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WO2018168583A1 - 植物機能性成分含有量向上剤および植物機能性成分含有量向上剤の製造方法 - Google Patents

植物機能性成分含有量向上剤および植物機能性成分含有量向上剤の製造方法 Download PDF

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Publication number
WO2018168583A1
WO2018168583A1 PCT/JP2018/008632 JP2018008632W WO2018168583A1 WO 2018168583 A1 WO2018168583 A1 WO 2018168583A1 JP 2018008632 W JP2018008632 W JP 2018008632W WO 2018168583 A1 WO2018168583 A1 WO 2018168583A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
plant functional
functional ingredient
plant
ingredient content
fatty acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2018/008632
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
大野　勝也
偏弘 野原
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ibiden Co Ltd
Original Assignee
Ibiden Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ibiden Co Ltd filed Critical Ibiden Co Ltd
Priority to CN201880017874.4A priority Critical patent/CN110418845A/zh
Priority to JP2019505912A priority patent/JPWO2018168583A1/ja
Priority to EP18767036.9A priority patent/EP3597762A4/en
Priority to US16/493,036 priority patent/US11317568B2/en
Publication of WO2018168583A1 publication Critical patent/WO2018168583A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US17/706,886 priority patent/US11963492B2/en
Priority to US18/612,558 priority patent/US12250911B2/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G7/00—Botany in general
    • A01G7/06—Treatment of growing trees or plants, e.g. for preventing decay of wood, for tingeing flowers or wood, for prolonging the life of plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/08—Organic fertilisers containing added bacterial cultures, mycelia or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
    • C12Y113/11012—Linoleate 13S-lipoxygenase (1.13.11.12)

Definitions

  • the present invention relates to a plant functional ingredient content improver and a method for producing a plant functional ingredient content improver.
  • Patent Document 1 discloses a technique for increasing the amount of polyphenol contained in strawberry fruits by irradiating ultraviolet rays.
  • irradiating plants with ultraviolet rays may destroy the plant's ecological organization, and the irradiation time is limited. Further, there is a concern that ultraviolet rays may be harmful to the human body, and there is a problem that the safety of workers cannot be sufficiently ensured.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and has no adverse effect on the biological tissue of the plant, and can be safely increased in the content of functional components of the plant by appropriately spraying or irrigating the plant. It aims at providing a plant functional ingredient content improvement agent, and its manufacturing method.
  • the present invention improves the content of plant functional components including fatty acid metabolites obtained by metabolizing fatty acids having 4 to 30 carbon atoms to proteobacteria in a dissolved oxygen concentration environment of 0.1 to 8 mg / l (liter). It relates to the agent.
  • a plant functional ingredient content improver in which the fatty acid is a fatty acid that is liquid at 20 ° C. is preferred.
  • a plant functional ingredient content improver in which the metabolism is metabolism in the presence of at least one mineral selected from Mg, P, Na and K is preferred.
  • a plant functional ingredient content improver in which the proteobacteria are pre-cultured proteobacteria is preferable.
  • a plant functional ingredient content improver wherein the pre-cultured proteobacterium is a proteobacterium pre-cultured to 1 ⁇ 10 8 to 9 ⁇ 10 10 cells / ml (milliliter), is preferable.
  • the plant functional component content improver is a plant functional component content improver containing a biosurfactant.
  • a plant functional ingredient content improver in which the metabolism is metabolism under conditions of 20 to 30 ° C. is preferable.
  • the plant functional component content improver is preferably a spray or immersion agent for contact with plant foliage or root, or a plant functional component content improver used as a soil irrigation agent.
  • the plant functional ingredient content improver is preferably selected from the group consisting of polyphenols, amino acids, terpenoids and combinations thereof.
  • a plant functional ingredient content improver wherein the amino acid is selected from the group consisting of proline, glutamic acid and ⁇ -aminobutyric acid is preferred.
  • the plant functional ingredient content improver is preferably used for a plant belonging to the family Solanaceae, Brassicaceae, Asteraceae, or Rubiaceae.
  • the present invention also includes a plant functional ingredient content including fatty acid metabolites, including a fatty acid metabolism step of metabolizing a fatty acid having 4 to 30 carbon atoms to proteobacteria in a dissolved oxygen concentration environment of 0.1 to 8 mg / l.
  • the present invention relates to a method for producing an improver.
  • a method for producing a plant functional ingredient content improver in which the fatty acid is a fatty acid that is liquid at 20 ° C. is preferred.
  • a method for producing a plant functional ingredient content improver in which the fatty acid metabolism step is carried out in the presence of at least one mineral selected from Mg, P, Na and K is preferred.
  • a method for producing a plant functional ingredient content improver in which the proteobacteria are pre-cultured proteobacteria is preferable.
  • a method for producing a plant functional ingredient content improver wherein the pre-cultured proteobacteria are pre-cultured to 1 ⁇ 10 8 to 9 ⁇ 10 10 cells / ml.
  • a method for producing a plant functional ingredient content improver which is a method for producing a plant functional ingredient content improver containing a biosurfactant is preferred.
  • a method for producing a plant functional ingredient content improver in which the fatty acid metabolism step is performed at 20 to 30 ° C. is preferable.
  • a method for producing a plant functional ingredient content improving agent which is a method for producing a plant functional ingredient content improving agent that functions as a spray or immersion agent to be brought into contact with a plant foliage or root, or a soil irrigating agent. preferable.
  • Plant functional ingredient content that is a method for producing a plant functional ingredient content improver that functions as an agent that improves the content of a plant functional ingredient selected from the group consisting of polyphenols, amino acids, terpenoids, and combinations thereof A method for producing an improver is preferred.
  • Production of a plant functional ingredient content improver which is a method for producing a plant functional ingredient content improver that functions as a drug that improves the content of the amino acid selected from the group consisting of proline, glutamic acid and ⁇ -aminobutyric acid The method is preferred.
  • a method for producing a plant functional component content improver which is a method for producing a plant functional component content improver used in plants of the eggplant family, cruciferous family, asteraceae family or akaza family, is preferred.
  • the plant functional component content improver as referred to in the present invention is to increase the functional component content in the plant by promoting the generation of the functional component and / or suppressing the degradation in the plant.
  • the plant functional ingredient content improver of the present invention can improve the content of the plant functional ingredient by spraying or irrigating the plant as appropriate without using stress cultivation or a high content variety.
  • the content of the plant functional ingredient is improved by appropriately spraying or irrigating the plant without using stress cultivation or a high content variety.
  • a plant functional ingredient content improver that can be made can be produced.
  • Plant Functional Component Content Improving Agent The plant functional component content improving agent of the present invention metabolizes fatty acids having 4 to 30 carbon atoms to proteobacteria under a dissolved oxygen concentration environment of 0.1 to 8 mg / l. It contains the resulting fatty acid metabolite.
