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WO2019209068A1 - Hla-g 단백질을 상시 분비 발현하는 세포주 및 이의 제조방법 - Google Patents

Hla-g 단백질을 상시 분비 발현하는 세포주 및 이의 제조방법 Download PDF

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WO2019209068A1
WO2019209068A1 PCT/KR2019/005072 KR2019005072W WO2019209068A1 WO 2019209068 A1 WO2019209068 A1 WO 2019209068A1 KR 2019005072 W KR2019005072 W KR 2019005072W WO 2019209068 A1 WO2019209068 A1 WO 2019209068A1
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WO
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protein
stem cells
culture
extract
hla
Prior art date
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PCT/KR2019/005072
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English (en)
French (fr)
Inventor
이장호
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Stemmedicare Co Ltd
Original Assignee
Stemmedicare Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Stemmedicare Co Ltd filed Critical Stemmedicare Co Ltd
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Priority to US16/486,882 priority patent/US11566220B2/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • stem cells are secured through long-term in vitro culture and injected into patients, risk of mutation and tumor formation to cancer cells in this process, and risk and major histocompatibility by heterologous proteins such as FBS used for cell storage and culture process.
  • Immunogenicity due to the Major Histocompatibility Complex (MHC) mismatch and immunorejection reactions requiring short-term or long-term follow-up are the major technical challenges for the commercialization of stem cell therapy.
  • extracellular vesicles such as exosomes, microvesicles, etc. secreted from cells as well as cells, in order to solve the immune rejection response due to immunogenicity such as cell therapy
  • Various immunomodulatory and inhibitory drugs have been developed, but only partially solved.
  • stem cell culture is known to contain a variety of growth factors, cytokines and the like produced in stem cells, the commercial value of the drug and cosmetics is rapidly increasing.
  • the scalp improvement cosmetic composition comprising the stem cell culture (Korean Patent Publication No. 10-2017-0132460), the upper layer of mesenchymal stem cells having excellent tissue regeneration ability, or excellent disease healing activity, or high physiological activity
  • a method of preparing a liquid (Korean Patent Publication No. 10-2017-0121205) and the like have been developed.
  • the present inventors have made diligent efforts to develop novel stem cells that do not exhibit immunogenicity rejection due to immunogenicity and cultures containing various useful components derived therefrom. As a result, HLA-G proteins known to exhibit immunotolerant properties are always present.
  • a novel stem cell line was secreted and produced. The culture medium of the stem cell line not only contained various extracellular vesicles and proteins, but also confirmed the effects of anti-oxidation and anti-aging directly, thereby completing the present invention. .
  • One object of the invention is the step of culturing trophoblast cells under similar culture conditions in the human body; And it provides a method for producing a trophoblast membrane that always secretes and expresses the HLA-G protein, comprising the step of subcultured cultured trophoblast cells.
  • Another object of the present invention is to co-culture trophoblast and stem cells expressing the secretion of HLA-G protein at all times; And subcultured with the cultured stem cells, to provide a method for producing a stem cell that always secretes and expresses HLA-G protein.
  • Another object of the present invention is to provide a stem cell that is always secreted by the HLA-G protein prepared by the method for producing a constantly expressing HLA-G protein.
  • Yet another object of the present invention is to provide a method for preparing a culture medium of stem cells expressing the HLA-G protein.
  • Yet another object of the present invention is to provide a culture solution of stem cells, which is always secreted and expressed HLA-G protein prepared by the method for producing a culture solution of stem cells that secrete the HLA-G protein.
  • Another object of the present invention is to provide an anti-aging or antioxidant composition comprising the culture solution as an active ingredient.
  • the novel trophoblast cell line and stem cell line established in the present invention may exhibit immunotolerant properties by constantly secreting and expressing HLA-G protein, and the culture medium of the stem cell may be a protein or extracellular vesicle that can normalize various physiologically active functions. Since a large amount and the like, the new cell line or its culture solution can be usefully used in various industries, such as pharmaceuticals, cosmetics.
  • Figure 1 is a graph showing the temperature conditions used in the culture, in order to produce cells with secretory expression of HLA-G protein at all times and have immunotolerant properties. Basic thermometry optimized for human-like environment was applied.
  • Figure 2 is a graph showing the micro-vibration conditions used in the culture, in order to produce cells with secretory expression of HLA-G protein at all times and immunotolerant properties. The daily activity pattern of the human body was reflected.
  • Figure 3 is a graph showing the concentration of HLA-G protein in the culture medium of trophoblast cells, control group cultured cells cultured by a conventional method, experimental group cultured cells reflecting the temperature and vibration conditions described above to be.
  • Figure 4 is a graph showing the concentration of HLA-G protein in the culture medium of a novel stem cell line (MBTC-Cell TM ) that is constantly secreting and expressing HLA-G protein, and the control group was cultured by a conventional method.
  • Culture medium of human-derived mesenchymal stem cells, the experimental group is a culture solution of MBTC-Cell TM .
  • FIG. 5 is a scanning electron micrograph of MBTC-Cell TM -derived culture, and shows extracellular vesicles (MBTC-EV TM ) and proteins such as microvesicles and exosomes having various sizes.
  • Figure 6 is a graph showing the total amount of protein contained in MBTC-Cell TM- derived culture.
  • hAM-MSC, hBM-MSC, HUMSC, hAF-MSC and hADSC each refer to human amnion, bone marrow, umbilical cord blood, amniotic fluid and adipose-derived mesenchymal stem cells cultured by a conventional method.
  • hAM-MSC derived MBTC-Cell TM refers to the human amnion, bone marrow, umbilical cord blood, amniotic fluid and fat-derived mesenchymal stem cells co-cultured with the trophoblast cells.
  • Figure 7 is a venn diagram qualitatively analyzing the types of proteins contained in MBTC-Cell TM- derived culture.
  • Figure 8 is a graph comparing the results of measuring the weight, drinking water and food amount of the mice administered the MBTC-Cell TM- derived culture medium.
  • the control group is 0.9% saline
  • test group 1 is a culture solution of human-derived mesenchymal stem cells cultured by a conventional method
  • test group 2 refers to the MBTC-Cell TM- derived culture administration group.
  • Figure 10 is a graph showing the antioxidant effect of MBTC-Cell TM- derived cultures, and compared the ratio GSH / GSSH (glutathione / glutathione disulfide).
  • the control group is 0.9% saline
  • test group 1 is a culture solution of human-derived mesenchymal stem cells cultured by a conventional method
  • test group 2 refers to the MBTC-Cell TM- derived culture administration group.
  • FIG. 11 is a graph showing the effect of normalizing macrophage phagocytosis of MBTC-Cell TM -derived cultures, and compared LDL cholesterol concentration and HDL cholesterol concentration in blood.
  • the control group is 0.9% saline
  • test group 1 is a culture solution of human-derived mesenchymal stem cells cultured by a conventional method
  • test group 2 refers to the MBTC-Cell TM- derived culture administration group.
  • one embodiment of the present invention is a step of culturing trophoblast cells under similar culture conditions in the human body, wherein the similar culture conditions in the human body is a temperature condition that is changed within the range of 36.3 °C to 37.2 °C, 10 RPM Vibration culture conditions vary within the range from 30 to 30 RPM, and the conditions using a cell culture plate containing extracellular matrix; And it provides a method for producing a trophoblast membrane that always secretes the HLA-G protein, comprising the step of subcultured cultured trophoblast cells.
  • New trophoblast cells expressing the HLA-G protein of the present invention at all times are cultivated by reflecting various physiological characteristics such as growth environment, temperature change and motility of cells in the human body to continuously produce HLA-G protein that can exhibit immunotolerant properties. It may have a secretory expression.
  • trophoblast is a kind of placenta-forming cell, which provides an inner cell mass with signal transduction and nutrients related to embryonic development, It is a cell that plays an important role in the maintenance of pregnancy and fetal development by inducing immune tolerance by protecting the fertilized embryo from the immune system and inducing successful implantation.
  • the role of trophoblast cells is known to be due to the expression of HLA-G protein.
  • the HLA-G protein may be HLA-G5, but is not limited thereto.
  • the similar culture conditions in the human body is a temperature condition that is changed within the range of 36.3 °C to 37.2 °C
  • the temperature condition may be a temperature change condition of 15 days cycle based on the basic body temperature method.
  • basal temperature means pregnancy control using a basal body temperature of a woman.
  • Basal body temperature refers to the body temperature at the moment when all activity is stopped except for breathing, which is usually measured in the morning when you just wake up. According to the menstrual cycle, the basal body temperature repeats the low temperature and the high temperature at two-week intervals. Especially, when the physiology starts, the temperature decreases again when the high temperature is maintained for two weeks after the ovulation day showing the lowest temperature (36.3 ° C). Since such a basic body temperature varies from person to person, the temperature condition can be appropriately adjusted by those skilled in the art as long as it changes within the range of 36.3 ° C to 37.2 ° C.
  • the similar culture conditions in the human body is a vibration culture condition that is changed within the range of 10 RPM to 30 RPM
  • the vibration culture condition may be a vibration culture condition of a 24-hour cycle. This may reflect a daily activity pattern of a person, since such activity patterns vary from person to person, the vibrating culture conditions may be appropriately adjusted by those skilled in the art if they vary within the range of 10 RPM to 30 RPM.
  • the human-like culture conditions may be a condition using a cell culture plate containing an extracellular matrix.
  • the extracellular matrix may be coated on a cell culture plate.
  • extracellular matrix refers to a substance produced by a cell, which serves to protect and support the cell by filling the space between the cell and the tissue.
  • the extracellular matrix may be one or more selected from the group consisting of collagen, fibronectin, and procollagen.
  • the extracellular matrix the step of inoculating fibroblasts at a density of 18,000 to 22,000 cells / cm 2 ; (b) culturing the fibroblasts in serum-free medium; And (c) obtaining fibroblast culture medium after 114 to 126 hours of culture, wherein the serum-free medium comprises 15 to 25% (v / v) of human mesenchymal stem cell-derived protein.
  • the serum-free medium comprises 15 to 25% (v / v) of human mesenchymal stem cell-derived protein.
  • extracellular matrix can be obtained at maximum yield.
  • protein derived from human mesenchymal stem cells means a protein secreted from human mesenchymal stem cells, and as a specific embodiment, derived from human mesenchymal stem cells including a protein derived from human mesenchymal stem cells. It may be a culture solution of.
  • the human mesenchymal stem cell-derived protein may be named interchangeably with "hPC”.
  • the protein derived from human mesenchymal stem cells (a) inoculating human mesenchymal stem cells at a density of 18,000 to 22,000 cells / cm 2 ; (b) culturing the stem cells in serum-free medium; And (c) may be prepared through the step of obtaining a stem cell culture after 114 to 126 hours of culture.
  • proteins derived from human mesenchymal stem cells can be obtained at the maximum yield.
  • the subculture may be one that is passaged more than five passages, specifically, may be one that is passaged for five passages to 15 passages.
  • Secretory expression of HLA-G protein in trophoblast cells is markedly increased when passaged for 5 passages or more.
  • the HLA-G protein may be maintained at 30 ng / ml or more.
  • the HLA-G protein may be secreted to the outside of the trophoblast, and may be HLA-G5 when secreted to the outside, but is not limited thereto.
  • an extracellular matrix such as procollagen, fibronectin, collagen, etc. was prepared and coated with the prepared extracellular matrix.
  • the trophoblast cells were cultured under human basal thermometry and activity pattern. As a result, the expression level of HLA-G protein was increased by the passage of 5 passages or more, and the level was 30 ng / By confirming that it is maintained in more than ml, a new trophoblast cell line was secreted expressing the HLA-G protein at all times (Figs. 1 to 3).
  • the trophoblast cells prepared by the above method secreted HLA-G5 protein and thus could secrete HLA-G protein to the outside of the cell, and the amount of HLA-G5 was increased with passage.
  • the trophoblast cells were able to confirm that HLA-G5 was secreted at all times (FIG. 12).
  • the trophoblast cell line always expresses HLA-G protein that exhibits immunotolerant properties, and thus can be usefully used for development of cell therapeutics or new cell lines requiring immunotolerant properties.
  • Another embodiment comprises coculture with trophoblast and stem cells expressing secretion of HLA-G protein at all times; And subcultured with the cultured stem cells, to provide a method for producing a stem cell that always secretes and expresses HLA-G protein.
  • the stem cells may be mesenchymal stem cells.
  • the term "mesenchymal stem cell” is a cell that helps to create cartilage, bone, fat, myeloid epilepsy, muscle, nerves, and the like. In adults, the cells usually remain in the bone marrow, but the cord blood, peripheral blood, fat, amniotic fluid, etc. It also exists in other tissues, etc., means stem cells that can be obtained from them. Specifically, the mesenchymal stem cells may be derived from fat, bone marrow, umbilical cord blood, amniotic fluid, or amniotic membrane, but is not limited thereto. In addition, the mesenchymal stem cells may be derived from humans or mammals including humans.
  • the HLA-G protein secreted by the stem cells prepared through the steps described above may be present in the culture supernatant and extracellular vesicles, the HLA-G protein may be HLA-G5, but is now limited It doesn't work.
  • the stem cells secrete HLA-G5 to secrete and express HLA-G protein to the outside of the cell, the amount of HLA-G5 protein increased as passaged By confirming that the stem cells were able to confirm that the HLA-G5 protein is always secreted (Fig. 13).
  • the stem cell line expresses the HLA-G protein that exhibits immunotolerant properties at all times, the stem cell line is useful for the development of a cell therapeutic agent or a new cell line requiring immunotolerant properties, the development of an extracellular vesicle therapeutic agent and an immunosuppressive agent having immunotolerant properties. It suggests that it can be utilized.
  • Another embodiment is always secreting the HLA-G protein prepared by the method for producing a culture medium of stem cells expressing the HLA-G protein at all times It provides a culture of the stem cells to express.
  • culture media refers to a medium capable of supporting the growth and survival of cells in vitro , and includes any conventional medium used in the art suitable for cell culture. Include.
