backbone plasmid pJQ200mpTet is cut with the restriction enzyme BamHI-HF (New England Biolabs, Evry, France). The digestion product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the selection of positive clones is carried out by PCR on a colony using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 92 (5 'TGAGTCCAAC CCGGTAAGAC 3') and 57 (5 'CCTCATAGAC GCTATCACAT GG 3 ').
  • the deletion of the NdA gene is confirmed by sequencing (Eurofins genomic) with the oligonucleotides 21, 57, 58 (5 'CCAT GT GAT AGCGTCT AT GAGG 3 ') and 24.
  • Plasmid pJQ200mpTet -AlldA is inserted into an electrocompetent strain Escherichia coli S17-1 by electroporation using a Gene Peurer electroporator, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
  • the selection of positive clones is carried out by PCR on a colony using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 92 and 57.
  • the clone of interest is isolated on LB / agar medium (Tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, NaCl 5 g / L, Sigma-Aldrich, agar 20 g / L) containing 15 pg / mL of tetracycline and incubated overnight at 37 ° C.
  • the conjugation between the Escherichia coli S17-1 cells and those of the strain CN0008 was adapted from the protocol of Lenz et al., 1994.
  • the selection method using sucrose (15% sucrose used) with SacB made it possible to precisely delete the gene encoding NdA.
  • the clones are validated by a PCR on colony using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 92 and 57.
  • the selection of the clones positive among tetracycline sensitive clones is carried out by colony PCR using the Kod Xtreme TM Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) and oligonucleotides 93 (5 'CTGGCTGAAC GTGAAGAATG C 3') and 94 (5 ' GGAAGATAAA CCCGAGCAGA TC 3 ').
  • the Cupriavidus necator H16 AlldA AlldD AphaCABQpLac_L-ldhc . ⁇ cat o r strain is recovered and named CN0009.
  • the genetic modifications are validated by sequencing using oligonucleotides 57, 58, 95 (5 'CAGGCTTATC GACAGAGAAA TTCG 3') and 96 (5 'GTATTTCGCA TCGTGCCAGA C 3').
  • Example 12 Construction of a genetically modified Cupriavidus necator strain in which a polyhydroxybutyrate (PHB) biosynthetic pathway is deleted, an endogenous lactate dehydrogenase is overexpressed and in which a phosphoenolpyruvate synthase is deleted (CN0010)
  • lactate-producing strain CN0010 The construction of the lactate-producing strain CN0010 is carried out according to the following protocol:
  • a plasmid carrying the sequences of the upstream and downstream regions of homology of the gene encoding the phosphoenolpyruvate synthase (ppsA) of Cupriavidus necator is cloned in one step in vitro via the NEBuilder ® HiFi DNA Assembly Cloning protocol (New England Biolabs, Evry, France).
  • the oligonucleotides are synthesized and purified (desalted) by Eurofins Genomics.
  • the sequence of the region of homology upstream of the gene encoding ppsA is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 strain using oligonucleotides 59 (5 'AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACCCGAA GATCTTCGGC TTGAACG 3') exhibiting in 5 'an overlap zone of 25 base pairs with the 3' end of the plasmid pL03 and 60 (5 'ACGTCAAATG CTTCACATGT CCGGTATGTT CTTGGAGTTC 3') having in 5 'a overlap zone of 15 base pairs with the 5' end of the region of downstream homology of the gene encoding ppsA and of the KOD Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) with 5% DMSO.
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the sequence of the downstream region of homology of the gene encoding ppsA is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 strain using oligonucleotides 61 (5 'AACATACCGG ACATGTGAAG CATTTGACGT CACAATAACG 3') exhibiting in 5 ' a zone of overlap of 15 base pairs with the 3 'end of the region of homology upstream of the gene encoding ppsA and 62 (5' ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCCTTGA GCACGTGCT TGTAGG 3 ') exhibiting at 5' a zone of overlap of 25 base pairs with the 5 'end of plasmid pL03 and the KOD Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) with 5% DMSO.
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the backbone plasmid pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) is cut by the restriction enzyme Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France).
  • the digestion product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the selection of the positive clones is carried out by PCR on a colony using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM). After extraction of the plasmids using the NucleoSpin® Plasmid kit (Macherey-Nagel), the deletion of the ppsA gene is confirmed by sequencing (Eurofins genomic) with oligonucleotides 63 (5 'ATGAACACCG GCACCTTCTA CC 3'), 64 (5 ' CAGGATGGAG TGGCTGAACG 3 ') and 29.
  • Plasmid pL03-AppsA is inserted into an electrocompetent strain Escherichia coli S17-1 by electroporation using a Gene Peurer electroporator, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
  • the conjugation between the Escherichia coli S17-1 cells and those of the strain CN0004 was adapted from the protocol of Lenz et al., 1994.
  • the selection method using sucrose (15% sucrose used) with SacB made it possible to precisely delete the gene encoding ppsA.
  • the clones are validated by colony PCR using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM).
  • the selection of the positive clones among the tetracycline sensitive clones is performed by colony PCR using the Kod Xtreme TM Hot Start DNA Polymerase (Novagen) enzyme.
  • the Cupriavidus necator H16 AppsA AphaCABQpLac_L-ldh C.necator strain is recovered and named CN0010. Genetic modifications are validated by sequencing.
  • Example 13 Evaluation of lactate consumption by strains CN0004 and CN0009
  • strains CN0004 Cupriavidus necator H 16 AphaCABQpLac_L-ldhc .necat o r
  • CN0009 Cupriavidus necator H 16 AlldA AlldD AphaCABQpLac_L-ldhc. ⁇ cat o
  • the rich medium consisted of 27.5% (w / v) soybean trypticase broth (TSB, Becton Dickinson, France).
  • the minimum medium used for the precultures and cultures in Erlenmeyer flasks (MMR medium) contained: 4.0 g / L of NaH 2 P0 4 2H 2 O; 4.6 g / L of Na 2 HP0 4 12H 2 O; 0.45 g / LK 2 S0 4 ; 0.39 g / L MgS0 4 7H 2 0; 0.062 g / L of CaCl 2 2H 2 0 and 1 ml / L of trace element solution.
  • the trace element solution contained: 15 g / L FeSO 4 7H 2 O; 2.4 g / l MnS0 4 H 2 0; 2.4 g / L of ZnS0 4 7H 2 0 and 0.48 g / L of CuS0 4 5H 2 0 in 0.1 M HCl.
  • NH 4 CI (1 g / L) was used as the nitrogen source to achieve a biomass concentration of approximately 2 g / L. 0.04 g / L of NaOH was added.
  • fructose (20 g / L) was used as a carbon source.
  • lactate (6 g / L) was used as a carbon source.
  • Inoculation chain A clone of strain CN0004 and a clone of strain CN0009 subcultured from a culture plate were first cultured for 8 h in 5 ml of medium rich with gentamycin (10 pg / ml) , in culture tubes, at 30 ° C with stirring (200 rpm). This first preculture was used to inoculate the second preculture at an initial ⁇ qboo of 0.05 in 25 mL of MMR medium + 20 g / L of fructose in 250 mL baffled Erlenmeyer flasks which were incubated for 20 h at 30 ° C. , 200 rpm.
  • Example 14 Construction of a genetically modified Cupriavidus necator strain in which a polyhydroxybutyrate (PHB) biosynthetic pathway is deleted, an endogenous lactate dehydrogenase is overexpressed, two ferricytochrome C lactate reductases are deleted and in which an Iut1 operon carrying the genes encoding proteins using lactate is deleted (CN0011).
  • PHB polyhydroxybutyrate
  • a plasmid carrying the sequences of the upstream and downstream regions of homology of the operon comprising the A1390, A1391 and A1392 genes of chromosome AM260479 of Cupriavidus necator is cloned in one step in vitro via the NEBuilder ® HiFi DNA assembly protocol Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France).
  • the oligonucleotides are synthesized and purified (desalted) by Eurofins Genomics.
  • the sequence of the region of homology upstream of the A1390 gene is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 strain using the oligonucleotides 65 (5 'AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACTCATA GATGCCGGCG GCAATGC 3') having a 5 ' overlap zone of 25 base pairs with the 3 'end of the plasmid pL03 and 66 (5' TTTACTGAAG CCTCACATTG TCGACTTCTC CAGACCCG 3 ') presenting in 5' a zone of overlap of 15 base pairs with the 5 'end of the area of downstream homology of the A1392 gene and the KOD Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) with 5% DMSO.
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the sequence of the downstream homology zone of the A1392 gene is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 strain using oligonucleotides 67 (5 ′ GAGAAGTCGA CAATGTGAGG CTTCAGTAAA GAACCAC 3 ′) having a 5 ′ zone of overlap of 15 base pairs with the 3 'end of the region of homology upstream of the A 1390 and 68 gene (5' ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCCCAAG CTGCTGTACG TGTC 3 ') having in 5' a zone of overlap of 25 base pairs with the 5 'end of the plasmid pL03 and the KOD Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) with 5% DMSO.
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the backbone plasmid pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) is cut by the restriction enzyme Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France).
  • the digestion product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the selection of the positive clones is carried out by PCR on colonies using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) using the oligonucleotides 97 (5 'AGGCATTGAC CTTGGTGCGT ATC 3') and 31.
  • the deletion of the Iut1 operon is confirmed by sequencing (Eurofins genomic) with oligonucleotides 69 (5 'GTGACAGCTC TTTCAGGCTG AC 3'), 31 and 29.
  • Plasmid pL03-Alut1 is inserted into an electrocompetent strain Escherichia coli S17-1 by electroporation using a Gene Peurer, BioRad electroporator (Datsenko and Wanner, 2000). The selection of the positive clones is carried out by PCR on colonies using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 97 and 31.
  • the clone of interest is isolated on LB / agar medium (Tryptone 10g / L, yeast extract 5g / L, NaCl 5g / L, Sigma-Aldrich, agar 20g / L) containing 15pg / mL of tetracycline and incubated overnight at 37 ° C.
  • the conjugation between the Escherichia coli S17-1 cells and those of the strain CN0009 was adapted from the protocol of Lenz et al., 1994.
  • the sucrose selection method (15% of sucrose used) with SacB made it possible to precisely delete the 'operon Iut1.
  • the clones are validated by colony PCR using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM).
  • the selection of the positive clones among the clones sensitive to tetracycline is carried out by PCR on colonies using the enzyme Kod Xtreme TM Hot Start DNA Polymerase (Novagen) and oligonucleotides 98 (5 'GGTCGGAGAA GACCTGATCG 3 ') and 69.
  • the Cupriavidus necator H16 Alutl AlldA AlldD AphaCABQpLac_L-ldhc . ⁇ cafo / - strain is recovered and named CN001 1.
  • the genetic modifications are validated by sequencing using oligonucleotides 99 (5 'GCTTCGGTCA CGTAGCCCAT G 3'), 100 (5 ' CTGGAATTCG TGGATACGCT GAC 3 '), 101 (5' TGTCCGCCAG CCTTAACATC AG 3 '), and 102 (5' CTCACCGGAA GTGATGTGCA TTG 3 ').
  • Example 15 Construction of a genetically modified Cupriavidus necator strain in which a polyhydroxybutyrate (PHB) biosynthetic pathway is deleted, an endogenous lactate dehydrogenase is overexpressed, two ferricytochrome C lactate reductases are deleted and in which an Iut2 operon carrying the genes encoding proteins using lactate is deleted (CN0012).
  • PHB polyhydroxybutyrate
  • a plasmid carrying the sequences of the upstream and downstream areas of homology of the lactate operon use comprising the genes B0091, B0092, B0093 of chromosome AM260480 of Cupriavidus necator is cloned in one step in vitro via the NEBuilder ® HiFi DNA assembly protocol Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France).
  • the oligonucleotides are synthesized and purified (desalted) by Eurofins Genomics.
  • the sequence of the region of homology upstream of the B0093 gene is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 strain using oligonucleotides 70 (5 'AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACGGCTG CGCACGAAGT CGATATG 3') having a 5 ' overlap zone of 25 base pairs with the 3 'end of plasmid pL03 and 71 (5' CGT GAT G ACGG ATT AT CAT GTCTCGCTCCGGACGT G 3 ') exhibiting at 5' a zone of overlap of 15 base pairs with the 5 'end of the downstream homology zone of the gene B0091 and KOD Hot Start DNA Polymerase Enzyme (Novagen) with 5% DMSO.
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the sequence of the downstream homology zone of the B0091 gene is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 strain using oligonucleotides 72 (5 ′ CGGAGCGAGA CATGATAATC CGTCATCACG GGCGCGAG 3 ′) having a 5 ′ zone of overlap of 15 base pairs with the 3 'end of the region of homology upstream of the B0093 and 73 gene (5' ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCGCGGC TGCCATACCT TCAGGAAC 3 ') exhibiting at 5' a region of overlap of 25 base pairs with the 5 'end of the plasmid pL03 and of the KOD Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) with 5% DMSO.
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the backbone plasmid pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) is cut by the restriction enzyme Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France).
  • the digestion product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the selection of the positive clones is carried out by PCR on colonies using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 31 and 74 ((5 'GTGGCCGATT GCATGGATCA TC 3'). After extraction of the plasmids using the NucleoSpin® Plasmid kit (Macherey-Nagel), the deletion of the Iut2 operon is confirmed by sequencing (Eurofins genomic) with oligonucleotides 29, 74, 75 (5 'TGTTGCGCGC CACCTCGTAT TGC 3') and 31.
  • Plasmid pL03-Alut2 is inserted into an electrocompetent strain Escherichia coli S17-1 by electroporation using a Gene Peurer electroporator, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
  • the selection of the positive clones is carried out by PCR on colonies using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 31 and 74.
  • the clone of interest is isolated on LB / agar medium (Tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, NaCl 5 g / L, Sigma-Aldrich, agar 20 g / L) containing 15 pg / mL of tetracycline and incubated overnight at 37 ° C.
  • the conjugation between the Escherichia coli S17-1 cells and those of the strain CN0009 was adapted from the protocol of Lenz et al., 1994.
  • the sucrose selection method (15% of sucrose used) with SacB made it possible to precisely delete the 'Iut2 operon.
  • the clones are validated by a PCR on colony using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 31 and 74.
  • the selection of the positive clones among the clones sensitive to tetracycline is carried out by PCR on colonies using the enzyme Kod Xtreme TM Hot Start DNA Polymerase (Novagen) and oligonucleotides 103 (5 'CGCGGAAGCG GGAATTATGC 3') and 104 (5 'TCCTGCTTCG GTGGTGTTTC G 3').
  • the Cupriavidus necator H16 Alut2 AlldA AlldD AphaCABQpLac_L-ldh C.necator strain is recovered and named CN0012.
  • the genetic modifications are validated by sequencing using oligonucleotides 103, 104, 105 (5 'CCTATCTTCT ATGCCTACCT GAAG 3') and 106 (5 'TGTAGGGCGA AGCCTTGC 3').
  • Example 16 Construction of a genetically modified Cupriavidus necator strain in which a polyhydroxybutyrate (PHB) biosynthetic pathway is deleted, an endogenous lactate dehydrogenase is overexpressed, two ferricytochrome C lactate reductases are deleted and in which the two operons lut 1 and Iut2 carrying the genes encoding lactate-using proteins are deleted (CN0013).
