[go: up one dir, main page]

WO2019224467A1 - Système de culture cellulaire en bioréacteur - Google Patents

Système de culture cellulaire en bioréacteur Download PDF

Info

Publication number
WO2019224467A1
WO2019224467A1 PCT/FR2019/051144 FR2019051144W WO2019224467A1 WO 2019224467 A1 WO2019224467 A1 WO 2019224467A1 FR 2019051144 W FR2019051144 W FR 2019051144W WO 2019224467 A1 WO2019224467 A1 WO 2019224467A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
bioreactor
microcompartments
microcompartment
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2019/051144
Other languages
English (en)
Inventor
Maxime FEYEUX
Kevin ALESSANDRI
Pierre Nassoy
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Bordeaux
Institut dOptique Graduate School
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Bordeaux
Institut dOptique Graduate School
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to CA3101003A priority Critical patent/CA3101003A1/fr
Priority to US17/057,143 priority patent/US20210123013A1/en
Priority to EP19733852.8A priority patent/EP3797150A1/fr
Priority to KR1020257009299A priority patent/KR20250044479A/ko
Priority to BR112020023707-8A priority patent/BR112020023707A2/pt
Priority to KR1020207036522A priority patent/KR20210011975A/ko
Priority to CN201980034566.7A priority patent/CN112424333A/zh
Priority to SG11202011501XA priority patent/SG11202011501XA/en
Priority to JP2020565372A priority patent/JP2021524253A/ja
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Bordeaux, Institut dOptique Graduate School filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority to AU2019273006A priority patent/AU2019273006B2/en
Priority to MX2020012412A priority patent/MX2020012412A/es
Publication of WO2019224467A1 publication Critical patent/WO2019224467A1/fr
Priority to IL278775A priority patent/IL278775A/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to JP2025092385A priority patent/JP2025128230A/ja
Priority to US19/233,809 priority patent/US20250304909A1/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/06—Hydrolysis; Cell lysis; Extraction of intracellular or cell wall material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • the invention relates to cell culture systems in a bioreactor.
  • the system according to the invention can be used for the production of cells of interest, cell sets (organoids, tissues) and / or the production of molecules of interest, or complex molecular assemblies (components of extracellular matrices, cell organelles, antibodies, vaccines, exosomes, viroids), or other material of interest derived from cells or produced by cells cultured in such systems.
  • Bioreactor cell culture systems are of growing interest to the pharmaceutical industry, among others. Indeed, eukaryotic cells are increasingly used as a therapeutic tool, particularly in cell and tissue therapy, and as a bioproduction tool of molecules of interest, since protein fractions (insulin, antibodies, etc. .), through protein complexes, lipids and sugars from cells or cell organelles, extracellular vesicles and exosomes, to viral derivatives (for the production of vaccines in particular). Bioreactor cell culture systems make it possible to mass culture these cells and thus meet the needs of cells and / or molecules of interest on an industrial scale.
  • the inventors have discovered that it is possible to provide a culture space within microcompartments delimited by an outer layer of hydrogel for culturing a large number of cells within a bioreactor. .
  • the cell niche of interest is thus surrounded by a hydrogel shell, which advantageously infiltrates the nutrients and exfiltrates the proteins and metabolites but retains elements whose size exceeds 150 KDa (extracellular matrix, exosomes, viral particles, cells).
  • the flow through the bioreactor can be as strong as the hydrogel shell can support it.
  • the hydrogel shell of cellular microcompartments contrary to existing culture systems, preserves the cells from mechanical constraints related to collisions and prevents fusions of multicellular elements (aggregates, micro-carriers) that exist during suspension culture. liquid, and which cause problems of reproducibility by varying the local conditions felt by the cells (diffusion distance in the middle, mechanical stresses).
  • the microcompartments are suspended in the bioreactor, which allows access to the culture medium and diffusion in homogeneous microcompartments, as well as good convection.
  • the hydrogel shell since the cell niche is protected by the hydrogel shell, it is possible to cultivate the most fragile cell types under optimal yield conditions with low cell death and a well-controlled phenotype.
  • each microcompartment comprises a single cellular niche.
  • a given hydrogel shell surrounds a single cell niche.
  • the outer layer of microcompartments being hydrogel, it can easily be dissolved to recover the cells after production.
  • the subject of the invention is therefore a bioreactor cell culture system comprising a closed chamber containing a plurality of cellular microcompartments, in which the microcompartments each comprise an outer layer of hydrogel forming a cavity containing a set of self-organized cells and the extracellular matrix. or an extracellular matrix substitute.
  • an outer layer of hydrogel surrounds a set of cells.
  • the hydrogel layer forms a hollow capsule, providing a cavity containing the set of cells.
  • the hydrogel capsule contains a single set of cells.
  • the plurality of cellular microcompartments is suspended in the enclosure of the bioreactor. More particularly, microcompartments float in the culture medium contained in the enclosure of the bioreactor.
  • the subject of the invention is also the use of such a bioreactor cell culture system, comprising a closed chamber, for the production and / or amplification of cells of interest.
  • the amplification is advantageously a factor of 2 to 100,000 between each pass. This amplification factor corresponds to the number of living cells harvested after amplification, divided by the number of living cells seeded.
  • the subject of the invention is also the use of such a bioreactor cell culture system for the production of molecules of interest and / or complex molecular assemblies, such as components of extracellular matrices, cellular organelles, antibodies, vaccines, exosomes, viroids, etc., said molecules and / or assemblages being excreted by the microcompartment cells out of said microcompartment into the culture medium, or conversely accumulated inside the microcompartment for a subsequent harvest.
  • molecules of interest and / or complex molecular assemblies such as components of extracellular matrices, cellular organelles, antibodies, vaccines, exosomes, viroids, etc.
  • the subject of the invention is also a process for producing organoids or cells of interest comprising the steps according to which:
  • microcompartments introducing a plurality of cellular microcompartments into a bioreactor, comprising a closed chamber, said microcompartments each comprising an outer layer of hydrogel encapsulating cells and extracellular matrix or an extracellular matrix substitute;
  • the microcompartment is cultured under conditions allowing the multiplication of the cells inside the microcompartments, and / or the self organization of the cells into organoids; the cellular microcompartments are recovered;
  • the hydrogel layer is hydrolyzed to recover the organoids or the cells of interest.
  • the invention also relates to a method for producing differentiated cells from multipotent, pluripotent or totipotent cells comprising the steps according to which:
  • microcompartments each comprising an outer layer of hydrogel encapsulating multipotent, pluripotent or totipotent cells and extracellular matrix or an extracellular matrix substitute;
  • the microcompartment is cultivated under conditions allowing the multiplication of the cells inside the microcompartment, and / or the differentiation in one or more cell types of interest;
  • the hydrogel layer is hydrolyzed to recover the cell type (s) of interest.
  • the inventors have discovered that it is possible and particularly advantageous to cultivate cells within a reactor comprising a closed enclosure, by keeping the cells inside an outer crosslinked hydrogel capsule. More specifically, the inventors have developed cell microcompartments each comprising an outer layer of hydrogel encapsulating a set of self-organized cells and the extracellular matrix or an extracellular matrix substitute. According to the invention, the cellular microcompartments are suspended in the bioreactor.
  • the term "self-organized cells” is understood to mean a set of cells positioned in a particular manner with respect to one another in order to create cellular interactions and communications and to form a three-dimensional microstructure of interest.
  • Each microcompartment thus comprises an outer layer of hydrogel, or hydrogel capsule, enclosing a set of self-organized cells.
  • the cells can multiply, organize and / or differentiate within the hydrogel capsule.
  • the hydrogel capsule contains a single set of self-organized cells.
  • single means that the capsule contains only a group of cells, which can be more or less cohesive.
  • a single set of cells means a three-dimensional cellular structure in which each cell of said set is in physical contact with at least one other cell of said set.
  • the cells are chosen from differentiated cells, progenitors, stem cells, multipotent cells, pluripotent cells, totipotent cells, genetically modified cells, and mixtures thereof, etc.
  • the encapsulated cells are pluripotent stem cells, chosen in particular from embryonic stem cells and / or pluripotency-induced cells (IPS).
  • the encapsulated cells are embryonic stem cells, including pluripotent embryonic stem cells.
  • the encapsulated cells are embryonic stem cells, excluding human embryonic stem cells that required the destruction of a human embryo.
  • the encapsulated cells are human embryonic stem cells derived from supernumerary human embryos designed in the context of a medically assisted procreation no longer the subject of a parental project, in accordance with the bioethical laws. in force at the time and in the country of collection of the said embryonic stem cells.
  • the encapsulated cells are pluripotency-induced cells (IPS), including pluripotency-induced human cells (hIPS).
  • IPS pluripotency-induced cells
  • hIPS pluripotency-induced human cells
  • the encapsulated cells are embryonic stem cells and pluripotency-induced cells.
  • the encapsulated cells comprise a mixture of embryonic stem cells and pluripotency-induced cells.
  • the "outer layer of hydrogel”, or “hydrogel shell” designates a three-dimensional structure formed from a matrix of polymer chains swollen with a liquid, and preferably of water.
  • Such an outer layer of hydrogel is obtained by crosslinking a hydrogel solution.
  • the polymer or polymers of the hydrogel solution are crosslinkable polymers when subjected to a stimulus, such as a temperature, a pH, ions, etc.
  • the hydrogel solution used is biocompatible, in that it is not toxic to the cells.
  • the hydrogel layer advantageously allows the diffusion of dissolved gases (and in particular oxygen and / or carbon dioxide), nutrients, and metabolic waste to allow the survival, proliferation, differentiation, maturation of the cells and or the production of molecules or molecular assemblies of interest and / or the recapitulation of cellular behaviors of interest.
  • the polymers of the hydrogel solution may be of natural or synthetic origin.
  • the hydrogel solution contains one or more polymers among sulfonate-based polymers, such as sodium polystyrene sulfonate, acrylate-based polymers, such as sodium polyacrylate, polyethylene glycol diacrylate, gelatin methacrylate compound, polysaccharides, and especially polysaccharides of bacterial origin, such as gellan gum, or of plant origin, such as pectin or alginate.
  • the hydrogel solution comprises at least alginate.
  • the hydrogel solution comprises only alginate.
  • alginate is understood to mean linear polysaccharides formed from bD-mannuronate (M) and ⁇ -L-gluluronate (G), salts and derivatives thereof.
  • the alginate is a sodium alginate, composed of more than 80% of G and less than 20% of M, with an average molecular mass of 100 to 400 kDa (for example: PRONOVA® SLG100) and a total concentration of between 0.5% and 5% by weight (weight / volume).
  • the microcompartment cell is closed. It is the outer layer of hydrogel that gives its size and shape to the cellular microcompartment.
  • the microcompartment can have any form compatible with cell encapsulation.
  • the extracellular matrix layer forms a gel.
  • the extracellular matrix layer comprises a mixture of proteins and extracellular compounds necessary for cell culture, for example pluripotent cells.
  • the extracellular matrix comprises structural proteins, such as laminin 521, 511 or 421, entactin, vitronectin, laminins, collagen, as well as growth factors, such as TGF-beta and / or EGF.
  • the extracellular matrix layer consists of, or contains Matrigel® and / or Geltrex®.
  • the microcompartment can contain, in place of the extracellular matrix, an extracellular matrix substitute.
  • An extracellular matrix substitute is a compound capable of promoting attachment and / or survival of cells by interacting with membrane proteins and / or extracellular signal transduction pathways.
  • such a substitute comprises biological polymers and their fragments, in particular proteins (laminins, vitronectins, fibronectins and collagens), non-sulfated (hyaluronic acid) or sulphated glycosaminoglycans (chondroitin sulfate, dermatan sulphate, keratan sulphate, heparan sulphate), and synthetic polymers containing units derived from biological polymers or reproducing their properties (RGD pattern) and small molecules mimicking attachment to a substrate (Rho-A kinase inhibitors such as Y-27632 or thiazovivin).
  • proteins laminins, vitronectins, fibronectins and collagens
  • non-sulfated hyaluronic acid
  • sulphated glycosaminoglycans chondroitin sulfate, dermatan sulphate, keratan sulphate, heparan sulphate
  • any method of producing cellular microcompartments containing within a hydrogel capsule of the extracellular matrix and cells can be used for carrying out the preparation method according to the invention.
  • the dimensions of the cellular microcompartment are controlled.
  • the cellular microcompartment according to the invention has a spherical shape.
  • the diameter of such a microcompartment is between 10 mh and 1 mm, more preferably between 50 mhi and 500 mh, more preferably less than 500 mhi, preferably less than 400 mhi.
  • the cellular microcompartment according to the invention has an elongate shape.
  • the microcompartment can have an ovoid or tubular shape.
  • the smallest dimension of such an ovoid or tubular microcompartment is between 10 mh and 1 mm, more preferably between 50 mhi and 500 mhi, more preferably less than 500 mhi, preferably less than 400 mhi.
  • "Smallest dimension” means twice the minimum distance between a point on the outer surface of the hydrogel layer and the center of the microcompartment.
  • the thickness of the hydrogel outer layer is 5 to 40% of the radius of the microcompartment.
  • the thickness of the extracellular matrix layer represents 5 to 80% of the radius of the microcompartment and is advantageously attached to the inner face of the hydrogel shell. This matrix layer can fill the space between the cells and the hydrogel shell.
  • the "thickness" of a layer is the dimension of said layer extending radially from the center of the microcompartment.
  • the bioreactor comprises microcompartments in which the cells are self-organized in a cyst.
  • At least one layer of pluripotent or totipotent cells organized around a central lumen is designated by cyst.
  • a microcompartment therefore comprises successively, around a central lumen, said layer of pluripotent cells, an extracellular matrix layer, or an extracellular matrix substitute, and the outer layer of hydrogel.
  • Light is generated at the time of cyst formation by the cells that multiply and grow in layers on the extracellular matrix layer.
  • the light contains a liquid and more particularly the culture medium.
  • a cyst advantageously contains one or more layers of pluripotent stem cells of a mammal, human or non-human.
  • a pluripotent stem cell, or pluripotent cell is a cell that has the capacity to form all the tissues present in the whole organism, without being able to form an organism. whole as such.
  • a cyst may contain embryonic stem cells (ESC), pluripotency-induced stem cells (IPS), or MUSE cells ("Multilineage-differentiating stress enduring") found in the skin and bone marrow. adult mammals.
  • ESC embryonic stem cells
  • IPS pluripotency-induced stem cells
  • MUSE cells Multilineage-differentiating stress enduring
  • the thickness of the hydrogel outer layer represents 5 to 40% of the radius of the microcompartment
  • the thickness of the extracellular matrix layer represents 5 to 80% of the microcompartment radius
  • the thickness of the pluripotent cell layer represents about 10% of the radius of the microcompartment.
  • the pluripotent cell layer is in contact at least at one point with the extracellular matrix layer, a space filled with culture medium may be present between the matrix layer and the cyst.
  • the light then represents from 5 to 30% of the radius of the microcompartment.
  • the cellular microcompartment has a spherical shape of radius equal to 1 OOmhi.
  • the hydrogel layer has a thickness of 5mhi to 40mhi.
