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WO2019027015A1 - 核酸複合体 - Google Patents

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WO2019027015A1
WO2019027015A1 PCT/JP2018/029113 JP2018029113W WO2019027015A1 WO 2019027015 A1 WO2019027015 A1 WO 2019027015A1 JP 2018029113 W JP2018029113 W JP 2018029113W WO 2019027015 A1 WO2019027015 A1 WO 2019027015A1
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WO
WIPO (PCT)
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compound
nucleic acid
formula
reference example
mmol
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2018/029113
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English (en)
French (fr)
Inventor
陽史 山田
麻奈 牧野
長谷川　尚
宏徒 岩井
上原　啓嗣
康裕 鈴木
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyowa Kirin Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kirin Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Publication of WO2019027015A1 publication Critical patent/WO2019027015A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid complex, a pharmaceutical composition containing the nucleic acid complex, and the like.
  • nucleic acid drugs As nucleic acid drugs, aptamers, antisenses, decoy nucleic acids, ribozymes, siRNAs, miRNAs and antimiRNAs are known. Nucleic acid drugs are expected to be clinically applicable to various diseases that have been considered difficult to treat up to now, because of their high versatility in which all genes in cells can be controlled. In addition, nucleic acid drugs are expected as next-generation drugs next to antibodies and small molecule drugs because of high target selectivity and activity in cells. However, the problem with nucleic acid medicines is that delivery to target tissues is difficult.
  • nucleic acid complex conjugate of a targeting compound and a nucleic acid
  • Targeting compounds include ligands capable of binding to extracellularly expressed receptors.
  • GalNAc N-acetyl-D-galactosamine
  • ASGPR asialoglycoprotein receptor
  • Patent Documents 1 and 2 disclose, for example, nucleic acid complexes shown below as complexes of a targeting compound and an oligonucleotide.
  • Patent Document 3 discloses a nucleic acid complex having the following structure having the same sugar ligand-tether unit as Patent Documents 1 and 2.
  • Patent Document 4 discloses a nucleic acid complex having a structure shown below as a sugar ligand-tether unit.
  • Complement is a group of blood proteins that mediate the immune response, and the action of complement is to promote phagocytosis of pathogenic bacteria by phagocytes and damage the virus with an outer membrane to lose infectivity etc. Can be mentioned.
  • C3 is most abundant in serum, and in the alternative pathway, its action is controlled by activation by complement factor B (CFB) etc. (non-patented) Literature 2).
  • Atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS), paroxysmal nocturnal hemoglobinuria when C3 continues to be activated due to abnormalities in regulatory factors involved in the alternative pathway of complement and stabilization with autoantibodies against C3 converting enzyme Disease (PNH), age-related macular degeneration (AMD), membranoproliferative glomerulonephritis (MPGN), C3 nephritis, membranous nephropathy, rapidly progressive glomerulonephritis (RPGN), acute nephropathy (AKI), It is known to be associated with the onset of diseases such as ANCA-related vasculitis, lupus nephritis, asthma, autoimmune diseases (eg, systemic lupus erythematosus (SLE), psoriasis, neuromyelitis optica, myasthenia gravis, etc.) Patent documents 3, 4).
  • ANCA-related vasculitis lupus nep
  • complement factor B is present in blood at a relatively high concentration of 300 ⁇ g / mL ( Non-patent document 5), it is not easy to continue to inhibit all these complement factor B by, for example, general antibody drugs.
  • An object of the present invention is to provide a nucleic acid complex capable of suppressing the expression of complement factor B (CFB).
  • Formula 1 (In the formula 1, X is a double stranded nucleic acid consisting of a sense strand and an antisense strand, comprising a duplex region of at least 11 base pairs, The double-stranded nucleic acid is any one of the target CFB mRNA sequences described in Tables 1-1 to 1-3 in a 17 to 30 nucleotides long oligonucleotide chain in the antisense strand.
  • Complementary and The 3 'or 5' end of the sense strand is linked to S3, L1 and L2 are each independently a sugar ligand, S1, S2 and S3 are each independently a linker.
  • nucleic acid complex according to [1], which has a structure represented by the following formula 2.
  • Formula 2 (In the formula 2, X, L1, L2 and S3 are as defined above, P1, P2, P3, P4, P5 and P6, and T1 and T2 are each independently absent, or -CO-, -NH-, -O-, -S-, -O-CO- , -S-CO-, -NH-CO-, -CO-O-, -CO-S- or -CO-NH-, Q1, Q2, Q3 and Q4 are each independently absent, or substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbon atoms or-(CH 2 CH 2 O) n -CH 2 CH 2- , N is an integer of 0 to 99, B1 and B2 are each independently a bond or a structure represented by the following formula 2-1, and the terminal black dot in each structure is P2 or P3 or P5, respectively.
  • Formula 5 (In the equation 5, X, S3, P1, P2, P3, Q1, Q2, B1, T1, L1, p1, q1 and q2 are as defined above. ) [7] The nucleic acid complex according to [6], wherein P1 is -CO-NH-, -NH-CO- or -O-. [8] The nucleic acid complex according to [6] or [7], which has any one of structures represented by the following formulas 6-1 to 6-9.
  • Formula 6-1 Formula 6-2: Equation 6-3: Equation 6-4: Formula 6-5: Formula 6-6: Formula 6-7: Formula 6-8: Formula 6-9: (In the formulas 6-1 to 6-9, X, S3, P3, Q2, T1, L1 and q2 are as defined above.
  • nucleic acid complex according to any one of [1] to [11], wherein the 3 'end of the sense strand and the 5' end of the antisense strand form a blunt end.
  • nucleic acid complex according to [11] wherein the double stranded nucleic acid comprises a sugar moiety modified nucleotide.
  • Formula 7-8-1 (In formula 7-8-1, X is as defined above.) [15] Any of [1] to [14], wherein X is a pair of sense strand / antisense strand selected from the group consisting of sense strand / antisense strand described in Tables 1-1 to 1-3. The nucleic acid complex according to item 1. [16] Any of [1] to [14], wherein X is a pair of sense strand / antisense strand selected from the group consisting of sense strand / antisense strand described in Table M1-1 to Table M1-3 The nucleic acid complex according to item 1.
  • [22] Administering the nucleic acid complex of any one of [1] to [18] or the pharmaceutical composition of any one of [19] to [21] to a patient in need thereof And methods of treating or preventing the disease.
  • [23] Introducing a double stranded nucleic acid into cells using the nucleic acid complex according to any one of [1] to [18] or the pharmaceutical composition according to any one of [19] to [21]
  • a method of suppressing the expression of the CFB gene including [24] A CFB related disease, which comprises administering to a mammal the nucleic acid complex according to any one of [1] to [18] or the pharmaceutical composition according to any one of [19] to [21]. Treatment method.
  • a medicament for use in the treatment of a CFB related disease comprising the nucleic acid complex according to any one of [1] to [18] or the pharmaceutical composition according to any one of [19] to [21].
  • a therapeutic agent for a CFB related disease comprising the nucleic acid complex according to any one of [1] to [18] or the pharmaceutical composition according to any one of [19] to [21].
  • CFB related diseases include atypical hemolytic uremic syndrome, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, age-related macular degeneration, membranoproliferative glomerulonephritis, C3 nephritis, membranous nephropathy, rapidly progressive glomerulonephritis (RPGN).
  • RPGN rapidly progressive glomerulonephritis
  • the treatment method according to [24] which is acute kidney injury (AKI), ANCA-related vasculitis, lupus nephritis, asthma, systemic lupus erythematosus (SLE), psoriasis, neuromyelitis optica or myasthenia gravis.
  • AKI acute kidney injury
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • psoriasis neuromyelitis optica or myasthenia gravis.
  • CFB related diseases include atypical hemolytic uremic syndrome, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, age-related macular degeneration, membranoproliferative glomerulonephritis, C3 nephritis, membranous nephropathy, rapidly progressive glomerulonephritis (RPGN).
  • the drug according to [25] which is acute kidney injury (AKI), ANCA-related vasculitis, lupus nephritis, asthma, systemic lupus erythematosus (SLE), psoriasis, neuromyelitis optica or myasthenia gravis.
  • AKI acute kidney injury
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • psoriasis neuromyelitis optica or myasthenia gravis.
  • CFB related diseases include atypical hemolytic uremic syndrome, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, age-related macular degeneration, membranoproliferative glomerulonephritis, C3 nephritis, membranous nephropathy, rapidly progressive glomerulonephritis (RPGN).
  • the therapeutic agent according to [26] which is acute kidney injury (AKI), ANCA-related vasculitis, lupus nephritis, asthma, systemic lupus erythematosus (SLE), psoriasis, neuromyelitis optica or myasthenia gravis.
  • AKI acute kidney injury
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • psoriasis neuromyelitis optica or myasthenia gravis.
  • a pharmaceutical composition containing the nucleic acid complex of the present invention can be administered to a mammal to treat various related diseases in vivo.
  • the nucleic acid complex of the present invention is a nucleic acid complex represented by the following formula 1.
  • Formula 1 :
  • X is a double stranded nucleic acid consisting of a sense strand and an antisense strand, comprising a duplex region of at least 11 base pairs
  • the double-stranded nucleic acid is any one of the target CFB mRNA sequences described in Tables 1-1 to 1-3 in a 17 to 30 nucleotides long oligonucleotide chain in the antisense strand.
  • Complementary and The 3 'or 5' end of the sense strand is linked to S3, L1 and L2 are each independently a sugar ligand, S1, S2 and S3 are each independently a linker.
  • S1 and S2 can bind to the benzene ring in the ortho position, meta position and para position respectively with respect to the substitution position on the benzene ring of S3, but the nucleic acid complex represented by the following formula 1-1 It is preferred that it is a body. It is meant that the bond of S1 and S2 to the benzene ring in Formula 1 may be at any position other than the substitution position of S3 on the benzene ring.
  • Formula 1-1 :
  • Formula 1-1 X, L1, L2, S1, S2 and S3 are as defined above. In the present specification, the same meaning as described above will be described by exemplifying Formula 1-1: X, L1, L2, S1, and S2 in Formula 1-1, X, L1, It means that it may be the same group as the definition for each of L2, S1 and S2.
  • X is a double stranded nucleic acid consisting of a sense strand and an antisense strand and comprising a double stranded region of at least 11 base pairs.
  • the double-stranded nucleic acid is a target CFB mRNA described in Tables 1-1 to 1-3 described later in the oligonucleotide chain of 17 to 30 nucleotides in chain length in the antisense strand. Complementary to any of the sequences.
  • the 3 'or 5' end of the sense strand is linked to S3.
  • L1 and L2 are each independently a sugar ligand.
  • a sugar ligand means a group derived from a saccharide (such as monosaccharide, disaccharide, trisaccharide and polysaccharide) capable of binding to a receptor expressed in a target cell.
  • the moiety excluding the hydroxyl group involved in the binding of the saccharide constituting the sugar ligand is a group derived from the saccharide.
  • sugar ligand is meant.
  • a sugar ligand to be a target cell of an oligonucleotide may be selected.
  • monosaccharides include allose, altose, arabinose, cladinose, erythrose, erythrulose, fructose, D-fusitol, L-fusitol, fucosamine, fucose, fucose, galactosamine, D-galactosaminitol, N-acetyl-galactosamine, Galactose, glucosamine, N-acetyl-glucosamine, glucosaminitol, glucose, glucose-6-phosphate, gulose, glyceraldehyde, L-glycero-D-manno-heptose, glycerol, glycerone, gulose, idoses, liquisose, mannosamine , Mannose, mannose-6-phosphate, psicose, quinobose, quinovosamine, rhamnitol, rhamnosamine,
  • disaccharides, trisaccharides and polysaccharides include avequase, aclavose, amysetose, amylopectin, amylose, apiose, alkanose, alkanose, alkanose, alkanose, ascorbic acid, boibinose, cellobiose, cellotriose, cellulose, cacotriose, chalcose, chitin, colitos, Cyclodextrin, Dextrose, Dextrin, 2-Deoxyribose, 2-Deoxyglucose, Diginose, Digitulose, Digitose, Evalose, Evemitrose, Fructooligosaccharide, Galto-oligosaccharide (galto-oligosaccharide), Gentianose, Gentiobiose, Glucan, Glucogen, Glycogen , Hammellose, heparin, inulin, isolevoglucosenone, isoma Tose
  • Each monosaccharide in the saccharide may be in D-form or L-form, or may be a mixture of D-form and L-form in any proportion.
  • an amino sugar in saccharides galactosamine, glucosamine, glucosamine, mannosamine, fucosamine, quinosamine, neuraminic acid, muramic acid, lactose acid, lactose diamine, acosamine, dacrosamine, daunosamine, desosamine, forosamine, garosamine, canosamine, kansosamine (kansamine) Mikaminose, mycosamine, perosamine, pneuimosamine, purpurosamine, rhodosamine etc. are mentioned.
  • the amino group of the amino sugar may be substituted with an acetyl group or the like.
  • sialic acid-containing sugar chains include sugar chains containing NeuAc at the non-reducing end of the sugar chain, such as NeuAc-Gal-GlcNAc-containing sugar chains, Neu5Ac ⁇ (2-6) Gal ⁇ (1-3) GlcNAc, etc. Can be mentioned.
  • Each monosaccharide in the saccharide may be substituted by a substituent, as long as it can bind to the receptor expressed in the target cell, for example, a hydroxyl group may be substituted, and each monosaccharide
  • the hydrogen atom in may be substituted one or more with an azide and / or an aryl group which may be substituted.
  • sugar ligand it is preferable to select a sugar ligand that binds to a receptor expressed on the surface of a target cell corresponding to each target organ, for example, when the target cell is a hepatocyte, on the surface of a hepatocyte Sugar ligands to the expressed receptor are preferred, and sugar ligands to the asialoglycoprotein receptor (ASGPR) are more preferred.
  • ASGPR asialoglycoprotein receptor
  • sugar ligand for ASGPR mannose or N-acetylgalactosamine is preferable, and N-acetylgalactosamine is more preferable.
  • sugar ligands having higher affinity to ASGPR for example, sugar derivatives described in Bioorganic Medicinal Chemistry, 17, 7254 (2009), and Journal of American Chemical Society, 134, 1978 (2012), etc. are known. These may be used.
  • S1, S2 and S3 are linkers.
  • S1 and S2 are not particularly limited as long as they are structures that link the sugar ligands L1 and L2 with the benzene ring, and a known structure used in a nucleic acid complex may be adopted.
  • S1 and S2 may be the same or different.
  • the sugar ligands L1 and L2 are preferably linked to S1 and S2 by glycosidic bonds, and S1 and S2 may be combined with a benzene ring, for example, -CO-, -NH-, -O-, -S- And -O-CO-, -S-CO-, -NH-CO-, -CO-O-, -CO-S-, or -CO-NH- bond.
  • S3 is not particularly limited as long as it is a structure linking X, which is a double-stranded nucleic acid, and a benzene ring, and a known structure used in a nucleic acid complex may be adopted.
  • the oligonucleotide X is preferably linked to S3 by a phosphodiester bond, and S3 is linked to a benzene ring, for example, -CO-, -NH-, -O-, -S-, -O-CO. -, -S-CO-, -NH-CO-, -CO-O-, -CO-S- or -CO-NH- bond may be linked.
  • linkers of S1, S2 and S3 for example, WO 2009/073809, WO 2013/075035, WO 2015/105083, WO 2014/179620, WO 2015/006740
  • the structure disclosed in the above may be adopted.
  • the nucleic acid complex is preferably a nucleic acid complex having a structure represented by the following formula 2.
  • Formula 2 :
  • X, L1, L2 and S3 are as defined above, P1, P2, P3, P4, P5 and P6, and T1 and T2 are each independently absent, or -CO-, -NH-, -O-, -S-, -O-CO- , -S-CO-, -NH-CO-, -CO-O-, -CO-S- or -CO-NH-, Q1, Q2, Q3 and Q4 are each independently absent, or substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbon atoms or-(CH 2 CH 2 O) n -CH 2 CH 2- , N is an integer of 0 to 99.
  • P1 and P4 are each independently absent, or -CO-, -NH-, -O-, -S-, -O-CO-, -S-CO-, -NH-CO-, -CO-O-, -CO-S- or -CO-NH-, but preferably -O-, -O-CO-, -NH-CO- or -CO-NH-, -O -, -NH-CO- or -CO-NH- is more preferable, and -NH-CO- is more preferable.
  • P1 or P4 is, for example, -NH-CO-, it has a partial structure of -NH-CO-benzene ring.
  • Q1, Q2, Q3 and Q4 are each independently absent, or substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbon atoms or-(CH 2 CH 2 O) n -CH 2 CH 2- And n is an integer of 0 to 99, preferably substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbon atoms, more preferably unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbon atoms, and unsubstituted More preferably, it is an alkylene having 1 to 6 carbon atoms, and still more preferably an unsubstituted alkylene having 1 to 4 carbon atoms.
  • P2 and P5 are each independently absent, or -CO-, -NH-, -O-, -S-, -O-CO-, -S-CO-, -NH-CO-, -CO-O-, -CO-S- or -CO-NH-, but not present, preferably -CO-O- or -CO-NH-, preferably absent, -CO-NH It is more preferable that it is-.
  • P2 and P5 are, for example, -CO-NH-, they have partial structures of B1-CO-NH-Q1 and B2-CO-NH-Q3.
  • m5 and m6 are each independently an integer of 0 to 10, and the terminal black dot in the structure of Formula 3-1 to Formula 3-3 is a bonding point to B1 or B2 or P1 or P4, respectively is there.
  • B1 and B2 are each independently a bond or a structure represented by the following formula, and the terminal black dot in each structure is P2 or P3 or P5 or P6, respectively.
  • m1, m2, m3 and m4 are each independently an integer of 0 to 10.
  • B1 and B2 are preferably groups derived from amino acids including non-natural amino acids such as glutamic acid, aspartic acid, lysine and iminodiacetic acid, or amino alcohols such as 2-amino-1,3-propanediol, And when B2 is a group derived from glutamic acid and aspartic acid, it is preferable that the amino groups of glutamic acid and aspartic acid are respectively bonded to form -NH-CO- as P2 and P5, and B1 and B2 are lysine When it is a group derived from, it is preferable that the carboxyl group of lysine is respectively bonded to form -CO-NH- bond as P2 and P5, and when B1 and B2 are groups derived from iminodiacetic acid, The amino group of iminodiacetic acid is bonded to form -CO- bonded as P2 and P5, respectively. It is preferable to be. Specifically, B1 and B2 preferably have the following structures.
  • the nucleic acid complex is preferably a nucleic acid complex having a structure represented by the following formulas 4-1 to 4-9.
  • Formula 4-1 :
  • X, L1, L2, S3, P3, P6, T1, T2, Q2, Q4, q2 and q4 are as defined above.
  • P3 and P6 each independently do not exist, or -CO-, -NH-, -O-, -S-, -O-CO-, -S-CO-, -NH-CO-, -CO-O-, -CO-S- or -CO-NH-, but preferably -O-CO- or -NH-CO-, and more preferably -NH-CO-.
  • P3 and P6 are, for example, -NH-CO-, they have partial structures of B1-NH-CO-Q2 and B2-NH-CO-Q4, respectively.
  • T1 and T2 are each independently absent, or -CO-, -NH-, -O-, -S-, -O-CO-, -S-CO-, -NH-CO-, -CO-O-, -CO-S- or -CO-NH- is preferably -O- or -S-, more preferably -O-.
  • the nucleic acid complex is preferably a nucleic acid complex having a structure represented by the following formula 5.
  • P1 and P4, P2 and P5, P3 and P6, Q1 and Q3, Q2 and Q4, B1 and B2, T1 and T2, L1 and L2, p1 and p2, q1 and q3, and q2 and q4 in Equation 2. are the same.
  • X, S3, P1, P2, P3, Q1, Q2, B1, T1, L1, p1, q1 and q2 are as defined above. Further, X, S3, P1, P2, P3, Q1, Q2, B1, T1, L1, p1, q1 and q2 in Formula 5 may be the above-mentioned suitable groups, but P1 is —CO— It is preferable that it is NH-, -NH-CO- or -O-. It is preferable that — (P 2 ⁇ Q 1) q 1 ⁇ in the formula 5 is absent or has any structure represented by the above formulas 3-1 to 3-3.
  • the nucleic acid complex is preferably a nucleic acid complex having a structure represented by the following formulas 6-1 to 6-9.
  • Formula 6-1 :
  • Equation 6-3
  • Equation 6-4
  • X, S3, P3, Q2, T1 and L1 are as defined above.
  • the nucleic acid complex is preferably a nucleic acid complex having a structure represented by any one of the following formulas 7-1 to 7-9.
  • Formula 7-1 :
  • X, L1, L2 and S3 are as defined above.
  • L1 and L2 may be identical or different, and are preferably identical.
  • each alkylene group moiety is introduced with an alkylene chain having a different chain length, or an amide bond or the like is substituted with another bond to form formulas 7-1 to 7
  • Nucleic acid derivatives other than the nucleic acid complex having the structure represented by -9 can also be produced.
  • the nucleic acid complex is preferably a nucleic acid complex having a structure represented by the following formula 11.
  • Formula 11 :
  • L1, L2, S1 and S2 are each as defined above, P7 and P8 each independently do not exist, or -CO-, -NH-, -O-, -S-, -O-CO-, -S-CO-, -NH-CO-, -CO-O-, -CO-S- or -CO-NH-, Q5, Q6 and Q7 are each independently absent or alkylene substituted or unsubstituted C 1-12 or - (CH 2 CH 2 O) n8 -CH 2 CH 2 - and is, n8 Is an integer from 0 to 99, B3 is herein referred to as a blanker unit and is any structure represented by the following formula 11-1 and means a bond with Q5 and Q6, respectively, in a broken line: Formula 11-1:
  • substitution at a group having a triazole ring is any of the nitrogen atoms at positions 1 and 3 of the triazole ring.
  • q5 and q6 are each independently an integer of 0 to 10.
  • P7 is absent, or -CO-, -NH-, -O-, -S-, -O-CO-, -S-CO-, -NH-CO-, -CO-O-,- CO-S- or -CO-NH-, preferably -O-, -NH-CO- or -CO-NH-, more preferably -O- or -NH-CO- .
  • P7 is, for example, -O-, it has a partial structure of a benzene ring -O-.
  • P8 is absent, or -CO-, -NH-, -O-, -S-, -O-CO-, -S-CO-, -NH-CO-, -CO-O-,- CO—S— or —CO—NH—, when present, is preferably —CO—O— or —CO—NH—, more preferably —CO—NH—.
  • P8 is, for example, -CO-NH-, it has a partial structure of Q6-CO-NH-.
  • Q5, Q6 and Q7 are each independently absent or alkylene substituted or unsubstituted C 1-12 or - (CH 2 CH 2 O) n8 -CH 2 CH 2 - and is, n8 Is an integer of 0 to 99, preferably substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbon atoms, more preferably unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbon atoms, and unsubstituted unsubstituted carbon atoms An alkylene of 1 to 6 is more preferable, and an unsubstituted alkylene of 1 to 4 carbon atoms is still more preferable.
  • q5 - is, -O- (CH 2) m15 -NH- and -NH-CO- (CH 2) a m16 -NH, m15 and m16 are each independently 1 to 10 It is preferable that it is an integer of
  • the nucleic acid complex is preferably a nucleic acid complex having a structure represented by any one of the following formulas 12-1 to 12-12.
  • Formula 12-1 :
  • X, L1, L2, S1 and S2 are as defined above, and n1 'to n12' are each independently an integer of 1 to 10.
  • the nucleic acid complex of the present invention is a nucleic acid complex obtained by combining the structure described in formula 2 corresponding to S1 and S2 with the structure described in formula 11 corresponding to S3 in the nucleic acid complex represented by formula 1 Is preferred.
  • Formula 2 may be Formula 4-1 to Formula 4-9, Formula 6-1 to Formula 6-9, Formula 7-1 to Formula 7-9, and Formula When 2 is Expression 4-1 to Expression 4-9, Expression 6-1 to Expression 6-9, or Expression 7-1 to Expression 7-9, Expression 11 has Expression 12-1 to Expression 12-. It may be twelve.
  • the nucleic acid complex of the present invention is a nucleic acid complex represented by formula 1, which has a structure according to any one of formulas 4-1 to 4-9 corresponding to S1 and S2, and a formula 12 corresponding to S3.
  • a nucleic acid complex combining any one of the structures described in any one of the structures 1 to 12-12, any one of the structures described in the formulas 6-1 to 6-9 corresponding to S1 and S2, and A nucleic acid complex combining any one of the structures described in the corresponding formula 12-1 to the formula 12-12, any one of the structures described in the formula 7-1 to the formula 7-9 corresponding to S1 and S2 More preferably, it is a nucleic acid complex obtained by combining any one of the structures described in formulas 12-1 to 12-12 corresponding to S3.
  • X in Formula 1 is a double-stranded nucleic acid consisting of a sense strand and an antisense strand and containing a double-stranded region of at least 11 base pairs, said double-stranded nucleic acid being in the antisense strand 17 It is complementary to any of the target CFB mRNA sequences described in Table 1-1 to Table 1-3 in oligonucleotide chains of 30 to 30 nucleotides long.
  • X binding to S3 is a sense strand constituting a double-stranded nucleic acid, which will be described later in Table 1-1 to Table 1- 3 or the sense strand represented by the sense strand sequence in Table M1-1 to Table M1-3.
  • a nucleic acid containing a base sequence complementary to CFB mRNA is referred to as an antisense strand nucleic acid
  • a nucleic acid containing a base sequence complementary to the base sequence of the antisense strand nucleic acid is also referred to as a sense strand nucleic acid.
  • the double-stranded nucleic acid constituting the nucleic acid complex used in the present invention is a double-stranded nucleic acid having the ability to reduce or stop the expression of the CFB gene when introduced into mammalian cells, and comprises a sense strand and an anti It is a double stranded nucleic acid having a sense strand.
  • the sense strand and the antisense strand have at least 11 base pairs, and at least 17 nucleotides and at most 30 nucleotides, ie, 17 to 30 nucleotides in the antisense strand.
  • An oligonucleotide strand of the following length is complementary to a target CFB mRNA sequence selected from the group described in Tables 1-1 to 1-3.
  • the double-stranded nucleic acid constituting the nucleic acid complex used in the present invention may be any molecule obtained by polymerizing a nucleotide or a molecule having the same function as the nucleotide, for example, a polymer of ribonucleotide And RNA which is a polymer of deoxyribonucleotide, a chimeric nucleic acid consisting of RNA and DNA, and a nucleotide polymer in which at least one nucleotide of these nucleic acids is substituted with a molecule having the same function as the nucleotide.
  • uracil (U) can be read unambiguously as thymine (T).
  • nucleotide derivatives examples include nucleotide derivatives and the like.
  • the nucleotide derivative may be any molecule as long as the nucleotide is modified.
  • the affinity to the complementary strand nucleic acid is selected.
  • a ribonucleotide or a deoxyribonucleotide modified molecule is preferably used.
  • nucleotides examples include sugar-modified nucleotides, phosphodiester bond-modified nucleotides, base-modified nucleotides, and nucleotides in which at least one of a sugar moiety, a phosphodiester bond and a base has been modified.
  • the sugar moiety-modified nucleotide may be any one in which part or all of the chemical structure of the nucleotide sugar is modified or substituted with an arbitrary substituent or substituted with an arbitrary atom, but '-Modified nucleotides are preferably used.
  • the 2'-modified nucleotides such as 2'-OH group of the ribose is H, OR, R, R'OR, SH, SR, NH 2, NHR, NR 2, N 3, CN, F, Cl, Br and Substituted with a substituent selected from the group consisting of I, wherein R is alkyl or aryl, preferably alkyl of 1 to 6 carbons, and R ′ is alkylene, preferably alkylene of 1 to 6 carbons It is a nucleotide, more preferably a nucleotide in which the 2'-OH group is substituted with H, F or a methoxy group, still more preferably a nucleotide in which the 2'-OH group is substituted with F or a methoxy group.
  • 2′-OH group is 2- (methoxy) ethoxy group, 3-aminopropoxy group, 2-[(N, N-dimethylamino) oxy] ethoxy group, 3- (N, N-dimethylamino) propoxy group, 2- A substituent selected from the group consisting of [2- (N, N-dimethylamino) ethoxy] ethoxy group, 2- (methylamino) -2-oxoethoxy group, 2- (N-methylcarbamoyl) etoxy group and 2-cyanoetoxy group Also included are substituted nucleotides and the like.
  • the content of 2'-modified nucleotides is preferably 50 to 100%, more preferably 70 to 100%, still more preferably 90 to 100% with respect to nucleotides in the double stranded nucleic acid region. .
  • the content of 2′-modified nucleotides is preferably 20 to 100%, more preferably 40 to 100%, still more preferably 60 to 100%, based on the nucleotides of the sense strand.
  • the 2'-modified nucleotide-modified nucleotide is preferably contained in an amount of 20 to 100%, more preferably 40 to 100%, still more preferably 60% to 100%, based on the nucleotides of the antisense strand. More preferable.
  • a phosphodiester bond modified nucleotide any one of those obtained by modifying or substituting a part or all of the chemical structure of phosphodiester bond of the nucleotide with an arbitrary substituent, or substituting with an arbitrary atom
  • a nucleotide in which a phosphodiester bond is substituted with a phosphorothioate bond a nucleotide in which a phosphodiester bond is substituted with a phosphorodithioate bond
  • a nucleotide in which a phosphodiester bond is substituted with an alkyl phosphonate bond phosphoric acid
  • the nucleotide etc. by which the diester bond was substituted by the phosphoroamidate bond etc. are mentioned.
  • any part or all of the chemical structure of the base of the nucleotide may be modified or substituted with any substituent, or any one substituted with any atom, for example, a base
  • the oxygen atom is substituted by a sulfur atom
  • the hydrogen atom is substituted by an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, halogen or the like
  • the methyl group is hydrogen, hydroxymethyl, an alkyl group having 2 to 6 carbon atoms, etc.
  • the amino group is substituted by an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkanoyl group having 1 to 6 carbon atoms, an oxo group, a hydroxy group or the like.
  • nucleotide derivative a nucleotide or a nucleotide derivative in which at least one of sugar moiety, phosphodiester bond or base is modified, peptide, protein, sugar, lipid, phospholipid, phenazine, folate, phenanthridine, anthraquinone, acridine, Fluorescein, rhodamine, coumarin, dyes, etc., which are added with another chemical substance directly or through a linker, can also be mentioned, and specifically, 5'-polyamine adduct nucleotide derivative, cholesterol adduct nucleotide derivative, steroid adduct nucleotide derivative And bile acid-added nucleotide derivatives, vitamin-added nucleotide derivatives, Cy5-added nucleotide derivatives, Cy3-added nucleotide derivatives, 6-FAM-added nucleotide derivatives, biotin-added nucleo
  • the nucleotide derivative may form a cross-linked structure, such as an alkylene structure, a peptide structure, a nucleotide structure, an ether structure, an ester structure, and a structure combining at least one of these with other nucleotides or nucleotide derivatives in the nucleic acid.
  • complementary means a relationship capable of base pairing between two bases, for example, a loose hydrogen such as a relationship between adenine and thymine or uracil, and a relationship between guanine and cytosine. It refers to one that takes on a double helical structure as a whole double stranded region via a bond.
  • an antisense strand complementary to CFB mRNA means that one or more bases may be substituted in the base sequence completely complementary to the partial base sequence of the mRNA.
  • the antisense strand is 1 to 8, preferably 1 to 6, preferably 1 to 4, 1 to 3, particularly 2 or 1 mismatched bases relative to the target sequence of the target gene. You may have.
  • the antisense strand when the antisense strand is 21 bases long, it may have 6, 5, 4, 3, 2, 2 or 1 mismatched bases with respect to the target sequence of the target gene, The position of the mismatch may be at the 5 'end or 3' end of each sequence.
  • “complementary” includes a case where one nucleotide sequence is a sequence in which one or more bases are added and / or deleted in a base sequence completely complementary to the other nucleotide sequence.
  • CFB mRNA and the antisense strand nucleic acid of the present invention have one or two bulge bases in the antisense strand and / or target CFB mRNA region by addition and / or deletion of bases in the antisense strand. You may
  • the double-stranded nucleic acid as a drug used in the present invention is a nucleic acid containing a base sequence complementary to a part of the base sequence of CFB mRNA and / or a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid. As long as it contains the nucleic acid, it may be composed of any nucleotide or its derivative.
  • the double-stranded nucleic acid of the present invention comprises at least 11 bases of a nucleic acid containing a base sequence complementary to a target CFB mRNA sequence and a nucleic acid containing a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid.
  • the length of the sequence capable of forming duplexes is usually 11 to 27 bases, preferably 15 to 25 bases, and 15 to 23 bases. Is more preferable, and 17 to 21 bases are more preferable.
  • a nucleic acid containing a base sequence complementary to the target CFB mRNA sequence is used, among which 1 to 3 bases, preferably 1 to 2 bases, Preferably, one in which one base is deleted, substituted or added may be used.
  • the nucleic acid that suppresses the expression of CFB is a nucleic acid that has a base sequence complementary to the target CFB mRNA sequence, and is a single-stranded nucleic acid that suppresses the expression of CFB, or is complementary to the target CFB mRNA sequence
  • a double-stranded nucleic acid consisting of a nucleic acid containing a unique base sequence and a nucleic acid containing a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid, and suppressing the expression of CFB is preferably used.
  • the single-stranded antisense strand nucleic acid and the single-stranded antisense strand nucleic acid constituting the double-stranded nucleic acid are the same or different, usually 11 to 30 bases, preferably the same or different 17 to 27 bases And 17 to 25 bases are more preferable, 19 to 25 bases are more preferable, and 21 to 23 bases are even more preferable.
  • the double-stranded region if having an additional nucleotide or nucleotide derivative which does not form a double strand at the 3 'or 5' side following the double-stranded region, the overhang Call it (overhang).
  • the nucleotides constituting the overhang may be ribonucleotides, deoxyribonucleotides or derivatives thereof.
  • a double-stranded nucleic acid having an overhang one having an overhang consisting of 1 to 6 bases, usually 1 to 3 bases, at the 3 'end or 5' end of at least one strand is used, but from 2 bases Those having a protruding portion are preferably used, for example, those having a protruding portion consisting of dTdT (dT represents deoxythymidine) or UU (U represents uridine).
  • the overhang can be present only in the antisense strand, only in the sense strand, and in both the antisense and sense strands, but in the present invention, a double-stranded nucleic acid having an overhang in the antisense strand is preferably used.
  • the antisense strand is a target CFB mRNA described in Tables 1-1 to 1-3 in an oligonucleotide strand consisting of 17 to 30 nucleotides, which includes a double-stranded region followed by an overhang. Fully complementary to any of the sequences.
  • double-stranded nucleic acid of the present invention for example, a nucleic acid molecule (WO 2005/089287) that produces a double-stranded nucleic acid by the action of ribonuclease such as Dicer or the like, or a protrusion at the 3 'end or the 5' end
  • ribonuclease such as Dicer or the like
  • a protrusion at the 3 'end or the 5' end A double stranded nucleic acid which forms a blunt end, a double stranded nucleic acid (US2012 / 0040459) etc. which only the sense strand protruded can also be used.
  • a nucleic acid consisting of the same sequence as the base sequence of the target gene or the base sequence of its complementary strand may be used.
  • a double-stranded nucleic acid consisting of a nucleic acid in which the 5 ′ end or 3 ′ end of the strand has been deleted by 1 to 4 bases and a nucleic acid containing a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid may be used.
  • the double-stranded nucleic acid constituting the nucleic acid complex used in the present invention is a double-stranded RNA (dsRNA) in which the RNAs form a duplex, and a double-stranded DNA (dsDNA) in which the DNAs form a duplex.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • dsDNA double-stranded DNA
  • a hybrid nucleic acid in which RNA and DNA form a duplex a hybrid nucleic acid in which RNA and DNA form a duplex.
  • one or both strands of the double strand may be a chimeric nucleic acid of DNA and RNA.
  • it is a double stranded RNA (dsRNA).
  • the second nucleotide from the 5 'end of the antisense strand of the nucleic acid complex of the present invention is preferably complementary to the second deoxyribonucleotide from the 3' end of the target CFB mRNA sequence, and the 5 'end of the antisense strand More preferably, the 2nd to 7th nucleotides are completely complementary to the 2nd to 7th deoxyribonucleotides from the 3 'end of the target CFB mRNA sequence, and the 2nd to 11th nucleotides from the 5' end of the antisense strand It is further preferred that is completely complementary to the 2nd to 11th deoxyribonucleotides from the 3 'end of the target CFB mRNA sequence.
  • the 11th nucleotide from the 5 'end of the antisense strand in the nucleic acid of the present invention is preferably complementary to the 11th deoxyribonucleotide from the 3' end of the target CFB mRNA sequence, and the 5 'end of the antisense strand More preferably, the 9th to 13th nucleotides are completely complementary to the 9th to 13th deoxyribonucleotides from the 3 'end of the target CFB mRNA sequence, and the 7th to 15th nucleotides from the 5' end of the antisense strand More preferably, it is completely complementary to the 7th to 15th deoxyribonucleotides from the 3 'end of the target CFB mRNA sequence.
