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WO2019225669A1 - 抗血液凝固剤、血液凝固改善装置、血液凝固改善方法、血管内皮細胞機能改善方法及び代謝改善方法 - Google Patents

抗血液凝固剤、血液凝固改善装置、血液凝固改善方法、血管内皮細胞機能改善方法及び代謝改善方法 Download PDF

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WO2019225669A1
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hydrogen
blood coagulation
improving
mitochondria
vascular endothelial
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English (en)
French (fr)
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徹 石橋
玄基 石原
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H2bank Co Ltd
Anicom Specialty Medical Institute Inc
Original Assignee
H2bank
H2bank Co Ltd
Anicom Specialty Medical Institute Inc
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K35/02—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution from inanimate materials
    • A61K35/08—Mineral waters; Sea water
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors

Definitions

  • the present invention relates to an anti-blood coagulation agent, a blood coagulation improvement device, a blood coagulation improvement method, a vascular endothelial cell function improvement method, and a metabolism improvement method comprising hydrogen gas or a mixed gas containing hydrogen gas, or water containing hydrogen molecules.
  • Hydrogen molecules are known to have a scavenger function for reactive oxygen species, and the improvement of life function by hydrogen has been considered with a focus on scavenger function.
  • the present invention relates to a method other than the scavenger function for reactive oxygen species, that is, to improve the function of mitochondria and to improve the function of hydrogen in order to improve the life function in each field of medicine, medical care, health industry, agriculture, livestock, and fisheries.
  • An object of the present invention is to provide an anti-blood coagulant, a blood coagulation improvement device, a blood coagulation improvement method, a vascular endothelial cell function improvement method and a metabolism improvement method.
  • Hydrogen molecules are very stable and do not dissociate under normal conditions in the body, but the inventors have found that hydrogen molecules dissociate into electrons and protons, especially in mitochondrial complexes I and III. By doing so, a rectifying action is given to the flow of electrons that are the source of active oxygen by backflow or stagnation.
  • the present inventors have found that administration of hydrogen to a living body can enhance mitochondrial hydrogenase activity and improve blood coagulation of the living body, and have completed the present invention.
  • the present inventors have found that administration of hydrogen to a living body brings about mitochondrial uncoupling, and as a result, it can bring about a metabolic improvement action such as an increase in body temperature, leading to the completion of the present invention. It was.
  • the present invention includes the following [1] to [10].
  • a method for improving vascular endothelial cell function comprising a step of administering water or hydrogen gas containing hydrogen molecules to a subject.
  • a method for improving metabolism comprising a step of administering a hydrogen molecule to a subject, wherein the hydrogen molecule reduces a mitochondrial membrane potential by an uncoupling action on mitochondria in the subject.
  • Hydrogen is an electron-donating molecule that supports life energy in the ancient times when oxygen is not present on the earth. Hydrogenase, which has evolved primitive life by carrying out hydrogen ion reduction and hydrogen molecule oxidation, is the mitochondrial respiratory chain. It was an evolutionary link to Complex I and was an energy source.
  • RET reverse electron transport
  • the present invention and the new knowledge behind it can clarify the biological effects of hydrogen intake more clearly, and can contribute to a new method of taking hydrogen. More importantly, the creation of the pathological state of the part that forms the basis of energy metabolism of life, which is the electron transfer function of mitochondria, which has been difficult to control from the outside, has been important. Since it is also useful for medicine, its industrial effectiveness is immeasurable.
  • the present invention is extremely effective as a medical or health promotion method with no side effects, and provides basic information for future drug discovery. In addition to health benefits, its industrial effectiveness is measured. I don't know.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of Example 8.
  • the anticoagulant of the present invention is composed of gaseous hydrogen molecules (hydrogen gas), a mixed gas containing the same, or water containing hydrogen gas.
  • hydrogen gas can be administered to a subject (or animal) using a conventionally known hydrogen gas supply device.
  • Administration specifically includes suction of a hydrogen molecule-containing gas and percutaneous absorption.
  • the dose of hydrogen gas is preferably 70 to 350 mg per day per kg of living body, more preferably 100 to 200 mg.
  • the containing gas other than hydrogen is not particularly limited as long as it is not harmful to the living body, and examples thereof include oxygen and air.
  • a mixed gas of hydrogen gas, helium gas, and oxygen gas has been put into practical use since the 1990s.
  • Water containing hydrogen gas can be administered to a living body as it is for drinking.
  • the concentration is not particularly limited, but is preferably 1.6 ppm to 8 ppm, and more preferably 7 ppm to 8 ppm.
  • the water containing hydrogen gas may contain conventionally known components that are not toxic even if administered to a living body, such as salts and nutrients.
  • the anticoagulant of the present invention can reduce von Willebrand factor activity.
  • von Willebrand factor (VWF) is a high molecular weight glycoprotein produced from vascular endothelial cells and bone marrow megakaryocytes, forms a multimeric structure, and has a molecular weight ranging from about 500 kDa to as large as 20,000 kDa.