  • extracellular vesicle is a heterogeneous group (heterogeneous group) containing a variety of biologically active substances secreted from the cells inside the double phospholipid membrane, depending on the origin and size of development exist. Most cells are involved in various biological reactions by protecting and transporting bioactive molecules such as active proteins and lipids to other cells through these extracellular vesicles. Since the extracellular vesicles have a membrane of a double phospholipid similar to that of the cell of origin, the exogenous antigen of the cell of origin present in this membrane acts as an immunogenicity, thereby causing an immune response. However, since the extracellular vesicles contained in the stem cell culture prepared in the present invention also express the HLA-G protein that can regulate this immune response, it can suppress the immune response through the immune tolerance mechanism when applied to the patient There is an advantage.
  • apoptotic body is a endoplasmic reticulum having a diameter of 1,000 nm or more, and formed when cell nucleus fragments, organelles, etc. adhere to the cell membrane when apoptosis occurs.
  • the stem cell culture prepared according to the present invention contains a large amount of the above-described protein exhibiting immunotolerant properties, the culture can be usefully used for the prevention and / or treatment of autoimmune related diseases.
  • it can be usefully used to suppress the immune rejection response generated in the process of transplanting the cells, tissues, organs or extracellular vesicles, etc. of the cells, tissues for the purpose of restoring the function, regeneration, treatment of cells, tissues, and the like.
  • the stem cell culture prepared according to the present invention contains a large amount of the above-described protein exhibiting the autophagy function normalization characteristics, it can be useful for the prevention and / or treatment of diseases associated with autophagy dysfunction.
  • the intracellular signal transduction homeostasis-related proteins include phosphatase and tensin homologs, SH2-containing inositol phosphatase-1 (SH2 (Src homology 2) -containing inositol phosphatase-1) or Glycogen synthase kinase 3 beta may be, but is not limited to, as long as it is a protein that exhibits intracellular signal transduction homeostasis.
  • the culture solution contains a large amount of proteins for normalizing various biological functions, and thus, may be useful for the treatment of diseases caused by such functional abnormalities.
  • the culture medium of stem cells expressing the HLA-G protein constantly secreted according to the present invention is not only HLA-G protein exhibiting immune tolerance properties, but also other immune tolerance related proteins, proteasome function normalization related proteins, and autophagy function normalization. It contains high levels of related proteins, macrophage-normalizing antioxidant proteins, and intracellular signal transduction homeostasis-related proteins, as well as a variety of extracellular vesicles, which have beneficial physiological activities such as anti-aging and antioxidant activity. Can be represented.
  • the anti-aging or antioxidant composition may be a health functional food, cosmetics, quasi-drugs or feed composition.
  • human fibroblasts were cultured using proteins secreted from mesenchymal stem cells, and extracellular matrix (procollagen, fibronectin, collagen) was secreted from the human fibroblast cells and used to prepare them directly.
  • extracellular matrix procollagen, fibronectin, collagen
  • HAmnio-01 were inoculated at 20,000 cells / cm 2 in DMEM / F12 medium without serum and then treated at 37 ° C and 5% CO.
  • Human Mesenchymal Stem Cells (hPC) were harvested by incubating for 120 hours in 2 incubators. Then, 20,000 cells in a DMEM culture medium in which human fibroblasts (Human CCD-98sk, human fibroblast cells) were added at concentrations (1.25%, 2.5%, 5%, 10%, 20%) in which the hPC showed no cytotoxicity. After inoculation at / cm 2, incubated for 120 hours in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
  • procollagen (collagen precursor), fibronectin (cell adhesion glycoprotein), and collagen (fibrous protein) were determined for each culture supernatant according to the hPC concentration according to a known method. It was measured, and the results are shown in Tables 1 to 3 below.
  • the extracellular matrix prepared by the above method was used for subsequent cell culture.
  • HLA-G protein was used.
  • HLA-G protein is a protein that protects cells from NK cells and functions as an immune tolerant and immunomodulatory agent, such as not mediating allogeneic immune responses by T cells in peripheral blood. It is expressed mainly in trophoblasts, which form the placenta, and plays an important role in inducing successful implantation and maintaining normal pregnancy by inducing immune tolerance to protect fertilized embryos from the mother's immune system at the beginning of implantation.
  • the present inventors pay attention to the immunotolerant properties and various signal transduction properties of trophoblast cells that secrete and express HLA-G protein at the highest level in the human body, and are capable of continuously secreting and expressing HLA-G protein.
  • By establishing its culture conditions and co-culture of the established trophoblast cell line and stem cells it was intended to establish a new stem cell line with induction of immunotolerant properties and with improved signal transduction ability.
  • trophoblast cells expressing HLA-G proteins that have immunotolerant properties through subculture were always produced.
  • Basal body temperature refers to the body temperature at the moment when all activity is stopped except for breathing, which is usually measured in the morning when you just wake up. Changes in basal body temperature are used to determine when ovulation and pregnancy occur in women. The basal body temperature repeats at low and high temperatures every two weeks, depending on the menstrual cycle, especially after ovulation days with the lowest temperature (36.4 °C). Maintaining a hot temperature for a week and then decreasing the body temperature once your period starts. The present inventors noted that such changes in basal body temperature will be closely related to ovulation and fertilization, pregnancy and implantation, and the characteristics of trophoblast cells and the body's immune system, which play an important role in this series of processes.
  • control group was cultured by using a normal cell culture plate, the experimental membrane was cultured in a plate coated with an extracellular matrix (procollagen, collagen, fibronectin) prepared in Example 1.
  • extracellular matrix procollagen, collagen, fibronectin
  • the experimental group was subjected to basic thermometry and shaking incubating conditions as shown in FIGS. 1 and 2. This was subcultured every 3 days, and the culture supernatant was collected at each subculture and the concentration of HLA-G molecules present in the culture supernatant was measured using the Human HLA-G ELISA Kit (LifeSpan BioSciences, Cat. # LS-F5033). Quantification using
  • the concentration of HLA-G protein in culture supernatants collected after 3 passages in the control group gradually decreased, but almost after 10 passages. It was confirmed that no expression.
  • the concentration of HLA-G molecules in the trophoblast cell culture supernatants collected at the passage after 5 passages was maintained at a level of 30 ng / ml or more.
  • trophoblast cells expressing HLA-G protein are always secreted when temperature profiling based on basal thermometry, micro-vibration culture conditions, and extracellular matrix are used in culture.
  • Example 2 the production of trophoblast cells having the characteristics of immunotolerance by constantly expressing HLA-G, which was intended to be used in the production of stem cell lines induced immunotolerance characteristics.
  • the trophoblast cells were cultured in a 6 well plate coated with the extracellular matrix prepared in Example 1.
  • the medium condition was serum-free DMEM Low medium, and as a result, a total of 30 kinds of mixed plant extracts as shown in Table 4 and a mixed composition of 1: 1 mixed hPC (SigGrow TM , Stemmedicare Inc., Korea) were used. 1.0 to 10% by weight relative to the medium was used.
  • one stem cell of human amnion-derived mesenchymal stem cells, human adipose-derived mesenchymal stem cells, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells, and human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells is 3 ⁇ m.
  • HLA-G protein was secreted and expressed in human stem cells obtained at the time of passage in the following manner.
  • the stem cells were washed 2-3 times with D-PBS and centrifuged at 1,000 rpm for 5 minutes to remove all media components.
  • Serum supernatant was harvested 120 hours later by adding DMEM / F12, serum-free medium, and inoculating the cell density at 18,000 to 22,000 cells / cm 2 in a new flask and incubating in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
  • the concentration of HLA-G molecules in each culture supernatant was quantified using a Human HLA-G ELISA kit.
  • HLA-G protein is not detected in the culture supernatant of human-derived stem cells passaged alone, not coculture with the trophoblast cells. Confirmed.
  • the concentration of HLA-G protein increases gradually as the passage is progressed, and the human stem cell cultures collected during the passage after 10 passages. It was confirmed that the concentration of HLA-G molecules present in the supernatant was maintained at a level of 20 ng / ml or more. Furthermore, it was confirmed that HLA-G molecules were continuously present up to 20 passages or more.
  • HLA-G protein is always secreted to express immunotolerance characteristics Induced new stem cell line (hereinafter referred to as MBTC-Cell TM ) it can be seen that can be prepared.
  • Example 4 Preparation method of culture medium derived from a new stem cell line (MBTC-Cell TM )
  • MBTC-Cell TM was inoculated at a density of 18,000 to 22,000 cells / cm 2 in DMEM / F12 medium, which was serum-free, and incubated for 120 hours at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. Collected. The collected supernatant was filtered with a 0.8 ⁇ m filter (MCE MF-Millipore TM ) to remove all cell debris and dead cells. Extracellular vesicles containing MBTC-Cell TM- derived exosomes, microvesicles, etc. (MBTC- EV TM ) and protein composition were obtained.
  • the exogenous virus negative test and the microbial residual test in accordance with the approval standard of the cell therapy product of the Ministry of Food and Drug Safety were conducted, and the MBTC-Cell TM- derived extracellular vesicles (MBTC-EV TM) ) And the protein composition did not contain foreign viruses and microorganisms.
  • Example 4 In order to check the components contained in the MBTC-Cell TM- derived culture medium prepared in Example 4 in more detail, quantitative and qualitative analysis were performed on the proteins contained therein. On the other hand, the control group was used as a culture medium cultured alone of the human-derived mesenchymal stem cells.
  • the new stem cell line prepared in Example 4 human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells derived MBTC-Cell TM (hAM-MSC derived MBTC-Cell TM ), human bone marrow-derived mesenchymal stem cells derived MBTC-Cell TM (hBM-MSC derived MBTC-Cell TM ), human cord blood-derived mesenchymal stem cell-derived MBTC-Cell TM (HUMSC derived MBTC-Cell TM ), human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cell-derived MBTC-Cell TM (hAF-MSC derived MBTC-cell TM) and human adipose derived mesenchymal stem cell-derived MBTC-cell TM (total protein contained in the culture solution produced from hADSC derived MBTC-cell TM
  • MBTC-Cell TM- derived cultures are significantly higher than the total stem cell cultures contained in the total protein content, it can be seen that even if the stem cells derived from different types of proteins similar to each other.
  • Example 5 Among the proteins included in the MBTC-Cell TM- derived culture medium (test group) prepared in Example 5, first, it was determined whether a protein related to immune tolerance was included. On the other hand, the control group was used as a culture medium cultured alone of the human-derived mesenchymal stem cells.
  • test group contains proteins related to immune tolerance at a higher content of about 4 to 8 times higher than the control group.
  • Example 5 Among the proteins included in the MBTC-Cell TM- derived culture medium (test group) prepared in Example 5, it was to check whether the protein related to the normalization of proteasome function. On the other hand, the control group was used as a culture medium cultured alone of the human-derived mesenchymal stem cells.
  • the mass spectrometry of the protein was performed by the method according to Example 6-1.
  • the mass spectrometry of the protein was performed by the method according to Example 6-1.
  • the test group contained proteins related to autophagy function normalization at a content of about 4 to 27 times higher than the control group, and also newly expressed proteins not contained in the control group. It was confirmed.
  • Example 5 Among the proteins included in the MBTC-Cell TM- derived culture medium (test group) prepared in Example 5, it was intended to determine whether the protein associated with the normalization of macrophage phagocytic function. On the other hand, the control group was used as a culture medium cultured alone of the human-derived mesenchymal stem cells.
  • the mass spectrometry of the protein was performed by the method according to Example 6-1.
  • the test group contained proteins related to the normalization of macrophage phagocytosis at a content of about 7 to 45 times higher than the control group, and the proteins not included in the control group were also newly added. It was confirmed that it is expressed.
  • Example 5 Among the proteins included in the MBTC-Cell TM- derived culture medium (test group) prepared in Example 5, it was intended to determine whether the proteins involved in maintaining intracellular signal transduction homeostasis. On the other hand, the control group was used as a culture medium cultured alone of the human-derived mesenchymal stem cells.
  • the mass spectrometry of the protein was performed by the method according to Example 6-1.
  • the test group contains about 49-fold higher levels of proteins related to the maintenance of intracellular signal transduction homeostasis compared to the control group, and newly expressed proteins not contained in the control group. Confirmed.
  • MBTC-Cell TM- derived culture medium prepared in Example 5 has a significant amount of immune tolerance, proteasome function normalization, autophagy function normalization, macrophage phagocytosis function normalization and intracellular signaling homeostasis maintenance efficiency, etc. As a result, it was determined that the physiological effects such as anti-aging are shown.
  • mice were used in each group, and 100 ⁇ l of the sample per mouse was administered to the vein, and then the weight, drinking water, and food volume were measured for 3 days. Aging efficacy was confirmed.
  • Example 7-3 Verification of Macrophage Phagocytosis Normalization Efficacy
  • the trophoblast cells prepared by the present invention secrete HLA-G5 protein to the outside of the trophoblast cells, and the amount of protein increases as the subcultured in the culture supernatant, resulting in the constant secretion of HLA-G5 protein. I could confirm it.

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Abstract

본 발명은 인체 유사 환경에서 최적의 온도 프로파일링 기법을 이용한 면역관용의 특성을 갖는 세포주의 확립 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 영양막세포의 제조 방법, HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포의 제조방법, 상기 제조방법으로 제조된 줄기세포의 배양액 및 상기 배양액을 유효성분으로 포함하는 항노화 또는 항산화용 조성물에 관한 것이다.

Description

HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 세포주 및 이의 제조방법
본 발명은 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 세포주 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 영양막세포의 제조 방법; HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포의 제조방법; 상기 제조방법으로 제조된 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포; HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포의 배양액의 제조방법; 상기 제조방법으로 제조된, HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포의 배양액; 및 배양액을 유효 성분으로 포함하는, 항노화 또는 항산화용 조성물에 관한 것이다.
세포 치료제는 환자 본인 또는 타인에서 채취한 세포를 체외에서 조작 및 배양하여 환자에게 주입함으로써 손상된 세포의 기능 및 조직을 복구하는 근본적 치료법으로 활용이 가능하다. 따라서, 신경 질환, 폐 질환, 간 질환, 암과 같이 기존의 치료방법으로는 치료가 불가능하거나 어려운 질환에 대하여 활발하게 개발이 진행되고 있다. 특히, 자기 복제능(self renewal) 및 다른 세포로의 분화능(differentiation capability)을 갖는 줄기세포(stem cell)를 이용한 임상이 전세계적으로 수천 건 이상이 진행중일 정도로 많은 관심을 받고 있다.
