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WO2018199530A2 - 대사체 분석을 이용한 베체트병의 진단방법 - Google Patents

대사체 분석을 이용한 베체트병의 진단방법 Download PDF

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WO2018199530A2
WO2018199530A2 PCT/KR2018/004417 KR2018004417W WO2018199530A2 WO 2018199530 A2 WO2018199530 A2 WO 2018199530A2 KR 2018004417 W KR2018004417 W KR 2018004417W WO 2018199530 A2 WO2018199530 A2 WO 2018199530A2
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WO
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behcet
disease
metabolite
acid
metabolites
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김경헌
차훈석
김정연
안중경
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Korea University Research and Business Foundation
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7095—Inflammation

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing Behcet's disease through metabolite analysis.
  • Behcet's disease is a systemic vasculitis of unknown cause, characterized by a variety of symptoms, including ulcers in the oral cavity, genitals and anus, uveitis, arthritis, gastrointestinal tract, invasion of vital organs such as blood vessels and the central nervous system). Behcet's disease is reported to have a high incidence from the Mediterranean coast to the Far East, particularly in Korea, China, Japan and Turkey.
  • Behcet's disease Clinical manifestations of Behcet's disease vary widely, ranging from mild symptoms such as repeated oral ulcers to the eye, gastrointestinal tract, blood vessels, and central nervous system, resulting in blindness, intestinal ulcers and perforations, hemoptysis due to aneurysms, deep vein thrombosis, unilateral paralysis, The same fatal sequelae can be left behind.
  • the various symptoms of Behcet's disease are those with the most severe disease activity in their 20s and 40s, and are expected to cause significant economic and social losses.
  • Behcet's disease has various clinical features and prognosis due to the involvement of various organs, and thus has difficulty in diagnosis and treatment. Therefore, it is very important to accurately diagnose Behcet's disease early in order to minimize the complications and disorders.
  • Behcet's disease is mainly dependent on clinical symptoms because there is no objective diagnostic biomarker that can distinguish patients with Behcet's disease.
  • Behcet's disease invades several organs due to genetic, environmental, and immunological abnormalities, resulting in various clinical symptoms.
  • a single known biomarker has low sensitivity and specificity. Therefore, accurate diagnosis is difficult due to various clinical symptoms and inaccuracies of existing biomarkers, and thus there is a problem that it takes a long time to confirm after the onset. To overcome this, it is very important to invent an objective diagnostic biomarker.
  • finding an objective diagnostic biomarker for diagnosing Behcet's disease can lead to early diagnosis of Behcet's disease, reduce the time it takes to confirm Behcet's disease, and provide appropriate treatment for the onset of the disease. It can be minimized. In addition, it is thought that better treatment results can be achieved by avoiding expensive and unnecessary treatments and by providing the patient with accurate information on the customized treatment and prognosis related to the disease.
  • metabolomix technology has been gaining a lot of attention for the discovery of biomarkers in rheumatoid arthritis, osteoarthritis, psoriatic arthritis, and systemic lupus erythematosus [Madsen RK et al.
  • the present inventors applied gas chromatography / time-of-flight mass spectrometry (GC / TOF MS) to find specific biomarkers in blood samples for rapid and convenient diagnosis of Behcet's disease.
  • GC / TOF MS gas chromatography / time-of-flight mass spectrometry
  • new biomarkers for the accurate diagnosis of Behcet's disease have been applied to the blood by applying metabolic techniques.
  • the present invention has been completed by discovering markers.
  • an object of the present invention is to provide a kit for diagnosing Behcet's disease through metabolite analysis.
  • Another object of the present invention is to provide a method for analyzing metabolite differentiation for diagnosing Behcet's disease.
  • the present invention is decanoic acid (fructose), fructose (fructose), tagatose (tagatose), oleic acid (oleic acid), linoleic acid (linoleic acid), L-cysteine (L-cysteine), sorbitol (sorbitol), Quantification of one or more blood metabolites selected from the group consisting of uridine, inosine, galactonate, glycolate, palmitic acid and histidine Provided is a diagnosis of Behcet's disease comprising a device.
  • the present invention is a method for detecting metabolite differentiation between blood from a normal control and Behcet's disease
  • the present invention has identified a biomarker capable of diagnosing Behcet's disease quickly and accurately through a metabolic approach to specifically discriminate patients with Behcet's disease.
  • GC / TOF MS was used to detect 104 metabolites by analyzing the metabolites in the blood of patients with Behcet's disease and the general public.
  • PLS-DA variable importance for projection (VIP) values, area under the curve (AUC) of receiver operating characteristic (ROC) curves, fold change, p-value, etc. Strong metabolite biomarkers were presented.
  • a Behcet's disease diagnostic panel using five biomarkers (decanoic acid, fructose, tagatose, oleic acid, linoleic acid) was made, and clinical validity was verified using an external validation set.
  • metabolism was used for blood analysis to identify a biomarker capable of specifically diagnosing Behcet's disease. This could be the basis for the study of the pathogenesis of Behcet's disease, which is not yet fully understood.
  • it can be applied to the development of therapeutics optimized for various clinical symptoms.
  • biomarkers which facilitate the diagnosis of Behcet's disease, enables the rapid and accurate diagnosis of Behcet's disease patients, greatly reducing the length of time required for clinical diagnosis, and providing customized treatments to quickly return to daily life.
  • the ripple effect is also expected to be significant.
  • FIG. 2 is a graph comparing the levels of significantly increased upper 9 metabolites (A) and significantly decreased upper 4 metabolites (B) in Behcet's disease [BD: Behcet's disease; HC: healthy control].
  • 3A to 3C show the metabolic differences between the steroid, colchicine, and azathioprine-administered and non-administered groups in patients with Behcet's disease as PLS-DA (the difference between QD and non-administered groups was very high. Low reproducibility and statistically no metabolic differences between groups].
  • a metabolic biomarker panel for diagnosing Behcet's disease using the top three metabolites (decanoic acid, fructose, tagatose) and significantly decreased top two metabolites (oleic acid, linoleic acid) in Behcet's disease.
  • It is a multivariate analysis model generated by PCA in order to make the model [When using one axis of PC1, the R2X value is appropriately classified as 0.721, and the Q2 value is 0.515 to confirm that the model is reproducible, BD: Behcet. Pain; HC: healthy control].
  • ROC receiver operating characteristic curve
  • 6 is an external sample verification result of the metabolic diagnostic panel for diagnosing Behcet's disease using a blood sample [9 Behcet's disease patients and 10 healthy controls of 10 Behcet's disease blood and 10 healthy controls in the principal component analysis Predictable, BD: Behcet's disease; HC: healthy control group.
  • the present invention is decanoic acid (fructose), fructose (fructose), tagatose (tagatose), oleic acid (oleic acid), linoleic acid (linoleic acid), L-cysteine (L-cysteine), sorbitol (sorbitol), Quantification of one or more blood metabolites selected from the group consisting of uridine, inosine, galactonate, glycolate, palmitic acid and histidine It relates to a Behcet's disease diagnostic kit comprising a device.