  • VWF is a factor that plays an important role in primary hemostasis, and has a function of adhering platelets to the subendothelial connective tissue at the site of vascular injury. VWF exists as a multimer and varies in size, but higher molecular weight multimers have higher hemostatic ability. VWF also functions to bind to blood coagulation factor VIII (FVIII) and stabilize FVIII in plasma. Decreasing VWF factor activity means making blood difficult to clot.
  • FVIII blood coagulation factor VIII
  • the anticoagulant of the present invention can prolong blood prothrombin time.
  • Prothrombin is a factor II of the blood clotting factor that hardens when a substance called thromboplastin is added. Therefore, the prothrombin time is defined as the time taken to add thromboplastin to plasma and measure the time until it solidifies.
  • the anticoagulant of the present invention can increase the partial thromboplastin time of blood. Partial thromboplastin time is a test that measures the intrinsic blood clotting ability. In the process of blood coagulation, there are pathways called the intrinsic system and pathways called the extrinsic system, and many blood coagulation factors are involved.
  • the anticoagulant of the present invention can also be expected to prevent the occurrence of diseases such as thromboembolism, thrombosis, arteriosclerosis such as cerebral infarction and myocardial infarction by suppressing blood coagulation.
  • the anticoagulant of the present invention preferably improves blood coagulation by enhancing mitochondrial hydrogenase activity.
  • the blood coagulation improving apparatus of the present invention is characterized by supplying hydrogen gas or a mixed gas containing the same to a subject, and supplying hydrogen gas or a mixed gas containing the same to a subject (human or animal).
  • a conventionally known medical hydrogen gas (hydrogen mixed gas) supply device can be used.
  • a conventionally known medical hydrogen gas (hydrogen mixed gas) supply device for example, a hydrogen gas generation device of Ecomo International Co., Ltd. may be mentioned.
  • the blood coagulation method of the present invention is characterized by comprising a step of administering water or hydrogen gas containing hydrogen molecules to a subject.
  • the method for improving vascular endothelial cell function of the present invention comprises a step of supplying hydrogen to a subject (referred to as a human or an animal), and the generation of active oxygen by the hydrogen molecule via the rectifying action of electrons in mitochondria. It suppresses vascular endothelial cell function by inhibiting mitochondrion or protects mitochondria. Improvement of vascular endothelial cell function can be evaluated by Reactive® Hyperemia® Index (Reactive Hyperemia Index, RHI).
  • RHI reflects blood flow responsive vasodilator function. That is, the hydrogen molecule exerts an effect of rectifying mitochondrial electrons, dilates blood vessels, and increases blood flow.
  • Mitochondria convert energy from food mainly into the form of NADH or FADH 2 , and in particular, electrons taken from NADH are transferred to oxygen via an electron transport system including complex I and reduced to water, and at the same time, protons sandwich the membrane. It is an energy converter that drives the ATP synthesizer (complex V) by creating a concentration gradient.
  • Electron flow from NADH to oxygen is in the forward direction of normal respiration (forward electron transport (FET)), but when cells fall into hypoxia due to blood flow failure or ischemia, for example, succinic acid
  • FET forward electron transport
  • quinol (QH 2 ) reduced from quinone (Q: Q10 in humans) flows back toward complex I, and conversely, NAD + is reduced to NADH in complex I (reverse electron transport (RET)).
  • This electron flow causes more electrons to leak than usual (electron leakage) .
  • oxygen is supplied in a large amount during reperfusion, oxygen is reduced non-enzymatically by one electron by the leaked electrons, A large amount of superoxide is produced, and as a result, hydrogen peroxide (H 2 0 2 ) and hydroxy radicals produced cause cell and tissue damage.
  • hydrogen peroxide H 2 0 2
  • hydroxy radicals produced cause cell and tissue damage.
  • vascular endothelial cells which are extremely important for vascular function, when the above reactive oxygen species are excessive, normal vasodilatory action by nitric oxide (NO) is inhibited and plays a central role in many lifestyle-related diseases It is a major cause of endothelial dysfunction.
  • NO nitric oxide
  • hydrogen H 2
  • hydrogen consists only of electrons and protons, and if protons can dissociate and supply protons and electrons in the mitochondrial electron transport system, , Will supply an unknown flow of electrons.
  • Complex I in particular, has evolved from a hydrogenase that uses hydrogen as an electron source, and the structure at its active center is particularly well preserved in evolution.
  • RET which is a problem in the ischemic state, or the generation of superoxide in the FET
  • whether hydrogen can improve the pathological active oxygen excess state by changing the flow of electrons (that is, exerting a rectifying action)
  • Example 1 For adults drinking 7 ppm hydrogen water (Ecomo International) once a day (about 500 ml) for 4 weeks, 4 weeks later, according to known methods, the adult von Willebrand factor activity, PT (prothrombin time) and PTT (partial thromboplastin time) was measured. As a result, 4 weeks after the start of drinking of hydrogen water, von Willebrand factor activity decreased by about 7%, PT (prothrombin time) increased by about 4%, and PTT (partial thromboplastin time) increased by about 5%. Before and after drinking, the adult male von Willebrand factor activity, PT (prothrombin time) and PTT (partial thromboplastin time) were all within the normal range.
  • Example 2 The effect of hydrogen on the oxidation of NADH or reduction of NAD + by mitochondria extracted from cultured human cells was investigated.
