FR3095817A1

FR3095817A1 - Bactérie génétiquement modifiée pour une production améliorée de lactate à partir de CO2

Info

Publication number: FR3095817A1
Application number: FR1904814A
Authority: FR
Inventors: Cédric Boisart; Nicolas Chabot; Marion DE LA MARE
Original assignee: Enobraq
Current assignee: Enobraq
Priority date: 2019-05-09
Filing date: 2019-05-09
Publication date: 2020-11-13
Also published as: WO2020225346A1

Abstract

L’invention a trait à une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO2, ladite bactérie étant génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant une lactate déshydrogénase et pour inhiber l’expression d’un opéron lut et à un procédé de production de lactate à partir de CO2 utilisant une telle bactérie.

Description

Bactérie génétiquement modifiée pour une production améliorée de lactate à partir de CO2

DOMAINE DE L'INVENTION.

L’invention a trait à une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO₂. L’invention a également trait à un procédé de production de lactate, ou d’acide lactique, à partir de CO₂utilisant une telle bactérie génétiquement modifiée.

ARRIERE PLAN DE L'INVENTION.

L’acide lactique trouve des applications dans de nombreuses industries. Par exemple, l’acide lactique est utilisé comme précurseur de l’acide polylactique (PLA) qui est un polymère entièrement biodégradable, utilisé par exemple dans les emballages alimentaires. L’acide lactique peut également être utilisé comme additif, en tant qu’antioxydant, acidifiant ou exhausteur de goût par l’industrie agroalimentaire. En cosmétique, l’acide lactique est généralement utilisé comme bactériostatique ou comme agent de peeling.

Actuellement, la production à l’échelle industrielle de l’acide lactique repose principalement sur la fermentation d’hydrate de carbone, et notamment de glucose, lactose, sucrose ou maltose. Si de nombreuses bactéries peuvent provoquer la transformation de ces sucres en acide lactique, seules les bactéries lactiques permettent de produire exclusivement de l’acide lactique, les autres bactéries produisant en général un mélange de plusieurs acides organiques.

En outre, la production d’acide lactique à partir de sucres fermentescibles, tels que le glucose ou le lactose, pose la question de la concurrence entre l’alimentation et la production de produits de commodité comme l’acide lactique.

En parallèle, les émissions de dioxyde de carbone (CO₂) dans l’atmosphère ne cessent de croître. Des systèmes biologiques qui fixent le carbone par des processus métaboliques biochimiques naturels, telles que les algues, ont déjà été utilisés pour produire des molécules d’intérêt par réactions photosynthétiques. Cependant, les rendements de production restent insuffisants et limitent l’intérêt économique de ces systèmes.

De même, des méthodes mettant en œuvre des cellules bactériennes génétiquement modifiées ont été développées, pour transformer des sucres en molécules d’intérêt dans des systèmes de fermentation hétérotrophe. Angermayret al., 2012 décrit la surexpression de la lactate déshydrogénase deBacillus subtilisdans la cyanobactérieSynechocystis. WO 2014/205146 et WO 2015/155790 décrivent des bactéries méthanotrophes dont la source d’énergie vient de leur substrat carboné. De tels systèmes présentent plusieurs inconvénients. En effet, les systèmes de fermentation hétérotrophe sont sensibles à la contamination, ce qui impacte considérablement les rendements de production. En outre, ces systèmes hétérotrophes ne résolvent pas les problèmes de concurrence avec l’alimentation, puisque des sucres fermentescibles restent nécessaires, ni d'impacts environnementaux négatifs.

Il existe donc toujours un besoin en des procédés microbiologiques pour permettre la production de molécules, telles que l’acide lactique, en grandes quantités à partir de CO₂comme seule source de carbone, afin de ne pas entrer en compétition avec l’alimentaire tout en réduisant les émissions de gaz à effet de serre.

En travaillant sur cette problématique, les inventeurs ont découvert qu’il est possible de forcer des bactéries oxydant naturellement l’hydrogène, et capables de produire de la matière organique à partir de CO₂, dans une voie de synthèse de lactate, au détriment éventuellement d’autres voies de synthèse. Notamment, les inventeurs ont découvert qu’il est possible de favoriser une voie de synthèse de lactate endogène, qui n’est pas ou peu exprimée naturellement dans la bactérie, en jouant sur l’expression du ou des gènes associés à cette voie de synthèse. Ainsi, les inventeurs ont découvert que les bactéries oxydant l’hydrogène peuvent être génétiquement modifiée de manière à surexprimer une lactate déshydrogénase endogène ou une hétérologue, et/ou de manière à réprimer l’expression de gènes intervenant dans une voie de synthèse de molécules venant en concurrence de la production de lactate, afin de produire du lactate à partir de CO₂. Plus particulièrement, les inventeurs ont découvert que la bactérieCupriavidus necator(également appeléeHydrogenomonas eutrophus, Alcaligenes eutropha, Ralstonia eutropha, ouWautersia eutropha)peut être génétiquement modifiée de manière à surexprimer une lactate déshydrogénase endogène, en jouant sur le promoteur et/ou le nombre de copie du gène codant pour cette lactate déshydrogénase notamment, de manière à produire du lactate à partir de CO₂. De manière alternative ou complémentaire, la production de lactate peut être améliorée en introduisant un ou plusieurs gènes exprimant une lactate déshydrogénase hétérologue et/ou en réprimant l’expression de gènes intervenant dans une voie de synthèse de molécules venant en concurrence de la production de lactate.

Ces modifications bien qu’efficaces atteignent des limites lorsque l’on cherche à favoriser la production de lactate en prolongeant la culture dans le temps. Les inventeurs ont alors constaté après quelques heures de culture que les bactéries re-consommaient le lactate produit. Contrairement à ce qui est généralement attendu, les inventeurs ont constaté que la délétion des gènes codant pour les lactates ferricytochrome C reductases (lldD et lldA) décrite dans la littérature comme permettant d’éviter la consommation de lactate notamment chezEscherichia coli(Wooet al.2014 ; Niuet al.2014 ; Mazumbaret al.2013 ; Wanget al.2012 ; Chaiet al.2009) et chezIssatachenkia orientalis(Suominenet al.2012 ; Milletet al.2012) ne permet pas de supprimer la re-consommation du lactate dans les bactéries oxydant naturellement l’hydrogène, et capables de produire de la matière organique à partir de CO₂. Ils ont identifié dans ces bactéries les gènes (lutA, lutB et lutC) réunis en opéron codant pour les composants d’un complexe enzymatique utilisant le lactate dont l’inhibition permet de réduire de manière substantielle voire de supprimer totalement la re-consommation du lactate produit.

BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION.

L’invention a donc pour objet une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO₂, ladite bactérie étant génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase et pour inhiber l’expression d’un opéron appelé lut, ledit opéron comprenant des gènes lutA, lutB ou lutC codant pour les composants d’un complexe enzymatique utilisant le lactate.

Selon l’invention, la bactérie peut être génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase endogène et/ou exogène.

L’invention a également pour objet l’utilisation d’une bactérie selon l’invention pour la production de lactate à partir de CO₂, préférentiellement pour la production exclusivement de L-lactate, ou pour la production exclusivement de D-lactate.

L’invention porte également sur un procédé de production de lactate à partir de CO₂, comprenant les étapes consistant à cultiver la bactérie avec du CO₂comme seule source de carbone, puis à récupérer le lactate.

DESCRIPTION DES FIGURES.

La figure 1 montre une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène selon l’invention apte à produire du lactate à partir de CO2 et H2.

La figure 2 montre les différentes voies métaboliques présentes naturellement chez Cupriavidus necator, et notamment, la glycolyse et le cycle de Calvin.

La figure 3 montre les différentes modifications génétiques (surexpression et/ou inhibition de l’expression de gènes) qui peuvent être réalisées chez Cupriavidus necator pour favoriser la production de L-lactate à partir de CO2.

La figure 4 montre les différentes modifications génétiques (surexpression et/ou inhibition de l’expression de gènes) qui peuvent être réalisées chez Cupriavidus necator pour favoriser la production de D-lactate à partir de CO2.

Les différentes abréviations utilisées dans la description et les figures 2, 3 et 4 sont donnés dans le Tableau 4.

La figure 5 représente la production de lactate par la bactérie CN0002 à partir de fructose.

La figure 6 représente la production de lactate par la bactérie oxydant naturellement l’hydrogène CN0002 et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO2.

La figure 7 représente la comparaison de la croissance cellulaire et de la consommation du lactate dans deux souches de Cupriavidus necator, CN0004 et CN0009, dont l’une comprend la délétion des gènes lldD et lldA (CN0009).

La figure 8 représente la comparaison de la croissance cellulaire et de la consommation du lactate dans quatre souches de Cupriavidus necator, avec ou sans délétion des opérons lut1 et lut2.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION.

L’invention a pour objet une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène, génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO₂, ladite bactérie étant génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase

Dans le contexte de l’invention, une bactérie «oxydant naturellement l’hydrogène» désigne une bactérie capable, sans manipulation génétique préalable, d’utiliser l’hydrogène gazeux comme donneur d’électron et l’oxygène comme accepteur d’électron, et capable de fixer le dioxyde de carbone. Ces bactéries sont également appelées bactéries «knallgas». Les bactéries oxydant naturellement l’hydrogène ont besoin de dioxyde de carbone comme source de carbone et d’hydrogène comme source d’énergie.

Selon l’invention, la bactérie oxydant naturellement l’hydrogène est préférentiellement sélectionnée parmiRalstoniasp,Cupriavidussp.,Hydrogenobactersp.,Rhodococcussp., Hydrogenovibriosp.;Rhodopseudomonas sp.,Rhodobacter sp., Aquifexsp.,Corynebacteriumsp.,Nocardiasp.,Rhodospirillumsp.,Rhizobiumsp.,Thiocapsasp.,Pseudomonassp.,Hydrogenomonassp.,Hydrogenobactersp.,Hydrogenophilussp.,Hydrogenautresmussp.,Helicobactersp.,Xanthobactersp.,Hydrogenophaga sp., Bradyrhizobiumsp.,Alcaligenessp.,Amycolatasp.;Aquaspirillumsp.,Arthrobactersp.,Azospirillumsp.,Variovouaxsp.,Acidovouaxsp.,Bacillussp.,Calderobacteriumsp.,Derxiasp.,Flavobacteriumsp.,Microcyclus sp., Mycobacteriumsp.,Paracoccussp.,Persephonellasp.,Renobactersp.,Thermocrinissp.,Wautersiasp., et les cyanobactéries telles queAnabaenasp.

Notamment, la bactérie est sélectionnée parmiRhodococcus opacus, Rhodococcus jostii, Hydrogenovibrio marinus, Rhodopseudomonas capsulata, Rhodopseudomonas palustris,Rhodobacter sphaeroides, Aquifex pyrophilus, Aquifex aeolicus, Cupriavidus necator, Cupriavidus metallidurans, Corynebacterium autotrophicum, Nocardia autotrophica, Nocardia opaca, Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas sulfoviridis, Rhodopseudomonas blastica, Rhodopseudomonas sphaeroides, Rhodopseudomonas acidophila, Rhodospirillum rubrum,Rhizobium japonicum, Thiocapsa roseopersicina, Pseudomonas facilis, Pseudomonas flava, Pseudomonas putida, Pseudomonas hydrogenovoua, , Pseudomonas palleronii, Pseudomonas pseudoflava, Pseudomonas saccharophila, Pseudomonas thermophila, Pseudomonas hydrogenothermophila, Hydrogenomonas pantotropha, Hydrogenomonas eutropha, Hydrogenomonas facilis,Hydrogenobacter thermophilus, Hydrogenobacter halophilus, Hydrogenobacter hydrogenophilus, Hydrogenophilus isleticus,Hydrogenophilus thermoluteolus,Hydrogenautresmus marinus, Helicobacter pylori, Xanthobacter autotrophicus, Xanthobacter flavus, Hydrogenophaga flava, Hydrogenophaga palleronii, Hydrogenophaga pseudoflava, Bradyrhizobium japonicum, Ralstonia eutropha, Alcaligenes eutrophus, Alcaligenes facilis, Alcaligenes hydrogenophilus, Alcaligenes latus, Alcaligenes paradoxus, Alcaligenes ruhletii, Amycolatasp.,Aquaspirillum autotrophicum,Arthrobacterstrain 11/X,Azospirillum lipoferum, Variovouax paradoxus,Acidovouax facilis,Hydrogeno bacillus schlegelii, Bacillus tusciae, Calderobacterium hydrogenophilum, Derxia gummosa, Flavobacterium autautresmophilum, Microcyclus aquaticus, Mycobacterium goudoniae, Paracoccus denitrificans, Persephonella marina, Persephonella guaymasensis, Renobacter vacuolatum, Thermocrinis ruber, Wautersiasp.,Anabaena oscillarioides, Anabaena spiroides et Anabaena cylindrica.

Les termes «bactérie recombinante» et «bactérie génétiquement modifiée» sont utilisés ici de manière interchangeable et désignent des bactéries qui ont été génétiquement modifiées pour exprimer ou pour surexprimer des séquences nucléotidiques endogènes, pour exprimer des séquences nucléotidiques hétérologues (exogènes), ou qui ont une altération de l'expression d'un gène endogène. Par «altération», on entend que l'expression du gène, ou niveau d'une molécule d'ARN ou molécules d'ARN équivalentes codant pour un ou plusieurs polypeptides ou sous-unités polypeptidiques, ou l'activité d'un ou plusieurs polypeptides ou sous-unités polypeptidiques est régulée, de sorte que l'expression, le niveau ou l'activité soit supérieur ou inférieur à celui observé en l'absence de cette modification. Il est entendu que les termes «bactérie recombinante» et «bactérie génétiquement modifiée» se réfèrent non seulement à la bactérie recombinante particulière, mais également à la descendance ou à la descendance potentielle d'une telle bactérie. Certaines modifications pouvant se produire dans les générations suivantes, du fait d'une mutation ou d'influences environnementales, cette progéniture peut ne pas être identique à la cellule mère, mais elle est encore comprise dans le cadre du terme tel qu'utilisé ici.