  • BD Behcet's disease
  • HC 35 healthy controls
  • PLS-DA partial least-matched analysis
  • PLS-DA analysis was performed by dividing the groups according to the drugs administered in Behcet's disease to confirm that the specific metabolite profile of Behcet's disease and the candidate biomarkers were not influenced by the drugs administered to treat Behcet's disease. As a result, it was confirmed that there was no metabolic difference according to the drugs administered in Behcet's disease.
  • metabolites selected as candidate biomarkers were selected to create a metabolic biomarker panel that distinguishes Behcet's disease, which consists of five metabolites.
  • Biomarker panels of five metabolites were validated using ROC curves to confirm the availability of diagnostic purposes for Behcet's disease. The sensitivity was 100%, specificity was 97.1%, and AUC value 0.993. Excellent results were shown.
  • the present invention consists of decanoic acid, fructose, tagatose, oleic acid and linoleic acid, which are indicator metabolites of Behcet's disease newly identified by the present inventors.
  • L-cysteine, sorbitol, uridine, inosine, galactonate, glycolate, palmitic acid in addition to one or more selected from the group
  • diagnosis refers to determining the susceptibility of an object to a particular disease or condition, determining whether an object currently has a particular disease or condition (eg, identifying Behcet's disease). ), Determining the prognosis of a subject with a particular disease or condition, or therametrics (eg, monitoring the condition of the subject to provide information about treatment efficacy).
  • the quantification device included in the diagnostic kit of the present invention may be a chromatography / mass spectrometer.
  • Chromatography used in the present invention is Gas Chromatography, Liquid-Solid Chromatography (LSC), Paper Chromatography (PC), Thin-Layer Chromatography (TLC) ), Gas-solid chromatography (GSC), liquid-liquid chromatography (Liquid-Liquid Chromatography, LLC), foam chromatography (Foam Chromatography (FC), emulsion chromatography (Emulsion Chromatography, EC), Gas-Liquid Chromatography (GLC), Ion Chromatography (IC), Gel Filtration Chromatograhy (GFC) or Gel Permeation Chromatography (GPC)
  • the chromatography used in the present invention is gas chromatography.
  • the mass spectrometer used in the present invention is MALDI-TOF MS or TOF MS, more preferably TOF MS.
  • each component is separated by gas chromatography, and the components are identified through elemental composition as well as accurate molecular weight information using information obtained through Q-TOF MS.
  • decanoic acid, fructose, fructose, tagatose, L-cysteine, sorbitol, uridine Increasing one or more concentrations selected from the group consisting of inosine, galactonate, and glycolate indicate Behcet's disease, oleic acid, linoleic acid, and palmitic acid. When one or more concentrations selected from the group consisting of (palmitic acid) and histidine (histidine) are reduced, Behcet's disease is indicated.
  • the term "increased blood metabolite concentration” means that the blood metabolite concentration of Behcet's disease patients is measurably increased as compared to a healthy normal person, and preferably means an increase of 70% or more, More preferably 30% or more.
  • the term "decreased blood metabolite concentration” means that the blood metabolite concentration of patients with Behcet's disease is measurably reduced compared to a healthy normal person, and preferably means a 40% or more decrease, More preferably 20% or more.
  • decanoic acid, fructose, fructose, tagatose, L-cysteine, sorbitol, uridine, inosine At least one selected from the group consisting of galactonate and glycolate exhibits significantly increased concentrations in patients with Behcet's disease compared to healthy normal subjects, oleic acid, linoleic acid, At least one selected from the group consisting of palmitic acid and histidine shows a significantly reduced concentration in patients with Behcet's disease compared to healthy normal persons (Table 1).
  • the present invention also provides a method for detecting metabolite differentiation between blood from normal control and Behcet's disease.
  • the present invention relates to a method for analyzing metabolite differentiation between blood obtained from Behcet's disease and a normal control group, which includes analyzing the metabolite biomarker from blood sequentially.
  • the method of analyzing metabolite differentiation between two biological sample groups of the present invention will be described in detail by taking a method of analyzing metabolite differentiation between Behcet's disease and a blood sample group obtained from a normal group.
  • blood samples taken from patients with settlement and Behcet's disease are extracted with 100% methanol and subjected to derivatization using known techniques for use in GC / TOF MS analysis.
  • the method for analyzing metabolites of blood using the GC / TOF MS is to analyze the blood extract with a GC / TOF MS instrument, convert the analysis result into a statistical value that can be processed, and then statistically two biological samples using the converted value This includes verifying the differentiation of the military.
  • Converting the results of GC / TOF MS analysis into statistical data can be done by dividing the total analysis time by the unit time interval and setting the largest value of the area or height of the chromatogram peaks displayed during the unit time as the representative value during the unit time. have.
  • GC / TOF MS analysis identified 104 metabolites that can be classified into amines, amino acids, fatty acids, organic acids, phosphates, sugars, etc., of which amino acids are the most Many were detected, followed by organic acids, fatty acids, sugars, amines, and phosphoric acids.
  • Each of the metabolites is normalized by dividing the strength of the metabolites from the GC / TOF MS analysis by the sum of the intensities of the total identified metabolites and subjected to PLS-DA analysis.
  • a V-plot consisting of the PLS-DA loading value and VIP value of the metabolite is prepared, a value of VIP value of 1.5 or more is selected as a metabolite biomarker candidate, and the increase or decrease of the loading value of PLS-DA is confirmed.
  • Positive loading values indicate an increasing tendency of metabolites and negative loading values indicate an increasing tendency of metabolites.
  • the intensity of the metabolites in the blood analyzed in GC / TOF MS can be used to confirm the increase or decrease of the metabolites.
  • a biomarker for diagnosing Behcet's disease decanoic acid, fructose, tagatose, oleic acid, linoleic acid ), L-cysteine, sorbitol, uridine, inosine, galactonate, glycolate, palmitic acid and histidine one or more selected from the group consisting of (histidine).
  • the dried sample was dried with a speed bag, and 5 ⁇ l of 40% (w / v) O-methylhydroxylamine hydrochloride in pyridine was added and reacted at 30 ° C. and 200 rpm for 90 minutes. 45 ⁇ l of N-methyl-N- (trimethylsilyl) trifluoroacetamide was added thereto, and the reaction was performed at 37 ° C. and 200 rpm for 30 minutes.
  • the column used in the analysis was an RTX-5Sil MS capillary column (30 m length, 0.25 mm film thickness, and 25 mm inner diameter), and the GC column temperature conditions were first maintained at 50 ° C for 5 minutes and then raised to 330 ° C. Hold for 1 minute. 1 ⁇ l of sample was injected by splitless method. Transfer line temperature and ion source temperature were maintained at 280 degrees and 250 degrees, respectively. 104 metabolites were identified by identifying and identifying in the library holding the GC / TOF MS results (Table 1).
  • Each metabolite was normalized by dividing the intensity of the metabolites from Example 1 by the sum of the intensities of the total identified metabolites. Thereafter, PLS-DA analysis was performed using SIMCA-P + (ver. 12.0).
  • Table 2 below is a result showing the VIP value and the loading value showing the degree and direction that the 104 metabolites used in the PLS-DA model of FIG. 1 affects the model.