  • PHB polyhydroxybutyrate
  • strain producing lactate CN0013 The construction of the strain producing lactate CN0013 is carried out according to the following protocol:
  • a plasmid carrying the sequences of the upstream and downstream areas of homology of the lactate operon use comprising the genes B0091, B0092, B0093 of chromosome AM260480 of Cupriavidus necator is cloned in one step in vitro via the NEBuilder ® HiFi DNA assembly protocol Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France).
  • the oligonucleotides are synthesized and purified (desalted) by Eurofins Genomics.
  • the sequence of the region of homology upstream of the B0093 gene is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 strain using oligonucleotides 70 exhibiting in 5 'a zone of overlap of 25 base pairs with the 3 'end of plasmid pL03 and 71 exhibiting at 5' a zone of overlap of 15 base pairs with the 5 'end of the region of downstream homology of the B0091 gene and of the KOD Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) with 5% DMSO.
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the sequence of the downstream homology zone of the B0091 gene is amplified by PCR on the genomic DNA of the Cupriavidus necator H16 strain using oligonucleotides 72 exhibiting in 5 'a zone of overlap of 15 base pairs with the 3 'end of the region of homology upstream of the B0093 and 73 gene exhibiting at 5' a zone of overlap of 25 base pairs with the 5 'end of the plasmid pL03 and of the KOD Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) with 5% DMSO.
  • the PCR product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the backbone plasmid pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) is cut with the restriction enzyme Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France).
  • the digestion product is gel purified with the Nucleospin gel and PCR clean-up kit (Macherey-Nagel).
  • the selection of the positive clones is carried out by PCR on colonies using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 31 and 74. After extraction of the plasmids using the NucleoSpin® Plasmid kit ( Macherey-Nagel), the deletion of the Iut2 operon is confirmed by sequencing (Eurofins genomic) with oligonucleotides 29, 74, 75 and 31.
  • Plasmid pL03-Alut2 is inserted into an electrocompetent strain Escherichia coli S17-1 by electroporation using a Gene Peurer electroporator, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
  • the selection of the positive clones is carried out by PCR on colonies using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 31 and 74.
  • the clone of interest is isolated on LB / agar medium (Tryptone 10g / L, yeast extract 5g / L, NaCl 5g / L, Sigma-Aldrich, agar 20g / L) containing 15 pg / mL of tetracycline and incubated overnight at 37 ° C.
  • the conjugation between the Escherichia coli S17-1 cells and those of the CN001 1 strain was adapted from the protocol of Lenz et al., 1994.
  • the sucrose selection method (15% of sucrose used) with SacB made it possible to precisely delete the Iut2 operon.
  • the clones are validated by a PCR on a colony using the enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific TM) and oligonucleotides 31 and 74.
  • selection of the clones positive among tetracycline-sensitive clones is carried out by colony PCR using the Kod Xtreme TM Hot Start DNA Polymerase enzyme (Novagen) and oligonucleotides 103 (5 'CGCGGAAGCG GGAATTATGC 3') and 104 (5 'TCCTGCTTCG GTGGTGTTTC G 3 ').
  • the Cupriavidus necator H16 Alutl Alut2 AlldA AlldD AphaCABQpLac_L- Idhc .necafo / - strain is recovered and named CN0013.
  • the genetic modifications are validated by sequencing using oligonucleotides 103, 104, 105 (5 'CCTATCTTCT ATGCCTACCT GAAG 3') and 106 (5 'TGTAGGGCGA AGCCTTGC 3').
  • Example 17 Evaluation of lactate consumption by strains CN0009, CN0011, CN0012 and CN0013
  • strains CN0009 Cupriavidus necator H16 AlldA AlldD AphaCABQpLac_L-ldh c.necat o r
  • CN001 1 Cupriavidus necator H16 Alutl AlldA AlldD AphaCABQpLac_L-ldhc .necat o r
  • CN0012 Cupriavidus necator H16 Alut2 AlldA AlldD AphaCABQpLac_L-ldhc . ⁇ cat o f
  • CN0013 Cupriavidus necldus necldus necldus neclda AldAl_ChaC-AldA AlldD ⁇ cat ⁇ cat o f
  • CN0013 Cupriavidus necldus necldus necldAlcA-AldC-AldC-AldC-AldC-AldA-H
  • strains CN0009, CN0011, CN0012 and CN0013 with lactate as the sole carbon source is shown in Figure 8.
  • the rate of lactate consumption for strain CN0009 is 0.89 g / L / h, for strain CN001 1 of 0.72 g / L / h, for strain CN0012 of 0.05 g / L / h and for strain CN0013 of 0 g / L / h.
  • the deletion of the Iut1 operon therefore results in a decrease in lactate consumption by Cupriavidus necator by 19%.
  • the deletion of the Iut2 operon therefore results in a 94% decrease in lactate consumption by Cupriavidus necator.
  • the concomitant deletion of the Iut1 and Iut2 operons therefore results in a total decrease in lactate consumption by Cupriavidus necator.
  • Example 18 Impact of the genetic modifications of the strain CN0013 on the re-consumption of lactate after production under autotrophic conditions.
  • strain CN0002 whose construction is described in Example 2
  • strain CN0013 whose construction is described in Example 16.
  • Fermentation in a gas bioreactor Fermentation under autotrophic conditions was carried out for each of the strains CN0002 and CN0013 as described in Example 4.

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Abstract

L'invention a trait à une bactérie oxydant naturellement l'hydrogène et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO2, ladite bactérie étant génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant une lactate déshydrogénase et pour inhiber l'expression d'un l'opéron lut et à un procédé de production de lactate à partir de CO2 utilisant une telle bactérie.

Description

Bactérie génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO2
Domaine de l’invention
Le projet à l’origine de cette demande de brevet a reçu un financement du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union Européenne au titre de la convention de subvention n° 70631.
L’invention a trait à une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO2. L’invention a également trait à un procédé de production de lactate, ou d’acide lactique, à partir de CO2 utilisant une telle bactérie génétiquement modifiée.
Etat de la technique
L’acide lactique trouve des applications dans de nombreuses industries. Par exemple, l’acide lactique est utilisé comme précurseur de l’acide polylactique (PLA) qui est un polymère entièrement biodégradable, utilisé par exemple dans les emballages alimentaires. L’acide lactique peut également être utilisé comme additif, en tant qu’antioxydant, acidifiant ou exhausteur de goût par l’industrie agroalimentaire. En cosmétique, l’acide lactique est généralement utilisé comme bactériostatique ou comme agent de peeling.
Actuellement, la production à l’échelle industrielle de l’acide lactique repose principalement sur la fermentation d’hydrate de carbone, et notamment de glucose, lactose, sucrose ou maltose. Si de nombreuses bactéries peuvent provoquer la transformation de ces sucres en acide lactique, seules les bactéries lactiques permettent de produire exclusivement de l’acide lactique, les autres bactéries produisant en général un mélange de plusieurs acides organiques.
En outre, la production d’acide lactique à partir de sucres fermentescibles, tels que le glucose ou le lactose, pose la question de la concurrence entre l’alimentation et la production de produits de commodité comme l’acide lactique.
En parallèle, les émissions de dioxyde de carbone (CO2) dans l’atmosphère ne cessent de croître. Des systèmes biologiques qui fixent le carbone par des processus métaboliques biochimiques naturels, telles que les algues, ont déjà été utilisés pour produire des molécules d’intérêt par réactions photosynthétiques. Cependant, les rendements de production restent insuffisants et limitent l’intérêt économique de ces systèmes.
De même, des méthodes mettant en œuvre des cellules bactériennes génétiquement modifiées ont été développées, pour transformer des sucres en molécules d’intérêt dans des systèmes de fermentation hétérotrophe. Angermayr et al., 2012 décrit la surexpression de la lactate déshydrogénase de Bacillus subtilis dans la cyanobactérie Synechocystis. WO 2014/205146 et WO 2015/155790 décrivent des bactéries méthanotrophes dont la source d’énergie vient de leur substrat carboné. De tels systèmes présentent plusieurs inconvénients. En effet, les systèmes de fermentation hétérotrophe sont sensibles à la contamination, ce qui impacte considérablement les rendements de production. En outre, ces systèmes hétérotrophes ne résolvent pas les problèmes de concurrence avec l’alimentation, puisque des sucres fermentescibles restent nécessaires, ni d'impacts environnementaux négatifs.
Il existe donc toujours un besoin en des procédés microbiologiques pour permettre la production de molécules, telles que l’acide lactique, en grandes quantités à partir de CO2 comme seule source de carbone, afin de ne pas entrer en compétition avec l’alimentaire tout en réduisant les émissions de gaz à effet de serre.
En travaillant sur cette problématique, les inventeurs ont découvert qu’il est possible de forcer des bactéries oxydant naturellement l’hydrogène, et capables de produire de la matière organique à partir de CO2, dans une voie de synthèse de lactate, au détriment éventuellement d’autres voies de synthèse. Notamment, les inventeurs ont découvert qu’il est possible de favoriser une voie de synthèse de lactate endogène, qui n’est pas ou peu exprimée naturellement dans la bactérie, en jouant sur l’expression du ou des gènes associés à cette voie de synthèse. Ainsi, les inventeurs ont découvert que les bactéries oxydant l’hydrogène peuvent être génétiquement modifiée de manière à surexprimer une lactate déshydrogénase endogène ou une hétérologue, et/ou de manière à réprimer l’expression de gènes intervenant dans une voie de synthèse de molécules venant en concurrence de la production de lactate, afin de produire du lactate à partir de CO2. Plus particulièrement, les inventeurs ont découvert que la bactérie Cupriavidus necator (également appelée Hydrogenomonas eutrophus, Alcaligenes eutropha, Ralstonia eutropha, ou Wautersia eutropha) peut être génétiquement modifiée de manière à surexprimer une lactate déshydrogénase endogène, en jouant sur le promoteur et/ou le nombre de copie du gène codant pour cette lactate déshydrogénase notamment, de manière à produire du lactate à partir de CO2. De manière alternative ou complémentaire, la production de lactate peut être améliorée en introduisant un ou plusieurs gènes exprimant une lactate déshydrogénase hétérologue et/ou en réprimant l’expression de gènes intervenant dans une voie de synthèse de molécules venant en concurrence de la production de lactate.
Ces modifications bien qu’efficaces atteignent des limites lorsque l’on cherche à favoriser la production de lactate en prolongeant la culture dans le temps. Les inventeurs ont alors constaté après quelques heures de culture que les bactéries consommaient le lactate. Contrairement à ce qui est généralement attendu, les inventeurs ont constaté que la délétion des gènes de lactate ferricytochrome C reductase (lldD et lldA) décrite dans la littérature comme permettant d’éviter la consommation de lactate notamment chez Escherichia coli (Woo et al. 2014 ; Niu et al. 2014 ; Mazumbar et al. 2013 ; Wang et al. 2012 ; Chai et al. 2009) et chez Issatachenkia orientalis (Suominen et al. 2012 ; Millet ét al. 2012) ne permet pas de supprimer la consommation du lactate dans les bactéries oxydant naturellement l’hydrogène, et capables de produire de la matière organique à partir de CO2. Ils ont identifié dans ces bactéries les gènes codant pour des protéines utilisant le lactate (lutA, lutB et lutC) dont l’inhibition permet de supprimer de manière substantielle la consommation du lactate produit.
Résumé de l’invention
L’invention a donc pour objet une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO2, ladite bactérie étant génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase et pour inhiber l’expression d’un opéron appelé lut, ledit opéron comprenant des gènes codant pour des protéines utilisant le lactate lutA, lutB ou lutC..
Selon l’invention, la bactérie peut être génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase endogène et/ou exogène.
L’invention a également pour objet l’utilisation d’une bactérie selon l’invention pour la production de lactate à partir de CO2, préférentiellement pour la production exclusivement de L-lactate, ou pour la production exclusivement de D-lactate.
L’invention porte également sur un procédé de production de lactate à partir de CO2, comprenant les étapes consistant à
- cultiver la bactérie avec du CO2 comme seule source de carbone, puis
- récupérer le lactate.
Description des figures
La figure 1 montre une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène selon l’invention apte à produire du lactate à partir de CO2 et H2.
La figure 2 montre les différentes voies métaboliques présentes naturellement chez Cupriavidus necator, et notamment, la glycolyse et le cycle de Calvin.
La figure 3 montre les différentes modifications génétiques (surexpression et/ou inhibition de l’expression de gènes) qui peuvent être réalisées chez Cupriavidus necator pour favoriser la production de L-lactate à partir de CO2.
La figure 4 montre les différentes modifications génétiques (surexpression et/ou inhibition de l’expression de gènes) qui peuvent être réalisées chez Cupriavidus necator pour favoriser la production de D-lactate à partir de CO2.
Les différentes abréviations utilisées dans la description et les figures 2, 3 et 4 sont expliquées dans le Tableau 5.
La figure 5 représente la production de lactate par la bactérie CN0002 à partir de fructose.
La figure 6 représente la production de lactate par la bactérie oxydant naturellement l’hydrogène CN0002 et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO2. La figure 7 représente la comparaison de la croissance cellulaire et de la consommation du lactate dans deux souches de Cupriavidus necator, CN0004 et CN0009, dont l’une comprend la délétion des gènes NdD et NdA (CN0009).
La figure 8 représente la comparaison de la croissance cellulaire et de la consommation du lactate dans quatre souches de Cupriavidus necator, avec ou sans délétion des opérons Iut1 et Iut2.
Description détaillée de l’invention
L’invention a pour objet une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène, génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO2, ladite bactérie étant génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase
Dans le contexte de l’invention, une bactérie «oxydant naturellement l’hydrogène» désigne une bactérie capable, sans manipulation génétique préalable, d’utiliser l’hydrogène gazeux comme donneur d’électron et l’oxygène comme accepteur d’électron, et capable de fixer le dioxyde de carbone. Ces bactéries sont également appelées bactéries « knallgas ». Les bactéries oxydant naturellement l’hydrogène ont besoin de dioxyde de carbone comme source de carbone et d’hydrogène comme source d’énergie.
Selon l’invention, la bactérie oxydant naturellement l’hydrogène est préférentiellement sélectionnée parmi Ralstonia sp, Cupriavidus sp., Hydrogenobacter sp., Rhodococcus sp., Hydrogenovibrio sp.; Rhodopseudomonas sp., Rhodobacter sp., Aquifex sp., Corynebacterium sp., Nocardia sp., Rhodospirillum sp., Rhizobium sp., Thiocapsa sp., Pseudomonas sp., Hydrogenomonas sp., Hydrogenobacter sp., Hydrogenophilus sp., Hydrogenautresmus sp., Hélicobacter sp., Xanthobacter sp., Hydrogenophaga sp., Bradyrhizobium sp., Alcaligenes sp., Amycolata sp.; Aquaspirillum sp., Arthrobacter sp., Azospirillum sp., Variovouax sp., Acidovouax sp., Bacillus sp., Calderobacterium sp., Derxia sp., Flavobacterium sp., Microcyclus sp., Mycobacterium sp., Paracoccus sp., Persephonella sp., Renobacter sp., Thermocrinis sp., Wautersia sp., et les cyanobactéries telles que Anabaena sp.