  • Conditions for RET observation 1 mM NAD + and 10 mM succinic acid as substrate, buffer (50 mM phosphoric acid (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.2 mM Q10 (ubiquinone10) 0.1 mg / ml bovine serum albumin (BSA, free of fatty acids) The mixture was allowed to react at 30 ° C. for 25 minutes, and the NADH concentration (average value per minute) was measured.
  • buffer 50 mM phosphoric acid (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.2 mM Q10 (ubiquinone10) 0.1 mg / ml bovine serum albumin (BSA, free of fatty acids
  • Example 3 In addition to the experimental conditions of Example 2 above, Strobilurin B, an inhibitor of complex III, was added to the experimental system to suppress the active oxygen generated from complex III, and then the active oxygen from complex I (superoxide dismutase (SOD ) presence, converts superoxide to H 2 0 2, was measured measurement) as H 2 0 2, although there was a 16.4 ⁇ M hydrogen absence, 1.36MyuM and about 12 minutes in the presence of hydrogen It was reduced to one. This means that under the conditions that cause RET, hydrogen suppressed the generation of active oxygen and shifted the flow of electrons to the FET side.
  • SOD superoxide dismutase
  • Example 4 To further observe the generation of active oxygen separately from the flow of electrons, it is an inhibitor of complex I, Q1 which is a water-soluble quinone, and Q10 (lipid soluble, lipid, mitochondrial membrane) And function as a carrier for electrons and protons in the electron transport system), and the same conditions as in Example 2 above were used. As a result, H 2 0 2 which was 10 ⁇ M in the absence of hydrogen became 195 ⁇ M in the presence of hydrogen. Contrary to the experiment in the presence of Q10, H 2 O 2 increased about 20 times.
  • Example 5 Furthermore, when the effect of hydrogen on the membrane potential of mitochondria was observed using the cell-permeable cationic fluorescent dye Tetramethylrhodamine Ethyl Ester (TMRE), the TMRE signal indicating the membrane potential was about 10% in the presence of hydrogen molecules. Reduced (caused uncoupling). This is thought to be due to the change in proton concentration gradient across the membrane due to redox energy released from dissociated hydrogen molecules in Complex I or complex III. For an adult who drank 7ppm hydrogen water (Ecomo International) 2 times a day (about 500ml) for about 6 months, the body temperature was measured after 6 months, and the basal body temperature was about in the normal range compared to before drinking. The temperature rose 0.5 ° C.
  • Example 6 In order to make it closer to physiological conditions as the conditions for RET observation, in the experimental system of Example 2 above, in addition to 1 mM NAD + and 10 mM succinic acid, 5 ⁇ M NADH was added as a substrate (NADH / NAD + ratio in normal cells).
  • Example 7 In the experimental system of Example 6 above, after suppressing active oxygen generated from complex III with Strobilurin B, which is an inhibitor of complex III, superoxide was added in the presence of superoxide dismutase (SOD). converted to H 2 0 2, was measured measurement) as H 2 0 2, although there was a 23 ⁇ M hydrogen absence was reduced to one 3.9 ⁇ M and about 5 minutes in the presence of hydrogen. This means that hydrogen suppressed generation of active oxygen even under the condition of increasing RET in the presence of NADH, and further shifted the electron flow to the RET side depending on the concentration of NADH.
  • SOD superoxide dismutase
  • the shift from the FET side to the RET side is such that hydrogen adjusts the direction of electron flow according to the NADH ratio and is active under both conditions. Since the generation of oxygen is suppressed, hydrogen is considered to mean that it has an electron rectifying action that suppresses electron leakage and changes the direction of flow.
  • Example 8 The improvement of RHI was measured in 32 cases of vascular endothelial dysfunction group with RHI value less than 2 (RHI ⁇ 2, placebo group 15 cases, 7 pppm hydrogen drinking group 17 cases). Seven cases of 7pppm hydrogen drinking group drink about 500ml of water containing 7ppm hydrogen per day, and placebo group drinks about 500ml of pure water per day, before drinking (initial measurement), 1h after starting drinking, 24 hours after the start of drinking (drinking twice in total), RHI was measured after 2 weeks. RHI was measured using Nihon Kohden's Endpad 2000 (Itamar Medical) according to the specifications. From the initial measurement (baseline), data at 1h, 24h and 2 weeks are shown in FIG.
  • Vascular endothelial cells are cells that line blood vessels, but are actually the largest endocrine organs in the human body and have a total weight of about 1.5 kg. In order to eradicate lifestyle-related diseases, it can be said that the organization must first ensure healthy functions.
  • RHI reactive hyperemia index
  • vascular endothelial cells Independent of risk factors in lifestyle-related diseases such as metabolic syndrome, it is being recognized as a factor that can predict human life prognosis, and is used in medical institutions around the world as a powerful medical examination tool.
  • Populations with low RHI have been found to be at extremely high risk for future cardiovascular disease. The only way to improve vascular function in this population is to exercise and diet control except for drugs. It is important to elucidate the role of hydrogen in low-RHI populations at high risk of cardiovascular disease as a non-invasive improvement method without side effects.
