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WO2025197801A1 - Ｃａｆ化抑制能の評価方法 - Google Patents

Ｃａｆ化抑制能の評価方法

Info

Publication number
WO2025197801A1
WO2025197801A1 PCT/JP2025/009965 JP2025009965W WO2025197801A1 WO 2025197801 A1 WO2025197801 A1 WO 2025197801A1 JP 2025009965 W JP2025009965 W JP 2025009965W WO 2025197801 A1 WO2025197801 A1 WO 2025197801A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cell
cell structure
cancer
evaluating
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2025/009965
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
吏惟 森村
イサナ 近藤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toppan Holdings Inc
Original Assignee
Toppan Holdings Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toppan Holdings Inc filed Critical Toppan Holdings Inc
Publication of WO2025197801A1 publication Critical patent/WO2025197801A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for more reliably evaluating the inhibitory effect on CAF formation in cancer tissues in an in vitro system without using an animal model.
  • the reliability of the evaluation obtained becomes an issue. That is, it is important that the evaluation in the evaluation system reflects the efficacy obtained when the drug is actually administered to a living organism.
  • An evaluation system that has a high probability of matching the evaluation in the evaluation system with the effect obtained when the drug is administered to a living organism is a highly reliable evaluation system.
  • Patent Document 1 discloses a method for producing three-dimensional cellular tissue, including the steps of obtaining a mixture in which cells are suspended in a solution containing at least a cationic buffer solution, an extracellular matrix component, and a strong electrolyte polymer; collecting the cells from the obtained mixture and forming a cell aggregate on a substrate; and culturing the cells to obtain three-dimensional cellular tissue.
  • the three-dimensional cellular tissue can be used, for example, in biological tissue models and solid cancer models, and can be used in various assays such as drug screening.
  • the stroma In the cancer microenvironment (in other words, the environment surrounding cancer cells in the body), the stroma has a significant impact on cancer cells. It has been reported that, particularly in highly malignant cancers, abnormally activated specialized fibroblasts appear in large numbers, and these cells are called “cancer associated fibroblasts (CAFs).” It has also been reported that these CAFs produce various growth factors that promote cancer cell proliferation, and promote angiogenesis, cancer cell proliferation, and invasion (Non-Patent Document 1). Therefore, it is thought that a cancer microenvironment that more closely resembles that found in the body can be created by creating a three-dimensional cellular tissue in which cancer cells and stroma coexist.
  • CAFs cancer associated fibroblasts
  • CAFs have a strong influence on cancer growth and sensitivity to anticancer drugs. Furthermore, in genetically modified T cell therapy (CAR-T cell therapy) using chimeric antigen receptors (CARs) and genetically modified T cell (TCR-T) therapy (TCR-T cell therapy) that introduces T cell receptors, it is essential for CAR-T cells and TCR-T cells to be able to attack cancer cells in order to achieve an anticancer effect, and CAFs function as a physical barrier, such as collagen fibers. Therefore, inhibiting the transformation of fibroblasts in cancer tissue into CAFs is important for achieving greater anticancer effects in anticancer treatment, and there is a need for the development of better agents that inhibit CAF formation.
  • the present invention aims to provide an in vitro method for evaluating the ability to inhibit CAF formation, which allows for more reliable evaluation without using an animal model.
  • the inventors conducted extensive research into various cell culture methods and discovered that by using a cell structure (also known as a three-dimensional cell tissue) containing stromal cells and cancer cells and whose surface has been converted into CAFs, and by using the effect on the anti-cancer effect of immune cells as an indicator, the ability of a compound to inhibit CAF formation can be evaluated, leading to the completion of the present invention.
  • a cell structure also known as a three-dimensional cell tissue
  • a method for evaluating CAF formation inhibitory ability comprising: a CAF formation step of culturing a cell structure containing fibroblasts and cancer cells in a medium containing ascorbic acid or a derivative thereof, TGF- ⁇ , and a compound to be evaluated; a culture step of adding immune cells to the cell structure after the CAF formation step and further culturing the cell structure; and an evaluation step of evaluating the CAF formation inhibitory ability of the compound to be evaluated using the number of live cancer cells in the cell structure after the culture step as an index.
  • a method for evaluating the ability to inhibit CAF formation comprising: [2] The method for evaluating the ability to inhibit CAF formation according to [1], wherein the cell structure is in contact with the culture medium on both the top and bottom surfaces, the cell structure includes a cancer cell layer containing the cancer cells, and the cancer cell layer is located within a range from one-quarter to three-quarters of the height from the bottom surface of the cell structure in the thickness direction. [3] The method for evaluating the ability to suppress CAF formation according to [1] or [2] above, wherein the immune cells are one or more types selected from the group consisting of leukocytes and lymphocytes.
  • the cell structure is (a) mixing cells and extracellular matrix components in a cationic buffer to obtain a mixture; (b) seeding the mixture obtained in step (a) into a cell culture vessel; (c) after the step (b), obtaining a cell structure that is a three-dimensional structure in which cells are stacked in multiple layers in the cell culture vessel; The method for evaluating the CAF formation inhibitory ability of any of [1] to [3] above, wherein the composition is produced by the method. [5] The method for evaluating the ability to suppress formation of CAFs according to any one of [1] to [4] above, wherein the immune cells include CAR-T cells or TCR-T cells.
  • [6] The method for evaluating the ability to suppress CAF formation according to any one of [1] to [5] above, wherein the immune cells include regulatory T cells.
  • [7] The method for evaluating the ability to inhibit CAF formation according to any one of [1] to [6] above, wherein the cell structure comprises multiple cell layers, and the cancer cells are present only in a specific cell layer within the cell structure.
  • [8] The method for evaluating the ability to inhibit CAF formation according to any one of [1] to [7] above, wherein the thickness of the cell structure is 5 ⁇ m or more.
  • [9] The method for evaluating the ability to inhibit CAF formation according to any one of [1] to [8] above, wherein the thickness of the cell structure is 500 ⁇ m or less.
  • the cell structure further comprises one or more cells selected from the group consisting of vascular endothelial cells and lymphatic endothelial cells.
  • the extracellular matrix component is selected from the group consisting of collagen, laminin, fibronectin, vitronectin, elastin, tenascin, entactin, fibrin, proteoglycan, and combinations thereof.
  • the cationic buffer solution further contains a strong electrolyte polymer,
  • the method for evaluating the ability to inhibit CAF formation according to any one of [4] to [11] above, wherein the strong electrolyte polymer is selected from the group consisting of glycosaminoglycan, dextran sulfate, rhamnan sulfate, fucoidan, carrageenan, polystyrene sulfonic acid, polyacrylamide-2-methylpropanesulfonic acid, polyacrylic acid, and combinations thereof.
  • a method for evaluating CAF formation inhibitory ability comprising: The method comprises: a CAF formation step of culturing a cell structure containing fibroblasts and cancer cells in a medium containing ascorbic acid or a derivative thereof, TGF- ⁇ , and a compound to be evaluated; a culture step of adding immune cells to the cell structure after the CAF formation step and further culturing the cell structure; and an evaluation step of evaluating the ability of the compound to be evaluated to inhibit CAF formation using the number of live cancer cells in the cell structure after the culture step as an index,
  • the cell structure is in contact with the medium on both the top and bottom surfaces, the cell structure comprises a cancer cell layer containing the cancer cells, the cancer cell layer is located within a range from one-quarter to three-quarters of the height from the bottom surface of the cell structure in the thickness direction, The ratio of the ascorbic
  • a compound selection method comprising: culturing a cell structure containing fibroblasts and cancer cells in a medium containing ascorbic acid or an ascorbic acid derivative, TGF- ⁇ , and a compound to be evaluated; after culturing the cell structure, adding immune cells to the cell structure and further culturing the cell structure; and counting the number of viable cancer cells in the cell structure after adding the immune cells and culturing the cell structure.
  • the method for evaluating the ability to inhibit CAF formation evaluates the presence or absence and strength of the ability of a compound to inhibit CAF formation using a cell structure that is in a state that is closest to the in vivo state, specifically, a cell structure in which stromal cells, including epithelial cells, and cancer cells coexist and have been converted into CAFs. Therefore, despite being an in vitro evaluation system, highly reliable evaluations can be obtained.
  • FIG. 1 shows the results of measuring the relative cancer cell survival rate (%) for each number of cells seeded in a cell structure converted into CAFs by AscP and TGF- ⁇ 1 (in the figure, "CAF") and a control cell structure not converted into CAFs (in the figure, “CNT”) in Reference Example 1.
  • FIG. 1 shows stained images of sections of a cell structure converted into CAFs by AscP and TGF- ⁇ 1 (in the figure, "CAF") and a control cell structure that was not converted into CAFs (in the figure, "CNT”) in Reference Example 1.
  • Example 1 these are fluorescence images of a cell structure cultured with fluorescently labeled TCR-T cells, taken immediately after the addition of the TCR-T cells ("0 h” in the figure) and 24 hours after the addition and culture ("24 h” in the figure).
  • FIG. 1 shows a blotting image obtained by Western blotting, using an anti- ⁇ -SMA antibody, an anti-collagen antibody, and an anti-GAPDH antibody, on proteins extracted from a cell structure cultured in a medium supplemented with a combination of AscP, TGF- ⁇ 1, and TSA in Example 1.
  • 1 shows images of the results of microscopic observation of cell structures after 7 days of culture in media containing various concentrations of ascorbic acid and TGF- ⁇ in Experimental Example 2.
  • 10 shows images of hematoxylin-eosin stained cell structures obtained by microscopic observation after 4 days and 7 days of culture in each medium in Experimental Example 2.
  • 1 is a graph showing the thickness of cell structures after 4 days and 7 days of culture in each medium in Experimental Example 2.
  • 10 shows images of the results of microscopic observation of cell structures stained with Sirius Red-saturated picric acid after 4 days and 7 days of culture in each medium in Experimental Example 2.
  • 1 is a graph showing the PSR ratio after 4 days and 7 days of culture in media containing various concentrations of ascorbic acid and TGF- ⁇ in Experimental Example 2.
  • 10 shows images of the results of microscopic observation of cell structures stained with Sirius Red and saturated picric acid after 4 days and 7 days of culture in each medium in Experimental Example 3.
  • a “cell structure” is a three-dimensional structure in which multiple cell layers are stacked.
  • a “cell layer” is a layer composed of a group of cells and stroma that exist in a direction perpendicular to the thickness direction and in which the cell nuclei do not overlap in the thickness direction when observed at a magnification at which cell nuclei can be recognized in a slice image of a cross section of the cell structure in the thickness direction, that is, a magnification at which the entire thickness of the stained slice is visible.
  • “layered” means that two or more different cell layers are stacked in the thickness direction.
  • the “thickness of the cell structure” is the length of the cell structure in the direction of its own weight.
  • the direction of gravity is the direction in which gravity is applied, and is also referred to as the thickness direction.
  • a method for evaluating the ability to inhibit CAF formation according to one embodiment of the present invention involves culturing a cell structure simulating a cancer microenvironment in a medium containing immune cells, a CAF-forming agent, and a target compound (hereinafter sometimes referred to as the "target compound") for evaluation of its ability to inhibit CAF formation, and evaluating the presence or strength of the compound's ability to inhibit CAF formation using as an indicator the cytotoxicity of the immune cells against cancer cells in the cell structure.
  • this evaluation method is a method for evaluating the ability to inhibit CAF formation, and includes a CAF formation step in which a cell structure containing fibroblasts and cancer cells is cultured in a medium containing ascorbic acid or a derivative thereof, TGF- ⁇ , and the target compound; a culture step in which immune cells are added to the cell structure after the CAF formation step and further cultured; and an evaluation step in which the target compound's ability to inhibit CAF formation is evaluated using as an indicator the number of viable cancer cells in the cell structure after the culture step.
  • cancer cells exist surrounded by the interstitium that supports them. Therefore, in order for immune cells to attack cancer cells, the immune cells must infiltrate the interstitium and reach the cancer cells.
  • the extracellular matrix such as collagen fibers
  • the strength of the cytotoxicity of immune cells against cancer cells within the cell structure can be used as an index of the degree of CAF formation in the cell structure.
  • the evaluation method according to this embodiment utilizes this cytotoxicity by immune cells as an index of CAF formation.
  • CAF transformation refers to a state in which ⁇ -SMA ( ⁇ -smooth muscle actin) is expressed or extracellular matrix such as fibronectin and collagen is excessively expressed. Whether fibroblasts have transformed into CAFs can be determined by immunostaining or other methods when there is an excess of extracellular matrix compared to the surrounding fibroblasts.
  • ⁇ -SMA smooth muscle actin
  • Markers such as ⁇ -SMA/ACTA2, COL1, FN1, FAP, MFAP5, COL11A1, TN-C, PDPN, ITGA11, NG2, PDGFR ⁇ / ⁇ , VIM, FSP-1/S100A4, POSTN, EPCAM, CALD1, SMTN, PTPRC, PECAM1, CD70, Vimentin, GPR77, CD10, CD36, CD74, CD146, CAV1, Saa3, P4H, ASPN, OGN, ZEB1, MCT4/SLC16A4, SPARC, MMPs, FOXF1, CAV1, and PTRF can be used to confirm whether fibroblasts have become CAFs by immunostaining.
  • the expression levels of the above-mentioned markers are confirmed and compared with the expression levels of the same markers in cells that have not become CAFs, and if the expression levels of the markers are increased or suppressed, the fibroblasts are determined to have become CAFs.
  • markers whose expression levels increase upon CAF formation include ⁇ -SMA/ACTA2, COL1, FN1, FAP, MFAP5, COL11A1, TN-C, PDPN, ITGA11, NG2, PDGFR ⁇ / ⁇ , VIM, FSP-1/S100A4, POSTN, CD70, Vimentin, GPR77, CD10, CD74, CD146, P4H, ASPN, OGN, ZEB1, MCT4/SLC16A4, SPARC, MMPs, FOXF1, and CAV1.
  • Markers whose expression levels are suppressed upon conversion to CAF include, for example, EPCAM, CALD1, SMTN, PTPRC, PECAM1, Saa3, CD36, CAV1, and PTRF.
  • the cell structure used in the evaluation method according to this embodiment is a cell structure that mimics a cancer microenvironment. Specifically, it is a cell structure that includes fibroblasts and cancer cells. Fibroblasts are the main cells that make up the stroma of cancer tissue and correspond to precursor cells of CAFs.
  • the fibroblasts contained in the cell structure used in this embodiment may be cells derived from any tissue. Examples of such fibroblasts include skin fibroblasts, lung fibroblasts, and cardiac fibroblasts. Furthermore, the fibroblasts contained in the cell structure used in this embodiment may be of one type, or two or more types.
  • the proportion of fibroblasts contained in the cell structure of this embodiment is preferably 10.0% or more, more preferably 20.0% or more, even more preferably 30.0% or more, and even more preferably 40.0% or more, relative to the total number of cells constituting the cell structure.
  • the proportion of fibroblasts contained in the cell structure of this embodiment is preferably 99.9% or less, more preferably 99.0% or less, and even more preferably 90.0% or less.
  • the cell structure used in this embodiment may contain cells other than fibroblasts that make up the interstitium (also referred to as interstitial cells).
  • interstitial cells include endothelial cells, neurons, mast cells, epithelial cells, cardiomyocytes, hepatocytes, pancreatic islet cells, tissue stem cells, and smooth muscle cells.
  • the interstitial cells other than fibroblasts contained in the cell structure used in this embodiment may be of one type, or of two or more types.
  • the type of interstitial cells contained in the cell structure used in this embodiment is not particularly limited, and can be selected appropriately taking into consideration the origin and type of cancer cells to be contained, the type of immune cells to be used for evaluation, the type of CAF formation inhibitor to be used for evaluation, or the in vivo environment in which the desired CAF formation inhibitory activity is exerted.
  • the cell structure used in this embodiment preferably has a vascular network structure.
  • the cell structure used in this embodiment preferably has a three-dimensional vascular network structure, such as lymphatic vessels and/or blood vessels, constructed in at least a portion of its interior, thereby constructing tissue that is closer to that found in a living organism.
  • the vascular network structure may be formed only inside the cell structure, or may be formed so that at least a portion of the vascular network structure is exposed on the surface or bottom of the cell structure.
  • the term "vascular network structure” refers to a network structure, such as a blood vessel network or lymphatic vessel network in biological tissue.
  • a vascular network structure can be formed by including endothelial cells, which form blood vessels, as interstitial cells.
  • the endothelial cells contained in the cell structure used in this embodiment may be vascular endothelial cells or lymphatic endothelial cells.
  • the cell structure may also contain both vascular endothelial cells and lymphatic endothelial cells.
  • the endothelial cells contained in the cell structure may be cells derived from the same biological species as the fibroblasts, or may be cells derived from a different biological species.
  • the number of endothelial cells in the cell structure is preferably sufficient to form a vascular network structure, and can be determined appropriately taking into account the size of the cell structure, the type of endothelial cells and cells other than endothelial cells, etc.
  • a cell structure having a vascular network structure can be prepared by setting the abundance ratio (cell number ratio) of endothelial cells to the total cells that make up the cell structure used in this embodiment to 0.1% or more.
  • the number of endothelial cells in the cell structure used in this embodiment is preferably 0.1% or more of the number of fibroblasts contained in the cell structure, and more preferably 0.1 to 5.0%.
  • the total number of vascular endothelial cells and lymphatic endothelial cells is preferably 0.1% or more of the number of fibroblasts, and more preferably 0.1 to 5.0%.
  • the cell structure used in this embodiment further includes cancer cells.
  • the cancer cells contained in the cell structure used in this embodiment may be one type or two or more types. Cancer cells are cells that are derived from somatic cells and have acquired the ability to proliferate indefinitely.
  • the cancer cells contained in the cell structure used in this embodiment may be established cultured cell lines, or cancer cells collected from a cancer patient. Cancer cells collected from a cancer patient may be cells that have been cultured and grown in advance. Specific examples include primary cancer cells collected from a cancer patient, artificially cultured cancer cells, iPS cancer stem cells, cancer stem cells, and established cancer cell lines prepared in advance for use in cancer treatment research and anticancer drug development. Cancer cells may also be derived from humans or from animals other than humans. When the cell structure used in this embodiment includes cancer cells collected from a cancer patient, it may also contain cells other than cancer cells collected from the cancer patient. Examples of cells other than cancer cells include one or more types of cells contained in solid tissue removed after surgery.
  • Cancers from which the cancer cells contained in the cell structure used in this embodiment are derived include, for example, breast cancer (e.g., invasive ductal carcinoma, ductal carcinoma in situ, and inflammatory breast cancer, etc.), prostate cancer (e.g., hormone-dependent prostate cancer and hormone-independent prostate cancer, etc.), pancreatic cancer (e.g., pancreatic ductal carcinoma, etc.), gastric cancer (e.g., papillary adenocarcinoma, mucinous adenocarcinoma, and adenosquamous carcinoma, etc.), lung cancer (e.g., non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, and malignant mesothelioma, etc.), colon cancer (e.g., gastrointestinal stromal tumor, etc.), rectal cancer ( gastrointestinal stromal tumors, etc.), colon cancer (e.g., familial colorectal cancer, hereditary non-polyposis colorectal cancer, and gastrointestinal stromal tumor
  • the proportion of cancer cells contained in the cell structure used in this embodiment is preferably 0.01% or more, more preferably 0.05% or more, and even more preferably 0.1% or more, relative to the total number of cells constituting the cell structure.
  • the number of cancer cells in the cell structure is not particularly limited, but in order to more closely resemble the cancer microenvironment in a living body, it is preferable that the ratio of the number of endothelial cells to the number of cancer cells in the cell structure ([number of endothelial cells]/[number of cancer cells]) be greater than 0 (greater than 0) and 50 or less.
  • the cell structure used in this embodiment may be one in which cancer cells are scattered throughout the structure, or one in which cancer cells are present only in a specific cell layer.
  • the cell layer containing these cancer cells (also referred to as the cancer cell layer) is preferably located outside the surface of the cell structure, and more preferably away from the surface.
  • the cancer cell layer is preferably located within a range from the bottom surface (lower surface) of the structure to half the height in the thickness direction, and more preferably within a range from the bottom surface (lower surface) of the structure to one-quarter the height in the thickness direction.
  • the cancer cell layer is preferably located within a range from one-quarter to three-quarters the height in the thickness direction from the bottom surface (lower surface) of the structure. If the distance from the surface of the cell structure to the cancer cell layer is sufficient, the degree of CAF formation on the surface of the cell structure, in other words, the difference in the ease of infiltration of immune cells, can be reflected by the survival rate of cancer cells within the cell structure.
  • the cell structure used in this embodiment may contain cells other than cancer cells and stromal cells.
  • examples of other cells include immune cells, nerve cells, liver cells, pancreatic cells, cardiac muscle cells, smooth muscle cells, bone cells, alveolar epithelial cells, and spleen cells.
  • the cells, including fibroblasts and cancer cells, that make up the cell structure used in this embodiment are not particularly limited and may be cells collected from an animal, cultured cells collected from an animal, cells obtained by subjecting cells collected from an animal to various treatments, or cultured cell lines.
