WO2018169282A2

WO2018169282A2 - Atpif1을 함유하는 당뇨 치료용 약학조성물

Info

Publication number: WO2018169282A2
Application number: PCT/KR2018/002933
Authority: WO
Inventors: 김현수
Original assignee: Korea University Research and Business Foundation
Current assignee: Korea University Research and Business Foundation
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2018-03-13
Publication date: 2018-09-20
Anticipated expiration: 2019-09-17
Also published as: US20200129581A1; WO2018169282A3; KR101941975B1; CN110536692A; US10946060B2; EP3597208B1; CN110536692B; EP3597208A2; KR20180107368A; EP3597208A4

Abstract

본 발명은 ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)을 유효성분으로 함유하는 당뇨 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 ATPIF1을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한으로, 본 발명에 따른 ATPIF1을 함유하는 조성물은 근육세포에서의 당 흡수를 촉진하고 인슐린 민감성을 향상시켜 당뇨 치료효과를 가지며, 지방세포에서 지방합성을 억제하고 지방세포의 갈색화를 촉진하는 효과를 가지고 있어, 비만을 예방 또는 치료하는 효과를 가진다.

Description

ATPIF1을 함유하는 당뇨 치료용 약학조성물

본 발명은 ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)을 유효성분으로 함유하는 당뇨 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 ATPIF1을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

근육은 인체의 구조를 지탱하는 골격근의 기능을 담당하며, 수축이완을 통해 운동에 관여한다고 알려져 왔으나, 최근 근육이 내분비 기관으로도 작용하는 것이 알려지고 있다. 1980년대 중반 지방조직이 새로운 내분비기관으로 발견되었고, 지방조직에서 분비하는 물질을 아디포카인(adipokine)으로 명명하였으며, 현재 알려진 아디포카인으로는 렙틴(leptin), 아디포넥틴(adiponectin), 레지스틴(resistin) 등이 있으며, 아디포카인은 지방 합성에 관련된 기능뿐 아니라 면역, 대사, 신경, 암 등에서도 다양한 기능을 하는 것으로 규명되었다. 최근 골격근이 수축할 때 물질이 분비되는 사실이 밝혀졌고, 이것은 한때 운동인자(exercise factor)라고 불리기도 했던 마이오카인인 것이 확인되었다. 현재 많은 종류의 마이오카인들이 질환 연구의 새로운 표적 물질로 여겨지고 있다(Whitham M, et al., Nat Rev Drug Discov. 15:719-29, 2016; Lightfoot AP, et al., Curr Opin Rheumatol., 28:661, 2016).

한편, 당뇨병, 비만, 고혈압, 고지혈증, 동맥경화증 등 여러 질환이 동반되어 나타나는 대사증후군(metabolic syndrome)은 세계보건기구(WHO)에서 현대사회 사망의 핵심 요인으로 지적하고 있으나, 아직까지 이에 대한 치료 및 관리방법이 확립되어 있지 않으며, 최근까지의 연구에 의하면 운동부족이 당뇨병과 비만을 발생시키는 병태생리학적인 원인들 가운데서 가장 중요한 부분을 차지하고 있으로 알려져 있다. 따라서 운동시 동반되는 근육수축 및 분비되는 물질에 대한 근본적인 이해가 총체적 치료를 위한 필수 조건이며, 따라서 근육 분비 물질인 마이오카인에 대한 연구는 현재 미충족 의료 현안을 해결할 수 있을 뿐만 아니라 경제적, 산업적, 기술적 파급 효과가 매우 클 것으로 예상된다.

미국 신약개발협회의 2015년 보고서에 따르면, 200 여개 이상의 표적을 대상으로 대사증후군 관련 신약 개발이 추진 중이며, 현재 전 세계적으로 경쟁적으로 진행되고 있는 연구 경향을 고려해 볼 때 앞으로 마이오카인이 치료제 개발 타겟이 될 가능성이 크다. 마이오카인에 대한 연구는 Amrad 사와 Genvec사, Novartis, 미국 Northwestern 대학교 등이 수행 중인 것으로 알려져 있다.

작용기전에 근거한 표적 개발에 주력하고 있는 외국의 경우와는 달리 국내에서는 기초 연구 성과가 부족하고 연계된 의료 산업적 응용 실적이 미흡하며, 최근 몇몇 연구실에서 마이오카인에 대한 연구가 진행되고 있고 일부 연구 성과를 내고는 있으나, 신약개발을 위한 연구 시도 등은 없는 것으로 파악된다.

이에, 본 발명자들은 당 흡수 조절 및 지방세포에서 지방대사 조절 기능을 가지는 마이오카인을 찾고자 예의 노력한 결과, 근육세포에서 미토콘드리아의 ATP 합성을 억제하는 역할을 한다고 알려진 단백질인 ATPIF1(ATPase inhibitor factor)이 근육세포에서의 당 조절 및 지방세포의 지방대사 조절능을 가진다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 당 흡수 조절 기능을 가지는 마이오카인을 함유하는 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 지방세포에서 지방대사 조절 기능을 가지는 마이오카인을 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)을 유효성분으로 함유하는 당뇨 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)을 투여하는 단계를 포함하는 함유하는 당뇨 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 당뇨 또는 당뇨 합병증의 치료 또는 예방을 위한 ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 당뇨 또는 당뇨 합병증의 치료 또는 예방용 약제 제조를 위한 ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)의 사용을 제공한다.

본 발명은 또한, ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)을 투여하는 단계를 포함하는 함유하는 비만의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 비만의 치료 또는 예방을 위한 ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 비만의 치료 또는 예방용 약제 제조를 위한 ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)의 사용을 제공한다.

도 1은 근육세포주에서 ATPIF1에 의한 AMPK 인산화 증가를 확인한 웨스턴블럿 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 근육세포주에서 ATPIF1에 의한 Akt 인산화 증가를 확인한 웨스턴블럿 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 근육세포주에서 ATPIF1에 의한 Glut4 단백질의 발현 증가를 확인한 웨스턴블럿 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 근육세포주에서 ATPIF1에 의한 Glut4 mRNA 발현 증가를 확인한 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 근육세포주에서 ATPIF1에 의한 당 섭취 증가를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 근육세포주에서 ATPIF1의 인슐린 센서타이저 기능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 지방세포에서 ATPIF1에 의한 ACC 인산화 및 UCP1 활성화를 확인한 웨스턴블럿 결과를 나타낸 것이다.

