[go: up one dir, main page]

WO2017116191A2 - 지속형 인간 성장 호르몬 결합체의 신규 액상 제제 - Google Patents

지속형 인간 성장 호르몬 결합체의 신규 액상 제제 Download PDF

Info

Publication number
WO2017116191A2
WO2017116191A2 PCT/KR2016/015534 KR2016015534W WO2017116191A2 WO 2017116191 A2 WO2017116191 A2 WO 2017116191A2 KR 2016015534 W KR2016015534 W KR 2016015534W WO 2017116191 A2 WO2017116191 A2 WO 2017116191A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hgh
liquid formulation
sustained
conjugate
growth hormone
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2016/015534
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2017116191A3 (ko
Inventor
임형규
동주영
배성민
권세창
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Hanmi Pharmaceutical Industries Co Ltd
Original Assignee
Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Hanmi Pharmaceutical Industries Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to MX2018008026A priority Critical patent/MX2018008026A/es
Priority to CA3009627A priority patent/CA3009627A1/en
Priority to EP16882143.7A priority patent/EP3398586A4/en
Priority to BR112018013535-6A priority patent/BR112018013535A2/pt
Priority to HK19100601.0A priority patent/HK1258240A1/en
Priority to RU2018125963A priority patent/RU2018125963A/ru
Priority to CN201680081848.9A priority patent/CN108697642A/zh
Priority to US16/066,877 priority patent/US20190022183A1/en
Application filed by Hanmi Pharmaceutical Co Ltd, Hanmi Pharmaceutical Industries Co Ltd filed Critical Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Priority to JP2018534559A priority patent/JP2019500390A/ja
Priority to AU2016382383A priority patent/AU2016382383A1/en
Publication of WO2017116191A2 publication Critical patent/WO2017116191A2/ko
Publication of WO2017116191A3 publication Critical patent/WO2017116191A3/ko
Priority to IL260316A priority patent/IL260316A/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1796—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to liquid formulations of sustained human growth hormone conjugates and methods for their preparation.
  • hGH Human growth hormone
  • hGH Human growth hormone
  • hGH has been successfully produced in Escherichia coli and yeast.Recombinant hGH products produced by these genetic engineering methods have been subjected to toxicity and clinical trials, and have been licensed in various countries since 1985. have.
  • Polypeptides such as hGH are generally less stable and readily denatured and degraded by proteolytic enzymes in the blood and are easily removed by the kidneys or liver. To maintain, the protein drug needs to be frequently administered to the patient. However, in the case of protein medicines that are administered to patients in the form of injections in most cases, frequent injections to maintain blood levels of active polypeptides cause pain in the patient. In order to solve this problem, efforts have been made to maximize the drug efficacy by increasing the blood stability of protein drugs and maintaining high blood drug concentrations for a long time. It is desirable that such a sustained-release preparation of protein drug should increase the stability of the protein drug while keeping the titer of the drug itself high enough and not induce an immune response in the patient.
  • the sustained hGH conjugate may be prepared by the above method.
  • a drug containing the sustained hGH conjugate may be applied to impurities in light, heat, or additives during storage and transportation. It is essential to maintain the effect in vivo while suppressing physicochemical changes such as denaturation, aggregation, adsorption or hydrolysis caused by deterioration induced.
  • Sustained hGH conjugates are bulkier than hGH on polypeptides and have increased molecular weight which makes it very difficult to stabilize compared to hGH on polypeptides.
  • the hGH which is a physiologically active peptide
  • an immunoglobulin Fc region since the hGH, which is a physiologically active peptide, and an immunoglobulin Fc region are combined, the molecular weight and volume are significantly different from those of the general hGH. Required.
  • the hGH and immunoglobulin Fc regions, which are physiologically active peptides are peptides or proteins with different physicochemical properties, respectively, the hGH and immunoglobulin Fc regions, which are physiologically active peptides, must be simultaneously stabilized.
  • the present inventors have made diligent efforts to find a composition for enhancing stability and lowering protein precipitation so that the sustained hGH conjugate can be stored for a long period of time without fear of viral contamination.
  • buffers, sugar alcohols, and nonionics are not included, without including isotonic agents.
  • a stabilizer containing a surfactant it is possible to increase the stability of the novel long-acting hGH conjugate to prepare an economical and stable liquid formulation, and also when the liquid formulation further contains a preservative.
  • the present invention was completed by confirming that a multi-use liquid formulation capable of maintaining high stability of the hGH conjugate was provided.
  • One object of the present invention is a sustained hGH conjugated liquid formulation comprising a sustained human growth hormone (hGH) conjugate and an albumin-free stabilizer containing a buffer, a sugar alcohol, a nonionic surfactant, and a preservative To provide.
  • hGH sustained human growth hormone
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing the sustained hGH conjugate liquid formulation.
  • Still another object of the present invention is to provide a therapeutic use of the pituitary dwarfism, growth hormone deficiency, Fred Willy syndrome or idiopathic short stature of the sustained hGH conjugated liquid formulation.
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating pituitary dwarfism, growth hormone deficiency, Fred Willy syndrome or idiopathic short stature, comprising administering the sustained hGH conjugate liquid formulation.
  • the liquid formulation of the sustained hGH conjugate according to the present invention does not contain human serum albumin and potentially harmful factors to humans, so there is no fear of viral infection, and the molecular weight of the hGH conjugate is composed of hGH and immunoglobulin Fc regions. Provides good storage stability for long-acting hGH conjugates with large, bioactive durations. It is also possible to provide a stable liquid formulation that can be used multiple times, including a preservative. Such a liquid formulation of the present invention is a formulation that can provide economical compared to other stabilizers or lyophilized formulations by showing a good storage stability in a simple formulation. In addition, compared to the conventional hGH formulations can maintain protein activity in the human body for a long time can be used as an effective drug formulation.
  • 1a and 1b are the results of an experiment on the effect of the liquid formulation containing a preservative for multiple administrations according to the present invention on the stability of low concentration sustained hGH conjugate.
  • 1A and 1B are graphs analyzed by IE-HPLC after storage at 4 ° C. and 25 ° C., respectively, and IE-HPLC (%) is (Area% / Start Area%), and low concentration is maintained compared to the initial result value. The residual rate of the type hGH conjugate is shown. As a result, it was found that when m-cresol, phenol, or benzyl alcohol was included as a preservative, there was no significant difference in stability compared to the case where it was not.
  • 2a and 2b are the results of experiments on the effect of preservatives added for multiple administrations on the stability of high concentration sustained hGH conjugates based on the liquid formulation of FIG. 1, respectively.
  • IE-HPLC IE-HPLC (%) is (Area% / Start Area%), the residual ratio of high concentration sustained hGH conjugate compared to the initial result value Indicates.
  • One embodiment for implementing the present invention comprises an albumin-free stabilizer comprising (i) a sustained human growth hormone (hGH) conjugate, and (ii) a buffer, a sugar alcohol, a nonionic surfactant, and a preservative. Long-acting hGH conjugate liquid formulation.
  • hGH sustained human growth hormone
  • the albumin-free stabilizer is characterized in that it does not include isotonic agents, such as sodium chloride.
  • the sustained human growth hormone conjugate is a sustained human growth hormone conjugate in which human growth hormone and an immunoglobulin Fc region are combined.
  • the sustained human growth hormone conjugate is in the form of a fusion protein in which the human growth hormone and the immunoglobulin Fc region are linked through a non-peptidyl polymer, or the human growth hormone and the immunoglobulin Fc region are linked using recombinant technology. It is characterized by.
  • the non-peptidyl polymer is polypropylene glycol, polyethylene glycol, copolymer of ethylene glycol and propylene glycol, polyoxy ethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, PLA (Polylactic acid, polylactic acid) and biodegradable polymers such as PLGA (polylactic-glycolic acid, polylactic-glycolic acid), lipid polymers, chitin, hyaluronic acid, and combinations thereof.
  • PLA Polylactic acid, polylactic acid
  • biodegradable polymers such as PLGA (polylactic-glycolic acid, polylactic-glycolic acid), lipid polymers, chitin, hyaluronic acid, and combinations thereof.
  • non-peptidyl polymer is characterized in that polyethylene glycol.
  • the buffer solution is characterized in that the citric acid buffer solution or acetic acid buffer solution.
  • the pH range of the buffer is characterized in that 4.0 to 7.0.
  • the sugar alcohol is at least one selected from the group consisting of mannitol, sucrose, and sorbitol.
  • the concentration of sugar alcohol is characterized in that 1% (w / v) to 10% (w / v) of the total volume of the liquid formulation.
  • the nonionic surfactant is polysorbate or poloxamer.
  • the concentration of the nonionic surfactant is characterized in that 0.001% (w / v) to 0.1% (w / v) relative to the total volume of the liquid formulation.
  • the preservative is at least one selected from the group consisting of m-cresol, phenol, and benzyl alcohol.
  • the concentration of the preservative is characterized in that 0.01% to 1.0% (w / v) relative to the total volume of the liquid formulation.
  • liquid formulation is characterized in that for multiple administration.
  • the concentration of the sustained hGH conjugate in the liquid formulation is characterized in that from 1mg / mL to 100mg / mL.
  • the stabilizer is characterized in that it further comprises one or more components selected from the group consisting of sugars, polyhydric alcohols and amino acids.
  • the hGH is characterized in that the hGH having the same amino acid as the native type hGH, the hGH in which the amino acid of the native type hGH is mutated, or a peptide analogue showing similar activity to the native type GH.
  • the sustained hGH conjugated liquid formulation comprises (i) a sustained human growth hormone (hGH) conjugate in which a human growth hormone (hGH) and an immunoglobulin Fc region are combined, and (ii) a buffer solution. And an albumin-free stabilizer composed of a sugar alcohol, a nonionic surfactant, and a preservative.
  • the buffer solution is citric acid buffer solution
  • sugar alcohol is mannitol
  • the surfactant is polysorbate 80
  • the preservative is characterized in that selected from the group consisting of m-cresol, phenol and benzyl alcohol.
  • the immunoglobulin Fc region is derived from IgG, IgA, IgD, IgE or IgM.
  • each domain of said immunoglobulin Fc region is a hybrid of domains with different origins derived from immunoglobulins selected from the group consisting of IgG, IgA, IgD, IgE and IgM.
  • the immunoglobulin Fc region is a dimer or multimer consisting of short-chain immunoglobulins consisting of domains of the same origin.
  • the immunoglobulin Fc region is a human nonglycosylated IgG4 Fc region.
  • the agent is characterized for the treatment of pituitary dwarfism, growth hormone deficiency, Freddie Willy syndrome or idiopathic short stature.
  • Another embodiment for embodying the present invention comprises mixing a human growth hormone conjugate comprising a human growth hormone and an immunoglobulin Fc region with a buffer, a sugar alcohol, a nonionic surfactant, and a preservative.
  • Type hGH conjugate is a method for preparing a liquid formulation.
  • Another aspect for embodying the present invention is the use of the sustained hGH conjugated liquid formulation for the treatment of pituitary dwarfism, growth hormone deficiency, Freddie Willy syndrome or idiopathic short stature.
  • Another aspect for embodying the present invention is a method of treating pituitary dwarfism, growth hormone deficiency, Freddie Willy syndrome or idiopathic short stature, comprising administering the sustained hGH conjugate liquid formulation.
  • One embodiment for embodying the present invention is (i) a sustained human growth hormone (hGH) conjugate in which a human growth hormone (hGH) and an immunoglobulin Fc region are combined, and (ii) a buffer solution, a sugar alcohol