  • the extracellular matrix layer has a thickness of 5 ⁇ m to about 80 ⁇ m.
  • the pluripotent cell layer has a thickness of 10 to 30 mHi, the light having a radius of about 5 to 30 mHi.
  • step (b) mixing said pluripotent stem cells from step (a) with an extracellular matrix
  • step (c) encapsulating the mixture of step (b) in a hydrogel layer
  • step (d) culturing the capsules obtained in step (c) in a culture medium containing a RHO / ROCK inhibitor
  • step (e) rinsing the capsules from step (d) so as to remove the RHO / ROCK inhibitor
  • step (f) cultivating in a fed-batch type of production the capsules resulting from step (e) for 3 to 20 days, preferably 5 to 10 days, by diluting the volume of medium by a factor of two each day with a pluripotent cell culture medium such as MTESR1 (Stemcell technologies) lacking RHO / ROCK pathway inhibitor, and optionally recovering the cell microcompartments obtained.
  • a pluripotent cell culture medium such as MTESR1 (Stemcell technologies) lacking RHO / ROCK pathway inhibitor
  • RhO / ROCK Rho-associated protein kinase pathway
  • thiazovivin C. , N: OS
  • Y-27632 C14H21N3O
  • step (a) is conducted for a time of between a few minutes and a few hours, preferably between 2 minutes and 2 hours, more preferably between 10 minutes and 1 hour.
  • step (d) of culture is conducted for a time of between 2 and 48 hours, preferably for a time of between 6 and 24 hours, more preferably for a time of between 12 and 18 hours.
  • Step (e) is necessary to ensure removal of any trace of RHO / ROCK pathway inhibitors.
  • Step (e) is for example carried out by rinsing, and preferably by several rinses, in successive culture media free of RHO / ROCK channel inhibitors.
  • step (f) is conducted for a time sufficient to obtain a cellular microcompartment in which the extracellular matrix and pluripotent cell layers have a cumulative thickness equal to 50 to 100% of the thickness of the hydrogel outer layer.
  • Any culture medium suitable for pluripotent stem cell culture can be used.
  • the method according to the invention comprises an intermediate step (a ') of dissociating the pluripotent stem cells resulting from step (a) before step (b), preferably by means of an enzyme-free reagent.
  • said reagent is inhibited or rinsed before the encapsulation step, in particular by successive rinsing in a specific medium for pluripotent cells.
  • the reagent used is ReLeSR®.
  • trypsin or an enzyme-containing reagent it is also possible to use trypsin or an enzyme-containing reagent, but the survival rate of the pluripotent cells at the end of this step may then be lower compared to the use of a reagent free of 'enzyme.
  • microcompartments can be obtained according to the steps below: (A) mixing differentiated mammalian cells with an extracellular matrix and cell reprogramming agents;
  • step (B) encapsulating the mixture of step (A) in a hydrogel layer
  • step (C) culturing the capsules from step (B) for at least 3 days, and optionally recovering the obtained cell microcompartments.
  • the differentiated cells used are fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells, epithelial cells and more generally cells derived from liquid or solid biopsies of human tissues.
  • the reprogramming agents are advantageously co-encapsulated with the differentiated cells, so as to concentrate the product and to promote contact with all the cells.
  • the reprogramming agents make it possible to impose on the cells a succession of phenotypic changes up to the pluripotent stage.
  • the reprogramming step (A) is carried out using specific culture media, promoting these phenotypic changes.
  • the cells are cultured in a first medium comprising 10% human serum, or bovine, in Eagle's Minimal Essential Medium (DMEM) supplemented with a serine / threonine protein kinase receptor inhibitor (such as the SB product).
  • DMEM Eagle's Minimal Essential Medium
  • the bioreactor comprises microcompartments including organo-organ-organized cells.
  • organoid denotes a multicellular structure organized in three dimensions so as to reproduce the microstructure of at least a part of an organ. According to the invention, such a microcompartment therefore comprises a multicellular structure in 3 dimensions, surrounded by extracellular matrix, the whole being encapsulated in the outer layer of hydrogel.
  • the organoids can be obtained by encapsulating pluripotent or progenitor cells which are then differentiated inside the hydrogel capsule, or by directly encapsulating differentiated cells or mature cells.
  • the cellular microcompartments introduced into the bioreactor contain pluripotent cells.
  • a cell differentiation step in at least one cell type of interest is then carried out inside the bioreactor, and optionally a step of multiplication of said differentiated cells in the microcompartments.
  • the cellular micro-compartments introduced into the bioreactor contain already differentiated cells or progenitors.
  • a step of multiplication and / or maturation of said differentiated cells in the microcompartments is then carried out inside the bioreactor.
  • the micro-compartments introduced into the bioreactor have an initial cell density of less than 10% of occupancy of the internal volume of the microcompartment, preferably less than 1%, more preferably less than 0.1%.
  • the microcompartment recovered at the end of the culture step in the bioreactor have a cell density greater than 10% occupancy of the internal volume of microcompartments.
  • the cells contained in the hydrogel capsules are subjected to the flow of medium contained in the bioreactor and which passes through the hydrogel layer.
  • the convective volume ratio outside the microcompartment on diffusive volume inside the microcompartment is between 1 and 10,000, preferably between 1 and 1000, more preferably between 1 and 100.
  • the convective volume designates the volume of culture medium inside the chamber of the reactor, between the microcompartments.
  • the microcompartments being in suspension in the bioreactor, the convective volume thus represents the medium flowing between the microcompartments.
  • the diffusive volume refers to the volume of culture medium diffusing inside the microcompartment, that is to say in the space / spaces / voids formed around / between / by the cells once self-organized.
  • the diffusive volume is mainly constituted by the central lumen and at the beginning of the growth of said cyst, the space between the wall of the capsule and the cyst.
  • the diffusive volume mainly consists of the spaces formed within the multicellular structure in 3 dimensions.
  • microcompartments according to the invention are advantageously characterized by the presence within the hydrogel capsule of one or more lumens, or one or more spaces, devoid of cells and allowing precisely the multiplication or self-organization. cells inside the microcompartment.
  • Those skilled in the art will be able to harvest the cells at the most appropriate moment for its amplification or differentiation process corresponding to a certain level of optimal space saturation in this context.
  • the microcompartment occupies between 0.01% and 74% of the volume of the enclosure of the bioreactor.
  • micro-compartments make it possible to cultivate the cells in any type of bioreactor, provided with a closed enclosure, and in particular in a bioreactor in "batch” feed mode, in feed mode with "fed” batch “or in continuous feeding mode (infusion).
  • the use of these microcompartments is particularly advantageous in the case of culture in continuous feed mode. Indeed, the cells being protected by the hydrogel shell, it is possible to subject them to continuous flows, without the risk of weakening them.
  • the bioreactor comprises a hermetically sealable enclosure. This makes it possible to control the atmosphere inside the bioreactor, and for example to cultivate microcompartments in an inert atmosphere.
  • the cell culture system according to the invention may comprise an enclosure having a volume of between 1 mL and 10,000 L, preferably between 5 mL and 10,000 L, between 10 mL and 10,000 L, between 100 mL and 10,000 L, between 200 mL and 10.000 L, between 500 mL and 10,000 L.
  • the enclosure has a volume of at least 1 mL.
  • the enclosure has a volume of at least 10 mL.
  • the enclosure has a volume of at least 100 mL.
  • the enclosure has a volume of at least 500 mL.
  • the enclosure has a volume of at least 1 L.
  • the enclosure has a volume of at least 10 L.
  • the enclosure has a volume of 100 L, or more.
  • any bioreactor comprising a closed chamber, and capable of producing, on an industrial scale, cells, organoids, molecules and / or complex molecule assemblies may be used.
  • the use of a closed enclosure allows a fine control of the culture environment, without risk of disturbance by the external environment. It is also easy to obtain sterile products. This also allows better volumetric efficiency.
  • the microcompartments comprise between 10% and 98% by volume of cells at harvest, ie between 100 and 1,000,000 cells depending on the diameter of the compartment concerned and the size of the cells produced, which can be calculated by realizing the ratio between the total number of cells produced (as measured by those skilled in the art with a Malassez cell or an automated cell counter) and the number of capsules obtained (as measured by the human the art by characterizing the volume of capsules by manual counting under an optical microscope or by an automated image analysis).
  • microcompartments having a smaller number of cells initially, and in particular between 1 and 1,000 cells, ie 0.01% and 10% by volume occupied by the cells within the microcompartment following the diameter of the compartment concerned and the size of the cells produced. More generally, the microcompartments according to the invention comprise between 0.01% and 98% by volume of cells.
  • the cells can then multiply inside the microcompartment and self-organize, including organoids.
  • the cells of a microcompartment are all of the same cell type. According to the invention, it is considered that the cells of the same microcompartment are all of the same cell type if at least 50%, preferably 70%, more preferably 90%, even more preferentially 98% or more of the cells of said microcompartment have the same phenotype, following the knowledge of those skilled in the art to characterize this cell type.
  • the cells of a microcompartment are at least two different cell types.
  • between 20 and 100% of the cells of a compartment have the same phenotype.
  • the bioreactor may contain two types of microcompartments, each containing a particular cell type.
  • the culture system according to the invention is particularly advantageous for the production and / or amplification of cells of interest. Indeed, the organization of the cells within the hydrogel capsule, with the extracellular matrix, allows their multiplication by a factor of 2 to 100,000 between each passage.
  • passage is meant the manipulation of cells to add space or culture surface in order to continue amplification or to initiate differentiation or self-organization into organoids.
  • This operation may require in the example of micro-carriers to reload the bioreactor with new micro-carriers.
  • this operation consists in detaching the cells from the old culture support in order to reseed a new culture medium with more surface, for those skilled in the art. operation can result in the loss of 50% of the cells.
  • the microcompartment culture according to the invention this corresponds to the dissociation of the microcompartment, the dissociation of self-organized cell sets or their dispersion in cell sets sufficiently small to be encapsulated again in new microcompartments.
  • the invention particularly relates to the use of such a bioreactor cell culture system for the mass production of pluripotent cells.
  • the invention also relates to the use of such a bioreactor cell culture system for the production of unipotent or multipotent progenitors from pluripotent cells.
  • the invention also relates to the use of such a bioreactor cell culture system for the production of end-differentiated cells (that is to say corresponding to one or more specific functions) from pluripotent cells and / or or unipotent or multipotent progenitors and / or combinatorics of these progenitors.
  • the subject of the invention is in particular a method for producing organoids or cells of interest comprising the steps according to which:
  • microcompartments introducing a plurality of cellular microcompartments into a bioreactor comprising a closed chamber, said microcompartments each comprising an outer layer of hydrogel encapsulating cells and extracellular matrix or an extracellular matrix substitute;
  • the microcompartment is cultivated under conditions allowing the multiplication of the cells inside the microcompartments, and / or the self-organization of the cells into organoids; cellular microcompartments are recovered
  • the hydrogel layer is hydrolyzed to recover the organoids or the cells of interest.
  • the cellular microcompartments introduced contain pluripotent cells, said method comprising, within the bioreactor, a cell differentiation step in at least one cell type of interest and a step of multiplication of said differentiated cells in the cells. microcompartments.
  • the production of primitive endoderm organoids for the study of differentiation in human endodermal tissues can be carried out according to the following protocol:
  • the introduced cell microcompartments contain already differentiated cells or progenitors, said method comprising, within the bioreactor, a step of multiplying said differentiated cells in microcompartments.
  • the cells will advantageously self-organize into a specific organoid, according to an organization specific to said cell type.
  • the microcompartments introduced into the bioreactor have a cell density of less than 10% of occupancy of the internal volume of the microcompartment, preferably 1% even more preferably 0.1%. The cells will then multiply inside the microcompartments during the culturing step.
  • microcompartments introduced into the bioreactor have a cell density greater than 1% occupancy of the internal volume of microcompartments.
  • the cells will then differentiate and / or mature and / or self-organize inside the microcompartments, during the culture stage.
  • a first type of production of neural organoids for neuronal transplantation as part of the cellular therapy of Parkinson's disease has been carried out according to the following protocol:
  • dopaminergic progenitors such as those marketed by Cellular Dynamics International (iCell® DopaNeurons),
  • the microcompartments introduced into the bioreactor advantageously have a cell density of less than 10% of occupancy of the internal volume of the microcompartment, preferably 1%, even more preferably 0.1%.
  • the cells will then multiply inside the microcompartments, during the culture step and then during the differentiation step.
  • the cells will then self-organize within the microcompartments, during a second culture step that can be triggered by a change in the nature of the nutrient medium or a physical trigger (temperature, illumination).
  • a second type of production of neural organoids for neuronal transplantation in the context of Parkinson's disease cell therapy has been carried out according to the following protocol:
  • the micro-compartments introduced into the bioreactor advantageously have a cell density of less than 10% occupancy of the internal volume of the microcompartment, preferably 1% even more preferably 0.1%.
  • the cells will then multiply inside the microcompartments.
  • the cells are then recovered by dissolution of the capsule, then subjected to a second encapsulation step followed by the differentiation step, the cells will then self-organize inside the microcompartments, during a second culture step. which can be triggered by a change in the nature of the nutrient medium or a physical trigger (temperature, illumination).
  • a change in the nature of the nutrient medium or a physical trigger temperature, illumination
  • the microcompartment recovered at the end of the step of culture in the bioreactor have a cell density greater than 10% occupancy of the internal volume of the microcompartment, preferably greater than 50%, and can go in the case of organoids up to at 98% occupancy.
  • the culture system according to the invention is also particularly advantageous for the production of molecules of interest and / or complex molecular assemblies, said molecules and / or complex molecular assemblies being excreted by the cells of the microcompartments out of said microcompartment. in the culture medium, or conversely accumulated inside the microcompartment for a subsequent harvest.
  • This production method notably makes it possible to limit the filtration steps of the cellular elements by concentrating them inside the microcompartments.
  • This method makes it possible, thanks to the separation in the bioreactor of the convective volume and the diffusive volume by the capsule, a facilitated segregation of the medium containing the dissolved elements of the insoluble elements or of a size greater than the size of the hydrogel of the capsule ( typically 150 to 250 KDa for alginate).
  • the microcompartments are then advantageously used in a reactor in continuous feed mode.
  • the presence of the protective hydrogel shell makes it possible to infuse the culture medium with a flow rate without risk of damaging the cells.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

