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WO2019176056A1 - 観察装置 - Google Patents

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Publication number
WO2019176056A1
WO2019176056A1 PCT/JP2018/010243 JP2018010243W WO2019176056A1 WO 2019176056 A1 WO2019176056 A1 WO 2019176056A1 JP 2018010243 W JP2018010243 W JP 2018010243W WO 2019176056 A1 WO2019176056 A1 WO 2019176056A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
optical system
imaging optical
optical axis
illumination
illumination light
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2018/010243
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
平田　唯史
仁 越後
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Olympus Corp
Original Assignee
Olympus Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Olympus Corp filed Critical Olympus Corp
Priority to JP2020506057A priority Critical patent/JP6989691B2/ja
Priority to PCT/JP2018/010243 priority patent/WO2019176056A1/ja
Publication of WO2019176056A1 publication Critical patent/WO2019176056A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes

Definitions

  • the present invention relates to an observation apparatus.
  • Patent Documents 1 and 2 Conventionally, an apparatus for observing a subject such as a cell without labeling has been proposed (see, for example, Patent Documents 1 and 2).
  • both the light source unit and the illumination unit are disposed below the sample.
  • Illumination light from the light source part passes through the sample obliquely upward, is reflected by the reflection member or the lid of the container containing the cells above the sample, and illuminates the sample from obliquely above.
  • the photographing optical system photographs illumination light that is transmitted obliquely downward through the sample.
  • Patent Documents 1 and 2 when the incident angle of the illumination light is equal to the capture angle of the objective optical system, oblique illumination in which the sample can be viewed three-dimensionally can be realized.
  • a reflective object that reflects the illumination light around the observation device.
  • an incubator shelf or ceiling exists above the observation apparatus.
  • part of the illumination light transmitted through the lid of the container is reflected by such a reflecting object and enters the objective optical system as unnecessary light.
  • Unnecessary light from a reflecting object located higher than the lid of the container enters the objective optical system at a small incident angle. Accordingly, unnecessary light is incident on the pupil plane of the objective optical system at a position close to the center of the pupil, and all or most of the unnecessary light passes through the pupil. As a result, the contrast of the cells in the image may be reduced, making it difficult to observe the cells.
  • the present invention has been made in view of the above-described circumstances, and prevents a decrease in the contrast of an image of a sample due to unnecessary light from a reflecting object, and allows a sample to be observed in three-dimensional contrast with oblique illumination.
  • An object of the present invention is to provide an observation device that can be used.
  • One aspect of the present invention is an observation apparatus disposed in an incubator, wherein a reflective object that reflects light is disposed above the observation apparatus in the incubator, and a substantially horizontal stage on which a sample is placed;
  • An illumination optical system disposed below the stage and emitting illumination light obliquely upward, and disposed below the stage, transmitted through the stage and reflected by a reflecting surface above the sample, and the sample and
  • An imaging optical system that images the illumination light transmitted obliquely downward through the stage, the illumination optical system emitting a light source that emits the illumination light, and the illumination light from the light source to a specific first emission region
  • An illumination mask to be limited, a collimator lens that converts the illumination light emitted from the first emission region into substantially parallel light, and the illumination light from the collimator lens for a specific second emission
  • An emission area limiting member for limiting the area, and a projection image of the first emission area projected onto the pupil plane of the imaging optical system partially overlaps with a marginal edge
  • NA is the numerical aperture on the sample side of the imaging optical system
  • ⁇ min is the minimum value of the emission angle of the illumination light emitted from the second emission region with respect to the optical axis of the imaging optical system
  • ⁇ max is The maximum value of the exit angle of the illumination light emitted from the second emission region with respect to the optical axis of the imaging optical system
  • Xex_max is X at the end farthest from the optical axis of the imaging optical system in the second emission region
  • Xfov_min is the X coordinate of the end of the real field of the imaging optical system far from the illumination optical system
  • Hill is the light of the imaging optical system from the exit area limiting member to the sample surface of the imaging optical system
  • Hinc is the height in the direction along the optical axis of the imaging
  • the illumination light emitted from the light source is restricted to the first emission region by the illumination mask, converted into substantially parallel light by the collimator lens, and directed obliquely upward from the second emission region of the emission region restriction member. And injected.
  • the illumination light passes through the stage and the sample obliquely upward, and is reflected obliquely downward by the reflecting surface above the sample, illuminating the sample from obliquely above.
  • the reflecting surface is, for example, the inner surface of the top plate of the container that stores the sample or the liquid surface of the solution in the container. Thereafter, the illumination light passes through the sample and the stage obliquely downward, and enters the imaging optical system obliquely with respect to the optical axis of the imaging optical system.
  • conditional expression (1) the luminous flux of illumination light is partially blocked by the edge of the pupil on the pupil plane of the imaging optical system.
  • conditional expression (2) the illumination light reflected downward by the reflecting object does not enter the real field of view of the imaging optical system. Accordingly, it is possible to prevent a decrease in contrast of the sample image due to unnecessary light from the reflecting object, and to reliably acquire a high-contrast sample image by oblique illumination.
  • Xex_min ⁇ Xfov_min + (Hill + 2Hcase) * NA (3)
  • Xex_min is the X coordinate of the end closest to the optical axis of the imaging optical system in the second emission region
  • Hcase is the direction along the optical axis of the imaging optical system from the sample surface to the reflection surface Height (air equivalent length).
  • Xfov_max is the X coordinate of the end of the real field of the imaging optical system near the illumination optical system
  • Hcase is the direction along the optical axis of the imaging optical system from the sample surface to the reflection surface Height (air equivalent length).
  • the exit region limiting member may be capable of changing the position of the end farthest from the optical axis of the imaging optical system in the second exit region in the X direction.
  • Xex_max in conditional expression (2) can be changed. That is, Xex_max can be adjusted within a range in which conditional expression (2) is satisfied according to observation conditions such as the type of container and the position of the reflecting object.
  • the illumination optical system may include a prism or a mirror that can change an emission direction of the illumination light from the second emission region.
  • the end of the first emission region farther from the imaging optical system is arranged outside the optical axis of the imaging optical system than the optical axis of the collimating lens. May be.
  • conditional expression (5) and conditional expression (6) may be satisfy
  • ⁇ min (Xm_min ⁇ Xc_axis) / Fc (5)
  • ⁇ max (Xm_max ⁇ Xc_axis) / Fc (6)
  • Xm_min is the X coordinate of the end of the first emission region closest to the optical axis of the imaging optical system
  • Xm_max is the X coordinate of the end of the first emission region farthest from the optical axis of the imaging optical system.
  • Xc_axis is the X coordinate of the optical axis of the collimating lens
  • Fc is the focal length of the collimating lens in the X direction.
  • the present invention it is possible to prevent the contrast of the sample from being lowered due to unnecessary light from the reflecting object, and to observe the sample in three-dimensional contrast with oblique illumination.
  • FIG. 1 is an overall configuration diagram of an observation apparatus according to an embodiment of the present invention. It is the top view which looked at the illumination optical system and imaging optical system of the observation apparatus of FIG. 1 from the upper side. It is a figure which shows each parameter of the observation apparatus of FIG. It is a figure which shows an example of the position of the illumination light in a pupil surface when satisfying conditional expression (1). It is a figure which shows an example of the position of the illumination light in a pupil surface when not satisfying conditional expression (1). It is a figure which shows the other example of the position of the illumination light in a pupil surface when not satisfying conditional expression (1). It is an example of an image when the conditional expression (1) is satisfied. It is an example of an image when the conditional expression (1) is not satisfied.
  • FIG. 1 is an overall configuration diagram of an observation apparatus according to a first embodiment of the present invention. It is the figure which looked at the illumination mask, the collimating lens, and the objective lens in the observation apparatus of FIG. 15A from the upper side. It is a whole block diagram of the observation apparatus which concerns on 2nd Example of this invention. It is the figure which looked at the light source of the observation apparatus of FIG.
  • FIG. 16A a diffuser plate, an illumination mask, a collimating lens, a prism, an objective lens, an image pick-up element, and an actual visual field from the upper side. It is the figure which looked at the illumination mask of the observation apparatus of FIG. 16A in the X direction. It is a whole block diagram of the observation apparatus which concerns on 3rd Example of this invention. It is a whole block diagram of the observation apparatus which concerns on 4th Example of this invention. It is a block diagram of the modification of an illumination optical system. It is a block diagram of the other modification of an illumination optical system.
  • the observation apparatus 100 is arranged in an incubator together with a cell culture container 1 and images a cell (sample) in the container 1.
  • a plurality of shelves arranged in the vertical direction are installed in the incubator, and the observation apparatus 100 is arranged on one of the shelves.
  • the shelves and ceiling are made of metal such as stainless steel and reflect light.
  • the observation apparatus 100 includes a stage 2 on which the container 1 is placed, an illumination optical system 3 that is arranged below the stage 2 and illuminates cells in the container 1, and below the stage 2. And an imaging optical system 4 that images the cells in the container 1.
  • the direction along the optical axis Z of the imaging optical system 4 is defined as the Z direction
  • the arrangement direction of the imaging optical system 4 and the optical axis Z ′ of the collimating lens 8 (described later) of the illumination optical system 3 is defined as the X direction.
  • the X direction is a direction orthogonal to the optical axis Z and passing through the optical axis Z ′.