  • the content of the plant functional component can be improved by bringing the fatty acid metabolite into contact with a part of the plant foliage or root. Since the improvement in the plant of the same component as the component increased in the stress cultivation that is generally performed can be confirmed, the fatty acid metabolite of the present invention is inherently signaled by environmental stress in the plant by being absorbed by the plant. It is considered to contain substances and / or precursors thereof that perform the same action as the molecules produced and act as plant bodies. That is, the fatty acid metabolite of the present invention can enhance the stress tolerance function inherent in plants. As a result, the production of functional components in the plant body is promoted and / or decomposition is suppressed, and the functional components in the plant body are increased.
  • Metabolism in the present invention means that a fatty acid having 4 to 30 carbon atoms is decomposed by an enzyme or the like that is exoculated or endocrine by proteobacteria under a predetermined dissolved oxygen concentration environment.
  • an enzyme or the like that is exoculated or endocrine by proteobacteria under a predetermined dissolved oxygen concentration environment.
  • a method of culturing proteobacteria in a medium containing fatty acid under a predetermined dissolved oxygen concentration environment can be mentioned.
  • Proteobacteria have a gene that produces lipoxygenase (LOX), an enzyme involved in fatty acid metabolism, and can produce fatty acid metabolites.
  • LOX lipoxygenase
  • the carbon number of the fatty acid used in the present invention is 4 to 30, and preferably 10 to 20.
  • the melting point / boiling point is low, and therefore, the volatility tends to increase at the temperature at the time of culturing and hardly remain in the medium.
  • the number of carbons exceeds 30, the melting point / boiling point becomes high, so that it becomes a solid at the temperature at the time of culturing and tends to be separated without being mixed with the medium.
  • the melting point may not depend only on the number of carbons depending on the number of hydrogen bonds.
  • the fatty acid used in the present invention is preferably a liquid at 20 to 30 ° C. and more preferably a liquid at 20 ° C. from the viewpoint of metabolic efficiency and suppression of solidification in the medium.
  • the fatty acid of the present invention can be a saturated fatty acid, an unsaturated fatty acid, or a mixture containing both.
  • a free fatty acid (monocarboxylic acid) is preferable because it is excellent in a decomposition rate.
  • Free fatty acids having 4 to 30 carbon atoms include butyric acid (butyric acid), valeric acid (valeric acid), caproic acid, enanthic acid (heptylic acid), caprylic acid, pelargonic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, pentadecyl Acid, palmitic acid, palmitoleic acid, margaric acid, stearic acid, oleic acid, vaccenic acid, linoleic acid, ⁇ -linolenic acid, ⁇ -linolenic acid, eleostearic acid, arachidic acid, mead acid, arachidonic acid, behenic acid, Examples include lignoceric acid, nervonic acid, serotic acid, montanic acid, and melicic acid.
  • capric acid having 10 to 20 carbon atoms, lauric acid, myristic acid, pentadecylic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, margaric acid, stearin Acid, oleic acid, vaccenic acid, linoleic acid, ⁇ -linolenic acid, ⁇ Linolenic acid, eleostearic acid, arachidic acid, mead acid, arachidonic acid are preferred, oleic acid having 18 carbon atoms, linoleic acid, alpha-linolenic acid, .gamma.-linolenic acid are more preferred.
  • the content of fatty acid is preferably 120 g / l or less, more preferably 100 g / l or less, and even more preferably 60 g / l or less. If it exceeds 120 g / l, emulsification with water in the medium becomes difficult, which may deteriorate metabolic efficiency and inhibit the growth of proteobacteria.
  • the lower limit of the fatty acid content is not particularly limited, but is preferably 1.0 g / l or more.
  • the medium containing fatty acid contains other mineral components.
  • a mineral component it is not specifically limited, The mineral component normally used for microorganism culture can be mentioned.
  • the component which has magnesium (Mg), phosphorus (P), sodium (Na), or potassium (K) is mentioned. These components can be used alone or in combination. Preferably two of these components may be used, more preferably three or more.
  • the content of the mineral component in the medium is not particularly limited, and can be the amount used in the conventional aerobic bacterium culture method, but since salt damage may occur during application to plants, preferably It can be used at 15 g / l or less, more preferably at 10 g / l or less.
  • proteobacteria used in the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired. From the viewpoint of fatty acid metabolism efficiency and growth efficiency, proteobacteria having a temperature suitable for growth (optimum temperature) of 10 to 40 ° C. are preferred, and proteobacteria having 20 to 30 ° C. are more preferred.
  • the proteobacteria are preferably pre-cultured proteobacteria because they are excellent in fatty acid metabolic efficiency, and the number of bacteria is preferably pre-cultured to 1 ⁇ 10 8 to 9 ⁇ 10 10 cells / ml. preferable.
  • metabolism is performed in a dissolved oxygen concentration environment of 0.1 to 8 mg / l.
  • the dissolved oxygen concentration is less than 0.1 mg / l, the activity of proteobacteria tends to decrease and the metabolic efficiency of fatty acids tends to be extremely low.
  • the dissolved oxygen concentration exceeds 8 mg / l, in parallel with the metabolic process by proteobacteria, decomposition of the fatty acid as a substrate by oxygen in the medium proceeds, resulting in a decrease in metabolic efficiency, and consequently an active ingredient. There is a risk that the production amount of the metabolite is reduced.
  • the dissolved oxygen concentration is 0.1 to 5 mg / l, more preferably 0.1 to 4 mg / l.
  • the dissolved oxygen concentration is a value measured by a diaphragm galvanic electrode method or a diaphragm polarographic method on a PO electrode with a dissolved oxygen meter manufactured by HORIBA, Ltd.
  • the temperature in metabolism can be appropriately adjusted according to the proteobacteria used, and is preferably 20 to 30 ° C. from the viewpoint of fatty acid metabolic efficiency.
  • the plant functional ingredient content improver may contain a biosurfactant in addition to the fatty acid metabolite.
  • Fatty acid metabolites are easily dispersed in water, which is considered preferable from the viewpoint of handling of the plant functional ingredient content improver.
  • the biosurfactant according to the present invention means a surfactant-like substance that is produced by a microorganism to take up a highly hydrophobic substance and secreted outside the cell.
  • the biosurfactant secreted by proteobacteria facilitates the dispersion of fatty acid metabolites in water, so that the application and irrigation of plant functional ingredient content improvers containing fatty acid metabolites can be efficiently and easily performed. Will be able to do.
  • biosurfactant not only the biosurfactant produced by the proteobacteria of the present invention at the time of fatty acid decomposition, but also biosurfactants produced by other microorganisms may be used, that is, the plant functional component of the present invention.
  • Biosurfactants produced by other microorganisms may be further added to the content enhancer. Compared to artificially synthesized surfactants, biosurfactants are less toxic to living organisms and have higher biodegradability, which can lead to a more environmentally friendly plant functional ingredient content improver. .