  • Mitochondrial respiratory activity was measured by mixing hydrogen molecules in the mitochondrial respiratory chain that inhibited the reduction of oxygen to water in the presence of cyanide.

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Abstract

本発明は、医学・医療・健康産業・農業・畜産・水産業の各分野において、水素分子が生命機能を改善させるための、活性酸素種に対するスカベンジャー機能以外の方法及びそれを利用したミトコンドリア機能改善作用および抗血液凝固剤、血液凝固改善装置、血液凝固改善方法及び血管内皮細胞機能改善方法を与えることを目的とする。　水素ガスからなることを特徴とする抗血液凝固剤、または、水素分子を含む水からなることを特徴とする抗血液凝固剤である。水素分子が、ミトコンドリアのハイドロゲナーゼ活性を亢進させることにより、ミトコンドリア機能改善させ、血液凝固を改善する抗血液凝固剤であることが好ましい。

Description

抗血液凝固剤、血液凝固改善装置、血液凝固改善方法、血管内皮細胞機能改善方法及び代謝改善方法
　本発明は、水素ガス又は水素ガスを含む混合ガス、又は水素分子を含む水からなる抗血液凝固剤、血液凝固改善装置、血液凝固改善方法、血管内皮細胞機能改善方法及び代謝改善方法に関する。
　水素分子は、活性酸素種に対するスカベンジャー機能を有することが知られており、水素による生命機能の改善作用もスカベンジャー機能を中心に考えられてきた。
　ガス状分子である水素を摂取する方法としては、水などの生体適応液に水素分子を含有させて飲むことが一般的であるが、他にも、水素分子含有気体の吸引や、水素分子含有液体を用いて直接的に電子供与を可能とする点滴や経皮吸収などの方法がある。
　水素による生命機能改善作用は、近年ますます注目され、特にヒトおよびペットの健康に不可欠となりつつある。しかしながら、これまでの水素の生命作用のほとんどは、スカベンジャー機能、すなわち、ヒドロキシラジカルやペルオキシナイトライトなど、極めて反応性が高い活性酸素種への電子供与によって説明されてきた（例えば、非特許文献１、２）。その範囲においては、水素分子の生命作用の一部しか説明できず、ひいては水素分子の適用が結果的に制限され、あるいはその生命作用の理解という重要な側面が損なわれてきた。
Vascular Health and Risk Management, 2014,10, 591-597 Current Pharmaceutical Design, 2013, 19, 6375-6381
　本発明は、医学・医療・健康産業・農業・畜産・水産業の各分野において、水素分子が生命機能を改善させるための、活性酸素種に対するスカベンジャー機能以外の方法すなわちミトコンドリアの機能改善及びそれを利用した抗血液凝固剤、血液凝固改善装置、血液凝固改善方法、血管内皮細胞機能改善方法及び代謝改善方法を与えることを目的とするものである。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、水素が、活性酸素種に対するスカベンジャー機能以外の機能を有することを見いだし、本発明を完成するに至った。
　脳梗塞や心筋梗塞によるダメージは命に関わるが、その時に、虚血状態のミトコンドリアに再灌流とともに酸素が供給されると、活性酸素が爆発的に発生し、予後の増悪を招くことが分かりつつある。分子レベルでは、本来はミトコンドリアの呼吸鎖において、complex IからIVへと順方向に電子が伝達される流れが、例えば虚血状態からの再灌流の際に生じるRET(reverse electron transport)では電子がcomplex Iへと逆流し、それによって、活性酸素が爆発的に発生すると考えられている。本発明者等は、水素が、ミトコンドリア、特に電子伝達系に作用して、この事象を抑制しうることを見いだした。
　水素分子は非常に安定で、分子は生体内の通常の状態では解離しないが、本発明者等が見いだしたところによれば、特にミトコンドリアのcomplex I とIIIにおいて、水素分子が電子とプロトンに解離することによって、逆流あるいは停滞することによって活性酸素の発生源となっている電子の流れに整流作用を与えるものである。
　また、水素によるミトコンドリアの電子の流れの整流作用は、活性酸素の発生自体を抑制する結果として、生体の血管内皮細胞機能を改善することが分かった。
　さらに、本発明者等は、水素を生体に投与すると、ミトコンドリアのハイドロゲナーゼ活性を亢進させることができること、及び、生体の血液凝固性を改善できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
　さらに、本発明者等は、水素を生体に投与すると、ミトコンドリアのuncoupling（脱共役）をもたらし、結果として、体温の上昇などの代謝改善作用をもたらしうることを見いだし、本発明を完成するに至った。
　本発明は、以下の［１］～［１０］である。
［１］水素ガス又は水素ガスを含む混合ガスからなることを特徴とする抗血液凝固剤。
［２］水素分子を含む水からなることを特徴とする抗血液凝固剤。