  • VIP values, fold change, AUC, and p- value that influence the difference in metabolite profiling derived from Example 2 from each metabolite were determined.
  • a criterion with a VIP value of 1.5 or more, fold change 1.2, AUC 0.800 or more and a p-value of less than 0.01 was obtained for each metabolite and 13 metabolites were shown to be appropriate for the diagnosis of Behcet's disease (Table 3).
  • the absolute intensity of these metabolites was compared group by group (FIG. 2).
  • Table 3 shows VIP, AUC, fold change, p-value values of 13 metabolites selected as potential biomarkers for Behcet's disease diagnosis [BD, Behcet's disease patients; control, healthy control].
  • Metabolite VIP Fold AUC p value Metabolites with higher abundance in the BD group than in the control group decanoic acid 2.94 16.26 1.000 ⁇ 0.001 fructose 2.68 17.84 0.971 ⁇ 0.001 tagatose 2.27 154.92 0.989 ⁇ 0.0001 L-cysteine 1.99 1.58 0.912 ⁇ 0.0001 sorbitol 1.94 3.71 0.877 ⁇ 0.0001 uridine 1.78 2.33 0.856 ⁇ 0.0001 inosine 1.70 14.56 0.944 ⁇ 0.0001 galactonate 1.65 1.43 0.857 ⁇ 0.0001 glycolate 1.51 1.33 0.860 ⁇ 0.0001 Metabolites with higher abundance in the control group than in the BD group oleic acid 1.82 1.89 0.858 ⁇ 0.0001 linoleic acid 1.79 1.67 0.851 ⁇ 0.0001 palmitic acid 1.60 1.23 0.809 ⁇ 0.0001 histidine 1.60 1.36 0.805 ⁇ 0.0001
  • AUC area under the ROC curve
  • BD Behcet's disease
  • VIP variable importance on projection
  • Example 4 Pls - DA Verification of drug effect on increased metabolites in patients with Behcet's disease
  • each drug group vs.
  • the non-drug group was compared using PLS-DA and found to be inadequate isolation and not reproducible.
  • the three drug groups, steroid, colchicine, and azathioprine, respectively, showed no reproducible results, and the difference was not statistically significant.
  • the top three substances (decanoic acid, fructose, tagatose) specifically increased in Behcet's disease
  • the top two substances specifically reduced in Behcet's disease (oleic acid and linoleic acid) were selected to create a metabolic diagnostic panel for diagnosing Behcet's disease. Therefore, a multivariate classification model that can distinguish BD and HC based on five metabolites was generated based on principal component analysis.
  • Example 6 Diagnosis of Behcet's Disease Using Blood Specimens Metabolic Model verification through ROC and external sample verification of diagnostic panel
  • a receiver operating characteristic (ROC) curve was drawn using the PC1 score of each sample in the model.
  • the sensitivity was 100%
  • the specificity was 97.1%
  • the AUC value was 0.993, which showed that the model is very suitable for diagnosis of Behcet's disease (FIG. 5).
  • a total of 20 specimens of 10 patients with Behcet's disease and healthy controls were used.

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Abstract

본 발명은 대사체 분석을 이용한 베체트병 진단방법에 관한 것으로, 대사체학을 이용하여 베체트병을 효과적으로 진단할 수 있는 바이오마커를 제공하며, 이는 베체트병 치료제 개발에도 적용할 수 있다.

Description

대사체 분석을 이용한 베체트병의 진단방법
본 발명은 대사체 분석을 통해 베체트병을 진단하는 방법에 관한 것이다.
베체트병은 원인이 밝혀지지 않은 전신적인 혈관염으로, 구강, 성기 및 항문의 궤양, 포도막염, 관절염, 위장관, 혈관 및 중추 신경계 등의 중요 장기의 침범 등 다양한 증상을 특징으로 하는 질환이다). 베체트병은 지중해 연안부터 극동 아시아에 이르는 지역, 특히 한국, 중국, 일본 그리고 터키 지역에서 발병 빈도가 높은 것으로 보고되어 있다.
베체트병의 임상 양상은 매우 다양하며, 반복적인 구강 궤양과 같은 경미한 증상부터 안구, 위장관, 혈관 및 중추 신경계 등을 침범하여 실명, 장궤양 및 천공, 동맥류로 인한 객혈, 심부 정맥 혈전증, 편측 마비와 같은 치명적인 후유증을 남길 수 있다. 베체트병의 다양한 증상은 20대에서 40대에서 가장 심한 질병의 활성도를 보여서 경제적, 사회적 손실이 매우 클 것으로 예상되는 질병이다.
베체트병은 다양한 기관의 침범에 따른 다양한 임상 양상과 예후를 보이기에, 이에 따른 진단 및 치료에 상당한 어려움을 겪고 있다. 그러므로 베체트병으로 합병증과 장애를 최소화하기 위해 베체트병을 조기에 정확히 진단하는 것은 매우 중요하다.
이러한 베체트병의 진단은 베체트병 환자와 건강한 사람을 구분할 수 있는 객관적인 진단적 생체표지자가 없으므로, 주로 임상적인 증상에 의존하고 있다. 그러나 실제 베체트병은 유전적, 환경적, 면역학적 이상에 의해 여러 장기를 침범하여 다양한 임상 증상이 나타나게 되고, 이런 이유로 기존에 알려진 단일 생체표지자는 낮은 민감도 및 특이성을 보인다. 따라서 다양한 임상 증상과 기존의 생체표지자의 부정확성으로 인해 정확한 진단이 어려우므로, 발병 후 확진까지 오랜 시간이 걸리는 문제점이 있다. 이를 극복하기 위해서, 객관적인 진단적 생체표지자를 발명하는 것은 매우 중요하다.
따라서 베체트병을 진단할 수 있는 객관적인 진단적 생체표지자를 발굴하는 것은, 베체트병을 조기 진단하여, 베체트병 확진에 걸리는 시간을 줄이고 발병에 적절한 치료를 할 수 있게 하여 환자의 증상 악화로 인한 합병증을 최소화시킬 수 있다. 또한, 이는 고가의 불필요한 치료를 피하고 환자에게 맞춤형 치료, 그리고 질환과 관련한 예후에 관한 정확한 정보를 제공함으로써 더 좋은 치료 성적을 거둘 수 있을 것으로 생각된다. 최근 류마티스 관절염, 골관절염, 건선관절염, 전신홍반루푸스와 같은 류마티스 질환에서 생체표지자 발굴을 위해 메타볼로믹스 기술이 많은 각광을 받고 있다[Madsen RK et al. Diagnostic properties of metabolic perturbations in rheumatoid arthritis (2011) Arthritis Res Ther. 13(1):R19; Kapoor et al. Metabolic profiling predicts response to anti-tumor necrosis factor α therapy in patients with rheumatoid arthritis (2013) Arthritis Rheum 65:1448-65; Kim s et al. Global metabolite profiling of synovial fluid for the specific diagnosis of rheumatoid arthritis from other inflammatory arthritis. (2014) PLos one 9:e97501]
베체트병에서 생체표지자 발굴을 위해 현재까지 보고된 기술들은 주로 유전체학 또는 단백질체학적 접근이었지만, 그 결과가 뚜렷하지 못하거나 실제 베체트병 진단에 사용되기는 어려웠으며[Yuko et al. Proteomic surveillance of autoimmunity in Behcet's disease with uveitis: selenium binding protein is a novel autoantigen in Behcet's disease. (2007) Experimental Eye Research 84: 823-831; Seido et al. Proteomic surveillance of autoantigens in patients with Behcet's disease by a proteomic approach. (2010) Microbiol Immunol 54:354-361], 베체트병에서 대사체학을 이용한 진단 및 예후 예측에 적절한 생체표지자 발굴을 위한 연구는 보고된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 베체트병의 신속하고 편리한 진단을 위한 혈액 샘플 내에서 특이적인 생체표지자를 찾기 위해 GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry) 기법을 적용하여 검체 다양한 증상의 베체트병 환자들과 건강한 대조군들과 감별할 수 있는 혈액 내 대사물질들의 대사체 프로파일링 및 특이적 대사체들을 찾고자 연구 노력한 결과, 혈액에 대사체학적 기법을 적용하여 베체트병의 정확한 진단을 위한 새로운 생체표지자를 발굴함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 대사체 분석을 통해 베체트병을 진단하기 위한 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 베체트병을 진단하기 위한 대사체 차별성을 분석하는 방법을 제공하는데 목적이 있다.