  • the site of collection is not particularly limited and they may be somatic cells derived from bone, muscle, internal organs, nerves, brain, bone, skin, or blood, or may be germ cells or embryonic stem cells (ES cells).
  • the biological species from which the cells that make up the cell structure of this embodiment are derived is not particularly limited. For example, cells derived from animals such as humans, monkeys, dogs, cats, rabbits, pigs, cows, mice, and rats can be used.
  • Cultured cells collected from animals may be primary cultured cells or subcultured cells. Examples of cells that have been subjected to various treatments include induced pluripotent stem cells (iPS cells) and cells after differentiation induction. Furthermore, the cell structure of this embodiment may be composed solely of cells derived from the same biological species, or may be composed of cells derived from multiple biological species.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • the cell structure of this embodiment may be composed solely of cells derived from the same biological species, or may be composed of cells derived from multiple biological species.
  • the size and shape of the cell structure used in this embodiment are not particularly limited. Because this allows for the formation of a vascular network structure more similar to the blood vessels formed in tissues in vivo and enables more accurate evaluation, the thickness of the cell structure is preferably 5 ⁇ m or more, more preferably 10 ⁇ m or more, even more preferably 50 ⁇ m or more, and even more preferably 100 ⁇ m or more. The thickness of the cell structure is also preferably 500 ⁇ m or less, more preferably 400 ⁇ m or less, and even more preferably 300 ⁇ m or less.
  • the number of cell layers in the cell structure used in this embodiment is preferably approximately 2 to 60 layers, more preferably approximately 5 to 60 layers, and even more preferably approximately 10 to 60 layers.
  • the number of cell layers that make up a cell structure is measured by dividing the total number of cells that make up the three-dimensional structure by the number of cells per layer (the number of cells required to make up one layer).
  • the number of cells per layer can be determined by culturing cells confluently in advance in a planar manner in the cell culture vessel that will be used to make the cell structure. Specifically, the number of cell layers in a cell structure formed in a certain cell culture vessel can be calculated by counting the total number of cells that make up the cell structure and dividing this by the number of cells per layer in the cell culture vessel.
  • the cell structures used in this embodiment are constructed in a cell culture vessel.
  • the cell culture vessel There are no particular limitations on the cell culture vessel, as long as it is possible to construct a cell structure and to culture the constructed cell structure.
  • Specific examples of the cell culture vessel include dishes, cell culture inserts (e.g., Transwell (registered trademark) inserts, Netwell (registered trademark) inserts, Falcon (registered trademark) cell culture inserts, Millicell (registered trademark) cell culture inserts, etc.), tubes, flasks, bottles, and plates.
  • dish or various cell culture inserts are preferred, as this allows for more appropriate evaluation using the cell structures.
  • the cell structure used in this embodiment may be a structure formed from multiple cell layers containing stromal cells, including fibroblasts, and cancer cells, and the method for constructing the cell structure is not particularly limited. For example, it may be constructed by sequentially stacking layers one by one, or it may be constructed by simultaneously stacking two or more cell layers, or it may be constructed by appropriately combining both construction methods to construct multiple cell layers. Furthermore, the cell structure used in this embodiment may be a multi-layer structure in which each cell layer is composed of a different cell type, or the cell type constituting each cell layer may be the same for all layers of the structure.
  • it may be constructed by forming layers for each cell type and sequentially stacking the cell layers for each cell type, or it may be constructed by previously preparing a cell mixture containing multiple types of cells and simultaneously constructing a multi-layered cell structure from the previously prepared cell mixture containing multiple types of cells.
  • An example of a method for constructing cells layer by layer and layering them sequentially is the method described in Japanese Patent No. 4919464, which involves alternately repeating the steps of forming a cell layer and contacting the formed cell layer with a solution containing ECM (extracellular matrix) components to continuously layer cell layers.
  • ECM extracellular matrix
  • a cell mixture is prepared in advance by mixing all of the cells that make up the cell structure, and each cell layer is formed using this cell mixture. This allows for the construction of a cell structure in which a vascular network structure is formed throughout the structure and cancer cells are scattered throughout the structure.
  • a cell structure can be constructed in which a vascular network structure is formed only in the layer formed from endothelial cells and cancer cells are present only in specific cell layers.
  • An example of a method for constructing two or more cell layers at once is the method described in Japanese Patent No. 5850419.
  • the entire surface of a cell is first coated with a polymer containing an arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequence to which integrins bind, and a polymer that interacts with the RGD sequence-containing polymer.
  • the coated cells, coated with this adhesive film are then placed in a cell culture vessel and the coated cells are allowed to accumulate by centrifugation or other methods, thereby constructing a cell structure formed from multiple cell layers.
  • a cell mixture is prepared in advance by mixing all the cells that make up the cell structure, and an adhesive component is added to this cell mixture to prepare the coated cells.
  • coated cells coating endothelial cells, coated cells coating fibroblasts, and coated cells coating a group of cells collected from a cancer patient can be separately prepared, and after forming multiple layers composed of coated fibroblast cells, a single layer formed from coated endothelial cells can be layered on top of that, and multiple layers formed from coated fibroblast cells can be layered on top of that, and a single layer formed from coated cells containing cancer cells can be layered on top of that.
  • the cell structure used in this embodiment can also be constructed by a method comprising the following steps (a) to (c). (a) mixing cells and extracellular matrix components in a cationic buffer to obtain a mixture; (b) seeding the mixture obtained in step (a) into a cell culture vessel; and (c) obtaining, after step (b), a cell structure in which cells are stacked in multiple layers in the cell culture vessel.
  • step (a) cells are mixed with a buffer solution containing a cationic substance (also referred to as a cationic buffer) and extracellular matrix components, and cell aggregates are formed from this cell mixture, thereby obtaining a three-dimensional cell tissue with few large internal voids. Furthermore, the obtained three-dimensional cell tissue is relatively stable, allowing it to be cultured for at least several days, and the tissue is less likely to collapse even when the culture medium is changed. Furthermore, in this embodiment, step (b) may include allowing the cell mixture seeded in the cell culture vessel to settle within the cell culture vessel. The cell mixture may be sedimented actively by centrifugation or the like, or it may be allowed to settle naturally.
  • a buffer solution containing a cationic substance also referred to as a cationic buffer
  • step (b) may include allowing the cell mixture seeded in the cell culture vessel to settle within the cell culture vessel. The cell mixture may be sedimented actively by centrifugation or the like, or it may be allowed to settle naturally.
  • step (a) it is preferable to further mix the cells with a strong electrolyte polymer.
  • a strong electrolyte polymer By mixing the cells with a cationic substance, a strong electrolyte polymer, and an extracellular matrix component, a thick, three-dimensional cell tissue with few voids can be obtained even when the cells are allowed to settle naturally, without the need for a process such as centrifugation to actively aggregate the cells in step (b).
  • the cationic buffer examples include Tris-HCl buffer, Tris-maleate buffer, Bis-Tris buffer, and HEPES.
  • concentration and pH of the cationic substance (e.g., Tris in Tris-HCl buffer) in the cationic buffer are not particularly limited, as long as they do not adversely affect cell growth and the construction of cell structures.
  • concentration of the cationic substance in the cationic buffer can be 10 to 100 mM, preferably 40 to 70 mM, and more preferably 50 mM.
  • the pH of the cationic buffer can be 6.0 to 8.0, preferably 6.8 to 7.8, and more preferably 7.2 to 7.6.
  • the strong electrolyte polymer examples include, but are not limited to, glycosaminoglycans such as heparin, chondroitin sulfate (e.g., chondroitin 4-sulfate and chondroitin 6-sulfate), heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, and hyaluronic acid; dextran sulfate, rhamnan sulfate, fucoidan, carrageenan, polystyrene sulfonic acid, polyacrylamide-2-methylpropanesulfonic acid, and polyacrylic acid, or derivatives thereof.
  • glycosaminoglycans such as heparin, chondroitin sulfate (e.g., chondroitin 4-sulfate and chondroitin 6-sulfate), heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulf
  • the mixture prepared in step (a) may contain only one type of strong electrolyte polymer, or a combination of two or more types.
  • the strong electrolyte polymer is preferably a glycosaminoglycan. It is more preferable to use at least one of heparin, dextran sulfate, chondroitin sulfate, and dermatan sulfate. It is even more preferable that the strong electrolyte polymer used in this embodiment is heparin.
  • the amount of the strong electrolyte polymer to be mixed with the cationic buffer solution is not particularly limited as long as it does not adversely affect cell growth and the construction of cell structures.
  • the concentration of the strong electrolyte polymer in the cationic buffer solution can be greater than 0 mg/mL (higher than 0 mg/mL) and less than 1.0 mg/mL, preferably 0.025 to 0.1 mg/mL, and more preferably 0.05 to 0.1 mg/mL.
  • the mixture can be prepared without adding the strong electrolyte polymer, and then cell structures can be constructed.
  • extracellular matrix components examples include collagen, laminin, fibronectin, vitronectin, elastin, tenascin, entactin, fibrin, proteoglycans, or modified or variant forms thereof.
  • proteoglycans include chondroitin sulfate proteoglycans, heparan sulfate proteoglycans, keratan sulfate proteoglycans, and dermatan sulfate proteoglycans.
  • the mixture prepared in step (a) may contain only one type of extracellular matrix component, or two or more types in combination. In constructing the cell structure used in this embodiment, collagen, laminin, and fibronectin are preferably used, and collagen is more preferred.
  • the amount of extracellular matrix component to be mixed with the cationic buffer solution is not particularly limited, as long as it does not adversely affect cell growth and cell structure formation.
  • the concentration of the extracellular matrix component in the cationic buffer can be greater than 0 mg/mL (greater than 0 mg/mL) and less than 1.0 mg/mL, preferably 0.025 to 0.1 mg/mL, and more preferably 0.05 to 0.1 mg/mL.
  • the blending ratio of the strong electrolyte polymer to the extracellular matrix component mixed with the cationic buffer solution is 1:2 to 2:1.
  • the blending ratio of the strong electrolyte polymer to the extracellular matrix component is preferably 1:1.5 to 1.5:1, and more preferably 1:1.
  • step (c) By repeating steps (a) to (c), specifically by seeding the mixture prepared in step (a) on the cell structure obtained in step (c) as step (b), and then repeating step (c), a cell structure of sufficient thickness can be constructed.
  • the cell composition of the mixture newly seeded on the cell structure obtained in step (c) may be the same as or different from the cell composition that constitutes the cell structure already constructed.
  • step (a) a mixture containing only fibroblasts as cells is prepared, and steps (b) and (c) are performed to obtain a cell structure formed from 10 fibroblast layers in a cell culture vessel.
  • step (a) a mixture containing only vascular endothelial cells as cells is prepared, and steps (b) and (c) are performed to layer one vascular endothelial cell layer on the fibroblast layer in the cell culture vessel.
  • step (a) a mixture containing only fibroblasts as cells is prepared, and steps (b) and (c) are performed to layer 10 fibroblast layers on the vascular endothelial cell layer in the cell culture vessel.
  • step (a) a mixture containing cancer cells collected from a cancer patient is prepared, and steps (b) and (c) are performed to layer one cancer cell layer on the fibroblast layer in the cell culture vessel.
  • steps (b) and (c) are performed to layer one cancer cell layer on the fibroblast layer in the cell culture vessel.
  • This allows the construction of a cell structure in which layers are layered in order by cell type: 10 fibroblast layers - 1 vascular endothelial cell layer - 10 fibroblast layers - 1 cancer cell layer.
  • the thickness of the cell layer laminated in step (c) can be adjusted. The greater the number of cells seeded in step (b), the greater the number of cell layers laminated in step (c).
  • step (a) a mixture of fibroblasts for 20 fibroblast layers and vascular endothelial cells for one vascular endothelial cell layer is prepared, and steps (b) and (c) are performed.
  • a similarly prepared mixture containing cancer cells collected from a cancer patient is then laminated on the resulting multilayer structure, thereby constructing a cell structure having a thickness of 21 layers and in which cancer cell layers are laminated on a structure with a vascular network structure scattered throughout the structure.
  • step (a) a mixture is prepared by mixing fibroblasts equivalent to 20 fibroblast layers, vascular endothelial cells equivalent to one vascular endothelial cell layer, and cells derived from a cancer patient equivalent to one cancer cell layer, and steps (b) and (c) are then performed to construct a cell structure having a thickness of 22 layers, in which both cancer cells and a vascular network structure are independently dispersed within the structure.
  • the resulting cell structure may be cultured after step (c) and before step (b).
  • Culture conditions such as the composition of the culture medium used for culture, culture temperature, culture time, and atmospheric composition during culture, should be set to conditions suitable for culturing the cells that make up the cell structure. Examples of culture media include D-MEM, E-MEM, MEM ⁇ , RPMI-1640, and Ham's F-12.
  • step (a) After step (a), (a'-1) the liquid portion is removed from the resulting mixture to obtain cell aggregates, and (a'-2) the cell aggregates are suspended in a solution, and then step (b) can be carried out. While the desired tissue can be obtained by carrying out steps (a) to (c) above, a more homogeneous tissue can be obtained by carrying out (a'-1) and (a'-2) after step (a) and then carrying out step (b).
  • step (b) the following steps (b'-1) and (b'-2) may be performed instead of step (b).
  • a more homogeneous tissue can also be obtained by performing steps (b'-1) and (b'-2).
  • step (b'-2) may also include allowing the cell mixture seeded in the cell culture vessel to settle within the cell culture vessel.
  • the cell mixture may be sedimented actively by centrifugation or the like, or may be allowed to settle naturally.
  • the term "cellular viscous body" refers to a gel-like cell aggregate as described in Non-Patent Document 4.
  • step (b'-1) A step of seeding the mixture obtained in step (a) into a cell culture vessel, and then removing the liquid component from the mixture to obtain a viscous cell mass.
  • step (b'-2) A step of suspending the viscous cell mass in a solvent in a cell culture vessel.
  • the solvent for preparing the cell suspension is not particularly limited as long as it is non-toxic to cells and does not impair their proliferation or function, and water, buffer solutions, cell culture media, etc. can be used.
  • buffer solutions include phosphate-buffered saline (PBS), HEPES, and Hanks' buffer solution.
  • culture media include D-MEM, E-MEM, MEM ⁇ , RPMI-1640, and Ham's F-12.
  • step (c) A step of forming a layer of cells on a substrate.
  • liquid components may be removed from the seeded mixture.
  • the method for removing liquid components in steps (c) and (c') is not particularly limited, as long as it does not adversely affect cell growth or the construction of cell structures, and can be any method known to those skilled in the art for removing liquid components from a suspension of liquid and solid components. Examples of such methods include aspiration, centrifugation, magnetic separation, and filtration. For example, when a cell culture insert is used as the cell culture vessel, the cell culture insert seeded with the mixture can be centrifuged at 10°C and 400 x g for 1 minute, causing the cell mixture to settle, and the liquid components can then be removed by aspiration.
  • the CAF formation step involves culturing the cell structure in a medium containing ascorbic acid or a derivative thereof (i.e., an ascorbic acid derivative), TGF- ⁇ , and a compound to be evaluated. After the CAF formation step, immune cells are added to the cell structure and further cultured.
  • ascorbic acid or a derivative thereof and TGF- ⁇ are CAF-forming agents that induce the formation of CAFs in fibroblasts in the cell structure.
  • the ascorbic acid or a derivative thereof and TGF- ⁇ used in the evaluation method according to this embodiment may be chemically synthesized products, or may be purified products produced by microorganisms or the like.
  • Immune cells are cells involved in immunity. Specific examples include lymphocytes, macrophages, and dendritic cells. Lymphocytes include T cells, B cells, NK cells, and plasma cells.
  • the immune cells used in the evaluation method according to this embodiment may be of one type, or two or more types.
  • the immune cells used in this embodiment are not particularly limited as long as they are immune cells, but cells that are actually present in the vicinity of the cancer microenvironment and are involved in the mechanism of attacking cancer cells through an immune response are preferred.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells in plasma
  • PBMCs include lymphocytes and monocytes.
  • Monocytes include macrophages.
  • Lymphocytes include NK cells, B cells, and T cells.
  • PBMCs may be isolated and purified from blood, but buffy coats prepared from blood can also be used as is.
  • Buffy coats contain PBMCs along with other components. Buffy coats can be prepared from blood by standard methods such as centrifugation.
  • Immune cells may have multiple types, such as ABO blood types, that contain the same components but have slightly different properties.
  • any one type of immune cell may be used, or multiple types of immune cells may be used in combination, as needed.
  • the immune cells used in the evaluation method according to this embodiment may be immune cells collected from a living body, a cultured cell line, or cells artificially altered or modified ex vivo.
  • immune cells collected from a cancer patient it is preferable to use immune cells isolated from the peripheral blood or tumor site of the cancer patient, particularly PBMCs.
  • artificially altered or modified immune cells are preferably immune cells whose immune function has been artificially altered to enhance anti-cancer activity. Examples of such immune cells with altered immune function include modified T cells used in CAR-T cell therapy (CAR-T cells) and modified T cells used in TCR-T cell therapy (TCR-T cells).
  • the cell structure is first cultured in a culture medium containing a mixture of ascorbic acid or a derivative thereof, TGF- ⁇ , and a target compound.
  • the culture medium can be the same as the one used to produce the cell structure.
  • Ascorbic acid, TGF- ⁇ , and the target compound may be added simultaneously or separately to the medium in which the cell structure is cultured.
  • Ascorbic acid is an organic compound with a lactone structure, known as vitamin C, a water-soluble vitamin. Ascorbic acid is an optically active compound and exists in both L and D forms, with the L form being preferred. It is the L form that is known as vitamin C. Ascorbic acid may be an ascorbate salt or an ascorbic acid derivative. Examples of ascorbate salts include sodium ascorbate, potassium ascorbate, and calcium ascorbate. Examples of ascorbic acid derivatives include magnesium ascorbyl phosphate, sodium ascorbyl phosphate, and ascorbic acid 2-glucoside.
  • the amounts of ascorbic acid or its derivatives, TGF- ⁇ , and target compound to be mixed into the culture medium can each be determined experimentally, taking into consideration conditions such as the type and number of cells that make up the cell structure, the type and amount of cancer cells contained therein, the type of culture medium, the culture temperature, or the culture time.
  • the amount of immune cells to be mixed into the culture medium can also be determined experimentally, taking into consideration the type and number of cells that make up the cell structure, the type and amount of cancer cells contained therein, the type of culture medium, the culture temperature, or the culture time.
  • the concentration of ascorbic acid in the culture medium is not particularly limited, as long as the thickness of the three-dimensional cell tissue can be made to exceed 50 ⁇ m for at least three days after culture in a culture medium containing ascorbic acid and TGF- ⁇ . It may be 0.02 mM or more and 0.7 mM or less, 0.02 mM or more and 0.5 mM or less, 0.02 mM or more and 0.3 mM or less, 0.02 mM or more and 0.1 mM or less, or 0.05 mM or more and 0.7 mM or less relative to the total volume of the culture medium.
  • It may be 0.05 mM or less, 0.05 mM to 0.5 mM, 0.05 mM to 0.3 mM, 0.05 mM to 0.1 mM, 0.07 mM to 1 mM, 0.07 mM to 0.7 mM, 0.07 mM to 0.5 mM, 0.07 mM to 0.3 mM, or 0.07 mM to 0.1 mM.
  • TGF- ⁇ (transforming growth factor- ⁇ ) is a cytokine belonging to the TGF- ⁇ family, and three isoforms exist in mammals (specifically, TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2, and TGF- ⁇ 3).
  • TGF- ⁇ plays an important role in cell proliferation, cell death, cell differentiation, immune regulation, cell motility, and other processes.
  • TGF- ⁇ may be any of TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2, and TGF- ⁇ 3.
  • the concentration of TGF- ⁇ in the medium is not particularly limited, as long as it allows the thickness of the three-dimensional cell tissue to exceed 50 ⁇ m for at least three days after culture in a medium containing ascorbic acid and TGF- ⁇ , and may be 0.05 ng/mL to 15 ng/mL, 0.05 ng/mL to 12 ng/mL, 0.05 ng/mL to 10 ng/mL, or 0.05 ng/mL to 7 ng/mL.
  • it may be 0.05 ng/mL or more and 5 ng/mL or less, 0.07 ng/mL or more and 15 ng/mL or less, 0.07 ng/mL or more and 12 ng/mL or less, 0.07 ng/mL or more and 10 ng/mL or less, 0.07 ng/mL or more and 7 ng/mL or less, 0.07 ng/mL or more and 5 ng/mL or less, or 0.1 ng/mL or more and 15 ng/mL or less.
  • the culture time for culturing the cell structure in a medium containing ascorbic acid or a derivative thereof, TGF- ⁇ , and a target compound may be long enough to convert the fibroblasts in the cell structure into CAFs, and may be, for example, 24 to 96 hours, preferably 48 to 96 hours, and more preferably 48 to 72 hours. Furthermore, hydrodynamic stress such as reflux can be applied as needed, as long as it does not significantly change the culture environment.
  • immune cells are added to the cell structure and cultured. Addition of immune cells to the cell structure is preferably carried out by replacing the culture medium with new culture medium containing immune cells.
