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WO2019039457A1 - 初代培養方法 - Google Patents

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WO2019039457A1
WO2019039457A1 PCT/JP2018/030777 JP2018030777W WO2019039457A1 WO 2019039457 A1 WO2019039457 A1 WO 2019039457A1 JP 2018030777 W JP2018030777 W JP 2018030777W WO 2019039457 A1 WO2019039457 A1 WO 2019039457A1
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WO
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cells
cell
cell structure
cancer
culture
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PCT/JP2018/030777
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English (en)
French (fr)
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祐生 ▲高▼橋
史朗 北野
量平 片山
聡 長山
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Japanese Foundation for Cancer Research
Toppan Inc
Original Assignee
Japanese Foundation for Cancer Research
Toppan Printing Co Ltd
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Priority to EP18847307.8A priority patent/EP3674394A4/en
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Priority to US16/782,579 priority patent/US11781115B2/en
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Priority to JP2023065826A priority patent/JP7589282B2/ja
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    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • the present invention relates to a method of primarily culturing cells in a tissue collected from a living body.
  • the present invention particularly relates to a method of primarily culturing cancer cells derived from tumor tissue of a cancer patient.
  • Priority is claimed on Japanese Patent Application No. 2017-158901, filed Aug. 21, 2017, the content of which is incorporated herein by reference.
  • Non-Patent Document 1 introduces a CD-DST (Collage gel droplet embedded drug sensitivity test) method using primary culture cells.
  • This test method is a drug sensitivity test in which tissue or cells isolated from a patient are embedded in collagen gel and verified.
  • primary culture cells it can not be said that culture methods have been established, and a low culture success rate is an issue.
  • Non-patent document 2 As a method of primarily culturing cancer cells from patient's tumor tissue, a method of adding ROCK inhibitor Y-27632 to a culture medium to inhibit cell death (apoptosis) accompanying cell dispersion (Non-patent document 2), There has been proposed a method of obtaining a cell mass of a certain size while maintaining intercellular adhesion and performing suspension culture (Patent Document 1). In these culture methods, a medium obtained by adding serum replacement and various growth factors to a serum-free medium for stem cells is used. However, in general, in addition to the high cost of serum-free medium for stem cells, it is possible that the growth environment artificially added with a large amount of growth factors may enhance or suppress the signal pathway different from the actual in vivo. There is sex. Under such circumstances, there is a concern that results different from actual in vivo results may be obtained, particularly in sensitivity tests using molecular targeting drugs.
  • the present invention provides a method of primarily culturing cells in a tissue (living tissue) collected from a living body, using a culture medium used for general cell culture, without specifically adding growth factors or any inhibitors. Intended to be provided.
  • the present inventors diligently studied to solve the above-mentioned problems, and it was found that the presence of stroma is important at the early stage of culture when culturing cells in tissue collected from living body extracellularly.
  • the present invention has been completed.
  • a primary culture method is a primary culture method for primary culture of cells contained in a tissue collected from a living body in vitro, which comprises cells constituting stroma; Cells in a tissue collected from a living body are seeded and cultured on the top surface of a cell structure in which a layer or two or more cell layers are stacked in the thickness direction.
  • a fragment of the tissue collected from the living body, an enzyme-treated product of the tissue collected from the living body, or a cell collected from the tissue collected from the living body, the top surface of the cell structure May be seeded and cultured.
  • the cell structure may contain, as cells constituting the stroma, at least one selected from the group consisting of fibroblasts, pericytes, endothelial cells, and immune cells.
  • the endothelial cell may be at least one selected from the group consisting of vascular endothelial cells and lymphatic endothelial cells.
  • the cell structure may comprise a vascular network structure.
  • the thickness of the cell structure may be 5 ⁇ m or more.
  • the thickness of the cell structure may be 150 ⁇ m or more.
  • the tissue collected from the living body may contain a tumor tissue.
  • cancer cells are sorted from the obtained minced material, and the sorted cancer cells are seeded on the top surface of the cell structure. It may be cultured.
  • one or more techniques selected from the group consisting of flow cytometry, magnetic separation, dielectrophoresis, size fractionation, and density gradient fractionation. The cancer cells may be sorted.
  • the cell structure may be constructed according to the step (c) of obtaining the cell structure.
  • the primary cultured cell-containing cell structure according to the second aspect of the present invention comprises an stromal cell layer including cells constituting stroma, in which a single layer or two or more cell layers are stacked in the thickness direction A cell layer formed of cells contained in a tissue collected from a living body is provided on the top surface of the cell.
  • the primary culture method according to the above aspect of the present invention is to culture cells in a living tissue on the top surface of a cell structure imitating stroma, a large amount of growth factors and special inhibition such as conventional primary culture are used. Even without using an agent, even when using a general culture medium widely used for culture of cultured cell lines, primary culture can be performed with a high success rate.
  • FIG. 1 is a fluorescence image of PKH-labeled cancer cell line JC004 after culture for 2 weeks in Example 1.
  • FIG. 2 is a fluorescence image of PKH-labeled patient tumor tissue-derived JC-115 cells on days 5, 7, 10 and 13 after the start of culture in Example 2.
  • FIG. 3 is a fluorescence image of patient tumor tissue-derived JC-121 cells after culturing for 2.5 weeks in D-MEM medium (10% FBS) in Example 3.
  • FIG. 4 is a fluorescence image of patient tumor tissue-derived JC-121 cells after culturing for 2.5 weeks in Y-27632-containing StemPro medium in Example 3.
  • FIG. 1 is a fluorescence image of PKH-labeled cancer cell line JC004 after culture for 2 weeks in Example 1.
  • FIG. 2 is a fluorescence image of PKH-labeled patient tumor tissue-derived JC-115 cells on days 5, 7, 10 and 13 after the start of culture in Example 2.
  • FIG. 3
  • Example 5 shows that in Example 4, patient tumor tissue-derived JC-052-3-liv cells were seeded in a 24-well Transwell cell culture insert in which cell structures were not constructed and cultured for 5 days. It is the figure which showed the measurement result of proliferation rate (seeding number ratio).
  • FIG. 6 shows that in Example 4, the proliferation rate after 5 days of a sample in which patient tumor tissue-derived JC-052-liv cells were seeded on the top surface of cell structures containing stromal cells and cultured for 5 days (seed (Number ratio) is shown.
  • seed Numberer ratio
  • Example 7 shows that, in Example 4, EpCAM-positive for the total cell number of a sample obtained by inoculating patient tumor tissue-derived JC-052-liv cells onto the top surface of a cell structure containing stromal cells and culturing for 5 days. It is the figure which showed the measurement result of the ratio (cell number ratio,%) of cells.
  • FIG. 8 shows the results of Example 4, in which the patient tumor tissue-derived JC-052-3-liv cells were cultured in a cell structure having 10 or 20 cell layers, relative to the total cell number before and after sorting and collection. It is the figure which showed the measurement result of the ratio (%) of the number of EpCAM positive cells.
  • FIG. 8 shows the results of Example 4, in which the patient tumor tissue-derived JC-052-3-liv cells were cultured in a cell structure having 10 or 20 cell layers, relative to the total cell number before and after sorting and collection. It is the figure which showed the measurement result of the ratio (%) of the number of EpCAM positive cells.
  • FIG. 9 is a fluorescence image obtained by fluorescently immunostaining JC-052-liv cells directly seeded in a cell culture vessel with anti-EpCAM antibody in Example 4.
  • FIG. 10 is a fluorescence image obtained by fluorescence immunostaining of cell layers of 20 layers formed of NHDF and HUVEC in Example 4 with anti-EpCAM antibody.
  • FIG. 11 shows that in Example 5, (1) patient tumor tissue-derived JC039-2-Liv cells are seeded on the top surface of the cell structure containing stromal cells, and cultured for 14 days using each of four types of media.
  • FIG. 12 shows Example 5 in which (1) patient tumor tissue-derived JC047-2-Liv cells are seeded on the top surface of a cell structure containing stromal cells, and cultured for fourteen days using four types of media.
  • FIG. 13 shows patient's tumor tissue (colorectal cancer primary lesion) -derived JC406-1-TT cells and stromal cells when the number of layers of 3D tissue of the cell structure to be constructed is changed in Example 6.
  • FIG. 14 shows 3D of two types of cell structures (a cell structure formed from NHDF and not having a vascular network structure or a cell structure formed from NHDF and HUVEC and having a vascular network structure) in Example 6.
  • FIG. 15 shows patient's tumor tissue (colorectal cancer primary lesion) -derived JC406-1-TT cells as stromal cells in the case where the content of vascular endothelial cells of the cell structure to be constituted is changed in Example 7. And the results of measurement of the proliferation rate (ratio of the number of seeds) after 14 days in a sample seeded on the top surface of a cell structure containing and cultured for 14 days.
  • the primary culture method is a culture method for primary culture of cells contained in a tissue collected from a living body in vitro, which comprises cells (stromal cells) constituting stroma.
  • the cells in the living tissue are seeded and cultured on the top surface of the cell structure including a single layer or two or more cell layers stacked in the thickness direction.
  • the cell structure used in the present embodiment is a structure that includes stromal cells and mimics stromal tissue. By culturing the cells in the living tissue on the top surface of the cell structure imitating the stroma, not on the surface of a typical culture substrate, a general culture medium widely used for culture of cultured cell lines is used. Even if it is, primary culture can be performed with a high success rate.
  • primary culture can be performed without using an excess growth factor or an artificial inhibitor as a culture medium on the top surface of a cell structure imitating a stromal tissue.
  • it is formed from cells contained in tissues collected from a living body on the top surface of the stromal cell layer including cells constituting the stroma and in which a monolayer or two or more cell layers are stacked in the thickness direction
  • a primary culture cell-containing cell structure is obtained, which comprises the That is, the primary culture (primary culture cell-containing cell structure) obtained according to the present embodiment is a culture obtained in an environment closer to in vivo. For this reason, the primary culture obtained according to the present embodiment is very useful as a sample for performing a cell-based assay closer to in vivo.
  • the cell structure used in the present embodiment includes at least stromal cells, and a monolayer or two or more cell layers in the thickness direction Is stacked on.
  • stromal cells three-dimensionally, it is possible to construct a cell structure that mimics stromal tissue.
  • “cell structure” means a planar or three-dimensional cell assembly including at least stromal cells
  • “thickness of cell structure” means the structure It means the length in the weight direction of the body.
  • the self-weight direction is a direction in which gravity is applied, and is also called a thickness direction.
  • the “cell layer” means a layer which is present in a direction perpendicular to the thickness direction and in which cell nuclei do not overlap in the thickness direction and is formed by a group of cells and stroma.
  • the cells such as stromal cells constituting the cell structure according to the present embodiment are not particularly limited, and may be cells collected from an animal, or may be cells obtained by culturing cells collected from an animal.
  • the cells may be cells obtained by variously treating cells collected from animals, or may be cultured cell lines. Alternatively, commercially available cells may be used, or cells derived from a patient may be used.
  • the collection site is not particularly limited, and somatic cells derived from bone, muscle, viscera, nerve, brain, bone, skin, blood etc. may be used, and even germ cells It may be an embryonic stem cell (ES cell).
  • ES cell embryonic stem cell
  • the species from which the cells constituting the cell structure according to the present embodiment are derived is not particularly limited.
  • the cell structure according to the present embodiment may be composed only of cells derived from the same species of biological species, or may be composed of cells derived from plural types of biological species.
  • Immune cells are cells involved in immunity. Specifically, lymphocytes, macrophages, dendritic cells and the like can be mentioned. Lymphocytes include T cells, B cells, NK cells, plasma cells and the like.
  • the stromal cells contained in the cell structure according to the present embodiment may be one type or two or more types.
  • the stromal cells contained in the cell structure according to the present embodiment preferably include one or more selected from the group consisting of fibroblasts, pericytes, endothelial cells, and immune cells.
  • the number of stromal cells in the cell structure according to the present embodiment is not particularly limited, but since a cell structure more resembling stromal tissue is formed, the cell structure according to the present embodiment is configured.
  • the abundance ratio (cell number ratio) of stromal cells to all cells is preferably 30% or more, more preferably 50% or more, still more preferably 70% or more, and 80% or more Is even more preferred.
  • the cell structure according to the present embodiment is preferably a cell structure provided with a vascular network structure. That is, as the cell structure according to the present embodiment, a vascular network structure such as a lymphatic vessel and / or a blood vessel is three-dimensionally constructed inside a laminate of cells which do not form a vasculature. Cell constructs that build up tissue close to the body are preferred.
  • the vascular network structure may be formed only inside the cell structure, or may be formed such that at least a part of the vascular network structure is exposed to the surface or the bottom of the cell structure.
  • vascular network structure may be constructed throughout the cell structure or may be formed only in a specific cell layer.
  • vascular network structure refers to a network-like structure such as a vascular network or a lymphatic network in a living tissue.
  • the vascular network structure can be formed by including endothelial cells that constitute a blood vessel as stromal cells.
  • the endothelial cells contained in the cell structure according to this embodiment may be vascular endothelial cells or lymphatic endothelial cells.
  • the endothelial cells contained in the cell structure according to the present embodiment may include both vascular endothelial cells and lymphatic endothelial cells.
  • the cell structure according to the present embodiment has a vascular network structure, it is easy to form a vascular network in which endothelial cells retain their original function and shape as cells other than endothelial cells in the cell structure. Therefore, it is preferable that the cells constitute the surrounding tissue of the vasculature in the living body, and it is possible to approximate the stromal tissue in the living body and the environment in the vicinity of the stromal tissue in the living body. More preferred are cells containing at least fibroblasts, and cells containing vascular endothelial cells and fibroblasts, cells containing lymphatic endothelial cells and fibroblasts, or vascular endothelial cells and lymphatic endothelial cells and fibroblasts. More preferred are cells.
  • the cells other than the endothelial cells contained in the cell structure may be cells derived from biological species of the same type as the endothelial cells, or cells derived from different biological species.
  • the number of endothelial cells in the cell structure according to the present embodiment is not particularly limited as long as it is a number sufficient to form a vascular network structure, and the size of the cell structure, other than endothelial cells and endothelial cells It can be determined appropriately in consideration of the cell type of the cells of For example, a cell structure in which a vascular network structure is formed is prepared by setting the abundance ratio (cell number ratio) of endothelial cells to all cells constituting the cell structure according to the present embodiment to 0.1% or more. it can.
  • the number of endothelial cells in the cell structure according to this embodiment is preferably 0.1% or more of the number of fibroblasts, 0.1 to 5.0. More preferably, it is%.
  • the total number of vascular endothelial cells and lymphatic endothelial cells is preferably at least 0.1% of the number of fibroblasts, 0.1 More preferably, it is -5.0%.
  • the cell structure to be used is a structure closer to the stroma in vivo. Is preferred. Therefore, as the cell structure, a cell structure in which a vascular network structure is formed is preferable, and a vascular structure in which a vascular network structure is formed and which includes fibroblasts is more preferable. Furthermore, in order to meet the demand for obtaining more cancer cells, it is preferable to have a vascular network structure.
  • the size and shape of the cell structure according to the present embodiment are not particularly limited. More preferably, the thickness of the cell structure is 5 ⁇ m or more, since a cell structure in a state closer to the stromal tissue in the living body can be formed, and primary culture in an environment closer to the living body can be expected. 30 micrometers or more are more preferable, 100 micrometers or more are further more preferable, 150 micrometers or more are still more preferable.
  • the thickness of the cell structure is preferably 500 ⁇ m or less, more preferably 400 ⁇ m or less, and still more preferably 200 ⁇ m or less.
  • the number of cell layers in the cell structure according to this embodiment is preferably about 1 to 60, more preferably about 2 to 60, still more preferably about 5 to 60, and still more preferably about 5 to 20. preferable.
  • the number of cell layers constituting the cell structure is the total number of cells constituting the three-dimensional structure, the number of cells per layer. It is measured by dividing by (the number of cells required to constitute one layer).
  • the number of cells per layer can be determined by planar culture of cells in advance so as to be confluent in a cell culture vessel used for forming a cell structure. Specifically, the number of cell layers of the cell structure formed in a cell culture vessel is obtained by measuring the total number of cells constituting the cell structure and dividing the number by the number of cells per one layer of the cell culture vessel. It can be calculated by
  • the cell structure according to the present embodiment is constructed in a cell culture vessel.
  • the cell culture vessel is not particularly limited as long as it can construct a cell structure and can culture the constructed cell structure.
  • the cell culture vessel specifically, dishes, cell culture inserts (for example, Transwell (registered trademark) inserts, Netwell (registered trademark) inserts, Falcon (registered trademark) cell culture inserts, Millicell (registered trademark) cell cultures Inserts, etc.), tubes, flasks, bottles, plates and the like.
  • a dish or various cell culture inserts are preferable because the constructed cell structure can be used for primary culture as it is.
  • the cell structure according to the present embodiment may be a structure formed of a monolayer or multilayer cell layer containing stromal cells, and the method of constructing the cell structure is not particularly limited. For example, it may be a method of constructing one layer at a time and laminating sequentially, or may be a method of constructing two or more cell layers at one time, or a combination of both construction methods as appropriate to form multiple cell layers. It may be a method of construction. Moreover, the cell structure according to the present embodiment may be a multilayer structure in which cell types constituting each cell layer are different in each layer, and cell types constituting each cell layer are all layers of the structure. It may be a common cell type.
  • a method may be used in which layers are formed for each cell type and the cell layers are sequentially stacked, or a cell mixture containing a plurality of cells mixed in advance is prepared, and a multilayer is prepared from this cell mixture. It may be a method of constructing a cell structure of a structure at one time.
  • a method of constructing by layering one by one and laminating sequentially for example, the method described in Japanese Patent No. 4919464, namely, the step of forming a cell layer, and the formed cell layer as ECM (cell (cell) And the step of alternately contacting the solution containing the component of the outer matrix) to continuously laminate the cell layers.
  • a cell mixture is prepared in advance in which all the cells constituting the cell structure are mixed, and by forming each cell layer with this cell mixture, a vascular network is formed throughout the structure.
  • Cell structures in which structures are formed can be constructed.
  • the method described in Japanese Patent No. 5850419 can be mentioned.
  • the entire surface of the cell is coated with a polymer containing an arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequence to which integrin is bound and a polymer that interacts with a polymer containing the RGD sequence
  • RGD arginine-glycine-aspartic acid
  • This method is a method of constructing a cell structure formed from multiple cell layers by storing coated cells coated with an adhesive film in a cell culture vessel and then accumulating the coated cells by centrifugation or the like.
  • a cell mixture prepared by mixing all the cells constituting the cell structure is prepared in advance, and coated cells prepared by adding an adhesive component to the cell mixture are used.
  • a single centrifugation process can construct a cell structure that is homogeneous in cell composition throughout the structure.