  • hGH conjugate liquid formulation comprising an albumin-free stabilizer containing a nonionic surfactant, and a preservative.
  • sustained hGH conjugate and its components included in the liquid formulation will be described in detail below. Meanwhile, each of the descriptions and the embodiments disclosed herein may be applied to each of the other descriptions and the embodiments. That is, all combinations of the various elements disclosed herein are within the scope of the present invention.
  • sustained human growth hormone conjugate is a protein in a carrier-linked form with a human growth hormone (hGH), which is a bioactive peptide, and refers to a conjugate having an increased duration of physiological activity compared to a native type hGH.
  • the protein may be a form in which an immunoglobulin Fc region is linked to a human growth hormone (hGH) which is a bioactive peptide.
  • the carrier may be selected from the group consisting of an immunoglobulin Fc region, albumin, transferrin and PEG, specifically, an immunoglobulin Fc region, but is not limited thereto.
  • sustained form means that the duration of physiological activity is increased compared to the natural form
  • conjugate refers to a form in which hGH and a carrier are combined.
  • the sustained human growth hormone conjugate is a human growth hormone and a carrier, specifically, an immunoglobulin Fc region is linked through a non-peptidyl polymer, or a recombinant human growth hormone and a protein form of a carrier, specifically May be in the form of a fusion protein to which an immunoglobulin Fc region is linked, but is not limited thereto.
  • a fusion protein form a form in which a carrier of human growth hormone and a protein form, in particular, an immunoglobulin Fc region, is connected through a peptide linker is included in the scope of the present invention.
  • the hGH is a concept including all of the hGH having the same amino acid as the native hGH, the hGH in which the amino acid of the natural hGH is mutated, or a peptide analogue showing similar activity to the natural GH.
  • Examples of the variation include, but are not limited to, substitution, removal, or insertion of amino acids constituting hGH, and the variation can be made within a range that does not significantly affect the biological activity of hGH.
  • the hGH may be of any natural or recombinant origin, specifically, it may be a recombinant hGH produced using a microorganism as a host cell, but is not limited thereto.
  • the microorganisms include E. coli, but are not limited thereto.
  • the sequence of hGH can be obtained from a known database such as GenBank of NCBI, and as long as it shows the activity of hGH, 70% with natural form, specifically 80%, more specifically 90%, even more specifically 95 %, Most specifically 98% or more.
  • non-peptidyl polymer refers to a biocompatible polymer having at least one repeating unit bonded thereto.
  • the repeating units are linked to each other through any covalent bond, not a peptide bond.
  • the non-peptidyl polymer may be used in combination with the non-peptidyl linker.
  • the non-peptidyl polymers include polypropylene glycol, polyethylene glycol, copolymers of ethylene glycol and propylene glycol, polyoxy ethylated polyols, polyvinyl alcohol, polysaccharides, dextran, polyvinyl ethyl ether, PLA (polylactic acid, polylactic acid) and biodegradable polymers such as PLGA (polylactic-glycolic acid), lipid polymers, chitin, hyaluronic acid, and combinations thereof, and specifically, polyethylene glycol, This is not restrictive.
  • the non-peptidic polymer also includes derivatives thereof known in the art and derivatives which can be easily prepared in the state of the art.
  • the disadvantage of the peptidic linkers used in fusion proteins prepared by the conventional inframe fusion method is that they are easily cleaved by proteases in vivo, so that the half-life increase effect of the active drug by the carrier cannot be achieved as expected. will be.
  • the use of polymers resistant to proteases can maintain the blood half-life of peptides at carrier-like levels. Therefore, the non-peptidyl polymer may be used without limitation as long as it is a polymer that is resistant to the above-described role, that is, protease in vivo.
  • the molecular weight of the non-peptidyl polymer may range from 1 to 100 kDa, specifically, 1 to 20 kDa, but is not limited thereto.
  • the non-peptidyl polymer of the present invention, which is combined with the immunoglobulin Fc region may be used not only as one kind of polymer but also as a combination of different kinds of polymers.
  • the immunoglobulin Fc region refers to the heavy chain constant region 2 (CH2) and the heavy chain constant region 3, except for the heavy and light chain variable regions, heavy chain constant region 1 (CH1) and light chain constant region (CL1) of the immunoglobulin (CH3) portion, and may include a hinge portion in the heavy chain constant region.
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention has a substantially equivalent or improved effect as the natural type, only some or all heavy chain constant region 1 (CH1) and / or light chain constant region, except for the heavy and light chain variable regions of immunoglobulin It may be an extended Fc region including 1 (CL1).
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention comprises 1) CH1 domain, CH2 domain, CH3 domain and CH4 domain, 2) CH1 domain and CH2 domain, 3) CH1 domain and CH3 domain, 4) CH2 domain and CH3 domain, 5) Combination of one or two or more domains with an immunoglobulin hinge region (or a portion of the hinge region), 6) heavy chain constant region dimer of each domain and light chain constant region.
  • This immunoglobulin Fc region is advantageous in terms of the preparation, purification and yield of the conjugate because of its relatively low molecular weight compared to the whole immunoglobulin molecule, as well as the homogeneity of the substance because the amino acid sequence varies from antibody to antibody and the Fab portion showing high heterogeneity is removed. This effect can be expected to be greatly increased and the likelihood of inducing blood antigens is lowered.
  • immunoglobulin Fc regions of the present invention include not only native amino acid sequences but also sequence derivatives thereof.
  • Amino acid sequence derivatives mean that one or more amino acid residues in a natural amino acid sequence have different sequences by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof.
  • IgG Fc amino acid residues 214 to 238, 297 to 299, 318 to 322 or 327 to 331 which are known to be important for binding can be used as suitable sites for modification.
  • various kinds of derivatives are possible, such as a site capable of forming disulfide bonds, a few amino acids at the N-terminus in the native Fc, or a methionine residue may be added at the N-terminus of the native Fc.
  • the complement binding site for example, C1q binding site may be removed to remove the effector function (antibody dependent cell mediated cytotoxicity) ADCC site may be removed.
  • Amino acid exchanges in proteins and peptides that do not alter the activity of the molecule as a whole are known in the art (H. Neurode, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Phe, Ala / Exchange between Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu, Asp / Gly.
  • it may be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, acetylation and amylation. may be modified.
  • Fc derivatives are derivatives which exhibit the same biological activity as the Fc region of the present invention and have enhanced structural stability against heat, pH, etc. of the Fc region.
  • the Fc region may be obtained from a natural type separated in vivo from animals such as humans, cows, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats or guinea pigs, or obtained from transformed animal cells or microorganisms. It may be recombinant or a derivative thereof.
  • the method of obtaining from the natural form may be a method of separating the whole immunoglobulin from a human or animal living body, and then processing the protease. Papain is cleaved into Fab and Fc and pepsin is cleaved into pF'c and F (ab) 2 . This may be separated by Fc or pF'c using size-exclusion chromatography.
  • a recombinant immunoglobulin Fc region obtained from a microorganism with a human-derived Fc region but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region may be in a natural sugar chain, an increased sugar chain compared to the natural form, a reduced sugar chain or a sugar chain removed from the natural form.
  • Conventional methods such as chemical methods, enzymatic methods, and genetic engineering methods using microorganisms can be used to increase or decrease such immunoglobulin Fc sugar chains.
  • the immunoglobulin Fc region in which the sugar chain is removed from the Fc is significantly reduced in binding strength with the complement (c1q), and the antibody-dependent cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity is reduced or eliminated, thereby not causing an unnecessary immune response in vivo. Do not.
  • a form more consistent with the original purpose as a carrier of the drug would be the immunoglobulin Fc region from which the sugar chains have been removed or unglycosylated.
  • “Deglycosylation” refers to an Fc region in which sugar is removed by an enzyme
  • Aglycosylation refers to an Fc region that is not glycosylated by prokaryotic animals, preferably E. coli.
  • the immunoglobulin Fc region may be of human origin or animal origin such as cattle, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats, guinea pigs, and the like, but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region may be an Fc region by IgG, IgA, IgD, IgE, IgM derived or combinations thereof or hybrids thereof. It is specifically derived from IgG or IgM, which is most abundant in human blood and even more specifically from IgG known to enhance the half-life of ligand binding proteins.
  • “combination” in the present invention means that, when forming a dimer or multimer, a polypeptide encoding a single-chain immunoglobulin Fc region of the same origin forms a bond with a single-chain polypeptide of different origin. That is, it is possible to prepare dimers or multimers from two or more fragments selected from the group consisting of Fc fragments of IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc and IgE.
  • hybrid refers to the presence of a sequence corresponding to two or more immunoglobulin Fc fragments of different origin within an immunoglobulin Fc region of a single chain.
  • various types of hybrids are possible. That is, hybridization of a domain consisting of 1 to 4 domains from the group consisting of CH1, CH2, CH3 and CH4 of IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc and IgD Fc is possible, and may include a hinge.
  • IgG can also be divided into subclasses of IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 and combinations or hybridization thereof are also possible in the present invention. Specifically, it is the IgG2 and IgG4 subclasses, and more specifically, the Fc region of IgG4 having little effector function such as Complement dependent cytotoxicity (CDC).
  • CDC Complement dependent cytotoxicity
  • the immunoglobulin Fc region for a carrier of the drug of the present invention is a non-glycosylated Fc region from human IgG4.
  • Human-derived Fc regions are preferred over non-human-derived Fc regions that can cause undesirable immune responses, such as acting as antigens in human living organisms to produce new antibodies against them.
  • the sustained hGH conjugate used in the present invention may be prepared by treating hGH and natural IgG prepared by any method of natural or recombinant origin with a specific protease or by combining immunoglobulin Fc regions prepared from transformed cells using recombinant technology. It can manufacture.
  • the hGH and the immunoglobulin Fc region may be cross-linked using a non-peptidyl polymer, or may be prepared as a fusion protein in a form in which the hGH and immunoglobulin Fc regions are linked by recombinant technology.
  • Korean Patent No. 10-0725315 protein conjugates using immunoglobulin fragments and preparation methods thereof
  • US Patent Publication No. 2013-0288333 etc. It is included as a reference.
  • the term "sustained hGH conjugate liquid formulation” means a liquid formulation comprising a sustained hGH conjugate.
  • the liquid formulation is a concept including both the liquid and external formulations of the liquid.
  • the long-acting hGH conjugate liquid formulation may include a therapeutically effective amount of a long-acting hGH conjugate, and in general, the therapeutically effective amount of hGH is about 1 to 3 mg in a single-use vial. Is not limited thereto.
  • the concentration of the sustained hGH conjugate included in the liquid formulation of the present invention may be 1 mg / mL to 200 mg / mL, specifically 1 mg / mL to 100 mg / mL, and more specifically 10 to 58.5 mg / mL. This is not restrictive.