  • the antisense strand and the sense strand of the nucleic acid complex of the present invention are based on, for example, the base sequence (SEQ ID NO: 3541) of the cDNA (sense strand) of full length mRNA of human CFB registered as Genbank Accession No. NM — 000042 It can be designed.
  • Double stranded nucleic acids can be designed to interact with target sequences within the CFB gene sequence.
  • sequence of one strand of double stranded nucleic acid is complementary to the target site sequence described above.
  • Double stranded nucleic acids can be chemically synthesized using the methods described herein.
  • RNA may be produced enzymatically or by partial / total organic synthesis, and modified ribonucleotides can be introduced in vitro by enzymatic or organic synthesis.
  • each strand is chemically prepared. Methods for chemically synthesizing RNA molecules are known in the art [see Nucleic Acids Research, 1998, Volume 32, p. 936-948]. In general, double stranded nucleic acids can be synthesized by using solid phase oligonucleotide synthesis methods (e.g., Usman et al., U.S. Patent 5,804,683; U.S. Patent 5,831,071; U.S. Patent No. 5,998,203; U.S. Patent No.
  • Single-stranded nucleic acids are synthesized, deprotected, and prepared using the solid phase phosphoramidite method (see Nucleic Acids Research, 1993, Vol. 30, p. 2435-2443). Desalted on a NAP-5 column (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Oligomers are Amersham Source 15Q columns using a 15 minute linear gradient-1.0 cm. Purified using ion exchange high performance liquid chromatography (IE-HPLC) at .25 cm height (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
  • IE-HPLC ion exchange high performance liquid chromatography
  • Samples are monitored at 260 nm and peaks corresponding to full-length oligonucleotide species are collected, pooled, desalted on a NAP-5 column, and lyophilized.
  • each single stranded nucleic acid is determined by capillary electrophoresis (CE) on a Beckman PACE 5000 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, Calif.).
  • the CE capillary has an internal diameter of 100 ⁇ m and contains ssDNA 100R Gel (Beckman-Coulter).
  • ssDNA 100R Gel (Beckman-Coulter).
  • about 0.6 nmole of oligonucleotide is injected into the capillary and run at an electric field of 444 V / cm, detected by UV absorbance at 260 nm.
  • Denatured Tris-Borate-7 mol / L-Urea running buffer is purchased from Beckman-Coulter.
  • Single stranded nucleic acids that are at least 90% pure as assessed by CE are obtained for use in the experiments described below.
  • Compound identity is determined using the matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight (MALDI-TOF) mass on Voyager DE.TM. Biospectrometry workstation (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) According to the manufacturer's recommended protocol. Verified by spectroscopy.
  • the relative molecular mass of single stranded nucleic acid can be obtained within 0.2% of the expected molecular mass.
  • Single stranded nucleic acid is resuspended at a concentration of 100 ⁇ mol / L in a buffer consisting of 100 mmol / L potassium acetate, 30 mmol / L HEPES, pH 7.5.
  • the complementary sense and antisense strands are mixed in equal molar amounts to obtain a final solution of 50 ⁇ mol / L double stranded nucleic acid.
  • the sample is heated to 95 ° C. for 5 minutes and allowed to cool to room temperature before use.
  • Double stranded nucleic acids are stored at -20 ° C.
  • Single stranded nucleic acids are lyophilized or stored at -80 ° C. in nuclease free water.
  • the sense strand and the antisense strand according to the present invention which comprises a duplex region of at least 11 base pairs, in the antisense strand, an oligonucleotide of 11 to 30 nucleotides in length, A group consisting of the antisense strand described in Tables 1-1 to 1-3 as a double-stranded nucleic acid complementary to a target CFB mRNA sequence selected from the group described in 1-1 to Table 1-3 Or a sequence selected from the group consisting of a sense strand described in Table M1-1 to Table M1-3, and Tables 1-1 to 1-3 described later.
  • a pair of senses selected from the group consisting of a double stranded nucleic acid, or a sense strand / antisense strand described in Tables M1-1 to M1-3 and Tables 1-1 to 1-3 described later.
  • Double stranded nucleic acids comprising the strand / antisense strand sequence may be used. That is, specific examples of the double stranded nucleic acid constituting the nucleic acid complex used in the present invention are the sense strand and the anti in the Tables M1-1 to M1-3 and the Tables 1-1 to 1-3 described later. It is a double stranded nucleic acid consisting of a sense strand.
  • N (M) represents 2'-O-methyl-modified RNA
  • N (F) represents 2'-fluorine-modified RNA
  • ⁇ represents phosphorothioate.
  • the 5 'terminal nucleotide of the antisense strand sequence described in Table 1-1 to Table 1-3 and Table M1-1 to Table M1-3 may be phosphorylated at the 5' end, It does not have to be, but is preferably phosphorylated.
  • the double-stranded nucleic acid comprising the sense / antisense strand sequences described in Tables 1-1 to 1-3 described later has a relative expression amount of CFB of 0.40 in the measurement of knockdown activity when 0.1 nM is added. The following is preferred.
  • the method for producing the nucleic acid complex of the present invention will be described.
  • introduction and removal of protecting groups commonly used in synthetic organic chemistry Methods eg, Protective Groups in Organic Synthesis, third edition, by T. Greene, John Wiley & Sons Inc.
  • the target compound can be produced by using the method described in (1999), etc.].
  • the order of reaction processes, such as substituent introduction can also be changed as needed.
  • the nucleic acid polymer represented by Formula 1 can also be synthesized by solid phase synthesis.
  • the nucleic acid polymer represented by the formula 1 can be synthesized with reference to a synthesis method of a linker structure known as a nucleic acid complex.
  • the synthesis of the L1-benzene ring unit using S1 as a linker and the L2-benzene ring unit using S2 as a linker in the nucleic acid complex represented by formula 1 can be performed, for example, using the nucleic acid complex represented by formula 2 as an example. explain.
  • the L1-benzene ring unit and the L2-benzene ring unit in the nucleic acid complex represented by the formula 2 are linked by P1, P2, P3, P4, P5, and P6, and T1 and T2.
  • the partial structure of the L1-benzene ring unit can be produced by combining a compound having Q1 as a partial structure and a compound having B1 as a partial structure sequentially from the benzene ring. Separately synthesizing a compound having L1 and Q2 as a partial structure, and binding a compound having L1 and Q2 as a partial structure to a compound having a partial structure of an L1-benzene ring unit having a benzene ring and Q1 and B1 as a partial structure
  • L 1 -benzene ring unit structure can be produced.
  • the partial structure of L2-benzene ring unit can be produced by sequentially binding a compound having Q3 as a partial structure and a compound having B2 as a partial structure sequentially from the benzene ring . Separately synthesizing a compound having L2 and Q4 as a partial structure, and combining a compound having L2 and Q4 as a partial structure with a compound having a partial structure of L2-benzene ring unit having a benzene ring and Q3 and B2 as partial structures Thus, an L2-benzene ring unit structure can be produced.
  • an alkylene having 1 to 10 carbon atoms or a — (CH 2 CH 2 O) n —CH 2 CH 2 — terminal group is a hydroxyl group or a carboxyl group at both ends
  • compounds having an amino group and a thiol group are represented by the compound having B1 as a partial structure and the compound having B2 as a partial structure.
  • the compound having B1 as a partial structure and the compound having B2 as a partial structure have one of the structures represented by the following formula 2-1, and a hydroxyl group and a carboxyl group are represented by the black dots at the end of each structure, respectively.
  • compounds having an amino group or a thiol group are represented by the black dots at the end of each structure, respectively.
  • the compound having B1 as a partial structure and the compound having B2 as a partial structure include glycol, glutamic acid, aspartic acid, lysine, Tris, iminodiacetic acid, 2-amino-1,3-propanediol and the like. Glutamic acid, aspartic acid, lysine and iminodiacetic acid are preferred.
  • B1 and B2 preferably have the following structures.
  • a compound having L1, Q2 and B1 as a partial structure may be synthesized and then coupled to a compound having Q1 and a benzene ring to produce an L1-benzene ring unit structure.
  • a compound having L2, Q4 and B2 as a partial structure may be synthesized and then combined with Q3 and a compound having a benzene ring to produce an L2-benzene ring unit structure.
  • [L1-T1- (Q2- P3) q2 -] p1 -B1- and substructure is (P2-Q1) q1 a -P1-, [L2-T2- (Q3 -P6) q4 -]
  • the partial structure which is p2- B2- (P5-Q3) q3- P2- may be identical or different, but is preferably identical.
  • Examples of the unit corresponding to L1-T1-Q2 of the sugar ligand include L3-T1-Q2-COOH, L3-T1- (Q2-P3) q2-1 -Q2-NH 2 and the like.
  • L3-O-alkylene-COOH having 1 to 12 carbon atoms L-alkylene-CO-NH having 1 to 12 carbons, alkylene-NH 2 having 2 to 12 carbons, etc. may be mentioned.
  • L3 is not particularly limited as long as it is a sugar ligand derivative that becomes L1 by deprotecting.
  • the substituent of the sugar ligand is not particularly limited as long as it is a substituent generally used in the field of carbohydrate chemistry, but an Ac group is preferable.
  • the number of carbon atoms of the alkylene chain is appropriately increased or decreased, with reference to the method described in the Examples, and synthesis of L1-benzene ring unit using S1 as a linker and L2 benzene ring unit using S2 as a linker
  • the terminal amino group and the terminal carboxyl group can be selected from -CO-, -NH-, -O-, -S-, -O-CO-, -S-CO-, -NH-CO-, -CO-O-
  • the compound can be synthesized by using a compound converted into a group capable of forming a -CO-S- or -CO-NH- bond.
  • mannose or N-acetylgalactosamine is exemplified in the examples also for L1 sugar ligands, but other sugar ligands can be used instead.
  • the synthesis of the X-benzene ring unit using the S3 as a linker in the nucleic acid complex represented by the formula 1 will be described, for example, by taking the nucleic acid complex represented by the formula 12 as an example.
  • the X-benzene ring unit in the nucleic acid complex represented by Formula 12 has a bond represented by P7 and P8 in addition to the bond of the oligonucleotide.
  • the compound can be appropriately synthesized by selecting an appropriate raw material for forming the structure represented by Formula 12 with reference to the method of the binding reaction described in 1.).
  • the partial structure of the X-benzene ring unit can be produced by combining a compound having Q5 as a partial structure and a compound having B3 as a partial structure sequentially from the benzene ring.
  • a compound having X and Q7 as a partial structure or a compound having X and Q6 as a partial structure is separately synthesized, and a compound having X and Q7 as a partial structure or a compound having X and Q6 as a partial structure is a benzene ring and Q5
  • An X-benzene ring unit structure can be produced by combining with a compound having a partial structure of the X-benzene ring unit having a partial structure to construct a B3 portion.
  • an X-benzene ring unit structure can be produced by reacting a formed oligonucleotide to cause cycloaddition to form a triazole ring to construct a B3 moiety.
  • a compound having Q5 as a partial structure a compound having Q6 as a partial structure, and a compound having Q7 as a partial structure, an alkylene having 1 to 10 carbon atoms or- (CH 2 CH 2 O) n 8 -CH 2 CH 2-
  • the compound which has a hydroxyl group, a carboxyl group, an amino group, and a thiol group is mentioned at both ends.
  • the L1-benzene ring unit structure, the L2-benzene ring unit structure, and the X-benzene ring unit structure can be sequentially produced, but the L1-benzene ring unit structure and the L2-benzene ring unit structure are synthesized. Then, it is preferable to combine the X-benzene ring unit structure.
  • X having an oligonucleotide moiety is preferably introduced into the compound near the final step of sugar ligand complex synthesis.
  • R1 and R2 are each independently a hydrogen atom, t-butoxycarbonyl group (Boc group), benzyloxycarbonyl group (Z group), 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc group), -CO-R4 Or -CO-B4-[(P9-Q8) q7- T3-L3] p3
  • P9 and T3 are each independently absent, or -CO-, -NH-, -O-, -S-, -O-CO-, -S-CO-, -NH-CO-, -CO-O-, -CO-S- or -CO-NH-
  • Q8 is absent or substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbon atoms, or-(CH 2 CH 2 O) n 1 -CH 2 CH 2- , and n 1 is an integer of 0 to 99
  • B4 is each independently a bond or a structure represented by Formula 8-1 below, and
  • p3 is an integer of 1, 2 or 3 and q7 is an integer of 0 to 10
  • L3 is a sugar ligand
  • Y is —O— (CH 2 ) m 11 —NH— and —NH—CO— (CH 2 ) m 12 —NH
  • m 11 and m 12 are each independently an integer of 1 to 10
  • R3 is a hydrogen atom, t-butoxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, -CO-R4, -CO- (CH 2 CH 2 O) n2 -CH 2 CH 2 -N 3 or -CO-Q9- B5- (Q10-P10) q8- X1, and n2 is an integer of 0 to 99
  • P10 is absent, or -CO-, -NH-, -O-, -S-, -O-CO-, -S-CO-, -NH-CO-, -CO
  • substitution at a group having a triazole ring is any of the nitrogen atoms at positions 1 and 3 of the triazole ring.
  • q8 is an integer of 0 to 10
  • X 1 is a hydrogen atom or a solid support
  • R 4 is selected from the group consisting of t-butoxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, amino group substituted or unsubstituted with 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, carboxy group, maleimide group, and aralkyloxycarbonyl group It is an alkyl group having 2 to 10 carbon atoms which is substituted by 1 or 2 substituents. )
  • R5 and R6 each independently represent a hydrogen atom, t-butoxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, -CO-R4 ', or -CO-Q11- (P11-Q11) ') Q9 -T4-L4,
  • P11 and T4 are each independently absent, or -CO-, -NH-, -O-, -S-, -O-CO-, -S-CO-, -NH-CO-, -CO-O-, -CO-S- or -CO-NH-
  • Q11 and Q11 ′ are absent or substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbon atoms or- (CH 2 CH 2 O) n 4 -CH 2 CH 2- , and n 4 is an integer of 0 to 99
  • q9 is an integer of 0 to 10
  • L4 is a sugar ligand
  • substitution at a group having a triazole ring is any of the nitrogen atoms at positions 1 and 3 of the triazole ring.
  • q8 ' is an integer of 0 to 10
  • X1 ' is a hydrogen atom or a solid support
  • R 4 ′ is selected from the group consisting of t-butoxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, amino group substituted or unsubstituted with 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, carboxy group, maleimide group, and aralkyloxycarbonyl group An alkyl group of 2 to 10 carbon atoms substituted with one or two substituents.
  • R7 and R8 are each independently a hydroxy group, a t-butoxy group, a benzyloxy group, -NH-R10 or -NH-Q12- (P12-Q12 ') q10- T4-L4, P12 and T4 are each independently absent, or -CO-, -NH-, -O-, -S-, -O-CO-, -S-CO-, -NH-CO-, -CO-O-, -CO-S- or -CO-NH-, Q12 and Q12 'is absent or alkylene substituted or unsubstituted C 1-12 or - (CH 2 CH 2 O) n2-CH 2 CH 2 - and is, n2 is an integer 0-99
  • L4 is a sugar ligand
  • Y 2 is —O— (CH 2 ) m 9 —NH— and —NH—CO— (CH 2 ) m 10 —NH
  • m 9 and m 10 are
  • substitution at a group having a triazole ring is any of the nitrogen atoms at positions 1 and 3 of the triazole ring.
  • q11 is an integer of 0 to 10
  • X2 is a hydrogen atom or a solid support
  • R 10 is selected from the group consisting of t-butoxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, amino group substituted or unsubstituted with 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, carboxy group, maleimide group, and aralkyloxycarbonyl group It is an alkyl group having 2 to 10 carbon atoms which is substituted by 1 or 2 substituents. )
  • the nucleic acid derivative in the present invention can be exemplified as a method for producing a compound having a partial structure represented by the formula (I ′).
  • P 1 represents a protecting group which can be deprotected by a base such as Fmoc
  • DMTr represents p, p′-dimethoxytrityl group
  • R represents a sugar ligand-tether unit
  • R ′ represents R in Each hydroxyl group of the sugar ligand is a group protected by a protecting group which can be deprotected by a base such as an acetyl group
  • Polymer is a solid phase carrier
  • Q ' is -CO-.
  • Step 1 Compound (I-B) is a compound (IA) and p, p'-dimethoxytrityl chloride in a solvent such as pyridine, optionally in the presence of a cosolvent, at a temperature between 0 ° C. and 100 ° C. Can be produced by reacting for 5 minutes to 100 hours.
  • a solvent such as pyridine
  • co-solvent for example, methanol, ethanol, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, diethyl ether, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, dioxane, N, N-dimethylformamide (DMF) And N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, pyridine, water and the like, and these may be used alone or in combination.
  • DMF N-dimethylformamide
  • N-dimethylacetamide N-methylpyrrolidone
  • pyridine water and the like
  • Step 2 Compound (IC) is reacted with Compound (IB) without solvent or in the presence of 1 to 1000 equivalents of a secondary amine in a solvent at a temperature between room temperature and 200 ° C. for 5 minutes to 100 hours.
  • a solvent for example, methanol, ethanol, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, diethyl ether, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, dioxane, N, N-dimethylformamide (DMF), Examples thereof include N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, pyridine, water and the like, which may be used alone or in combination.
  • secondary amines include diethylamine, piperidine and the like.
  • Step 3 Compound (1-E) is a compound (IC) and compound (ID), 1 to 30 equivalents of a base, a condensing agent, and optionally 0.01 to 30 equivalents without solvent or in a solvent C. for 5 minutes to 100 hours at a temperature between room temperature and 200.degree. C. in the presence of an additive.
  • a base for example, cesium carbonate, potassium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, sodium methoxide, potassium tert-butoxide, triethylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, pyridine, 1,8-diazabicyclo [5.4.
  • DBU 1,3-dicyclohexanecarbodiimide
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide ⁇ hydrochloride
  • carbonyldiimidazole benzotriazol-1-yloxytris (Dimethylamino) phosphonium hexaflurophosphate, (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate, O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ′, N '-Tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU), O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N', N'-tetramethyl
  • additive examples include 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 4-dimethylaminopyridine (DMAP) and the like.
  • HOBt 1-hydroxybenzotriazole
  • DMAP 4-dimethylaminopyridine
  • ID can be obtained by a known method (see, for example, Journal of American Chemical Society, 136, 16958, (2014)) or a method analogous thereto.
  • Step 4 Compound (IF) is prepared by reacting Compound (IE) and succinic anhydride in a solvent in the presence of 1 to 30 equivalents of a base at a temperature between room temperature and 200 ° C. for 5 minutes to 100 hours.
  • IE Compound (IE)
  • succinic anhydride succinic anhydride
  • step 2 As the solvent, those exemplified in step 2 can be mentioned.
  • Step 5 The compound (IG) is obtained by using a compound (IF) and a terminally aminated solid phase carrier, 1 to 30 equivalents of a base, a condensing agent, and optionally 0. After reacting for 5 minutes to 100 hours at a temperature between room temperature and 200 ° C. in the presence of 01 to 30 equivalents of additive, for 5 minutes to 100 hours at a temperature between room temperature and 200 ° C. It can be produced by reaction.
  • the solvent those exemplified in step 2 can be mentioned.
  • the base, the condensing agent and the additive include those exemplified in Step 3.
  • the aminated solid phase carrier include long-chain alkylamine pore glass (LCAA-CPG) and the like, which can be obtained as commercial products.
  • the nucleic acid complex having a sugar ligand-tether-brancher unit represented by the formula (I ′) is a compound (IG) after extending the corresponding nucleotide chain by a known oligonucleotide chemical synthesis method. It can be produced by removal from the solid phase, deprotection of the protective group and purification.
  • oligonucleotide chemical synthesis methods include the phosphoroamidite method, the phosphorothioate method, the phosphotriester method, the CEM method (see Nucleic Acids Research, 35, 3287 (2007)), and the like, for example, ABI 3900 high. It can be synthesized by a throughput nucleic acid synthesizer (manufactured by Applied Biosystems).
  • Removal from solid phase, deprotection may be prepared by treatment with a base for 10 seconds to 72 hours after chemical synthesis of oligonucleotide in a solvent or in the absence of solvent, at a temperature between -80 ° C and 200 ° C. it can.
  • ammonia for example, ammonia, methylamine, dimethylamine, ethylamine, diethylamine, isopropylamine, diisopropylamine, piperidine, triethylamine, ethylenediamine, 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene (DBU), carbonate Potassium and the like can be mentioned.
  • DBU 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene
  • Examples of the solvent include water, methanol, ethanol, THF and the like.
  • oligonucleotide Purification of the oligonucleotide is possible by combining a C18 reverse phase column or an anion exchange column, preferably the two methods described above.
  • the nucleic acid complex purity after purification is desirably 90% or more, preferably 95% or more.
  • the compound (ID) can be divided into two units, divided into two steps, and condensed with the compound (IC).
  • the compound in step 3 Ethyl ester of the compound obtained by condensing (IC) and CH 3 CH 2 -O-CO-Q 4 '-CO-OH (Q 4' is as defined above) in the same manner as in step 3.
  • the compound is hydrolyzed with a base such as lithium hydroxide in a solvent such as ethanol or water, and then it is condensed with R′—NH 2 (R ′ is as defined above) to give the desired compound.
  • a base such as lithium hydroxide
  • R′ is as defined above
  • CH 3 CH 2 -O-CO -Q4'-CO-OH Q4 ' is as defined above
  • R'-NH 2 R' is as defined above
  • Q 4 ′ the substituted or unsubstituted C 1 to C 12 alkylene substituent and alkylene moiety are as defined above.
  • the nucleic acid derivative in the present invention can be exemplified as a method for producing a compound having a partial structure represented by formula (II ′).
  • TBDMS represents a t-butyldimethylsilyl group
  • Fmoc represents a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group
  • Step 7 Compound (II-A) can be prepared by reacting compound (IA), t-butyldimethylsilyl chloride and dimethylaminopyridine in a solvent such as N, N-dimethylformamide (DMF), preferably in the presence of 2 equivalents of a base The reaction can be carried out at a temperature between 0 ° C. and 100 ° C. for 5 minutes to 100 hours.
  • a solvent such as N, N-dimethylformamide (DMF)
  • a base those exemplified in Step 3 of Production Method 1 can be mentioned.
  • Step 8 Compound (II-B) can be produced using compound (II-A) under the same conditions as in step 1 of production method 1.
  • Step 9 Compound (II-C) is produced by reacting compound (II-B) with n-tetrabutylammonium fluoride (TBAF) in a solvent at a temperature between room temperature and 200 ° C. for 5 minutes to 100 hours. can do.
  • TBAF n-tetrabutylammonium fluoride
  • Step 10 Compound (II-D) can be produced using compound (II-C) under the same conditions as in step 2 of production method 1.
  • Step 11 Compound (II-E) can be produced using compound (II-D) and compound (ID) under the same conditions as in step 3 of production method 1.
  • Steps 12 to 14 Compound (II ′) can be produced using compound (II-E) under the same conditions as steps 4 to 6 of production method 1.
  • the compound (ID) can be divided into two units, divided into two steps, and condensed with the compound (II-C).
  • R-Q ' is -NH-CO-Q4'-CO- (Q4' is substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbon atoms)
  • compound (II- C) and CH 3 CH 2 -O-CO-Q 4 '-CO-OH (Q 4' is as defined above) are condensed in the same manner as in step 11, and the ethyl ester of the obtained compound is ethanol or After hydrolysis with a base such as lithium hydroxide in a solvent such as water, the compound is further condensed with R′—NH 2 (R ′ is as defined above) to give the desired compound.
  • the nucleic acid derivative in the present invention can be exemplified as a method for producing a compound having a partial structure represented by formula (III ′).
  • Compound (III ′) can be produced using compound (III-A) under the same conditions as steps 1 to 6 of production method 1.
  • Compound (III-A) can be obtained as a commercial product.
  • Step 15 Compound (III-B) can be produced using compound (III-A) under the same conditions as in step 1 of production method 1.
  • Compound (III-A) can be purchased as a commercial product.
  • Step 16 Compound (III-C) can be produced using compound (III-B) under the same conditions as in step 2 of production method 1.
  • Step 17 Compound (III-E) can be produced using compound (III-C) under the same conditions as in step 3 of production method 1.
  • Steps 18 to 20 Compound (III ′) can be produced using compound (III-E) under the same conditions as in Steps 4 to 6 of Production Method 1.
  • the compound (ID) can be divided into two units, divided into two steps, and condensed with the compound (III-C).
  • the compound (III-) is C) and CH 3 CH 2 -O-CO-Q 4 '-CO-OH (wherein Q 4' is as defined above) are condensed in the same manner as in step 17 to obtain ethyl ester of the obtained compound as ethanol or After hydrolysis with a base such as lithium hydroxide in a solvent such as water, the compound is further condensed with R′—NH 2 (R ′ is as defined above) to give the desired compound.
  • the nucleic acid derivative in the present invention can be exemplified as a method for producing a compound having a partial structure represented by formula (IV ′).
  • Compound (IV ′) can be produced using compound (IV-A) under the same conditions as steps 1 to 6 of production method 1.
  • Compound (IV-A) can be obtained as a commercial product.
  • compound (ID) can be divided into two units, divided into two steps, and condensed with compound (IV-C).
  • compound (IV-C) when R'-Q 'is -NH-CO-Q4'-CO- (Q4' is substituted or unsubstituted alkylene having 1 to 12 carbon atoms), the compound in step 23 (IV-C) and CH 3 CH 2 —O—CO—Q 4 ′ —CO—OH (Q 4 ′ is as defined above) are condensed in the same manner as in step 23 to obtain ethyl ester of the compound obtained
  • the compound is hydrolyzed with a base such as lithium hydroxide in a solvent such as ethanol or water, and then it is condensed with R′—NH 2 (R ′ is as defined above) to give the desired compound.
  • the nucleic acid derivative in the present invention can be exemplified as a method for producing a compound having a partial structure represented by the formula (V ′).
  • Compound (V ′) can be produced using compound (IV-A) under the same conditions as steps 1 to 7 of production method 2.
  • Compound (IV-A) can be obtained as a commercial product.
  • the compound (ID) can also be divided into two units if necessary, divided into two steps, and condensed with the compound (VD).
  • the compound in step 31 (VD) and CH 3 CH 2 —O—CO—Q 4 ′ —CO—OH (Q 4 ′ is as defined above) are condensed in the same manner as in step 31 to obtain ethyl ester of the compound obtained
  • the compound is hydrolyzed with a base such as lithium hydroxide in a solvent such as ethanol or water, and then it is condensed with R′—NH 2 (R ′ is as defined above) to give the desired compound.
  • Manufacturing method 6 The method for producing the nucleic acid complex of the present invention in which a sugar ligand-tether-brancher unit is linked to the 5 'end of the oligonucleotide is exemplified below.
  • Step 35 Compound (I-H) comprises compound (II-E) and 2-cyanoethyl-N, N, N ′, N′-tetraisopropylphosphodiamidite in the presence of a base and a reaction accelerator either in the absence or in the presence of a solvent.
  • a reaction accelerator either in the absence or in the presence of a solvent.
  • C. at a temperature between room temperature and 200.degree. C., for 5 minutes to 100 hours.
  • the solvent those exemplified in step 2 of production method 1 can be mentioned.
  • As the base those exemplified in step 3 of production method 1 can be mentioned.
  • reaction accelerators include 1H-tetrazole, 4,5-dicyanoimidazole, 5-ethylthiotetrazole, 5-benzylthiotetrazole and the like, and they can be purchased as commercial products.
  • Step 36 The oligonucleotide chain is extended, and finally the compound (IH) is used to modify the 5 'end of the oligonucleotide with a sugar ligand-tether-brancher unit, followed by removal from the solid phase, deprotection of the protecting group Compound (I ′ ′) can be produced by performing and purification.
  • the removal from the solid phase, the deprotection of the protective group and the purification can be carried out in the same manner as in step 7 of production method 1, respectively.
  • Manufacturing method 7 The method for producing the nucleic acid complex of the present invention in which a sugar ligand-tether-brancher unit is linked to the 5 'end of the oligonucleotide is exemplified below.
  • Manufacturing method 8 The method for producing the nucleic acid complex of the present invention in which a sugar ligand-tether-brancher unit is linked to the 5 'end of the oligonucleotide is exemplified below.
  • Manufacturing method 9 The method for producing the nucleic acid complex of the present invention in which a sugar ligand-tether-brancher unit is linked to the 5 'end of the oligonucleotide is exemplified below.
  • Manufacturing method 10 The method for producing the nucleic acid complex of the present invention in which a sugar ligand-tether-brancher unit is linked to the 5 'end of the oligonucleotide is exemplified below.
  • Manufacturing method 11 Water or a suitable buffer of the sense strand having a sugar ligand-tether-brancher unit at the 3 'end or 5' end of the sense strand constituting the double stranded nucleic acid, and the antisense strand constituting the double stranded nucleic acid
  • a nucleic acid complex having double-stranded nucleic acid can be obtained by dissolving each in a liquid and mixing.
  • the buffer include acetate buffer, Tris buffer, citrate buffer, phosphate buffer, water and the like, and these may be used alone or in combination.
  • the mixing ratio of the sense strand to the antisense strand is preferably 0.5 to 2 equivalents, more preferably 0.9 to 1.1 equivalents, and 0.95 equivalents to 1 equivalent of the antisense strand per equivalent of the sense strand. More preferred is .05 equivalents.
  • an annealing treatment may be appropriately performed.
  • the annealing treatment is carried out by heating the mixture of sense strand and antisense strand to preferably 50 to 100 ° C., more preferably 60 to 100 ° C., still more preferably 80 to 100 ° C., and then gradually cooling to room temperature.
  • the annealing treatment is carried out by heating the mixture of sense strand and antisense strand to preferably 50 to 100 ° C., more preferably 60 to 100 ° C., still more preferably 80 to 100 ° C., and then gradually cooling to room temperature.
  • the antisense strand can be obtained according to the known oligonucleotide synthesis method described above.
  • the nucleic acid derivative in the present invention can be exemplified as a method for producing a compound having a partial structure represented by the formula (VI ′).
  • TBS represents a t-butyldimethylsilyl group
  • R 0 and R x are the same or different, and are hydrogen atoms
  • W is a C1-C10 alkylene, a C3-C8 cycloalkylene, or together with R0, a C4-C8 nitrogen-containing heterocyclic ring You may form.
  • Step 45 Compound (VI-B) can be produced using compound (VI-A) under the same conditions as in step 1 of production method 1.
  • Compound (VI-A) can be obtained as a commercially available product, or by a known method (eg, Bioorganic & Medical Chemistry Letters, 11: 383-386) or a method analogous thereto.
  • Step 46 Compound (VI-C) can be produced using compound (VI-B) under the same conditions as in step 2 of production method 1.
  • Step 47 Compound (VI-D) can be produced using compound (VI-C) under the same conditions as in step 3 of production method 1.
  • Step 48 Compound (VI-E) can be produced using compound (VI-D) under the same conditions as in step 2 of production method 1.
  • Step 49 Compound (VI-G) can be produced under the same conditions as in step 3 of production method 1 using compound (VI-E) and compound (VI-F).
  • Step 50 Compound (VI-H) can be produced using compound (VI-G) under the same conditions as in step 9 of production method 2.
  • Steps 51-53 Compound (VI ′) can be produced using compound (VI-H), compound (VI-I) and compound (VI-J) under the same conditions as in steps 4 to 6 of production method 1.
  • Steps 45 to 53 can be carried out by a known method (for example, the method described in WO 2015/105083) or a method analogous thereto.
  • Compound (VI-F) can be obtained by a known method (for example, a method described in Journal of American Chemical Society, 136, 16958, Trio, 2014), or a method according thereto be able to.
  • the sugar ligand-tether unit in formula 2 wherein P1 and P4 are -NH-CO-, -O-CO- or -S-CO- can be produced by the following method.
  • q 2 ′ is represents an integer smaller than 1 by q2
  • q4 ' represents an integer smaller by 1 than q4
  • Z represents H, OH, NH 2 , SH, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, methanesulfonyloxy, p-toluenesulfonyloxy or a carboxylic acid
  • B1 'and B2' are any of the structures of the following formulas And PG1, PG2, PG3, PG4, PG5, PG6 and PG7 each represent a suitable protecting group.
  • n1, m2, m3 or m4 each independently represent an integer of 0 to 10.
  • Step 54 Compound (VII-C) is obtained by adding Compound (VII-A) and Compound (VII-B) in a solvent such as tetrohydrofuran etc, triphenylphosphine polymer support, and under ice-cooling, diisopropylazodicarboxylate toluene It can be produced by reacting a solution.
  • a solvent such as tetrohydrofuran etc, triphenylphosphine polymer support, and under ice-cooling, diisopropylazodicarboxylate toluene It can be produced by reacting a solution.
  • a solvent such as tetrohydrofuran etc, triphenylphosphine polymer support, and under ice-cooling, diisopropylazodicarboxylate toluene It can be produced by reacting a solution.
  • the solvent those exemplified in step 2 of production process 1 can be mentioned.
  • Compound (VII-A) can
  • Step 55 Compound (VII-D) can be produced by reacting Compound (VII-C) in a solvent such as methanol under ice-cooling in the presence of a base.
  • a solvent such as methanol
  • a base those exemplified in Step 3 of Production Process 1 can be mentioned.
  • Step 56 Compound (VII-F) can be produced using compound (VII-D) and compound (VII-E) under the same conditions as in step 3 of production process 1.
  • Step 57 Compound (VII-H) can be produced using compound (VII-F) and compound (VII-G) under the same conditions as in step 3 of production process 1.
  • Step 58 Compound (VII-J) can be produced using compound (VII-H) and compound (VII-I) under the same conditions as in step 3 of production process 1. Also, by repeatedly performing the DP step and the step 58, a compound (VII-J) having a desired value of q1 can be produced.
  • Step 59 Compound (VII-L) can be produced using compound (VII-J) and compound (VII-K) under the same conditions as in step 3 of production process 1.
  • Step 60 Compound (VII-N) can be produced using compound (VII-L) and compound (VII-M) under the same conditions as in step 3 of production process 1.
  • Steps 61 to 63 Compound (VII ′) can be produced using compound (VII-O), compound (VII-P) and compound (VII-Q) under the same conditions as in step 3 of production process 1. Also, by repeatedly performing the DP step and the step 61, a compound (VII ′) having a desired q3 value can be produced.
  • Manufacturing method 14 A unit in which P7 is -O- in Formula 4 can be manufactured by the following method.
  • q5 '' represents an integer smaller than 2 by q5
  • Z2 represents H, OH, NH 2 or SH
  • PG8 and PG9 each represent a suitable protecting group
  • LC represents a sugar ligand-tether unit
  • E represents a carboxylic acid or maleimide.
  • Step 64 Compound (VIII-C) can be produced using compound (VIII-A) and compound (VIII-B) under the same conditions as in step 3 of production process 1. Also, by repeatedly performing the DP step and the step 64, a compound (VIII-C) having a desired q5 ′ ′ value can be produced.
  • Compound (VIII-B) is commercially available, or “Experimental Chemistry Lecture 4th Edition Organic Synthesis, p. 258, Maruzen (1992)”, “March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7 th It can obtain by combining the method as described in Edition, or the method according to it.
  • Step 65 Compound (VIII ′) can be produced using compound (VIII-C) and compound (VIII-D) under the same conditions as in step 3 of production process 1.
  • Compound (VIII-D) is commercially available, or “Experimental Chemistry Lecture 4th Edition Organic Synthesis, p. 258, Maruzen (1992)”, “March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7 th It can obtain by combining the method as described in Edition, or the method according to it.
  • a sugar ligand-tether unit in which P1 and P4 in the formula 2 are -O- can be produced by the following method.
  • n1, m2, m3 and m4 are as defined above.
  • Step 66 Compound (IX-C) is prepared by dissolving Compound (IX-A) and Compound (IX-B) in a solvent such as N, N′-dimethylformamide, adding a base such as potassium hydrogen carbonate, and the like to room temperature to 200 ° C. The reaction can be carried out by reacting for 5 minutes to 100 hours.
  • a solvent such as N, N′-dimethylformamide
  • a base such as potassium hydrogen carbonate, and the like
  • Step 67 Compound (IX-E) is prepared by dissolving Compound (IX-C) and Compound (IX-D) in a solvent such as N, N′-dimethylformamide, adding a base such as potassium hydrogen carbonate, and the like to room temperature to 200 ° C. The reaction can be carried out by reacting for 5 minutes to 100 hours.
  • a solvent such as N, N′-dimethylformamide
  • a base such as potassium hydrogen carbonate, and the like
  • the reaction can be carried out by reacting for 5 minutes to 100 hours.
  • As the solvent those exemplified in step 2 of production process 1 can be mentioned.
  • As the base those exemplified in Step 3 of Production Process 1 can be mentioned.
  • Compound (IX-A) can be obtained as a commercial product.
  • Step 68 Compound (IX-G) can be produced using compound (IX-E) and compound (IX-F) under the same conditions as in step 3 of production process 1.
  • Step 69 Compound (IX-I) can be produced using compound (IX-G) and compound (IX-H) under the same conditions as in step 3 of production process 1. Also, by repeatedly performing the DP step and the step 69, it is possible to produce the compound (VII-J) having a desired value of q1.