도 8은 마우스의 운동 시 혈액 내 ATPIF1의 농도 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 9는 제2형 당뇨모델 dbdb 마우스에 재조합 단백질 ATPIF1 단백질을 한 달 간 복강 투여 후 GTT(glucose tolerance test)를 시행한 결과를 나타낸 것이다.

발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

ATPIF1는 알파 - 베타 계면에서 결합하여 ATPase와 1 대 1의 복합체를 형성하고, 이는 ATP의 방출을 막아서 ATP 합성을 억제하는 것으로 생각되고 있다 (van Raaij MJ et al., Biochemistry. 35:15618, 1996). ATPIF1는 2 개의 올리고머 상태 이합체 (활성 상태) 및 4량체를 가지고, 낮은 pH에서는 2 개의 모노머의 C 말단 영역 사이의 역 평행 코일드 코일 상호 작용을 통해 이합체를 형성한다. 높은 pH에서는 억제제는 N 말단 및 저해 영역을 포함하는 코일드 코일 상호 작용에 의해 4량체 및 고급 올리고머를 형성하여, 저해 활성을 억제한다(Cabezon E et al., J. Biol. Chem. 277:41334, 2002)

ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)은 마이토콘드리아의 ATP 합성 억제 역할을 하는 단백질로써, 본 발명에서는 근육세포에서의 당 조절 및 지방세포에서의 지방대사 조절 기능을 처음으로 규명하였다. 본 발명에서는 근육세포주에서 ATPIF1의 당 조절 기작을 증명하기 위해 AMPK(AMPK-activated protein kinase)의 인산화 정도, 인슐린 시그널 하위 물질인 Akt의 인산화, Glut4의 단백질 및 mRNA 발현 정도, 동위원소를 이용한 당 섭취(glucose uptake) 실험 비교 등을 수행하였다. 또한, 지방세포주에서 ATPIF1의 지방합성 관련성을 규명하기 위하여, ACC(acetyl-CoA carboxylase) 인산화와 갈색화(fat-browning) 표지 유전자인 UCP1(uncoupling protein 1)에 대한 실험을 수행하였다.

상기 실험을 통해 ATPIF1이 근육세포에서 AMPK 및 Akt의 활성을 증가시켜 당 조절 효능을 나타내는 것을 확인하였고, 또한 인슐린 저항성을 극복할 수 있는 인슐린 센서타이저(sensitizer) 기능을 나타냄으로써 제2형 당뇨를 극복할 수 있는 제제로 응용 가능성을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일관점에서, ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)을 유효성분으로 함유하는 당뇨 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

현재까지 혈당조절에 관여하는 주요 단백질로는 Akt, AS(Akt substrate) 160, PKCzeta 등이 있고, 주로 포도당 수송체(glucose transporter) 단백질의 수송에 작용한다고 알려져 있다. 또한, 당, 뇨 등에 대한 분자 수준에서의 발생기전은 인슐린 수용체 자체의 결함보다는 수용체 이후의 과정, 특히 PI-3 kinase(phosphoinositide-3 kinase)를 통한 단백질들 간의 신호전달 이상이 질병의 원인으로 여겨지고 있다. 따라서, 당뇨에 대한 인슐린의 치료 효과는 제한적이므로 혈당 조절과 관련된 신규 타켓 단백질 발굴 및 그 분자적 메커니즘을 밝히는 것이 중요하다.

본 발명에서, 상기 당뇨는 제1형 당뇨 또는 초기 제2형 당뇨일 수 있으며, 상기 당뇨 합병증은 당뇨성 신증, 당뇨성 망막증, 고지혈증, 지방간 등 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1, 서열번호 1)은 인슐린 감수성을 촉진하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 따라서, 본 발명은 인슐린 또는 인슐린 아날로그를 추가로 포함할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)을 이용한 당뇨 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 당뇨 또는 당뇨 합병증의 치료 또는 예방을 위한 ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)의 용도에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 당뇨 또는 당뇨 합병증의 치료 또는 예방용 약제 제조를 위한 ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)의 사용에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "당뇨병"은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사질환(metabolic disease)를 의미한다. 본 발명의 조성물을 개체에 병용 투여함으로써, 혈당을 조절하여 당뇨병을 치료할 수 있다.

본 발명에서 용어, "예방"이란 본 발명의 조성물의 병용투여로 당뇨병을 방지하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란 본 발명의 조성물의 병용투여로 당뇨병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 상기 당뇨병 치료는 당뇨병이 발생할 수 있는 임의의 포유 동물에 적용이 가능하며, 그 예로 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등 가축을 제한없이 포함하나, 바람직하게는 인간일 수 있다.

본 발명에서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물들 의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비강내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여 시, 펩타이드는 소화가 되기 때 문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다.

바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 지속성 제제는 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명에서 인슐린이란 인슐린 수용체 자극 활성이 있는 모든 펩타이드 또는 변형 펩타이드를 망라하는데, 예를 들어 천연형 인슐린, 속효성 인슐린, basal 인슐린, 천연형 인슐린에서 일부 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중에 어느 하나의 방법 또는 이들 방법의 조합을 통해 변형이 일어난 물질인 인슐린 아날로그, 또는 이들의 단편 일 수도 있다. 또한 본 발명에서 인슐린은 짧은 반감기를 극복하기 위한 지속형 기술을 적용한 지속형 인슐린 일 수 있다. 바람직하게는 일주 일 회 투여 가능한 지속형 인슐린 혹은 지속형 인슐린 아날로그다. 본 발명에 따른 인슐린의 구체적인 예를 일부만 들자면 대한민국 등록특허 제10-1058290호, 대한민국 특허출원 제10-2014-0022909호 및, 제10-2014-0006938호에 기재된 인슐린 또는 인슐린 아날로그와 그 지속형들을 포함하나 그 범위는 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "인슐린 아날로그"란 천연형 서열에서 하나 이상의 아미노산이 변형된 것을 의미한다.