［３］水素分子が、ミトコンドリアのハイドロゲナーゼ活性を亢進させることにより血液凝固を改善する［１］または［２］の抗血液凝固剤。
［４］水素ガス又は水素ガスを含む混合ガスを対象に供給することを特徴とする血液凝固改善装置。
［５］水素分子が、ミトコンドリアのハイドロゲナーゼ活性を亢進させることにより血液凝固を改善する［４］の血液凝固改善装置。
［６］水素分子を含む水または水素ガスを対象に投与する工程を備えることを特徴とする血液凝固改善方法。
［７］水素分子を含む水または水素ガスを対象に投与する工程を備えることを特徴とする血管内皮細胞機能改善方法。
［８］水素分子が、ミトコンドリアにおける電子の整流作用を介することで活性酸素の発生を抑制することにより血管内皮細胞機能を改善する［７］の血管内皮細胞機能改善方法。
［９］水素分子が、ミトコンドリアにおける電子の整流作用を介することにより活性酸素発生を抑制し、ミトコンドリアの機能を改善する、あるいはミトコンドリアを保護するミトコンドリアを保護するミトコンドリアの保護方法。
［１０］水素分子を対象に投与する工程を有し、水素分子が、対象内において、ミトコンドリアに対するuncoupling作用によりミトコンドリア膜電位を低下させる、代謝改善方法。
　水素は、地球上に酸素が存在しない太古における生命エネルギーを支えた電子供与分子であり、水素イオン還元および水素分子酸化を担うことで原始生命を進化させてきたハイドロゲナーゼは、ミトコンドリア呼吸鎖におけるコンプレックスIと進化上リンクしており、エネルギー源であった。水素によるミトコンドリアのハイドロゲナーゼ活性の亢進作用は、ヒトを含む特に高等生物において、その生命機能の根源である細胞呼吸の機能不全、ミトコンドリアの病的状態における電子の逆流や漏れ(electron leakage)、特にRET(reverse electron transport)を、水素分子がミトコンドリア内において電子とプロトンに解離することによって整流作用を及ぼすことによって健康に寄与するという上記作用に関連するものであると考えられる。
　本発明の水素分子によるミトコンドリアの電子伝達系における水素分子の整流作用、ハイドロゲナーゼ活性の亢進作用、血液凝固の改善作用およびそれを利用した血管内皮細胞機能改善剤、血液凝固改善剤、装置は、従来説明されてきた水素分子による活性酸素種のスカベンジャーとしての機能では説明することができない新たな作用・用途である。
　本発明とその背景となる新規知見は、水素摂取による生体作用をより明快に解明でき、新たな水素の摂取方法などに寄与することができる。さらに重要なことは、これにより、これまで細胞外からのコントロールが困難であったミトコンドリアが担う電子伝達機能という生命のエネルギー代謝の根源をなす部分について、その病的状態を健全化するための創薬にも役立つので、その産業上の有効性は計り知れない。
　本発明は、副作用のない医療あるいは健康増進方法として、極めて有効であり、今後の創薬にとって基本的な情報を与えるものであり、健康上の利点のみならず、その産業上の有効性は計り知れない。
実施例８の結果を表すグラフ図である。
　本発明の抗血液凝固剤は、ガス状の水素分子（水素ガス）又はそれを含む混合ガス、又は水素ガスを含む水からなるものである。
　水素ガス又は水素ガスを含む混合ガスの場合、対象者（又は動物）に対して、従来公知の水素ガス供給装置を用いて水素ガスを投与することができる。投与は、具体的に水素分子含有気体の吸引や、経皮吸収などがある。水素ガスの投与量は、生体1kgあたり、1日に70～350mgが好ましく、100～200mgがより好ましい。混合ガスの場合、生体にとって有害でなければ、水素以外の含有ガスは特に限定されず、例えば酸素や大気などが挙げられる。深海潜水においては、水素ガスとヘリムガス、酸素ガスの混合気体が1990年代よりすでに実用されている。
　水素ガスを含む水は、そのまま飲用に供することで生体に投与することができる。水素ガスを水に含ませる場合、含有濃度は特に限定されないが、好ましくは、1.6ppm～8ppmであり、より好ましくは7ppm～8ppmである。
　また、水素ガスを含む水には、塩や栄養分など生体に投与しても有毒ではない従来公知の成分を含んでいてもよい。
　本発明の抗血液凝固剤は、von Willebrand 因子活性を減少させることができる。von Willebrand因子（VWF）は血管内皮細胞や骨髄巨核球から産生される高分子量の糖蛋白質であり、マルチマー構造を形成し、分子量は約500ｋDaから大きいもので20,000kDaに及ぶ。VWFは、一次止血において重要な役割を果たす因子であり、血管の損傷部位において血小板を内皮下結合組織へ粘着させる機能を有する。VWFはマルチマーとして存在し、大きさは様々であるが、高分子量のマルチマーほど止血能が高い。またVWFは血液凝固第VIII因子（FVIII）と結合し血漿中のFVIIIを安定化させる機能も有する。VWF因子活性を下げるということは血液を凝固しにくくさせるということである。
　また、本発明の抗血液凝固剤は、血液のプロトロンビン時間を長くすることができる。プロトロンビンは血液凝固因子の第II因子で、トロンボプラスチンという物質を加えると固まる。そこで血漿にトロンボプラスチンを加え、固まるまでの時間を測定したものが、プロトロンビン時間と定義される。また、本発明の抗血液凝固剤は、血液の部分トロンボプラスチン時間を長くすることができる。部分トロンボプラスチン時間は、内因系の血液凝固能力を測定する検査である。血液凝固の過程には、内因系といわれる経路と、外因系といわれる経路があり、それぞれ多くの血液凝固因子が関わっている。