Selon l’invention, on entend par «surexpression d’un gène» le fait que ledit gène est plus exprimé dans la bactérie considérée que dans une bactérie non génétiquement modifiée pour surexprimer ledit gène, conduisant à une production ou une production plus importante de la protéine correspondante (et plus particulièrement de la lactate déshydrogénase) et notamment à une augmentation supérieure à 20%, plus préférentiellement 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. Selon l’invention, une telle surexpression s’entend de l’expression d’une lactate déshydrogénase endogène, qui n’est pas ou peu exprimée dans la bactérie non génétiquement modifiée, ou de l’expression d’une lactate déshydrogénase exogène.

Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie est sélectionnée parmi les bactéries oxydant naturellement l’hydrogène possédant une lactate déshydrogénase endogène.

Avantageusement, la bactérie est sélectionnée parmiCupriavidussp., telle queCupriavidus necator,Hydrogenobactersp., telle queHydrogenobacter thermophilus,Rhodococcussp., telle queRhodococcus opacus, etPseudomonassp., telle quePseudomonas hydrogenothermophila.

Les termes "endogène" ou "natif" désignent un gène qui est normalement ou naturellement présent dans le génome de la bactérie considérée. A l’inverse, les termes «exogène» ou « hétérologue » tels qu'utilisés ici en référence à un gène (séquence nucléotidique) désignent un gène qui n’est pas normalement ou naturellement présent dans le génome de la bactérie considérée.

Dans le cas d’une bactérie possédant une lactate déshydrogénase endogène, il est possible de modifier génétiquement ladite bactérie, de manière à permettre une surexpression dudit gène. Notamment, il est possible de modifier la bactérie pour que au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase endogène soit sous le contrôle d’un promoteur permettant une telle surexpression. Un promoteur désigne la séquence à l'extrémité 5 'du gène structural considéré et qui dirige l'initiation de la transcription. D’une manière générale, selon l’invention, les promoteurs utilisables incluent des promoteurs constitutifs, à savoir des promoteurs qui sont actifs dans la plupart des états cellulaires et des conditions environnementales, ainsi que des promoteurs inductibles qui sont activés ou réprimés par des stimuli physiques ou chimiques exogènes, et qui induisent donc un niveau d’expression variable en fonction de la présence ou de l’absence de ces stimuli. De manière alternative ou complémentaire, il est possible de modifier génétiquement le promoteur endogène, par exemple pour lever de potentielles inhibitions de son induction. Il est également possible de surexprimer une lactate déshydrogénase endogène en multipliant le nombre de copies du gène dans le génome de la bactérie, par le biais de plasmides et/ou en introduisant des séquences nucléotidiques à d’autres loci sur le ou les chromosomes de la bactérie, etc.

Dans un mode de réalisation, la bactérie selon l’invention est génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase endogène. Avantageusement, la bactérie est génétiquement modifiée pour surexprimer seulement la L-lactate déshydrogénase endogène ou seulement la D-lactate déshydrogénase endogène.

Les tableaux 1 et 2 ci-dessous répertorient, à titre d’exemples, des séquences codant pour des L-lactate déshydrogénase (Tableau 1 : Exemples de L-lactate déshydrogénase (EC 1.1.1.27)) et des D-lactate déshydrogénase (Tableau 2 : Exemples de D-lactate déshydrogénase (EC 1.1.1.28)) de différentes bactéries, ainsi que les séquences protéiques correspondantes. Selon l’invention, ces séquences peuvent être la cible de modifications génétiques, y compris de multiplication, pour conduire à une bactérie génétiquement modifiée apte à produire du lactate à partir de CO₂.- un polyhydrogénosiloxane II de formule X(R)₂SiO-((R)₂SiO)_m-(RXSiO)_n-Si(R)₂X avec R tel que défini ci-dessus et X correspondant à H ou R,

Microorganisme	Gène	GenBank	Séquence protéique
Cupriavidus necatorH16	Ldh	CAJ91814.1	SEQ ID N°1
Pediococcus acidilactici	ldhA	1082254718	SEQ ID N°2
Streptococcus equinus (Streptococcus bovis)	Ldh	KFN85486.1	SEQ ID N°3
Bacillus coagulans	Ldh	AGU00860.1	SEQ ID N°4
Lactobacillus casei	Ldh	CAQ65818.1	SEQ ID N°5
Lactobacillus helveticus	Ldh	ABX26516.1	SEQ ID N°6
Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus	Ldh	KRN37463.1	SEQ ID N°7
Lactobacillus plantarum	Ldh	EFK28653.1	SEQ ID N°8
Lactobacillus pentosus	Ldh	EIW14906.1	SEQ ID N°9
Lactococcus lactissubsp.lactis	Ldh	BAL51029.1	SEQ ID N°10

Microorganisme	Gène	GenBank	Séquence protéique
Cupriavidus necatorH16	ldhA1	CAJ92810.1	SEQ ID N°11
Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus	ldhA	CAI96942.1	SEQ ID N°12
Escherichia colistr. K-12 substr. MG1655	ldhA	16129341	SEQ ID N°13
Bacillus coagulans	ldhA	ADV02473.1	SEQ ID N°14

Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie est une bactérieCupriavidus necator, génétiquement modifiée au niveau du promoteur associé au(x) gène(s) codant pour la L-lactate déshydrogénase endogène et/ou la D-lactate déshydrogénase endogène, afin de favoriser l’expression de l’un et/ou de l’autre gène. En effet, les inventeurs ont découvert queCupriavidus necatorpossède des gènes codant une L-lactate déshydrogénase (ldh) et une D-lactate déshydrogénase (ldhA1) endogènes, dont l’expression dépend des conditions de culture et qui est généralement quasiment nulle en limitation de nutriments. Selon l’invention, cette bactérie peut avantageusement être génétiquement modifiée au niveau de la séquence nucléotidique codant pour ledit promoteur, afin de lever cette régulation négative et permettre l’expression des gènes correspondants, même en limitation de nutriments. Il est notamment possible de modifierCupriavidus necatorde manière à associer la ou les séquences codant pour la L-lactate déshydrogénase et/ou la D-lactate déshydrogénase endogènes à un promoteur constitutif ou à un promoteur inductible.

Dans un mode de réalisation, les gènes codant pour la L-lactate déshydrogénase et/ou à la D-lactate déshydrogénase endogènes sont modifiés de manière à être sous contrôle d’un promoteur recombinant constitutif (non soumis à une régulation négative) ou inductible en présence d’une molécule particulière. A titre d’exemple, il est possible d’utiliser des promoteurs constitutifs tels que pLac, pTAC, pJ5 (Gruberet al., 2014), un promoteur inductible tel que le promoteur pBAD, inductible à l’arabinose (Grousseauet al., 2014), le promoteur pPHAP inductible en limitation phosphate (Barnardet al.2015), le promoteur pCBBL inductible en conditions autotrophes (Lütteet al., 2012) ou le promoteur pKRrha inductible au rhamnose (Sydowet al., 2017).

Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie selon l’invention est génétiquement modifiée pour surexprimer un gène codant pour l’expression d’une protéine présentant au moins 50% d’homologie avec SEQ ID N°1 (séquence de la L-lactate déshydrogénase deCupriavidus necatorH16), préférentiellement au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%. Dans un autre mode de réalisation, la bactérie selon l’invention est génétiquement modifiée pour surexprimer un gène codant pour l’expression d’une protéine présentant au moins 50% d’homologie avec SEQ ID N°11 (séquence d’une D-lactate déshydrogénase deCupriavidus necatorH16), préférentiellement au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%.

De manière alternative ou cumulative, la bactérie peut être génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une lactate déshydrogénase exogène, ou hétérologue.

Selon l’invention, le génome de la bactérie est alors modifié de manière à intégrer une séquence nucléique codant pour une telle lactate déshydrogénase exogène. Ladite séquence nucléique peut avoir été introduite dans le génome de la bactérie ou d’un de ses ascendants, par le biais de toute méthode de clonage moléculaire adaptée. Dans le contexte de l’invention, le génome de la bactérie s’entend de l’ensemble du matériel génétique contenu dans ladite bactérie, y compris le matériel génétique extrachromosomique contenu par exemple dans des plasmides, épisomes, chromosomes synthétiques, etc. La séquence nucléique introduite peut être une séquence hétérologue, c’est-à-dire qui n’existe pas à l’état naturel dans ladite bactérie, ou une séquence homologue. Avantageusement, on introduit dans le génome de la bactérie une unité transcriptionnelle comportant la séquence nucléique d’intérêt, placée sous le contrôle d’un ou plusieurs promoteur(s) et d’un ou plusieurs sites de liaison au ribosome. Une telle unité transcriptionnelle comprend également, avantageusement, les séquences usuelles telles que des terminateurs transcriptionnels, et le cas échéant d’autres éléments de régulation de la transcription.

Un gène codant pour une lactate déshydrogénase exogène peut par exemple être dérivé d’une bactérie, d’un champignon, d’une levure ou d’un mammifère. Préférentiellement, un tel gène est dérivé d’une bactérie et notamment deE. coli, Bacillus coagulans, Pediococcus acidilactici, Streptococcus bovis(Streptococcus equinus), d’une bactérie lactique, et notamment deLactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bulgaricus,Lactobacillus delbrueckii,Lactobacillus plantarum ou Lactobacillus pentosus, Lactococcus lactissubsp.lactis. Les gènes listés dans les tableaux 1 et 2 peuvent également être utilisés pour modifier génétiquement une bactérie selon l’invention.

Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l’invention présente au moins 50% d’homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase dePediococcus acidilactici(SEQ ID N°2), préférentiellement au moins 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.

Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l’invention présente au moins 50% d’homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase deStreptococcus equinus (Streptococcus bovis)(SEQ ID N°3), préférentiellement au moins 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.

Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l’invention présente au moins 50% d’homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase deBacillus coagulans(SEQ ID N°4), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.

Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l’invention présente au moins 50% d’homologie avec la séquence de la L-lactate déshydrogénase deLactobacillus casei(SEQ ID N°5), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.

Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l’invention présente au moins 50% d’homologie avec la séquence de la D-lactate déshydrogénase deLactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus(SEQ ID N°12), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.

Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l’invention présente au moins 50% d’homologie avec la séquence de la D-lactate déshydrogénase deEscherichia coli(SEQ ID N°13), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.

Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la lactate déshydrogénase hétérologue utilisée pour modifier génétiquement la bactérie selon l’invention présente au moins 50% d’homologie avec la séquence de la D-lactate déshydrogénaseBacillus coagulans(SEQ ID N°14), préférentiellement au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%.

Dans un mode de réalisation, la bactérie est génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une L-lactate déshydrogénase (endogène ou hétérologue), de manière à pouvoir produire du L-lactate. Dans le cas d’une bactérie possédant un gène codant pour une D-lactate déshydrogénase endogène, l’expression dudit gène est avantageusement au moins partiellement inhibée, de manière à favoriser la production de L-lactate seulement.

De manière alternative, la bactérie peut être génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant pour une D-lactate déshydrogénase (endogène ou hétérologue) de manière à pouvoir produire du D-lactate. Dans le cas d’une bactérie possédant un gène codant pour une L-lactate déshydrogénase endogène, l’expression dudit gène est avantageusement au moins partiellement inhibée, de manière à favoriser la production de D-lactate seulement.

Selon l’invention, on entend par «inhibition de l’expression d’un gène» le fait que ledit gène n’est plus exprimé dans la bactérie considérée ou que son expression est réduite, comparativement à la bactérie sauvage (non génétiquement modifiée pour inhiber l’expression du gène), conduisant à l’absence de production de la protéine correspondante ou à une baisse significative de sa production, et notamment à une baisse supérieure à 20%, plus préférentiellement 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. Dans un mode de réalisation, l’inhibition peut être totale, c’est-à-dire que la protéine codée par ledit gène n’est plus du tout produite. L’inhibition de l’expression d’un gène peut notamment être obtenue par délétion, mutation, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides dans le gène considéré. Préférentiellement, l’inhibition de l’expression du gène est obtenue par délétion totale de la séquence nucléotidique. Selon l’invention, toute méthode d’inhibition d’un gène, connue en soi par l’homme de l’art et applicable à une bactérie peut être utilisée. Par exemple, l’inhibition de l’expression d’un gène peut être obtenue par recombinaison homologue (Datsenkoet al.,2000; Lodishet al.,2000) ; mutagénèse aléatoire ou dirigée pour modifier l’expression d’un gène et/ou l’activité de la protéine encodée (Thomaset al.,1987) ; modification d’une séquence promotrice du gène pour altérer son expression (Kaufmannet al.,2011) ; ciblage induit des lésions locales dans les génomes (TILLING) ; conjugaison, etc. Une autre approche particulière est l'inactivation génique par insertion d'une séquence étrangère, par exemple par mutagenèse de transposon en utilisant des éléments génétiques mobiles, d'origine naturelle ou artificielle ou par exemple par insertion d’une cassette antibiotique. Selon un autre mode de réalisation préféré, l’inhibition de l’expression du gène est obtenue par des techniques knock-out. L’inhibition de l’expression du gène peut également être obtenue par extinction du gène en utilisant des ARN interférents, ribozymes ou antisens (Daneholt, 2006. Nobel Prize in Physiology or Medicine). Dans le contexte de la présente invention, le terme "ARN interférent" ou "ARNi" désigne toute molécule d'ARNi (par exemple ARN monocaténaire ou ARN bicaténaire) qui peut bloquer l'expression d’un gène cible et/ou faciliter la dégradation de l'ARNm correspondants. L’inhibition du gène peut également être obtenue par des méthodes d’édition génomique qui permettent de directement apporter des modifications génétiques à un génome donné, via l’utilisation de nucléases à doigts de zinc (Kimet al.,1996), de nucléases effectrices de type activateur de transcription, dites « TALEN » (Ousteroutet al.2016), d’un système combinant des nucléases de type Cas9 avec des courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées dites ‘CRISPR’ (Maliet al.,2013), ou encore de méganucléases (Daboussiet al.,2012). L’inhibition de l’expression du gène peut également être obtenue par inactivation de la protéine codée par ledit gène. L’inhibition de l’expression du gène peut également être obtenue par délétion, mutation, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides dans le promoteur en amont du gène considéré. L’inhibition de l’expression du gène peut également être obtenue par délétion, mutation, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides dans le site de liaison au ribosome en amont du gène considéré.