상기 인슐린 아날로그는 천연형에 비해 인슐린 역가가 감소 및/또는 인슐린 수용체 결합력이 감소된, 인슐린의 B 쇄 또는 A 쇄의 아미노산이 변이된 인슐린 아날로그일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 인슐린은 유전자 재조합 기술로 만든 인슐린 아날로그이지만, 본 발명은 이것에만 국한되지 않으며, 바람직하게는 역방향 인슐린(inverted insulin), 인슐린 변이체(variants), 인슐린 단편(fragments) 등을 포함하며 제조법으로는 유전자 재조합뿐만 아니라 solid phase 방법으로도 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

인슐린 아날로그는 인슐린과 동일한 생체내의 혈당 조절기능을 보유한 펩타이드로서, 이러한 펩타이드는 인슐린 아고니스트(agonist), 유도체(derivatives), 단편(fragments), 변이체(variants) 등을 포함한다.

본 발명의 인슐린 아고니스트는 인슐린의 구조와 상관없이 인슐린의 생체 내 수용체에 결합하여 인슐린과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 물질을 의미한다.

본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린의 A쇄, B쇄와 각각 아미노산 서열에서 상동성을 보이며, 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예;deamination) 또는 수식(예; N-methylation), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택하는 변형이 된 형태일 수 있고, 체내에서 혈당을 조절하는 기능을 보유한 펩타이드를 의미할 수 있다.

본 발명에서 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린과 아미노산 서열이 전형 상동성이 없어도 인슐린 수용체와 결합하여 혈당을 조절할 수 있는 펩타이드 미믹 및 저분자 혹은 고분자 화합물을 의미할 수 있다.

본 발명의 인슐린 단편은 인슐린에 하나 또는 그 이상 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 추가된 아미노산은 천연 상태에서 존재하지 않는 아미노산 (예; D형 아미노산) 도 가능할 수 있고, 이러한 인슐린 단편은 체내에서 혈당조절 기능을 보유한다.

본 발명의 인슐린 변이체는, 인슐린과 아미노산서열이 하나 이상 다른 펩타이드로서, 체내에서 혈당조절 기능을 보유한 펩타이드를 의미한다.

본 발명의 인슐린 아고니스트, 유도체, 단편 및 변이체에서 각각 사용된 제조방법은 독립적으로 사용될 수 있고 조합도 가능하다. 예를 들어 아미노산 서열이 하나 이상 다르고 아미노말단 아미노산 잔기에 탈아미노화(deamination) 된 체내에서 혈당조절 기능을 보유한 펩타이드도 포함된다.

구체적으로, 상기 인슐린 아날로그는 B 쇄의 1번 아미노산, 2번 아미노산, 3번 아미노산, 5번 아미노산, 8번 아미노산, 10번 아미노산, 12번 아미노산, 16번 아미노산, 23번 아미노산, 24번 아미노산, 25번 아미노산, 26번 아미노산, 27번 아미노산, 28번 아미노산, 29번 아미노산, 30번 아미노산, A쇄의 1번, 2번, 5번, 8번 아미노산, 10번 아미노산, 12번 아미노산 14번, 16번 아미노산, 17번 아미노산, 18번 아미노산 19번 및 21번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 바람직하게는 알라닌, 글루탐산, 아스파라긴, 이소루신, 발린, 글루타민, 글라이신, 라이신, 히스티딘, 시스테인, 페닐알라닌, 트립토판, 프로린, 세린, 트레오닌, 아스파틱산으로 치환된 것일 수 있다. 또한 하나 이상의 아미노산이 결실(deleltion)된 인슐린 아날로그도 본 발명의 범주에 속하나 인슐린 아날로그는 제한 없이 포함될 수 있다.

바람직한 인슐린 아날로그는 생체적합성 물질 혹은 캐리어와 결합 시 천연형 인슐린에 비해 반감기가 증가된 인슐린 아날로그이며 이는 대한미국 특허출원 제10-2014-0022909호와 제10-2014-0006938호에 개시된 인슐린 아날로그일 수 있으나 제한은 없다.

본 발명의 조성물에서 알부민을 캐리어로 사용할 경우 알부민 혹은 알부민 단편을 직접 인슐린 및/또는 ATPIF1에 직접 공유결합하여 생체내 안정성을 높일 수 있는 기술이 포함될 수 있으며 알부민을 직접 결합하지 않더라도 알부민에 결합하는 물질 예을 들어 알부민 특이적 결합 항체 혹은 항체단편을 상기 펩타이드들에 결합시켜 알부민에 결합하게 하는 기술 및 알부민에 결합력을 가진 특정 펩타이드/단백질을 상기 펩타이드들에 결합하는 기술이 포함될 수 있으며 알부민에 결합력을 가진 지방산등을 결합시키는 기술들이 이에 포함될 수 있으나 이에 한정되지 않으며 알부민을 이용한 생체내 안정성을 높일 수 있는 어떤 기술, 결합방식등이 이에 포함될 수 있다.

생체내 반감기를 증가시키기 위해 항체 혹은 항체단편을 캐리어로 사용하여 상기 펩타이드들에 결합시키는 기술도 본 발명에 포함될 수 있다. FcRn 결합 부위를 같는 항체 혹은 항체 단편일 수 있으며, Fab등 FcRn 결합부위를 포함하지 않는 어떠한 항체 단편일 수 있다. 촉매적(Catalytic) 항체를 이용하는 CovX사의 CovX-body 기술이 이에 포함될 수 있으며 Fc 단편을 이용하여 생체내 반감기를 증가시키는 기술도 본 발명에 포함될 수 있다. Fc 단편을 이용할 경우 Fc 단편과 상기 펩타이드들에 결합하는 링커 및 결합방식은 펩타이드 결합 혹은 폴리에틸렌글리콜 등일 수 있으나 이에 한정되지 않으며 어떠한 화학적 결합방식도 가능하다. 또한 Fc 단편과 본 발명의 인슐린의 결합비는 1:1 혹은 1:2 일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

생체내 반감기를 증가시키기 위해 펩타이드 혹은 단백질 단편을 캐리어로 사용하여 인슐린 아날로그에 결합시키는 기술도 본 발명에 포함될 수 있다. 사용되는 펩타이드 혹은 단백질 단편은 특정 아미노산의 조합의 반복단위로 구성된 엘라스틴 유사 폴리펩타이드(Elastin like polypeptide(ELP)일 수 있으며 Versartis사의 인위적 폴리펩타이드 PEG인 Xten 기술도 본 발명에 포함된다. 또한 Zealand사의 multi-Lysine을 이용하여 생체내 반감기를 증가시키는 구조 형성 탐침(Structure inducing probe(SIP) 기술도 이에 포함되며 Prolor사의 CTP 융합기술도 이에 포함되며, 생체내 안정성이 높다고 알려진 트랜스페린 혹은 결합조직의 구성성분인 파이브로넥틴 등과 이의 유도체등도 포함될 수 있다.