　本発明の抗血液凝固剤は、血液の凝固を抑制することにより、脳梗塞や心筋梗塞なのどの塞栓症や血栓症、動脈硬化といった病気の発生を予防することも期待できる。
　本発明の抗血液凝固剤は、好ましくはミトコンドリアのハイドロゲナーゼ活性を亢進させることにより血液凝固を改善するものである。
　本発明の血液凝固改善装置は、水素ガス又はそれを含む混合ガスを対象に供給することを特徴とするものであり、水素ガス又はそれを含む混合ガスを対象（ヒトや動物）に供給することができれば、構成は特に限定されず、従来公知の医療用水素ガス（水素混合ガス）供給装置を用いることができる。従来公知の医療用水素ガス（水素混合ガス）供給装置としては、例えば、エコモ・インターナショナル社の水素ガス発生装置が挙げられる。
　また、本発明の血液凝固方法は、水素分子を含む水または水素ガスを対象に投与する工程を備えることを特徴とするものである。
　本発明の血管内皮細胞機能改善方法は、対象（ヒト又は動物をいう。）に水素を供給する工程を備えるものであり、水素分子が、ミトコンドリアにおける電子の整流作用を介することで活性酸素の発生を抑制することにより血管内皮細胞機能を改善する、あるいはミトコンドリアを保護するものである。血管内皮細胞機能の改善は、Reactive Hyperemia Index（反応性充血指数、RHI）により評価することができる。RHIは、血流反応性血管拡張機能を反映するものである。すなわち、水素分子によって、ミトコンドリアの電子の整流作用効果が奏され、血管が拡張し、血流量が増大する。
　ミトコンドリアは、食物からのエネルギーを主にNADHあるいはFADH2の形に変換し、中でもNADHから取り出した電子をcomplex Iを含む電子伝達系を介し酸素に渡し水へと還元すると同時に膜を挟んでプロトンの濃度勾配を作ることにより、ATP合成装置(complex V)を駆動させるエネルギー変換装置である。
　NADHから酸素への電子の流れが通常の呼吸における順方向(forward electron transport (FET))であるが、血流不全や虚血などによって細胞が低酸素状態(hypoxia)に陥ると、例えばコハク酸などが上昇し、complex IIにおいてキノン（Q:ヒトではQ10）から還元されたキノール(QH2)がcomplex Iの方に逆流し、逆にNAD+がcomplex IにおいてNADHに還元される(reverse electron transport(RET))。この電子の流れにより、通常よりも多くの電子が漏れることになり(electron leakage)、例えば再灌流時に、酸素が多く供給されると、漏れた電子によって非酵素的に酸素が一電子還元され、スーパーオキサイドが多く生じ、その結果生産される過酸化水素(H202)やヒドロキシラジカルによって、細胞や組織障害を引き起こす。
　血管機能に極めて重要である血管内皮細胞においては、上記活性酸素種が過剰になると、一酸化窒素(NO)による正常な血管拡張作用が阻害され、多くの生活習慣病で中心的な役割を果たす内皮細胞機能不全の大きな原因となる。
　本発明においては、例えば水素（H2）を用いているが、水素は電子とプロトンのみからなり、プロトンがミトコンドリアの電子伝達系において解離しプロトンと電子を供給することができれば、電子伝達系において、これまで知られていない電子の流れを供給することになる。特にcomplex Iは、水素を電子供給源としていたヒドロゲナーゼから進化しており、特にその活性中心における構造は進化上よく保存されている。虚血状態において問題となる上記RETあるいは、FETにおけるスーパーオキサイドの発生に対して、水素が電子の流れを変える（つまり整流作用を及ぼす）ことによって、病的な活性酸素過剰状態を改善できるかについて、以下の実験において実施例として得ることができた。
　このことは、水素と同様に電子およびプロトンの両者を適切に供与できる分子が、ミトコンドリアの電子伝達系において優れた整流機能を持つ分子として健康に寄与できることを意味する。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
［実施例１］
　7ppm水素水(エコモ・インターナショナル社)を1日１本（約500ｍｌ）、４週間にわたり飲用した成人について、４週間後、公知の方法に従い、当該成人のvon Willebrand 因子活性、PT(プロトロンビン時間）及びPTT(部分トロンボプラスチン時間）を測定した。
　その結果、水素水の飲用を始めてから４週間後に、von Willebrand 因子活性が約７％減少し、PT(プロトロンビン時間）が約4%延長、PTT(部分トロンボプラスチン時間）が約5%延長した。飲用前後において、この成人男性のvon Willebrand 因子活性、PT(プロトロンビン時間）及びPTT(部分トロンボプラスチン時間）はいずれも正常値範囲内であった。
［実施例２］