그러나, 줄기세포는 장기간의 체외 배양을 통해 확보되어 환자에게 주입되므로, 이러한 과정에서 암세포로의 변이 및 종양 형성 위험성, 세포 보관 및 배양 과정에 사용되는 FBS 등의 이종단백질에 의한 위해성, 주조직적합성복합체(Major Histocompatibility Complex, MHC) 불일치에 의한 면역원성 및 이로 인한 단기 또는 장기간 추적조사가 필요한 면역거부반응 등의 문제를 안고 있으며, 이는 줄기세포치료제의 상용화에 가장 큰 기술적 난제라고 할 수 있다. 또한, 세포뿐만 아니라 세포에서부터 분비되는 엑소좀(exosome), 미세소포체(microvesicle) 등과 같은 세포외소포체(extracellular vesicle) 등의 이식에 있어서도, 세포치료제와 같은 면역원성에 의한 면역 거부 반응을 해결하기 위해 다양한 면역 조절 및 억제 약물들이 개발되고 있으나, 부분적으로만 해결이 가능한 실정이다.
한편, 줄기세포의 배양액은 줄기세포에서 생산되는 다양한 성장인자, 사이토카인 등을 포함하고 있다고 알려지면서, 의약품 및 화장료로서의 상업적 이용가치가 급상승하고 있다. 관련하여 줄기세포 배양액을 포함하는 두피개선 화장 조성물(한국 공개특허공보 제10-2017-0132460호), 우수한 조직 재생능, 또는 우수한 질환 치유작용, 또는 높은 생리활성을 갖는 중간엽 줄기세포의 배양 상층액을 제작하는 방법(한국 공개특허공보 제10-2017-0121205호) 등이 개발된바 있다.
다만, 현재의 줄기세포 배양액은 인체의 지방 등에서 분리한 줄기세포를 일반적인 세포 배양 방법으로 배양하여 생산되고 있는바, 상기 배양액에 포함될 수 있는 물질은 제한적이며, 이에 따른 효과도 다양하지는 않은 실정이었다.
본 발명자는 면역원성에 의한 면역 거부 반응을 나타내지 않는 신규의 줄기세포 및 이로부터 유래하여 다양한 유용 성분을 포함하는 배양액을 개발하고자 예의 노력 연구한 결과, 면역관용 특성을 나타낸다고 알려진 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 신규의 줄기세포주를 제조하였으며, 상기 줄기세포주의 배양액에는 다양한 세포외소포체 및 단백질이 포함되어 있을 뿐만 아니라, 직접적으로 항산화 및 항노화 등의 효과를 나타냄을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 인체내 유사 배양 조건 하에서 영양막세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 영양막세포를 계대배양하는 단계를 포함하는, HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 영양막세포의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 영양막세포 및 줄기세포를 공배양하는 단계; 및 상기 배양된 줄기세포를 계대배양하는 단계를 포함하는, HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포의 제조방법으로 제조된, HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포의 배양액의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포의 배양액의 제조방법으로 제조된, HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포의 배양액을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 배양액을 유효성분으로 포함하는, 항노화 또는 항산화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서 확립한 신규 영양막세포주, 줄기세포주는 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현함에 따라 면역관용 특성을 나타낼 수 있고, 상기 줄기세포의 배양액에는 다양한 생리활성 기능을 정상화시킬 수 있는 단백질, 세포외소포체 등이 다량 함유되어 있으므로, 신규 세포주 또는 이의 배양액은 의약품, 화장품 등의 다양한 산업에서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1는 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하며 면역관용 특성을 갖는 세포를 제조하기 위하여, 배양 시 사용한 온도 조건을 보여주는 그래프이다. 인체 유사 환경에 최적화된 기초체온법을 적용하였다.
도 2은 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하며 면역관용 특성을 갖는 세포를 제조하기 위하여, 배양 시 사용한 미세 진동 조건을 보여주는 그래프이다. 인체의 하루 활동패턴을 반영하였다.
도 3은 영양막세포의 배양액에 존재하는 HLA-G 단백질의 농도를 보여주는 그래프로서, 대조군은 종래의 방법으로 배양한 세포의 배양액, 실험군은 상기의 온도 및 진동 조건 등을 반영하여 배양한 세포의 배양액이다.
도 4는 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하며 면역관용 특성을 갖는 신규 줄기세포주(MBTC-CellTM)의 배양액에 존재하는 HLA-G 단백질의 농도를 보여주는 그래프로서, 대조군은 종래의 방법으로 배양한 인체 유래 중간엽 줄기세포의 배양액, 실험군은 MBTC-CellTM의 배양액이다.
도 5는 MBTC-CellTM 유래 배양액의 주사전자현미경 사진으로, 다양한 크기를 갖는 미세소포체 및 엑소좀 등의 세포외소포체(MBTC-EVTM) 및 단백질 등을 보여준다.
도 6은 MBTC-CellTM 유래 배양액에 포함된 단백질의 총량을 보여주는 그래프이다. 구체적으로, hAM-MSC, hBM-MSC, HUMSC, hAF-MSC 및 hADSC 각각은 종래의 방법으로 배양한 인체 양막, 골수, 제대혈, 양수 및 지방 유래 중간엽 줄기세포를 의미한다. 또한, hAM-MSC derived MBTC-CellTM, hBM-MSC derived MBTC-CellTM, HUMSC derived MBTC-CellTM, hAF-MSC derived MBTC-CellTM 및 hADSC derived MBTC-CellTM 각각은 상기의 온도 및 진동 조건 등을 반영하여 상기 영양막세포와 공배양한 인체 양막, 골수, 제대혈, 양수 및 지방 유래 중간엽 줄기세포를 의미한다.
도 7은 MBTC-CellTM 유래 배양액에 포함된 단백질의 종류를 정성분석한 벤다이어그램이다.
도 8은 MBTC-CellTM 유래 배양액을 투여한 마우스의 몸무게, 음수량 및 먹이량 측정 결과를 비교한 그래프이다. 대조군은 0.9% 식염수, 시험군1은 종래의 방법으로 배양한 인체 유래 중간엽 줄기세포의 배양액, 시험군2는 상기 MBTC-CellTM 유래 배양액 투여군을 의미한다.
도 9는 MBTC-CellTM 유래 배양액의 항노화 효과를 보여주는 그래프로서, 성장 호르몬(Growth Hormone) 및 인슐린-유사 성장인자 1(Insulin-like Growth Factor 1: IGF-1)의 발현 정도를 비교하였다. 대조군은 0.9% 식염수, 시험군1은 종래의 방법으로 배양한 인체 유래 중간엽 줄기세포의 배양액, 시험군2는 상기 MBTC-CellTM 유래 배양액 투여군을 의미한다.
도 10은 MBTC-CellTM 유래 배양액의 항산화 효과를 보여주는 그래프로서, GSH/GSSH(glutathione/glutathione disulfide) 비율을 비교하였다. 대조군은 0.9% 식염수, 시험군1은 종래의 방법으로 배양한 인체 유래 중간엽 줄기세포의 배양액, 시험군2는 상기 MBTC-CellTM 유래 배양액 투여군을 의미한다.
도 11은 MBTC-CellTM 유래 배양액의 대식세포 포식 기능 정상화 효과를 보여주는 그래프로서, 혈중 내 LDL 콜레스테롤 농도 및 HDL 콜레스테롤 농도를 비교하였다. 대조군은 0.9% 식염수, 시험군1은 종래의 방법으로 배양한 인체 유래 중간엽 줄기세포의 배양액, 시험군2는 상기 MBTC-CellTM 유래 배양액 투여군을 의미한다.
도 12는 영양막세포의 배양액에 존재하는 HLA-G5 단백질의 농도를 보여주는 그래프로서, 대조군은 종래의 방법으로 배양한 세포의 배양액, 시험군은 상기 도 1 및 도 2의 온도 및 진동 조건 등을 반영하여 배양한 세포의 배양액이다.
도 13은 HLA-G5 단백질을 상시 분비 발현하며 면역관용 특성을 갖는 신규 줄기세포주(MBTC-CellTM)의 배양액에 존재하는 HLA-G5 단백질의 농도를 보여주는 그래프이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 인체내 유사 배양 조건 하에서 영양막세포를 배양하는 단계로서, 상기 인체내 유사 배양 조건은 36.3℃ 내지 37.2℃ 범위 내에서 변화되는 온도 조건, 10 RPM 내지 30 RPM 범위 내에서 변화되는 진동 배양 조건, 및 세포외기질을 함유하는 세포배양 플레이트를 이용하는 조건인 것인 단계; 및 상기 배양된 영양막세포를 계대배양하는 단계를 포함하는, HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 영양막세포의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 신규 영양막세포는 인체 내 세포의 성장 환경, 온도 변화, 운동성 등 다양한 생리적 특성을 반영하여 배양됨으로써 면역관용 특성을 나타낼 수 있는 HLA-G 단백질을 지속적으로 분비 발현하는 특성을 가질 수 있다.
본 발명의 용어, "HLA-G 단백질"은 인간 백혈구 항원 G(human leukocyte antigen G) 또는 HLA-G 조직적합성 항원 클래스, G 등으로 불리는 단백질을 의미한다. HLA-G 단백질은 낮은 다형성, 면역세포에 작용하는 특이성으로 인하여 면역세포의 독성을 낮추고 조절 T 세포의 분화를 촉진함으로써 면역 관용 역할을 한다. 활성화된 T 세포의 활성을 감소시킴과 동시에 T 조절세포의 증식을 촉진시켜 상대적으로 T 세포에 의한 면역 반응을 감소시키게 되며, 수지상세포의 성숙 및 NK 세포의 활성을 감소시키며 B 세포의 활성을 억제시키는 등 모든 종류의 면역세포로부터의 공격으로부터 보호받을 수 있는 면역관용에 중심적인 역할을 한다. 따라서, HLA-G가 발현된 세포, 세포외소포체 등은 면역 관용 특성을 갖게 되며, 인체에 적용되면 국소적 또는 전신에 걸쳐 면역 거부 반응을 억제하여 환자의 면역체계로부터 안전하게 보호될 수 있다. HLA-G 단백질은 7가지 종류가 있으며, 이 중 HLA-G1/2/3/4 단백질은 세포막, 세포표면에서 발현되며, HLA-G5/6/7은 세포외부로 분비되는 단일분자 형태이다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 HLA-G 단백질은 HLA-G5일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "영양막세포"(trophoblast)는 태반을 형성하는 세포의 일종으로, 발생 초기 세포 내괴(inner cell mass)에 배아 발생과 관련된 신호 전달 및 영양물질을 제공하며, 착상 초기에 산모의 면역체계로부터 수정된 배아를 보호하는 면역 관용을 일으켜서 성공적인 착상을 유도함으로써 임신의 유지 및 태아의 발달에 중요한 역할을 하는 세포이다. 이와 같은 영양막세포의 역할은 HLA-G 단백질의 발현에 의한 것으로 알려져 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 HLA-G 단백질은 HLA-G5일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 인체내 유사 배양 조건은 36.3℃ 내지 37.2℃ 범위 내에서 변화되는 온도 조건이며, 상기 온도 조건은 기초체온법에 기반한 15일 주기의 온도 변화 조건인 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "기초체온법"은 여성의 기초체온을 이용한 임신조절법을 의미한다. 기초체온은 호흡 외에 모든 활동이 멈춘 순간의 체온을 의미하며, 통상 잠에서 막 깬 아침에 재는 체온이다. 월경 주기에 따라 기초체온이 저온기 및 고온기가 2주 간격으로 반복되는데 특히 가장 낮은 온도(36.3℃)를 보이는 배란일 이후 2주 간 고온기가 유지되다가 생리가 시작하면 다시 체온이 떨어지게 된다. 이와 같은 기초체온은 사람마다 다르므로, 상기 36.3℃ 내지 37.2℃ 범위 내에서 변화하는 것이라면 온도 조건은 당업자가 적절히 조절할 수 있다.
또한, 상기 인체내 유사 배양 조건은 10 RPM 내지 30 RPM 범위 내에서 변화되는 진동 배양 조건이며, 상기 진동 배양 조건은 24시간 주기의 진동 배양 조건인 것일 수 있다. 이는, 사람의 하루 활동 패턴을 반영한 것일 수 있고, 이와 같은 활동 패턴은 사람마다 다르므로, 상기 10 RPM 내지 30 RPM 범위 내에서 변화하는 것이라면 진동 배양 조건은 당업자가 적절히 조절할 수 있다.
또한, 상기 인체내 유사 배양 조건은 세포외기질을 함유하는 세포배양 플레이트를 이용하는 조건일 수 있다. 구체적인 실시 양태로서, 상기 세포외기질은 세포배양 플레이트 상에 코팅되는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "세포외기질"은 세포와 조직 사이의 공간을 채워줌으로써 세포를 보호하고 지지해주는 역할을 하는, 세포에 의해 생성되는 물질이다. 구체적으로, 상기 세포외기질은, 콜라겐, 파이브로넥틴, 프로콜라겐으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 세포외기질은, 섬유아세포를 18,000 내지 22,000 세포/cm2의 밀도로 접종하는 단계; (b) 상기 섬유아세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) 배양 114 내지 126시간 경과 후 섬유아세포 배양액을 수득하는 단계를 통해 제조되는 것으로서, 상기 무혈청 배지는 인간 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 15 내지 25%(v/v)로 포함하는 것일 수 있다. 상기의 조건에서 섬유아세포를 배양하는 경우 세포외기질을 최대의 생산량으로 수득할 수 있다.
본 발명의 용어, "인간 중간엽 줄기세포 유래의 단백질"은 인간 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 단백질을 의미하며, 구체적인 실시 양태로서 인간 중간엽 줄기세포 유래의 단백질이 포함된 인간 중간엽 줄기세포 유래의 배양액일 수 있다. 본 명세서에서 상기 인간 중간엽 줄기세포 유래의 단백질은 "hPC"와 혼용되어 명명될 수 있다.