본 발명의 ATPIF1 또는 인슐린에 결합시키는 펩타이드 혹은 단백질은 이에 한정되지 않으며 인슐린의 생체내 반감기를 증가시키는 어떠한 펩타이드 혹은 단백질도 본 발명의 범주에 포함된다. 또한 본 발명의 ATPIF1 또는 인슐린과 생체내 반감기를 증가시키는 펩타이드 혹은 단백질과의 결합은 공유결합일 수 있고 사용되는 링커의 종류 및 결합방식은 펩타이드 결합 혹은 폴리에틸렌글리콜등 일 수 있으나 반드시 이에 한정되지 않으며 어떠한 화학적 결합방식도 가능하다.

또한 생체 내 반감기를 증가시키기 위해 사용되는 캐리어는 다당류 혹은 지방산등 비펩타이드 물질일 수 있다. 상기 펩타이드의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 캐리어를 연결하는 링커는 펩타이드, 폴리에틸렌 글리콜, 지방산, 당류, 고분자 중합체, 저분자 화합물, 뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 이루어질 수 있으며 비공유 화학 결합 혹은 공유화학결합 등 어떠한 화학적 결합일 수 있으며 그 제한은 없다.

생체이용율을 증가시킬 수 있거나 지속적으로 활성을 유지할 수 있는 제제로는 PLGA, 히알루론산, 키토산등을 이용한 마이크로입자, 나노입자 등에 의한 지속 방출 제형이 이에 포함될 수 있다.

또한 생체이용율을 증가 혹은 지속적인 활성유지를 할 수 있는 다른 양태의 제제로는 임플란트, 흡입제(inhalation), 경비(經鼻 transnasal) 제제, 패치와 같은 제제일 수 있다.

본 발명에서, 병용투여 가능한 인슐린의 예로는 천연형 인슐린, 인슐린 아날로그, 지속형 인슐린등 (예를 들어 천연형 인슐린인 Humulin, Novolin과 속효성 인슐린인 Novolog, Humalog, Apidra, 지속형 인슐린인 Lantus, Levemir, Tresiba)을 들 수 있다.

본 발명에 사용가능한 캐리어 물질은 항체, 면역글로불린 Fc 영역, 알부민, 지방산, 탄수화물, 반복단위가 펩타이드인 중합체, 트랜스페린 및 PEG로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 면역글로불린 Fc영역이다. 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서 지속형 인슐린 혹은 지속형 GLP-1/글루카곤 이중작용제는 비펩타이드성 중합체를 링커로 하여 캐리어에 연결된다. 더욱 구체적 실시 형태에서 이 비펩타이드성 중합체 링커에 연결된 캐리어는 면역글로불린 Fc 단편이다. 면역글로불린 Fc 영역과 상기 인슐린 또는 이중작용제의 결합은 링커 없는 인프레임(inframe) 융합이거나 비펩타이드성 중합체를 링커로 사용하여 연결될 수 있다. 본 발명에서 면역글로불린 Fc는 면역글로불린 단편과 혼용하여 사용될 수 있다.

본 발명에서 "비펩타이드성 중합체"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 본 발명에서 상기 비펩타이드성 중합체는 비펩타이드성 링커와 혼용되어 사용될 수 있다.

본 발명에 사용가능한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌글리콜과 프로필렌글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜이다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.

기존 인프레임 융합방법으로 제조된 융합단백질에서 사용된 펩타이드성 링커의 단점은 생체내에서 단백질분해효소에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성약물의 혈중반감기 증가 효과를 기대만큼 얻을 수 없다는 것이다.

그러나, 본 발명에서는 단백질분해효소에 저항성있는 중합체를 사용하여 캐리어와 유사하게 펩타이드의 혈중반감기를 유지할 수 있다. 그러므로, 본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 중합체는 상기와 같은 역할, 즉 생체 내 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체이면 제한없이 사용될 수 있다. 비펩타이드성 중합체의 분자량은 1 내지 100 kDa 범위, 바람직하게는 1 내지 20 kDa 범위이다. 또한, 상기 면역글로불린 Fc 영역과 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.

본 발명에 사용되는 비펩타이드성 중합체는 면역글로불린 Fc 영역 및 단백질약물과 결합될 수 있는 반응기를 가질 수 있다. 상기 비 펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 반응 알데히드 그룹, 프로피온 알테히드 그룹, 부틸 알테히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다. 특히, 상기 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 양말단에서 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다. 상기 비펩타이드성 중합체인 링커의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 양쪽 말단에 히드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 본 발명의 지속형 인슐린 혹은 인슐린 유도체 결합체와 지속형 GLP-1/글루카곤 결합체를 제조할 수 있다.

또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라, 아미노산 서열이 항체마다 달라 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.

본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1)CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2)CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3)CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4)CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5)1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 6)중쇄 불변 영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다.

또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.

또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC (antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제WO 96/32478호 등에 개시되어 있다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly,Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내며 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.

또한, 이러한 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.

또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것 이다.

본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.

한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다.

또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.

한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.

본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.

한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC,Complement dependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc영역이다.

즉, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.

본 발명의 지속형 인슐린 결합체의 제조 방법은 특별히 한정되지 않는다. 자세한 제조방법의 예와 그 효력에 관한 기술은 예를 들어 대한민국 등록특허 제10-1330868호, 제10-1324828호, 제10-1058290호, 대한민국 공개특허 제10-2011-0111267호 및 대한민국 출원 제10-2014-0022909호에서 찾을 수 있다.