  • the cell structure according to the present embodiment can also be constructed by a method including the following steps (a) to (c). Step (a): mixing the cells and extracellular matrix components in a cationic buffer to obtain a mixture (a); Step (b): Seeding the mixture obtained in the step (a) into a cell culture vessel (b) Step (c): A step (c) of obtaining a cell structure in which cells are stacked in multiple layers in the cell culture vessel after the step (b).
  • step (a) cells are mixed with a buffer solution containing a cationic substance (cationic buffer solution) and an extracellular matrix component, and by forming a cell assembly from this cell mixture, a large void is formed inside. Fewer three-dimensional cell tissues can be obtained.
  • the obtained three-dimensional cell tissue is relatively stable, it can be cultured for at least several days, and the tissue is less likely to be disintegrated even when the medium is replaced.
  • the step (b) may include settling the cell mixture seeded in the cell culture vessel into the cell culture vessel. In the sedimentation of the cell mixture, cells may be actively sedimented by centrifugation or the like, or may be spontaneously sedimented.
  • step (a) it is preferable to further mix the cells with the strong electrolyte polymer.
  • the cells are spontaneously sedimented without mixing treatment with cells, such as centrifugation, in step (b) by mixing the cells with the cationic substance, the strong electrolyte polymer and the extracellular matrix component. Even in this case, a three-dimensional cellular tissue having a small gap and a large thickness can be obtained.
  • the cationic buffer examples include Tris-HCl buffer, Tris-maleate buffer, bis-Tris-buffer, HEPES and the like.
  • concentration and pH of the cationic substance (eg, Tris in Tris-HCl buffer) in the cationic buffer is not particularly limited as long as it does not adversely affect cell growth and cell structure construction.
  • concentration of the cationic substance in the cationic buffer can be 10 to 100 mM, preferably 40 to 70 mM, and more preferably 50 mM.
  • the pH of the cationic buffer can be 6.0 to 8.0, preferably 6.8 to 7.8, and more preferably 7.2 to 7.6. .
  • the strong electrolyte polymer examples include heparin, chondroitin sulfate (eg, chondroitin 4-sulfate, chondroitin 6-sulfate), heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, and glycosaminoglycans such as hyaluronic acid; dextran sulfate Rhamnan sulfate, fucoidan, carrageenan, polystyrene sulfonic acid, polyacrylamide-2-methylpropane sulfonic acid, and polyacrylic acid, or derivatives thereof, and the like, but are not limited thereto.
  • chondroitin sulfate eg, chondroitin 4-sulfate, chondroitin 6-sulfate
  • glycosaminoglycans such as hyaluronic acid
  • the strong electrolyte polymer is preferably glycosaminoglycan. Furthermore, it is more preferable to use at least one of heparin, dextran sulfate, chondroitin sulfate and dermatan sulfate. More preferably, the strong electrolyte polymer used in the present embodiment is heparin.
  • the amount of the strong electrolyte polymer mixed in the cationic buffer solution is not particularly limited as long as it does not adversely affect the cell growth and the construction of the cell structure.
  • the concentration of the strong electrolyte polymer in the cationic buffer can be more than 0 mg / mL (more than 0 mg / mL) less than 1.0 mg / mL, which is 0.025 to 0.1 mg / mL Is preferable, and 0.05 to 0.1 mg / mL is more preferable.
  • the cell assembly can be constructed by preparing the mixture without mixing the strong electrolyte polymer.
  • extracellular matrix component examples include collagen, laminin, fibronectin, vitronectin, elastin, tenascin, entactin, fibrillin, proteoglycan, or variants or variants thereof, and the like.
  • proteoglycans include chondroitin sulfate proteoglycan, heparan sulfate proteoglycan, keratan sulfate proteoglycan, dermatan sulfate proteoglycan and the like. In the mixture prepared in step (a), only one type of extracellular matrix component may be mixed, or two or more types may be combined and mixed.
  • collagen, laminin and fibronectin are preferably used, and collagen is more preferably used.
  • Variants and variants of the above mentioned extracellular matrix components may be used as long as they do not adversely affect cell growth and formation of cellular structures.
  • the amount of extracellular matrix component mixed in the cationic buffer solution is not particularly limited as long as it does not adversely affect cell growth and cell structure construction.
  • the concentration of extracellular matrix components in cationic buffer can be more than 0 mg / mL (more than 0 mg / mL) less than 1.0 mg / mL, which is 0.025 to 0.1 mg / mL Is preferable, and 0.05 to 0.1 mg / mL is more preferable.
  • the blending ratio of the strong electrolyte polymer to the extracellular matrix component mixed in the cationic buffer is 1: 2 to 2: 1.
  • the blending ratio of the strong electrolyte polymer to the extracellular matrix component is preferably 1: 1.5 to 1.5: 1, preferably 1: 1. Is more preferred.
  • Steps (a) to (c) are repeated. Specifically, after seeding the mixture prepared in step (a) as step (b) on the cell structure obtained in step (c) By repeating the step (c), a cell structure with a sufficient thickness can be constructed.
  • the cell composition of the mixture to be newly seeded on the cell structure obtained in step (c) may be the same as or different from the cell composition constituting the cell structure already constructed. .
  • the obtained cell structure may be cultured after the step (c) and before the step (b).
  • the culture conditions such as the composition of the culture medium used for culture, the culture temperature, the culture time, and the atmospheric composition at the time of culture are performed under conditions suitable for culture of the cells constituting the cell structure.
  • Examples of the culture medium include D-MEM, E-MEM, MEM ⁇ , RPMI-1640, Ham's F-12 and the like.
  • step (a) the liquid portion is removed from the resulting mixture (a'-1) to obtain cell aggregates, and (a'-2) the cell aggregates are suspended in a solution. And may proceed to step (b).
  • the desired structure can be obtained by carrying out the above-mentioned steps (a) to (c), the steps (a'-1) and (a'-2) are carried out after the step (a) And performing step (b), a more homogeneous tissue body can be obtained.
  • step (b′-1) and the step (b′-2) may be performed in place of the step (b).
  • step (b′-1) and step (b′-2) more homogeneous tissue can also be obtained.
  • the step may include precipitation of the cell mixture seeded in the cell culture vessel into the cell culture vessel.
  • cells may be actively sedimented by centrifugation or the like, or may be spontaneously sedimented.
  • the “cell viscous body” refers to a gel-like cell aggregate as described in Non-Patent Document 3.
  • Step (b′-1) after seeding the mixture obtained in step (a) into a cell culture vessel, removing the liquid component from the mixture to obtain a cell viscous body
  • Step (b'-2) suspending the cell viscous body in a solvent in a cell culture vessel.
  • the solvent for preparing the cell suspension is not particularly limited as long as it is a solvent which does not have toxicity to cells and does not impair the proliferation or function, and water, buffer solution, culture medium for cells, etc. can be used.
  • the buffer include phosphate saline (PBS), HEPES, Hanks buffer and the like.
  • the culture medium includes D-MEM, E-MEM, MEM ⁇ , RPMI-1640, Ham's F-12 and the like.
  • Step (c ′) forming a layer of cells on a substrate.
  • the liquid component may be removed from the seeded mixture.
  • the method of removing the liquid component in the step (c) and the step (c ′) is not particularly limited as long as it does not adversely affect the cell growth and the construction of the cell structure, and a suspension of the liquid component and the solid component Can be suitably carried out by a method known to those skilled in the art as a method for removing the liquid component therefrom. Examples of the method include suction, centrifugation, magnetic separation, filtration, and the like.
  • the cell mixture is precipitated by subjecting the cell culture insert seeded with the mixture to centrifugation at 400 ⁇ g for 1 minute at 10 ° C.
  • the liquid component can be removed by suction.
  • the cells cultured in the present embodiment are cells contained in a living tissue.
  • a plurality of types of cells contained in a living tissue may be simultaneously subjected to primary culture, and only cells of a specific type are isolated from cells contained in the living tissue. Primary culture.
  • the living tissue from which the cells cultured in this embodiment are derived may be a tissue collected from an animal of any species.
  • biological tissues collected from animals such as humans, monkeys, dogs, cats, rabbits, pigs, cows, mice and rats can be used.
  • the living tissue from which the cells cultured in this embodiment are derived may be a solid tissue or a liquid tissue.
  • solid tissue include surgically resected and collected epithelial tissue, connective tissue, muscle tissue, nerve tissue, stromal tissue, and mucosal tissue.
  • liquid tissue include body fluids such as blood, lymph fluid, pleural fluid, ascites fluid, spinal fluid, tears, saliva, urine and the like. These tissues can be extracted by using a scalpel or a laser, for example, in surgery or endoscopy, or collected by a syringe, swab or the like. For example, tissues collected for clinical examination can be used as human body tissues.
  • the cells cultured in this embodiment may be a living tissue derived from normal tissue, or may have some kind of dysfunction as a diseased tissue.
  • cancer cells contained in a tumor tissue collected from a cancer patient can be efficiently primary cultured.
  • Cancer cells are cells derived from somatic cells and having acquired infinite proliferation ability.
  • cancer cells may be primarily cultured with cells other than cancer cells contained in tumor tissues collected from cancer patients, and only cancer cells may be isolated. Primary culture.
  • the primary culture method according to the present embodiment allows primary culture of disease related cells collected from patients suffering from various diseases, such as cancer cells collected from cancer patients, and the obtained disease Primary cultures of related cells are particularly suitable for cell based assays.
  • the primary culture method according to the present embodiment is also useful for construction of a culture of disease-related cells collected from a patient. For example, by primary culture of cells contained in a patient's tumor tissue by the primary culture method according to the present embodiment, the patient's origin, which reflects the characteristics of the original patient's tumor, such as proliferative capacity, rather than ordinary cell lines. Cancer cell lines can be established efficiently.
  • cancer from which cancer cells are primarily cultured in this embodiment examples include: breast cancer (eg, invasive ductal carcinoma, non-invasive ductal carcinoma, inflammatory breast cancer, etc.)
  • breast cancer eg, invasive ductal carcinoma, non-invasive ductal carcinoma, inflammatory breast cancer, etc.
  • pancreatic cancer eg, pancreatic duct cancer etc.
  • gastric cancer eg, papillary adenocarcinoma, mucinous adenocarcinoma, adenosquamous carcinoma
  • lung cancer eg, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, malignant mesothelioma etc.
  • colon cancer eg, gastrointestinal stromal tumor etc.
  • rectal cancer eg, gastrointestinal stromal tumor etc
  • Colorectal cancer eg, familial colorectal cancer, hereditary non-polyposis colorectal cancer, gastrointestinal stromal tumor, etc.
  • small intestine cancer eg,
  • liver cancer eg, primary liver cancer, extrahepatic cholangiocarcinoma, etc.
  • kidney cancer eg, renal cell carcinoma, transitional cell carcinoma of the renal pelvis and ureter
  • gallbladder cancer Cholangiocarcinoma, pancreatic cancer, liver cancer, endometrial cancer, cervical cancer, ovarian cancer (eg, epithelial ovarian cancer, extragonadal germ cell tumor, ovarian germ cell tumor, ovarian low malignant potential Degree tumors, bladder cancer, urethral cancer, skin cancer (eg, intraocular (eye) melanoma, Merkel cell cancer, etc.), hemangioma, malignant lymphoma (eg, reticular sarcoma, lymph sarcoma, Hodgkin) Disease, etc.), melanoma (malignant melanoma), thyroid cancer (eg, medullary thyroid cancer etc.), parathyroid cancer, nasal cavity cancer, sinus cancer, bone tumor (eg , Osteta
  • ⁇ Primary culture> cells in a living tissue are seeded and cultured on the top surface of the cell structure according to the present embodiment. Specifically, cells in a living tissue are added to the culture solution of the cell structure according to the present embodiment. Thus, the cells in the living tissue are adhered to the top surface of the cell structure, and the cells in the living tissue are cultured in a state of being attached to the top surface of the cell structure.
  • the culture medium used for the culture may be a medium containing a growth factor, a ROCK inhibitor, etc. like a culture medium generally used in primary culture such as StemPro medium, but a cultured cell line It is preferable that it is a general culture medium widely used for culture of Common culture media widely used for culture of cultured cell lines include, for example, D-MEM, E-MEM, MEM ⁇ , RPMI-1640, Ham's F-12, etc., and CS (bovine serum) thereof. There is a medium in which serum such as FBS (fetal bovine serum), HBS (fetal calf serum) or the like is added to about 1 to 10% by volume.
  • FBS fetal bovine serum
  • HBS fetal calf serum
  • the culture temperature is preferably about 30-40 ° C, most preferably 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is preferably about 1 to 10% by volume, most preferably about 5% by volume.
  • the culture can also be performed under an environment where the O 2 concentration is controlled to be lower than the atmosphere.
  • the living tissue is a solid tissue
  • the internal cells be fragmented in advance so that the cells can be efficiently adhered to the top surface of the cell structure and the culture can be started.
  • a mechanical method using scissors, a knife, a scalpel, a tweezers or the like is suitably used for fragmenting a living tissue, but it is not particularly limited thereto. It is preferable that the living tissue be fragmented into, for example, about 5 mm or less, because internal cells can be removed more efficiently.
  • a fragmented biological tissue can be used as it is for primary culture as it is, it is also preferable to perform enzyme treatment.
  • the enzyme treatment makes it easier for the cells present inside the fragment to be exposed to the surface, so when this enzyme-treated product is added to the culture medium of the cell structure, it easily adheres to the top surface.
  • the enzyme treatment may be performed when the living tissue is a liquid tissue. For example, as in the case of high viscosity, it may be difficult for cells contained in the living tissue to adhere to the top surface of the cell structure simply by adding the living tissue to the culture medium of the cell structure. It is preferable to perform an enzyme treatment on such a living tissue in advance.
  • the enzyme used for the enzyme treatment of a living tissue or its fragment is not particularly limited, but an enzyme that degrades protein, sugar, lipid, nucleic acid and the like is preferably used.
  • One type or two or more types of enzymes may be used for the enzyme treatment of the fragmented body tissue.
  • the enzyme to be used is not particularly limited as long as it has an objective enzyme activity, and may be an enzyme derived from any biological species, or may be an artificial enzyme obtained by modifying a naturally occurring enzyme. In addition, it may be an enzyme extracted and purified from various cells, or it may be a chemically synthesized enzyme.
  • DNase I In fragmenting treatment or enzyme treatment of living tissue, DNase I is used in combination to prevent massive aggregation of cells due to the influence of DNA released from the cells dissolved during fragmentation or enzyme treatment. May be The DNase I to be used is not particularly limited as long as it is an enzyme having DNase I activity.
  • Commercially available enzyme mixes containing DNase I and enzymes for degrading biological components such as proteins include Liberase Blendzyme 1 (registered trademark) (manufactured by Roche Diagnostics) and Tumor Dissociation Kit (manufactured by Miltenyi Biotech). It can be mentioned.
  • the treatment temperature of the enzyme treatment may be any condition that allows the enzyme to be used to exhibit the enzyme activity, but is preferably 30 to 40 ° C. because the influence on the cells in the debris of the living tissue is suppressed. And 37 ° C. are more preferable.
  • the treatment time of the enzyme treatment is not particularly limited, and may be, for example, 10 to 90 minutes, preferably 30 to 60 minutes.
  • the number of cells before seeding the enzyme-treated product of the living tissue on the top surface of the cell structure according to the present embodiment, and in particular, to count the number of living cells.
  • the measurement of the number of cells and the measurement of the number of living cells can be performed by a conventional method.
  • the measurement of viable cell number includes a staining method using trypan blue and the like.
  • Fragments of biological tissue may be washed with buffer or culture medium prior to enzyme treatment.
  • a buffer used for washing phosphate buffer, acetate buffer, citrate buffer, borate buffer, tartrate buffer, Tris buffer, PBS or the like can be used.
  • Antibiotics can also be added to the buffer or culture medium used for washing.
  • washing of the tissue can be performed with PBS containing penicillin G (200 U / mL), streptomycin sulfate (200 ⁇ g / mL) and amphotericin B (0.5 ⁇ g / mL).
  • the number of times of washing can be appropriately determined depending on the origin of the collected biological tissue, but 3 to 8 times are preferable.
  • washing with buffer or culture medium may be performed only after enzyme treatment or before or after enzyme treatment.
  • the selected cells are treated as cells.
  • cancer cells are added to the culture medium for cell structures.
  • specific cells can be sorted by one or more techniques selected from the group consisting of flow cytometry, magnetic separation, dielectrophoresis, size fractionation, and density gradient fractionation.
  • cancer cells can be screened using cancer cell-specific protein expression and an increase in enzyme activity as cancer markers.
  • the cancer marker is not particularly limited. For example, when a protein specifically expressed in cancer cells such as EpCAM, CEA, Cytokeratin, or HER2 is used as a cancer marker, an immune tissue using an antibody against them is used. Cancer cells can be visualized by chemical (IHC) staining or immunofluorescence (IF) staining.
  • ProteoGREEN registered trademark, pentagonal drug
  • GlycoGREEN It can measure using fluorescent probes, such as a registered trademark (Pharmaceuticals).
  • Screening of cancer cells can be performed by methods such as flow cytometry, magnetic separation, dielectrophoresis, size fractionation, density gradient fractionation, etc., and the screening method is based on the source organ or clinical background of the original patient tumor. And can be appropriately determined from the various inspection results that precede.
  • flow cytometry cancer cells can be sorted by separating cells stained positive after staining with IF or a fluorescent probe.
  • live and dead cells can also be determined from the values of forward scattered light and side scattered light, so that living cancer cells can be sorted and recovered more efficiently.
  • cells in the living tissue may be labeled in advance with a fluorescent substance or the like. All cells in living tissue may be labeled, or only specific cells of interest for primary culture may be labeled.
  • the method for labeling cells is not particularly limited, and can be appropriately selected from various labeling methods known in the art.
  • cell tracker registered trademark, Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.
  • PKH cell linker kit Sigma-Aldrich
  • the labeling of the cancer cells may be performed on the living tissue itself, or may be performed on a fragment of the living tissue or an enzyme-treated product of the shredded living tissue.
  • the cancer cells after the selection process may be labeled.
  • collagen I was used as collagen unless otherwise specified.
  • Example 1 A cell line established from a tumor cell collected from a cancer patient was cultured on the top surface of a cell structure containing stromal cells, and a case where culture was performed using a normal culture medium and a primary culture medium was compared.
  • the cancer cell line used was JC-004, which is a cell line derived from a colon cancer patient (established from a surgical specimen at a cancer research society).
  • the patient-derived cancer cell line was constructed as follows. First, after mechanically shredding tumor tissue collected from a cancer patient, the scraped material is treated with collagenase / dispase (manufactured by Roche Diagnostics) and Dnase I (manufactured by Thermo Fisher Scientific). Used and processed. Then, the obtained enzyme-treated product was established by culturing in StemPro medium (registered trademark, manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.), a serum-free medium for stem cells to which ROCK inhibitor Y-27632 was added. . The established cancer cell line was cultured using the medium until it was used in this experiment.