본 발명은 데칸산(decanoic acid), 프룩토오스(fructose), 타가토오스(tagatose), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), L-시스테인(L-cysteine), 소르비톨(sorbitol), 우리딘(uridine), 이노신(inosine), 갈락토네이트(galactonate), 글라이콜레이트(glycolate), 팔미트산(palmitic acid) 및 히스티딘(histidine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 혈액 대사체에 대한 정량 장치를 포함하는 베체트병 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 정상 대조군과 베체트병에서 얻은 혈액 간의 대사체 차별성을 검출하는 방법으로,
(1) GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry)를 이용한 대사체 분석 단계;
(2) GC/TOF MS에서 동정된 대사체에 대해 부분최소자승판별분석(PLS-DA)를 이용하여 대사체 프로파일의 차이를 확인하는 단계;
(3) PLS-DA에서 도출된 대사체의 VIP(Variable Importance for Projection) 값이 1.5 이상인 값을 대사체 바이오마커 후보물질로 선정하고, PLS-DA의 로딩 값을 통해 대사체 바이오마커 후보물질의 증감 확인하는 단계;
(4) ROC 곡선(Receiver Operating Characteristic curve)을 이용하여 대사체 바이오마커를 검증하는 단계
를 순차적으로 적용하여, 혈액으로부터 대사체 바이오마커를 분석하는 것을 포함하는 정상 대조군과 베체트병에서 얻은 혈액 간의 대사체 차별성 분석 방법을 제공한다.
본 발명은 베체트병 환자를 특이적으로 감별 진단하기 위해 대사체학적 접근을 통하여 신속하고 정확하게 베체트병을 진단할 수 있는 생체표지자를 발굴하였다. GC/TOF MS를 이용하여 베체트병 환자와 일반인의 혈액 내 대사체 분석을 통해 104개의 대사체를 검출하였다. 부분최소제곱회귀법(PLS-DA)과 VIP(variable importance for projection) 값, ROC (Receiver operating characteristic) 곡선의 AUC(area under the curve)의 값, fold change, p-value 등을 산출하여 통해 13개의 강력한 대사물질 생체표지자를 제시하였다. 또한, 최종적으로 5개(decanoic acid, fructose, tagatose, oleic acid, linoleic acid)의 생체표지자를 이용한 베체트병 진단 panel을 만들었으며, 이를 외부 검체(validation set)을 이용하여 임상적 타당성을 검증하였다. 본 발명을 통하여 대사체학을 혈액 분석에 이용해 베체트병을 특이적으로 진단할 수 있는 생체표지자를 최초로 규명하였다. 이는 아직까지도 완전히 밝혀져 있지 않은 베체트병의 발병 기전을 밝히는 연구의 기반이 될 수 있다. 또한, 다양한 임상 증상에 최적화된 치료제 개발에도 응용될 수 있다. 베체트병의 진단을 용이하게 하는 생체표지자의 발견은 베체트병 환자를 신속하고 정확하게 진단하고, 임상적 진단에 걸리는 긴 시간을 크게 줄여서 맞춤형 치료를 빠르게 제공하여 일상생활로 복귀를 빠르게 하는 등의 사회 경제적 파급 효과도 상당할 것으로 기대된다.
도 1은 PLS-DA를 이용하여 베체트병 환자와 건강한 대조군의 혈액 내 대사체 프로파일링 차이를 나타낸 결과이다[베체트병 환자와 건강한 대조군의 대사체가 확연한 차이를 보여 구분됨. BD, 베체트병; HC, 건강한 대조군].
도 2는 베체트병에서 유의미하게 증가한 상위　9개 대사물질(A)과 유의미하게 감소한 상위　4개 대사물질(B)의 수준 비교　그래프이다[BD: 베체트병; HC: 건강한 대조군].
도 3a 내지 도 3c는 베체트병 환자 내 steroid, colchicine, azathioprine 투여 그룹과 비투여 그룹 간의 대사체적 차이를 PLS-DA로 나타낸 결과이다[각각의 약물투여 그룹과 비투여 그룹 간의 차이가 Q2 값이 매우 낮아 재현성이 없고, 통계학적으로 그룹 간의 대사체적 차이가 없음을 보임].
도 4는 베체트병에서 유의미하게 증가한 상위 3개 대사물질(decanoic acid, fructose, tagatose)과 유의미하게 감소한 상위 2개 대사물질(oleic acid, linoleic acid)을 이용해 베체트병을 진단하는 대사체적 생체표지자 panel을 만들기 위하여 PCA를 통해 생성한 다변량 분석 모델이다[PC1 하나의 축을 이용하였을 때, R2X 값이 0.721로 적절하게 구분됨을 보였으며, Q2값이 0.515로 모델이 재현성이 있음을 확인함, BD: 베체트병; HC: 건강한 대조군].
도 5는 혈액 검체를 이용한 베체트병 진단을 위한 대사체적 진단 panel의 ROC(receiver operating characteristic curve) 결과이다[5개의 대사체 조합을 이용한 생체표지자 panel이 베체트병의 진단에 있어 민감도 100%, 특이도 97.1%, AUC 0.993의 결과를 보임].
도 6은 혈액 샘플을 이용한 베체트병 진단을 위한 대사체적 진단 panel의 외부 검체 검증 결과이다[주성분 분석에서 10개의 베체트병 환자 혈액 및 10개의 건강한 대조군 중 9개의 베체트병 환자 및 10개의 건강한 대조군을 정확하게 예측할 수 있음을 보임, BD: 베체트병; HC: 건강한 대조군].