이러한 본 발명의 ATPIF1과 인슐린을 병용 투여하면 ATPIF1과 인슐린이 동시에 작용하여 각각의 단독 투여시보다 혈중 당의 농도를 감소시키고, 안정적인 변화 추이를 보인다. 또한 상기 결합체를 병용 투여하는 경우, 인슐린 단독투여시 나타날 수 있는 저혈당의 위험을 낮출 수 있으며, 체중을 감소시키는 효과가 있고, 인슐린 분비 펩타이드에 의해 전체 인슐린 투여량을 낮출 수 있다. ATPIF1과 인슐린의 병용투여는 혈중 반감기 및 생체 내 효력 지속 효과의 획기적인 증가로 인해 매일 투여되야 하는 만성환자에게 투여 횟수를 감소시켜 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있는 큰 장점이 있어 당뇨병의 치료에 큰 도움을 준다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하고 병용 투여 방법을 이용하여 용량을 현저하게 감소시킬 수 있다.

ATPIF1과 인슐린는 각각 동시, 순차적, 또는 역순으로 투여될 수 있으며, 적절한 유효량의 조합으로 동시에 투여될 수 있다. 또한 바람직하게는 ATPIF1과 인슐린는 각각 별도의 용기에 보관된 후 동시, 순차적 또는 역순으로 병용투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 병용 투여용 조성물인 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 GLP-1/글루카곤 이중작용제 결합체는 하나의 용기에 포함된 당뇨병 치료용 키트, 각각 별도의 용기에 보관된 것인 당뇨병 치료용 키트의 형태일 수 있다. 이와 같은 키트는 약학적으로 허용가능한 담체, 키트의 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다.

아울러, 본 발명에서는 마이토콘드리아에서 ATP 합성 억제 역할을 하는 단백질인 ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)이 근육세포에서의 당 조절 및 지방세포에서의 지방대사 조절 기능을 하는 것을 확인하였다.

비만은 지방생성과정에 의하여 지방세포의 세포내 중성지방(triglyceride, TG)의 축적으로 발생하며 이러한 지방생성기전을 조절하는 것이 비만 억제의 효과적인 치료방법으로 알려져 있다(Chen, H. C. and Farese, R. V.Arterioscler Thromb Vasc Biol 25,482-4865,2005; Cooke, D. and Bloom, S., Nat Rev Drug Discov 5, 919-1200, 2006).

본 발명에서는 또한, 지방세포에서는 지방합성 억제에 관여하는 ACC활성을 조절하고, 갈색화 표지 인자인 UCP1발현을 증가시켜 지방대사 개선에도 관여함을 밝혔고, 마지막으로 운동 상태의 동물에서 마이오카인 ATIF1의 농도가 높아지는지 확인하기 위해 동물실험을 수행하고, 운동그룹에서, ATIF1의 농도가 증가하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)을 이용한 비만의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

또다른 관점에서, 본 발명은 비만의 예방 또는 치료를 위한 ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)의 용도에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 비만의 치료 또는 예방용 약제 제조를 위한 ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)의 사용에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 이러한 질병 또는 문제를 치료하는데 유효한 다양한 치료 약제와 병행하여 사용될 수 있다. 상기에서 명백히 논의된 것처럼, 현재의 당뇨병 치료는 식이조절, 운동, 인슐린, 인슐린 분비 촉진약, 글구코스를 낮추는 효능제, PPAR-γ 작용약, 및 알파-글루코시다제 억제제를 포함한다. 본 발명의 화합물은 타입 I 당뇨병 및 타입 Ⅱ 당뇨병, 비만, 당내성(glucose intolerance), 인슐린 저항성, 대사 증후군, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 알테로스세로시스(artheroscelrosis), 신경퇴행성 질병, 및 염증 및 뇌졸중과 같은 다른 증상을 포함하는, 그러나 이로 한정되지는 않는, 당뇨병 및 이와 관련된 질병 이상을 치료하거나/또는 예방하기 위한 이러한 또는 다른 의학적 치료와 병행될 수 있다. 예를 들어, 타입 Ⅱ 당뇨병을 치료할 때에, 본 발명의 화합물은 멧포민정(metformin), 글리브라이드(glyburide) 및 글리피지드(glipizide)과 같은 술로닐 요소(sulfonylurea), 레파글리니드(repaglinide), 나테글리니드(nateglinide), 로시글리타존(rosiglitazone) 및 피오글리타존(pioglitazone)과 같은 디아졸리딘디온(thiazolidinedione), 아카보스(acarbose), 미그리톨(miglitol), 엑스안타이드(exanatide), 프람린타이드(pramlintide) 및 인슐린을 포함하는 하나 이상의 약학적으로 효과있는 약제와 병용될 수 있다.

본 발명의 치료용 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 약제학적으로 허용되는 담체는 담체, 보조제 및 비히클을 포함하며 총괄적으로 “약제학적으로 허용되는 담체”라고 한다. 본 발명의 의약 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 이온 교환, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청알부민), 완충 물질(예, 여러 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로즈-계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-차단 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 등이 포함된다.

본 발명에 따른 의약 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 본 발명에서 사용된 용어 “비경구”는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.

의약 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예, 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매중의 멸균 주사용액 또는 현탁액(예, 1,3-부탄디올중의 용액)일 수 있다. 허용적으로 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링겔 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 불휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 어떠한 불휘발성 오일도 사용할 수 있다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산이 약제학적으로 허용되는 천연오일(예, 올리브유 또는 피마자유), 특히 이들의 폴리옥시에틸화된 것과 마찬가지로 주사 제제에 유용하다.

본 발명의 의약 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만 캡슐, 정제 및 수성 현탁액 및 용액을 포함하여 경구적으로 허용되는 어떠한 용량형으로도 경구 투여될 수 있다. 경구용 정제의 경우, 흔히 사용되는 담체로는 락토즈 및 옥수수 전분이 포함된다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐형으로 경구 투여하는 경우 유용한 희석제로는 락토즈 및 건조된 옥수수 전분이 포함된다. 수성 현탁액이 경구 투여될 때 활성 성분은 유화제 및 현탁화제와 배합된다. 필요한 경우, 감미제 및/또는 풍미제 및/또는 착색제가 첨가될 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 본 발명의 화합물을 실온에서 고형이지만 직장 온도에서는 액상인 적합한 비자극성 부형제와 혼합하여 제조할 수 있다. 이러한 물질로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 코코아 버터, 밀랍 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.