  • Step 70 Compound (IX-K) can be produced using compound (IX-I) and compound (IX-J) under the same conditions as in step 3 of production process 1.
  • Step 71 Compound (IX-M) can be produced using compound (IX-K) and compound (IX-L) under the same conditions as in step 3 of production process 1.
  • Steps 72-74 The compound (IX ′) can be produced using compound (IX-M), compound (IX-N), compound (IX-O) and compound (IX-P) under the same conditions as in step 3 of production process 1. Can. Also, by repeatedly performing the DP step and the step 72, the compound (IX ′) having a desired value of q3 can be produced.
  • Compound (IX'-B), Compound (IX'-D), Compound (IX'-F), Compound (IX'-H), Compound (IX'-J), Compound (IX'-L), Compound (IX) IX'-N), compound (IX'-O) and compound (IX'-P) are commercially available products, or "Experimental Chemistry Lecture 4th Edition Organic Synthesis, p. 258, Maruzen (1992)", "March 's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7 th Edition "combining the methods described, or can be obtained by a method analogous thereto.
  • Manufacturing method 16 The following method can also be used as a method for producing the nucleic acid complex of Formula 1 to Formula 8.
  • Step 75 Compound (XB) can be produced by reacting compound (XIII ′ ′) with compound (XA) in a solvent at 0 ° C. to 100 ° C. for 10 seconds to 100 hours.
  • the solvent include water, phosphate buffer, sodium acetate buffer, dimethyl sulfoxide and the like, and these can be used alone or in combination.
  • Compound (VIII ′) can be obtained by using production method 14.
  • the compound (X-A) can be prepared by a known method (for example, Bioconjugate Chemistry, Vol. 21, pp. 187-202, 2010, or Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry (Current Protocols) in Nucleic Acid Chemistry), September, 2010; CHAPTER: Unit 4.41) or an equivalent method.
  • Step 76 The compound (X ′) is produced by reacting the compound (X-B) at a temperature of room temperature and 200 ° C. for 5 minutes to 100 hours under conditions of pH 8 or more such as aqueous sodium carbonate solution or ammonia water Can.
  • Manufacturing method 17 The following method can also be used as a method for producing the nucleic acid complex of Formula 1 to Formula 8.
  • Step 77 Compound (XI-A) can be produced by a known method (for example, the method described in Bioconjugate Chemistry, Vol. 26, pp. 1451-1455, 2015) or the compound using Compound (VIII ′ ′) It can be obtained by a similar method. Compound (VIII ′ ′ ′) can be obtained by using production method 14.
  • Step 78 The compound (XI ′) can be produced using a compound (XI-A) and a compound (XI-B) according to a known method (eg, Bioconjugate Chemistry, vol. 26, p. 1451-1455, 2015) The methods described) or can be obtained by methods analogous thereto.
  • Compound (XI-B) can be obtained by the method described in Bioconjugate Chemistry, vol. 26, p. 1451-1455 (2015) or a method analogous thereto.
  • Step 79 As another method, compound (XI ′) can be obtained by a known method (see, for example, Bioconjugate Chemistry, 22: 1723-1728, 2011) or a method according thereto. It can be obtained directly from XI-A).
  • the nucleic acid complex in the present specification can also be obtained as a salt such as an acid addition salt, a metal salt, an ammonium salt, an organic amine addition salt, an amino acid addition salt and the like.
  • acid addition salts include inorganic acid salts such as hydrochlorides, sulfates and phosphates, and organic acid salts such as acetates, maleates, fumarates, citrates and methanesulfonates.
  • metal salts include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts, alkaline earth metal salts such as magnesium salts and calcium salts, aluminum salts, zinc salts and the like, and examples of ammonium salts include ammonium and tetramethyl Salts such as ammonium may be mentioned, organic amine addition salts may include addition salts such as morpholine and piperidine, and amino acid addition salts may include addition salts such as lysine, glycine and phenylalanine.
  • the complex When it is desired to prepare a salt of the nucleic acid complex of the present invention, the complex may be purified as it is when it is obtained in the form of the desired salt, or when it is obtained in free form, the complex Is dissolved or suspended in an appropriate solvent, the corresponding acid or base is added, and isolation and purification may be performed.
  • the complex salt when converting the counter ion that forms the complex salt to a different counter ion, the complex salt is dissolved or suspended in an appropriate solvent, and then an acid, a base and / or a salt (sodium chloride, chloride It may be isolated and purified by adding several equivalent to a large excess amount of an inorganic salt such as ammonium).
  • nucleic acid complexes of the present invention may have geometric isomers, stereoisomers such as optical isomers, tautomers etc., all possible isomers and their mixtures are also possible. Included in the present invention.
  • nucleic acid complex of the present invention may exist in the form of an adduct with water or various solvents, and these adducts are also included in the present invention.
  • nucleic acid complex of the present invention also includes those in which a part or all of the atoms in the molecule are substituted by atoms (isotopes) having different mass numbers (for example, deuterium atoms etc.).
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises the nucleic acid complex represented by Formula 1.
  • the nucleic acid complex of the present invention is recognized by the target cell by having the L1 and L2 sugar ligands, and is introduced into the cell.
  • the nucleic acid complex of the present invention can be administered to a mammal to suppress or reduce the expression of a target gene in vivo, and can be used to treat a disease associated with the target gene.
  • the nucleic acid complex of the present invention is used as a therapeutic agent or a prophylactic agent, it is desirable to use the most effective administration route for treatment as a therapeutic agent or a prophylactic agent, and it is not particularly limited.
  • Administration, subcutaneous administration, intramuscular administration and the like can be mentioned, preferably subcutaneous administration.
  • the dose varies depending on the condition, age, administration route and the like of the administration subject, it may be administered, for example, such that the daily dose converted to double-stranded oligonucleotide is 0.1 ⁇ g to 1000 mg, daily administration More preferably, the amount is 1 to 100 mg.
  • preparations suitable for intravenous administration or intramuscular administration include injections, and it is possible to use the prepared solution as it is, for example, in the form of injections, etc.
  • the solvent is removed and used by lyophilization, the solution is used by lyophilization, and / or the solution with an excipient such as mannitol, lactose, trehalose, maltose or glycine is used by lyophilization. It can also be done.
  • an injection can be prepared by adding an antioxidant such as citric acid, ascorbic acid, cysteine or EDTA, or an isotonic agent such as glycerin, glucose or sodium chloride.
  • an antioxidant such as citric acid, ascorbic acid, cysteine or EDTA
  • an isotonic agent such as glycerin, glucose or sodium chloride.
  • a cryopreservative such as glycerin can be added and cryopreserved.
  • the double stranded nucleic acid in the composition of the present invention can be introduced into cells by administering the composition of the present invention to mammalian cells.
  • the introduction of the nucleic acid complex of the present invention into mammalian cells in vivo may be carried out according to known transfection procedures which can be carried out in vivo.
  • the composition of the present invention can be delivered to the liver by intravenous administration to mammals including humans, and the double stranded nucleic acid in the composition of the present invention can be introduced into the liver or hepatocytes.
  • the expression of the CFB gene in the hepatocytes is reduced to treat a disorder mediated by a complement pathway abnormality. Or it can be prevented.
  • CFB related diseases include atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS), paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH), age-related macular degeneration (AMD), membranoproliferative glomerulonephritis (MPGN), C3 nephritis, Membrane nephropathy, asthma, autoimmune diseases (eg, systemic lupus erythematosus (SLE), psoriasis, neuromyelitis optica, myasthenia gravis, etc.) and the like can be mentioned.
  • the administration subject is a mammal, preferably a human.
  • the dose varies depending on the condition, age, administration route and the like of the administration subject, it may be administered, for example, such that the daily dose converted to double-stranded nucleic acid is 0.1 ⁇ g to 1000 mg. It is preferable to administer to 1 to 100 mg.
  • the invention also relates to nucleic acid complexes for use in the treatment of diseases; pharmaceutical compositions for use in the treatment of diseases; use of nucleic acid complexes for the treatment of diseases; in the manufacture of a medicament for the treatment of diseases
  • a nucleic acid complex for use in the manufacture of a medicament for treating a disease a method for treating or preventing a disease comprising administering an effective amount of the nucleic acid complex to a subject in need thereof; provide.
  • Mobile phase A aqueous solution containing 0.1% formic acid
  • B acetonitrile solution gradient: linear gradient (10 minutes-90%) of mobile phase B (3 minutes)
  • Synthesis step 1 of compound RE1-4 The compound RE1-1 (0.9602 g, 2.1460 mmol) is dissolved in N, N'-dimethylformamide (10 mL), N-Boc-ethylenediamine (manufactured by Sigma-Aldrich, 0.6877 g, 4.292 mmol), diisopropylethylamine (1.90 mL) , 10.87 mmol), and 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 1.6437 g, 4.3229 mmol) was added and stirred overnight at room temperature.
  • Reference Example 3 Step 7 Reference Example 3 Compound RE 3-7 (180 mg, 0.406 mmol) synthesized in step 6 N ⁇ , N ⁇ -bis (tert-butoxycarbonyl) -L-lysine (manufactured by Nova Biochem, 295 mg, 0.852 mmol), diisopropylethylamine ( Add 0.354 mL, 2.029 mmol) and 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (324 mg, 0.852 mmol) at room temperature And stirred overnight. The reaction mixture was ice-cooled, 10% aqueous citric acid solution was added, and the mixture was extracted with chloroform.
  • Reference Example 4 Step 1 Compound RE4-1 synthesized by the method described in Reference Example 3 (compound RE3-5, 0.5716 g, 0.7582 mmol in Reference Example 3), Bioconjugate Chemistry, Volume 22, pp. 690-699, Dodecanoic acid monobenzyl ester (0.4859 g, 1.5164 mmol), diisopropylethylamine (0.662 mL, 3.79 mmol) synthesized by the method described in 2011, and 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1 3,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (0.5766 g, 1.516 mmol) was dissolved in N, N dimethylformamide (12 mL) and stirred at room temperature for 1 hour.
  • Reference Example 4 Step 3 Reference Example 4 Compound RE4-3 (0.437 g, 0.7143 mmol) synthesized in step 2, N ⁇ , N ⁇ -bis (tert-butoxycarbonyl) -L-lysine (manufactured by Nova Biochem, 0.5483 g, 1.583 mmol), diisopropylethylamine ( Add 0.624 mL, 3.57 mmol) and 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (0.5703 g, 1.5 mmol) to room temperature. The mixture was stirred for 2 hours.
  • Reference Example 6 Step 2
  • Reference Example 6 Compound RE6-3 was quantitatively obtained in the same manner as in step 4 of reference example 3 using compound RE6-2 (0.9622 g, 1.952 mmol) synthesized in step 1.
  • Reference Example 6 Step 3 Reference Example 6 Compound RE6-3 (0.1146 g, 0.290 mmol) synthesized in step 2 and N-succinimidyl 15-azido-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoic acid (N3-PEG4-NHS, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Compound RE6-4 was quantitatively obtained in the same manner as in step 2 of Reference Example 5, using company-made, 0.0750 g, 0.1931 mmol).
  • Reference Example 6 Step 5
  • Reference Example 6 The process of Reference Example 3 using compound RE6-5 (0.1252 g, 0.193 mmol) synthesized in step 4 and L-glutamic acid di-tert-butyl ester (manufactured by Watanabe Kagaku Co., Ltd., 0.1180 g, 0.399 mmol).
  • Compound RE6-6 (0.0521 g, yield 24%) was obtained in the same manner as 3.
  • Reference Example 7 Step 2
  • Reference Example 7 Compound RE7-2 (0.1524 g, yield 61%) was obtained in the same manner as in step 1 of reference example 5 using compound RE7-2 (0.2653 g, 0.1097 mmol) synthesized in step 1.
  • Reference Example 10 Step 3 Reference Example 10 Compound RE10- was prepared using Compound D1 (0.1091 g, 0.044 mmol) synthesized in Step 2 and Compound RE2-3 (0.0748 g, 0.184 mmol) of Reference Example 2 in the same manner as in Step 3 of Reference Example 3. 3 was obtained as a crude product.
  • Reference Example 10 Step 5 Reference Example 10 Compound RE10-4 synthesized in step 4 (0.0816 g, 0.02734 mmol), O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ′, N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate (0.0221 g, 0.05827 mmol) and diisopropylethylamine (0.02 mL, 0.1094 mmol) are dissolved in N, N-dimethylformamide (4 mL), LCAA-CPG (Chem Gene, 0.4882 g) is added, and the mixture is allowed to reach room temperature. Stir overnight.
  • O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ′, N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate 0.0221 g, 0.05827 mmol
  • diisopropylethylamine 0.02 mL, 0.1094 mmol
  • the mixture was filtered off, washed successively with dichloromethane, 10% methanol solution in dichloromethane and diethyl ether, and then reacted with acetic anhydride / pyridine solution to obtain compound C1 (49.5 ⁇ mol / g, yield 89%) .
  • the yield was calculated from the introduction ratio to the solid phase carrier which can be calculated from the absorption derived from the DMTr group by adding 1% trifluoroacetic acid / dichloromethane solution to the solid phase carrier.
  • Compound RE 11-2 (1.050) was prepared according to the method described in Compound RE 11-1 (1.200 g, 3.640 mmol), Journal of Medicinal Chemistry, Volume 59, 2718-2733 (2016). g, 50% yield) was synthesized.
  • Compound RE 13-1 (Compound RE 1-1, 898.0 mg, 2.007 mmol in Reference Example 1) was dissolved in dichloromethane (15 mL), 1-hydroxybenzotriazole monohydrate (338.0 mg, 2.208 mmol), 1- (1 Add 3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (343 mg, 2.208 mmol), and N-1-Z-l, 3-diaminopropane hydrochloride (0.4910 mL, 2.208 mmol), and add 3 hours at room temperature. It stirred.
  • Reference Example 15 Dissolve iminodiacetic acid (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 1.5 g, 6.43 mmol,) in methylene chloride (30 mL), pentafluorotrifluoroacetic acid (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 2.75 mL, 16.08 mmol), triethylamine (4.48) mL, 32.2 mmol) was added and stirred for 4 hours. To the reaction solution was added 10% aqueous citric acid solution, and the mixture was extracted with chloroform, and then the organic layer was washed with saturated brine and dried over anhydrous magnesium sulfate.
  • Reference Example 16 Step 1 Using Compound RE16-1 (1.855 g, 3.19 mmol) synthesized by the method described in Reference Example 11 using N- (t-butoxycarbonyl) -L-glutamic acid (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), Reference Example 15 A crude purified product of compound RE16-2 was obtained in the same manner as in the step 1). ESI-MS m / z: 1105 (M + H) +
  • Reference Example 20 Step 1 The same method as in step 3 of Reference Example 3 using compound RE20-1 (AstaTech, 100 mg, 1.148 mmol) and Fmoc-Ser (tBuMe2Si) -OH (Watanabe Chemical Industry, 532 mg, 1.205 mmol) Thus, compound RE20-2 (410 mg, yield 70%) was obtained.
  • Reference Example 22 step 1 A crude product of compound RE22-2 was obtained in the same manner as in step 1 of Reference Example 2 using compound RE22-1 (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 1.2 g, 4.24 mmol).
  • Reference Example 22 Process 3 Compound RE22- was prepared by the same method as in step 3 of Reference Example 3 using compound RE22-3 (1.15 g, 3.16 mmol) and Fmoc-Ser (tBuMe2Si) -OH (manufactured by Watanabe Chemical Industries, Ltd., 1.677 g, 3.8 mmol). 4 (560 mg, 31% yield) was obtained.
  • 1 H-NMR 400 MHz, CDCl 3 ) ⁇ : 0.00-0.07 (6 H, m), 0.83-0.89 (9 H, m), 3.18-3.26 (2 H, m), 3.39-3. 46 (2 H, m), 3.61- 3.68 (1 H, m), 3. 76 (6 H, s), 3.
  • Reference Example 23 The compounds RE23-1 to RE23-5 listed in Table Y-1 and Fmoc-Ser (tBuMe 2 Si) -OH were listed in Table Y-2 in the same manner as in Reference Example 22. Compounds RE23-6 to RE23-10 were obtained. The compound RE23-11 described in Table Y-2 was obtained in the same manner as in Reference Example 22 using the compound RE22-3 in Reference Example 22 and Fmoc-Thr (tBuMe 2 Si) -OH. The compound RE23-12 described in Table Y-2 is obtained in the same manner as in Reference Example 22 using the compound RE23-1 and Fmoc-Thr (tBuMe 2 Si) -OH described in Table Y-1. The The NMR analysis data of the compound synthesized according to this example is shown in Table Y-3.
  • Compound RE24-2 was obtained in the same manner as in Step 2 of Reference Example 2 using Compound RE24-1 (compound RE22-4 in Reference Example 22; 2.487 g, 3.16 mmol) synthesized by the method described in Reference Example 22. (1.2 g, 67% yield).
  • Reference Example 25 Compounds RE25-1 to RE25-7 described in Table Z-1 were obtained in the same manner as in Reference Example 24 using compounds RE23-6 to RE23-12 described in Table Y-2. The mass spectrometry results of the compound synthesized according to this example are shown in Table Z-2.
  • Reference example 26 process 1 Compound RE26-1 (2.00 g, 9.47 mmol) was dissolved in N, N'-dimethylformamide (40 mL), iminodiacetic acid di-tert-butyl ester (5.11 g, 20.84 mmol) at room temperature, 1- ( 3-Dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (4.00 g, 20.84 mmol) and 1-hydroxybenzotriazole monohydrate (145 mg, 0.947 mmol) were added and stirred for 2 hours.
  • Reference Example 28 step 1 Compound RE28-1 (Compound RE 26-3, 474 mg, 0.744 mmol in Reference Example 26) synthesized by the method described in Reference Example 26 is dissolved in N, N'-dimethylformamide (10 mL), and a journal is prepared at room temperature. Trans-cyclohexane-1,4-dicarboxylic acid monobenzyl ester (0.234 mg, 0.893) synthesized by the method described in Journal of Medicinal Chemistry, Vol. 54, p. 2433-2446, 2011.
  • Reference Example 31 step 1 Dissolve 4-nitroisophthalic acid RE31-1 (500 mg, 2.37 mmol) and N-Boc-ethylenediamine (808 mg, 5.21 mmol) in N, N'-dimethylformamide (10 mL) and use triethylamine (0.90) at room temperature. Add 1 mL (7.11 mmol), 1-hydroxybenzotriazole monohydrate (703 mg, 5.21 mmol) and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (1.36 g, 7.11 mmol) to Stir for hours. The reaction mixture was worked up, and the crude product was purified by silica gel column chromatography to obtain compound RE31-2 (650 mg, yield 55%).
  • Reference example 32 process 1 Dissolve 3,5-dinitrobenzoic acid RE 32-1 (500 mg, 2.36 mmol) and N-Cbz-ethylenediamine (588 mg, 2.83 mmol) in N, N'-dimethylformamide (5.0 mL) and use triethylamine at room temperature Add (0.65 mL, 4.72 mmol), 1-Hydroxybenzotriazole monohydrate (380 mg, 2.83 mmol) and 1- (3-Dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (675 mg, 3.54 mmol) Stir for 16 hours. The reaction mixture was worked up, and the crude product was purified by silica gel column chromatography to obtain compound RE32-2 (445 mg, yield 48%).
  • Reference example 32 process 2 Compound RE32-2 (200 mg, 0.515 mmol) is dissolved in ethanol (5.0 mL), tin (II) chloride (584 mg, 3.09 mmol) and concentrated hydrochloric acid (0.2 mL) are added at room temperature, and Stir for hours. The reaction mixture was worked up to give compound RE32-3 (180 mg, quantitative). ESI-MS m / z: 329 (M + H) +
  • Reference Example 37 Step 1 Compound RE 37-1 (Compound RE 13-2 in Reference Example 13, 430 mg, 0.674 mmol) synthesized by the method described in Reference Example 13 was dissolved in N, N′-dimethylformamide (6 mL), % Palladium carbon powder (water content, 54.29%; 79 mg) was added and stirred for 4 hours under hydrogen atmosphere. The reaction solution was filtered. The compound RE26-5 (105.0 mg, 0.148 mmol) in Reference Example 26, 1-hydroxybenzotriazole monohydrate (11. 31 mg, 0.074 mmol), and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethyl were added to the filtrate.
  • Reference Example 39 Step 1 Compound RE 39-1 (Compound RE 13-2, 418 mg, 0.655 mmol in Reference Example 13) synthesized by the method described in Reference Example 13 was dissolved in N, N′-dimethylformamide (6 mL), % Palladium carbon powder (hydrous, 54.29%; 77 mg) was added and stirred for 5 hours under hydrogen atmosphere. The reaction solution was filtered. The compound RE27-6 (85 mg, 0.144 mmol), 1-hydroxybenzotriazole monohydrate (121.0 mg, 0.791 mmol), and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3 which were synthesized in Reference Example 27 were added to the filtrate.
  • Reference Example 45 Step 1 Compound RE 45-1 (Compound RE 32-3, 75.0 mg, 0.228 mmol in Reference Example 32) synthesized by the method described in Reference Example 32 is dissolved in N, N'-dimethylformamide (3.0 mL), and the reaction is performed at room temperature Compound RE 14-3 of Example 14 (574 mg, 0.571 mmol), diisopropylethylamine (0.199 mL, 1.14 mmol), O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ′, N′-tetra Methyluronium hexafluorophosphate (217 mg, 0.571 mmol) was added and stirred overnight.
  • Reference Example 47 Step 1 Using compound RE47-1 (compound RE33-4 in Reference Example 33, 0.101 g, 0.282 mmol) synthesized by the method described in Reference Example 33, Compound RE15-2 (0.607 g, 0.613 mmol) of Reference Example 15 was synthesized. The compound RE47-2 (0.25 g, yield 39%) was obtained by the same method as used in Step 3 of Reference Example 3. ESI-MS m / z: 2304 (M + H) +
  • a compound A6 was synthesized by the same method as the synthesis of the compound A1 of Reference Example 8 using the compound RE49-1 (0.048 g, 0.021 mmol) and N-succinimidyl 3-maleimidopropionate (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 0.017 g, 0.064 mmol). (0.040 g, 78% yield) was obtained.
  • Reference Example 51 step 1 Compound RE51-1 (0.122 g, 0.054 mmol) synthesized by the method described in Reference Example 7 and the method described in Bioconjugate Chemistry, Volume 22, pp. 690-699, 2011 A compound RE51-2 (0.076 g, yield 56%) was obtained in the same manner as in Reference Example 4, step 1, using hexanoic acid monobenzyl ester synthesized using a similar method.
  • Reference Example 59 step 1 Method similar to step 3 of Reference Example 3 using compound D10 (74.1 mg, 0.029 mmol) synthesized by the method described in Reference Example 46 and compound RE22-2 (15 mg, 0.027 mmol) of Reference Example 22; Alternatively, a crude organism of compound RE59-1 was obtained by the method described in Bioconjugate Chemistry, Vol. 26, pp. 1451-1455 (2015). ESI-MS m / z: 1392 (M + H) + , detected as de-DMTr body
  • Reference Example 60 Tables P-1 and P-2 in the same manner as in Reference Example 59, Steps 1 and 2, using Compound D1 and Compound RE20-4 of the structure of Reference Example 20 described in Table Z-1 or Reference Example 20 The compound described in was obtained.
  • the mass spectrometry results of the compound synthesized according to this example are shown in Table P-3.
  • Step 1 Reference Example Compound A1 and a terminal thiolated oligonucleotide synthesized by the method described in Molecules, Vol. 17, p. 13825-13843, 2012 were added and allowed to stand at room temperature for 4 hours. Sodium carbonate was added to the reaction mixture and allowed to stand overnight at 4 ° C.
  • Step 2 Compound 1-1 (3′-CFB-ssRNA) synthesized in step 1 was prepared in a mixed buffer (100 mmol / L potassium acetate, 30 mmol / L 2- [4- (2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl The concentration was adjusted (50 ⁇ mol / L) with ethanesulfonic acid, HEPES) -KOH (pH 7.4), 2 mmol / L magnesium acetate). Equal amounts of the sense strand and the antisense strand (50 ⁇ mol / L) were mixed and allowed to stand at 80 ° C. for 10 minutes. Antisense strand sequences are as described in Table R-2. The temperature was gradually lowered and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour to obtain a double-stranded compound 1-2.
  • Examples 2 to 11 Synthesis of Compounds 2-1 to 11-1 and Compounds 2-2 to 11-2 Compound 2- was prepared in the same manner as in Example 1 except that oligonucleotides having a different base sequence from Example 1 were used. 1-11-1 and compounds 2-2-11-2 were synthesized.
  • Step 1 Reference Example Compound D5 is used to add an amino-terminal modified oligonucleotide synthesized by the method described in Molecules, Vol. 17, p. 13825-13843, 2012, to obtain bioconjugate chemistry. 22: 1723-1728 (2011) or Bioconjugate Chemistry, 26: 1451-1455 (2015). Purification by the method described in Example 1 gave compound 12-1.
  • Step 2 Compound 12-2 was obtained in the same manner as in step 2 of Example 1.
  • Examples 13 to 15 Synthesis of Compounds 13-1 to 15-1 and Compounds 13-2 to 15-2 In the same manner as in Example 1 except that oligonucleotides having a different base sequence from Example 1 were used, Compound 13 -1 to 15-1 and compounds 13-2 to 15-2 were synthesized.
  • N (M) represents 2'-O-methyl modified RNA
  • N (F) represents 2'-fluorine modified RNA
  • ⁇ represents phosphorothioate.
  • N (M) represents 2'-O-methyl modified RNA
  • N (F) represents 2'-fluorine modified RNA
  • p represents phosphorylation at the 5 'end
  • ⁇ represents phosphorothioate.
  • Reference test example 1 Measurement of knockdown activity of CFB mRNA in human cells Huh 7 cells (National Research and Development Corporation, National Institute of Biomedical Innovation and Health and Nutrition Research Institute, JCRB Cell Bank) ) Were seeded at 10,000 cells / 80 ⁇ L / well.
  • DMEM medium Life Technology, catalog number 08458-16
  • FBS fetal bovine serum
  • n (n 2 to 124) and the antisense strand shown in SEQ ID NO: [n + 123] form a pair).
  • the double-stranded nucleic acid described in Tables 1-1 to 1-3 and RNAiMax transfection reagent (Life Technology, catalog number: 1401251) were prepared using Opti-MEM medium (Life Technology, catalog number 11058-021).
  • the amount of CFB mRNA relative to the amount of CFB mRNA introduced when each double stranded nucleic acid was introduced was calculated, assuming that the amount of CFB mRNA was 1.0 when the Huh7 cells were treated with the transfection reagent alone without addition of siRNA. This experiment was performed multiple times, and the average value of the relative expression amount of CFB mRNA is shown in Tables 1-1 to 1-3.
  • human primary hepatocytes (Bioprediction International, catalog number HEP 187) suspended in plating medium (Bioprediction International, catalog number LV 0304-2), the cell number 10000
  • the cells are seeded to be cells / 80 ⁇ L / well and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 for 6 hours, and then the culture supernatant is carefully removed, and the incubation medium (Bioprediction International, catalog number LV0304)
  • Each nucleic acid complex was subjected to human primary hepatocytes by adding -2).
  • cells treated with nothing were seeded.
  • the cells to which each nucleic acid complex has been added are cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C.
  • the cDNA was prepared by reverse transcription reaction.
  • the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) is a CFB gene and a constitutively expressed gene by PCR reaction according to the method described in the attached instruction manual.
  • the following PCR reaction was performed on the gene (hereinafter referred to as gapdh) to measure the amount of mRNA amplification, and the amount of amplification of gapdh was used as an internal control to calculate a semi-quantitative value of mRNA of CFB.
  • the expression rate of CFB mRNA was determined from the semi-quantitative value of CFB mRNA, where the semi-quantitative value of CFB mRNA in the negative control measured similarly was 1.
  • the results of the expression rate of the obtained CFB mRNA are shown in Table S1. As apparent from Table S1, each nucleic acid complex suppressed the expression of mRNA of CFB gene after addition to human primary hepatocytes.
  • Test Example 2 In Vitro Knockdown Test of Nucleic Acid Complex on Mouse Primary Hepatocytes
  • the in vitro knockdown activity of mouse primary hepatocytes was measured for each of the nucleic acid complexes obtained in Examples 10, 11, 14 and 15. .
  • Williams' E Medium Wood's E Medium
  • Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements Thermo Fisher Scientific, Catalog No.
  • CM 3000 The CD1 mouse-derived mouse primary hepatocytes (manufactured by Thermo Fisher Scientific, catalog number MSCP 10) suspended in (Thermo Fisher Scientific, catalog number A12176-01) were seeded so that 10000cells / 80 ⁇ L / well, 37 ° C., the After incubation for 6 hours under 5% CO 2, culture Each nucleic acid complex was added to mouse primary hepatocytes by carefully removing the supernatant and adding Williams Emedium containing Primary Hepatocyte Maintenance Supplements (Thermo Fisher Scientific, catalog number CM4000). Provided for. In addition, as a negative control group, cells treated with nothing were seeded.
  • the cells to which each nucleic acid complex has been added are cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 18 hours, washed with ice-cold phosphate buffered saline (DPBS) (manufactured by Nacalai Tesque) and superprep cell Total RNA was recovered and the obtained total RNA was templated according to the method described in the instruction attached to the product, using Lysis and T kit ForQ PCR (Toyobo Co., Ltd., catalog number SCQ-201). The cDNA was prepared by reverse transcription reaction.
  • DPBS ice-cold phosphate buffered saline
  • the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) is a CFB gene and a constitutively expressed gene by PCR reaction according to the method described in the attached instruction manual.
  • the following PCR reaction was performed on the gene (hereinafter referred to as gapdh) to measure the amount of mRNA amplification, and the amount of amplification of gapdh was used as an internal control to calculate a semi-quantitative value of mRNA of CFB.
  • the expression rate of CFB mRNA was determined from the semi-quantitative value of CFB mRNA, where the semi-quantitative value of CFB mRNA in the negative control measured similarly was 1.
  • the expression rate of the obtained CFB mRNA is shown in Table S2.
  • each nucleic acid complex suppressed the expression of mRNA of CFB gene after addition to mouse primary hepatocytes.
  • Test Example 3 In Vivo Knockdown Test of Nucleic Acid Complex in Mouse
  • DPBS phosphate buffered saline
  • BALB / cA obtained from CLEA Japan, Inc.
  • each nucleic acid complex was subcutaneously administered to mice at 30 mg / kg, 10 mg / kg, 3 mg / kg or 0.3 mg / kg.
  • DPBS phosphate buffered saline
  • N.T. represents that it did not evaluate.
  • nucleic acid complex of the present invention was administered to mice to reduce the expression of the CFB gene in the liver.
  • Test Example 4 In Vitro Knockdown Test of Nucleic Acid Complex on Rat Primary Hepatocytes
  • the in vitro knockdown activity of rat primary hepatocytes was measured for each of the nucleic acid complexes shown in Table S4.
  • 96 well culture plate of each nucleic acid complex diluted with Optim (Opti-MEM) (Thermo Fisher Scientific, Catalog No. 31985) to a final concentration of 30, 10, 3 or 1 nmol / L After dispensing 20 ⁇ l each into the tube, Williams 'E Medium (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements) (Thermo Fisher Scientific, Catalog No.
  • CM 3000 containing Williams' E Medium (William's E Medium)
  • the primary rat hepatocytes (Thermo Fisher Scientific, catalog number: RTCP10) suspended in (Thermo Fisher Scientific, Catalog No. A12176-01) become 10000 cells / 80 ⁇ L / well of the cell number. seeded manner, 37 ° C., the After incubation for 6 hours under 5% CO 2, and carefully removing the culture supernatant, Lai Mali HEPA door site maintenance supplements (Primary Hepatocyte Maintenance Supplements) (Thermo Fisher Scientific, Inc., catalog number CM4000) with the addition of Williams E medium, including, each nucleic acid complexes were subjected to rat primary hepatocytes.
  • Lai Mali HEPA door site maintenance supplements Primary Hepatocyte Maintenance Supplements
  • the cDNA was prepared by reverse transcription reaction.
  • the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) is a CFB gene and a constitutively expressed gene by PCR reaction according to the method described in the attached instruction manual.
  • the following PCR reaction was performed on the gene (hereinafter referred to as gapdh) to measure the amount of mRNA amplification, and the amount of amplification of gapdh was used as an internal control to calculate a semi-quantitative value of mRNA of CFB. Assuming that the semiquantitative value of CFB mRNA in the negative control similarly measured was 1, the expression rate of CFB mRNA was determined. The results of the expression rate of the obtained CFB mRNA are shown in Table S4. As apparent from Table S4, each nucleic acid complex suppressed the expression of mRNA of CFB gene after addition to rat primary hepatocytes.
  • Test Example 5 In Vivo Activity of Nucleic Acid Complex in Rat
  • a rat in vivo knockdown test was performed by the following method.
  • Each nucleic acid complex was diluted with phosphate buffered saline (DPBS) (manufactured by Nacalai Tesque) according to the test.
  • DPBS phosphate buffered saline
  • DPBS phosphate buffered saline
  • RNA samples were prepared using Trizol® ARE Isolation Reagents (Thermo Fisher Scientific, Catalog No. 1559 026) and Magna Pure 96 (MagNA Pure 96) (Roche Life Sciences).
  • Total RNA was recovered according to the method described in the attached manual.
  • reverse transcription using the obtained total RNA as a template according to the method described in the instruction attached to the product using Transcriptor First Strand CDNA Synthesis Kit (Roche Life Science, catalog number 04897030001)
  • the cDNA was prepared by the reaction.
  • the expression rate of CFB mRNA was determined from the quasi-quantitative value of CFB mRNA, where the quasi-quantitative value of CFB mRNA in the PBS administration group measured in the same manner was 1.
  • the expression rate of the obtained CFB mRNA is shown in Table S5.
  • nucleic acid complex of the present invention is administered to rats to reduce the expression of the CFB gene in the liver.
  • the nucleic acid complex of the present invention can be administered to mammals and used to treat CFB related diseases in vivo.