  • biosurfactants produced by other microorganisms may be added during fatty acid degradation by proteobacteria. Fatty acid uptake by proteobacteria may be promoted.
  • the plant functional ingredient content improver of the present invention can induce the expression of stress response genes PR1, PR2 and PDF1.2 in the plant to be applied.
  • the plant functional ingredient content improver of the present invention reinforces the stress tolerance function that a plant originally has. Therefore, the functional component of a plant can be increased without using stress cultivation. There are no problems such as a decrease in yield and resistance to pests that occur when stress cultivation or high varieties are used.
  • the stress resistance function of a plant can be improved by a simple treatment without changing the conventional cultivation method, and the functional component content can be increased.
  • Examples of the functional component whose content increases according to the present invention include polyphenols, glycosides of functional components, and amino acids.
  • Examples of polyphenols include chlorogenic acid, scopoletin, sinapinic acid, and sinapiraldehyde.
  • Examples of the functional component glycoside include glucosinolates such as gluconasturtiin and 2-methylpropylglucosinolate, syringin, luteolin glucoside and the like.
  • Examples of amino acids include proline, glutamic acid, ⁇ -aminobutyric acid, arginine, and tryptophan. Other examples include adenosine. At least one of these functional ingredients can be increased by the plant functional ingredient content improver of the present invention.
  • the plant to which the present invention can be applied is not particularly limited, and examples thereof include plants of the eggplant family, the Brassicaceae family, the Asteraceae family, the legume family, the lily family, or the red department.
  • leafy vegetables such as lettuce, spinach, komatsuna, mizuna, cabbage, Chinese cabbage, baby leaves such as romaine lettuce, beets, komatsuna, spinach, mizuna, arugula, mustard, kale, chicory, medicinal herbs such as licorice, mao, tomato, eggplant It can be applied to fruit vegetables such as cucumber, pepper, paprika, okra, pepper, pumpkin, beans such as soybean, root vegetables such as leek, onion, carrot, lotus root and burdock.
  • the plant may be cultivated in any way, that is, it may be planted in soil, or may be cultivated by dipping in a hydroponic solution.
  • the plant functional ingredient content-enhancing agent of the present invention can be applied by any method, and can be used, for example, as a spray or immersion agent for contact with plant leaves or roots, or as a soil irrigation agent. .
  • the present invention is very advantageous because the functional component of a plant can be increased only by spraying the plant functional component content improver of the present invention without preparing special equipment.
  • the present invention also relates to a plant having increased functional components cultivated by the aforementioned cultivation method. Such plants are considered to be useful for food or as raw materials for cosmetics, pharmaceuticals, supplements and the like.
  • the method for producing a plant functional ingredient content improver containing a fatty acid metabolite of the present invention metabolizes a fatty acid having 4 to 30 carbon atoms to proteobacteria under a dissolved oxygen concentration environment of 0.1 to 8 mg / l. It includes a fatty acid metabolism process.
  • the fatty acid metabolism step according to the present invention is a step in which a fatty acid having 4 to 30 carbon atoms is decomposed by an enzyme or the like that is secreted or secreted by proteobacteria under a predetermined dissolved oxygen concentration environment.
  • an enzyme or the like that is secreted or secreted by proteobacteria under a predetermined dissolved oxygen concentration environment.
  • a method of culturing proteobacteria in a medium containing fatty acid under a predetermined dissolved oxygen concentration environment can be mentioned.
  • the dissolved oxygen concentration in the fatty acid metabolism process is 0.1 to 8 mg / l.
  • the dissolved oxygen concentration is less than 0.1 mg / l, the activity of proteobacteria tends to decrease and the metabolic efficiency of fatty acids tends to be extremely low.
  • the dissolved oxygen concentration exceeds 8 mg / l, in parallel with the metabolic process by proteobacteria, decomposition of the fatty acid as a substrate by oxygen in the medium proceeds, resulting in a decrease in metabolic efficiency, and consequently an active ingredient. There is a risk that the production amount of the metabolite is reduced.
  • the dissolved oxygen concentration is 0.1 to 5 mg / l, more preferably 0.1 to 4 mg / l.
  • the dissolved oxygen concentration is a value measured by a diaphragm galvanic electrode method or a diaphragm polarographic method on a PO electrode with a dissolved oxygen meter manufactured by HORIBA, Ltd.
  • the dissolved oxygen concentration can be adjusted by the culture vessel, the number of shakes, the amount of aeration, etc.
  • the culture conditions in the fatty acid metabolism step can be the same as the conventional conditions for culturing aerobic bacteria except that the dissolved oxygen concentration is within a predetermined range. Examples thereof include a method of culturing for 3 to 7 days by shaking with a flask and aeration culture with a spinner flask or a jar fermenter.
  • the number of days of culture is preferably the number of days during which the fatty acid is sufficiently emulsified and decomposed, but the number of days of culture varies depending on the agitation and the amount of bacteria.
  • the fatty acid decomposition state is determined by measuring the absorbance at a wavelength of 230 nm, thin layer chromatography (TLC), high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography mass spectrometry (GC / MS), liquid chromatography. It is preferable to confirm by graph mass spectrometry (LC / MS) or the like.
  • the temperature in the fatty acid metabolism step can be appropriately adjusted according to the proteobacteria used, and it is preferable to carry out the treatment at 20 to 30 ° C. from the viewpoint of fatty acid metabolic efficiency.
  • fatty acid and proteobacteria in the fatty acid metabolism step those described above in the description of the plant functional ingredient content improver of the present invention can be used.
  • the pre-culturing step for proteobacteria is not particularly limited, and a normal method for culturing aerobic bacteria can be used. It is preferable that only the cells are collected from the preculture solution by centrifugation or the like and used in the fatty acid metabolism step.
  • the plant functional ingredient content improver obtained by the production method of the present invention may contain a biosurfactant in addition to a fatty acid metabolite.
  • the biosurfactant according to the present invention means a surfactant-like substance that is produced by a microorganism to take up a highly hydrophobic substance and secreted outside the cell.
  • the biosurfactant secreted by proteobacteria also facilitates the dispersion of fatty acid metabolites in water. It is thought that the handleability of the plant functional ingredient content improver is improved.
  • the plant functional ingredient content improver of the present invention is obtained as a culture solution that is a mixture with a culture medium, a proteobacterium exocrine product containing a biosurfactant, microbial cells, and the like.
  • the culture solution may be used as the plant functional component content improver of the present invention as it is, and the supernatant obtained by removing the cells from the culture solution by centrifugation or the like may be used as the plant functional component content improver.
  • the plant functional ingredient content improver obtained by the production method of the present invention is applied to plants.
