JP2011008188A - 光学顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】標本の形状に対応させて、標本と偏斜照明を標本の垂直軸に対して相対的に回転させることにより、標本によって偏斜照明が遮断されることなく照射され、適切な偏斜照明により観察することができる光学顕微鏡を提供すること。
【解決手段】標本３を保持するステージ２と、前記標本３を照明する透過照明光学系４を備えた光学顕微鏡であって、前記透過照明光学系４は、光源１からの光束を非対称に遮光して照明する遮光手段４３を備えているとともに、前記遮光手段４３が前記ステージ２に対し光軸を中心に相対的に回転するように構成されている。
【選択図】 図１

Description

本発明は、顕微鏡の透過照明光学系に関するものであり、特に、光束を光軸に対して非対称に標本に照射する照明光学系を有する光学顕微鏡に関するものである。

培養細胞の画像を大量に撮像し、得られた画像からコンピュータソフトウエアにより細胞の特徴量を抽出して、細胞の活性を評価したり、薬剤の奏功性を評価する、細胞解析手法が近年盛んに行われるようになった。細胞は多くの場合、解析目的に応じて細胞の細胞成分（細胞の核や膜、ゴルジ体やミトコンドリア、ＥＲ、或いは細胞質全体など）を蛍光試薬で標識することによって、実験に供される。

しかし、蛍光試薬は基本的に毒性があり、細胞を生かした状態で、すなわち培養しながら、間欠的に撮像するタイムラプス観察は基本的に不可能である。これを実現する手法として、細胞に蛍光タンパクを遺伝子導入するという方法が近年盛んに行われるようになった。この技術の導入により、細胞を可視化しながら蛍光顕微鏡を利用して長期間観察ができるようになった。

ところが、近年盛んに研究されるようになったｉＰＳ細胞や、多くの幹細胞は分化レベルの低い細胞であり、蛍光タンパクの遺伝子導入は、蛍光試薬のようなケミカルな毒性は無いにせよ、本来細胞が有する特質に影響を与える可能性を否定できない。そのため、これらの細胞の長期間に亘る観察は、蛍光タンパクを遺伝子導入せずに、そのまま顕微鏡下で培養し、長期間に亘る画像データを得ることが強く求められるようになった。つまり、蛍光標識に頼るのではなく、位相差観察手法のような透過観察手法で得られる像から、先に述べたような解析を行い得ることが望まれているのである。

しかしながら、透過観察手法は以下のような欠点を有する。
通常、細胞を培養しながら顕微鏡下で観察するには、倒立顕微鏡が用いられる。これは細胞を培養するには少なくとも培養液が必要で、培養液を保持するための容器、例えばシャーレや容器がアレイ状に並んだマイクロプレートを使うことになるのだが、細胞を観察する場合は、対物レンズが前記容器の下方にある倒立型顕微鏡がその構成上、当然有利である。

しかし、倒立型顕微鏡は透過画像を得るための透過照明はコンデンサレンズから射出する光が集光角度をもっているために、照明光が培養容器の壁に当たってしまい十分な性能の照明が得られない。さらにまた、顕微鏡の解像度を上げようとすると、より大きな角度（ＮＡ）が必要となる。

そこで、透過照明方法には前記欠点の一解決手段として偏斜照明という手法がある。これは、光束を部分的に遮断し、光軸に対して偏った光束を標本に向けて照射し、主に像のコントラストを向上させる手法として一般的に知られている。なお、「偏斜照明」は、「斜光照明」、「傾斜照明」または「斜照明」などと称される場合もあるが、本出願では「偏斜照明」と称する。

そして顕微鏡に用いる偏斜照明を行う照明装置として、例えば、特許文献１に示すように開口絞りによって制限された照明光路に対して遮光シートを挿脱させるとともに、照明光路内への遮光シートの挿入量に対応させて照明光束を照明光軸に対して非対称に遮光する遮光機構を備えたものがある。