En travaillant sur les modifications à apporter à une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène génétiquement modifiée pour lui permettre de produire du lactate à partir de CO₂, les inventeurs ont mis en évidence dans ces bactéries des gènes (lutA, lutB ou lutC) codant pour les composants d’un complexe enzymatique utilisant le lactate dont l’inhibition permet de réduire de manière substantielle voire de supprimer totalement la re-consommation du lactate produit. Ces gènes sont réunis sur un opéron appelé lut.

L’opéron lut jusqu’alors inconnu chez les bactéries oxydant naturellement l’hydrogène réunit des gènes qui ont moins de 50% d’identité avec les gènes de l’opéron lut deB. subtilis(Chaiet al., 2009) connu pour permettre la croissance de cette bactérie sur le L-lactate comme source de carbone. PourCupriavidus necator, les gènes réunis dans l’opéron lut ont moins de 44% d’identité avec ceux deB. subtilis. PourRhodococcus opacusles gènes réunis dans l’opéron lut ont moins de 40% d’identité avec ceux deB. subtilis. Pour Rhodococcus jostiiles gènes réunis dans l’opéron lut ont moins de 40% d’identité avec ceux deB. subtilis. Pour Helicobacter pylori ,les gènes réunis dans l’opéron lut ont moins de 37% d’identité avec ceux deB. subtilis. Pour Bacillus tusciae ,les gènes réunis dans l’opéron lut ont moins de 55% d’identité avec ceux deB. subtilis.PourPseudomonas putida,les gènes réunis dans l’opéron lut ont moins de 43% d’identité avec ceux deB. subtilis.PourCupriavidus metallidurans ,les gènes réunis dans l’opéron lut ont moins de 42% d’identité avec ceux deB. subtilis.PourParacoccus denitrificans ,les gènes réunis dans l’opéron lut ont moins de 42% d’identité avec ceux deB. subtilis.

Le Tableau 3 ci-après identifie les gènes codant pour des protéines utilisant le lactate réunis dans plusieurs bactéries oxydant naturellement l’hydrogène.

Microorganisme	Gène	GenBank	Séquence protéique
Cupriavidus necatorH16	lutA	WP_011615044.1	SEQ ID N°15
Cupriavidus necatorH16	lutB	WP_011615043.1	SEQ ID N°16
Cupriavidus necatorH16	lutC	WP_011615045.1	SEQ ID N°17
Cupriavidus necatorH16	lutA	WP_011616347.1	SEQ ID N°18
Cupriavidus necatorH16	lutB	WP_010814062.1	SEQ ID N°19
Cupriavidus necatorH16	lutC	WP_010814659.1	SEQ ID N°20
Rhodococcus opacus	lutA	ANS31563.1	SEQ ID N°21
Rhodococcus opacus	lutB	WP_105418126.1	SEQ ID N°22
Rhodococcus opacus	lutC	RKM74017.1	SEQ ID N°23
Rhodococcus jostii	lutA	WP_073359632.1	SEQ ID N°24
Rhodococcus jostii	lutB	WP_073359631.1	SEQ ID N°25
Rhodococcus jostii	lutC	WP_073359630.1	SEQ ID N°26
Helicobacter pylori	lutA	WP_000867265.1	SEQ ID N°27
Helicobacter pylori	lutB	WP_033777014.1	SEQ ID N°28
Helicobacter pylori	lutC	WP_096411967.1	SEQ ID N°29
Bacillus tusciae	lutA	WP_013076354.1	SEQ ID N°30
Bacillus tusciae	lutB	WP_013076353.1	SEQ ID N°31
Bacillus tusciae	lutC	WP_013076352.1	SEQ ID N°32
Pseudomonas putida	lutA	WP_110966271.1	SEQ ID N°33
Pseudomonas putida	lutB	WP_077182418.1	SEQ ID N°34
Pseudomonas putida	lutC	WP_077182417.1	SEQ ID N°35
Cupriavidus metallidurans	lutA	WP_029308115.1	SEQ ID N°36
Cupriavidus metallidurans	lutB	WP_011518104.	SEQ ID N°37
Cupriavidus metallidurans	lutC	WP_035836231.1	SEQ ID N°38
Paracoccus denitrificans	lutA	WP_011749200.1	SEQ ID N°39
Paracoccus denitrificans	lutB	WP_011749199.1	SEQ ID N°40
Paracoccus denitrificans	lutC	WP_011749198.1	SEQ ID N°41

L’homme du métier saura identifier les gènes codant pour des protéines utilisant le lactate réunis dans des opérons lut dans d’autres espèces de bactéries oxydant naturellement l’hydrogène à partir des informations contenues dans la présente demande.

Dans la bactérie oxydant naturellement l’hydrogène et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO₂selon l’invention, inhiber l’expression de l’opéron lut comprend l’inhibition de l’expression d’au moins l’un des gènes lutA, lutB ou lutC, de préférence d’au moins deux gènes parmi les trois, plus préférentiellement l’inhibition de l’expression des trois gènes lutA, lutB et lutC.

De manière préférée, l’inhibition de l’expression d’un gène de l’opéron lut consiste en la délétion partielle ou totale de la séquence codant pour le dit gène. L’inhibition de l’expression de l’opéron lut consiste de préférence en une délétion dudit opéron lut.

Dans certaines bactéries oxydant naturellement l’hydrogène commeCupriavidus necatoron trouve plusieurs opérons lut. DansCupriavidus necator, le premier opéron lut réunissant les gènes SEQ ID N°15, SEQ ID N°16 et SEQ ID N°17, est nommé lut1. DansCupriavidus necator, le deuxième opéron lut réunissant les gènes SEQ ID N°18, SEQ ID N°19 et SEQ ID N°20, est nommé lut2. Selon un premier mode de réalisation de l’invention, dans les bactéries qui contiennent deux opérons lut ou plus, au moins l’un des gènes lutA, lutB ou lutC de l’un des opérons lut est inhibé. Selon un autre mode de réalisation de l’invention, au moins l’un des gènes lutA, lutB ou lutC d’au moins deux des opérons lut est inhibée. Avantageusement, l’expression d’au moins l’un des gènes lutA, lutB ou lutC de chacun des opérons lut est inhibée.

Selon un autre mode de réalisation de l’invention, l’expression d’au moins l’un des opérons lut est inhibé. Selon un mode préféré de réalisation de l’invention, l’expression d’au moins deux des opérons lut est inhibée. Avantageusement l’expression de chacun des opérons lut est inhibée. C’est en particulier le cas pourCupriavidus necatorqui comprend deux opérons lut1 et lut2 et où de préférence l’expression des deux opérons lut1 et lut2 est inhibée.

En plus des modifications décrites plus haut, en travaillant sur les modifications génétiques à apporter à une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène pour lui permettre de produire du lactate à partir de CO₂, les inventeurs ont mis en évidence que, dans certaines bactéries, il est possible d’inhiber au moins partiellement une voie de dégradation du pyruvate compétitrice de la voie de synthèse du lactate, de manière à favoriser la production de lactate à partir dudit pyruvate.

En effet, certaines bactéries oxydant naturellement l’hydrogène et susceptible d’être modifiées génétiquement selon l’invention, présentent une voie de synthèse du Polyhydroxybutyrate (PHB) à partir du pyruvate. C’est le cas notamment deCupriavidus necator(figure 2). Une telle voie de biosynthèse peut entrer en compétition avec la voie de synthèse du lactate, en forçant la consommation du pyruvate dans cette voie. Aussi, dans un mode de réalisation, une telle bactérie est génétiquement modifiée pour inhiber au moins partiellement la voie de synthèse du PHB (figure 3). Plus particulièrement, il est possible d’inhiber au moins partiellement l’expression d’au moins un gène choisi parmi les gènes codant pour l’Acétyl-CoA acetyltransférase (EC : 2.3.1.9), l’Acetoacétyl-CoA réductase (EC : 1.1.1.36) et la poly(3-hydroxybutyrate) synthase (EC : 2.3.1.-), préférentiellement l’expression d’au moins deux desdits gènes, plus préférentiellement l’expression desdits trois gènes.

Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie génétiquement modifiée estCupriavidus necator, dans laquelle l’expression d’au moins un et préférentiellement des trois gènes parmi les gènes codant pour une phaA (GenBank: CAJ91322.1), une phaB (GenBank: CAJ92574.1) et une phaC (GenBank: CAJ92572.1) est inhibée (figure 2). Les inventeurs ont découvert qu’une telle bactérie également génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase est capable de produire des quantités importantes de lactate en présence de CO₂comme seule source de carbone, le pyruvate produit n’étant pas ou peu consommé par la voie de production du PHB.

De manière alternative ou complémentaire, il est possible de modifier génétiquement la bactérie de manière à inhiber au moins partiellement l’expression d’un gène codant pour une phosphoenolpyruvate synthase (EC : 2.7.9.2), qui convertit le pyruvate en phosphoenol pyruvate (PEP), et/ou une pyruvate carboxylase (EC : 6.4.1.1) et/ou un complexe pyruvate dehydrogenase (EC : 1.2.4.1) et/ou une fumarate reductase (EC : 1.3.5.4).

Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie génétiquement modifiée estCupriavidus necator, dans laquelle l’expression d’au moins un gène parmi les gènes codant pour une ppsa (GenBank: CAJ93138.1), une pyc (GenBank: CAJ92391.1), une pdhA (GenBank: CAJ92510.1) et une sdhABCD (GenBank: CAJ93711.1, CAJ93712.1, CAJ93713.1, CAJ93714.1) est inhibée (figure 2). Les inventeurs ont découvert qu’une telle bactérie également génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase est capable de produire des quantités importantes de lactate en présence de CO₂comme seule source de carbone, le pyruvate produit n’étant pas ou peu consommé par ces voies compétitrices.

De manière alternative ou complémentaire, il est possible de modifier génétiquement la bactérie de manière à inhiber au moins partiellement la voie de conversion de l’Acetyl-CoA en acétate et/ou en Acétaldéhyde. Pour cela, il est possible d’inhiber au moins partiellement l’expression d’au moins un gène choisi parmi les gènes codant pour une acetyl-CoA hydrolase (EC : 3.1.2.1), une phosphate acétyltransférase (EC : 2.3.1.8), une Acétate kinase (EC : 2.7.2.1), une propionate CoA-transferase (EC : 2.8.3.1), une succinyl-CoA: acetate CoA-transferase (EC :2.8.3.18) et une Acétaldéhyde déhydrogénase (EC : 1.2.1.10).

Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie génétiquement modifiée estCupriavidus necator, dans laquelle l’expression d’au moins un gène parmi les gènes codant pour une Acetyl-CoA hydrolase (GenBank: CAJ96157.1), une Phosphate acétyltransférase (pta1, pta2) (GenBank: CAJ96416.1, GenBank: CAJ96653.1), une Acétate kinase (ackA, ackA2) (GenBank: CAJ91818.1, GenBank: CAJ96415.1), une Propionate CoA-transferase (GenBank: CAJ93797.1), une Succinyl-CoA :acetate CoA-transferase (GenBank: CAJ92496.1) et une Acétaldéhyde déhydrogénase (mhpf) (GenBank: CAJ92911.1) est inhibée (figure 2). Les inventeurs ont découvert qu’une telle bactérie également génétiquement modifiée pour surexprimer une lactate déshydrogénase et inhiber l’expression d’au moins un gène de l’opéron lut est capable de produire des quantités importantes de lactate en présence de CO₂comme seule source de carbone, le pyruvate produit n’étant pas ou peu consommé par ces voies compétitrices.

Dans certains cas, les bactéries oxydant naturellement l’hydrogène possèdent un ou des gènes codant pour une Lactate ferricytochrome C reductase. C’est le cas notamment deCupriavidus necatorqui possèdent trois gènes lldD (EC : 1.1.2.3, GenBank: CAJ95257.1), lldA (EC : 1.1.2.3, GenBank: CAJ96599.1), dld (EC :1.1.2.4, GenBank: CAJ94166.1) codant pour une telle Lactate ferricytochrome C reductase. Une telle enzyme est également susceptible de diminuer le taux de lactate produit, en convertissant ledit lactate en pyruvate. Aussi, selon l’invention, dans le cas où la bactérie possède une telle Lactate ferricytochrome C reductase endogène, le gène codant pour ladite enzyme est avantageusement au moins partiellement inhibé.

L’invention propose avantageusement d’utiliser une bactérie génétiquement modifiée selon l’invention pour produire du lactate à partir de CO₂. Avantageusement, une bactérie génétiquement modifiée pour surexprimer une L-lactate déshydrogénase, et le cas échéant inhiber une D-lactate déshydrogénase est utilisée pour produire exclusivement du L-lactate. De manière similaire, une bactérie génétiquement modifiée pour surexprimer une D-lactate déshydrogénase, et le cas échéant inhiber une L-lactate déshydrogénase est utilisée pour produire exclusivement du D-lactate.

L’invention propose plus particulièrement un procédé de production de lactate à partir de CO₂, selon lequel on cultive, par exemple en batch, fed-batch ou en culture continue, une bactérie génétiquement modifiée selon l’invention en présence de CO₂et on récupère le lactate produit.

Dans un mode de mise en œuvre du procédé, une solution de base est ajoutée pendant la fermentation pour contrôler le pH. L'acide lactique se trouve alors dans le milieu de fermentation sous forme de sel (lactate de sodium, lactate de potassium, lactate de calcium ou lactate d'ammonium, seuls ou en mélange, en fonction de la base choisie pour réguler le pH du milieu de fermentation).

Le bouillon de fermentation contenant les bactéries, les impuretés du milieu de fermentation (protéines non consommées et sels inorganiques de natures diverses) et le sel de lactate, est alors traité afin de les séparer. Une telle étape de séparation peut notamment être mise en œuvre en utilisant un séparateur de cellules tel qu’une centrifugeuse, un dispositif de microfiltration ou d'ultrafiltration. Après séparation, on obtient d’une part une biomasse cellulaire concentrée et d’autre part une solution de sel de lactate.

Il est ensuite possible de procéder à une étape de conversion des sels de lactate en acide lactique sous forme libre. Cette étape de récupération de l'acide lactique à partir du milieu de fermentation peut notamment être réalisée via l'extraction de l'acide lactique en tant que tel du milieu de fermentation, ou par acidification du milieu à l'acide sulfurique.

Une étape de purification par extraction, estérification, distillation ou hydrolyse peut ensuite être réalisée, afin d’obtenir un acide lactique à haut degré de pureté.