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 데칸산(decanoic acid), 프룩토오스(fructose), 타가토오스(tagatose), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), L-시스테인(L-cysteine), 소르비톨(sorbitol), 우리딘(uridine), 이노신(inosine), 갈락토네이트(galactonate), 글라이콜레이트(glycolate), 팔미트산(palmitic acid) 및 히스티딘(histidine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 혈액 대사체에 대한 정량 장치를 포함하는 베체트병 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명자들은 베체트병의 바이오마커를 찾기 위해 환자들의 혈액으로부터 샘플을 채취하여 메탄올 추출하고 GC/TOF MS를 이용하여 베체트병 환자들과 정상인들의 대사체 프로파일 차이를 비교 분석하고, 이 차이를 이용하여 베체트병 환자들을 진단할 수 있는 바이오마커 발굴 연구를 수행하였다.
그 결과, 아민류, 아미노산류, 지방산류, 유기산류, 인산류, 당류 등으로 구분할 수 있는 104종의 대사체를 동정하였다. 이 중 아미노산류가 가장 많이 검출되었으며, 그 다음으로 유기산류, 지방산류, 당류, 아민류, 인산류 등의 순서로 검출되었다.
35명의 베체트병 환자(BD)와 35명의 건강한 대조군(HC)의 혈액을 비교하였을 때, 부분최소자승판별분석(PLS-DA)을 통해 베체트병 환자들과 건강한 대조군의 혈액 내 대사체 프로파일의 명확한 차이를 확인하였으며, 각각의 대사물질에 대해, VIP 값이 1.5, fold change 1.2, AUC 0.800 이상, p-values 0.01 미만을 기준으로 선정하고 13종의 대사체를 신규 바이오마커 후보 물질로 선정하였다. 각각의 대사물질은 베체트병과 건강한 대조군에서 통계적으로 확연한 차이를 보여, 적절한 후보 생체표지자임을 확인하였다. 또한, 베체트병의 특이적 대사체 프로파일과 후보 생체표지자가 베체트병 치료를 위해 투여한 약물에 의한 영향이 아니라는 것을 확인하기 위해 베체트병에서 투여한 약물에 따라 그룹을 나누어 PLS-DA 분석을 시행하였다, 그 결과 베체트병에서 투여한 약물에 따른 대사체적 차이가 없음을 확인하였다.
또한, 후보 생체표지자로 선정된 13개의 대사물질 중 베체트병 환자의 혈액에서 유의미하게 증가한 대사물질 3개(decanoic acid, fructose, tagatose)와, 베체트병 환자의 혈액에서 유의미하게 감소한 대사물질 2개(oleic acid, linoleic acid)를 선정하여, 5개의 대사물질로 구성된 베체트병을 감별하는 대사체적 생체표지자 panel을 생성하였다. 5개 대사체의 생체표지자 panel이 베체트병의 진단적 목적의 이용 가능성을 확인하기 위해 ROC curve를 이용하여 검증하였으며, sensitivity가 100%, specificity가 97.1%, AUC 값 0.993으로 베체트병을 진단하는데 매우 우수한 결과를 보였다. 또한 이 모델의 적정성을 확인하기 위해 다시 외부에서 받은 10개의 베체트병 환자와 10개의 건강한 대조군의 혈액을 이용하여 주성분 분석을 시행하였다. 그 결과 우리가 발견한 5개의 대사물질을 이용한 생체표지자 panel이 베체트병 진단에 적절함을 검증할 수 있었다.
나아가, 본 발명자들에 의하여 새롭게 규명된 베체트병의 지표 대사체인 데칸산(decanoic acid), 프룩토오스(fructose), 타가토오스(tagatose), 올레산(oleic acid) 및 리놀레산(linoleic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 외에도 L-시스테인(L-cysteine), 소르비톨(sorbitol), 우리딘(uridine), 이노신(inosine), 갈락토네이트(galactonate), 글라이콜레이트(glycolate), 팔미트산(palmitic acid) 및 히스티딘(histidine)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 대한 정량정보를 추가적으로 포함함으로써 보다 일관성 있고 신뢰도 높은 정확한 베체트병의 진단이 가능하다.
본 명세서에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것(예컨대, 베체트병 의 동정), 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본 발명의 진단 키트에 포함된 정량 장치는 크로마토그래피/질량분석기일 수 있다.
본 발명에서 이용되는 크로마토그래피는 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography), 액체-고체 크로마토그래피(Liquid-Solid Chromatography, LSC), 종이 크로마토그래피(Paper Chromatography, PC), 박층 크로마토그래피(Thin-Layer Chromatography, TLC), 기체-고체 크로마토그래피(Gas-Solid Chromatography, GSC), 액체-액체 크로마토그래피(Liquid-Liquid Chromatography, LLC), 포말 크로마토그래피(Foam Chromatography, FC), 유화 크로마토그래피(Emulsion Chromatography, EC), 기체-액체 크로마토그래피(Gas-Liquid Chromatography, GLC), 이온 크로마토그래피(Ion Chromatography, IC), 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatograhy, GFC) 또는 겔 투과 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography, GPC)를 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 모든 정량용 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 크로마토그래피는 가스 크로마토그래피이다. 더불어 본 발명에서 이용되는 질량분석기는 MALDI-TOF MS 또는 TOF MS이고, 보다 바람직하게는 TOF MS이다.
본 발명의 혈액 대사체는 가스 크로마토그래피에서 각 성분들이 분리되며, Q-TOF MS를 거쳐 얻어진 정보를 이용하여 정확한 분자량 정보뿐만 아니라 구조 정보(elemental composition)를 통해 구성 성분을 확인한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 데칸산(decanoic acid), 프룩토오스(fructose), 타가토오스(tagatose), L-시스테인(L-cysteine), 소르비톨(sorbitol), 우리딘(uridine), 이노신(inosine), 갈락토네이트(galactonate) 및 글라이콜레이트(glycolate)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 농도가 증가되는 경우, 베체트병을 나타내고 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 팔미트산(palmitic acid) 및 히스티딘(histidine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 농도가 감소되는 경우, 베체트병을 나타낸다.
본 명세서에서, 용어 "혈액 대사체 농도의 증가"는 건강한 정상인에 비해 베체트병 환자의 혈액 대사체 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 증가된 것을 의미하며, 바람직하게는 70% 이상 증가된 것을 의미하고, 보다 바람직하게는 30% 이상 증가된 것을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "혈액 대사체 농도의 감소"는 건강한 정상인에 비해 베체트병 환자의 혈액 대사체 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 감소된 것을 의미하며, 바람직하게는 40% 이상 감소된 것을 의미하고, 보다 바람직하게는 20% 이상 감소된 것을 의미한다.
본 발명에 따르면, 데칸산(decanoic acid), 프룩토오스(fructose), 타가토오스(tagatose), L-시스테인(L-cysteine), 소르비톨(sorbitol), 우리딘(uridine), 이노신(inosine), 갈락토네이트(galactonate) 및 글라이콜레이트(glycolate)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상은 건강한 정상인에 비해 베체트병 환자에서 유의하게 증가된 농도를 나타내고, 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 팔미트산(palmitic acid) 및 히스티딘(histidine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상은 건강한 정상인에 비해 베체트병 환자에서 유의하게 감소된 농도를 나타낸다(표 1).