  • the direction from the optical axis Z of the imaging optical system 4 to the optical axis Z ′ of the collimating lens 8 is defined as the positive direction of the X direction.
  • the container 1 is, for example, a dish, flask, or multiwell plate for cell culture.
  • the container 1 has a bottom plate 1a and a top plate 1b that face each other in the vertical direction.
  • the container 1 is formed of a material that is optically transparent as a whole.
  • the stage 2 is a plate-like member and is formed from an optically transparent material such as glass.
  • the stage 2 is disposed substantially horizontally and covers the illumination optical system 3 and the imaging optical system 4.
  • the stage 2 may be a top plate of a box-shaped housing that houses the illumination optical system 3 and the imaging optical system 4.
  • the illumination optical system 3 is arranged in the X direction with the imaging optical system 4.
  • the illumination optical system 3 limits the illumination light emitted from the light source 5 that generates illumination light, the diffusion plate 6 that diffuses the illumination light emitted from the light source 5, and the illumination light emitted from the diffusion plate 6 to a specific first emission region 7a.
  • An area limiting member 9 is provided.
  • the light source 5 is a point light source such as an LED.
  • the diffusion plate 6 diffuses the illumination light incident from the light source 5 and emits the diffused illumination light. That is, the diffusion plate 6 functions as a surface light source.
  • the illumination mask 7 includes a first emission region 7a that is an opening and allows illumination light to pass therethrough. The illumination light diffused by the diffusion plate 6 is emitted only from the first emission region 7a.
  • the illumination mask 7 is disposed on the focal plane of the collimating lens 8.
  • the collimating lens 8 converts the illumination light emitted from the first emission region 7a into substantially parallel light.
  • the emission region limiting member 9 has a second emission region 9a that is made of an opening and allows illumination light to pass therethrough.
  • the illumination light converted into substantially parallel light by the collimating lens 8 is emitted only from the second emission region 9a.
  • the emission region limiting member 9 is a frame that holds the periphery of the collimating lens 8, for example.
  • the center of the first emission region 7a is decentered to the side opposite to the imaging optical system 4 with respect to the optical axis Z 'of the collimating lens 8.
  • illumination light is emitted obliquely upward from the second direction from the second emission region 9a.
  • Illumination light emitted from the second emission region 9a passes through the stage 2 and the bottom plate 1a, is reflected by the inner surface (reflecting surface) of the top plate 1b, passes through the bottom plate 1a and the stage 2, and enters the imaging optical system 4.
  • the imaging optical system 4 includes an objective lens 11 and an imaging element 12 that takes an image of a cell formed by the objective lens 11 and generates an image of the cell.
  • the objective lens 11 has a pupil (brightness stop) 11a on the optical axis.
  • the objective lens 11 forms an image of incident illumination light on the image sensor 12.
  • the image sensor 12 is a two-dimensional image sensor.
  • conditional expressions (3) and (4) relate to the improvement of the image quality at the edge of the image generated by the image sensor 12. If the image quality at the edge of the image does not matter, conditional expressions (3) and (4) may not necessarily be satisfied.
  • FIG. 3 shows various parameters in the conditional expressions (1) to (4).
  • the X coordinate is a position coordinate in the X direction with the optical axis Z of the imaging optical system 4 as the origin.
  • NA is the numerical aperture on the object side (cell side) of the objective lens 11.
  • ⁇ min is the minimum value (deg) of the emission angle of the illumination light emitted from the second emission region 9a with respect to the optical axis Z of the imaging optical system 4.
  • ⁇ max is the maximum value (deg) of the emission angle of the illumination light emitted from the second emission region 9a with respect to the optical axis Z of the imaging optical system 4.
  • Xex_max is the X coordinate (mm) of the end farthest from the imaging optical system 4 in the second emission region 9a.
  • Xex_min is the X coordinate (mm) of the end closest to the imaging optical system 4 in the second emission region 9a.
  • Xfov_max is the X coordinate (mm) of the end of the real field of view FOV of the imaging optical system 4 on the side far from the illumination optical system 3.
  • Xfov_min is the X coordinate (mm) of the end of the real field FOV of the imaging optical system 4 on the side close to the illumination optical system 3.
  • Hill is the height (mm) in the Z direction from the emission region limiting member 9 to the sample surface P of the imaging optical system 4.
  • Hinc is the height (mm) in the Z direction from the sample surface P to the reflecting object 20.
  • Hcase is the height (mm) in the Z direction from the sample surface P to the inner surface (reflection surface) of the top plate 1b.
  • the sample surface P When observing cells adhered to the inner surface of the bottom plate 1a, the sample surface P substantially coincides with the inner surface of the bottom plate 1a.
  • Hill, Hinc, and Hcase when there is a medium other than air in the optical path of the illumination light between the second emission region 9a and the reflective object 20 of the incubator, Hill, Hinc, and Hcase are air equivalent lengths. .
  • Conditional expression (1) defines the irradiation condition of the illumination light on the specimen surface P for giving contrast to the cell image by oblique illumination.
  • ⁇ min and ⁇ max are expressed by the following equations (5) and (6).
  • ⁇ min (Xm_min ⁇ Xc_axis) / Fc (5)
  • ⁇ max (Xm_max ⁇ Xc_axis) / Fc (6)
  • Xm_min is the X coordinate (mm) of the end closest to the optical axis Z of the imaging optical system 4 in the first emission region 7a.
  • Xm_max is the X coordinate (mm) of the end farthest from the optical axis Z of the imaging optical system 4 in the first emission region 7a.
  • Xc_axis is the Z coordinate (mm) of the optical axis Z ′ of the collimating lens 8.
  • Fc is the focal length (mm) of the collimating lens 8 in the X direction.
  • the X coordinate of the end closest to the optical axis Z of the light beam of the illumination light L is R * ⁇ min / NA
  • the X coordinate of the end farthest from the optical axis Z of the light beam of the illumination light L is R * ⁇ max / NA.
  • R is the radius of the pupil 11a.
  • the luminous flux of the illumination light L partially overlaps the edge 11b of the pupil 11a. That is, a part of the light beam of the illumination light L is blocked by the edge portion 11b on the pupil plane.
  • FIG. 5A brightness and darkness are formed in the image of the cell S formed by the objective lens 11, and an image in which the cell S can be seen three-dimensionally is obtained.
  • Conditional expression (2) defines a condition for preventing unnecessary light from the reflecting object 20 above the container 1 from entering the real field of view FOV of the imaging optical system 4. A part of the illumination light passes through the top plate 1b, is reflected by the reflecting object 20, and returns to the lower side of the stage 2 as unnecessary light.
  • the left side of conditional expression (2) is expressed as follows.
  • Xinc_max Xex_max ⁇ (Hill + 2Hcase) * ⁇ min Xinc_max is the maximum value of the X coordinate on the sample surface P of the illumination light having the minimum angle ⁇ min reflected by the reflecting object 20.
  • Conditional expression (3) defines a condition that can ensure brightness over the entire image.
  • conditional expression (3) the following expression is established.
  • Xobj_min Xex_min ⁇ (Hill + 2Hcase) * ⁇ min
  • Xobj_min is the minimum value of the X coordinate on the sample surface P of the illumination light having the minimum angle ⁇ min reflected by the inner surface of the top board 1b.
  • X ′′ obj_min is the minimum value of the X coordinate on the sample surface P of the illumination light having an angle NA reflected by the inner surface of the top board 1b.
  • X ′′ obj_min> Xfov_min Illumination light having an angle smaller than the NA of the imaging optical system 4 does not reach near the end Xfov_min of the real field of view FOV.
  • FIG. 10A the end region far from the illumination optical system 3 of the real field FOV becomes dark, and the cell S at the end in the real field FOV cannot be observed.
  • conditional expression (3 ′) In order to further reduce the decrease in brightness at the end of the real field of view FOV, it is more preferable to satisfy the following conditional expression (3 ′).
  • the conditional expression (3) When the conditional expression (3) is satisfied but the conditional expression (3 ′) is not satisfied, as shown in FIGS. 9B and 10B, the brightness is reduced at the end of the real field of view FOV.
  • the conditional expression (3 ′) By satisfying the conditional expression (3 ′), the brightness at the end of the real field of view FOV can be made equal to the vicinity of the center.
  • Conditional expression (4) defines a condition that can ensure the contrast of the cells S over the entire image.
  • conditional expression (4) the following expression is established.
  • X ′′ obj_max Xex_max ⁇ (Hill + 2Hcase) * NA
  • X ′′ obj_max is the maximum value of the X coordinate on the specimen surface P of the illumination light having an angle NA reflected by the inner surface of the top board 1b.
  • the container 1 is placed on the stage 2 with the bottom plate 1a facing downward, as shown in FIG.
  • the container 1 and the observation device 100 are placed in an incubator.
  • the light source 5 is operated to generate illumination light.
  • the illumination light emitted from the light source 5 is diffused by the diffusion plate 6, emitted from the first emission region 7 a of the illumination mask 7, converted into substantially parallel light by the collimator lens 8, and the second emission from the emission region limiting member 9. Injected obliquely upward from the region 9a toward the stage 2.
  • the illumination light passes through the stage 2 and the bottom plate 1a of the container 1 obliquely upward, is reflected on the inner surface of the top plate 1b of the container 1, and illuminates the cells S from obliquely above.