구체적으로, 상기 단백질은 인간 중간엽 줄기세포 유래의 성장인자 또는 사이토카인을 포함할 수 있으며, 더욱 구체적으로 AR, BDNF, bFGF, BMP-4, BMP-5, BMP-7, b-NGF, EGF-R, FGF-4, FGF-7, GDF-15, GDNF, HGF, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-6, IGF-1, Insulin, MCSF, MCSF-R, NGF-R, NT-3, NT-4, OPG, PDGF-AA, PIGF, SCF, SCF-R, TGF-α, TGF-β1, VEGF, VEGF-R3, ICAM-1, G-CSF, IL-1α, IL-2, IL-5, IL-6, IL-8, IL-11, MCP-1, MIG, MIP-1a, MIP-b, MIP-d, TIMP-1, TIMP-2, TNFα, TNFβ, TNF-R1 또는 TNF-R11를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 인간 중간엽 줄기세포 유래의 단백질은, (a) 인간 중간엽 줄기세포를 18,000 내지 22,000 세포/cm2의 밀도로 접종하는 단계; (b) 상기 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) 배양 114 내지 126시간 경과 후 줄기세포 배양액을 수득하는 단계를 통해 제조되는 것일 수 있다. 상기의 조건에서 인간 중간엽 줄기세포를 배양하는 경우 인간 중간엽 줄기세포 유래의 단백질을 최대의 생산량으로 수득할 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 계대배양은 5 계대 이상 계대배양되는 것일 수 있고, 구체적으로 5 계대 내지 15 계대동안 계대배양되는 것일 수 있다. 5 계대 이상 계대배양될 때 영양막세포의 HLA-G 단백질의 분비 발현이 현저하게 증가하는 효과를 나타낸다.
또한, 전술한 바와 같은 단계를 통해 제조된 본 발명의 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 영양막세포에서, 상기 HLA-G 단백질은 30 ng/ml 이상으로 유지되는 것일 수 있다. 이때, 상기 HLA-G 단백질은 영양막세포 외부로 분비될 수 있으며, 외부로 분비 발현 될 경우 HLA-G5 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, hPC 20%를 첨가한 배지를 사용하여 사람섬유아세포를 배양함으로써 프로콜라겐, 파이브로넥틴, 콜라겐 등의 세포외기질을 제조하였고, 상기 제조한 세포외기질로 코팅한 배양 플레이트를 사용하여, 사람의 기초체온법 및 활동 패턴을 적용한 조건으로 영양막세포를 배양한 결과, 5 계대 이상의 계대배양을 진행하는 경우 HLA-G 단백질의 발현양이 증가하여 그 수준이 30 ng/ml 이상으로 유지됨을 확인함으로써, HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 신규 영양막세포주를 확립하였다(도 1 내지 3).
또한, 상기 방법에 의해 제조된 영양막세포는 HLA-G5 단백질을 분비함을 확인하여 HLA-G 단백질을 세포 외부로 분비할 수 있음을 확인하였으며, 계대배양을 할수록 HLA-G5의 양이 증가됨을 확인하여 상기 영양막세포는 HLA-G5을 상시 분비 발현함을 확인할 수 있었다(도 12).
이는, 상기 영양막세포주는 면역관용 특성을 나타내는 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하므로, 면역관용 특성이 요구되는 세포 치료제 또는 신규 세포주의 개발 등에 유용하게 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.
다른 하나의 양태는 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 영양막세포 및 줄기세포를 공배양하는 단계; 및 상기 배양된 줄기세포를 계대배양하는 단계를 포함하는, HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포의 제조방법을 제공하는 것이다.
또 다른 하나의 양태는 상기 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포의 제조방법으로 제조된, HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포를 제공한다.
이때, 상기 "HLA-G 단백질" 및 "영양막세포"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 신규 줄기세포주(본 명세서에서, "MBTC-CellTM"로 명명됨)는 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 영양막세포와의 공배양을 통해 배양됨으로써 면역관용 특성을 나타낼 수 있는 HLA-G 단백질을 지속적으로 분비 발현하는 특성을 가질 수 있다. 나아가 면역관용, 프로테아좀 기능 정상화, 오토파지 기능 정상화, 대식세포 포식 기능 정상화, 세포 내 신호전달 항상성 유지와 관련한 관련 단백질 등을 많은 양으로 발현할 수 있으므로, 상기 줄기세포 또는 이의 배양액은 전술한 기능의 불활성화에 의한 다양한 질환의 치료 등에 면역 거부반응 없이 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 용어, "중간엽 줄기세포"는 연골, 뼈, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등을 만드는데 원조가 되는 세포로서, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대혈, 말초혈액, 지방, 양수 등 기타 조직 등에도 존재하며, 이들로부터 수득할 수 있는 줄기세포를 의미한다. 구체적으로, 상기 중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 제대혈, 양수 또는 양막 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 또는 인간을 포함한 포유류에서 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 줄기세포는 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 영양막세포와 공배양(co-culture)되는 것일 수 있다. 공배양은 서로 다른 두 종류의 세포를 하나의 배양 용기에서 배양하는 것으로서, 세포가 서로 접촉하지는 않으나 배양액을 공유함으로써 각 세포로부터 분비된 물질에 영향을 받게 된다. 본 발명의 줄기세포 또한 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 영양막세포와의 공배양 등을 통해 상호작용하면서 HLA-G 단백질을 상시 세포 외부로 분비 발현하는 특성을 갖게 될 수 있다. 이때, 상기 HLA-G 단백질은 HLA-G5 단백질 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 공배양은 인간 중간엽 줄기세포 유래의 단백질 및 식물 추출물이 1:0.5 내지 1:1.5의 비율로 혼합된 혼합물을 포함하는 배지로 수행되는 것일 수 있다.
이때, 상기 "인간 중간엽 줄기세포 유래의 단백질"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서, 상기 식물 추출물은 루이보스잎추출물, 서양측백나무잎추출물, 티트리잎추출물, 로즈마리잎추출물, 병풀추출물, 살비아잎추출물, 선백리향추출물, 레몬밤잎추출물, 히솝추출물, 꽃박하잎추출물, 감초뿌리추출물, 참당귀뿌리추출물, 천궁뿌리추출물, 작약뿌리추출물, 자소엽잎추출물, 약모밀추출물, 녹차추출물, 복령추출물, 인삼뿌리추출물, 뽕나무껍질추출물, 라임추출물, 레몬추출물, 포도추출물, 멜론추출물, 블루베리추출물, 매실추출물, 커피콩추출물, 무환자열매추출물, 오렌지추출물, 파인애플추출물 또는 이들의 조합인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 혼합물은, 상기 인간 중간엽 줄기세포 유래의 단백질 및 식물 추출물이 1:0.5 내지 1:1.5의 비율, 구체적으로 1:1의 비율로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상, 상기 계대배양은 10 계대 내지 30 계대 동안 계대배양되는 것일 수 있다. 상기의 범위로 계대배양될 때 줄기세포가 건강한 상태를 유지할 수 있으며, HLA-G 단백질의 분비 발현 또한 현저하게 증가하는 효과를 나타낸다.
또한, 전술한 바와 같은 단계를 통해 제조된 줄기세포가 분비 발현하는 HLA-G 단백질은 배양 상층액 및 세포외소포체에 존재하는 것일 수 있으며, HLA-G 단백질은 HLA-G5일 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.
또한, 상기 HLA-G 단백질은 20 ng/ml 이상으로 유지되는 것일 수 있고, 구체적으로 20 내지 30 ng/ml으로 유지되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 신규 영양막세포와 중간엽 줄기세포를 공배양하고, 공배양 시 30종의 혼합 식물추출물 및 hPC를 1:1로 혼합한 것을 배지에 1.0 내지 10 중량%로 첨가하여 배양한 결과, 10 계대 이상의 계대배양을 진행하는 경우 HLA-G 단백질의 분비량이 증가하여 그 수준이 20 ng/ml 이상으로 유지됨을 확인함으로써, HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 신규 줄기세포주를 확립하였다(도 4).
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 줄기세포가 HLA-G5를 분비함을 확인하여 세포 외부로 HLA-G 단백질을 분비 발현함을 확인할 수 있었으며, 계대배양할수록 HLA-G5 단백질의 양이 증가함을 확인하여 상기 줄기세포는 HLA-G5 단백질을 상시 분비 발현함을 확인할 수 있었다(도 13).
이는, 상기 줄기세포주는 면역관용 특성을 나타내는 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하므로, 면역관용 특성이 요구되는 세포 치료제 또는 신규 세포주의 개발, 면역관용 특성을 갖는 세포외소포체 치료제 및 면역억제제 개발 등에 유용하게 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포의 제조방법으로 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포를 제조하는 단계; 및 상기 줄기세포 제조시의 계대배양시 수득된 줄기세포를, (a) 18,000 내지 22,000 세포/cm2의 밀도로 접종하는 단계; 및 (b) 상기 줄기세포를 무혈청 배지에서 114 내지 126 시간 동안 배양하여 배양 상층액을 수득하는 단계를 포함하는, HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포의 배양액의 제조방법을 제공한다.
또 다른 하나의 양태는 상기 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포의 배양액의 제조방법으로 제조된, HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포의 배양액을 제공한다.
이때, 상기 "인간 중간엽 줄기세포 유래의 단백질"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서, 상기 제조된 줄기세포 배양액은 세포외소포체를 함유하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "배양액"(culture media)은 인비트로(in vitro) 상에서 세포들의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하며, 세포 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제조된 줄기세포의 배양액은 줄기세포에서 세포 외부로 분비 발현된 HLA-G 단백질 및 HLA-G 단백질을 함유하는 세포외소포체를 포함할 수 있으며, 이때, 상기 HLA-G 단백질은 HLA-G5 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "세포외소포체"(Extracellular Vesicle)는 세포에서 분비되는 다양한 생리활성 물질을 이중 인지질 막 내부에 포함하고 있는 비균질한 군(heterogeneous group)으로서, 발생 기원 및 크기에 따라 다양한 종류가 존재한다. 대부분의 세포는 이러한 세포외소포체를 통해 활성 단백질, 지질 등의 생리활성분자들을 보호 및 운반하여 다른 세포에 전달함으로써 다양한 생물학적 반응에 관여하게 된다. 세포외소포체도 그 기원세포의 세포막과 거의 동일한 이중인지질의 막을 가지고 있으므로, 이 막에 존재하는 기원세포의 외래성 항원이 면역원성으로 작용하여 이로 인하여 면역반응을 일으킬 수 있다. 그러나, 본 발명에서 제조된 줄기세포 배양액에 포함된 상기 세포외소포체는 이러한 면역반응을 조절할 수 있는 HLA-G 단백질을 또한 발현하고 있으므로, 환자에게 적용 시 면역 관용 기전을 통해 면역 반응을 억제시킬 수 있는 장점이 있다.
구체적으로, 상기 세포외소포체는 자멸소체(Apototic Body), 미세소포체(Microvesicle) 및 엑소좀(Exosome)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 미세소포체 및 엑소좀으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 용어, "자멸소체"는 직경이 1,000nm 이상이며, 세포 자멸사가 일어날 때 세포 핵 조각이나 소기관 등이 세포막에 붙어 있는 형태로 생기는 소포체이다.
또한, 상기 용어, "엑소좀(Exosome)"은 직경이 30~150nm 정도이며, 세포 내에서 원형질막과 다포성소체가 결합된 엔도솜 형태가 세포막과의 퓨전 기전을 통해 세포 외부로 분비되는 소포체이다.
또한, 상기 용어, "미세소포체(Microvesicle)"는 직경이 50~1,000nm 정도이며, 세포 원형질막 바깥쪽으로 직접 분비되는 소포체이다.
또한, 본 발명에서, 상기 제조된 줄기세포 배양액은 총 단백질 함량이 증가된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 제조된 줄기세포 배양액은, HLA-G를 상시 분비 발현하지 않는 줄기세포의 배양액 또는 HLA-G를 상시 분비 발현하는 영양막세포와 공배양되지 않은 중간엽 줄기세포의 배양액보다 총 단백질 함량이 증가된 것일 수 있다.
이때, 상기 단백질은, 면역관용 관련 단백질, 프로테아좀 기능 정상화 관련 단백질, 오토파지 기능 정상화 관련 단백질, 대식세포 포식 기능 정상화 관련 항산화 단백질, 또는 세포 내 신호 전달 항상성 유지 관련 단백질인 것일 수 있다.
또한, 구체적으로, 상기 면역관용 관련 단백질은, 팩신(Fascin), 갈렉틴-3(Galectin-3), 갈렉틱-3-바인딩 단백질(Galectic-3-binding Protein), 펩티딜프롤일 시스-트랜스 이소머라제 B(Peptidylprolyl cis-trans isomerase B), 포크헤드 박스 P3(Forkhead box P3), 인터류킨-10(Interleukin-10) 또는 형질전환 성장인자 베타1(Transforming growth factor beta 1)일 수 있으나, 면역관용 특성을 나타내는 단백질인 한, 이에 제한되지 않는다.
따라서, 본 발명에 따라 제조된 줄기세포 배양액은 면역관용 특성을 나타내는 전술한 단백질을 많은 양으로 포함하고 있으므로, 상기 배양액은 자가면역 관련 질환의 예방 및/또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 아울러, 세포, 조직의 기능 복원, 재생, 치료 등을 목적으로 자가, 타가의 세포, 조직, 장기 또는 세포외소포체 등을 이식하는 과정에서 발생되는 면역 거부 반응을 억제하는데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 구체적으로, 상기 프로테아좀 기능 정상화 관련 단백질은, 26S 프로테아제 조절 서브유닛 8(26S protease regulatory subunit 8), 26S 프로테아좀 비-ATP아제 조절 서브유닛 2(26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 2), 26S 프로테아좀 비-ATP아제 조절 서브유닛 3, 26S 프로테아좀 비-ATP아제 조절 서브유닛 6, 열충격 70kDa 단백질 1L(Heat shock 70kDa protein 1L), 26S 프로테아제 조절 서브유닛 S10B, E3 유비퀴틴-단백질 리가제 BRE1B(E3 ubiquitin-protein ligase BRE1B), 열충격 70kDa 단백질 6(Heat shock 70kDa protein 6), 열충격 70kDa 단백질 90Bb(Heat shock 70kDa protein 90Bb), 열충격 단백질 베타-1(Heat shock protein beta-1), 열충격 단백질 90-베타, 열충격-연관 70kDa 단백질 2(Heat shock-related 70kDa protein 2), 열충격-연관 70kDa 단백질 8(Heat shock-related 70kDa protein 8), 26S 프로테아좀 비-ATP아제 조절 서브유닛 1, 프로테아좀 서브유닛 알파 타입-1(Proteasome subunit alpha type-1), 프로테아좀 서브유닛 알파 타입-2, 프로테아좀 서브유닛 알파 타입-5, 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-4, 프로테아좀 서브유닛 알파 타입-6, 프로테아좀 서브유닛 알파 타입-7, 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-5, 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-8, 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-1, 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-2, 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-3 또는 유비퀴틴-유사 조절자-활성 효소 1(Ubiquitin-like modifier-activating enzyme 1)일 수 있으나, 프로테아좀 기능 정상화 특성을 나타내는 단백질인 한, 이에 제한되지 않는다.