  • the culture time after adding immune cells is not particularly limited, and can be, for example, 24 to 96 hours, preferably 48 to 96 hours, and more preferably 48 to 72 hours.
  • hydrodynamic stress such as reflux can be applied as needed, as long as it does not significantly change the culture environment.
  • CAFs include the application of TGF- ⁇ family ligands, lipid mediator lysophosphotidic acid, inflammatory cytokines (IL-1, IL-6, TNF), contact with cancer cells (Notch signaling), and physiological stress.
  • Administering ascorbic acid or a derivative thereof and TGF- ⁇ is more preferable as a method for forming CAFs, as this allows the thickness of the cell structure to be maintained for a long period of time.
  • ⁇ Evaluation process> The ability of a target compound to inhibit CAF formation is evaluated using as an index the number of viable cancer cells in the cell structure after the step of adding immune cells to the cell structure and culturing it.
  • a target compound has the ability to inhibit CAF formation
  • the amount of CAFs in the cell structure is lower than when cultured in a medium not containing the target compound, making it easier for immune cells to infiltrate, and therefore the number of surviving cancer cells is lower.
  • the higher the ability of a target compound to inhibit CAF formation the lower the number of surviving cancer cells.
  • the number of surviving cancer cells when cultured in a medium containing the target compound is similar to that when cultured in a medium not containing the target compound.
  • the target compound is evaluated as having the ability to inhibit CAF formation; if the number of surviving cancer cells is the same or higher, the target compound is evaluated as not having the ability to inhibit CAF formation.
  • the compound with a lower number of surviving cancer cells is evaluated as having a higher ability to inhibit CAF formation.
  • the number of viable cancer cells in a cell structure can be evaluated using a signal correlated with the number of viable cancer cells or the amount of viable cancer cells present. It is sufficient to be able to measure the number of viable cancer cells at the time of evaluation; it is not necessary to measure them while they are still alive.
  • cancer cells can be labeled to distinguish them from other cells, and the signal from the label can be used as an indicator for examination. For example, by fluorescently labeling cancer cells and then assessing their viability, it is possible to directly count the viable cancer cells in the cell structure. Image analysis techniques can also be used in this case. Cell viability can be assessed using known cell viability assessment methods such as trypan blue staining and PI (propidium iodide) staining.
  • Fluorescent labeling of cancer cells can be performed using known techniques, such as immunostaining, which uses an antibody against a substance specifically expressed on the cell surface of cancer cells as a primary antibody and a fluorescently labeled secondary antibody that specifically binds to the primary antibody.
  • Cell viability assessment and viable cell count measurement can be performed in the cell structure, or after the cell structure has been disrupted to the single-cell level. For example, after labeling cancer cells and dead cells and destroying the three-dimensional structure of the cell structure, it is possible to directly count only the cancer cells that were alive at the time of evaluation using FACS (fluorescence activated cell sorting) using the label as an indicator.
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • the number of viable cancer cells in the cell structure can also be measured over time.
  • Cancer cells in the cell structure can be labeled after the cell structure is constructed, or they can be labeled in advance before the cell structure is constructed.
  • the cancer cells can be labeled in advance before the cell structure is constructed.
  • Other cells derived from the cancer patient may also be similarly labeled along with the cancer cells.
  • the number of viable cancer cells can also be assessed by measuring the fluorescence intensity of the lysate obtained by lysing the cell structure using a microplate reader, etc.
  • the evaluation method according to this embodiment uses a cell structure with a stroma similar to the structure of the tissue surrounding cancer cells in an actual living organism, and performs evaluation in vitro in an environment closer to that of in vivo, thereby enabling a highly reliable evaluation of the target compound's ability to inhibit CAF formation.
  • Compounds evaluated as having CAF formation inhibitory ability using the evaluation method according to this embodiment are expected to exhibit sufficient CAF formation inhibitory ability when actually administered to cancer patients, and to achieve even greater therapeutic effects when combined with cancer immunotherapy or anticancer drug treatment.
  • the evaluation method according to this embodiment can be used as an unprecedented in vitro drug efficacy evaluation tool in screening candidate CAF formation inhibitor compounds and drug repositioning screening in drug discovery settings, and in selecting and determining anticancer drug treatments (single agents and combination agents) in clinical settings (anticancer drug sensitivity testing).
  • Immunotherapeutic agents are drugs that achieve anti-cancer effects by improving immune function, such as by activating the immune function or motility of immune cells.
  • immunotherapeutic agents include drugs used in biological response modifier therapy (hereinafter abbreviated as "BRM agents"), cytokine-based agents formed from cytokines secreted by immune cells and involved in migration and infiltration, cancer immune checkpoint inhibitors, cancer vaccines, and cancer viruses, which have attracted attention in recent years.
  • BRM agents include krestin, lentinan, and OK-432.
  • cytokine-based agents include interleukins such as IL-8 and IL-2; interferons such as IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , and IFN- ⁇ ; and chemokines such as CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL16/CXCR6, and CX3CL1/CX3CR1.
  • the compound selection method includes culturing a cell structure containing fibroblasts and cancer cells in a medium containing ascorbic acid or an ascorbic acid derivative, TGF- ⁇ , and a target compound; after culturing the cell structure, adding immune cells to the cell structure and further culturing the cell structure; and counting the number of viable cancer cells in the cell structure after adding the immune cells and culturing the cell structure.
  • the compound selection method of this embodiment involves culturing a cell structure containing fibroblasts and cancer cells in a medium containing ascorbic acid or an ascorbic acid derivative, TGF- ⁇ , and a target compound, and, after culturing the cell structure, adding immune cells to the cell structure and further culturing it.
  • the cell structure is the same as the cell structure described in the method for evaluating the ability to inhibit CAF formation.
  • ascorbic acid or an ascorbic acid derivative and TGF- ⁇ are CAF-forming agents that cause fibroblasts in the cell structure to become CAFs. Therefore, if the target compound does not have the ability to inhibit CAF formation, the cell structure, specifically the fibroblasts in the cell structure, will become CAFs. If the target compound has the ability to inhibit CAF formation, the cell structure, specifically the fibroblasts in the cell structure, will be inhibited from becoming CAFs.
  • the number of viable cancer cells in the cell structure after adding immune cells and culturing is counted. If the target compound has the ability to inhibit CAF formation, when cultured in a medium containing the target compound, the amount of CAFs in the cell structure is lower than when cultured in a medium without the target compound, making it easier for immune cells to infiltrate, and therefore fewer cancer cells survive. The higher the target compound's ability to inhibit CAF formation, the fewer the number of surviving cancer cells. If the target compound does not have the ability to inhibit CAF formation, the number of surviving cancer cells when cultured in a medium containing the target compound will be similar to when cultured in a medium without the target compound.
  • the target compound is selected as a compound capable of inhibiting CAF formation. If the number of surviving cancer cells is the same or higher compared to when cultured under the same conditions except for the absence of the target compound, the target compound is evaluated as not having the ability to inhibit CAF formation.
  • the one with the lower number of surviving cancer cells is selected as the compound with the greater ability to inhibit CAF formation.
  • kits for evaluating CAF formation inhibitors which is a kit containing reagents and the like used in the evaluation method and selection method according to this embodiment.
  • a kit can be formed from a cell structure containing at least fibroblasts and cancer cells and a cell culture vessel for accommodating the cell structure.
  • the kit can also include, instead of the cell structure, cells that constitute the cell structure and a culture vessel used in producing the cell structure.
  • the kit may further comprise other substances used in the evaluation and selection methods.
  • other substances include ascorbic acid or its derivatives, TGF- ⁇ , cell structure culture media, labeling substances for labeling cancer cells, reagents for determining cell viability, and substances used in constructing cell structures (e.g., cationic buffer solutions, strong electrolyte polymers, extracellular matrix components, etc.).
  • DMEM fetal bovine serum
  • general-purpose medium 10% FBS (fetal bovine serum) and 1% P/S
  • general-purpose medium 10% FBS (fetal bovine serum)
  • AIM-V medium containing 1% HEPES, 55 mM 2-ME, and 1% P/S
  • T cell medium was used as the culture medium.
  • the culture vessel used was a "Transwell Culture Insert” (model number: 3470, manufactured by Corning).
  • ⁇ Cell> Normal human dermal fibroblasts (NHDF) (manufactured by Lonza, product number: CC-2509) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) (manufactured by Lonza, product number: C2517A) were used.
  • Human colon adenocarcinoma-derived HCT15/ ⁇ 2m cells genetically modified to constitutively express green fluorescent protein (GFP) (provided by Sapporo Medical University) were used as cancer cells.
  • GFP green fluorescent protein
  • a stromal cell layer was formed. Specifically, NHDFs (1 x 10 cells) and HUVECs (1.5 x 10 cells) were suspended in Tris-HCl buffer (0.1 mg/mL heparin, 0.1 mg/mL collagen, 50 mM Tris, pH 7.4) containing heparin and collagen to prepare a cell suspension. This cell suspension was centrifuged at 1,000 x g for 2 minutes at room temperature, the supernatant was removed, and the cell suspension was resuspended in 300 ⁇ L of general-purpose medium.
  • Tris-HCl buffer 0.1 mg/mL heparin, 0.1 mg/mL collagen, 50 mM Tris, pH 7.4
  • a cancer cell layer was formed on the formed stromal layer. Specifically, first, the medium outside the culture vessel was removed, and 1 mL of new general-purpose medium was added. Next, the medium inside the culture vessel insert was removed, and a cancer cell suspension (1 x 10 cancer cells suspended in 100 ⁇ L of general-purpose medium) was added to the culture vessel insert, and the culture vessel insert was left to stand in a CO2 incubator (37°C, 5% CO2 ) for 2 hours.
  • a CO2 incubator 37°C, 5% CO2
  • a stromal cell layer was then formed on the cancer cell layer.
  • NHDFs (1 x 10 cells) and HUVECs (1.5 x 10 cells) were first suspended in a Tris-HCl buffer solution containing heparin and collagen (0.1 mg/mL heparin, 0.1 mg/mL collagen, 50 mM Tris, pH 7.4).
  • the resulting cell suspension was centrifuged at 1,000 x g for 2 minutes at room temperature. The supernatant was removed and the cell suspension was resuspended in 200 ⁇ L of general-purpose medium.
  • the resulting cell suspension was then added to the culture vessel insert containing the cancer cell layer, centrifuged at 400 x g for 2 minutes at room temperature, and then allowed to stand for 2 hours in a CO2 incubator (37°C, 5% CO2 ). This resulted in the formation of a cell structure in which the cancer cell layer was sandwiched between stromal cell layers.
  • ⁇ CAF conversion> The general-purpose medium outside the culture vessel insert in which the cell constructs were formed was removed, and 2.3 mL of general-purpose medium containing 100 ⁇ M AscP and 1 ng/mL TGF- ⁇ 1 was added. The culture vessel was then cultured in a CO2 incubator (37°C, 5% CO2 ) for 3 days (CAF-formed cell constructs). As a control, 2.3 mL of general-purpose medium not containing AscP and TGF- ⁇ 1 was added, and the cells were cultured in the same manner to prepare a control (CTL) cell construct.
  • CTL control
  • TCR-T ⁇ Addition of TCR-T>
  • the medium outside the culture vessel was removed, 1 mL of T cell medium was added, and then the medium inside the culture vessel insert was removed.
  • a TCR-T cell suspension (a suspension of TCR-T cells in 300 ⁇ L of T cell medium) was added to the culture vessel insert, and the cells were cultured for 3 to 7 days in a CO2 incubator (37°C, 5% CO2 ).
  • TCR-T ⁇ Fluorescently labeled TCR-T>
  • the TCR-T added to the cell construct was fluorescently labeled in advance, and the state of infiltration of TCR-T into cancer cells in the cell construct was evaluated.
  • the TCR-T was fluorescently labeled with an anti-CD8 antibody (CD8_Alexa647, 557708, manufactured by BD) labeled with a fluorescent substance (Alexa647).
  • TCR-T cells (2 x 10 cells) were suspended in 50 ⁇ L of 1% BSA-containing PBS, and 2 ⁇ L of fluorescently labeled antibody solution was added and mixed. The mixture was then left to stand at 4°C for at least 30 minutes.
  • T cell medium After washing with 500 ⁇ L of 1% BSA-containing PBS, the cells were suspended in T cell medium to achieve an appropriate cell number. The resulting fluorescently labeled TCR-T cell suspension was added to a culture vessel insert and cultured for 3 to 7 days in a CO2 incubator (37°C, 5% CO2 ).
  • GFP expressed in cancer cells was photographed using a microscope system ("OperettaCLS," manufactured by PerkinElmer) so that the entire cell structure in the culture vessel insert was captured within the imaging range.
  • the obtained images were analyzed to calculate the percentage of live cancer cells (cells in which GFP was detected) occupying the insert (the number of cells in a confluent state is set to 100%) as the cancer cell survival rate (%).
  • the cancer cell survival rate (%) of the control cell structure to which TCR-T was not added was set to 100%, and the cancer cell survival rate (%) of the cell structure to which TCR-T was added was calculated as the relative cancer cell survival rate (%).
  • ⁇ Section evaluation> The cell structures subjected to viable cell count analysis were washed twice with PBS and then fixed by adding 300 ⁇ L of 10% formalin buffer and leaving it to stand for at least 15 minutes. The fixed cell structures were then washed three times with PBS. The fixed cell structures were then embedded in paraffin using a low-toxicity solvent ("G-Nox,” manufactured by Genostaff) and a paraffin embedding device ("CT-Pro20,” manufactured by Genostaff), and 6 mm-thick sections were prepared.
  • G-Nox low-toxicity solvent
  • CT-Pro20 paraffin embedding device
  • paraffin sections were immersed in citrate buffer (pH 6) and heated in a microwave oven to activate the antigen, and then stained with anti- ⁇ -SMA (alpha smooth muscle actin) antibody (mouse monoclonal antibody, M0851, manufactured by Dako) (antibody concentration: 0.2 ⁇ g/mL).
  • anti- ⁇ -SMA alpha smooth muscle actin
  • the paraffin sections were then immersed in proteinase K solution (5 ⁇ g/mL) for enzymatic treatment to activate the antigen, and then stained with anti-fibronectin antibody (mouse monoclonal antibody, ab6328, manufactured by abcam) (antibody concentration: 0.4 ⁇ g/mL).
  • the stained paraffin sections were placed on glass slides and observed using an optical microscope (MX51, Olympus), and images were obtained.
  • Figure 1 shows the results of measuring the relative cancer cell survival rate (%) for each number of cells seeded for cell structures converted into CAFs using AscP and TGF- ⁇ 1, and for control cell structures that had not been converted into CAFs.
  • the relative cancer cell survival rate for cell structures converted into CAFs (referred to as “CAF” in the figure) was clearly higher than for control cell structures (referred to as "CNT” in the figure). This is thought to be because CAF conversion made it difficult for TCR-T to infiltrate into the cell structures, resulting in a decrease in the amount of TCR-T that reached the cancer cells.
  • FIG 2 shows stained images of paraffin sections of each cell structure.
  • "HE” indicates a hematoxylin-eosin stained image.
  • the cell structure converted into CAF (“CAF” in Figure 2) had increased amounts of ⁇ -SMA, fibronectin, and collagen compared to the control cell structure ("CNT" in Figure 2).
  • Example 1 Several drugs (low molecular weight compounds) were examined for their ability to inhibit CAF formation. Specifically, the relative cancer cell survival rate (%) of CAF-formed cell structures and control cell structures was calculated in the same manner as in Reference Example 1, except that drugs were added to the cell structures simultaneously with AscP and TGF- ⁇ 1 at various concentrations. For drug-free controls, DMSO was added in an amount equal to that of the drug. For comparison, the relative cancer cell survival rate (%) was also calculated for cell structures cultured in the same manner with the addition of only the drug, without the addition of TCR-T cells.
  • HDAC histone deacetylase
  • TSA histone deacetylase
  • JQ-1 BET family inhibitor JQ-1
  • Figure 4(A) shows the general behavior of relative cancer cell survival rate (%) when a drug without CAF formation inhibitor was added
  • Figure 4(B) shows the results of measuring the relative cancer cell survival rate (%) of cell structures transformed into CAFs with the addition of TSA
  • Figure 4(C) shows the results of measuring the relative cancer cell survival rate (%) of cell structures transformed into CAFs with the addition of JQ-1.
  • drug only indicates the relative cancer cell survival rate (%) of cell structures to which only the drug was added
  • drug + immune cells indicates the relative cancer cell survival rate (%) of cell structures to which TCR-T cells were added after the drug was added.
  • the relative cancer cell survival rate (%) is lower when TCR-T cells are added, but the relative cancer cell survival rate (%) does not change even when the drug concentration is changed. This is because the drug itself does not have the effect of promoting the cytotoxicity of TCR-T cells.
  • the relative cancer cell survival rate (%) of the TSA-added cell constructs on days 7 and 11 of culture was measured using drug combination effect analysis software (Synergy Finder) to determine whether TCR-T cells and TSA had a synergistic effect on cancer cell cytotoxicity.
  • the resulting synergy score was 21.651 from the results on day 7 of culture, and 28.214 from the results on day 11 of culture, indicating that there was a synergistic effect between TCR-T cells and TSA.
  • FIG. 5 shows fluorescent images (GFP/CD8-Alexa647) taken immediately after the addition of the TCR-T cells ("0 h” in the figure) and 24 hours after the addition and culture ("24 h” in the figure).
  • the accumulation of fluorescently labeled TCR-T cells around the cancer cells was suppressed and not observed in the cell constructs without TSA ("DMSO" in the figure).
  • TSA in the cell constructs with TSA added
  • TSA and JQ-1 promoted the cytotoxicity of TCR-T cells against cancer cells, and accumulation of TCR-T cells in cancer cells was also observed. Therefore, TSA and JQ-1 were assessed to have the ability to suppress CAF formation.
  • a cell structure consisting of NHDF and HUVEC was formed in the same manner as in Reference Example 1, except that a cancer cell layer was not formed.
  • the cell structure was cultured for three days in a general-purpose medium containing AscP, TGF- ⁇ 1, and TSA in the combinations shown in Figure 6.
  • the cell structures were lysed in SDS lysis buffer, heated at 100°C for 5 minutes, and then stirred in a vortex mixer for 30 seconds. The supernatant was then centrifuged at 16,500 x g for 10 minutes and collected. The protein content of the supernatant was quantified using a protein quantification kit (Protein Assay BCA Kit, Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation). 2 ⁇ g of supernatant protein was mixed with 6x SDS-PAGE Sample Buffer (final concentration 1x, Cosmo Bio Co., Ltd.) and RIPA Buffer (adjusted to 10 ⁇ L, Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation) to prepare the electrophoresis sample.
  • a protein quantification kit Protein Assay BCA Kit, Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation
  • the prepared electrophoresis samples and molecular weight markers were electrophoresed (SDS-PAGE). Proteins were transferred from the gel after SDS-PAGE to a PVDF membrane. After transfer, the membrane was blocked with 4% BSA/TBS-T (1% Tween-20, 1x TBS Buffer) and then reacted with primary antibody solution overnight at 4°C.
  • the primary antibodies used were anti-COL1A1 (E8F4L) antibody (72026, CST), anti- ⁇ -SMA (D4K9N) antibody (19245, CST), and anti-GAPDH monoclonal antibody (016-25523, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries). The membrane was then washed with TBS-T and reacted with secondary antibody solution for 1 hour with shaking.
  • the secondary antibodies used were Amersham ECL-specific HRP-conjugated rabbit IgG full-length antibody (NA934V, Cytiva) and Amersham ECL-specific HRP-conjugated mouse IgG full-length antibody (NA931, Cytiva). After washing again with TBS-T, the bands detected by each antibody were detected using the detection reagent "SuperSignal® West Femto Maximum Sensitivity Substrate” (34095, Thermo Fisher Scientific) and the image analyzer "Amersham Imager 600" (GE Healthcare).
  • 1.0 x 106 cells of human neonatal dermal fibroblasts NHDF (product number "CC-2509”, Lonza) and 1.5 x 104 cells of human umbilical vein endothelial cells HUVEC (product number "C2517A”, Lonza) were suspended in 50 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.4) containing 0.1 mg/mL heparin (product number "H3149-100KU”, Sigma) and 0.1 mg/mL collagen (product number "ASC-1-100-100", Sigma).
  • the cell suspension was then centrifuged at 1,000 x g (gravitational acceleration) for 2 minutes at room temperature, the supernatant removed, and the cells resuspended in 300 ⁇ L of general-purpose medium.
  • the resulting cell suspension was then seeded into a 24-well cell culture insert (product number "3470", Corning) pre-coated with 0.1 mg/mL fibronectin, with 1 mL of general-purpose medium added to the outside.
  • the cell culture insert was then centrifuged at 400 ⁇ g for 2 minutes at room temperature and then placed in a CO2 incubator (37°C, 5% CO2 ) for 2 hours. 1 mL of general-purpose medium was then added to the outside of the cell culture insert, and the insert was cultured in a CO2 incubator (37°C, 5% CO2 ) for 24 hours (the start of this culture was defined as the start of the culture).