Selon l’invention, la source de CO₂peut être du CO₂pur ou du CO₂issu d’émissions des usines ayant des procédés industriels tels que les raffineries de pétrole, les cimenteries, les productions d’ammoniaque, les productions de méthanol, etc. Le CO₂peut également être un produit de fermentation, un gaz enrichi en CO₂, un gaz CO₂au moins partiellement purifié, une solution de carbonate ou de bicarbonate, et / ou l'acide formique. La teneur du gaz total en CO₂peut être de 10% à 100%. Un tel gaz contenant du CO₂peut être injecté directement ouviaune étape intermédiaire de capture ou purification du CO₂. La purification du CO₂peut être réalisée par traitement chimique, par exemple en présence d’amines, ou par traitement enzymatique mettant par exemple en œuvre une anhydrase carbonique.

Selon l’invention, la source l’hydrogène peut être un produit du vaporeformage du méthane, de l'électrolyse de l’eau ou être un co-produit (hydrogène « fatal ») des procédés industriels tels que le procédé chlore-alcali lors de la préparation du dichlore ou l’incinération des déchets.

Selon l’invention, il est possible de prévoir éventuellement une étape de croissance de la bactérie en amont, en présence notamment de sucres fermentescibles, tels que du glucose du fructose ou du glycérol. Il est également possible de cultiver la bactérie en présence de CO₂et d’une autre source de carbone lors de l’étape de production de lactate.

EXEMPLES.

Exemple 1 - souche productrice de lactate CN0001

Souche et constructions génétiques.Pour la production de lactate, une soucheCupriavidus necatorH16 PHB-4 (DSM n°541) est utilisée. Cette souche ne forme pas de poly-β-hydroxy-butyrate (PHB). La construction de la souche productrice de lactate CN0001 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant la L-lactate déhydrogénase deCupriavidus necator(ldh, EC:1.1.1.27) sous promoteur inductible à l’arabinose est cloné en une étape in vitro via le protocole d’assemblage In-Fusion® (Clontech). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

Le gène ldh est amplifié par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 PHB-4 à l’aide des oligonucléotides 1 (5’ GGATCCAAAC TCGAGTAAGG ATCTCC 3’) et 2 (5’ ATGTATATCT CCTTCTTAAA AGATCTTTTG AATTCC 3’) et de l’enzyme Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer (New England Biolabs, Evry, France). Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Le plasmide squelette pJM3 (Mülleret al., 2013) dérivé du plasmide pBBR1-MCS2 (Kovach et al, 1995), contenant un promoteur pBAD deEscherichia coli, est amplifié à l’aide des oligonucléotides 3 (5’ GAAGGAGATA TACATATGAA GATCTCCCTC ACCAGCG 3’) et 4 (5’ CTCGAGTTTG GATCCTCAGG CCGTGGGGAC GGC 3’) et de l’enzyme Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix (New England Biolabs, Evry, France).Le produit de PCR est digéré par l’enzyme DpnI (New England Biolabs, Evry, France) : 1µl de DpnI est ajouté à 50µL de produit PCR, puis incubé 15-60min à 37°C, l’enzyme est ensuite inactivée 10min à 80°C. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblage in vitro par In-fusion est réalisé avec les deux fragments afin d’obtenir le plasmide pJM3-ldh. 5µl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellulesEscherichia coliStellar (Clontech) chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5g/L, NaCl 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 25µg/mL de kanamycine. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), l’insertion correcte du gène ldh est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 5 (5’ GACGCTTTTT ATCGCAACTC TCTACTG 3’) et 6 (5’ CGAACGCCCT AGGTATAAAC GCAG 3’).

Le plasmide pBBAD-ldh est inséré dans la soucheCupriavidus necatorH16 PHB-4 par électroporation (protocole adapté de Taghaviet al., 1994). Des cellulesCupriavidus necatorsont mises en culture en milieu TSB contenant 27.5 g/L de bouillon de soja tryptique (TSB, Becton Dickinson, Sparks, Maryland, USA, 3ml dans des tubes 10ml) et incubées une nuit à 30°C sous agitation vigoureuse. Le lendemain, 1ml de la culture est transféré dans un erlenmeyer de 250mL contenant 25mL de milieu TSB et incubé à 30°C, 200 rpm jusqu’à atteindre une DO_600nmde 0,5-0,6. Les cellules sont alors récoltées et lavées deux fois avec 25mL de tampon de lavage froid (10%glycerol, 90% eau [vol/vol]). Les cellules rendues par ce procédé électro-compétentes sont ensuite concentrées dans la solution de lavage afin d’obtenir une DO_600nmde 50 et aliquotées par 150 µL.

Un aliquot de cellules compétentes est transformée avec 2-5 µL d’ADN plasmidique (100-150ng/µl). Le mélange ADN/cellules contenu dans un tube 1.5 mL est agité par de légers tapotements (4-5 fois). Le mélange est placé 5 min sur la glace et transféré dans une cuvette d’électroporation froide (0.2 cm, 10573463, Fisher scientific, Illkirch). L’électroporation est réalisée avec les réglages suivants : voltage 2.5 kV, capacité 25 µF, résistance externe 200 Ω. Immédiatement après l’électroporation les cellules sont mélangées avec 1mL de milieu SOC (tryptone 2 %, extrait de levure 0,5 %, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl₂10 mM, MgSO₄10 mM et glucose 20 mM), incubées 2h à 30°C puis étalées sur des boites de pétri maintenue à 30°C contenant du milieu TSB/Agar (20g/L) additionné de 10 µg/mL de gentamycine et 200 µg/mL de kanamycine).

La soucheCupriavidus necatorH16 PHB-4 pJM3-ldh est récupérée et nommée CN0001. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.

MilieuxPour les précultures, le milieu minimum A utilisé contient : NaH2PO4, 4,0 g/L ; Na₂HPO₄, 4,6 g/L ; K₂SO₄, 0,45 g/L ; MgSO₄0,39 g/L, CaCl₂, 0,062 g/L ; NH₄Cl 0.05 % (w/v), trace d’éléments, 1ml/L (FeSO₄·7H₂O, 15 g/L ; MnSO₄·H₂O, 2,4 g/L ; ZnSO₄·7H₂O, 2.4 g/L ; CuSO₄·5H2O, 0,48 g/L dans HCl 0,1M).

Pour les cultures en bioréacteurs le milieu minimum B utilisé contient par litre : MgSO₄,7H₂O, 0,75 g; phosphate (Na₂HPO₄,12H₂O, 1,5g; KH₂PO₄, 0,25 g); acide nitrilotriacetique, 0,285g; citrate d’ammonium de fer(III), 0,9 g; CaCl₂, 0,015 g; trace d’éléments (H₃BO₃, 0,45 mg; CoCl₂,6H₂O, 0,3 mg; ZnSO₄,7H₂O, 0,15 mg; MnCl₂,4H₂O, 0,045 mg; Na₂MoO₄,2H₂O, 0,045 mg; NiCl₂,6H₂O, 0,03 mg; CuSO₄, 0,015 mg); kanamycin, 0,1 g.

PréculturesUne colonie isolée de la souche CN0001 est utilisée pour ensemencer la première culture qui est cultivée pendant 24 h avec 10 mL de TSB contenant 10 µg/mL de gentamycine et 200 µg/mL de kanamycine, dans un erlenmeyer baflé de 100 mL. Deux autres étapes de propagation sont menées pendant 12 h chacune (25 mL et 300 mL de milieu minimum A, respectivement dans des flacons Erlenmeyer de 250 mL et 3 L). Chaque culture est cultivée à 30 °C et agitée à 100 tours par minute dans un incubateur. Cette préculture est utilisée pour inoculer l’étape de culture en bioréacteurs.

Culture en bioréacteursLa culture de la souche CN0001 en fed-batch est réalisée en trois phases. La première phase consiste en une phase de croissance contrôlée sur fructose pour atteindre 0,9 g/L de biomasse à un taux de croissance spécifique de 0,16 h^-1. Après la consommation du fructose, la deuxième phase est réalisée pour permettre l'adaptation du métabolisme cellulaire aux substrats gazeux. Il est démarré en par un flux de 0,22 L/min d’un mélange commercial H₂/O₂/CO₂/N₂(% molaire: 60:2:10:28, Air Liquide, Paris, France). La troisième phase consiste en une croissance limitée en azote sur des substrats gazeux couplée à la production de lactate. Cette phase est initiée par l’ajout de 1 g/L de L-arabinose pour induire l'expression de la lactate déshydrogénase. L'azote est alimenté à partir d'une solution de 56 g/L de NH₃, pour contrôler un taux de croissance spécifique résiduel de 0,02 h^-1. Cette culture est menée dans des bioréacteurs de 1,4 L BDCU B.Braun. La température est régulée à 30 °C et le pH à 7,0 par l'addition d'une solution de KOH 2,5 M.

Analyse du lactate et des métabolitesAfin de déterminer les concentrations en acides organiques, en particulier celle en lactate, le surnageant de fermentation est analysé par chromatographie HPLC-UV-RI. Le moût de fermentation régulièrement prélevé (1 mL) est d’abord centrifugé pendant 10 min à 10 000 g. Puis, il est filtré sur 0,45 µm (Minicart RC4, Sartorius). Le système HPLC utilisé est un Thermo Scientific UltiMate 3000 HPLC, couplé à un réfractomètre et détecteur UV (210 nm). 10 µL de chaque échantillon est injecté sur une colonne Aminex HPX-87H H+, 300 mm x 7,8 mm (Biorad). L’éluant est une solution aqueuse d’acide sulfurique 4 mM. Le débit est fixé à 0,5 ml/min. La température du four est de 45°C. Une élution isocratique est réalisée. La quantification est réalisée grâce à une gamme étalon appropriée. Si besoin, les échantillons sont dilués.

RésultatLa souche CN0001 produit dans ces conditions de culture de 5 à 100 mg/L de lactate.

Exemple 2 : Construction d’une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène, Cupriavidus necator et génétiquement modifiée pour surexprimer de manière plasmidique une lactate déshydrogénase endogène et pour produire du lactate à partir de CO ₂ (CN0002).

Souche et constructions génétiquesPour la production de lactate, une soucheCupriavidus necatorH16 PHB-4 (DSM n°541) est utilisée. Cette souche ne forme pas de poly-β-hydroxy-butyrate (PHB).

La construction de la souche productrice de lactate CN0002 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant la L-lactate déshydrogénase deCupriavidus necator(ldh, EC:1.1.1.27) sous promoteur inductible à l’arabinose est cloné en une étapein vitrovia le protocole d’assemblage In-Fusion® (Clontech). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

Le gène ldh (GenBank: CAJ91814.1) est amplifié par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 PHB-4 à l’aide des oligonucléotides oligonucléotides 7 (5’ AAGGAGATAT ACATATGAAG ATCTCCCTCA CCAGCG 3’) et 8 (5’ ACTCGAGTTT GGATCCTCAG GCCGTGGGGA CGGC 3’) et de l’enzyme Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer (New England Biolabs, Evry, France). Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Le plasmide squelette pBADTrfp (Biet al., 2013) dérivé du plasmide pBBR1-MCS (Kovachet al., 1995), contenant un promoteur pBAD deEscherichia coli, est digéré par les enzymes de restrictions BamHI-HF et NdeI (New England Biolabs, Evry, France) afin d’éliminer la séquence codant pour la protéine RFP. Le fragment d’ADN de 5247 paires de bases contenant l’origine de réplication pBBR1, le gène de selection (kan) et le promoteur pBAD est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblagein vitropar In-fusion est réalisé avec les deux fragments afin d’obtenir le plasmide pBAD-ldh(cn). 5 µl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellulesEscherichia coliStellar™ (Clontech) chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 25 µg/mL de kanamycine (Gibco™). La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 9 (5’ CGAAGGTGAG CCAGTGTGAC TC 3’) et 10 (5’ CCTGTCGATC CTGCCCAACT AC 3’). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), l’insertion correcte du gène l.ldh est confirmée par séquençage (Eurofins Genomic) avec les oligonucléotides 9 et 11 (5’ CATTGATTAT TTGCACGGCG TCAC 3’).

Le plasmide pBAD-l.ldh(cn) est inséré dans une souche électrocompétenteEscherichia coliS17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).

La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 9 et 10. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 25 µg/mL de kanamycine et incubé une nuit à 37°C.

La conjugaison entre les cellulesEscherichia coliS17-1 et celles de la soucheCupriavidus necatorH16 PHB-4 (DSM n°541) est réalisée comme suit:

Les cellulesCupriavidus necatorsont mises en culture dans 3 mL de milieu TSB contenant 27,5 g/L de bouillon de soja tryptique (TSB, Becton Dickinson, Sparks, Maryland, USA) et incubées 20 h à 30°C sous agitation vigoureuse. Les cellulesEscherichia colisont mises en culture dans 3 mL de milieu LB (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl 5 g/L, Sigma-Aldrich) contenant 25 µg/mL de kanamycine et incubées une nuit à 37°C sous agitation vigoureuse. Le lendemain, la densité optique (DO_600nm) est mesurée pour chaque culture et l’équivalent de 1 DO de cellules sont transférées en tube 1,5 ml et centrifugées (5 minutes, 3000 rpm). Le surnageant est éliminé et les cellules sont lavées dans 1ml de PBS (Sigma-Aldrich). Le lavage est répété une seconde fois. 50 µL de la suspension cellulaireCupriavidus necatoret 50 µL de la suspension cellulaireEscherichia colisont prélevés et mélangés dans un tube 1,5 mL. Ce mélange est déposé sous forme d’une goutte sur un milieu non sélectif LB/Agar contenant 2% de fructose et incubé 6h à 30°C. Les cellules sont ensuite grattées et resuspendues dans 1 ml de PBS. Cette suspension est diluée au 1 :1000ème et 100 µL de cette dilution sont étalés sur milieu sélectif LB/Agar contenant 2% de fructose, 300 µg/mL de kanamycine et 10 µg/mL de gentamycine (Sigma-Aldrich). Les cellules sont mises à incuber 24h à 30°C. Des clones isolés sont prélevés, striés sur le même milieu sélectif et mis à incuber 24h à 30°C. La sélection des clones contenant le plasmide pBAD-ldh(cn) est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 9 et 10.

La soucheCupriavidus necatorH16 PHB-4 pBAD-ldh(cn) est récupérée et nommée CN0002. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.