본 발명에 따른 의약 조성물의 경구 투여는 목적하는 치료가 국소 적용으로 접근이 용이한 부위 또는 기관과 관련이 있을 때 특히 유용하다. 피부에 국소적으로 적용하는 경우, 의약 조성물은 담체에 현탁 또는 용해된 활성성분을 함유한 적합한 연고로 제형되어야 한다. 본 발명의 화합물을 국소 투여하기 위한 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 광유, 유동 파라핀, 백색 와셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물이 포함된다. 다른 방도로서, 의약 조성물은 담체에 현탁 또는 용해된 활성 화합물을 함유한 적합한 로션 또는 크림으로 제형될 수 있다. 적합한 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 광유, 솔비탄 모노스테아레이트, 폴리솔베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알코올 및 물이 포함된다. 본 발명의 의약 조성물은 또한 직장 좌제에 의해 또한 적합한 관장제로 하부 장관으로 국소 적용할 수 있다. 국소 적용된 경피 패치가 또한 본 발명에 포함된다.

본 발명의 의약 조성물은 비내 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 약제의 분야에 잘 알려진 기술에 따라 제조하며 벤질 알코올 또는 다른 적합한 보존제, 생체이용율을 증강시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 기타 본 분야에 알려진 가용화제 또는 분산제를 사용하여 염수중의 용액으로서 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 통상적인 항염증제와 혼합하거나 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제, 리폭시게나제 억제제 및 IL-1β외의 사이토킨의 억제제와 혼합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 염증과 같은 IL-1 매개된 질환 증세를 예방 또는 퇴치하기 위해 면역조절제(예, 브로피리민, 항-사람 알파 인터페론 항체, IL-2, GM-CSF, 메티오닌 엔케팔린, 인터페론 알파, 디에틸디티오카바메이트, 종양 괴사 인자, 날트렉손 및 rEPO) 또는 프로스타글란딘과 배합하여 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물이 다른 치료 제제와 배합하여 투여될 때 이들은 환자에게 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 다른 방도로서, 본 발명에 따른 의약 조성물은 ATPIF1과 상기된 다른 치료 또는 예방제와 혼합하여 이루어질 수 있다.

용어 “치료학적 유효량”은 사람의 경우 상기 증세의 치료에 사용하기 위해 일일당 체중 kg 당 약 0.1 mg 내지 약 100 mg의 용량 수준을 가리킨다.

그러나, 특정 환자에 대한 특정 유효량은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 규정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 변할 수 있음은 이해될 것이다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

바람직한 양태로서, 구강내 투여를 위한 의약 조성물은 고체상의 부형제와 함께 활성 성분을 혼합함으로써 제조할 수 있으며 정제 또는 당의정 형태로 제조하기 위해 과립형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제로는 락토스, 수크로스, 만니톨 및 소비톨과 같은 슈가 형태 또는 옥수수, 밀가루, 쌀, 감자 또는 다른 식물로부터 전분, 메틸 셀룰로스, 하이드로시프로필메틸-셀룰로스 또는 나트륨 카복시메틸세룰로스와 같은 세룰로스, 아라빅 검, 타가칸쓰 검을 포함하는 검류와 같은 카보하이드레이트 또는 젤라틴, 콜라겐과 같은 단백질 필러를 사용할 수 있다. 필요한 경우에는, 교차결합된 폴리비닐피롤리돈, 아가 및 알긴산 또는 나트륨 알긴산과 같은 각각의 염 형태의 붕해제 또는 용해제를 첨가할 수 있다.

바람직한 양태로서, 비경구적 투여의 경우 본 발명의 의약 조성물은 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는, 한스 용액 (Hank's solution), 링거 용액 (Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 물리적으로 적절한 완충용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입 (injection) 현탁액은 소디움 카복시메틸 셀루로스, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. 덧붙여서, 활성 성분의 현탁액은 적합한 유질의 주입 현탁액 (oily injection suspensions)으로 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 담체는 참기름과 같은 지방산 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 복수양이온성 비지질 아미노 폴리머(polycationic amino polymers)도 운반체로서 사용될 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시키고 고농도의 용액을 제조하기 위해 적합한 안정화제 또는 약제를 사용할 수 있다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: ATPIF1에 의한 근육세포주에서의 AMPK 인산화 증가 확인

ATPIF1가 근육세포에서 AMPK(AMP-activated Protein Kinase)의 인산화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 5% FBS를 함유한 DMEM (10% FBS) 배지에서 근육세포주(ATCC C2C12)를 12-WELL plate 에 24 시간 배양한 후, ATPIF1 (Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA)을 각각 시간 및 농도별(0ng/ml, 6ng/ml, 20ng/ml, 60ng/ml, 200ng/ml 및 600ng/ml) 처리 후 세포질 단백질 30㎍을 취해 10% SDS-PAGE젤에서 전기영동한 후, AMPK(AMP-ACTIVATED PROTEIN KINASE) 인산화 항체 (Millipore-Upstate, Billerica, MA, USA)를 이용한 웨스텃 블럿 분석을 수행하였다.

그 결과, ATPIF1(60ng/ml)을 1~3시간 처리하였을 때, AMPK 인산화가 최대로 증가하는 것으로 확인되었다(도 1A). 또한, ATPIF1의 농도별로 각각 0ng/ml, 6ng/ml, 20ng/ml, 60ng/ml, 200ng/ml 및 600ng/ml 처리하였을 때, 20ng/ml에서 AMPK 인산화가 증가하기 시작하고, 60ng/ml ATPIF1 처리에서 최대의 효과를 나타내는 것으로 확인되었다(도 1B). AMPK 전체 단백질의 양은 비활성 AMPK 항체(Millipore-Upstate, Billerica, MA, USA)를 사용하여 확인하였다.

실시예 2: ATPIF1에 의한 근육세포주에서의 Akt의 인산화 증가 확인

Akt는 AMPK와 함께 당 조절에 관여하는 중요 단백질이다. ATPIF1가 근육세포에서 Akt의 인산화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실시예 1과 동일한 조건으로 배양한 근육세포주(C2C12)에 ATPIF1을 각각 시간 및 농도별 처리 후 세포질 단백질 30㎍을 취해 10% SDS-PAGE 젤에서 전기영동한 후, Akt 인산화 항체(Millipore-Upstate, Billerica, MA, USA)를 이용하여, 웨스턴블럿 분석을 수행하였다.