  • the illumination light that illuminates the cells S passes through the bottom plate 1a and the stage 2 obliquely downward and enters the objective lens 11 obliquely with respect to the optical axis Z. At this time, the illumination light is refracted and scattered by the shape and refractive index of the cell S, and is attenuated by the transmittance of the cell S. Therefore, the illumination light on which the information of the cell S is placed is collected by the objective lens 11 and imaged by the imaging element 12.
  • the illumination light passing outside the pupil 11a is blocked by the edge portion 11b.
  • the illumination lights L1 and L5 that do not pass through the cells S are near the edge 11b of the pupil 11a. And reaches the image sensor 12.
  • the illumination light L2 that has passed through the left end of the cell S is refracted in the cell S, reaches the outside of the pupil 11a, is kicked, and does not reach the image sensor 12.
  • the illumination light L3 that passes through the vicinity of the center of the cell S and the illumination light L4 that passes through the right side of the cell S are refracted in the cell S and reach the image sensor 12 through the pupil 11a.
  • FIG. 5A an image of the cell S that is shaded and looks three-dimensional is obtained.
  • conditional expression (1) when the conditional expression (1) is satisfied, a part of the illumination light is blocked on the pupil plane of the objective lens 11, and the image of the cell S connected by the objective lens 11 is bright and dark. It is formed. Thereby, the cell S in the container 1 can be observed three-dimensionally with good contrast by oblique illumination. Further, by satisfying conditional expression (2), it is possible to prevent the contrast of the image of the cell S from being lowered due to the illumination light reflected by the reflecting object 20 above the top plate 1b of the container 1. Thereby, the image of the high contrast cell S by oblique illumination can be obtained reliably.
  • the reflection surface for oblique illumination is the inner surface of the top plate 1b of the container 1, but it may be the liquid surface of the culture solution in the container 1 instead. That is, oblique illumination of the cells S may be realized by illumination light reflected obliquely downward on the liquid level of the culture solution in the container 1.
  • the position Xex_max at the end farthest from the optical axis Z of the objective lens 11 in the second emission region 9a may be changeable in the X direction.
  • the injection region limiting member 9 may be movable in the X direction.
  • the position Xm_min of the end closest to the optical axis Z of the objective lens 11 in the first emission region 7a may be changeable in the X direction.
  • the illumination mask 7 may be movable in the X direction.
  • ⁇ min in conditional expressions (1) and (2) depends on Xm_min.
  • Xm_min can be adjusted within a range in which conditional expressions (1) and (2) are satisfied according to observation conditions such as Hinc.
  • the values of various parameters in each example are shown in FIG.
  • the setting parameters of the illumination optical system in FIG. 14 are Fc, Xc_axis, Xm_min, Xm_max, Xex_min, and Xex_max.
  • the values of ⁇ min and ⁇ max in FIG. 14 are approximate values calculated from conditional expressions (5) and (6).
  • the calculation in each embodiment is performed based on the values of ⁇ min and ⁇ max calculated from the conditional expressions (5) and (6).
  • FIG. 15A shows an observation apparatus 101 according to the first example.
  • the imaging optical system 4 can move in the Z direction, and the cell S can be focused by moving the imaging optical system 4 in the Z direction.
  • the upper part shows the positional relationship between the collimating lens 8 and the objective lens 11 as seen from above
  • the lower part shows the positional relationship between the illumination mask 7 and the objective lens 11 as seen from above.
  • conditional expression (1) As shown in FIG. 14, in this embodiment, ⁇ min, ⁇ max, and NA satisfy the conditional expression (1).
  • Conditional expression (2) is satisfied when Hinc> 91.83. That is, the relative position in the Z direction between the observation apparatus 101 and the reflective object 20 is determined so that the height from the sample surface P to the reflective object 20 is greater than 91.83 mm.
  • Conditional expression (3) is satisfied when Hcase> 8.9.
  • Conditional expression (4) is satisfied when Hcase ⁇ 48.1. Therefore, it is preferable to use the container 1 whose height from the sample surface P to the inner surface of the top plate 1b is larger than 8.9 mm and smaller than 48.1 mm.
  • General well plate for cell culture T12.5 flask, T25 flask, 100 mm dish Hcase is 12 mm to 25 mm.
  • the Hcase for 35 mm dishes and 60 mm dishes is 8 mm to 5 mm.
  • the Hcase of the T75 flask is 25 mm to 35 mm. That is, a general cell culture vessel can be preferably used.
  • the conditional expression (3 ′) is satisfied. Further, when Hcase ⁇ 32.8, the conditional expression (4 ′) is satisfied. Therefore, it is more preferable to use the container 1 having a height from the specimen surface P to the inner surface of the top plate 1b that is larger than 19 mm and smaller than 32.8 mm.
  • FIG. 16A shows a line scanning observation apparatus 102 according to the second embodiment.
  • the optical axes Z ′ of the light source 5 and the collimating lens 8 are arranged along the X direction, and the illumination light emitted from the collimating lens 8 is directed obliquely upward.
  • a prism 10 that deflects by 45 ° is further provided.
  • FIG. 16B a plurality of light sources 5 are arranged along the Y direction.
  • the Y direction is a direction orthogonal to the Z direction and the X direction.
  • the illumination mask 7, the collimating lens 8, and the prism 10 have a long shape extending in the Y direction.
  • the collimating lens 8 is a linear Fresnel lens having a focal length Fc.
  • the linear Fresnel lens has refractive power in the Z direction and does not have refractive power in the Y direction.
  • the optical axis Z ′ of the collimating lens 8 is bent 90 ° by the prism 10.
  • FIG. 16C is a diagram when the illumination mask 7 is viewed in the X direction.
  • the image sensor 12 is a line sensor extending in the Y direction, and a plurality of objective lenses 11 are arranged in the Y direction.
  • the illumination optical system 3 and the imaging optical system 4 can move in the X direction integrally.
  • a one-dimensional image of the sample surface P is sequentially acquired by the image sensor 12 while scanning the illumination light in the X direction by the movement of the illumination optical system 3 in the X direction.
  • conditional expression (1) As shown in FIG. 14, in this embodiment, ⁇ min, ⁇ max, and NA satisfy the conditional expression (1).
  • Conditional expression (2) is satisfied when Hinc> 82.0. That is, the relative position in the Z direction between the observation apparatus 102 and the reflective object 20 is determined so that the height from the sample surface P to the reflective object 20 is greater than 82.0 mm.
  • Conditional expression (3) is satisfied when Hcase> 2.17.
  • Conditional expression (4) is satisfied when Hcase ⁇ 56.3. Therefore, it is preferable to use the container 1 whose height from the sample surface P to the inner surface of the top plate 1b is larger than 2.17 mm and smaller than 56.3 mm.
  • a general well plate for cell culture, T12.5 flask, T25 flask, T75 flask, 100 mm dish can be suitably used.
  • the conditional expression (3 ′) is satisfied. Further, when Hcase ⁇ 40.0, the conditional expression (4 ′) is satisfied. Therefore, it is more preferable to use the container 1 having a height from the specimen surface P to the inner surface of the top plate 1b that is larger than 4 mm and smaller than 40.0 mm.
  • the prism 10 may be capable of swinging around the swing axis in the Y direction in order to change the exit direction of the illumination light emitted from the second exit region 9a.
  • ⁇ min can be adjusted within a range in which conditional expressions (1) and (2) are satisfied according to observation conditions such as Hill and Hinc.
  • a mirror may be employed instead of the prism 10.
  • FIG. 17 shows a scanning observation apparatus 103 according to the third embodiment.
  • An observation apparatus 103 according to the present embodiment is a modification of the observation apparatus 102, and the emission region limiting member 9 is movable in the X direction.
  • Xex_max changes due to the movement of the injection region limiting member 9 in the X direction.
  • Xex_max can be adjusted within a range in which conditional expression (2) is satisfied, according to the height Hinc of the reflecting object 20 in the incubator.
  • conditional expression (3) is satisfied when Hcase> 2.17.
  • Conditional expression (4) is satisfied when Hcase ⁇ 31.3. Therefore, it is preferable to use the container 1 having a height from the sample surface P to the inner surface of the top plate 1b that is larger than 2.17 mm and smaller than 31.3 mm.
  • FIG. 18 shows a scanning observation apparatus 104 according to the fourth embodiment.
  • An observation apparatus 104 according to the present embodiment is another modification of the observation apparatus 102, and the illumination mask 7 is movable in the Z direction.
  • the X direction and the Z direction viewed from the illumination mask 7 are respectively the Z direction and the X direction viewed from the imaging optical system 4. It corresponds. Therefore, Xm_min changes in the Z direction corresponding to the X direction viewed from the imaging optical system 4 by the movement of the illumination mask 7 in the Z direction.
  • Xm_min can be adjusted within a range in which conditional expressions (1) and (2) are satisfied, according to the height Hinc of the reflecting object 20 in the incubator.
  • conditional expression (2) is satisfied when Hinc> 62.6. That is, the relative position in the Z direction between the observation apparatus 103 and the reflective object 20 is determined so that the height from the sample surface P to the reflective object 20 is larger than 62.6 mm.
  • Conditional expressions (3) and (4) are the same as in the second embodiment.