Exemple 3: Production de lactate à partir de Fructose par culture en Erlenmeyer d’une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène, Cupriavidus necator , génétiquement modifiée (CN0002)

SouchePour la production de lactate, la souche CN0002 (Cupriavidus necatorH16 PHB-4 pBAD -ldh) est utilisée. Dans cette souche, la LDH (lactate déshydrogénase) deC. necatorest surexprimée sur plasmideviaun promoteur inductible à l’arabinose. Cette souche est naturellement résistante à la gentamycine et porte une résistance plasmidique à la kanamycine.

$ MilieuxLe milieu riche était constitué de 27,5% (p/v) de bouillon trypticase de soja (TSB, Becton Dickinson, France). Le milieu minimum utilisé pour les cultures en Erlenmeyers (milieu MMR) contenait : 4,0 g/L de NaH₂PO₄2H₂O; 4,6 g/L de Na₂HPO₄12H₂O; 0,45 de g/L K₂SO₄; 0,39 g/L de MgSO₄7H₂O; 0,062 g/L de CaCl₂2H₂O et 1 ml/L de solution de trace d’éléments. La solution de trace d’éléments contenait : 15 g/L de FeSO₄7H₂O; 2,4 g/L MnSO₄H₂O; 2,4 g/L de ZnSO₄7H₂O et 0,48 g/L de CuSO₄5H₂O dans 0,1 M de HCl. Le fructose (20 g/L) a été utilisé comme source de carbone. NH₄Cl (0,5 g/L) a été utilisé comme source d’azote pour atteindre une concentration de biomasse d’environ 1 g/L. 0,04 g/L de NaOH ont été ajoutés.

Chaîne d’inoculationUn clone de la souche CN0002 repiqué d’une plaque de culture a été tout d’abord cultivé durant 8 h dans 5 mL de milieu riche avec de la gentamycine (10 µg/mL) et de la kanamycine (200 µg/mL) (dépendant de la souche), dans des tubes de culture, à 30°C sous agitation (200 rpm). Cette première préculture a été utilisée pour inoculer la deuxième préculture à une DO₆₀₀initiale de 0,05 dans 25 mL de milieu MMR dans des Erlenmeyer bafflés de 250 mL qui ont été incubés durant 20 h à 30°C, 200 rpm. Cette seconde préculture a été utilisée pour inoculer la culture en Erlenmeyer dans 50 mL de milieu MMR en présence de gentamycine (10 µg/mL) et de kanamycine (200 µg/mL) (dépendant de la souche). La DO₆₀₀initiale visée a été de 0,05.

Culture en ErlenmeyerLa culture hétérotrophe a été réalisée dans un volume de MMR de 50 mL dans des Erlenmeyers bafflés de 500 mL, à une température de 30°C et une agitation de 200 rpm. Une phase de croissance d’une durée de 20h a été réalisée jusqu’à l’obtention d’une biomasse de 1 g/L. Après cette première phase de croissance, une modification de l’aération est opérée (2% air soit 0,4% d’O₂), une induction du promoteur de la LDH est réalisée par l’ajout de 1 g/L d’arabinose (dépendant de la souche) ce qui conduit à une phase de production de lactate d’une durée de 120 h.

Protocole d'échantillonnage et d'analyseDes échantillons de 1mL ont été prélevés régulièrement au cours de la culture. La croissance a été suivie par une mesure de la densité optique (DO) à 600 nm; convertie en poids sec de cellules bactériennes (gCDW/L) selon une courbe d'étalonnage. La production de lactate a été analysée par HPLC comme décrit dans l’exemple 1. Les échantillons ont été centrifugés pendant 5 min à 13 000 tr/min et les surnageants ont été filtrés avant d’être analysés par HPLC. L'étalonnage a varié de 0,1 à 5 g/L dans de l'eau.

RésultatsLa croissance de la souche est représentée à la figure 5. Pendant la phase de croissance exponentielle, le taux de croissance spécifique de CN0002 en condition hétérotrophe atteint μ_max= 0,14 h^-1. Un maximum de lactate, c'est-à-dire 1,3 g/L, a été atteint après 139 h de culture comme représenté à la figure 5. Il est à noter que dans les mêmes conditions de culture, la soucheCupriavidus necatorH16 PHB-4 sans surexpression de lactate déshydrogénase ne produit pas de lactate.

Exemple 4 : Production de lactate à partir de CO ₂ par fermentation d’une bactérie oxydant naturellement l’hydrogène, Cupriavidus necator , génétiquement modifiée (CN0002).

MilieuxLe milieu riche était constitué de 27,5% (p/v) de bouillon trypticase de soja (TSB, Becton Dickinson, France). Le milieu minimum utilisé pour les cultures en Erlenmeyers (milieu MMR) contenait : 4,0 g/L de NaH₂PO₄2H₂O; 4,6 g/L de Na₂HPO₄12H₂O; 0,45 de g/L K₂SO₄; 0,39 g/L de MgSO₄7H₂O; 0,062 g/L de CaCl₂2H₂O et 1 ml/L de solution de trace d’éléments. La solution de trace d’éléments contenait : 15 g/L de FeSO₄7H₂O; 2,4 g/L MnSO₄H₂O; 2,4 g/L de ZnSO₄7H₂O et 0,48 g/L de CuSO₄5H₂O dans 0,1 M de HCl. Le fructose (20 g/L) a été utilisé comme source de carbone. NH₄Cl (0,5 g/L) a été utilisé comme source d’azote pour atteindre une concentration de biomasse d’environ 1 g/L. 0,04 g/L de NaOH ont été ajoutés.

Le milieu minimum utilisé dans le bioréacteur pour les fermentations gaz (milieu FAME) était constitué de : 0,29 g/L d’acide NitriloTriAcetique; 0,09 g/L de citrate d’ammonium ferrique ; 0,75 g/L de MgSO₄7H₂O; 0,015 g/L de CaCl₂2H₂O et 1,5 ml/L de solution de trace élément. La composition de la solution de trace élément était : 0,3 g/L de H₃BO₃; 0,2 g/L de CoCl₂6H₂O; 0,1 g/L de ZnSO₄7H₂O; 0,03 g/L de MnCl₂4H₂O; 0,03 g/L de Na₂MoO₄2H₂O; 0,02 g/L de NiCl₂6H₂O; 0,01 g/L de CuSO₄5H₂O. (NH₄)₂SO₄(1,6 g/L) a été utilisé comme source d’azote pour atteindre une concentration en biomasse d’environ 2,5 g/L. Le pH a été ajusté à 7 avec 2,5 M de KOH. Après autoclavage du milieu, une solution de phosphate stérile de Na₂HPO₄12H₂O (concentration finale de 1,6 g/L) et de KH₂PO₄(concentration finale de 2,9 g/L) a été ajoutée stérilement dans le bioréacteur (permettant de produire environ 10 g/L de biomasse) ainsi qu’une solution stérile de FeSO₄7H₂O (10,7 g/L; concentration finale 0,032 g/L).

Chaîne d’inoculationUn clone de la souche CN0002 repiqué d’une plaque de culture a été tout d’abord cultivé durant 24 h dans 5 mL de milieu TSB avec de la gentamycine (10 mg/L) et de la kanamycine (50 mg/L) (dépendant de la souche), dans des Erlenmeyers bafflés de 50 mL, à 30°c sous agitation (110 rpm). Le milieu de culture a été ensuite centrifugé durant 10 min à 1900 g. Les cellules ont été resuspendues dans 5 mL de milieu MMR, et ont été utilisées pour inoculer les 45 mL de milieu MMR avec 5,5 µg/mL de gentamycine et 100 µg/mL de kanamycine dans des Erlenmeyers bafflés de 500 mL qui ont été incubés durant 20-24 h à 30°C, 110 rpm. Le milieu de culture a été centrifugé durant 5 min à 4000 g et les cellules ont été resuspendues dans 30 mL de milieu FAME, et ont été utilisées pour inoculer les 300 mL de milieu FAME avec 100 mg/L de kanamycine dans le bioréacteur gaz. La DO₆₀₀initiale visée a été de 0,2.

Bioréacteur gazLa culture autotrophe a été réalisée dans un bioréacteur à gaz avec un volume de travail de 330 mL. La température a été réglée à 30 ° C, le pH à 7. La pression et la vitesse d'agitation ont été définies en fonction des besoins de la culture. Les débits de gaz étaient contrôlés individuellement (CO₂, H₂, air). Un analyseur de gaz a été utilisé pour l’analyse des gaz de sortie (% O₂et CO₂) et un volumètre pour mesurer les débits de gaz de sortie totaux. Après 53 heures de croissance, environ 3 g/L de biomasse ont été atteint, la concentration en oxygène dissous est tombée à 0 et 160 mg/L de lactate ont été produits.

Protocole d'échantillonnage et d'analyseDes échantillons (environ 1 ml) ont été prélevés régulièrement (toutes les 2-3 heures) en prélevant au travers d'un septum avec une seringue et une aiguille. La croissance a été suivie par une mesure de la densité optique (DO) à 600 nm; convertis en poids sec de cellules bactériennes (gCDW/L) selon une courbe d'étalonnage. La production de lactate a été analysée par HPLC/HPAIC comme décrit dans l’exemple 1. Les échantillons ont été centrifugés pendant 3 min à 13 000 tr/min et les surnageants ont été analysés. Pour l'analyse HPLC, les surnageants des échantillons ont été filtrés avant analyse. L'étalonnage a varié de 0,1 à 5 g/L dans de l'eau.

FermentationLa production de lactate par la souche CN0002 a été caractérisée en bioréacteur en conditions autotrophes. La croissance de la souche est représentée à la figure 6. Pendant la phase de croissance exponentielle, le taux de croissance spécifique de CN0002 en condition autotrophe atteint μ_max= 0,14 h^-1. Un maximum de lactate, c'est-à-dire 160 mg/L, a été atteint après 53 h de culture comme représenté à la figure 6.

Exemple 5 : Construction et évaluation d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une lactate déshydrogénase hétérologue de Streptococcus bovis est surexprimée (CN0003).

Souche et constructions génétiques.Pour la production de lactate, une soucheCupriavidus necatorH16 PHB-4 (DSM n°541) est utilisée. Cette souche ne forme pas de poly-β-hydroxy-butyrate (PHB). La construction de la souche productrice de lactate CN0003 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant la L-lactate déshydrogénase (ldh, EC:1.1.1.27) deStreptococcus bovis(ATCC 33317) sous promoteur inductible à l’arabinose est cloné en une étapein vitro viale protocole d’assemblage In-Fusion® (Clontech). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

Le gène ldh (GenBank: KFN85486.1) est recodé selon le biais d’usage de codon décrit pourCupriavidus necatorH16 et synthétiséin vitro(GenScript®). Il est amplifié par PCR à l’aide des oligonucléotides 12 (5’ AAGGAGATAT ACATATGACC GCGACCAAGC AGCAC 3’) et 13 (5’ ACTCGAGTTT GGATCCTCAG TTCTTGCAGG CCGACGCGA 3’) et de l’enzyme Phusion High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer (New England Biolabs, Evry, France). Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Le plasmide squelette pBADTrfp (Biet al., 2013) dérivé du plasmide pBBR1-MCS (Kovachet al., 1995), contenant un promoteur pBAD deEscherichia coli, est digéré par les enzymes de restrictions BamHI-HF et NdeI (New England Biolabs, Evry, France) afin d’éliminer la séquence codant pour la protéine RFP. Le fragment d’ADN de 5247 paires de bases contenant l’origine de réplication pBBR1, le gène de sélection (kan) et le promoteur pBAD est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblagein vitropar In-fusion est réalisé avec les deux fragments afin d’obtenir le plasmide pBAD-ldh(sb). 5 µl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellulesEscherichia coliStellar™ (Clontech) chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 25 µg/mL de kanamycine (Gibco™). La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 9 et 14 (5’ GGAGCTGGGC ATCATCGAGA TC 3’). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), l’insertion correcte du gène ldh est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 9 et 11.

Le plasmide pBAD-ldh(sb) est inséré dans une souche électrocompétenteEscherichia coliS17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).

La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 9 et 14. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 25 µg/mL de kanamycine et incubé une nuit à 37°C.

La conjugaison entre les cellulesEscherichia coliS17-1 et celles de la soucheCupriavidus necatorH16 PHB-4 (DSM n°541) est réalisé comme suit :

Les cellulesCupriavidus necatorsont mises en culture dans 3 mL de milieu TSB contenant 27,5 g/L de bouillon de soja tryptique (TSB, Becton Dickinson, Sparks, Maryland, USA) et incubées 20h à 30°C sous agitation vigoureuse. Les cellulesEscherichia colisont mises en culture dans 3 mL de milieu LB (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl 5 g/L, Sigma-Aldrich) contenant 25 µg/mL de kanamycine et incubées une nuit à 37°C sous agitation vigoureuse. Le lendemain, la densité optique (DO_600nm) est mesurée pour chaque culture et l’équivalent de 1 DO de cellules est transféré en tube 1,5ml et centrifugé (5 minutes, 3000 rpm). Le surnageant est éliminé et les cellules sont lavées dans 1 ml de PBS (Sigma-Aldrich). Le lavage est répété une seconde fois. 50 µL de la suspension cellulaireCupriavidus necatoret 50 µL de la suspension cellulaireEscherichia colisont prélevées et mélangées dans un tube 1,5 ml. Ce mélange est déposé sous forme d’une goutte sur un milieu non sélectif LB/Agar contenant 2% de fructose et incubé 6h à 30°C. Les cellules sont ensuite grattées et resuspendues dans 1 ml de PBS. Cette suspension est diluée au 1 :1000eme et 100 µl de cette dilution sont étalés sur milieu sélectif LB/Agar contenant 2% de fructose, 300 µg/mL de kanamycine et 10 µg/mL de gentamycine (Sigma-Aldrich). Les cellules sont mises à incuber 24h à 30°C. Des clones isolés sont prélevés, striés sur le même milieu sélectif et mis à incuber 24h à 30°C. La sélection des clones contenant le plasmide pBAD- ldh(sb) est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 9 et 14.

La soucheCupriavidus necatorH16 PHB-4 pBAD-ldh(sb) est récupérée et nommée CN0003.

Evaluation de la souche CN0003 en fructoseLa production de lactate sur fructose de la soucheCupriavidus necatorH16 PHB-4 pBAD-ldh(sb) (CN0003) a été évaluée selon la méthode décrite dans l’exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0003 produit 1 g/L de lactate après 140h de culture.