본 발명은 또한 정상 대조군과 베체트병에서 얻은 혈액 간의 대사체 차별성을 검출하는 방법으로,
(1) GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry)를 이용한 대사체 분석 단계;
(2) GC/TOF MS에서 동정된 대사체에 대해 부분최소자승판별분석(PLS-DA)를 이용하여 대사체 프로파일의 차이를 확인하는 단계;
(3) PLS-DA에서 도출된 대사체의 VIP(Variable Importance for Projection) 값이 1.5 이상인 값을 대사체 바이오마커 후보물질로 선정하고, PLS-DA의 로딩 값을 통해 대사체 바이오마커 후보물질의 증감 확인하는 단계;
(4) ROC 곡선(Receiver Operating Characteristic curve)을 이용하여 대사체 바이오마커를 검증하는 단계
를 순차적으로 적용하여, 혈액으로부터 대사체 바이오마커를 분석하는 것을 포함하는 정상 대조군과 베체트병에서 얻은 혈액 간의 대사체 차별성 분석 방법에 관한 것이다.
본 발명의 두 생체시료군 간의 대사체 차별성 분석 방법은 베체트병과 정상군에서 얻은 혈액 시료군 간의 대사체 차별성을 분석하는 방법을 예로 들어 구체적으로 설명한다.
우선, 정산인과 베체트병 환자에서 채취한 혈액 샘플을 100% 메탄올로 추출한 후 GC/TOF MS 분석에 사용할 수 있도록 공지 기술을 이용하여 유도체화 과정을 거친다.
상기 GC/TOF MS를 이용한 혈액의 대사체 분석 방법은 혈액 추출물을 GC/TOF MS 기기로 분석하고, 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환한 다음, 변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 두 생체시료군의 차별성을 검증하는 것을 포함한다.
GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 것은 총 분석시간을 단위시간 간격으로 나누어 단위시간 동안 나타난 크로마토그램 피크의 면적 또는 높이 중 가장 큰 수치를 단위시간 동안의 대표값으로 정하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, GC/TOF MS 분석 결과 아민류, 아미노산류, 지방산류, 유기산류, 인산류, 당류 등으로 구분할 수 있는 104종의 대사체를 동정하였고, 이 중 아미노산류가 가장 많이 검출 되었으며, 그 다음으로 유기산류, 지방산류, 당류, 아민류, 인산류 등의 순서로 검출되었다.
상기 GC/TOF MS 분석 결과 나온 대사체의 강도를 총 동정된 대사체의 강도 합으로 나누어 각 대사체를 표준화하고, PLS-DA 분석을 실시한다.
대사체의 PLS-DA 로딩 값과 VIP 값으로 구성된 V-plot를 작성하고, VIP 값이 1.5 이상인 값을 대사체 바이오마커 후보물질로 선정하고, PLS-DA의 로딩 값의 증감을 확인하며, 이때 로딩 값이 양수인 것은 대사체의 증가 경향을, 로딩 값이 음수인 것은 대사체의 감소 경향을 나타내는 것이다.
GC/TOF MS에서 분석된 혈액의 대사체의 강도를 이용하여 대사체의 증감을 확인할 수 있다.
ROC 곡선을 통해 상기 대사체 바이오마커를 검증한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 베체트병을 진단하기 위한 바이오마커로, 데칸산(decanoic acid), 프룩토오스(fructose), 타가토오스(tagatose), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), L-시스테인(L-cysteine), 소르비톨(sorbitol), 우리딘(uridine), 이노신(inosine), 갈락토네이트(galactonate), 글라이콜레이트(glycolate), 팔미트산(palmitic acid) 및 히스티딘(histidine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 정상군과 베체트병에서 얻은 혈액 시료군 간의 대사체 차별성 분석 방법을 통해 보다 일관성 있고 신뢰도 높은 정확한 베체트병을 진단할 수 있고, 이를 치료제 개발에 적용할 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: GC/TOF MS를 이용한 대사체 동정
베체트병 환자 및 건강한 대조군 각각의 혈액 20 ㎕에 순수 메탄올 980 ㎕을 섞고 원심분리하여 대사체를 추출하였다.
GC/TOF MS 분석을 위한 유도체화 과정은 다음과 같다.
추출한 샘플을 스피드 백으로 건조시킨 후에 5 ㎕의 40%(w/v) 농도의 O-methylhydroxylamine hydrochloride in pyridine을 넣고 30도 200 rpm에서 90분간 반응을 시켰다. 그리고 45 ㎕의 N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide를 넣고 37도 200 rpm에서 30분간 반응을 실시하였다.
GC/TOF MS 분석을 위한 기기 조건은 다음과 같다.
분석할 때 사용한 컬럼은 RTX-5Sil MS capillary column (30 m length, 0.25 mm film thickness, and 25 mm inner diameter)이며, GC 컬럼 온도 조건은 먼저 50도에서 5분간 유지시킨 후 330도까지 승온시킨 다음 1분간 유지하였다. 1 ㎕의 샘플을 비분할법(splitless)으로 주입(injection)하였다. Transfer line 온도와 Ion source 온도는 각각 280도, 250도로 유지시켰다. GC/TOF MS 결과를 보유하고 있는 라이브러리에서 찾아 동정하여, 104개의 대사체를 동정하였다(표 1).
하기 표 1(베체트병 환자와 건강한 대조군의 혈액 검체를 이용하여 대사체 분석 결과 확인된 104개 대사체)에서와 같이, 각각의 대사체군별로 분류하였을 때. 아미노산 26%, 유기산 19%, 지방산 17%, 당 15%, 아민 11%, 인 5%, 기타 7%로 나타났다.
Identified metabolites
Amines
2-hydroxypyridine 3-hydroxypyridine adenosine
inosine methylamine O-phosphorylethanolamine
spermidine thymine uric acid
uridine xanthine
Amino acids
alanine asparagine asparagine dehydrated
cyano-L-alanine glutamate glutamine
glycine histidine isoleucine
isothreonate L-citrulline L-cysteine
leucine L-homoserine lysine
methionine N-methylalanine ornithine
oxoproline phenylalanine proline
serine threonine tryptophan
tyrosine valine β-alanine
Fatty acids
1-monopalmitin arachidic acid arachidonic acid
decanoic acid heptadecanoic acid lauric acid
lignoceric acid linoleic acid linolenic acid
methyl palmitoleate myristic acid octadecanol
oleic acid palmitic acid palmitoleic acid
pelargonic acid pentadecanoic acid stearic acid
Organic acids
2-hydroxyhexanoate 2-hydroxyvalerate 2-ketoisocaproic acid
adipate benzoate citrate
fumarate galactonate galacturonate
glycerate glycolate isocitrate
lactate malate oxalate
pyrrole-2-carboxylate pyruvate succinate
terephthalate α-ketoglutarate
Sugars and sugar alcohols
1,5-anhydroglucitol arabitol fructose
fucose galactose glucose
glycerol lyxose mannitol
mannose myo-inositol sorbitol
sucrose tagatose threitol
threose
Phosphates
glucose-6-phosphate glycerol-1-phosphate mannose-6-phosphate
phosphate phosphogluconate
Others
indole-3-lactate salicylaldehyde squalene
taurine uracil urea
α-tocopherol
실시예 2: PLS - DA를 이용한 베체트병 환자와 건강한 대조군의 혈액 내 대사체 프로파일 차이
실시예 1로부터 나온 대사체의 강도(intensity)를 총 동정된 대사체의 강도 합으로 나누어 각 대사체를 표준화하였다. 그 후 SIMCA-P+ (ver. 12.0)를 이용하여 PLS-DA 분석을 실시하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 베체트병 환자와 건강한 대조군의 혈액 내 대사체 프로파일링이 명확하게 차이가 나는 것을 확인하였다.