  • the sustained-type hGH conjugated liquid formulation of the present invention can stably store the conjugate without precipitation even when it is present at a high concentration as well as when the long-term hGH conjugate is present in a stable manner, thereby stably supplying a high concentration of hGH in vivo.
  • the sustained hGH conjugate liquid formulation of the present invention comprises a pharmacologically effective amount of a sustained hGH conjugate, and an albumin-free stabilizer.
  • stabilizer refers to an agent that contains a component that allows stable storage of the hGH conjugate.
  • storage stability is important not only to ensure accurate dosage, but also to inhibit the potential production of antigenic substances such as aggregates of long-acting hGH conjugates.
  • the stabilizer preferably contains a buffer solution, a sugar alcohol, and a nonionic surfactant, and may further include a preservative. More specifically, the stabilizer may be essentially composed of a buffer solution, a sugar alcohol, a nonionic surfactant, and a preservative, but is not limited thereto. In addition, the stabilizer may be one that does not include isotonic agents such as sodium chloride, but is not limited thereto.
  • the buffer serves to maintain the pH of the solution so that the pH of the solution formulation does not change rapidly to stabilize the long-acting hGH conjugate.
  • the buffer may be any of the other pharmaceutically acceptable salts known in the art, including alkali salts (sodium or potassium phosphate or hydrogen or dihydrogen salts thereof), sodium citrate / citric acid (sodium citrate / citric acid), sodium acetate / acetic acid pH buffers may be included, and mixtures of these buffers may also be used.
  • alkali salts sodium or potassium phosphate or hydrogen or dihydrogen salts thereof
  • sodium citrate / citric acid sodium citrate / citric acid
  • sodium acetate / acetic acid pH buffers may be included, and mixtures of these buffers may also be used.
  • More preferred buffers for the purposes of the present invention are acetic acid or citric acid buffers (e.g. sodium acetate, sodium citrate), even more preferably citric acid buffers.
  • acetic acid or citric acid buffers e.g. sodium acetate, sodium citrate
  • the concentration of acetate and citrate constituting acetic acid or citric acid buffer is specifically 1 mM to 100 mM, even more specifically 3 mM to 100 mM, but is not limited thereto.
  • the pH of the buffer solution is specifically 4.0 to 8.0, more specifically 4.0 to 7.0, but is not limited thereto.
  • Sugar alcohols may play a role in enhancing the stability of the sustained hGH conjugate.
  • the concentration of sugar alcohol used in the present invention is specifically 1% to 20% (w / v), more specifically 1% to 10% (w / v) compared to the total liquid formulation, but is not limited thereto.
  • the sugar alcohol is not particularly limited thereto, but one or more selected from the group consisting of mannitol, sucrose and sorbitol may be used, specifically mannitol or sorbitol, and more specifically mannitol may be used.
  • Nonionic surfactants lower the surface tension of the protein solution to prevent the protein from adsorbing or agglomerating onto hydrophobic surfaces.
  • nonionic surfactants that can be used in the present invention include polysorbate-based nonionic surfactants and poloxamer-based nonionic surfactants, and the like, and these may be used in one or two or more combinations, among others.
  • Polysorbate-based nonionic surfactants are more preferred, but are not limited thereto.
  • polysorbate-based nonionic surfactants examples include polysorbate 20, polysorbate 40, polysorbate 60, and polysorbate 80, among which polysorbate 80 may be preferred, but is not limited thereto. no.
  • the nonionic surfactant is specifically low concentration of 0.1% (w / v) or less, more specifically 0.001% to 0.1% (w / v), but is not limited thereto.
  • the said stabilizer of this invention does not contain albumin. Since human serum albumin, which can be used as a stabilizer of protein, is made from human blood, there is a possibility of contamination by pathogenic viruses derived from humans, and gelatin or bovine serum albumin causes disease, or in some cases, allergy. There is a possibility of causing a reaction.
  • the albumin-free stabilizers of the present invention do not contain heterologous proteins, such as serum albumin or purified gelatin derived from humans or animals, and there is no fear of viral infection.
  • the stabilizer of the present invention may further comprise a sugar, a polyhydric alcohol or a neutral amino acid.
  • sugars in the saccharides and polyhydric alcohols which may be further included to increase the storage stability of the long-acting hGH conjugate include monosaccharides such as mannose, glucose, fucose and xylose and lactose, maltose, sucrose, raffinose and Polysaccharides such as dextran, and the like, and specific examples of the polyhydric alcohols include propylene glycol, low molecular weight polyethylene glycol, glycerol, low molecular weight polypropylene glycol, and the like, in the form of one or two or more thereof. Can be used.
  • the sustained-type hGH conjugated liquid formulation of the present invention may further include a preservative for the purpose of preventing microbial contamination of the multi-dose preparation, in addition to the binder, the buffer solution, the sugar alcohol, and the nonionic surfactant described above.
  • preservative means a compound added to a pharmaceutical formulation to act as an antimicrobial agent, and such preservatives include benzetonium, chlorohexidine, phenol, m-cresol, benzyl alcohol, methylparaben, propylparaben , Chlorobutanol, o-cresol, p-cresol, chlorocresol, benzalkonium chloride, phenyl mercuric acid nitrate, thimerosal, benzoic acid and the like can be used, but is not limited thereto.
  • the liquid formulation of the present invention may contain one or more of m-cresol, phenol, and benzyl alcohol as a preservative.
  • the preservative may be included in an amount of 0.01% to 3% (w / v), more specifically may be included in an amount of 0.1% to 1.0% (w / v), but is not limited thereto. Do not.
  • liquid formulations of the novel long-acting hGH conjugates of the present invention further comprising a preservative in addition to the stabilizers described above can be used for multiple administrations.
  • the liquid formulation of the present invention may optionally further include other ingredients or substances known in the art within the scope of not impairing the effects of the present invention. It may be.
  • the liquid formulation more specifically comprises (i) a sustained hGH conjugate conjugated with hGH and an immunoglobulin Fc region, and (ii) an albumin-free stabilizer consisting of a buffer solution, a sugar alcohol, a nonionic surfactant, and a preservative. It may be included, but is not limited thereto.
  • the buffer solution is citric acid buffer solution
  • sugar alcohol is mannitol
  • the surfactant is polysorbate 80
  • the preservative may be selected from the group consisting of m-cresol, phenol and benzyl alcohol.
  • liquid formulation is more specifically, 20 mM sodium citrate, 4% mannitol, 0.005% polysorbate 80, and a preservative, when the concentration of the sustained hGH conjugate is 10.0 mg / mL to 58.5 mg / mL, pH 5.2. And m-cresol, phenol, or benzyl.
  • the agent may be for the treatment of pituitary dwarfism, growth hormone deficiency, Fred Willy syndrome or idiopathic short stature. That is, it may correspond to a pharmaceutical composition.
  • the present invention provides a method for preparing the liquid formulation.
  • the preparation method may comprise mixing a human growth hormone conjugated with a human growth hormone and an immunoglobulin Fc region with a buffer solution, a sugar alcohol, a nonionic surfactant, and a preservative.
  • the method includes preparing a sustained hGH conjugate, and mixing the sustained hGH conjugate prepared in the step with a stabilizer including a buffer solution, a sugar alcohol, and a nonionic surfactant. can do. It is also possible to prepare stable long-acting hGH conjugate liquid formulations for multiple use by further mixing the preservatives in addition to the stabilizers.
  • stabilizers comprising sodium citrate as buffer, mannitol as sugar alcohol, polysorbate 80 as surfactant, and m-cresol, phenol, or benzyl alcohol as preservatives have low and high concentrations of sustained hGH. It has been shown to be a stabilizer that provides stability without causing precipitation in the binder. That is, it was confirmed that a stable liquid formulation without precipitation in the sustained hGH conjugate of 10 to 58.5 mg / mL was confirmed.
  • the present invention provides an albumin-r comprising (i) a sustained hGH conjugate conjugated to hGH and an immunoglobulin Fc region, and (ii) a buffer, a sugar alcohol, a nonionic surfactant, and a preservative.
  • a sustained hGH conjugate conjugated to hGH and an immunoglobulin Fc region comprising (i) a sustained hGH conjugate conjugated to hGH and an immunoglobulin Fc region, and (ii) a buffer, a sugar alcohol, a nonionic surfactant, and a preservative.
  • the sustained hGH conjugated liquid formulation containing hGH may have an effect of improving, preventing or treating symptoms of the pituitary dwarfism, growth hormone deficiency, Fred Willy syndrome or idiopathic short stature disease.
  • the present invention provides an albumin-r comprising (i) a sustained hGH conjugate conjugated to hGH and an immunoglobulin Fc region, and (ii) a buffer, a sugar alcohol, a nonionic surfactant, and a preservative.
  • a method of treating pituitary dwarfism, growth hormone deficiency, Freddie Willy syndrome or idiopathic short stature comprising administering the sustained hGH conjugated liquid formulation comprising a containing stabilizer.
  • ALD-PEG-ALD a polyethylene glycol having a molecular weight of about 3.4 kDa with an aldehyde reactor at both ends, is coupled to human growth hormone (hGH, molecular weight 22 kDa), which is a non-glycosylated Fc region from human IgG4 (about 50 kDa) was bound to the N terminus to prepare and purify the hGH-PEG-Fc conjugate (hereinafter referred to as "persisted hGH conjugate”), a representative sustained human growth hormone conjugate of the present invention.
  • hGH human growth hormone
  • the inventors of the present invention provide a sustained hGH conjugated liquid formulation containing a pharmacologically effective amount of a sustained hGH conjugate, a buffer solution, a sugar alcohol, a surfactant, and an isotonic agent, in which a physiologically active peptide, hGH and an immunoglobulin Fc region is bound. 10-2010-0067796) and liquid formulations of low and high concentrations of sustained hGH conjugates containing pharmacologically effective amounts of sustained hGH conjugates, buffers, sugar alcohols, and surfactants (Korean Patent No. 10-2015-0035681). ).
  • sustained hGH binder liquid formulations further comprising a preservative to develop an optimized sustained hGH conjugate liquid formulation comprising a preservative as follows. Specifically, the effects of preservatives added for multiple administrations on the stability of low concentration sustained hGH conjugates were evaluated as follows.
  • compositions shown in Table 1 as a liquid formulation of the continuous hGH conjugate, respectively, stored at 4 ° C. and 25 ° C. for 0 to 3 months, followed by ion exchange chromatography (IE-HPLC) and size exclusion chromatography. The analysis was carried out by the method (size-exclusion chromatography). IE-HPLC (%) and SE-HPLC (%) in Tables 2 and 3 are (Area% / Start Area%), representing the residual percentage of the sustained hGH conjugate relative to the initial result.
  • Table 2 shows the IE-HPLC and SE-HPLC residual ratios of the low concentration sustained hGH conjugate after storage at 4 ° C
  • Table 3 shows the IE-HPLC and SE-HPLC residual ratios of the low concentration sustained hGH conjugate after storage at 25 ° C. .
  • Example 1 Based on the liquid formulation identified in Example 1, the effect of the preservative added for multiple administration on the stability of the high concentration of the sustained hGH conjugate was tested.
  • compositions shown in Table 4 below were each stored at 0 ° C. and 25 ° C. at 4 ° C. and 25 ° C. as liquid formulations of the sustained hGH conjugate, and analyzed using ion exchange chromatography and size exclusion chromatography.
  • IE-HPLC (%) and SE-HPLC (%) in Tables 5 and 6 are (Area% / Start Area%), representing the residual percentage of the sustained hGH conjugate relative to the initial result.
  • Table 5 shows the IE-HPLC and SE-HPLC residual ratios of the high concentration sustained hGH conjugate after storage at 4 ° C
  • Table 6 shows the IE-HPLC and SE-HPLC residual ratios of the high concentration sustained hGH conjugate after storage at 25 ° C. .
  • Example 1 results, 20 mM sodium citrate, 4% mannitol, 0.005% polysorbate 80 at a pH of 5.2 when the concentration of the sustained hGH conjugate is 10.0 mg / mL to 58.5 mg / mL. Under conditions, stability was excellent even when m-cresol, phenol, or benzyl alcohol was included as a preservative.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)