Extrapolation production de lactate par la CN0003 à partir de CO ₂ La production de lactate de la souche CN0003 n’a pas été réalisée à partir de CO₂. Cependant, l’évaluation en fructose a montré que la souche CN0003 produisait 23% de lactate en moins que la souche CN0002 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu’à partir de CO₂tel que décrit dans l’exemple 4, la souche CN0003 produirait 23% de lactate en moins à partir de CO₂que la souche CN0002.

Exemple 6 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée et dans laquelle une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée (CN0004).

SouchePour la production de lactate, la soucheCupriavidus necatorH16 (ATCC 17699) est utilisée. La délétion de l’opéron de voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est inhibée par insertion d’une lactate déshydrogénase endogène.

Constructions génétiquesLa construction de la souche productrice de lactate CN0004 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant la L-lactate déshydrogénase deCupriavidus necator(ldh, EC:1.1.1.27) sous promoteur inductible pLac ainsi que les séquences des zones d’homologie amont et aval de l’opéron phaCAB est cloné en une étapein vitro viale protocole d’assemblage NEBuilder^®HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

Le gène ldh est amplifié par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 à l’aide des oligonucléotides 15 (5’ AGACAATCAA ATCTTTACAC TTTATGCTTC CGGCTCGTAT GTTGTGTGGA ATTGTGAGCG GATAACAATT TCACACAGGA AACAGCTATG AAGATCTCCC TCACCAGCGC CC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 13 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont de l’opéron phaCAB et la séquence du promoteur pLac provenant du pJQ200mp18 (Quandt and Hynes, 1993) et 16 (5’ CCAGGCCGGC AGGTCAGGCC GTGGGGACGG CCA 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 13 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval de l’opéron phaCAB et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

La séquence de la zone d’homologie amont de l’opéron phaCAB est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 à l’aide des oligonucléotides 17 (5’ GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGGGTCG CTTCTACTCC TATCG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pJQ200mpTet et 18 (5’ CATAAAGTGT AAAGATTTGA TTGTCTCTCT GCC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 13 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la séquence du promoteur pLac et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

La séquence de la zone d’homologie aval de l’opéron phaCAB est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 à l’aide des oligonucléotides 19 (5’ CCCCACGGCC TGACCTGCCG GCCTGGTTCA ACC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 13 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la séquence du gène ldh de la soucheCupriavidus necatorH16 et 20 (5’ TACGAATTCG AGCTCGGTAC CCGGGTTCTG GATGTCGATG AAGGCCTG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pJQ200mpTet et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Le plasmide squelette pJQ200mpTet est un dérivé du plasmide pJQ200mp18 (Quandt and Hynes, 1993) où le gène de résistance à la gentamycine a été remplacé par le gène de résistance à la tétracycline. Le plasmide squelette pJQ200mpTet est coupé par l’enzyme de restriction BamHI-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblagein vitropar NEBuilder^®HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les quatre fragments afin d’obtenir le plasmide pJQ200mp-ΔphaCABΩpLac L-ldh. 2 µl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellulesEscherichia coliNEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 µg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 22 (5’ CATGCAAAGT GCCGGCCAGG 3’) et 23 (5’ CTGCACGAAC ATGGTGCTGG CT 3’). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), l’insertion correcte du gène ldh, de la séquence de la zone d’homologie amont et de la séquence de la zone d’homologie aval est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 21 (5’ TGCAAGGCGA TTAAGTTG 3’), 22, 23 et 24 (5’ CTGGCACGAC AGGTTTCCCG A 3’).

Le plasmide pJQ200mp-ΔphaCABΩpLac L-ldh est inséré dans une souche électrocompétenteEscherichia coliS17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).

La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 22 et 23. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 µg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.

La conjugaison entre les cellulesEscherichia coliS17-1 et celles de la soucheCupriavidus necatorH16 (ATCC 17699) a été adaptée du protocole de Lenzet al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément l’opéron phaCAB et d’y insérer pLac L-ldh. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™)™) et des oligonucleotides 22 et 23. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen) (Kraußeet al., 2009) et des oligonucleotides 76 (5’ CTGCATGTTC ATGAACTGCG AC 3’) et 77 (5’ CGACGCGTCA ACCATGTTCG 3’).

La soucheCupriavidus necatorH16 ΔphaCABΩpLac_L-ldh _C.necator est récupérée et nommée CN0004. Les modifications génétiques sont validées par séquençage à l’aide des oligonucléotides 78 (5' GTACCTTGCC GACATCTATG C 3'), 79 (5' GCTGCTTGCA TCACGGACTT G 3'), 10, 77 et 76.

Evaluation de la souche CN0004 en fructoseLa production de lactate sur fructose de la soucheCupriavidus necatorH16 ΔphaCABΩpLac_L-ldhC.necator(CN0004) a été évaluée selon la méthode décrite dans l’exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0004 produit 1,5 g/L de lactate après 140 h de culture.

Extrapolation production de lactate de la CN0004 à partir de CO ₂ La production de lactate de la souche CN0004 n’a pas été réalisée à partir de CO₂. Cependant, l’évaluation en fructose a montré que la souche CN0004 produisait 25% de lactate en plus que la souche CN0002 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu’à partir de CO₂tel que décrit dans l’exemple 4, la souche CN0004 produirait 25% de lactate en plus à partir de CO₂que la souche CN0002.

Exemple 7 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une pyruvate carboxylase est délétée (CN0005)

Souche et constructions génétiquesLa construction de la souche productrice de lactate CN0005 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval du gène codant pour la pyruvate carboxylase (pyc) deCupriavidus necatorest cloné en une étapein vitro viale protocole d’assemblage NEBuilder^®HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

La séquence de la zone d’homologie amont du gène codant pour pyc est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 à l’aide des oligonucléotides 25 (5’ AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACCGCAT GGCCAAGGTG GAAGAG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pLO3 (Lenz and Friedrich, 1998) et 26 (5’ TGCCGGCCAA CGTCACATGG GATGCAGGGA AGCGAAC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène codant pour pyc et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

La séquence de la zone d’homologie aval du gène codant pour pyc est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 à l’aide des oligonucléotides 27 (5’ TCCCTGCATC CCATGTGACG TTGGCCGGCA GGG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène codant pour pyc et 28 (5’ ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCCCCGG GCTGATAGTT CTTCAACACC AGCAGTC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 31 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pLO3 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Le plasmide squelette pLO3 (Lenz and Friedrich, 1998) est coupé par l’enzyme de restriction XmaI-HF (New England Biolabs, Evry, France). Le produit de digestion est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblagein vitropar NEBuilder^®HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pLO3-Δpyc. 2 µl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellulesEscherichia coliNEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 µg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucleotides 51 et 80 (5' AATGGGACGT GCGAGTCCAT CC 3'). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène pyc est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 29 (5’ GCAAACAAAC CACCGCTGGT 3’), 30 (5’ CGCCATATCG GATGCCGTTC 3’) et 31 (5’ TAGCAGCACG CCATAGTGAC TG 3’).

Le plasmide pLO3-Δpyc est inséré dans une souche électrocompétenteEscherichia coliS17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).

La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 51 et 80. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 µg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.

La conjugaison entre les cellulesEscherichia coliS17-1 et celles de la souche CN0004 a été adaptée du protocole de Lenzet al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour pyc. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 51 et 80. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen) et des oligonucléotides 81 (5' CCATTTGCCC AATACGACTA GC 3') et 30.

La soucheCupriavidus necatorH16 Δpyc ΔphaCABΩpLac_L-ldhC.necatorest récupérée et nommée CN0005. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.

Evaluation de la souche CN0005 en fructoseLa production de lactate sur fructose de la soucheCupriavidus necatorH16 Δpyc ΔphaCABΩpLac_L-ldhC.necator(CN0005) a été évaluée selon la méthode décrite dans l’exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0005 produit 21% de lactate de plus que la souche CN0004 après 51 h de culture.

Extrapolation production de lactate de la CN0005 à partir de CO ₂ La production de lactate de la souche CN0005 n’a pas été réalisée à partir de CO₂. Cependant, l’évaluation en fructose a montré que la souche CN0005 produisait 21% de lactate en plus que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu’à partir de CO₂tel que décrit dans l’exemple 4, la souche CN0005 produirait 25% de lactate en plus à partir de CO₂que la souche CN0004.

Exemple 8 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une pyruvate déshydrogénase est délétée (CN0006)

Souche et constructions génétiquesLa construction de la souche productrice de lactate CN0006 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval du gène codant pour le composant E1 de la pyruvate deshydrogénase (pdhA2) deCupriavidus necatorest cloné en une étapein vitro viale protocole d’assemblage NEBuilder^®HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

La séquence de la zone d’homologie amont du gène codant pour pdhA2 est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 à l’aide des oligonucléotides 32 (5’ TCCTTTAATT CGAGCTCGGT ACCCGGGTGC GTAATCCACT TCCAG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pLO3 (Lenz and Friedrich, 1998) et 33 (5’ CCCATCGTTC ACACGGCAAG TCTCCGTTAA GGAATTC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 11 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène codant pour pdhA2 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

La séquence de la zone d’homologie aval du gène codant pour pdhA2 est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 à l’aide des oligonucléotides 34 (5’ GACTTGCCGT GTGAACGATG GGCCATCGGG CA 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 11 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène codant pour pdhA2 et 35 (5’ TAAGGATCCG GCGCGCCCCC GGGTTGAGCA GGATCACGTC GATCC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pLO3 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblagein vitropar NEBuilder^®HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pLO3-ΔpdhA2. 2 µl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellulesEscherichia coliNEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 µg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 29 et 82 (5' ATGTCCTGGA TTGCGCAGAT C 3'). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène pdhA2 est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 36 (5’ TAATCCACTT CCAGCGCGAT AAG 3’), 37 (5’ CCTGAAGTCT CCGCGATAAC 3’), 38 (5’ GTTCGAAGCC ACCGAGTATG AC 3’) et 29.

Le plasmide pLO3-ΔpdhA2 est inséré dans une souche électrocompétenteEscherichia coliS17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).

La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 29 et 82. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 µg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.

La conjugaison entre les cellulesEscherichia coliS17-1 et celles de la souche CN0004 a été adaptée du protocole de Lenzet al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour pdhA2. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 29 et 82. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen).

La soucheCupriavidus necatorH16 ΔpdhA2 ΔphaCABΩpLac_L-ldh _C.necator est récupérée et nommée CN0006. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.

Evaluation de la souche CN0006 en fructoseLa production de lactate sur fructose de la soucheCupriavidus necatorH16 ΔpdhA2 ΔphaCABΩpLac_L-ldh _C.necator (CN0006) a été évaluée selon la méthode décrite dans l’exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0006 produit 13% de lactate de plus que la souche CN0004 après 51 h de culture.

Extrapolation production de lactate de la CN0006 à partir de CO ₂ La production de lactate de la souche CN0006 n’a pas été réalisée à partir de CO₂. Cependant, l’évaluation en fructose a montré que la souche CN0006 produisait 13% de lactate en plus que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu’à partir de CO₂tel que décrit dans l’exemple 4, la souche CN0006 produirait 13% de lactate en plus à partir de CO₂que la souche CN0004.

Exemple 9 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une phosphate acétyltransférasee et une acétate kinase phosphoenolpyruvate synthase sont délétées (CN0007)

Souche et constructions génétiques

La construction de la souche productrice de lactate CN0007 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval de l’opéron codant pour les gènes acétate kinase (ackA) et phosphotransacétylase (pta1) deCupriavidus necatorest cloné en une étapein vitro viale protocole d’assemblage NEBuilder^®HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

La séquence de la zone d’homologie amont du gène codant pour pta1 est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 à l’aide des oligonucléotides 39 (5’ TCCTTTAATT CGAGCTCGGT ACGTGTCCAA TGAGATGACA GCACG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pLO3 (Lenz and Friedrich, 1998) et 40 (5’ TGTAGCGGTG GTGCGTCAGG GTCGTCGGTG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 11 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène codant pour ackA et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

La séquence de la zone d’homologie aval du gène codant pour ackA est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 à l’aide des oligonucléotides 41 (5’ ACCCTGACGC ACCACCGCTA CAGCCGACCA AG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 11 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène codant pour pta1 et 42 (5’ TAAGGATCCG GCGCGCCCCC GGGCTGATAC GTTCACGCAT AGTGGTC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 22 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pLO3 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblagein vitropar NEBuilder^®HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pLO3-Δpta1-ackA. 2 µl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellulesEscherichia coliNEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 µg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucleotides 29 et 43 (5’ GACTTCCGGC AGGTCATGC 3’). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion de l’opéron ackA-pta1 est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 43, 44 (5’ CAGTTGTTGC GCTGCAGTCA T 3’), 45 (5’ GCCAAGCCGG AACGCGTC 3’) et 46 (5’ GATGGTGGCA CGATGTTCAC 3’).

Le plasmide pLO3-Δpta1-ackA est inséré dans une souche électrocompétenteEscherichia coliS17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).

La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 29 et 43. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 µg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.

La conjugaison entre les cellulesEscherichia coliS17-1 et celles de la souche CN0004 a été adaptée du protocole de Lenzet al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément l’opéron pta1-ackA. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 29 et 43. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen) et des oligonucléotides 44 et 83 (5' CAGAACTGGC TGTTCTCGGA C 3').

La soucheCupriavidus necatorH16 Δpta1-ackA ΔphaCABΩpLac_L-ldh _C.necator est récupérée et nommée CN0007. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.

Evaluation de la souche CN0007 en fructoseLa production de lactate sur fructose de la soucheCupriavidus necatorH16 Δpta1-ackA ΔphaCABΩpLac_L-ldhC.necator(CN0007) a été évaluée selon la méthode décrite dans l’exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0007 produit 11% de lactate de plus que la souche CN0004 après 51 h de culture.

Extrapolation production de lactate de la CN0007 à partir de CO ₂ La production de lactate de la souche CN0007 n’a pas été réalisée à partir de CO₂. Cependant, l’évaluation en fructose a montré que la souche CN0007 produisait 11% de lactate en plus que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu’à partir de CO₂tel que décrit dans l’exemple 4, la souche CN0007 produirait 11% de lactate en plus à partir de CO₂que la souche CN0004.