  • ⁇ Dissemination of cancer cells>> The medium outside the cell culture insert was removed, and 1 mL of general-purpose medium was added. Subsequently, the medium inside the culture insert was removed, and 100 ⁇ L of a suspension of 1 ⁇ 10 3 human colon adenocarcinoma cells HCT15/ ⁇ 2m was suspended in 100 ⁇ L of general-purpose medium. The resulting suspension was seeded into the cell culture insert, and the insert was left to stand in a CO 2 incubator (37°C, 5% CO 2 ) for 2 hours.
  • ⁇ Layer of interstitial cells 1.0 ⁇ 10 NHDF cells and 1.5 ⁇ 10 HUVEC cells were suspended in 50 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.4) containing 0.1 mg/mL heparin (product number "H3149-100KU”, Sigma) and 0.1 mg/mL collagen (product number "ASC-1-100-100", Sigma).
  • the resulting cell suspension was then centrifuged at 1,000 x g for 2 minutes at room temperature, the supernatant was removed, and the cells were resuspended in 200 ⁇ L of general-purpose medium.
  • the 200 ⁇ L of general-purpose medium containing the suspended cells was then layered onto the cell culture insert on which the cancer cells had been seeded.
  • the cell culture insert obtained above was left to stand in a CO 2 incubator (37° C., 5% CO 2 ) for 2 hours.
  • the medium inside and outside the culture insert was then removed, and 2.3 mL of general-purpose medium with an ascorbic acid concentration of 0 mM, 0.05 mM, or 0.1 mM and a TGF- ⁇ concentration of 0 ng/mL, 0.1 ng/mL, 1 ng/mL, 5 ng/mL, or 10 ng/mL was added, followed by culturing for 3 days in a CO2 incubator (37°C, 5% CO2 ).
  • Figure 7 shows images of cell structures observed under a microscope after 7 days of culture in media containing various concentrations of ascorbic acid and TGF- ⁇ . As shown in Figure 7, when cells were cultured in media containing ascorbic acid, cell structures were formed. In contrast, when cells were cultured in media containing only TGF- ⁇ without ascorbic acid, the cell tissue shrank and detached from the cell culture insert, and no cell structures were formed.
  • ⁇ Measuring the thickness of cell structures>> The cell construct was then removed from the cell culture insert and embedded in paraffin. 6 mm thin sections were prepared along a line passing through the center of gravity of the cell construct as viewed from the top of the cell culture insert. The thin sections were then stained with hematoxylin and eosin (HE). The HE-stained thin sections were photographed under an optical microscope (MX51, Olympus Corporation), and the maximum thickness of the cell construct was measured using ImageJ.
  • HE hematoxylin and eosin
  • Figure 8 shows images of hematoxylin-eosin stained cell structures obtained by microscopy after 4 and 7 days of culture in each medium.
  • Figure 9 is a graph showing the thickness of the cell structures after 4 and 7 days of culture in each medium.
  • "General Medium” indicates cell structures cultured in a general medium that does not contain ascorbic acid or TGF- ⁇
  • “Ascorbic Acid-Added Medium” indicates cell structures cultured in a general medium containing 0.1 mM ascorbic acid
  • “Ascorbic Acid/TGF- ⁇ -Added Medium” indicates cell structures cultured in a general medium containing 0.1 mM ascorbic acid and 10 ng/L TGF- ⁇ .
  • general-purpose medium indicates cell constructs cultured in a general-purpose medium containing no ascorbic acid or TGF- ⁇
  • "ascorbic acid added” indicates cell constructs cultured in a general-purpose medium containing 0.1 mM ascorbic acid
  • "ascorbic acid/TGF- ⁇ added” indicates cell constructs cultured in a general-purpose medium containing 0.1 mM ascorbic acid and 1 ng/L TGF- ⁇ .
  • Example 3 (Production of cell structure 3) As NHDF, 2.0 ⁇ 10 6 cells of human neonatal dermal fibroblast NHDF were seeded in a square dish (model number "166508", Nunc) containing 90 mL of general-purpose medium or general-purpose medium containing 0.1 mM ascorbic acid, and cultured for 24 hours in a CO 2 incubator (37°C, 5% CO 2 ). Except for this, the preparation of stromal cells, seeding of cancer cells, and layering of stromal cells were carried out in the same manner as in Experimental Example 1.
  • the medium inside and outside the cell culture insert was removed, and 2.3 mL of general-purpose medium or general-purpose medium containing 0.1 mM ascorbic acid was added, followed by culturing for 3 days in a CO2 incubator (37°C, 5% CO2 ). Then, the medium inside and outside the culture insert was removed, and 2.3 mL of general-purpose medium or general-purpose medium containing 0.1 mM ascorbic acid was added, followed by culturing for 3 days in a CO2 incubator (37°C, 5% CO2 ).
  • the evaluation method according to this embodiment is a method that can provide a more reliable evaluation of the ability to inhibit CAF formation in cancer tissues without using an animal model. Therefore, this evaluation method can be used in drug discovery for the development of new CAF formation inhibitors and drug repositioning screening, etc.

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Abstract

ＣＡＦ化抑制能の評価方法は、繊維芽細胞とがん細胞とを含む細胞構造体を、アスコルビン酸又はその誘導体、ＴＧＦ－β、及び評価対象の化合物を含む培地で培養するＣＡＦ化工程と、前記ＣＡＦ化工程後に免疫細胞を前記細胞構造体に添加してさらに培養する培養工程と、前記培養工程後における前記細胞構造体中の前記がん細胞の生細胞数を指標として、前記評価対象の化合物のＣＡＦ化抑制能を評価する評価工程と、を有する。

Description

ＣＡＦ化抑制能の評価方法
　本発明は、がん組織におけるＣＡＦ化に対する抑制効果について、動物モデルを用いることなく、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの系でより信頼性の高い評価を行う方法に関する。
　本願は、２０２４年３月２１日に日本に出願された特願２０２４－０４５７６１号について優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　薬剤の薬効評価をｉｎ　ｖｉｔｒｏの評価系で行う場合、得られる評価の信頼性が問題となる。すなわち、当該評価系での評価が、実際に当該薬剤を生体に投与した場合に得られる薬効を反映していることが重要であり、当該評価系での評価と生体に投与して得られる効果とが一致する確率が高い評価系が、信頼性の高い評価系である。より生体に近い環境のアッセイ系を用いることにより、評価対象の薬剤が生体内において実際に作用する状態が再現でき、実際に当該薬剤を生体に投与した場合に得られる薬効が反映された評価が得られる、すなわちより信頼性の高い評価系となることが期待される。近年、生体に近い環境が求められる薬剤のアッセイ系等の分野において、平板上で成育させた細胞よりも立体的に組織化させた立体的細胞組織を使用することの優位性が示されている。このため、生体外で立体的細胞組織を構築するための様々な技術が開発されている。
　特許文献１には、細胞が、カチオン性緩衝液、細胞外マトリックス成分及び強電解質高分子を少なくとも含む溶液に懸濁されている混合物を得る工程と、得られた前記混合物から前記細胞を集め、基材上に細胞集合体を形成する工程と、前記細胞を培養し、立体的細胞組織を得る工程と、を含む、立体的細胞組織の製造方法が開示されている。立体的細胞組織は、例えば、生体組織モデル及び固形癌モデル等に使用して、薬物スクリーニング等の様々なアッセイに利用することができる。
　がん微小環境（言い換えれば、生体内におけるがん細胞とその周辺環境）において、間質ががん細胞に与える影響は非常に大きい。特に悪性度が高いがんでは、異常に活性化した特殊な線維芽細胞が多く出現することが報告され、「がん関連線維芽細胞（Ｃａｎｃｅｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＣＡＦ）」と呼ばれている。これらのＣＡＦは、がん細胞の増殖促進に働くさまざまな増殖因子を産生し、血管新生やがん細胞の増殖及び浸潤などを促進することも既に報告されている（非特許文献１）。したがって、がん細胞と間質を共存させた立体的細胞組織によって、より生体内に近いがん微小環境を構築できると考えられる。
特許第６６３９６３４号公報
Shimoda, et al., Seminars in Cell & Developmental Biology, 2010, vol.21(1), p.19-25.
　ＣＡＦは、がんの増殖や抗がん剤への感受性に強く影響するものである。また、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いた遺伝子改変Ｔ細胞療法（ＣＡＲ－Ｔ細胞療法）や、Ｔ細胞受容体を導入した遺伝子改変Ｔ細胞（ＴＣＲ－Ｔ）療法（ＴＣＲ－Ｔ細胞療法）においても、抗がん効果を得るためには、がん細胞へＣＡＲ－Ｔ細胞やＴＣＲ－Ｔ細胞が攻撃できることが肝要であり、コラーゲン繊維等の物理障壁としてＣＡＦは機能する。このため、がん組織の繊維芽細胞のＣＡＦ化の抑制が、抗がん治療においてより高い抗がん効果を得るためには重要であり、より優れたＣＡＦ化抑制剤の開発が期待されている。
　本発明は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの系で行うＣＡＦ化抑制能の評価方法であって、動物モデルを用いることなく、より信頼性の高い評価を行うことができる評価方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記の課題を解決するため、種々、細胞培養方法に関して検討を重ねたところ、間質細胞とがん細胞を含み、表面がＣＡＦ化された細胞構造体（立体的細胞組織ともいう）を用い、免疫細胞による抗がん効果に対する影響を指標とすることにより、評価対象の化合物のＣＡＦ化抑制能が評価できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、下記の態様を含む。
［１］　ＣＡＦ化抑制能の評価方法であって、
　繊維芽細胞とがん細胞とを含む細胞構造体を、アスコルビン酸又はその誘導体、ＴＧＦ－β、及び評価対象の化合物を含む培地で培養するＣＡＦ化工程と、前記ＣＡＦ化工程後に免疫細胞を前記細胞構造体に添加してさらに培養する培養工程と、前記培養工程後における前記細胞構造体中の前記がん細胞の生細胞数を指標として、前記評価対象の化合物のＣＡＦ化抑制能を評価する評価工程と、
　を有する、ＣＡＦ化抑制能の評価方法。
［２］　前記細胞構造体が、天面と底面の両方で前記培地に接しており、前記細胞構造体が、前記がん細胞を含むがん細胞層を含み、前記がん細胞層が、前記細胞構造体の前記底面から厚み方向の４分の１の高さから４分の３の高さまでの範囲内に位置する、［１］に記載のＣＡＦ化抑制能の評価方法。
［３］　前記免疫細胞が、白血球及びリンパ球からなる群より選択される１種以上である、前記［１］又は［２］のＣＡＦ化抑制能の評価方法。
［４］前記ＣＡＦ化工程の前に、前記細胞構造体を、
　（ａ）カチオン性緩衝液中で、細胞と細胞外マトリックス成分とを混合して混合物を得る工程と、
　（ｂ）前記工程（ａ）により得られた混合物を、細胞培養容器中に播種する工程と、
　（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記細胞培養容器中に細胞が多層に積層された３次元構造体である細胞構造体を得る工程と、
　により製造する、前記［１］～［３］のいずれかのＣＡＦ化抑制能の評価方法。
［５］　前記免疫細胞が、ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＴＣＲ－Ｔ細胞を含む、前記［１］～［４］のいずれかのＣＡＦ化抑制能の評価方法。
［６］　前記免疫細胞が、制御性Ｔ細胞を含む、前記［１］～［５］のいずれかのＣＡＦ化抑制能の評価方法。
［７］　前記細胞構造体が、複数の細胞層を含み、前記がん細胞が、前記細胞構造体の内部の特定の細胞層にのみ存在している、前記［１］～［６］のいずれかのＣＡＦ化抑制能の評価方法。
［８］　前記細胞構造体の厚みが５μｍ以上である、前記［１］～［７］のいずれかのＣＡＦ化抑制能の評価方法。
［９］　前記細胞構造体の厚みが５００μｍ以下である、前記［１］～［８］のいずれかのＣＡＦ化抑制能の評価方法。
［１０］　前記細胞構造体が、さらに、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞からなる群より選択される１種以上を含む、前記［１］～［９］のいずれかのＣＡＦ化抑制能の評価方法。
［１１］　前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリン、プロテオグリカン及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、前記［４］～［１０］のいずれかのＣＡＦ化抑制能の評価方法。
［１２］　前記カチオン性緩衝液がさらに強電解質高分子を含有しており、
　前記強電解質高分子が、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、ポリアクリル酸及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、前記［４］～［１１］のいずれかのＣＡＦ化抑制能の評価方法。
［１３］　前記アスコルビン酸又はその誘導体の割合が、前記培地の総体積に対し０．０７ｍＭ以上１ｍＭ以下である、［１］～［１２］のいずれかのＣＡＦ化抑制能の評価方法。
［１４］　前記ＴＧＦ－βが０．５ｎｇ／ｍＬ以上５ｎｇ／ｍＬ以下である、［１］～［１３］のいずれかのＣＡＦ化抑制能の評価方法。
［１５］　前記ＣＡＦ化工程は、前記細胞構造体を作製した後に行なわれる、［１］～［１４］のいずれかのＣＡＦ化抑制能の評価方法。
［１６］　免疫細胞がＴＣＲ－Ｔ細胞である、［１］～［１５］のいずれかのＣＡＦ化抑制能の評価方法。
［１７］　ＣＡＦ化抑制能の評価方法であって、
　繊維芽細胞とがん細胞とを含む細胞構造体を、アスコルビン酸又はその誘導体、ＴＧＦ－β、及び評価対象の化合物を含む培地で培養するＣＡＦ化工程と、前記ＣＡＦ化工程後に免疫細胞を前記細胞構造体に添加してさらに培養する培養工程と、前記培養工程後における前記細胞構造体中の前記がん細胞の生細胞数を指標として、前記評価対象の化合物のＣＡＦ化抑制能を評価する評価工程と、を有し、
　前記細胞構造体が、天面と底面の両方で前記培地に接しており、
　前記細胞構造体が、前記がん細胞を含むがん細胞層を含み、
　前記がん細胞層が、前記細胞構造体の前記底面から厚み方向の４分の１の高さから４分の３の高さまでの範囲内に位置し、
　前記アスコルビン酸又はその誘導体の割合が、前記培地の総体積に対し０．０７ｍＭ以上１ｍＭ以下であり、
　前記ＴＧＦ－βが０．５ｎｇ／ｍＬ以上５ｎｇ／ｍＬ以下であるＣＡＦ化抑制能の評価方法。
［１８］　繊維芽細胞とがん細胞とを含む細胞構造体を、アスコルビン酸又はアスコルビン酸の誘導体、ＴＧＦ－β、及び評価対象の化合物を含む培地で培養することと、前記細胞構造体の培養後、免疫細胞を前記細胞構造体に添加してさらに培養することと、前記免疫細胞を添加して培養した後における前記細胞構造体中の前記がん細胞の生細胞数をカウントすることと、を含む、化合物選定方法。
　本発明の上記態様に係るＣＡＦ化抑制能の評価方法は、評価対象の化合物のＣＡＦ化抑制能の有無や強さを、生体内の状態により近い状態の細胞構造体、具体的には、上皮細胞を含む間質細胞とがん細胞が共存しており、ＣＡＦ化されている細胞構造体を利用して評価する。このため、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの評価系であるにもかかわらず、信頼性の高い評価を得ることができる。