Abstract

본 발명은 지속형 인간 성장 호르몬 결합체의 액상 제제 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

지속형 인간 성장 호르몬 결합체의 신규 액상 제제
본 발명은 지속형 인간 성장 호르몬 결합체의 액상 제제 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
인간 성장 호르몬(human growth hormone, hGH, 하기 "hGH"로 인용됨)은 사람의 뇌하수체에서 생성되는 191개의 아미노산으로 구성된 분자량 약 22,000의 폴리펩타이드 호르몬으로서 주로 소아의 뇌하수체성 왜소증 치료에 사용되고 있다. 종래에는 사람의 뇌하수체에서 추출한 hGH이 사용되었으나 그 양이 제한되어 치료를 받을 수 있는 사람이 극히 제한되었다. 또한 뇌하수체에서 추출한 hGH을 사용한 환자 중의 일부에서 치명적 신경계 질환인 크루즈펠트-야콥(Creutzfeldt-Jacob) 질병이 발생된 예가 보고되어 이러한 뇌하수체에서 추출한 hGH의 사용은 중단되었다. 최근에는 유전 공학 기술이 발전함에 따라서 대장균, 효모 등에서 hGH의 생산에 성공하였으며, 이러한 유전 공학 방법으로 생산된 재조합 hGH 제제들은 독성 및 임상 시험을 거쳐 1985년 이후에 여러 국가에서 허가를 획득하여 시판되고 있다.
hGH과 같은 폴리펩타이드는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 신장이나 간을 통해 쉽게 제거되기 때문에, 약리성분으로 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 단백질 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나, 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되는 단백질 의약품의 경우, 활성 폴리펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사를 놓는 것은 환자에게 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 단백질 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔다. 이러한 단백질 약물의 지속성 제제는 단백질 약물의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않는 것이 바람직하다.
한편, 활성 감소 최소화와 안정성 증가를 동시에 이룰 수 있는 지속성 단백질 약물 제제로, 면역글로불린 Fc 영역, 비펩타이드성 중합체 및 생리활성 폴리펩타이드를 결합시켜 제조한 결합체가 대한민국 등록특허 제10-0567902호 및 대한민국 등록특허 제10-0725315호 등에 본 출원인에 의하여 개시된 바 있다.
상기의 방법으로 생리활성 폴리펩타이드로서 hGH을 적용시켜 지속형 hGH 결합체를 제조할 수 있는데, 지속형 hGH 결합체가 포함된 약물을 제품으로 공급하기 위해서는 저장 운송 과정에서 빛, 열, 또는 첨가제 내 불순물에 의해 유도된 열화에 의한 변성, 응집, 흡착 또는 가수분해 등의 물리화학적인 변화를 억제하면서 생체 내 효력을 유지시키는 것이 필수적이다. 지속형 hGH 결합체는 폴리펩타이드 상의 hGH에 비해 부피가 커지고, 분자량이 증가하여 폴리펩타이드 상의 hGH에 비해 안정화하는데 매우 어려움이 있다.
제약 산업에서 액상에서의 단백질 안정성이 문제되어, 단백질을 동결 건조하는 방법을 통하여 이러한 안정성 문제를 해결하곤 했다. 그러나, 동결 건조된 단백질 제제는 장기간 안정성을 유지시키는 장점을 가지나, 주사 시 용해보조제로 재구성해야 하는 불편함이 따르고, 용해보조제로 재구성하는 경우 또는 동결 건조 과정 중에 중합체 등의 생성으로 다소 활성의 소실을 가져오며, 동결건조 과정에 드는 비용 및 시간 소요의 문제가 있었다.
안정한 액상 hGH 제제를 개발하기 위해서는 탈아미드화, 중합체 형성 및 산화과정에 의한 분해 산물의 생성속도 조절과 같은 hGH의 분해 양상을 조절하는 것이 중요하다.
액상 제제의 온도, pH, 첨가제 등이 분해 산물의 생성 속도에 영향을 미치지만 현재까지 모든 단백질을 안정화시켜 임상에 적용할 수 있게 하는 조성은 아직 알려져 있지 않고 있으며, 특정 단백질에서 안정화 효과를 나타내는 액상 조성이 다른 단백질의 안정화에는 적용되지 않는 경우가 많다. 이러한 목적의 단백질, 구체적으로 hGH 단백질의 액상에서의 안정성을 극대화시키기 위해서 단백질의 특이 분해 산물 생성 속도를 최소화시킬 수 있는 인자 및 첨가제의 선정 및 이들의 조합이 광범위하게 선행되어야 할 필요가 있음이 당업계에 알려져 있다.
또한, 상이한 단백질들은 그들의 화학적 차이점으로 인해, 저장 동안 상이한 비율 및 상이한 조건하에서 점진적으로 비활성화될 수 있다. 즉, 안정화를 위해 사용되는 물질에 의한 저장기간 연장 효과는 상이한 단백질에 대해서 동등하지 않으며, 이로 인해 저장 안정성을 부여하기 위해 사용되는 안정화제는 목적 단백질의 물리화학적 특성에 따라 적합한 비율, 농도 및 종류가 다양하다. 안정화제들을 병용할 경우 상호 간의 경쟁 작용 및 부작용으로 인하여 목적한 바와 다른 역효과를 가져올 수 있으며, 저장하는 동안 저장 단백질의 본질이 변화하거나 농도가 변화하기 때문에 상이한 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 용액 중의 단백질을 안정화하기 위해서는 많은 노력과 주의가 필요하다.
특히, 생체 내 지속성 및 안정성을 높인 지속형 hGH 결합체의 경우, 생리활성 펩타이드인 hGH과 면역글로불린 Fc영역이 결합된 형태이므로 분자량 및 부피가 일반적인 hGH과 확연하게 달라, 단백질을 안정화하기 위한 특별한 조성이 요구된다. 또한, 생리활성 펩타이드인 hGH과 면역글로불린 Fc영역은 각각 물리 화학적 특성이 다른 펩타이드 또는 단백질이므로, 생리활성 펩타이드인 hGH과 면역글로불린 Fc영역을 동시에 안정화하여야 한다. 그러나, 상기에서 설명한 바와 같이, 상이한 펩타이드 또는 단백질들은 그들의 물리 화학적 차이점으로 인해, 저장 동안 상이한 비율 및 상이한 조건하에서 점진적으로 비활성화될 수 있고, 각각의 펩타이드 또는 단백질에 적합한 안정화제들을 병용하는 경우 상호 간의 경쟁 작용 및 부작용으로 인하여 목적한 바와 다른 역효과를 가져올 수 있다. 따라서, 지속형 hGH 결합체의 경우 생리활성 펩타이드인 hGH과 면역글로불린 Fc영역을 동시에 안정화하는 안정화제의 조성을 찾는 것에 많은 어려움이 있다.
본 발명자들은 지속형 hGH 결합체를 바이러스 오염의 우려 없이 장기간 동안 보관할 수 있도록 안정성을 높이고 단백질 침전을 낮추기 위한 조성을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 등장화제를 포함하지 않으면서, 완충용액, 당알코올, 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 안정화제를 이용함으로써 신규한 지속형 hGH 결합체의 안정성을 증대시켜 경제적이고 안정한 액상 제제를 제조할 수 있음을 확인하였으며, 또한 상기 액상 제제가 추가로 보존제를 포함하는 경우에도 지속형 hGH 결합체의 높은 안정성을 유지할 수 있는 다회 사용이 가능한 액상 제제를 제공할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 및 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 및 보존제를 함유하는 알부민-비함유 안정화제를 포함하는, 지속형 hGH 결합체 액상 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 지속형 hGH 결합체 액상 제제의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 지속형 hGH 결합체 액상 제제의 뇌하수체성 왜소증, 성장 호르몬 결핍증, 프레더 윌리 증후군 또는 특발성 저신장의 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 지속형 hGH 결합체 액상 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 뇌하수체성 왜소증, 성장 호르몬 결핍증, 프레더 윌리 증후군 또는 특발성 저신장의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 지속형 hGH 결합체의 액상 제제는 인간 혈청 알부민 및 인체에 잠재적으로 유해한 인자를 포함하지 않아, 바이러스 감염의 우려가 없고, hGH과 면역글로불린 Fc 영역의 결합으로 이루어져 천연형에 비해 분자량이 크고 생리활성 지속시간이 증대된 지속형 hGH 결합체에 대해 우수한 저장 안정성을 제공한다. 또한 보존제를 포함하여 다회 사용이 가능한 안정한 액상 제제를 제공할 수 있다. 이와 같은 본 발명의 액상 제제는 간단한 제형으로 우수한 저장 안정성을 나타내어 다른 안정화제나 동결 건조 제제에 비해 경제적인 제공이 가능한 제제이다. 또한, 통상적인 hGH 제제에 비해 인체 내에서 단백질 활성을 장기간 유지할 수 있어 효율적인 약물 제제로 이용할 수 있다.
도 1a 및 1b는 본 발명에 따른 다회 투여를 위한 보존제를 포함하는 액상제제가 저농도 지속형 hGH 결합체의 안정성에 미치는 영향을 실험한 결과이다. 도 1a 및 1b는 각각 4℃ 및 25℃에서 보관 후, IE-HPLC를 통해 분석한 그래프이며, IE-HPLC(%)는 (Area %/Start Area %)로서, 초기 결과 값에 대비한 저농도 지속형 hGH 결합체의 잔존율을 나타낸다. 그 결과, 보존제로서 m-크레졸, 페놀, 또는 벤질 알코올이 포함될 때, 그렇지 않은 경우와 비교하여 유의할 만한 안정성 차이가 없음을 알 수 있었다.
도 2a 및 2b는 각각 상기 도 1의 액상 제제를 기초하여 다회 투여를 위해 추가되는 보존제가 고농도 지속형 hGH 결합체의 안정성에 미치는 영향을 실험한 결과이다. 4℃ 및 25℃에서 보관 후, IE-HPLC를 통해 분석한 그래프이며, IE-HPLC(%)는 (Area %/Start Area %)로서, 초기 결과 값에 대비한 고농도 지속형 hGH 결합체의 잔존율을 나타낸다. 도 1a 및 b의 결과와 동일하게 보존제가 포함될 때, 그렇지 않은 경우와 비교하여 유의할 만한 안정성 차이가 없음을 알 수 있었다.
본 발명을 구현하기 위한 하나의 양태는 (i) 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 및 (ii) 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 및 보존제를 함유하는 알부민-비함유 안정화제를 포함하는, 지속형 hGH 결합체 액상 제제이다.
하나의 구체예로서, 상기 알부민-비함유 안정화제는 등장화제, 예컨대 염화나트륨을 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 지속형 인간 성장 호르몬 결합체는 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬 결합체인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 지속형 인간 성장 호르몬 결합체는 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체를 통하여 연결되거나, 재조합 기술을 이용하여 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 융합 단백질 형태인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 비펩타이드성 중합체가 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 완충용액은 시트르산 완충용액 또는 아세트산 완충용액인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 완충용액의 pH 범위가 4.0 내지 7.0인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 당알코올이 만니톨, 수크로오스, 및 소르비톨로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 당알코올의 농도가 액상 제제의 전체 부피 대비 1%(w/v) 내지 10%(w/v)인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 또는 폴록사머인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 비이온성 계면활성제의 농도가 액상 제제의 총 부피 대비 0.001%(w/v) 내지 0.1%(w/v)인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 보존제가 m-크레솔, 페놀, 및 벤질 알코올로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 보존제의 농도가 액상 제제 총 부피 대비 0.01% 내지 1.0%(w/v)인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 액상 제제는 다회 투여용인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 액상 제제에서 지속형 hGH 결합체의 농도는 1mg/mL 내지 100mg/mL인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 안정화제가 당류, 다가알코올 및 아미노산으로 구성되는 군 중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 hGH는 천연형 hGH와 동일한 아미노산을 갖는 hGH, 천연형 hGH의 아미노산이 변이된 hGH 또는 천연형 GH와 유사한 활성을 나타내는 펩타이드 유사체인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 지속형 hGH 결합체 액상 제제는 (i) 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 및 (ii) 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 및 보존제로 구성된 알부민-비함유 안정화제를 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 완충용액은 시트르산 완충용액이고, 당알코올은 만니톨이며, 게면활성제는 폴리소르베이트 80이며, 보존제는 m-크레졸, 페놀 및 벤질 알코올로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인이 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 제제는 뇌하수체성 왜소증, 성장 호르몬 결핍증, 프레더 윌리 증후군 또는 특발성 저신장의 치료를 위한 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬 결합체를 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 및 보존제와 혼합하는 단계를 포함하는, 상기 지속형 hGH 결합체 액상 제제의 제조 방법이다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 상기 지속형 hGH 결합체 액상 제제의 뇌하수체성 왜소증, 성장 호르몬 결핍증, 프레더 윌리 증후군 또는 특발성 저신장의 치료 용도이다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 상기 지속형 hGH 결합체 액상 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 뇌하수체성 왜소증, 성장 호르몬 결핍증, 프레더 윌리 증후군 또는 특발성 저신장의 치료 방법이다.