　ヒト培養細胞から抽出したミトコンドリアによるNADHの酸化あるいはNAD+の還元に対する水素の影響を調べた。RETを観察する条件として、1mM NAD+および10mM コハク酸を基質として、buffer（50mM リン酸(pH 7.5)、1mM EDTA、0.2mM Q10 (ubiquinone10) 0.1 mg/ml bovine serum albumin(BSA、脂肪酸を含まないもの)内にて、30℃ 25分反応させ、NADH濃度（毎分の平均値）を測定した。
　水素非存在下で306 pmol/mlのNADHが検出されたが、水素(約25μM)の存在下では、165pmol/mlとNADH濃度が減少すなわちNADHが酸化された。
　このことは水素がRETの条件下において電子の流れをFETに傾かせたことを意味する。
［実施例３］
　上記実施例２の実験条件に加えて、complex IIIのインヒビターであるStrobilurin Bを実験系に添加し、complex IIIから発生する活性酸素を抑制した上で、complex Iからの活性酸素(superoxide dismutase (SOD)存在下、スーパーオキサイドをH202に変換し、H202として測定)を測定したところ、水素非存在下で16.4μMであったが、水素存在下で1.36μMと約12分の一に減少していた。
　このことは、RETを引き起こす条件下において、水素が活性酸素の発生を抑制するとともに、電子の流れをFET側にシフトさせたことを意味する。
［実施例４］
　電子の流れとは別に活性酸素の発生についてさらに観察するため、complex Iのインヒビターであり、水溶性のキノンであるQ1を本来の電子伝達体であるQ10（脂溶性で、脂質であるミトコンドリア膜内を移動し、電子伝達系における電子とプロトンの運搬体として機能する）の代わりに用いた以外は上記実施例２と同様の条件とした。その結果、水素非存在下で10μMであったH202が、水素存在下で195μMとなった。上記Q10存在下における実験とは逆にH2O2が約20倍に上昇した。
　これは、解離した水素分子から供与された電子が、complex IIIの主たる活性酸素発生部位であるQo部位において酸素を一電子還元しスーパーオキサイドを発生させたことと、complex Iのキノン結合部位に、電子受容体ではあるが完全に還元されて膜内へと移動できない水溶性のQ1がセミキノンラジカルとなり、スーパーオキサイドを発生させたものと考えられる。このことから、実際に水素はcomplex Iのキノン結合部位あるいはcomplex IIIのキノン結合部位(Qo)において解離し、電子を放出することが示唆された。逆にQ10など生理的にミトコンドリアにて電子運搬隊として電子を受け取る分子が存在する場合には、水素が活性酸素を生じさせない電子供与体であることを意味する。
［実施例５］
　さらに、細胞浸透性陽イオン蛍光色素Tetramethylrhodamine Ethyl Ester(TMRE)を用いてミトコンドリアの膜電位に対する水素の影響を観察したところ、膜電位を示すTMREのシグナルが、水素分子存在下にて、約10%低下した(uncouplingが引き起こされた)。Complex I あるいはcomplex IIIにおいて解離した水素分子から放出された酸化還元エネルギーによって、膜を挟んだプロトンの濃度勾配が変化したことによると考えられる。
　7ppm水素水(エコモ・インターナショナル社)を1日2本（約500ｍｌ）、約６ヶ月にわたり飲用した成人について、６ヶ月後、体温を測定したところ、基礎体温が飲用前に比べ、正常範囲において約0.5℃上昇していた。これは、上記水素分子による脂肪細胞ミトコンドリアへのuncoupling作用によるものと思われた。
　このことは、膜電位のuncoupling作用を意味し、代謝改善において重要な役割を果たすuncoupling protein 脱共役タンパク質に近い作用を水素がもたらすことを意味する。最近、褐色脂肪細胞や、ベージュ脂肪細胞による脂肪消費とそれに伴う熱産生及び代謝改善が、生活習慣病予防などに重要であることがわかってきた。
　水素がuncouplingを引き起こす条件としては、ミトコンドリアのハイドロゲナーゼ活性が起動される際に、水素が作用した時点のミトコンドリアの膜電位によって影響を受け、例えば、complex IにおいてNADHから電子を伝達するFe-Sクラスターの列の、最終電子受容クラスターであるN2 clusterの酸化還元電位は、プロトン勾配による電気化学ポテンシャル（すなわち膜電位）に影響されて変化することが影響すると考えられる。水素がuncouplingを引き起こす機序としては、作用時の膜電位およびcomplex IのN2クラスターあるいはcomplex IIIにおけるシトクロムCおよびRieske Fe-Sクラスター、hame bL、haem bHなどの酸化還元電位との関係性が重要であると考えられる。
［実施例６］
　RETの観察に用いる条件として、より生理的条件に近づけるため、上記実施例２の実験系について、1mM NAD+および10mM コハク酸に加えさらに、5μM NADHを基質として加え（通常細胞内ではNADH/ NAD+比は1/100以下である）、buffer（50mM リン酸(pH 7.5)、1mM EDTA、0.2mM Q10 (ubiquinone10)0.1 mg/ml bovine serum albumin(BSA、脂肪酸を含まないもの)内にて、30℃ 25分反応させ、NADH濃度（毎分の平均値）を測定した。水素非存在下で282 pmol/mlのNADHが検出されたが、水素の存在下(約25μM)では、1118 pmol/mlとNADH濃度が増加すなわちNAD+がNADHに還元された。