特開２００９−１４７７２号公報

しかし、上記特許文献１に示す方法では、標本に対して一定方向からしか、偏斜照明を行うことができず、例えば、一般に顕微鏡で使用される標本として、ディッシュ又はウェルプレートを使用した場合、観察位置によって、標本の培養液を保持するための壁が光を遮ってしまい、適切に偏斜照明を行うことができないという問題がある。

本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、標本の形状に対応させて、標本と偏斜照明を標本の垂直軸に対して相対的に回転させることにより、標本によって偏斜照明が遮断されることなく照射され、適切な偏斜照明により観察することができる光学顕微鏡を提供することを目的としている。

上記の目的を達成するために、本発明による光学顕微鏡は、標本を保持するステージと、前記標本を照明する透過照明光学系を備えた光学顕微鏡であって、前記透過照明光学系は、光源からの光束を非対称に遮光して照明する遮光手段を備えているとともに、前記遮光手段が前記ステージに対し光軸を中心に相対的に回転するように構成されていることを特徴としている。

また、本発明の光学顕微鏡においては、前記ステージの位置情報に基づいて、前記遮光手段の回転位置が前記標本に対応させて自動的に制御されることが好ましい。

また、本発明の光学顕微鏡においては、前記遮光手段は、前記遮光手段を通過した光束の形状が扇形であるように構成されていることが好ましい。

あるいは、本発明の光学顕微鏡は、標本を保持するステージと、前記標本を照明する透過照明光学系を備えた光学顕微鏡であって、前記透過照明光学系は、光束が光軸に対して非対称となるように点灯可能に光源が設けられているとともに、前記光源は、光束が光軸を中心に相対的に回転するように又は点灯位置が選択されるように構成されていることを特徴としている。

また、本発明の光学顕微鏡においては、前記ステージの位置情報に基づいて、前記光源の回転位置又は点灯位置が前記標本に対応させて自動的に制御されることが好ましい。

また、本発明の光学顕微鏡においては、前記光源は複数の光源からなるアレイで構成されていることが好ましい。

さらに、本発明の光学顕微鏡においては、前記ステージに保持される前記標本は、培養液を保持可能なウェルプレート又はディッシュ状の培養容器であることが好ましい。

また、本発明の光学顕微鏡においては、前記透過照明光学系が位相差観察に適用されることが好ましい。

本発明の光学顕微鏡によれば、標本の形状に対応させて、標本と偏斜照明を標本の垂直軸に対して相対的に回転させることにより、標本によって偏斜照明が遮断されることなく照射され、適切な偏斜照明により観察することができるという効果を有する。

本発明に係る光学顕微鏡の実施例１の概略を示す正面図である。 実施例２の遮断板の一例を示す平面図である。 培養容器の一例を示し、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は正面図である。 図２に示す遮断板の回転位置を示す説明図である。 マイクロプレートの一例を示し、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は正面図である。 実施例２の遮断板の他例を示す平面図である。 実施例２のスライダのスライド位置を示す説明図である。 実施例２のスライダの回転位置を示す説明図である。 （Ａ）は本発明に係る光学顕微鏡の実施例３の概略を示す正面図であり、（Ｂ）は実施例３の複数のＬＥＤからなるアレイが同心円上に一周するように配置された例を示す平面図であり、（Ｃ）は複数のＬＥＤからなるアレイが同心円上の一部に配置された例を示す平面図である。 図９（Ｂ）に示すＬＥＤの点灯位置を示す説明図である。

実施形態の説明に先立ち、本発明の概略及び作用効果について説明する。
本発明の光学顕微鏡は、標本を保持するステージと、標本を照明する透過照明光学系を備えた光学顕微鏡であって、透過照明光学系は、光源からの光束を非対称に遮光して照明する遮光手段を備えているとともに、遮光手段はステージに対し光軸を中心に相対的に回転するように構成されている。

標本を載せているステージを、照明を非対称に遮光して照明する手段に対して、相対的に回転することができるような回転機構を備える。または、固定された標本に対して、照明を非対称に遮光して照明する手段を光軸に対して回転可能にする機構を備える。このようにすることにより、光を遮らない方向から偏斜照明を行うようにすることができ、適切な偏斜照明での観察が可能となる。