  • StemPro medium registered trademark, manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.
  • the cell structure containing the vascular network structure is a human neonatal skin fibroblast (Normal Human Dermal Fibroblasts: NHDF) (Lonza, product number: CC-2509), a human umbilical vein endothelial cell (Human Umbilical Vein Endothelial Cell: Two types of cells, HUVEC (manufactured by Lonza, product number: CC-2517A), were used for construction.
  • Transwell cell culture insert (manufactured by Corning, product number: # 3470) is used as a cell culture vessel, and 10% by volume FBS (manufactured by Corning, product number: # 35-010-CV) and culture medium are used as a culture medium.
  • NHDF and HUVEC are suspended in Tris-HCl buffer (0.05 mg / mL heparin, 0.05 mg / mL collagen, 50 mM Tris, pH 7.4) containing heparin and collagen to prepare a cell suspension.
  • Tris-HCl buffer 0.05 mg / mL heparin, 0.05 mg / mL collagen, 50 mM Tris, pH 7.4
  • the cell suspension was centrifuged at 1200 rpm for 3 minutes at room temperature, and after removing the supernatant, it was resuspended with an appropriate amount of culture medium (step (a'-1), step (a'-2) ).
  • this cell suspension is seeded in Transwell cell culture inserts so that the number of cell layers is 20 (step (b)), and then the Transwell cell culture inserts are at room temperature at 400 ⁇ g.
  • a cell structure formed of 20 cell layers and in which a vascular network structure was formed was constructed.
  • a cell structure was prepared so that NHDF was 2 ⁇ 10 6 / well and HUVEC was 1.5% of the total number of NHDFs.
  • patient-derived cell line JC-004 was fluorescently labeled using a PKH67 cell linker kit. Thereafter, PKH26-labeled JC-004 was suspended in an appropriate amount of D-MEM medium (10% FBS) or StemPro medium containing Y-27632, and seeded on the top surface of the cell construct constructed in a 24-well Transwell cell culture insert. Then, it culture
  • PKH26-labeled JC-004 suspended in an appropriate amount of D-MEM medium (10% FBS) or StemPro medium containing Y-27632 is seeded in a 24-well Transwell cell culture insert in which no cell structure has been constructed. , Cultured.
  • FIG. 1 The cultured cancer cells were observed with a fluorescent microscope to confirm their growth. The fluorescence image of each cancer cell is shown in FIG.
  • “without stroma” is a sample directly seeded and cultured on a culture insert.
  • “on 3D tissue” is a sample seeded and cultured on the top surface of the cell structure.
  • DMEM is a sample cultured in D-MEM medium (10% FBS)
  • ES medium is a sample cultured in Y-27632-containing StemPro medium.
  • Example 2 Cancer cells in a patient's tumor tissue removed by surgery were cultured in a normal culture medium on the top of a cell structure containing stromal cells.
  • a culture medium D-MEM medium containing 10% FBS was used.
  • Cancer cells in patient tumor tissues were prepared as follows. First, after mechanically fragmenting a tumor tissue (JC-115) excised from a colon cancer patient at a nonprofit foundation cancer research society, collagenase / dispase and Dnase I were carried out in the same manner as in Example 1. After enzyme treatment in the above, it was thoroughly washed to prevent contamination. Then, the cancer cells (patient tumor tissue-derived JC-115 cells) in the obtained enzyme-treated product were fluorescently labeled using a PKH67 cell linker kit.
  • a cellular structure formed from NHDF and HUVEC which has a vascular network structure, a cellular structure formed only from NHDF, which does not have a vascular network structure, and a cellular structure formed from only one layer of HUVEC (two-dimensional
  • the cultures were each constructed on a culture substrate (in a cell culture vessel).
  • the cell culture vessel, NHDF, HUVEC, and their culture media were the same as in Example 1.
  • a 20-layer cell structure formed from NHDF and HUVEC and having a vascular network was constructed in the same manner as the cell structure constructed in Example 1.
  • Twenty layers of cell structures formed only from NHDF were prepared by preparing a cell suspension by using NHDF, heparin and collagen in Tris-HCl buffer (0.05 mg / mL heparin, 0.05 mg / mL collagen, It was constructed in the same manner as the cell construct constructed in Example 1 except that it was suspended in 50 mM Tris, pH 7.4).
  • the cell structure formed from only one layer of HUVEC is suspended in Tris-HCl buffer (0.05 mg / mL heparin, 0.05 mg / mL collagen, 50 mM Tris, pH 7.4) containing heparin and collagen
  • Tris-HCl buffer 0.05 mg / mL heparin, 0.05 mg / mL collagen, 50 mM Tris, pH 7.4
  • the HUVECs were constructed by seeding and culturing directly in a 24-well Transwell cell culture insert so that the number of cell layers was one.
  • the fluorescently labeled patient tumor tissue-derived JC-115 cells were suspended in an appropriate amount of D-MEM medium (10% FBS) and seeded on the top surface of the cell construct constructed in a 24-well Transwell cell culture insert. Then, it culture
  • fluorescently labeled JC-115 cells suspended in an appropriate amount of D-MEM medium (10% FBS) were seeded into a 24-well Transwell cell culture insert in which no cell structure had been constructed, and cultured.
  • FIG. 2 “without stroma” is a sample directly seeded and cultured on a culture insert.
  • H only 1 layer is a sample cultured on the top surface of a cell structure formed of only 1 layer of HUVEC.
  • N only 20 layers (without blood vessels) is a sample cultured on the top of a 20 layer cell structure formed only of NHDF.
  • N + H20 layer (with blood vessels)” is a sample cultured on the top surface of a cell layer of 20 layers formed from NHDF and HUVEC.
  • the cell structure in which the vascular network structure is constructed (the sample of “N + H20 layer (with blood vessels)” in FIG. 2) and the vascular network structure Both unassembled cell structures (sample of “N only 20 layers (without blood vessels)” in FIG. 2) were able to confirm more fluorescently labeled cells at 5 days of culture than without stroma . Furthermore, between the cell structure in which the vascular network structure is constructed and the cell structure in which the vascular network structure is not constructed, a remarkable increase or decrease in fluorescence labeled cells is observed between 5 days and 2 weeks of culture. It was not done.
  • Example 3 Cancer cells in the patient's tumor tissue removed by surgery were cultured on the top surface of the cell structure containing stromal cells.
  • D-MEM medium containing 10% FBS or StemPro medium containing Y-27632 was used as a culture medium.
  • Cancer cells in patient tumor tissues were prepared as follows. First, after mechanically fragmenting a tumor tissue (JC-121) excised from a colon cancer patient at a nonprofit foundation cancer research society, in the same manner as in Example 1, collagenase / dispase and Dnase I After enzyme treatment in the above, it was thoroughly washed to prevent contamination.
  • JC-121 tumor tissue excised from a colon cancer patient at a nonprofit foundation cancer research society
  • a 20-layer cell structure formed from NHDF and HUVEC and comprising a vascular network was constructed in the same manner as the cell structure constructed in Example 1.
  • D-MEM medium 10% FBS
  • StemPro medium containing Y-27632 Patient tumor tissue-derived JC-121 cells are suspended in an appropriate amount of D-MEM medium (10% FBS) or StemPro medium containing Y-27632, and placed on top of a cell construct constructed in a 24-well Transwell cell culture insert. Sowed. Thereafter, the cells were cultured for 2.5 weeks while appropriately changing the medium in D-MEM medium (10% FBS) or StemPro medium containing Y-27632.
  • FIG. 3 shows a stained image of a cell construct cultured in D-MEM medium (10% FBS). Further, FIG. 4 shows a stained image of a cell construct cultured in StemPro medium containing Y-27632.
  • Example 4 The cancer cells in the tumor tissue of the patient removed by surgery were sorted and collected together with other cells or only the cancer cells, and then cultured on the top surface of a plurality of cell structures having different numbers of cell layers.
  • a culture medium D-MEM medium containing 10% FBS was used.
  • Cancer cells in patient tumor tissues were prepared as follows. First, after mechanically fragmenting a tumor tissue (JC-052-liv) excised from a patient with liver cancer (metastatic cancer from colorectal cancer) at the Cancer Research Institute, After enzymatic treatment with collagenase / dispase and Dnase I in the same manner as in Example 1, the membrane was thoroughly washed to prevent contamination.
  • JC-052-liv tumor tissue excised from a patient with liver cancer (metastatic cancer from colorectal cancer) at the Cancer Research Institute
  • a 20-layer cell structure formed from NHDF and HUVEC and comprising a vascular network was constructed in the same manner as the cell structure constructed in Example 1.
  • the number of cell layers was set to 1, 5, or 10
  • a cell structure formed of NHDF and HUVEC and having a vascular network structure was constructed in the same manner.
  • a 20-layer cell structure formed from NHDF and not provided with a vascular network was constructed in the same manner as the cell structure constructed in Example 2.
  • the number of cell layers was 1, 5, or 10
  • a cell structure formed of NHDF and not having a vascular network structure was constructed in the same manner.
  • JC-052-3-liv cells were suspended in an appropriate amount of D-MEM medium (10% FBS) and seeded onto the top surface of the cell construct constructed in a 24-well Transwell cell culture insert. Thereafter, the cells were cultured for 5 days while appropriately changing the medium in D-MEM medium (10% FBS).
  • D-MEM medium 10% FBS
  • JC-052-liv cells suspended in an appropriate amount of D-MEM medium (10% FBS) or StemPro medium containing Y-27632 in a 24-well Transwell cell culture insert in which no cell structure has been constructed Were seeded and cultured.
  • FIG. 5 shows the calculation results of a sample seeded in a 24-well Transwell cell culture insert in which no cell structure was constructed.
  • FIG. 6 shows the calculation results of the sample seeded on the top surface of the cell structure.
  • DMEM is a sample cultured in D-MEM medium (10% FBS).
  • ES is a sample cultured in StemPro medium containing Y-27632. Also, in FIG.
  • EpCAM positive cells were observed regardless of the number of cell layers. From these results, it was confirmed that primary cultured cancer cells were grown in D-MEM medium (10% FBS) by culturing on the top surface of the cell structure containing stromal cells.
  • JC-052-liv cells ⁇ Staining of patient tumor tissue-derived JC-052-liv cells with anti-EpCAM antibody>
  • anti-EpCAM was applied to JC-052-liv cells seeded in a 24-well Transwell cell culture insert in which cell structures were not constructed and cultured in D-MEM medium (10% FBS) for 5 days. Fluorescent immunostaining with antibody was performed. The staining results are shown in FIG. As a result, since EpCAM-positive cells were confirmed, it is clear that JC-052-liv cells, which are cancer cells derived from patient tumor tissue, are EpCAM-positive cells.
  • Example 5 Patient's tumor tissue-derived cells (PDC) derived from metastasis from colorectal cancer (liver cancer), even when using various “general media” other than DMEM We examined whether it was possible to grow.
  • PDC tumor tissue-derived cells derived from metastasis from colorectal cancer
  • liver cancer are sorted and collected along with other cells or only cancer cells, and then cultured on the top surface of a cell structure with 20 cell layers did.
  • Patient tumor tissue derived cells were prepared as follows. First, the tumor tissue (JC039-2-Liv) excised from a patient with liver cancer (metastatic cancer from colorectal cancer) was mechanically shredded at the Cancer Research Society of the Non-profit Foundation and implemented as an example. After enzymatic treatment with collagenase / dispase and Dnase I in the same manner as in 1, the cells were thoroughly washed to prevent contamination. Similarly, the tumor tissue (JC047-Liv) excised from a patient with liver cancer (metastatic cancer from a colon cancer) was mechanically minced by the Cancer Research Institute and implemented. After enzymatic treatment with collagenase / dispase and Dnase I in the same manner as in Example 1, the plate was thoroughly washed to prevent contamination.
  • D-MEM medium 10% FBS
  • the patient tumor tissue-derived JC039-2-Liv cells were cultured for 14 days using each of the following three media instead of the D-MEM medium.
  • the patient tumor tissue-derived JC039-2-Liv cells are the same as in the case of using the above D-MEM medium except that one of the following three mediums is used instead of the D-MEM medium: Was cultured.
  • RPMI-1640 medium (a medium used as a high nutrient medium that can be widely used for mammalian cells) • McCoy's 5A medium (a medium developed for lymphocyte culture and often used in cancer cell lines) ES medium (in this example, Y-27632-containing StemPro medium was used. This medium is often used for primary culture of cancer clinical specimens and used for establishment and maintenance of patient-derived cell lines.) The number of cells derived from the patient's tumor tissue seeded in the cell construct was 1 ⁇ 10 4 cells / well.
  • the patient tumor tissue-derived JC047-Liv cells are seeded on the top surface of the cell structure, D-MEM medium (10% FBS), RPMI- The cells were cultured for 14 days each using four types of media, 1640 medium, McCoy's 5A medium, and ES medium. The number of cells derived from the patient's tumor tissue seeded in the cell construct was 1 ⁇ 10 4 cells / well.
  • FIG. 11 shows a sample obtained by seeding patient tumor tissue-derived JC039-2-Liv cells on the top surface of a cell structure containing stromal cells, and culturing each of them for 14 days using the above four types of media (FIG. 11).
  • FIG. 11 shows that in Example 5, (1) patient tumor tissue-derived JC039-2-Liv cells are seeded on the top surface of a cell structure containing stromal cells, and four types of media are used respectively.
  • Samples cultured for 14 days and (2) patient tumor tissue-derived JC039-2-Liv cells are seeded in a collagen-coated 6-well plate in which cell structures have not been constructed, and each medium is used to It is the figure which showed the comparison of the measurement result of the proliferation rate (seeding number ratio) in the sample culture
  • FIG. 12 the patient tumor tissue-derived JC047-Liv cells were seeded on the top surface of the cell structure containing stromal cells, and samples were cultured for 14 days each using the above four types of media (FIG. 12). It shows as 3D and the calculation result of the proliferation rate of the cell structure having a three-dimensional structure.
  • FIG. 12 patient tumor tissue-derived JC047-Liv cells are seeded in a collagen-coated 6-well plate in which no cell structure has been constructed, and the above four types of media are used to The calculation result of the growth rate of the sample (It shows as 2D in FIG. 12 and respond
  • Example 12 shows that, in Example 5, (1) patient tumor tissue-derived JC047-2-Liv cells were seeded on the top surface of the cell structure containing stromal cells, and each of four media was used for 14 The day-cultured sample and (2) patient tumor tissue-derived JC047-Liv cells are seeded in a collagen-coated 6-well plate in which cell structures have not been constructed, and cultured for 14 days each using 4 types of media It is the figure which showed the comparison of the measurement result of the proliferation rate (seeding number ratio) after 14 days in the sample which carried out.
  • JC039-2-Liv cells and JC047-2-Liv cells have a three-dimensional structure.
  • the growth rate exceeded 1.0 in any of the four media. That is, when cancer cells were cultured using a cell structure having a three-dimensional structure, the growth of cancer cells was also confirmed when a general medium other than D-MEM medium was used.
  • Example 6 Next, using tumor cells in primary culture, the relationship between the thickness of 3D tissue in the cell structure, the presence or absence of vascular network and proliferation rate, and the influence of cancer type were examined.
  • Cancer cells in patient tumor tissues were prepared as follows.
  • a 20-layer cell structure formed from NHDF and without the vascular network structure was constructed in the same manner as the cell structure constructed in Example 2.
  • the number of cell layers was 1, 5, or 10
  • a cell structure formed of NHDF and not having a vascular network structure was constructed in the same manner.
  • ⁇ Dissemination of cancer cells Dissemination of tumor tissue-derived JC406-1-TT cells from colorectal cancer patients
  • the tumor tissue-derived JC406-1-TT cells from colorectal cancer patients obtained by the above fractionation are used in an appropriate amount of D-MEM medium (10% FBS)
  • D-MEM medium 10% FBS
  • the cells were suspended and suspended onto the top surface of a 20-layer cell structure (formed from NHDF and HUVEC and having a vascular network structure) constructed in a 24-well Transwell cell culture insert. Thereafter, the cells were cultured for 14 days while appropriately changing the medium in D-MEM medium (10% FBS).
  • colon cancer patient tumor tissue-derived JC406-1-TT cells were each cultured for 14 days using RPMI-1640 medium instead of D-MEM medium. Furthermore, in the same manner, colon cancer patient tumor tissue-derived JC406-1-TT cells were each cultured for 14 days using McCoy's 5A medium instead of D-MEM medium. Similarly, JC406-1-TT cells were cultured using three types of media, respectively, in any of the cell structures with one, five, and ten layers.
  • the tumor tissue-derived JC247-2-PUL cells from lung cancer patients obtained by the above fractionation are treated with an appropriate amount of D-MEM medium (10% FBS). It was suspended and seeded on the top surface of a 20-layer cell structure (formed from NHDF and HUVEC and having a vascular network structure) constructed in a 24-well Transwell cell culture insert. Thereafter, the cells were cultured for 14 days while appropriately changing the medium in D-MEM medium (10% FBS).
  • D-MEM medium (10% FBS)
  • the lung cancer patient tumor tissue-derived JC247-2-PUL cells were cultured for 14 days while appropriately changing the medium.
  • medium exchange is appropriately performed using D-MEM medium (10% FBS) as well. Lung cancer patient tumor tissue-derived JC247-2-PUL cells were cultured for 14 days while performing.
  • the number of cells (the number of cells of JC406-1-TT or the number of cells of JC247-2-PUL) (the number of cells of JC406-1-TT or the number of cells of JC247-2-PUL) before culture start is set to 1 for each cell structure.
  • the relative cell number after culture was calculated as the proliferation rate of the cells (cell number of JC406-1-TT or cell number of JC247-2-PUL).
  • FIG. 13 shows the number of layers of cell structures formed of NHDF and HUVEC and having a vascular network structure when three types of media (D-MEM media, RPMI-1640 media, McCoy's 5A media) were used respectively
  • D-MEM media three types of media
  • RPMI-1640 media RPMI-1640 media
  • McCoy's 5A media The change (%) in proliferation rate after 2 weeks of JC406-1-TT cells with respect to the change in layer number of 3D tissue is shown.
  • FIG. 1 shows the change in proliferation rate after 2 weeks of JC406-1-TT cells with respect to the change in layer number of 3D tissue.
  • Example 6 shows that, in Example 6, when the number of layers of 3D tissue of the cell structure to be constructed is changed, patient tumor tissue (colorectal cancer primary lesion) -derived JC406-1-TT cells, It is the figure which showed the measurement result of the proliferation rate (seeding number ratio) after 14 days in the sample seed
  • Example 14 shows two types of cell structures (cell structures formed from NHDF and not having a vascular network structure, or cell structures formed from NHDF and HUVEC and having a vascular network structure) in Example 6.