L'invention concerne un système de culture cellulaire en bioréacteur comprenant une enceinte close contenant une pluralité de microcompartiments cellulaires, dans lequel les microcompartiments comprennent chacun une couche externe en hydrogel ménageant une cavité contenant un ensemble de cellules autoorganisées et de la matrice extracellulaire ou un substitut de matrice extra-cellulaire.L'invention a également trait à l'utilisation de tels bioréacteurs pour la production de cellules et/ou d'organoïdes, et/ou de molécules et/ou d'assemblages moléculaires complexes.

Description

Système de culture cellulaire en bioréacteur
L’invention concerne les systèmes de culture de cellules en bioréacteur. Le système selon l’invention peut être utilisé pour la production de cellules d’intérêt, d’ensembles cellulaires (organoïdes, tissus) et/ou la production de molécules d’intérêt, ou d’assemblages moléculaires complexes (composants de matrices extracellulaires, organites cellulaires, anticorps, vaccins, exosomes, viroïdes), ou autres matériels d’intérêt provenant des cellules ou produits par les cellules cultivées dans de tels systèmes.
Les systèmes de culture de cellules en bioréacteur revêtent un intérêt grandissant pour l’industrie pharmaceutique entre autres. En effet, les cellules eucaryotes sont de plus en plus utilisées en tant qu’outil thérapeutique, notamment en thérapie cellulaire et tissulaire, et en tant qu’outil de bioproduction de molécules d’intérêt, depuis des fractions protéiques (insuline, anticorps, etc.), en passant par les complexes de protéines, lipides et sucres issus des cellules ou les organites cellulaires, les vésicules extracellulaires et les exosomes, jusqu’aux dérivés viraux (pour la production de vaccins notamment). Les systèmes de culture de cellules en bioréacteur permettent de cultiver en masse ces cellules et de répondre ainsi aux besoins en cellules et/ou molécules d’intérêt à l’échelle industrielle.
Actuellement, il existe trois grandes classes de méthodes de culture de cellules en bioréacteur :
- Les méthodes permettant la culture par lots (« batch »), dans lesquelles les cellules sont ensemencées dans un volume fixe de milieu de culture. Après un temps de culture adéquat pour permettre une croissance suffisante, les molécules et/ou cellules sont récoltées. Le problème majeur de ces méthodes est que les nutriments présents dans le milieu s’épuisent au cours du temps, et que les métabolites toxiques s’accumulent ;
- Les méthodes permettant la culture en lots nourris (« fed batch »), dans lesquelles du milieu de culture est rajouté au fur et à mesure pour nourrir les cellules tout en gardant une densité cellulaire acceptable. Le problème principal de ces systèmes est que les déchets du métabolisme ne sont pas retirés et s’accumulent dans le bioréacteur, ce qui finit par affecter le rendement ;
- Les méthodes permettant la culture en perfusion, dans lesquelles le milieu de culture est changé en continu, afin de nourrir les cellules et d’éliminer les déchets. De tels systèmes permettent un plus haut rendement mais le changement rapide et continu du milieu de culture nécessite de retenir les cellules sans les endommager (stress mécanique généré par le flux). Dans l’état de l’art, ces méthodes de bioproduction de masse ne sont pas ou peu applicables aux cellules fragiles ou aux assemblages cellulaires fragiles. En effet, en suspension, en agrégat ou sur des micro-carriers, les cellules et les assemblages cellulaires sont directement exposés dans le milieu de culture aux contraintes mécaniques (choc, stress de cisaillement, pression, etc.). Lorsque les volumes deviennent importants, les forces mécaniques utilisées pour brasser ou faire circuler le milieu peuvent détruire les cellules ou les assemblages cellulaires notamment par le stress de cisaillement appliqué par les flux de liquide ou l’impact avec les éléments mobiles qui brassent le milieu.
Résumé de l’invention
En travaillant sur ces problématiques de culture cellulaire en bioréacteur, les inventeurs ont découvert qu’il est possible de ménager un espace de culture au sein de microcompartiments délimités par une couche externe en hydrogel pour cultiver un grand nombre de cellules au sein d’un bioréacteur. La niche cellulaire d’intérêt est ainsi entourée d’une coque d’hydrogel laissant avantageusement infiltrer les nutriments et exfïltrer les protéines et métabolites mais conservant les éléments dont la taille dépasse 150KDa (matrice extracellulaire, exosomes, particules virales, cellules). En outre, les cellules étant protégées des contraintes pouvant exister au sein du réacteur par la coque d’hydrogel, le flux au travers du bioréacteur peut être aussi fort que la coque d’hydrogel peut le soutenir. En outre, la coque d’hydrogel des microcompartiments cellulaires, contrairement aux systèmes de culture existants, préserve les cellules des contraintes mécaniques liées aux collisions et prévient les fusions des éléments multicellulaires (agrégats, micro-carriers) qui existent lors de la culture en suspension liquide, et qui causent des problèmes de reproductibilité en faisant varier les conditions locales ressenties par les cellules (distance de diffusion au milieu, contraintes mécaniques). Les microcompartiments sont en suspension dans le bioréacteur, ce qui permet un accès au milieu de culture et une diffusion dans les microcompartiments homogènes, ainsi qu’une bonne convection. De plus, la niche cellulaire étant protégée par la coque d’hydrogel, il est possible de cultiver les types cellulaires les plus fragiles dans les conditions de rendement optimal avec une mort cellulaire faible et un phénotype bien contrôlé. Contrairement au simple sphéroïde enchâssé dans un gel, la cavité dans la capsule laisse la place aux cellules de se multiplier et/ou de s’ auto -organiser sur de la matrice extra-cellulaire. Avantageusement, chaque microcompartiment comprend une unique niche cellulaire. Autrement dit, une coque d’hydrogel donnée entoure une seule niche cellulaire. La couche externe des microcompartiments étant en hydrogel, elle peut facilement être dissoute pour récupérer les cellules à l’issue de la production. Ces microcompartiments étant en 3D, ils permettent avantageusement une amplification cellulaire dans le microcompartiment d’un facteur pouvant aller jusqu’à 100.000. L’invention a donc pour objet un système de culture cellulaire en bioréacteur comprenant une enceinte close contenant une pluralité de microcompartiments cellulaires, dans lequel les microcompartiments comprennent chacun une couche externe en hydrogel ménageant une cavité contenant un ensemble de cellules autoorganisées et de la matrice extracellulaire ou un substitut de matrice extra-cellulaire.
Selon l’invention, une couche externe en hydrogel entoure un ensemble de cellules. La couche en hydrogel forme une capsule creuse, ménageant une cavité contenant l’ensemble de cellules.
Avantageusement, la capsule d’hydrogel contient un unique ensemble de cellules.
Selon l’invention, la pluralité de microcompartiments cellulaires est en suspension dans l’enceinte du bioréacteur. Plus particulièrement, les microcompartiments flottent dans le milieu de culture contenu dans l’enceinte du bioréacteur.
L’invention a également pour objet l’utilisation d’un tel système de culture cellulaire en bioréacteur, comprenant une enceinte close, pour la production et/ou amplification de cellules d’intérêt. L’amplification est avantageusement d’un facteur 2 à 100.000 entre chaque passage. Ce facteur d’amplification correspond au nombre de cellules vivantes récolté à l’issue de l’amplification, divisé par le nombre de cellules vivantes ensemencé.
L’invention a également pour objet l’utilisation d’un tel système de culture cellulaire en bioréacteur pour la production de molécules d’intérêt et/ou d’assemblages moléculaires complexes, tels que des composants de matrices extracellulaires, organites cellulaires, anticorps, vaccins, exosomes, viroïdes, etc., lesdites molécules et/ou assemblages étant excrétés par les cellules des microcompartiments hors desdits microcompartiments jusque dans le milieu de culture, ou inversement accumulés à l’intérieur du microcompartiment pour une récolte ultérieure.
L’invention a aussi pour objet un procédé de production d’organoïdes ou de cellules d’intérêt comprenant les étapes selon lesquelles :
- on introduit une pluralité de microcompartiments cellulaires dans un bioréacteur, comprenant une enceinte close, lesdits microcompartiments comprenant chacun une couche externe en hydrogel encapsulant des cellules et de la matrice extracellulaire ou un substitut de matrice extra-cellulaire ;
- on cultive les microcompartiments dans des conditions permettant la multiplication des cellules à l’intérieur des microcompartiments, et/ou l’auto organisation des cellules en organoïdes ; - on récupère les microcompartiments cellulaires ;
- et optionnellement, on hydrolyse la couche d’hydrogel pour récupérer les organoïdes ou les cellules d’intérêt.
L’invention a aussi pour objet un procédé de production de cellules différenciées à partir de cellules multipotentes, pluripotentes ou totipotentes comprenant les étapes selon lesquelles :
- on introduit une pluralité de microcompartiments cellulaires dans un bioréacteur, lesdits microcompartiments comprenant chacun une couche externe en hydrogel encapsulant des cellules multipotentes, pluripotentes ou totipotentes et de la matrice extracellulaire ou un substitut de matrice extra-cellulaire ;
- on cultive les microcompartiments dans des conditions permettant la multiplication des cellules à l’intérieur des microcompartiments, et/ou la différenciation dans un ou des types cellulaires d’intérêt ;
- on récupère les microcompartiments cellulaires ;
- et optionnellement, on hydrolyse la couche d’hydrogel pour récupérer le ou les types cellulaires d’intérêt.
Description détaillée
Les inventeurs ont découvert qu’il est possible et particulièrement avantageux de cultiver des cellules au sein d’un réacteur comprenant une enceinte close, en maintenant les cellules à l’intérieur d’une capsule externe en hydrogel réticulé. Plus précisément, les inventeurs ont mis au point des microcompartiments cellulaires comprenant chacun une couche externe en hydrogel encapsulant un ensemble de cellules autoorganisées et de la matrice extracellulaire ou un substitut de matrice extra-cellulaire. Selon l’invention, les microcompartiments cellulaires sont en suspension dans le bioréacteur.
Selon l’invention, on entend par cellules autoorganisées un ensemble de cellules positionnées de manière particulière les unes par rapport aux autres pour créer des interactions et communications cellulaires et former une microstructure tridimensionnelle d’intérêt. Chaque microcompartiment comprend ainsi une couche externe d’hydrogel, ou capsule d’hydrogel, renfermant un ensemble de cellules autoorganisées. Les cellules peuvent se multiplier, s’organiser et/ou se différencier au sein de la capsule d’hydrogel.
Dans un mode de réalisation, la capsule d’hydrogel renferme un unique ensemble de cellules autoorganisées. Par unique, on entend que la capsule ne contient qu’un groupe de cellules, qui peut être plus ou moins cohésif. Notamment, un ensemble de cellules unique s’entend d’une structure cellulaire tridimensionnelle dans laquelle chaque cellule dudit ensemble est en contact avec physique avec au moins une autre cellule dudit ensemble.
Selon l’invention, il est possible d’encapsuler toutes sortes de cellules eucaryotes, et plus particulièrement des cellules de mammifères. Notamment, les cellules sont choisies parmi les cellules différenciées, les progéniteurs, les cellules souches, les cellules multipotentes, les cellules pluripotentes, les cellules totipotentes, les cellules génétiquement modifiées, et leurs mélanges etc. Dans un mode de réalisation, les cellules encapsulées sont des cellules souches pluripotentes, choisies notamment parmi les cellules souches embryonnaires et/ou les cellules induites à la pluripotence (IPS). Dans un mode de réalisation, les cellules encapsulées sont des cellules souches embryonnaires, notamment des cellules souches embryonnaires pluripotentes. Dans un mode de réalisation, les cellules encapsulées sont des cellules souches embryonnaires, à l’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines ayant nécessité la destruction d’un embryon humain. Dans un autre mode de réalisation, les cellules encapsulées sont des cellules souches embryonnaires humaines issues d’embryons humains surnuméraires conçus dans le cadre d’une procréation médicalement assistée ne faisant plus l’objet d’un projet parental, dans le respect des lois bioéthiques en vigueur au moment et dans le pays de prélèvement desdites cellules souches embryonnaires. Dans un autre mode de réalisation, les cellules encapsulées sont des cellules induites à la pluripotence (IPS), et notamment des cellules humaines induites à la pluripotence (hIPS). Dans un autre mode de réalisation, les cellules encapsulées sont des cellules souches embryonnaires et des cellules induites à la pluripotence. Dans un mode de réalisation, les cellules encapsulées comprennent un mélange de cellules souches embryonnaires et de cellules induites à la pluripotence.