また、本発明の光学顕微鏡においては好ましくは、ステージの位置情報に基づいて、遮光手段の回転位置が標本に対応させて自動的に制御される。

自動観察を行う装置の場合、標本の観察位置に合わせて、ステージを光軸を中心に回転させる。又は照明を非対称に遮光して照明する手段を標本の観察位置に合わせて、光軸を中心に回転させる。これにより、標本の観察位置に合わせて遮光手段の回転位置が自動的に調節され、常に光が標本により遮られない方向から照明を行うことができ、自動観察が可能となる。

また、本発明の光学顕微鏡においては好ましくは、遮光手段は、遮光手段を通過した光束の形状が扇形であるように構成されている。

対物レンズが位相差対物レンズの場合、遮光手段を通過した光束の形状が扇形となるようにし、光束が対物レンズの位相膜に投影されるようにする。これにより、位相差観察が可能となる。

さらに、本発明の光学顕微鏡は、標本を保持するステージと、標本を照明する透過照明光学系を備えた光学顕微鏡であって、透過照明光学系は、光束が光軸に対して非対称となるように点灯可能に光源が設けられているとともに、光源は、光束が光軸を中心に相対的に回転するように又は点灯位置が選択されるように構成されている。

標本を載せているステージを、光束が光軸に対して非対称となるように点灯している光源に対して、相対的に回転することができるような回転機構を備える。または、固定された標本に対して、光束が光軸を中心に回転可能または点灯位置が選択可能となるように光源を構成する。このようにすることにより、光を遮らない方向から偏斜照明を行うようにすることができ、適切な偏斜照明での観察が可能となる。

また、本発明の光学顕微鏡においては好ましくは、ステージの位置情報に基づいて、光源の回転位置又は点灯位置が標本に対応させて自動的に制御される。

自動観察を行う装置の場合、標本の観察位置に合わせて、ステージを光軸を中心に回転させる。又は非対称に照明する光源を標本の観察位置に合わせて、光軸を中心に回転させるか、あるいは点灯位置を適宜選択する。これにより、標本の観察位置に合わせて光源の回転位置又は点灯位置が自動的に調節され、常に光が標本により遮られない方向から照明を行うことができ、自動観察が可能となる。

また、本発明の光学顕微鏡においては好ましくは、光源は複数の光源からなるアレイで構成されている。

光源を物理的に回転させる機構が不要となり、点灯させるアレイを適宜選択することにより光束の形状を任意に選択できる。また、点灯させるアレイを制御することにより光束を光軸を中心に回転させることができる。

また、本発明の光学顕微鏡においては好ましくは、ステージに保持される標本は、培養液を保持可能なウェルプレート又はディッシュ状の培養容器である。

本発明の光学顕微鏡は、培養液とともに培養細胞からなる標本をステージに載せて観察する場合に有用であり、特にウェルプレート又はディッシュのような培養容器に対応させて光源の回転位置が制御されるので、標本の形状によって偏斜照明が遮られることなく、適切な偏斜照明を行うことができる。

また、本発明の光学顕微鏡においては好ましくは、透過照明光学系が位相差観察に適用される。

位相差対物レンズを使用すると、照明光学系については本発明の照明光学系がそのまま位相差観察に適用できることになる。

次に、本発明の光学顕微鏡の基本的構成を図１に基づいて説明する。
本発明の光学顕微鏡は、ハロゲンランプの光源１と、光源１からの光をステージ２で保持されている標本３に導く透過照明光学系４と、標本３内の被観察物体の像を拡大するための結像光学系５とから構成されている。

透過照明光学系４には、集光レンズ４１，４２と、光源１からの光束を非対称に遮光して照明する遮光手段４３と、コンデンサレンズ４４及び光拡散板４５が備えられている。遮光手段４３は、例えば光軸方向に扇形状の穴４３１が開いている円盤状の遮断板４３２と、この遮断板４３２をコンピュータ６からの指令により光軸を中心に回転させるモータ４３３とギヤ機構４３４と図示しない回転保持機構により構成されている。