하기 표 2는 도 1의 PLS-DA 모델에 사용된 104개의 대사체가 모델에 영향을 끼치는 정도 및 방향성을 보여주는 VIP 값 및 loading 값을 나타내는 결과이다.
Metabolites Loading_[t1] Loading_[t2] VIP values
1,5-anhydroglucitol 0.033 0.071 0.364
1-monopalmitin -0.097 0.143 1.049
2-hydroxyhexanate 0.097 0.131 0.998
2-hydroxypyridine 0.001 0.123 0.312
2-hydroxyvalerate -0.019 0.153 0.438
2-ketoisocaproic acid 0.100 0.134 1.024
3-hydroxypyridine 0.004 -0.071 0.184
adenosine 0.043 -0.051 0.454
adipate 0.035 0.000 0.344
alanine 0.063 -0.065 0.650
arabitol 0.012 -0.017 0.124
arachidic acid 0.000 0.044 0.112
arachidonic acid -0.080 0.191 0.955
asparagine 0.070 -0.036 0.705
asparagine dehydrated 0.025 0.143 0.427
benzoate 0.114 0.023 1.131
citrate 0.026 0.062 0.292
cyano-L-alanine 0.054 -0.009 0.536
decanoic acid 0.295 0.236 2.944
fructose 0.270 0.177 2.682
fucose -0.024 0.057 0.286
fumarate 0.088 0.096 0.890
galactonate 0.165 0.129 1.649
galactose -0.058 -0.134 0.652
galacturonate 0.008 -0.065 0.185
glucose -0.061 -0.151 0.697
glucose-6-phosphate -0.106 0.061 1.073
glutamate 0.015 -0.002 0.153
glutamine 0.085 -0.039 0.853
glycerate -0.057 -0.082 0.591
glycerol -0.100 0.066 1.009
glycerol-1-phosphate -0.047 0.045 0.480
glycine -0.018 -0.075 0.253
glycolate 0.153 0.025 1.511
heptadecanoic acid -0.140 0.168 1.474
histidine -0.160 -0.150 1.602
indole-3-lactate 0.010 0.178 0.456
inosine 0.171 0.113 1.699
isocitrate 0.027 0.065 0.301
isoleucine 0.055 0.069 0.565
isothreonate 0.063 0.139 0.697
lactate -0.061 -0.107 0.646
lauric acid 0.033 0.148 0.486
L-citrulline -0.048 0.108 0.559
L-cysteine 0.201 0.097 1.988
leucine -0.034 -0.017 0.335
L-homoserine 0.025 0.054 0.277
lignoceric acid -0.001 0.054 0.138
linoleic acid -0.176 0.123 1.790
linolenic acid -0.110 0.082 1.122
lysine -0.138 0.018 1.371
lyxose -0.045 -0.108 0.511
malate 0.064 0.041 0.635
mannitol 0.118 0.001 1.169
mannose -0.050 -0.122 0.572
mannose-6-phosphate 0.087 0.086 0.878
methionine 0.070 0.038 0.695
methyl palmitoleate -0.144 0.053 1.434
methylamine 0.039 -0.005 0.386
myo-inositol -0.013 0.078 0.244
myristic acid -0.062 0.226 0.861
N-methylalanine -0.075 -0.058 0.753
octadecanol -0.047 0.154 0.626
oleic acid -0.180 0.109 1.820
O-phosphorylethanolamine 0.034 0.112 0.430
ornithine -0.018 -0.036 0.198
oxalate 0.040 0.085 0.439
oxoproline -0.027 0.087 0.354
palmitic acid -0.159 0.101 1.605
palmitoleic acid -0.117 0.153 1.244
pelargonic acid 0.146 0.012 1.446
pentadecanoic acid 0.020 -0.065 0.263
phenylalanine -0.114 0.006 1.131
phosphate -0.057 0.021 0.572
phosphogluconate 0.063 0.169 0.738
proline 0.128 -0.039 1.281
pyrrole-2-carboxylate -0.085 0.122 0.913
pyruvate 0.057 0.041 0.569
salicylaldehyde 0.038 -0.053 0.403
serine -0.059 -0.100 0.626
sorbitol 0.194 0.160 1.943
spermidine 0.148 0.098 1.469
squalene 0.076 0.086 0.766
stearic acid -0.041 0.194 0.652
succinate -0.021 -0.083 0.285
sucrose 0.101 0.008 0.996
tagatose 0.230 0.105 2.272
taurine 0.055 -0.006 0.541
terephtalate -0.030 -0.104 0.386
threitol 0.101 0.067 1.002
threonine 0.098 0.045 0.967
threose 0.130 0.104 1.295
thymine -0.126 -0.005 1.248
tryptophan -0.090 0.120 0.953
tyrosine -0.006 0.149 0.387
uracil 0.038 0.024 0.373
urea 0.054 -0.096 0.595
uric acid -0.038 0.088 0.444
uridine 0.179 0.123 1.781
valine 0.062 -0.014 0.612
xanthine -0.140 -0.003 1.385
α-ketoglutarate -0.007 0.062 0.173
α-tocopherol 0.052 0.075 0.536
β-alanine -0.052 0.126 0.624
실시예 3: 베체트병 환자에 특이적인 생체표지자 대사물질들의 선별
베체트병 환자에서 특이적으로 증감한 생체표지자를 찾기 위해서, 각각의 대사물질로부터 실시예 2로부터 도출된 대사체 프로파일링의 차이에 영향을 미치는 VIP 값과 fold change, AUC, p-value를 구하였다. VIP 값이 1.5 이상, fold change 1.2, AUC 0.800 이상, p-value 0.01 미만의 기준을 각각의 대사물질에 대해 구하였고, 13개의 대사물질이 베체트병 진단에 적절함을 보였다(표 3). 또한, 이 대사물질들의 절대적 intensity를 그룹별로 비교하였다 (도 2).
하기 표 3은 베체트병 진단을 위한 잠재적 생체표지자로 선정된 13개의 대사물질의 VIP, AUC, fold change, p-value 값[BD, 베체트병 환자; control, 건강한 대조군]을 나타낸 것이다.