  • JC247-2-PUL cells derived from the patient's tumor tissue colonrectal cancer lung metastases
  • FIG. 14 when the cell structure according to the above embodiment is used according to this example, colon cancer (colorectal cancer primary lesion) as shown in Examples 1 to 5; In addition to liver cancer (metastatic lesions from colon cancer, cases of liver metastasis), it has been confirmed that cancer cells can be similarly cultured in lung cancer (metastatic lesions from large intestine, lung metastasis cases).
  • the growth rate of cancer cells tends to improve as the number of layers of 3D tissues in the cell structure increases, as in colon cancer cells.
  • FIG. 14 only fibroblasts are compared between a cell structure formed from NHDF and not having a vascular network structure and a cell structure formed from NHDF and HUVEC and having a vascular network structure. It has been revealed that the growth rate of cells tends to be higher on tissues containing vascular endothelial cells than in cell structures composed of
  • both the cell structure formed from NHDF and not provided with the vascular network structure and the cell structure formed from NHDF and HUVEC and provided with the vascular network structure are 3D in the cell structure.
  • the tendency for cell proliferation to improve as the number of tissue layers increased was similar. That is, the tendency of the cell proliferation rate to improve as the number of layers of 3D tissue in the cell structure increased was similar regardless of the presence or absence of the vascular network.
  • Example 7 In this example, the relationship between the percentage of vascular endothelial cells in 3D tissue and the proliferation rate of cancer cells was confirmed using tumor cells in primary culture.
  • Cancer cells in patient tumor tissues were prepared as follows. First, after mechanically fragmenting a tumor tissue (JC406-1-TT) excised from a patient with colorectal cancer (colorectal cancer primary lesion) at the cancer research society of the public interest incorporated foundation, Example 1 and Similarly, after enzymatic treatment with collagenase / dispase and Dnase I, it was thoroughly washed to prevent contamination.
  • JC406-1-TT tumor tissue excised from a patient with colorectal cancer (colorectal cancer primary lesion) at the cancer research society of the public interest incorporated foundation
  • HUVEC content the content of HUVECs in the cell structure relative to the total number of NHDFs
  • HUVEC content the content of HUVECs in the cell structure relative to the total number of NHDFs
  • the HUVEC content is 0%
  • Cell structures (20 layers) were constructed at 0.5%, 5.0% and 15%.
  • five types of cell structures (20 layers) having a HUVEC content of 0%, 0.5%, 1.5%, 5.0%, and 15% were constructed.
  • a cell structure (HUVEC content 1.5%) constructed by suspending patient tumor tissue-derived JC406-1-TT cells in an appropriate amount of D-MEM medium (10% FBS) and assembling in a 24-well Transwell cell culture insert Sowed on the top of the Thereafter, the cells were cultured for 14 days while appropriately changing the medium in D-MEM medium (10% FBS).
  • D-MEM medium 10% FBS
  • the patient tumor tissue-derived JC406-1-TT cells are seeded on the top surface of the cell structure with HUVEC content of 0%, 0.5%, 5.0%, 15%, and D- The cells were cultured for 14 days while appropriately changing the medium in MEM medium (10% FBS).
  • the number of cells derived from the patient's tumor tissue seeded in the cell construct was 1 ⁇ 10 4 cells / well.
  • the relative number of cells after culture when the number of cells (the number of JC406-1-TT cells) (the number of JC406-1-TT cells) before culture start (the number of JC406-1-TT cells) is 1 It was calculated as the proliferation rate of 1-TT cells.
  • patient tumor tissue-derived JC406-1-TT cells are seeded on the top surface of a cell construct containing stromal cells whose HUVEC content is varied between 0 and 15%, and D-MEM medium is used.
  • the calculation result of the proliferation rate of the sample cultured using for 14 days is shown. In other words, FIG.
  • Example 15 shows that, in Example 7, when the content rate of the vascular endothelial cells of the cell structure to be constructed is changed, the patient tumor tissue (primary colon cancer primary lesion) -derived JC406-1-TT cells are used.
  • FIG. 6 shows the results of measurement of the proliferation rate (ratio of seeded number) after 14 days in a sample seeded on the top surface of a cell structure containing stromal cells and cultured for 14 days.
  • a tissue containing vascular endothelial cells such as HUVEC is more suitable than a cell structure (3D tissue) formed only from fibroblasts such as NHDF.
  • a cell structure such as HUVEC
  • fibroblasts such as NHDF.
  • cancer cells show high proliferation rate. That is, according to this example, when the cell structure contains vascular endothelial cells, favorable results are obtained from the viewpoint of cancer cell growth regardless of the ratio of vascular endothelial cells (HUVEC) in the cell structure. It was done.
  • the ratio of vascular endothelial cells to fibroblasts was in the range of 0.5% to 5.0%, the proliferation rate of cancer cells tended to be particularly high.

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Abstract

生体から採取した組織に含まれている細胞をインビトロで初代培養する初代培養方法は、間質を構成する細胞を含み、単層の又は２以上の細胞層が厚み方向に積層されている細胞構造体の天面に、生体から採取した組織中の細胞を播種し培養する。

Description

初代培養方法
　本発明は、生体から採取された組織中の細胞を初代培養する方法に関する。本発明は、特に、がん患者の腫瘍組織由来のがん細胞を初代培養する方法に関する。
　本願は、２０１７年８月２１日に日本に出願された特願２０１７－１５８９０１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　従来、がん研究では、培養に最適化した条件で継代培養され確立された細胞株を用いた実験が主流であった。しかし、長年にわたり生体外で維持され培養され続けているがん細胞株は、もとの患者腫瘍組織と性質が変化しており、生体内での挙動を十分に反映できているとはいえない可能性がある。そこで、より精度の高い抗がん剤開発や、患者ごとに最適な治療の選択のために、がん細胞の初代培養が有望視されている。
　例えば、非特許文献１では、初代培養細胞を用いたＣＤ－ＤＳＴ（Collagen gel droplet embedded drug sensitivity test）法が紹介されている。この試験法は、患者から単離された組織又は細胞を、コラーゲンゲル内にて包埋培養して検証する薬剤感受性試験である。しかしながら、初代培養細胞については、培養法が確立しているとは言い難く、培養成功率の低さが課題である。
　患者腫瘍組織からがん細胞を初代培養する方法として、細胞分散に伴う細胞死（アポトーシス）を阻害するために、ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ－２７６３２を培地に添加する方法（非特許文献２）や、細胞間接着を維持したままの一定のサイズの細胞塊を得て浮遊培養する方法（特許文献１）が提案されている。これらの培養法では、幹細胞用の無血清培地に血清代替物や各種増殖因子を添加した培地が用いられる。しかし、一般に、幹細胞用無血清培地は高額であることに加えて、人為的に増殖因子が大量に加えられた生育環境では、実際の生体内とは異なるシグナル経路が亢進又は抑制されている可能性がある。そのような環境下では、特に分子標的薬を用いた感受性試験などで、実際の生体内とは異なる結果が得られてしまう懸念がある。
日本国特許第５６５２８０９号公報
Takamura et al.，International Journal of Cancer, 2002，Vol.98，p.450-455. Zhang L et al.，PLOS ONE，2011，vol.6, p.18271. Nishiguchi et al.,　Macromol Bioscience，2015，vol.15(3)，p.312-317.
　本発明は、特別に増殖因子や何らかの阻害剤を加えることなく、一般的な細胞培養に用いられる培養培地を用いて、生体から採取された組織（生体組織）中の細胞を初代培養する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決しようと鋭意検討を重ねたところ、生体から採取された組織中の細胞を細胞外で培養する場合、培養の初期において間質の存在が重要であることを見出し、本発明を完成するに至った。
［１］　本発明の第一態様に係る初代培養方法は、生体から採取した組織に含まれている細胞をインビトロで初代培養する初代培養方法であって、間質を構成する細胞を含み、単層の又は２以上の細胞層が厚み方向に積層されている細胞構造体の天面に、生体から採取した組織中の細胞を播種し培養する。
［２］　前記生体から採取した前記組織の細片化物、前記生体から採取した前記組織の酵素処理物、又は前記生体から採取した前記組織から回収された細胞を、前記細胞構造体の前記天面に播種し培養してもよい。
［３］　前記細胞構造体が、前記間質を構成する細胞として、線維芽細胞、周皮細胞、内皮細胞、及び免疫細胞からなる群から選択される１種以上を含んでいてもよい。
［４］　前記内皮細胞が、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞からなる群から選択される１種以上であってもよい。
［５］　前記細胞構造体が、脈管網構造を備えていてもよい。
［６］　前記細胞構造体の厚みが５μｍ以上であってもよい。
［７］　前記細胞構造体の厚みが１５０μｍ以上であってもよい。
［８］　前記生体から採取した前記組織が腫瘍組織を含んでいてもよい。
［９］　前記生体から採取した前記組織を細片化した後、得られた細片化物からがん細胞を選別し、選別された前記がん細胞を、前記細胞構造体の前記天面に播種し培養してもよい。
［１０］　前記細片化物から前記がん細胞を選別する際に、フローサイトメトリー、磁気分離、誘電泳動、サイズ分画、及び密度勾配分画からなる群から選択される１種以上の手法によって前記がん細胞を選別してもよい。
［１１］　カチオン性緩衝液中で、少なくとも間質を構成する細胞を含む細胞と強電解質高分子と細胞外マトリックス成分とを混合して混合物を得る工程（ａ）と、前記工程（ａ）により得られた前記混合物を、細胞培養容器中に播種する工程（ｂ）と、前記工程（ｂ）の後、前記細胞培養容器中に、少なくとも間質を構成する細胞を含む細胞が多層に積層された細胞構造体を得る工程（ｃ）と、により、前記細胞構造体を構築してもよい。
［１２］　本発明の第二態様に係る初代培養細胞含有細胞構造体は、間質を構成する細胞を含み、単層の又は２以上の細胞層が厚み方向に積層されている間質細胞層の天面に生体から採取した組織に含まれている細胞から形成された細胞層を備える。
　本発明の上記態様に係る初代培養方法は、生体組織中の細胞を、間質を模した細胞構造体の天面で培養するため、従来の初代培養のような大量の増殖因子や特殊な阻害剤を使用せずとも、培養細胞株の培養に汎用されている一般的な培養培地を用いた場合でも、高い成功率で初代培養を行うことができる。
図１は、実施例１において、２週間培養した後のＰＫＨ標識したがん細胞株ＪＣ００４の蛍光画像である。 図２は、実施例２において、培養開始から５日目、７日目、１０日目、及び１３日目のＰＫＨ標識した患者腫瘍組織由来ＪＣ－１１５細胞の蛍光画像である。 図３は、実施例３において、Ｄ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）で２．５週間培養した後の患者腫瘍組織由来ＪＣ－１２１細胞の蛍光画像である。 図４は、実施例３において、Ｙ－２７６３２含有ＳｔｅｍＰｒｏ培地で２．５週間培養した後の患者腫瘍組織由来ＪＣ－１２１細胞の蛍光画像である。 図５は、実施例４において、患者腫瘍組織由来ＪＣ－０５２－３－ｌｉｖ細胞を、細胞構造体を構築していない２４穴Ｔｒａｎｓｗｅｌｌセルカルチャーインサート内に播種して５日間培養したサンプルの５日後増殖率（播種数比）の測定結果を示した図である。 図６は、実施例４において、患者腫瘍組織由来ＪＣ－０５２－３－ｌｉｖ細胞を、間質細胞を含む細胞構造体の天面に播種して５日間培養したサンプルの５日後増殖率（播種数比）の測定結果を示した図である。 図７は、実施例４において、患者腫瘍組織由来ＪＣ－０５２－３－ｌｉｖ細胞を、間質細胞を含む細胞構造体の天面に播種して５日間培養したサンプルの総細胞数に対するＥｐＣＡＭ陽性細胞の比率（細胞数比、％）の測定結果を示した図である。 図８は、実施例４において、患者腫瘍組織由来ＪＣ－０５２－３－ｌｉｖ細胞を、細胞層数が１０層又は２０層の細胞構造体で培養したサンプルについて、選別回収前後の全細胞数に対するＥｐＣＡＭ陽性細胞数の比率（％）の測定結果を示した図である。 図９は、実施例４において、細胞培養容器に直接播種したＪＣ－０５２－３－ｌｉｖ細胞を抗ＥｐＣＡＭ抗体による蛍光免疫染色した蛍光画像である。 図１０は、実施例４において、ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣとから形成された２０層の細胞構造体を抗ＥｐＣＡＭ抗体による蛍光免疫染色した蛍光画像である。 図１１は、実施例５において、（１）患者腫瘍組織由来ＪＣ０３９－２－Ｌｉｖ細胞を、間質細胞を含む細胞構造体の天面に播種し、４種の培地をそれぞれ用いて１４日間培養したサンプルと、（２）患者腫瘍組織由来ＪＣ０３９－２－Ｌｉｖ細胞を、細胞構造体を構築していないコラーゲンコート６穴プレート内に播種し、４種の培地をそれぞれ用いて１４日間培養したサンプルと、における１４日後増殖率（播種数比）の測定結果の比較を示した図である。 図１２は、実施例５において、（１）患者腫瘍組織由来ＪＣ０４７－２－Ｌｉｖ細胞を、間質細胞を含む細胞構造体の天面に播種し、４種の培地を用いてそれぞれ１４日間培養したサンプルと、（２）患者腫瘍組織由来ＪＣ０４７－２－Ｌｉｖ細胞を、細胞構造体を構築していないコラーゲンコート６穴プレート内に播種し、４種の培地を用いてそれぞれ１４日間培養したサンプルと、における１４日後増殖率（播種数比）の測定結果の比較を示した図である。 図１３は、実施例６において、構成する細胞構造体の３Ｄ組織の層数を変化させた場合に、患者腫瘍組織（大腸がん原発巣）由来ＪＣ４０６-１-ＴＴ細胞を、間質細胞を含む細胞構造体の天面に播種し、３種の培地をそれぞれ用いて１４日間培養したサンプルにおける１４日後増殖率（播種数比）の測定結果を示した図である。 図１４は、実施例６において、２種の細胞構造体（ＮＨＤＦから形成され血管網構造を備えていない細胞構造体、または、ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣから形成され血管網構造を備える細胞構造体）の３Ｄ組織の層数を変化させた場合に、患者腫瘍組織（大腸がん肺転移巣）由来ＪＣ２４７－２－ＰＵＬ細胞を、間質細胞を含む細胞構造体の天面に播種し、１４日間培養したサンプルにおける１４日後増殖率（播種数比）の測定結果を示した図である。 図１５は、実施例７において、構成する細胞構造体の血管内皮細胞の含有率を変化させた場合に、患者腫瘍組織（大腸がん原発巣）由来ＪＣ４０６-１-ＴＴ細胞を、間質細胞を含む細胞構造体の天面に播種し、１４日間培養したサンプルにおける１４日後増殖率（播種数比）の測定結果を示した図である。