結像光学系５は、標本３の底面に向けられ位相膜５１を有している位相差対物レンズ５２と、図示しない結像レンズや撮像装置により構成されている。位相膜５１は位相差対物レンズ５２の瞳位置に設定されており、遮断板４３２の部分的な扇形状の穴４３１は位相差対物レンズ５２の位相膜５１に投影されるようになっている。

標本３を保持するステージ２は、図示しないＸＹ駆動機構により、光軸に対して垂直方向に移動可能となっている。また、コンピュータ６によりＸＹ駆動機構と遮光手段４３が連動して制御されるようになっている。なお、場合によってはステージ２をＸＹ駆動機構とともに、光軸を中心として回転させる回転機構を設けてもよい。また、ＸＹ駆動機構とは別に、ステージ２のみを回転させるようにしてもよい。あるいはＸＹ駆動機構を設けず、ステージ２のみを直接回転させるようにしてもよい。

次に、上記した実施例１の光学顕微鏡を制御・観察方法とともに更に詳しく説明する。
ハロゲンランプの光源１から射出する光は集光レンズ４２，４３により遮断板４３２上に投影される。なお、ハロゲンランプ像が均一に遮断板４３２に投影されるように光路の途中に例えば光拡散板４５が挿入される。

遮断板４３２は部分的に図２に示すように扇形状の穴４３１が開いている。また、遮断板４３２はコンピュータ６からの指令によりモータ４３３とギヤ機構４３４と図示しない回転保持機構により駆動・制御され、光軸を中心として回転するように構成されるとともに、その回転位置はステージ２のＸＹ座標位置情報に基づきコンピュータ６により制御されるようになっている。すなわち、コンピュータ６によりステージ２のＸＹ座標位置情報が逐次取得され、このＸＹ座標位置情報に基づき遮断板４３２の回転位置がコンピュータ６により逐次制御されることとなる。なお、ステージ２の位置情報はＸＹ駆動機構の座標位置に基づかず、その他の方法によりステージ２の位置情報は取得してもよい。

次に、ＸＹ駆動機構によって取得されるステージ２のＸＹ座標位置情報に基づく遮断板４３２の回転位置の制御について詳述する。
光源１から出射された光束のうち遮断板４３２の扇形状の穴４３１を通過した光束は、コンデンサレンズ４４を通過して培養液が入った培養容器３１を通過して図示しない細胞を照射し、対物レンズ５２と図示しない結像レンズにより拡大像が得られ、図示しないカメラで撮像される。なお、培養容器３１は図示しないＸＹ駆動機構を有するステージ２に載っており、そのほぼ全域が撮像されるようにコンピュータ６の指令により、ＸＹ位置が次々に移動され、順次撮像される。

そして、コンピュータ６の指令により培養容器３１がＸＹ駆動機構により移動され順次撮像されるとき、そのときのコンピュータ６によるステージ２のＸＹ座標位置情報により、遮断板４３２の扇形状の穴４３１を通った光が培養容器３１の壁で遮られないように遮断板４３２の回転位置がコンピュータ６により制御される。

すなわち、遮断板４３２の回転位置は、コンピュータ６によりあらかじめ記憶され或いは逐次取得されたステージ２のＸＹ座標位置情報により、遮断板４３２の扇形状の穴４３１を通った光が培養容器３１の壁で遮られないように制御される。あるいは遮断板４３２の回転位置は、使用される培養容器３１とステージ２のＸＹ座標位置との関係においてあらかじめ設定されている計算式により自動的に決定される。なお、この計算式は培養容器３１として使用されるマイクロプレートやディッシュの種類に応じて適宜選択する。

ここで、撮像位置と遮断板４３２の回転位置の関係を図３と図４に基づいてさらに詳述する。図３（Ａ）は培養容器３１の平面図を、（Ｂ）は正面図を示したものであり、（Ａ）において、ａ，ｂ，ｃ，ｄはそれぞれ撮像を行う位置を示している。そして、培養容器４３２の中心からみて９時から１２時の位置ａを撮像する場合、遮断板４３２は図４（Ａ）に示すように扇形状の穴４３１が光軸に対して３時から６時の位置となるように計算式によって決定され、コンピュータ６によりモータ４３３が回転し、遮断板４３２が所定位置となるように制御される。同様に、ｂを撮像する場合は図４（Ｂ）の位置に遮断板４３２を回転させ、ｃを撮像する場合は同図（Ｃ）の位置に遮断板４３２を回転させ、ｄを撮像する場合は同図（Ｄ）の位置に遮断板４３２を回転させる。