参考例１において、ＡｓｃＰとＴＧＦ－β１によりＣＡＦ化させた細胞構造体（図中、「ＣＡＦ」）と、ＣＡＦ化させていないコントロールの細胞構造体（図中、「ＣＮＴ」）の播種した細胞数ごとの相対がん細胞生残率（％）の測定結果を示した図である。 参考例１において、ＡｓｃＰとＴＧＦ－β１によりＣＡＦ化させた細胞構造体（図中、「ＣＡＦ」）と、ＣＡＦ化させていないコントロールの細胞構造体（図中、「ＣＮＴ」）の切片の染色画像である。 参考例１において、蛍光標識ＴＣＲ－Ｔ細胞を添加して培養した細胞構造体のＴＣＲ－Ｔ細胞を添加直後（図中、「０ｈ」）と添加後培養２４時間後（図中、「２４ｈ」）の蛍光画像である。 実施例１において、ＣＡＦ化抑制能を有していない薬剤を添加した場合の一般的な相対がん細胞生残率（％）の挙動を図４（Ａ）に、ＴＳＡを添加したＣＡＦ化させた細胞構造体の相対がん細胞生残率（％）の測定結果を図４（Ｂ）に、ＪＱ－１を添加したＣＡＦ化させた細胞構造体の相対がん細胞生残率（％）の測定結果を図４（Ｃ）に、それぞれ示す。 実施例１において、蛍光標識ＴＣＲ－Ｔ細胞を添加して培養した細胞構造体のＴＣＲ－Ｔ細胞を添加直後（図中、「０ｈ」）と添加後培養２４時間後（図中、「２４ｈ」）の蛍光画像である。 実施例１において、ＡｓｃＰとＴＧＦ－β１とＴＳＡとを組み合わせて添加した培地で培養した細胞構造体から抽出したタンパク質に対して、抗α－ＳＭＡ抗体、抗コラーゲン抗体、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行って得られたブロッティング画像である。 実験例２において、各アスコルビン酸の濃度及びＴＧＦ－βの濃度の培地で培養７日後の細胞構造体の顕微鏡観察の結果を示す画像である。 実験例２において、各培地で培養４日後及び培養７日後にヘマトキシリン・エオジン染色した細胞構造体の顕微鏡観察の結果を示す画像である。 実験例２において、各培地で培養４日後及び培養７日後の細胞構造体の厚さを示すグラフである。 実験例２において、各培地で培養４日後及び培養７日後にシリウスレッド－飽和ピクリン酸染色した細胞構造体の顕微鏡観察の結果を示す画像である。 実験例２において、各アスコルビン酸の濃度及びＴＧＦ－βの濃度の培地における培養４日後及び培養７日後のＰＳＲ割合を示すグラフである。 実験例３において、各培地で培養４日後及び培養７日後にシリウスレッド－飽和ピクリン酸染色した細胞構造体の顕微鏡観察の結果を示す画像である。
　本実施形態及び本願明細書において、「細胞構造体」とは、複数の細胞層が積層された３次元構造体である。「細胞層」とは、細胞構造体の厚み方向の断面の切片画像において、細胞核を認識できる倍率、つまり、染色した切片の厚みの全体が視野に入る倍率で観察した際に、厚み方向と直交する方向に存在し、厚み方向に対して細胞核が重ならないで存在する一群の細胞および間質によって構成される層のことである。また、「層状」とは、異なる細胞層が厚み方向に２層以上重ねられているという意味である。また、本実施形態及び本願明細書において、「細胞構造体の厚み」とは、細胞構造体の自重方向の長さである。自重方向とは、重力のかかる方向であり、厚み方向ともいう。
　本発明の一実施形態に係るＣＡＦ化抑制能の評価方法（以下、「本実施形態に係る評価方法」ということがある。）は、がん微小環境を模した細胞構造体を、免疫細胞と、ＣＡＦ化剤と、ＣＡＦ化抑制能を評価する対象の化合物（以下、「標的化合物」ということがある。）とを含む培地で培養し、当該細胞構造体中のがん細胞に対する免疫細胞による細胞障害性を指標として、当該評価化合物のＣＡＦ化抑制能の有無や強さを評価する方法である。具体的には、本実施形態に係る評価方法は、ＣＡＦ化抑制能の評価方法であって、繊維芽細胞とがん細胞とを含む細胞構造体を、アスコルビン酸又はその誘導体、ＴＧＦ－β、及び評価対象の化合物を含む培地で培養するＣＡＦ化工程と、前記ＣＡＦ化工程後に免疫細胞を前記細胞構造体に添加してさらに培養する培養工程と、前記培養工程後における前記細胞構造体中の前記がん細胞の生細胞数を指標として、前記標的化合物のＣＡＦ化抑制能を評価する評価工程と、を有する。
　がん微小環境においては、がん細胞は、これを支える間質に囲まれて存在しているため、免疫細胞によりがん細胞を攻撃するためには、免疫細胞は、間質を浸潤してがん細胞まで到達する必要がある。間質を構成する繊維芽細胞がＣＡＦ化すると、コラーゲン繊維等の細胞外マトリックスが密になり、物理的な障壁が強くなり、免疫細胞のがん細胞への浸潤が抑制される。つまり、がん微小環境を模した細胞構造体において、当該細胞構造体内のがん細胞に対する免疫細胞による細胞障害性の強さを、当該細胞構造体のＣＡＦ化の程度の指標とすることができる。本実施形態に係る評価方法は、この免疫細胞による細胞障害性をＣＡＦ化の指標とすることを利用する。
　本実施形態におけるＣＡＦ化とは、α－ＳＭＡ（α－平滑筋アクチン）が発現している、乃至フィブロネクチンやコラーゲンなどの細胞外マトリックスが過剰に発現している状態をいう。繊維芽細胞がＣＡＦ化しているかどうかは、免疫染色等により、細胞外マトリックスが周囲の線維芽細胞と比較して過剰に存在している時にCAF化が起こっていると判断できる。免疫染色で繊維芽細胞がＣＡＦ化しているかの確認には、α－ＳＭＡ/ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１、ＦＮ１、ＦＡＰ、ＭＦＡＰ５、ＣＯＬ１１Ａ１、ＴＮ－Ｃ、ＰＤＰＮ、ＩＴＧＡ１１、ＮＧ２、ＰＤＧＦＲα／β、ＶＩＭ、ＦＳＰ－１／Ｓ１００Ａ４、ＰＯＳＴＮ、ＥＰＣＡＭ、ＣＡＬＤ１、ＳＭＴＮ、ＰＴＰＲＣ、ＰＥＣＡＭ１、ＣＤ７０、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＧＰＲ７７、ＣＤ１０、ＣＤ３６、ＣＤ７４、ＣＤ１４６、ＣＡＶ１、Ｓａａ３、Ｐ４Ｈ、ＡＳＰＮ、ＯＧＮ、ＺＥＢ１、ＭＣＴ４／ＳＬＣ１６Ａ４、ＳＰＡＲＣ、ＭＭＰｓ、ＦＯＸＦ１、ＣＡＶ１及びＰＴＲＦ等のマーカーを用いることができる。より具体的には、上述のマーカーの発現量を確認し、ＣＡＦ化していない細胞における同一のマーカーの発現量と比較し、マーカーの発現量が上昇又は抑制状態であるときに繊維芽細胞がＣＡＦ化していると判断する。ＣＡＦ化すると発現量が上昇するマーカーとしては、例えばα－ＳＭＡ/ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１、ＦＮ１、ＦＡＰ、ＭＦＡＰ５、ＣＯＬ１１Ａ１、ＴＮ－Ｃ、ＰＤＰＮ、ＩＴＧＡ１１、ＮＧ２、ＰＤＧＦＲα／β、ＶＩＭ、ＦＳＰ－１／Ｓ１００Ａ４、ＰＯＳＴＮ、ＣＤ７０、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＧＰＲ７７、ＣＤ１０、ＣＤ７４、ＣＤ１４６、Ｐ４Ｈ、ＡＳＰＮ、ＯＧＮ、ＺＥＢ１、ＭＣＴ４／ＳＬＣ１６Ａ４、ＳＰＡＲＣ、ＭＭＰｓ、ＦＯＸＦ１及びＣＡＶ１が挙げられる。ＣＡＦ化するとマーカーの発現量が抑制されるマーカーとしては、例えばＥＰＣＡＭ、ＣＡＬＤ１、ＳＭＴＮ、ＰＴＰＲＣ、ＰＥＣＡＭ１、Ｓａａ３、ＣＤ３６、ＣＡＶ１及びＰＴＲＦが挙げられる。
　＜細胞構造体＞
　本実施形態に係る評価方法において用いられる細胞構造体は、がん微小環境を模した細胞構造体である。具体的には、繊維芽細胞とがん細胞とを含む細胞構造体である。繊維芽細胞は、がん組織の間質を構成する主要な細胞であり、ＣＡＦの前駆細胞に相当する。本実施形態で用いられる細胞構造体に含まれる繊維芽細胞は、いずれの組織由来の細胞であってもよい。当該繊維芽細胞としては、例えば、皮膚繊維芽細胞、肺繊維芽細胞、心臓繊維芽細胞等が挙げられる。また、本実施形態で用いられる細胞構造体に含まれる繊維芽細胞は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。
　本実施形態に係る細胞構造体に含まれている繊維芽細胞の数の割合は、細胞構造体を構成する全細胞に対して、１０．０％以上が好ましく、２０．０％以上がより好ましく、３０．０％以上がさらに好ましく、４０．０％以上がよりさらに好ましい。本実施形態に係る細胞構造体に含まれている繊維芽細胞の数の割合の上限値は特に限定されるものではなく、例えば、９９．９％以下が好ましく、９９．０％以下がより好ましく、９０．０％以下がさらに好ましい。
　本実施形態で用いられる細胞構造体には、繊維芽細胞以外の間質を構成する細胞（間質細胞ともいう）が含まれていてもよい。間質細胞としては、繊維芽細胞に加えて、例えば、内皮細胞、神経細胞、肥満細胞、上皮細胞、心筋細胞、肝細胞、膵島細胞、組織幹細胞、及び平滑筋細胞等が挙げられる。本実施形態で用いられる細胞構造体に含まれる繊維芽細胞以外の間質細胞は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。本実施形態で用いられる細胞構造体に含まれる間質細胞の細胞種としては、特に限定されなく、含有させるがん細胞の由来や種類、評価に使用される免疫細胞の種類、評価に使用されるＣＡＦ化抑制剤の種類、又は目的のＣＡＦ化抑制活性が奏される生体内の環境等を考慮して、適宜選択することができる。
　血管網構造やリンパ管網構造は、がん細胞の増殖や活性に重要である。このため、本実施形態で用いられる細胞構造体は、脈管網構造を備えるものが好ましい。すなわち、本実施形態で用いられる細胞構造体としては、内部の少なくとも一部に、リンパ管及び／又は血管等の脈管網構造が三次元的に構築され、より生体内に近い組織を構築しているものが好ましい。脈管網構造は、細胞構造体の内部にのみ形成されていてもよく、少なくとも脈管網構造の一部が細胞構造体の表面又は底面に露出されるように形成されていてもよい。なお、本実施形態及び本願明細書において、「脈管網構造」とは、生体組織における血管網やリンパ管網のような、網状の構造を指す。
　脈管網構造は、間質細胞として脈管を構成する内皮細胞を含むことにより形成させることができる。本実施形態で用いられる細胞構造体に含まれる内皮細胞としては、血管内皮細胞であってもよく、リンパ管内皮細胞であってもよい。また、血管内皮細胞とリンパ管内皮細胞との両方を含んでいてもよい。なお、細胞構造体に含まれる内皮細胞としては、繊維芽細胞と同種の生物種由来の細胞であってもよく、異種の生物種由来の細胞であってもよい。
　本実施形態で用いられる細胞構造体が脈管を構成する内皮細胞を含む場合、当該細胞構造体中の内皮細胞の数は、脈管網構造が形成されるのに充分な数であることが好ましく、細胞構造体の大きさ、内皮細胞や内皮細胞以外の細胞の細胞種等を考慮して適宜決定することができる。例えば、本実施形態で用いられる細胞構造体を構成する全細胞に対する内皮細胞の存在比（細胞数比）を０．１％以上にすることによって、脈管網構造が形成された細胞構造体を調製できる。本実施形態で用いられる細胞構造体における内皮細胞数は、当該細胞構造体に含まれる線維芽細胞数の０．１％以上であることが好ましく、０．１～５.０％であることがより好ましい。内皮細胞として血管内皮細胞とリンパ管内皮細胞の両方を含む場合、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の総細胞数が、線維芽細胞数の０．１％以上であることが好ましく、０．１～５.０％であることがより好ましい。
　本実施形態で用いられる細胞構造体は、さらに、がん細胞を含む。本実施形態で用いられる細胞構造体に含まれるがん細胞は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。なお、がん細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。本実施形態で用いられる細胞構造体に含まれるがん細胞としては、株化された培養細胞であってもよく、がん患者から採取されたがん細胞であってもよい。がん患者から採取されたがん細胞は、予め培養して増殖させた細胞であってもよい。具体的には、がん患者から採取された初代がん細胞、人工培養がん細胞、ｉＰＳがん幹細胞、がん幹細胞、及びがん治療の研究や抗がん剤の開発に利用するために予め準備されている株化がん細胞等が挙げられる。また、ヒト由来のがん細胞であってもよく、ヒト以外の動物由来のがん細胞であってもよい。なお、本実施形態で用いられる細胞構造体ががん患者から採取されたがん細胞を含む場合、がん患者から採取されたがん細胞以外の細胞も、がん細胞と共に含んでいてもよい。がん細胞以外の細胞としては、例えば、術後摘出した固形組織内に含まれる１種類以上の細胞が挙げられる。
　本実施形態で用いられる細胞構造体に含まれるがん細胞の由来となるがんとしては、例えば、乳がん（例えば、浸潤性乳管がん、非浸潤性乳管がん、及び炎症性乳がん等）、前立腺がん（例えば、ホルモン依存性前立腺がん、及びホルモン非依存性前立腺がん等）、膵がん（例えば、膵管がん等）、胃がん（例えば、乳頭腺がん、粘液性腺がん、及び腺扁平上皮がん等）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、及び悪性中皮腫等）、結腸がん（例えば、消化管間質腫瘍等）、直腸がん（例えば、消化管間質腫瘍等）、大腸がん（例えば、家族性大腸がん、遺伝性非ポリポーシス大腸がん、及び消化管間質腫瘍等）、小腸がん（例えば、非ホジキンリンパ腫、及び消化管間質腫瘍等）、食道がん、十二指腸がん、舌がん、咽頭がん（例えば、上咽頭がん、中咽頭がん、及び下咽頭がん等）、頭頚部がん、唾液腺がん、脳腫瘍（例えば、松果体星細胞腫瘍、毛様細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫、及び退形成性星細胞腫等）、神経鞘腫、肝臓がん（例えば、原発性肝がん、及び肝外胆管がん等）、腎臓がん（例えば、腎細胞がん、及び腎盂と尿管の移行上皮がん等）、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、肝がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、卵巣がん（例、上皮性卵巣がん、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣性胚細胞腫瘍、及び卵巣低悪性度腫瘍等）、膀胱がん、尿道がん、皮膚がん（例えば、眼内（眼）黒色腫、及びメルケル細胞がん等）、血管腫、悪性リンパ腫（例えば、細網肉腫、リンパ肉腫、及びホジキン病等）、メラノーマ（悪性黒色腫）、甲状腺がん（例えば、甲状腺髄様がん等）、副甲状腺がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、骨腫瘍（例えば、骨肉腫、ユーイング腫瘍、子宮肉腫、及び軟部組織肉腫等）、転移性髄芽腫、血管線維腫、隆起性皮膚線維肉腫、網膜肉腫、陰茎癌、精巣腫瘍、小児固形がん（例えば、ウィルムス腫瘍、及び小児腎腫瘍等）、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、慢性骨髄増殖性疾患、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、及び急性リンパ芽球性白血病等）等が挙げられ、これらに限定されない。
　本実施形態で用いられる細胞構造体に含まれているがん細胞の数の割合は、細胞構造体を構成する全細胞に対して、０．０１％以上が好ましく、０．０５％以上がより好ましく、０．１％以上がさらに好ましい。本実施形態で用いられる細胞構造体に含まれているがん細胞の数の割合の上限値は特に限定されるものではなく、例えば、５．０％以下が好ましく、２．０％以下がより好ましく、１．０％以下がさらに好ましい。
　本実施形態で用いられる細胞構造体が脈管を構成する内皮細胞を含む場合、当該細胞構造体中のがん細胞の数は、特に限定されないが、より生体内のがん微小環境とより近似させられることから、細胞構造体中のがん細胞数に対する内皮細胞数の比率（[内皮細胞数]／[がん細胞数]）が０超（０より大きく）５０以下であることが好ましい。
　本実施形態で用いられる細胞構造体は、がん細胞が構造体内部全体に散在している細胞構造体であってもよく、がん細胞が特定の細胞層にのみ存在している細胞構造体であってもよい。本実施形態で用いられる細胞構造体において、がん細胞が特定の細胞層にのみ存在している場合、このがん細胞を含む細胞層（がん細胞層ともいう）の細胞構造体における位置は、細胞構造体の表面以外であることが好ましく、表面から離れていることがより好ましい。例えば、細胞構造体が天面（上面）でのみ培養培地に接している場合には、がん細胞層は、当該構造体の底面（下面）から厚み方向の半分の高さまでの範囲内にあることが好ましく、当該構造体の底面（下面）から厚み方向の４分の１の高さまでの範囲内にあることがより好ましい。細胞構造体が天面と底面の両方で培養培地に接している場合には、がん細胞層は、当該構造体の底面（下面）から厚み方向の４分の１の高さから４分の３の高さまでの範囲内にあることが好ましい。細胞構造体の表面からがん細胞層までの距離が十分であれば、細胞構造体表面におけるＣＡＦ化の程度、言い換えると免疫細胞の浸潤しやすさの差を、当該細胞構造体内のがん細胞の生残率により反映させることができる。
　本実施形態で用いられる細胞構造体は、がん細胞と間質細胞以外の細胞を含んでいてもよい。その他の細胞としては、免疫細胞、神経細胞、肝細胞、膵細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨細胞、肺胞上皮細胞、及び脾臓細胞等が挙げられる。
　本実施形態で用いられる細胞構造体を構成する繊維芽細胞やがん細胞を含む細胞は特に限定されなく、動物から採取された細胞であってもよく、動物から採取された細胞を培養した細胞であってもよく、動物から採取された細胞に各種処理を施した細胞であってもよく、培養細胞株であってもよい。動物から採取された細胞の場合、採取部位は特に限定されず、骨、筋肉、内臓、神経、脳、骨、皮膚、又は血液などに由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよく、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であってもよい。また、本実施形態に係る細胞構造体を構成する細胞が由来する生物種は特に限定されなく、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、及びラット等の動物に由来する細胞を用いることができる。動物から採取された細胞を培養した細胞としては、初代培養細胞であってもよく、継代培養細胞であってもよい。また、各種処理を施した細胞としては、誘導多能性幹細胞細胞（ｉＰＳ細胞）や、分化誘導後の細胞が挙げられる。また、本実施形態に係る細胞構造体は、同種の生物種由来の細胞のみから構成されていてもよく、複数種類の生物種由来の細胞により構成されていてもよい。
　本実施形態で用いられる細胞構造体の大きさや形状は、特に限定されない。より生体内の組織に形成された脈管と近い状態の脈管網構造が形成可能であり、より精度の高い評価が可能であることから、当該細胞構造体の厚さは、５μｍ以上が好ましく、１０μｍ以上がより好ましく、５０μｍ以上がさらに好ましく、１００μｍ以上がよりさらに好ましい。当該細胞構造体の厚さとしては、また、５００μｍ以下が好ましく、４００μｍ以下がより好ましく、３００μｍ以下がさらに好ましい。本実施形態で用いられる細胞構造体の細胞層の数としては、２～６０層程度が好ましく、５～６０層程度がより好ましく、１０～６０層程度がさらに好ましい。
　なお、細胞構造体を構成する細胞層数は、三次元構造を構成する細胞の総数を、１層当たりの細胞数（１層を構成するために必要な細胞数）で除することにより測定される。１層当たりの細胞数は、細胞構造体を構成させる際に使用する細胞培養容器に、予め細胞をコンフルエントになるように平面的に培養して調べることができる。具体的には、ある細胞培養容器に形成された細胞構造体の細胞層数は、当該細胞構造体を構成する全細胞数を計測し、当該細胞培養容器の１層当たりの細胞数で除することにより算出できる。
　一般的に、本実施形態で用いられる細胞構造体は、細胞培養容器中に構築される。当該細胞培養容器としては、細胞構造体の構築が可能であり、かつ構築された細胞構造体の培養が可能な容器であれば特に限定されない。当該細胞培養容器としては、具体的には、ディッシュ、セルカルチャーインサート（例えば、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサート、Ｎｅｔｗｅｌｌ（登録商標）インサート、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）セルカルチャーインサート、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）セルカルチャーインサート等）、チューブ、フラスコ、ボトル、及びプレート等が挙げられる。本実施形態で用いられる細胞構造体の構築においては、当該細胞構造体を用いた評価をより適正に行うことができるため、ディッシュ又は各種セルカルチャーインサートが好ましい。
　本実施形態で用いられる細胞構造体は、線維芽細胞を含む間質細胞とがん細胞とを含む多層の細胞層から形成された構造体であればよく、細胞構造体の構築方法は特に限定されない。例えば、一層ずつ構築して順次積層させて構築する方法であってもよく、２層以上の細胞層を一度に構築する方法であってもよく、両構築方法を適宜組み合わせて多層の細胞層を構築する方法であってもよい。また、本実施形態で用いられる細胞構造体は、各細胞層を構成する細胞種が層ごとに異なる多層構造体であってもよく、各細胞層を構成する細胞種が、構造体の全層で共通する細胞種であってもよい。例えば、細胞種毎に層を形成し、細胞種毎の細胞層を順次積層させることによって構築する方法であってもよく、複数種類の細胞を混合した細胞混合液を予め調製し、予め調製された複数種類の細胞を混合した細胞混合液から多層構造の細胞構造体を一度に構築する方法であってもよい。
　一層ずつ構築して順次積層させて構築する方法としては、例えば、特許第４９１９４６４号公報に記載されている方法、すなわち、細胞層を形成する工程と、形成された細胞層をＥＣＭ（細胞外マトリックス）の成分を含有する溶液に接触させる工程と、を交互に繰り返すことにより、連続的に細胞層を積層する方法が挙げられる。例えば、当該方法を行うに際し、予め、細胞構造体を構成する全ての細胞を混合した細胞混合物を調製しておき、この細胞混合物によって各細胞層を形成することによって、構造体全体に脈管網構造が形成されており、かつがん細胞が構造体全体に散在している細胞構造体が構築できる。また、各細胞層を、細胞種ごとに形成することによって、内皮細胞から形成された層にのみ脈管網構造が形成されており、がん細胞が特定の細胞層にのみ存在している細胞構造体が構築できる。
　２層以上の細胞層を一度に構築する方法としては、例えば、特許第５８５０４１９号公報に記載されている方法が挙げられる。当該方法は、予め細胞の表面全体をインテグリンが結合するアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含む高分子と前記ＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用をする高分子によって被覆しておき、この接着膜で被覆された被覆細胞を細胞培養容器に収容した後、遠心処理等によって被覆細胞同士を集積させることにより、多層の細胞層から形成された細胞構造体を構築する方法である。例えば、当該方法を行うに際し、予め、細胞構造体を構成する全ての細胞を混合した細胞混合物を調製しておき、この細胞混合物に接着性成分を添加することによって調製された被覆細胞を用いる。これにより、１度の遠心処理によって、構造体全体にがん細胞が散在する細胞構造体が構築できる。また、例えば、内皮細胞を被覆した被覆細胞と、線維芽細胞を被覆した被覆細胞と、がん患者から採取された細胞群を被覆した被覆細胞とを、それぞれ別個に調製し、線維芽細胞の被覆細胞から構成された多層を形成させた後、その上に内皮細胞の被覆細胞から形成された１層を積層させ、さらにその上に線維芽細胞の被覆細胞から形成された多層を積層させ、さらにその上にがん細胞を含む細胞の被覆細胞から形成された１層を積層させる。これにより、厚みのある線維芽細胞層に挟まれた脈管網構造を備え、かつ天面にがん患者から採取されたがん細胞を含む層を備える細胞構造体が構築できる。