Notamment, la bactérie est sélectionnée parmi Rhodococcus opacus, Rhodococcus jostii, Hydrogenovibrio marinus, Rhodopseudomonas capsulata, Rhodopseudomonas palustris, Rhodobacter sphaeroides, Aquifex pyrophilus, Aquifex aeolicus, Cupriavidus necator, Cupriavidus metallidurans, Corynebacterium autotrophicum, Nocardia autotrophica, Nocardia opaca, Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas sulfoviridis, Rhodopseudomonas blastica, Rhodopseudomonas sphaeroides, Rhodopseudomonas acidophila, Rhodospirillum rubrum, Rhizobium japonicum, Thiocapsa roseopersicina, Pseudomonas facilis, Pseudomonas flava, Pseudomonas putida, Pseudomonas hydrogenovoua, , Pseudomonas palleronii, Pseudomonas pseudoflava, Pseudomonas saccharophila, Pseudomonas thermophila, Pseudomonas hydrogenothermophila, Hydrogenomonas pantotropha, Hydrogenomonas eutropha, Hydrogenomonas facilis, Hydrogenobacter thermophilus, Hydrogenobacter halophilus, Hydrogenobacter hydrogenophilus, Hydrogenophilus isleticus, Hydrogenophilus thermoluteolus, Hydrogenautresmus marinus, Hélicobacter pylori, Xanthobacter autotrophicus, Xanthobacter flavus, Hydrogenophaga flava, Hydrogenophaga palleronii, Hydrogenophaga pseudoflava, Bradyrhizobium japonicum, Ralstonia eutropha, Alcaligenes eutrophus, Alcaligenes facilis, Alcaligenes hydrogenophilus, Alcaligenes latus, Alcaligenes paradoxus, Alcaligenes ruhletii, Amycolata sp., Aquaspirillum autotrophicum, Arthrobacter strain 11/X, Azospirillum lipoferum, Variovouax paradoxus, Acidovouax facilis, Hydrogenobacillus schlegelii, Bacillus tusciae, Calderobacterium hydrogenophilum, Derxia gummosa, Flavobacterium autautresmophilum, Microcyclus aquaticus, Mycobacterium goudoniae, Paracoccus denitrificans, Persephonella marina, Persephonella guaymasensis, Renobacter vacuolatum, Thermocrinis ruber, Wautersia sp., Anabaena oscillarioides, Anabaena spiroides et Anabaena cylindrica.
Les termes «bactérie recombinante» et « bactérie génétiquement modifiée» sont utilisés ici de manière interchangeable et désignent des bactéries qui ont été génétiquement modifiées pour exprimer ou pour surexprimer des séquences nucléotidiques endogènes, pour exprimer des séquences nucléotidiques hétérologues (exogènes), ou qui ont une altération de l'expression d'un gène endogène. Par «altération», on entend que l'expression du gène, ou niveau d'une molécule d'ARN ou molécules d'ARN équivalentes codant pour un ou plusieurs polypeptides ou sous-unités polypeptidiques, ou l'activité d'un ou plusieurs polypeptides ou sous-unités polypeptidiques est régulée, de sorte que l'expression, le niveau ou l'activité soit supérieur ou inférieur à celui observé en l'absence de cette modification. Il est entendu que les termes « bactérie recombinante » et « bactérie génétiquement modifiée» se réfèrent non seulement à la bactérie recombinante particulière, mais également à la descendance ou à la descendance potentielle d'une telle bactérie. Certaines modifications pouvant se produire dans les générations suivantes, du fait d'une mutation ou d'influences environnementales, cette progéniture peut ne pas être identique à la cellule mère, mais elle est encore comprise dans le cadre du terme tel qu'utilisé ici.
Selon l’invention, on entend par « surexpression d’un gène » le fait que ledit gène est plus exprimé dans la bactérie considérée que dans une bactérie non génétiquement modifiée pour surexprimer ledit gène, conduisant à une production ou une production plus importante de la protéine correspondante (et plus particulièrement de la lactate déshydrogénase) et notamment à une augmentation supérieure à 20%, plus préférentiellement 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. Selon l’invention, une telle surexpression s’entend de l’expression d’une lactate déshydrogénase endogène, qui n’est pas ou peu exprimée dans la bactérie non génétiquement modifiée, ou de l’expression d’une lactate déshydrogénase exogène.
Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie est sélectionnée parmi les bactéries oxydant naturellement l’hydrogène possédant une lactate déshydrogénase endogène. Avantageusement, la bactérie est sélectionnée parmi Cupriavidus sp., telle que Cupriavidus necator, Hydrogenobacter sp., telle que Hydrogenobacter thermophilus, Rhodococcus sp., telle que Rhodococcus opacus, et Pseudomonas sp., telle que Pseudomonas hydrogenothermophila.
Les termes " endogène " ou "natif' désignent un gène qui est normalement ou naturellement présent dans le génome de la bactérie considérée. A l’inverse, les termes «exogène» ou « hétérologue » tels qu'utilisés ici en référence à un gène (séquence nucléotidique) désignent un gène qui n’est pas normalement ou naturellement présent dans le génome de la bactérie considérée.
Dans le cas d’une bactérie possédant une lactate déshydrogénase endogène, il est possible de modifier génétiquement ladite bactérie, de manière à permettre une surexpression dudit gène. Notamment, il est possible de modifier la bactérie pour que au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase endogène soit sous le contrôle d’un promoteur permettant une telle surexpression. Un promoteur désigne la séquence à l'extrémité 5 'du gène structural considéré et qui dirige l'initiation de la transcription. D’une manière générale, selon l’invention, les promoteurs utilisables incluent des promoteurs constitutifs, à savoir des promoteurs qui sont actifs dans la plupart des états cellulaires et des conditions environnementales, ainsi que des promoteurs inductibles qui sont activés ou réprimés par des stimuli physiques ou chimiques exogènes, et qui induisent donc un niveau d’expression variable en fonction de la présence ou de l’absence de ces stimuli. De manière alternative ou complémentaire, il est possible de modifier génétiquement le promoteur endogène, par exemple pour lever de potentielles inhibitions de son induction. Il est également possible de surexprimer une lactate déshydrogénase endogène en multipliant le nombre de copies du gène dans le génome de la bactérie, par le biais de plasmides et/ou en introduisant des séquences nucléotidiques à d’autres loci sur le ou les chromosomes de la bactérie, etc.
Dans un mode de réalisation, la bactérie selon l’invention est génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase endogène. Avantageusement, la bactérie est génétiquement modifiée pour surexprimer seulement la L-lactate déshydrogénase endogène ou seulement la D-lactate déshydrogénase endogène.
Les tableaux 1 et 2 ci-dessous répertorient, à titre d’exemples, des séquences codant pour des L-lactate déshydrogénase et des D-lactate déshydrogénase, respectivement, de différentes bactéries, ainsi que les séquences protéiques correspondantes. Selon l’invention, ces séquences peuvent être la cible de modifications génétiques, y compris de multiplication, pour conduire à une bactérie génétiquement modifiée apte à produire du lactate à partir de CO2.
Tableau 1 : Exemples de L-lactate déshydrogénase (EC 1.1.1.27)
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Tableau 2 : Exemples de D-lactate déshydrogénase (EC 1.1.1.28)
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Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie est une bactérie Cupriavidus necator, génétiquement modifiée au niveau du promoteur associé au(x) gène(s) codant pour la L-lactate déshydrogénase endogène et/ou la D-lactate déshydrogénase endogène, afin de favoriser l’expression de l’un et/ou de l’autre gène. En effet, les inventeurs ont découvert que Cupriavidus necator possède des gènes codant une L-lactate déshydrogénase (Idh) et une D-lactate déshydrogénase (IdhAI) endogènes, dont l’expression dépend des conditions de culture et qui est généralement quasiment nulle en limitation de nutriments. Selon l’invention, cette bactérie peut avantageusement être génétiquement modifiée au niveau de la séquence nucléotidique codant pour ledit promoteur, afin de lever cette régulation négative et permettre l’expression des gènes correspondants, même en limitation de nutriments. Il est notamment possible de modifier Cupriavidus necator de manière à associer la ou les séquences codant pour la L-lactate déshydrogénase et/ou la D-lactate déshydrogénase endogènes à un promoteur constitutif ou à un promoteur inductible.
Dans un mode de réalisation, les gènes codant pour la L-lactate déshydrogénase et/ou à la D-lactate déshydrogénase endogènes sont modifiés de manière à être sous contrôle d’un promoteur recombinant constitutif (non soumis à une régulation négative) ou inductible en présence d’une molécule particulière. A titre d’exemple, il est possible d’utiliser des promoteurs constitutifs tels que pLac, pTAC, pJ5 (Gruber et al., 2014), un promoteur inductible tel que le promoteur pBAD, inductible à l’arabinose (Grousseau et al., 2014), le promoteur pPHAP inductible en limitation phosphate (Barnard et al. 2015), le promoteur pCBBL inductible en conditions autotrophes (Lütte et al., 2012) ou le promoteur pKRrha inductible au rhamnose (Sydow ét al., 2017) .
Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie selon l’invention est génétiquement modifiée pour surexprimer un gène codant pour l’expression d’une protéine présentant au moins 50% d’homologie avec SEQ ID N°1 (séquence de la L-lactate déshydrogénase de Cupriavidus necator H16), préférentiellement au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%. Dans un autre mode de réalisation, la bactérie selon l’invention est génétiquement modifiée pour surexprimer un gène codant pour l’expression d’une protéine présentant au moins 50% d’homologie avec SEQ ID N°11 (séquence d’une D-lactate déshydrogénase de Cupriavidus necator H16), préférentiellement au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%.
De manière alternative ou cumulative, la bactérie peut être génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase exogène, ou hétérologue.
Selon l’invention, le génome de la bactérie est alors modifié de manière à intégrer une séquence nucléique codant pour une telle lactate déshydrogénase exogène. Ladite séquence nucléique peut avoir été introduite dans le génome de la bactérie ou d’un de ses ascendants, par le biais de toute méthode de clonage moléculaire adaptée. Dans le contexte de l’invention, le génome de la bactérie s’entend de l’ensemble du matériel génétique contenu dans ladite bactérie, y compris le matériel génétique extrachromosomique contenu par exemple dans des plasmides, épisomes, chromosomes synthétiques, etc. La séquence nucléique introduite peut être une séquence hétérologue, c’est-à-dire qui n’existe pas à l’état naturel dans ladite bactérie, ou une séquence homologue. Avantageusement, on introduit dans le génome de la bactérie une unité transcriptionnelle comportant la séquence nucléique d’intérêt, placée sous le contrôle d’un ou plusieurs promoteur(s) et d’un ou plusieurs sites de liaison au ribosome. Une telle unité transcriptionnelle comprend également, avantageusement, les séquences usuelles telles que des terminateurs transcriptionnels, et le cas échéant d’autres éléments de régulation de la transcription.
Un gène codant pour une lactate déshydrogénase exogène peut par exemple être dérivé d’une bactérie, d’un champignon, d’une levure ou d’un mammifère. Préférentiellement, un tel gène est dérivé d’une bactérie et notamment de E. coli, Bacillus coagulans, Pediococcus acidilactici, Streptococcus bovis ( Streptococcus equinus ), d’une bactérie lactique, et notamment de Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum ou Lactobacillus pentosus, Lactococcus lactis subsp. lactis. Les gènes listés dans les tableaux 1 et 2 peuvent également être utilisés pour modifier génétiquement une bactérie selon l’invention. Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l’invention présente au moins 50% d’homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase de Pediococcus acidilactici (SEQ ID N°2), préférentiellement au moins 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l’invention présente au moins 50% d’homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase de Streptococcus equinus (Streptococcus bovis) (SEQ ID N°3), préférentiellement au moins 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l’invention présente au moins 50% d’homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase de Bacillus coagulans (SEQ ID N°4), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l’invention présente au moins 50% d’homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase de Lactobacillus casei (SEQ ID N°5), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l’invention présente au moins 50% d’homologie avec la séquence de la D-lactate déshydrogénase de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (SEQ ID N°12), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l’invention présente au moins 50% d’homologie avec la séquence de la D-lactate déshydrogénase de Escherichia coli (SEQ ID N°13), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l’invention présente au moins 50% d’homologie avec la séquence de la D-lactate déshydrogénase Bacillus coagulans (SEQ ID N°14), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.
Dans un mode de réalisation, la bactérie est génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une L-lactate déshydrogénase (endogène ou hétérologue), de manière à pouvoir produire du L-lactate. Dans le cas d’une bactérie possédant un gène codant pour une D-lactate déshydrogénase endogène, l’expression dudit gène est avantageusement au moins partiellement inhibée, de manière à favoriser la production de L-lactate seulement.
De manière alternative, la bactérie peut être génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une D-lactate déshydrogénase (endogène ou hétérologue) de manière à pouvoir produire du D-lactate. Dans le cas d’une bactérie possédant un gène codant pour une L-lactate déshydrogénase endogène, l’expression dudit gène est avantageusement au moins partiellement inhibée, de manière à favoriser la production de D-lactate seulement.
Selon l’invention, on entend par « inhibition de l’expression d’un gène » le fait que ledit gène n’est plus exprimé dans la bactérie considérée ou que son expression est réduite, comparativement à la bactérie sauvage (non génétiquement modifiée pour inhiber l’expression du gène), conduisant à l’absence de production de la protéine correspondante ou à une baisse significative de sa production, et notamment à une baisse supérieure à 20%, plus préférentiellement 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. Dans un mode de réalisation, l’inhibition peut être totale, c’est-à-dire que la protéine codée par ledit gène n’est plus du tout produite. L’inhibition de l’expression d’un gène peut notamment être obtenue par délétion, mutation, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides dans le gène considéré. Préférentiellement, l’inhibition de l’expression du gène est obtenue par délétion totale de la séquence nucléotidique. Selon l’invention, toute méthode d’inhibition d’un gène, connue en soi par l’homme de l’art et applicable à une bactérie peut être utilisée. Par exemple, l’inhibition de l’expression d’un gène peut être obtenue par recombinaison homologue (Datsenko et al., 2000; Lodish ét al., 2000) ; mutagénèse aléatoire ou dirigée pour modifier l’expression d’un gène et/ou l’activité de la protéine encodée (Thomas et al., 1987) ; modification d’une séquence promotrice du gène pour altérer son expression (Kaufmann et al., 2011) ; ciblage induit des lésions locales dans les génomes (TILLING) ; conjugaison, etc. Une autre approche particulière est l'inactivation génique par insertion d'une séquence étrangère, par exemple par mutagenèse de transposon en utilisant des éléments génétiques mobiles, d'origine naturelle ou artificielle ou par exemple par insertion d’une cassette antibiotique. Selon un autre mode de réalisation préféré, l’inhibition de l’expression du gène est obtenue par des techniques knock-out. L’inhibition de l’expression du gène peut également être obtenue par extinction du gène en utilisant des ARN interférents, ribozymes ou antisens (Daneholt, 2006. Nobel Prize in Physiology or Medicine). Dans le contexte de la présente invention, le terme "ARN interfèrent" ou "ARNi" désigne toute molécule d'ARNi (par exemple ARN monocaténaire ou ARN bicaténaire) qui peut bloquer l'expression d’un gène cible et/ou faciliter la dégradation de l'ARNm correspondants. L’inhibition du gène peut également être obtenue par des méthodes d’édition génomique qui permettent de directement apporter des modifications génétiques à un génome donné, via l’utilisation de nucléases à doigts de zinc (Kim et al., 1996), de nucléases effectrices de type activateur de transcription, dites « TALEN » (Ousterout et al. 2016), d’un système combinant des nucléases de type Cas9 avec des courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées dites ‘CRISPR’ (Mali et al., 2013), ou encore de méganucléases (Daboussi et al., 2012). L’inhibition de l’expression du gène peut également être obtenue par inactivation de la protéine codée par ledit gène. L’inhibition de l’expression du gène peut également être obtenue par délétion, mutation, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides dans le promoteur en amont du gène considéré. L’inhibition de l’expression du gène peut également être obtenue par délétion, mutation, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides dans le site de liaison au ribosome en amont du gène considéré.