Exemple 10 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une lactate ferricytochrome C reductase est délétée (CN0008)

Souche et constructions génétiques.La construction de la souche productrice de lactate CN0008 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval du site actif de la L-Lactate cytochrome c reductase (lldD, 1.1.2.3) deCupriavidus necatorest cloné en une étapein vitro viale protocole d’assemblage NEBuilder^®HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

La séquence de la zone d’homologie amont du gène codant pour lldD est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 à l’aide des oligonucléotides 47 (5’ CCTGCAGGTC GACTCTAGAG AGCAATTGCT CCGCCATCAG C 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 20 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pJQ200mpTet et 48 (5’ AGTCGATGGC CACTTGGCGG CGCAAGGTAC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 10 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène codant pour lldD et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

La séquence de la zone d’homologie aval du gène codant pour lldD est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 à l’aide des oligonucléotides 49 (5’ CCGCCAAGTG GCCATCGACT TGTTGCAGGC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 10 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène codant pour lldD et 50 (5’ ATTCGAGCTC GGTACCCGGG CAAAGGCTGC GTCCAGCCAG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 20 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pJQ200mpTet et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblagein vitropar NEBuilder^®HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pJQ200mpTet -ΔlldD. 2 µl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellulesEscherichia coliNEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 µg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 24 et 86 (5' GACAACCTGA TGGTGCACAA GG 3'). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène lldD est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 24, 51 (5’ TGCAAGGCGA TTAAGTTGGG TAACG 3’) et 52 (5’ GAACAGCTGC ACGCCGAG 3’).

Le plasmide pJQ200mpTet -ΔlldD est inséré dans une souche électrocompétenteEscherichia coliS17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).

La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 24 et 86. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 µg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.

La conjugaison entre les cellulesEscherichia coliS17-1 et celles de la souche CN0004 a été adaptée du protocole de Lenzet al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour lldD. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 24 et 86. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen) ) et des oligonucléotides 52 et 87 (5' CACATTGCGT CGCTGACATT G 3').

La soucheCupriavidus necatorH16 ΔlldD ΔphaCABΩpLac_L-ldh _C.necator est récupérée et nommée CN0008. Les modifications génétiques sont validées par séquençage à l’aide des oligonucléotides 88 (5' AGCTGTTGCA CACCAGGCGA C 3'), 89 (5' CATTGCCATA TCGCGCGAGA TC 3'), 90 (5' CTATCGATCATGTCAGCTCTTCATG 3') et 91 (5' CACTCCGTAC ACAATGACCA CG 3').

Evaluation de la souche CN0008 en fructoseLa production de lactate sur fructose de la soucheCupriavidus necatorH16 ΔlldD ΔphaCABΩpLac_L-ldhC.necator(CN0008) a été évaluée selon la méthode décrite dans l’exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0008 produit 1,4 g/L de lactate après 140 h de culture.

Extrapolation production de lactate de la CN0008 à partir de CO ₂ La production de lactate de la souche CN0008 n’a pas été réalisée à partir de CO₂. Cependant, l’évaluation en fructose a montré que la souche CN0008 produisait 7% de lactate en moins que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu’à partir de CO₂tel que décrit dans l’exemple 4, la souche CN0008 produirait 7% de lactate en moins à partir de CO₂que la souche CN0004.

Exemple 11 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle deux lactates ferricytochrome C reductases sont délétées (CN0009)

Souche et constructions génétiquesLa construction de la souche productrice de lactate CN0009 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval du gène codant pour L-Lactate cytochrome reductase (lldA) deCupriavidus necatorest cloné en une étapein vitro viale protocole d’assemblage NEBuilder^®HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

La séquence de la zone d’homologie amont du gène codant pour lldA est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 à l’aide des oligonucléotides 53 (5’ CCTGCAGGTC GACTCTAGAG GATCCGCAAG ACGGTTTATC TCTCGGTC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pJQ200mpTet et 54 (5’ GACGCTATCA CATGGGAACT CCCTTGAAAA AAACAAAAAG CTGC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 10 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène codant pour lldA et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

La séquence de la zone d’homologie aval du gène codant pour lldA est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 à l’aide des oligonucléotides 55 (5’ AGTTCCCATG TGATAGCGTC TATGAGGCGT C 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 10 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène codant pour lldA et 56 (5’ ATTCGAGCTC GGTACCCGGG GATCGAGGAA ATCGGCTGCG TAGG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 24 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pJQ200mpTet et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblagein vitropar NEBuilder^®HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pJQ200mpTet -ΔlldA. 2 µl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellulesEscherichia coliNEB 5-alpha compétentes (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 µg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 92 (5' TGAGTCCAAC CCGGTAAGAC 3') et 57 (5’ CCTCATAGAC GCTATCACAT GG 3’). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène lldA est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 21, 57, 58 (5’ CCATGTGATAGCGTCTATGAGG 3’) et 24.

Le plasmide pJQ200mpTet -ΔlldA est inséré dans une souche électrocompétenteEscherichia coliS17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).

La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 92 et 57. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 µg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.

La conjugaison entre les cellulesEscherichia coliS17-1 et celles de la souche CN0008 a été adaptée du protocole de Lenzet al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour lldA. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 92 et 57. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen) et des oligonucléotides 93 (5' CTGGCTGAAC GTGAAGAATG C 3') et 94 (5' GGAAGATAAA CCCGAGCAGA TC 3').

La soucheCupriavidus necatorH16 ΔlldA ΔlldD ΔphaCABΩpLac_L-ldh _C.necator est récupérée et nommée CN0009. Les modifications génétiques sont validées par séquençage à l’aide des oligonucléotides 57, 58, 95 (5' CAGGCTTATC GACAGAGAAA TTCG 3') et 96 (5' GTATTTCGCA TCGTGCCAGA C 3').

Evaluation de la souche CN0009 en fructoseLa production de lactate sur fructose de la soucheCupriavidus necatorH16 ΔlldD ΔphaCABΩpLac_L-ldhC.necator(CN0009) a été évaluée selon la méthode décrite dans l’exemple 3. Dans ces conditions de culture, la souche CN0009 produit 1,4 g/L de lactate après 140 h de culture.

Extrapolation production de lactate de la CN0009 à partir de CO ₂ La production de lactate de la souche CN0009 n’a pas été réalisée à partir de CO₂. Cependant, l’évaluation en fructose a montré que la souche CN0009 produisait 7% de lactate en moins que la souche CN0004 dans les mêmes conditions de culture. Nous pouvons extrapoler qu’à partir de CO₂tel que décrit dans l’exemple 4, la souche CN0009 produirait 7% de lactate en moins à partir de CO₂que la souche CN0004.

Exemple 12 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée et dans laquelle une phosphoenolpyruvate synthase est délétée (CN0010)

Souche et constructions génétiques.La construction de la souche productrice de lactate CN0010 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval du gène codant pour la phosphoenolpyruvate synthase (ppsA) deCupriavidus necatorest cloné en une étapein vitro viale protocole d’assemblage NEBuilder^®HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

La séquence de la zone d’homologie amont du gène codant pour ppsA est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 à l’aide des oligonucléotides 59 (5’ AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACCCGAA GATCTTCGGC TTGAACG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pLO3 et 60 (5’ ACGTCAAATG CTTCACATGT CCGGTATGTT CTTGGAGTTC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène codant pour ppsA et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

La séquence de la zone d’homologie aval du gène codant pour ppsA est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 à l’aide des oligonucléotides 61 (5’ AACATACCGG ACATGTGAAG CATTTGACGT CACAATAACG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène codant pour ppsA et 62 (5’ ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCCTTGA GCACGTGCT TGTAGG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pLO3 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblagein vitropar NEBuilder^®HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pLO3-ΔppsA. 2 µl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellulesEscherichia coliNEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 µg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion du gène ppsA est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 63 (5’ ATGAACACCG GCACCTTCTA CC 3’), 64 (5’ CAGGATGGAG TGGCTGAACG 3’) et 29.

Le plasmide pLO3-ΔppsA est inséré dans une souche électrocompétenteEscherichia coliS17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).

La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 µg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.

La conjugaison entre les cellulesEscherichia coliS17-1 et celles de la souche CN0004 a été adaptée du protocole de Lenzet al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément le gène codant pour ppsA. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen).

La soucheCupriavidus necatorH16 ΔppsA ΔphaCABΩpLac_L-ldhC.necatorest récupérée et nommée CN0010. Les modifications génétiques sont validées par séquençage.

Exemple 13 : Evaluation de la consommation lactate par les souches CN0004 et CN0009

SouchesPour l’évaluation de la consommation de lactate, les souches CN0004 (Cupriavidus necatorH16 ΔphaCABΩpLac_L-ldh _C.necator ) et CN0009 (Cupriavidus necatorH16 ΔlldA ΔlldD ΔphaCABΩpLac_L-ldh _C.necator ) sont utilisées.

MilieuxLe milieu riche était constitué de 27,5% (p/v) de bouillon trypticase de soja (TSB, Becton Dickinson, France). Le milieu minimum utilisé pour les précultures et les cultures en Erlenmeyers (milieu MMR) contenait : 4,0 g/L de NaH₂PO₄2H₂O; 4,6 g/L de Na₂HPO₄12H₂O; 0,45 de g/L K₂SO₄; 0,39 g/L de MgSO₄7H₂O; 0,062 g/L de CaCl₂2H₂O et 1 ml/L de solution de trace d’éléments. La solution de trace d’éléments contenait : 15 g/L de FeSO₄7H₂O; 2,4 g/L MnSO₄H₂O; 2,4 g/L de ZnSO₄7H₂O et 0,48 g/L de CuSO₄5H₂O dans 0,1 M de HCl. NH₄Cl (1 g/L) a été utilisé comme source d’azote pour atteindre une concentration de biomasse d’environ 2 g/L. 0,04 g/L de NaOH ont été ajoutés. Pour les précultures, le fructose (20 g/L) a été utilisé comme source de carbone. Pour les cultures, le lactate (6 g/L) a été utilisé comme source de carbone.

Chaîne d’inoculationUn clone de la souche CN0004 et un clone de la souche CN0009 repiqués d’une plaque de culture ont été tout d’abord cultivés durant 8 h dans 5 mL de milieu riche avec de la gentamycine (10 µg/mL), dans des tubes de culture, à 30°C sous agitation (200 rpm). Cette première préculture a été utilisée pour inoculer la deuxième préculture à une DO₆₀₀initiale de 0,05 dans 25 mL de milieu MMR + 20 g/L de fructose dans des Erlenmeyer bafflés de 250 mL qui ont été incubés durant 20 h à 30°C, 200 rpm.

Culture en ErlenmeyerLa seconde préculture a été centrifugée, le culot cellulaire a été lavé deux fois avec du MMR sans source de carbone et utilisé pour inoculer la culture en Erlenmeyer de 500mL dans 50 mL de milieu MMR + 6g/L de lactate en présence de gentamycine (10 µg/mL). La DO₆₀₀initiale visée a été de 0,2. La culture en présence de lactate comme seule source de carbone a été réalisée à une température de 30°C et une agitation de 200 rpm. Une phase de croissance d’une durée de 8h a été réalisée jusqu’à la consommation totale du lactate.

Protocole d'échantillonnage et d'analyseDes échantillons de 1mL ont été prélevés régulièrement au cours de la culture. La croissance a été suivie par une mesure de la densité optique (DO) à 600 nm. La consommation de lactate a été analysée par HPLC comme décrit dans l’exemple 1. Les échantillons ont été centrifugés pendant 5 min à 13 000 tr/min et les surnageants ont été filtrés avant d’être analysés par HPLC. L'étalonnage a varié de 0,1 à 5 g/L dans de l'eau.

RésultatsLa croissance des souches CN0004 et CN0009 avec le lactate comme seule source de carbone est représentée à la figure 7. Pendant la phase de croissance exponentielle, la vitesse de consommation du lactate pour la souche CN0004 est de 0,89 g/L/h et pour la souche CN0009 de 0,88 g/L/h. La délétion des deux lactates ferricytochrome C reductases entraine moins de 1% de diminution de la consommation du lactate parCupriavidus necator . Ces résultats démontrent que la délétion des gènes lldD et lldA usuellement décrite n’est pas suffisante pour inhiber de manière substantielle la consommation de lactate parCupriavidus necator.

Exemple 14 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée, deux lactates ferricytochrome C reductases sont délétées et dans laquelle l’ opéron lut1 portant les gènes codant pour pour les composants d’un complexe enzymatique utilisant le lactate est délété (CN0011).

Souche et constructions génétiques :

La construction de la souche productrice de lactate CN0011 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval de l’opéron comprenant les gènes A1390, A1391 et A1392 du chromosome AM260479 deCupriavidus necatorest cloné en une étapein vitro viale protocole d’assemblage NEBuilder^®HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

La séquence de la zone d’homologie amont du gène A1390 est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 à l’aide des oligonucléotides 65 (5’ AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACTCATA GATGCCGGCG GCAATGC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pLO3 et 66 (5’ TTTACTGAAG CCTCACATTG TCGACTTCTC CAGACCCG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène A1392 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

La séquence de la zone d’homologie aval du gène A1392 est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 à l’aide des oligonucléotides 67 (5’ GAGAAGTCGA CAATGTGAGG CTTCAGTAAA GAACCAC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène A1390 et 68 (5’ ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCCCAAG CTGCTGTACG TGTC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pLO3 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblagein vitropar NEBuilder^®HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pLO3-Δlut1. 2µl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellulesEscherichia coliNEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10g/L, extrait de levures 5g/L, NaCl 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 15µg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) à l’aide des oligonucléotides 97 (5' AGGCATTGAC CTTGGTGCGT ATC 3') et 31. Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion de l’opéron lut1 est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 69 (5’ GTGACAGCTC TTTCAGGCTG AC 3’), 31 et 29.

Le plasmide pLO3-Δlut1 est inséré dans une souche électrocompétenteEscherichia coliS17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).

La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 97 et 31. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10g/L, extrait de levures 5g/L, NaCl 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 15µg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.

La conjugaison entre les cellulesEscherichia coliS17-1 et celles de la souche CN0009 a été adaptée du protocole de Lenzet al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément l’opéron lut1. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™). Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen) et des oligonucléotides 98 (5' GGTCGGAGAA GACCTGATCG 3') et 69.