　本実施形態で用いられる細胞構造体は、下記（ａ）～（ｃ）の工程を有する方法により構築することもできる。
　（ａ）カチオン性緩衝液中で、細胞と細胞外マトリックス成分とを混合して混合物を得る工程。
　（ｂ）前記工程（ａ）により得られた混合物を、細胞培養容器中に播種する工程
　（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記細胞培養容器中に細胞が多層に積層された細胞構造体を得る工程。
　工程（ａ）においては、細胞を、カチオン性物質を含む緩衝液（カチオン性緩衝液ともいう）及び細胞外マトリックス成分と混合し、この細胞混合物から細胞集合体を形成することにより、内部に大きな空隙が少ない立体的細胞組織を得ることができる。また、得られた立体的細胞組織は、比較的安定であるため、少なくとも数日間の培養が可能であり、かつ培地交換時にも組織が崩壊し難い。また、本実施形態においては、工程（ｂ）において、細胞培養容器内に播種した細胞混合物を当該細胞培養容器内に沈降させることを含み得る。細胞混合物の沈降は、遠心分離等によって積極的に細胞を沈降させてもよく、自然沈降させてもよい。
　工程（ａ）において、細胞をさらに強電解質高分子と混合することが好ましい。細胞をカチオン性物質、強電解質高分子及び細胞外マトリックス成分と混合することにより、工程（ｂ）において遠心分離等の細胞を積極的に集合させる処理を要することなく、自然沈降させた場合であっても、空隙が少なく厚みのある立体的細胞組織が得られる。
　前記カチオン性緩衝液としては、例えば、トリス－塩酸緩衝液、トリス－マレイン酸緩衝液、ビス－トリス－緩衝液、又はＨＥＰＥＳ等が挙げられる。当該カチオン性緩衝液中のカチオン性物質（例えば、トリス－塩酸緩衝液におけるトリス）の濃度及びｐＨは、細胞の生育及び細胞構造体の構築に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、カチオン性緩衝液中のカチオン性物質の濃度は、１０～１００ｍＭとすることができ、４０～７０ｍＭであることが好ましく、５０ｍＭであることがより好ましい。また、当該カチオン性緩衝液のｐＨは、６．０～８．０とすることができ、６．８～７．８であることが好ましく、７．２～７．６であることがより好ましい。
　前記強電解質高分子としては、例えば、ヘパリンや、コンドロイチン硫酸（例えば、コンドロイチン４－硫酸、及びコンドロイチン６－硫酸）、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、及びヒアルロン酸等のグリコサミノグリカン；デキストラン硫酸や、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、及びポリアクリル酸、又はこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。工程（ａ）において調製される混合物には、強電解質高分子を１種類のみ混合させてもよく、２種類以上を組み合わせて混合させてもよい。本実施形態で用いられる細胞構造体の構築においては、強電解質高分子はグリコサミノグリカンであることが好ましい。また、ヘパリン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、及びデルマタン硫酸のうち少なくとも１つを用いることがより好ましい。本実施形態で用いられる強電解質高分子はヘパリンであることがさらに好ましい。前記カチオン性緩衝液に混合する強電解質高分子の量は、細胞の生育及び細胞構造体の構築に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。
　例えば、カチオン性緩衝液中の強電解質高分子の濃度は、０ｍｇ／ｍＬ超（０ｍｇ／ｍＬより高く）１．０ｍｇ／ｍＬ未満とすることができ、０．０２５～０．１ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、０．０５～０．１ｍｇ／ｍＬであることがより好ましい。また、本実施形態においては、前記強電解質高分子を混合せずに前記混合物を調整し、細胞構造体の構築を行うこともできる。
　前記細胞外マトリックス成分としては、例えば、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリン、プロテオグリカン、又はこれらの改変体若しくはバリアント等が挙げられる。プロテオグリカンには、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、及びデルマタン硫酸プロテオグリカン等が挙げられる。工程（ａ）において調製される混合物には、細胞外マトリックス成分を１種類のみ混合させてもよく、２種類以上を組み合わせて混合させてもよい。本実施形態で用いられる細胞構造体の構築においては、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンを用いることが好ましく、コラーゲンを用いることがより好ましい。細胞の生育及び細胞構造体の形成に悪影響を及ぼさない限り、上述の細胞外マトリックス成分の改変体及びバリアントを用いてもよい。前記カチオン性緩衝液に混合する細胞外マトリックス成分の量は、細胞の生育及び細胞構造体の構築に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、カチオン性緩衝液中の細胞外マトリックス成分の濃度は、０ｍｇ／ｍＬ超（０ｍｇ／ｍＬより高く）１．０ｍｇ／ｍＬ未満とすることができ、０．０２５～０．１ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、０．０５～０．１ｍｇ／ｍＬであることがより好ましい。
　前記カチオン性緩衝液に混合する強電解質高分子と細胞外マトリックス成分の配合比は、１：２～２：１である。本実施形態で用いられる細胞構造体の構築においては、強電解質高分子と細胞外マトリックス成分の配合比が、１：１．５～１．５：１であることが好ましく、１：１であることがより好ましい。
　工程（ａ）～（ｃ）を繰り返す、具体的には、工程（ｃ）で得られた細胞構造体の上に、工程（ｂ）として、工程（ａ）で調製した混合物を播種した後、工程（ｃ）を行うことを繰り返すことにより、充分な厚みの細胞構造体を構築することができる。工程（ｃ）で得られた細胞構造体の上に新たに播種する混合物の細胞組成は、既に構築されている細胞構造体を構成する細胞組成と同じであってもよく、異なっていてもよい。
　例えば、まず、工程（ａ）において細胞としては線維芽細胞のみを含む混合物を調製し、工程（ｂ）及び（ｃ）を行って細胞培養容器に１０層の線維芽細胞層から形成された細胞構造体を得る。次いで、工程（ａ）として細胞として血管内皮細胞のみを含む混合物を調製し、工程（ｂ）及び（ｃ）を行って細胞培養容器内の線維芽細胞層の上に１層の血管内皮細胞層を積層させる。さらに、工程（ａ）として細胞として線維芽細胞のみを含む混合物を調製し、工程（ｂ）及び（ｃ）を行って細胞培養容器内の血管内皮細胞層の上に、１０層の線維芽細胞層を積層させる。さらに、工程（ａ）として、がん患者から採取されたがん細胞を含む混合物を調製し、工程（ｂ）及び（ｃ）を行って細胞培養容器内の線維芽細胞層の上に１層のがん細胞層を積層させる。これにより、線維芽細胞層１０層－血管内皮細胞層１層－線維芽細胞層１０層－がん細胞層１層と細胞種毎に順番に層状に積層された細胞構造体が構築できる。工程（ｂ）において播種される細胞数を調節することにより、工程（ｃ）において積層される細胞層の厚みを調整できる。工程（ｂ）において播種される細胞数が多いほど、工程（ｃ）において積層される細胞層の数が多くなる。また、工程（ａ）において、線維芽細胞層２０層分の線維芽細胞と血管内皮細胞層１層分の血管内皮細胞を全て混合した混合物を調製し、工程（ｂ）及び（ｃ）を行い、形成された多層の構造体の上に、同様にして調製したがん患者から採取されたがん細胞を含む混合物を積層することによって、２１層分の厚みを有し、血管網構造が構造体内部に散在している構造体の上にがん細胞層が積層された細胞構造体が構築できる。さらに、工程（ａ）において、線維芽細胞層２０層分の線維芽細胞と血管内皮細胞層１層分の血管内皮細胞とがん細胞層１層分のがん患者由来の細胞とを全て混合した混合物を調製し、工程（ｂ）及び（ｃ）を行うことにより、２２層分の厚みを有し、がん細胞と血管網構造の両方が構造体内部にそれぞれ独立して散在している細胞構造体が構築できる。
　工程（ａ）～（ｃ）を繰り返す場合に、工程（ｃ）の後、工程（ｂ）を行う前に、得られた細胞構造体を培養してもよい。培養に用いる培養培地の組成、培養温度、培養時間、培養時の大気組成等の培養条件は、当該細胞構造体を構成する細胞の培養に適した条件で行う。培養培地としては、例えば、Ｄ－ＭＥＭ、Ｅ－ＭＥＭ、ＭＥＭα、ＲＰＭＩ－１６４０、及びＨａｍ’ｓ Ｆ－１２等が挙げられる。
　工程（ａ）の後に、（ａ’－１）得られた混合物から液体部分を除去し、細胞集合体を得る工程、及び（ａ’－２）細胞集合体を溶液に懸濁する工程を行い、工程（ｂ）へ進んでもよい。上述の工程（ａ）～（ｃ）を実施することで所望の組織体を得ることができるが、工程（ａ）の後に（ａ’－１）及び（ａ’－２）を実施し、工程（ｂ）を実施することで、より均質な組織体を得ることができる。
　また、工程（ａ）の後に、前記工程（ｂ）に代えて、下記工程（ｂ’－１）及び（ｂ’－２）を行ってもよい。工程（ｂ’－１）及び工程（ｂ’－２）を行うことによっても、より均質な組織体を得ることができる。工程（ｂ’－２）においても、工程（ｂ）と同様に、細胞培養容器内に播種した細胞混合物を当該細胞培養容器内に沈降させることを含み得る。細胞混合物の沈降は、遠心分離等によって積極的に細胞を沈降させてもよく、自然沈降させてもよい。本実施形態及び本願明細書において、「細胞粘稠体」とは、非特許文献４に記載されるようなゲル様の細胞集合体を指す。
　（ｂ’－１）工程（ａ）で得られた混合物を細胞培養容器内に播種した後、混合物から液体成分を除去し、細胞粘稠体を得る工程。
　（ｂ’－２）細胞培養容器内に細胞粘稠体を溶媒に懸濁する工程。
　細胞懸濁液を調製するための溶媒としては、細胞に対する毒性がなく、増殖性や機能を損なわない溶媒であれば特に限定されず、水、緩衝液、又は細胞の培養培地等を用いることができる。当該緩衝液としては、例えば、リン酸生理食塩水（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳ、及びＨａｎｋｓ緩衝液等が挙げられる。培養培地としては、Ｄ－ＭＥＭ、Ｅ－ＭＥＭ、ＭＥＭα、ＲＰＭＩ－１６４０、及びＨａｍ’ｓ Ｆ－１２等が挙げられる。細胞懸濁液を調製するための溶媒として、細胞の培養培地を用いる場合には、後述する工程（ｃ）において液体成分を除去することなく細胞を培養することができる。
　前記工程（ｃ）に代えて、下記工程（ｃ’）を行ってもよい。
　（ｃ’）：基材上に細胞の層を形成する工程。
　工程（ｃ）及び工程（ｃ’）において、播種した混合物から液体成分を除去してもよい。工程（ｃ）及び工程（ｃ’）における液体成分の除去処理の方法は、細胞の生育及び細胞構造体の構築に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されず、液体成分と固体成分の懸濁物から液体成分を除去する方法として当業者に公知の手法により適宜行うことができる。当該手法としては、例えば、吸引、遠心分離処理、磁性分離処理、又はろ過処理等が挙げられる。例えば、細胞培養容器としてセルカルチャーインサートを用いた場合には、混合物を播種したセルカルチャーインサートを、１０℃、４００×ｇで１分間の遠心分離処理に供することによって、細胞混合物が沈降するので、吸引によって液体成分を除去することができる。
　＜ＣＡＦ化工程及び免疫細胞の培養工程＞
　本実施形態に係る評価方法においては、ＣＡＦ化工程として、前記細胞構造体を、アスコルビン酸又はその誘導体（つまりアスコルビン酸の誘導体）、ＴＧＦ－β、及び評価対象の化合物を含む培地で培養する。ＣＡＦ化工程後に、免疫細胞を前記細胞構造体に添加してさらに培養する。ここで、アスコルビン酸又はその誘導体とＴＧＦ－βとは、前記細胞構造体中の繊維芽細胞のＣＡＦ化を引き起こすＣＡＦ化剤である。本実施形態に係る評価方法において用いられるアスコルビン酸又はその誘導体とＴＧＦ－βとは、化学合成品であってもよく、微生物等に産生させた精製品であってもよい。
　免疫細胞とは、免疫に関与する細胞である。具体的には、リンパ球、マクロファージ、及び樹状細胞などが挙げられる。リンパ球には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及び形質細胞等がある。
　本実施形態に係る評価方法において用いられる免疫細胞は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。本実施形態において用いられる免疫細胞としては、免疫細胞であれば特に限定されないが、実際にがん微小環境周辺に存在し、免疫反応によりがん細胞を攻撃する機構に携わる細胞が好ましい。具体的には、本実施形態においては、免疫細胞として、白血球及びリンパ球からなる群より選択される１種以上を用いることが好ましく、Ｔ細胞が含まれていることがより好ましい。なかでも、細胞障害性Ｔ細胞及び制御性Ｔ細胞からなる群より選択される１種以上が含まれていることが特に好ましい。
　本実施形態に係る評価方法においては、免疫細胞として、ＰＢＭＣ（血漿中末梢血単核球）が使用できる。ＰＢＭＣには、リンパ球及び単球が包含される。単球にはマクロファージが包含される。リンパ球には、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞が包含される。ＰＢＭＣ以外にも、これらの成分を単独あるいは複数組み合わせたものを用いることができる。ＰＢＭＣは、血液から単離精製されたものであってもよいが、血液から調製されたバフィーコートをそのまま用いることもできる。バフィーコート中には、ＰＢＭＣがその他の成分と共に含まれている。血液からのバフィーコートの調製は、遠心分離法等の常法により調製できる。
　免疫細胞には、ＡＢＯ血液型のように、同じ成分でも少し異なった性質を有する複数の型が存在することがある。本実施形態に係る評価方法においては、必要に応じて、何れか一つの型の免疫細胞を使用してもよく、複数型の免疫細胞を組み合わせて使用してもよい。
　本実施形態に係る評価方法において用いられる免疫細胞は、生体から採取された免疫細胞であってもよく、培養細胞株であってもよく、生体外で人工的に改変又は修飾された細胞であってもよい。がん患者から採取された免疫細胞を用いる場合には、がん患者の末梢血又は腫瘍部から単離された免疫細胞、特にＰＢＭＣを用いることが好ましい。また、人工的に改変又は修飾された免疫細胞としては、免疫機能を人工的に改変し、抗がん活性を高めた免疫細胞が好ましい。このような免疫機能を改変した免疫細胞としては、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法に使用される改変Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）、及びＴＣＲ－Ｔ細胞療法に使用される改変Ｔ細胞（ＴＣＲ－Ｔ細胞）等が挙げられる。
　具体的には、まず、アスコルビン酸又はその誘導体、ＴＧＦ－β、及び標的化合物を混合した培養培地中で、細胞構造体を培養する。培養培地としては、細胞構造体を製造する際に用いたものと同様の培地を用いることができる。アスコルビン酸、ＴＧＦ－β、及び標的化合物は、細胞構造体を培養する培地中に、同時に添加してもよく、それぞれ別個に添加してもよい。
　アスコルビン酸とは、水溶性ビタミンであるビタミンＣとして知られている、ラクトン構造を有する有機化合物である。アスコルビン酸は、光学活性化合物であり、Ｌ体とＤ体が存在するが、Ｌ体が好ましい。なお、ビタミンＣとして知られているのはＬ体である。アスコルビン酸としては、アスコルビン酸塩又はアスコルビン酸誘導体であってもよい。アスコルビン酸塩としては、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カリウム及びアスコルビン酸カルシウム等が挙げられる。アスコルビン酸誘導体としては、例えば、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸リン酸ナトリウム及びアスコルビン酸２－グルコシド等が挙げられる。
　培養培地に混合するアスコルビン酸又はその誘導体、ＴＧＦ－β、及び標的化合物の量は、それぞれ、細胞構造体を構成する細胞の種類や数、含まれているがん細胞の種類や量、培養培地の種類、培養温度、又は培養時間等の条件を考慮して実験的に決定することができる。同様に、培養培地に混合する免疫細胞の量も、細胞構造体を構成する細胞の種類や数、含まれているがん細胞の種類や量、培養培地の種類、培養温度、又は培養時間等を考慮して実験的に決定することができる。
　アスコルビン酸の培地中での濃度は、アスコルビン酸とＴＧＦ－βとを含む培地で培養後少なくとも３日間、立体的細胞組織の厚さを５０μｍ超にできる限り、特に限定されず、培地の総体積に対し０．０２ｍＭ以上０．７ｍＭ以下であってもよく、０．０２ｍＭ以上０．５ｍＭ以下であってもよく、０．０２ｍＭ以上０．３ｍＭ以下であってもよく、０．０２ｍＭ以上０．１ｍＭ以下であってもよく、０．０５ｍＭ以上０．７ｍＭ以下であってもよく、０．０５ｍＭ以上０．５ｍＭ以下であってもよく、０．０５ｍＭ以上０．３ｍＭ以下であってもよく、０．０５ｍＭ以上０．１ｍＭ以下であってもよく、０．０７ｍＭ以上１ｍＭ以下であってもよく、０．０７ｍＭ以上０．７ｍＭ以下であってもよく、０．０７ｍＭ以上０．５ｍＭ以下であってもよく、０．０７ｍＭ以上０．３ｍＭ以下であってもよく、０．０７ｍＭ以上０．１ｍＭ以下であってもよい。
　ＴＧＦ－β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－β）は、ＴＧＦ－βファミリーに属するサイトカインであり、哺乳動物で３種類のアイソフォーム（具体的には、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３）が存在する。ＴＧＦ－βは、細胞増殖、細胞死、細胞分化、免疫調節及び細胞運動等において重要な役割を果たしている。本実施形態において、ＴＧＦ－βは、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２及びＴＧＦ－β３のいずれであってもよい。
　ＴＧＦ－βの培地中での濃度は、アスコルビン酸とＴＧＦ－βとを含む培地で培養後少なくとも３日間、立体的細胞組織の厚さを５０μｍ超にできる限り、特に限定されず、０．０５ｎｇ／ｍＬ以上１５ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０５ｎｇ／ｍＬ以上１２ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０５ｎｇ／ｍＬ以上１０ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０５ｎｇ／ｍＬ以上７ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０５ｎｇ／ｍＬ以上５ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０７ｎｇ／ｍＬ以上１５ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０７ｎｇ／ｍＬ以上１２ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０７ｎｇ／ｍＬ以上１０ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０７ｎｇ／ｍＬ以上７ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０７ｎｇ／ｍＬ以上５ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．１ｎｇ／ｍＬ以上１５ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．１ｎｇ／ｍＬ以上１２ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．１ｎｇ／ｍＬ以上１０ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．１ｎｇ／ｍＬ以上７ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．１ｎｇ／ｍＬ以上５ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．２ｎｇ／ｍＬ以上１５ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．２ｎｇ／ｍＬ以上１２ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．２ｎｇ／ｍＬ以上１０ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．２ｎｇ／ｍＬ以上７ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．２ｎｇ／ｍＬ以上５ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．５ｎｇ／ｍＬ以上１５ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．５ｎｇ／ｍＬ以上１２ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．５ｎｇ／ｍＬ以上１０ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．５ｎｇ／ｍＬ以上７ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．５ｎｇ／ｍＬ以上５ｎｇ／ｍＬ以下であってもよい。