따라서, 본 발명에 따라 제조된 줄기세포 배양액은 프로테아좀 기능 정상화 특성을 나타내는 전술한 단백질을 많은 양으로 포함하고 있으므로, 상기 배양액은 프로테아좀 기능 이상 관련 질환의 예방 및/또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 구체적으로, 상기 오토파지 기능 정상화 관련 단백질은, 세포 사멸의 Bcl2-연관 아고니스트(Bcl2-associated agonist of cell death), NF-카파-B 필수 조절자(NF-kappa-B essential modulator), 인슐린(Insulin), 전-표피 성장 인자(Pro-epidermal growth factor), 소마토트로핀(Somatotropin), 형질전환 성장 인자 베타-2(Transforming growth factor beta-2), 인터류킨-1 베타(Interleukin-1 beta), 리소솜-연관 막 단백질2(Lysosomal-associated membrane protein 2), 오토파지-연관 단백질 16-2(Autophagy-related protein 16-2), 오토파지-연관 단백질 9A 또는 만노스-6-포스페이트(Mannose-6-phosphate)일 수 있으나, 오토파지 기능 정상화 특성을 나타내는 단백질인 한, 이에 제한되지 않는다.
따라서, 본 발명에 따라 제조된 줄기세포 배양액은 오토파지 기능 정상화 특성을 나타내는 전술한 단백질을 많은 양으로 포함하고 있으므로, 오토파지 기능 이상 관련 질환의 예방 및/또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 구체적으로, 상기 대식세포 포식 기능 정상화 관련 항산화 단백질은, 글루타치온 S-트랜스퍼라제 오메가-1(Glutathione S-transferase omega-1), 글루타치온 리덕타제(Glutathione reductase), 페록시리독신-1(Peroxiredoxin-1), 페록시리독신-2, 페록시리독신-4, 페록시리독신-6 또는 수퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase)일 수 있으나, 대식세포 포식 기능 정상화 특성을 나타내는 단백질인 한, 이에 제한되지 않는다.
따라서, 본 발명에 따라 제조된 줄기세포 배양액은 대식세포 포식 기능 정상화 특성을 나타내는 전술한 단백질을 많은 양으로 포함하고 있으므로, 대식세포 포식 기능 이상 관련 질환의 예방 및/또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 대식세포의 포식 기능은 활성산소종/활성질소종의 제거에도 관여하는 바, 산화적 스트레스 관련 질환의 예방 및/또는 치료에도 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 구체적으로, 상기 세포 내 신호 전달 항상성 유지 관련 단백질은, 포스파타제 및 텐신 동종형(Phosphatase and tensin homolog), SH2-포함 이노시톨 포스파타제-1(SH2(Src homology 2)-containing inositol phosphatase-1) 또는 글리코겐 신타제 키나제 3 베타(Glycogen synthase kinase 3 beta)일 수 있으나, 세포 내 신호 전달 항상성 특성을 나타내는 단백질인 한, 이에 제한되지 않는다.
따라서, 본 발명에 따라 제조된 줄기세포 배양액은 세포 내 신호 전달 항상성 유지 특성을 나타내는 전술한 단백질을 많은 양으로 포함하고 있으므로, 상기 배양액은 세포 내 신호 전달의 항상성을 유지 기능 이상 또는 세포 내 과도한 신호 전달과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포의 배양액에는 면역관용 관련 단백질, 프로테아좀 기능 정상화 관련 단백질, 오토파지 기능 정상화 관련 단백질, 대식세포 포식 기능 정상화 관련 항산화 단백질, 또는 세포 내 신호 전달 항상성 유지 관련 단백질 등이 높은 함량으로 포함되어 있으며, 미세소포체, 엑소좀 등의 세포외소포체도 다양하게 포함되어 있음을 확인하였다(도 5 내지 7, 및 표 5 내지 9).
이는, 상기 배양액은 다양한 생체 기능을 정상화시키는 단백질 등을 다량 포함하고 있으므로, 이와 같은 기능 이상에 의해 발병되는 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
또 다른 하나의 양태는 상기 배양액을 유효성분으로 포함하는, 항노화 또는 항산화용 조성물을 제공한다.
이때, 상기 "배양액"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에 따른 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포의 배양액은, 면역관용 특성을 나타내는 HLA-G 단백질뿐만 아니라, 이외에 다른 면역관용 관련 단백질, 프로테아좀 기능 정상화 관련 단백질, 오토파지 기능 정상화 관련 단백질, 대식세포 포식 기능 정상화 관련 항산화 단백질, 세포 내 신호 전달 항상성 유지 관련 단백질 등을 높은 함량으로 포함하고 있으며, 동시에 다양한 세포외소포체도 포함하고 있는바, 항노화, 항산화 등과 같은 유리한 생리 활성을 나타낼 수 있다.
구체적으로, 상기 항노화 또는 항산화용 조성물은 건강기능식품, 화장료, 의약외품 또는 사료 조성물인 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "건강기능식품"(functional food)은 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 본 발명에서, 상기 건강기능식품은 건강식품 또는 건강보조식품과 호용된다.
본 발명의 용어, "화장료"는 인체를 청결, 미화하여 매력을 더하고 용모를 밝게 변화시키거나 피부, 모발의 건강을 유지 또는 증진하기 위하여 인체에 사용되는 물품으로서 인체에 대한 작용이 경미한 것을 의미한다. 피부의 미백에 도움을 주거나, 피부의 주름개선에 도움을 주거나, 피부를 곱게 태워주거나 자외선으로부터 피부를 보호하는데 도움을 주는 기능성화장품의 의미도 포함된다.
본 발명의 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미한다. 예를 들어, 약사법에 따른 의약외품은 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람/동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
본 발명의 용어, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포의 배양액을 마우스에 투여한 결과, 항노화 관련 바이오마커인 GF 및 IGF-1의 발현이 증가하고, 대표적인 항산화 관련 바이오마커인 혈중 내 GSH/GSSH 비율이 증가하며, 혈중 내 LDL 콜레스테롤 농도는 감소시키는 반면에 HDL 콜레스테롤의 농도는 증가시킴을 확인하였다(도 8 내지 11).
이는, 상기 배양액을 포함하는 본 발명의 조성물은 우수한 항노화, 항산화 등의 효과를 나타내므로, 건강기능식품, 화장료, 의약외품, 사료 조성물 등의 형태로 유용하게 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인비보(in vivo) 유사 세포 배양 환경을 제공하기 위한 세포외기질(Extracellular matrix) 제조
면역관용 특성이 유도된 신규의 줄기세포주를 제조하기 위하여, 세포의 배양 시 인비보와 유사한 환경을 제공하고자 하였다.
구체적으로, 중간엽 줄기세포로부터 분비된 단백질을 이용하여 사람섬유아세포를 배양하였으며, 상기 사람섬유아세포로부터 세포외기질 (프로콜라겐, 파이브로넥틴, 콜라겐)을 분비시켜 직접 제조하여 사용하였다.
더욱 자세한 제조 방법은 다음과 같다. 먼저, 인체 양막 유래 중간엽 줄기세포(Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell, SCIENCELL, Cat.# 7501), 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포(STEMPRO Human Adipose-Derived Stem Cells, INVITROGEN, Cat. # R7788-110), 인체 골수 유래 중간엽 줄기세포(Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cell, SCIENCELL, Cat.# 7500), 인체 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(Human Umblical Mesenchymal Stem Cell, SCIENCELL, Cat.# 7530) 및 인간 양수 유래 중간엽 줄기세포(Human amniotic fluid derived cell, ANGIOCRINE, cat.# hAmnio-01) 중 1종의 줄기세포를 무혈청배지인 DMEM/F12 배지에 20,000 세포/㎠로 접종한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 120 시간 동안 배양하여 인간 중간엽 줄기세포 유래 단백질(Human Protein Complex from Human Mesenchymal Stem Cell, 이하 hPC)을 수거하였다. 이후, 사람섬유아세포(Human CCD-98sk, human fibroblast cell)를 상기 hPC가 세포 독성을 나타내지 않는 농도(1.25%, 2.5%, 5%, 10%, 20%)로 첨가된 DMEM 배양배지에 20,000 세포/㎠로 접종한 후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 120시간 동안 배양하였다.
배양 완료 후, hPC 농도에 따른 각각의 배양 상층액에 대하여 프로콜라겐(콜라겐 전구물질), 파이브로넥틴(세포 부착성 당단백질), 콜라겐(섬유성단백질)의 함유량을 기존에 공지된 방법에 따라 측정하였고, 그 결과는 하기 표 1 내지 3에 나타내었다.
hPC 농도별 프로콜라겐의 생산량 비교
hPC 농도(%, 총 단백질(㎍/㎖)) 프로콜라겐 (ng/ml) 프로콜라겐평균(ng/ml, Mean ± S.E.) % 음성 대조군
0 (0) 162.17 160.87 164.25 162.43 ± 0.98 100.00 ± 0.00
1.25 (0.625) 167.56 167.11 170.39 168.35 ± 1.03 103.65 ± 0.17
2.5 (1.25) 191.38 166.84 192.44 183.55 ± 8.36 112.96 ± 4.63
5.0 (2.5) 277.34 257.76 271.93 269.01 ± 5.84 165.60 ± 3.11
10.0 (5.0) 622.07 751.34 747.01 706.81 ± 42.39 435.15 ± 26.02
20.0 (10.0) 1,786.17 2,095.16 2,690.04 2,190.46 ± 265.24 1,347.19 ± 156.44
hPC 농도별 콜라겐의 생산량 비교
hPC 농도(%, 총 단백질(㎍/㎖)) 콜라겐 (ng/ml) 콜라겐 평균(ng/ml, Mean ± S.E.) % 음성 대조군
0 (0) 144.80 134.47 143.97 140.08 ± 4.31 100.00 ± 0.00
20.0 (10.0) 3,073.26 3,148.36 3,128.05 3,116.56 ± 22.43 2,229.95 ± 83.66
hPC 농도별 파이브로넥틴의 생산량 비교
hPC 농도(%, 총 단백질(㎍/㎖)) 파이브로넥틴 (ng/ml) 파이브로넥틴 평균 (ng/ml, Mean ± S.E. % 음성 대조군
0 (0) 223.01 206.47 201.36 210.28 ± 6.53 100.00 ± 0.00
20.0 (10.0) 5,261.64 5,306.78 5,420.74 5,329.72 ± 47.34 2,540.56 ± 97.18
상기 표 1 내지 3에서 볼 수 있듯이, 인간섬유아세포에서 생성되는 프로콜라겐은 배지에 첨가된 hPC 농도에 비례하여 증가함을 확인하였으며, 프로콜라겐, 콜라겐 및 파이브로넥틴은 20% hPC가 함유된 배양배지에서 인간섬유아세포를 무혈청 배양할 때 가장 많은 생성됨을 확인하였다.
따라서, 상기의 방법으로 제조한 세포외기질을 이후의 세포 배양에 사용하였다.
실시예 2: HLA-G를 상시 분비 발현하는 영양막세포(Trophoblast)의 제조 방법
면역관용 특성이 유도된 신규의 줄기세포주를 제조하기 위하여, HLA-G 단백질을 이용하였다.
HLA-G 단백질은 NK 세포로부터 세포를 보호하며 말초 혈액 내의 T 세포에 의한 동종 면역 반응을 매개하지 않는 등의 면역관용 및 면역조절 기능을 하는 단백질이다. 태반을 형성하는 영양막세포(Trophoblast)에서 주로 발현되며, 착상 초기에 산모의 면역체계로부터 수정된 배아를 보호하는 면역관용을 일으켜서 성공적인 착상 유도 및 정상적인 임신을 유지하는 역할을 수행한다.
따라서, 본 발명자는 인체 내에서 가장 높은 수준으로 HLA-G 단백질을 분비 발현하는 영양막세포의 면역관용 특성 및 다양한 신호 전달의 특성에 주목하여, 지속적으로 HLA-G 단백질을 분비 발현할 수 있는 영양막세포를 제조하고자 이의 배양조건을 확립하고, 확립된 상기 영양막세포주와 줄기세포를 공배양함으로써, 면역관용 특성이 유도되어 보다 향상된 신호 전달 능력을 갖는 새로운 줄기세포주를 확립하고자 하였다.
먼저, 계대배양을 통해 면역관용 특성을 갖게 하는 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 영양막세포를 제조하였다.
이는, 기초체온법을 이용하였다. 기초체온은 호흡 외에 모든 활동이 멈춘 순간의 체온을 의미하며, 통상 잠에서 막 깬 아침에 재는 체온이다. 기초체온의 변화 측정을 통해 여성들의 배란 시기 및 임신 여부를 알아내기도 하며, 월경 주기에 따라 기초체온이 저온기 및 고온기가 2주 간격으로 반복되는데 특히 가장 낮은 온도(36.4℃)를 보이는 배란일 이후 2주 간 고온기가 유지되다가 생리가 시작하면 다시 체온이 떨어지게 된다. 본 발명자는 이러한 기초체온의 변화가 배란과 수정, 임신 및 착상 그리고 이러한 일련의 과정에서 중요한 역할을 하는 영양막세포 및 체내 면역체계의 특성에도 밀접한 관련이 있을 것임에 착안하였다.