  • the center of the first emission region 7a is deviated in the X direction or a direction corresponding to the X direction with respect to the optical axis Z ′ of the collimating lens 8.
  • illumination light may be emitted obliquely by other means.
  • the prism 10 may have a reflecting surface larger than 45 °, and as shown in FIG. 19B, the light source 5, the diffuser plate 6, and the illumination mask 7 are imaged. It may be inclined with respect to the optical axis Z of the optical system 4.

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Abstract

観察装置（１００）は、ステージ（２）の下方に配置された照明光学系（３）および撮像光学系（４）を備え、照明光学系（３）が、光源（５）と、光源（５）からの照明光を第１射出領域（７ａ）に制限する照明マスク（７）と、第１射出領域（７ａ）からの照明光を略平行光に変換するコリメートレンズ（８）と、コリメートレンズ（８）からの照明光を第２射出領域（９ａ）に制限する射出領域制限部材（９）とを備え、撮像光学系（４）の瞳面における第１射出領域（７ａ）の投影像が、瞳（１１ａ）の辺縁部に部分的に重なり、下記条件式を満たす。　０．１ＮＡ＜θｍｉｎ＜ＮＡ＜θｍａｘ　Ｘｅｘ＿ｍａｘ－（Ｈｉｌｌ＋２Ｈｉｎｃ）＊θｍｉｎ＜Ｘｆｏｖ＿ｍｉｎ

Description

観察装置
　本発明は、観察装置に関するものである。
　従来、細胞等の被写体を標識せずに観察する装置が提案されている（例えば、特許文献１および２参照。）。特許文献１，２の観察装置において、光源部および照明部の両方が試料の下方に配置されている。光源部からの照明光は、試料を斜め上方に向かって透過し、試料の上方において反射部材または細胞を収容する容器の蓋によって反射され、試料を斜め上方から照明する。撮影光学系は、試料を斜め下方に透過した照明光を撮影する。特許文献１，２に記載されているとおり、照明光の入射角が対物光学系の取り込み角と同等の場合に、試料が立体的に見える偏斜照明を実現することができる。
国際公開第２０１６／１５８７８０号 国際公開第２０１７／１０４０６８号
　観察装置の周囲には、照明光を反射する反射物体が存在することがある。例えば、細胞観察用の観察装置が設置されるインキュベータの内部には、観察装置の上方に、インキュベータの棚または天井が存在する。容器の蓋を透過した照明光の一部が、このような反射物体によって反射され、不要光として対物光学系に入射する場合がある。容器の蓋よりも高い位置の反射物体からの不要光は、小さな入射角度で対物光学系に入射する。したがって、対物光学系の瞳面において不要光は瞳の中心に近い位置に入射し、不要光の全部または大部分が瞳を通過する。その結果、画像内の細胞のコントラストが低下し細胞の観察が困難になる場合がある。
　本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、反射物体からの不要光に因る試料の像のコントラスト低下を防ぎ、偏斜照明によって試料を立体的にコントラストよく観察することができる観察装置を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
　本発明の一態様は、インキュベータ内に配置される観察装置であって、光を反射する反射物体が前記インキュベータ内の前記観察装置の上方に配置され、試料が載置される略水平なステージと、該ステージの下方に配置され、斜め上方に向けて照明光を射出する照明光学系と、前記ステージの下方に配置され、前記ステージを透過し前記試料の上方において反射面によって反射され前記試料および前記ステージを斜め下方に透過した前記照明光を撮像する撮像光学系とを備え、前記照明光学系が、前記照明光を発する光源と、該光源からの前記照明光を特定の第１射出領域に制限する照明マスクと、前記第１射出領域から射出された前記照明光を略平行光に変換するコリメートレンズと、該コリメートレンズからの前記照明光を特定の第２射出領域に制限する射出領域制限部材とを備え、前記撮像光学系の瞳面に投影された前記第１射出領域の投影像が、前記撮像光学系の瞳の辺縁部に部分的に重なり、下記条件式（１）および条件式（２）を満たす観察装置である。
　０．１ＮＡ＜θｍｉｎ＜ＮＡ＜θｍａｘ…（１）
　Ｘｅｘ＿ｍａｘ－（Ｈｉｌｌ＋２Ｈｉｎｃ）＊θｍｉｎ＜Ｘｆｏｖ＿ｍｉｎ…（２）
　ここで、ＮＡは、前記撮像光学系の前記試料側の開口数、θｍｉｎは、前記第２射出領域から射出される前記照明光の前記撮像光学系の光軸に対する射出角の最小値、θｍａｘは、前記第２射出領域から射出される前記照明光の前記撮像光学系の光軸に対する射出角の最大値、Ｘｅｘ＿ｍａｘは、前記第２射出領域の前記撮像光学系の光軸から最も遠い端のＸ座標、Ｘｆｏｖ＿ｍｉｎは、前記撮像光学系の実視野の前記照明光学系から遠い側の端のＸ座標、Ｈｉｌｌは、前記射出領域制限部材から前記撮像光学系の標本面までの前記撮像光学系の光軸に沿う方向の高さ（空気換算長）、Ｈｉｎｃは、前記標本面から前記インキュベータ内の前記反射物体までの前記撮像光学系の光軸に沿う方向の高さ（空気換算長）であり、Ｘ座標は、前記撮像光学系の光軸に直交し前記第２射出領域から射出される前記照明光の光軸を通るＸ方向の位置座標であり、前記撮像光学系の光軸がＸ座標の原点であり、前記撮像光学系の光軸から前記コリメートレンズの光軸に向かう方向が正である。
　本態様によれば、光源から発せられた照明光は、照明マスクによって第１射出領域に制限され、コリメートレンズによって略平行光に変換され、射出領域制限部材の第２射出領域から斜め上方に向かって射出される。照明光は、ステージおよび試料を斜め上方に向かって透過し、試料の上方において反射面によって斜め下方へ反射され、試料を斜め上方から照明する。反射面は、例えば、試料を収容する容器の天板の内面または容器内の溶液の液面である。その後、照明光は、試料およびステージを斜め下方に向かって透過し、撮像光学系の光軸に対して斜めに撮像光学系に入射する。
　この場合において、条件式（１）を満たすことによって、撮像光学系の瞳面において、照明光の光束が部分的に瞳の辺縁部によって遮られる。このような偏斜照明によって、陰影が付き立体的に見える試料の像を撮像光学系によって取得することができる。
　また、反射面の上方に、照明光を反射する反射物体が存在することがある。条件式（２）を満たすことによって、反射物体によって下方に反射された照明光が撮像光学系の実視野に入射しない。これにより、反射物体からの不要光に因る試料の像のコントラスト低下を防ぎ、偏斜照明による高コントラストの試料の像を確実に取得することができる。
　上記態様においては、下記条件式（３）を満たすことが好ましい。
　Ｘｅｘ＿ｍｉｎ＜Ｘｆｏｖ＿ｍｉｎ＋（Ｈｉｌｌ＋２Ｈｃａｓｅ）＊ＮＡ…（３）
　ここで、Ｘｅｘ＿ｍｉｎは、前記第２射出領域の前記撮像光学系の光軸に最も近い端のＸ座標、Ｈｃａｓｅは、前記標本面から前記反射面までの前記撮像光学系の光軸に沿う方向の高さ（空気換算長）である。
　この構成によって、反射面によって反射された照明光により、実視野の中央のみならず実視野の端まで明るく照明することができる。
　上記態様においては、下記条件式（４）を満たすことが好ましい。
　Ｘｅｘ＿ｍａｘ＞Ｘｆｏｖ＿ｍａｘ＋（Ｈｉｌｌ＋２Ｈｃａｓｅ）＊ＮＡ…（４）
　ここで、Ｘｆｏｖ＿ｍａｘは、前記撮像光学系の実視野の前記照明光学系に近い側の端のＸ座標、Ｈｃａｓｅは、前記標本面から前記反射面までの前記撮像光学系の光軸に沿う方向の高さ（空気換算長）である。