Dans le contexte de l’invention, « la couche externe d’hydrogel », ou « coque d’hydrogel », désigne une structure tridimensionnelle formée à partir d’une matrice de chaînes de polymères gonflée par un liquide, et préférentiellement de l’eau. Une telle couche externe d’hydrogel est obtenue par réticulation d’une solution d’hydrogel. Avantageusement, le ou les polymères de la solution d’hydrogel sont des polymères réticulables lorsque soumis à un stimulus, tel qu’une température, un pH, des ions, etc. Avantageusement, la solution d’hydrogel utilisée est biocompatible, en ce sens qu’elle n’est pas toxique pour les cellules. La couche d’hydrogel permet avantageusement la diffusion de gaz dissous (et notamment d’oxygène et/ou de dioxyde de carbone), de nutriments, et de déchets métaboliques pour permettre la survie, la prolifération, la différenciation, la maturation des cellules et/ou la production de molécules ou d’assemblages moléculaires d’intérêt et/ou la récapitulation de comportements cellulaires d’intérêt. Les polymères de la solution d’hydrogel peuvent être d’origine naturelle ou synthétique. Par exemple, la solution d’hydrogel contient un ou plusieurs polymères parmi les polymères à base de sulfonate, tel que le polystyrène sulfonate de sodium, les polymères à base d’acrylate, tel que le polyacrylate de sodium, le polyéthylène glycol diacrylate, le composé gélatine méthacrylate, les polysaccharides, et notamment les polysaccharides d’origine bactérienne, tels que la gomme gellane, ou d’origine végétale, tels que la pectine ou l’alginate. Dans un mode de réalisation, la solution d’hydrogel comprend au moins de l’alginate. Préférentiellement, la solution d’hydrogel ne comprend que de l’alginate. Dans le contexte de l’invention, on entend par « alginate » des polysaccharides linéaires formés à partir de b-D-mannuronate (M) et a-L- guluronate (G), des sels et dérivés de ceux-ci. Avantageusement, l’alginate est un alginate de sodium, composé à plus de 80% de G et moins de 20% de M, avec une masse moléculaire moyenne de 100 à 400 kDa (par exemple : PRONOVA® SLG100) et une concentration totale comprise entre 0.5% et 5% en masse volumique (poids/volume).
Selon l’invention, le microcompartiment cellulaire est clos. C’est la couche externe en hydrogel qui confère sa taille et sa forme au microcompartiment cellulaire. Le microcompartiment peut avoir n’importe quelle forme compatible avec l’encapsulation de cellules.
Préférentiellement, la couche de matrice extracellulaire forme un gel. La couche de matrice extracellulaire comprend un mélange de protéines et de composés extracellulaires nécessaires à la culture cellulaire, par exemple de cellules pluripotentes. Préférentiellement, la matrice extracellulaire comprend des protéines structurelles, telles que de la laminine 521, 511 ou 421, de l’entactine, de la vitronectine, des laminines, du collagène, ainsi que des facteurs de croissance, tels que du TGF-béta et/ou de l’EGF. Dans un mode de réalisation, la couche de matrice extracellulaire consiste en, ou contient du Matrigel® et/ou de la Geltrex®.
Selon l’invention, le microcompartiment peut contenir, à la place de la matrice extracellulaire, un substitut de matrice extra-cellulaire. Un substitut de matrice extracellulaire s’entend d’un composé capable de favoriser l’attachement et/ou la survie des cellules en interagissant avec les protéines de membranes et/ou les voies de transduction du signal extracellulaire. Par exemple, un tel substitut comprend les polymères biologiques et leurs fragments notamment les protéines (laminines, vitronectines, fibronectines et collagènes), les glycosaminoglycanes non sulfatés (acide hyaluronique) ou sulfatés (chondroïtine sulfate, dermatane sulfate, kératane sulfate, héparane sulfate), et polymères synthétiques contenant des motifs issus des polymères biologiques ou reproduisant leurs propriétés (motif RGD) et les petites molécules mimant l’attachement à un substrat (inhibiteurs de Rho-A kinase tel que Y-27632 ou thiazovivin).
Toute méthode de production de microcompartiments cellulaires contenant à l’intérieur d’une capsule d’hydrogel de la matrice extracellulaire et des cellules peut être utilisée pour la mise en œuvre du procédé de préparation selon l’invention. Notamment, il est possible de préparer des microcompartiments en adaptant la méthode et le dispositif micro fluidique décrits dans Alessandri et al., 2016 (« A 3D printed microfluidic device for production of fimctionalized hydrogel microcapsules for culture and différentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC) », Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, p. 1593-1604).
Avantageusement, les dimensions du microcompartiment cellulaire sont contrôlées. Dans un mode de réalisation, le microcompartiment cellulaire selon l’invention a une forme sphérique. Préférentiellement, le diamètre d’un tel microcompartiment est compris entre 10 mhi et 1 mm, plus préférentiellement entre 50 mhi et 500 mih, encore plus préférentiellement inférieur à 500 mhi, de manière préférée inférieur à 400 mhi. Dans un autre mode de réalisation, le microcompartiment cellulaire selon l’invention a une forme allongée. Notamment, le microcompartiment peut avoir une forme ovoïde ou tubulaire. Avantageusement, la plus petite dimension d’un tel microcompartiment ovoïde ou tubulaire est comprise entre 10 mhi et 1 mm, plus préférentiellement entre 50 mhi et 500 mhi, encore plus préférentiellement inférieure à 500 mhi, de manière préférée inférieure à 400 mhi. Par « plus petite dimension », on entend le double de la distance minimale entre un point situé sur la surface externe de la couche en hydrogel et le centre du microcompartiment.
Dans un mode de réalisation particulier, l’épaisseur de la couche externe en hydrogel représente 5 à 40% du rayon du microcompartiment. L’épaisseur de la couche de matrice extracellulaire représente 5 à 80 % du rayon du microcompartiment et est avantageusement accrochée sur la face interne de la coque en hydrogel. Cette couche de matrice peut combler l’espace entre les cellules et la coque en hydrogel. Dans le contexte de l’invention, « l’épaisseur » d’une couche est la dimension de ladite couche s’étendant radialement par rapport au centre du microcompartiment.
Dans un mode de réalisation de l’invention, le bioréacteur comprend des microcompartiments dans lesquels les cellules sont autoorganisées en cyste.
Dans le contexte de l’invention, on désigne par cyste au moins une couche de cellules pluripotentes ou totipotentes organisées autour d’une lumière centrale. Selon l’invention, un tel microcompartiment comprend donc successivement, autour d’une lumière centrale, ladite couche de cellules pluripotentes, une couche de matrice extracellulaire, ou d’un substitut de matrice extra-cellulaire, et la couche externe en hydrogel. La lumière est générée, au moment de la formation du cyste, par les cellules qui se multiplient et se développent en couches sur la couche de matrice extracellulaire. Avantageusement, la lumière contient un liquide et plus particulièrement du milieu de culture.
Selon l’invention, un cyste contient avantageusement une ou plusieurs couches de cellules souches pluripotentes d’un mammifère, humain ou non humain. Une cellule souche pluripotente, ou cellule pluripotente, s’entend d’une cellule qui a la capacité de former tous les tissus présents dans l’organisme d’origine entier, sans pour autant pouvoir former un organisme entier en tant que tel. Notamment, un cyste peut contenir des cellules souches embryonnaires (ESC), des cellules souches induites à la pluripotence (IPS), ou des cellules MUSE (« Multilineage-differentiating Stress Enduring ») que l’on trouve dans la peau et la moelle osseuse des mammifères adultes. Avantageusement, l’épaisseur de la couche externe en hydrogel représente 5 à 40% du rayon du microcompartiment, l’épaisseur de la couche de matrice extracellulaire représente 5 à 80 % du rayon du microcompartiment et l’épaisseur de la couche de cellule pluripotentes représente environ 10% du rayon du microcompartiment. La couche de cellules pluripotente est en contact au moins en un point avec la couche de matrice extra cellulaire, un espace rempli par du milieu de culture peut être présent entre la couche de matrice et le cyste. La lumière représente alors de 5 à 30% du rayon du microcompartiment. Dans un exemple particulier, le microcompartiment cellulaire a une forme sphérique de rayon égal à 1 OOmhi. La couche en hydrogel a une épaisseur de 5mhi à 40mhi. La couche de matrice extracellulaire a une épaisseur de 5pm à environ 80mhi. La couche de cellules pluripotentes a une épaisseur de 10 à 30 mhi, la lumière ayant un rayon de 5 à 30 mhi, environ.
Selon un exemple de réalisation de l’invention, il est possible de cultiver en bioréacteur par exemple de l50mL de tels microcompartiments, dans lesquels les cellules forment des cystes, selon les étapes ci-dessous :
(a) incuber de 600.000 à 2 millions de cellules souches pluripotentes de mammifère dans un milieu de culture contenant un inhibiteur des voies RHO/ROCK ;
(b) mélanger ces cellules souches pluripotentes issues de l’étape (a) avec une matrice extracellulaire ;
(c) encapsuler le mélange de l’étape (b) dans une couche d’hydrogel ;
(d) cultiver les capsules obtenues à l’étape (c) dans un milieu de culture contenant un inhibiteur des voies RHO/ROCK ;
(e) rincer les capsules issues de l’étape (d), de manière à éliminer l’inhibiteur des voies RHO/ROCK ;
(f) cultiver dans un mode de production de type fed-batch les capsules issues de l’étape (e) pendant 3 à 20 jours, préférentiellement 5 à 10 jours, en diluant le volume de milieu d’un facteur deux chaque jour avec un milieu de culture de cellules pluripotentes tel que le MTESR1 (Stemcell technologies) dépourvu d’inhibiteur des voies RHO/ROCK, et optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus. L’homme du métier saura adapter le nombre de cellules et le volume du bioréacteur en fonction des besoins.
L’étape (a) d’incubation et l’étape (d) de culture dans un milieu contenant un ou plusieurs inhibiteurs des voies RHO/ROCK (« Rho-associated protein kinase »), tels que du thiazovivin (C .AL-,N:OS) et/ou Y-27632 (C14H21N3O) permettent de promouvoir la survie des cellules souches pluripotentes, et l’adhérence des cellules à la matrice extracellulaire au moment de la formation de la couche externe d’hydrogel autour de ladite matrice extracellulaire. Il est toutefois souhaitable que ces étapes soient limitées dans le temps, afin que les inhibiteurs des voies RHO/ROCK n’empêchent pas la formation des cystes.
Ainsi, préférentiellement, l’incubation de l’étape (a) est conduite pendant un temps compris entre quelques minutes et quelques heures, préférentiellement entre 2 minutes et 2 heures, plus préférentiellement entre 10 minutes et 1 heure.
De même, préférentiellement, l’étape (d) de culture est conduite pendant un temps compris entre 2 et 48 heures, préférentiellement pendant un temps compris entre 6 et 24 heures, plus préférentiellement pendant un temps compris entre 12 et 18 heures.
L’étape (e) est nécessaire pour garantir l’élimination de toute trace d’inhibiteurs des voies RHO/ROCK. L’étape (e) est par exemple réalisée par rinçage, et préférentiellement par plusieurs rinçages, dans des milieux de cultures successifs exempts d’inhibiteurs des voies RHO/ROCK.
Avantageusement, l’étape (f) est conduite pendant un temps suffisant pour obtenir un microcompartiment cellulaire dans lequel les couches de matrice extracellulaire et de cellules pluripotentes présentent une épaisseur cumulée égale à 50 à 100% de l’épaisseur de la couche externe en hydrogel. Tout milieu de culture adapté à la culture de cellules souches pluripotentes peut être utilisé.