  • the culture solution can be used as it is. However, in the case of the stock solution, the treated portion of the plant at high temperatures may be condensed due to the evaporation of minerals and the effect of osmotic pressure.
  • the dilution factor is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited, but a dilution of 10 to 1000 times is preferable.
  • Preparation of plant functional ingredient content improver for test ⁇ Pre-culture step> 20 g of peptone (Difco protein enzyme hydrolyzate), 1.5 g of magnesium sulfate heptahydrate and 1.5 g of dipotassium hydrogen phosphate in 1 l (liter) of water in a glass Erlenmeyer flask, or 1 l (liter) ) 10 g of peptone (Difco protein enzyme hydrolyzate), 5 g of yeast extract and 10 g of sodium chloride are dissolved in autoclaved water at 121 ° C. for 20 minutes, cooled to room temperature, Inoculated. The mouth of the culture vessel was sealed with a silicon stopper.
  • the inoculated container was cultured for 24 hours under the conditions of 25 ⁇ 5 ° C. and 120 rpm using a bioshaker (BR-23UM manufactured by Taitec Corporation).
  • the number of bacteria in the culture was 5 ⁇ 10 8 cells / ml.
  • the cells were collected from the culture solution by centrifuging the culture solution under conditions of 15,000 ⁇ G and 20 ° C.
  • ⁇ Fatty acid metabolism process In 1 l (liter) of sterilized water in a glass Erlenmeyer flask, 12 g of linoleic acid (primary linoleic acid manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1.5 g of magnesium sulfate heptahydrate and / or dipotassium hydrogen phosphate 1 .5 g and the total amount of the cells obtained from the pre-culture step were added. This was cultured for 4 days under the conditions of 20 ° C., 120 rpm, and dissolved oxygen concentration of 4 mg / l using a bioshaker (BR-23UM manufactured by Taitec Corporation).
  • a bioshaker BR-23UM manufactured by Taitec Corporation
  • the degradation of linoleic acid involves measuring the concentration of oxidized lipid, which is one of linoleic acid intermediate products, in the culture solution using a spectrophotometer BioSpec-mini manufactured by Shimadzu Corporation at a wavelength of 230 nm. Confirmed. The following evaluation was performed after culture
  • Example 1 Effect of improving plant functional ingredient content in tomato Diluted solution in which 54 seedlings of tomato (variety: Reika) were planted between 60 cm strains at a general supplementary field, and the test plant functional ingredient content improver was diluted 50 to 100 times with water every week. Were sprayed (about 20 ml / strain) and / or soil irrigated (about 200 ml / strain). An untreated zone was established as a control zone. Four weeks after the start of the test, five tomato fruits were collected from the test group and the untreated group to evaluate the content of the plant functional component.
  • proline As a result, the content of proline, glutamic acid, and GABA ( ⁇ -aminobutyric acid) is increased in tomato fruits treated with the plant functional ingredient content improver for testing compared to tomato fruits collected from the control group. It has been found. The amount of each increase was 2.5 times for proline, 1.2 times for glutamic acid, and 1.4 times for GABA in the peak intensity in mass spectrometry. It has been reported that proline is recognized as sweet and that its hydroxy derivative has a skin beautifying effect. GABA has also been reported to have effects such as lowering blood pressure. Therefore, both proline and GABA are plant functional ingredients.
  • the plant functional ingredient content improver of the present invention has an excellent plant functional ingredient content improving effect.
  • components whose increase in content is observed in this example such as proline and GABA are components in which the increase in content is observed due to promotion of generation and / or suppression of degradation in commonly performed stress cultivation. Therefore, it is thought that it increased by the stress effect which caused the resistance induction effect of the plant functional ingredient content improver of the present invention. That is, the plant functional ingredient content improvement effect of the present invention is due to the promotion of the production of functional ingredients in plants, the suppression of degradation of functional ingredients produced in plants, or the combination thereof. Conceivable.
  • FIG. 1 to FIG. 3 show the detected amounts of functional components after application of the plant functional component content improver compared to before application of the plant functional component content improver of the present invention in komatsuna, mizuna and arugula, respectively.
  • the Volcano plot which analyzed was shown.
  • the horizontal axis indicates the intensity change rate value of the quantitative change, and the change rate (Fold Change) of the corresponding component area value (substantially synonymous with the component amount) on the mass chromatogram. Is represented by a logarithmic display of base 2.
  • the shaded portion in each figure is a portion where the log 2 (Fold Change) value is 1 or more, and the area value of the corresponding component is 2 before and after the application of the plant functional ingredient content improver. It shows that a difference of more than double is seen. And the shaded portion on the left side of each figure shows that the area value of the functional component after application is twice or more higher than before application of the plant functional component content improver.
  • the area less than -2 times has a significant difference in the area value before and after application of the plant functional ingredient content improver.
  • the vertical axis represents the statistical reliability p value, and represents the logarithm (10 as the base) of the reciprocal of the statistical p value at that time. Generally, if the p value is less than 0.05, it is determined to be reliable. Since -log 10 0.05 is 1.3, the shaded area is an area of 1.3 or more on the vertical axis. In other words, the shaded region on the left side of the drawings in FIGS. 1 to 3 significantly increases the components detected in the mass spectrum by applying the plant functional component content improver of the present invention. This is a region where the reliability of the event that there is and increases is high. It can be said that the number of plots present in this region is the number of components specifically increased by applying the plant functional component content improver of the present invention.
  • Table 1 shows typical functional components among the components specifically increased in each plant and their increase amounts.
  • the content of glucosinolates was significantly increased by 9.8 times in Komatsuna treated with the plant functional ingredient content improver for testing and 5.5 times in Mizuna.
  • luteolin glycosides were significantly increased 1.5 times.
  • Glucosinolate is a glucose glycoside containing sulfur and is a functional component that also serves as a precursor such as isothiocyanate having a carcinogenic inhibitory effect.
  • luteolin glycosides have anti-inflammatory activity and antioxidant activity.
  • the plant functional ingredient content enhancer of the present invention enhances the stress tolerance function of plants, and as a result, plants It can be seen that the functional component content is increased.
  • Example 3 for improving plant functional ingredient content in house-grown tomatoes In an outdoor general farm, 36 seedlings that were expanded to the eighth leaf of tomato (variety: Reika) were planted in the farm in June. The field was cultivated with 3 sheets of mulching sheets. In the test group, a diluted solution obtained by diluting the test plant functional ingredient content improver 50 to 100 times with water was irrigated at the base once every two weeks to give 200 ml per strain. An untreated zone was established as a control zone. In both the test group and the control group, water was appropriately given according to the state of the tomato seedlings with a watering tube.
  • treatment with the plant functional ingredient content improver for testing increases the sugar content of tomato fruit, promotes the accumulation of glutamic acid, and further suppresses the degradation of GABA.