　この構成によって、撮像光学系の実視野の端まで試料のコントラストを得ることができる。
　上記態様においては、前記射出領域制限部材が、前記第２射出領域の前記撮像光学系の光軸から最も遠い端の位置を前記Ｘ方向に変更可能であってもよい。
　この構成によって、条件式（２）におけるＸｅｘ＿ｍａｘを変更することができる。すなわち、容器の種類および反射物体の位置等の観察条件に応じて、条件式（２）が満たされる範囲内にＸｅｘ＿ｍａｘを調整することができる。
　上記態様においては、前記照明光学系が、前記第２射出領域からの前記照明光の射出方向を変更可能であるプリズムまたはミラーを備えていてもよい。
　この構成によって、条件式（１）および（２）におけるθｍｉｎを変更することができる。すなわち、容器の種類および反射物体の位置等の観察条件に応じて、条件式（１）および（２）が満たされる範囲内にθｍｉｎを調整することができる。
　上記態様においては、前記Ｘ方向において、前記第１射出領域の前記撮像光学系から遠い側の端が、前記コリメートレンズの光軸よりも前記撮像光学系の光軸に対して外側に配置されていてもよい。
　この構成によって、コリメートレンズから、撮像光学系の光軸に向かって斜め上方に照明光を射出させることができる。
　上記態様においては、下記条件式（５）および条件式（６）を満たしていてもよい。
　θｍｉｎ＝（Ｘｍ＿ｍｉｎ－Ｘｃ＿ａｘｉｓ）／Ｆｃ…（５）
　θｍａｘ＝（Ｘｍ＿ｍａｘ－Ｘｃ＿ａｘｉｓ）／Ｆｃ…（６）
　ここで、Ｘｍ＿ｍｉｎは、前記第１射出領域の前記撮像光学系の光軸に最も近い端のＸ座標、Ｘｍ＿ｍａｘは、前記第１射出領域の前記撮像光学系の光軸から最も遠い端のＸ座標、Ｘｃ＿ａｘｉｓは、前記コリメートレンズの光軸のＸ座標、Ｆｃは、前記コリメートレンズの前記Ｘ方向の焦点距離である。
　本発明によれば、反射物体からの不要光に因る試料のコントラスト低下を防ぎ、偏斜照明によって試料を立体的にコントラストよく観察することができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係る観察装置の全体構成図である。 図１の観察装置の照明光学系および撮像光学系を上側から見た平面図である。 図１の観察装置の各パラメータを示す図である。 条件式（１）を満たすときの、瞳面における照明光の位置の一例を示す図である。 条件式（１）を満たさないときの、瞳面における照明光の位置の一例を示す図である。 条件式（１）を満たさないときの、瞳面における照明光の位置の他の例を示す図である。 条件式（１）を満たすときの、画像の一例である。 条件式（１）を満たさないときの、画像の一例である。 条件式（１）を満たさないときの、画像の他の例である。 条件式（２）を満たさないときの、瞳面における照明光と不要光の一例を示す図である。 条件式（２）を満たさないときの、画像の一例である。 インキュベータの棚の構造例である。 条件式（３）を満たさないときの、瞳面における照明光の一例である。 条件式（３）を満たすときの、瞳面における照明光の一例である。 条件式（３）を満たさないときの、画像の一例である。 条件式（３）を満たすときの、画像の一例である。 条件式（４）を満たさないときの、瞳面における照明光の一例を示す図である。 条件式（４）を満たさないときの、画像の一例である。 図１の観察装置による偏斜照明の原理を説明する図である。 本発明の第１から第４実施例に係る観察装置の各種パラメータの値を示す図表である。 本発明の第１実施例に係る観察装置の全体構成図である。 図１５Ａの観察装置における照明マスク、コリメートレンズおよび対物レンズを上側から見た図である。 本発明の第２実施例に係る観察装置の全体構成図である。 図１６Ａの観察装置の光源、拡散板、照明マスク、コリメートレンズ、プリズム、対物レンズ、撮像素子および実視野を上側から見た図である。 図１６Ａの観察装置の照明マスクをＸ方向に見た図である。 本発明の第３実施例に係る観察装置の全体構成図である。 本発明の第４実施例に係る観察装置の全体構成図である。 照明光学系の変形例の構成図である。 照明光学系の他の変形例の構成図である。
　本発明の一実施形態に係る観察装置１００について図面を参照して以下に説明する。
　本実施形態に係る観察装置１００は、細胞培養用の容器１と一緒にインキュベータ内に配置され、容器１内の細胞（試料）を撮像する。インキュベータ内には上下方向に並ぶ複数の棚が設置され、観察装置１００はいずれかの棚の上に配置される。観察装置１００の上方には、図１に示されるように、反射物体２０である他の棚またはインキュベータの天井が存在する。棚および天井は、ステンレスのような金属製であり、光を反射する。
　観察装置１００は、図１に示されるように、容器１が載置されるステージ２と、ステージ２の下方に配置され容器１内の細胞を照明する照明光学系３と、ステージ２の下方に配置され容器１内の細胞を撮像する撮像光学系４とを備えている。
　以下、撮像光学系４の光軸Ｚに沿う方向をＺ方向と定義し、撮像光学系４と照明光学系３のコリメートレンズ８（後述）の光軸Ｚ’との配列方向をＸ方向と定義する。Ｘ方向は、光軸Ｚに直交し光軸Ｚ’を通過する方向である。また、撮像光学系４の光軸Ｚからコリメートレンズ８の光軸Ｚ’に向かう方向を、Ｘ方向の正方向と定義する。
　容器１は、例えば、細胞培養用のディッシュ、フラスコ、またはマルチウェルプレートである。容器１は、上下方向に相互に対向する底板１ａおよび天板１ｂを有する。容器１は、全体的に光学的に透明な材質から形成されている。
　ステージ２は、平板状の部材であり、ガラスのような光学的に透明な材質から形成されている。ステージ２は、略水平に配置され、照明光学系３および撮像光学系４の上方を覆っている。ステージ２は、照明光学系３および撮像光学系４を収容する箱型の筐体の天板であってもよい。
　照明光学系３は、撮像光学系４とＸ方向に配列されている。照明光学系３は、照明光を発生する光源５と、光源５から発せられた照明光を拡散させる拡散板６と、拡散板６から射出される照明光を特定の第１射出領域７ａに制限する照明マスク７と、第１射出領域７ａから射出された照明光を略平行光に変換するコリメートレンズ８と、コリメートレンズ８から射出される照明光を特定の第２射出領域９ａに制限する射出領域制限部材９とを備えている。
　光源５は、ＬＥＤのような点光源である。
　拡散板６は、光源５から入射した照明光を拡散し、拡散された照明光を射出する。つまり、拡散板６は、面光源として機能する。
　照明マスク７は、開口部からなり照明光を通過させる第１射出領域７ａを有している。拡散板６によって拡散された照明光は第１射出領域７ａのみから射出される。
　照明マスク７は、コリメートレンズ８の焦点面上に配置されている。コリメートレンズ８は、第１射出領域７ａから射出された照明光を略平行光に変換する。
　射出領域制限部材９は、開口部からなり照明光を通過させる第２射出領域９ａを有している。コリメートレンズ８によって略平行光に変換された照明光は、第２射出領域９ａのみから射出される。射出領域制限部材９は、例えば、コリメートレンズ８の周縁を保持する枠である。
　図２に示されるように、Ｘ方向において、第１射出領域７ａの中心はコリメートレンズ８の光軸Ｚ’に対して撮像光学系４とは反対側に偏心している。これにより、第２射出領域９ａからは、Ｚ方向に対して斜め上方に照明光が射出される。第２射出領域９ａから射出された照明光は、ステージ２および底板１ａを透過し、天板１ｂの内面（反射面）によって反射され、底板１ａおよびステージ２を透過し、撮像光学系４に入射する。
　撮像光学系４は、対物レンズ１１と、対物レンズ１１によって形成された細胞の像を撮影し細胞の画像を生成する撮像素子１２とを備えている。
　対物レンズ１１は、光軸上に瞳（明るさ絞り）１１ａを有している。対物レンズ１１は、入射した照明光を撮像素子１２上に結像する。
　撮像素子１２は、２次元イメージセンサである。
　観察装置１００は、後述する条件式（１）～（４）のうち、少なくとも条件式（１），（２）を満たしている。条件式（３），（４）は、撮像素子１２によって生成される画像の端部の画質の向上に関するものである。画像の端部の画質が問題とならない場合には、条件式（３），（４）は必ずしも満たしていなくてもよい。