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Abstract

本発明は下記式１で表される、補体B因子（CFB）の発現を抑制することが可能な核酸複合体を提供する。 式１：（式１中、　Ｘは、センス鎖およびアンチセンス鎖からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸であり、　該二本鎖核酸は、該アンチセンス鎖中の、17個～30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、表1-1～表1-3に記載された標的CFB mRNA配列のいずれかと相補的であり、　該センス鎖の3'末端または5'末端はＳ３に結合し、　Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドであり、　Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ独立して、リンカーである。）

Description

核酸複合体
　本発明は、核酸複合体および該核酸複合体を含む医薬組成物等に関する。
　核酸医薬として、アプタマー、アンチセンス、デコイ核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびａｎｔｉｍｉＲＮＡ等が知られている。核酸医薬は、細胞内のあらゆる遺伝子を制御できる汎用性の高さから、今まで治療困難とされてきたさまざまな疾患への臨床応用が期待されている。
　また、核酸医薬は、細胞内における標的選択性と活性の高さから抗体、低分子医薬に次ぐ、次世代医薬として期待されている。
　しかしながら、核酸医薬は、標的組織への送達が困難であることが問題点として挙げられる。
　インビボにおける効果的な核酸医薬の送達法の１つとして、標的化化合物と核酸との核酸複合体（コンジュゲート）を用いることが報告されている。標的化化合物としては、細胞外に発現する受容体に結合可能なリガンドが挙げられる。その中でも特に、肝細胞に極めて高発現しているアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合可能であるリガンドとしてＮ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）等を利用した核酸複合体が複数報告されている。近年では、これらのリガンドとｓｉＲＮＡ類とを結合した核酸複合体が肝細胞に効率的に送達されることが報告されている（非特許文献１）。
　標的化化合物とオリゴヌクレオチドの複合体として、特許文献１および２には、例えば、以下に示す核酸複合体が開示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 （式中、Ａｃはアセチル基を表す。以下、本明細書において同様である。）
　また、特許文献３には、特許文献１および２と同様の糖リガンド－テザーユニットを有する以下の構造を有する核酸複合体が開示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　また、特許文献４には、糖リガンド－テザーユニットとして、以下に示す構造を有する核酸複合体が開示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　補体は免疫反応を媒介する血中タンパク質の一群であり、補体の作用としては、食細胞による病原菌の食作用促進や外膜を持つウィルスに対して傷害を与えて感染力を失わせる等が挙げられる。補体の中でもC3は血清中に最も多量に存在し、補体第二経路では補体B因子（complement factor B；CFB）等によって活性化されることによってその作用が制御されている（非特許文献２）。
　補体第二経路に関わる制御因子の異常や、C3転換酵素に対する自己抗体での安定化などにより、C3が活性化され続けると、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD）、膜性増殖性糸球体腎炎（MPGN）、C3腎炎、膜性腎症、急速進行性糸球体腎炎（RPGN）、急性腎障害（AKI）、ANCA関連血管炎、ループス腎炎、喘息、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス(SLE)、乾癬、視神経脊髄炎、重症筋無力症等）などの疾患発症に関連することが知られている（非特許文献３、４）。補体B因子の作用を特異的に阻害することにより、上記の疾患を予防あるいは治療できると期待できるが、補体B因子は血中に300μg/mLという比較的高濃度で存在しており（非特許文献５）、これら全ての補体B因子を例えば一般的な抗体医薬によって阻害し続けることは容易ではない。
国際公開第２００９／０７３８０９号 国際公開第２０１３／０７５０３５号 国際公開第２０１５／１０５０８３号 国際公開第２０１４／１７９６２０号
ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ），２０１４年，第１３６巻，ｐ１６９５８－１６９６１ プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ）１９９７年，　第９４巻，　ｐ８７２０－８７２５ イムノロジカル・レビュー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ）２００８年，　　第２２３巻，　ｐ３００－３１６ ジャーナル・オブ・アメリカン・ソサエティ・オブ・ネフロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ　２０１５年，　第２６巻，ｐ　２９１７－２９２９ 補体への招待、２０１１年、メディカルビュー社、ｐ１８
　本発明の目的は、補体B因子（CFB）の発現を抑制することが可能な核酸複合体を提供することにある。
　本発明は、以下に関する。
［１］
　下記式１で表される核酸複合体。
式１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 （式１中、
　Ｘは、センス鎖およびアンチセンス鎖からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸であり、
　　該二本鎖核酸は、該アンチセンス鎖中の、17個～30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、表1-1～表1-3に記載された標的CFB mRNA配列のいずれかと相補的であり、
　　該センス鎖の3’末端または5’末端はＳ３に結合し、
　Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドであり、
　Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ独立して、リンカーである。）
［２］
　下記式２で表される構造を有する、［１］に記載の核酸複合体。
式２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 （式２中、
　Ｘ、Ｌ１、Ｌ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義であり、
　Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５およびＰ６、ならびにＴ１およびＴ２は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎは０～９９の整数であり、
　Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式２－１で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｐ２またはＰ３あるいはＰ５またはＰ６との結合点であり、ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４は、それぞれ独立して、０～１０の整数であり、
式２－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
 　ｐ１およびｐ２は、それぞれ独立して、１、２または３の整数であり、
　ｑ１、ｑ２、ｑ３およびｑ４は、それぞれ独立して、０～１０の整数であり、
　ただし、ｐ１およびｐ２がそれぞれ２または３の整数であるとき、それぞれのＰ３およびＰ６、Ｑ２およびＱ４、Ｔ１およびＴ２ならびにＬ１およびＬ２は、同一または異なっていてもよく、ｑ１～ｑ４が２～１０のとき、それぞれの－［Ｐ２－Ｑ１］－，－［Ｑ２－Ｐ３］－，－［－Ｐ５－Ｑ３］－，－［Ｑ４－Ｐ６］－の組み合わせは同一または異なっていてもよい。）
［３］
　Ｐ１およびＰ４が、それぞれ独立して、－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－または－Ｏ－である［２］に記載の核酸複合体。
［４］
　－［Ｐ２－Ｑ１］ｑ１－および－［Ｐ５－Ｑ３］ｑ３－がそれぞれ独立して、存在しないか、または下記式３－１～式３－３で表されるいずれかの構造である、［２］または［３］に記載の核酸複合体。
式３－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 式３－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
 式３－３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
 （式３－１～式３－３中、
　ｍ５およびｍ６は、それぞれ独立して、０～１０の整数であり、式３－１～式３－３の構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｂ１またはＢ２あるいはＰ１またはＰ４との結合点である。）
［５］
　下記式４－１～式４－９で表されるいずれかの構造を有する、［２］～［４］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
式４－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
 式４－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
 式４－３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
 式４－４：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
 式４－５：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
 式４－６：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
 式４－７：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 式４－８：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
 式４－９：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
 （式４－１～４－９中、
　Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ３、Ｐ３、Ｐ６、Ｔ１、Ｔ２、Ｑ２、Ｑ４、ｑ２およびｑ４はそれぞれ前記と同義である。）
［６］
　下記式５で表される構造を有する、［１］に記載の核酸複合体。
式５：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
 （式５中、
　Ｘ、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｑ１、Ｑ２、Ｂ１、Ｔ１、Ｌ１、p１、q１およびｑ２はそれぞれ前記と同義である。）
［７］
　Ｐ１が－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－または－Ｏ－である［６］に記載の核酸複合体。
［８］
　下記式６－１～式６－９で表されるいずれかの構造を有する、［６］または［７］に記載の核酸複合体。
式６－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
 式６－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
 式６－３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
 式６－４：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
 式６－５：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
 式６－６：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
 式６－７：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
 式６－８：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
 式６－９：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
 （式６－１～６－９中、
　Ｘ、Ｓ３、Ｐ３、Ｑ２、Ｔ1、Ｌ１およびｑ２は、それぞれ前記と同義である。）
［９］
　下記式７－１～式７－９で表されるいずれかの構造を有する、［２］～［５］に記載の核酸複合体。
式７－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
 式７－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
 式７－３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
 式７－４：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
 式７－５：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
 式７－６：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
 式７－７：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
 式７－８：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
 式７－９：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
 （式７－１～７－９中、
　Ｘ、Ｓ３、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ前記と同義である。）
［１０］
　前記糖リガンドが、Ｎ－アセチルガラクトサミンである、［１］～［９］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［１１］
　前記二本鎖核酸が修飾ヌクレオチドを含む、［１］～［１０］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［１２］
　センス鎖の3’末端およびアンチセンス鎖の5’末端は、平滑末端を形成する、［１］～［１１］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［１３］
　前記二本鎖核酸が、糖部修飾ヌクレオチドを含む、［１１］に記載の核酸複合体。
［１４］
　下記式７－８－１で表される構造を有する、［１］～［１３］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
式７－８－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
 （式７－８－１中、Ｘは前記と同義である。）
［１５］
　Ｘが、表1-1～表1-3に記載のセンス鎖／アンチセンス鎖からなる群から選択される1対のセンス鎖／アンチセンス鎖である、［１］～［１４］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［１６］
　Ｘが、表M1-1～表M1-3に記載のセンス鎖／アンチセンス鎖からなる群から選択される1対のセンス鎖／アンチセンス鎖である、［１］～［１４］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［１７］
　Ｘが、表M1-4に記載のセンス鎖／アンチセンス鎖からなる群から選択される１対のセンス鎖／アンチセンス鎖である、［１］～［１４］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［１８］
　Ｘが、表M1-4に記載のＥＢ０１２５で表される１対のセンス鎖／アンチセンス鎖である、［１７］に記載の核酸複合体。
［１９］
　［１］～［１８］のいずれか１項に記載の核酸複合体を含む、医薬組成物。
[２０］
　細胞内に導入するための、［１９］に記載の医薬組成物。
[２１］
　静脈内投与または皮下投与される、［１９］または［２０］に記載の医薬組成物。
[２２］
　［１］～［１８］のいずれか１項に記載の核酸複合体または［１９］～［２１］のいずれか１項に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療または予防方法。
［２３］
　［１］～［１８］のいずれか１項に記載の核酸複合体または［１９］～［２１］のいずれか１項に記載の医薬組成物を用いて二本鎖核酸を細胞内に導入することを含む、CFB遺伝子の発現を抑制する方法。
［２４］
　［１］～［１８］のいずれか１項に記載の核酸複合体または［１９］～［２１］のいずれか１項に記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、CFB関連疾患の治療方法。
［２５］
　［１］～［１８］のいずれか１項に記載の核酸複合体または［１９］～［２１］のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、CFB関連疾患の治療に用いるための医薬。
［２６］
　［１］～［１８］のいずれか１項に記載の核酸複合体または［１９］～［２１］のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、CFB関連疾患の治療剤。
［２７］
　CFB関連疾患が、非典型溶血性尿毒症症候群、発作性夜間ヘモグロビン尿症、加齢黄斑変性症、膜性増殖性糸球体腎炎、C3腎炎、膜性腎症、急速進行性糸球体腎炎（RPGN）、急性腎障害（AKI）、ANCA関連血管炎、ループス腎炎、喘息、全身性エリテマトーデス(SLE)、乾癬、視神経脊髄炎または重症筋無力症である、［２４］に記載の治療方法。
［２８］
　CFB関連疾患が、非典型溶血性尿毒症症候群、発作性夜間ヘモグロビン尿症、加齢黄斑変性症、膜性増殖性糸球体腎炎、C3腎炎、膜性腎症、急速進行性糸球体腎炎（RPGN）、急性腎障害（AKI）、ANCA関連血管炎、ループス腎炎、喘息、全身性エリテマトーデス(SLE)、乾癬、視神経脊髄炎または重症筋無力症である、［２５］に記載の医薬。
［２９］
　CFB関連疾患が、非典型溶血性尿毒症症候群、発作性夜間ヘモグロビン尿症、加齢黄斑変性症、膜性増殖性糸球体腎炎、C3腎炎、膜性腎症、急速進行性糸球体腎炎（RPGN）、急性腎障害（AKI）、ANCA関連血管炎、ループス腎炎、喘息、全身性エリテマトーデス(SLE)、乾癬、視神経脊髄炎または重症筋無力症である、［２６］に記載の治療剤。
　例えば本発明の核酸複合体を含む医薬組成物を、哺乳動物に投与して、生体内において、各種関連疾患を治療することができる。
　本発明の核酸複合体は、下記式１で表される核酸複合体である。
式１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
　式１中、
　Ｘは、センス鎖およびアンチセンス鎖からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸であり、
　　該二本鎖核酸は、該アンチセンス鎖中の、17個～30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、表1-1～表1-3に記載された標的CFB mRNA配列のいずれかと相補的であり、
　　該センス鎖の3’末端または5’末端はＳ３に結合し、
　Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドであり、
　Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ独立して、リンカーである。
　本発明において、Ｓ１およびＳ２は、Ｓ３のベンゼン環上の置換位置に対して、それぞれオルト位、メタ位、パラ位でベンゼン環と結合し得るが、下記式１－１で表される核酸複合体であることが好適である。式１におけるＳ１およびＳ２のベンゼン環への結合手は、ベンゼン環上のＳ３の置換位置以外で任意の位置であり得ることを意味する。
式１－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
　式１－１中、
　Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義である。
　本明細書において、前記と同義とは、式１－１中を例示して説明すると、式１－１中のＸ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１およびＳ２それぞれについて、式１において前記するＸ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１およびＳ２それぞれについての定義と同様の基であり得ることを意味している。
　本発明において、Ｘは、センス鎖およびアンチセンス鎖からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸である。
　また、該二本鎖核酸は、該アンチセンス鎖中の、17個～30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、後述する表1-1～表1-3に記載された標的CFB mRNA配列のいずれかと相補的である。
　さらにまた、該センス鎖の3’末端または5’末端はＳ３に結合する。
　Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドである。
　本発明において、糖リガンドとしては、標的細胞に発現している受容体に結合可能な糖類（単糖、二糖、三糖および多糖等）に由来する基を意味する。本発明においては、糖リガンドがＯ－結合によりＳ１およびＳ２のリンカーに結合している場合には、糖リガンドを構成する糖類の結合に関与する水酸基を除いた部分が糖類に由来する基としての糖リガンドを意味する。
　本発明においては、オリゴヌクレオチドの標的細胞となる糖リガンドを選択すればよい。
　単糖としては、例えば、アロース、アルトース、アラビノース、クラジノース、エリトロース、エリスルロース、フルクトース、Ｄ－フシトール、Ｌ－フシトール、フコサミン、フコース、フクロース、ガラクトサミン、Ｄ－ガラクトサミニトール、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、ガラクトース、グルコサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グルコース－６－リン酸、グロース、グリセルアルデヒド、Ｌ－グリセロ－Ｄ－マンノ－ヘプトース、グリセロール、グリセロン、グロース、イドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、マンノース－６－リン酸、プシコース、キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブロース、セドヘプツロース、ソルボース、タガトース、タロース、酒石酸、トレオース、キシロース、およびキシルロース等が挙げられる。
　二糖、三糖、多糖としては、例えば、アベクオース、アクラボース、アミセトース、アミロペクチン、アミロース、アピオース、アルカノース、アスカリロース、アスコルビン酸、ボイビノース、セロビオース、セロトリオース、セルロース、カコトリオース、カルコース、キチン、コリトース、シクロデキストリン、シマロース、デキストリン、２－デオキシリボース、２－デオキシグルコース、ジギノース、ジギタロース、ジギトキソース、エバロース、エベミトロース（ｅｖｅｍｉｔｒｏｓｅ）、フルクトオリゴ糖、ガルトオリゴ糖（ｇａｌｔｏ－ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、ゲンチアノース、ゲンチオビオース、グルカン、グルコーゲン、グリコーゲン、ハマメロース、ヘパリン、イヌリン、イソレボグルコセノン、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソパノース、コジビオース、ラクトース、ラクトサミン、ラクトースジアミン、ラミナラビオース、レボグルコサン、レボグルコセノン、β－マルトース、マルトリオース、マンナン－オリゴ糖、マンニノトリオース、メレチトース、メリビオース、ムラミン酸、ミカロース、ミシノース、ノイラミン酸、シアル酸含有糖鎖、ニゲロース、ノジリミシン、ノビオース、オレアンドロース、パノース、パラトース、プランテオース、プリメベロース、ラフィノース、ロジノース、ルチノース、サルメントース、セドヘプツロース、セドヘプツロサン、ソラトリオース、ソホロース、スタキオース、ストレプトース、スクロース、α，α－トレハロース、トラハロサミン、ツラノース、チベロース、キシロビオース、ウンベリフェロース等が挙げられる。
　糖類における各単糖は、Ｄ体またはＬ体であってもよく、Ｄ体とＬ体の任意割合による混合物であってもよい。
　糖類は、デオキシ糖（アルコールヒドロキシ基を水素原子に置換したもの）、アミノ糖（アルコールヒドロキシ基をアミノ基に置換したもの）、チオ糖（アルコールヒドロキシ基をチオールに置換したもの、またはＣ＝ＯをＣ＝Ｓに置換したもの、または環酸素を硫黄に置換したもの）、セレノ糖、テルロ糖、アザ糖（環炭素を窒素に置換したもの）、イミノ糖（環酸素を窒素に置換したもの）、ホスファノ糖（環酸素をリンに置換したもの）、ホスファ糖（環炭素をリンに置換したもの）、Ｃ－置換単糖（非末端炭素原子における水素原子を炭素原子で置換したもの）、不飽和単糖、アルジトール（カルボニル基をＣＨＯＨ基で置換したもの）、アルドン酸（アルデヒド基をカルボキシ基に置換したもの）、ケトアルドン酸、ウロン酸、アルダル酸等を含んでいてもよい。
　アミノ糖としては、糖類におけるアミノ単糖として、ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミン、フコサミン、キノボサミン、ノイラミン酸、ムラミン酸、ラクトースジアミン、アコサミン、バシロサミン、ダウノサミン、デソサミン、フォロサミン、ガロサミン、カノサミン、カンソサミン（ｋａｎｓｏｓａｍｉｎｅ）、ミカミノース、ミコサミン、ペロサミン、プノイモサミン、プルプロサミン（ｐｕｒｐｕｒｏｓａｍｉｎｅ）、ロドサミン等が挙げられる。また、アミノ糖のアミノ基は、アセチル基等で置換されていてもよい。
　シアル酸含有糖鎖としては、ＮｅｕＡｃを糖鎖非還元末端に含有する糖鎖が挙げられ、ＮｅｕＡｃ－Ｇａｌ－ＧｌｃＮＡｃを含有する糖鎖や、Ｎｅｕ５Ａｃα（２－６）Ｇａｌβ（１－３）ＧｌｃＮＡｃ等が挙げられる。
　糖類における各単糖は、標的細胞に発現している受容体に結合可能であることを限度として、置換基で置換されていてもよく、例えば、水酸基が置換されていてもよく、各単糖における水素原子がアジドおよび／または置換されていてもよいアリール基で１～複数置換されていてもよい。
　糖リガンドとしては、標的とする各臓器に対応して標的細胞の表面に発現する受容体に結合する糖リガンドを選択することが好ましく、例えば、標的細胞が肝細胞である場合、肝細胞表面に発現する受容体に対する糖リガンドが好ましく、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に対する糖リガンドがより好ましい。
　ＡＳＧＰＲに対する糖リガンドとしては、マンノースまたはＮ－アセチルガラクトサミンが好ましく、Ｎ－アセチルガラクトサミンがより好ましい。
　ＡＳＧＰＲに対してより親和性の高い糖リガンドとして、例えばＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１７，７２５４　（２００９）、およびＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，　１３４，　１９７８　（２０１２）等に記載の糖誘導体が知られており、これらを用いてもよい。
　本発明において、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、リンカーである。
　Ｓ１とＳ２は、糖リガンドであるＬ１とＬ２と、ベンゼン環とを連結する構造であれば特に限定されるものではなく、核酸複合体において用いられる公知の構造を採用してもよい。Ｓ１とＳ２は、同一であってもよく、異なっていてもよい。
　糖リガンドであるＬ１とＬ２は、Ｓ１およびＳ２とグリコシド結合により連結していることが好ましく、Ｓ１およびＳ２は、ベンゼン環と、例えば、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－結合によりそれぞれ連結していてもよい。
　Ｓ３は、二本鎖核酸であるＸと、ベンゼン環とを連結する構造であれば特に限定されるものではなく、核酸複合体において用いられる公知の構造を採用してよい。
　オリゴヌクレオチドであるＸは、Ｓ３とホスホジエステル結合により連結していることが好ましく、Ｓ３は、ベンゼン環と、例えば、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－結合により連結していてもよい。
　Ｓ１、Ｓ２およびＳ３のリンカーとしては、例えば、国際公開第２００９／０７３８０９号、国際公開第２０１３／０７５０３５号、国際公開第２０１５／１０５０８３号、国際公開第２０１４／１７９６２０号、国際公開第２０１５／００６７４０号に開示される構造を採用してもよい。
　本発明において、核酸複合体は、下記式２で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
　式２中、
　Ｘ、Ｌ１、Ｌ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義であり、
　Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５およびＰ６、ならびにＴ１およびＴ２は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎは０～９９の整数である。
　Ｐ１およびＰ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であるが、－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－または－ＣＯ－ＮＨ－であることが好ましく、－Ｏ－、－ＮＨ－ＣＯ－または－ＣＯ－ＮＨ－であることがより好ましく、－ＮＨ－ＣＯ－であることがさらに好ましい。
　Ｐ１またはＰ４が、例えば、－ＮＨ－ＣＯ－である場合、－ＮＨ－ＣＯ－ベンゼン環という部分構造を有する。
　Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎは０～９９の整数であるが、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンであることが好ましく、無置換の炭素数１～１２のアルキレンであることがより好ましく、無置換の炭素数１～６のアルキレンであることがさらに好ましく、無置換の炭素数１～４のアルキレンであることがよりさらに好ましい。
　Ｐ２およびＰ５は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であるが、存在しないか、－ＣＯ－Ｏ－または－ＣＯ－ＮＨ－であることが好ましく、存在しないか、－ＣＯ－ＮＨ－であることがより好ましい。Ｐ２およびＰ５が、例えば、－ＣＯ－ＮＨ－である場合、Ｂ１－ＣＯ－ＮＨ－Ｑ１およびＢ２－ＣＯ－ＮＨ－Ｑ３という部分構造を有する。
　－［Ｐ２－Ｑ１］ｑ１－および－［Ｐ５－Ｑ３］ｑ３－がそれぞれ独立して、存在しないか、または下記式３－１～式３－３で表されるいずれかの構造であることが好適である。
式３－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
 式３－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
 式３－３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
　式３－１～３－３中、
　ｍ５およびｍ６は、それぞれ独立して、０～１０の整数であり、式３－１～式３－３の構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｂ１またはＢ２あるいはＰ１またはＰ４との結合点である。
　Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｐ２またはＰ３あるいはＰ５またはＰ６との結合点であり、ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４は、それぞれ独立して、０～１０の整数である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
　Ｂ１およびＢ２は、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、イミノ二酢酸等の非天然アミノ酸を含むアミノ酸、または2-アミノ-1，3－プロパンジオール等のアミノアルコールに由来する基であることが好ましく、Ｂ１およびＢ２がグルタミン酸およびアスパラギン酸に由来する基である場合、グルタミン酸およびアスパラギン酸のアミノ基がそれぞれ結合して、Ｐ２およびＰ５として、－ＮＨ－ＣＯ－結合であることが好ましく、Ｂ１およびＢ２がリジンに由来する基である場合、リジンのカルボキシル基がそれぞれ結合して、Ｐ２およびＰ５として、－ＣＯ－ＮＨ－結合であることが好ましく、Ｂ１およびＢ２がイミノ二酢酸に由来する基である場合、イミノ二酢酸のアミノ基がそれぞれ結合して、Ｐ２およびＰ５として、－ＣＯ－結合となることが好ましい。Ｂ１およびＢ２は、具体的には、以下の構造を持つことが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
　ｐ１およびｐ２がそれぞれ２または３の整数であるとき、それぞれのＰ３およびＰ６、Ｑ２およびＱ４、Ｔ１およびＴ２ならびにＬ１およびＬ２は、同一または異なっていてもよい。
　ｑ１～ｑ４が２～１０のとき、それぞれの－［Ｐ２－Ｑ１］－，－［Ｑ２－Ｐ３］－，－［Ｐ５－Ｑ３］－，－［Ｑ４－Ｐ６］－の組み合わせは同一または異なっていてもよい。それぞれの－［Ｐ２－Ｑ１］－，－［Ｑ２－Ｐ３］－，－［Ｐ５－Ｑ３］－，および－［Ｑ４－Ｐ６］－の組み合わせが同一または異なるとは、－［Ｐ２－Ｑ１］－，－［Ｑ２－Ｐ３］－，－［Ｐ５－Ｑ３］－，および－［Ｑ４－Ｐ６］－で示される各２～１０の単位が、同一である場合と異なる場合があることを意味する。
　本発明において、核酸複合体は、下記式４－１～４－９で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式４－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
 式４－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
 式４－３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
 式４－４：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
 式４－５：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000086
 式４－６：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
 式４－７：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
 式４－８：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
 式４－９：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
　式４－１～４－９中、
　Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ３、Ｐ３、Ｐ６、Ｔ１、Ｔ２、Ｑ２、Ｑ４、ｑ２およびｑ４はそれぞれ前記と同義である。
　Ｐ３およびＰ６は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であるが、－Ｏ－ＣＯ－または－ＮＨ－ＣＯ－であることが好ましく、－ＮＨ－ＣＯ－であることがより好ましい。Ｐ３およびＰ６が、例えば、－ＮＨ－ＣＯ－である場合、それぞれ、Ｂ１－ＮＨ－ＣＯ－Ｑ２およびＢ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｑ４という部分構造を有する。
　Ｔ１およびＴ２は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であるが、－Ｏ－または－Ｓ－であることが好ましく、－Ｏ－であることがより好ましい。
　本発明において、核酸複合体は、下記式５で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
　式５では、式２におけるＰ１とＰ４、Ｐ２とＰ５、Ｐ３とＰ６、Ｑ１とＱ３、Ｑ２とＱ４、Ｂ１とＢ２、Ｔ１とＴ２、Ｌ１とＬ２、ｐ１とｐ２、ｑ１とｑ３ならびにｑ２とｑ４がそれぞれ同一である。
式５：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000091
　式５中、
　Ｘ、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｑ１、Ｑ２、Ｂ１、Ｔ１、Ｌ１、p１、q１およびｑ２はそれぞれ前記と同義である。
　また、式５におけるＸ、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｑ１、Ｑ２、Ｂ１、Ｔ１、Ｌ１、p１、q１およびｑ２は、各々、上述した好適な基であって良いが、Ｐ１が－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－または－Ｏ－であることが好ましい。
　式５における－（Ｐ２－Ｑ１）ｑ１－は、存在しないか、または上記式３－１～式３－３で表されるいずれかの構造であることが好適である。
　本発明において、核酸複合体は、下記式６－１～６－９で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式６－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000092
 式６－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000093
 式６－３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000094
 式６－４：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000095
 式６－５：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000096
 式６－６：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000097
 式６－７：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000098
 式６－８：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000099
 式６－９：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000100
　式６－１～式６－９中、
　Ｘ、Ｓ３、Ｐ３、Ｑ２、Ｔ1、およびＬ１は、それぞれ前記と同義である。
　本発明において、核酸複合体は、下記式７－１～式７－９のいずれかで表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式７－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000101
 式７－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000102
 式７－３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000103
 式７－４：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000104
 式７－５：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000105
 式７－６：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000106
 式７－７：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000107
  
式７－８：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000108
 式７－９：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000109
　式７－１～式７－９中、
　Ｘ、Ｌ１、Ｌ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義である。Ｌ１とＬ２は同一であってもよく、異なっていてもよく、同一であることが好適である。
　式７－１～式７－９において、各アルキレン基部分を鎖長の異なるアルキレン鎖を導入することにより、また、アミド結合等を他の結合に置換することにより、式７－１～式７－９で表される構造を有する核酸複合体以外の核酸誘導体を製造することもできる。
　本発明において、核酸複合体は、下記式１１で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式１１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000110
　式１１中、
　Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１およびＳ２は、それぞれ前記と同義であり、
　Ｐ７およびＰ８は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ５、Ｑ６およびＱ７は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ８－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ８は０～９９の整数であり、
　Ｂ３は、本明細書中ではブランチャーユニットと呼ばれ、下記式１１－１で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ５およびＱ６との結合手を意味し、
式１１－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000111
　式１１－１中、トリアゾール環を有する基における置換は、該トリアゾール環の1位および3位の窒素原子のいずれかである。
　ｑ５およびｑ６は、それぞれ独立して、０～１０の整数である。
　Ｐ７は、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であるが、－Ｏ－、－ＮＨ－ＣＯ－または-ＣＯ－ＮＨ－であることが好ましく、－Ｏ－または－ＮＨ－ＣＯ－であることがより好ましい。。Ｐ７が、例えば、－Ｏ－である場合、ベンゼン環－Ｏ－という部分構造を有する。
　Ｐ８は、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であるが、存在する場合、－ＣＯ－Ｏ－または－ＣＯ－ＮＨ－であることが好ましく、－ＣＯ－ＮＨ－であることがより好ましい。Ｐ８が、例えば、－ＣＯ－ＮＨ－である場合、Ｑ６－ＣＯ－ＮＨ－という部分構造を有する。
　Ｑ５、Ｑ６およびＱ７は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ８－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ８は０～９９の整数であるが、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンであることが好ましく、無置換の炭素数１～１２のアルキレンであることがより好ましく、無置換の炭素数１～６のアルキレンであることがさらに好ましく、無置換の炭素数１～４のアルキレンであることがよりさらに好ましい。
　－（Ｐ７－Ｑ５）ｑ５－は、－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ１５－ＮＨ－および－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ１６－ＮＨであり、ｍ１５およびｍ１６は、それぞれ独立して、１～１０の整数であることが好適である。
　本発明において、核酸複合体は、下記式１２－１～式１２－１２のいずれかで表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式１２－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000112
 式１２－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000113
 式１２－３：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000114
 式１２－４：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000115
 式１２－５：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000116
 式１２－６：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000117
 式１２－７：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000118
 式１２－８：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000119
 式１２－９：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000120
 式１２－１０：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000121
 式１２－１１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000122
 式１２－１２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000123
　式１２－１～１２－１２中、
　Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１およびＳ２は、それぞれ前記と同義であり、ｎ１’～ｎ１２’はそれぞれ独立して、１～１０の整数である。
　本発明の核酸複合体は、式１で表される核酸複合体において、Ｓ１およびＳ２に対応する式２に記載の構造と、Ｓ３に対応する式１１に記載の構造とを組み合わせた核酸複合体であることが好ましい。式２が、式４－１～式４－９であってもよく、式６－１～式６－９であってもよく、式７－１～式７－９であってもよく、式２が、式４－１～式４－９、式６－１～式６－９、あるいは式７－１～式７－９である場合に、式１１が、式１２－１～式１２－１２であってもよい。本発明の核酸複合体は、式１で表される核酸複合体において、Ｓ１およびＳ２に対応する式４－１～式４－９に記載のいずれか１つの構造、およびＳ３に対応する式１２－１～式１２－１２に記載のいずれか１つの構造とを組み合わせた核酸複合体、Ｓ１およびＳ２に対応する式６－１～式６－９に記載のいずれか１つの構造および、Ｓ３に対応する式１２－１～式１２－１２に記載のいずれか１つの構造とを組み合わせた核酸複合体、Ｓ１およびＳ２に対応する式７－１～式７－９に記載のいずれか１つの構造および、Ｓ３に対応する式１２－１～式１２－１２に記載のいずれか１つの構造を組み合わせた核酸複合体であることがより好適である。
　式1におけるＸは、センス鎖およびアンチセンス鎖からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸であり、該二本鎖核酸は、該アンチセンス鎖中の、17個～30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、表1-1～表1-3に記載された標的CFBmRNA配列のいずれかと相補的である。センス鎖の3’末端または5’末端がＳ３に結合するため、式1において、Ｓ３と結合するＸは、二本鎖核酸を構成するセンス鎖であり、後述する表1-1～表1-3または表M1-1～表M1-3中のセンス鎖配列であらわされるセンス鎖である。
　本発明において、CFB mRNAに対して相補的な塩基配列を含む核酸をアンチセンス鎖核酸と称し、アンチセンス鎖核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をセンス鎖核酸とも称する。
　本発明で用いられる核酸複合体を構成する二本鎖核酸は、哺乳動物細胞に導入された場合、CFB遺伝子の発現を低下または停止させる能力を有する二本鎖核酸であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸である。また、該センス鎖と該アンチセンス鎖とは少なくとも11個の塩基対を有し、該アンチセンス鎖中の、少なくとも17個のヌクレオチドかつ多くとも30個の、すなわち、17個～30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖が、表1-1～表1-3に記載された群から選択される標的CFB mRNA配列と相補的である。
　本発明で用いられる核酸複合体を構成する二本鎖核酸としては、ヌクレオチドまたは該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなる分子であってもよく、例えばリボヌクレオチドの重合体であるRNA、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるDNA、RNAとDNAとからなるキメラ核酸、およびこれらの核酸の少なくとも一つのヌクレオチドが該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子で置換されたヌクレオチド重合体が挙げられる。また、これらの核酸内にヌクレオチドと同等の機能を有する分子を少なくとも一つ含む誘導体も、本発明で用いられる薬物としての二本鎖核酸に含まれる。またウラシル（U）は、チミン（T）に一義的に読み替えることができる。
　ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えばヌクレオチド誘導体等が挙げられる。ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドに修飾を施した分子であればいかなる分子であってもよいが、例えばRNAまたはDNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上もしくは安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、細胞透過性を上げるため、または可視化させるために、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
　ヌクレオチドに修飾を施した分子としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド、ならびに糖部、リン酸ジエステル結合および塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド等が挙げられる。
　糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2’-修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
　2’-修飾ヌクレオチドとしては、例えばリボースの2’-OH基がH、OR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、BrおよびIからなる群(Rはアルキルまたはアリール、好ましくは炭素数1～6のアルキルであり、R’はアルキレン、好ましくは炭素数1～6のアルキレンである)から選択される置換基で置換されたヌクレオチドであり、より好ましくは2’-OH基がH、Fまたはメトキシ基で置換されたヌクレオチドであり、さらに好ましくは2’-OH基がFまたはメトキシ基で置換されたヌクレオチドである。また、2’-OH基が2-(methoxy)ethoxy基、3-aminopropoxy基、2-[(N,N-dimethylamino)oxy]ethoxy基、3-(N,N-dimethylamino)propoxy基、2-[2-(N,N-dimethylamino)ethoxy]ethoxy基、2-(methylamino)-2-oxoethoxy基、2-(N-methylcarbamoyl)etoxy 基および2-cyanoetoxy 基からなる群から選択される置換基で置換されたヌクレオチド等も挙げられる。
　二本鎖核酸領域内のヌクレオチドに対して、2’-修飾ヌクレオチドは、50～100％含まれることが好ましく、70～100％含まれることがより好ましく、90～100％含まれることがさらに好ましい。また、センス鎖のヌクレオチドに対して、2’-修飾ヌクレオチドは、20～100％含まれることが好ましく、40～100％含まれることがより好ましく、60％～100％含まれることがさらに好ましい。また、アンチセンス鎖のヌクレオチドに対して、2’-修飾ヌクレオチド修飾ヌクレオチドは、20～100％含まれることが好ましく、40～100％含まれることがより好ましく、60％～100％含まれることがさらに好ましい。
　リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等が挙げられる。
　塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数1～6のアルキル基、ハロゲン等で置換されたもの、メチル基が水素、ヒドロキシメチル、炭素数2～6のアルキル基等で置換されたもの、アミノ基が炭素数1～6のアルキル基、炭素数1～6のアルカノイル基、オキソ基、ヒドロキシ基等に置換されたものが挙げられる。
　ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドまたは糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に、ペプチド、蛋白質、糖、脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素等、別の化学物質を、直接またはリンカーを介して付加したものも挙げられ、具体的には、5’-ポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、Cy5付加ヌクレオチド誘導体、Cy3付加ヌクレオチド誘導体、6-FAM付加ヌクレオチド誘導体、およびビオチン付加ヌクレオチド誘導体等が挙げられる。