　このことは水素がRETの条件下においても、NADHの濃度によっては、電子の流れをさらにRETに傾かせたことを意味する。
［実施例７］
　上記実施例６の実験系において、complex IIIのインヒビターであるStrobilurin Bにてcomplex IIIから発生する活性酸素を抑制した上で、complex Iからの活性酸素(superoxide dismutase (SOD)存在下、スーパーオキサイドをH202に変換し、H202として測定)を測定したところ、水素非存在下で23μMであったが、水素存在下で3.9μMと約5分の一に減少していた。
　このことは、NADH存在下、RETを増加させる条件下においても、水素が活性酸素の発生を抑制するとともに、電子の流れをNADHの濃度によってはさらにRET側にシフトさせたことを意味する。上記実施例２のNADHを含まない条件下での結果と比べると、FET側からRET側にシフトしており、水素はNADHの比率に応じで電子が流れる方向を調整しかつ両条件下において活性酸素の発生を抑制していることから、水素は電子の漏れを抑制しかつ流れの方向を変換する電子の整流作用を有することを意味すると考えられる。
［実施例８］
　RHI値が２未満の血管内皮機能不良群32例（RHI<2, プラセボ群15例、7pppm水素飲用群17例）のRHIの改善を測定した。7pppm水素飲用群17例は、７ｐｐｍの水素が含まれる水を１日あたり約500ｍｌ飲用し、プラセボ群は純水を１日あたり約500ｍｌ飲用し、飲用前（初回測定）、飲用開始後１ｈ、飲用開始後２４ｈ（計２回飲用）、２週間経過時のRHIを測定した。RHIの測定は、日本光電のエンドパット2000(Itamar Medical社製)を用いて、その仕様書に従って行った。初回測定（baseline）より、１h、２４h、２週間時点でのデータを図１に示す。
　測定の結果、血管内皮機能不良群32例(RHI値<２)における7ppm水素水飲用によるRHI改善は、２週間の継続摂取により有意に認められた。末梢細血管内皮細胞に対する7ppm水素水継続飲用の意義として、RHI値不良群、すなわち、心・血管疾患の比較的ハイリスクな群に対して血管内皮機能を改善する可能性が明らかとなった。
　血管内皮細胞は、血管を裏打ちする細胞であるが、実は人体最大の内分泌器官であり総重量約1.5kg にもなる。生活習慣病の撲滅のためには、第一に健康的機能を確保しなければならない組織と言える。
　非侵襲的なエンドパット検査の指尖3D脈波から得られるRHI(reactive hyperemia index)は、末梢血管における内皮細胞機能を反映している。メタボリックシンドロームなどの生活習慣病におけるリスクファクターとは独立に、ヒトの生命予後を予測できるファクターとして認識されつつあり、強力な健診ツールとして世界の医療機関で使用されている。
　RHIが低値である集団は、将来心血管疾病に罹患するリスクが極めて高いことが明らかになっている。この集団における血管機能を改善する方法としては、drugを除くと運動や食餌のコントロールのみしかないのが現状である。副作用のない非侵襲的改善方法として、水素が心臓血管疾患への罹患リスクが高いRHI低値集団に果たす役割を明らかにすることは重要である。
［実施例９］
　シアン化合物存在下、酸素の水への還元を阻害したミトコンドリア呼吸鎖において、水素分子を混入させることによりミトコンドリアの呼吸活性が測定された。
［実施例１０］
　シアン化合物存在下、酸素の水への還元を阻害したミトコンドリア呼吸鎖において、水素分子を混入させることによりミトコンドリア・コンプレックスIIIの呼吸活性が測定された。
 
 

Claims (10)

  1. 　水素ガス又は水素ガスを含む混合ガスからなることを特徴とする抗血液凝固剤。
  2. 　水素分子を含む水からなることを特徴とする抗血液凝固剤。
  3. 　水素分子が、ミトコンドリアのハイドロゲナーゼ活性を亢進させることにより血液凝固を改善する請求項１または２記載の抗血液凝固剤。
  4. 　水素ガス又は水素ガスを含む混合ガスを対象に供給することを特徴とする血液凝固改善装置。
  5. 　水素分子が、ミトコンドリアのハイドロゲナーゼ活性を亢進させることにより血液凝固を改善する請求項４記載の血液凝固改善装置。
  6. 　水素分子を含む水または水素ガスを対象に投与する工程を備えることを特徴とする血液凝固改善方法。
  7. 　水素分子を含む水または水素ガスを対象に投与する工程を備えることを特徴とする血管内皮細胞機能改善方法。
  8. 　水素分子が、ミトコンドリアにおける電子の整流作用を介することで活性酸素の発生を抑制することにより血管内皮細胞機能を改善する請求項７記載の血管内皮細胞機能改善方法。
  9. 　水素分子が、ミトコンドリアにおける電子の整流作用を介することにより活性酸素発生を抑制し、ミトコンドリアの機能を改善する、あるいはミトコンドリアを保護するミトコンドリアの保護方法。
  10. 　水素分子を対象に投与する工程を有し、水素分子が、対象内において、ミトコンドリアに対するuncoupling作用によりミトコンドリア膜電位を低下させる、代謝改善方法。
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