En travaillant sur les modifications à apporter à une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène génétiquement modifiée pour lui permettre de produire du lactate à partir de CO2, les inventeurs ont mis en évidence dans ces bactéries des gènes codant pour une protéine utilisant le lactate dont l’inhibition permet de supprimer de manière substantielle la consommation du lactate produit. Ces gènes sont réunis sur un opéron appelé lut.
L’opéron lut jusqu’alors inconnu chez les bactéries oxydant naturellement l’hydrogène réunit des gènes qui ont moins de 50% d’identité avec les gènes de l’opéron lut de B. subtilis (Chai et al., 2009) connu pour permettre la croissance de cette bactérie sur le L-lactate comme source de carbone. Pour Cupriavidus necator, les gènes réunis dans l’opéron lut ont moins de 44% d’identité avec ceux de B. subtilis. Pour Rhodococcus opacus les gènes réunis dans l’opéron lut ont moins de 40% d’identité avec ceux de B. subtilis. Pour Rhodococcus jostii les gènes réunis dans l’opéron lut ont moins de 40% d’identité avec ceux de B. subtilis. Pour Hélicobacter pylori, les gènes réunis dans l’opéron lut ont moins de 37% d’identité avec ceux de B. subtilis. Pour Bacillus tusciae, les gènes réunis dans l’opéron lut ont moins de 55% d’identité avec ceux de B. subtilis. Pour Pseudomonas putida, les gènes réunis dans l’opéron lut ont moins de 43% d’identité avec ceux de B. subtilis. Pour Cupriavidus metallidurans, les gènes réunis dans l’opéron lut ont moins de 42% d’identité avec ceux de B. subtilis. Pour Paracoccus denitrificans, les gènes réunis dans l’opéron lut ont moins de 42% d’identité avec ceux de B. subtilis.
Le Tableau 3 ci-après identifie les gènes codant pour des protéines utilisant le lactate réunis dans plusieurs bactéries oxydant naturellement l’hydrogène.
Tableau 3 : Exemples de gènes codant pour des protéines utilisant le lactate
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L’homme du métier saura identifier les gènes codant pour des protéines utilisant le lactate réunis dans des opérons lut dans d’autres espèces de bactéries oxydant naturellement l’hydrogène à partir des informations contenues dans la présente demande.
Dans la bactérie oxydant naturellement l’hydrogène et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO2 selon l’invention, inhiber l’expression de l’opéron lut comprend l’inhibition de l’expression d’au moins l’un des gènes lutA, lutB ou lutC, de préférence d’au moins deux gènes parmi les trois, plus préférentiellement l’inhibition de l’expression des trois gènes lutA, lutB et lutC.
De manière préférée, l’inhibition de l’expression d’un gène de l’opéron lut consiste en la délétion partielle ou totale de la séquence codant pour le dit gène. L’inhibition de l’expression de l’opéron lut consiste de préférence en une délétion dudit opéron lut.
Dans certaines bactéries oxydant naturellement l’hydrogène comme Cupriavidus necator on trouve plusieurs opérons lut. Selon un premier mode de réalisation de l’invention, au moins l’un des gènes lutA, lutB ou lutC de l’un des opérons lut est inhibé. Selon un autre mode de réalisation de l’invention, au moins l’un des gènes lutA, lutB ou lutC d’au moins deux des opérons lut est inhibée. Avantageusement, l’expression d’au moins l’un des gènes lutA, lutB ou lutC de chacun des opérons lut est inhibée.
Selon un autre mode de réalisation de l’invention, l’expression d’au moins l’un des opérons lut est inhibé. Selon un mode préféré de réalisation de l’invention, l’expression d’au moins deux des opérons lut est inhibée. Avantageusement l’expression de chacun des opérons lut est inhibée. C’est en particulier le cas pour Cupriavidus necator qui comprend deux opérons Iut1 et Iut2 et où de préférence l’expression des deux opérons Iut1 et Iut2 est inhibée.
En plus des modifications décrites plus haut, en travaillant sur les modifications génétiques à apporter à une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène pour lui permettre de produire du lactate à partir de CO2, les inventeurs ont mis en évidence que, dans certaines bactéries, il est possible d’inhiber au moins partiellement une voie de dégradation du pyruvate compétitrice de la voie de synthèse du lactate, de manière à favoriser la production de lactate à partir dudit pyruvate.
En effet, certaines bactéries oxydant naturellement l’hydrogène et susceptible d’être modifiées génétiquement selon l’invention, présentent une voie de synthèse du Polyhydroxybutyrate (PHB) à partir du pyruvate. C’est le cas notamment de Cupriavidus necator (figure 2). Une telle voie de biosynthèse peut entrer en compétition avec la voie de synthèse du lactate, en forçant la consommation du pyruvate dans cette voie. Aussi, dans un mode de réalisation, une telle bactérie est génétiquement modifiée pour inhiber au moins partiellement la voie de synthèse du PHB (figure 3). Plus particulièrement, il est possible d’inhiber au moins partiellement l’expression d’au moins un gène choisi parmi les gènes codant pour l’Acétyl-CoA acetyltransférase (EC : 2.3.1.9), l’Acetoacétyl-CoA réductase (EC : 1.1.1.36) et la poly(3- hydroxybutyrate) synthase (EC : 2.3.1.-), préférentiellement l’expression d’au moins deux desdits gènes, plus préférentiellement l’expression desdits trois gènes.
Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie génétiquement modifiée est Cupriavidus necator, dans laquelle l’expression d’au moins un et préférentiellement des trois gènes parmi les gènes codant pour une phaA (GenBank: CAJ91322.1), une phaB (GenBank: CAJ92574.1) et une phaC (GenBank: CAJ92572.1) est inhibée (figure 2). Les inventeurs ont découvert qu’une telle bactérie également génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase est capable de produire des quantités importantes de lactate en présence de CO2 comme seule source de carbone, le pyruvate produit n’étant pas ou peu consommé par la voie de production du PHB.
De manière alternative ou complémentaire, il est possible de modifier génétiquement la bactérie de manière à inhiber au moins partiellement l’expression d’un gène codant pour une phosphoenolpyruvate synthase (EC : 2.7.9.2), qui convertit le pyruvate en phosphoenol pyruvate (PEP), et/ou une pyruvate carboxylase (EC : 6.4.1.1) et/ou un complexe pyruvate dehydrogenase (EC : 1.2.4.1) et/ou une fumarate reductase (EC : 1.3.5.4). Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie génétiquement modifiée est Cupriavidus necator, dans laquelle l’expression d’au moins un gène parmi les gènes codant pour une ppsa (GenBank: CAJ93138.1), une pyc (GenBank: CAJ92391.1), une pdhA (GenBank: CAJ92510.1) et une sdhABCD (GenBank: CAJ93711.1 , CAJ93712.1 , CAJ93713.1 , CAJ93714.1) est inhibée (figure 2). Les inventeurs ont découvert qu’une telle bactérie également génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase est capable de produire des quantités importantes de lactate en présence de CO2 comme seule source de carbone, le pyruvate produit n’étant pas ou peu consommé par ces voies compétitrices.
De manière alternative ou complémentaire, il est possible de modifier génétiquement la bactérie de manière à inhiber au moins partiellement la voie de conversion de l’Acetyl-CoA en acétate et/ou en Acétaldéhyde. Pour cela, il est possible d’inhiber au moins partiellement l’expression d’au moins un gène choisi parmi les gènes codant pour une acetyl-CoA hydrolase (EC : 3.1.2.1), une phosphate acétyltransférase (EC : 2.3.1.8), une Acétate kinase (EC : 2.7.2.1), une propionate CoA-transferase (EC : 2.8.3.1), une succinyl-CoA: acetate CoA- transferase (EC :2.8.3.18) et une Acétaldéhyde déhydrogénase (EC : 1.2.1.10).
Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie génétiquement modifiée est Cupriavidus necator, dans laquelle l’expression d’au moins un gène parmi les gènes codant pour une Acetyl-CoA hydrolase (GenBank: CAJ96157.1), une Phosphate acétyltransférase (pta1 , pta2) (GenBank: CAJ96416.1 , GenBank: CAJ96653.1), une Acétate kinase (ackA, ackA2) (GenBank: CAJ91818.1 , GenBank: CAJ96415.1), une Propionate CoA-transferase (GenBank: CAJ93797.1), une Succinyl-CoA :acetate CoA-transferase (GenBank: CAJ92496.1) et une Acétaldéhyde déhydrogénase (mhpf) (GenBank: CAJ9291 1.1) est inhibée (figure 2). Les inventeurs ont découvert qu’une telle bactérie également génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase et inhiber l’expression d’au moins un gène de l’opéron lut est capable de produire des quantités importantes de lactate en présence de CO2 comme seule source de carbone, le pyruvate produit n’étant pas ou peu consommé par ces voies compétitrices.
Dans certains cas, les bactéries oxydant naturellement l’hydrogène possèdent un ou des gènes codant pour une Lactate ferri cytochrome C reductase. C’est le cas notamment de Cupriavidus necator qui possèdent trois gènes lldD (EC : 1.1.2.3, GenBank: CAJ95257.1), lldA (EC : 1.1.2.3, GenBank: CAJ96599.1), dld (EC : 1.1.2.4, GenBank: CAJ94166.1) codant pour une telle Lactate ferricytochrome C reductase. Une telle enzyme est également susceptible de diminuer le taux de lactate produit, en convertissant ledit lactate en pyruvate. Aussi, selon l’invention, dans le cas où la bactérie possède une telle Lactate ferricytochrome C reductase endogène, le gène codant pour ladite enzyme est avantageusement au moins partiellement inhibé. L’invention propose avantageusement d’utiliser une bactérie génétiquement modifiée selon l’invention pour produire du lactate à partir de CO2. Avantageusement, une bactérie génétiquement modifiée pour surexprimer une L-lactate déshydrogénase, et le cas échéant inhiber une D-lactate déshydrogénase est utilisée pour produire exclusivement du L-lactate. De manière similaire, une bactérie génétiquement modifiée pour surexprimer une D-lactate déshydrogénase, et le cas échéant inhiber une L-lactate déshydrogénase est utilisée pour produire exclusivement du D-lactate.
L’invention propose plus particulièrement un procédé de production de lactate à partir de CO2, selon lequel on cultive, par exemple en batch, fed-batch ou en culture continue, une bactérie génétiquement modifiée selon l’invention en présence de CO2 et on récupère le lactate produit.
Dans un mode de mise en œuvre du procédé, une solution de base est ajoutée pendant la fermentation pour contrôler le pH. L'acide lactique se trouve alors dans le milieu de fermentation sous forme de sel (lactate de sodium, lactate de potassium, lactate de calcium ou lactate d'ammonium, seuls ou en mélange, en fonction de la base choisie pour réguler le pH du milieu de fermentation).
Le bouillon de fermentation contenant les bactéries, les impuretés du milieu de fermentation (protéines non consommées et sels inorganiques de natures diverses) et le sel de lactate, est alors traité afin de les séparer. Une telle étape de séparation peut notamment être mise en œuvre en utilisant un séparateur de cellules tel qu’une centrifugeuse, un dispositif de microfiltration ou d'ultrafiltration. Après séparation, on obtient d’une part une biomasse cellulaire concentrée et d’autre part une solution de sel de lactate.
Il est ensuite possible de procéder à une étape de conversion des sels de lactate en acide lactique sous forme libre. Cette étape de récupération de l'acide lactique à partir du milieu de fermentation peut notamment être réalisée via l'extraction de l'acide lactique en tant que tel du milieu de fermentation, ou par acidification du milieu à l'acide sulfurique.
Une étape de purification par extraction, estérification, distillation ou hydrolyse peut ensuite être réalisée, afin d’obtenir un acide lactique à haut degré de pureté.
Selon l’invention, la source de CO2 peut être du CO2 pur ou du CO2 issu d’émissions des usines ayant des procédés industriels tels que les raffineries de pétrole, les cimenteries, les productions d’ammoniaque, les productions de méthanol, etc. Le CO2 peut également être un produit de fermentation, un gaz enrichi en CO2, un gaz CO2 au moins partiellement purifié, une solution de carbonate ou de bicarbonate, et / ou l'acide formique. La teneur du gaz total en CO2 peut être de 10% à 100%. Un tel gaz contenant du CO2 peut être injecté directement ou via une étape intermédiaire de capture ou purification du CO2. La purification du CO2 peut être réalisée par traitement chimique, par exemple en présence d’amines, ou par traitement enzymatique mettant par exemple en œuvre une anhydrase carbonique. Selon l’invention, la source l’hydrogène peut être un produit du vaporeformage du méthane, de l'électrolyse de l’eau ou être un co-produit (hydrogène « fatal ») des procédés industriels tels que le procédé chlore-alcali lors de la préparation du dichlore ou l’incinération des déchets.
Selon l’invention, il est possible de prévoir éventuellement une étape de croissance de la bactérie en amont, en présence notamment de sucres fermentescibles, tels que du glucose du fructose ou du glycérol. Il est également possible de cultiver la bactérie en présence de CO2 et d’une autre source de carbone lors de l’étape de production de lactate.