　本発明の一実施形態に係る初代培養方法は、生体から採取した組織に含まれている細胞をインビトロで初代培養するための培養方法であって、間質を構成する細胞（間質細胞）を含み、単層の又は２以上の細胞層が厚み方向に積層されている細胞構造体の天面に、生体組織中の細胞を播種し培養する。本実施形態において用いられる細胞構造体は、間質細胞を含み、間質組織を模した構造体である。生体組織中の細胞を、通常の培養基材表面ではなく、間質を模した細胞構造体の天面で培養することにより、培養細胞株の培養に汎用されている一般的な培養培地を用いた場合でも、高い成功率で初代培養を行うことができる。
　本実施形態に係る初代培養方法では、間質組織を模した細胞構造体の天面で、培養培地として過剰な増殖因子や人工的な阻害剤を使用することなく初代培養できる。この結果、間質を構成する細胞を含み、単層の又は２以上の細胞層が厚み方向に積層されている間質細胞層の天面に生体から採取した組織に含まれている細胞から形成された細胞層を備える、初代培養細胞含有細胞構造体が得られる。つまり、本実施形態により得られる初代培養物（初代培養細胞含有細胞構造体）は、より生体内に近しい環境下で得られた培養物である。このため、本実施形態により得られた初代培養物は、より生体内に近いセルベースアッセイを行うための試料として非常に有用である。
＜細胞構造体＞
　本実施形態において使用される細胞構造体（以下、「本実施形態に係る細胞構造体」ということがある。）は、少なくとも間質細胞を含み、単層の又は２以上の細胞層が厚み方向に積層されている。間質細胞を立体的に構築することにより、間質組織を模した細胞構造体を構築できる。なお、本実施形態及び本明細書において、「細胞構造体」とは、少なくとも間質細胞を含む平面的又は立体的な細胞集合体を意味し、「細胞構造体の厚み」とは、当該構造体の自重方向の長さを意味する。自重方向とは、重力のかかる方向であり、厚み方向ともいう。「細胞層」とは、厚み方向と直交する方向に存在し、厚み方向に対して細胞核が重ならないで存在する一群の細胞および間質によって構成される層のことを意味する。
　本実施形態に係る細胞構造体を構成する間質細胞等の細胞は特に限定されなく、動物から採取された細胞であってもよく、動物から採取された細胞を培養した細胞であってもよく、動物から採取された細胞に各種処理を施した細胞であってもよく、培養細胞株であってもよい。また、市販の細胞を用いてもよく、患者由来の細胞を用いてもよい。動物から採取された細胞の場合、採取部位は特に限定されず、骨、筋肉、内臓、神経、脳、骨、皮膚、血液などに由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよく、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であってもよい。また、本実施形態に係る細胞構造体を構成する細胞が由来する生物種は特に限定されなく、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等の動物に由来する細胞を用いることができる。動物から採取された細胞を培養した細胞としては、初代培養細胞であってもよく、継代培養細胞であってもよい。また、各種処理を施した細胞としては、誘導多能性幹細胞細胞（ｉＰＳ細胞）や、分化誘導後の細胞が挙げられる。また、本実施形態に係る細胞構造体は、同種の生物種由来の細胞のみから構成されていてもよく、複数種類の生物種由来の細胞により構成されていてもよい。
　本実施形態に係る細胞構造体を構築する間質細胞としては、例えば、内皮細胞、線維芽細胞、周皮細胞、免疫細胞、神経細胞、肥満細胞、上皮細胞、心筋細胞、肝細胞、膵島細胞、組織幹細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。免疫細胞とは、免疫に関与する細胞である。具体的には、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞などが挙げられる。リンパ球には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、形質細胞等がある。本実施形態に係る細胞構造体に含まれる間質細胞は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。本実施形態に係る細胞構造体に含まれる間質細胞としては、線維芽細胞、周皮細胞、内皮細胞、及び免疫細胞からなる群から選択される１種以上を含むことが好ましい。
　本実施形態に係る細胞構造体中の間質細胞の数は、特に限定されないが、より間質組織を模した細胞構造体が形成されることから、本実施形態に係る細胞構造体を構成する全細胞に対する間質細胞の存在比（細胞数比）が、３０％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがよりさらに好ましい。
　血管網構造やリンパ管網構造は、本実施形態に係る細胞構造体が生体内の間質組織に類似した機能を発現するために重要であると考えられる。このため、本実施形態に係る細胞構造体は、脈管網構造を備える細胞構造体が好ましい。すなわち、本実施形態に係る細胞構造体としては、脈管を形成していない細胞の積層体の内部に、リンパ管及び／又は血管等の脈管網構造が三次元的に構築され、より生体内に近い組織を構築している細胞構造体が好ましい。脈管網構造は、細胞構造体の内部にのみ形成されていてもよく、少なくとも脈管網構造の一部が細胞構造体の表面又は底面に露出されるように形成されていてもよい。また、脈管網構造は、細胞構造体全体に構築されていてもよく、特定の細胞層にのみ形成されていてもよい。なお、本実施形態及び本願明細書において、「脈管網構造」とは、生体組織における血管網やリンパ管網のような、網状の構造を指す。
　脈管網構造は、間質細胞として脈管を構成する内皮細胞を含むことにより形成させることができる。本実施形態に係る細胞構造体に含まれる内皮細胞としては、血管内皮細胞であってもよく、リンパ管内皮細胞であってもよい。また、本実施形態に係る細胞構造体に含まれる内皮細胞は、血管内皮細胞とリンパ管内皮細胞との両方を含んでいてもよい。
　本実施形態に係る細胞構造体が脈管網構造を備える場合、当該細胞構造体中の内皮細胞以外の細胞としては、内皮細胞が本来の機能及び形状を保持する脈管網を形成しやすいことから、生体内において脈管の周辺組織を構成する細胞であることが好ましく、生体内の間質組織及び生体内の間質組織の近傍の環境とより近似させられることから、内皮細胞以外の細胞として少なくとも線維芽細胞を含む細胞がより好ましく、血管内皮細胞と線維芽細胞を含む細胞、リンパ管内皮細胞と線維芽細胞を含む細胞、又は血管内皮細胞とリンパ管内皮細胞と線維芽細胞を含む細胞がさらに好ましい。なお、細胞構造体に含まれる内皮細胞以外の細胞としては、内皮細胞と同種の生物種由来の細胞であってもよく、異種の生物種由来の細胞であってもよい。
　本実施形態に係る細胞構造体中の内皮細胞の数は、脈管網構造が形成されるのに充分な数であれば特に限定されなく、細胞構造体の大きさ、内皮細胞や内皮細胞以外の細胞の細胞種等を考慮して適宜決定することができる。例えば、本実施形態に係る細胞構造体を構成する全細胞に対する内皮細胞の存在比（細胞数比）を０．１％以上にすることによって、脈管網構造が形成された細胞構造体を調製できる。内皮細胞以外の細胞として線維芽細胞を用いる場合、本実施形態に係る細胞構造体における内皮細胞数は、線維芽細胞数の０．１％以上であることが好ましく、０．１～５.０％であることがより好ましい。内皮細胞として血管内皮細胞とリンパ管内皮細胞の両方を含む場合、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の総細胞数が、線維芽細胞数の０．１％以上であることが好ましく、０．１～５.０％であることがより好ましい。
　特に、本実施形態に係る初代培養方法により得られた初代培養物を、薬剤感受性試験などのセルベースアッセイに用いる場合には、用いる細胞構造体は、より生体内の間質に近しい構造体であることが好ましい。このため、当該細胞構造体としては、脈管網構造が形成された細胞構造体が好ましく、脈管網構造が形成され、かつ線維芽細胞を含む細胞構造体がより好ましい。
　また、がん細胞をより多く得たいという需要に応えるためには、脈管網構造を有するのが好ましい。
　本実施形態に係る細胞構造体の大きさや形状は、特に限定されない。より生体内の間質組織に近い状態の細胞構造体が形成可能であり、より生体内に近しい環境下での初代培養が期待できることから、当該細胞構造体の厚さは、５μｍ以上が好ましく、３０μｍ以上がより好ましく、１００μｍ以上がさらに好ましく、１５０μｍ以上がよりさらに好ましい。当該細胞構造体の厚さとしては、また、５００μｍ以下が好ましく、４００μｍ以下がより好ましく、２００μｍ以下がさらに好ましい。本実施形態に係る細胞構造体の細胞層の数としては、１～６０層程度が好ましく、２～６０層程度がより好ましく、５～６０層程度がさらに好ましく、５～２０層程度がよりさらに好ましい。
　なお、細胞構造体が２層以上の細胞層が積層された立体構造である場合、細胞構造体を構成する細胞層数は、三次元構造を構成する細胞の総数を、１層当たりの細胞数（１層を構成するために必要な細胞数）で除することにより測定される。１層当たりの細胞数は、細胞構造体を構成させる際に使用する細胞培養容器に、予め細胞をコンフルエントになるように平面的に培養して調べることができる。具体的には、ある細胞培養容器に形成された細胞構造体の細胞層数は、当該細胞構造体を構成する全細胞数を計測し、当該細胞培養容器の１層当たりの細胞数で除することにより算出できる。
　一般的に、本実施形態に係る細胞構造体は、細胞培養容器中に構築される。当該細胞培養容器としては、細胞構造体の構築が可能であり、かつ構築された細胞構造体の培養が可能な容器であれば特に限定されない。当該細胞培養容器としては、具体的には、ディッシュ、セルカルチャーインサート（例えば、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサート、Ｎｅｔｗｅｌｌ（登録商標）インサート、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）セルカルチャーインサート、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）セルカルチャーインサート等）、チューブ、フラスコ、ボトル、プレート等が挙げられる。本実施形態に係る細胞構造体の構築においては、構築された細胞構造体をそのまま初代培養に用いることができるため、ディッシュ又は各種セルカルチャーインサートが好ましい。
　本実施形態に係る細胞構造体は、間質細胞を含む単層又は多層の細胞層から形成された構造体であればよく、細胞構造体の構築方法は特に限定されない。例えば、一層ずつ構築して順次積層させて構築する方法であってもよく、２層以上の細胞層を一度に構築する方法であってもよく、両構築方法を適宜組み合わせて多層の細胞層を構築する方法であってもよい。
また、本実施形態に係る細胞構造体は、各細胞層を構成する細胞種が層ごとに異なる多層構造体であってもよく、各細胞層を構成する細胞種が、構造体の全層で共通する細胞種であってもよい。例えば、細胞種毎に層を形成し、この細胞層を順次積層させることによって構築する方法であってもよく、複数種類の細胞を混合した細胞混合液を予め調製し、この細胞混合液から多層構造の細胞構造体を一度に構築する方法であってもよい。
　一層ずつ構築して順次積層させて構築する方法としては、例えば、日本国特許第４９１９４６４号公報に記載されている方法、すなわち、細胞層を形成する工程と、形成された細胞層をＥＣＭ（細胞外マトリックス）の成分を含有する溶液に接触させる工程と、を交互に繰り返すことにより、連続的に細胞層を積層する方法が挙げられる。例えば、当該方法を行うに際し、予め、細胞構造体を構成する全ての細胞を混合した細胞混合物を調製しておき、この細胞混合物によって各細胞層を形成することによって、構造体全体に脈管網構造が形成されている細胞構造体が構築できる。また、各細胞層を、細胞種ごとに形成することによって、内皮細胞から形成された層にのみ脈管網構造が形成されている細胞構造体が構築できる。
　２層以上の細胞層を一度に構築する方法としては、例えば、日本国特許第５８５０４１９号公報に記載されている方法が挙げられる。当該方法は、予め細胞の表面全体をインテグリンが結合するアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含む高分子と前記ＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用をする高分子によって被覆しておき、この接着膜で被覆された被覆細胞を細胞培養容器に収容した後、遠心処理等によって被覆細胞同士を集積させることにより、多層の細胞層から形成された細胞構造体を構築する方法である。例えば、当該方法を行うに際し、予め、細胞構造体を構成する全ての細胞を混合した細胞混合物を調製しておき、この細胞混合物に接着性成分を添加することによって調製された被覆細胞を用いる。これにより、１度の遠心処理によって、細胞組成が構造体全体で均質な細胞構造体が構築できる。
　本実施形態に係る細胞構造体は、下記工程（ａ）～工程（ｃ）の工程を有する方法により構築することもできる。
　工程（ａ）：カチオン性緩衝液中で、細胞と細胞外マトリックス成分とを混合して混合物を得る工程（ａ）と、
　工程（ｂ）：前記工程（ａ）により得られた混合物を、細胞培養容器中に播種する工程（ｂ）と、
　工程（ｃ）：前記工程（ｂ）の後、前記細胞培養容器中に細胞が多層に積層された細胞構造体を得る工程（ｃ）。
　工程（ａ）においては、細胞を、カチオン性物質を含む緩衝液（カチオン性緩衝液）及び細胞外マトリックス成分と混合し、この細胞混合物から細胞集合体を形成することにより、内部に大きな空隙が少ない立体的細胞組織を得ることができる。また、得られた立体的細胞組織は、比較的安定であるため、少なくとも数日間の培養が可能であり、かつ培地交換時にも組織が崩壊し難い。また、本実施形態においては、工程（ｂ）において、細胞培養容器内に播種した細胞混合物を当該細胞培養容器内に沈降させることを含み得る。細胞混合物の沈降は、遠心分離等によって積極的に細胞を沈降させてもよく、自然沈降させてもよい。
　工程（ａ）において、細胞をさらに強電解質高分子と混合することが好ましい。細胞をカチオン性物質、強電解質高分子及び細胞外マトリックス成分と混合することにより、工程（ｂ）において遠心分離等の細胞を積極的に集合させる処理を要することなく、自然沈降させた場合であっても、空隙が少なく厚みのある立体的細胞組織が得られる。
　前記カチオン性緩衝液としては、例えば、トリス－塩酸緩衝液、トリス－マレイン酸緩衝液、ビス－トリス－緩衝液、又はＨＥＰＥＳ等が挙げられる。当該カチオン性緩衝液中のカチオン性物質（例えば、トリス－塩酸緩衝液におけるトリス）の濃度及びｐＨは、細胞の生育及び細胞構造体の構築に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、カチオン性緩衝液中のカチオン性物質の濃度は、１０～１００ｍＭとすることができ、４０～７０ｍＭであることが好ましく、５０ｍＭであることがより好ましい。また、当該カチオン性緩衝液のｐＨは、６．０～８．０とすることができ、６．８～７．８であることが好ましく、７．２～７．６であることがより好ましい。
　前記強電解質高分子としては、例えば、ヘパリンや、コンドロイチン硫酸（例えば、コンドロイチン４－硫酸、コンドロイチン６－硫酸）、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸等のグリコサミノグリカン；デキストラン硫酸や、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、及びポリアクリル酸、又はこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。工程（ａ）において調製される混合物には、強電解質高分子を１種類のみ混合させてもよく、２種類以上を組み合わせて混合させてもよい。本実施形態に係る細胞構造体の構築においては、強電解質高分子はグリコサミノグリカンであることが好ましい。また、ヘパリン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、及びデルマタン硫酸のうち少なくとも１つを用いることがより好ましい。本実施形態で用いられる強電解質高分子はヘパリンであることがさらに好ましい。前記カチオン性緩衝液に混合する強電解質高分子の量は、細胞の生育及び細胞構造体の構築に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。
　例えば、カチオン性緩衝液中の強電解質高分子の濃度は、０ｍｇ／ｍＬ超（０ｍｇ／ｍＬより高く）１．０ｍｇ／ｍＬ未満とすることができ、０．０２５～０．１ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、０．０５～０．１ｍｇ／ｍＬであることがより好ましい。また、本実施形態においては、前記強電解質高分子を混合せずに前記混合物を調整し、細胞構造体の構築を行うこともできる。
　前記細胞外マトリックス成分としては、例えば、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、プロテオグリカン、又はこれらの改変体若しくはバリアント等が挙げられる。プロテオグリカンには、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン等が挙げられる。工程（ａ）において調製される混合物には、細胞外マトリックス成分を１種類のみ混合させてもよく、２種類以上を組み合わせて混合させてもよい。本実施形態に係る細胞構造体の構築においては、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンを用いることが好ましく、コラーゲンを用いることがより好ましい。細胞の生育及び細胞構造体の形成に悪影響を及ぼさない限り、上述の細胞外マトリックス成分の改変体及びバリアントを用いてもよい。前記カチオン性緩衝液に混合する細胞外マトリックス成分の量は、細胞の生育及び細胞構造体の構築に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、カチオン性緩衝液中の細胞外マトリックス成分の濃度は、０ｍｇ／ｍＬ超（０ｍｇ／ｍＬより高く）１．０ｍｇ／ｍＬ未満とすることができ、０．０２５～０．１ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、０．０５～０．１ｍｇ／ｍＬであることがより好ましい。
　前記カチオン性緩衝液に混合する強電解質高分子と細胞外マトリックス成分の配合比は、１：２～２：１である。本実施形態に係る細胞構造体の構築においては、強電解質高分子と細胞外マトリックス成分の配合比が、１：１．５～１．５：１であることが好ましく、１：１であることがより好ましい。
　工程（ａ）～工程（ｃ）を繰り返す、具体的には、工程（ｃ）で得られた細胞構造体の上に、工程（ｂ）として、工程（ａ）で調製した混合物を播種した後、工程（ｃ）を行うことを繰り返すことにより、充分な厚みの細胞構造体を構築することができる。工程（ｃ）で得られた細胞構造体の上に新たに播種する混合物の細胞組成は、既に構築されている細胞構造体を構成する細胞組成と同じであってもよく、異なっていてもよい。
　工程（ａ）～工程（ｃ）を繰り返す場合に、工程（ｃ）の後、工程（ｂ）を行う前に、得られた細胞構造体を培養してもよい。培養に用いる培養培地の組成、培養温度、培養時間、培養時の大気組成等の培養条件は、当該細胞構造体を構成する細胞の培養に適した条件で行う。培養培地としては、例えば、Ｄ－ＭＥＭ、Ｅ－ＭＥＭ、ＭＥＭα、ＲＰＭＩ－１６４０、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２等が挙げられる。