본 발명을 구현하기 위한 하나의 양태는 (i) 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 및 (ii) 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 및 보존제를 함유하는 알부민-비함유 안정화제를 포함하는, 지속형 hGH 결합체 액상 제제를 제공한다.
먼저, 액상 제제에 포함되는 지속형 hGH 결합체 및 이의 구성성분에 대하여 하기에서 상세히 설명한다. 한편, 본원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다.
본 발명에서 용어, "지속형 인간 성장 호르몬 결합체"는 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬 (hGH)과 캐리어가 연결된 형태의 단백질로서, 천연형 hGH에 비해 생리활성 지속기간이 증가된 특징을 가진 결합체를 말한다. 구체적으로, 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬 (hGH)에 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 형태의 단백질일 수 있다.
여기서, 상기 캐리어는 면역글로불린 Fc 영역, 알부민, 트랜스페린 및 PEG로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 구체적으로는 면역글로불린 Fc 영역이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "지속형"이란 생리활성 지속기간이 천연형에 비해 증대된 것을 의미하는 것이며, "결합체"란 hGH과 캐리어가 결합된 형태를 말한다.
구체적으로, 상기 지속형 인간 성장 호르몬 결합체는 인간 성장 호르몬과 캐리어, 구체적으로는 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체를 통하여 연결되거나, 재조합 기술을 이용하여 인간 성장 호르몬과 단백질 형태의 캐리어, 구체적으로는 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 융합 단백질 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 융합 단백질 형태인 경우, 펩타이드 링커를 통하여 인간 성장 호르몬과 단백질 형태의 캐리어, 구체적으로 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 형태도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명에서 상기 hGH는 천연형 hGH와 동일한 아미노산을 갖는 hGH, 천연형 hGH의 아미노산이 변이된 hGH 또는 천연형 GH와 유사한 활성을 나타내는 펩타이드 유사체를 모두 포함하는 개념이다. 상기 변이의 예로서는 hGH를 구성하는 아미노산의 치환, 제거, 또는 삽입 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 변이는 hGH의 생물학적 활성에 크게 영향을 미치지 않는 범위 내에서 이루어질 수 있다.
또한 상기 hGH는 천연 또는 재조합 기원 중 어느 것이나 가능하나, 구체적으로는 미생물을 숙주 세포로 이용하여 생산된 재조합 hGH 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 미생물의 예로서 대장균을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 hGH의 서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, hGH의 활성을 나타내는 한, 천연형과 70%, 구체적으로는 80%, 더 구체적으로는 90%, 더욱 더 구체적으로는 95%, 가장 구체적으로는 98% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본 발명에서 용어, "비펩타이드성 중합체"는 반복 단위가 1개 이상 결합된 생체적합성 중합체를 의미한다. 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 본 발명에서 상기 비펩타이드성 중합체는 비펩타이드성 링커와 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 비펩타이드성 중합체는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 구체적으로는 폴리에틸렌글리콜이나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 비펩타이성 중합체에는 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범주에 포함된다.
기존 인프레임 퓨전(inframe fusion) 방법으로 제조된 융합 단백질에서 사용된 펩타이드성 링커의 단점은 생체 내에서 단백질 분해효소에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성약물의 혈중 반감기 증가 효과를 기대만큼 얻을 수 없다는 것이다. 그러나, 단백질 분해효소에 저항성 있는 중합체를 사용하는 경우 캐리어와 유사한 수준의 펩타이드의 혈중 반감기를 유지할 수 있다. 그러므로, 비펩타이드성 중합체는 상기와 같은 역할, 즉 생체 내 단백질 분해효소에 저항성 있는 중합체이면 제한 없이 사용될 수 있다. 비펩타이드성 중합체의 분자량은 1 내지 100 kDa 범위, 구체적으로 1 내지 20 kDa 범위일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 면역글로불린 Fc 영역과 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄 불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) 1개 또는 2개 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)과의 조합, 6) 중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다.
이러한 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라, 아미노산 서열이 항체마다 달라 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과를 기대할 수 있다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능(effector function)을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 WO 97/34631, 국제특허공개 WO 96/32478 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내며 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질 전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 구체적으로는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화 되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 구체적으로는 인간 기원이나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 구체적으로는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며 보다 더 구체적으로는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "혼성(hybrid)"이란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 구체적으로는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 보다 구체적으로는 보체 의존적 독성(CDC, Complement dependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다.
보다 더 구체적인 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 지속형 hGH 결합체는 천연 또는 재조합 기원 중 어떠한 방법으로 제조된 hGH과 천연 IgG를 특정 단백질 분해효소로 처리하거나 재조합 기술을 이용하여 형질전환 세포로부터 제조한 면역글로불린 Fc 영역을 결합시켜 제조할 수 있다. 이때 이용되는 결합 방법으로, hGH과 면역글로불린 Fc 영역을 비펩타이드성 중합체를 이용하여 교차 결합시키거나, 재조합 기술을 이용하여 hGH과 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 형태의 융합 단백질로 제조할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 지속형 hGH 결합체의 제조를 위해 대한민국 등록특허 제10-0725315호(면역글로불린 단편을 이용한 단백질 결합체 및 그의 제조방법) 또는 미국 특허공개 제2013-0288333호 등의 명세서 전문이 본원의 참고문헌으로서 포함된다.
이하에서는 상기 지속형 hGH 결합체의 액상 제제의 조성에 대하여 구체적으로 서술한다. 앞서 언급한 바와 같이, 본원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다.
본 발명에서 용어, "지속형 hGH 결합체 액상 제제"는 지속형 hGH 결합체를 포함하는 액상 제제를 의미한다. 상기 액상 제제는 액상의 내용 제제 및 외용 제제를 모두 포함하는 개념이다. 본 발명에서, 상기 지속형 hGH 결합체 액상 제제는 치료학적 유효량의 지속형 hGH 결합체를 포함할 수 있으며, 일반적으로 hGH의 치료학적 유효량은 1회용 바이알(single-use vial) 내에 약 1 내지 3 mg 정도가 함유된 양이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 액상 제제에 포함되는 지속형 hGH 결합체의 농도는 1 mg/mL 내지 200 mg/mL, 구체적으로는 1mg/mL 내지 100mg/mL, 보다 더 구체적으로는 10 내지 58.5 mg/mL일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 상기 지속형 hGH 결합체 액상 제제는 지속형 hGH 결합체가 저농도로 존재할 경우뿐만 아니라 고농도로 존재할 경우에도 결합체를 침전없이 안정적으로 저장할 수 있어, 안정적으로 생체 내로 고농도의 hGH을 공급할 수 있다.
본 발명의 지속형 hGH 결합체 액상 제제는 약리학적 유효량의 지속형 hGH 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함한다.
본 발명에서 용어, "안정화제"는 지속형 hGH 결합체가 안정하게 저장될 수 있도록 하는 성분을 포함하는 물질(agent)을 의미한다. 지속형 hGH 결합체와 같은 단백질에 있어서, 저장 안정성은 정확한 투여량을 보장하기 위해서뿐만 아니라, 지속형 hGH 결합체의 응집체와 같은 항원성 물질의 잠재적인 생성을 억제하기 위해서 중요하다.
상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 및 비이온성 계면활성제를 함유하는 것이 바람직하며, 추가적으로 보존제를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 및 보존제로 필수적으로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 안정화제는 염화 나트륨과 같은 등장화제를 포함하지 않는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
완충용액은 지속형 hGH 결합체가 안정해지도록 용액 제형의 pH가 급격히 변화하지 않게 용액의 pH를 유지시키는 역할을 한다.
상기 완충용액은 알칼리 염(나트륨 또는 칼륨 포스페이트 또는 이들의 수소 또는 이수소염), 나트륨 시트레이트/시트르산(구연산 나트륨/구연산), 나트륨 아세테이트/아세트산을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 다른 제약상 허용 가능한 pH 완충제를 포함할 수 있으며, 이들 완충제의 혼합물도 사용될 수 있다.
본 발명의 목적상 보다 바람직한 상기 완충용액은 아세트산 또는 시트르산 완충용액 (예, 아세트산나트륨, 시트르산나트륨)이고, 보다 더 바람직하게는 시트르산 완충용액이다.
아세트산 또는 시트르산 완충액을 구성하는 아세트산염 및 시트르산염의 농도는 구체적으로는 1 mM 내지 100 mM 이고, 보다 더 구체적으로는 3 mM 내지 100 mM이나, 이에 제한되지 않는다.
완충용액의 pH는 구체적으로는 4.0 내지 8.0, 더욱 구체적으로는 4.0 내지 7.0이나, 이에 제한되지 않는다.
당알코올은 지속형 hGH 결합체의 안정성을 증대시키는 역할을 수행할 수 있다.
본 발명에 사용되는 당알코올의 농도는 구체적으로는 전체 액상 제제 대비 1% 내지 20%(w/v), 더욱 구체적으로는 1% 내지 10%(w/v)이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 당알코올은 특별히 이에 제한되지는 않으나, 만니톨, 수크로오스 및 소르비톨로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이 사용될 수 있으며, 구체적으로는 만니톨 또는 소르비톨, 보다 더 구체적으로는 만니톨이 사용될 수 있다.
비이온성 계면활성제는 단백질 용액의 표면장력을 낮추어 소수성 표면에 단백질이 흡착되거나 응집되는 것을 방지하여 준다.
본 발명에 사용될 수 있는 비이온성 계면활성제의 구체적인 예로는 폴리소르베이트계 비이온성 계면활성제 및 폴록사머계 비이온성 계면활성제 등을 들 수 있고, 이들이 하나 또는 둘 이상의 조합 형태로 사용될 수 있으며, 그 중에서도 폴리소르베이트계 비이온성 계면활성제가 더욱 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