Dans un mode de mise en œuvre, le procédé selon l’invention comprend une étape intermédiaire (a’) consistant à dissocier les cellules souches pluripotentes issues de l’étape (a) avant l’étape (b), préférentiellement au moyen d’un réactif exempt d’enzyme. Avantageusement, ledit réactif est inhibé ou rincé avant l’étape d’encapsulation, notamment par rinçage successif dans un milieu spécifique pour cellules pluripotentes. Par exemple, le réactif utilisé est le ReLeSR®. Bien entendu, il est également possible d’utiliser de la trypsine ou un réactif contenant une enzyme, mais le taux de survie des cellules pluripotentes à l’issue de cette étape peut alors être moindre comparativement à l’utilisation d’un réactif exempt d’enzyme.
Alternativement, de tels microcompartiments peuvent être obtenus selon les étapes ci-dessous : (A) mélanger des cellules différenciées de mammifères avec une matrice extracellulaire et des agents de reprogrammation cellulaire ;
(B) encapsuler le mélange de l’étape (A) dans une couche d’hydrogel ;
(C) cultiver les capsules issues de l’étape (B) pendant au moins 3 jours, et optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
Par exemple, les cellules différenciées utilisées sont des fîbroblastes, des cellules mononucléées sanguines périphériques, des cellules épithéliales et plus généralement des cellules issues de biopsie liquides ou solides de tissus humain.
L’homme du métier sait procéder à la reprogrammation d’une cellule différenciée en une cellule souche en réactivant l’expression des gènes associés au stade embryonnaire au moyen de facteurs spécifiques. A titre d’exemples, on peut citer les méthodes décrites dans Takahashi et al., 2006 (« Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fïbroblast cultures by defïned factors » Cell, 2006 Vol 126, pages 663-676) et dans la demande internationale W02010/105311 ayant pour titre « Production of reprogrammed pluripotent cells ».
Les agents de reprogrammation sont avantageusement co-encapsulés avec les cellules différenciées, de manière à concentrer le produit et à favoriser le contact avec l’ensemble des cellules.
Les agents de reprogrammation permettent d’imposer aux cellules une succession de changements phénotypiques jusqu’au stade pluripotent. Avantageusement, l’étape (A) de reprogrammation est réalisée en utilisant des milieux de cultures spécifiques, favorisant ces changements phénotypiques. Par exemple, les cellules sont mis en culture dans un premier milieu comprenant 10% de sérum humain, ou bovin, dans un milieu minimum essentiel de Eagle (DMEM) supplémenté avec un inhibiteur des récepteurs sérine/thréonine protéine kinase (tel que le produit SB-431542 (C22H16N4O3)), un ou plusieurs inhibiteurs des voies RHO/ROCK (« Rho-associated protein kinase »), tels que du thiazovivin et/ou Y-27632, des facteurs de croissance des fîbroblastes, tel que du FGF-2, de l’acide ascorbique et des antibiotiques, tels que le Trichostatin A (C17H22N2O3). Puis le milieu de culture est remplacé par du milieu favorisant la multiplication des cellules pluripotentes, tel que le milieu mTeSR®l. De tels cystes peuvent ensuite être forcés dans une voie de différentiation d’intérêt, de manière à obtenir des microcompartiments contenant un ou plusieurs types cellulaires d’intérêt, notamment pour la production de molécules d’intérêt, ou la production d’organoïdes d’intérêt. Dans un mode de réalisation, le bioréacteur comprend des microcompartiments comprenant des cellules autoorganisées en organoïdes.
Dans le contexte de l’invention, on désigne par organoïde une structure multicellulaire organisée en trois dimensions de manière à reproduire la microstructure d’au moins une partie d’un organe. Selon l’invention, un tel microcompartiment comprend donc une structure multicellulaire en 3 dimensions, entourée de matrice extracellulaire, le tout étant encapsulé dans la couche externe en hydrogel.
Selon l’invention, les organoïdes peuvent être obtenus en encapsulant des cellules pluripotentes ou progéniteurs qui sont ensuite différenciées à l’intérieur de la capsule d’hydrogel, ou en encapsulant directement des cellules différenciées ou des cellules matures.
Dans un mode de réalisation, les microcompartiments cellulaires introduits dans le bioréacteur contiennent des cellules pluripotentes. Une étape de différenciation cellulaire en au moins un type cellulaire d’intérêt est alors réalisée à l’intérieur du bioréacteur, et optionnellement une étape de multiplication desdites cellules différenciées dans les microcompartiments.
Dans un mode de réalisation, les microcompartiments cellulaires introduits dans le bioréacteur contiennent des cellules déjà différenciées ou des progéniteurs. Une étape de multiplication et/ou de maturation desdites cellules différenciées dans les microcompartiments est alors réalisée à l’intérieur du bioréacteur.
Avantageusement, les microcompartiments introduits dans le bioréacteur ont une densité cellulaire initiale inférieure à 10% d’occupation du volume interne des microcompartiments, préférentiellement inférieure à 1%, encore plus préférentiellement inférieure à 0.1%.
Avantageusement, les microcompartiments récupérés à l’issue de l’étape de culture dans le bioréacteur ont une densité cellulaire supérieure à 10% d’occupation du volume interne des microcompartiments.
Selon l’invention, les cellules contenues dans les capsules d’hydrogel sont soumises au flux de milieu contenu dans le bioréacteur et qui passe à travers la couche d’hydrogel.
Avantageusement, le ratio volume convectif à l’extérieur des microcompartiments sur volume diffusif à l’intérieur des microcompartiments est compris entre 1 et 10.000, préférentiellement entre 1 et 1000, plus préférentiellement entre 1 et 100.
Selon l’invention, le volume convectif désigne le volume de milieu de culture à l’intérieur de l’enceinte du réacteur, entre les microcompartiments. Les microcompartiments étant en suspension dans le bioréacteur, le volume convectif représente ainsi le milieu circulant entre les microcompartiments. A l’inverse, le volume diffusif désigne le volume de milieu de culture diffusant à l’intérieur des microcompartiments, c’est-à-dire dans le ou les espaces/les vides ménagés autour/entre/par les cellules une fois autoorganisées.
Ainsi, dans le cas d’un microcompartiment contenant un cyste, le volume diffusif est principalement constitué par la lumière centrale et au début de la croissance dudit cyste, de l’espace entre la paroi de la capsule et le cyste. Dans le cas d’un microcompartiment contenant un organoïde, le volume diffusif est principalement constitué des espaces ménagés au sein de la structure multicellulaire en 3 dimensions.
Les microcompartiments selon l’invention sont avantageusement caractérisés par la présence au sein de la capsule d’hydrogel d’une ou plusieurs lumières, ou un ou plusieurs espaces, dépourvu(e)s de cellules et permettant justement la multiplication ou G auto-organisation des cellules à l’intérieur du microcompartiment. L’homme du métier saura récolter les cellules au moment le plus adéquat pour son procédé d’amplification ou de différenciation correspondant à un certain niveau de saturation de l’espace optimal dans ce cadre.
Dans un mode de réalisation, les microcompartiments occupent entre 0,01% et 74% du volume de l’enceinte du bioréacteur.
L’utilisation de microcompartiments cellulaires permet de cultiver les cellules dans n’importe quel type de bioréacteur, muni d’une enceinte close, et notamment dans un bioréacteur en mode d’alimentation par « batch », en mode d’alimentation par « fed batch » ou en mode d’alimentation continu (perfusion). L’utilisation de ces microcompartiments est particulièrement avantageuse dans le cas de culture en mode d’alimentation continu. En effet, les cellules étant protégées par la coque d’hydrogel, il est possible de les soumettre à des flux continus, sans risque de les fragiliser.
Dans un mode de réalisation, le bioréacteur comprend une enceinte pouvant être fermée hermétiquement. Cela permet de contrôler l’atmosphère à l’intérieur du bioréacteur, et par exemple de cultiver les microcompartiments sous atmosphère inerte.
Le système de culture cellulaire selon l’invention peut comporter une enceinte ayant un volume compris entre 1 mL et 10 000L, préférentiellement entre 5 mL et 10.000 L, entre 10 mL et 10.000 L, entre 100 mL et 10.000 L, entre 200 mL et 10.000 L, entre 500 mL et 10.000 L. Dans un mode de réalisation, l’enceinte a un volume d’au moins 1 mL. Dans un mode de réalisation, l’enceinte a un volume d’au moins 10 mL. Dans un mode de réalisation, l’enceinte a un volume d’au moins 100 mL. Dans un mode de réalisation, l’enceinte a un volume d’au moins 500 mL. Dans un mode de réalisation, l’enceinte a un volume d’au moins 1 L. Dans un mode de réalisation, l’enceinte a un volume d’au moins 10 L. Dans un mode de réalisation, l’enceinte a un volume de 100 L, ou plus. Avantageusement, tout bioréacteur comprenant une enceinte close, et apte à produire à l’échelle industrielle des cellules, organoïdes, molécules et/ou assemblages molécules complexes peut être utilisé.
D’une manière générale, l’utilisation d’une enceinte close permet un contrôle fin de l’environnement de culture, sans risque de perturbation par l’environnement extérieur. Il est par ailleurs aisé d’obtenir des produits stériles. Cela permet également un meilleur rendement volumétrique.
Dans un mode de réalisation, les microcompartiments comprennent entre 10% et 98% en volume de cellules à la récolte, soit entre 100 et 1.000.000 de cellules suivant le diamètre du compartiment concerné et la taille des cellules produites, ce qui peut être calculé en réalisant le rapport entre le nombre total de cellules produites (tel que mesuré par l’homme de l’art ave une cellule de Malassez ou un compteur de cellules automatisé) et le nombre de capsules obtenu (tel que mesuré par l’homme de l’art en caractérisant le volume de capsules par comptage manuel sous un microscope optique ou par une analyse d’image automatisée). Bien entendu, il est possible de commencer la culture cellulaire avec des microcompartiments comprenant un nombre plus restreint de cellules au départ, et notamment entre 1 et 1.000 cellules, soit 0.01% et 10% en volume occupé par les cellules au sein du microcompartiment suivant le diamètre du compartiment concerné et la taille des cellules produites. Plus généralement, les microcompartiments selon l’invention comprennent entre 0,01% et 98% en volume de cellules.
Les cellules peuvent ensuite se multiplier à l’intérieur du microcompartiment et s’autoorganiser, notamment en organoïdes.
Dans un mode de réalisation, les cellules d’un microcompartiment sont toutes du même type cellulaire. Selon l’invention, on considère que les cellules d’un même microcompartiment sont toutes du même type cellulaire si au moins 50%, préférentiellement 70%, plus préférentiellement 90%, encore plus préférentiellement 98% ou plus des cellules dudit microcompartiments ont le même phénotype, suivant les connaissances de l’homme de l’art permettant de caractériser ce type cellulaire. Dans un autre mode de réalisation, les cellules d’un microcompartiment sont d’aux moins deux types cellulaires différents. Avantageusement, entre 20 et 100% des cellules d’un compartiment présentent un même phénotype.
Selon l’invention, il est possible de cultiver au sein d’un même bioréacteur des microcompartiments comprenant tous les mêmes types cellulaires, ou inversement présentant des types cellulaires différents. Par exemple, le bioréacteur peut contenir deux types de microcompartiments, contenant chacun un type cellulaire particulier. Le système de culture selon l’invention est particulièrement avantageux pour la production et/ou l’amplification de cellules d’intérêt. En effet, l’organisation des cellules au sein de la capsule d’hydrogel, avec la matrice extracellulaire, permet leur multiplication d’un facteur 2 à 100.000 entre chaque passage.
Par passage, on entend la manipulation des cellules pour ajouter de l’espace ou de la surface de culture afin de continuer l’amplification ou de lancer la différenciation ou l’auto-organisation en organoïdes. Cette opération peut nécessiter dans l’exemple des micro-carriers de recharger le bioréacteur avec de nouveaux micro-carriers. Pour la culture standard à deux dimensions de cellules souches pluripotentes, adhérentes, cette opération consiste à détacher les cellules de l’ancien support de culture afin de réensemencer un nouveau support de culture avec plus de surface, pour l’homme de l’art cette opération peut entraîner la perte de 50% des cellules. Pour la culture en microcompartiments selon l’invention, cela correspond à la dissociation des microcompartiments, la dissociation des ensemble cellulaires autoorganisés ou à leur dispersion en ensembles cellulaires suffisamment petits pour être encapsulés à nouveau dans de nouveaux microcompartiments.