なお、培養容器３１を載せているステージ２を、遮断板４３２に対して光軸を中心として相対的に回転させるためには、培養容器３１が載せられているステージ２を回転させても、遮断板４３２を回転させても、あるいはステージ２と遮断板４３２の双方を回転させてもよい。いずれにしても、遮断板４３２の扇形状の穴４３１を通った光が培養容器３１の壁により遮られない方向から偏斜照明が行われればよい。

本実施例では、対物レンズは位相差対物レンズ５２であり、その瞳位置に位相膜５１が設定されており、遮断板４３２の部分的な扇形状の穴４３１は位相膜５１に投影されるようになっている。これにより位相差観察が行えることになる。
なお、対物レンズには必ずしも位相膜を設定しなくてもよく、位相膜がない場合は通常の透過偏斜照明として機能する。

また、本実施例では培養容器３１としてシャーレの例を図示したが、図５に示すように多数のウェル３２を有するマイクロプレート３３であってもよい。このばあいは、ウェル３２の１つ１つをディッシュと考え、それぞれのウェル３２について、例えばａ，ｂ，ｃ，ｄの撮像位置に合わせて遮断板４３２を回転させる。

さらに、対物レンズが位相差対物レンズでない場合は、遮断板４３２の開口部は扇形状の穴４３１である必要はなく、図６に示すように遮断板４３２の開口部は矩形状の穴４３５であってもよい。

また、遮断板４３２として図２に示すような扇形状の穴４３１が開いているものを使用した場合、偏斜する量の調整を行うためには、開口の幅の違う遮断板に取り替える必要がある。また偏斜照明を必要としない場合には、遮断板を取り外す作業が生じる。
そこでこれらの不具合を解決するために、円盤状の遮断板４３２に代え、図７に示すようなスライダ８を使用してもよい。スライダ８はその中央部分に光軸方向に略指先形状の穴８１が開いており、図７（Ａ）において紙面左右方向にスライドするともに光軸を中心として回転可能となっている。

偏斜照明を使用しない場合には、図７の（Ａ）、（Ｂ）に示すように光束を遮らず均等な照明を行うことができる。また、図７の（Ｃ）、（Ｄ）に示すように光軸に対して垂直にスライダ８を動かすことにより、光束８２を遮る量を調整することができ、コントラストを調整することが可能である。

また、図３（Ａ）のａ，ｂ，ｃ，ｄの位置を撮像する場合には、図８に示すように光軸に対してスライダ８を回転させることにより、コントラストの位置を自由に調整しながら、培養容器３１の壁に光が遮られることなく偏斜照明を行うことができる。具体的には、ａを撮像する場合は図８（Ａ）の位置にスライダ８を回転させ、ｂを撮像する場合は同図（Ｂ）の位置にスライダ８を回転させ、ｃを撮像する場合は同図（Ｃ）の位置にスライダ８を回転させ、ｄを撮像する場合は同図（Ｄ）の位置にスライダ８を回転させる。

本実施例は上記構成において、光源１と遮光手段４３に代え、遮断板４３２の位置に図９に示すような複数のＬＥＤ７のアレイが同心円上に設けられた光源１を配置する。複数のＬＥＤ７のアレイは、図９（Ｂ）に示すように同心円上を一周するように配置してもよく、あるいは同図（Ｃ）に示すように同心円上の一部にのみ配置してもよい。

そして、図９（Ｂ）に示すようにＬＥＤ７のアレイを同心円上を一周するように配置した場合は、コンピュータ６によってステージ２のＸＹ座標位置情報により同心円上に設けられたＬＥＤ７のうち点灯させるＬＥＤ７を選択して点灯する。
例えば図９（Ｂ）では、２時から４時の間のＬＥＤ７１を点灯し、その他のＬＥＤ７２は点灯させない。点灯させるＬＥＤ７を選択・変更することにより、光束を光軸に対して非対称にできる。また、点灯させるＬＥＤ７を順次回転させるように切り替えることにより、光束を光軸を中心に相対的に回転させることができる。