　ヌクレオチド誘導体は、核酸内の他のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造、およびこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。
　本明細書において「相補」とは、2つの塩基間で塩基対合をし得る関係を意味し、例えば、アデニンとチミンまたはウラシルとの関係、並びにグアニンとシトシンとの関係のように緩やかな水素結合を介して、二重鎖領域全体として2重螺旋構造をとるものをいう。
　本明細書において「相補的」とは、2つのヌクレオチド配列が完全に相補する場合だけでなく、該ヌクレオチド配列間で0～30％、0～20％または0～10％のミスマッチ塩基を有することができ、例えば、CFB mRNAに対して相補的なアンチセンス鎖は、該mRNAの部分塩基配列と完全に相補する塩基配列において、1つまたは複数の塩基の置換を含んでよいことを意味する。具体的には、アンチセンス鎖は、標的遺伝子の標的配列に対して1～8個、好ましくは1～6個、1～4個、1～3個、特に2個または1個のミスマッチ塩基を有していてもよい。例えば、アンチセンス鎖が21塩基長の場合には、標的遺伝子の標的配列に対して6個、5個、4個、3個、2個または1個のミスマッチ塩基を有してもよく、そのミスマッチの位置は、それぞれの配列の5’末端または3’末端であってもよい。
　また、「相補的」とは、一方のヌクレオチド配列が、他方のヌクレオチド配列と完全に相補する塩基配列において、１つまたは複数の塩基が付加および／または欠失した配列である場合を包含する。例えば、CFB mRNAと本発明のアンチセンス鎖核酸とは、アンチセンス鎖における塩基の付加および／または欠失により、アンチセンス鎖および／または標的CFB mRNA領域に1個または2個のバルジ塩基を有してもよい。
　本発明で用いられる薬物としての二本鎖核酸は、CFB mRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸および／または該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸であれば、いずれのヌクレオチドまたはその誘導体から構成されていてもよい。本発明の二本鎖核酸は、標的CFB mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とが、少なくとも11個の塩基対の二重鎖を形成することができればいずれの長さでもよいが、二重鎖を形成できる配列の長さは、通常11～27塩基であり、15～25塩基が好ましく、15～23塩基がより好ましく、17～21塩基がさらに好ましい。
　本発明の核酸複合体のアンチセンス鎖としては、標的CFB mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸が用いられるが、該核酸のうち1～3塩基、好ましくは1～2塩基、より好ましくは1塩基が欠失、置換または付加したものを用いてもよい。
　CFBの発現を抑制する核酸としては、標的CFB mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸であって、かつCFBの発現を抑制する一本鎖核酸、もしくは標的CFB mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなり、かつCFBの発現を抑制する二本鎖核酸が好適に用いられる。
　二本鎖核酸を構成する一本鎖のアンチセンス鎖核酸およびセンス鎖核酸は、それぞれ同一または異なって、通常11～30塩基からなるが、それぞれ同一または異なって17～27塩基からなることが好ましく、17～25塩基からなることがより好ましく、19～25塩基からなることがさらに好ましく、21～23塩基からなることがよりさらに好ましい。
　本発明で用いられる薬物としての二本鎖核酸において、二重鎖領域に続く3’側または5’側に二重鎖を形成しない追加のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を有する場合には、これを突出部(オーバーハング)と呼ぶ。突出部を有する場合には、突出部を構成するヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはこれらの誘導体であってもよい。
　突出部を有する二本鎖核酸としては、少なくとも一方の鎖の3’末端または5’末端に1～6塩基、通常は1～3塩基からなる突出部を有するものが用いられるが、2塩基からなる突出部を有するものが好ましく用いられ、例えば、dTdT(dTはデオキシチミジンを表す)またはUU(Uはウリジンを表す)からなる突出部を有するものが挙げられる。突出部は、アンチセンス鎖のみ、センス鎖のみ、およびアンチセンス鎖とセンス鎖の両方に有することができるが、本発明において、アンチセンス鎖に突出部を有する二本鎖核酸が好ましく用いられる。なお、アンチセンス鎖は、二重鎖領域とそれに続く突出部とを含む、17個～30個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド鎖において、表1-1～表1-3に記載された標的CFB mRNA配列のいずれかと十分に相補的である。さらに、本発明の二本鎖核酸としては、例えばDicer等のリボヌクレアーゼの作用により二本鎖核酸を生成する核酸分子(WO2005/089287)や、3’末端や5’末端の突出部を有さず平滑末端を形成する二本鎖核酸、センス鎖のみが突出した二本鎖核酸（US2012/0040459）等を用いることもできる。
　本発明で用いられる核酸複合体を構成する二本鎖核酸としては、標的遺伝子の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列と同一の配列からなる核酸を用いてもよいが、該核酸の少なくとも一方の鎖の5’末端または3’末端が1～4塩基削除された核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなる二本鎖核酸を用いてもよい。
　本発明で用いられる核酸複合体を構成する二本鎖核酸は、RNA同士が二重鎖を形成した二本鎖RNA（dsRNA）、DNA同士が二重鎖を形成した二本鎖DNA（dsDNA）、またはRNAとDNAが二重鎖を形成したハイブリッド核酸であってもよい。あるいは、二本鎖のうちの一方もしくは両方の鎖がDNAとRNAとのキメラ核酸であってもよい。好ましくは二本鎖RNA（dsRNA）である。
　本発明の核酸複合体のアンチセンス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドは、標的CFB mRNA配列の3’末端から2番目のデオキシリボヌクレオチドと相補であることが好ましく、アンチセンス鎖の5’末端から2～7番目のヌクレオチドが、標的CFB mRNA配列の3’末端から2～7番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがより好ましく、アンチセンス鎖の5’末端から2～11番目のヌクレオチドが、標的CFB mRNA配列の3’末端から2～11番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがさらに好ましい。また、本発明の核酸におけるアンチセンス鎖の5’末端から11番目のヌクレオチドが、標的CFB mRNA配列の3’末端から11番目のデオキシリボヌクレオチドと相補であることが好ましく、アンチセンス鎖の5’末端から9～13番目のヌクレオチドが、標的CFB mRNA配列の3’末端から9～13番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがより好ましく、アンチセンス鎖の5’末端から7～15番目のヌクレオチドが、標的CFB mRNA配列の3’末端から7～15番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがさらに好ましい。
　本発明の核酸複合体のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、例えば、Genbank Accession No.NM_000042として登録されているヒトCFBの完全長mRNAのcDNA（センス鎖）の塩基配列（配列番号3541)に基づいて設計することができる。
　二本鎖核酸は、CFB遺伝子配列内の標的配列と相互作用するように設計することができる。
　二本鎖核酸の1つの鎖の配列は、上記した標的部位配列に対して相補的である。二本鎖核酸は、本明細書に記述された方法を使用して、化学的に合成することができる。
　RNAは、酵素的または部分/全有機合成によって生成してもよく、また修飾されたリボヌクレオチドは、インビトロで酵素的または有機合成によって導入することができる。一つの態様において、それぞれの鎖は、化学的に調製される。RNA分子を化学的に合成する方法は、当該技術分野において公知である[ヌクレイックアシッズリサーチ（Nucleic Acids Research）、1998年、第32巻、p.936-948参照]。一般に、二本鎖核酸は、固相オリゴヌクレオチド合成法を使用することによって合成することができる(たとえば、Usman et al.,米国特許第5,804,683号明細書;米国特許第5,831,071号明細書;米国特許第5,998,203号明細書;米国特許第6,117,657号明細書;米国特許第6,353,098号明細書;米国特許第6,362,323号明細書;米国特許第6,437,117号明細書;米国特許第6,469,158号明細書;Scaringe et al.,米国特許第6,111,086号明細書;米国特許第6,008,400号明細書;米国特許第6,111,086号明細書を参照)。
　一本鎖核酸は、固相ホスホロアミダイト法（ヌクレイックアシッズリサーチ（Nucleic Acids Research)、1993年、第30巻、p.2435-2443参照)を使用して合成され、脱保護され、およびNAP-5カラム(Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ)上で脱塩される。オリゴマーは、15分工程のリニア勾配を使用するAmersham Source 15Qカラム-1.0cm。高さ.25 cm (Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ)でのイオン交換高性能液体クロマトグラフィー(IE-HPLC)を使用して精製する。勾配は、90:10の緩衝液A:Bから52:48の緩衝液A:Bに変化し、緩衝液Aは100mmol/L Tris pH 8.5であり、および緩衝液Bは、100mmol/L Tris pH 8.5(1mol/LのNaCl)である。試料は、260nmにてモニターされ、全長オリゴヌクレオチド種に対応するピークは、収集され、プールされ、NAP-5カラムで脱塩され、および凍結乾燥される。
　各一本鎖核酸の純度は、Beckman PACE 5000(Beckman Coulter、Inc., Fullerton, Calif)でのキャピラリー電気泳動(CE)によって決定される。CEキャピラリーは、100μmの内径を有し、ssDNA 100R Gel(Beckman-Coulter)を含む。典型的には、約0.6nmoleのオリゴヌクレオチドをキャピラリーに注射して、444V/cmの電界において実行して、260nmにおけるUV吸光度によって検出される。変性トリス-ホウ酸-7mol/L-尿素泳動緩衝液は、Beckman-Coulterから購入する。以下に記述した実験に使用するための、CEによって評価すると少なくとも90%純粋である一本鎖核酸が得られる。化合物同一性は、製造業者の推奨プロトコルにしたがって、Voyager DE.TM.Biospectometryワークステーション(Applied Biosystems、Foster City,、Calif.)でのマトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型(MALDI-TOF)質量分光法によって検証される。一本鎖核酸の相対的な分子質量は、予想される分子質量の0.2%以内で得ることができる。
　一本鎖核酸は、100mmol/L 酢酸カリウム、30mmol/L HEPES、pH 7.5からなる緩衝液中に100μmol/L濃度にて再懸濁させる。相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を同等のモル量で混合して、50μmol/L二本鎖核酸の最終溶液を得る。試料を95℃まで5分間加熱して、使用前に室温に冷却させる。二本鎖核酸は、-20℃にて保存する。一本鎖核酸は、凍結乾燥させるか、またはヌクレアーゼフリー水中に、-80℃で貯蔵する。
　本発明におけるセンス鎖およびアンチセンス鎖からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含み、該アンチセンス鎖中の、11個～30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、表1-1～表1-3に記載された群から選択される標的CFB mRNA配列と相補的な二本鎖核酸として、表1-1～表1-3に記載されたアンチセンス鎖からなる群から選択される配列を含む二本鎖核酸か、表M1-1～表M1-3、ならびに後述する表1-1～表1-3に記載されたセンス鎖からなる群から選択される配列を含む二本鎖核酸か、あるいは表M1-1～表M1-3、ならびに後述する表1-1～表1-3に記載のセンス鎖／アンチセンス鎖からなる群から選択される１対のセンス鎖／アンチセンス鎖の配列を含む二本鎖核酸を用いてよい。すなわち、本発明で用いられる核酸複合体を構成する二本鎖核酸の具体例は、表M1-1～表M1-3、ならびに後述する表1-1～表1-3中のセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる二本鎖核酸である。なお、表M1-1～表M1-3中、N(M)は2’-O-メチル修飾RNA、N(F)は2’-フッ素修飾RNA、および＾はホスホロチオエートを示す。また、表1-1～表1-3、および表M1-1～表M1-3に記載のアンチセンス鎖配列の5’末端ヌクレオチドは、5’末端においてリン酸化されていてもよく、リン酸化されていなくてもよいが、リン酸化されていることが好ましい。
　後述する表1-1～表1-3に記載のセンス鎖／アンチセンス鎖の配列を含む二本鎖核酸は、0.1nM添加時のノックダウン活性の測定において、CFBの相対的発現量が0.40以下であるものが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000124
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000125
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000126
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000127
　本発明の核酸複合体の製造法について説明する。なお、以下に示す製造法において、定義した基が該製造法の条件下で変化するかまたは該製造法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で常用される保護基の導入および除去方法［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第３版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ　Ｉｎｃ．（１９９９年）等に記載の方法］等を用いることにより、目的化合物を製造することができる。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
　式１で表される核酸重合体は、固相合成によっても合成することができる。
　式１で表される核酸重合体は、核酸複合体として公知のリンカー構造の合成方法を参考にして合成することができる。
　式１で表される核酸複合体における、Ｓ１をリンカーとしたＬ１－ベンゼン環ユニットやＳ２をリンカーとしたＬ２－ベンゼン環ユニットの合成は、例えば、式２で表される核酸複合体を例として説明する。
　式２で表される核酸複合体におけるＬ１－ベンゼン環ユニットやＬ２－ベンゼン環ユニットは、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、およびＰ６ならびにＴ１およびＴ２により連結している。
　Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、およびＰ６ならびにＴ１およびＴ２の－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－または－ＣＯ－ＮＨ－結合は、例えば、第４版実験化学講座１９「有機化合物の合成Ｉ」丸善（１９９２年）、第４版実験化学講座２０「有機化合物の合成ＩＩ」、丸善（１９９２年））等に記載の結合反応の方法を参考にして、式２で表される構造を形成するのに適切な原料を選択することにより適宜合成することができる。
　また、ベンゼン環から順次、Ｑ１を部分構造として有する化合物、Ｂ１を部分構造として有する化合物を結合させることで、Ｌ１－ベンゼン環ユニットの部分構造を製造することができる。
　Ｌ１とＱ２を部分構造として有する化合物を別途合成し、Ｌ１とＱ２を部分構造として有する化合物をベンゼン環、Ｑ１およびＢ１を部分構造として有するＬ１－ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物と結合させることにより、Ｌ１－ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
　Ｌ２－ベンゼン環ユニットについても同様に、ベンゼン環から順次、Ｑ３を部分構造として有する化合物、Ｂ２を部分構造として有する化合物を結合させることで、Ｌ２－ベンゼン環ユニットの部分構造を製造することができる。
　Ｌ２とＱ４を部分構造として有する化合物を別途合成し、Ｌ２とＱ４を部分構造として有する化合物をベンゼン環、Ｑ３およびＢ２を部分構造として有するＬ２－ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物と結合させることにより、Ｌ２－ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
　Ｑ１を部分構造として有する化合物、Ｑ３を部分構造として有する化合物としては、炭素数１～１０のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＨ２－の両末端に、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基を有する化合物が挙げられる。
　Ｂ１を部分構造として有する化合物、Ｂ２を部分構造として有する化合物としては、下記式２－１で表されるいずれかの構造を有し、各構造における末端の黒丸点において、それぞれ、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、またはチオール基を有する化合物が挙げられる。
式２－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000128
　Ｂ１を部分構造として有する化合物、Ｂ２を部分構造として有する化合物の具体例としては、グリコール、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、Ｔｒｉｓ、イミノ二酢酸、２－アミノ－１，３－プロパンジオール等が挙げられ、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、イミノ二酢酸が好ましい。具体的には、Ｂ１およびＢ２は以下の構造が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000129
　Ｌ１、Ｑ２およびＢ１を部分構造として有する化合物を合成してから、Ｑ１とベンゼン環を有する化合物と結合することにより、Ｌ１－ベンゼン環ユニット構造を製造してもよい。
　Ｌ２、Ｑ４およびＢ２を部分構造として有する化合物を合成してから、Ｑ３とベンゼン環を有する化合物と結合することにより、Ｌ２－ベンゼン環ユニット構造を製造してもよい。
　本発明においては、［Ｌ１－Ｔ１－（Ｑ２－Ｐ３）ｑ２－］ｐ１－Ｂ１－（Ｐ２－Ｑ１）ｑ１－Ｐ１－である部分構造と、［Ｌ２－Ｔ２－（Ｑ３－Ｐ６）ｑ４－］ｐ２－Ｂ２－（Ｐ５－Ｑ３）ｑ３－Ｐ２－である部分構造とは同一または異なっていても良いが、同一であることが好ましい。
　糖リガンドのＬ１－Ｔ１－Ｑ２に相当するユニットとして、例えば、Ｌ３－Ｔ１－Ｑ２－ＣＯＯＨ、Ｌ３－Ｔ１－（Ｑ２－Ｐ３）ｑ２－１－Ｑ２－ＮＨ２等が挙げられる。具体的には、Ｌ３－Ｏ―炭素数１～１２のアルキレン―ＣＯＯＨや、Ｌ３－炭素数１～１２のアルキレン－ＣＯ－ＮＨ－炭素数２～１２のアルキレン－ＮＨ２等が挙げられる。
　Ｌ３は、脱保護することにより、Ｌ１となる糖リガンド誘導体であれば特に限定されない。糖リガンドの置換基としては、糖質化学の分野で汎用される置換基であれば特に限定されないが、Ａｃ基が好ましい。
　Ｓ１をリンカーとしたＬ１－ベンゼン環ユニットやＳ２をリンカーとしたＬ２－ベンゼン環ユニットの合成は、具体的には実施例に記載の方法を参考にして、アルキレン鎖の炭素数を適宜増減し、また、末端アミノ基や末端カルボキシル基を、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－または－ＣＯ－ＮＨ－結合を形成し得る基に変換した化合物を用いることにより、合成することができる。また、Ｌ１の糖リガンドについても、実施例においては、マンノースまたはＮ－アセチルガラクトサミンを例示しているが、他の糖リガンドに変更して実施することができる。
　式１で表される核酸複合体における、Ｓ３をリンカーとしたＸ－ベンゼン環ユニットの合成は、例えば、式１２で表される核酸複合体を例として説明する。
　式１２で表される核酸複合体におけるＸ－ベンゼン環ユニットは、オリゴヌクレオチドの結合以外に、Ｐ７およびＰ８により表される結合を有する。
　Ｐ７およびＰ８の－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－または－ＣＯ－ＮＨ－結合は、例えば、第４版実験化学講座１９「有機化合物の合成Ｉ」丸善（１９９２年）、第４版実験化学講座２０「有機化合物の合成ＩＩ」、丸善（１９９２年））に記載の結合反応の方法を参考にして、式１２で表される構造を形成するのに適切な原料を選択することにより適宜合成することができる。
　また、ベンゼン環から順次、Ｑ５を部分構造として有する化合物、Ｂ３を部分構造として有する化合物を結合させることで、Ｘ－ベンゼン環ユニットの部分構造を製造することができる。
　ＸとＱ７を部分構造として有する化合物や、ＸとＱ６を部分構造として有する化合物を別途合成し、ＸとＱ７を部分構造として有する化合物やＸとＱ６を部分構造として有する化合物をベンゼン環およびＱ５を部分構造として有するＸ－ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物と結合させて、Ｂ３部分を構築することにより、Ｘ－ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
　具体的には、ベンゼン環およびＱ５を部分構造として有するＸ－ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物の末端にアジド基を有する場合を例にとると、実施例に開示するような末端結合性官能基化したオリゴヌクレオチドを反応させることにより、環化付加させて、トリアゾール環を形成させて、Ｂ３部分を構築することにより、Ｘ－ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
　Ｑ５を部分構造として有する化合物、Ｑ６を部分構造として有する化合物、Ｑ７を部分構造として有する化合物としては、炭素数１～１０のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ８－ＣＨ２ＣＨ２－の両末端に、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基を有する化合物が挙げられる。
　Ｌ１－ベンゼン環ユニット構造、Ｌ２－ベンゼン環ユニット構造と、Ｘ－ベンゼン環ユニット構造とは、それぞれ順次製造していくことができるが、Ｌ１－ベンゼン環ユニット構造およびＬ２－ベンゼン環ユニット構造を合成してから、Ｘ－ベンゼン環ユニット構造を結合させることが好ましい。特に、オリゴヌクレオチド部分を有するＸについては、糖リガンド複合体合成の最終工程近くで化合物内に導入することが好ましい。
　本発明においては、下記式８～式１０で表される化合物が合成中間体として得られる。
式８：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000130
（式８中、
　Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ｔ－ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）、－ＣＯ－Ｒ４、または－ＣＯ－Ｂ４－［（Ｐ９－Ｑ８）ｑ７－Ｔ３－Ｌ３］ｐ３であり、
　Ｐ９およびＴ３は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ８は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ１－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ１は０～９９の整数であり、
　Ｂ４は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式８－１で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、カルボニル基またはＰ９との結合点であり、ｍ７、ｍ８、ｍ９およびｍ１０は、それぞれ独立して、０～１０の整数であり、
式８－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000131
　ｐ３は、１、２または３の整数であり、
　ｑ７は、０～１０の整数であり、
　Ｌ３は、糖リガンドであり、
　Ｙは-Ｏ－（ＣＨ２）ｍ１１－ＮＨ－および－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ１２－ＮＨであり、ｍ１１およびｍ１２は、それぞれ独立して、１～１０の整数であり、
　Ｒ３は、水素原子、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、－ＣＯ－Ｒ４、－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ２－ＣＨ２ＣＨ２－Ｎ３、または－ＣＯ－Ｑ９－Ｂ５－（Ｑ１０－Ｐ１０）ｑ８－Ｘ１あり、ｎ２は０～９９の整数であり、
　Ｐ１０は、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ９およびＱ１０は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ３－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ３は０～９９の整数であり、
　Ｂ５は、下記式８－２で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ９およびＱ１０との結合手を意味し、
式８－２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000132
　式８－２中、トリアゾール環を有する基における置換は、該トリアゾール環の1位および3位の窒素原子のいずれかである。
　ｑ８は、０～１０の整数であり、
　Ｘ１は、水素原子または固相担体であり、
　Ｒ４は、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される１または２個の置換基で置換された炭素数２～１０のアルキル基である。）
　本発明においては、下記式９で表される化合物が合成中間体として得られる。
式９：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000133
（式９中、
　Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、－ＣＯ－Ｒ４’、または－ＣＯ－Ｑ１１－（Ｐ１１－Ｑ１１’）ｑ９－Ｔ４－Ｌ４であり、
　Ｐ１１およびＴ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ１１およびＱ１１’は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ４－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ４は０～９９の整数であり、
　ｑ９は、０～１０の整数であり、
　Ｌ４は、糖リガンドであり、
　Ｙ’は-Ｏ－（ＣＨ２）ｍ１１’－ＮＨ－および－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ１２’－ＮＨであり、ｍ１１’およびｍ１２’は、それぞれ独立して、１～１０の整数であり、
　Ｒ３’は、水素原子、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、－ＣＯ－Ｒ４’、－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ２’－ＣＨ２ＣＨ２－Ｎ３、または－ＣＯ－Ｑ９’－Ｂ５’－（Ｑ１０’－Ｐ１０’）ｑ８’－Ｘ１’であり、ｎ２’は０～９９の整数であり、
　Ｐ１０’は、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ９’およびＱ１０’は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ３’－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ３’は０～９９の整数であり、
　Ｂ５’は、下記式９－１で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ９’およびＱ１０’との結合手を意味し、
式９－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000134
　式９－１中、トリアゾール環を有する基における置換は、該トリアゾール環の1位および3位の窒素原子のいずれかである。
ｑ８'は、０～１０の整数であり、
Ｘ１’は、水素原子または固相担体であり、
Ｒ４’は、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される１または２個の置換基で置換された炭素数２～１０のアルキル基である。）
　本発明においては、下記式１０で表される化合物が合成中間体として得られる。
式１０：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000135
　式１０中、
　Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、ヒドロキシ基、ｔ－ブトキシ基、ベンジルオキシ基、－ＮＨ－Ｒ１０、または－ＮＨ－Ｑ１２－（Ｐ１２－Ｑ１２’）ｑ10－Ｔ４－Ｌ４であり、
　Ｐ１２およびＴ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ１２およびＱ１２’は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ2－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ2は０～９９の整数であり、
　Ｌ４は、糖リガンドであり、
　Ｙ２は-Ｏ－（ＣＨ２）ｍ９－ＮＨ－および－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｍ１０－ＮＨであり、ｍ９、ｍ１０は、それぞれ独立して、１～１０の整数であり、
　ｑ１０は、０～１０の整数であり、
　Ｒ９は、水素原子、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、－ＣＯ－Ｒ１０、－ＣＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ６－ＣＨ２ＣＨ２－Ｎ３、または－ＣＯ－Ｑ１３－Ｂ６－（Ｑ１４－Ｐ１３）ｑ１１－Ｘ２であり、ｎ６は０～９９の整数であり、
　Ｐ１３は、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
　Ｑ１３およびＱ１４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ７－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎ７は０～９９の整数であり、
　Ｂ６は、下記式１０－１で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ１３およびＱ１４との結合手を意味し、
式１０－１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000136
　式１０－１中、トリアゾール環を有する基における置換は、該トリアゾール環の1位および3位の窒素原子のいずれかである。
　ｑ１１は、０～１０の整数であり、
　Ｘ２は、水素原子または固相担体であり、
　Ｒ１０は、ｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される１または２個の置換基で置換された炭素数２～１０のアルキル基である。）
　以下、本発明に関連して、製造方法を一例として示す。なお、以下の製造方法１～製造方法１７に関する記載において、本発明の核酸誘導体等における式１～式１２で表される化合物とで、基を表す記号として同一の記号が用いられているものがあるが、両者は切り離して理解されるものであり、製造方法１～製造方法１２に対して記載される基の説明により、本発明が限定的に解釈されるものではない。また、本発明における核酸誘導体に関し、オリゴヌクレオチドを表すＸを、製造方法１～製造方法１７では、－Ｏ－Ｘとして記載する。
　　製造方法１
　本発明における核酸誘導体は、式（Ｉ’）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000137
（式中、Ｐ１はＦｍｏｃ等の塩基により脱保護可能な保護基であり、ＤＭＴｒはｐ，ｐ’－ジメトキシトリチル基を表し、Ｒは糖リガンド-テザーユニットを表し、Ｒ’は、Ｒ中の糖リガンドの各水酸基がアセチル基等の塩基で脱保護可能な保護基で保護された基を表し、Ｐｏｌｙｍｅｒは固相担体を表し、Ｑ’は－ＣＯ－である。）
工程１
　化合物（Ｉ－Ｂ）は、化合物（Ｉ－Ａ）とｐ，ｐ’－ジメトキシトリチルクロリドを、ピリジン等の溶媒中、必要に応じて共溶媒の存在下、０℃と１００℃の間の温度で、５分間～１００時間反応させることにより製造することができる。
　共溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，２－ジメトキシエタン、ジオキサン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン、ピリジン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
工程２
　化合物（Ｉ－Ｃ）は、化合物（Ｉ－Ｂ）を、無溶媒でまたは溶媒中、１～１０００当量の２級アミン存在下、室温と２００℃の間の温度で、５分間～１００時間反応させることにより製造することができる。
　溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，２－ジメトキシエタン、ジオキサン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン、ピリジン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
　２級アミンとしては、例えばジエチルアミン、ピペリジン等が挙げられる。
工程３
　化合物（１－Ｅ）は、化合物（Ｉ－Ｃ）と化合物（Ｉ－Ｄ）を、無溶媒でまたは溶媒中、１～３０当量の塩基、縮合剤および必要に応じて０．０１～３０当量の添加剤の存在下、室温と２００　℃の間の温度で、５分間～１００時間反応させることにより製造することができる。
　溶媒としては、工程２で例示したものが挙げられる。
　塩基としては、例えば炭酸セシウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム　ｔｅｒｔ－ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、ピリジン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン（ＤＭＡＰ）等が挙げられる。
　縮合剤としては、例えば１，３－ジシクロヘキサンカルボジイミド（DCC）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ）、カルボニルジイミダゾール、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルホロホスファート、（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム　ヘキサフルオロホスファート、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、ヨウ化　２－クロロ－１－メチルピリジニウム等が挙げられる。
　添加剤としては、例えば１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等が挙げられる。
　化合物（Ｉ－Ｄ）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，　１３６，　１６９５８，　（２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
工程４
　化合物（Ｉ－Ｆ）は、化合物（Ｉ－Ｅ）とコハク酸無水物を、溶媒中、１～３０当量の塩基存在下、室温と２００℃の間の温度で、５分間～１００時間反応させることにより製造することができる。
　溶媒としては、工程２で例示したものが挙げられる。
　塩基としては、工程３で例示したものが挙げられる。
工程５
　化合物（Ｉ－Ｇ）は、化合物（Ｉ－Ｆ）と末端がアミノ化された固相担体とを、無溶媒でまたは溶媒中、１～３０当量の塩基、縮合剤および必要に応じて０．０１～３０当量の添加剤の存在下、室温と２００℃の間の温度で、５分間～１００時間反応した後、無水酢酸／ピリジン溶液と室温と２００℃の間の温度で５分間～１００時間反応させることにより製造することができる。
　溶媒としては、工程２で例示したものが挙げられる。
　塩基、縮合剤および添加剤としては、それぞれ工程３で例示したものがあげられる。
　アミノ化された固相担体としては、例えば長鎖アルキルアミン細孔性ガラス（ＬＣＡＡ－ＣＰＧ）等　があげられ、これらは市販品として得ることができる。
工程６
　式（Ｉ’）で表される糖リガンド－テザー－ブランチャーユニットを有する核酸複合体は、化合物（Ｉ－Ｇ）を用い、公知のオリゴヌクレオチド化学合成法で対応するヌクレオチド鎖を伸長した後に、固相からの脱離、保護基の脱保護および精製を行うことで製造することができる。
　公知のオリゴヌクレオチド化学合成法としては、ホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法、ＣＥＭ法　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　３５，　３２８７　（２００７）を参照）等をあげることができ、例えば、ＡＢＩ３９００ハイスループット核酸合成機（アプライドバイオシステムズ社製）により合成することができる。
　固相からの脱離、脱保護は、オリゴヌクレオチド化学合成後、溶媒または無溶媒中、－８０　℃から２００　℃の間の温度で、１０秒間から７２時間塩基で処理することにより製造することができる。
　塩基としては、例えばアンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、イソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ピペリジン、トリエチルアミン、エチレンジアミン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）、炭酸カリウム等が挙げられる。
　溶媒としては、水、メタノール、エタノール、ＴＨＦ等が挙げられる。
　オリゴヌクレオチドの精製は、Ｃ１８逆相カラムあるいは陰イオン交換カラム、好ましくは前述２つの手法を組み合わせにより可能である。精製後の核酸複合体純度は、９０％以上、好ましくは９５％以上とするのが望ましい。
　また、上記工程３において、必要により、化合物（Ｉ－Ｄ）を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物（Ｉ－Ｃ）と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばＲ－Ｑ’がＲ－ＮＨ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－である場合（Ｑ４’は置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンである）、工程３において、化合物（Ｉ－Ｃ）と、ＣＨ３ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）とを、工程３と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにＲ’－ＮＨ２（Ｒ’は前記と同義）と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、ＣＨ３ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）およびＲ’－ＮＨ２（Ｒ’は前記と同義）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，　１３６，　１６９５８　（２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。ここで、Ｑ４’において、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンにおける置換基およびアルキレン部分は上記と同様である。
　Ｑが－ＣＯ－である場合を例示して示しているが、Ｑが－ＣＯ－でない場合の化合物についても、Ｑの構造を適宜変更することにより、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらを組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
　　製造方法２
　本発明における核酸誘導体は、式（ＩＩ’）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000138
（式中、ＤＭＴｒ、Ｒ、Ｒ’、Ｘ、Ｑ’、およびＰｏｌｙｍｅｒは前記と同義。ＴＢＤＭＳはｔ－ブチルジメチルシリル基、Ｆｍｏｃは９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基を表す）
工程７
　化合物（ＩＩ－Ａ）は、化合物（Ｉ－Ａ）、ｔ－ブチルジメチルシリルクロリドおよびジメチルアミノピリジンをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の溶媒中、好ましくは２等量の塩基の存在下、０℃～１００℃の間の温度で、５分間～１００時間反応させることにより製造することができる。
　塩基としては、製造方法１の工程３で例示したものが挙げられる。
工程８
　化合物（ＩＩ－Ｂ）は、化合物（ＩＩ－Ａ）を用い、製造方法１の工程１と同様の条件にて製造することができる。
工程９
　化合物（ＩＩ－Ｃ）は、化合物（ＩＩ－Ｂ）とフッ化ｎ－テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）を、溶媒中、室温と２００℃の間の温度で、５分間～１００時間反応させることにより製造することができる。
　溶媒としては、工程２で例示したものが挙げられる。
工程１０
　化合物（ＩＩ－Ｄ）は、化合物（ＩＩ－Ｃ）を用い、製造方法１の工程２と同様の条件にて製造することができる。
工程１１
　化合物（ＩＩ－Ｅ）は、化合物（ＩＩ－Ｄ）および化合物（Ｉ－Ｄ）を用い、製造方法１の工程３と同様の条件にて製造することができる。
工程１２～１４
　化合物（ＩＩ’）は、化合物（ＩＩ－Ｅ）を用い、製造方法１の工程４～工程６と同様の条件にて製造することができる。
　また、上記工程１１において、必要により、化合物（Ｉ－Ｄ）を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物（ＩＩ－Ｃ）と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばＲ－Ｑ’が－ＮＨ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－である場合（Ｑ４’は置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレン）、工程１１において、化合物（ＩＩ－Ｃ）と、ＣＨ３ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）とを、工程１１と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにＲ’－ＮＨ２（Ｒ’は前記と同義）と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、ＣＨ３ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）およびＲ’－ＮＨ２（Ｒ’は前記と同義）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，　１３６，　１６９５８　（２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
　Ｑが－ＣＯ－である場合を例示して示しているが、Ｑが－ＣＯ－でない場合の化合物についても、Ｑの構造を適宜変更することにより、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらを組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
　　製造方法３
　本発明における核酸誘導体は、式（ＩＩＩ’）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000139
（式中、ＤＭＴｒ、Ｆｍｏｃ、Ｒ、Ｒ’、Ｑ’、ＸおよびＰｏｌｙｍｅｒは前記と同義である。）
　化合物（ＩＩＩ’）は、化合物（ＩＩＩ－Ａ）を用い、製造方法１の工程１から工程６と同様の条件にて製造することができる。なお、化合物（ＩＩＩ－Ａ）は市販品として得ることができる。
工程１５
　化合物（ＩＩＩ－Ｂ）は、化合物（ＩＩＩ－Ａ）を用い、製造法１の工程１と同様の条件にて製造することができる。
　化合物（ＩＩＩ－Ａ）は市販品として購入することができる。
工程１６
　化合物（ＩＩＩ－Ｃ）は、化合物（ＩＩＩ－Ｂ）を用い、製造法１の工程２と同様の条件にて製造することができる。
工程１７
　化合物（ＩＩＩ－Ｅ）は、化合物（ＩＩＩ－Ｃ）を用い、製造法１の工程３と同様の条件にて製造することができる。
工程１８～２０
　化合物（ＩＩＩ’）は、化合物（ＩＩＩ－Ｅ）を用い、製造方法１の工程４～工程６と同様の条件にて製造することができる。
　また、上記工程１７において、必要により、化合物（Ｉ－Ｄ）を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物（ＩＩＩ－Ｃ）と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばＲ－Ｑ’が－ＮＨ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－である場合（Ｑ４’は置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレン）、工程１７において、化合物（ＩＩＩ－Ｃ）と、ＣＨ３ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）とを、工程１７と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにＲ’－ＮＨ２（Ｒ’は前記と同義）と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、ＣＨ３ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）およびＲ’－ＮＨ２（Ｒ’は前記と同義）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，１３６，　１６９５８　（２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
　Ｑが－ＣＯ－である場合を例示して示しているが、Ｑが－ＣＯ－でない場合の化合物についても、Ｑの構造を適宜変更することにより、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらを組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
　　製造方法４
　本発明における核酸誘導体は、式（ＩＶ’）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000140
（式中、ＤＭＴｒ、Ｆｍｏｃ、Ｒ、Ｒ’、Ｑ’、ＸおよびＰｏｌｙｍｅｒは前記と同義である。）
　化合物（ＩＶ’）は、化合物（ＩＶ－Ａ）を用い、製造方法１の工程１から工程６と同様の条件にて製造することができる。なお、化合物（ＩＶ－Ａ）は市販品として得ることができる。
　また、上記工程２３において、必要により、化合物（Ｉ－Ｄ）を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物（ＩＶ－Ｃ）と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばＲ’－Ｑ’が－ＮＨ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－である場合（Ｑ４’は置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンである）、工程２３において、化合物（ＩＶ－Ｃ）と、ＣＨ３ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）とを、工程２３と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにＲ’－ＮＨ２（Ｒ’は前記と同義）と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、ＣＨ３ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）およびＲ’－ＮＨ２（Ｒ’は前記と同義）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，　１３６，　１６９５８　（２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
　Ｑが－ＣＯ－である場合を例示して示しているが、Ｑが－ＣＯ－でない場合の化合物についても、Ｑの構造を適宜変更することにより、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらを組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
　　製造方法５
　本発明における核酸誘導体は、式（Ｖ’）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000141
（式中、ＤＭＴｒ、Ｒ、Ｒ’、Ｘ、Ｑ’、ＴＢＤＭＳ、ＦｍｏｃおよびＰｏｌｙｍｅｒは前記と同義。）
　化合物（Ｖ’）は、化合物（ＩＶ－Ａ）を用い、製造方法２の工程１から工程７と同様の条件にて製造することができる。なお、化合物（ＩＶ－Ａ）は市販品として得ることができる。
　また、上記工程３１において、必要により、化合物（Ｉ－Ｄ）を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物（Ｖ－Ｄ）と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばＲ’－Ｑ’が－ＮＨ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－である場合（Ｑ４’は置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンである）、工程３１において、化合物（Ｖ－Ｄ）と、ＣＨ３ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）とを、工程３１と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにＲ’－ＮＨ２（Ｒ’は前記と同義）と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、ＣＨ３ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｑ４’－ＣＯ－ＯＨ（Ｑ４’は前記と同義）およびＲ’－ＮＨ２（Ｒ’は前記と同義）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，　１３６，　１６９５８　（２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
　Ｑが－ＣＯ－である場合を例示して示しているが、Ｑが－ＣＯ－でない場合の化合物についても、Ｑ－ＯＨの構造を適宜変更することにより、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらを組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
　　製造方法６
　オリゴヌクレオチドの５’末端に糖リガンド－テザー－ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000142
 （式中、Ｒ、Ｒ’、Ｑ’、ＤＭＴｒおよびＸは前記と同義である）
工程３５
　化合物（Ｉ－Ｈ）は、化合物（ＩＩ－Ｅ）と２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホジアミダイトを、無溶媒でまたは溶媒中、塩基および反応促進剤共存下、室温と２００℃の間の温度で、５分間～１００時間反応させることにより製造することができる。
　溶媒としては、製造方法１の工程２で例示したものがあげられる。
　塩基としては、製造方法１の工程３で例示したものがあげられる。
　反応促進剤としては、例えば、１Ｈ－テトラゾール、４，５－ジシアノイミダゾール、５－エチルチオテトラゾール、５－ベンジルチオテトラゾール等があげられ、市販品として購入できる。
工程３６
　オリゴヌクレオチド鎖を伸長し、最後に化合物（Ｉ－Ｈ）を用い、オリゴヌクレオチドの５’末端を糖リガンド－テザー－ブランチャーユニットで修飾した後、固相からの脱離、保護基の脱保護および精製を行うことにより、化合物(I’’)を製造することができる。ここで、固相からの脱離、保護基の脱保護および精製は、それぞれ製造方法１の工程７と同様にして製造できる。
　　製造方法７