폴리소르베이트계 비이온성 계면활성제의 예로는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60 및 폴리소르베이트 80 등이 있으며, 그 중에서도 폴리소르베이트 80이 바람직할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용액 제형에는 상기 비이온성 계면활성제가 구체적으로는 0.1%(w/v) 이하의 저농도, 더욱 구체적으로는 0.001% 내지 0.1%(w/v)이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 안정화제는 알부민을 함유하지 않는 것이 바람직하다. 단백질의 안정화제로 이용될 수 있는 인간 혈청 알부민은 인체의 혈액으로부터 제조되므로, 인간 유래의 병원성 바이러스에 의한 오염 가능성이 존재하며, 젤라틴이나 소 혈청 알부민은 질환을 야기하거나, 또는 일부 환자의 경우에는 알러지 반응을 유발할 가능성이 있다. 본 발명의 알부민-비함유 안정화제는 인간 또는 동물 유래의 혈청 알부민 또는 정제된 젤라틴 등의 이종 단백질을 함유하지 않아 바이러스 감염의 우려가 없다.
또한, 본 발명의 상기 안정화제는 당류, 다가 알코올 또는 중성 아미노산을 추가로 포함할 수 있다.
지속형 hGH 결합체의 저장 안정성을 증대시키기 위해 추가로 포함될 수 있는 당류 및 다가 알코올 중 당류의 구체적인 예로는 만노오스, 글루코오스, 푸코오스 및 크실로오스 등의 단당류와 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스 및 덱스트란 등의 다당류 등을 들 수 있고, 다가 알코올의 구체적인 예로는, 프로필렌글리콜 및 저분자량의 폴리에틸렌글리콜, 글리세롤, 저분자량의 폴리프로필렌글리콜 등을 들 수 있으며, 이들의 하나 또는 둘 이상의 조합 형태로 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 지속형 hGH 결합체 액상 제제는 상기 설명한 결합체, 완충용액, 당알코올, 및 비이온성 계면활성제 이외에, 다회 투여용 제제의 미생물 오염 방지를 목적으로 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 “보존제”란 항균제로서 작용하기 위해 제약 제제에 첨가되는 화합물을 의미하며, 이러한 보존제로는 벤즈에토늄, 클로로헥시딘, 페놀, m-크레졸, 벤질 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로로부탄올, o-크레졸, ρ-크레졸, 클로로크레졸, 염화 벤잘코늄, 페닐수은산 질산염, 티메로살, 벤조산 등을 사용할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
이들 보존제는 1종 단독으로 사용하거나 2종 이상을 임의로 조합하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 액상 제제는 보존제로서 m-크레졸, 페놀, 및 벤질 알코올 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 본 발명의 액상 제제에 있어서, 보존제는 0.01% 내지 3 %(w/v)의 양으로 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로 0.1% 내지 1.0 %(w/v)의 양으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 본 발명의 액상 제제에 보존제로서 페놀, m-크레졸 및 벤질 알코올을 0.1% 내지 1.0%(w/v) 포함시켜 각 보존제가 지속형 hGH 결합체의 안정성에 미치는 영향을 평가한 결과, 지속형 hGH 결합체의 침전이 일어나지 않고 결합체의 안정성이 유지됨을 확인할 수 있었다.
따라서, 상기한 안정화제에 더하여 보존제를 추가로 포함하는 본 발명의 신규한 지속형 hGH 결합체의 액상 제제는 다회 투여를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 액상 제제에는 상기 설명한 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 및 보존제 이외에, 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업계에 공지되어 있는 기타의 성분 내지 물질들이 선택적으로 더 포함될 수도 있다.
상기 액상 제제는 보다 구체적으로 (i) hGH과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 hGH 결합체, 및 (ii) 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 및 보존제로 구성된 알부민-비함유 안정화제를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
여기서, 상기 완충용액은 시트르산 완충용액이고, 당알코올은 만니톨이며, 게면활성제는 폴리소르베이트 80이며, 보존제는 m-크레졸, 페놀 및 벤질 알코올로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
또한, 상기 액상 제제는 보다 더 구체적으로, 지속형 hGH 결합체의 농도가 10.0 mg/mL 내지 58.5 mg/mL인 경우, pH 5.2인 20mM 시트르산 나트륨, 4% 만니톨, 0.005% 폴리소르베이트 80, 및 보존제로서 m-크레졸, 페놀, 또는 벤질을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 제제는 뇌하수체성 왜소증, 성장 호르몬 결핍증, 프레더 윌리 증후군 또는 특발성 저신장의 치료를 위한 것일 수 있다. 즉, 약학적 조성물에 해당할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 액상 제제의 제조방법을 제공한다.
상기 액상 제제 및 이를 구성하는 성분들에 대해서는 앞서 기술한 바와 같다.
상기 제조방법은 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬 결합체를 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 및 보존제와 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 제조방법은 지속형 hGH 결합체를 제조하는 단계, 및 상기 단계에서 제조된 지속형 hGH 결합체를 완충용액, 당알코올, 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 안정화제와 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 또한 상기 안정화제에 더하여 보존제를 추가로 혼합함으로써 다회 사용을 위한 안정한 지속형 hGH 결합체 액상 제제를 제조할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면 완충용액으로서 시트르산나트륨, 당알코올로서 만니톨, 계면활성제로서 폴리소르베이트 80, 그리고 보존제로서 m-크레졸, 페놀, 또는 벤질 알코올을 포함하는 안정화제는 저농도 및 고농도 지속형 hGH 결합체에서 침전을 유발하지 않고 안정성을 제공하는 안정화제임을 보여주었다. 즉, 10 내지 58.5 mg/mL의 지속형 hGH 결합체에서 침전 없이 안정한 액상 제제를 만들 수 있음을 확인하였다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (i) hGH와 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 hGH 결합체, 및 (ii) 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 및 보존제를 포함하는 알부민-비함유 안정화제를 포함하는, 상기 지속형 hGH 결합체 액상 제제의 뇌하수체성 왜소증, 성장 호르몬 결핍증, 프레더 윌리 증후군 또는 특발성 저신장의 치료 용도를 제공한다.
상기 액상 제제 및 이를 구성하는 성분들에 대해서는 앞서 기술한 바와 같다.
hGH를 포함하는 상기 지속형 hGH 결합체 액상 제제는 상기 뇌하수체성 왜소증, 성장 호르몬 결핍증, 프레더 윌리 증후군 또는 특발성 저신장 질환의 증상이 개선, 예방 또는 치료 효과를 가질 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (i) hGH와 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 hGH 결합체, 및 (ii) 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 및 보존제를 포함하는 알부민-비함유 안정화제를 포함하는, 상기 지속형 hGH 결합체 액상 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 뇌하수체성 왜소증, 성장 호르몬 결핍증, 프레더 윌리 증후군 또는 특발성 저신장의 치료 방법을 제공한다.
상기 액상 제제 및 이를 구성하는 성분들에 대해서는 앞서 기술한 바와 같다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 좀 더 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
제조예: 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체의 제조
양쪽 말단에 알데히드 반응기를 가진 분자량 약 3.4 kDa의 폴리에틸렌 글리콜인 ALD-PEG-ALD를 인간 성장 호르몬(hGH, 분자량 22 kDa)과 결합시키고, 이를 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역(약 50 kDa) N 말단에 결합시켜, 본 발명의 대표적인 지속형 인간 성장 호르몬 결합체인 hGH-PEG-Fc 결합체(이하 "지속형 hGH 결합체"로 명명)를 제조 및 정제하였다.
실시예 1: 보존제에 따른 저농도 지속형 hGH 결합체 액상 제제의 안정성 평가
본 발명자들은 생리활성 펩타이드인 hGH과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 hGH 결합체, 완충용액, 당알코올, 계면활성제, 및 등장화제를 함유하는 지속형 hGH 결합체 액상 제제 (대한민국 공개특허 제 10-2010-0067796호)와 약리학적 유효량의 지속형 hGH 결합체, 완충용액, 당알코올, 계면활성제를 함유하는 저농도 및 고농도 지속형 hGH 결합체의 액상 제제 (대한민국 공개특허 제 10-2015-0035681호)를 개발한 바 있다.
그러나, 보존제를 추가로 포함하는 지속형 hGH 결합체 액상제제의 제조가 여전히 요구되어 하기와 같이 보존제를 포함하는 최적화된 지속형 hGH 결합체 액상 제제를 개발하고자 하였다. 구체적으로, 하기와 같이 다회 투여를 위해 추가되는 보존제가 저농도 지속형 hGH 결합체의 안정성에 미치는 영향을 평가하였다.
하기 표 1과 같은 조성을 각각 지속형 hGH 결합체의 액상 제제로 사용하여 4℃ 및 25℃에서 0 내지 3개월 동안 보관 후, 이온 교환 크로마토그래피법(Ion exchange chromatography, IE-HPLC)과 크기 배제 크로마토그래피법(size-exclusion chromatography)을 이용하여 분석하였다. 표 2 및 3에서 IE-HPLC(%)와 SE-HPLC(%)는 (Area %/Start Area %)로서, 초기 결과 값에 대비한 지속형 hGH 결합체의 잔존율을 나타낸다. 표 2는 4℃에서 보관 후 저농도 지속형 hGH 결합체의 IE-HPLC 및 SE-HPLC 잔존율을, 표 3은 25℃에서 보관 후 저농도 지속형 hGH 결합체의 IE-HPLC 및 SE-HPLC 잔존율을 나타낸다.
Figure PCTKR2016015534-appb-T000001
Figure PCTKR2016015534-appb-T000002
Figure PCTKR2016015534-appb-T000003
상기 결과에서 보듯이, 4℃에서 보관 후 IE-HPLC 및 SE-HPLC 결과, 지속형 hGH 결합체의 농도가 10.0 mg/mL인 경우, 보존제로서 m-크레졸, 페놀, 또는 벤질 알코올이 포함될 때(표 2의 #2, #3, #4) 그렇지 않은 경우(표 2의 #1)와 비교하여 유의할 만한 안정성 차이는 없었다.
또한 25℃에서 보관 후 IE-HPLC 및 SE-HPLC 결과, 지속형 hGH 결합체의 농도가 10.0 mg/mL인 경우, 보존제가 포함될 때(표 3의 #2, #3, #4) 그렇지 않은 경우(표 3의 #1)와 비교하여 안정성이 미미하게 저하되었지만 유의할 만한 차이는 없었다.
이때 4℃ 및 25℃에서 보관할 때, 보존제 종류에 따른 저농도 지속형 hGH 결합체의 안정성은 유사하였다.
실시예 2: 보존제에 따른 고농도 지속형 hGH 결합체 액상 제제의 안정성 평가
상기 실시예 1에서 확인한 액상 제제를 기초하여 다회 투여를 위해 추가되는 보존제가 고농도 지속형 hGH 결합체의 안정성에 미치는 영향을 실험하였다.
하기 표 4와 같은 조성을 각각 지속형 hGH 결합체의 액상 제제로 사용하여 4℃ 및 25℃에서 0 내지 3개월 동안 보관 후, 이온 교환 크로마토그래피법과 크기 배제 크로마토그래피법을 이용하여 분석하였다. 표 5 및 6에서 IE-HPLC(%)와 SE-HPLC(%)는 (Area %/Start Area %)로서, 초기 결과 값에 대비한 지속형 hGH 결합체의 잔존율을 나타낸다. 표 5는 4℃에서 보관 후 고농도 지속형 hGH 결합체의 IE-HPLC 및 SE-HPLC 잔존율을, 표 6은 25℃에서 보관 후 고농도 지속형 hGH 결합체의 IE-HPLC 및 SE-HPLC 잔존율을 나타낸다.
Figure PCTKR2016015534-appb-T000005
Figure PCTKR2016015534-appb-T000006
상기 결과에서 보듯이, 4℃에서 보관 후 IE-HPLC 및 SE-HPLC 결과, 지속형 hGH 결합체의 농도가 58.5 mg/mL인 경우, 보존제로서 m-크레졸, 페놀, 또는 벤질 알코올이 포함될 때(표 5의 #2, #3, #4) 그렇지 않은 경우(표 5의 #1)와 비교하여 유의할 만한 안정성 차이는 없었다.
또한 25℃에서 보관 후 IE-HPLC 및 SE-HPLC 결과, 지속형 hGH 결합체의 농도가 58.5 mg/mL인 경우, 보존제가 포함될 때(표 6의 #2, #3, #4) 그렇지 않은 경우(표 6의 #1)와 비교하여 안정성이 미미하게 저하되었지만 유의할 만한 차이는 없었다.
이때 4℃ 및 25℃에서 보관할 때, 보존제 종류에 따른 고농도 지속형 hGH 결합체의 안정성은 유사하였다.
특히, 실시예 1 및 실시예 2 결과에서 보듯이, 지속형 hGH 결합체의 농도가 10.0 mg/mL 내지 58.5 mg/mL인 경우, pH 5.2인 20mM 시트르산 나트륨, 4% 만니톨, 0.005% 폴리소르베이트 80 조건일 때, 보존제로서 m-크레졸, 페놀, 또는 벤질 알코올이 포함되어도 안정성이 우수한 결과를 보였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허 청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포섭되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (24)