  • functional proline such as promotion of collagen synthesis increased 2.1 times. From these results, the plant functional ingredient content improver of the present invention has a remarkable effect of promoting the production of plant functional ingredients and / or inhibiting the degradation of plant functional ingredients. It turns out that it has the effect excellent in the improvement of component content.
  • the plant functional component content improver of the present invention and the plant functional component content improver produced by the production method of the present invention are excellent in the functional component content improving effect in plants. It turns out that it is a sex component content improver.

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Abstract

ストレス栽培や高含有品種を使用しなくとも、植物に適宜散布または灌注することで植物の機能性成分の含有量の増加を図ることのできる植物機能性成分含有量向上剤、およびその製造方法を提供すること目的とする。炭素数４～３０の脂肪酸を０．１～８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含む植物機能性成分含有量向上剤、および炭素数４～３０の脂肪酸を０．１～８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含む、脂肪酸代謝物を含む植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。

Description

植物機能性成分含有量向上剤および植物機能性成分含有量向上剤の製造方法
　本発明は、植物機能性成分含有量向上剤および植物機能性成分含有量向上剤の製造方法に関する。
　多くの植物には、ビタミン類、カロチノイド、ポリフェノール類などの様々な機能性成分が含まれている。近年、健康志向から農作物に含まれるこれら機能性成分に対する関心が高まっており、特に、細胞や組織に損傷を与え、ガンや生活習慣病、老化を促進させる一因になっていると考えられる活性酸素等のラジカルを除去する抗酸化活性がある機能性成分を多く含む農産物のニーズは高い。そこで、植物体中での有用な機能性成分の産生を有意に高めるための試みが行われてきている。
　植物に含まれる機能性成分の増収方法としては、特許文献１に紫外線を照射してイチゴの実に含まれるポリフェノールの量を増やす技術が開示されている。
国際公開第２０１２／１３３１３０号
　しかしながら、紫外線を植物に照射すると植物の生態組織を破壊する場合があり、照射時間には限度があった。また、紫外線は人体に対する害も懸念され、作業者の安全を十分に確保できないという問題があった。
　本発明は、前記問題点に鑑みてなされたもので、植物の生体組織に悪影響がなく、植物に適宜散布または灌注することで安全に植物の機能性成分の含有量の増加を図ることのできる植物機能性成分含有量向上剤、およびその製造方法を提供することを目的とする。
　本発明は、炭素数４～３０の脂肪酸を０．１～８ｍｇ／ｌ（リットル）の溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含む植物機能性成分含有量向上剤に関する。
　前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である植物機能性成分含有量向上剤が好ましい。
　前記代謝が、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下での代謝である植物機能性成分含有量向上剤が好ましい。
　前記プロテオバクテリアが、前培養されたプロテオバクテリアである植物機能性成分含有量向上剤が好ましい。
　前記前培養されたプロテオバクテリアが、菌数１×１０8～９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（ミリリットル）に前培養されたプロテオバクテリアである植物機能性成分含有量向上剤が好ましい。
　前記植物機能性成分含有量向上剤が、バイオサーファクタントを含む植物機能性成分含有量向上剤であることが好ましい。
　前記代謝が、２０～３０℃の条件下での代謝である植物機能性成分含有量向上剤が好ましい。
　前記植物機能性成分含有量向上剤が、植物の茎葉もしくは根に接触させる噴霧剤もしくは浸漬用薬剤、または、土壌灌注用薬剤として用いられる植物機能性成分含有量向上剤が好ましい。
　前記植物機能性成分が、ポリフェノール類、アミノ酸、テルペノイドおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される植物機能性成分含有量向上剤が好ましい。
　前記アミノ酸が、プロリン、グルタミン酸およびγ－アミノ酪酸からなる群より選択される植物機能性成分含有量向上剤が好ましい。
　前記植物機能性成分含有量向上剤が、ナス科、アブラナ科、キク科またはアカザ科の植物に対して使用されることを特徴とする植物機能性成分含有量向上剤が好ましい。
　また、本発明は、炭素数４～３０の脂肪酸を０．１～８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含む、脂肪酸代謝物を含む植物機能性成分含有量向上剤の製造方法に関する。
　前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である植物機能性成分含有量向上剤の製造方法が好ましい。
　前記脂肪酸代謝工程を、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下で実施する植物機能性成分含有量向上剤の製造方法が好ましい。
　前記プロテオバクテリアが、前培養されたプロテオバクテリアである植物機能性成分含有量向上剤の製造方法が好ましい。
　前記前培養されたプロテオバクテリアが、菌数１×１０8～９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌに前培養されたプロテオバクテリアである植物機能性成分含有量向上剤の製造方法が好ましい。
　バイオサーファクタントを含む植物機能性成分含有量向上剤の製造方法である植物機能性成分含有量向上剤の製造方法が好ましい。
　前記脂肪酸代謝工程を、２０～３０℃の条件下で実施する植物機能性成分含有量向上剤の製造方法が好ましい。
　植物の茎葉もしくは根に接触させる噴霧剤もしくは浸漬用薬剤、または、土壌灌注用薬剤としてとして機能する植物機能性成分含有量向上剤の製造方法である植物機能性成分含有量向上剤の製造方法が好ましい。