　工程（ａ）の後に、（ａ’－１）得られた混合物から液体部分を除去し、細胞集合体を得る工程、及び（ａ’－２）細胞集合体を溶液に懸濁する工程を行い、工程（ｂ）へ進んでもよい。上述の工程（ａ）～工程（ｃ）を実施することで所望の組織体を得ることができるが、工程（ａ）の後に工程（ａ’－１）及び工程（ａ’－２）を実施し、工程（ｂ）を実施することで、より均質な組織体を得ることができる。
　また、工程（ａ）の後に、前記工程（ｂ）に代えて、下記工程（ｂ’－１）及び工程（ｂ’－２）を行ってもよい。工程（ｂ’－１）及び工程（ｂ’－２）を行うことによっても、より均質な組織体を得ることができる。工程（ｂ’－２）においても、工程（ｂ）と同様に、細胞培養容器内に播種した細胞混合物を当該細胞培養容器内に沈降させることを含み得る。細胞混合物の沈降は、遠心分離等によって積極的に細胞を沈降させてもよく、自然沈降させてもよい。本実施形態及び本願明細書において、「細胞粘稠体」とは、非特許文献３に記載されるようなゲル様の細胞集合体を指す。
　工程（ｂ’－１）：工程（ａ）で得られた混合物を細胞培養容器内に播種した後、混合物から液体成分を除去し、細胞粘稠体を得る工程と、
　工程（ｂ’－２）：細胞培養容器内に細胞粘稠体を溶媒に懸濁する工程。
　細胞懸濁液を調製するための溶媒としては、細胞に対する毒性がなく、増殖性や機能を損なわない溶媒であれば特に限定されず、水、緩衝液、細胞の培養培地等を用いることができる。当該緩衝液としては、例えば、リン酸生理食塩水（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳ、Ｈａｎｋｓ緩衝液等が挙げられる。培養培地としては、Ｄ－ＭＥＭ、Ｅ－ＭＥＭ、ＭＥＭα、ＲＰＭＩ－１６４０、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２等が挙げられる。細胞懸濁液を調製するための溶媒として、細胞の培養培地を用いる場合には、後述する工程（ｃ）において液体成分を除去することなく細胞を培養することができる。
　前記工程（ｃ）に代えて、下記工程（ｃ’）を行ってもよい。
工程（ｃ’）：基材上に細胞の層を形成する工程。
　工程（ｃ）及び工程（ｃ’）において、播種した混合物から液体成分を除去してもよい。工程（ｃ）及び工程（ｃ’）における液体成分の除去処理の方法は、細胞の生育及び細胞構造体の構築に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されず、液体成分と固体成分の懸濁物から液体成分を除去する方法として当業者に公知の手法により適宜行うことができる。当該手法としては、例えば、吸引、遠心分離処理、磁性分離処理、又はろ過処理等が挙げられる。例えば、細胞培養容器としてセルカルチャーインサートを用いた場合には、混合物を播種したセルカルチャーインサートを、１０℃、４００×ｇで１分間の遠心分離処理に供することによって、細胞混合物が沈降するので、吸引によって液体成分を除去することができる。
＜生体組織に含まれる細胞＞
　本実施形態において培養される細胞は、生体組織に含まれる細胞である。本実施形態に係る初代培養方法においては、生体組織に含まれている複数種類の細胞を同時に初代培養してもよく、生体組織に含まれている細胞のうち特定の種類の細胞のみを単離して初代培養してもよい。
　本実施形態において培養される細胞が由来する生体組織は、いずれの生物種の動物から採取された組織であってもよい。例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等の動物から採取された生体組織を用いることができる。
　本実施形態において培養される細胞が由来する生体組織は、固形の組織であってもよく、液体の組織であってもよい。固形組織としては、例えば、上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織、間質組織、粘膜組織を外科的に切除採取したものが挙げられる。液体組織としては、例えば、血液、リンパ液、胸水、腹水、髄液、涙、唾液、尿等の体液が挙げられる。
　これらの組織は、例えば、手術や内視鏡検査等において、メスやレーザー等で摘出したり、注射器、スワブ等で採取することができる。ヒトの生体組織としては、例えば、臨床検査のために採取された組織を用いることができる。
　本実施形態において培養される細胞は、正常組織に由来する生体組織であってもよく、病変組織のように何等かの機能不全が生じているであってもよい。例えば、本実施形態に係る初代培養方法により、がん患者から採取された腫瘍組織に含まれているがん細胞を効率よく初代培養することができる。なお、がん細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。本実施形態に係る初代培養方法においては、がん患者から採取された腫瘍組織に含まれているがん細胞以外の細胞と共にがん細胞を初代培養してもよく、がん細胞のみを単離して初代培養してもよい。
　本実施形態に係る初代培養方法によって、がん患者から採取されたがん細胞のような、各種疾患の罹患者から採取された疾患関連細胞を、高い成功率で初代培養でき、得られた疾患関連細胞の初代培養物は、特に、セルベースアッセイに好適である。また、本実施形態に係る初代培養方法は、患者から採取された疾患関連細胞の培養株の構築にも有用である。例えば、本実施形態に係る初代培養方法によって患者腫瘍組織に含まれている細胞を初代培養することにより、通常の細胞株よりも元の患者腫瘍の特性、例えば増殖能等を反映した、患者由来がん細胞株を効率的に樹立することができる。
　本実施形態において初代培養するがん細胞の由来となるがんとしては、例えば、乳がん（例えば、浸潤性乳管がん、非浸潤性乳管がん、炎症性乳がん等）、前立腺がん（例えば、ホルモン依存性前立腺がん、ホルモン非依存性前立腺がん等）、膵がん（例えば、膵管がん等）、胃がん（例えば、乳頭腺がん、粘液性腺がん、腺扁平上皮がん等）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性中皮腫等）、結腸がん（例えば、消化管間質腫瘍等）、直腸がん（例えば、消化管間質腫瘍等）、大腸がん（例えば、家族性大腸がん、遺伝性非ポリポーシス大腸がん、消化管間質腫瘍等）、小腸がん（例えば、非ホジキンリンパ腫、消化管間質腫瘍等）、食道がん、十二指腸がん、舌がん、咽頭がん（例えば、上咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん等）、頭頚部がん、唾液腺がん、脳腫瘍（例えば、松果体星細胞腫瘍、毛様細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫、退形成性星細胞腫等）、神経鞘腫、肝臓がん（例えば、原発性肝がん、肝外胆管がん等）、腎臓がん（例えば、腎細胞がん、腎盂と尿管の移行上皮がん等）、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、肝がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、卵巣がん（例、上皮性卵巣がん、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣性胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍等）、膀胱がん、尿道がん、皮膚がん（例えば、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞がん等）、血管腫、悪性リンパ腫（例えば、細網肉腫、リンパ肉腫、ホジキン病等）、メラノーマ（悪性黒色腫）、甲状腺がん（例えば、甲状腺髄様がん等）、副甲状腺がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、骨腫瘍（例えば、骨肉腫、ユーイング腫瘍、子宮肉腫、軟部組織肉腫等）、転移性髄芽腫、血管線維腫、隆起性皮膚線維肉腫、網膜肉腫、陰茎癌、精巣腫瘍、小児固形がん（例えば、ウィルムス腫瘍、小児腎腫瘍等）、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、慢性骨髄増殖性疾患、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病等）等が挙げられ、これらに限定されない。
＜初代培養＞
　本実施形態に係る初代培養方法では、本実施形態に係る細胞構造体の天面に、生体組織中の細胞を播種し培養する。具体的には、本実施形態に係る細胞構造体の培養溶液中に、生体組織中の細胞を添加する。これにより、生体組織中の細胞が細胞構造体の天面に接着し、生体組織中の細胞が細胞構造体の天面に接着された状態で培養される。
　培養に使用される培養培地としては、ＳｔｅｍＰｒｏ培地のような初代培養において一般的に使用される培養培地のように増殖因子やＲＯＣＫ阻害剤等を含有する培地であってもよいが、培養細胞株の培養に汎用されている一般的な培養培地であることが好ましい。
　培養細胞株の培養に汎用されている一般的な培養培地としては、例えば、Ｄ－ＭＥＭ、Ｅ－ＭＥＭ、ＭＥＭα、ＲＰＭＩ－１６４０、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２等や、これらにＣＳ（ウシ血清）、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、ＨＢＳ（ウマ胎児血清）等の血清を１～１０容量％程度になるように添加した培地が挙げられる。
　また、その他の培養条件は、一般的な動物細胞の培養条件と同様に適宜設定できる。例えば、培養温度は、好ましくは約３０～４０℃であり、最も好ましくは３７℃である。また、ＣＯ２濃度は、好ましくは約１～１０容量％、最も好ましくは約５容量％である。その他、Ｏ２濃度を大気よりも低い濃度となるように制御した環境下で培養することもできる。
　生体組織が固形組織の場合、内部の細胞が細胞構造体の天面に効率よく接着して培養が開始できるように、予め細片化しておくことが好ましい。生体組織の細片化には、ハサミ、ナイフ、メス、ピンセットなどを用いた機械的な手法が好適に用いられるが、特にこれに限定されない。生体組織は、より効率よく内部の細胞を取り出すことができるため、例えば、約５ｍｍ以下に細片化することが好ましい。
　細片化された生体組織は、そのまま初代培養に用いることもできるが、酵素処理を行うことも好ましい。酵素処理により、細片化物の内部に存在している細胞が表面により露出しやすくなるため、この酵素処理物を細胞構造体の培養培地に添加した場合に天面に接着しやすくなる。酵素処理は、生体組織が液体組織の場合に行ってもよい。例えば粘性が高い場合のように、単に生体組織を細胞構造体の培養培地に添加しただけでは、当該生体組織に含まれている細胞が、細胞構造体の天面に接着し難い場合もある。このような生体組織には、予め酵素処理を行うことが好ましい。
　生体組織又はその細片化物に対する酵素処理に用いる酵素は、特に限定されないが、タンパク質、糖、脂質、核酸等を分解する酵素が好適に用いられる。生体組織の細片化物の酵素処理に用いる酵素は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。本実施形態においては、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、エラスターゼ、パパイン、及びヒアルロニダーゼからなる群から選択される１種以上の酵素を用いることが好まく、コラゲナーゼ又はコラゲナーゼを含む２種類以上の酵素を用いることがより好ましく、コラゲナーゼ及びディスパーゼを、必要に応じてその他の酵素と共に用いることがさらに好ましい。なお、使用する酵素は目的の酵素活性を有する酵素であれば特に限定されなく、いずれの生物種由来の酵素であってもよく、天然に存在する酵素を改変した人工酵素であってもよい。また、各種細胞から抽出・精製した酵素であってもよく、化学的に合成された酵素であってもよい。
　生体組織の細片化処理又は酵素処理においては、細片化処理中又は酵素処理中に溶解された細胞から放出されるＤＮＡの影響によって細胞が塊状に凝集するのを防ぐために、ＤＮａｓｅＩを併用してもよい。使用するＤＮａｓｅＩとしては、ＤＮａｓｅＩ活性を持つ酵素であれば特に限定されない。タンパク質等の生体成分の分解酵素とＤＮａｓｅＩとを含む市販の酵素ミックスとしては、リベラーゼブレンザイム１（登録商標）（ロシュダイアグノスティックス社製）やＴｕｍｏｒ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ミルテニーバイオテク社製）が挙げられる。
　酵素処理の処理温度は、使用する酵素が酵素活性を発揮し得る条件であればよいが、生体組織の細片物中の細胞に対する影響が抑えられることから、３０～４０℃であることが好ましく、３７℃であることがより好ましい。また、酵素処理の処理時間は、特に限定されなく、例えば、１０～９０分間とすることができ、３０～６０分間が好ましい。
　生体組織の酵素処理物は、本実施形態に係る細胞構造体の天面へ播種する前に、細胞数を計測しておくことが好ましく、特に、生細胞の細胞数を計測しておくことが好ましい。細胞数の計測、生細胞数の計測は、常法により行うことができる。例えば、生細胞数の計測は、トリパンブルーを用いた染色法等が挙げられる。
　生体組織の細片化物は、酵素処理に先立って、緩衝液又は培養培地を用いて洗浄してもよい。洗浄に用いる緩衝液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、ＰＢＳなどを用いることができる。また、洗浄に用いる緩衝液又は培養培地中に抗生物質を添加することもできる。特に好ましくは、ペニシリンＧ（２００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン硫酸（２００μｇ／ｍＬ）、及びアムホテリシンＢ（０．５μｇ／ｍＬ）を含有するＰＢＳで組織の洗浄を行うことができる。洗浄の回数は、採取した生体組織の由来によって適宜決定できるが、３～８回が好適である。また、緩衝液又は培養培地を用いた洗浄は、酵素処理の後にのみ、又は酵素処理の前後に行ってもよい。
　生体組織中の特定の細胞のみを細胞構造体の天面で培養する場合、生体組織又は生体組織の酵素処理物から、目的の細胞種の細胞のみを選別した後、この選別された細胞を細胞構造体の培養培地に添加する。例えば、腫瘍組織の酵素処理物からがん細胞を選別した後、がん細胞のみを細胞構造体の培養培地に添加する。生体組織又は生体組織の酵素処理物からの特定の細胞の選別方法は、特に限定されなく、一般的に細胞の選別に使用される各種の方法の中から適宜選択して用いることができる。例えば、フローサイトメトリー、磁気分離、誘電泳動、サイズ分画、及び密度勾配分画からなる群から選択される１種以上の手法によって特定の細胞を選別することができる。
　がん患者由来の生体組織又は生体組織の酵素処理物からがん細胞のみを選別して、選別されたがん細胞を細胞構造体の天面で培養する場合、がん細胞の選別に先立ち、生体組織又は生体組織の酵素処理物中に含まれているがん細胞量を確認してもよい。がん細胞特異的なタンパク質の発現や酵素活性の上昇をがんマーカーとして、がん細胞を選別することができる。がんマーカーとしては、特に限定されなく、例えば、ＥｐＣＡＭやＣＥＡ、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ、ＨＥＲ２などのがん細胞において特異的に発現しているタンパク質をがんマーカーとした場合、これらに対する抗体を利用した免疫組織化学（ＩＨＣ）染色や免疫蛍光（ＩＦ）染色によって、がん細胞を可視化することができる。また、がん細胞で上昇しているγ－グルタミルトランスペプチダーゼやβ－ガラクトシターゼの酵素活性をがんマーカーとした場合、これらの酵素活性を、ＰｒｏｔｅｏＧＲＥＥＮ（登録商標、五稜化薬）やＧｌｙｃｏＧＲＥＥＮ（登録商標、五稜化薬）などの蛍光プローブを利用して測定することができる。
　がん細胞の選別は、フローサイトメトリー、磁気分離、誘電泳動、サイズ分画、密度勾配分画などの手法によって行うことができ、当該選別手法は、元の患者腫瘍の由来臓器や臨床的背景、先行する各種検査結果などから適宜決定できる。フローサイトメトリーを用いる場合、ＩＦや蛍光プローブを用いて染色した後に、染色処理陽性の細胞を分取することで、がん細胞の選別が可能である。また、フローサイトメトリーでは、前方散乱光及び側方散乱光の値から生細胞と死細胞を判定することもできるため、より効率的に生きたがん細胞を選別して回収可能である。また、磁気分離を用いる場合、抗体を用いて細胞を磁気標識するが、標識したがん細胞を磁気によって回収するポジティブセレクション方式と、標識した間質細胞を磁気によって除去するネガティブセレクション方式と、任意の方式を選択することができる。また、誘電泳動及び／又は密度勾配分画を用いる場合は、予め間質細胞の構築に用いた細胞種の誘電特性及び／又は密度勾配特性を把握しておくことが好ましい。
　また、細胞構造体の天面で培養する前に、生体組織中の細胞は、予め蛍光物質等により標識しておいてもよい。生体組織中の細胞全てを標識してもよく、初代培養を行う目的の特定の細胞のみを標識してもよい。細胞の標識方法は特に限定されなく、当該分野で公知の様々な標識方法の中から適宜選択して用いることができる。例えば、生体組織中のがん細胞を初代培養する場合、生体組織中のがん細胞の標識には、セルトラッカー（登録商標、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）やＰＫＨセルリンカーキット（シグマ－アルドリッチ社）による蛍光標識などが好適に利用できる。がん細胞の標識は、生体組織自体に対して行ってもよく、生体組織の細断物や生体組織の細断物の酵素処理物に対して行ってもよい。また、生体組織又はその酵素処理物からがん細胞を選別する場合、選抜処理後のがん細胞を標識してもよい。
　以下、実施例を用いて本発明の上記実施形態を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されなく、本発明の主旨を逸脱しない範囲で多くの変形が当該分野において通常の知識を有する者により可能である。
　以下の実施例において、特に説明がない限り、コラーゲンとしてコラーゲンＩを用いた。
［実施例１］
　間質細胞を含む細胞構造体の天面でがん患者から採取された腫瘍細胞から樹立された細胞株を培養し、通常培養培地と初代培養用培地で培養した場合とを比較した。
＜がん細胞株＞
　がん細胞株は、大腸がん患者由来細胞株（公益財団法人がん研究会にて手術検体より樹立）ＪＣ－００４を用いた。当該患者由来がん細胞株は、以下の通りにして構築された。
　まず、がん患者から採取された腫瘍組織を機械的に細片化した後、細片化物をコラゲナーゼ／ディスパーゼ（ロシュダイアグノスティックス社製）及びＤｎａｓｅ　Ｉ(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて処理した。次いで、得られた酵素処理物を、ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ－２７６３２を添加した幹細胞用の無血清培地であるＳｔｅｍＰｒｏ培地（登録商標、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で培養することで樹立した。樹立後のがん細胞株は、本実験に用いるまで、当該培地を用いて培養した。
＜細胞構造体の構築＞
　血管網構造を含む細胞構造体を、ヒト新生児由来皮膚線維芽細胞（Normal Human Dermal Fibroblasts：ＮＨＤＦ）（Ｌｏｎｚａ社製、製品番号：ＣＣ－２５０９）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell：ＨＵＶＥＣ）（Ｌｏｎｚａ社製、製品番号：ＣＣ－２５１７Ａ）の２種類の細胞を用いて構築した。細胞培養容器としては、トランズウェルセルカルチャーインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、製品番号：＃３４７０）を用い、培養培地としては、１０容量％ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、製品番号：＃３５－０１０－ＣＶ）及び１容量％ペニシリン／ストレプトマイシン（和光純薬社製、製品番号：１６８－２３１９１）含有Ｄ－ＭＥＭ（和光純薬社製、製品番号：０４３－３００８５）を用いた。