L’invention a notamment pour objet l’utilisation d’un tel système de culture cellulaire en bioréacteur pour la production de masse de cellules pluripotentes.
L’invention a également pour objet l’utilisation d’un tel système de culture cellulaire en bioréacteur pour la production de progéniteurs unipotents ou multipotents à partir de cellules pluripotentes.
L’invention a également pour objet l’utilisation d’un tel système de culture cellulaire en bioréacteur pour la production de cellules terminalement différenciées (c’est-à-dire correspondant à une ou des fonctions spécifiques) à partir de cellules pluripotentes et/ou de progéniteurs unipotents ou multipotents et/ou de combinatoires de ces progéniteurs.
L’invention a notamment pour objet un procédé de production d’organoïdes ou de cellules d’intérêt comprenant les étapes selon lesquelles :
- on introduit une pluralité de microcompartiments cellulaires dans un bioréacteur comprenant une enceinte close, lesdits microcompartiments comprenant chacun une couche externe en hydrogel encapsulant des cellules et de la matrice extracellulaire ou un substitut de matrice extra-cellulaire ;
- on cultive les microcompartiments dans des conditions permettant la multiplication des cellules à l’intérieur des microcompartiments, et/ou l’auto -organisation des cellules en organoïdes ; - on récupère les microcompartiments cellulaires
- et optionnellement, on hydrolyse la couche d’hydrogel pour récupérer les organoïdes ou les cellules d’intérêt.
L’homme du métier est à même d’adapter les conditions de culture au type cellulaire des microcompartiments, afin de favoriser leur multiplication et/ou auto -organisation.
Dans un mode de réalisation, les microcompartiments cellulaires introduits contiennent des cellules pluripotentes, ledit procédé comprenant, à l’intérieur du bioréacteur, une étape de différenciation cellulaire en au moins un type cellulaire d’intérêt et une étape de multiplication desdites cellules différenciées dans les microcompartiments. Par exemple, la production d’organoïdes d’endoderme primitif pour l’étude de la différenciation en tissus endodermiques humains peut être réalisée selon le protocole suivant :
- A partir de l’étape f) d’obtention de microcompartiments, décrite ci-dessus, à 2-3 jour de culture :
Mise en culture en bioréacteur clos de l50mL dans un milieu STEMdiff™ Pancreatic stage 1 du STEMdiff™ Pancreatic Progenitor Kit commercialisé par STEMCELL technologies pendant 3 à 6 jours.
- Utilisation de l’endoderme primitif obtenu pour des études développementales.
Dans un autre mode de réalisation, les microcompartiments cellulaires introduits contiennent des cellules déjà différenciées ou des progéniteurs, ledit procédé comprenant, à l’intérieur du bioréacteur, une étape de multiplication desdites cellules différenciées dans les microcompartiments .
Lors de l’étape de multiplication et/ ou de maturation, les cellules vont avantageusement s’autoorganiser en un organoïde spécifique, selon une organisation propre audit type cellulaire.
Dans un mode de réalisation concernant l’amplification, les microcompartiments introduits dans le bioréacteur ont une densité cellulaire inférieure à 10% d’occupation du volume interne des microcompartiments, préférentiellement 1% encore plus préférentiellement 0.1%. Les cellules vont ensuite se multiplier à l’intérieur des microcompartiments, lors de l’étape de culture.
Dans un mode de réalisation concernant la différenciation et/ou la maturation sans amplification, les microcompartiments introduits dans le bioréacteur ont une densité cellulaire supérieure à 1% d’occupation du volume interne des microcompartiments. Les cellules vont ensuite se différencier et/ou maturer et/ou s’autoorganiser à l’intérieur des microcompartiments, lors de l’étape de culture. Par exemple, un premier type de production d’organoïdes neuraux pour la greffe de neurones dans le cadre de la thérapie cellulaire de la maladie de Parkinson a été réalisée selon le protocole suivant :
- Décongélation de 5 millions de progéniteurs dopaminergiques tels que ceux commercialisés par Cellular Dynamics international (iCell® DopaNeurons),
- Encapsulation de progéniteurs neuraux pré-différenciés selon le protocole décrit dans Alessandri et Al. 2016.
Mise en culture en bioréacteur clos de l50mL dans le milieu de culture fourni par Cellular Dynamics.
- Maturation et structuration des organoïdes neuraux dopaminergiques pendant deux semaines au sein du bioréacteur.
- Préparation de la greffe par dissociation de la capsule d’hydrogel à l’aide de deux rinçages de trente secondes dans 1 mL de ReLeSR® (Stemcell technologies) puis resuspension dans une solution de 11% en masse de dextran 70KDa dans le milieu de culture des neurones, distribution dans une canule en verre fabriquée par nos soins.
Greffe dans un animal modèle de la maladie de Parkinson.
Dans un mode de réalisation combinant amplification et différenciation/maturation, les microcompartiments introduits dans le bioréacteur ont avantageusement une densité cellulaire inférieure à 10% d’occupation du volume interne des microcompartiments, préférentiellement 1% encore plus préférentiellement 0.1%. Les cellules vont ensuite se multiplier à l’intérieur des microcompartiments, lors de l’étape de culture puis lors de l’étape de différenciation. Les cellules vont ensuite s’autoorganiser à l’intérieur des microcompartiments, lors d’une seconde étape de culture qui peut être déclenchée par un changement de la nature du milieu nutritif ou d’un déclencheur physique (température, illumination). Par exemple, un second type de production d’organoïdes neuraux pour la greffe de neurones dans le cadre de la thérapie cellulaire de la maladie de Parkinson a été réalisé selon le protocole suivant :
- A partir de l’étape f) d’obtention de microcompartiments décrite ci-dessus à 2-3 jour de culture :
Mise en culture en bioréacteur clos de l50mL dans un milieu d’induction neurale contenant des inhibiteurs des voies de signalisation BMP2 (Dorsomorphin 2 mM ou LDN 193189 0.5 mM) et TGLbeta (+SB 431542 10 mM), 24(S),25-epoxycholesterol 10 mM sur base neurobasal/DMEM-Ll2 complémenté N2 et B27 pendant 1 à 2 jours.
Mise en culture en bioréacteur clos de l50mL dans un milieu de régionalisation neurale contenant des inhibiteurs des voies de signalisation BMP2 (Dorsomorphin 2 mM ou LDN 193189 0.5 mM) et TGLbeta (+SB 431542 10 mM), deux activateurs de la voie SHH (SHH 200 ng/mL ; Purmorphamine 1 mM) et du LGL8 (100 ng/ml), un inhibiteur de la voie WNT Chir9902l 3 mM), 24(S),25-epoxycholesterol 10 mM sur base neurobasal/DMEM-Fl2 complémenté N2 et B27 pendant 6 jours.
- Mise en culture en bioréacteur clos de l50mL dans un second milieu de régionalisation neurale contenant un inhibiteur de la voie de signalisation BMP2 (Dorsomorphin 2 mM ou LDN 193189 0.5 mM), un inhibiteur de la voie WNT Chir9902l 3 mM), 24(S),25- epoxycholesterol 10mM sur base neurobasal/DMEM-Fl2 complémenté N2 et B27 pendant 1 jours.
Mise en culture en bioréacteur clos de l50mL dans un milieu de maturation et structuration des organoïdes neuraux dopaminergiques pendant deux semaines au sein du bioréacteur contenant AMP cyclique (500mM) + acide ascorbique (200mM) + GDNF (20ng/mL) + BDNF (20ng/mL) + FGF-20 (5ng/mL) + TGFbeta (lng/mL) + trichostatine (10hM) + Compound E (ImM).
- Préparation de la greffe par dissociation de la capsule d’hydrogel à l’aide de deux rinçages de trente secondes dans 1 mL de ReLeSR® (Stemcell technologies) puis resuspension dans une solution de 11% en masse de dextran 70KDa dans le milieu de culture des neurones, distribution dans une canule en verre fabriquée par nos soins.
Greffe dans un animal modèle de la maladie de Parkinson.
Dans un autre mode de réalisation combinant amplification et différenciation/maturation, les microcompartiments introduits dans le bioréacteur ont avantageusement une densité cellulaire inférieure à 10% d’occupation du volume interne des microcompartiments, préférentiellement 1% encore plus préférentiellement 0.1%. Les cellules vont ensuite se multiplier à l’intérieur des microcompartiments. Les cellules sont alors récupérées par dissolution de la capsule, puis soumise à une seconde étape d’encapsulation suivie de l’étape de différenciation, les cellules vont ensuite s’autoorganiser à l’intérieur des microcompartiments, lors d’une seconde étape de culture qui peut être déclenchée par un changement de la nature du milieu nutritif ou d’un déclencheur physique (température, illumination). Par exemple, la production d’organoïdes de pancréas humain pour la greffe de tissus pancréatiques humains a été réalisée selon le protocole suivant :
- A partir de l’étape f) d’obtention de microcompartiments décrite ci-dessus à 2-3 jours de culture :
Mise en culture en bioréacteur clos de l50mL dans un milieu STEMdiff™ Pancreatic stage 1 complémenté par le complément 1A et le complément 1B du STEMdiff™ Pancreatic Progenitor Kit commercialisé par STEMCELL technologies pendant 1 jours.
Mise en culture en bioréacteur clos de l50mL dans un milieu STEMdiff™ Pancreatic stage 1 complémenté par le complément 1B du STEMdiff™ Pancreatic Progenitor Kit commercialisé par STEMCELL technologies pendant 1 jours. Mise en culture en bioréacteur clos de l50mL dans un milieu STEMdiff™ Pancreatic stage 2-4 complémenté par le complément 2A et le complément 2B du STEMdiff™ Pancreatic Progenitor Kit commercialisé par STEMCELL technologies pendant 1 jours.
Mise en culture en bioréacteur clos de l50mL dans un milieu STEMdiff™ Pancreatic stage 2-4 complémenté par le complément 2A et le complément 2B du STEMdiff™ Pancreatic Progenitor Kit commercialisé par STEMCELL technologies pendant 2 jours.
Mise en culture en bioréacteur clos de l50mL dans un milieu STEMdiff™ Pancreatic stage 2-4 complémenté par le complément 3 du STEMdiff™ Pancreatic Progenitor Kit commercialisé par STEMCELL technologies pendant 3 jours.
Mise en culture en bioréacteur clos de l50mL dans un milieu STEMdiff™ Pancreatic stage 2-4 complémenté par le complément 3 du STEMdiff™ Pancreatic Progenitor Kit commercialisé par STEMCELL technologies pendant 5 jours.
- Préparation de la greffe par dissociation de la capsule d’hydrogel à l’aide de deux rinçages de trente secondes dans lmL de ReLeSR® (Stemcell technologies) puis resuspension dans une solution de 11% en masse de dextran 70KDa dans le milieu précédent, distribution dans une canule en verre fabriquée par nos soins.
Greffe dans un animal modèle du diabète de type 1.
Avantageusement, les microcompartiments récupérés à l’issue de l’étape de culture dans le bioréacteur ont une densité cellulaire supérieure à 10% d’occupation du volume interne des microcompartiments, préférentiellement supérieure à 50%, et pouvant aller dans le cas des organoïdes jusqu’à 98% d’occupation.
Le système de culture selon l’invention est également particulièrement intéressant pour la production de molécules d’intérêt et/ou d’assemblages moléculaires complexes, lesdits molécules et/ou d’assemblages moléculaires complexes étant excrétés par les cellules des microcompartiments hors desdits microcompartiments jusque dans le milieu de culture, ou inversement accumulées à l’intérieur du microcompartiment pour une récolte ultérieure. Cette méthode de production permet notamment de limiter les étapes de filtration des éléments cellulaires en les concentrant à l’intérieur des microcompartiments. Cette méthode permet grâce à la séparation dans le bioréacteur du volume convectif et du volume diffusif par la capsule une ségrégation facilitée du milieu contenant les éléments dissous des éléments non solubles ou d’une taille supérieure à la maille de l’hydrogel de la capsule (typiquement 150 à 250 KDa pour l’alginate).
Selon l’invention, les microcompartiments sont alors avantageusement utilisés dans un réacteur en mode d’alimentation continu. Comme exposé ci-dessus, la présence de la coque d’hydrogel protectrice permet de perfuser le milieu de culture avec un débit sans risque d’endommager les cellules. Il est notamment possible de perfuser l’intérieur du réacteur en milieu de culture avec un débit compris entre 0,001 et 100 volumes de cellules contenues dans le bioréacteur par jour.
5