　０．１ＮＡ＜θｍｉｎ＜ＮＡ＜θｍａｘ…（１）
　Ｘｅｘ＿ｍａｘ－（Ｈｉｌｌ＋２Ｈｉｎｃ）＊θｍｉｎ＜Ｘｆｏｖ＿ｍｉｎ…（２）
　Ｘｅｘ＿ｍｉｎ＜Ｘｆｏｖ＿ｍｉｎ＋（Ｈｉｌｌ＋２Ｈｃａｓｅ）＊ＮＡ…（３）
　Ｘｅｘ＿ｍａｘ＞Ｘｆｏｖ＿ｍａｘ＋（Ｈｉｌｌ＋２Ｈｃａｓｅ）＊ＮＡ…（４）
　図３は、条件式（１）～（４）中の各種パラメータを示している。以下の各種パラメータの説明において、Ｘ座標とは、撮像光学系４の光軸Ｚを原点とするＸ方向の位置座標である。
　ＮＡは、対物レンズ１１の物体側（細胞側）の開口数である。θｍｉｎは、第２射出領域９ａから射出される照明光の、撮像光学系４の光軸Ｚに対する射出角の最小値（ｄｅｇ）である。θｍａｘは、第２射出領域９ａから射出される照明光の、撮像光学系４の光軸Ｚに対する射出角の最大値（ｄｅｇ）である。Ｘｅｘ＿ｍａｘは、第２射出領域９ａの撮像光学系４から最も遠い端のＸ座標（ｍｍ）である。Ｘｅｘ＿ｍｉｎは、第２射出領域９ａの撮像光学系４に最も近い端のＸ座標（ｍｍ）である。Ｘｆｏｖ＿ｍａｘは、撮像光学系４の実視野ＦＯＶの、照明光学系３から遠い側の端のＸ座標（ｍｍ）である。Ｘｆｏｖ＿ｍｉｎは、撮像光学系４の実視野ＦＯＶの、照明光学系３に近い側の端のＸ座標（ｍｍ）である。Ｈｉｌｌは、射出領域制限部材９から撮像光学系４の標本面ＰまでのＺ方向の高さ（ｍｍ）である。Ｈｉｎｃは、標本面Ｐから反射物体２０までのＺ方向の高さ（ｍｍ）である。Ｈｃａｓｅは、標本面Ｐから天板１ｂの内面（反射面）までのＺ方向の高さ（ｍｍ）である。
　底板１ａの内面に接着している細胞を観察する場合には、標本面Ｐは底板１ａの内面と略一致する。
　Ｈｉｌｌ、ＨｉｎｃおよびＨｃａｓｅに関して、第２射出領域９ａとインキュベータの反射物体２０との間の照明光の光路に空気以外の媒質が存在する場合には、Ｈｉｌｌ、ＨｉｎｃおよびＨｃａｓｅは、空気換算長である。
　条件式（１）は、偏斜照明によって細胞の像にコントラストを与えるための標本面Ｐでの照明光の照射条件を規定している。θｍｉｎおよびθｍａｘは、下式（５）および（６）で表される。
　θｍｉｎ＝（Ｘｍ＿ｍｉｎ－Ｘｃ＿ａｘｉｓ）／Ｆｃ…（５）
　θｍａｘ＝（Ｘｍ＿ｍａｘ－Ｘｃ＿ａｘｉｓ）／Ｆｃ…（６）
　ここで、Ｘｍ＿ｍｉｎは、第１射出領域７ａの撮像光学系４の光軸Ｚに最も近い端のＸ座標（ｍｍ）である。Ｘｍ＿ｍａｘは、第１射出領域７ａの撮像光学系４の光軸Ｚから最も遠い端のＸ座標（ｍｍ）である。Ｘｃ＿ａｘｉｓは、コリメートレンズ８の光軸Ｚ’のＺ座標（ｍｍ）である。Ｆｃは、コリメートレンズ８のＸ方向の焦点距離（ｍｍ）である。
　図４Ａから図４Ｃは、対物レンズ１１の瞳面に投影された第１射出領域７ａの投影像、すなわち、瞳面における照明光Ｌの光束を示している。対物レンズ１１には光軸Ｚに対して斜めに照明光Ｌが入射するので、瞳面において、照明光Ｌの光束は光軸Ｚに対してＸ方向に偏心する。瞳面において、照明光Ｌの光束の光軸Ｚに最も近い端のＸ座標はＲ＊θｍｉｎ／ＮＡであり、照明光Ｌの光束の光軸Ｚから最も遠い端のＸ座標はＲ＊θｍａｘ／ＮＡである。Ｒは、瞳１１ａの半径である。
　条件式（１）を満たすときには、図４Ａに示されるように、照明光Ｌの光束は、瞳１１ａの辺縁部１１ｂに部分的に重なる。すなわち、瞳面において、照明光Ｌの光束の一部分が辺縁部１１ｂによって遮られる。これにより、図５Ａに示されるように、対物レンズ１１によって形成される細胞Ｓの像に明暗が形成され、細胞Ｓが立体的に見える画像が得られる。
　ＮＡ≧θｍａｘである場合、図４Ｂに示されるように、照明光Ｌの光束の全部が瞳１１ａを通過する。したがって、図５Ｂに示されるように、細胞Ｓの像にコントラストがつかない。
　ＮＡ≦θｍｉｎである場合、図４Ｃに示されるように、照明光Ｌの光束の全部が瞳面において遮られるため、撮像素子１２に照明光Ｌが入射しない。したがって、図５Ｃに示されるように、実視野ＦＯＶ全体が暗くなる。
　条件式（２）は、容器１の上方の反射物体２０からの不要光が撮像光学系４の実視野ＦＯＶに入射しないための条件を規定している。照明光の一部は、天板１ｂを透過し、反射物体２０によって反射され、不要光としてステージ２の下方に戻る。
　条件式（２）の左辺は、下記のように表される。
　Ｘｉｎｃ＿ｍａｘ＝Ｘｅｘ＿ｍａｘ－（Ｈｉｌｌ＋２Ｈｃａｓｅ）＊θｍｉｎ
　Ｘｉｎｃ＿ｍａｘは、反射物体２０によって反射された最小角度θｍｉｎの照明光の標本面ＰでのＸ座標の最大値である。条件式（２）を満たすことによって、反射物体２０からの不要光が撮像光学系４の実視野ＦＯＶに入射しない。すなわち、天板１ｂによって反射された照明光のみによる偏斜照明を実現することができる。
　Ｘｉｎｃ＿ｍａｘ≧Ｘｆｏｖ＿ｍｉｎである場合、図６に示されるように、反射物体２０からの不要光Ｌ’が、容器１の天板１ｂからの照明光Ｌと重なる。その結果、図７に示されるように、画像に明るさのムラが生じる。反射物体２０であるインキュベータの棚には、図８に示されるように、穴が開いていることがある。このような場合には、実視野ＦＯＶの場所による明るさムラがより顕著になる。
　条件式（３）は、画像全体にわたって明るさを確保することができる条件を規定している。条件式（３）に関して、下式が成立する。
　Ｘｏｂｊ＿ｍｉｎ＝Ｘｅｘ＿ｍｉｎ－（Ｈｉｌｌ＋２Ｈｃａｓｅ）＊θｍｉｎ
　Ｘｏｂｊ＿ｍｉｎは、天板１ｂの内面によって反射された最小角度θｍｉｎの照明光の標本面ＰでのＸ座標の最小値である。条件式（３）を満たすことによって、容器１の天板１ｂからの照明光が、実視野ＦＯＶ全体に入射する。すなわち、実視野ＦＯＶの端まで照明光が届き、全体にわたって明るい画像を得ることができる。
　Ｘ”ｏｂｊ＿ｍｉｎは、天板１ｂの内面によって反射された角度ＮＡの照明光の標本面ＰでのＸ座標の最小値である。Ｘ”ｏｂｊ＿ｍｉｎ＞Ｘｆｏｖ＿ｍｉｎである場合、図９Ａに示されるように、実視野ＦＯＶの端Ｘｆｏｖ＿ｍｉｎ付近には、撮像光学系４のＮＡよりも角度が小さい照明光は届かない。その結果、図１０Ａに示されるように、実視野ＦＯＶの照明光学系３から遠い端の領域が暗くなり、実視野ＦＯＶ内の端の細胞Ｓを観察することができない。
　実視野ＦＯＶの端での明るさの低下をさらに低減するために、下記条件式（３’）を満たすことがさらに好ましい。
　Ｘｅｘ＿ｍｉｎ－（Ｈｉｌｌ＋２Ｈｃａｓｅ）＊θｍｉｎ＜Ｘｆｏｖ＿ｍｉｎ…（３’）
　条件式（３）を満たしているが条件式（３’）を満たしていないときには、図９Ｂおよび図１０Ｂに示されるように、実視野ＦＯＶの端において明るさが低下する。条件式（３’）を満たすことによって、実視野ＦＯＶの端の明るさを中心付近と同等にすることができる。
　条件式（４）は、画像全体にわたって細胞Ｓのコントラストを確保することができる条件を規定している。条件式（４）に関して、下式が成立する。
　Ｘ”ｏｂｊ＿ｍａｘ＝Ｘｅｘ＿ｍａｘ－（Ｈｉｌｌ＋２Ｈｃａｓｅ）＊ＮＡ
　Ｘ”ｏｂｊ＿ｍａｘは、天板１ｂの内面によって反射された角度ＮＡの照明光の標本面ＰでのＸ座標の最大値である。条件式（４）を満たすことによって、実視野ＦＯＶの端まで細胞Ｓの高いコントラストを得ることができる。
　Ｘ”ｏｂｊ＿ｍａｘ≦Ｘｆｏｖ＿ｍａｘである場合、図１１に示されるように、実視野ＦＯＶの端Ｘｆｏｖ＿ｍａｘ付近には、撮像光学系４のＮＡよりも角度が小さい照明光Ｌしか届かず、細胞Ｓによって屈折された照明光Ｌは全て瞳１１ａを通過してしまう。その結果、図１２に示されるように、実視野ＦＯＶの照明光学系３に近い側の端の領域では細胞Ｓにコントラストがつかなくなる。また、照明光Ｌが瞳面で蹴られるので、画像の背景が暗くなる。
　実視野ＦＯＶの端まで高コントラストの細胞Ｓの像を得るために、下記条件式（４’）を満たすことがさらに好ましい。
　Ｘｅｘ＿ｍａｘ－（Ｈｉｌｌ＋２Ｈｃａｓｅ）＊θｍａｘ＞Ｘｆｏｖ＿ｍａｘ…（４’）
　条件式（４’）を満たすことによって、実視野ＦＯＶの端においても、実視野ＦＯＶの中央部分と同程度の細胞Ｓのコントラストを得ることができる。
　次に、観察装置１００の作用について説明する。
　本実施形態に係る観察装置１００によって容器１内で培養中の細胞Ｓを観察するためには、図１に示されるように、底板１ａを下側に向けた状態で容器１をステージ２上に載置し、容器１と観察装置１００をインキュベータ内に配置する。