구체적으로, 대조군은 일반 세포 배양용 플레이트를 사용하여 배양한 영양막세포, 실험군은 상기 실시예 1에서 제조한 세포외기질(프로콜라겐, 콜라겐, 파이브로넥틴)로 코팅된 플레이트에서 배양하였다. 또한, 상기 실험군에는 도 1 및 2에 나타낸 바와 같은 기초체온법 및 미세 진동 배양(shaking incubating) 조건을 적용하였다. 이를 3일마다 계대배양하였으며, 각 계대배양 시에 배양 상층액을 각각 수거하여 배양 상층액 내에 존재하는 HLA-G 분자의 농도를 Human HLA-G ELISA 키트(LifeSpan BioSciences, Cat. #LS-F5033)를 이용하여 정량하였다.
그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, 각각 15번씩의 계대배양 결과, 대조군에서는 3 계대(passage) 이후부터 수거된 배양 상층액에 존재하는 HLA-G 단백질의 농도가 점차 감소하다가 10 계대 이후에서는 거의 발현이 되지 않음을 확인하였다. 반면에, 실험군에서는 5 계대 이후의 계대배양 시 수거한 영양막세포 배양 상층액 내에 존재하는 HLA-G 분자의 농도가 30 ng/ml 이상 수준으로 높게 유지됨을 확인하였다.
따라서, 배양 시 기초체온법에 기반한 온도 프로파일링, 미세 진동 배양 조건, 및 세포외기질을 이용하는 경우 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 영양막세포를 제조할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3: HLA-G를 상시 분비 발현하는 영양막세포와의 공배양을 통한 면역관용 특성이 유도된 줄기세포주의 제조 방법
상기 실시예 2를 통해 HLA-G를 상시 분비 발현함으로써 면역관용의 특성을 갖는 영양막세포를 제조한 바, 이를 면역관용 특성이 유도된 줄기세포주의 제조에 사용하고자 하였다.
먼저, 실시예 1에서 제조한 세포외기질로 코팅한 6 웰 플레이트에 영양막세포를 배양하였다. 이때의 배지 조건으로는 무혈청 DMEM Low 배지를 사용하였고, 이에 표 4와 같은 총 30종의 혼합 식물추출물 및 hPC를 1:1로 혼합한 혼합조성물(SigGrowTM, Stemmedicare Inc., Korea)을 전체 배지에 대해 1.0 내지 10 중량%로 첨가하여 사용하였다.
세포 증식용 배지에 포함된 혼합 식물추출물의 조성
번호 INCI 이름 (영문) 성분명(한글) CAS 번호
1 Aspalathus Linearis Leaf Extract 루이보스잎추출물 -
2 Thuja Occidentalis Leaf Extract 서양측백나무잎추출물 90131-58-1
3 Melaleuca Alternifolia (Tea Tree) Leaf Extract 티트리잎추출물 85085-48-9
4 Rosmarinus Officinalis (Rosemary) Leaf Extract 로즈마리잎추출물 84604-14-8
5 Centella Asiatica Extract 병풀추출물 84696-21-9
6 Salvia Officinalis (Sage) Leaf Extract 살비아잎추출물 84082-79-1
7 Thymus Vulgaris (Thyme) Extract 선백리향추출물 84929-51-1
8 Melissa Officinalis Leaf Extract 레몬밤잎추출물 84082-61-1
9 Hyssopus Officinalis Extract 히솝추출물 84603-66-7
10 Origanum Majorana Leaf Extract 꽃박하잎추출물 84082-58-6
11 Glycyrrhiza Uralensis (Licorice) Root Extract 감초뿌리추출물 94349-91-4
12 Anagelica Gigas Root Extract 참당귀뿌리추출물 -
13 Cnidium Officinale Root Extract 천궁뿌리추출물 168456-52-8
14 Paeonia Lactiflora (Peonia) Root Extract 작약뿌리추출물 -
15 Perilla Frutescens Leaf Extract 자소엽잎추출물 90082-61-4
16 Houttuynia Cordata Extract 약모밀추출물 164288-50-0
17 Camelia Sinensis Leaf Extract 녹차추출물 84650-60-2
18 Poria Cocos Extract 복령추출물 168456-53-9
19 Panax Ginseng Root Extract 인삼뿌리추출물 84650-12-4
20 Morus Alba Bark Extract 뽕나무껍질추출물 94167-05-2
21 Citrus Aurantifolia (Lime) Fruit Extract 라임추출물 90063-52-8
22 Citrus Limon (Lemon) Fruit Extract 레몬추출물 84929-31-7
23 Vitis Vinifera (Grape) Fruit Extract 포도추출물 84929-27-1
24 Cucumis Melo (Melon) Fruit Extract 멜론추출물 90063-94-8
25 Vaccinium Angustifolium (Blueberry) Fruit Extract 블루베리추출물 -
26 Prunus Mume Fruit Extract 매실추출물 -
27 Coffee Arabica (Coffee) Seed Extract 커피콩추출물 84650-00-0
28 Sapindus Mukorossi Fruit Extract 무환자열매추출물 -
29 Citrus Aurantium Dulcis (Orange) Fruit Extract 오렌지추출물 84012-28-2
30 Ananas Sativus (Pineapple) Fruit Extract 파인애플추출물 -
동시에, 인체 양막 유래 중간엽 줄기세포, 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포, 인체 골수 유래 중간엽 줄기세포, 인체 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 및 인간 양수 유래 중간엽 줄기세포 등의 줄기세포 1종을 3㎛ 구멍 크기를 갖는 6 웰 멀티디쉬 배양 NuncTM 폴리카보네이트 세포 배양 인서트(ThermoFisher Scientific Inc., Rockford, IL USA, Cat. #140663)에 분주하여 영양막세포가 분주된 상기 6 웰 플레이트에 0.9mm 간격 (Low Position)으로 위치시켰다. 이후, 실시예 2에서 적용된 온도 프로파일링 및 진동배양조건으로 5% CO2 인큐베이터에서 3 내지 4일간 배양하고 플레이트에 70 내지 90% 정도로 세포가 증식하면 1:3 비율로 계대배양을 실시하였다.
이후, 상기와 같은 계대배양 시에 수득된 인체 유래 줄기세포들에서 HLA-G 단백질이 분비 발현되었는지 여부를 다음과 같은 방법으로 확인하였다. 상기 줄기세포를 D-PBS로 2 내지 3회 세척한 후 1,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 모든 배지성분을 제거하였다. 새로운 플라스크에 무혈청 배지인 DMEM/F12를 첨가하고 세포 밀도를 18,000 내지 22,000 세포/cm2로 접종한 후 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하여, 120 시간 후 배양 상층액을 수거하였다. 실시예 2와 같은 방법으로 각각의 배양 상층액 내에 존재하는 HLA-G 분자의 농도를 Human HLA-G ELISA 키트를 이용하여 정량하였다.
그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, 총 30회의 계대배양 결과, 상기 영양막세포와의 공배양이 아닌 단독으로 계대배양한 인체 유래 줄기세포의 배양 상층액에서는 HLA-G 단백질이 검출이 되지 않음을 확인하였다. 반면에, 상기 영양막세포와 공배양된 인체 유래 줄기세포의 배양 상층액에서는 계대배양이 진행될수록 HLA-G 단백질의 농도가 점점 증가하며, 10 계대 이후의 계대배양 시에는 수거한 인체 유래 줄기세포 배양 상층액 내에 존재하는 HLA-G 분자의 농도가 20 ng/ml 이상 수준으로 유지됨을 확인하였다. 나아가, 20 계대 이상까지 지속적으로 HLA-G 분자가 존재함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 상기 실시예 2에서 제조한 HLA-G 분자를 상시 분비 발현하는 영양막세포와 줄기세포를 상기의 방법에 따라 공배양하는 경우, HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하여 면역관용 특성이 유도된 신규 줄기세포주(이하, MBTC-CellTM로 명명함)를 제조할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4: 신규 줄기세포주(MBTC-CellTM) 유래 배양액의 제조 방법
상기 실시예 3을 통해 제조한, HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하여 면역관용 특성이 유도된 신규 줄기세포주 MBTC-CellTM 유래의 세포외소포체 및 단백질 조성물, 즉 배양액을 제조하고자 하였다.
세포외소포체(Extracellular Vesicle)는 줄기세포를 비롯한 대부분의 동식물의 세포에서 세포외부로 분비될 수 있는 막 소포체로서, 크기 및 분비기전에 따라 자멸소체(Apototic Body), 미세소포체(Microvesicle) 및 엑소좀(Exosome) 등으로 구분된다. 세포외소포체는 기원 세포의 특성에 따라 다양한 miRNA 및 mRNA, 사이토카인 등을 함유하여 이를 통해 세포 간 신호전달 및 대사작용에 중요한 역할을 하는 것과 동시에 그 자체로도 치료 효과를 가지고 있다는 연구 결과들이 보고되면서 면역거부반응이라는 난제를 해결하지 못하고 있는 세포치료제의 대안으로 관심을 받고 있다. 그러나, 아직까지는 혈액 등에 미량 존재하는 엑소좀을 이용한 질병의 진단 분야에서만 제한적으로 활용되고 있는 등 엑소좀 및 미세소포체를 이용한 본격적인 치료제 개발을 위한 연구는 실험실 수준에 제한된 미비한 실정이며, 임상적으로 적용가능한 수준의 순도의 엑소좀을 분리하기는 거의 불가능하며, 임상적으로 활용가능한 미세소포체만을 분리할 수 있는 방법은 개발조차 되지 않은 상황이다. 또한, 치료 목적으로 세포외소포체를 적용할 때에도 기원 세포의 특성을 보유하고 있는 세포외소포체의 막에 존재하는 다양한 항원표시인자들에 의한 면역거부반응이 발생할 가능성도 있으므로, 이를 해소하기 위해서 본 발명자는 상기 실시예 3에서 제조한, 신규 줄기세포주에서 유래된 배양액에 포함된 세포외소포체의 면역관용 특성을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 상기 MBTC-CellTM를 무혈청배지인 DMEM/F12 배지에 18,000 내지 22,000 세포/cm2의 밀도로 접종하였고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 120 시간 동안 배양한 후 배양 상층액을 수거하였다. 수거한 상층액을 0.8㎛ 필터(MCE MF-MilliporeTM)로 여과하여 세포 잔해 및 사멸한 세포 등을 모두 제거함으로써 MBTC-CellTM 유래 엑소좀, 미세소포체 등이 모두 포함된 세포외소포체(MBTC-EVTM) 및 단백질 조성물을 수득하였다.
이의 미생물 및 바이러스 등의 오염 여부를 확인하기 위해 식품의약품안전처의 세포치료제 허가기준에 부합하는 외래성 바이러스 부정시험 및 미생물 잔존 검사를 실시한 결과, 상기 MBTC-CellTM 유래 세포외소포체(MBTC-EVTM) 및 단백질 조성물에 외래성 바이러스 및 미생물이 함유되어 있지 않음을 확인하였다.
또한, 도 5에서 볼 수 있듯이, 상기 MBTC-CellTM 유래 배양액을 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope(SEM), Hitachi S-4800)으로 관찰한 결과, 다양한 크기를 갖는 미세소포체 및 엑소좀이 공존하고 있음을 확인하였다.
실시예 5: MBTC-CellTM 유래 배양액에 포함된 단백질의 확인
상기 실시예 4를 통해 제조한, MBTC-CellTM 유래 배양액에 포함된 성분을 더욱 자세히 확인하기 위하여, 이에 포함된 단백질에 대하여 정량 및 정성분석을 수행하였다. 한편, 대조군은 상기 인체 유래 중간엽 줄기세포를 단독으로 배양한 것의 배양액을 사용하였다.
구체적으로, 대조군 및 시험군에 대하여 각각 BCA 정량법을 이용하여 단백질을 정량하였고, 100 ㎍을 취하여 동결건조를 실시한 후 질량 분석을 실시하였다. 질량 분석을 통해 얻어진 결과는 ProteinLynx Global Server (PLGS) Ver. 3.0을 이용하여 단백질 동정 및 절대정량을 실시하였다. 단백질 동정은 International Protein Index의 Human Database (Ver. 3.87)를 이용하여 실시하였으며, 절대정량은 표준품 BSA (SwissProt P2769)의 질량값 정보를 바탕으로 수행하였다.
그 결과, 도 6에서 볼 수 있듯이, 인체 양막 유래 중간엽 줄기세포(hAM-MSC), 인체 골수 유래 중간엽 줄기세포(hBM-MSC), 인체 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(HUMSC), 인간 양수 유래 중간엽 줄기세포(hAF-MSC) 및 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포(hADSC)를 단독으로 배양하여 생산된 배양액에 함유된 총 단백질 함량은 각각 29.91 ㎍/㎖, 23.37 ㎍/㎖, 19.89 ㎍/㎖, 51.36 ㎍/㎖, 20.16 ㎍/㎖임을 확인하였다. 반면에, 상기 실시예 4를 통해 제조한 신규 줄기세포주인, 인체 양막 유래 중간엽 줄기세포 유래 MBTC-CellTM (hAM-MSC derived MBTC-CellTM), 인체 골수 유래 중간엽 줄기세포 유래 MBTC-CellTM (hBM-MSC derived MBTC-CellTM), 인체 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 유래 MBTC-CellTM (HUMSC derived MBTC-CellTM), 인간 양수 유래 중간엽 줄기세포 유래 MBTC-CellTM (hAF-MSC derived MBTC-CellTM) 및 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포 유래 MBTC-CellTM (hADSC derived MBTC-CellTM)로부터 생산된 배양액에 함유된 총 단백질 함량은 각각 236.32 ㎍/㎖, 189.13 ㎍/㎖, 195.28 ㎍/㎖, 211.70 ㎍/㎖, 178.53 ㎍/㎖으로서, 대조군에 비하여 각각 790%, 809%, 982%, 412%, 886% 증가하였음을 확인하였다.
또한, 도 7에서 볼 수 있듯이, 각 유래의 MBTC-CellTM의 배양액에 대한 정성분석을 실시한 결과, 동일한 단백질 성분이 약 520종 포함되어 있으며, 이외의 600여 종의 단백질들도 서로 유사한 종류임을 확인하였다.