　オリゴヌクレオチドの５’末端に糖リガンド－テザー－ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
　製造方法６の工程３５および３６と同様の条件にて製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000143
（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｑ’、ＤＭＴｒおよびＸは前記と同義である）
　　製造方法８
　オリゴヌクレオチドの５’末端に糖リガンド－テザー－ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
　製造方法６の工程３５および３６と同様の条件にて製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000144
（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｑ’、ＤＭＴｒおよびＸは前記と同義である）
　　製造方法９
　オリゴヌクレオチドの５’末端に糖リガンド－テザー－ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
　製造方法６の工程３５および３６と同様の条件にて製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000145
（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｑ’、ＤＭＴｒおよびＸは前記と同義である）
　　製造方法１０
　オリゴヌクレオチドの５’末端に糖リガンド－テザー－ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
　製造方法６の工程３５および３６と同様の条件にて製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000146
（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｑ’、ＤＭＴｒおよびＸは前記と同義である）
　　製造方法１１
　二本鎖核酸を構成するセンス鎖の３末端’または５’末端に糖リガンド－テザー－ブランチャーユニットを有するセンス鎖と、二本鎖核酸を構成するアンチセンス鎖とを、水または適当な緩衝液にそれぞれ溶解し、混合することにより二本鎖核酸を有する核酸複合体を得ることができる。
　緩衝液としては、例えば酢酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、水等が挙げられ、これらを単独または混合して用いられる。
　センス鎖とアンチセンス鎖の混合比としては、センス鎖１当量に対してアンチセンス鎖が０．５～２当量が好ましく、０．９～１．１当量がより好ましく、０．９５当量～１．０５当量がさらに好ましい。
　また、該センス鎖と該アンチセンス鎖を混合後、適宜アニーリング処理を行ってもよい。アニーリング処理は、センス鎖とアンチセンス鎖の混合物を、好ましくは５０～１００℃、より好ましくは６０～１００℃、さらに好ましくは８０～１００℃に加熱した後に、室温まで徐冷することにより行うことができる。
　アンチセンス鎖は、上記の公知オリゴヌクレオチド合成法に準じて得ることができる。
　　製造方法１２
　本発明における核酸誘導体は、式（ＶＩ’）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000147
(式中、ＤＭＴｒ、Ｒ、Ｒ’、Ｘ、Ｑ’、Ｐｏｌｙｍｅｒ、およびＦｍｏｃは前記と同義であり、ＴＢＳはｔ－ブチルジメチルシリル基を表し、Ｒ０およびＲｘは、同一または異なって、水素原子、Ｃ１～Ｃ１０のアルキレンまたはＣ３－Ｃ８のシクロアルキレンを表し、ＷはＣ１～Ｃ１０のアルキレン、Ｃ３－Ｃ８のシクロアルキレンであるか、Ｒ０と一緒になって、Ｃ４－Ｃ８の含窒素複素環を形成してもよい。)
工程４５
　化合物（ＶＩ－Ｂ）は化合物（ＶＩ－Ａ）を用い、製造方法１の工程１と同様の条件にて製造することができる。
　化合物（ＶＩ－Ａ）は市販品として、または公知の方法（例えばバイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ，第１１巻，３８３－３８６頁）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
工程４６
　化合物（ＶＩ－Ｃ）は化合物（ＶＩ－Ｂ）を用い、製造方法１の工程２と同様の条件にて製造することができる。
工程４７
　化合物（ＶＩ－Ｄ）は化合物（ＶＩ－Ｃ）を用い、製造方法１の工程３と同様の条件にて製造することができる。
工程４８
　化合物（ＶＩ－Ｅ）は化合物（ＶＩ－Ｄ）を用い、製造方法１の工程２と同様の条件にて製造することができる。
工程４９
　化合物（ＶＩ－Ｇ）は化合物（ＶＩ－Ｅ）と化合物（ＶＩ－Ｆ）とを用い、製造方法１の工程３と同様の条件にて製造することができる。
工程５０
　化合物（ＶＩ－Ｈ）は化合物（ＶＩ－Ｇ）を用い、製造方法２の工程９と同様の条件にて製造することができる。
工程５１～５３
　化合物（ＶＩ’）は化合物（ＶＩ－Ｈ）、化合物（ＶＩ－Ｉ）および化合物（ＶＩ－Ｊ）を用い、製造方法１の工程４～６と同様の条件にて製造することができる。
　工程４５～５３は公知の方法（例えば国際公開第２０１５／１０５０８３号記載の方法）、またはそれに準じた方法でも実施することができる。
　化合物（ＶＩ－Ｆ）は公知の方法（例えば、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ），　１３６巻，　１６９５８貢，　２０１４年記載の方法）、またはそれに準じた方法で得ることができる。
　　製造方法１３
　式２においてＰ１およびＰ４が－ＮＨ－ＣＯ－、－Ｏ－ＣＯ－または－Ｓ－ＣＯ－である、糖リガンド－テザーーユニットは以下の方法で製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000148
（式中、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｑ５、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｔ１、Ｔ２、L１、Ｌ２、ｑ１、ｑ２、ｑ３およびｑ４はそれぞれ前記と同義であり、ｑ２’はｑ２より１小さい整数を表し、ｑ４’はｑ４より１小さい整数を表し、Ｐ１’およびＰ４’は、それぞれ独立して、－ＮＨ－ＣＯ－、－Ｏ－ＣＯ－または－Ｓ－ＣＯ－を表し、ＺはＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メタンスルホニルオキシ、p-トルエンスルホニルオキシまたはカルボン酸を表し、Ｂ１’およびＢ２’は下記式の構造体のいずれか１つを表し、ＰＧ１、ＰＧ２、ＰＧ３、ＰＧ４、ＰＧ５、ＰＧ６およびＰＧ７はそれぞれ適切な保護基を表す。）
式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000149
ｍ１、ｍ２、ｍ３またはｍ４はそれぞれ独立して、０～１０の整数を表す。
工程５４
　化合物（ＶＩＩ－Ｃ）は、化合物（ＶＩＩ－Ａ）と化合物（ＶＩＩ－Ｂ）を、テトロヒドロフラン等の溶媒中、トリフェニルホスフィンポリマー担持体を加え、氷冷下、ジイソプロピルアゾジカルボキシレートトルエン溶液を反応させることにより製造することができる。
　溶媒としては製造工程１の工程２で例示したものが挙げられる。
　化合物（ＶＩＩ－Ａ）は市販品として得ることができる。
工程５５
　化合物（ＶＩＩ－Ｄ）は化合物（ＶＩＩ－Ｃ）を用い、メタノール等の溶媒中、氷冷下、塩基の存在下、反応させることにより製造することができる。
　溶媒としては、製造工程１の工程２で例示したものが挙げられる。
　塩基としては、製造工程１の工程３で例示したものが挙げられる。
工程５６
　化合物（ＶＩＩ－Ｆ）は化合物（ＶＩＩ－Ｄ）および化合物（ＶＩＩ－Ｅ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
工程５７
　化合物（ＶＩＩ－Ｈ）は化合物（ＶＩＩ－Ｆ）および化合物（ＶＩＩ－Ｇ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
工程５８
　化合物（ＶＩＩ－Ｊ）は化合物（ＶＩＩ－Ｈ）および化合物（ＶＩＩ－Ｉ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
　また、ＤＰ工程と工程５８を繰り返し行うことで、望みのｑ１の値をもつ化合物（ＶＩＩ－Ｊ）を製造することができる。
工程５９
　化合物（ＶＩＩ－Ｌ）は化合物（ＶＩＩ－Ｊ）および化合物（ＶＩＩ－Ｋ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
工程６０
　化合物（ＶＩＩ－Ｎ）は化合物（ＶＩＩ－Ｌ）および化合物（ＶＩＩ－Ｍ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
工程６１～６３
　化合物（ＶＩＩ’）は化合物（ＶＩＩ－Ｏ）、化合物（ＶＩＩ－Ｐ）および化合物　（ＶＩＩ－Ｑ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
　また、ＤＰ工程と工程６１を繰り返し行うことで、望みのｑ3の値をもつ化合物（ＶＩＩ’）を製造することができる。
工程ＤＰ
　有機合成化学で常用される方法［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第３版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ　Ｉｎｃ．（１９９９年）等に記載の方法等］を適切に用いることで製造することができる。
　化合物（ＶＩＩ－Ｂ）、化合物（ＶＩＩ－Ｅ）、化合物（ＶＩＩ－Ｇ）、化合物（ＶＩＩ－Ｉ）、化合物（ＶＩＩ－Ｋ）、化合物（ＶＩＩ－Ｍ）、化合物（ＶＩＩ－Ｏ）、化合物（ＶＩＩ－Ｐ）および化合物（ＶＩＩ－Ｑ）は市販品として、または「実験化学講座第４版　有機合成、ｐ．　２５８、丸善（１９９２年）」、「Ｍａｒｃｈ’ｓ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，　７ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載の方法を組み合わせること、もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
　　製造方法１４
　式４においてＰ７が－Ｏ－である、ユニットは以下の方法で製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000150
（式中、Ｑ５、Ｐ７、ｑ５はそれぞれ前記と同義であり、ｑ５’ ’はｑ５より２小さい整数を表し、ｑ５’はｑ５より１小さい整数を表し、Ｚ２はＨ、ＯＨ、ＮＨ２またはＳＨを表し、ＰＧ８およびＰＧ９はそれぞれ適切な保護基を表し、ＬＣは糖リガンド－テザーユニットを表し、Ｅはカルボン酸またはマレイミドを表す。）
工程６４
　化合物（ＶＩＩＩ－Ｃ）は化合物（ＶＩＩＩ－Ａ）および化合物（ＶＩＩＩ－Ｂ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
　また、ＤＰ工程と工程６４を繰り返し行うことで、望みのｑ5’’の値をもつ化合物（ＶＩＩＩ－Ｃ）を製造することができる。　化合物（ＶＩＩＩ－Ｂ）は市販品として、または「実験化学講座第４版　有機合成、ｐ．　２５８、丸善（１９９２年）」、「Ｍａｒｃｈ’ｓ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，　７ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載の方法を組み合わせること、もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
工程６５
　化合物（ＶＩＩＩ’）は化合物（ＶＩＩＩ－Ｃ）および化合物（ＶＩＩＩ－Ｄ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
　化合物（ＶＩＩＩ－Ｄ）は市販品として、または「実験化学講座第４版　有機合成、ｐ．　２５８、丸善（１９９２年）」、「Ｍａｒｃｈ’ｓ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，　７ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載の方法を組み合わせること、もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
工程ＤＰ
　有機合成化学で常用される方法［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第３版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ　Ｉｎｃ．（１９９９年）等に記載の方法等］を適切に用いることで製造することができる。
　　製造方法１５
　式２においてＰ１およびＰ４が－Ｏ－である、糖リガンド－テザーユニットは以下の方法で製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000151
（式中、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ６、Ｔ１、Ｔ２、Ｌ１、Ｌ２、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ２’、ｑ４’ 、Ｚ、Ｂ１’、Ｂ２’はそれぞれ前記と同義であり、ＰＧ１０、ＰＧ１１、ＰＧ１２、ＰＧ１３、ＰＧ１４およびＰＧ１５はそれぞれ適切な保護基を表す）
式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000152
ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４は前記と同義である。
工程６６
　化合物（ＩＸ－Ｃ）は化合物（ＩＸ－Ａ）と化合物（ＩＸ－Ｂ）をＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミドな等の溶媒に溶解し、炭酸水素カリウム等の塩基を加えて、室温～２００℃にて５分間～１００時間反応させることにより製造することができる。
　溶媒としては、製造工程１の工程２に例示したものが挙げられる。
　塩基としては、製造工程１の工程３で例示したものが挙げられる。
工程６７
　化合物（ＩＸ－Ｅ）は化合物化合物（ＩＸ－Ｃ）と化合物（ＩＸ－Ｄ）をＮ，　Ｎ’－ジメチルホルムアミド等の溶媒に溶解し、炭酸水素カリウム等の塩基を加えて、室温～２００℃で５分間～１００時間反応させることにより製造することができる。
　溶媒としては、製造工程１の工程２で例示したものが挙げられる。
　塩基としては、製造工程１の工程３で例示したものが挙げられる。
　化合物（ＩＸ－Ａ）は市販品として得ることができる。
工程６８
　化合物（ＩＸ－Ｇ）は化合物（ＩＸ－Ｅ）および化合物（ＩＸ－Ｆ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
工程６９
　化合物（ＩＸ－Ｉ）は化合物（ＩＸ－Ｇ）および化合物（ＩＸ－Ｈ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
　また、ＤＰ工程と工程６９を繰り返し行うことで、望みのｑ１の値をもつ化合物（ＶＩＩ－Ｊ）を製造することができる。
工程７０
　化合物（ＩＸ－Ｋ）は化合物（ＩＸ－Ｉ）および化合物（ＩＸ－Ｊ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
工程７１
　化合物（ＩＸ－Ｍ）は化合物（ＩＸ－Ｋ）および化合物（ＩＸ－Ｌ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
工程７２－７４
　化合物（ＩＸ’）は化合物（ＩＸ－Ｍ），　化合物（ＩＸ－Ｎ），　化合物（ＩＸ－Ｏ）および化合物（ＩＸ－Ｐ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
　また、ＤＰ工程と工程７２を繰り返し行うことで、望みのｑ３の値をもつ化合物（ＩＸ’）を製造することができる。
工程ＤＰ
　有機合成化学で常用される方法［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第３版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ　Ｉｎｃ．（１９９９年）等に記載の方法等］を適切に用いることで製造することができる。
　化合物（ＩＸ’－Ｂ），　化合物（ＩＸ’－Ｄ），　化合物（ＩＸ’－Ｆ），　化合物（ＩＸ’－Ｈ），　化合物（ＩＸ’－Ｊ），　化合物（ＩＸ’－Ｌ），　化合物（ＩＸ’－Ｎ），　化合物（ＩＸ’－Ｏ）および化合物（ＩＸ’－Ｐ）は市販品として、または「実験化学講座第４版　有機合成、ｐ．　２５８、丸善（１９９２年）」、「Ｍａｒｃｈ’ｓ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，　７ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載の方法を組み合わせること、もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
　　製造方法１６
　式１～式８の核酸複合体の製造方法として、以下の方法も用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000153
（式中、ＬＣ、Ｑ５、Ｑ６、Ｑ７、Ｐ７、Ｐ８、ｑ５’、ｑ６およびＸは前記と同義である。）
工程７５
　化合物（Ｘ－Ｂ）は化合物（ＸＩＩＩ’’）と化合物（Ｘ－Ａ）を溶媒中、０℃～１００℃で１０秒間～１００時間反応させることにより製造することができる。
　溶媒としては水、リン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、ジメチルスルホキシド等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
　化合物（ＶＩＩＩ’）は製造法１４を用いることで、得ることができる。
　化合物（Ｘ－Ａ）は公知の方法（例えばバイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），　第２１巻，　１８７－２０２頁，　２０１０年、またはカレント・プロトコールズ・イン・ヌクレイック・アシッド・ケミストリー　（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），　２０１０年，　９月；　ＣＨＡＰＴＥＲ：　Ｕｎｉｔ　４．４１）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
工程７６
　化合物（Ｘ’）は化合物（Ｘ－Ｂ）を用いて炭酸ナトリウム水溶液またはアンモニア水中等ｐＨ８以上の条件下、室温と２００℃の間の温度で、５分間～１００時間反応させることにより製造することができる。
　　製造方法１７
　式１～式８の核酸複合体の製造方法として、以下の方法も用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000154
（式中、ＬＣ、Ｑ５、Ｑ６、Ｑ７、Ｐ７、Ｐ８、ｑ５’ 、ｑ６およびＸは前記と同義である。）
工程７７
　化合物（ＸI－Ａ）は化合物（ＶIII’’）を用いて、公知の方法（例えばバイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），　第２６巻，　１４５１－１４５５頁，　２０１５年に記載の方法）またはそれに準じた方法で得ることができる。
　化合物（ＶＩＩＩ’’’）は製造法１４を用いることで、得ることができる。
工程７８
　化合物（ＸI’）は化合物（ＸI－Ａ）と化合物（ＸI－Ｂ）を用いて、公知の方法（例えばバイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），　第２６巻，　１４５１－１４５５頁，　２０１５年に記載の方法）またははそれに準じた方法で得ることができる。
化合物（ＸI－Ｂ）はバイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），　第２６巻，　１４５１－１４５５頁，　２０１５年に記載の方法）またははそれに準じた方法で得ることができる。
工程７９
　また別の方法として、化合物（ＸＩ’）は、公知の方法（例えばバイオコンジュゲートケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），　第２２巻，１７２３－１７２８頁，　２０１１年を参照）あるいはそれに準じた方法で、化合物（ＸＩ－Ａ）から直接得ることができる。
　本明細書における核酸複合体は、例えば酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等の塩として得ることも可能である。
　酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、金属塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられ、アンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられ、有機アミン付加塩としては、例えば、モルホリン、ピペリジン等の付加塩が挙げられ、アミノ酸付加塩としては、例えば、リジン、グリシン、フェニルアラニン等の付加塩が挙げられる。
　本明細書の核酸複合体の塩を調製したい場合には、該複合体が所望の塩の形で得られるときはそのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られるときは、該複合体を適当な溶媒に溶解または懸濁し、対応する酸または塩基を加え、単離・精製すればよい。また、該複合体塩を形成する対イオンを異なる対イオンに変換する際には、該複合体塩を適当な溶媒に溶解または懸濁した後、酸、塩基および／または塩（塩化ナトリウム、塩化アンモニウム等の無機塩等）を数当量～大過剰量加えて単離、精製すればよい。
　本明細書の核酸複合体の中には、幾何異性体、光学異性体等の立体異性体、互変異性体等が存在し得るものもあるが、全ての可能な異性体およびそれらの混合物も本発明に包含される。
　また、本明細書の核酸複合体は、水または各種溶媒との付加物の形で存在することもああり、これらの付加物も本発明に包含される。
　さらに、本発明の核酸複合体は、分子中の一部あるいは全部の原子が質量数の異なる原子（同位体）（例えば、重水素原子等）で置換されたものも包含される。
　本発明の医薬組成物は、式１で表される核酸複合体を含む。本発明の核酸複合体は、Ｌ１およびＬ２の糖リガンドを有することにより、標的細胞に認識され、細胞内に導入される。
　本発明の核酸複合体は、哺乳動物に投与して、生体内において、標的遺伝子の発現を低下または停止させることで抑制し、標的遺伝子に関連する疾患の治療に用いることができる。
　本発明の核酸複合体を治療剤または予防剤として使用する場合、投与経路としては、治療に際し最も効果的な投与経路を使用するのが望ましく、特に限定されるものではないが、例えば、静脈内投与、皮下投与および筋肉内投与等が挙げられ、好ましくは皮下投与である。
　投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路等によって異なるが、例えば二本鎖のオリゴヌクレオチドに換算した1日投与量が0.1μg～1000 mgとなるように投与すればよく、1日投与量が1～100 mgとなるように投与することがより好ましい。
　静脈内投与または筋肉内投与に適当な製剤としては、例えば注射剤があげられ、調製した液剤をそのまま例えば注射剤等の形態として用いることも可能であるが、該液剤から例えば濾過、遠心分離等によって溶媒を除去して使用することも、該液剤を凍結乾燥して使用する、および/または例えばマンニトール、ラクトース、トレハロース、マルトースもしくはグリシン等の賦形剤を加えた液剤を凍結乾燥して使用することもできる。
　注射剤の場合、液剤または溶媒を除去または凍結乾燥した組成物に、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理食塩水またはアミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインもしくはEDTA等の抗酸化剤、またはグリセリン、ブドウ糖もしくは塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えばグリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。
　本発明の組成物を、哺乳動物の細胞に投与することで、本発明の組成物中の二本鎖核酸を細胞内に導入することができる。
　インビボにおける本発明の核酸複合体の哺乳動物の細胞への導入方法は、インビボにおいて行うことのできる公知のトランスフェクションの手順に従って行えばよい。本発明の組成物を、人を含む哺乳動物に静脈内投与することで、肝臓へ送達され、肝臓または肝細胞内に本発明の組成物中の二本鎖核酸を導入することができる。
　肝臓または肝細胞内に本発明の組成物中の二本鎖核酸が導入されると、その肝細胞内のCFB遺伝子の発現を低下させ、補体第二経路の異常により媒介される障害を治療あるいは予防することができる。CFB関連疾患としては、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD）、膜性増殖性糸球体腎炎（MPGN）、C3腎炎、膜性腎症、喘息、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス(SLE)、乾癬、視神経脊髄炎、重症筋無力症等）等が挙げられる。投与対象は、哺乳動物であり、ヒトであることが好ましい。
　投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路等によって異なるが、例えば二本鎖核酸に換算した1日投与量が0.1μg～1000 mgとなるように投与すればよく、1日投与量が1～100 mgとなるように投与することが好ましい。
　また、本発明は、疾患の治療に使用するための核酸複合体；疾患の治療に使用するための医薬組成物；疾患を治療するための核酸複合体の使用；疾患の治療用医薬の製造における核酸複合体の使用；疾患の治療用医薬の製造に使用するための核酸複合体；有効量の核酸複合体を、その必要のある対象に投与することを含む、疾患の治療または予防方法；を提供する。
　次に、参考例、実施例および試験例により、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例および試験例に限定されるものではない。なお、実施例および参考例に示されたプロトン核磁気共鳴スペクトル(1H NMR)は、270MHz、300MHzまたは400MHzで測定されたものであり、化合物および測定条件によっては交換性プロトンが明瞭には観測されないことがある。また、シグナルの多重度の表記としては通常用いられるものを用いているが、brとはbroadを意味し、見かけ上幅広いシグナルであることを表す。
　UPLC分析は以下の条件を用いた。
移動相A：　0.1%ギ酸含有水溶液、B：　アセトニトリル溶液
グラジエント：　移動相Bが10%-90%のリニアグラジエント（3分間）
カラム：　Waters社製ACQUITY UPLC BEH C18 (1.7 μm、内経 2.1 x 50 mm)
流速：　0.8 mL/min
PDA検出波長：　254 nm (検出範囲190-800 nm)
　表X-1～表X-4に参考例化合物を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000155
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000156
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000157
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000158
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000159
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000160
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000161
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000162
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000163
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000164
参考例１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000165
化合物RE1-2の合成
　ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958-16961頁, 2014年に記載された方法で合成した化合物RE1-1 (0.8755g, 1.9567 mmol)をテトラヒドロフラン (10 mL)に溶解し、1, 3－ジシクロヘキサンカルボジイミド（DCC, 0.4247 g, 2.0584 mmol)とN-ヒドロキシスクシミド (0.2412 g, 2.0958 mmol)を室温にて一晩撹拌した。反応混合物から析出した固体を除き、減圧下、溶媒を留去した。得られた混合物をN, N’-ジメチルホルムアミド (DMF)に溶解し、2-アミノエチルマレイミド臭酸塩 (0.6479 g, 2.5491 mmol)とジイソプロピルエチルアミン (1.7 mL, 9.7835 mmol)を加えた後、室温で一晩撹拌した。減圧下、反応液の溶媒を留去し、逆相カラムクロマトグラフィー (水/メタノール=80/20)で溶出させることにより、化合物RE1-2 (0.8502 g, 収率76%)を得た。
ESI-MS m/z: 570 (M + H)+;
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.45-1.56 (4H, m), 1.78 (3H, s), 1.90 (3H, s), 1.97 (2H, t, J= 7.0 Hz), 2.00 (3H, s), 2.11 (3H, s), 3.18-3.19 (2H, m), 3.38-3.45 (3H, m), 3.64-3.71 (1H, m), 3.85-3.89 (1H, m), 4.01-4.04 (3H, m), 4.48 (1H, d, J= 8.6 Hz), 4.95-4.98 (1H, m), 5.21 (1H, d, J = 3.5 Hz), 6.99 (2H, s), 7.81-7.87 (2H, m).
化合物RE1-4の合成
工程１
　化合物RE1-1 (0.9602 g, 2.1460 mmol)をN,N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、N-Boc-エチレンジアミン （シグマアルドリッチ社製, 0.6877 g, 4.292 mmol）、ジイソプロピルエチルアミン (1.90 mL, 10.87 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸塩 (和光純薬工業社製, 1.6437 g, 4.3229 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液に水を加え、クロロホルムで2回抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、化合物RE1-3の粗精製物を得た。
ESI-MS m/z: 590 (M + H)+
工程２
　化合物RE1-4の合成工程1で合成した化合物RE1-3 (1.2654 g, 2.1460mmol)をジクロロメタン (15 mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸 (4 mL)を加えて、室温にて一晩攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、逆相カラムクロマトグラフィー (水/メタノール=80/20)で溶出させることにより、化合物RE1-4 (0.3879 g, 収率37 %)を得た。
ESI-MS m/z: 490 (M + H)+;
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.46-1.52 (4H, m), 1.78 (3H, s), 1.90 (3H, s), 2.00 (3H, s), 2.08 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.11 (3H, s), 2.85 (2H, t, J = 6.3 Hz), 3.27 (2H, dd, J = 12.3, 6.2 Hz), 3.67-3.69 (1H, m), 3.68-3.73 (1H, m), 3.86-3.90 (1H, m), 4.01-4.04 (3H, m), 4.49 (1H, d, J = 8.4 Hz), 4.97 (1H, dd, J = 11.3, 3.4 Hz), 5.22 (1H, d, J = 3.5 Hz), 7.86 (1H, d, J = 9.1 Hz), 7.95-8.02 (1H, m).
参考例２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000166
参考例2工程１
　(9H-フルオレン-9-イル)メチル((2R,3R)-1,3-ジヒドロキシブタン-2-イル)カルバマート (化合物RE2-1, Chem-Impex International, Inc社製, 1.50 g, 4.58 mmol)をピリジン (20 mL)に溶解し、氷冷下、4,4’-ジメトキシトリチルクロライド (東京化成工業社製, 1.71 g, 5.04 mmol)を加えた後、室温にて2時間攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=90/10)で精製することにより、化合物RE2-2 (1.07 g, 収率37%)を得た。
ESI-MS m/z: 630 (M + H)+
参考例2工程2
　参考例2の工程1で合成した化合物RE2-2 (1.07 g, 1.699 mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にてピペリジン (0.336 mL, 3.40 mmol)を加えて3時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製することにより、化合物RE2-3 (0.59 g, 収率85 %)を得た。
ESI-MS m/z: 408 (M + H)+
参考例3
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000167
参考例3工程1
　5-ヒドロキシイソフタル酸ジメチル(化合物RE3-1, 和光純薬工業社製, 5.0443 g, 24 mmol)をテトラヒドロフラン (和光純薬工業社製25 mL)に溶解し、2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-1-エタノール (東京化成工業社製, 4.0343 g, 25.03 mmol）、およびトリフェニルホスフィン ポリマー担持体 （シグマアルドリッチ社製, 6.61 g, 25.2 mmol）を加えた後、氷冷下、40％ジイソプロピルアゾジカルボキシレート(DIAD)トルエン溶液 (東京化成工業社製, 13.26 mL, 25.2 mmol)を加え、室温にて一晩攪拌した。反応液をろ過し、減圧下、ろ液を留去した後、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=95/5～80/20)で精製することにより、化合物RE3-2 (5.3071 g, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 254 (M + H)+, 脱Boc体として検出
参考例3工程2
　参考例3工程1で合成した化合物RE3-2 (5.3071g, 15.02 mmol)をメタノール (25 mL)に溶解し、氷冷下、2mol/L水酸化ナトリウム水溶液 (和光純薬工業社製, 13 mL)を加え、室温にて4時間攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE3-3を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 324 (M - H)-
参考例3工程3
　参考例3工程2で合成した化合物RE3-3 (1.9296 g, 5.93 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (70 mL)に溶解し、N-1-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル)-エチレンジアミン塩酸塩 (3.3493 g, 11.86mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (5.18 mL, 29.7 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (4.5168 g,  11.88 mmol)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物RE3-4 (3.4407 g, 収率68%)を得た。
ESI-MS m/z: 898 (M + HCOO)-
参考例3工程4
　参考例3工程3で合成した化合物RE3-4 (1.6087 g, 1.884mmol)をジクロロメタン (20 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸 (5mL, 64.9 mmol)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE3-5 (2.4079 g)を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 798(M + HCOO)-
参考例3工程5
　参考例3工程4で合成した化合物RE3-5 (386 mg, 0.512 mmol)をテトラヒドロフラン (10 mL)に溶解し、氷冷下、塩化ベンゾイル (175 mg, 1.024mmol)を加えて、室温にて1時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物RE3-6 (373 mg, 収率82%)を得た。
ESI-MS m/z: 888(M + H)+
参考例3工程6
　参考例3工程5で合成した化合物RE3-6 (108 mg, 0.122 mmol)をジクロロメタン (5 mL)に溶解し、室温にてジエチルアミン (0.5 mL,4.8 mmol)を加えて1時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE3-7 (54.9 mg)を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 444(M + H)+
参考例3工程7
　参考例3工程6で合成した化合物RE3-7 (180 mg, 0.406mmol)、Nα,Nε-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-L-リジン (ノババイオケム社製, 295 mg, 0.852 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.354 mL,2.029 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (324 mg, 0.852 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物RE3-8 (450 mg)を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1101(M + H)+
参考例3工程8
　参考例3工程7で合成した化合物RE3-8 (2.1558 g, 1.9593 mmol)をジクロロメタン(20 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸 (5 mL)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE3-9を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 700(M + H)+
参考例４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000168
 （図中、Bnはベンジル基を表す。）
参考例4工程1
　参考例3に記載の方法で合成した化合物RE4-1(参考例3における化合物RE3-5, 0.5716 g, 0.7582 mmol)、バイオコンジュゲート・ケミストリー (Bioconjugate Chemistry), 第22巻, 690-699頁, 2011年に記載された方法で合成したドデカン酸モノベンジルエステル (0.4859g, 1.5164 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.662 mL, 3.79 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (0.5766 g, 1.516 mmol)をN,Nジメチルホルムアミド(12 mL)に溶解し、室温にて1時間攪拌した。反応液を氷冷し、飽和クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物RE4-2 (0.88 g, 収率84%)を得た。
ESI-MS m/z: 1057(M + H)+
参考例4工程2
　参考例4工程1で合成した化合物RE4-2 (0.7545 g, 0.714 mmol)をジクロロメタンテトラヒドロフラン (20 mL)に溶解し、室温にてジエチルアミン (5 mL,47.9 mmol)を加えて終夜攪拌した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE4-3を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 612(M + H)+
参考例4工程3
　参考例4工程2で合成した化合物RE4-3 (0.437 g, 0.7143 mmol)、Nα,Nε-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-L-リジン (ノババイオケム社製, 0.5483 g, 1.583 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.624 mL, 3.57 mmol)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (0.5703 g, 1.5 mmol)を加えて、室温にて2時間攪拌した。反応液に10%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE4-4の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1269(M + H)+
参考例4工程4
　参考例4工程3で合成した化合物RE4-4 (0.906 g, 0.7143 mmol)をジクロロメタン (12 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸 (3mL, 38.9 mmol)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE4-5の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 869(M + H)+
参考例５
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000169
参考例5工程1
　参考例3に記載の方法で合成した化合物RE5-1 (参考例3におけるRE3-8, 100 mg, 0.091 mmol)をメタノール (3 mL)に溶解し、酢酸 (2 μL)を添加した後、パラジウム/炭素による接触水素還元を行った。得られた溶液留分を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE5-2を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 967 (M + H)+
参考例5工程2
　化合物RE5-2 (50 mg, 0.052 mmol)およびN-(6-マレイミドカプロイルオキシ)スクシミド (48 mg, 0.155 mmol)をテトラヒドロフラン (2 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン (0.045 mL, 0.259  mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物RE5-3 (18 mg, 収率30%)を得た。
ESI-MS m/z: 1160 (M + H)+
参考例5工程3
　参考例5工程2で合成した化合物RE5-3 (18 mg, 0.016 mmol)をジクロロメタン (2 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸 (0.2 mL, 2.6 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、ジエチルエーテルにて晶析した後、化合物RE5-4 (7.5 mg, 収率64%)を白色固体として得た。
ESI-MS m/z: 759 (M + H)+
参考例6
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000170
参考例6工程1
　参考例3に記載の方法で合成した化合物RE6-1 (参考例3における化合物RE3-2, 0.9372 g, 2.8809 mmol)、β-アラニンメチルエステル塩酸塩 (東京化成工業株式会社製, 0.8082 g, 5.7902 mmol)を用い、参考例3の工程3と同様の方法で化合物RE6-2を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 495 (M + H)+
参考例6工程2
参考例6工程1で合成した化合物RE6-2 (0.9622 g, 1.952 mmol)を用い、参考例3の工程4と同様の方法で化合物RE6-3を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 396 (M + H)+
参考例6工程3
　参考例6工程2で合成した化合物RE6-3 (0.1146 g, 0.290 mmol)およびN-スクシンイミジル15-アジド-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカン酸(N3-PEG4-NHS， 東京化成工業株式会社製, 0.0750 g, 0.1931 mmol)を用い、参考例5の工程2と同様の方法で化合物RE6-4を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 669 (M + H)+
参考例6工程4
　参考例6工程3で合成した化合物RE6-4 (0.1291 g, 0.193 mmol)を用い、参考例3の工程2と同様の方法で化合物RE6-5を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 641 (M + H)+
参考例6工程5
　参考例6工程4で合成した化合物RE6-5 (0.1252 g, 0.193 mmol)およびL-グルタミン酸 ジ-tert-ブチルエステル(渡辺化学株式会社製, 0.1180 g, 0.399 mmol)を用い、参考例3の工程3と同様の方法で化合物RE6-6 (0.0521 g, 収率24%)を得た。
ESI-MS m/z: 1124 (M + H)+
参考例6工程6
　参考例6工程5で合成した化合物RE6-6 (0.0521 g, 0.0464 mmol)を用い 、参考例3の工程4と同様の方法で化合物RE6-7 (36 mg, 収率86%)を得た。
ESI-MS m/z: 899 (M + H)+
参考例７
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000171
参考例7工程1
　参考例3に記載の方法で合成した化合物RE7-1 (参考例3におけるRE3-9, 0.2586 g, 0.3695 mmol)とジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958-16961頁, 2014年に記載された方法で合成した参考例1に記載の化合物RE-1 (0.8559 g, 1.7927mmol)を用い、参考例3の工程3と同様の方法で化合物RE7-2 (0.5272 g, 収率61%)を得た。
ESI-MS m/z: 2418 (M + H)+
参考例7工程2
　参考例7工程1で合成した化合物RE7-2 (0.2653 g, 0.1097 mmol)を用い、参考例5の工程1と同様の方法で化合物RE7-3 (0.1524 g, 収率61%)を得た。
ESI-MS m/z: 2284 (M + H)+
参考例8:化合物A1およびB1の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000172
化合物A1の合成
　参考例7に記載の方法で合成した化合物RE8-1 (参考例7における化合物RE7-3, 0.0152 g, 0.006657 mmol)を用い、参考例5の工程2と同様の方法で化合物A1 (0.0077 g, 収率47%)を得た。
ESI-MS m/z: 1239(M + 2H)2+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.11-1.66 (34H, m), 1.77 (12H, d, J = 1.5 Hz), 1.89 (12H, s), 2.01-2.14 (10H, m), 2.01 (12H, s), 2.10 (12H, s), 2.92-2.99 (4H, m), 3.16-3.54 (14H, m), 3.65-3.74 (4H, m), 3.81-3.91 (4H, m), 3.98-4.08 (14H, m), 4.11-4.24 (4H, m), 4.48 (4H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 4.93-5.00 (4H, m), 5.21 (4H, d, J = 3.5 Hz), 6.99 (2H, s), 7.52 (2H, s), 7.66-7.75 (2H, m), 7.78-7.87 (6H, m), 7.91 (1H, br s), 8.01-8.08 (3H, br m), 8.54-8.60 (2H, br m).
化合物B1の合成
　化合物RE8-1 (参考例7における化合物RE7-3, 0.0150 g, 0.00657mmol)を用い、参考例3の工程3と同様の方法で化合物B1 (0.0062 g, 収率37%)を得た。
ESI-MS m/z: 1279(M + 2H)2+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.11-1.66 (30H, m), 1.77 (12H, s), 1.89 (12H, s), 2.01-2.14 (8H, m), 2.01 (12H, s), 2.10 (12H, s), 2.33-2.38 (2H, m), 2.92-2.99 (4H, m), 3.16-3.54 (14H, m), 3.58-3.63 (16H, m), 3.65-3.74 (4H, m), 3.81-3.91 (4H, m), 3.98-4.08 (12H, m), 4.11-4.24 (4H, m), 4.48 (4H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 4.93-5.00 (4H, m), 5.21 (4H, d, J = 3.5 Hz), 7.52 (2H, s), 7.66-7.75 (2H, m), 7.78-7.87 (6H, m), 7.91 (1H, br s), 8.01-8.08 (3H, br m), 8.54-8.60 (2H, br m).
参考例9:化合物B2およびB3の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000173
化合物B2の合成
　参考例6に記載の方法で合成した化合物RE9-1 (参考例6における化合物RE6-5, 0.00436 g, 0.00681 mmol)および参考例1の化合物RE1-4 (0.010 g, 0.020 mmol)を用い、参考例3の工程3と同様の方法で化合物B2の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1584(M + H)+
化合物B3の合成
　参考例6に記載の方法で合成した化合物RE9-2 (参考例6における化合物RE6-7, 0.0100 g, 0.01112 mmol)を用い、参考例3の工程3と同様の方法で化合物B3 (0.0223 g, 収率72%)を得た。
ESI-MS m/z: 1393(M + 2H)2+
参考例10：化合物C1およびD1の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000174
参考例10工程1
　参考例4に記載の方法で合成した化合物RE10-1 (参考例4における化合物RE4-5, 0.1952 g, 0.225 mmol)とジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958-16961頁、2014年に記載された方法で合成した参考例1の化合物RE1-1 (0.4162 g, 0.93 mmol)を用い、参考例3の工程3と同様の方法で化合物RE10-2 (334.8 mg, 収率58%)を得た。
ESI-MS m/z: 1294 (M + 2H)2+
参考例10工程2
　参考例10工程1で合成した化合物RE10-2 (0.1459 g, 0.056 mmol)を用い、参考例5の工程1と同様の方法で化合物D1 (112 mg, 収率80%)を得た。
ESI-MS m/z: 1249 (M + 2H)2+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.11-1.66 (44H, m), 1.77 (12H, d, J = 1.5 Hz), 1.89 (12H, s), 2.01-2.20 (12H, m), 2.01 (12H, s), 2.10 (12H, s), 2.92-2.99 (4H, m), 3.16-3.54 (10H, m), 3.58-3.64 (4H, m), 3.65-3.74 (4H, m), 3.81-3.91 (4H, m), 3.98-4.08 (12H, m), 4.11-4.24 (4H, m), 4.48 (4H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 4.93-5.00 (4H, m), 5.21 (4H, d, J = 3.5 Hz), 6.99 (2H, s), 7.52 (2H, s), 7.66-7.75 (2H, m), 7.78-7.87 (6H, m), 7.91 (1H, br s), 8.01-8.08 (3H, br m), 8.54-8.60 (2H, br m).