La soucheCupriavidus necatorH16 Δlut1 ΔlldA ΔlldD ΔphaCABΩpLac_L-ldh _C.necator est récupérée et nommée CN0011. Les modifications génétiques sont validées par séquençage à l’aide des oligonucléotides 99 (5' GCTTCGGTCA CGTAGCCCAT G 3'), 100 (5' CTGGAATTCG TGGATACGCT GAC 3'), 101 (5' TGTCCGCCAG CCTTAACATC AG 3'), et 102 (5' CTCACCGGAA GTGATGTGCA TTG 3').

Exemple 15 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée, deux lactates ferricytochrome C reductases sont délétées et dans laquelle l’ opéron lut2 portant les gènes codant pour pour les composants d’un complexe enzymatique utilisant le lactate est délété (CN0012).

Souche et constructions génétiques :

La construction de la souche productrice de lactate CN0012 est réalisée selon le protocole suivant :

Un plasmide portant les séquences des zones d’homologie amont et aval de l’opéron lactate utilisation comprenant les gènes B0091, B0092, B0093 du chromosome AM260480 deCupriavidus necatorest cloné en une étapein vitro viale protocole d’assemblage NEBuilder^®HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France). Les oligonucléotides sont synthétisés et purifiés (dessalés) par Eurofins Genomics.

La séquence de la zone d’homologie amont du gène B0093 est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 à l’aide des oligonucléotides 70 (5’ AGATCCTTTA ATTCGAGCTC GGTACGGCTG CGCACGAAGT CGATATG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pLO3 et 71 (5’ CGTGATGACGGATTATCATGTCTCGCTCCGGACGTG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène B0091 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

La séquence de la zone d’homologie aval du gène B0091 est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 à l’aide des oligonucléotides 72 (5’ CGGAGCGAGA CATGATAATC CGTCATCACG GGCGCGAG 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène B0093 et 73 (5’ ACTTAATTAA GGATCCGGCG CGCCCGCGGC TGCCATACCT TCAGGAAC 3’) présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pLO3 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblagein vitropar NEBuilder^®HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pLO3-Δlut2. 2µl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellulesEscherichia coliNEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10g/L, extrait de levures 5g/L, NaCl 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 15µg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 31 et 74 ((5’ GTGGCCGATT GCATGGATCA TC 3’). Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion de l’opéron lut2 est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 29, 74, 75 (5’ TGTTGCGCGC CACCTCGTAT TGC 3’) et 31.

Le plasmide pLO3-Δlut2 est inséré dans une souche électrocompétenteEscherichia coliS17-1 par électroporation en utilisant un électroporateur Gene Pulser, BioRad (Datsenko and Wanner, 2000).

La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 31 et 74. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10 g/L, extrait de levures 5 g/L, NaCl 5 g/L, Sigma-Aldrich, agar 20 g/L) contenant 15 µg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.

La conjugaison entre les cellulesEscherichia coliS17-1 et celles de la souche CN0009 a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément l’opéron lut2. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 31 et 74. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen) et des oligonucléotides 103 (5' CGCGGAAGCG GGAATTATGC 3') et 104 (5' TCCTGCTTCG GTGGTGTTTC G 3').

La soucheCupriavidus necatorH16 Δlut2 ΔlldA ΔlldD ΔphaCABΩpLac_L-ldhC.necatorest récupérée et nommée CN0012. Les modifications génétiques sont validées par séquençage à l’aide des oligonucléotides 103, 104, 105 (5' CCTATCTTCT ATGCCTACCT GAAG 3') et 106 (5' TGTAGGGCGA AGCCTTGC 3').

Exemple 16 : Construction d’une souche de Cupriavidus necator génétiquement modifiée dans laquelle une voie de biosynthèse du polyhydroxybutyrate (PHB) est délétée, une lactate déshydrogénase endogène est surexprimée, deux lactates ferricytochrome C reductases sont délétées et dans laquelle les deux opérons lut1et lut2 portant les gènes codant pour les composants d’un complexe enzymatique utilisant le lactate sont délétés (CN0013).

Souche et constructions génétiques.

La construction de la souche productrice de lactate CN0013 est réalisée selon le protocole suivant :

La séquence de la zone d’homologie amont du gène B0093 est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 à l’aide des oligonucléotides 70 présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 3’ du plasmide pLO3 et 71 présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 5’ de la zone d’homologie aval du gène B0091 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

La séquence de la zone d’homologie aval du gène B0091 est amplifiée par PCR sur l’ADN génomique de la soucheCupriavidus necatorH16 à l’aide des oligonucléotides 72 présentant en 5’ une zone de recouvrement de 15 paires de bases avec l’extrémité 3’ de la zone d’homologie amont du gène B0093 et 73 présentant en 5’ une zone de recouvrement de 25 paires de bases avec l’extrémité 5’ du plasmide pLO3 et de l’enzyme KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) avec 5% de DMSO. Le produit PCR est purifié sur gel avec le kit Nucleospin gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel).

Un assemblagein vitropar NEBuilder^®HiFi DNA Assembly Cloning (New England Biolabs, Evry, France), est réalisé avec les trois fragments afin d’obtenir le plasmide pLO3-Δlut2. 2µl du produit d’assemblage sont transformés dans des cellulesEscherichia coliNEB 5-alpha competent (New England Biolabs, Evry, France), chimio-compétentes. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu LB/Agar (Tryptone 10g/L, extrait de levures 5g/L, NaCl 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 15µg/mL de tétracycline. La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 31 et 74. Après extraction des plasmides à l’aide du kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel), la délétion de l’opéron lut2 est confirmée par séquençage (Eurofins genomic) avec les oligonucléotides 29, 74, 75 et 31.

La sélection des clones positifs est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 31 et 74. Le clone d’intérêt est isolé sur milieu LB/agar (Tryptone 10g/L, extrait de levures 5g/L, NaCl 5g/L, Sigma-Aldrich, agar 20g/L) contenant 15 µg/mL de tétracycline et incubé une nuit à 37°C.

La conjugaison entre les cellulesEscherichia coliS17-1 et celles de la souche CN0011 a été adaptée du protocole de Lenz et al., 1994. La méthode de sélection au saccharose (15% de saccharose utilisé) avec SacB a permis de déléter précisément l’opéron lut2. Après la première recombinaison homologue, les clones sont validés par une PCR sur colonie à l’aide de l’enzyme DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific™) et des oligonucléotides 31 et 74. Après la deuxième recombinaison homologue, la sélection des clones positifs parmi les clones sensibles à la tétracycline est réalisée par PCR sur colonies à l’aide de l’enzyme Kod Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (Novagen) et des oligonucléotides 103 (5' CGCGGAAGCG GGAATTATGC 3') et 104 (5' TCCTGCTTCG GTGGTGTTTC G 3').

La soucheCupriavidus necatorH16 Δlut1 Δlut2 ΔlldA ΔlldD ΔphaCABΩpLac_L-ldh _C.necator est récupérée et nommée CN0013. Les modifications génétiques sont validées par séquençage à l’aide des oligonucléotides 103, 104, 105 (5' CCTATCTTCT ATGCCTACCT GAAG 3') et 106 (5' TGTAGGGCGA AGCCTTGC 3').

Exemple 17 : Evaluation de la consommation lactate par les souches CN0009, CN0011, CN0012 et CN0013

Souches :Pour l’évaluation de la consommation de lactate, les souches CN0009 (Cupriavidus necatorH16 ΔlldA ΔlldD ΔphaCABΩpLac_L-ldh _C.necator ), CN0011 (Cupriavidus necatorH16 Δlut1 ΔlldA ΔlldD ΔphaCABΩpLac_L-ldh _C.necator ), CN0012 (Cupriavidus necatorH16 Δlut2 ΔlldA ΔlldD ΔphaCABΩpLac_L-ldh _C.necator ), CN0013 (Cupriavidus necatorH16 Δlut1 Δlut2 ΔlldA ΔlldD ΔphaCABΩpLac_L-ldh _C.necator ) sont utilisées.

Milieux, conditions de culture et protocole d’échantillonnage et d’analyseLes milieux, les conditions de culture et le protocole d’échantillonnage et d’analyse utilisés sont les mêmes que ceux décrits dans l’exemple 13.

RésultatsLa croissance des souches CN0009, CN0011, CN0012 et CN0013 avec le lactate comme seule source de carbone est représentée à la figure 8. Pendant la phase de croissance, la vitesse de consommation du lactate pour la souche CN0009 est de 0,89 g/L/h, pour la souche CN0011 de 0,72 g/L/h, pour la souche CN0012 de 0,05 g/L/h et pour la souche CN0013 de 0 g/L/h. La délétion de l’opéron lut1 entraine donc une diminution de la vitesse de consommation du lactate parCupriavidus necatorde 19%.La délétion de l’opéron lut2 entraine donc une diminution de la vitesse de consommation du lactate parCupriavidus necatorde 94%.La délétion concomitante des opérons lut1 et lut2 entraine donc une diminution totale de la consommation du lactate parCupriavidus necator.

Abréviations	Nom
F6P	Fructose 6 phosphate
F16BP	Fructose 1,6 bisphosphate
G3P	Glyceraldehyde 3 Phosphate
13BPG	1,3 bis Phospho Glycerate
3PG	3 PhosphoGlycerate
2PG	2 PhosphoGlycerate
PEP	Phospho Enol Pyruvate
R-HB-CoA	3 hydroxybutyrate-CoA
PHB	PolyHydroxyButyrate
Cit	Citrate
Isocit	Isocitrate
AKG	2 oxoglutarate
SucCoA	Succinyl-CoA
Succ	Succinate
Fum	Fumarate
Mal	Malate
OAA	OxaloAcetate
DHAP	Dihydroxyacetone Phosphate
E4P	Erythrose 4 phosphate
X5P	Xylulose 5 phosphate
R5P	Ribose 5 Phosphate
Ru5P	Ribulose 5 Phosphate
R15BP	Ribose 1,5 Bis Phosphate
G6P	Glucose 6 phosphate
15PGL	1,5 Phospho-glucono-lactone
6PGA	6 Phospho gluconate
S7P	Sedoheptulose 7 phosphate
S17BP	Sedoheptulose 1,7 biphosphate
fbp	Fructose 1,6 BisPhosphatase
cbbF2, cbbFp	Fructose 1,6 BisPhosphatase, Sedoheptulose 1,7 bisphosphatase
fba, cbbA2, cbbAp	Fructose-bisphosphate aldolase class II
fbaB	Fructose-bisphosphate aldolase class I
tpiA	triose phosphate isomerase
gapA, cbbG2, cbbGp	Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
pgk, cbbK2, cbbKp	Phosphoglycerate kinase
cbbS2, cbbL2, cbbSp, cbbLp rbcL	Ribulose bisphosphate carboxylase small chain Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit
cbbP2, cbbPp	Phosphoribulokinase
tktA, cbbT2	Transketolase
rpe, cbbE2, cbbEp	Ribulose-phosphate 3-epimerase
pgam1, pgam2	phosphoglycerate mutase 1, phosphoglycerate mutase 2
eno	enolase
pyk1, pyk2, pyk2	pyruvate kinase
pdhA1, pdhA2, ace, bkdA1, bkdA2	Pyruvate dehydrogenase
phaA	Acetyl-CoA acetyltransferase
phaB	Acetoacetyl-CoA reductase
phaC	Poly(3-hydroxybutyrate) synthase
ppsA	Phosphoenolpyruvate synthase
ldh	L-lactate dehydrogenase
ldhA1, ldhA2	D-lactate dehydrogenase
lldD, lldA	L-lactate dehydrogenase (cytochrome)
dld	D-lactate dehydrogenase (cytochrome)
pyc	Pyruvate carboxylase
mhpf	Acetaldehyde dehydrogenase
pta	Phosphate acetyltransferase
ackA	Acetate kinase
cisY	Citrate synthase
acnA, acnB	Aconitate hydratase
icd1, icd2, icd3	Isocitrate dehydrogenase
odhA, odhB	2-Oxoglutarate dehydrogenase
sucC, sucD	Succinyl-CoA synthetase
sdhA,B,C,D	Succinate dehydrogenase
fumA, fumC	Fumarate hydratase
mdh1	Malate dehydrogenase
lutA, lutB, lutC	Complexe enzymatique utilisant le lactate

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WO 2014/205146, WO 2015/155790

Claims

Bactérie oxydant naturellement l’hydrogène et génétiquement modifiée pour produire du lactate à partir de CO₂, ladite bactérie étant génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant une lactate déshydrogénase et pour inhiber l’expression d’un opéron lut.
Bactérie selon la revendication 1, caractérisée en ce que l’inhibition de l’expression d’un opéron lut comprend l’inhibition de l’expression d’au moins un gène lutA, lutB ou lutC dudit opéron lut.
Bactérie selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l’inhibition de l’expression de l’opéron lut consiste en une délétion dudit opéron lut.
Bactérie selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que lorsque la bactérie comprend plusieurs opérons lut, l’expression d’au moins un opéron est inhibée.
Bactérie selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu’elle est génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant une lactate déshydrogénase endogène.
Bactérie selon la revendication 1 à 5, caractérisée en ce qu’elle est génétiquement modifiée pour surexprimer au moins un gène codant une lactate déshydrogénase exogène, préférentiellement dérivé d’une bactérie, d’un champignon, d’une levure ou d’un mammifère, plus préférentiellement dérivé d’une bactérie.
Bactérie selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu’elle est également génétiquement modifiée pour inhiber au moins partiellement au moins une voie de dégradation du pyruvate compétitrice de la voie de synthèse du lactate.
Bactérie selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l’expression d’au moins un gène codant une lactate ferricytochrome C reductase est au moins partiellement inhibée.
Bactérie selon l’une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu’elle est choisie parmiCupriavidussp., telle queCupriavidus necator,Hydrogenobactersp., telle queHydrogenobacter thermophilus,Rhodococcussp., telle queRhodococcus opacus, etPseudomonassp., telle quePseudomonas hydrogenothermophila.
Bactérie selon l’une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu’elle estCupriavidus necator.
Utilisation d’une bactérie définie selon l’une des revendications 1 à 10, pour la production de lactate à partir de CO₂.
Procédé de production de lactate à partir de CO₂, comprenant les étapes consistant à cultiver la bactérie selon l’une des revendications 1 à 10 en présence de CO₂comme seule source de carbone, puis à récupérer le lactate.