그 결과, ATPIF1(60ng/ml) 처리 후, 3시간에서 최대로 Akt 인산화가 증가하였다(도 2A). 또한 ATPIF1의 농도별로 각각 0ng/ml, 6ng/ml, 20ng/ml, 60ng/ml, 200ng/ml 및 600ng/ml 처리하였을 때, 20ng/ml 농도 처리 시에 증가하기 시작하고, 60ng/ml 농도를 처리하였을 때, 최대의 효과를 나타내었다(도 2B).

또한, Akt 상위물질인 PI3K에 대한 억제제인 LY294002(Calbiochem, San Diego, CA, USA)를 처리하면 ATPIF1에 의한 Akt 인산화 증가 현상이 사라지는 것을 확인하여, PI3K가 ATPIF1에 의한 Akt 인산화 과정에 관여하는 것을 확인하였다(도 2C). Akt 전체 단백질의 양은 비활성 Akt 항체(Millipore-Upstate, Billerica, MA, USA)를 이용하여 확인하였다.

실시예 3: ATPIF1에 의한 근육 세포주에서의 Glut4 단백질 발현 증가확인

당이 세포내로 이동하기 위해서는 transporter의 역할이 중요하며, 근육세포의 경우 Glut4가 트랜스포터로서 중요한 역할을 한다. ATPIF1에 의해 나타나는 AMPK의 인산화 증가 및 Akt 인산화 증가가 실제로 Glut4의 발현을 증가시키는지 확인하기 위하여, ATPIF1처리에 의한 근육세포 내의 Glut4 발현 변화를 glut4 항체(Millipore-Upstate, Billerica, MA, USA)를 이용하여 웨스턴 블럿으로 분석하였다.

그 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이, ATPIF1 처리에 의하여, 근육세포 내의 Glut4 발현이 증가하는 것으로 확인되었다.

또한, PI3K에 대한 억제제인 LY294002(Calbiochem, San Diego, CA, USA) 및 AMPK 억제제인 compound C(Calbiochem, San Diego, CA, USA) 처리하면 ATPIF1에 의한 Glut4 발현 증가 현상이 사라지는 것으로 확인되어, PI3K 및 AMPK가 Glut4 단백질 발현에 관여하는 것을 알 수 있었다(도 3B). 실험에 사용한 단백질의 양의 동일성을 보여주기 위해 beta-actin 항체(Millipore-Upstate, Billerica, MA, USA)를 활용해서 확인하였다.

실시예 4: ATPIF1에 의한 근육세포주에서 Glut4 mRNA 발현 증가 확인

ATPIF1에 의해 나타나는 glut4 단백질 발현 변화가 mRNA 수준에서도 나타나는지를 확인하기 위해 RT-PCR 분석을 수행하였다.

근육세포주(C2C12)에서, TRI 시약(Life Technologies, UK)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA 1μg에서 Thermoscript II one-step RT-PCR Kit (Life Technologies, UK)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA는 Gene Amp System 9700 thermocycler(Applied Biosystems, UK)로 증폭하였으며, PCR 반응은 34사이클(94℃ 30초, 55℃ 30초 및 72℃ 60초)을 수행한 후, 72℃에서 10분간 신장시켰다.

프라이머로는 하기 프라이머 쌍을 사용하였다.

GLUT4-sense: 5′-TTG GAG AGA GAG CGT CCA AT-3′(서열번호 2)

GLUT4-antisense: 5′-CTC AAA GAA GGC CAC AAA GC-3′(서열번호 3)

β-actin-sense: 5′-CAG GAG GAG CAA TGA TCT TGA-3′(서열번호 4)

β-actin-antisense: 5′-ACT ACC TCA TGA AGA TCC TCA-3′(서열번호 5)

상기 수행된 10μL의 RT-PCR 반응산물을 아가로즈 젤에 전기영동하여 확인하였다.

그 결과, 도 4A에 나타난 바와 같이, ATPIF1 처리에 의하여 근육세포 내에서 Glut4 mRNA발현이 증가하는 것으로 확인되었다.

또한, PI3K에 대한 억제제인 LY294002 (Calbiochem, San Diego, CA, USA) 및 AMPK 억제제인 compound C (Calbiochem, San Diego, CA, USA) 처리하면 ATPIF1에 의한 Glut4 mRNA 발현 증가 현상이 사라짐을 관찰함으로써 PI3K 및 AMPK가 Glut4 mRNA 발현과정에 관여함을 확인할 수 있었다 (B). 전체 mRNA 동일성을 보여주기 위해 beta-actin에 대해 확인하였다.

실시예 5: ATPIF1에 의한 근육세포주에서 당 섭취(glucose uptake) 증가 확인

당 조절 기전의 핵심은 포도당이 세포 내로 이동하는 섭취 현상이다.

ATPIF1에 의해 나타나는 AMPK 활성 증가가 실제로 당 섭취 현상을 증가시키는지 알아보기 위하여, 동위원소 라벨된 포도당을 이용하여 근육세포 내로 포도당이 실제로 섭취되는 지를 확인하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 5A에 나타난 바와 같이, ATPIF1에 의해 근육세포의 포도당 섭취가 증가하는 것을 확인하였다.

또한, 도 5B에 나타난 바와 같이, ATPIF1와 함께 PI3K에 대한 억제제인 LY294002 및 AMPK 억제제인 compound C 처리하는 경우, ATPIF1에 의한 당 섭취 증가 현상이 사라지는 것으로 나타나, PI3K 및 AMPK가 당 섭취과정에 관여하는 것을 확인할 수 있었다). 인슐린 (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 양성대조군으로 사용되었다.

실시예 6: ATPIF1의 근육세포주에서 인슐린 센서타이저 기능 확인

제2형 당뇨병 환자들은 대부분 인슐린 저항성을 나타내고, 이는 치료에 가장 큰 걸림돌이다. 이를 극복하기 위해서는 인슐린 반응에 민감하게 만들어 줄 인슐린 센서타이저 개발이 필요한데, AMPK와 Akt 활성을 증가시키는 ATPIF1이 인슐린 센서타이저 기능을 나타낼 수 있는지를 당 섭취 실험을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 인슐린 및 ATPIF1을 각각 단독 처리한 경우보다 ATPIF1과 인슐린을 함께 처리하였을 때 인슐린에 의한 당 섭취 현상이 더욱 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 ATPIF1이 인슐린 센서타이저 효능을 가지고 있음을 보여준다.