　まず、ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣを、ヘパリンとコラーゲンを含有するトリス－塩酸緩衝液（０．０５ｍｇ／ｍＬ　ヘパリン、０．０５ｍｇ／ｍＬ　コラーゲン、５０ｍＭ　トリス、ｐＨ７．４）に懸濁し、細胞懸濁液を調製した（工程（ａ））。この細胞懸濁液を、室温、１２００ｒｐｍで３分間、遠心処理し、上清を取り除いた後、適量の培養培地で再懸濁した（工程（ａ’－１）、工程（ａ’－２））。次いで、この細胞懸濁液を、細胞層数が２０層となるように、トランズウェルセルカルチャーインサート内に播種した後（工程（ｂ））、当該トランズウェルセルカルチャーインサートを室温、４００×ｇで１分間、遠心処理した。その後、当該トランズウェルセルカルチャーインサートに、適量の培養培地を追加した後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）にて２４時間培養した（工程（ｃ））。これにより、２０層の細胞層から形成され、脈管網構造が形成された細胞構造体が構築された。
　なお、本実施例においては、ＮＨＤＦが２×１０６個／ｗｅｌｌとなり、ＨＵＶＥＣがＮＨＤＦ総数に対して１．５％となるように細胞構造体を作成した。
＜がん細胞の播種＞
　まず、患者由来細胞株ＪＣ－００４を、ＰＫＨ６７セルリンカーキットを用いて蛍光標識した。その後、ＰＫＨ２６標識ＪＣ－００４を適量のＤ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）又はＹ－２７６３２含有ＳｔｅｍＰｒｏ培地で懸濁し、２４穴Ｔｒａｎｓｗｅｌｌセルカルチャーインサート内に構築した細胞構造体の天面に播種した。その後、適宜培地交換を行いながら２週間培養した。対照として、細胞構造体を構築していない２４穴Ｔｒａｎｓｗｅｌｌセルカルチャーインサート内に、適量のＤ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）又はＹ－２７６３２含有ＳｔｅｍＰｒｏ培地で懸濁したＰＫＨ２６標識ＪＣ－００４を播種し、培養した。
＜形態評価＞
　培養後のがん細胞を蛍光顕微鏡にて観察し、生育を確認した。各がん細胞の蛍光画像を図１に示す。
　図１において、「間質なし」がカルチャーインサート上に直接播種して培養したサンプルである。
　また、図１において、「３Ｄ組織上」が細胞構造体の天面に播種して培養したサンプルである。
　また、「ＤＭＥＭ」はＤ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）で培養したサンプルであり、「ＥＳ培地」はＹ－２７６３２含有ＳｔｅｍＰｒｏ培地で培養したサンプルである。
　その結果、カルチャーインサート上に直接播種して培養したサンプルでは、Ｙ－２７６３２含有ＳｔｅｍＰｒｏ培地では問題なく生育していたものの、Ｄ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）ではカルチャーインサート上に細胞がほとんど残っていなかった。一方で、間質細胞を含む細胞構造体の天面へ播種して培養したサンプルでは、培地によって形態的な差異はみられたものの、どちらの培地でもがん細胞が生育していることが確認できた。
［実施例２］
　手術にて摘出された患者腫瘍組織中のがん細胞を、間質細胞を含む細胞構造体の天面で、通常培養培地で培養した。培養培地は、１０％ＦＢＳ含有Ｄ－ＭＥＭ培地を用いた。
＜患者腫瘍組織中のがん細胞＞
　患者腫瘍組織中のがん細胞は次の通りにして調製した。まず、公益財団法人がん研究会にて大腸がん患者から摘出された腫瘍組織（ＪＣ－１１５）を、機械的に細片化した後、実施例１と同様にしてコラゲナーゼ／ディスパーゼ及びＤｎａｓｅ　Ｉにて酵素処理した後、コンタミネーション防止のために十分に洗浄した。次いで、得られた酵素処理物中のがん細胞（患者腫瘍組織由来ＪＣ－１１５細胞）を、ＰＫＨ６７セルリンカーキットを用いて蛍光標識した。
＜細胞構造体の構築＞
　ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣから形成され、血管網構造を備える細胞構造体と、ＮＨＤＦのみから形成され、血管網構造を備えていない細胞構造体と、１層のＨＵＶＥＣのみから形成された細胞構造体（二次元培養物）とを、それぞれ、培養基材上（細胞培養容器内）に構築した。細胞培養容器、ＮＨＤＦ、ＨＵＶＥＣ、及びこれらの培養培地は、実施例１と同種のものを用いた。
　ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣから形成され、血管網構造を備える２０層の細胞構造体は、実施例１で構築した細胞構造体と同様にして構築した。
　ＮＨＤＦのみから形成された２０層の細胞構造体は、細胞懸濁液の調製を、ＮＨＤＦをヘパリンとコラーゲンを含有するトリス－塩酸緩衝液（０．０５ｍｇ／ｍＬ　ヘパリン、０．０５ｍｇ／ｍＬ　コラーゲン、５０ｍＭ　トリス、ｐＨ７．４）に懸濁して行った以外は、実施例１で構築した細胞構造体と同様にして構築した。
　１層のＨＵＶＥＣのみから形成された細胞構造体は、ヘパリンとコラーゲンを含有するトリス－塩酸緩衝液（０．０５ｍｇ／ｍＬ　ヘパリン、０．０５ｍｇ／ｍＬ　コラーゲン、５０ｍＭ　トリス、ｐＨ７．４）に懸濁したＨＵＶＥＣを、細胞層数が１層となるように、直接２４穴Ｔｒａｎｓｗｅｌｌセルカルチャーインサート内に播種して培養することにより構築した。
＜がん細胞の播種＞
　蛍光標識した患者腫瘍組織由来ＪＣ－１１５細胞を、適量のＤ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）にて懸濁し、２４穴Ｔｒａｎｓｗｅｌｌセルカルチャーインサート内に構築した細胞構造体の天面に播種した。その後、適宜培地交換を行いながら２週間培養した。対照として、細胞構造体を構築していない２４穴Ｔｒａｎｓｗｅｌｌセルカルチャーインサート内に、適量のＤ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）で懸濁した蛍光標識ＪＣ－１１５細胞を播種し、培養した。
＜形態評価＞
　培養後のがん細胞を、培養開始から５、７、１０、及び１３日目に、蛍光顕微鏡にて観察し、生育を確認した。同一サンプル中のがん細胞を経時的に観察した蛍光画像を図２に示す。
　図２において、「間質なし」がカルチャーインサート上に直接播種して培養したサンプルである。
　図２において、「Ｈのみ１層」が１層のＨＵＶＥＣのみから形成された細胞構造体の天面で培養したサンプルである。
　図２において、「Ｎのみ　２０層（血管なし）」はＮＨＤＦのみから形成された２０層の細胞構造体の天面で培養したサンプルである。
　図２において、「Ｎ＋Ｈ２０層（血管あり）」はＮＨＤＦとＨＵＶＥＣから形成された２０層の細胞構造体の天面で培養したサンプルである。
　同一サンプルを経時的に観察した結果、間質なしのサンプルでは、播種した後の一定期間は蛍光標識細胞が確認できるものの、徐々に減少していることが判った。
　また、二次元培養ＨＵＶＥＣ上に播種したサンプル（図２における「Ｈのみ１層」のサンプル）では、培養期間が長くなるにつれ、間質なしと同程度にまで蛍光標識細胞が減少していたが、培養５日の時点では間質なしよりも多くの蛍光標識細胞が確認できた。即ち、二次元培養ＨＵＶＥＣは、初代培養がん細胞の増殖を亢進する効果には乏しいものの、培養初期の細胞接着を助ける効果はあると言える。
　ＮＨＤＦを含む２０層の細胞構造体の天面に播種したサンプルでは、血管網構造が構築されている細胞構造体（図２における「Ｎ＋Ｈ２０層（血管あり）」のサンプル）と、血管網構造が構築されていない細胞構造体（図２における「Ｎのみ２０層（血管なし）」のサンプル）と、の両方とも、培養５日の時点で間質なしよりも多くの蛍光標識細胞が確認できた。
　さらに、血管網構造が構築されている細胞構造体と、血管網構造が構築されていない細胞構造体と、の間で、培養５日から２週間の間で蛍光標識細胞の顕著な増減は認められなかった。
　即ち、間質細胞を含む立体的な細胞構造体の天面で培養することにより、初代培養がん細胞の生育に正の影響が及ぼされたこと、培養初期の細胞接着を助ける効果と初代培養がん細胞の増殖を亢進する効果の両方が得られることが示唆された。
［実施例３］
　手術にて摘出された患者腫瘍組織中のがん細胞を、間質細胞を含む細胞構造体の天面において培養した。培養培地は、１０％ＦＢＳ含有Ｄ－ＭＥＭ培地又はＹ－２７６３２含有ＳｔｅｍＰｒｏ培地を用いた。
＜患者腫瘍組織中のがん細胞＞
　患者腫瘍組織中のがん細胞は次の通りにして調製した。まず、公益財団法人がん研究会にて大腸がん患者から摘出された腫瘍組織（ＪＣ－１２１）を、機械的に細片化した後、実施例１と同様にしてコラゲナーゼ／ディスパーゼ及びＤｎａｓｅ　Ｉにて酵素処理した後、コンタミネーション防止のために十分に洗浄した。
＜細胞構造体の構築＞
　ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣから形成され、血管網構造を備える２０層の細胞構造体を、実施例１で構築した細胞構造体と同様にして構築した。
＜がん細胞の播種＞
　患者腫瘍組織由来ＪＣ－１２１細胞を、適量のＤ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）又はＹ－２７６３２含有ＳｔｅｍＰｒｏ培地にて懸濁し、２４穴Ｔｒａｎｓｗｅｌｌセルカルチャーインサート内に構築した細胞構造体の天面に播種した。その後、Ｄ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）又はＹ－２７６３２含有ＳｔｅｍＰｒｏ培地にて適宜培地交換を行いながら２．５週間培養した。
＜形態評価＞
　培養後の細胞構造体から培地を除去した後、ＰＢＳにて洗浄し、１０％中性緩衝ホルマリンを用いて固定した。その後、サンプル中のがん細胞を、大腸がんのマーカーによって可視化し、評価した。具体的には、抗非リン酸化（活性化）β－カテニン抗体、抗ＣＤ３１抗体を用いて免疫蛍光染色を行い、さらにＤＡＰＩによる核染色を行った。非リン酸化β－カテニンは、がん細胞に特異的に蓄積するタンパク質であり、ＣＤ３１は、血管内皮細胞の特異的に発現しているタンパク質である。染色後の細胞構造体を蛍光顕微鏡にて観察した。
　図３にＤ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）で培養した細胞構造体の染色像を示す。
　また、図４にＹ－２７６３２含有ＳｔｅｍＰｒｏ培地で培養した細胞構造体の染色像を示す。
　図３及び図４に示すように、どちらの培養培地で培養した細胞構造体でも、正常細胞では見られない非リン酸化β－カテニンの蓄積が認められたことから、がん細胞が確かに存在していることが確認できた。即ち、患者腫瘍組織由来の細胞のうち、線維芽細胞だけではなく、がん細胞も増殖していることが確認された。
［実施例４］
　手術にて摘出された患者腫瘍組織中のがん細胞を、他の細胞と共に又はがん細胞のみ選別回収した後、細胞層数の異なる複数の細胞構造体の天面でそれぞれ培養した。培養培地は、１０％ＦＢＳ含有Ｄ－ＭＥＭ培地を用いた。
＜患者腫瘍組織中のがん細胞＞
　患者腫瘍組織中のがん細胞は次の通りにして調製した。まず、公益財団法人がん研究会にて肝臓がん（大腸がんからの転移巣）患者から摘出された腫瘍組織（ＪＣ－０５２－３－ｌｉｖ）を、機械的に細片化した後、実施例１と同様にしてコラゲナーゼ／ディスパーゼ及びＤｎａｓｅ　Ｉにて酵素処理した後、コンタミネーション防止のために十分に洗浄した。
＜細胞構造体の構築＞
　ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣから形成され、血管網構造を備える２０層の細胞構造体を、実施例１で構築した細胞構造体と同様にして構築した。また、細胞層数が１、５、又は１０層となるようにした以外は同様にして、ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣから形成され、血管網構造を備える細胞構造体を構築した。
　また、ＮＨＤＦから形成され、血管網構造を備えていない２０層の細胞構造体を、実施例２で構築した細胞構造体と同様にして構築した。また、細胞層数が１、５、又は１０層となるようにした以外は同様にして、ＮＨＤＦから形成され、血管網構造を備えていない細胞構造体を構築した。
＜がん細胞の播種＞
　患者腫瘍組織由来ＪＣ－０５２－３－ｌｉｖ細胞を、適量のＤ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）にて懸濁し、２４穴Ｔｒａｎｓｗｅｌｌセルカルチャーインサート内に構築した細胞構造体の天面に播種した。その後、Ｄ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）にて適宜培地交換を行いながら５日間培養した。
　対照として、細胞構造体を構築していない２４穴Ｔｒａｎｓｗｅｌｌセルカルチャーインサート内に、適量のＤ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）又はＹ－２７６３２含有ＳｔｅｍＰｒｏ培地で懸濁したＪＣ－０５２－３－ｌｉｖ細胞を播種し、培養した。
＜酵素処理及びＥｐＣＡＭ陽性細胞の計測＞
　培養後の細胞構造体から培地を除去した後、ＰＢＳにて洗浄し、Tumor Dissociation Kit（ミルテニーバイオテク社製）に付属の酵素を用いて処理し、当該細胞構造体を構成する細胞を分散させた。その後、酵素処理物を抗ＥｐＣＡＭ抗体によって免疫蛍光染色に供し、蛍光フィルタ付の自動セルカウンターを用いて、ＥｐＣＡＭ陽性細胞の割合を計測した。
　各細胞構造体について、培養開始前の（細胞構造体の天面に播種した）ＪＣ－０５２－３－ｌｉｖ細胞数を１とした場合の培養後の相対細胞数を、ＪＣ－０５２－３－ｌｉｖ細胞の増殖率として算出した。
　図５に細胞構造体を構築していない２４穴Ｔｒａｎｓｗｅｌｌセルカルチャーインサート内に播種したサンプルの算出結果を示す。
　図６に、細胞構造体の天面に播種したサンプルの算出結果を示す。
　図５において、「ＤＭＥＭ」はＤ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）で培養したサンプルである。
　図５において、「ＥＳ」はＹ－２７６３２含有ＳｔｅｍＰｒｏ培地で培養したサンプルである。
　また、図６において、「血管あり」は、血管網構造を備える細胞構造体の結果を示す。
　図６において、「血管なし」は、血管網構造を備えていない細胞構造体の結果を示す。
　さらに、細胞構造体の天面に播種したサンプルについて、総細胞数に対するＥｐＣＡＭ陽性細胞（抗ＥｐＣＡＭ抗体で染色された細胞）の割合（％）を図７に示す。
　図５に示すように、細胞培養容器内に直接播種した場合には、ＪＣ－０５２－３－ｌｉｖ細胞は、Ｙ－２７６３２含有ＳｔｅｍＰｒｏ培地では増殖できたものの、Ｄ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）では増殖できなかった。これに対して、図６に示すように、Ｄ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）中で細胞構造体の天面で培養した場合、血管網構造を備える細胞構造体では、５層以上の細胞構造体で培養した場合に、５日後の増殖率が１以上であり、播種した細胞の増殖が認められた。血管網構造を備えていない細胞構造体では、２０層の細胞構造体で培養した場合に、５日後の増殖率が１以上であり、播種した細胞の増殖が認められた。
　図７に示すように、細胞構造体の天面で培養したサンプルでは、細胞層数にかかわらず、ＥｐＣＡＭ陽性細胞が認められた。この結果から、間質細胞を含む細胞構造体の天面で培養することにより、Ｄ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）中で初代培養がん細胞が生育していることが確認された。
＜磁気分離処理後のＥｐＣＡＭ陽性細胞の計測＞
　更に、Tumor Cell Isolation Kit（ミルテニーバイオテク社製）を用いて、当該酵素処理物中のＮＨＤＦ及びＨＵＶＥＣを磁気標識した後、磁気標識された細胞をネガティブセレクションによって除去し、ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣ以外の細胞を選別回収した。その後、前記自動セルカウンターを用いて、選別回収された細胞中のＥｐＣＡＭ陽性細胞の割合を計測した。細胞層数が１０層及び２０層の細胞構造体で培養したサンプルについて、選別回収後の全細胞数に対するＥｐＣＡＭ陽性細胞数の比率（％）の計測結果を図８に示す。
　比較のため、選別回収前の結果も同時に示す。この結果、選別回収の前後でＥｐＣＡＭ陽性細胞の割合が上昇した。この結果から、初代培養がん細胞を濃縮して回収することが可能であることが示された。
＜患者腫瘍組織由来ＪＣ－０５２－３－ｌｉｖ細胞の抗ＥｐＣＡＭ抗体による染色＞
　細胞構造体を構築していない２４穴Ｔｒａｎｓｗｅｌｌセルカルチャーインサート内に播種し、Ｄ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）で５日間培養したＪＣ－０５２－３－ｌｉｖ細胞について、前記と同様にして抗ＥｐＣＡＭ抗体による蛍光免疫染色を行った。染色結果を図９に示す。この結果、ＥｐＣＡＭ陽性細胞が確認されたことから、患者腫瘍組織由来のがん細胞であるＪＣ－０５２－３－ｌｉｖ細胞がＥｐＣＡＭ陽性細胞であることが明らかである。
＜ＮＨＤＦ及びＨＵＶＥＣの抗ＥｐＣＡＭ抗体による染色＞
　ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣから形成され、血管網構造を備える２０層の細胞構造体について、前記と同様にして抗ＥｐＣＡＭ抗体による蛍光免疫染色を行った。染色結果を図１０に示す。この結果、ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣは、抗ＥｐＣＡＭ抗体で染色されないことが確認された。
［実施例５］
　大腸がんからの転移巣（肝臓がん）由来の患者腫瘍組織由来細胞（ＰＤＣ）を用いて、ＤＭＥＭ以外の種々の「一般的な培地」を用いた場合においても、初代培養がん細胞の生育が可能か検討を行った。
　大腸がんからの転移巣（肝臓がん）由来の患者腫瘍組織由来細胞を、他の細胞と共に又はがん細胞のみ選別回収した後、細胞層数が２０層の細胞構造体の天面で培養した。
＜患者腫瘍組織中のがん細胞＞
　患者腫瘍組織由来細胞（ＰＤＣ）は次の通りにして調製した。
　まず、公益財団法人がん研究会にて肝臓がん（大腸がんからの転移巣）患者から摘出された腫瘍組織（ＪＣ０３９－２－Ｌｉｖ）を、機械的に細片化した後、実施例１と同様にしてコラゲナーゼ／ディスパーゼ及びＤｎａｓｅ　Ｉにて酵素処理した後、コンタミネーション防止のために十分に洗浄した。
　同様に、公益財団法人がん研究会にて肝臓がん（大腸がんからの転移巣）患者から摘出された腫瘍組織（ＪＣ０４７-２-Ｌｉｖ）を、機械的に細片化した後、実施例１と同様にしてコラゲナーゼ／ディスパーゼ及びＤｎａｓｅ　Ｉにて酵素処理した後、コンタミネーション防止のために十分に洗浄した。
＜細胞構造体の構築＞
　実施例１で構築した細胞構造体と同様にして、ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣから形成され、血管網構造を備える２０層の細胞構造体（ＮＨＤＦ：２×１０６個／ｗｅｌｌ、ＨＵＶＥＣ：ＮＨＤＦ総数に対して１．５％）を構築した。
＜がん細胞の播種＞
　患者腫瘍組織由来ＪＣ０３９－２－Ｌｉｖ細胞を、適量のＤ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）にて懸濁し、２４穴Ｔｒａｎｓｗｅｌｌセルカルチャーインサート内に構築した細胞構造体の天面に播種した。その後、Ｄ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）にて適宜培地交換を行いながら１４日間培養した。
　Ｄ－ＭＥＭ培地に代えて、以下の３つの培地をそれぞれ用いて、患者腫瘍組織由来ＪＣ０３９－２－Ｌｉｖ細胞を１４日間培養した。
　なお、Ｄ－ＭＥＭ培地に代えて、以下の３つの培地のいずれか一つの培地を用いた他は、上記Ｄ－ＭＥＭ培地を用いた場合と同様に、患者腫瘍組織由来ＪＣ０３９－２－Ｌｉｖ細胞を培養した。
・ＲＰＭＩ－１６４０培地（哺乳類細胞に広く使用できる高栄養培地として使用される培地である。）
・ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地（リンパ球の培養用に開発され、がん細胞株でも良く用いられる培地である。）
・ＥＳ培地（本実施例では、Ｙ－２７６３２含有ＳｔｅｍＰｒｏ培地を用いた。がん臨床検体の初代培養によく用いられ、患者由来細胞株の樹立・維持に使用される培地である。）
　なお、細胞構造体に播種した患者腫瘍組織由来の細胞数は１×１０４個／ｗｅｌｌとした。
　上記患者腫瘍組織由来ＪＣ０３９－２－Ｌｉｖ細胞の場合と同様に、患者腫瘍組織由来ＪＣ０４７-２-Ｌｉｖ細胞を細胞構造体の天面に播種し、Ｄ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地、ＥＳ培地の４種類の培地を用いて、それぞれ１４日間培養した。
　なお、細胞構造体に播種した患者腫瘍組織由来の細胞数は１×１０４個／ｗｅｌｌとした。
　対照として、細胞構造体を構築していない、コラーゲンコート６穴プレートに、適量の上記４つの培地（Ｄ－ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地、またはＥＳ培地）を用いて、それぞれ患者腫瘍組織由来細胞（ＪＣ０３９－２－Ｌｉｖ細胞、または、ＪＣ０４７-２-Ｌｉｖ細胞）を播種し、培養した。