Claims

REVENDICATIONS
1- Système de culture cellulaire en bioréacteur comprenant une enceinte close contenant une pluralité de microcompartiments cellulaires en suspension, dans lequel les microcompartiments comprennent chacun une couche externe en hydrogel ménageant une cavité contenant un ensemble de cellules autoorganisées et de la matrice extracellulaire ou un substitut de matrice extra-cellulaire.
2- Système de culture cellulaire en bioréacteur selon la revendication 1 , dans lequel le ratio volume convectif à l’extérieur des microcompartiments sur volume diffusif à l’intérieur des microcompartiments est compris entre 1 et 10000.
3- Système de culture cellulaire en bioréacteur selon l’une des revendications précédentes, dans lequel tout ou partie des microcompartiments comprennent des cellules autoorganisées en cyste.
4- Système de culture cellulaire en bioréacteur selon l’une des revendications précédentes, dans lequel tout ou partie des microcompartiments comprennent des cellules autoorganisées en organoïdes
5- Système de culture cellulaire en bioréacteur selon l’une des revendications précédentes, dans lequel le bioréacteur est choisi parmi les bioréacteurs en mode d’alimentation par batch, les bioréacteurs en mode d’alimentation par fed batch et les bioréacteurs en mode d’alimentation continu, préférentiellement parmi les bioréacteurs en mode d’alimentation continu (perfusion). 6- Système de culture cellulaire en bioréacteur selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’enceinte présente un volume compris entre 1 mL et 10.000L.
7- Système de culture cellulaire en bioréacteur selon l’une des revendications précédentes, dans lequel les microcompartiments comprennent entre 0,01% et 98% en volume de cellules.
8- Système selon l’une des revendications précédentes, dans lequel les cellules d’un microcompartiment sont toutes du même type cellulaire, ou inversement sont d’aux moins deux types cellulaires différents.
9- Système selon l’une des revendications précédentes, dans lequel les microcompartiments comprennent tous les mêmes types cellulaires, ou inversement présentent au moins partiellement des types cellulaires différents. 10- Utilisation du système de culture cellulaire en bioréacteur selon l’une des revendications 1 à 9, pour la production et/ou amplification de cellules d’intérêt, préférentiellement d’un facteur 2 à 100.000 entre chaque passage.
11- Utilisation du système de culture cellulaire en bioréacteur selon l’une des revendications 1 à 9 pour la production de molécules d’intérêt ou d’assemblages moléculaires complexes, lesdits molécules ou assemblages étant excrétés par les cellules des microcompartiments hors desdits microcompartiments jusque dans le milieu de culture ou inversement accumulées à l’intérieur du microcompartiment pour une récolte ultérieure.
12- Procédé de production d’organoïdes ou de cellules d’intérêt comprenant les étapes selon lesquelles :
- on introduit une pluralité de microcompartiments cellulaires dans un bioréacteur, lesdits microcompartiments comprenant chacun une couche externe en hydrogel encapsulant des cellules et de la matrice extracellulaire ou un substitut de matrice extra-cellulaire ;
- on cultive les microcompartiments dans des conditions permettant la multiplication des cellules à l’intérieur des microcompartiments, et/ou l’auto organisation des cellules en organoïdes ;
- on récupère les microcompartiments cellulaires
- et optionnellement, on hydrolyse la couche d’hydrogel pour récupérer les organoïdes ou les cellules.
13- Procédé selon la revendication 12, dans lequel les microcompartiments cellulaires introduits contiennent des cellules pluripotentes, ledit procédé comprenant, à l’intérieur du bioréacteur, une étape de différenciation cellulaire en au moins un type cellulaire d’intérêt et optionnellement une étape de multiplication desdites cellules différenciées dans les microcompartiments .
14- Procédé selon la revendication 12, dans lequel les microcompartiments cellulaires introduits contiennent des cellules déjà différenciées ou des progéniteurs, ledit procédé comprenant, à l’intérieur du bioréacteur, une étape de multiplication et/ou de maturation desdites cellules différenciées dans les microcompartiments.
15- Procédé selon l’une des revendications 12 à 14, dans lequel les microcompartiments introduits dans le bioréacteur ont une densité cellulaire initiale inférieure à 10% d’occupation du volume interne des microcompartiments, préférentiellement inférieure à 1% encore plus préférentiellement inférieure à 0.1%.
16- Procédé selon l’une des revendications 12 à 15, dans lequel les microcompartiments récupérés à l’issue de l’étape de culture dans le bioréacteur ont une densité cellulaire supérieure à 10% d’occupation du volume interne des microcompartiments.
PCT/FR2019/051144 2018-05-21 2019-05-20 Système de culture cellulaire en bioréacteur Ceased WO2019224467A1 (fr)