そして例えば、図３（Ａ）のａ，ｂ，ｃ，ｄの位置を撮像する場合には、図１０に示すように光軸に対して点灯させるＬＥＤ７を順次回転させることにより、コントラストの位置を自由に調整しながら、培養容器３１の壁に光が遮られることなく偏斜照明を行うことができる。具体的には、ａを撮像する場合は図１０（Ａ）の位置のＬＥＤ７１を点灯し、ｂを撮像する場合は同図（Ｂ）の位置のＬＥＤ７１を点灯し、ｃを撮像する場合は同図（Ｃ）の位置のＬＥＤ７１を点灯し、ｄを撮像する場合は同図（Ｄ）の位置のＬＥＤ７１を点灯する。

また、図９（Ｃ）に示すようにＬＥＤ７のアレイを同心円上の一部にのみ配置した場合は、コンピュータ６によってステージ２のＸＹ座標位置情報に基づきモータ４３３により光源１を回転させる。
例えば図９（Ｃ）では、２時から４時の間のＬＥＤ７が位置するように光源１を回転させる。光源１の回転位置を変更することにより、光束を光軸を中心に回転させることができる。

本発明は、位相差対物レンズを搭載した倒立型光学顕微鏡に限らず、透明容器内に細胞と培養液を入れた標本を光学顕微鏡で観察する場合に透過偏斜照明として機能するので、位相差観察に限らず広く適用可能である。

１ 光源
２ ステージ
３ 標本
３１ 培養容器
３２ ウェル
３３ マイクロプレート
４ 透過照明光学系
４１ 集光レンズ
４２ 集光レンズ
４３ 遮光手段
４３１ 扇形状の穴
４３２ 遮断板
４３３ モータ
４３４ ギヤ機構
４３５ 矩形状の穴
４４ コンデンサレンズ
４５ 光拡散板
５ 結像光学系
５１ 位相膜
５２ 位相差対物レンズ
６ コンピュータ
７ ＬＥＤ
７１ 点灯しているＬＥＤ
７２ 消灯しているＬＥＤ
８ スライダ
８１ 略指先形状の穴
８２ 光束

Claims (8)

1. 標本を保持するステージと、前記標本を照明する透過照明光学系を備えた光学顕微鏡であって、前記透過照明光学系は、光源からの光束を非対称に遮光して照明する遮光手段を備えているとともに、前記遮光手段が前記ステージに対し光軸を中心に相対的に回転するように構成されていることを特徴とする光学顕微鏡。
2. 前記ステージの位置情報に基づいて、前記遮光手段の回転位置が前記標本に対応させて自動的に制御されることを特徴とする請求項１に記載の光学顕微鏡。
3. 前記遮光手段は、前記遮光手段を通過した光束の形状が扇形であるように構成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の光学顕微鏡。
4. 標本を保持するステージと、前記標本を照明する透過照明光学系を備えた光学顕微鏡であって、前記透過照明光学系は、光束が光軸に対して非対称となるように点灯可能に光源が設けられているとともに、前記光源は、光束が光軸を中心に相対的に回転するように又は点灯位置が選択されるように構成されていることを特徴とする光学顕微鏡。
5. 前記ステージの位置情報に基づいて、前記光源の回転位置又は点灯位置が、前記標本に対応させて自動的に制御されることを特徴とする請求項４に記載の光学顕微鏡。
6. 前記光源は複数の光源からなるアレイで構成されていることを特徴とする請求項４又は５に記載の光学顕微鏡。
7. 前記ステージに保持される前記標本は、培養液を保持可能なウェルプレート又はディッシュ状の培養容器であることを特徴とする請求項１〜６の何れかに記載の光学顕微鏡。
8. 前記透過照明光学系が位相差観察に適用されることを特徴とする請求項１〜７の何れかに記載の光学顕微鏡。

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