EXEMPLES
Exemple 1 - souche productrice de lactate CN0001
Souche et constructions génétiques. Pour la production de lactate, une souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 (DSM n°541) est utilisée. Cette souche ne forme pas de poly- b-hydroxy-butyrate (PHB). La construction de la souche productrice de lactate CN0001 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant la L-lactate déhydrogénase de Cupriavidus necator (Idh, EC: 1.1.1.27) sous promoteur inductible à l’arabinose est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage In-Fusion® (Clontech). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
Le gène Idh est amplifié par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 à l’aide des oligonucléotides 1 (5’ GGATCCAAAC TCGAGTAAGG ATCTCC 3’) et 2 (5’ ATGTATATCT CCTTCTTAAA AGATCTTTTG AATTCC 3’) et de l’enzyme Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer (New England Biolabs, Evry, France). Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pJM3 (Müller et al., 2013) dérivé du plasmide pBBR1-MCS2 (Kovach et al, 1995), contenant un promoteur pBAD de Escherichia coli, est amplifié à l’aide des oligonucléotides 3 (5’ GAAGGAGATA TACATATGAA GATCTCCCTC ACCAGCG 3’) et 4 (5’ CTCGAGTTTG GATCCTCAGG CCGTGGGGAC GGC 3’) et de l’enzyme Phusion High- Fidelity PCRMaster Mix (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de PCR est digéré par l’enzyme Dpnl (New England Biolabs, Evry, France) : 1 pi de Dpnl est ajouté à 50pL de produit PCR, puis incubé 15-60min à 37°C, l’enzyme est ensuite inactivée 10min à 80°C. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par ln-fusion est réalisé avec les deux fragments afin d’obtenir le plasmide pJM3-ldh. 5mI du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli Stellar (Clontech) chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5g/L, NaCI 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 25pg/mL de kanamycine. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), l’insertion correcte du gène Idh est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 5 (5’ GACGCTTTTT ATCGCAACTC TCTACTG 3’) et 6 (5’ CGAACGCCCT AGGTATAAAC GCAG 3’).
Le plasmide pBBAD-ldh est inséré dans la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 par électroporation (protocole adapté de Taghavi et al., 1994). Des cellules Cupriavidus necator sont mises en culture en milieu TSB contenant 27.5 g/L de bouillon de soja tryptique (TSB, Becton Dickinson, Sparks, Maryland, USA, 3ml dans des tubes 10ml) et incubées une nuit à 30°C sous agitation vigoureuse. Le lendemain, 1 ml de la culture est transféré dans un erlenmeyer de 250mL contenant 25mL de milieu TSB et incubé à 30°C, 200 rpm jusqu’à atteindre une DOeoonm de 0,5-0, 6. Les cellules sont alors récoltées et lavées deux fois avec 25mL de tampon de lavage froid (10%glycerol, 90% eau [vol/vol]). Les cellules rendues par ce procédé électro-compétentes sont ensuite concentrées dans la solution de lavage afin d’obtenir une DOeoonm de 50 et aliquotées par 150 pL.
Un aliquot de cellules compétentes est transformée avec 2-5 pL d’ADN plasmidique (100-150ng/pl). Le mélange ADN/cellules contenu dans un tube 1.5 mL est agité par de légers tapotements (4-5 fois). Le mélange est placé 5 min sur la glace et transféré dans une cuvette d’électroporation froide (0.2 cm, 10573463, Fisher scientific, lllkirch). L’électroporation est réalisée avec les réglages suivants : voltage 2.5 kV, capacité 25 pF, résistance externe 200 W. Immédiatement après l’électroporation les cellules sont mélangées avec 1 mL de milieu SOC (tryptone 2 %, extrait de levure 0,5 %, NaCI 10 mM, KCI 2,5 mM, MgCI2 10 mM, MgS04 10 mM et glucose 20 mM), incubées 2h à 30°C puis étalées sur des boites de pétri maintenue à 30°C contenant du milieu TSB/Agar (20g/L) additionné de 10 pg/mL de gentamycine et 200 pg/mL de kanamycine).
La souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 pJM3-ldh est récupérée et nommée CN0001. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.
Milieux Pour les précultures, le milieu minimum A utilisé contient : NaH2P04, 4,0 g/L ; Na2HP04, 4,6 g/L ; K2S04, 0,45 g/L ; MgS04 0,39 g/L, CaCI2, 0,062 g/L ; NH4CI 0.05 % (w/v), trace d’éléments, 1 ml/L (FeS04-7H20, 15 g/L ; MnS04 H20, 2,4 g/L ; ZnS04-7H20, 2.4 g/L ; CUS04-5H20, 0,48 g/L dans HCl 0, 1 M).
Pour les cultures en bioréacteurs le milieu minimum B utilisé contient par litre : MgS04,7H20, 0,75 g; phosphate (Na2HP04, 12H20, 1 ,5g; KH2P04, 0,25 g); acide nitrilotriacetique, 0,285g; citrate d’ammonium de fer(lll), 0,9 g; CaCI2, 0,015 g; trace d’éléments (H3BO3, 0,45 mg; CoCI2,6H20, 0,3 mg; ZnS04,7H20, 0, 15 mg; MnCI2,4H20, 0,045 mg; Na2Mo04,2H20, 0,045 mg; NiCI2,6H20, 0,03 mg; CuS04, 0,015 mg); kanamycin, 0,1 g.
Précultures Une colonie isolée de la souche CN0001 est utilisée pour ensemencer la première culture qui est cultivée pendant 24 h avec 10 mL de TSB contenant 10 pg/mL de gentamycine et 200 pg/mL de kanamycine, dans un erlenmeyer baflé de 100 ml_. Deux autres étapes de propagation sont menées pendant 12 h chacune (25 ml_ et 300 ml_ de milieu minimum A, respectivement dans des flacons Erlenmeyer de 250 ml_ et 3 L). Chaque culture est cultivée à 30 °C et agitée à 100 tours par minute dans un incubateur. Cette préculture est utilisée pour inoculer l’étape de culture en bioréacteurs.
Culture en bioréacteurs La culture de la souche CN0001 en fed-batch est réalisée en trois phases. La première phase consiste en une phase de croissance contrôlée sur fructose pour atteindre 0,9 g/L de biomasse à un taux de croissance spécifique de 0, 16 h 1. Après la consommation du fructose, la deuxième phase est réalisée pour permettre l'adaptation du métabolisme cellulaire aux substrats gazeux. Il est démarré en par un flux de 0,22 L/min d’un mélange commercial H2/O2/CO2/N2 (% molaire: 60:2: 10:28, Air Liquide, Paris, France). La troisième phase consiste en une croissance limitée en azote sur des substrats gazeux couplée à la production de lactate. Cette phase est initiée par l’ajout de 1 g/L de L-arabinose pour induire l'expression de la lactate déshydrogénase. L'azote est alimenté à partir d'une solution de 56 g/L de NH3, pour contrôler un taux de croissance spécifique résiduel de 0,02 h 1. Cette culture est menée dans des bioréacteurs de 1 ,4 L BDCU B. Braun. La température est régulée à 30 °C et le pH à 7,0 par l'addition d'une solution de KOH 2,5 M.
Analyse du lactate et des métabolites Afin de déterminer les concentrations en acides organiques, en particulier celle en lactate, le surnageant de fermentation est analysé par chromatographie HPLC-UV-RI. Le moût de fermentation régulièrement prélevé (1 mL) est d’abord centrifugé pendant 10 min à 10 000 g. Puis, il est filtré sur 0,45 pm (Minicart RC4, Sartorius). Le système HPLC utilisé est un Thermo Scientific UltiMate 3000 HPLC, couplé à un réfractomètre et détecteur UV (210 nm). 10 pL de chaque échantillon est injecté sur une colonne Aminex HPX-87H H+, 300 mm x 7,8 mm (Biorad). L’éluant est une solution aqueuse d’acide sulfurique 4 mM. Le débit est fixé à 0,5 ml/min. La température du four est de 45°C. Une élution isocratique est réalisée. La quantification est réalisée grâce à une gamme étalon appropriée. Si besoin, les échantillons sont dilués.
Résultat La souche CN0001 produit dans ces conditions de culture de 5 à 100 mg/L de lactate.
Exemple 2 : Construction d’une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène, Cupriavidus necator et génétiquement modifiée pour surexprimer de manière plasmidique une lactate déshydrogénase endogène et pour produire du lactate à partir de C02 (CN0002).
Souche et constructions génétiques Pour la production de lactate, une souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 (DSM n°541) est utilisée. Cette souche ne forme pas de poly- b-hydroxy-butyrate (PHB). La construction de la souche productrice de lactate CN0002 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant la L-lactate déshydrogénase de Cupriavidus necator (Idh, EC: 1.1.1.27) sous promoteur inductible à l’arabinose est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage In-Fusion® (Clontech). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
Le gène Idh (GenBank: CAJ91814.1) est amplifié par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 à l’aide des oligonucléotides oligonucléotides 7 (5’ AAGGAGATAT ACATATGAAG ATCTCCCTCA CCAGCG 3’) et 8 (5’ ACTCGAGTTT GGATCCTCAG GCCGTGGGGA CGGC 3’) et de l’enzyme Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer (New England Biolabs, Evry, France). Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pBADTrfp (Bi et al., 2013) dérivé du plasmide pBBR1-MCS (Kovach et al., 1995), contenant un promoteur pBAD de Escherichia coli, est digéré par les enzymes de restrictions BamHI-HF et Ndel (New England Biolabs, Evry, France) afin d’éliminer la séquence codant pour la protéine RFP. Le fragment d’ADN de 5247 paires de bases contenant l’origine de réplication pBBR1 , le gène de sélection (kan) et le promoteur pBAD est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par ln-fusion est réalisé avec les deux fragments afin d’obtenir le plasmide pBAD-ldh(cn). 5 pl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli Stellar™ (Clontech) chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 25 pg/mL de kanamycine (Gibco™). La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 9 (5’ CGAAGGTGAG CCAGTGTGAC TC 3’) et 10 (5’ CCTGTCGATC CTGCCCAACT AC 3’). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), l’insertion correcte du gène l.ldh est confirmée par séquençage (Eurofins Genomic) avec les oligonucléotides 9 et 1 1 (5’ CATTGATTAT TTGCACGGCG TCAC 3’).
Le plasmide pBAD-l.ldh(cn) est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Puiser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 9 et 10. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubé une nuit à 37°C. La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 (DSM n°541) est réalisée comme suit:
Les cellules Cupriavidus necator sont mises en culture dans 3 mL de milieu TSB contenant 27,5 g/L de bouillon de soja tryptique (TSB, Becton Dickinson, Sparks, Maryland, USA) et incubées 20 h à 30°C sous agitation vigoureuse. Les cellules Escherichia coli sont mises en culture dans 3 mL de milieu LB (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich) contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubées une nuit à 37°C sous agitation vigoureuse. Le lendemain, la densité optique (DOeoonm) est mesurée pour chaque culture et l’équivalent de 1 DO de cellules sont transférées en tube 1 ,5 ml et centrifugées (5 minutes, 3000 rpm). Le surnageant est éliminé et les cellules sont lavées dans 1 ml de PBS (Sigma- Aldrich). Le lavage est répété une seconde fois. 50 pL de la suspension cellulaire Cupriavidus necator et 50 pL de la suspension cellulaire Escherichia coli sont prélevés et mélangés dans un tube 1 ,5 mL. Ce mélange est déposé sous forme d’une goutte sur un milieu non sélectif LB/Agar contenant 2% de fructose et incubé 6h à 30°C. Les cellules sont ensuite grattées et resuspendues dans 1 ml de PBS. Cette suspension est diluée au 1 : 1000ème et 100 pL de cette dilution sont étalés sur milieu sélectif LB/Agar contenant 2% de fructose, 300 pg/mL de kanamycine et 10 pg/mL de gentamycine (Sigma-Aldrich). Les cellules sont mises à incuber 24h à 30°C. Des clones isolés sont prélevés, striés sur le même milieu sélectif et mis à incuber 24h à 30°C. La sélection des clones contenant le plasmide pBAD-ldh(cn) est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 9 et 10.
La souche Cupriavidus necator H 16 PHB-4 pBAD-ldh(cn) est récupérée et nommée CN0002. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.
Exemple 3: Production de lactate à partir de Fructose par culture en Erlenmeyer d’une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène, Cupriavidus necator, génétiquement modifiée (CN0002)
Souche Pour la production de lactate, la souche CN0002 ( Cupriavidus necator H 16 PHB-4 pBAD -Idh) est utilisée. Dans cette souche, la LDH (lactate déshydrogénase) de C. necator est surexprimée sur plasmide via un promoteur inductible à l’arabinose. Cette souche est naturellement résistante à la gentamycine et porte une résistance plasmidique à la kanamycine.
Milieux Le milieu riche était constitué de 27,5% (p/v) de bouillon trypticase de soja (TSB, Becton Dickinson, France). Le milieu minimum utilisé pour les cultures en Erlenmeyers (milieu MMR) contenait : 4,0 g/L de NaH2P04 2H20; 4,6 g/L de Na2HP04 12H20; 0,45 de g/L K2S04; 0,39 g/L de MgS04 7H20; 0,062 g/L de CaCI2 2H20 et 1 ml/L de solution de trace d’éléments. La solution de trace d’éléments contenait : 15 g/L de FeS04 7H20; 2,4 g/L MnS04 H20; 2,4 g/L de ZnS04 7H20 et 0,48 g/L de CuS04 5H20 dans 0, 1 M de HCl. Le fructose (20 g/L) a été utilisé comme source de carbone. NhUCI (0,5 g/L) a été utilisé comme source d’azote pour atteindre une concentration de biomasse d’environ 1 g/L. 0,04 g/L de NaOH ont été ajoutés.
Chaîne d’inoculation Un clone de la souche CN0002 repiqué d’une plaque de culture a été tout d’abord cultivé durant 8 h dans 5 mL de milieu riche avec de la gentamycine (10 pg/mL) et de la kanamycine (200 pg/mL) (dépendant de la souche), dans des tubes de culture, à 30°C sous agitation (200 rpm). Cette première préculture a été utilisée pour inoculer la deuxième préculture à une ϋqboo initiale de 0,05 dans 25 mL de milieu MMR dans des Erlenmeyer bafflés de 250 mL qui ont été incubés durant 20 h à 30°C, 200 rpm. Cette seconde préculture a été utilisée pour inoculer la culture en Erlenmeyer dans 50 mL de milieu MMR en présence de gentamycine (10 pg/mL) et de kanamycine (200 pg/mL) (dépendant de la souche). La DC>6OO initiale visée a été de 0,05.
Culture en Erlenmeyer La culture hétérotrophe a été réalisée dans un volume de MMR de 50 mL dans des Erlenmeyers bafflés de 500 mL, à une température de 30°C et une agitation de 200 rpm. Une phase de croissance d’une durée de 20h a été réalisée jusqu’à l’obtention d’une biomasse de 1 g/L. Après cette première phase de croissance, une modification de l’aération est opérée (2% air soit 0,4% d’C>2), une induction du promoteur de la LDH est réalisée par l’ajout de 1 g/L d’arabinose (dépendant de la souche) ce qui conduit à une phase de production de lactate d’une durée de 120 h.
Protocole d'échantillonnage et d'analyse Des échantillons de 1 mL ont été prélevés régulièrement au cours de la culture. La croissance a été suivie par une mesure de la densité optique (DO) à 600 nm; convertie en poids sec de cellules bactériennes (gCDW/L) selon une courbe d'étalonnage. La production de lactate a été analysée par HPLC comme décrit dans l’exemple 1. Les échantillons ont été centrifugés pendant 5 min à 13 000 tr/min et les surnageants ont été filtrés avant d’être analysés par HPLC. L'étalonnage a varié de 0, 1 à 5 g/L dans de l'eau.