　ポリフェノール類、アミノ酸、テルペノイドおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される植物機能性成分の含有量を向上させる薬剤として機能する植物機能性成分含有量向上剤の製造方法である植物機能性成分含有量向上剤の製造方法が好ましい。
　プロリン、グルタミン酸およびγ－アミノ酪酸からなる群より選択される前記アミノ酸の含有量を向上させる薬剤として機能する植物機能性成分含有量向上剤の製造方法である植物機能性成分含有量向上剤の製造方法が好ましい。
　ナス科、アブラナ科、キク科またはアカザ科の植物に使用される植物機能性成分含有量向上剤の製造方法である植物機能性成分含有量向上剤の製造方法が好ましい。
　なお、本発明でいう植物機能性成分含有量向上剤は、植物内で機能性成分の生成促進および／または分解の抑制を起こさせ、植物中の機能性成分含有量を増加させるものである。
　本発明の植物機能性成分含有量向上剤は、ストレス栽培や高含有品種を使用しなくとも、植物に適宜散布または灌注することで植物機能性成分の含有量を向上させることができる。また、本発明の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法によれば、ストレス栽培や高含有品種を使用しなくとも、植物に適宜散布または灌注することで植物機能性成分の含有量を向上させることができる植物機能性成分含有量向上剤を製造することができる。
本発明の植物機能性成分含有量向上剤を小松菜に対して使用した場合の、機能性成分間比較解析を示すボルケーノプロットである。 本発明の植物機能性成分含有量向上剤を水菜に対して使用した場合の、機能性成分間比較解析を示すボルケーノプロットである。 本発明の植物機能性成分含有量向上剤をルッコラに対して使用した場合の、機能性成分間比較解析を示すボルケーノプロットである。
植物機能性成分含有量向上剤
　本発明の植物機能性成分含有量向上剤は、炭素数４～３０の脂肪酸を０．１～８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含むことを特徴とする。
　脂肪酸代謝物を植物の茎葉または根の一部に接触させることで、植物機能性成分の含有量を向上させることができる。一般的に行われるストレス栽培において増加する成分と同じ成分の植物体内での向上が確認できることから、本発明の脂肪酸代謝物は、植物体に吸収されることによって、本来植物体内で環境ストレスによりシグナルとして産生され作用する分子と同様の作用を植物体内で行う物質および／またはその前駆体を含んでいると考えられる。すなわち、本発明の脂肪酸代謝物により、植物が本来有しているストレス耐性機能を強化することができる。その結果、植物体内での機能性成分の生成促進および／または分解の抑制が起き、植物体内での機能性成分が増加される。
　本発明における代謝とは、所定の溶存酸素濃度環境下においてプロテオバクテリアが外分泌または内分泌する酵素等により炭素数４～３０の脂肪酸の分解が行われることをいう。例えば、所定の溶存酸素濃度環境下、脂肪酸を含有する培地でプロテオバクテリアを培養する方法が挙げられる。
　プロテオバクテリアは、脂肪酸の代謝に関わる酵素であるリポキシゲナーゼ（lipoxygenase:ＬＯＸ）を産生する遺伝子を持っており、脂肪酸代謝物を生成できる。
　本発明において用いられる脂肪酸の炭素数は４～３０であり、１０～２０が好ましい。炭素数が４未満の場合は、融点・沸点が低いため、培養時の温度で揮発性が高まり培地中に残存しにくくなる傾向がある。また、炭素数が３０を超える場合は、融点・沸点が高くなるため、培養時の温度で固体となり培地と混合できず分離してしまう傾向がある。ただし、融点は水素結合の数によって炭素数のみに依存しない場合もある。
　本発明において用いられる脂肪酸は、代謝効率の観点や培地中で固化することを抑制する観点から、２０～３０℃で液体であることが好ましく、２０℃で液体であることがより好ましい。
　本発明の脂肪酸は、飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸のいずれか、または両方を含む混合物とすることができる。また、植物油やグリセリドの形態や遊離脂肪酸を用いることができるが、分解速度に優れるという理由から遊離脂肪酸（モノカルボン酸）が好ましい。
　炭素数４～３０の遊離脂肪酸としては、酪酸（ブチル酸）、吉草酸（バレリアン酸）、カプロン酸、エナント酸（ヘプチル酸）、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、α－リノレン酸、γ－リノレン酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、ミード酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸などが挙げられ、なかでも炭素数が１０～２０のカプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、α－リノレン酸、γ－リノレン酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、ミード酸、アラキドン酸が好ましく、炭素数が１８のオレイン酸、リノール酸、α－リノレン酸、γ－リノレン酸がより好ましい。
　脂肪酸を含有する培地を使用する場合の脂肪酸の含有量は、１２０ｇ／ｌ以下が好ましく、１００ｇ／ｌ以下がより好ましく、６０ｇ／ｌ以下がさらに好ましい。１２０ｇ／ｌを超える場合は、培地の水分との乳化が困難となり、代謝効率が悪化する恐れやプロテオバクテリアの生育を阻害する恐れがある。また、脂肪酸の含有量の下限は特に限定されないが、１．０ｇ／ｌ以上が好ましい。
　脂肪酸を含有する培地は、他にミネラル成分を含有することが好ましい。ミネラル成分としては、特に限定されず微生物培養に通常用いられるミネラル成分を挙げることができる。例えば、マグネシウム（Ｍｇ）、リン（Ｐ）、ナトリウム（Ｎａ）またはカリウム（Ｋ）を有する成分が挙げられる。これらの成分は単独で使用することも、複数を併用することもできる。好ましくはこれらの成分のうちの２種類、さらに好ましくは３種類以上が使用され得る。培地中のミネラル成分の含有量は特に限定されず、従来の好気性細菌の培養方法で使用される量とすることができるが、植物への施用時に塩害が発生する恐れがあるため、好ましくは１５ｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｇ／ｌ以下で使用され得る。
　本発明にて用いられるプロテオバクテリアは、本発明の効果を損なわない限り特に限定されない。好ましくは脂肪酸の代謝効率や生育効率の観点から、増殖に適した温度（至適温度）が１０～４０℃のプロテオバクテリアが好ましく、２０～３０℃のプロテオバクテリアがより好ましい。
　プロテオバクテリアは、脂肪酸の代謝効率に優れるという理由から、前培養されたプロテオバクテリアであることが好ましく、菌数が１×１０8～９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌまで前培養されていることがより好ましい。