상기 결과를 통해, MBTC-CellTM 유래의 배양액은 일반적인 줄기세포 배양액에 비하여 이에 포함된 총 단백질 함량이 현저하게 많으며, 줄기세포의 유래가 다르더라도 서로 유사한 종류의 단백질을 분비함을 알 수 있었다.
실시예 6: MBTC-CellTM 유래 배양액에 포함된 단백질의 성분 분석
실시예 6-1: 면역관용 관련 단백질
상기 실시예 5에서 제조한 MBTC-CellTM 유래 배양액(시험군)에 포함된 단백질 중에서, 먼저 면역관용과 관련된 단백질이 포함되어 있는지 확인하고자 하였다. 한편, 대조군은 상기 인체 유래 중간엽 줄기세포를 단독으로 배양한 것의 배양액을 사용하였다.
구체적으로, 상기 대조군 및 시험군에 대하여 각각 BCA 정량법을 이용하여 단백질을 정량하였고, 100㎍을 취하여 동결건조를 실시한 후 질량 분석을 실시하였다.
그 결과, 하기 표 5에서 볼 수 있듯이, 대조군에 비하여 시험군에 약 4배 내지 8배의 더 높은 함량으로 면역관용과 관련된 단백질들이 함유되어 있음을 확인하였다.
면역관용과 관련된 단백질 성분 함량 비교
항체 이름 단백질 이름 함량(ng/ml)
대조군 시험군
1 FSCN1 팩신(Fascin) 0.617 4.293
2 LGALS3 갈렉틴-3(Galectin-3) 0.527 3.734
3 LGALS3BP 갈렉틱-3-바인딩 단백질(Galectic-3-binding Protein) 4.711 34.105
4 Cyclophilin 펩티딜프롤일 시스-트랜스 이소머라제 B(Peptidylprolyl cis-trans isomerase B) 0.454 3.598
5 FOXP3 포크헤드 박스 P3(Forkhead box P3) 0.317 2.390
6 IL-10 인터류킨-10(Interleukin-10) 0.551 2.370
7 TGF beta1 형질전환 성장인자 베타1(Transforming growth factor beta 1) 0.486 2.350
실시예 6-2: 프로테아좀 기능 정상화 관련 단백질의 분석
상기 실시예 5에서 제조한 MBTC-CellTM 유래 배양액(시험군)에 포함된 단백질 중에서, 프로테아좀 기능 정상화와 관련된 단백질이 포함되어 있는지 확인하고자 하였다. 한편, 대조군은 상기 인체 유래 중간엽 줄기세포를 단독으로 배양한 것의 배양액을 사용하였다.
구체적으로, 대조군 및 시험군에 대하여, 상기 실시예 6-1에 따른 방법으로 단백질의 질량 분석을 실시하였다.
그 결과, 하기 표 6에서 볼 수 있듯이, 대조군에 비하여 시험군에 약 3배 내지 16배의 더 높은 함량으로 프로테아좀 기능 정상화와 관련된 단백질들이 함유되어 있으며, 대조군에는 함유되지 않은 단백질들도 새롭게 발현됨을 확인하였다.
프로테아좀 기능 정상화와 관련된 단백질 성분 함량 비교
항체 이름 단백질 이름 함량(ng/ml)
대조군 시험군
1 PSMC8 26S 프로테아제 조절 서브유닛 8(26S protease regulatory subunit 8) - 0.162
2 PSMD2 26S 프로테아좀 비-ATP아제 조절 서브유닛 2(26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 2) - 0.346
3 PSMD3 26S 프로테아좀 비-ATP아제 조절 서브유닛 3 3.713 293.877
4 PSMD6 26S 프로테아좀 비-ATP아제 조절 서브유닛 6 0.571 14.209
5 HS71L 열충격 70kDa 단백질 1L(Heat shock 70kDa protein 1L) 1.345 30.678
6 PSMC6 26S 프로테아제 조절 서브유닛 S10B - 0.023
7 RNF40 E3 유비퀴틴-단백질 리가제 BRE1B(E3 ubiquitin-protein ligase BRE1B) 2.664 38.697
8 HSP76 열충격 70kDa 단백질 6(Heat shock 70kDa protein 6) 2.140 46.257
9 HSP90Bb 열충격 70kDa 단백질 90Bb(Heat shock 70kDa protein 90Bb) - 7.127
10 HSP27 열충격 단백질 베타-1(Heat shock protein beta-1) 3.697 59.562
11 HSP90b 열충격 단백질 90-베타 5.841 163.066
12 HSPA2 열충격-연관 70kDa 단백질 2(Heat shock-related 70kDa protein 2) 2.014 50.585
13 HSPA8 열충격-연관 70kDa 단백질 8(Heat shock-related 70kDa protein 8) 1.068 73.012
14 PSMD1 26S 프로테아좀 비-ATP아제 조절 서브유닛 1 3.215 48.998
15 PSMA1 프로테아좀 서브유닛 알파 타입-1(Proteasome subunit alpha type-1) 6.997 110.504
16 PSMA2 프로테아좀 서브유닛 알파 타입-2 - 3.551
17 PSMA5 프로테아좀 서브유닛 알파 타입-5 3.547 18.875
18 PSMB4 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-4 0.697 4.520
19 PSMA6 프로테아좀 서브유닛 알파 타입-6 1.547 5.817
20 PSMA7 프로테아좀 서브유닛 알파 타입-7 0.647 9.693
21 PSMB5 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-5 - 2.772
22 PSMB8 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-8 - 1.830
23 PSMB1 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-1 - 2.592
24 PSMB2 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-2 - 2.951
25 PSMB3 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-3 - 2.931
26 UBA1 유비퀴틴-유사 조절자-활성 효소 1(Ubiquitin-like modifier-activating enzyme 1) 1.697 24.037
실시예 6-3: 오토파지 기능 정상화 관련 단백질의 분석
상기 실시예 5에서 제조한 MBTC-CellTM 유래 배양액(시험군)에 포함된 단백질 중에서, 오토파지 기능 정상화와 관련된 단백질이 포함되어 있는지 확인하고자 하였다. 한편, 대조군은 상기 인체 유래 중간엽 줄기세포를 단독으로 배양한 것의 배양액을 사용하였다.
구체적으로, 대조군 및 시험군에 대하여, 상기 실시예 6-1에 따른 방법으로 단백질의 질량 분석을 실시하였다.
그 결과, 하기 표 7에서 볼 수 있듯이, 대조군에 비하여 시험군에 약 4배 내지 27배의 더 높은 함량으로 오토파지 기능 정상화와 관련된 단백질들이 함유되어 있으며, 대조군에는 함유되지 않은 단백질들도 새롭게 발현됨을 확인하였다.
오토파지 기능 정상화와 관련된 인자들의 단백질 분석 비교
항체 이름 단백질 이름 함량(ng/ml)
대조군 시험군
1 BAD 세포 사멸의 Bcl2-연관 아고니스트(Bcl2-associated agonist of cell death) 2.894 186.5
2 IKK-gamma NF-카파-B 필수 조절자(NF-kappa-B essential modulator) 3.247 193.0
3 Insulin 인슐린(Insulin) 7.598 134.5
4 EGF 전-표피 성장 인자(Pro-epidermal growth factor) 16.547 148.5
5 HGH 소마토트로핀(Somatotropin) 29.327 130.0
6 TGF beta2 형질전환 성장 인자 베타-2(Transforming growth factor beta-2) 14.015 146.0
7 IL-1 beta 인터류킨-1 베타(Interleukin-1 beta) 10.369 157.0
8 LAMP2 리소솜-연관 막 단백질2(Lysosomal-associated membrane protein 2) - 4.246
9 ATG16L2 오토파지-연관 단백질 16-2(Autophagy-related protein 16-2) 4.117 67.144
10 ATG9A 오토파지-연관 단백질 9A - 0.118
11 M6P 만노스-6-포스페이트(Mannose-6-phosphate) 3.476 93.180
실시예 6-4: 대식세포 포식 기능 정상화 관련 단백질의 분석
상기 실시예 5에서 제조한 MBTC-CellTM 유래 배양액(시험군)에 포함된 단백질 중에서, 대식세포 포식 기능 정상화와 관련된 단백질이 포함되어 있는지 확인하고자 하였다. 한편, 대조군은 상기 인체 유래 중간엽 줄기세포를 단독으로 배양한 것의 배양액을 사용하였다.
구체적으로, 대조군 및 시험군에 대하여, 상기 실시예 6-1에 따른 방법으로 단백질의 질량 분석을 실시하였다.
그 결과, 하기 표 8에서 볼 수 있듯이, 대조군에 비하여 시험군에 약 7배 내지 45배의 더 높은 함량으로 대식세포 포식 기능 정상화와 관련된 단백질들이 함유되어 있으며, 대조군에는 함유되지 않은 단백질들도 새롭게 발현됨을 확인하였다.
대식세포 기능 정상화와 관련된 항산화 인자들의 단백질 분석 비교
항체 이름 단백질 이름 함량(ng/ml)
대조군 시험군
1 GSTO1 글루타치온 S-트랜스퍼라제 오메가-1(Glutathione S-transferase omega-1) - 5.501
2 GR 글루타치온 리덕타제(Glutathione reductase) - 1.648
3 PRDX1 페록시리독신-1(Peroxiredoxin-1) 3.647 62.662
4 PRDX2 페록시리독신-2 0.448 16.194
5 PRDX4 페록시리독신-4 - 6.355
6 PRDX6 페록시리독신-6 5.716 45.358
7 SOD 수퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase) 0.037 1.668
실시예 6-5: 세포 내 신호전달 항상성 유지 관련 단백질의 분석
상기 실시예 5에서 제조한 MBTC-CellTM 유래 배양액(시험군)에 포함된 단백질 중에서, 세포 내 신호 전달 항상성 유지와 관련된 단백질이 포함되어 있는지 확인하고자 하였다. 한편, 대조군은 상기 인체 유래 중간엽 줄기세포를 단독으로 배양한 것의 배양액을 사용하였다.
구체적으로, 대조군 및 시험군에 대하여, 상기 실시예 6-1에 따른 방법으로 단백질의 질량 분석을 실시하였다.
그 결과, 하기 표 9에서 볼 수 있듯이, 대조군에 비하여 시험군에 약 49배의 더 높은 함량으로 세포 내 신호 전달 항상성 유지와 관련된 단백질들이 함유되어 있으며, 대조군에는 함유되지 않은 단백질들도 새롭게 발현됨을 확인하였다.
세포 내 신호 전달 항상성 유지와 관련된 인자들의 단백질 분석 비교
항체 이름 단백질 이름 함량(ng/ml)
대조군 시험군
1 PTEN 포스파타제 및 텐신 동종형(Phosphatase and tensin homolog) 0.047 2.331
2 SHIP1 SH2-포함 이노시톨 포스파타제-1(SH2(Src homology 2)-containing inositol phosphatase-1) - 2.600
3 GSK-3b 글리코겐 신타제 키나제 3 베타(Glycogen synthase kinase 3 beta) - 2.378
실시예 7: MBTC-CellTM 유래 배양액의 항노화, 항산화, 대식세포의 포식 작용 정상화 효능 검증
실시예 7-1: 항노화 효능 검증
상기 실시예 5에서 제조한 MBTC-CellTM 유래 배양액에는 면역관용, 프로테아좀 기능 정상화, 오토파지 기능 정상화, 대식세포 포식 기능 정상화 및 세포 내 신호전달 항상성 유지 효능을 나타내는 단백질 등이 현저하게 많은 양으로 포함되어 있음을 확인한 바, 이를 통해 항노화 등의 생리 효과를 나타내는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, 대조군으로는 0.9% 식염수; 실험군 1로는 상기 인체 유래 중간엽 줄기세포를 단독으로 배양한 것의 배양액; 실험군 2로는 MBTC-CellTM 유래 배양액을 사용하였다. 각 군 당 4마리의 마우스를 사용하였고, 마우스 당 시료를 100 ㎕ 씩 정맥에 투여한 후 3일 간 몸무게, 음수량 및 먹이양을 측정하였으며, 3일 후 부검을 통한 육안 검사 및 혈액 검사를 통해 항노화 효능을 확인하였다.
그 결과, 도 8에서 볼 수 있듯이, 대조군 및 실험군 1, 실험군 2에서 시료 투여에 따른 몸무게, 음수 및 사료 섭취의 유의한 변화는 관찰되지 않았으며, 정상적인 범위 내에서 증감이 관찰되었다. 또한, 부검 결과 상기 대조군 및 실험군 모두에서 이상 증상이 발견되지 않았다.
아울러, 도 9에서 볼 수 있듯이, 대표적인 항노화 관련 바이오마커인 성장 호르몬(Growth Hormone) 및 인슐린-유사 성장인자 1(Insulin-like Growth Factor 1: IGF-1)의 발현 정도를 비교한 결과, 대조군 및 실험군 1에 비하여 실험군 2에서 약 20 내지 30%의 현저한 정도로 증가됨을 확인하였다.
상기 결과를 통해, MBTC-CellTM 유래의 배양액은 우수한 항노화 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 7-2: 항산화 효능 검증
또한, 상기 MBTC-CellTM 유래 배양액의 항산화 효능을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 상기 실시예 7-1과 동일한 방법으로 대조군, 실험군 1 및 실험군 2를 설정하였고, 이를 마우스에 투여한 후 대표적인 항산화 관련 바이오마커인 혈중 내 GSH/GSSH 비율을 측정하였다.
그 결과, 도 10에서 볼 수 있듯이, 혈중 내 GSH/GSSH(glutathione/glutathione disulfide) 비율은 대조군 및 실험군 1에 비해 실험군 2에서 약 10%의 현저한 정도로 증가됨을 확인하였다.
상기 결과를 통해, MBTC-CellTM 유래의 배양액은 우수한 항산화 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 7-3: 대식세포 포식작용 정상화 효능 검증
또한, 상기 MBTC-CellTM 유래 배양액의 대식세포 포식작용 정상화 효능을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 상기 실시예 7-1과 동일한 방법으로 대조군, 실험군 1 및 실험군 2를 설정하였고, 이를 마우스에 투여한 후 대표적인 대식세포 포식작용 정상화 관련 바이오마커인 혈액 내 LDL 콜레스테롤 및 HDL 콜레스테롤의 농도를 측정하였다. 이는 LDL-콜레스테롤 시약(Bayer, USA), 다이렉트 HDL-콜레스테롤 시약(Bayer, USA)을 이용하여 자동혈액분석기(ADVIA 1650, Bayer, Japan)로 측정하였다.