参考例10工程3
　参考例10工程2で合成した化合物D1 (0.1091 g, 0.044 mmol)および参考例2の化合物RE2-3 (0.0748 g, 0.184 mmol)を用い、参考例3の工程3と同様の方法で化合物RE10-3を粗生成物として得た。
ESI-MS m/z: 1292 (M + 2H)2+, 脱DMTr体として検出
参考例10工程4
　参考例10工程3で合成した化合物RE10-3 (0.161 g, 0.05586 mmol)をジクロロメタン (5 mL)に溶解し、コハク酸無水物 (東京化成工業社製, 0.1182 g, 1.181 mmol）、N,N-ジメチルアミノピリジン (0.0224 g,0.183 mmol)、およびトリエチルアミン(0.55 mL, 3.95 mmol)を加えて、室温にて一晩攪拌した。反応液を氷冷し、水を加え、酢酸エチルで2回抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE10-4の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1342(M + 2H)2+, 脱DMTr体として検出
参考例10工程5
　参考例10工程4で合成した化合物RE10-4 (0.0816 g, 0.02734 mmol)、O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸塩 (0.0221 g, 0.05827 mmol)、およびジイソプロピルエチルアミン（0.02 mL, 0.1094 mmol）をN,N-ジメチルホルムアミド(4 mL)に溶解し、LCAA-CPG (Chem Gene社製, 0.4882 g)を加え、室温にて終夜攪拌した。混合物を濾別し、ジクロロメタン、10%メタノールジクロロメタン溶液、およびジエチルエーテルで順次洗浄した後、無水酢酸/ピリジン溶液と作用させることにより、化合物C1（49.5 μmol/g, 収率89%）を得た。なお、収率は1%トリフルオロ酢酸/ジクロロメタン溶液を固相担持体に添加し、DMTr基に由来する吸収から計算できる固相担体への導入率より算出した。
参考例11
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000175
　化合物RE11-1（1.200 g, 3.640 mmol）から、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Journal of Medicinal Chemistry）, 第59巻, 2718-2733頁, 2016年に記載された方法で化合物RE11-2（1.050 g, 収率50%）を合成した。
ESI-MS m/z: 582 (M + H)+
参考例12
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000176
　化合物RE12-1（4.000g, 10.27 mmol）をジクロロメタン（60 mL）に溶解し、ベンジル-2-(2-ヒドロキシエトキシ)エチルカーバメイト（2.700 g, 11.30 mmol）、およびトリフルオロメタンスルホン酸（0.1360 mL, 1.541 mmol）を加えて、還流条件下で終夜攪拌した。反応液に10 wt% 炭酸カリウム水溶液を加え、ジクロロメタンと分液した後、有機相を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、2-メチルテトラヒドロフランへと置換濃縮した。残渣をへプタンに滴下し、得られた結晶をろ過することにより、化合物RE12-2（5.130 g, 収率88%）を得た。
ESI-MS m/z: 570 (M + H)+
参考例13
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000177
　化合物RE13-1（参考例1における化合物RE1-1, 898.0 mg, 2.007 mmol）をジクロロメタン（15 mL）に溶解し、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（338.0 mg, 2.208 mmol）、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（343 mg, 2.208 mmol）、およびN-1-Z-1, 3-ジアミノプロパン塩酸塩（0.4910 mL, 2.208 mmol）を加え、室温で3時間攪拌した。反応液に水を加え、ジクロロメタンで分液した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール=90/10）で精製することにより、化合物RE13-2（873.0 mg, 収率68%）を得た。
ESI-MS m/z: 639 (M + H)+
参考例14
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000178
参考例14工程1
　化合物RE14-1 (参考例1における化合物RE1-1, 3.00 g, 6.70 mmol)をジクロロメタン (60 mL)に溶解し、室温にてL-リジンベンジルエステル二p-トルエンスルホン酸塩 (1.75 g, 3.02 mmol)、トリエチルアミン(0.935 mL, 6.70 mmol), 1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (1.29 g, 6.70 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (103 mg, 0.670 mmol)を加えて2.5時間撹拌した。反応液を水と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製することにより、化合物RE14-2を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1096 (M + H)+
参考例14工程2
　化合物RE14-2 (2.30 g, 2.10 mmol)をテトラヒドロフラン (46 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 424 mg)を加え、水素雰囲気下で終夜撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE14-3を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1006 (M + H)+
参考例15
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000179
参考例15工程1
　イミノ二酢酸 (東京化成工業社製, 1.5 g, 6.43 mmol,)を塩化メチレン(30 mL)に溶解し、ペンタフルオロトリフルオロ酢酸(東京化成工業社製, 2.75 mL, 16.08 mmol)、トリエチルアミン(4.48 mL, 32.2 mmol)を加えて4時間撹拌した。反応液に10%クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。そこに、参考例11に記載の方法で合成した化合物RE15-1 (参考例11における化合物RE11-2, 2 g, 3.45 mmol)を酢酸エチル(10 mL)とアセトニトリル(10 mL)との混合液に溶解し、パラジウム/炭素による接触水素還元を行った。得られた溶液部分を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE15-2の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 1091(M+H)+
参考例15工程2
　化合物RE15-2 (1.5 g,1.37 mmol)を用い、参考例1化合物RE1-4の合成の工程2と同様の方法で化合物RE15-3を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 990(M+H)+
参考例16
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000180
参考例16工程1
　N-(t-ブトキシカルボニル)-L-グルタミン酸 (東京化成工業社製)を用いて、参考例11に記載の方法で合成した化合物RE16-1 (1.855 g, 3.19 mmol)を用い、参考例15の工程1と同様の方法で化合物RE16-2の粗精製物を得た。
ESI-MS m/z: 1105(M+H)+
参考例16工程2
　化合物RE16-2(1.421 g, 1.2866 mmol)を用い、参考例1化合物RE1-4の合成の工程2と同様の方法で化合物RE16-3を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1004(M+H)+
参考例17
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000181
　ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Journal of Organic Chemistry）, 第74巻, 6837-6842頁, 2009年に記載された方法で合成した化合物RE17-1 (90 mg, 0.173 mmol) をテトラヒドロフラン (1 mL) に溶解し、トリフェニルホスフィン、ポリマー担持 (シグマアルドリッチ社製, 63 mg, 0.189 mmol) を加えて、加熱環流下3時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE17-2 (70 mg, 収率82%)を得た。
ESI-MS m/z: 516 (M+Na)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ0.89 (3H, s), 1.42-1.48 (2H, m), 1.52-1.61 (2H, m), 1.85 (1H, br s), 2.68 (2H, t, J= 7.2 Hz), 3.06-3.07 (2H, m), 3.39-3.44 (3H, m), 3.51-3.55 (3H, m), 3.78 (6H, s), 6.80-6.85 (4H, m), 7.17-7.23 (1H, m), 7.27-7.33 (6H, m), 7.41-7.43 (2H, m).
参考例18
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000182
参考例18工程1
　化合物RE18-1 (東京化成工業社製, 0.500 g, 3.73 mmoL)を用いて参考例2の工程1と同様の方法で化合物RE18-2の粗生成物 (1.5 g) を得た。
ESI-MS m/z: 435 (M-H)-
参考例18工程2
　化合物RE18-2の粗生成物 (1.5 g) と1,4-Diaminobutane (東京化成工業社製, 3.29 g, 37.3 mmol)を用いて参考例3の工程3と同様の方法で化合物RE18-3 (0.18 g, 2 段階収率10%)を得た。
ESI-MS m/z: 551 (M+HCOO)-
1H-NMR (400 MHz, MeOD)：δ1.09 (3H, s), 1.45-1.52 (4H, m), 2.80 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.91 (2H, s), 3.05 (1H, d, J = 8.8 Hz), 3.12-3.16 (4H, m), 3.24 (1H, s), 3.43 (1H, d, J = 10.8 Hz), 3.62-3.66 (7H, m), 6.71-6.76 (4H, m), 7.05-7.11 (1H, m), 7.12-7.20 (6H, m), 7.28-7.32 (2H, m).
参考例19
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000183
　ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Journal of Organic Chemistry）, 第74巻, 6837-6842頁, 2009年に記載された方法で合成した化合物RE19-1 (110 mg, 0.212 mmol) をテトラヒドロフラン (2 mL) に溶解し、N-(1R,8S,9s)-Bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethyloxycarbonyl-1,8-diamino-3,6-dioxaoctane (東京化成工業社製, 72 mg, 0.222 mmol) を加えて、室温にて1時間撹拌した。反応液に水を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製することにより、化合物RE19-2 (160 mg, 収率90 %)を得た。ESI-MS m/z: 845 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ0.88 (3H, s), 0.91-1.09 (3H, m), 1.20-1.25 (1H, m), 1.52-1.59 (4H, m), 1.80-1.85 (2H, m), 2.19-2.25 (4H, m), 2.59-2.68 (1H, m), 2.84-2.90 (4H, m), 3.02-3.11 (3H, m), 3.35-3.44 (5H, m), 3.49-3.53 (5H, m), 3.54-3.58 (2H, m), 3.62 (5H, s), 3.78 (6H, s), 4.13 (2H, d, J = 6.4 Hz), 4.21 (2H, t, J = 7.2 Hz), 6.79-6.84 (4H, m), 7.18-7.21 (1H, m), 7.24-7.27 (2H, m), 7.28-7.32 (4H, m), 7.39-7.44 (2H, m).
参考例20
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000184
参考例20工程1
　化合物RE20-1 (AstaTech社製, 100 mg, 1.148 mmol)およびFmoc-Ser(tBuMe2Si)-OH (渡辺化学工業社製, 532 mg, 1.205 mmol)を用いて参考例3の工程3と同様の方法で化合物RE20-2 (410 mg, 収率70%)を得た。
ESI-MS m/z: 511 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ 0.06 (6H, s), 0.90 (9H, s), 2.76-2.85 (1H, m), 3.65-3.86 (5H, m), 4.02-4.23 (3H, m), 4.32-4.40 (4H, m), 5.55 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.31 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.40 (2H, t, J= 7.6 Hz), 7.59 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.76 (2H, d, J = 7.6 Hz).
参考例20工程2
　化合物RE20-2 (410 mg, 0.803 mmol)を用いて参考例2の工程1と同様の方法で化合物RE20-3の粗生成物(680 mg)を得た。
ESI-MS m/z: 814 (M+H)+
参考例20工程3
　化合物RE20-3の粗生成物 (680 mg)を用いて参考例2の工程5と同様の方法で化合物RE20-4 (330 mg, 2段階収率70％)を得た。
ESI-MS m/z: 519 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ0.02-0.09 (6H, m), 0.89 (9H, d, J = 28.8 Hz), 2.84-2.94 (1H, m), 3.24-3.30 (2H, m), 3.46 (1H, t, J = 7.2 Hz), 3.52-3.68 (2H, m), 3.75-3.80 (1H, m), 3.82 (6H, d, J= 2.4 Hz), 3.89-3.96 (1H, m), 4.05-4.17 (1H, m), 4.27-4.37 (1H, m), 6.82-6.89 (4H, m), 7.22-7.27 (1H, m), 7.29-7.34 (6H, m), 7.41-7.45 (2H, m)
参考例21
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000185
参考例21工程1
　N-(Tert-ブトキシカルボニル)-1,3-ジアミノプロパン（東京化成工業社製，1.788 g, 10.26 mmol）をジクロロメタン（22.8 mL）に溶解し、トリエチルアミン（1.907 mL, 13.68 mmol)を加え、室温で15分撹拌した。反応液に、オーガニックレター（Organic Letter）, 第16巻, 6318-6321頁, 2014年に記載された方法で合成した化合物RE21-1（1.126 g, 6.84 mmol）のジクロロメタン溶液（5 mL)を滴下し、室温で2時間撹拌した。反応液に水を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘプタン/酢酸エチル＝35/65）で精製することにより、化合物RE21-2（1.65 ｇ，収率80％）を得た。
ESI-MS m/z: 303 (M+H)+
参考例21工程2
　化合物RE21-2 (1.65 g, 5.46 mmol)を用いて参考例1化合物RE1-4の合成の工程2と同様の方法で化合物RE21-3 (1.10 g, 収率100%)を得た。
ESI-MS m/z: 203 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.74 (2H, dt, J = 12.0, 6.0 Hz), 2.95 (2H, t, J = 6.0 Hz), 3.18 (1H, s), 3.60 (2H, td, J= 6.0, 5.2 Hz), 7.54 (2H, dt, J = 8.4, 1.8 Hz), 7.76 (2H, dt, J = 8.4, 1.8 Hz), 7.97 (1H, br s).
参考例22
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000186
参考例22工程1
　化合物RE22-1 (東京化成社製, 1.2 g, 4.24mmol)を用いて参考例2の工程1と同様の方法で化合物RE22-2の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 608(M+Na)+
参考例22工程2
　化合物RE22-2の粗生成物を用いて参考例2の工程5もしくは実施例1の工程11に記載された方法で化合物R22-3 (1.34 g, 2段階収率52%) を得た。
ESI-MS m/z: 386(M+Na)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ3.34 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.47 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.79 (6H, s), 6.78-6.84 (4H, m), 7.17-7.21 (1H, m), 7.27-7.35 (6H, m), 7.42-7.46 (2H, m).
参考例22工程3
　化合物RE22-3 (1.15 g,3.16  mmol)およびFmoc-Ser(tBuMe2Si)-OH(渡辺化学工業社製, 1.677 g, 3.8  mmol)を用いて参考例3の工程3と同様の方法で化合物RE22-4 (560 mg, 収率31%)を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.00-0.07 (6H, m), 0.83-0.89 (9H, m), 3.18-3.26 (2H, m), 3.39-3.46 (2H, m), 3.61-3.68 (1H, m), 3.76 (6H, s), 3.89 (1H, dd, J= 10.0, 4.0 Hz), 4.03 (1H, dd, J = 10.0, 4.0 Hz), 4.15-4.20 (1H, m), 4.22-4.28 (1H, m), 4.32-4.40 (2H, m), 5.65-5.88 (1H, m), 6.76-6.85 (4H, m), 7.16-7.23 (1H, m), 7.25-7.34 (8H, m), 7.36-7.44 (4H, m), 7.50-7.64 (2H, m), 7.72-7.79 (2H, m).
参考例23
　第Y-1表に記載された化合物RE23-1～RE23-5およびFmoc-Ser(tBuMe2Si)-OHを用いて、参考例22と同様の方法により、第Y-2表に記載された化合物RE23-6～RE23-10を得た。
　参考例22の化合物RE22-3とFmoc-Thr(tBuMe2Si)-OHを用いて、参考例22と同様の方法により第Y-2表に記載した化合物RE23-11を得た。
　第Y-1表に記載された化合物RE23-1とFmoc-Thr(tBuMe2Si)-OHを用いて、参考例22と同様の方法により第Y-2表に記載した化合物RE23-12を得た。
　本実施例により合成した化合物のNMR分析データを第Y-3表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000187
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000188
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000189
参考例24
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000190
　参考例22に記載の方法で合成した化合物RE24-1 (参考例22における化合物RE22-4, 2.487 g, 3.16  mmol)を用いて参考例2工程2と同様の方法で化合物RE24-2を得た(1.2 g, 収率67%)。
ESI-MS m/z: 587(M+Na)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ-0.01-0.07 (6H, m), 0.86-0.90 (9H, m), 3.15-3.21 (2H, m), 3.41-3.48 (3H, m), 3.72 (1H, dd, J= 10.0, 6.4 Hz), 3.79 (6H, s), 3.84 (1H, dd, J = 10.0, 4.8 Hz), 6.79-6.84 (4H, m), 7.18-7.23 (1H, m), 7.27-7.33 (6H, m), 7.40-7.44 (2H, m), 7.72-7.75 (1H, br m).
参考例25
　第Y-2表に記載した化合物RE23-6～RE23-12を用いて参考例24と同様の方法により第Z-1表に記載した化合物RE25-1～RE25-7を得た。
　本実施例により合成した化合物の質量分析結果を第Z-2表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000191
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000192
参考例26
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000193
参考例26工程1
　化合物RE26-1 (2.00 g, 9.47 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (40 mL)に溶解し、室温にてイミノ二酢酸ジ-tert-ブチルエステル (5.11 g, 20.84 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (4.00 g, 20.84 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (145 mg, 0.947 mmol)を加えて2時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製した。さらにメタノールでスラリー精製することにより、化合物RE26-2 (4.07 g, 収率65 %)を得た。
ESI-MS m/z: 664 (M - H)-
参考例26工程2
　化合物RE26-2 (2.66 g, 4.00 mmol)をテトラヒドロフラン (53 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 490 mg)を加え、水素雰囲気下で3時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE26-3 (2.86 g, 収率113%)を得た。
ESI-MS m/z: 634 (M - H)-
参考例26工程3
　化合物RE26-3（871.0 mg, 1.370 mmol）をN, N’-ジメチルホルムアミド（17 mL）に溶解し、O-(7-アザベンゾトリアゾール-１-イン)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（625.0 mg, 1.644 mmol）、ジイソプロピルエチルアミン（0.5730 mL, 3.290 mmol）、およびドデカン二酸モノベンジルエステル（527.0 mg, 1.644 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へプタン/酢酸エチル=60/40）で精製することにより、化合物RE26-4（1.030 g, 収率80%）を得た。
ESI-MS m/z: 939 (M + H)+
参考例26工程4
　化合物RE26-4（1.030 g, 1.098 mmol）をジクロロメタン（10 mL）に溶解し、トリフルオロ酢酸（10.00 mL, 130.0 mmol）を加え、室温で1時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、化合物RE26-5の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 713 (M - H)-
参考例27
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000194
参考例27工程1
　化合物RE27-1（2.000 g, 12.98 mmol）をN, N’-ジメチルホルムアミド（30 mL）に溶解し、炭酸水素カリウム（1.559 g, 15.57 mmol）および塩化ベンジル（2.328 mL, 19.47 mmol）を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウムを加え、ジクロロメタンで抽出した後、有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へプタン/酢酸エチル=50/50）で精製することにより、化合物RE27-2（2.850 g, 収率90%）を得た。
ESI-MS m/z: 243 (M - H)-
参考例27工程2
　化合物RE27-2（2.500 g, 10.24 mmol）をN, N’-ジメチルホルムアミド（30 mL）に溶解し、炭酸カリウム（5.660 g, 40.90 mmol）およびtert-ブチルブロモ酢酸（3.300 mL, 22.52 mmol）を加え、90℃で4時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウムを加え、ジクロロメタンで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へプタン/酢酸エチル=75/25）で精製することにより、化合物RE27-3（4.300 g, 収率89%）を得た。
ESI-MS m/z: 472 (M - H)-
参考例27工程3
　化合物RE27-3（1.000 g, 2.116 mmol）をジクロロメタン（10 mL）に溶解し、トリフルオロ酢酸（10.00 mL, 130.0 mmol）を加え、室温で6時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、化合物RE27-4の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 359 (M - H)-
参考例27工程4
　化合物RE27-4（350.0 mg, 0.9710 mmol）をN, N’-ジメチルホルムアミド（7 mL）に溶解し、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（327.0 mg, 2.137 mmol）、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（410.0 mg, 2.137 mmol）、およびイミノジ酢酸ジ-tert-ブチルエステル（524.0 mg, 2.137 mmol）を加え、室温で5時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へプタン/酢酸エチル=60/40）で精製することにより、化合物RE27-5（617.0 mg, 収率78%）を得た。
ESI-MS m/z: 814 (M - H)-
参考例27工程5
　化合物RE27-5（610.0 mg, 0.7490 mmol）をジクロロメタン（6 mL）に溶解し、トリフルオロ酢酸（6 mL, 78.00 mmol）を加え、室温で1時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、化合物RE27-6の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 590 (M + H)+
参考例28
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000195
参考例28工程1
　参考例26に記載に方法で合成した化合物RE28-1 (参考例26における化合物RE26-3, 474 mg, 0.744 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にてジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー (Journal of Medicinal Chemistry), 第54巻, 2433-2446頁, 2011年に記載された方法で合成したtrans-シクロヘキサン-1,4-ジカルボン酸モノベンジルエステル (0.234 mg, 0.893 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.312 mL, 1.79 mmol)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート (339 mg, 0.893 mmol)を加えて6時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物RE28-2 (448 mg, 収率68 %)を得た。
ESI-MS m/z: 879 (M - H)-
参考例28工程2
　化合物RE28-2 (341 mg, 0.387 mmol)をジクロロメタン (3.4 mL)に溶解し、室温にてトリフルオロ酢酸 (3.4 mL)を加えて終夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチルで共沸し、ヘプタンでスラリー精製することにより、化合物RE28-3 (254 mg, 収率100%)を得た。
ESI-MS m/z: 656 (M + H)+
参考例29
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000196
参考例29工程1
　化合物RE29-1 (500 mg, 2.75 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にてイミノジ酢酸ジ-tert-ブチルエステル (1.48 g, 6.04 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (1.16 g, 6.04 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (42.0 mg, 0.275 mmol)を加えて4時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物RE29-2 (329 mg, 収率19 %)を得た。
ESI-MS m/z: 635 (M - H)-
参考例29工程2
　化合物RE29-2 (323 mg, 0.507 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (6v5 mL)に溶解し、室温にて炭酸カリウム (84.0 mg, 0.609 mmol)、ブロモ酢酸ベンジル (139 mg, 0.609 mmol)を加えて3時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物RE29-3 (313 mg, 収率79 %)を得た。
ESI-MS m/z: 783 (M - H)-
参考例29工程3
　化合物RE29-3 (312 mg, 0.398 mmol)をジクロロメタン (3.1 mL)に溶解し、室温にてトリフルオロ酢酸 (3.1 mL)を加えて終夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチルで共沸することにより、化合物RE29-4 (252 mg, 定量的)を得た。
ESI-MS m/z: 561 (M + H)+
参考例30
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000197
参考例30工程1
　化合物RE30-1 (2.00 g, 9.47 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (40 mL)に溶解し、室温にて2-アミノ-1,3-プロパンジオール (1.90 g, 20.84 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (4.00 g, 20.84 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (145 mg, 0.947 mmol)を加えて2時間撹拌した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル/メタノール=70/30)で精製した。さらに酢酸エチルでスラリー精製することにより、化合物RE30-2 (2.68 g, 収率79 %)を得た。
ESI-MS m/z: 356 (M - H)-
参考例30工程2
　化合物RE30-2 (500 mg, 1.40 mmol)をアセトニトリル (10 mL)に懸濁し、室温にてアクリル酸tert-ブチルエステル (3.59 g, 28.0 mmol)、ベンジルトリメチルアンモニウムヒドロキシド (40%水溶液; 1.76 mL, 702 mmol)を加えて終夜撹拌した。減圧下、溶媒を留去し、水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物RE30-3 (300 mg, 収率24 %)を得た。
ESI-MS m/z: 871 (M + H)+
参考例30工程3
　化合物RE30-3 (340 mg, 0391 mmol)をテトラヒドロフラン (6.8 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 31.3 mg)を加え、水素雰囲気下で6時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=30/70)で精製することにより、化合物RE30-4 (235 mg, 収率72 %)を得た。
ESI-MS m/z: 841 (M + H)+
参考例30工程4
　化合物RE30-4 (232 mg, 0.276 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (4.6 mL)に溶解し、室温にてドデカン酸モノベンジルエステル (0.133 mg, 0.414 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.145 mL, 0.829 mmol)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート (158 mg, 0.414 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=30/70)で精製することにより、化合物RE30-5 (274 mg, 収率87 %)を得た。
ESI-MS m/z: 1141 (M - H)-
参考例30工程5
　化合物RE30-5 (273 mg, 0.239 mmol)をジクロロメタン (2.7 mL)に溶解し、室温にてトリフルオロ酢酸 (2.7 mL)を加えて終夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチルで共沸することにより、化合物RE30-6 (231 mg, 定量的)を得た。
ESI-MS m/z: 919 (M + H)+
参考例31
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000198
参考例31工程1
　4-ニトロイソフタル酸RE31-1 (500 mg, 2.37 mmol)およびN-Boc-エチレンジアミン (808 mg, 5.21 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にてトリエチルアミン (0.90 mL, 7.11 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（703 mg, 5.21 mmol）および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（1.36 g, 7.11 mmol）を加えて16時間撹拌した。反応液を後処理し、粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、化合物RE31-2 (650 mg, 収率55 %)を得た。
参考例31工程2
　化合物RE31-2 (500 mg, 1.01 mmol)および亜鉛末 (330 mg, 5.05 mmol)をメタノール (3.5 mL)およびテトラヒドロフラン (3.5 mL)に懸濁し、0℃にて塩化アンモニウム (378 mg, 7.07 mmol)の水溶液を滴下し、室温にて24時間撹拌した。反応液を後処理し、粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、化合物RE31-3 (160 mg, 収率34 %)を得た。
参考例31工程3
　化合物RE31-3 (200 mg, 0.430 mmol)およびN-ベンジルオキシカルボニル-グリシン（ベンジルオキシカルボニルを、Cbzとも記載する。） (90.0 mg, 0.430 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (2.0 mL)に溶解し、室温にてジイソプロピルエチルアミン (0.220 mL, 1.29 mmol)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート (245 mg, 0.645 mmol)を加えて16時間撹拌した。反応液を後処理し、粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、化合物RE31-4 (180 mg, 収率64 %)を得た。
ESI-MS m/z: 657 (M + H)+
参考例32
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000199
参考例32工程1
　3,5-ジニトロ安息香酸RE32-1 (500 mg, 2.36 mmol)およびN-Cbz-エチレンジアミン (588 mg, 2.83 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (5.0 mL)に溶解し、室温にてトリエチルアミン (0.65 mL, 4.72 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（380 mg, 2.83 mmol）および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（675 mg, 3.54 mmol）を加えて16時間撹拌した。反応液を後処理し、粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、化合物RE32-2 (445 mg, 収率48 %)を得た。
参考例32工程2
　化合物RE32-2 (200 mg, 0.515 mmol)をエタノール (5.0 mL)に溶解し、室温にて塩化スズ(II) (584 mg, 3.09 mmol)および濃塩酸 (0.2 mL)を加え、80℃で16時間撹拌した。反応液を後処理し、化合物RE32-3 (180 mg,定量的)を得た。
ESI-MS m/z: 329 (M + H)+
参考例33
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000200
参考例33工程1
　参考例3に記載の方法で合成した化合物RE33-1 (参考例3における化合物RE3-2, 8.17 g, 23.12 mmol)を用いて参考例3の工程4と同様の方法で化合物RE33-2 (3.7 g, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 254(M+H)+
参考例33工程2
　化合物RE33-2 (3.7 g, 14.63 mmol)を用いて参考例3の工程5と同様の方法で化合物RE33-3 (3.82 g, 収率67%)を得た。
ESI-MS m/z: 432(M+HCOO)-
参考例33工程3
　化合物RE33-3 (3.82 g, 9.86 mmol)を用いて参考例1の工程2と同様の方法で化合物RE33-4(3.08 g, 収率87%)を得た。
ESI-MS m/z: 360(M+H)+
参考例34
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000201
参考例34工程1
　化合物RE34-1 (2g, 9.53mmol)とtert-ブトキシカルボニルアミノ)-1-ペンタノール (東京化成社製, 2g,10mmol)を用い、参考例3の工程1と同様の方法で化合物RE34-2 (2.40 g, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 296(M+H)+, 脱Boc体として検出
参考例34工程2
　化合物RE34-2を用いて、参考例3の工程2～4および参考例4の工程1～4と同様の方法で化合物RE34-3 (1.579g,収率21%)を得た。
ESI-MS m/z: 910 (M+H)+
参考例35:化合物D2の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000202
参考例35工程1
　参考例11に記載の方法で合成した化合物RE35-1 (参考例11における化合物RE11-2, 1.015 g, 1.748 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (12 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 187 mg)を加え、水素雰囲気下で6時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に参考例26で合成した化合物RE26-5（250.0 mg, 0.350 mmol）, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（26.80 mg, 0.1750 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（402.0 mg, 2.099 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール=87/13）で精製することにより、化合物RE35-2（617.0 mg, 収率88%）を得た。
ESI-MS m/z: 1215 (M + 2H) 2+
参考例35工程2
　化合物RE35-2 (0.7380 g, 0.3040 mmol)をテトラヒドロフラン (7 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 135.90 mg)を加え、水素雰囲気下で終夜撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール=87/13）で精製することにより、化合物D2（581 mg, 収率82%）を得た。
ESI-MS m/z: 1170 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.12-2.36 (106H, m), 2.91-3.19 (8H, m), 3.23-3.55 (14H, m), 3.60-3.76 (4H, m), 3.78-3.94 (8H, m), 3.95-4.10 (16H, m), 4.47 (4H, d, J = 8.8 Hz), 4.92-5.01 (4H, m), 5.17-5.24 (4H, m), 6.98 (1H, s), 7.64 (2H, s), 7.81-7.95 (4H, m), 8.28-8.38 (2H, m), 8.44-8.56 (2H, m), 10.13 (1H, s)
参考例36:化合物D3の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000203
参考例36工程1
　参考例12に記載の方法で合成した化合物RE36-1 (参考例12における化合物RE12-2, 500 mg, 0.879 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (6.5 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 94 mg)を加え、水素雰囲気下で4時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に参考例26における化合物RE26-5（126.0 mg, 0.176 mmol）, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（13.47 mg, 0.088 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（202.0 mg, 1.055 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル）で精製することにより、化合物RE36-2（249.7 mg, 収率60%）を得た。
ESI-MS m/z: 1191 (M + 2H) 2+
参考例36工程2
　化合物RE36-2 (0.242 g, 0.102 mmol)をテトラヒドロフラン (3.6 mL)および水（1.2 mL）に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 45 mg)を加え、水素雰囲気下で4時間攪拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物D3（216 mg, 収率93%）を得た。
ESI-MS m/z: 1146 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.15-1.65 (20H, m), 1.68-2.15 (52H, m), 3.13-3.29 (6H, m), 3.40-3.67 (16H, m), 3.71-3.96 (11H, m), 3.98-4.14 (16H, m), 4.55 (4H, t, J = 8.8 Hz), 4.93-5.06 (4H, m), 5.12-5.28 (4H, m), 6.56 (1H, s), 6.98 (1H. s), 7.64 (2H, s), 7.77-7.93 (4H, m), 8.26-8.49 (3H, m), 10.10 (1H, s)
参考例37:化合物D4の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000204
参考例37工程1
　参考例13に記載の方法で合成した化合物RE37-1 (参考例13における化合物RE13-2, 430 mg, 0.674 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (6 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 79 mg)を加え、水素雰囲気下で4時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に参考例26における化合物RE26-5（105.0 mg, 0.148 mmol）, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（11.31 mg, 0.074 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（170.0.0 mg, 0.887 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル）で精製することにより、化合物RE37-2（218.1 mg, 収率56%）を得た。
ESI-MS m/z: 1329 (M + 2H) 2+
参考例37工程2
　化合物RE37-2 (0.210 g, 0.079 mmol)をテトラヒドロフラン (3.1 mL)および水（1.0 mL）に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 39 mg)を加え、水素雰囲気下で4時間攪拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物D4 （192.7 mg, 収率95%）を得た。
ESI-MS m/z: 1284 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.17-1.65 (42H, m), 1.69-2.13 (61H, m), 2.95-3.17 (16H, m), 3.65-3.77 (3H, m), 3.79-3.94 (6H, m), 3.96-4.10 (16H, m), 4.48 (4H, d, J = 8.4 Hz), 4.96 (4H, dd, J = 2.4, 11.2 Hz), 5.21 (4H, d, J = 3.2 Hz), 7.01 (1H, s), 7.64-7.92 (11H, m), 8.26-8.48 (4H, m), 10.14 (1H, s)
参考例38：化合物D5の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000205
参考例38工程1
　参考例12に記載の方法で合成した化合物RE38-1 (参考例12における化合物RE12-2, 450 mg, 0.791 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (6 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 85 mg)を加え、水素雰囲気下で5時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に参考例27における化合物RE27-6（94 mg, 0.158 mmol）, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（133.0 mg, 0.871 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（182.0 mg, 0.950 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル）で精製することにより、化合物RE38-2（99 mg, 収率28%）を得た。
ESI-MS m/z: 1129 (M + 2H) 2+
参考例38工程2
　化合物RE38-2 (80 mg, 0.035 mmol)をテトラヒドロフラン (1.7 mL)および水（0.85 mL）に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 26 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物D5（57.5 mg, 収率75%）を得た。
ESI-MS m/z: 1084 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.69-2.21 (46H, m), 3.14-3.65 (28H, m), 3.67-4.22 (27H, m), 4.43-4.66 (4H, m), 4.69-4.88 (4H, m), 4.89-5.08 (4H, m), 5.12-5.32 (4H, m), 6.54-6.68 (1H, br), 7.01 (2H, s), 7.78-8.09 (3H, m), 8.13-8.31 (2H, m), 8.58-8.75 (2H, m)
参考例39：化合物D6の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000206
参考例39工程1
　参考例13に記載の方法で合成した化合物RE39-1 (参考例13における化合物RE13-2, 418 mg, 0.655 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (6 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 77 mg)を加え、水素雰囲気下で5時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に参考例27で合成した化合物RE27-6（85 mg, 0.144 mmol）, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（121.0 mg, 0.791 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（165.0 mg, 0.863 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル）で精製することにより、化合物RE39-2（99 mg, 収率28%）を得た。
ESI-MS m/z: 1268 (M + 2H) 2+
参考例39工程2
　化合物RE39-2 (186 mg, 0.073 mmol)をテトラヒドロフラン (2.8 mL)および水（0.93 mL）に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 40 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物D6（156.7 mg, 収率87%）を得た。
ESI-MS m/z: 1222 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.36-1.62 (27H, m), 1.67-2.17 (64H, m), 2.92-3.21 (15H, m), 3.58-3.77 (2H, m), 3.80-3.95 (7H, m), 3.97-4.13 (15H, m), 4.47 (4H, d, J = 8.8 Hz), 4.88-5.02 (7H, m), 5.10-5.24 (3H, m), 6.95-7.00 (1H, m), 7.26-7.31 (2H, m), 7.72-7.88 (8H, m), 8.10-8.20 (2H, m), 8.51-8.60 (2H, m)
参考例40
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000207
参考例40工程1
　参考例38に記載の方法で合成した化合物D5 (171 mg, 0.079 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (3.4 mL)に溶解し、グリシンベンジル p-トルエンスルホン酸塩（32.0 mg, 0.095 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（12.09 mg, 0.079 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（18.16 mg, 0.095 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル）で精製することにより、化合物RE40-2（55.7 mg, 収率31%）を得た。
ESI-MS m/z: 1158 (M + 2H) 2+
参考例40工程2
　化合物RE40-2 (54 mg, 0.023 mmol)をテトラヒドロフラン (0.83 mL)および水（0.28 mL）に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 18 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物RE40-3（50.1 mg, 収率97%）を得た。
ESI-MS m/z: 1112 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 0.96-1.06 (3H, m), 1.71-2.20 (54H, m), 3.41-3.64 (15H, m), 3.68-4.20 (32H), 4.55 (4H, d, J = 8.4 Hz), 4.81 (4H, s), 4.94-5.02 (4H, m), 5.17-5.25 (4H, m), 6.63-6.76 (2H, m), 6.93-7.02 (2H, m), 7.84-8.00 (3H, m), 8.17-8.30 (2H, m), 8.58-8.70 (2H, m)
参考例41:化合物D7の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000208
参考例41工程1
　化合物RE41-1 (500 mg, 0.861 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 92.1 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて参考例27で合成した化合物RE27-3 (113 mg, 0.172 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (198 mg, 1.03 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (13.2 mg, 0.086 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物RE41-2 (195 mg, 収率48%)を得た。
ESI-MS m/z: 1186 (M + 2H) 2+
参考例41工程2
　化合物RE41-2 (194 mg, 0.082 mmol)をテトラヒドロフラン (2.9 mg)および水 (1.0 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 35.7 mg)を加え、水素雰囲気下で8時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物D7（183 mg, 収率98%）を得た。
ESI-MS m/z: 1141 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.21-1.45 (m, 40H), 1.76-2.18 (m, 50H), 3.00-3.09 (m, 8H), 3.40-4.20 (m, 32H), 4.47 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 4.96 (dd, J = 3.1, 11.2 Hz, 4H), 5.21 (d, J = 3.1 Hz, 4H), 6.98 (s, 1H), 7.65 (s, 2H), 7.84 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 8.31 (brs, 1H), 8.44 (brs, 1H), 10.11 (s, 1H).
参考例42：化合物D8の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000209
参考例42工程1
　参考例11に記載の方法で合成した化合物RE42-1 (参考例11における化合物RE11-2, 500 mg, 0.861 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 92.1 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて参考例29で合成した化合物RE29-4 (97.0 mg, 0.172 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (198 mg, 1.03 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (13.2 mg, 0.086 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=85/15)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物RE42-2 (179 mg, 収率46%)を得た。
ESI-MS m/z: 1138 (M + 2H) 2+
参考例42工程2
　化合物RE42-2 (175 mg, 0.077 mmol)をテトラヒドロフラン (2.6 mg)および水 (0.9 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 32.4 mg)を加え、水素雰囲気下で1時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物D8（160 mg, 収率95%）を得た。
ESI-MS m/z: 1093 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.23-1.45 (m, 32H), 1.77 (s, 12H), 1.89 (s, 12H), 1.99 (s, 12H), 2.10 (s, 12H), 3.01-3.11 (m, 8H), 3.69-4.02 (m, 34H), 4.47-4.50 (m, 4H), 4.94-4.98 (m, 4H), 5.21 (d, J = 3.1 Hz, 4H), 6.92 (s, 1H), 6.94 (s, 2H), 7.87 (d, J = 9.4 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 8.33 (brs, 2H), 8.50 (brs, 2H).