Résultats La croissance de la souche est représentée à la figure 5. Pendant la phase de croissance exponentielle, le taux de croissance spécifique de CN0002 en condition hétérotrophe atteint pmax= 0, 14 h 1. Un maximum de lactate, c'est-à-dire 1 ,3 g/L, a été atteint après 139 h de culture comme représenté à la figure 5. Il est à noter que dans les mêmes conditions de culture, la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 sans surexpression de lactate déshydrogénase ne produit pas de lactate.
Exemple 4 : Production de lactate à partir de CO2 par fermentation d’une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène, Cupriavidus necator, génétiquement modifiée (CN0002).
Souche Pour la production de lactate, la souche CN0002 ( Cupriavidus necator H 16 PHB-4 pBAD -Idh) est utilisée. Dans cette souche, la LDH (lactate déshydrogénase) de C. necator est surexprimée sur plasmide via un promoteur inductible à l’arabinose. Cette souche est naturellement résistante à la gentamycine et porte une résistance plasmidique à la kanamycine.
Milieux Le milieu riche était constitué de 27,5% (p/v) de bouillon trypticase de soja (TSB, Becton Dickinson, France). Le milieu minimum utilisé pour les cultures en Erlenmeyers (milieu MMR) contenait : 4,0 g/L de NaH2P04 2H20; 4,6 g/L de Na2HP04 12H20; 0,45 de g/L K2S04; 0,39 g/L de MgS04 7H20; 0,062 g/L de CaCI2 2H20 et 1 ml/L de solution de trace d’éléments. La solution de trace d’éléments contenait : 15 g/L de FeS04 7H20; 2,4 g/L MnS04 H20; 2,4 g/L de ZnS04 7H20 et 0,48 g/L de CuS04 5H20 dans 0, 1 M de HCl. Le fructose (20 g/L) a été utilisé comme source de carbone. NH4CI (0,5 g/L) a été utilisé comme source d’azote pour atteindre une concentration de biomasse d’environ 1 g/L. 0,04 g/L de NaOH ont été ajoutés.
Le milieu minimum utilisé dans le bioréacteur pour les fermentations gaz (milieu FAME) était constitué de : 0,29 g/L d’acide NitriloTriAcetique; 0,09 g/L de citrate d’ammonium ferrique ; 0,75 g/L de MgS04 7H20; 0,015 g/L de CaCI2 2H20 et 1 ,5 ml/L de solution de trace élément. La composition de la solution de trace élément était : 0,3 g/L de H3BO3; 0,2 g/L de CoCI2 6H20; 0, 1 g/L de ZnS04 7H20; 0,03 g/L de MnCI2 4H20; 0,03 g/L de Na2Mo042H20; 0,02 g/L de NiCI2 6H20; 0,01 g/L de CuS04 5H20. (NH4)2S04 (1 ,6 g/L) a été utilisé comme source d’azote pour atteindre une concentration en biomasse d’environ 2,5 g/L. Le pH a été ajusté à 7 avec 2,5 M de KOH. Après autoclavage du milieu, une solution de phosphate stérile de Na2HP04 12H20 (concentration finale de 1 ,6 g/L) et de KH2P04 (concentration finale de 2,9 g/L) a été ajoutée stérilement dans le bioréacteur (permettant de produire environ 10 g/L de biomasse) ainsi qu’une solution stérile de FeS04 7H20 (10,7 g/L; concentration finale 0,032 g/L).
Chaîne d’inoculation Un clone de la souche CN0002 repiqué d’une plaque de culture a été tout d’abord cultivé durant 24 h dans 5 mL de milieu TSB avec de la gentamycine (10 mg/L) et de la kanamycine (50 mg/L) (dépendant de la souche), dans des Erlenmeyers bafflés de 50 mL, à 30°c sous agitation (1 10 rpm). Le milieu de culture a été ensuite centrifugé durant 10 min à 1900 g. Les cellules ont été resuspendues dans 5 mL de milieu MMR, et ont été utilisées pour inoculer les 45 mL de milieu MMR avec 5,5 pg/mL de gentamycine et 100 pg/mL de kanamycine dans des Erlenmeyers bafflés de 500 mL qui ont été incubés durant 20-24 h à 30°C, 1 10 rpm. Le milieu de culture a été centrifugé durant 5 min à 4000 g et les cellules ont été resuspendues dans 30 mL de milieu FAME, et ont été utilisées pour inoculer les 300 mL de milieu FAME avec 100 mg/L de kanamycine dans le bioréacteur gaz. La ϋqboo initiale visée a été de 0,2.
Bioréacteur gaz La culture autotrophe a été réalisée dans un bioréacteur à gaz avec un volume de travail de 330 mL. La température a été réglée à 30 0 C, le pH à 7. La pression et la vitesse d'agitation ont été définies en fonction des besoins de la culture. Les débits de gaz étaient contrôlés individuellement (C02, H2, air). Un analyseur de gaz a été utilisé pour l’analyse des gaz de sortie (% 02 et C02) et un volumètre pour mesurer les débits de gaz de sortie totaux. Après 53 heures de croissance, environ 3 g/L de biomasse ont été atteint, la concentration en oxygène dissous est tombée à 0 et 160 mg/L de lactate ont été produits.
Protocole d'échantillonnage et d'analyse Des échantillons (environ 1 ml) ont été prélevés régulièrement (toutes les 2-3 heures) en prélevant au travers d'un septum avec une seringue et une aiguille. La croissance a été suivie par une mesure de la densité optique (DO) à 600 nm; convertis en poids sec de cellules bactériennes (gCDW/L) selon une courbe d'étalonnage. La production de lactate a été analysée par HPLC/HPAIC comme décrit dans l’exemple 1. Les échantillons ont été centrifugés pendant 3 min à 13 000 tr/min et les surnageants ont été analysés. Pour l'analyse HPLC, les surnageants des échantillons ont été filtrés avant analyse. L'étalonnage a varié de 0, 1 à 5 g/L dans de l'eau.
Fermentation La production de lactate par la souche CN0002 a été caractérisée en bioréacteur en conditions autotrophes. La croissance de la souche est représentée à la figure 6. Pendant la phase de croissance exponentielle, le taux de croissance spécifique de CN0002 en condition autotrophe atteint pmax = 0, 14 h 1. Un maximum de lactate, c'est-à-dire 160 mg/L, a été atteint après 53 h de culture comme représenté à la figure 6.
Exemple 5 : Construction et évaluation d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une lactate déshydrogénase hétérologue de Streptococcus bovis est surexprimée (CN0003).
Souche et constructions génétiques. Pour la production de lactate, une souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 (DSM n°541) est utilisée. Cette souche ne forme pas de poly- b-hydroxy-butyrate (PHB). La construction de la souche productrice de lactate CN0003 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant la L-lactate déshydrogénase (Idh, EC: 1.1.1.27) de Streptococcus bovis (ATCC 33317) sous promoteur inductible à l’arabinose est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage In-Fusion® (Clontech). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
Le gène Idh (GenBank: KFN85486.1) est recodé selon le biais d’usage de codon décrit pour Cupriavidus necator H16 et synthétisé in vitro (GenScript®). Il est amplifié par PCR à l’aide des oligonucléotides 12 (5’ AAGGAGATAT ACATATGACC GCGACCAAGC AGCAC 3’) et 13 (5’ ACTCGAGTTT GGATCCTCAG TTCTTGCAGG CCGACGCGA 3’) et de l’enzyme Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer (New England Biolabs, Evry, France). Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pBADTrfp (Bi et al., 2013) dérivé du plasmide pBBR1-MCS (Kovach et al., 1995), contenant un promoteur pBAD de Escherichia coli, est digéré par les enzymes de restrictions BamHI-HF et Ndel (New England Biolabs, Evry, France) afin d’éliminer la séquence codant pour la protéine RFP. Le fragment d’ADN de 5247 paires de bases contenant l’origine de réplication pBBR1 , le gène de sélection (kan) et le promoteur pBAD est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par ln-fusion est réalisé avec les deux fragments afin d’obtenir le plasmide pBAD-ldh(sb). 5 pi du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli Stellar™ (Clontech) chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 25 pg/mL de kanamycine (Gibco™). La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 9 et 14 (5’ GGAGCTGGGC ATCATCGAGA TC 3’). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), l’insertion correcte du gène Idh est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 9 et 1 1.
Le plasmide pBAD-ldh(sb) est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Puiser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 9 et 14. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubé une nuit à 37°C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche Cupriavidus necator H16 PHB-4 (DSM n°541) est réalisé comme suit :
Les cellules Cupriavidus necator sont mises en culture dans 3 mL de milieu TSB contenant 27,5 g/L de bouillon de soja tryptique (TSB, Becton Dickinson, Sparks, Maryland, USA) et incubées 20h à 30°C sous agitation vigoureuse. Les cellules Escherichia coli sont mises en culture dans 3 mL de milieu LB (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich) contenant 25 pg/mL de kanamycine et incubées une nuit à 37°C sous agitation vigoureuse. Le lendemain, la densité optique (DOeoonm) est mesurée pour chaque culture et l’équivalent de 1 DO de cellules est transféré en tube 1 ,5ml et centrifugé (5 minutes, 3000 rpm). Le surnageant est éliminé et les cellules sont lavées dans 1 ml de PBS (Sigma-Aldrich). Le lavage est répété une seconde fois. 50 pL de la suspension cellulaire Cupriavidus necator et 50 pL de la suspension cellulaire Escherichia coli sont prélevées et mélangées dans un tube 1 ,5 ml. Ce mélange est déposé sous forme d’une goutte sur un milieu non sélectif LB/Agar contenant 2% de fructose et incubé 6h à 30°C. Les cellules sont ensuite grattées et resuspendues dans 1 ml de PBS. Cette suspension est diluée au 1 : 1000eme et 100 pi de cette dilution sont étalés sur milieu sélectif LB/Agar contenant 2% de fructose, 300 pg/mL de kanamycine et 10 pg/mL de gentamycine (Sigma-Aldrich). Les cellules sont mises à incuber 24h à 30°C. Des clones isolés sont prélevés, striés sur le même milieu sélectif et mis à incuber 24h à 30°C. La sélection des clones contenant le plasmide pBAD- Idh(sb) est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 9 et 14.
La souche Cupriavidus necator H 16 PHB-4 pBAD-ldh(sb) est récupérée et nommée CN0003.
Evaluation de la souche CN0003 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H 16 PHB-4 pBAD-ldh(sb) (CN0003) a été évaluée selon la méthode décrite dans l’exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0003 produit 1 g/L de lactate après 140h de culture.
Extrapolation production de lactate par la CN0003 à partir de CO2 La production de lactate de la souche CN0003 n’a pas été réalisée à partir de CO2. Cependant, l’évaluation en fructose a montré que la souche CN0003 produisait 23% de lactate en moins que la souche CN0002 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu’à partir de CO2 tel que décrit dans l’exemple 4, la souche CN0003 produirait 23% de lactate en moins à partir de CO2 que la souche CN0002.
Exemple 6 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée et dans laquelle une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée (CN0004).
Souche Pour la production de lactate, la souche Cupriavidus necator H16 (ATCC 17699) est utilisée. La délétion de l’opéron de voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est inhibée par insertion d’une lactate déshydrogénase endogène.
Constructions génétiques La construction de la souche productrice de lactate CN0004 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant la L-lactate déshydrogénase de Cupriavidus necator (Idh, EC: 1.1.1.27) sous promoteur inductible pLac ainsi que les séquences des zones d’homologie amont et aval de l’opéron phaCAB est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
Le gène Idh est amplifié par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 15 (5’ AGACAATCAA ATC TTTACAC TTTATGCTTC CGGCTCGTAT GTTGTGTGGA ATTGTGAGCG GATAACAATT TCACACAGGA AACAGCTATG AAGATCTCCC TCACCAGCGC CC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 13 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont de l’opéron phaCAB et la séquence du promoteur pLac provenant du pJQ200mp18 (Quandt and Hynes, 1993) et 16 (5’ CCAGGCCGGC AGGTCAGGCC GTGGGGACGG CCA 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 13 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval de l’opéron phaCAB et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d’homologie amont de l’opéron phaCAB est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 17 (5’ GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGGGTCG CTTCTACTCC TATCG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pJQ200mpTet et 18 (5’ CATAAAGTGT AAAGATTTGA TTGTCTCTCT GCC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 13 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la séquence du promoteur pLac et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey- Nagel).
La séquence de la zone d’homologie aval de l’opéron phaCAB est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 19 (5’ CCCCACGGCC TGACCTGCCG GCCTGGTTCA ACC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 13 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la séquence du gène Idh de la souche Cupriavidus necator H 16 et 20 (5’ TACGAATTCG AGCTCGGTAC CCGGGTTCTG GATGTCGATG AAGGCCTG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pJQ200mpTet et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pJQ200mpTet est un dérivé du plasmide pJQ200mp18 (Quandt and Hynes, 1993) où le gène de résistance à la gentamycine a été remplacé par le gène de résistance à la tétracycline. Le plasmide squelette pJQ200mpTet est coupé par l’enzyme de restriction BamHI-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les quatre fragments afin d’obtenir le plasmide pJQ200mp-AphaCABQpLac L-Idh. 2 pl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio- compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 22 (5’ CATGCAAAGT GCCGGCCAGG 3’) et 23 (5’ CTGCACGAAC ATGGTGCTGG CT 3’). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), l’insertion correcte du gène Idh, de la séquence de la zone d’homologie amont et de la séquence de la zone d’homologie aval est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 21 (5’ TGCAAGGCGA TTAAGTTG 3’), 22, 23 et 24 (5’ CTGGCACGAC AGGTTTCCCG A 3’).
Le plasmide pJQ200mp-AphaCABQpLac L-ldh est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Puiser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™)™) et des oligonucléotides 22 et 23. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche Cupriavidus necator H16 (ATCC 17699) a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément l’opéron phaCAB et d’y insérer pLac L-ldh. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™)™) et des oligonucleotides 22 et 23. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen) (KrauBe et al., 2009) et des oligonucleotides 76 (5’ CTGCATGTTC ATGAACTGCG AC 3’) et 77 (5’ CGACGCGTCA ACCATGTTCG 3’).
La souche Cupriavidus necator H16 AphaCABQpLac_L-ldhc.necator est récupérée et nommée CN0004. Les modifications génétiques sont validées par séquençage à l’aide des oligonucléotides 78 (5' GTACCTTGCC GACATCTATG C 3'), 79 (5' GCTGCTTGCA TCACGGACTT G 3'), 10, 77 et 76.
Evaluation de la souche CN0004 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 AphaCABQpLac_L-ldh C. necator (CN0004) a été évaluée selon la méthode décrite dans l’exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0004 produit 1 ,5 g/L de lactate après 140 h de culture.
Extrapolation production de lactate de la CN0004 à partir de CO2 La production de lactate de la souche CN0004 n’a pas été réalisée à partir de CO2. Cependant, l’évaluation en fructose a montré que la souche CN0004 produisait 25% de lactate en plus que la souche CN0002 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu’à partir de CO2 tel que décrit dans l’exemple 4, la souche CN0004 produirait 25% de lactate en plus à partir de CO2 que la souche CN0002.