　本発明においては、代謝は、０．１～８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下で行われる。溶存酸素濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満の場合は、プロテオバクテリアの活動が低下し脂肪酸の代謝効率が極めて低くなる傾向がある。また、溶存酸素濃度が８ｍｇ／ｌを超える場合は、プロテオバクテリアによる代謝工程と並行して、基質である脂肪酸の培地中の酸素による分解が進行してしまい、代謝効率が低下し、ひいては有効成分である代謝産物の産生量が低下してしまう恐れがある。より好ましくは、溶存酸素濃度は０．１～５ｍｇ／ｌであり、さらに好ましくは０．１～４ｍｇ／ｌである。なお、溶存酸素濃度は株式会社堀場製作所製の溶存酸素計でＰＯ電極に隔膜ガルバニ電極法または隔膜ポーラログラフ法により測定される値とする。
　代謝における温度は使用するプロテオバクテリアに応じて適宜調整することができ、脂肪酸の代謝効率の観点から、２０～３０℃がより好ましい。
　本発明において、植物機能性成分含有量向上剤は、脂肪酸代謝物に加えバイオサーファクタントを含有し得る。脂肪酸代謝物が水に分散されやすくなり、植物機能性成分含有量向上剤の取扱性の観点から好ましいと考えられる。本発明に係るバイオサーファクタントとは、微生物が疎水性の高い物質を取り込むために産生し、細胞外へと分泌する界面活性剤様の物質を意味する。本発明において、プロテオバクテリアによって分泌されたバイオサーファクタントは、脂肪酸代謝物の水への分散も容易にするため、脂肪酸代謝物を含む植物機能性成分含有量向上剤の散布や灌注などが効率よく簡単に行えるようになる。しかしながら、バイオサーファクタントとしては、脂肪酸の分解時に本発明のプロテオバクテリアによって産生されたバイオサーファクタントだけではなく、他の微生物が産生したバイオサーファクタントが使用されてもよく、すなわち、本発明の植物機能性成分含有量向上剤には他の微生物によって産生されたバイオサーファクタントがさらに添加されてもよい。人工的に合成された界面活性剤と比較して、バイオサーファクタントは生物に関する毒性が低く、また、生分解性も高いため、より環境に優しい植物機能性成分含有量向上剤が得られると考えられる。また、プロテオバクテリアによる脂肪酸分解を促進させるために、他の微生物が産生したバイオサーファクタントが、プロテオバクテリアによる脂肪酸分解において添加されてもよい。プロテオバクテリアによる脂肪酸の取り込みが促進される可能性がある。
　本発明の植物機能性成分含有量向上剤は、施用される植物においてストレス応答遺伝子ＰＲ１、ＰＲ２およびＰＤＦ１．２の発現を誘導することができる。この結果、植物の種類・品種や生育ステージ、また栽培環境や季節に依存して、クチクラの発達、トライコームの発達、毛根発生促進、抗酸化物質の生成量増加、水分蒸散防止機能の促進（プロリンなどの生産増加や葉を厚くする）、茎が太くなる、などが起こる。すなわち、本発明の植物機能性成分含有量向上剤は、植物が本来有しているストレス耐性機能を強化する。したがって、ストレス栽培を用いずとも、植物の機能性成分を増加させることができる。ストレス栽培や高含有品種を使用した場合に発生する収量の低下や病害虫に対する抵抗性の低下といった問題が生じない。本発明の植物機能性成分含有量向上剤によれば、従来の栽培方法を変えることなく簡便な処理によって植物のストレス耐性機能を向上させ、機能性成分含有量を増加させることができる。
　本発明によって含量が増加する機能性成分としては、例えば、ポリフェノール類、機能性成分の配糖体、アミノ酸を挙げることができる。ポリフェノール類としては、例えば、クロロゲン酸、スコポレチン、シナピン酸、シナピルアルデヒドなどが挙げられる。機能性成分の配糖体としては、例えば、グルコナスツルチインや２－メチルプロピルグルコシノレートなどのグルコシノレート類、シリンギン、ルテオリングルコシドなどが挙げられる。アミノ酸としては、例えば、プロリン、グルタミン酸、γ－アミノ酪酸、アルギニン、トリプトファンなどが挙げられる。その他、アデノシンなどが挙げられる。本発明の植物機能性成分含有量向上剤によって、これらの機能性成分の少なくとも１つが増加され得る。
　本発明を適用することのできる植物は、特に限定されないが、例えば、ナス科、アブラナ科、キク科、マメ科、ユリ科、またはアカザ科の植物が挙げられる。例えば、レタス、ホウレンソウ、コマツナ、ミズナ、キャベツ、白菜などの葉菜類、ロメインレタス、ビーツ、コマツナ、ホウレンソウ、ミズナ、ルッコラ、カラシナ、ケール、チコリーなどのベビーリーフ類、カンゾウ、マオウなどの薬草、トマト、ナス、キュウリ、ピーマン、パプリカ、オクラ、トウガラシ、カボチャなどの果菜類、大豆などの豆類、ネギ、玉ねぎ、ニンジン、レンコン、ゴボウなどの根菜類などに施用することができる。
　植物はどのように栽培されていてもよく、すなわち土壌に植え付けられていても、また水耕液に浸して栽培されていてもよい。本発明の植物機能性成分含有量向上剤は、任意の方法で施用することができ、例えば、植物の茎葉もしくは根に接触させる噴霧剤もしくは浸漬用薬剤、または、土壌灌注用薬剤として使用され得る。特殊な設備等を用意せずとも、本発明の植物機能性成分含有量向上剤を散布等するだけで植物の機能性成分を増加させることができるため、本発明は非常に有利である。
　本発明はまた、前述した栽培方法により栽培した機能性成分が増加した植物に関する。そのような植物は、食用として或いは化粧品や医薬品、サプリメントなどの原料として有用であると考えられる。
製造方法
　本発明の脂肪酸代謝物を含む植物機能性成分含有量向上剤の製造方法は、炭素数４～３０の脂肪酸を０．１～８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含むことを特徴とする。
　本発明における脂肪酸代謝工程は、所定の溶存酸素濃度環境下においてプロテオバクテリアが外分泌または内分泌する酵素等により炭素数４～３０の脂肪酸の分解が行われる工程である。例えば、所定の溶存酸素濃度環境下、脂肪酸を含有する培地でプロテオバクテリアを培養する方法が挙げられる。
　脂肪酸代謝工程における溶存酸素濃度は、０．１～８ｍｇ／ｌである。溶存酸素濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満の場合は、プロテオバクテリアの活動が低下し脂肪酸の代謝効率が極めて低くなる傾向がある。また、溶存酸素濃度が８ｍｇ／ｌを超える場合は、プロテオバクテリアによる代謝工程と並行して、基質である脂肪酸の培地中の酸素による分解が進行してしまい、代謝効率が低下し、ひいては有効成分である代謝産物の産生量が低下してしまう恐れがある。より好ましくは、溶存酸素濃度は０．１～５ｍｇ／ｌであり、さらに好ましくは０．１～４ｍｇ／ｌである。なお、溶存酸素濃度は株式会社堀場製作所製の溶存酸素計でＰＯ電極に隔膜ガルバニ電極法または隔膜ポーラログラフ法により測定される値とする。
　溶存酸素濃度は、培養容器、振とう数、通気量などによって、調整することができる。
　脂肪酸代謝工程における培養条件は、溶存酸素濃度を所定の範囲とすること以外は、従来の好気性細菌を培養する条件と同様の条件とすることができる。例えば、フラスコによる振とうや、スピナーフラスコまたはジャーファメンターによる通気培養により３～７日間培養する方法が挙げられる。
　培養日数は、脂肪酸の乳化、分解等が充分に行われる日数とすることが好ましいが、撹拌や菌量によって培養日数は変化する。なお、脂肪酸代謝工程の終了は、脂肪酸の分解状態を、波長２３０ｎｍにおける吸光度の測定、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）等で確認することが好ましい。