　前記細胞構造体を、アスコルビン酸又はその誘導体、ＴＧＦ－β、及び標的化合物を含有する培地中で培養する際の培養時間は、当該細胞構造体内の繊維芽細胞がＣＡＦ化するために充分な時間であればよく、例えば、２４～９６時間とすることができ、４８～９６時間であることが好ましく、４８～７２時間であることがより好ましい。また、培養環境を著しく変化させない限度において、必要に応じて還流等の流体力学的な付加を与えることもできる。
　ＴＧＦ－β等の存在下で培養した後の細胞構造体を、さらに免疫細胞を添加して培養する。当該細胞構造体への免疫細胞の添加は、免疫細胞を含有させた新しい培養培地に培地交換することにより行うことが好ましい。免疫細胞添加後の培養時間は、特に限定されるものではなく、例えば、２４～９６時間とすることができ、４８～９６時間であることが好ましく、４８～７２時間であることがより好ましい。また、培養環境を著しく変化させない限度において、必要に応じて還流等の流体力学的な付加を与えることもできる。
　なお、ＣＡＦ化工程においてアスコルビン酸又はその誘導体とＴＧＦ－βとを用いる例について説明したが、本発明はこれに限定されない。ＣＡＦ化させる手段としては、ＴＧＦ－βファミリーリガンド、ｌｉｐｉｄ　ｍｅｄｉａｔｏｒ　ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ　ａｃｉｄ、炎症性サイトカイン（ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＴＮＦ）、癌細胞との接触（Ｎｏｔｃｈシグナル）及び生理的ストレスを与えることが挙げられる。長時間、細胞構造体の厚みが維持できるため、ＣＡＦ化させる手段として、アスコルビン酸又はその誘導体及びＴＧＦ-βを投与することがより好ましい。
　＜評価工程＞
　免疫細胞を細胞構造体に添加して培養する工程後の細胞構造体中のがん細胞の生細胞数を指標として、標的化合物のＣＡＦ化抑制能を評価する。標的化合物がＣＡＦ化抑制能を有する場合には、当該標的化合物を含む培地で培養した場合には、当該標的化合物を含まない培地で培養された場合よりも、細胞構造体中のＣＡＦ量が少なく、免疫細胞が浸潤しやすいため、生残するがん細胞数が少なくなる。標的化合物のＣＡＦ化抑制能が高いほど、生残がん細胞数が減少する。標的化合物がＣＡＦ化抑制能を有していない場合には、当該標的化合物を含む培地で培養した場合の生残がん細胞数は、当該標的化合物を含まない培地で培養した場合と同程度である。
　具体的には、標的化合物が存在していない以外は同じ環境下で培養した場合と比較して、前記細胞構造体中のがん細胞の生細胞数（生残がん細胞数ともいう）が少ない場合には、当該標的化合物はＣＡＦ化抑制能を有すると評価し、生残がん細胞数が同程度又は多い場合には、当該標的化合物はＣＡＦ化抑制能を有していないと評価する。２種以上の標的化合物に対して、それぞれ評価を行う場合には、生残がん細胞数がより少ないほうが、より高いＣＡＦ化抑制能を有すると評価する。
　細胞構造体中のがん細胞の生細胞数は、がん細胞の生細胞又はがん細胞の生細胞の存在量に相関のあるシグナルを用いて評価することができる。評価時点のがん細胞の生細胞数を測定できればよく、必ずしも生きている状態で測定する必要はない。例えば、がん細胞をその他の細胞と区別するように標識し、当該標識からのシグナルを指標として調べることができる。例えば、がん細胞を蛍光標識した後、細胞の生死判定を行うことにより、細胞構造体中の生きているがん細胞を直接計数することができる。この際、画像解析技術を利用することもできる。細胞の生死判定はトリパンブルー染色やＰＩ（Propidium Iodide）染色等の公知の細胞の生死判定方法により行うことができる。なお、がん細胞の蛍光標識は、例えば、がん細胞の細胞表面に特異的に発現している物質に対する抗体を一次抗体とし、当該一次抗体と特異的に結合する蛍光標識二次抗体を用いる免疫染色法等の公知の手法で行うことができる。細胞の生死判定及び生細胞数の測定は、細胞構造体の状態で行ってもよく、細胞構造体を単細胞レベルに破壊した状態で行ってもよい。例えば、がん細胞と死細胞を標識した後の細胞構造体の立体構造を破壊した後、標識を指標としたＦＡＣＳ(fluorescence activated cell sorting)等により、評価時点において生きていたがん細胞のみを直接計数することもできる。
　細胞構造体中のがん細胞を生きている状態で標識し、当該標識からのシグナルを経時的に検出することによって、当該細胞構造体中のがん細胞の生細胞数を経時的に測定することもできる。細胞構造体を構築した後に当該細胞構造体中のがん細胞を標識してもよく、細胞構造体を構築する前に予めがん細胞を標識しておいてもよい。例えば、がん患者由来のがん細胞を含む細胞群を含む細胞構造体を用いる場合、細胞構造体を構築する前に、予めがん細胞を標識しておくこともできる。また、がん細胞と共にがん患者由来のその他の細胞も同様に標識されていてもよい。その他、蛍光色素を恒常的に発現させているがん細胞を用いた場合には、細胞構造体を溶解させて得られたライセートの蛍光強度をマイクロプレートリーダー等で測定することによっても、がん細胞の生細胞数を評価することができる。
　本実施形態に係る評価方法は、実際の生体内におけるがん細胞の周辺組織の構造に近い間質を備える細胞構造体を用いており、よりｉｎ　ｖｉｖｏに近い環境をｉｎ　ｖｉｔｒｏで模した状態で評価を行うため、標的化合物のＣＡＦ化抑制能について信頼性の高い評価を得ることができる。本実施形態に係る評価方法によりＣＡＦ化抑制能があると評価された化合物は、実際にがん患者に投与した場合でも、充分なＣＡＦ化抑制能を発揮し、がん免疫療法や抗がん剤治療と組み合わせることによって、より高い治療効果が得られることが期待できる。このため、本実施形態に係る評価方法は、創薬現場におけるＣＡＦ化抑制剤候補化合物のスクリーニングやドラッグリポジショニングスクリーニング、臨床現場における抗がん剤治療法（単剤・併用）の選別・決定（抗がん剤感受性試験）等において、これまでにないｉｎ　ｖｉｔｒｏ薬効評価ツールとして利用することができる。
　その他、免疫細胞に代えて、又は免疫細胞と共にさらに、各種抗がん剤や免疫療法剤等を使用することにより、それぞれの抗がん効果について、より信頼性の高い評価を行うこともできる。
　免疫療法剤は、免疫細胞の免疫機能又は運動能の活性化等により、免疫機能を向上させることによって抗がん効果を得る薬剤である。免疫療法剤としては、例えば、生体応答調節剤療法に用いられる薬剤（以下、「ＢＲＭ製剤」と略記する。）、免疫細胞から分泌され、遊走や浸潤に関与するサイトカインから形成されたサイトカイン系製剤、近年注目を集めるがん免疫チェックポイント阻害剤、がんワクチン、がんウイルスなどが挙げられる。ＢＲＭ製剤としては、クレスチン、レンチナン、ＯＫ－４３２などが挙げられる。サイトカイン系製剤としては、例えば、ＩＬ－８、及びＩＬ－２などのインターロイキン；ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮ－γなどのインターフェロン；及びＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１６／ＣＸＣＲ６、及びＣＸ３ＣＬ１／ＣＸ３ＣＲ１などのケモカインが挙げられる。
　＜ＣＡＦ化抑制剤の選定方法＞
　もう一つの側面として、本実施形態に係る化合物選定方法は、繊維芽細胞とがん細胞とを含む細胞構造体を、アスコルビン酸又はアスコルビン酸の誘導体、ＴＧＦ－β、及び標的化合物を含む培地で培養することと、前記細胞構造体の培養後、免疫細胞を前記細胞構造体に添加してさらに培養することと、前記免疫細胞を添加して培養した後における前記細胞構造体中の前記がん細胞の生細胞数をカウントすることと、を含む。
　本実施形態の化合物選定方法において、ＣＡＦ化抑制能の評価方法と同一の部分については、その説明を省略する。
　本実施形態に係る化合物選定方法は、繊維芽細胞とがん細胞とを含む細胞構造体を、アスコルビン酸又はアスコルビン酸の誘導体、ＴＧＦ－β、及び標的化合物を含む培地で培養することと、前記細胞構造体の培養後、免疫細胞を前記細胞構造体に添加してさらに培養することを含む。細胞構造体については、ＣＡＦ化抑制能の評価方法で説明される細胞構造体と同一である。上述の通り、アスコルビン酸又はアスコルビン酸の誘導体とＴＧＦ－βは、細胞構造体中の繊維芽細胞のＣＡＦ化を引き起こすＣＡＦ化剤である。そのため、標的化合物がＣＡＦ化抑制能を有していない場合は、細胞構造体の、具体的には細胞構造体中の繊維芽細胞のＣＡＦ化が生じる。標的化合物がＣＡＦ化抑制能を有している場合は、細胞構造体の、具体的には細胞構造体中の繊維芽細胞のＣＡＦ化が抑制される。
　次いで、免疫細胞を添加して培養した後における細胞構造体中のがん細胞の生細胞数をカウントする。標的化合物がＣＡＦ化抑制能を有する場合には、当該標的化合物を含む培地で培養した場合には、当該標的化合物を含まない培地で培養された場合よりも、細胞構造体中のＣＡＦ量が少なく、免疫細胞が浸潤しやすいため、生残するがん細胞数が少なくなる。標的化合物のＣＡＦ化抑制能が高いほど、生残がん細胞数が減少する。標的化合物がＣＡＦ化抑制能を有していない場合には、当該標的化合物を含む培地で培養した場合の生残がん細胞数は、当該標的化合物を含まない培地で培養した場合と同程度である。
　具体的には、標的化合物が存在していない以外は同じ環境下で培養した場合と比較して、前記細胞構造体中のがん細胞の生細胞数（生残がん細胞数ともいう）が少ない場合に、当該標的化合物はＣＡＦ化抑制能を有する化合物として選択される。標的化合物が存在していない以外は同じ環境下で培養した場合と比較して、生残がん細胞数が同程度又は多い場合には、当該標的化合物はＣＡＦ化抑制能を有していないと評価する。２種以上の標的化合物からＣＡＦ化抑制能を有する化合物を選択する場合は、生残がん細胞数がより少ないほうを、より高いＣＡＦ化抑制能を有する化合物として選択する。
　＜ＣＡＦ化抑制剤の評価用キット＞
　本実施形態に係る評価方法及び選定方法に用いられる試薬等をキット化したＣＡＦ化抑制剤評価用キットを用いることにより、本実施形態に係る評価方法をより簡便に実施することができる。例えば、少なくとも繊維芽細胞とがん細胞を含む細胞構造体と、当該細胞構造体を収容する細胞培養容器は、キットを構成することができる。また、当該キットには、細胞構造体に代えて、細胞構造体を構成する細胞と、当該細胞構造体を製造する際に用いられる培養容器を備えることもできる。
　当該キットは、さらに、当該評価方法及び選定方法において用いられるその他の物質を備えることもできる。当該その他の物質としては、例えば、アスコルビン酸又はその誘導体、ＴＧＦ－β、細胞構造体の培養培地、がん細胞を標識するための標識物質、細胞の生死判定用試薬、細胞構造体を構築する際に使用する物質（例えば、カチオン性緩衝液、強電解質高分子、細胞外マトリックス成分等）、などが挙げられる。
　以下、実施例を示し、本実施形態を具体的に説明するが、本実施形態は下記実施例に限定されない。
　＜試薬＞
　以降の実験において、下記の試薬を用いた。
　また、Ｔ細胞以外の細胞の培養においては、１０％ ＦＢＳ（ウシ胎児血清）と１％ Ｐ/Ｓを含有させたＤＭＥＭ（以降、「汎用培地」と称する）を培養培地として用いた。Ｔ細胞の培養においては、１％ ＨＥＰＥＳ、５５ｍＭ ２－ＭＥ及び１％ Ｐ/Ｓを含有させたＡＩＭ－Ｖ培地（以降、「Ｔ細胞用培地」と称する）を培養培地として用いた。
　培養容器としては、「トランズウェルカルチャーインサート」（型番：３４７０、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を用いた。
　＜細胞＞
　ヒト新生児由来皮膚線維芽細胞（Normal Human Dermal Fibroblasts：ＮＨＤＦ）（Ｌｏｎｚａ社製、製品番号：ＣＣ－２５０９）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell：ＨＵＶＥＣ）（Ｌｏｎｚａ社製、製品番号：Ｃ２５１７Ａ）を用いた。がん細胞として、ヒト結腸腺癌由来のＨＣＴ１５／β２ｍ細胞を緑色蛍光タンパク質ＧＦＰを恒常的に発現するよう遺伝子改変した細胞（札幌医科大学より提供）を用いた。
　［参考例１］
　線維芽細胞と血管内皮細胞とがん細胞とから形成される細胞構造体を、アスコルビン酸誘導体（ＡｓｃＰ）、ＴＧＦ－β１、及び細胞障害性Ｔ細胞を含む培養培地で培養し、ＣＡＦ化と生残がん細胞数の関係を調べた。
　＜細胞構造体の作製１＞
　まず、間質細胞層を形成した。具体的には、ＮＨＤＦ（１×１０６個）とＨＵＶＥＣ（１．５×１０４個）を、ヘパリンとコラーゲンを含有するトリス－塩酸緩衝液（０．１ｍｇ／ｍＬ　ヘパリン、０．１ｍｇ／ｍＬ　コラーゲン、５０ｍＭ　トリス、ｐＨ７．４）に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を、室温、１０００×ｇで２分間、遠心処理し、上清を取り除いた後、３００μＬの汎用培地で再懸濁した。次いで、培養容器外側に１ｍＬの汎用培地を添加し、予め０．１ｍｇ／ｍＬフィブロネクチンでコートした培養容器インサート内に、細胞懸濁液全量（３００μＬ）を添加し、室温、４００×ｇで２分間、遠心処理した後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて２時間静置した。その後、培養容器外側に１ｍＬの汎用培地を添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて一晩静置した。
　次いで、形成された間質層の上にがん細胞層を形成した。具体的には、まず、培養容器外側の培地を除去した後、新たに１ｍＬの汎用培地を添加した。次いで、培養容器インサート内の培地を除去し、がん細胞の懸濁液（１×１０３個のがん細胞を１００μＬの汎用培地に懸濁させた液）を培養容器インサート内に添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて２時間静置した。
　その後さらに、がん細胞層の上に間質細胞層を形成した。具体的には、まず、ＮＨＤＦ（１×１０６個）とＨＵＶＥＣ（１．５×１０４個）を、ヘパリンとコラーゲンを含有するトリス－塩酸緩衝液（０．１ｍｇ／ｍＬ　ヘパリン、０．１ｍｇ／ｍＬ　コラーゲン、５０ｍＭ　トリス、ｐＨ７．４）に懸濁し、得られた細胞懸濁液を、室温、１０００×ｇで２分間、遠心処理し、上清を取り除いた後、２００μＬの汎用培地で再懸濁した。次いで、得られた細胞懸濁液を、がん細胞層を形成させた培養容器インサート内に添加し、室温、４００×ｇで２分間、遠心処理した後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて２時間静置した。これにより、がん細胞層が間質細胞層で挟まれた細胞構造体が形成された。
　＜ＣＡＦ化＞
　細胞構造体を形成した培養容器インサート外の汎用培地を除去し、１００μＭ ＡｓｃＰと１ｎｇ/ｍＬ ＴＧＦ－β１を含有させた汎用培地を２.３ｍＬ添加した。次いで、この培養容器を、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて３日間培養した（ＣＡＦ化細胞構造体）。
　対照として、ＡｓｃＰとＴＧＦ－β１を含有させていない汎用培地を２.３ｍＬのみを添加し、同様に培養したものを、コントロール（ＣＴＬ）細胞構造体とした。
　＜ＴＣＲ－Ｔの添加＞
　次いで、培養容器外側の培地を除去し、１ｍＬのＴ細胞用培地を添加した後、培養容器インサート内の培地を除去し、ＴＣＲ－Ｔ細胞懸濁液（ＴＣＲ－Ｔ細胞を３００μＬのＴ細胞用培地に懸濁させた液）を培養容器インサート内に添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて３～７日間培養した。
　＜蛍光標識ＴＣＲ－Ｔ＞
　細胞構造体に添加するＴＣＲ－Ｔを予め蛍光標識しておくことにより、ＴＣＲ－Ｔの細胞構造体中のがん細胞への浸潤の状態を評価した。ＴＣＲ－Ｔの蛍光標識には、蛍光物質（Ａｌｅｘａ６４７）で標識した抗ＣＤ８抗体（ＣＤ８_Ａｌｅｘａ６４７、５５７７０８、ＢＤ社製）を用いた。
　まず、ＴＣＲ－Ｔ細胞（２×１０５個）を、５０μＬの１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳに懸濁し、２μＬの蛍光標識抗体溶液を添加して混合し、４℃で３０分間以上静置した。その後、５００μＬの１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳで洗浄した後、適当な細胞数になるようにＴ細胞用培地に懸濁させた。得られた蛍光標識ＴＣＲ－Ｔ細胞懸濁液を、培養容器インサート内に添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて３～７日間培養した。
　＜生細胞数解析及び評価＞
　がん細胞に発現しているＧＦＰを、顕微鏡システム（「ＯｐｅｒｅｔｔａＣＬＳ」、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて、培養容器インサート内の細胞構造体の全体が撮像範囲に入るようにして撮影した。取得された画像の画像解析により、インサート内を占める生きているがん細胞（ＧＦＰが検出された細胞）の割合（コンフルエントな状態の細胞数を１００％とする）をがん細胞生残率（％）として算出した。
　ＴＣＲ－Ｔを添加していないコントロールの細胞構造体のがん細胞生残率（％）を１００％としたときの、ＴＣＲ－Ｔを添加した細胞構造体のがん細胞生残率（％）を、相対がん細胞生残率（％）として算出した。
　＜切片評価＞
　生細胞数解析を行った細胞構造体を、ＰＢＳで２回洗浄した後、３００μＬの１０％ ホルマリン緩衝液を添加して１５分間以上静置することにより固定した。固定後の細胞構造体は、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、低毒性溶剤（「Ｇ－Ｎｏｘ」、ジェノスタッフ社製）とパラフィン包埋装置（「ＣＴ－Ｐｒｏ２０」、ジェノスタッフ社製）を用いて、固定後の細胞構造体をパラフィンで包埋した後、厚さ６ｍｍの切片を調製した。
　得られたパラフィン切片を、クエン酸バッファー（ｐＨ６）に浸漬させた状態で電子レンジで加熱することにより抗原を賦活化させた後、抗α－ＳＭＡ（ａｌｐｈａ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ）抗体（マウスモノクローナル抗体、Ｍ０８５１、Ｄａｋｏ社製）で染色した（抗体濃度：０．２μｇ／ｍＬ）。次いで、当該パラフィン切片を、プロテイナーゼＫ溶液（５μｇ／ｍＬ）に浸漬させて酵素処理を行うことにより抗原を賦活化させた後、抗ファイブロネクチン抗体（マウスモノクローナル抗体、ａｂ６３２８、ａｂｃａｍ社製）で染色した（抗体濃度：０．４μｇ／ｍＬ）。
　別のパラフィン切片を、Ｐｉｃｒｏ－Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ（０．１％ シリウスレッド－飽和ピクリン液)に浸漬させて、コラーゲンを染色した。
　染色後のパラフィン切片をスライドガラスに載せ、光学顕微鏡（ＭＸ５１、オリンパス社製）を用いて観察し、画像を取得した。
　ＡｓｃＰとＴＧＦ－β１によりＣＡＦ化させた細胞構造体と、ＣＡＦ化させていないコントロールの細胞構造体について、播種した細胞数ごとの相対がん細胞生残率（％）の測定結果を図１に示す。ＣＡＦ化させた細胞構造体（図中、「ＣＡＦ」）は、コントロールの細胞構造体（図中、「ＣＮＴ」）よりも、相対がん細胞生残率が明らかに高かった。これは、ＣＡＦ化によりＴＣＲ－Ｔが細胞構造体内に浸潤し難くなり、がん細胞へ到達するＴＣＲ－Ｔが減ったためと推察された。
　図２に、各細胞構造体のパラフィン切片の染色画像を示す。図２中、「ＨＥ」はヘマトキシリン・エオジン染色画像である。ＣＡＦ化させた細胞構造体（図２中、「ＣＡＦ」）では、コントロールの細胞構造体（図２中、「ＣＮＴ」）よりも、α－ＳＭＡ、フィブロネクチン、及びコラーゲンが全て増量していた。
　また、蛍光標識ＴＣＲ－Ｔ細胞を添加して培養した細胞構造体について、蛍光撮像装置（「Ｏｐｅｒｅｔｔａ ＣＬＳ」、Ｒｅｖｖｉｔｙ社製）を用いて、ウェル中心付近の視野の蛍光画像を撮影した（×１０倍レンズ）。ＴＣＲ－Ｔ細胞を添加直後（図中、「０ｈ」）と添加後培養２４時間後（図中、「２４ｈ」）の蛍光画像（ＧＦＰ／ＣＤ８－Ａｌｅｘａ６４７）を図３に示す。この結果、コントロールの細胞構造体（図中、「ＣＮＴ」）では、がん細胞（ＨＣＴ１５／β２ｍ細胞：ＧＦＰ）の周辺に蛍光標識ＴＣＲ－Ｔ細胞（ＣＤ８－Ａｌｅｘａ６４７）が集積しているのが確認された。一方で、ＣＡＦ化させた細胞構造体（図中、「ＣＡＦ」）では、がん細胞周辺への蛍光標識ＴＣＲ－Ｔ細胞の集積は観察されなかった。
　［実施例１］
　いくつかの薬剤（低分子化合物）について、ＣＡＦ化抑制能の有無を調べた。具体的には、薬剤を、様々な濃度で、ＡｓｃＰとＴＧＦ－β１と同時に細胞構造体に添加した以外は、参考例１と同様にして、ＣＡＦ化させた細胞構造体とコントロールの細胞構造体の相対がん細胞生残率（％）を算出した。薬剤無添加のコントロールでは、薬剤と等量のＤＭＳＯを添加した。
　比較対象として、ＴＣＲ－Ｔ細胞を添加せず、薬剤のみを添加して同様に培養した細胞構造体の相対がん細胞生残率（％）も算出した。
　この結果、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）（ＣＡＳ　Ｎｏ.：５８８８０－１９－６）とＢＥＴファミリー阻害剤であるＪＱ－１（ＣＡＳ　Ｎｏ.：１２６８５２４－７０－４）は、ＣＡＦ化抑制能があると評価された。ＣＡＦ化抑制能を有していない薬剤を添加した場合の一般的な相対がん細胞生残率（％）の挙動を図４（Ａ）に、ＴＳＡを添加したＣＡＦ化させた細胞構造体の相対がん細胞生残率（％）の測定結果を図４（Ｂ）に、ＪＱ－１を添加したＣＡＦ化させた細胞構造体の相対がん細胞生残率（％）の測定結果を図４（Ｃ）に、それぞれ示す。図中、「薬剤のみ」は、薬剤のみを添加した細胞構造体の相対がん細胞生残率（％）であり、「薬剤＋免疫細胞」は、薬剤を添加した後、ＴＣＲ－Ｔ細胞を添加した細胞構造体の相対がん細胞生残率（％）である。
　添加した薬剤がＣＡＦ化抑制能を有していない場合には、図４（Ａ）に示すように、ＴＣＲ－Ｔ細胞を添加した場合のほうが、相対がん細胞生残率（％）は低くなるが、薬剤濃度を変えても相対がん細胞生残率（％）は変化しない。これは、薬剤自体に、ＴＣＲ－Ｔ細胞の細胞障害性を促進する効果がないためである。