参考例43:化合物D9の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000210
参考例43工程1
　参考例13に記載の方法で合成した化合物RE43-1 (参考例13における化合物RE13-2, 500 mg, 0.784 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 92.1 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて参考例30で合成した化合物RE30-6 (144 mg, 0.157 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (180 mg, 0.941 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (12.0 mg, 0.078 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=80/20)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物RE43-2 (191 mg, 収率43%)を得た。
ESI-MS m/z: 1431 (M + 2H) 2+
参考例43工程2
　化合物RE43-2 (186 mg, 0.065 mmol)をテトラヒドロフラン (2.8 mg)および水 (0.9 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 34.3 mg)を加え、水素雰囲気下で1時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物D9（174 mg, 収率97%）を得た。
ESI-MS m/z: 1386 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ):1.25-4.02 (m, 164H), 4.18-4.26 (m, 2H), 4.47 (d, J= 8.1 Hz, 4H), 4.96 (dd, J = 3.1, 11.2 Hz, 4H), 5.21 (d, J = 3.6 Hz, 4H), 7.74-7.91 (m, 13H), 8.18 (s, 2H), 8.36 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 10.27 (brs, 1H).
参考例44：化合物A2の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000211
参考例44工程1
　参考例31に記載の方法で合成した化合物RE44-1 (参考例31における化合物RE31-4, 150 mg, 0.228 mmol)をジクロロメタン (1.5 mL)に溶解し、室温にてトリフルオロ酢酸 (1.5 mL)を加えて4時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチルで共沸するした。残渣をN, N’-ジメチルホルムアミド (3 mL)に溶解し、室温にて参考例14の化合物RE14-3 (574 mg, 0.571 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (109 mg, 0.571 mmol)、トリエチルアミン (0.159 mL, 1.14 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物(3.50 mg, 0.023 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物RE44-2 (242 mg, 収率44%)を得た。
ESI-MS m/z: 1216 (M + 2H) 2+
参考例44工程2
　化合物RE44-2 (242 mg, 0.100 mmol)を テトラヒドロフラン/水 (4/1; 12 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 44.6 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて6-マレイミドヘキサン酸 (23.2 mg, 0.110 mmol)、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド (55.2 mg, 0.199 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をHP20レジン (アセトン/水)で精製することにより、化合物A2 (97.4 mg, 収率39%)を得た。
ESI-MS m/z: 1245 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ):1.14-2.16 (100H, m), 2.96-2.98 (4H, m), 3.24-3.41 (18H, m), 3.69-3.73 (4H, m), 3.83-3.91 (6H, m), 4.14-4.16 (2H, m), 4.47 (4H, d, J= 8.6 Hz), 4.96 (4H, dd, J = 3.6, 11.3 Hz), 5.21 (4H, d, J = 3.2 Hz), 7.01 (2H, s), 7.73-7.75 (2H, m), 7.83-7.94 (7H, m), 8.05-8.08 (2H, m), 8.14-8.20 (3H, m), 8.55-8.56 (2H, m), 10.24 (1H, brs).
参考例45：化合物A3の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000212
参考例45工程1
　参考例32に記載の方法で合成した化合物RE45-1 (参考例32における化合物RE32-3, 75.0 mg, 0.228 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (3.0 mL)に溶解し、室温にて参考例14の化合物RE14-3 (574 mg, 0.571 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.199 mL, 1.14 mmol)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート (217 mg, 0.571 mmol)を加えて終夜撹拌した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物RE45-2 (202 mg, 収率38%)を得た。
ESI-MS m/z: 1152 (M + 2H) 2+
参考例45工程2
　化合物RE45-2 (196 mg, 0.085 mmol)を テトラヒドロフラン/水 (4/1; 10 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 36.1 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて6-マレイミドヘキサン酸 (19.8 mg, 0.094 mmol)、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド (47.0 mg, 0.170 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をHP20レジン (アセトン/水)で精製することにより、化合物A3 (42.4 mg, 収率21%)を得た。
ESI-MS m/z: 1182 (M + 2H) 2+
参考例46:化合物D10
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000213
　参考例34に記載の方法で合成した化合物RE46-1（参考例34における化合物RE34-3）を用い、参考例10の工程1および2と同様の方法で化合物D10 (2.2 g, 収率58%)を得た。
ESI-MS m/z: 2437(M+H)+
参考例47：化合物A4の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000214
参考例47工程1
　参考例33に記載の方法で合成した化合物RE47-1 (参考例33における化合物RE33-4, 0.101 g, 0.282 mmol)を用いて、参考例15の化合物RE15-2 (0.607 g, 0.613 mmol)を用い、参考例3の工程3と同様の方法によって化合物RE47-2 (0.25 g, 収率39%)を得た。
ESI-MS m/z: 2304(M+H)+
参考例47工程2
　化合物RE47-2 (0.255 g, 0.111 mmol)を用いて、参考例3の工程2と同様の方法によって化合物RE47-3 (0.15 g, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 2170(M+H)+
参考例47工程3
　化合物RE47-3 (20.8 mg, 9.59 μmol)を用いて、参考例5の工程2と同様の方法によって化合物A4 (5.5 mg, 収率24%)を得た。
ESI-MS m/z: 1182(M+2H)2+
参考例48：化合物A5の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000215
参考例48工程1
　参考例33に記載の方法で合成した化合物RE48-1 (参考例33における化合物RE33-4, 0.099g, 0.277 mmol)を用いて、参考例16の工程2で合成した化合物RE16-3 (0.618 g, 0.615 mmol)を用い、参考例3の工程3と同様の方法によって化合物RE48-2 (0.343 g, 収率53%)を得た。
ESI-MS m/z: 2333(M+H)+
参考例48工程2
　化合物RE48-2を用いて、参考例10の工程1および2と同様の方法で化合物A5 (6.9 mg, 収率28%)を得た。
ESI-MS m/z: 2392(M+H)+
参考例49：化合物A6の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000216
　化合物RE49-1 (0.048 g, 0.021 mmol)と3-マレイミドプロピオン酸 N-スクシンイミジル (東京化成社製, 0.017 g, 0.064 mmol)を用いて参考例8の化合物A1の合成と同様の方法で化合物A6 (0.040 g, 収率78%)を得た。
ESI-MS m/z: 2480(M+HCOO)-
参考例50：化合物A7の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000217
工程131
　参考例10に記載の方法で合成した化合物D1 (23.6 mg, 9.46 μmol)とN-(2-アミノエチル)マレイミド トリフルオロ酢酸塩 (シグマアルドリッチ社製, 7.21 mg, 0.028 μmol)を用いて参考例3の工程3と同様の方法で化合物A7 (9.1 mg, 収率36%)を得た。
ESI-MS m/z: 1310(M+2H)2+
参考例51
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000218
参考例51工程1
　参考例7に記載の方法で合成した化合物RE51-1 (0.122 g, 0.054 mmol)と、バイオコンジュゲート・ケミストリー (Bioconjugate Chemistry), 第22巻, 690-699頁, 2011年に記載された方法と同様の方法を用いて合成したヘキサン酸モノベンジルエステルを用い、参考例4工程1と同様にして、化合物RE51-2 (0.076 g, 収率56%)を得た。
ESI-MS m/z: 2503(M+H)+
参考例51工程2
　化合物RE51-2 (0.076 g, 0.03 mmol)を用いて参考例3の工程1と同様の方法にて化合物RE51-3 (0.030 g, 収率40%)を得た。
ESI-MS m/z: 2412(M+H)+
参考例52
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000219
　参考例6に記載の方法で合成した化合物RE52-1 (参考例6における化合物RE6-5, 4.36 mg, 0.006 mmol)と参考例1の化合物RE1-4 (10 mg, 0.02 mmol) を用い、参考例3の工程7と同様の方法で化合物RE52-2 (7 mg, 収率65%)を得た。
ESI-MS m/z: 1581 (M - H)-
参考例53：化合物C2の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000220
参考例53工程1
　参考例46に記載の方法で合成した化合物D10 (0.2011 g, 0.079 mmol)を用いて、参考例10の工程3を用いて化合物RE53-1 (0.129 g, 収率55%)を得た。
ESI-MS m/z: 2972 (M+HCOO)-
参考例53工程2
　化合物RE53-1(0.129 g, 0.044 mmol)を用いて、参考例10の工程4を用いて化合物RE53-2の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 1535 (M+HCOOH-2H)2-
参考例53工程3
　化合物RE53-2 (0.0467 g, 0.013 mmol)を用いて、参考例10の工程5を用いて、化合物C2(19.4 μmol/g, 収率35%)を得た。
参考例54:化合物C3の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000221
参考例54工程1
　参考例10に記載の方法で合成した化合物D1 (100 mg, 0.040mmol) および参考例17の化合物RE17-2を用い、参考例10の工程3と同様の方法で化合物RE54-1 (90 mg, 収率76%) を得た。
ESI-MS m/z: 1335 (M-DMTr+2H)2+
参考例54工程2
　化合物RE54-1 (90 mg, 0.030 mmol) を用い、参考例10の工程4と同様の方法で化合物RE54-2の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1558 (M+HCOOH-2H)2-
参考例54工程3
　化合物RE54-2の粗生成物を用い、参考例10の工程5と同様の方法で化合物C3 (21.5 μmol/g, 2段階収率32%) を得た。
参考例55：化合物C4の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000222
参考例55工程1
　参考例46に記載の方法で合成した化合物D10 (100 mg, 0.039 mmol) および参考例17で合成した化合物RE17-2を用い、参考例10の工程3と同様の方法で化合物RE55-1 (90 mg, 収率76%) を得た。
ESI-MS m/z: 1356 (M+2H)2+　脱DMTr体として検出
参考例55工程2
　化合物RE55-1 (90 mg, 0.030 mmol) を用い、参考例10の工程4と同様の方法で化合物RE55-2の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1579 (M+HCOOH-2H)2-
参考例55工程3
　化合物RE55-2の粗生成物を用い、参考例10の工程5と同様の方法で化合物C4 (17.0 μmol/g, 2段階収率26%) を得た。
参考例56：化合物C5の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000223
参考例56工程1
　参考例46に記載の方法で合成した化合物D10 (100 mg, 0.039 mmol) および参考例18の工程2で合成した化合物RE18-3を用い、参考例10の工程3と同様の方法で化合物RE56-1 (50 mg, 収率42%) を得た。
ESI-MS m/z: 1363 (M+2H)2+　脱DMTr体として検出
参考例56工程2
　化合物RE56-1 (50 mg, 0.017 mmol) を用い、参考例10の工程4と同様の方法で化合物RE56-2の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1587 (M+HCOOH-2H)2-
参考例56工程3
　化合物RE56-2の粗生成物を用い、参考例10の工程5と同様の方法で化合物C5 (0.5 μmol/g, 2段階収率1%) を得た。
参考例57：化合物C6の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000224
参考例57工程1
　参考例46に記載の方法で合成した化合物D10 (100 mg, 0.039 mmol) および参考例19の化合物RE19-2を用い、参考例10の工程3と同様の方法で化合物RE57-1 (40 mg, 収率30%) を得た。
ESI-MS m/z: 1532 (M+2H)2+　脱DMTr体として検出
参考例57工程2
　化合物RE57-1(40 mg, 0.012 mmol)を用い、参考例10の工程4と同様の方法で化合物RE57-2の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1582 (M+2H)2+
　脱DMTr体として検出
参考例57工程3
　化合物RE57-2の粗生成物を用い、参考例10の工程5と同様の方法で化合物C6 (0.2 μmol/g, 2段階収率1%) を得た。
参考例58：化合物C7の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000225
参考例58工程1
　参考例10に記載の方法で合成したD1 (70 mg, 0.028 mmol) および参考例21の化合物RE21-3を用い、参考例10の工程3と同様の方法で化合物RE58-1 (58 mg, 収率77%) を得た。
ESI-MS m/z: 1341 (M+2H)2+
参考例58工程2
　化合物RE58-1 (58 mg, 0.022 mmol) をメタノール (0.15  mL) に溶解し、ジャーナルオブオーガニックケミストリー（Journal of Organic Chemistry）, 第74巻, 6837-6842頁, 2009年に記載された方法で合成した参考例17の化合物RE17-1 (16.9 mg, 0.032 mmol)、1 mol /L SODIUM L-ASCORBATE水溶液 (0.022 mL, 0.022 mmol)、20 mmol/L 硫酸銅(II)水溶液 (0.011 mL, 0.22 μmol)、及び10 mmol/L Tris(2-benzimidazolylmethyl)amine / DMSO溶液 (0.022 mL, 0.22μmol)を加え、室温にて3時間撹拌した。反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム／メタノール=80/20）にて精製し、化合物RE58-2 (7 mg, 収率10%) を得た。
ESI-MS m/z: 1450 (M+2H)2+　脱DMTr体として検出
参考例58工程3
　化合物RE58-2 (10 mg, 3.13 μmol) を用い、参考例10の工程4と同様の方法で化合物RE58-3の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1500 (M+2H)2+　脱DMTr体として検出
参考例58工程4
　化合物RE58-3の粗生成物を用い、参考例10の工程5と同様の方法で化合物C7 (8.4 μmol/g,収率27%) を得た。
参考例59
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000226
参考例59工程1
　参考例46に記載の方法で合成した化合物D10 (74.1 mg, 0.029 mmol)と参考例22の化合物RE22-2 (15 mg, 0.027 mmol)を用いて、参考例3の工程3と同様の方法、またはバイオコンジュゲートケミストリー, 第26巻,1451-1455頁, 2015年に記載の方法にて化合物RE59-1の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 1392(M +H)+, 脱DMTr体として検出
参考例59工程2
　化合物RE59-1 (0.083 g, 0.027 mmol)を用いて、国際公開公報2015105083号に記載の方法により化合物RE59-2の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 2669(M+H)+ , 脱DMTr体として検出
参考例59工程3
　化合物RE59-2 (0.08 g, 0.027 mmol)を用いて、参考例10の工程4と同様の方法で化合物RE59-3の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 1556(M+HOOH-2H)2-
1H-NMR (400 MHz, MeOD)：δ1.45-1.86 (48H, m), 1.93 (12H, s), 1.94 (12H, s), 2.02 (12H, s), 2.13 (12H, s), 2.16-2.28 (17H, m), 2.48 (4H, s), 3.10-3.16 (6H, m), 3.36-3.56 (19H, m), 3.77 (6H, s), 3.80-3.89 (6H, m), 3.98-4.35 (30H, m), 4.53-4.59 (4H, m), 4.66-4.72 (1H, m), 5.04-5.10 (4H, m), 5.31-5.36 (4H, m), 6.81-6.88 (4H, m), 7.17-7.23 (1H, m), 7.26-7.32 (6H, m), 7.38-7.44 (2H, m), 7.54 (2H, br s), 7.90 (1H, br s).
参考例60
　化合物D1、および第Z-1表記載の構造または参考例20の化合物RE20-4を用い、参考例59工程1および工程2と同様の方法にて、第P-1表および第P-2表に記載した化合物を得た。
　本実施例により合成した化合物の質量分析結果を第P-3表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000227
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000228
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000229
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000230
参考例61：化合物C8の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000231
　参考例59に記載の化合物RE59-3を用いて、参考例10の工程5と同様の方法で化合物C8 (10.0 μmol/g) を得た。
参考例62：C9～C17の合成
　第P-1表および第P-2表に記載した化合物を用いて、参考例61と同様の方法で第Q-1表および第Q-2表記載の化合物を得た。
　本実施例により合成した化合物の担持量を第Q-3表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000232
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000233
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000234
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000235
実施例１：化合物１－１および１－２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000236
工程１
　参考例化合物Ａ１と、モレキュールズ (Molecules), 第17巻, 13825-13843頁, 2012年に記載された方法で合成した末端チオール化されたオリゴヌクレオチドを加えて、室温にて4時間静置した。反応混合物に炭酸ナトリウムを加え、4℃で一晩静置した。陰イオン交換クロマトグラフィー (GE Healthcare, MonoQ 5/50GL, 10μm, 5.0 mm x 50 mm、A液： 10 mmol/L Tris緩衝液/30%アセトニトリル, B液: 10 mmol/L Tris緩衝液/30%アセトニトリル/1mol/L NaBrによるグラジエント)あるいは逆相液体クロマトグラフィー (ウォーターズ, X BridgeC18, 5μm, 4.6 mmx250 mm、0.1 mol/L酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液, B液:アセトニトリルによるグラジエント)のいずれかの方法で精製することにより化合物１－１を得た。
工程２
　工程１で合成した化合物１－１（3’-CFB-ssRNA）を、混合緩衝液（100 mmol/L酢酸カリウム、30 mmol/L 2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸、HEPES)-KOH(pH 7.4)、2 mmol/L酢酸マグネシウム）にて濃度調整（50 μmol/L）した。前述センス鎖とアンチセンス鎖（50 μmol/L）を各々等量混合し、80 ℃で10分間静置した。アンチセンス鎖配列は、第R-2表に記載されているとおりである。徐々に温度を下げ、37 ℃で1時間静置し、2本鎖の化合物１－２を得た。
実施例２～１１：化合物２－１～１１－１および化合物２－２～１１－２の合成
　実施例1とは塩基配列の異なるオリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様にして、化合物２－１～１１－１、および化合物２－２～１１－２を合成した。
実施例１２：化合物１２－１、および化合物１２－２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000237
工程1
　参考例化合物Ｄ5を用いて、モレキュールズ(Molecules)、第17巻、13825-13843頁、2012年に記載された方法で合成した末端がアミノ基で修飾されたオリゴヌクレオチドを加えて、バイオコンジュゲートケミストリー, 第22巻,1723-1728頁, 2011年もしくはバイオコンジュゲートケミストリー, 第26巻,1451-1455頁, 2015年に記載の方法にて反応させた。実施例1に記載した方法で精製することにより、化合物12-1を得た。
工程２
　実施例1の工程２と同様の方法にて、化合物12-2を得た。
　実施例１３～１５：化合物１３－１～１５－１、および化合物１３－２～１５－２の合成
　実施例1とは塩基配列の異なるオリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様にして、化合物１３－１～１５－１、および化合物13-2～15-2のを合成した。
　本実施例により合成した化合物のリガンド－リンカー構造を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000238
　本実施例により合成した核酸複合体の配列（センス鎖）および質量分析結果を第R-1表に示す。なお、第R-1表中、N(M)は2’-O-メチル修飾RNA、N(F)は2’-フッ素修飾RNA、および＾はホスホロチオエートを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000239
　本実施例により合成した核酸複合体の配列をR-2表に示す。なお、第R-2表中、N(M)は2’-O-メチル修飾RNA、N(F)は2’-フッ素修飾RNA、pは5’末端におけるリン酸化、および＾はホスホロチオエートを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000240
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000241
参考試験例1: ヒト細胞におけるCFB mRNAのノックダウン活性の測定
　96ウェルの培養プレートにヒト肝臓癌由来の細胞株であるHuh7細胞（国立研究開発法人　医薬基盤・健康・栄養研究所　JCRB細胞バンクより入手）を、10,000細胞/80μL/ウェルとなるよう播種した。培地は、10%ウシ胎仔血清(FBS)を含むDMEM培地(ライフテクノロジー社製、カタログ番号08458-16)を用いた。二本鎖核酸は、表１－１～表１－３に記載のものをジーンデザインにて合成して利用した。具体的には配列番号２～１２４に示すリボヌクレオチドからなるセンス鎖、配列番号１２５～２４７に示すリボヌクレオチドからなるアンチセンス鎖をアニーリングさせた二本鎖核酸で構成される（配列番号ｎ（ｎ＝２～１２４）に示すセンス鎖と配列番号［ｎ＋１２３］に示すアンチセンス鎖とが対をなす）。この表１－１～表１－３に記載の二本鎖核酸とRNAiMaxトランスフェクション試薬(ライフテクノロジー社製、カタログ番号:1401251)をOpti-MEM 培地(ライフテクノロジー社製、カタログ番号11058-021)で希釈して、二本鎖核酸の終濃度が1 nMあるいは0.1 nMとなるように20μLのsiRNA/RNAiMax混合液を各々96ウェルの培養プレートに添加し、37℃、5%CO2条件下で24時間培養した。その後、細胞をPBS（Phosphate buffered saline）で洗浄し、各々のプレートからSuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qPCRキット（東洋紡社製、カタログ番号: SCQ-101）を用いて製品に添付された説明書に記載された方法に従いcDNAを合成した。このcDNA 5μLをMicroAmpOptical 96ウェルプレート（アプライドバイオシステムズ社製、カタログ番号4326659）に加え、更に10μLのTaqMan Gene Expression Master Mix（アプライドバイオシステムズ社製、カタログ番号4369016）、3μLのUltraPure Distilled Water（ライフテクノロジーズ社製、カタログ番号:10977-015）、1μLのhumanCFBプローブ、1μLのhumanβ-actinプローブを添加した。QuantStudioTM 12K FlexリアルタイムPCRシステムを用いて、human CFB遺伝子およびhumanβ-actinのリアルタイムPCRをおこなった。β-actinは構成的発現遺伝子であり内部対照として測定し、CFB発現量を補正した。siRNAを添加せずにトランスフェクション試薬だけでHuh7細胞を処理した時のCFB mRNA量を1.0として、各二本鎖核酸を導入した時のCFB mRNA相対発現量を算出した。本実験を複数回おこない、CFB mRNA相対発現量の平均値を表１－１～表１－３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000242
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000243
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000244
　実施例1～10、および12～15で得られた各核酸複合体について、ヒト初代肝細胞におけるin vitroノックダウン活性を測定した。最終濃度が10または30 nmol/Lとなるように、オプティメム (Opti-MEM)(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号31985)で希釈した各核酸複合体を、96ウェルの培養プレートに、20 μLずつ分注した後、プレーティングメディウム (バイオプレディックインターナショナル社製、カタログ番号 LV0304-2)に懸濁させたヒト初代肝細胞(バイオプレディックインターナショナル社製、カタログ番号HEP187)を、細胞数10000 cells/80μL/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2条件下で6時間培養したのちに、培養上清を注意深く除去し、インキュベーションメディウム (バイオプレディックインターナショナル社製、カタログ番号LV0304-2)を添加して、各核酸複合体をヒト初代肝細胞に供した。また陰性対照の群として何も処理しない細胞を播種した。各核酸複合体を添加した細胞を37℃の5% CO2インキュベーター内で18時間培養し、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS)(ナカライテスク社製)で洗浄し、スーパープレップセルリシスアンドアールティーキットフォーキューピーシーアール(東洋紡社製、カタログ番号 SCQ-201)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収と、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製を行った。得られたcDNAを鋳型とし、タックマン (登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)をプローブとして、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、CFB遺伝子および構成的発現遺伝子であるグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素 (D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、以下gapdhと表す)遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、CFBのmRNAの準定量値を算出した。同様に測定した陰性対照におけるCFBのmRNAの準定量値を1として、CFBのmRNAの準定量値から、CFBのmRNAの発現率を求めた。得られたCFBのmRNAの発現率の結果を表S1に示す。
　表S1から明らかなように、各核酸複合体は、ヒト初代肝細胞に添加後のCFB遺伝子のmRNAの発現を抑制した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000245
試験例2　核酸複合体のマウス初代肝細胞に対するin vitroノックダウン試験
　実施例10、11、14、および15で得られた各核酸複合体について、マウス初代肝細胞におけるin vitroノックダウン活性を測定した。最終濃度が30, 10, 3または1 nmol/Lとなるように、オプティメム (Opti-MEM)(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号 31985)で希釈した各核酸複合体を、96ウェルの培養プレートに、20μLずつ分注した後、プライマリヘパトサイトゾウイングアンドプレーティングサプリメント (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements ) (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号CM3000)を含むウィリアムズイーメディウム (William’s E Medium) (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号A12176-01)に懸濁させたシーディーワン(CD-1)由来マウス初代肝細胞(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号MSCP10)を、細胞数10000cells/80μL/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2条件下で6時間培養したのちに、培養上清を注意深く除去し、プライマリヘパトサイトメンテナンスサプリメント （Primary Hepatocyte Maintenance Supplements）(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号 CM4000)を含むウィリアムズイーメディウムを添加して、各核酸複合体をマウス初代肝細胞に供した。また陰性対照の群として何も処理しない細胞を播種した。各核酸複合体を添加した細胞を37℃の5%CO2インキュベーター内で18時間培養し、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS)(ナカライテスク社製)で洗浄し、スーパープレップセルリシスアンドアールティーキットフォーキューピーシーアール(東洋紡社製、カタログ番号 SCQ-201)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収と、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製を行った。得られたcDNAを鋳型とし、タックマン (登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)をプローブとして 、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、CFB遺伝子および構成的発現遺伝子であるグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素 (D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、以下gapdhと表す)遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、CFBのmRNAの準定量値を算出した。同様に測定した陰性対照におけるCFBのmRNAの準定量値を1として、CFBのmRNAの準定量値から、CFBのmRNAの発現率を求めた。得られたCFBのmRNAの発現率を表S2に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000246
　表S2から明らかなように、各核酸複合体は、マウス初代肝細胞に添加後のCFB遺伝子のmRNAの発現を抑制した。
試験例3　核酸複合体のマウスにおけるin vivoノックダウン試験
　表S3の各核酸複合体について、それぞれ以下の方法によりマウスin vivoノックダウン試験を実施した。なお、各核酸複合体は、試験に合わせてリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS)(ナカライテスク社製)で希釈して用いた。マウス (BALB/cA、日本クレアより入手)を馴化飼育後、各核酸複合体を30mg/kg、10 mg/kg、3mg/kgまたは0.3mg/kgずつマウスに皮下注投与した。また、コントロール群としてはDPBSのみをマウスに皮下注投与した。投与から3日後に安楽死させ、肝臓を採取し液体窒素で凍結保存した。肝臓凍結サンプルをトリゾール(登録商標)アールエヌエーアイソレーションリージェンツ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号15596026)およびマグナピュア96 (MagNA Pure 96) (ロシュ・ライフサイエンス社製)を用い、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収を行った。さらにトランスクリプターファーストストランドシーディーエヌエーシンセシスキット (ロシュ・ライフサイエンス社製、カタログ番号 04897030001)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製を行った。得られたcDNAを鋳型とし、タックマン(登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)をプローブとして、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、CFB遺伝子およびgapdh遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、CFBのmRNAの準定量値を算出した。同様に測定したPBS投与群におけるCFBのmRNAの準定量値を1として、CFBのmRNAの発現率を求めた。得られたCFBのmRNAの発現率を表S3に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000247
　表中、N.T.は評価しなかったことを表す。
　表S3から明らかなように、本発明の核酸複合体をマウスに投与して、肝臓中のCFB遺伝子の発現を低下させることが明らかになった。
試験例4　核酸複合体のラット初代肝細胞に対するin vitroノックダウン試験
　表S4に示した各核酸複合体について、ラット初代肝細胞におけるin vitroノックダウン活性を測定した。
　最終濃度が30, 10, 3または1 nmol/Lとなるように、オプティメム(Opti-MEM)(サーモフィッシャーサイエンティフィック社、カタログ番号 31985)で希釈した各核酸複合体を、96ウェルの培養プレートに20μLずつ分注した後、プライマリヘパトサイトゾウイングアンドプレーティングサプリメント (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Suppl ements) (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号 CM3000)を含むウィリアムズイーメディウム (William’s E Medium) (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号 A12176-01)に懸濁させたラット初代肝細胞(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号：RTCP10)を、細胞数10000 cells/80μL/ ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2条件下で6時間培養したのちに、培養上清を注意深く除去し、プライマリヘパトサイトメンテナンスサプリメント （Primary Hepatocyte Maintenance Supplements）(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号 CM4000)を含むウィリアムズイーメディウムを添加して、各核酸複合体をラット初代肝細胞に供した。また陰性対照の群として何も処理しない細胞を播種した。各核酸複合体を添加した細胞を37℃の5%CO2インキュベーター内で18時間培養し、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS)(ナカライテスク社製)で洗浄し、スーパープレップセルリシスアンドアールティーキットフォーキューピーシーアール(東洋紡社製、カタログ番号 SCQ-201)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収と、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製を行った。得られたcDNAを鋳型とし、タックマン (登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)をプローブとして、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、CFB遺伝子および構成的発現遺伝子であるグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素 (D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、以下gapdhと表す)遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、CFBのmRNAの準定量値を算出した。同様に測定した陰性対照におけるCFBのmRNAの準定量値を1として、CFBのmRNAの発現率を求めた。得られたCFBのmRNAの発現率の結果を表S4に示す。
　表S4から明らかなように、各核酸複合体は、ラット初代肝細胞に添加後のCFB遺伝子のmRNAの発現を抑制した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000248
試験例5　核酸複合体のラットにおけるin vivo活性
　表S5の各核酸複合体について、それぞれ以下の方法によりラットin vivoノックダウン試験を実施した。なお、各核酸複合体は、試験に合わせてリン酸緩衝化生理食塩水 (DPBS)(ナカライテスク社製)で希釈して用いた。ラット (WKY、日本チャールズリバーより入手)を馴化飼育後、各核酸複合体を10 mg/kgずつラットに皮下注投与した。また、コントロール群としてはDPBSのみをラットに皮下注投与した。投与から3日後に安楽死させ、肝臓を採取し液体窒素で凍結保存した。肝臓凍結サンプルをトリゾール(登録商標)アールエヌエーアイソレーションリージェンツ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号15596026)およびマグナピュア96 (MagNA Pure 96) (ロシュ・ライフサイエンス社製)を用い、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収を行った。さらにトランスクリプターファーストストランドシーディーエヌエーシンセシスキット (ロシュ・ライフサイエンス社製、カタログ番号04897030001)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製を行った。得られたcDNAを鋳型とし、タックマン(登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)をプローブとして、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、CFB遺伝子およびgapdh遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、CFBのmRNA増幅量を内部対照として、CFBのmRNAの準定量値を算出した。同様に測定したPBS投与群におけるCFBのmRNAの準定量値を1として、CFBのmRNAの準定量値から、CFBのmRNAの発現率を求めた。得られたCFBのmRNAの発現率を表S5に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000249
　表S5から明らかなように、本発明の核酸複合体をラットに投与して、肝臓中のCFB遺伝子の発現を低下させることが明らかになった。
　本発明の核酸複合体は、哺乳動物に投与して、生体内において、CFB関連疾患を治療するために用いることができる。

Claims (26)

  1. 　下記式１で表される核酸複合体。
    式１：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式１中、
    　Ｘは、センス鎖およびアンチセンス鎖からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸であり、
    　　該二本鎖核酸は、該アンチセンス鎖中の、17個～30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、表1-1～表1-3に記載された標的CFB mRNA配列のいずれかと相補的であり、
    　　該センス鎖の3’末端または5’末端はＳ３に結合し、
    　Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドであり、
    　Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ独立して、リンカーである。）
  2. 　下記式２で表される構造を有する、請求項１に記載の核酸複合体。
    式２：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式２中、
    　Ｘ、Ｌ１、Ｌ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義であり、
    　Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５およびＰ６、ならびにＴ１およびＴ２は、それぞれ独立して、存在しないか、または、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、－Ｓ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＯ－Ｓ－もしくは－ＣＯ－ＮＨ－であり、
    　Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１～１２のアルキレンまたは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｎは０～９９の整数であり、
    　Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式２－１で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｐ２またはＰ３あるいはＰ５またはＰ６との結合点であり、ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４は、それぞれ独立して、０～１０の整数であり、
    式２－１：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　ｐ１およびｐ２は、それぞれ独立して、１、２または３の整数であり、
    　ｑ１、ｑ２、ｑ３およびｑ４は、それぞれ独立して、０～１０の整数であり、
    　ただし、ｐ１およびｐ２がそれぞれ２または３の整数であるとき、それぞれのＰ３およびＰ６、Ｑ２およびＱ４、Ｔ１およびＴ２ならびにＬ１およびＬ２は、同一または異なっていてもよく、ｑ１～ｑ４が２～１０のとき、それぞれの－［Ｐ２－Ｑ１］－，－［Ｑ２－Ｐ３］－，－［Ｐ５－Ｑ３］－，－［Ｑ４－Ｐ６］－の組み合わせは同一または異なっていてもよい。）
  3. 　Ｐ１およびＰ４が、それぞれ独立して、－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－または－Ｏ－である請求項２に記載の核酸複合体。
  4. 　－[Ｐ２－Ｑ１]ｑ１－および－[Ｐ５－Ｑ３]ｑ３－がそれぞれ独立して、存在しないか、または下記式３－１～式３－３で表されるいずれかの構造である、請求項２または３に記載の核酸複合体。
    式３－１：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     式３－２：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     式３－３：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （式３－１～式３－３中、
    　ｍ５およびｍ６は、それぞれ独立して、０～１０の整数であり、式３－１～式３－３の構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｂ１またはＢ２あるいはＰ１またはＰ４との結合点である。）
  5. 　下記式４－１～式４－９で表されるいずれかの構造を有する、請求項２～４のいずれか１項に記載の核酸複合体。
    式４－１：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     式４－２：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     式４－３：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     式４－４：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     式４－５：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     式４－６：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     式４－７：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     式４－８：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     式４－９：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     （式４－１～４－９中、
    　Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ３、Ｐ３、Ｐ６、Ｔ１、Ｔ２、Ｑ２、Ｑ４、ｑ２およびｑ４はそれぞれ前記と同義である。）
  6. 　下記式５で表される構造を有する、請求項１に記載の核酸複合体。
    式５：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
     （式５中、
    　Ｘ、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｑ１、Ｑ２、Ｂ１、Ｔ１、Ｌ１、p１、q１およびｑ２はそれぞれ前記と同義である。）
  7. 　Ｐ１が－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－または－Ｏ－である請求項６に記載の核酸複合体。
  8. 　下記式６－１～式６－９で表されるいずれかの構造を有する、請求項６または７に記載の核酸複合体。
    式６－１：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
     式６－２：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
     式６－３：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
     式６－４：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
     式６－５：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
     式６－６：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
     式６－７：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
     式６－８：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
     式６－９：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
     （式６－１～６－９中、
    　Ｘ、Ｓ３、Ｐ３、Ｑ２、Ｔ1、Ｌ１およびｑ２は、それぞれ前記と同義である。）
  9. 　下記式７－１～式７－９で表されるいずれかの構造を有する、請求項２～５のいずれか１項に記載の核酸複合体。
    式７－１：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
     式７－２：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
     式７－３：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
     式７－４：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
     式７－５：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
     式７－６：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
     式７－７：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
     式７－８：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
     式７－９：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
     （式７－１～７－９中、
    　Ｘ、Ｓ３、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ前記と同義である。）
  10. 　前記糖リガンドが、Ｎ－アセチルガラクトサミンである、請求項１～９のいずれか１項に記載の核酸複合体。
  11. 　前記二本鎖核酸が、修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の核酸複合体。
  12. 　センス鎖の3’末端およびアンチセンス鎖の5’末端は、平滑末端を形成する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の核酸複合体。
  13. 　前記二本鎖核酸が、糖部修飾ヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の核酸複合体。
  14. 　下記式７－８－１で表される構造を有する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の核酸複合体。
    式７－８－１：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
     （式７－８－１中、Ｘは前記と同義である。）
  15. 　Ｘが、表1-1～表1-3に記載のセンス鎖／アンチセンス鎖からなる群から選択される1対のセンス鎖／アンチセンス鎖である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の核酸複合体。
  16. 　Ｘが、表M1-1～表M1-3に記載のセンス鎖／アンチセンス鎖からなる群から選択される1対のセンス鎖／アンチセンス鎖である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の核酸複合体。
  17. 　Ｘが、表M1-4に記載のセンス鎖／アンチセンス鎖からなる群から選択される1対のセンス鎖／アンチセンス鎖である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の核酸複合体。
  18. 　Ｘが、表M1-4に記載のEB0125で表される1対のセンス鎖／アンチセンス鎖である、請求項１７に記載の核酸複合体。
  19. 　請求項１～１８のいずれか１項に記載の核酸複合体を含む、医薬組成物。
  20. 　細胞内に導入するための、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 　静脈内投与または皮下投与される、請求項１９または２０に記載の医薬組成物。
  22. 　請求項１～１８のいずれか１項に記載の核酸複合体または請求項１９～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療または予防方法。
  23. 　請求項１～１８のいずれか１項に記載の核酸複合体または請求項１９～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物を用いて二本鎖核酸を細胞内に導入することを含む、CFB遺伝子の発現を抑制する方法。
  24. 　請求項１～１８のいずれか１項に記載の核酸複合体または請求項１９～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、CFB関連疾患の治療方法。
  25. 　請求項１～１８のいずれか１項に記載の核酸複合体または請求項１９～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、CFB関連疾患の治療に用いるための医薬。
  26. 　請求項１～１８のいずれか１項に記載の核酸複合体または請求項１９～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、CFB関連疾患の治療剤。
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