  1. (i) 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 및 (ii) 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 및 보존제를 함유하고, 등장화제를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 알부민-비함유 안정화제를 포함하는, 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 지속형 인간 성장 호르몬 결합체는 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체를 통하여 연결되거나, 재조합 기술을 이용하여 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 융합 단백질 형태인, 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 비펩타이드성 중합체가 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는, 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜인, 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 완충용액은 시트르산 완충용액 또는 아세트산 완충용액인, 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 완충용액의 pH 범위가 4.0 내지 7.0인, 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 당알코올이 만니톨, 수크로오스, 및 소르비톨로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인, 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  8. 제1항 또는 제7항에 있어서,
    상기 당알코올의 농도가 액상 제제의 전체 부피 대비 1%(w/v) 내지 10%(w/v)인, 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 또는 폴록사머인, 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  10. 제1항 또는 제9항에 있어서,
    상기 비이온성 계면활성제의 농도가 액상 제제의 총 부피 대비 0.001%(w/v) 내지 0.1%(w/v)인, 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 보존제가 m-크레솔, 페놀, 및 벤질 알코올로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  12. 제1항 또는 제11항에 있어서,
    상기 보존제의 농도가 액상 제제 총 부피 대비 0.01% 내지 1.0%(w/v)인 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 액상 제제는 다회 투여용인, 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 액상 제제에서 지속형 hGH 결합체의 농도는 1mg/mL 내지 100mg/mL인, 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 안정화제가 당류, 다가알코올 및 아미노산으로 구성되는 군 중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 hGH는 천연형 hGH와 동일한 아미노산을 갖는 hGH, 천연형 hGH의 아미노산이 변이된 hGH 또는 천연형 GH와 유사한 활성을 나타내는 펩타이드 유사체인, 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 지속형 hGH 결합체 액상 제제는 (i) 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 및 (ii) 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 및 보존제로 구성된 알부민-비함유 안정화제를 포함하는, 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  18. 제1항 또는 제17항에 있어서,
    상기 완충용액은 시트르산 완충용액이고, 당알코올은 만니톨이며, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이며, 보존제는 m-크레졸, 페놀 및 벤질 알코올로 이루어진 군에서 선택된, 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된, 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인이 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인, 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역이 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인, 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인, 지속형 hGH 결합체 액상 제제.
  23. 제1항에 있어서,
    상기 제제는 뇌하수체성 왜소증, 성장 호르몬 결핍증, 프레더 윌리 증후군 또는 특발성 저신장의 치료를 위한 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  24. 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체를 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제, 및 보존제와 혼합하는 단계를 포함하는, 제1항의 지속형 hGH 결합체 액상 제제의 제조 방법.
PCT/KR2016/015534 2015-12-30 2016-12-30 지속형 인간 성장 호르몬 결합체의 신규 액상 제제 Ceased WO2017116191A2 (ko)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201680081848.9A CN108697642A (zh) 2015-12-30 2016-12-30 新型长效人生长激素缀合物液体制剂
EP16882143.7A EP3398586A4 (en) 2015-12-30 2016-12-30 NOVEL LIQUID PHASE PREPARATION FROM HUMAN GROWTH HORMONE CONJUGATE
BR112018013535-6A BR112018013535A2 (pt) 2015-12-30 2016-12-30 ?formulação líquida inovadora de conjugado de hormônio de crescimento humano de atuação longa e seu método de preparo?
HK19100601.0A HK1258240A1 (en) 2015-12-30 2016-12-30 Novel liquid-phase preparation of long-acting human growth hormone conjugate
RU2018125963A RU2018125963A (ru) 2015-12-30 2016-12-30 Новая жидкая композиция конъюгата человеческого гормона роста длительного действия
US16/066,877 US20190022183A1 (en) 2015-12-30 2016-12-30 A novel liquid formulation of long-acting human growth hormone conjugate
JP2018534559A JP2019500390A (ja) 2015-12-30 2016-12-30 持続型ヒト成長ホルモン結合体の新規液状製剤
MX2018008026A MX2018008026A (es) 2015-12-30 2016-12-30 Una formulacion de conjugado de crecimiento humano de accion prolongada.
CA3009627A CA3009627A1 (en) 2015-12-30 2016-12-30 A novel liquid formulation of long-acting human growth hormone conjugate
AU2016382383A AU2016382383A1 (en) 2015-12-30 2016-12-30 A novel liquid formulation of long-acting human growth hormone conjugate
IL260316A IL260316A (en) 2015-12-30 2018-06-27 A novel liquid formulation of long-acting human growth hormone conjugate