　一方で、図４（Ｂ）に示すように、ＴＳＡを添加したＣＡＦ化させた細胞構造体では、薬剤のみを添加した細胞構造体の相対がん細胞生残率（％）の挙動から予想される薬剤とＴＣＲ－Ｔ細胞を添加した細胞構造体の相対がん細胞生残率（％）の挙動（図中、二点鎖線）よりも、実際のＴＣＲ－Ｔ細胞を添加した細胞構造体の相対がん細胞生残率（％）は、明らかに低かった。同様に、図４（Ｃ）に示すように、ＪＱ－１を添加したＣＡＦ化させた細胞構造体でも、薬剤のみを添加した細胞構造体の相対がん細胞生残率（％）の挙動から予想される薬剤とＴＣＲ－Ｔ細胞を添加した細胞構造体の相対がん細胞生残率（％）の挙動（図中、二点鎖線）よりも、実際のＴＣＲ－Ｔ細胞を添加した細胞構造体の相対がん細胞生残率（％）は、明らかに低かった。これは、がん細胞への障害性に、薬剤とＴＣＲ－Ｔ細胞の相乗効果があることを示している。
　ＴＳＡを添加した細胞構造体の培養７日目と１１日目（ＴＣＲ－Ｔ細胞添加から培養３日目と７日目）の相対がん細胞生残率（％）の結果に対して、薬剤併用効果解析ソフトウェア（Ｓｙｎｅｒｇｙ　Ｆｉｎｄｅｒ）を用いて、がん細胞への細胞障害性に対して、ＴＣＲ－Ｔ細胞とＴＳＡに相乗効果があるかどうかを判定した。この結果、シナジースコアは、培養７日目の結果からは２１．６５１であり、培養１１日目の結果からは２８．２１４であり、いずれも、ＴＣＲ－Ｔ細胞とＴＳＡに相乗効果があると判断された。
　また、ＴＳＡを添加した細胞構造体について、蛍光標識ＴＣＲ－Ｔ細胞を添加して培養し、参考例１と同様にして、蛍光画像を撮影した。ＴＣＲ－Ｔ細胞を添加直後（図中、「０ｈ」）と添加後培養２４時間後（図中、「２４ｈ」）の蛍光画像（ＧＦＰ／ＣＤ８－Ａｌｅｘａ６４７）を図５に示す。蛍光標識ＴＣＲ－Ｔ細胞添加から培養２４時間目において、ＴＳＡ無添加の細胞構造体（図中、「ＤＭＳＯ」）では、がん細胞周辺への蛍光標識ＴＣＲ－Ｔ細胞の集積は抑制されており、観察されなかった。これに対して、ＴＳＡを共に添加した細胞構造体（図中、「ＴＳＡ」）では、ＣＡＦ化未処理の細胞構造体と同様に、がん細胞の周辺に蛍光標識ＴＣＲ－Ｔ細胞が集積しているのが確認された。つまり、ＣＡＦ化によって抑制されていた免疫細胞のがん細胞への集積が、ＴＳＡにより解除されたことが確認された。
　このように、ＴＳＡとＪＱ－１の添加により、ＴＣＲ－Ｔ細胞によるがん細胞の細胞障害性が促進されており、また、ＴＣＲ－Ｔ細胞のがん細胞への集積も観察されたことから、ＴＳＡとＪＱ－１は、ＣＡＦ化抑制能を有していると評価された。
　実際にＴＳＡがＣＡＦ化抑制能を有していることを確認するために、ウェスタンブロッティングを行い、α－ＳＭＡ等のＣＡＦ化により増加する繊維タンパク質の発現量に対する、ＴＳＡ添加の影響を調べた。
　具体的には、がん細胞層を形成させない以外は参考例１と同様にして、ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣからなる細胞構造体を形成した。次いで、前記と同様にして、当該細胞構造体を、ＡｓｃＰとＴＧＦ－β１とＴＳＡとを図６に示す組み合わせで含有させた汎用培地を添加して３日間培養した。
　培養後の細胞構造体を、ＳＤＳ Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒで溶解し、１００℃、５分間の加熱処理の後、３０秒間ボルテックスミキサーにて撹拌した。その後、１６，５００×ｇで１０分間の遠心処理を行い、上清を回収した。タンパク質定量キット（「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ＢＣＡ Ｋｉｔ」、富士フイルム和光純薬社製）を用いて、当該上清のタンパク質を定量した。上清のタンパク質２μｇ、６×ＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（最終濃度１×、コスモバイオ社製）、ＲＩＰＡ Ｂｕｆｆｅｒ（１０μＬに調整、富士フイルム和光純薬社製）を混合し、泳動サンプルを調製した。
　調製された泳動サンプルと分子量マーカーを電気泳動した（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）。タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のゲルからＰＶＤＦ膜へ転写した。転写後の膜を、４％ ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔ（１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、１×ＴＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ）でブロッキング処理した後、一次抗体液で、４℃で一晩反応させた。一次抗体として、抗ＣＯＬ１Ａ１（Ｅ８Ｆ４Ｌ）抗体（７２０２６、ＣＳＴ社製）、抗α－ＳＭＡ（Ｄ４Ｋ９Ｎ）抗体（１９２４５、ＣＳＴ社製）、抗ＧＡＰＤＨモノクローナル抗体（０１６－２５５２３、富士フイルム和光純薬社製）を用いた。次いで、当該膜を、ＴＢＳ－Ｔで洗浄した後、二次抗体液で、１時間振とうしながら反応させた。二次抗体として、Ａｍｅｒｓｈａｍ　ＥＣＬ用ＨＲＰ標識ウサギＩｇＧ全長抗体（ＮＡ９３４Ｖ、Ｃｙｔｉｖａ社製）とＡｍｅｒｓｈａｍ　ＥＣＬ用ＨＲＰ標識マウスＩｇＧ全長抗体（ＮＡ９３１、Ｃｙｔｉｖａ社製）を用いた。再度ＴＢＳ－Ｔで洗浄した後、検出試薬「ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標） Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ」（３４０９５、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）と画像解析装置「Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｍａｇｅｒ６００」（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、各抗体で検出されたバンドを検出した。
　取得したブロッティング画像を図６に示す。ＡｓｃＰとＴＧＦ－β１を添加して培養したサンプル２では、ＡｓｃＰとＴＧＦ－β１を添加していないサンプル１よりも、α－ＳＭＡの発現量が明らかに増量していた。ＴＳＡのみを添加して培養したサンプル３では、α－ＳＭＡの発現量はサンプル１と同程度であった。これに対して、ＡｓｃＰとＴＧＦ－β１とＴＳＡを添加して培養したサンプル４は、サンプル２よりも、α－ＳＭＡの発現量が明らかに減少していたことに加えて、コラーゲンの発現量の低下していた。これらの結果から、ＴＳＡは、ＣＡＦ化抑制能を有することが確認された。
　［実験例２］
　（細胞構造体の製造２）
　《間質細胞の作製》
　１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％抗生物質溶液（ペニシリン、ストレプトマイシン）を含むＤＭＥＭ培地（型番「０４３－３００８５」、富士フィルム和光純薬）を調製した（以下、「汎用培地」という場合がある。）。
　１．０×１０６細胞のヒト新生児由来皮膚線維芽細胞ＮＨＤＦ（型番「ＣＣ－２５０９」、ロンザ社）及び１．５×１０４細胞のヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣ（型番「Ｃ２５１７Ａ」、ロンザ社）を、０．１ｍｇ／ｍＬヘパリン（型番「Ｈ３１４９－１００ＫＵ」、シグマ社）、０．１ｍｇ／ｍＬコラーゲン（型番「ＡＳＣ－１－１００－１００」、シグマ社）を含む、５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）に懸濁した。
　続いて、細胞懸濁液を、室温、１，０００×ｇ（重力加速度）で２分間遠心分離し、上清を取り除き、汎用培地３００μＬに再懸濁した。続いて、得られた細胞懸濁液を、外側に汎用培地１ｍＬを添加し、予め、０．１ｍｇ／ｍＬフィブロネクチンでコートした２４ウェルセルカルチャーインサート（型番「３４７０」、コーニング社）内に播種した。
　続いて、セルカルチャーインサートを、室温、４００×ｇで２分間遠心分離後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２時間静置した。続いて、セルカルチャーインサートの外側に、１ｍＬの汎用培地を添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２４時間培養した（この培養を開始した時点を培養開始時とする）。
　《がん細胞の播種》
　上記セルカルチャーインサートの外側の培地を除去し、汎用培地１ｍＬを添加した。続いて、カルチャーインサート内側の培地を除去し、１×１０３個のヒト結腸腺癌細胞ＨＣＴ１５／β２ｍを、汎用培地１００μＬに懸濁して得られた懸濁液１００μＬを、上記セルカルチャーインサート内に播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２時間静置した。
　《間質細胞の積層》
　１．０×１０６個のＮＨＤＦ細胞及び１．５×１０４個のＨＵＶＥＣ細胞を、０．１ｍｇ／ｍＬヘパリン（型番「Ｈ３１４９－１００ＫＵ」、シグマ社）、０．１ｍｇ／ｍＬコラーゲン（型番「ＡＳＣ－１－１００－１００」、シグマ社）を含む、５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）に懸濁した。
　続いて、得られた細胞懸濁液を、室温、１，０００×ｇで２分間遠心分離し、上清を取り除いた後、汎用培地２００μＬに再懸濁した。続いて、細胞を懸濁した汎用培地２００μＬを、がん細胞が播種されたセルカルチャーインサート内に積層した。
　続いて、上記で得られたセルカルチャーインサートを、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２時間静置した。
　《アスコルビン酸とＴＧＦ－βの添加》
　上記セルカルチャーインサートの内側及び外側の培地を除去し、アスコルビン酸リン酸マグネシウム（型番「０１３－１２０６１」、富士フィルム和光純薬社）とＴＧＦ－β（型番「２０９－１６５４４」、富士フィルム和光純薬社）を用い、アスコルビン酸の濃度が、０ｍＭ、０．０５ｍＭ又は０．１ｍＭ、ＴＧＦ－βの濃度が、０ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ又は１０ｎｇ／ｍＬとなる汎用培地２ｍＬを添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で３日間培養した。その後、カルチャーインサートの内側と外側の培地を除去し、アスコルビン酸の濃度が、０ｍＭ、０．０５ｍＭ又は０．１ｍＭ、ＴＧＦ－βの濃度が、０ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ又は１０ｎｇ／ｍＬとなる汎用培地２．３ｍＬを添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で３日間培養した。
　《細胞構造体の固定》
　培養開始時から４日後と７日後に、得られた細胞構造体を、ＰＢＳで２回洗浄し、１０％ホルマリン緩衝液（型番「０６２－０１６６１」、富士フィルム和光純薬社）３００ｍＬを、セルカルチャーインサート内に添加し、１５分間以上静置した後に、ＰＢＳで３回洗浄し、細胞構造体の固定を行った。
　《細胞構造体の観察》
　上記で得られた細胞構造体を、顕微鏡システム（ＯｐｅｒｅｔｔａＣＬＳ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて、セルカルチャーインサートの内側全体が入るように、明視野モードで観察した。
　図７は、各アスコルビン酸の濃度及びＴＧＦ－βの濃度の培地で培養７日後の細胞構造体の顕微鏡観察の結果を示す画像である。図７に示したように、アスコルビン酸を添加した培地で培養した場合は、細胞構造体が形成された。それに対し、アスコルビン酸を含まず、ＴＧＦ－βのみを含む培地で培養した場合は、細胞組織が収縮して、セルカルチャーインサートから剥離し、細胞構造体が形成されなかった。
　《細胞構造体の厚さの測定》
　続いて、細胞構造体をセルカルチャーインサートから取り出し、パラフィンで包埋後、細胞構造体の上面（セルカルチャーインサートの上面）から見たときの重心を通る線に沿って６ｍｍの薄切切片を作製した。続いて、薄切切片をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を行い、ＨＥ染色した薄切切片を光学顕微鏡（ＭＸ５１、オリンパス社）で撮影し、ＩｍａｇｅＪを用いて、細胞構造体の厚さの最大値を測定した。
　図８は、各培地で培養４日後及び培養７日後にヘマトキシリン・エオジン染色した細胞構造体の顕微鏡観察の結果を示す画像である。図９は、各培地で培養４日後及び培養７日後の細胞構造体の厚さを示すグラフである。図８及び図９中、「汎用培地」は、アスコルビン酸及びＴＧＦ－βを含まない汎用培地で培養した細胞構造体を示し、「アスコルビン酸添加培地」は、アスコルビン酸の濃度が０．１ｍＭの汎用培地で培養した細胞構造体を示し、「アスコルビン酸／ＴＧＦ－β添加培地」は、アスコルビン酸の濃度が０．１ｍＭ及びＴＧＦ－βの濃度が１０ｎｇ／Ｌの汎用培地で培養した細胞構造体を示す。図８及び図９に示したように、アスコルビン酸とＴＧＦ－βとを添加することによって、細胞構造体の厚さが維持され、培養４日後（アスコルビン酸とＴＧＦ－β添加後３日目）でも、細胞構造体の厚さが５０μｍを超えていることが明らかとなった。
　《コラーゲンの形成》
　続いて、細胞構造体をセルカルチャーインサートから取り出し、パラフィンで包埋後、細胞構造体の上面（セルカルチャーインサートの上面）から見たときの重心を通る線に沿って６ｍｍの薄切切片を作製した。得られた薄切切片を０．１％シリウスレッド－飽和ピクリン酸（Ｐｉｃｏ－Ｓｉｒｉｕｓ　Ｒｅｄ；ＰＳＲ）染色を行い、光学顕微鏡（ＭＸ５１、オリンパス社）を用いて観察し、ＰＳＲ染色面積が組織面積に占める割合（ＰＳＲ割合）を算出した。図１０は、各培地で培養４日後及び培養７日後にシリウスレッド－飽和ピクリン酸染色した細胞構造体の顕微鏡観察の結果を示す画像である。図１１各アスコルビン酸の濃度及びＴＧＦ－βの濃度の培地における培養４日後及び培養７日後のＰＳＲ割合を示すグラフである。図１０中、「汎用培地」は、アスコルビン酸及びＴＧＦ－βを含まない汎用培地で培養した細胞構造体を示し、「アスコルビン酸添加」は、アスコルビン酸の濃度が０．１ｍＭの汎用培地で培養した細胞構造体を示し、「アスコルビン酸／ＴＧＦ－β添加」は、アスコルビン酸の濃度が０．１ｍＭ及びＴＧＦ－βの濃度が１ｎｇ／Ｌの汎用培地で培養した細胞構造体を示す。
　図１０及び図１１に示したように、アスコルビン酸、又は、アスコルビン酸とＴＧＦ－βとを添加することにより、ファイバー様コラーゲンが形成された。
　［実験例３］
　（細胞構造体の製造３）
　ＮＨＤＦとして、２．０×１０６細胞のヒト新生児由来皮膚線維芽細胞ＮＨＤＦを、汎用培地又は０．１ｍＭアスコルビン酸を含む汎用培地９０ｍＬを入れたスクエアディッシュ（型番「１６６５０８」、Ｎｕｎｃ社）に播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２４時間培養したＮＨＤＦを用いる以外は、実験例１と同様にして間質細胞の作製、がん細胞の播種及び間質細胞の積層を行った。
　続いて、セルカルチャーインサートの内側と外側の培地を除去し、汎用培地又は０．１ｍＭアスコルビン酸を含む汎用培地２．３ｍＬを添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で３日間培養した。その後、カルチャーインサートの内側と外側の培地を除去し、汎用培地又は０．１ｍＭアスコルビン酸を含む汎用培地２．３ｍＬを添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で３日間培養した。
　《細胞構造体の固定》
　培養開始時から７日後に、細胞構造体を、ＰＢＳで２回洗浄し、１０％ホルマリン緩衝液（型番「０６２－０１６６１」、富士フィルム和光純薬社製）３００μＬを、セルカルチャーインサート内に添加し、１５分間以上静置した後に、ＰＢＳで３回洗浄し、細胞構造体の固定を行った。
　《コラーゲンの形成》
　続いて、細胞構造体をセルカルチャーインサートから取り出し、パラフィンで包埋後、細胞構造体の上面（セルカルチャーインサートの上面）から見たときの重心を通る線に沿って６ｍｍの薄切切片を作製した。得られた薄切切片を０．１％シリウスレッド－飽和ピクリン酸（Ｐｉｃｏ－Ｓｉｒｉｕｓ　Ｒｅｄ；ＰＳＲ）染色を行い、光学顕微鏡（ＭＸ５１、オリンパス社）を用いて観察した。図１２は、各培地で培養４日後及び培養７日後にシリウスレッド－飽和ピクリン酸染色した細胞構造体の顕微鏡観察の結果を示す画像である。
　図１２に示したように、アスコルビン酸を細胞構造体形成後に添加した場合は、コラーゲンの形成が認められたが、ＮＨＤＦに予めアスコルビン酸を添加しても、細胞構造体におけるコラーゲン形成に変化はなかった。このことから、細胞構造体を形成させた後に、アスコルビン酸を含む培地で細胞構造体を培養することが、細胞構造体のコラーゲン形成と厚さの維持には重要であることが明らかとなった。
　以上に、本発明の実施形態を説明したが、実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨から逸脱しない範囲内で、構成の付加、省略、置換、及びその他の変更が可能である。また、本発明は実施形態によって限定されない。
　本実施形態に係る評価方法は、主にがん組織に対するＣＡＦ化抑制能について、動物モデルを用いることなく、より信頼性の高い評価が得られる評価方法である。このため、当該評価方法は、創薬現場における新しいＣＡＦ化抑制剤の開発やドラッグリポジショニングスクリーニング等に利用可能である。

Claims (17)

  1. 　ＣＡＦ化抑制能の評価方法であって、
    　繊維芽細胞とがん細胞とを含む細胞構造体を、アスコルビン酸又はその誘導体、ＴＧＦ－β、及び評価対象の化合物を含む培地で培養するＣＡＦ化工程と、
    　前記ＣＡＦ化工程後に、免疫細胞を前記細胞構造体に添加してさらに培養する培養工程と、
    　前記培養工程後における前記細胞構造体中の前記がん細胞の生細胞数を指標として、前記評価対象の化合物のＣＡＦ化抑制能を評価する評価工程と、
    　を有する、ＣＡＦ化抑制能の評価方法。
  2. 　前記細胞構造体が、天面と底面の両方で前記培地に接しており、
    　前記細胞構造体が、前記がん細胞を含むがん細胞層を含み、
    　前記がん細胞層が、前記細胞構造体の前記底面から厚み方向の４分の１の高さから４分の３の高さまでの範囲内に位置する、請求項１に記載のＣＡＦ化抑制能の評価方法。
  3. 　前記免疫細胞が、白血球及びリンパ球からなる群より選択される１種以上である、請求項１に記載のＣＡＦ化抑制能の評価方法。
  4. 　前記ＣＡＦ化工程の前に、
    　前記細胞構造体を、
    　（ａ）カチオン性緩衝液中で、細胞と細胞外マトリックス成分とを混合して混合物を得る工程と、
    　（ｂ）前記工程（ａ）により得られた混合物を、細胞培養容器中に播種する工程と、
    　（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記細胞培養容器中に細胞が多層に積層された３次元構造体である細胞構造体を得る工程と、
    　により製造する、請求項１に記載のＣＡＦ化抑制能の評価方法。
  5. 　前記免疫細胞が、ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＴＣＲ－Ｔ細胞を含む、請求項３に記載のＣＡＦ化抑制能の評価方法。
  6. 　前記免疫細胞が、制御性Ｔ細胞を含む、請求項３に記載のＣＡＦ化抑制能の評価方法。
  7. 　前記細胞構造体が、複数の細胞層を含み、
    　前記がん細胞が、前記細胞構造体の内部の特定の細胞層にのみ存在している、請求項１に記載のＣＡＦ化抑制能の評価方法。
  8. 　前記細胞構造体の厚みが５μｍ以上である、請求項１に記載のＣＡＦ化抑制能の評価方法。
  9. 　前記細胞構造体の厚みが５００μｍ以下である、請求項１に記載のＣＡＦ化抑制能の評価方法。
  10. 　前記細胞構造体が、さらに、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞からなる群より選択される１種以上を含む、請求項１に記載のＣＡＦ化抑制能の評価方法。
  11. 　前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリン、プロテオグリカン及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４に記載のＣＡＦ化抑制能の評価方法。
  12. 　前記カチオン性緩衝液がさらに強電解質高分子を含有しており、
    　前記強電解質高分子が、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、ポリアクリル酸及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４に記載のＣＡＦ化抑制能の評価方法。
  13. 　前記アスコルビン酸又はその誘導体の割合が、前記培地の総体積に対し０．０７ｍＭ以上１ｍＭ以下である、請求項１に記載のＣＡＦ化抑制能の評価方法。
  14. 　前記ＴＧＦ－βが０．５ｎｇ／ｍＬ以上５ｎｇ／ｍＬ以下である、請求項１に記載のＣＡＦ化抑制能の評価方法。
  15. 　前記ＣＡＦ化工程は、前記細胞構造体を作製した後に行なわれる、請求項１に記載のＣＡＦ化抑制能の評価方法。
  16. 　免疫細胞がＴＣＲ－Ｔ細胞である、請求項１に記載のＣＡＦ化抑制能の評価方法。
  17. 　ＣＡＦ化抑制能の評価方法であって、
    　繊維芽細胞とがん細胞とを含む細胞構造体を、アスコルビン酸又はその誘導体、ＴＧＦ－β、及び評価対象の化合物を含む培地で培養するＣＡＦ化工程と、
    　前記ＣＡＦ化工程後に免疫細胞を前記細胞構造体に添加してさらに培養する培養工程と、
    　前記培養工程後における前記細胞構造体中の前記がん細胞の生細胞数を指標として、前記評価対象の化合物のＣＡＦ化抑制能を評価する評価工程と、を有し、
    　前記細胞構造体が、天面と底面の両方で前記培地に接しており、
    　前記細胞構造体が、前記がん細胞を含むがん細胞層を含み、
    　前記がん細胞層が、前記細胞構造体の前記底面から厚み方向の４分の１の高さから４分の３の高さまでの範囲内に位置し、
    　前記アスコルビン酸又はその誘導体の割合が、前記培地の総体積に対し０．０７ｍＭ以上１ｍＭ以下であり、
    　前記ＴＧＦ－βが０．５ｎｇ／ｍＬ以上５ｎｇ／ｍＬ以下であるＣＡＦ化抑制能の評価方法。
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