Exemple 7 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une pyruvate carboxylase est délétée (CN0005)
Souche et constructions génétiques La construction de la souche productrice de lactate CN0005 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval du gène codant pour la pyruvate carboxylase (pyc) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
La séquence de la zone d’homologie amont du gène codant pour pyc est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 25 (5’ AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACCGCAT GGCCAAGGTG GAAGAG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) et 26 (5’ TGCCGGCCAA CGTCACATGG GATGCAGGGA AGCGAAC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène codant pour pyc et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d’homologie aval du gène codant pour pyc est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 27 (5’ TCCCTGCATC CCATGTGACG TTGGCCGGCA GGG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène codant pour pyc et 28 (5’ ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCCCCGG GCTGATAGTT CTTCAACACC AGCAGTC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 31 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pL03 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l’enzyme de restriction Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pL03- Apyc. 2 mI du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli NEB 5- alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucleotides 51 et 80 (5' AATGGGACGT GCGAGTCCAT CC 3'). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène pyc est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 29 (5’ GCAAACAAAC CACCGCTGGT 3’), 30 (5’ CGCCATATCG GATGCCGTTC 3’) et 31 (5’ TAGCAGCACG CCATAGTGAC TG 3’).
Le plasmide pL03-Apyc est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Puiser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 51 et 80. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche CN0004 a été adaptée du protocole de Lenz ét al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour pyc. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 51 et 80. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen) et des oligonucléotides 81 (5' CCATTTGCCC AATACGACTA GC 3') et 30.
La souche Cupriavidus necator H16 Apyc AphaCABQpLac_L-ldh C.necator est récupérée et nommée CN0005. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.
Evaluation de la souche CN0005 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 Apyc AphaCABQpLac_L-ldh C.necator (CN0005) a été évaluée selon la méthode décrite dans l’exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0005 produit 21 % de lactate de plus que la souche CN0004 après 51 h de culture.
Extrapolation production de lactate de la CN0005 à partir de CO2 La production de lactate de la souche CN0005 n’a pas été réalisée à partir de CO2. Cependant, l’évaluation en fructose a montré que la souche CN0005 produisait 21 % de lactate en plus que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu’à partir de CO2 tel que décrit dans l’exemple 4, la souche CN0005 produirait 25% de lactate en plus à partir de CO2 que la souche CN0004.
Exemple 8 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une pyruvate déshydrogénase est délétée (CN0006) Souche et constructions génétiques La construction de la souche productrice de lactate CN0006 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval du gène codant pour le composant E1 de la pyruvate deshydrogénase (pdhA2) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
La séquence de la zone d’homologie amont du gène codant pour pdhA2 est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H 16 à l’aide des oligonucléotides 32 (5’ TCCTTTAATT CGAGCTCGGT ACCCGGGTGC GTAATCCACT TCCAG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) et 33 (5’ CCCATCGTTC ACACGGCAAG TCTCCGTTAA GGAATTC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 11 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène codant pour pdhA2 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d’homologie aval du gène codant pour pdhA2 est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 34 (5’ GACTTGCCGT GTGAACGATG GGCCATCGGG CA 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 1 1 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène codant pour pdhA2 et 35 (5’ TAAGGATCCG GCGCGCCCCC GGGTTGAGCA GGATCACGTC GATCC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pL03 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l’enzyme de restriction Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pL03- ApdhA2. 2 pl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 29 et 82 (5' ATGTCCTGGA TTGCGCAGAT C 3'). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène pdhA2 est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 36 (5’ TAATCCACTT CCAGCGCGAT AAG 3’), 37 (5’ CCTGAAGTCT CCGCGATAAC 3’), 38 (5’ GTTCGAAGCC ACCGAGTATG AC 3’) et 29.
Le plasmide pL03-ApdhA2 est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Puiser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 29 et 82. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche CN0004 a été adaptée du protocole de Lenz ét al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour pdhA2. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 29 et 82. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen).
La souche Cupriavidus necator H 16 ApdhA2 AphaCABQpLac_L-ldhc.necator est récupérée et nommée CN0006. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.
Evaluation de la souche CN0006 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 ApdhA2 AphaCABQpLac_L-ldhc.necator (CN0006) a été évaluée selon la méthode décrite dans l’exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0006 produit 13% de lactate de plus que la souche CN0004 après 51 h de culture.
Extrapolation production de lactate de la CN0006 à partir de CO2 La production de lactate de la souche CN0006 n’a pas été réalisée à partir de CO2. Cependant, l’évaluation en fructose a montré que la souche CN0006 produisait 13% de lactate en plus que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu’à partir de CO2 tel que décrit dans l’exemple 4, la souche CN0006 produirait 13% de lactate en plus à partir de CO2 que la souche CN0004.
Exemple 9 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une phosphate acétyltransférasee et une acétate kinase phosphoenolpyruvate synthase sont délétées (CN0007)
Souche et constructions génétiques La construction de la souche productrice de lactate CN0007 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval de l’opéron codant pour les gènes acétate kinase (ackA) et phosphotransacétylase (pta1) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
La séquence de la zone d’homologie amont du gène codant pour pta1 est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 39 (5’ TCCTTTAATT CGAGCTCGGT ACGTGTCCAA TGAGATGACA GCACG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) et 40 (5’ TGTAGCGGTG GTGCGTCAGG GTCGTCGGTG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 1 1 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène codant pour ackA et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d’homologie aval du gène codant pour ackA est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 41 (5’ ACCCTGACGC ACCACCGCTA CAGCCGACCA AG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 1 1 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène codant pour pta1 et 42 (5’ TAAGGATCCG GCGCGCCCCC GGGCTGATAC GTTCACGCAT AGTGGTC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pL03 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean- up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l’enzyme de restriction Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pL03- Apta1-ackA. 2 pl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucleotides 29 et 43 (5’ GACTTCCGGC AGGTCATGC 3’). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion de l’opéron ackA-pta1 est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 43, 44 (5’ CAGTTGTTGC GCTGCAGTCA T 3’), 45 (5’ GCCAAGCCGG AACGCGTC 3’) et 46 (5’ GATGGTGGCA CGATGTTCAC 3’).
Le plasmide pL03-Apta1-ackA est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Puiser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 29 et 43. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche CN0004 a été adaptée du protocole de Lenz ét al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément l’opéron pta1-ackA. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 29 et 43. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen) et des oligonucléotides 44 et 83 (5' CAGAACTGGC TGTTCTCGGA C 3').
La souche Cupriavidus necator H16 Apta1-ackA AphaCABQpLac_L-ldhc.necator est récupérée et nommée CN0007. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.
Evaluation de la souche CN0007 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 Apta1-ackA AphaCABQpLac_L-ldh C. necator (C N 0007) a été évaluée selon la méthode décrite dans l’exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0007 produit 11 % de lactate de plus que la souche CN0004 après 51 h de culture.
Extrapolation production de lactate de la CN0007 à partir de CO2 La production de lactate de la souche CN0007 n’a pas été réalisée à partir de CO2. Cependant, l’évaluation en fructose a montré que la souche CN0007 produisait 1 1 % de lactate en plus que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu’à partir de CO2 tel que décrit dans l’exemple 4, la souche CN0007 produirait 1 1 % de lactate en plus à partir de CO2 que la souche CN0004.
Exemple 10 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une lactate ferricytochrome C reductase est délétée (CN0008)
Souche et constructions génétiques. La construction de la souche productrice de lactate CN0008 est réalisée selon le protocole suivant : Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval du site actif de la L-Lactate cytochrome c reductase (NdD, 1.1.2.3) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
La séquence de la zone d’homologie amont du gène codant pour NdD est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 47 (5’ CCTGCAGGTC GACTCTAGAG AGCAATTGCT CCGCCATCAG C 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 20 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pJQ200mpTet et 48 (5’ AGTCGATGGC CACTTGGCGG CGCAAGGTAC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 10 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène codant pour NdD et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey- Nagel).
La séquence de la zone d’homologie aval du gène codant pour NdD est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 49 (5’ CCGCCAAGTG GCCATCGACT TGTTGCAGGC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 10 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène codant pour NdD et 50 (5’ ATTCGAGCTC GGTACCCGGG CAAAGGCTGC GTCCAGCCAG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 20 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pJQ200mpTet et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pJQ200mpTet est un dérivé du plasmide pJQ200mp18 (Quandt and Hynes, 1993) où le gène de résistance à la gentamycine a été remplacé par le gène de résistance à la tétracycline. Le plasmide squelette pJQ200mpTet est coupé par l’enzyme de restriction BamHI-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pJQ200mpTet -AlidD. 2 pi du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio- compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 24 et 86 (5' GACAACCTGA TGGTGCACAA GG 3'). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène NdD est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 24, 51 (5’ TGCAAGGCGA TTAAGTTGGG TAACG 3’) et 52 (5’ GAACAGCTGC ACGCCGAG 3’).
Le plasmide pJQ200mpTet -AlldD est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Puiser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 24 et 86. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche CN0004 a été adaptée du protocole de Lenz ét al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour NdD. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 24 et 86. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen) ) et des oligonucléotides 52 et 87 (5' CACATTGCGT CGCTGACATT G 3').
La souche Cupriavidus necator H16 AlldD AphaCABQpLac_L-ldhc.æcafo/- est récupérée et nommée CN0008. Les modifications génétiques sont validées par séquençage à l’aide des oligonucléotides 88 (5' AGCTGTTGCA CACCAGGCGA C 3'), 89 (5' CATTGCCATA TCGCGCGAGA TC 3'), 90 (5' CT ATCGAT CAT GT CAGCT CTT CAT G 3') et 91 (5'
CACTCCGTAC ACAATGACCA CG 3').
Evaluation de la souche CN0008 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 AlldD AphaCABQpLac_L-ldh C. necator (CN0008) a été évaluée selon la méthode décrite dans l’exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0008 produit 1 ,4 g/L de lactate après 140 h de culture.
Extrapolation production de lactate de la CN0008 à partir de CO2 La production de lactate de la souche CN0008 n’a pas été réalisée à partir de CO2. Cependant, l’évaluation en fructose a montré que la souche CN0008 produisait 7% de lactate en moins que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu’à partir de CO2 tel que décrit dans l’exemple 4, la souche CN0008 produirait 7% de lactate en moins à partir de CO2 que la souche CN0004.
Exemple 11 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle deux lactates ferricytochrome C reductases sont délétées (CN0009)
Souche et constructions génétiques La construction de la souche productrice de lactate CN0009 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval du gène codant pour L-Lactate cytochrome reductase (NdA) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
La séquence de la zone d’homologie amont du gène codant pour NdA est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 53 (5’ CCTGCAGGTC GACTCTAGAG GATCCGCAAG ACGGTTTATC TCTCGGTC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pJQ200mpTet et 54 (5’ GACGCTATCA CATGGGAACT CCCTTGAAAA
AAACAAAAAG CTGC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 10 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène codant pour NdA et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d’homologie aval du gène codant pour NdA est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 55 (5’ AGTTCCCATG TGATAGCGTC TATGAGGCGT C 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 10 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène codant pour NdA et 56 (5’ ATTCGAGCTC GGTACCCGGG GATCGAGGAA ATCGGCTGCG TAGG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 24 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pJQ200mpTet et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pJQ200mpTet est un dérivé du plasmide pJQ200mp18 (Quandt and Hynes, 1993) où le gène de résistance à la gentamycine a été remplacé par le gène de résistance à la tétracycline. Le plasmide squelette pJQ200mpTet est coupé par l’enzyme de restriction BamHI-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pJQ200mpTet -AlldA. 2 mI du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli NEB 5-alpha compétentes (New England Biolabs, Evry, France), chimio- compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 mg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 92 (5' TGAGTCCAAC CCGGTAAGAC 3') et 57 (5’ CCTCATAGAC GCTATCACAT GG 3’). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène NdA est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 21 , 57, 58 (5’ CCAT GT GAT AGCGTCT AT GAGG 3’) et 24.
Le plasmide pJQ200mpTet -AlldA est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Puiser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 92 et 57. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche CN0008 a été adaptée du protocole de Lenz ét al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour NdA. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 92 et 57. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen) et des oligonucléotides 93 (5' CTGGCTGAAC GTGAAGAATG C 3') et 94 (5' GGAAGATAAA CCCGAGCAGA TC 3').
La souche Cupriavidus necator H16 AlldA AlldD AphaCABQpLac_L-ldhc.æcator est récupérée et nommée CN0009. Les modifications génétiques sont validées par séquençage à l’aide des oligonucléotides 57, 58, 95 (5' CAGGCTTATC GACAGAGAAA TTCG 3') et 96 (5' GTATTTCGCA TCGTGCCAGA C 3').
Evaluation de la souche CN0009 en fructose La production de lactate sur fructose de la souche Cupriavidus necator H16 AlldD AphaCABQpLac_L-ldh C. necator (CN0009) a été évaluée selon la méthode décrite dans l’exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0009 produit 1 ,4 g/L de lactate après 140 h de culture.
Extrapolation production de lactate de la CN0009 à partir de CO2 La production de lactate de la souche CN0009 n’a pas été réalisée à partir de CO2. Cependant, l’évaluation en fructose a montré que la souche CN0009 produisait 7% de lactate en moins que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu’à partir de CO2 tel que décrit dans l’exemple 4, la souche CN0009 produirait 7% de lactate en moins à partir de CO2 que la souche CN0004. Exemple 12 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une phosphoenolpyruvate synthase est délétée (CN0010)
Souche et constructions génétiques. La construction de la souche productrice de lactate CN0010 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval du gène codant pour la phosphoenolpyruvate synthase (ppsA) de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
La séquence de la zone d’homologie amont du gène codant pour ppsA est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 59 (5’ AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACCCGAA GATCTTCGGC TTGAACG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pL03 et 60 (5’ ACGTCAAATG CTTCACATGT CCGGTATGTT CTTGGAGTTC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène codant pour ppsA et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d’homologie aval du gène codant pour ppsA est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 61 (5’ AACATACCGG ACATGTGAAG CATTTGACGT CACAATAACG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène codant pour ppsA et 62 (5’ ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCCTTGA GCACGTGCT TGTAGG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pL03 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean- up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l’enzyme de restriction Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pL03- AppsA. 2 mI du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 mg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène ppsA est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 63 (5’ ATGAACACCG GCACCTTCTA CC 3’), 64 (5’ CAGGATGGAG TGGCTGAACG 3’) et 29.
Le plasmide pL03-AppsA est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Puiser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche CN0004 a été adaptée du protocole de Lenz ét al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour ppsA. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen).
La souche Cupriavidus necator H16 AppsA AphaCABQpLac_L-ldh C.necator est récupérée et nommée CN0010. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.
Exemple 13 : Evaluation de la consommation lactate par les souches CN0004 et CN0009
Souches Pour l’évaluation de la consommation de lactate, les souches CN0004 ( Cupriavidus necator H 16 AphaCABQpLac_L-ldhc.necator) et CN0009 ( Cupriavidus necator H 16 AlldA AlldD AphaCABQpLac_L-ldhc.æcato) sont utilisées.