Metabolite VIP Fold AUC p value
Metabolites with higher abundance in the BD group than in the control group
decanoic acid 2.94 16.26 1.000 < 0.001
fructose 2.68 17.84 0.971 < 0.001
tagatose 2.27 154.92 0.989 < 0.0001
L-cysteine 1.99 1.58 0.912 < 0.0001
sorbitol 1.94 3.71 0.877 < 0.0001
uridine 1.78 2.33 0.856 < 0.0001
inosine 1.70 14.56 0.944 < 0.0001
galactonate 1.65 1.43 0.857 < 0.0001
glycolate 1.51 1.33 0.860 < 0.0001
Metabolites with higher abundance in the control group than in the BD group
oleic acid 1.82 1.89 0.858 < 0.0001
linoleic acid 1.79 1.67 0.851 < 0.0001
palmitic acid 1.60 1.23 0.809 < 0.0001
histidine 1.60 1.36 0.805 < 0.0001
AUC, area under the ROC curve; BD, Behcet's disease; VIP, variable importance on projection
실시예 4: PLS - DA를 이용한 베체트병 환자에서 증감한 대사물질에 약물 효과 존재 유무 검증
베체트병 환자에서 특이적으로 증감한 생체표지자가 약물에 의해 증감한 물질이 아님을 보이기 위해서, 각각의 약물투여 그룹 vs. 약물비투여 그룹을 PLS-DA를 이용해 비교한 결과, 분리 수준이 적절하지 않고 재현성이 없는 것으로 나타났다. 3개의 투여된 약물 그룹 steroid, colchicine, azathioprine에서 각각 재현성이 없는 결과를 보였으며, 약물에 따른 차이가 통계적으로 유의미하지 않았다.
따라서, 실시예 3에서 보인 베체트병에서 증감한 대사물질이 질병 자체에 의한 변화이므로 생체표지자로 적절함을 확인하였다(도 3a~c).
실시예 5: 혈액 검체를 통한 베체트병의 진단을 위해 5개의 대사물질을 이용한 대사체적 진단 panel의 생성
실시예 3으로부터 선정된 베체트병 진단을 위한 생체표지자 13개 중 베체트병에서 특이적으로 증가한 물질 상위 3개(decanoic acid, fructose, tagatose), 베체트병에서 특이적으로 감소한 물질 상위 2개(oleic acid, linoleic acid)를 선정하여 베체트병을 진단할 수 있는 대사체적 진단 panel을 만들고자 하였다. 따라서 5개의 대사물질을 기반으로 BD와 HC를 구분할 수 있는 다변량 구분 모델을 주성분 분석을 기반으로 생성하였다. PC1의 하나의 축을 이용했을 때, BD와 HC가 완전히 구분됨을 보일 수 있었으며, 모델의 수치는 R2X 값이 0.721, Q2 값이 0.515로 베체트병 환자와 건강한 대조군을 적절하고 재현성 있게 구분하였다(도 4).
실시예 6: 혈액 검체를 이용한 베체트병의 진단을 위한 대사체적 진단 panel의 ROC 및 외부 검체 검증을 통한 모델 검증
실시예 5를 통해 생성된 혈액 검체를 통한 베체트병 진단용 대사체적 생체표지자 panel이 진단에 적절한지 살펴보기 위하여 모델 내 각 검체의 PC1 score를 이용해서 ROC(receiver operating characteristic) 곡선을 그렸다. 그 결과 sensitivity가 100%, specificity가 97.1%, AUC값이 0.993으로 모델이 베체트병 진단에 매우 적합함을 보였다(도 5). 또한, 이 panel이 외부 검체를 이용하여 베체트 질환의 진단을 예측할 수 있는지 살펴보기 위하여, 베체트병 환자 및 건강한 대조군의 혈액 검체를 각 10개씩, 총 20개의 검체를 이용하였다. 그 결과 총 20개의 검체 중 19개의 검체를 정확하게 베체트병 환자 혹은 건강한 대조군으로 예측할 수 있음을 나타내어, 5개의 대사체 생체표지자 panel이 외부 검체의 베체트병 진단에도 적절함을 나타내었다(도 6).

Claims (10)

  1. 데칸산(decanoic acid), 프룩토오스(fructose), 타가토오스(tagatose), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), L-시스테인(L-cysteine), 소르비톨(sorbitol), 우리딘(uridine), 이노신(inosine), 갈락토네이트(galactonate), 글라이콜레이트(glycolate), 팔미트산(palmitic acid) 및 히스티딘(histidine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 혈액 대사체에 대한 정량 장치를 포함하는 베체트병 진단 키트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 혈액 대사체 중 데칸산(decanoic acid), 프룩토오스(fructose), 타가토오스(tagatose), 올레산(oleic acid) 및 리놀레산(linoleic acid)으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 베체트병 진단 키트.
  3. 제 1 항에 있어서,
    정량 장치는 크로마토그래피/질량분석기인 베체트병 진단 키트.
  4. 제 1 항에 있어서,
    데칸산(decanoic acid), 프룩토오스(fructose), 타가토오스(tagatose), L-시스테인(L-cysteine), 소르비톨(sorbitol), 우리딘(uridine), 이노신(inosine), 갈락토네이트(galactonate) 및 글라이콜레이트(glycolate)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 농도가 증가되는 경우, 베체트병을 나타내는 것인 베체트병 진단 키트.
  5. 제 1 항에 있어서,
    올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 팔미트산(palmitic acid) 및 히스티딘(histidine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 농도가 감소하는 경우, 베체트병을 나타내는 것인 베체트병 진단 키트.
  6. 정상 대조군과 베체트병에서 얻은 혈액 간의 대사체 차별성을 검출하는 방법으로,
    (1) GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry)를 이용한 대사체 분석 단계;
    (2) GC/TOF MS에서 동정된 대사체에 대해 부분최소자승판별분석(PLS-DA)를 이용하여 대사체 프로파일의 차이를 확인하는 단계;
    (3) PLS-DA에서 도출된 대사체의 VIP(Variable Importance for Projection) 값이 1.5 이상인 값을 대사체 바이오마커 후보물질로 선정하고, PLS-DA의 로딩 값을 통해 대사체 바이오마커 후보물질의 증감 확인하는 단계;
    (4) ROC 곡선(Receiver Operating Characteristic curve)을 이용하여 대사체 바이오마커를 검증하는 단계
    를 순차적으로 적용하여, 혈액으로부터 대사체 바이오마커를 분석하는 것을 포함하는 정상 대조군과 베체트병에서 얻은 혈액 간의 대사체 차별성 분석 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    GC/TOF MS를 이용한 대사체 분석 방법은 혈액 시료를 GC/TOF MS 기기로 분석하고, 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환한 다음, 변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 정상 대조군과 베체트병에서 얻은 혈액 간의 대사체의 차별성을 검증하는 것인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 것은 총 분석시간을 단위시간 간격으로 나누어 단위시간 동안 나타난 크로마토그램 피크의 면적 또는 높이 중 가장 큰 수치를 단위시간 동안의 대표값으로 정하는 것인 방법.
  9. 제 6 항에 있어서,
    PLS-DA의 로딩 값이 양수인 것은 대사체의 증가 경향을, 로딩 값이 음수인 것은 대사체의 감소 경향을 나타내는 것인 방법.
  10. 제 6 항에 있어서,
    대사체 바이오마커는 데칸산(decanoic acid), 프룩토오스(fructose), 타가토오스(tagatose), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), L-시스테인(L-cysteine), 소르비톨(sorbitol), 우리딘(uridine), 이노신(inosine), 갈락토네이트(galactonate), 글라이콜레이트(glycolate), 팔미트산(palmitic acid) 및 히스티딘(histidine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 방법.
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