Priority Applications (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020565372A JP2021524253A (ja) 2018-05-21 2019-05-20 バイオリアクターでの細胞培養システム
EP19733852.8A EP3797150A1 (fr) 2018-05-21 2019-05-20 Système de culture cellulaire en bioréacteur
KR1020257009299A KR20250044479A (ko) 2018-05-21 2019-05-20 생물반응기에서 세포 배양을 위한 시스템
BR112020023707-8A BR112020023707A2 (pt) 2018-05-21 2019-05-20 sistema de cultura celular em biorreator
KR1020207036522A KR20210011975A (ko) 2018-05-21 2019-05-20 생물반응기에서 세포 배양을 위한 시스템
CN201980034566.7A CN112424333A (zh) 2018-05-21 2019-05-20 用于在生物反应器中进行细胞培养的系统
SG11202011501XA SG11202011501XA (en) 2018-05-21 2019-05-20 System for cell culture in a bioreactor
CA3101003A CA3101003A1 (fr) 2018-05-21 2019-05-20 Systeme de culture cellulaire en bioreacteur
AU2019273006A AU2019273006B2 (en) 2018-05-21 2019-05-20 System for cell culture in a bioreactor
US17/057,143 US20210123013A1 (en) 2018-05-21 2019-05-20 System for cell culture in a bioreactor
MX2020012412A MX2020012412A (es) 2018-05-21 2019-05-20 Sistema de cultivo celular en biorreactor.
IL278775A IL278775A (en) 2018-05-21 2020-11-17 A system for cell culture in a bioreactor
JP2025092385A JP2025128230A (ja) 2018-05-21 2025-06-03 バイオリアクターにおける細胞培養のためのシステム
US19/233,809 US20250304909A1 (en) 2018-05-21 2025-06-10 System for cell culture in a bioreactor

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1854207 2018-05-21
FR1854207A FR3081168B1 (fr) 2018-05-21 2018-05-21 Systeme de culture cellulaire en bioreacteur

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US17/057,143 A-371-Of-International US20210123013A1 (en) 2018-05-21 2019-05-20 System for cell culture in a bioreactor
US19/233,809 Division US20250304909A1 (en) 2018-05-21 2025-06-10 System for cell culture in a bioreactor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019224467A1 true WO2019224467A1 (fr) 2019-11-28

Family

ID=64049308

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2019/051144 Ceased WO2019224467A1 (fr) 2018-05-21 2019-05-20 Système de culture cellulaire en bioréacteur

Country Status (14)

Country Link
US (2) US20210123013A1 (fr)
EP (1) EP3797150A1 (fr)
JP (2) JP2021524253A (fr)
KR (2) KR20250044479A (fr)
CN (1) CN112424333A (fr)
AU (1) AU2019273006B2 (fr)
BR (1) BR112020023707A2 (fr)
CA (1) CA3101003A1 (fr)
CL (1) CL2020003003A1 (fr)
FR (1) FR3081168B1 (fr)
IL (1) IL278775A (fr)
MX (1) MX2020012412A (fr)
SG (1) SG11202011501XA (fr)
WO (1) WO2019224467A1 (fr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023235884A1 (fr) 2022-06-03 2023-12-07 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions et méthodes

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114214267B (zh) * 2021-12-06 2024-04-09 大连大学 一种类器官基质胶微球及其制备方法和应用
CN114672455B (zh) * 2022-03-25 2024-07-09 中山大学 一种利用多能干细胞诱导骨髓基质细胞的方法
FR3151044A1 (fr) * 2023-07-11 2025-01-17 Treefrog Therapeutics Transduction et/ou transfection dans un microcompartiment en trois dimensions
CN118308295B (zh) * 2024-06-06 2024-08-27 上海遇见味来生物技术有限公司 一种促进细胞生产胶原的添加剂、培养基及方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010105311A1 (fr) 2009-03-20 2010-09-23 Angioblast Systems, Inc. Production de cellules pluripotentes reprogrammées
WO2016103002A1 (fr) * 2014-12-22 2016-06-30 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Dispositifs d'agrégation à haut rendement et de manipulation de cellules mammaliennes
WO2018050862A1 (fr) * 2016-09-19 2018-03-22 Ecole Polytechnique Fèdèrale De Lausanne Réseaux d'organoïdes

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1660629A4 (fr) * 2003-07-17 2015-04-08 Global Cell Solutions Llc Systeme et procédé de culture cellulaire automatique
DE10349484A1 (de) * 2003-10-21 2005-05-25 Universität Leipzig Verfahren und Bioreaktor zum Kultivieren und Stimulieren von dreidimensionalen, vitalen und mechanisch widerstandsfähigen Zelltransplantaten
JP2006136212A (ja) * 2004-11-10 2006-06-01 Olympus Corp 細胞培養用担体
CN1288235C (zh) * 2004-11-25 2006-12-06 西安交通大学 一种旋转灌注式生物反应器系统
US9109193B2 (en) * 2007-07-30 2015-08-18 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Continuous perfusion bioreactor system
JP2009247334A (ja) * 2008-04-11 2009-10-29 Toray Ind Inc 細胞培養担体
EP3061808B1 (fr) * 2009-02-03 2020-08-12 Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen Milieu de culture de cellules souches épithéliales et organoïdes comprenant lesdites cellules souches
KR102073530B1 (ko) * 2011-06-06 2020-02-04 리제네시스 비브이비에이 중공 섬유 생물 반응기에서의 줄기 세포의 확장
CN103146572B (zh) * 2011-12-07 2016-01-06 清华大学 一种实现细胞集落均质性生长的装置和方法
PL2739720T3 (pl) * 2012-09-06 2015-06-30 Pluristem Ltd Układy i sposoby hodowli komórek
JP6807853B2 (ja) * 2015-03-03 2021-01-06 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 機能的ヒト組織の作製方法
GB201706544D0 (en) * 2017-04-25 2017-06-07 Plasticell Ltd Method

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010105311A1 (fr) 2009-03-20 2010-09-23 Angioblast Systems, Inc. Production de cellules pluripotentes reprogrammées
WO2016103002A1 (fr) * 2014-12-22 2016-06-30 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Dispositifs d'agrégation à haut rendement et de manipulation de cellules mammaliennes
WO2018050862A1 (fr) * 2016-09-19 2018-03-22 Ecole Polytechnique Fèdèrale De Lausanne Réseaux d'organoïdes

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALESSANDRI ET AL.: "A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC", LAB ON A CHIP, vol. 16, no. 9, 2016, pages 1593 - 1604, XP055393107, DOI: doi:10.1039/C6LC00133E
TAKAHASHI ET AL.: "Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors", CELL, vol. 126, 2006, pages 663 - 676

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023235884A1 (fr) 2022-06-03 2023-12-07 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions et méthodes

Also Published As

Publication number Publication date
CA3101003A1 (fr) 2019-11-28
CL2020003003A1 (es) 2021-04-16
FR3081168A1 (fr) 2019-11-22
KR20210011975A (ko) 2021-02-02
US20210123013A1 (en) 2021-04-29
BR112020023707A2 (pt) 2021-02-09
JP2025128230A (ja) 2025-09-02
SG11202011501XA (en) 2020-12-30
CN112424333A (zh) 2021-02-26
JP2021524253A (ja) 2021-09-13
US20250304909A1 (en) 2025-10-02
FR3081168B1 (fr) 2022-03-11
MX2020012412A (es) 2021-02-09
AU2019273006B2 (en) 2024-11-28
EP3797150A1 (fr) 2021-03-31
KR20250044479A (ko) 2025-03-31
AU2019273006A1 (en) 2020-12-03
IL278775A (en) 2021-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3545080B1 (fr) Microcompartiment cellulaire et procédés de préparation
EP3797150A1 (fr) Système de culture cellulaire en bioréacteur
EP4337761A1 (fr) Microcompartiments cellulaires comprenant des cellules dont l'intégrité génomique est maintenue apres amplification et procede de preparation
CA3222350A1 (fr) Microcompartiments cellulaires de grande taille comprenant plusieurs cystes
EP4214305A1 (fr) Microcompartiments cellulaires comprenant des cellules humaines en cours de differenciation cardiaque, tissus obtenus a partir de ces microcompartiments et utilisations
JPWO2019224467A5 (fr)
FR3124193A3 (fr) Microcompartiments cellulaires de grande taille comprenant plusieurs cystes
WO2025012400A1 (fr) Transduction et/ou transfection dans un microcompartiment en trois dimensions
FR3141945A1 (fr) Substitut de matrice extracellulaire dans un microcompartiment cellulaire
CA3192855A1 (fr) Tissu cardiaque particulier et utilisation dans le traitement de pathologies cardiaque
EP4569083A1 (fr) Substitut de matrice extracellulaire dans un microcompartiment cellulaire
EP3994249A1 (fr) Procede de production in vitro de neurones de mammiferes
FR3138661A1 (fr) Substitut de matrice extracellulaire dans un microcompartiment cellulaire
FR3134117A1 (fr) Microcompartiments cellulaires comprenant des lymphocytes adaptés pour la culture à grande échelle
FR3151339A1 (fr) Optimisation de la culture cellulaire en trois dimensions
FR3134114A1 (fr) Microcompartiments cellulaires comprenant des lymphocytes adaptés pour la culture à grande échelle
EP4504912A1 (fr) Microcompartiments cellulaires comprenant des lymphocytes formant une culture groupee en 3d et ayant une faible teneur en granzyme b

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19733852

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3101003

Country of ref document: CA

Ref document number: 2020565372

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112020023707

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019273006

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20190520

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20207036522

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019733852

Country of ref document: EP

Effective date: 20201221

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112020023707

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20201119

WWD Wipo information: divisional of initial pct application

Ref document number: 1020257009299

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020257009299

Country of ref document: KR

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: MX/A/2020/012412

Country of ref document: MX