　次に、光源５を作動させて照明光を発生させる。光源５から発せられた照明光は、拡散板６によって拡散され、照明マスク７の第１射出領域７ａから射出され、コリメートレンズ８によって略平行光に変換され、射出領域制限部材９の第２射出領域９ａからステージ２に向かって斜め上方に射出される。
　照明光は、ステージ２および容器１の底板１ａを斜め上方に向かって透過し、容器１の天板１ｂの内面において反射され、細胞Ｓを斜め上方から照明する。
　細胞Ｓを照明する照明光のうち、細胞Ｓを透過した照明光は、底板１ａおよびステージ２を斜め下方に向かって透過し、対物レンズ１１に光軸Ｚに対して斜めに入射する。この際、照明光は、細胞Ｓの形状および屈折率によって屈折および散乱され、また、細胞Ｓの透過率によって減光される。したがって、細胞Ｓの情報を載せた照明光が対物レンズ１１によって集められ、撮像素子１２によって撮像される。
　ここで、対物レンズ１１内において、瞳１１ａよりも外側を通る照明光は辺縁部１１ｂによって遮られる。図１３に示されるように、対物レンズ１１への照明光の入射角が対物レンズ１１の取り込み角と同等の場合、細胞Ｓを通らない照明光Ｌ１，Ｌ５は、瞳１１ａの辺縁部１１ｂ近傍を通り、撮像素子１２に達する。細胞Ｓの左端を通った照明光Ｌ２は、細胞Ｓにおいて屈折して瞳１１ａの外側に達して蹴られ、撮像素子１２に達しない。細胞Ｓの中央付近を通った照明光Ｌ３および細胞Ｓの右側を通った照明光Ｌ４は、細胞Ｓにおいて屈折され、瞳１１ａを通り撮像素子１２に達する。この結果、図５Ａに示されるように、影が付き立体的に見える細胞Ｓの画像が得られる。
　このように、本実施形態によれば、条件式（１）を満たすことによって、対物レンズ１１の瞳面において照明光の一部が遮られ、対物レンズ１１によって結ばれる細胞Ｓの像に明暗が形成される。これにより、容器１内の細胞Ｓを偏斜照明によって立体的にコントラストよく観察することができる。
　また、条件式（２）を満たすことによって、容器１の天板１ｂよりも上方の反射物体２０によって反射された照明光が原因で細胞Ｓの像のコントラストが低下することが防止される。これにより、偏斜照明による高コントラストの細胞Ｓの像を確実に得ることができる。
　本実施形態においては、偏斜照明用の反射面が、容器１の天板１ｂの内面であることとしたが、これに代えて、容器１内の培養液の液面であってもよい。すなわち、容器１内の培養液の液面において斜め下方に反射された照明光によって、細胞Ｓの偏斜照明が実現されてもよい。
　本実施形態においては、第２射出領域９ａの対物レンズ１１の光軸Ｚから最も遠い端の位置Ｘｅｘ＿ｍａｘがＸ方向に変更可能であってもよい。例えば、射出領域制限部材９が、Ｘ方向に移動可能であってもよい。
　この構成によって、Ｈｉｎｃ等の観察条件に応じて、条件式（２）が満たされる範囲内にＸｅｘ＿ｍａｘを調整することができる。
　本実施形態においては、第１射出領域７ａの対物レンズ１１の光軸Ｚに最も近い端の位置Ｘｍ＿ｍｉｎをＸ方向に変更可能であってもよい。例えば、照明マスク７が、Ｘ方向に移動可能であってもよい。
　条件式（１）および（２）のθｍｉｎは、Ｘｍ＿ｍｉｎに依存する。Ｈｉｎｃ等の観察条件に応じて、条件式（１）および（２）が満たされる範囲内にＸｍ＿ｍｉｎを調整することができる。
　次に、本発明の一実施形態に係る観察装置の実施例について説明する。
　各実施例における各種パラメータの値を図１４に示す。
　図１４中の照明光学系の設定パラメータは、Ｆｃ、Ｘｃ＿ａｘｉｓ、Ｘｍ＿ｍｉｎ、Ｘｍ＿ｍａｘ、Ｘｅｘ＿ｍｉｎ、Ｘｅｘ＿ｍａｘである。図１４中のθｍｉｎおよびθｍａｘの値は、条件式（５），（６）から算出された概算値である。各実施例における計算は、条件式（５），（６）から算出されたθｍｉｎ、θｍａｘの値に基づいて行っている。
（第１実施例）
　図１５Ａは、第１実施例に係る観察装置１０１を示している。撮像光学系４はＺ方向に移動可能であり、撮像光学系４のＺ方向の移動によって細胞Ｓに焦点を合わせることができる。図１５Ｂにおいて、上段は、上側から見たコリメートレンズ８と対物レンズ１１との位置関係を示し、下段は、上側から見た照明マスク７と対物レンズ１１との位置関係を示している。
　図１４に示されるように、本実施例において、θｍｉｎ、θｍａｘおよびＮＡは、条件式（１）を満たしている。
　Ｈｉｎｃ＞９１．８３のときに、条件式（２）を満たす。すなわち、標本面Ｐから反射物体２０までの高さが９１．８３ｍｍよりも大きくなるように、観察装置１０１と反射物体２０とのＺ方向の相対位置が決定される。
　Ｈｃａｓｅ＞８．９のときに条件式（３）を満たす。また、Ｈｃａｓｅ＜４８．１のときに条件式（４）を満たす。したがって、標本面Ｐから天板１ｂの内面までの高さが、８．９ｍｍよりも大きく、４８．１ｍｍよりも小さい容器１を使用することが好ましい。
　一般的な細胞培養用のウェルプレート、Ｔ１２．５フラスコ、Ｔ２５フラスコ、１００ｍｍディッシュのＨｃａｓｅは、１２ｍｍから２５ｍｍである。３５ｍｍディッシュおよび６０ｍｍディッシュのＨｃａｓｅは、８ｍｍから５ｍｍである。Ｔ７５フラスコのＨｃａｓｅは、２５ｍｍから３５ｍｍである。すなわち、一般的な細胞培養用の容器を好適に使用することができる。
　Ｈｃａｓｅ＞１９のときに、条件式（３’）を満たす。また、Ｈｃａｓｅ＜３２．８のときに、条件式（４’）を満たす。したがって、標本面Ｐから天板１ｂの内面までの高さが、１９ｍｍよりも大きく、３２．８ｍｍよりも小さい容器１を使用することが、さらに好ましい。
（第２実施例）
　図１６Ａは、第２実施例に係るライン走査型の観察装置１０２を示している。
　本実施例に係る観察装置１０２の照明光学系３において、光源５およびコリメートレンズ８の光軸Ｚ’がＸ方向に沿って配置され、コリメートレンズ８から射出された照明光を斜め上方に向かって４５°偏向するプリズム１０がさらに設けられている。
　図１６Ｂに示されるように、複数の光源５が、Ｙ方向に沿って配列されている。Ｙ方向は、Ｚ方向およびＸ方向に直交する方向である。複数の光源５のアレイに対応して、照明マスク７、コリメートレンズ８およびプリズム１０は、Ｙ方向に延びる長尺の形状を有している。コリメートレンズ８は、焦点距離Ｆｃを有するリニアフレネルレンズである。リニアフレネルレンズは、Ｚ方向に屈折力を有し、Ｙ方向に屈折力を有しない。コリメートレンズ８の光軸Ｚ’は、プリズム１０によって９０°折り曲げられている。図１６Ｃは、照明マスク７をＸ方向に見た図である。
　撮像素子１２はＹ方向に延びるラインセンサであり、複数の対物レンズ１１がＹ方向に並んでいる。本実施例において、実視野ＦＯＶはＸ方向に幅を有しないので、Ｘｆｏｖ＿ｍａｘ＝Ｘｆｏｖ＿ｍｉｎ＝０である。
　照明光学系３および撮像光学系４は一体的となってＸ方向に移動可能である。照明光学系３のＸ方向の移動によって照明光をＸ方向に走査しながら、標本面Ｐの一次元画像が撮像素子１２によって順次取得される。
　図１４に示されるように、本実施例において、θｍｉｎ、θｍａｘおよびＮＡは、条件式（１）を満たしている。
　Ｈｉｎｃ＞８２．０のときに、条件式（２）を満たす。すなわち、標本面Ｐから反射物体２０までの高さが８２．０ｍｍよりも大きくなるように、観察装置１０２と反射物体２０とのＺ方向の相対位置が決定される。
　Ｈｃａｓｅ＞２．１７のときに条件式（３）を満たす。また、Ｈｃａｓｅ＜５６．３のときに条件式（４）を満たす。したがって、標本面Ｐから天板１ｂの内面までの高さが、２．１７ｍｍよりも大きく、５６．３ｍｍよりも小さい容器１を使用することが好ましい。
　本実施例において、一般的な細胞培養用のウェルプレート、Ｔ１２．５フラスコ、Ｔ２５フラスコ、Ｔ７５フラスコ、１００ｍｍディッシュを好適に使用することができる。
　Ｈｃａｓｅ＞４のときに、条件式（３’）を満たす。また、Ｈｃａｓｅ＜４０．０のときに、条件式（４’）を満たす。したがって、標本面Ｐから天板１ｂの内面までの高さが、４ｍｍよりも大きく、４０．０ｍｍよりも小さい容器１を使用することが、さらに好ましい。