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2015-0189919 2015-12-30
KR1020150189919A KR20170079409A (ko) 2015-12-30 2015-12-30 지속형 인간 성장 호르몬 결합체의 신규 액상 제제

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2017116191A2 true WO2017116191A2 (ko) 2017-07-06
WO2017116191A3 WO2017116191A3 (ko) 2018-03-08

Family

ID=59227383

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2016/015534 Ceased WO2017116191A2 (ko) 2015-12-30 2016-12-30 지속형 인간 성장 호르몬 결합체의 신규 액상 제제

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20190022183A1 (ko)
EP (1) EP3398586A4 (ko)
JP (1) JP2019500390A (ko)
KR (1) KR20170079409A (ko)
CN (1) CN108697642A (ko)
AR (1) AR107276A1 (ko)
AU (1) AU2016382383A1 (ko)
BR (1) BR112018013535A2 (ko)
CA (1) CA3009627A1 (ko)
HK (1) HK1258240A1 (ko)
IL (1) IL260316A (ko)
MX (1) MX2018008026A (ko)
RU (1) RU2018125963A (ko)
TW (1) TW201735940A (ko)
WO (1) WO2017116191A2 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200029374A (ko) * 2018-09-10 2020-03-18 삼성바이오에피스 주식회사 단백질을 포함하는 액상 조성물
JP7728176B2 (ja) * 2019-03-15 2025-08-22 イーライ リリー アンド カンパニー 保存製剤
WO2021085518A1 (ja) * 2019-10-30 2021-05-06 Ｊｃｒファーマ株式会社 血清アルブミンと成長ホルモンの融合蛋白質を含有する水性医薬組成物

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4635340B2 (ja) * 1999-05-31 2011-02-23 三菱化学株式会社 Ｈｇｆ凍結乾燥製剤
BRPI0406606A (pt) * 2003-11-13 2005-12-06 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Composição farmacêutica compreendendo uma região fc de imunoglobulina como um veìculo
BRPI0821359A2 (pt) * 2007-12-21 2015-06-16 Merck Patent Ges Mit Beschränkter Haftung Microcápsulas de lipídeos sólidas contendo hormônio de crescimento no núcleo sólido interno
KR101337797B1 (ko) * 2010-07-14 2013-12-06 한미사이언스 주식회사 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 액상 제제
US10064951B2 (en) * 2012-03-30 2018-09-04 Hanmi Science Co., Ltd. Liquid formulation of highly concentrated long-acting human growth hormone conjugate
WO2015046974A1 (ko) * 2013-09-27 2015-04-02 한미약품 주식회사 지속형 인간 성장 호르몬 제제

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017116191A3 (ko) 2018-03-08
US20190022183A1 (en) 2019-01-24
RU2018125963A (ru) 2020-01-30
MX2018008026A (es) 2018-11-29
EP3398586A2 (en) 2018-11-07
HK1258240A1 (en) 2019-11-08
AR107276A1 (es) 2018-04-11
JP2019500390A (ja) 2019-01-10
BR112018013535A2 (pt) 2018-12-04
TW201735940A (zh) 2017-10-16
CA3009627A1 (en) 2017-07-06
CN108697642A (zh) 2018-10-23
AU2016382383A1 (en) 2018-07-26
EP3398586A4 (en) 2019-08-07
KR20170079409A (ko) 2017-07-10
IL260316A (en) 2019-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2014017847A1 (en) A liquid formulation of long-acting insulin conjugate
WO2014017849A1 (en) A liquid formulation of long-acting insulin and insulinotropic peptide
WO2012057525A2 (en) Liquid formulations of long acting interferon alpha conjugate
WO2010011096A2 (en) A polypeptide complex comprising non-peptidyl polymer having three functional ends
WO2015183054A1 (en) Composition for treating diabetes mellitus comprising insulin and a glp-1/glucagon dual agonist
WO2012008779A2 (en) A liquid formulation of long-acting human growth hormone conjugate
WO2011090306A2 (en) Liquid formulations for long-acting erythropoietin conjugate
WO2014017845A2 (en) A liquid formulation of long acting insulinotropic peptide conjugate
WO2011090305A2 (en) Liquid formulations for long-acting g-csf conjugate
WO2015080513A1 (en) A liquid formulation of a fusion protein comprising tnfr and fc region
WO2015046974A1 (ko) 지속형 인간 성장 호르몬 제제
WO2014133324A1 (ko) 신규한 인슐린 아날로그 및 이의 용도
WO2015005748A1 (ko) 수용체-매개 제거가 감소된, 생리활성 폴리펩타이드 단량체-면역글로불린 Fc 단편 결합체 및 이의 제조방법
WO2013147559A1 (en) A liquid formulation of highly concentrated long-acting human growth hormone conjugate
WO2014133327A1 (ko) 인슐린 위치 특이적 결합체
EP2822972A1 (en) An improved process for preparation of physiologically active polypeptide complex
WO2015005747A1 (ko) FcRn 결합력이 유지되는 면역글로불린 Fc 결합체
WO2012002745A2 (en) Factor viia complex using an immunoglobulin fragment
WO2017116191A2 (ko) 지속형 인간 성장 호르몬 결합체의 신규 액상 제제
WO2019066603A1 (ko) 효력이 향상된 지속성 단백질 결합체
KR102478588B1 (ko) 신규 중간체 제조를 통한 지속형 약물 결합체의 제조 방법
WO2014137161A1 (ko) 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 고수율 생산을 위한 개선된 제조 방법
WO2021187897A1 (ko) Il-2 단백질 및 cd80 단백질을 포함하는 융합단백질 제제
WO2017052324A1 (en) Method of producing immunoglobulin fc region including initial methionine residue
HK40008252A (en) A liquid formulation of long-acting insulin and insulinotropic peptide

Legal Events

Date Code Title Description
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3009627

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 260316

Country of ref document: IL

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: MX/A/2018/008026

Country of ref document: MX

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018534559

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112018013535

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016382383

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20161230

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2018125963

Country of ref document: RU

Ref document number: 2016882143

Country of ref document: EP

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16882143

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016882143

Country of ref document: EP

Effective date: 20180730

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112018013535

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20180629