그 결과, 도 11에서 볼 수 있듯이, 혈중 내 LDL 콜레스테롤 농도는 대조군 및 실험군 1에 비해 실험군 2에서 각각 약 2.88 및 2.55 mg/dL의 현저한 정도로 감소하며, HDL 콜레스테롤의 농도는 대조군 및 실험군 1에 비해 실험군 2에서 각각 약 3.83 및 3.1 mg/dL의 현저한 정도로 증가됨을 확인하였다.
상기 결과를 통해, MBTC-CellTM 유래의 배양액은 혈중 콜레스테롤을 유리하게 조절하는 등의 대식세포의 포식작용의 정상화 효능이 있음을 알 수 있었다.
실시예 8. 영양막세포 배양액에 함유된 HLA-G5 단백질의 분비특성 확인
본 발명에 의해 제조된 영양막세포 배양액에 함유된 HLA-G5 단백질의 분비특성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 2와 동일한 방법에 의해 영양막세포를 배양하여 배양 상층액에 함유된 HLA-G5 단백질을 ELISA 분석방법에 의하여 분석하였다. 또한, 영양막세포의 배양상층액은 종래의 방법으로 배양한 세포의 배양액(대조군)과 비교하였다.
이때, 상기 ELISA 분석은 세포외로 분비 발현되는 HLA-G5 단백질만을 선택적으로 검출할 수 있도록 5A6G7항체를 이용한 ELISA Kit(MBS267094, MyBiosource)를 사용하였으며 그 결과는 도 12에 도시하였다.
그 결과, 도 12에서 볼 수 있듯이, 통상적인 배양방법으로 배양한 영양막세포의 배양 상층액에 함유된 HLA-G5 단백질의 농도는 계대배양을 진행할수록 점차 감소하는 반면, 본원발명의 인체내 유사 배양 조건에서 배양한 영양막세포의 배양 상층액에 함유된 HLA-G5 단백질의 농도(시험군)은 계대배양을 진행할수록 점차 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로 본발명에 의해 제조된 영양막세포의 경우 영양막세포 외부로 HLA-G5 단백질을 분비하며, 배양상층액에서 계대배양할수록 단백질의 양이 증가하는 것으로 보아 HLA-G5 단백질을 상시 분비 발현함을 확인할 수 있었다.
실시예 9. 줄기세포 배양액에 함유된 HLA-G5 단백질의 분비특성 확인
본 발명과 같이 인체내 유사 배양 조건에서 배양된 영양막세포와 공배양을 통해 면역관용 특성이 유도된 줄기세포 배양액에 함유된 HLA-G5 단백질의 분비특성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 3과 동일한 방법에 의해 중간엽 줄기세포를 배양하여 배양 상층액에 함유된 HLA-G5 단백질을 ELISA 분석방법에 의하여 분석하였다. 이때, 상기 ELISA 분석은 세포외부로 분비 발현되는 HLA-G5 단백질만을 선택적으로 검출할 수 있도록 5A6G7항체를 이용한 ELISA Kit(MBS267094, MyBiosource)를 사용하였으며 그 결과는 도 13에 도시하였다.
그 결과, 도 13에서 볼 수 있듯이, 계대배양을 진행할수록 배양 상층액에 함유된 HLA-G5 단백질이 점차 증가됨을 확인할 수 있었다.
즉, 상기 결과로 인하여 본 발명에 의해 제조된 줄기세포는 세포 외부로 분비 발현되는 형태일 수 있으며, HLA-G5 단백질을 지속적으로 상시 분비 발현할 수 있는 특성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (37)

  1. 인체내 유사 배양 조건 하에서 영양막세포를 배양하는 단계로서, 상기 인체내 유사 배양 조건은 36.3℃ 내지 37.2℃ 범위 내에서 변화되는 온도 조건, 10 RPM 내지 30 RPM 범위 내에서 변화되는 진동 배양 조건, 및 세포외기질을 함유하는 세포배양 플레이트를 이용하는 조건인 것인 단계; 및
    상기 배양된 영양막세포를 계대배양하는 단계를 포함하는,
    HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 영양막세포의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 온도 조건은 기초체온법에 기반한 15일 주기의 온도 변화 조건인 것인, 영양막세포의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 진동 배양 조건은 24시간 주기의 진동 배양 조건인 것인, 영양막세포의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세포외기질은, 콜라겐, 파이브로넥틴, 프로콜라겐으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 영양막세포의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 세포외기질은,
    (a) 섬유아세포를 18,000 내지 22,000 세포/cm2의 밀도로 접종하는 단계;
    (b) 상기 섬유아세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및
    (c) 배양 114 내지 126시간 경과 후 섬유아세포 배양액을 수득하는 단계를 통해 제조되는 것으로서,
    상기 무혈청 배지는 인간 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 15 내지 25%(v/v)로 포함하는 것인, 영양막세포의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 인간 중간엽 줄기세포 유래의 단백질은,
    (a) 인간 중간엽 줄기세포를 18,000 내지 22,000 세포/cm2의 밀도로 접종하는 단계;
    (b) 상기 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및
    (c) 배양 114 내지 126시간 경과 후 줄기세포 배양액을 수득하는 단계를 통해 제조되는 것인, 영양막세포의 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 계대배양은 5 계대 내지 15 계대동안 계대배양되는 것인, 영양막세포의 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 HLA-G 단백질은 30 ng/ml 이상으로 유지되는 것인, 영양막세포의 제조 방법.
  9. HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 영양막세포 및 줄기세포를 공배양하는 단계; 및
    상기 배양된 줄기세포를 계대배양하는 단계를 포함하는,
    HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 영양막세포는 제1항의 방법에 의해 제조된 것인, 줄기세포의 제조방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것인, 줄기세포의 제조방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 지방, 제대혈, 양수 또는 양막 유래인 것인, 줄기세포의 제조방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 계대배양은 10 계대 내지 30 계대 동안 계대배양되는 것인, 중간엽 줄기세포의 제조 방법.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 제조된 중간엽 줄기세포 내 HLA-G 단백질은 배양 상층액 및 세포외소포체에 존재하는 것인, 중간엽 줄기세포의 제조 방법.
  15. 제9항에 있어서,
    상기 제조된 중간엽 줄기세포 내 HLA-G 단백질은 20ng/ml 이상으로 유지되는 것인, 중간엽 줄기세포의 제조 방법.
  16. 제9항에 있어서,
    상기 공배양은 인간 중간엽 줄기세포 유래의 단백질 및 식물 추출물이 1:0.5 내지 1:1.5의 비율로 혼합된 혼합물을 포함하는 배지로 수행되는 것인, 줄기세포의 제조 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 식물 추출물은 루이보스잎추출물, 서양측백나무잎추출물, 티트리잎추출물, 로즈마리잎추출물, 병풀추출물, 살비아잎추출물, 선백리향추출물, 레몬밤잎추출물, 히솝추출물, 꽃박하잎추출물, 감초뿌리추출물, 참당귀뿌리추출물, 천궁뿌리추출물, 작약뿌리추출물, 자소엽잎추출물, 약모밀추출물, 녹차추출물, 복령추출물, 인삼뿌리추출물, 뽕나무껍질추출물, 라임추출물, 레몬추출물, 포도추출물, 멜론추출물, 블루베리추출물, 매실추출물, 커피콩추출물, 무환자열매추출물, 오렌지추출물, 파인애플추출물 또는 이들의 조합인 것인, 중간엽 줄기세포의 제조 방법.
  18. 제9항의 제조방법으로 제조된, HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포.
  19. 제18항에 있어서, 상기 HLA-G 단백질은 HLA-G5를 포함하는 것인, 줄기세포.
  20. 제18항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것인, 줄기세포.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 지방, 제대혈, 양수 또는 양막 유래인 것인, 줄기세포.
  22. 제9항의 제조방법으로 HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 중간엽 줄기세포를 제조하는 단계; 및
    상기 중간엽 줄기세포 제조시의 계대배양시 수득된 중간엽 줄기세포를,
    (a) 18,000 내지 22,000 세포/cm2의 밀도로 접종하는 단계; 및
    (b) 상기 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 114 내지 126 시간 동안 배양하여 배양 상층액을 수득하는 단계를 포함하는,
    HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 중간엽 줄기세포의 배양액의 제조방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것인, 줄기세포의 배양액의 제조방법.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 HLA-G 단백질은 HLA-G5를 포함하는 것인, 중간엽 줄기세포의 배양액의 제조방법.
  25. 제22항에 있어서,
    상기 제조된 줄기세포 배양액은 세포외소포체를 함유하는 것인, 줄기세포의 배양액의 제조방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 세포외소포체는 자멸소체(Apototic Body), 미세소포체(Microvesicle) 및 엑소좀(Exosome)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 줄기세포의 배양액의 제조방법.
  27. 제25항에 있어서,
    상기 제조된 줄기세포 배양액은 총 단백질 함량이 증가된 것인, 줄기세포의 배양액의 제조방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 단백질은, 면역관용 관련 단백질, 프로테아좀 기능 정상화 관련 단백질, 오토파지 기능 정상화 관련 단백질, 대식세포 포식 기능 정상화 관련 항산화 단백질, 또는 세포 내 신호 전달 항상성 유지 관련 단백질인 것인, 줄기세포의 배양액의 제조방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 면역관용 관련 단백질은,
    팩신(Fascin), 갈렉틴-3(Galectin-3), 갈렉틱-3-바인딩 단백질(Galectic-3 binding Protein), 펩티딜프롤일 시스-트랜스 이소머라제 B(Peptidylprolyl cis-trans isomerase B), 포크헤드 박스 P3(Forkhead box P3), 인터류킨10(Interleukin-10) 또는 형질전환 성장인자 베타1(Transforming growth factor beta 1)인 것인, 줄기세포의 배양액의 제조방법.
  30. 제28항에 있어서,
    상기 프로테아좀 기능 정상화 관련 단백질은,
    26S 프로테아제 조절 서브유닛 8(26S protease regulatory subunit 8), 26S 프로테아좀 비-ATP아제 조절 서브유닛 2(26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 2), 26S 프로테아좀 비-ATP아제 조절 서브유닛 3, 26S 프로테아좀 비-ATP아제 조절 서브유닛 6, 열충격 70kDa 단백질 1L(Heat shock 70kDa protein 1L), 26S 프로테아제 조절 서브유닛 S10B, E3 유비퀴틴-단백질 리가제 BRE1B(E3 ubiquitin-protein ligase BRE1B), 열충격 70kDa 단백질 6(Heat shock 70kDa protein 6), 열충격 70kDa 단백질 90Bb(Heat shock 70kDa protein 90Bb), 열충격 단백질 베타-1(Heat shock protein beta-1), 열충격 단백질 90-베타, 열충격-연관 70kDa 단백질 2(Heat shock-related 70kDa protein 2), 열충격-연관 70kDa 단백질 8(Heat shock-related 70kDa protein 8), 26S 프로테아좀 비-ATP아제 조절 서브유닛 1, 프로테아좀 서브유닛 알파 타입-1(Proteasome subunit alpha type-1), 프로테아좀 서브유닛 알파 타입-2, 프로테아좀 서브유닛 알파 타입-5, 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-4, 프로테아좀 서브유닛 알파 타입-6, 프로테아좀 서브유닛 알파 타입-7, 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-5, 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-8, 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-1, 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-2, 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-3 또는 유비퀴틴-유사 조절자-활성 효소 1(Ubiquitin-like modifier-activating enzyme 1)인 것인, 줄기세포의 배양액의 제조방법.
  31. 제28항에 있어서,
    상기 오토파지 기능 정상화 관련 단백질은,
    세포 사멸의 Bcl2-연관 아고니스트(Bcl2-associated agonist of cell death), NF-카파-B 필수 조절자(NF-kappa-B essential modulator), 인슐린(Insulin), 전-표피 성장 인자(Pro-epidermal growth factor), 소마토트로핀(Somatotropin), 형질전환 성장 인자 베타-2(Transforming growth factor beta2), 인터류킨-1 베타(Interleukin-1 beta), 리소솜-연관 막 단백질2(Lysosomal associated membrane protein 2), 오토파지-연관 단백질 16-2(Autophagy-related protein 16-2), 오토파지-연관 단백질 9A 또는 만노스-6-포스페이트(Mannose-6 phosphate)인 것인, 줄기세포의 배양액의 제조방법.
  32. 제28항에 있어서,
    상기 대식세포 포식 기능 정상화 관련 항산화 단백질은,
    글루타치온 S-트랜스퍼라제 오메가-1(Glutathione S-transferase omega-1),글루타치온 리덕타제(Glutathione reductase), 페록시리독신-1(Peroxiredoxin-1), 페록시리독신-2, 페록시리독신-4, 페록시리독신-6 또는 수퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase)인 것인, 줄기세포의 배양액의 제조방법.
  33. 제28항에 있어서,
    상기 세포 내 신호 전달 항상성 유지 관련 단백질은,
    포스파타제 및 텐신 동종형(Phosphatase and tensin homolog), SH2-포함 이노시톨 포스파타제-1(SH2(Src homology 2)-containing inositol phosphatase-1) 또는 글리코겐 신타제 키나제 3 베타(Glycogen synthase kinase 3 beta)인 것인, 줄기세포의 배양액의 제조방법.
  34. 제22항의 제조방법으로 제조된, HLA-G 단백질을 상시 분비 발현하는 줄기세포의 배양액.
  35. 제34항에 있어서, 상기 HLA-G 단백질은 HLA-G5를 포함하는 것인, 줄기세포의 배양액.
  36. 제34항의 배양액을 유효 성분으로 포함하는, 항노화 또는 항산화용 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 상기 항노화 또는 항산화용 조성물은 건강기능식품, 화장료, 의약품, 의약외품 또는 사료 조성물인 것인, 조성물.
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