Milieux Le milieu riche était constitué de 27,5% (p/v) de bouillon trypticase de soja (TSB, Becton Dickinson, France). Le milieu minimum utilisé pour les précultures et les cultures en Erlenmeyers (milieu MMR) contenait : 4,0 g/L de NaH2P04 2H2O; 4,6 g/L de Na2HP04 12H2O; 0,45 de g/L K2S04; 0,39 g/L de MgS04 7H20; 0,062 g/L de CaCI2 2H20 et 1 ml/L de solution de trace d’éléments. La solution de trace d’éléments contenait : 15 g/L de FeSÜ4 7H2O; 2,4 g/L MnS04 H20; 2,4 g/L de ZnS04 7H20 et 0,48 g/L de CuS04 5H20 dans 0, 1 M de HCl. NH4CI (1 g/L) a été utilisé comme source d’azote pour atteindre une concentration de biomasse d’environ 2 g/L. 0,04 g/L de NaOH ont été ajoutés. Pour les précultures, le fructose (20 g/L) a été utilisé comme source de carbone. Pour les cultures, le lactate (6 g/L) a été utilisé comme source de carbone.
Chaîne d’inoculation Un clone de la souche CN0004 et un clone de la souche CN0009 repiqués d’une plaque de culture ont été tout d’abord cultivés durant 8 h dans 5 ml_ de milieu riche avec de la gentamycine (10 pg/mL), dans des tubes de culture, à 30°C sous agitation (200 rpm). Cette première préculture a été utilisée pour inoculer la deuxième préculture à une ϋqboo initiale de 0,05 dans 25 ml_ de milieu MMR + 20 g/L de fructose dans des Erlenmeyer bafflés de 250 mL qui ont été incubés durant 20 h à 30°C, 200 rpm.
Culture en Erlenmeyer La seconde préculture a été centrifugée, le culot cellulaire a été lavé deux fois avec du MMR sans source de carbone et utilisé pour inoculer la culture en Erlenmeyer de 500mL dans 50 mL de milieu MMR + 6g/L de lactate en présence de gentamycine (10 pg/mL). La ϋqboo initiale visée a été de 0,2. La culture en présence de lactate comme seule source de carbone a été réalisée à une température de 30°C et une agitation de 200 rpm. Une phase de croissance d’une durée de 8h a été réalisée jusqu’à la consommation totale du lactate.
Protocole d'échantillonnage et d'analyse Des échantillons de 1 mL ont été prélevés régulièrement au cours de la culture. La croissance a été suivie par une mesure de la densité optique (DO) à 600 nm. La consommation de lactate a été analysée par HPLC comme décrit dans l’exemple 1. Les échantillons ont été centrifugés pendant 5 min à 13 000 tr/min et les surnageants ont été filtrés avant d’être analysés par HPLC. L'étalonnage a varié de 0, 1 à 5 g/L dans de l'eau.
Résultats La croissance des souches CN0004 et CN0009 avec le lactate comme seule source de carbone est représentée à la figure 7. Pendant la phase de croissance exponentielle, la vitesse de consommation du lactate pour la souche CN0004 est de 0,89 g/L/h et pour la souche CN0009 de 0,88 g/L/h. La délétion des deux lactates ferri cytochrome C reductases entraine moins de 1 % de diminution de la consommation du lactate par Cupriavidus necator.
Exemple 14 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée, deux lactates ferricytochrome C reductases sont délétées et dans laquelle un opéron Iut1 portant les gènes codant pour des protéines utilisant le lactate est délété (CN0011 ).
Souche et constructions génétiques :
La construction de la souche productrice de lactate CN0011 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval de l’opéron comprenant les gènes A1390, A1391 et A1392 du chromosome AM260479 de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
La séquence de la zone d’homologie amont du gène A1390 est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 65 (5’ AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACTCATA GATGCCGGCG GCAATGC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pL03 et 66 (5’ TTTACTGAAG CCTCACATTG TCGACTTCTC CAGACCCG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène A1392 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey- Nagel).
La séquence de la zone d’homologie aval du gène A1392 est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 67 (5’ GAGAAGTCGA CAATGTGAGG CTTCAGTAAA GAACCAC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène A 1390 et 68 (5’ ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCCCAAG CTGCTGTACG TGTC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pL03 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey- Nagel).
Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l’enzyme de restriction Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pL03-Alut1. 2mI du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli NEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10g/L, extrait de levures 5g/L, NaCI 5g/L, Sigma- Aldrich, agar 20g/L) contenant 15pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) à l’aide des oligonucléotides 97 (5' AGGCATTGAC CTTGGTGCGT ATC 3') et 31. Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion de l’opéron Iut1 est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 69 (5’ GTGACAGCTC TTTCAGGCTG AC 3’), 31 et 29.
Le plasmide pL03-Alut1 est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Puiser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000). La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 97 et 31. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10g/L, extrait de levures 5g/L, NaCI 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 15pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche CN0009 a été adaptée du protocole de Lenz ét al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément l’opéron Iut1. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen) et des oligonucléotides 98 (5' GGTCGGAGAA GACCTGATCG 3') et 69.
La souche Cupriavidus necator H16 Alutl AlldA AlldD AphaCABQpLac_L-ldhc.æcafo/- est récupérée et nommée CN001 1. Les modifications génétiques sont validées par séquençage à l’aide des oligonucléotides 99 (5' GCTTCGGTCA CGTAGCCCAT G 3'), 100 (5' CTGGAATTCG TGGATACGCT GAC 3'), 101 (5' TGTCCGCCAG CCTTAACATC AG 3'), et 102 (5' CTCACCGGAA GTGATGTGCA TTG 3').
Exemple 15 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée, deux lactates ferricytochrome C reductases sont délétées et dans laquelle un opéron Iut2 portant les gènes codant pour des protéines utilisant le lactate est délété (CN0012).
Souche et constructions génétiques :
La construction de la souche productrice de lactate CN0012 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval de l’opéron lactate utilisation comprenant les gènes B0091 , B0092, B0093 du chromosome AM260480 de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
La séquence de la zone d’homologie amont du gène B0093 est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 70 (5’ AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACGGCTG CGCACGAAGT CGATATG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pL03 et 71 (5’ CGT GAT G ACGG ATT AT CAT GTCTCGCTCCGGACGT G 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène B0091 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d’homologie aval du gène B0091 est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 72 (5’ CGGAGCGAGA CATGATAATC CGTCATCACG GGCGCGAG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène B0093 et 73 (5’ ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCGCGGC TGCCATACCT TCAGGAAC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pL03 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean- up (Macherey-Nagel).
Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l’enzyme de restriction Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pL03- Alut2. 2mI du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli NEB 5- alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10g/L, extrait de levures 5g/L, NaCI 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 15pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 31 et 74 ((5’ GTGGCCGATT GCATGGATCA TC 3’). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion de l’opéron Iut2 est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 29, 74, 75 (5’ TGTTGCGCGC CACCTCGTAT TGC 3’) et 31.
Le plasmide pL03-Alut2 est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Puiser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 31 et 74. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCI 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche CN0009 a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément l’opéron Iut2. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 31 et 74. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen) et des oligonucléotides 103 (5' CGCGGAAGCG GGAATTATGC 3') et 104 (5' TCCTGCTTCG GTGGTGTTTC G 3').
La souche Cupriavidus necator H16 Alut2 AlldA AlldD AphaCABQpLac_L-ldh C.necator est récupérée et nommée CN0012. Les modifications génétiques sont validées par séquençage à l’aide des oligonucléotides 103, 104, 105 (5' CCTATCTTCT ATGCCTACCT GAAG 3') et 106 (5' TGTAGGGCGA AGCCTTGC 3').
Exemple 16 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée, deux lactates ferricytochrome C reductases sont délétées et dans laquelle les deux opérons lut 1et Iut2 portant les gènes codant pour des protéines utilisant le lactate sont délétés (CN0013). Souche et constructions génétiques.
La construction de la souche productrice de lactate CN0013 est réalisée selon le protocole suivant :
Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval de l’opéron lactate utilisation comprenant les gènes B0091 , B0092, B0093 du chromosome AM260480 de Cupriavidus necator est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.
La séquence de la zone d’homologie amont du gène B0093 est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 70 présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pL03 et 71 présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène B0091 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
La séquence de la zone d’homologie aval du gène B0091 est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la souche Cupriavidus necator H16 à l’aide des oligonucléotides 72 présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène B0093 et 73 présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pL03 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel). Le plasmide squelette pL03 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l’enzyme de restriction Xmal-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).
Un assemblage in vitro par NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pL03- Alut2. 2mI du produit d’assemblage sont transformés dans des cellules Escherichia coli NEB 5- alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10g/L, extrait de levures 5g/L, NaCI 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 15pg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 31 et 74. Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion de l’opéron Iut2 est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 29, 74, 75 et 31.
Le plasmide pL03-Alut2 est inséré dans une souche électrocompétente Escherichia coli S17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Puiser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).
La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 31 et 74. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10g/L, extrait de levures 5g/L, NaCI 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 15 pg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.
La conjugaison entre les cellules Escherichia coli S17-1 et celles de la souche CN001 1 a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément l’opéron Iut2. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 31 et 74. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen) et des oligonucléotides 103 (5' CGCGGAAGCG GGAATTATGC 3') et 104 (5' TCCTGCTTCG GTGGTGTTTC G 3').
La souche Cupriavidus necator H16 Alutl Alut2 AlldA AlldD AphaCABQpLac_L- Idhc.necafo/- est récupérée et nommée CN0013. Les modifications génétiques sont validées par séquençage à l’aide des oligonucléotides 103, 104, 105 (5' CCTATCTTCT ATGCCTACCT GAAG 3') et 106 (5' TGTAGGGCGA AGCCTTGC 3').
Exemple 17 : Evaluation de la consommation lactate par les souches CN0009, CN0011, CN0012 et CN0013
Souches : Pour l’évaluation de la consommation de lactate, les souches CN0009 (Cupriavidus necator H16 AlldA AlldD AphaCABQpLac_L-ldhc.necator), CN001 1 ( Cupriavidus necator H16 Alutl AlldA AlldD AphaCABQpLac_L-ldhc.necator), CN0012 ( Cupriavidus necator H16 Alut2 AlldA AlldD AphaCABQpLac_L-ldhc.æcatof), CN0013 ( Cupriavidus necator H16 Alutl Alut2 AlldA AlldD AphaCABQpLac_L-ldhc.æcatof) sont utilisées.
Milieux, conditions de culture et protocole d’échantillonnage et d’analyse Les milieux, les conditions de culture et le protocole d’échantillonnage et d’analyse utilisés sont les mêmes que ceux décrits dans l’exemple 13.
Résultats La croissance des souches CN0009, CN0011 , CN0012 et CN0013 avec le lactate comme seule source de carbone est représentée à la figure 8. Pendant la phase de croissance, la vitesse de consommation du lactate pour la souche CN0009 est de 0,89 g/L/h, pour la souche CN001 1 de 0,72 g/L/h, pour la souche CN0012 de 0,05 g/L/h et pour la souche CN0013 de 0 g/L/h. La délétion de l’opéron Iut1 entraîne donc une diminution de la consommation du lactate par Cupriavidus necator de 19%. La délétion de l’opéron Iut2 entraîne donc une diminution de la consommation du lactate par Cupriavidus necator de 94%. La délétion concomitante de l’opéron Iut1 et Iut2 entraîne donc une diminution totale de la consommation du lactate par Cupriavidus necator.
Exemple 18 : Impact des modifications génétiques de la souche CN0013 sur la reconsommation du lactate après production en conditions autotrophes.
Souches : Dans cet exemple, nous comparons deux souches : la souche CN0002 dont la construction est décrite dans l’exemple 2 et la souche CN0013 dont la construction est décrite dans l’exemple 16.
Fermentation en bioréacteur gaz : La fermentation en conditions autotrophe a été réalisée pour chacune des souches CN0002 et CN0013 tel que décrit dans l’exemple 4.
Résultats :
Comme présenté dans le tableau 4 ci-dessous, nous avons normalisé le pic de production maximale de lactate à 53h de culture à 100% pour les deux souches CN0002 et CN0013, et ce afin de pouvoir comparer ensuite la cinétique de reconsommation pour ces deux souches. En ce qui concerne la souche CN0002, une reconsommation quasi-totale du lactate produit est observée, avec seulement 5% de lactate encore présent à 83h de culture. Dans le cas de la souche CN0013, dont les opérons Iut1 et Iut2 sont délétés, 74% de lactate résiduel est observé à 83h de fermentation. Ces résultats montrent que les modifications génétiques apportées à la souche CN0013 et notamment la délétion des opérons Iut1 et Iut2 permet de maintenir 74% de la production de lactate contre seulement 5% sans délétion (souche CN0002). Nous avons donc amélioré la production finale de lactate en inactivant la voie de reconsommation du lactate. Tableau 4
Figure imgf000048_0001
Tableau 5
Figure imgf000048_0002
Figure imgf000049_0001
RÉFÉRENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Bactérie oxydant naturellement l’hydrogène et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO2, ladite bactérie étant génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant une lactate déshydrogénase et pour inhiber l’expression d’un opéron lut.
2. Bactérie selon la revendication 1 , caractérisée en ce que l’inhibition de l’expression d’un opéron lut comprend l’inhibition de l’expression d’au moins un gène lutA, lutB ou lutC dudit opéron lut.
3. Bactérie selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l’inhibition de l’expression de l’opéron lut consiste en une délétion dudit opéron lut.
4. Bactérie selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que lorsque la bactérie comprend plusieurs opérons lut, l’expression d’au moins deux opérons est inhibée.
5. Bactérie selon l’une des revendication s 1 à 4, caractérisée en ce qu’elle est génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant une lactate déshydrogénase endogène.
6. Bactérie selon la revendication 1 à 5, caractérisée en ce qu’elle est génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant une lactate déshydrogénase exogène, préférentiellement dérivé d’une bactérie, d’un champignon, d’une levure ou d’un mammifère, plus préférentiellement dérivé d’une bactérie.
7. Bactérie selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu’elle est également génétiquement modifiée pour inhiber au moins partiellement au moins une voie de dégradation du pyruvate compétitrice de la voie de synthèse du lactate.
8. Bactérie selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l’expression d’au moins un gène codant une lactate ferricytochrome C reductase est au moins partiellement inhibée.
9. Bactérie selon l’une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu’elle est choisie parmi Cupriavidus sp., telle que Cupriavidus necator, Hydrogenobacter sp., telle que Hydrogenobacter thermophilus, Rhodococcus sp., telle que Rhodococcus opacus, et Pseudomonas sp., telle que Pseudomonas hydrogenothermophila.
10. Bactérie selon l’une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu’elle est Cupriavidus necator.
1 1. Utilisation d’une bactérie définie selon l’une des revendications 1 à 10, pour la production de lactate à partir de CO2.
12. Procédé de production de lactate à partir de CO2, comprenant les étapes consistant à - cultiver la bactérie selon l’une des revendications 1 à 10 en présence de CO2 comme seule source de carbone, puis
- récupérer le lactate.
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