　第２射出領域９ａから射出される照明光の射出方向の変更を可能とするために、プリズム１０が、Ｙ方向の揺動軸回りに揺動可能であってもよい。この構成によって、ＨｉｌｌおよびＨｉｎｃ等の観察条件に応じて、条件式（１）および（２）が満たされる範囲内にθｍｉｎを調整することができる。プリズム１０に代えて、ミラーを採用してもよい。
（第３実施例）
　図１７は、第３実施例に係る走査型の観察装置１０３を示している。
　本実施例に係る観察装置１０３は、観察装置１０２の変形例であり、射出領域制限部材９がＸ方向に移動可能である。射出領域制限部材９のＸ方向の移動によって、Ｘｅｘ＿ｍａｘが変化する。本実施例によれば、インキュベータ内の反射物体２０の高さＨｉｎｃに応じて、条件式（２）が満たされる範囲内にＸｅｘ＿ｍａｘを調整することができる。図１４には、Ｘｅｘ＿ｍａｘ＝４の場合を示している。この場合、Ｈｉｎｃ＞４６．０のときに、条件式（２）を満たす。すなわち、標本面Ｐから反射物体２０までの高さが４６．０ｍｍよりも大きくなるように、観察装置１０３と反射物体２０とのＺ方向の相対位置が決定される。
　第２実施例と同様に、Ｈｃａｓｅ＞２．１７のときに条件式（３）を満たす。また、Ｈｃａｓｅ＜３１．３のときに条件式（４）を満たす。したがって、標本面Ｐから天板１ｂの内面までの高さが、２．１７ｍｍよりも大きく、３１．３ｍｍよりも小さい容器１を使用することが好ましい。
（第４実施例）
　図１８は、第４実施例に係る走査型の観察装置１０４を示している。
　本実施例に係る観察装置１０４は、観察装置１０２の他の変形例であり、照明マスク７がＺ方向に移動可能である。本実施例においてはコリメートレンズ８の光軸がプリズム１０によって９０°折り曲げられているので、照明マスク７から見たＸ方向およびＺ方向は、撮像光学系４から見たＺ方向およびＸ方向にそれぞれ対応している。したがって、照明マスク７のＺ方向の移動によって、Ｘｍ＿ｍｉｎが、撮像光学系４から見たＸ方向に対応するＺ方向に変化する。本実施例によれば、インキュベータ内の反射物体２０の高さＨｉｎｃに応じて、条件式（１）および（２）が満たされる範囲内にＸｍ＿ｍｉｎを調整することができる。
　図１４には、Ｘｍ＿ｍｉｎ＝３．６５の場合を示している。この場合、Ｈｉｎｃ＞６２．６のときに、条件式（２）を満たす。すなわち、標本面Ｐから反射物体２０までの高さが６２．６ｍｍよりも大きくなるように、観察装置１０３と反射物体２０とのＺ方向の相対位置が決定される。
　条件式（３）および（４）については、第２実施例と同一である。
　上述した実施形態および実施例においては、照明光を斜めに射出するために、コリメートレンズ８の光軸Ｚ’に対して第１射出領域７ａの中心がＸ方向またはＸ方向に対応する方向に偏心していることとしたが、他の手段によって照明光を斜めに射出させてもよい。
　例えば、図１９Ａに示されるように、プリズム１０が、４５°よりも大きな反射面を有していてもよく、図１９Ｂに示されるように、光源５、拡散板６および照明マスク７が、撮像光学系４の光軸Ｚに対して傾斜していてもよい。
１００，１０１，１０２，１０３，１０４　観察装置
１　容器
２　ステージ
３　照明光学系
４　撮像光学系
５　光源
６　拡散板
７　照明マスク
７ａ　第１射出領域
８　コリメートレンズ
９　射出領域制限部材
９ａ　第２射出領域
１０　プリズム
１１　対物レンズ
１１ａ　瞳
１１ｂ　辺縁部
１２　撮像素子
Ｚ　撮像光学系の光軸
Ｚ’　コリメートレンズの光軸
Ｐ　標本面

Claims (7)

  1. 　インキュベータ内に配置される観察装置であって、光を反射する反射物体が前記インキュベータ内の前記観察装置の上方に配置され、
    　試料が載置される略水平なステージと、
    　該ステージの下方に配置され、斜め上方に向けて照明光を射出する照明光学系と、
    　前記ステージの下方に配置され、前記ステージを透過し前記試料の上方において反射面によって反射され前記試料および前記ステージを斜め下方に透過した前記照明光を撮像する撮像光学系とを備え、
    　前記照明光学系が、
    　前記照明光を発する光源と、
    　該光源からの前記照明光を特定の第１射出領域に制限する照明マスクと、
    　前記第１射出領域から射出された前記照明光を略平行光に変換するコリメートレンズと、
    　該コリメートレンズからの前記照明光を特定の第２射出領域に制限する射出領域制限部材とを備え、
    　前記撮像光学系の瞳面に投影された前記第１射出領域の投影像が、前記撮像光学系の瞳の辺縁部に部分的に重なり、
    　下記条件式（１）および条件式（２）を満たす観察装置。
    　０．１ＮＡ＜θｍｉｎ＜ＮＡ＜θｍａｘ…（１）
    　Ｘｅｘ＿ｍａｘ－（Ｈｉｌｌ＋２Ｈｉｎｃ）＊θｍｉｎ＜Ｘｆｏｖ＿ｍｉｎ…（２）
    　ここで、
    　ＮＡは、前記撮像光学系の前記試料側の開口数、
    　θｍｉｎは、前記第２射出領域から射出される前記照明光の前記撮像光学系の光軸に対する射出角の最小値、
    　θｍａｘは、前記第２射出領域から射出される前記照明光の前記撮像光学系の光軸に対する射出角の最大値、
    　Ｘｅｘ＿ｍａｘは、前記第２射出領域の前記撮像光学系の光軸から最も遠い端のＸ座標、
    　Ｘｆｏｖ＿ｍｉｎは、前記撮像光学系の実視野の前記照明光学系から遠い側の端のＸ座標、
    　Ｈｉｌｌは、前記射出領域制限部材から前記撮像光学系の標本面までの前記撮像光学系の光軸に沿う方向の高さ（空気換算長）、
    　Ｈｉｎｃは、前記標本面から前記インキュベータ内の前記反射物体までの前記撮像光学系の光軸に沿う方向の高さ（空気換算長）
    であり、
    　Ｘ座標は、前記撮像光学系の光軸に直交し前記第２射出領域から射出される前記照明光の光軸を通るＸ方向の位置座標であり、前記撮像光学系の光軸がＸ座標の原点であり、前記撮像光学系の光軸から前記コリメートレンズの光軸に向かう方向が正である。
  2. 　下記条件式（３）を満たす請求項１に記載の観察装置。
    　Ｘｅｘ＿ｍｉｎ＜Ｘｆｏｖ＿ｍｉｎ＋（Ｈｉｌｌ＋２Ｈｃａｓｅ）＊ＮＡ…（３）
    　ここで、
    　Ｘｅｘ＿ｍｉｎは、前記第２射出領域の前記撮像光学系の光軸に最も近い端のＸ座標、
    　Ｈｃａｓｅは、前記標本面から前記反射面までの前記撮像光学系の光軸に沿う方向の高さ（空気換算長）
    である。
  3. 　下記条件式（４）を満たす請求項１または請求項２に記載の観察装置。
    　Ｘｅｘ＿ｍａｘ＞Ｘｆｏｖ＿ｍａｘ＋（Ｈｉｌｌ＋２Ｈｃａｓｅ）＊ＮＡ…（４）
    　ここで、
    　Ｘｆｏｖ＿ｍａｘは、前記撮像光学系の実視野の前記照明光学系に近い側の端のＸ座標、
    　Ｈｃａｓｅは、前記標本面から前記反射面までの前記撮像光学系の光軸に沿う方向の高さ（空気換算長）
    である。
  4. 　前記射出領域制限部材が、前記第２射出領域の前記撮像光学系の光軸から最も遠い端の位置を前記Ｘ方向に変更可能である請求項１から請求項３のいずれかに記載の観察装置。
  5. 　前記照明光学系が、前記第２射出領域からの前記照明光の射出方向を変更可能であるプリズムまたはミラーを備える請求項１から請求項４のいずれかに記載の観察装置。
  6. 　前記Ｘ方向において、前記第１射出領域の前記撮像光学系から遠い側の端が、前記コリメートレンズの光軸よりも前記撮像光学系の光軸に対して外側に配置される請求項１から請求項５のいずれかに記載の観察装置。
  7. 　下記条件式（５）および条件式（６）を満たす請求項１から請求項６のいずれかに記載の観察装置。
    　θｍｉｎ＝（Ｘｍ＿ｍｉｎ－Ｘｃ＿ａｘｉｓ）／Ｆｃ…（５）
    　θｍａｘ＝（Ｘｍ＿ｍａｘ－Ｘｃ＿ａｘｉｓ）／Ｆｃ…（６）
    　ここで、
    　Ｘｍ＿ｍｉｎは、前記第１射出領域の前記撮像光学系の光軸に最も近い端のＸ座標、
    　Ｘｍ＿ｍａｘは、前記第１射出領域の前記撮像光学系の光軸から最も遠い端のＸ座標、
    　Ｘｃ＿ａｘｉｓは、前記コリメートレンズの光軸のＸ座標、
    　Ｆｃは、前記コリメートレンズの前記Ｘ方向の焦点距離
    である。
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