실시예 7: 지방세포에서 ATPIF1의 지방합성 억제 및 갈색화 촉진 확인

ATPIF1의 비만조절 가능성을 하기 위하여, 지방합성 조절 단백질인 ACC의 인사화를 ATPIF1가 조절하는지 확인하였다.

DMEM (10% FBS) 배지에서 지방세포주(3T3L1)(ATCC: American Type Culture Collection)에서 ACC 인산화 항체(Millipore-Upstate, Billerica, MA, USA)를 이용하여 WESTERN BLOT 실험을 조사하였다.

그 결과, 도 7A에 나타난 바와 같이, ATPIF1 처리 후, 30분 및 1시간 후 최대로 ACC 인산화가 증가하는 것으로 확인되었으며, 도 7B에 나타난 바와 같이, ATPIF1의 농도별로 각각 0ng/ml, 6ng/ml, 20ng/ml, 60ng/ml, 200ng/ml 및 600ng/ml 처리하였을 때, 20ng/ml 농도 처리 시에 ACC 인산화가 증가하기 시작하였고, 60ng/ml 농도에서 최대의 효과를 나타내었다.

지방세포주(3T3L1)에서, TRI 시약(Life Technologies, UK)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA 1μg에서 Thermoscript II one-step RT-PCR Kit (Life Technologies, UK)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA는 Gene Amp System 9700 thermocycler(Applied Biosystems, UK)로 증폭하였으며, PCR 반응은 34사이클(94℃ 30초, 55℃ 30초 및 72℃ 60초)을 수행한 후, 72℃에서 10분간 신장시켰다.

프라이머로는 하기 프라이머 쌍을 사용하였다.

UCP1- sense-CTG CCT CTC TCG GAA ACA AG(서열번호 6)

UCP1-antisense:- GCC ACA AAC CCT TTG AAA AA(서열번호 7)

β-actin-sense: 5′-CAG GAG GAG CAA TGA TCT TGA-3′(서열번호 4)

β-actin-antisense: 5′-ACT ACC TCA TGA AGA TCC TCA-3′(서열번호 5)

그 결과, 지방세포에서 갈색화 표지 유전자인 UCP1의 발현 변화에 대한 RT-PCR 실험결과, ATPIF1을 처리하였을 때 UCP1 mRNA 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있으며(도 7C), 이는 ATPIF1이 지방 합성 억제뿐만아니라, 지방의 갈색화 촉진 기능도 가지고 있음을 보여준다.

비만은 지방생성과정에 의하여 지방세포의 세포내 중성지방(triglyceride, TG)의 축적으로 발생하며 이러한 지방생성기전을 조절하는 것이 비만 억제의 효과적인 치료방법으로 알려져 있고(Chen, H. C. and Farese, R. V.Arterioscler Thromb Vasc Biol 25,482-4865,2005; Cooke, D. and Bloom, S., Nat Rev Drug Discov 5, 919-1200, 2006), 갈색지방세포가 열 생성에 의하여 비만과 당뇨병 치료에 효과적이므로(Aaron M Cyess and C Ronald Kanh, Curr OPin Endocrinol Diabetes obes, 17:143, 2010), 상기 결과는 ATPIF1이 비만 치료효과를 나타낸다는 것을 나타낸다.

실시예 8: 운동한 쥐의 혈액에서 ATPIF1의 농도 분석

ATPIF1의 생리적 중요성을 확인하기 위해 운동한 동물의 혈액에서 ATPIF1의 농도가 증가하는지 확인하였다.

그룹당 마우스(BALB/c, 중앙실험동물) 10 마리씩 준비하여 단기 운동(1시간 운동 후 혈액 체취) 조건(B)과 장기 운동 (하루에 한시간씩 한달간 운동)을 시킨 마우스(A)의 혈액을 이용하여 ATIF1에 대한 ELIZA 키트(Myobiosource, San Diego, California, USA)로 측정하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 단기 및 장기 운동 그룹 모두에서 대조군에 비해 ATIF1의 농도가 증가함을 보여준다. 이 결과는 실제 운동시 ATIF1이 근육조직에서 분비되어 혈액 속에 높게 존재한다는 것이고, 이것은 마이오카인 ATIF1이 실제 in vivo 조건에서도 유의미한 생리적 역할을 담당할 수 있고, 향후 임상적으로도 활용 가능함을 의미한다.

실시예 9: 동물실험에서 ATPIF1의 glucose tolerance 개선효과

제2형 당뇨모델 dbdb 마우스(중앙실험동물, 대한민국)에 재조합 단백질 ATPIF1 단백질을 5mg/kg 농도로 총 10주간 복강 투여 후 인슐린 저항성 개선 여부를 조사하기 위하여 GTT(glucose tolerance test)를 시행하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 대조군이나 GST만 투여한 쥐에서보다 ATPIF1을 투여한 쥐에서 혈당 증가 정도가 완화되는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 ATPIF1이 인슐린 저항성을 개선하여 당 조절 기능을 수행할 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 ATPIF1을 함유하는 조성물은 근육세포에서의 당 흡수를 촉진하고 인슐린 민감성을 향상시켜 당뇨 치료효과를 가지며, 지방세포에서 지방합성을 억제하고 지방세포의 갈색화를 촉진하는 효과를 가지고 있어, 비만을 예방 또는 치료하는 효과를 가진다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

전자파일 첨부하였음.

Claims

ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)을 유효성분으로 함유하는 당뇨 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 당뇨는 제1형 당뇨 또는 초기 제2형 당뇨인 것을 특징으로 하는 당뇨 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 당뇨 합병증은 당뇨성 신증, 당뇨성 망막증, 고지혈증 및 지방간으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는 당뇨 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)은 인슐린 감수성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 당뇨 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 인슐린 또는 인슐린 아날로그를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
ATPIF1(ATPase inhibitor factor 1)을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.