　なお、コラーゲンコート６穴プレートに播種した患者腫瘍組織由来細胞の細胞数は１×１０５個／ｗｅｌｌとした。
＜酵素処理及びＥｐＣＡＭ陽性細胞の計測＞
　実施例４と同様の手法により、培養後の細胞構造体、または、細胞構造体を構築していないコラーゲンコート６穴プレートから培地を除去した後、ＰＢＳにて洗浄し、Tumor Dissociation Kit（ミルテニーバイオテク社製）に付属の酵素を用いて処理し、当該細胞構造体を構成する細胞を分散させた。その後、酵素処理物を抗ＥｐＣＡＭ抗体によって免疫蛍光染色に供し、蛍光フィルタ付の自動セルカウンターを用いて、ＥｐＣＡＭ陽性細胞の割合を計測した。
　各細胞構造体について、培養開始前の（細胞構造体の天面に播種した）細胞数（ＪＣ０３９－２－Ｌｉｖの細胞数、または、ＪＣ０４７-２-Ｌｉｖの細胞数）を１とした場合の培養後の相対細胞数を、細胞（ＪＣ０３９－２－Ｌｉｖ細胞、または、ＪＣ０４７-２-Ｌｉｖ細胞）の増殖率として算出した。
　図１１には、間質細胞を含む細胞構造体の天面に患者腫瘍組織由来ＪＣ０３９－２－Ｌｉｖ細胞を播種し、上記４種の培地を用いて、それぞれ１４日間培養したサンプル（図１１中３Ｄと示し、三次元構造を有する細胞構造体を用いた例である）の増殖率の算出結果を示す。
　また、対照として、図１１には、細胞構造体を構築していないコラーゲンコート６穴プレート内に患者腫瘍組織由来ＪＣ０３９－２－Ｌｉｖ細胞を播種し、上記４種の培地を用いて、それぞれ１４日間培養したサンプル（図１１において２Ｄと示し、間質なしに対応する）の増殖率の算出結果を示す。
　換言すれば、図１１は、実施例５において、（１）患者腫瘍組織由来ＪＣ０３９－２－Ｌｉｖ細胞を、間質細胞を含む細胞構造体の天面に播種し、４種の培地をそれぞれ用いて１４日間培養したサンプルと、（２）患者腫瘍組織由来ＪＣ０３９－２－Ｌｉｖ細胞を、細胞構造体を構築していないコラーゲンコート６穴プレート内に播種し、４種の培地をそれぞれ用いて１４日間培養したサンプルと、における１４日後増殖率（播種数比）の測定結果の比較を示した図である。
　図１２には、間質細胞を含む細胞構造体の天面に患者腫瘍組織由来ＪＣ０４７－２－Ｌｉｖ細胞を播種し、上記４種の培地を用いて、それぞれ１４日間培養したサンプル（図１２中３Ｄと示し、三次元構造を有する細胞構造体を用いた例である）の増殖率の算出結果を示す。
　また、対照として、図１２には、細胞構造体を構築していないコラーゲンコート６穴プレート内に患者腫瘍組織由来ＪＣ０４７－２－Ｌｉｖ細胞を播種し、上記４種の培地を用いて、それぞれ１４日間培養したサンプル（図１２において２Ｄと示し、間質なしに対応する）の増殖率の算出結果を示す。
　すなわち、図１２は、実施例５において、（１）患者腫瘍組織由来ＪＣ０４７－２－Ｌｉｖ細胞を、間質細胞を含む細胞構造体の天面に播種し、４種の培地をそれぞれ用いて１４日間培養したサンプルと、（２）患者腫瘍組織由来ＪＣ０４７－２－Ｌｉｖ細胞を、細胞構造体を構築していないコラーゲンコート６穴プレート内に播種し、４種の培地を用いてそれぞれ１４日間培養したサンプルと、における１４日後増殖率（播種数比）の測定結果の比較を示した図である。
　図１１、および、図１２に示したように、２種類の患者腫瘍組織由来細胞（ＪＣ０３９－２－Ｌｉｖ細胞、ＪＣ０４７－２－Ｌｉｖ細胞）のいずれを用いた場合にも、三次元構造を有する細胞構造体を用いた際（図１１、図１２における３Ｄ）では、４種のいずれの培地でも増殖率が１．０を超えた。
　すなわち、三次元構造を有する細胞構造体を用いてがん細胞を培養した際には、Ｄ－ＭＥＭ培地以外の一般的な培地を用いた場合にも、がん細胞の増殖が確認された。
　一方、細胞構造体を構築していない２Ｄ（「間質なし」の場合）には、ＥＳ培地以外の培地を用いた場合には、播種した細胞数よりも回収細胞数が少なくなり、患者腫瘍組織由来のがん細胞が一般的な培地では増殖しない傾向にあることを確認した。
　本実施例により、上記実施形態に係る細胞構造体を用いた場合には、患者腫瘍組織由来のがん細胞が、Ｄ―ＭＥＭ培地以外の「一般的な培地」を用いた場合にも生育されることを確認できた。
　換言すれば、本実施例により、上記実施形態に係る細胞構造体を用いた場合には、培地によらず、初代培養がん細胞を培養できる可能性が示された。
［実施例６］
　次に、初代培養の腫瘍細胞を用いて、細胞構造体における３Ｄ組織の厚さや血管網の有無と増殖率の関係、がん種による影響を検討した。
＜患者腫瘍組織中のがん細胞＞
　患者腫瘍組織中のがん細胞は次の通りにして調製した。
・大腸がん原発巣由来がん細胞の試料調製
　まず、公益財団法人がん研究会にて大腸がん患者から摘出された腫瘍組織（大腸がん原発巣、ＪＣ４０６－１－ＴＴ）を、機械的に細片化した後、実施例１と同様にしてコラゲナーゼ／ディスパーゼ及びＤｎａｓｅ　Ｉにて酵素処理した後、ポアサイズ１００μｍのフィルタで分画した後に得られた通過画分を得て、コンタミネーション防止のために十分に洗浄した。
・肺がん由来がん細胞の試料調製
　また、公益財団法人がん研究会にて肺がん（大腸がんからの転移巣）患者から摘出された腫瘍組織（大腸がん肺転移巣、ＪＣ２４７－２－ＰＵＬ）を、機械的に細片化した後、実施例１と同様にしてコラゲナーゼ／ディスパーゼ及びＤｎａｓｅ　Ｉにて酵素処理した後、ポアサイズ１００μｍのフィルタで分画した後に得られた通過画分を得て、コンタミネーション防止のために十分に洗浄した。
＜細胞構造体の構築＞
・血管網構造を備える細胞構造体
　ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣから形成され、血管網構造を備える２０層の細胞構造体を、実施例１で構築した細胞構造体と同様にして構築した。また、細胞層数が１、５、又は１０層となるようにした以外は同様にして、ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣから形成され、血管網構造を備える細胞構造体を構築した。
・血管網構造を備えていない細胞構造体
　また、ＮＨＤＦから形成され、血管網構造を備えていない２０層の細胞構造体を、実施例２で構築した細胞構造体と同様にして構築した。また、細胞層数が１、５、又は１０層となるようにした以外は同様にして、ＮＨＤＦから形成され、血管網構造を備えていない細胞構造体を構築した。
＜がん細胞の播種＞
・大腸がん患者腫瘍組織由来ＪＣ４０６－１－ＴＴ細胞の播種
　上記分画により得られた大腸がん患者腫瘍組織由来ＪＣ４０６－１－ＴＴ細胞を、適量のＤ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）にて懸濁し、２４穴Ｔｒａｎｓｗｅｌｌセルカルチャーインサート内に構築した２０層の細胞構造体（ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣから形成され、血管網構造を備える細胞構造体）の天面に播種した。その後、Ｄ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）にて適宜培地交換を行いながら１４日間培養した。
　また、同様の方法により、大腸がん患者腫瘍組織由来ＪＣ４０６－１－ＴＴ細胞を、Ｄ－ＭＥＭ培地に代えて、ＲＰＭＩ－１６４０培地を用いて、それぞれ１４日間培養した。
　さらに、同様の方法により、大腸がん患者腫瘍組織由来ＪＣ４０６－１－ＴＴ細胞を、Ｄ－ＭＥＭ培地に代えて、ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地を用いて、それぞれ１４日間培養した。
　同様に、層数が、１層、５層、１０層の細胞構造体のいずれにおいても、３種の培地をそれぞれ用いて、ＪＣ４０６－１－ＴＴ細胞の培養を行った。
・肺がん患者腫瘍組織由来ＪＣ２４７－２－ＰＵＬ細胞の播種
　また、上記分画により得られた肺がん患者腫瘍組織由来ＪＣ２４７－２－ＰＵＬ細胞を、適量のＤ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）にて懸濁し、２４穴Ｔｒａｎｓｗｅｌｌセルカルチャーインサート内に構築した２０層の細胞構造体（ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣから形成され、血管網構造を備える細胞構造体）の天面に播種した。その後、Ｄ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）にて適宜培地交換を行いながら１４日間培養した。
　同様に、層数が、１層、５層、１０層の細胞構造体（ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣから形成され、血管網構造を備える細胞構造体）のいずれにおいても、Ｄ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）にて適宜培地交換を行いながら１４日間、肺がん患者腫瘍組織由来ＪＣ２４７－２－ＰＵＬ細胞を培養した。
　また、ＮＨＤＦから形成され、血管網構造を備えていない細胞構造体（１層、５層、１０層、２０層）についても同様に、Ｄ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）にて適宜培地交換を行いながら１４日間、肺がん患者腫瘍組織由来ＪＣ２４７－２－ＰＵＬ細胞を培養した。
＜酵素処理及びＥｐＣＡＭ陽性細胞の計測＞
　実施例４、実施例５と同様の手法により、培養後の細胞構造体から培地を除去した後、ＰＢＳにて洗浄し、Tumor Dissociation Kit（ミルテニーバイオテク社製）に付属の酵素を用いて処理し、当該細胞構造体を構成する細胞を分散させた。その後、酵素処理物を抗ＥｐＣＡＭ抗体によって免疫蛍光染色に供し、蛍光フィルタ付の自動セルカウンターを用いて、ＥｐＣＡＭ陽性細胞の割合を計測した。
　各細胞構造体について、培養開始前の（細胞構造体の天面に播種した）細胞数（ＪＣ４０６－１－ＴＴの細胞数、または、ＪＣ２４７－２－ＰＵＬの細胞数）を１とした場合の培養後の相対細胞数を、細胞（ＪＣ４０６－１－ＴＴの細胞数、または、ＪＣ２４７－２－ＰＵＬの細胞数）の増殖率として算出した。
　図１３は、３種の培地（Ｄ－ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地）をそれぞれ用いた場合において、ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣから形成され、血管網構造を備える細胞構造体の層数（３Ｄ組織の層数）の変化に対する、ＪＣ４０６－１－ＴＴ細胞の２週間後増殖率（％）の変化を示す。
　換言すれば、図１３は、実施例６において、構成する細胞構造体の３Ｄ組織の層数を変化させた場合に、患者腫瘍組織（大腸がん原発巣）由来ＪＣ４０６-１-ＴＴ細胞を、間質細胞を含む細胞構造体の天面に播種し、３種の培地をそれぞれ用いて１４日間培養したサンプルにおける１４日後増殖率（播種数比）の測定結果を示した図である。
　また、図１４は、実施例６において、２種の細胞構造体（ＮＨＤＦから形成され血管網構造を備えていない細胞構造体、または、ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣから形成され血管網構造を備える細胞構造体）の３Ｄ組織の層数を変化させた場合に、患者腫瘍組織（大腸がん肺転移巣）由来ＪＣ２４７－２－ＰＵＬ細胞を、間質細胞を含む細胞構造体の天面に播種し、１４日間培養したサンプルにおける１４日後増殖率（播種数比）の測定結果を示した図である。
　このように、初代培養の腫瘍細胞を用いて、細胞構造体における３Ｄ組織の厚さや血管網の有無と増殖率の関係を確認したところ、図１３に示すように、いずれの培地でも、３Ｄ組織の層数の増加に従い、がん細胞の増殖率が向上する傾向にあった。
　また、図１４に示すように、本実施例により、上記実施形態に係る細胞構造体を用いた場合には、実施例１～５に示したような大腸がん(大腸がん原発巣)、肝臓がん（大腸がんからの転移巣、肝臓転移症例）に加えて、肺がん（大腸からの転移巣、肺転移症例）でも同様にがん細胞を培養可能であることが確認された。また、肺がん細胞においても、大腸がん細胞と同様に、細胞構造体における３Ｄ組織の層数の増加に従い、がん細胞の増殖率が向上する傾向にあった。
　さらに、図１４に示したように、ＮＨＤＦから形成され血管網構造を備えていない細胞構造体と、ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣから形成され血管網構造を備える細胞構造体と、の比較により、線維芽細胞のみで構成された細胞構造体よりも血管内皮細胞を含む組織上のほうが、細胞の増殖率が高い傾向を示すことが明らかになった。
　なお、図１４に示すように、ＮＨＤＦから形成され血管網構造を備えていない細胞構造体と、ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣから形成され血管網構造を備える細胞構造体と、の両者ともに、細胞構造体における３Ｄ組織の層数の増加に従い、細胞の増殖率が向上する傾向は同様であった。すなわち、細胞構造体における３Ｄ組織の層数の増加に従って細胞の増殖率が向上する傾向は、血管網の有無にかかわらず、同様であった。
［実施例７］
　本実施例では、初代培養の腫瘍細胞を用いて、３Ｄ組織中の血管内皮細胞の割合と、がん細胞の増殖率と、の関係を確認した。
＜患者腫瘍組織中のがん細胞＞
　患者腫瘍組織中のがん細胞は次の通りにして調製した。
　まず、公益財団法人がん研究会にて大腸がん（大腸がん原発巣）患者から摘出された腫瘍組織（ＪＣ４０６－１－ＴＴ）を、機械的に細片化した後、実施例１と同様にしてコラゲナーゼ／ディスパーゼ及びＤｎａｓｅ　Ｉにて酵素処理した後、コンタミネーション防止のために十分に洗浄した。
＜細胞構造体の構築＞
　ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣから形成され、血管網構造を備える２０層の細胞構造体（ＮＨＤＦ：２×１０６個／ｗｅｌｌ、ＨＵＶＥＣ：ＮＨＤＦ総数に対して１．５％）を、実施例１で構築した細胞構造体と同様にして構築した。
　また、３Ｄ組織中の血管内皮細胞の割合を変化させるように、細胞構造体におけるＨＵＶＥＣのＮＨＤＦ総数に対する含有率（以下、ＨＵＶＥＣ含有率ということがある）を変化させて、ＨＵＶＥＣ含有率が０％、０．５％、５．０％、１５％とした細胞構造体（２０層）を構築した。
　換言すれば、本実施例では、ＨＵＶＥＣ含有率が０％、０．５％、１．５％、５．０％、１５％とした５種類の細胞構造体（２０層）を構築した。
＜がん細胞の播種＞
　患者腫瘍組織由来ＪＣ４０６－１－ＴＴ細胞を、適量のＤ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）にて懸濁し、２４穴Ｔｒａｎｓｗｅｌｌセルカルチャーインサート内に構築した細胞構造体（ＨＵＶＥＣ含有率１．５％）の天面に播種した。その後、Ｄ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）にて適宜培地交換を行いながら１４日間培養した。
　また、同様に、患者腫瘍組織由来ＪＣ４０６－１－ＴＴ細胞を、ＨＵＶＥＣ含有率を０％、０．５％、５．０％、１５％とした細胞構造体の天面に播種し、Ｄ－ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）にて適宜培地交換を行いながら１４日間培養した。
　なお、細胞構造体に播種した患者腫瘍組織由来の細胞数は１×１０４個／ｗｅｌｌとした。
＜酵素処理及びＥｐＣＡＭ陽性細胞の計測＞
　実施例４～６と同様の手法により、培養後の細胞構造体から培地を除去した後、ＰＢＳにて洗浄し、Tumor Dissociation Kit（ミルテニーバイオテク社製）に付属の酵素を用いて処理し、当該細胞構造体を構成する細胞を分散させた。その後、酵素処理物を抗ＥｐＣＡＭ抗体によって免疫蛍光染色に供し、蛍光フィルタ付の自動セルカウンターを用いて、ＥｐＣＡＭ陽性細胞の割合を計測した。
　各細胞構造体について、培養開始前の（細胞構造体の天面に播種した）細胞数（ＪＣ４０６－１－ＴＴ細胞数）を１とした場合の培養後の相対細胞数を、細胞（ＪＣ４０６－１－ＴＴ細胞）の増殖率として算出した。
　図１５には、ＨＵＶＥＣ含有率を０～１５％の間で変化させた間質細胞を含む細胞構造体の天面に患者腫瘍組織由来ＪＣ４０６－１－ＴＴ細胞を播種し、Ｄ－ＭＥＭ培地を用いて１４日間培養したサンプルの増殖率の算出結果を示す。
　換言すれば、図１５は、実施例７において、構成する細胞構造体の血管内皮細胞の含有率を変化させた場合に、患者腫瘍組織（大腸がん原発巣）由来ＪＣ４０６-１-ＴＴ細胞を、間質細胞を含む細胞構造体の天面に播種し、１４日間培養したサンプルにおける１４日後増殖率（播種数比）の測定結果を示した図である。
　図１５に示すように、本実施例によれば、ＮＨＤＦのような線維芽細胞のみから形成された細胞構造体（３Ｄ組織）よりも、ＨＵＶＥＣのような血管内皮細胞を含む組織のほうが、がん細胞が高い増殖率を示すことが明らかになった。
　すなわち、本実施例によれば、細胞構造体が血管内皮細胞を含む場合には、細胞構造体における血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の割合にかかわらず、がん細胞の増殖の観点から好ましい結果が得られた。
　また、本実施例によれば、線維芽細胞に対する血管内皮細胞の割合が０．５％～５．０％の範囲内にある際に、特にがん細胞の増殖率が高くなる傾向にあった。
　本実施例によれば、がん細胞をより多く得たいという観点においては、血管内皮細胞を細胞構造体に含めて、脈管網構造を形成させるのが好ましい可能性が示された。
　以上に、本発明の実施形態を説明したが、実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨から逸脱しない範囲内で、構成の付加、省略、置換、及びその他の変更が可能である。また、本発明は実施形態によって限定されない。

Claims (12)

  1. 　生体から採取した組織に含まれている細胞をインビトロで初代培養する初代培養方法であって、
    　間質を構成する細胞を含み、単層の又は２以上の細胞層が厚み方向に積層されている細胞構造体の天面に、生体から採取した組織中の細胞を播種し培養する、初代培養方法。
  2. 　前記生体から採取した前記組織の細片化物、前記生体から採取した前記組織の酵素処理物、又は前記生体から採取した前記組織から回収された細胞を、前記細胞構造体の前記天面に播種し培養する、請求項１に記載の初代培養方法。
  3. 　前記細胞構造体が、前記間質を構成する細胞として、線維芽細胞、周皮細胞、内皮細胞、及び免疫細胞からなる群から選択される１種以上を含む、請求項１又は２に記載の初代培養方法。
  4. 　前記内皮細胞が、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞からなる群から選択される１種以上である、請求項３に記載の初代培養方法。
  5. 　前記細胞構造体が、脈管網構造を備える、請求項１～４のいずれか一項に記載の初代培養方法。
  6. 　前記細胞構造体の厚みが５μｍ以上である、請求項１～５のいずれか一項に記載の初代培養方法。
  7. 　前記細胞構造体の厚みが１５０μｍ以上である、請求項１～５のいずれか一項に記載の初代培養方法。
  8. 　前記生体から採取した前記組織が腫瘍組織を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の初代培養方法。
  9. 　前記生体から採取した前記組織を細片化した後、得られた細片化物からがん細胞を選別し、
    　選別された前記がん細胞を、前記細胞構造体の前記天面に播種し培養する、
    　請求項８に記載の初代培養方法。
  10. 　前記細片化物から前記がん細胞を選別する際に、フローサイトメトリー、磁気分離、誘電泳動、サイズ分画、及び密度勾配分画からなる群から選択される１種以上の手法によって前記がん細胞を選別する、請求項９に記載の初代培養方法。
  11. 　カチオン性緩衝液中で、少なくとも間質を構成する細胞を含む細胞と強電解質高分子と細胞外マトリックス成分とを混合して混合物を得る工程（ａ）と、
    　前記工程（ａ）により得られた前記混合物を、細胞培養容器中に播種する工程（ｂ）と、
    　前記工程（ｂ）の後、前記細胞培養容器中に、少なくとも間質を構成する細胞を含む細胞が多層に積層された細胞構造体を得る工程（ｃ）と、により、
    　前記細胞構造体を構築する、
    　請求項１～１０のいずれか一項に記載の初代培養方法。
  12. 　初代培養細胞含有細胞構造体であって、
    　間質を構成する細胞を含み、単層の又は２以上の細胞層が厚み方向に積層されている間質細胞層の天面に生体から採取した組織に含まれている細胞から形成された細胞層を備える、
    　初代培養細胞含有細胞構造体。
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