　脂肪酸代謝工程における温度は使用するプロテオバクテリアに応じて適宜調整することができ、脂肪酸の代謝効率の観点から、２０～３０℃の条件下で実施することが好ましい。
　脂肪酸代謝工程における脂肪酸およびプロテオバクテリアは、本発明の植物機能性成分含有量向上剤の説明で前述したものを使用することができる。
　なお、プロテオバクテリアの前培養工程としては、特に限定されず通常の好気性細菌の培養方法とすることができる。前培養液から遠心分離等により菌体のみを回収し、脂肪酸代謝工程に用いることが好ましい。
　本発明の製造方法により得られる植物機能性成分含有量向上剤は、脂肪酸代謝物に加えバイオサーファクタントを含有し得る。本発明に係るバイオサーファクタントとは、微生物が疎水性の高い物質を取り込むために産生し、細胞外へと分泌する界面活性剤様の物質を意味する。本発明において、プロテオバクテリアによって分泌されたバイオサーファクタントは、脂肪酸代謝物の水への分散も容易にする。植物機能性成分含有量向上剤の取扱性が向上すると考えられる。
　本発明の植物機能性成分含有量向上剤は、培地、バイオサーファクタントを含むプロテオバクテリアの外分泌物、菌体などとの混合物である培養液として得られる。当該培養液をそのまま本発明の植物機能性成分含有量向上剤としてもよく、培養液から遠心分離などにより菌体を除去した上澄み液を植物機能性成分含有量向上剤としてもよい。本発明の製造方法により得られる植物機能性成分含有量向上剤は、植物に施用される。培養液は原液のままでも使用することができるが、原液の場合は高温時に植物への処理部分が、ミネラル分が蒸発濃縮され浸透圧の影響で縮む恐れがあるため、原液を希釈して使用することが望ましい場合がある。希釈倍率としては本発明の効果を発揮する限り特に限定されないが、１０～１０００倍希釈が好ましい。なお、除去した菌体を再度、脂肪酸を含有する培地で培養することにより本発明の脂肪酸代謝工程を繰り返し行うことが可能である。
　本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
試験用植物機能性成分含有量向上剤の調製
＜前培養工程＞
　ガラス製三角フラスコ内の１ｌ（リットル）の水にペプトン（Ｄｉｆｃｏ製のタンパク質酵素加水分解物）２０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物１．５ｇおよびリン酸水素二カリウム１．５ｇ、または、１ｌ（リットル）の水にペプトン（Ｄｉｆｃｏ製のタンパク質酵素加水分解物）１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇおよび塩化ナトリウム１０ｇを溶解させ、１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌を行い、室温まで冷却後、プロテオバクテリアの菌液を植菌した。なお、培養容器の口はシリコン栓で密栓した。植菌後の容器をバイオシェーカー（タイテック株式会社製のＢＲ－２３ＵＭ）を用い、２５±５℃、１２０ｒｐｍの条件下で、２４時間培養を行った。培養液中の菌数は５×１０8ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった。培養後、培養液を１５，０００×Ｇ、２０℃の条件で遠心分離することで培養液から菌体を回収した。
＜脂肪酸代謝工程＞
　ガラス製三角フラスコ内の１ｌ（リットル）の滅菌水に、リノール酸（和光純薬工業株式会社製の一級リノール酸）１２ｇ、硫酸マグネシウム七水和物１．５ｇおよび／またはリン酸水素二カリウム１．５ｇ、および前培養工程から得られた菌体の全量を加えた。これを、バイオシェーカー（タイテック株式会社製のＢＲ－２３ＵＭ）を用い、２０℃、１２０ｒｐｍ、溶存酸素濃度４ｍｇ／ｌの条件下で、４日間培養を行った。なお、リノール酸の分解は、リノール酸中間生成物の１つである酸化脂質の培養液中の濃度を株式会社島津製作所製の分光光度計ＢｉｏＳｐｅｃ－ｍｉｎｉを用いて波長２３０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、確認した。培養後、菌体を含む培養液を試験用植物機能性成分含有量向上剤とし、下記の評価を行った。
トマトにおける植物機能性成分含有量向上効果
・実施例１
　一般補場にて、トマト（品種：麗夏）の幼苗５４株を６０ｃｍの株間で植え付け、１週間ごとに、試験用植物機能性成分含有量向上剤を水で５０～１００倍希釈した希釈液を噴霧（２０ｍｌ／株程度）および／もしくは土壌灌注（２００ｍｌ／株程度）で接種した。対照区として無処理区を設けた。試験を開始してから４週間後に、トマト果実を試験区および無処理区から５個体ずつ採取して植物機能性成分の含有量を評価した。評価は、採取したトマト果実の果肉を破砕し、絹ごしして得られたろ液を凍結乾燥により乾燥させ、これをアセトニトリル：水＝１：１の溶液にて抽出した成分の、ブルカーダルトニクス社製のＭＳ定性機Ｍａｘｉｓとサーモフィッシャーサイエンティフィック社製ＨＰＬＣのＵｌｔｉｍａｔｅ３０００を用いたＬＣＭＳ多変量解析により行った。
　その結果、試験用植物機能性成分含有量向上剤で処理したトマト果実において、対照区より採取したトマト果実と比べて、プロリン、グルタミン酸、ＧＡＢＡ（γ－アミノ酪酸）の含有量が増加していることが判明した。それぞれの増加量は、質量分析におけるピーク強度において、プロリンで２．５倍、グルタミン酸で１．２倍、ＧＡＢＡで１．４倍、であった。プロリンは甘みとして認識されたり、そのヒドロキシ誘導体に美肌効果があることなどが報告されている。また、ＧＡＢＡには血圧低下等の効果があることが報告されている。したがって、プロリンやＧＡＢＡなどはともに植物機能性成分である。
　以上の結果より、本発明の植物機能性成分含有量向上剤は優れた植物機能性成分含有量向上効果を有していることがわかる。また、プロリンやＧＡＢＡなどの本実施例において含有量の増加が観察された成分は、一般的に行われるストレス栽培において生成の促進および／または分解の抑制により含有量の増加が見られる成分であるため、本発明の植物機能性成分含有量向上剤の抵抗性誘導効果を引き起こしたストレス効果によって増加したと考えられる。すなわち、本発明の植物機能性成分含有量向上効果は、植物中での機能性成分の生成促進、植物中で生成された機能性成分の分解抑制、またはそれらの組合せの結果によるものであると考えられる。
葉菜類、ベビーリーフ類およびハーブ類における植物機能性成分含有量向上効果
・実施例２
　供試材料として、小松菜、水菜、ルッコラを用いた。培土（タキイ種苗（株）　商品名「種まき培土」）に播種し、発芽後１週間以内に、試験用植物機能性成分含有量向上剤を水で１００倍希釈した希釈液で根（地下部）のみ灌注処理した。播種後およそ１９日までのベビーリーフ期を目安に栽培した。それぞれの可食部を凍結粉砕後に凍結乾燥させ、得られた試料粉３０ｍｇをアセトリル：水＝１：１（２ｍＬ）にて抽出し、抽出液を試料として可食部に含有される成分をＬＣＭＳを用いて主成分分析した。対照として、水のみを灌注したものを準備し、同様の分析を行った。結果を図１、図２および図３ならびに表１に示す。さらに、栽培後の各植物の形質を観察した。
　図１～図３は、それぞれ、小松菜、水菜およびルッコラにおける、本発明の植物機能性成分含有量向上剤の付与前と対比した植物機能性成分含有量向上剤付与後の機能性成分の検出量を解析したボルケーノプロットを示している。それぞれのボルケーノプロットにおいて、その横軸は、量的変化の強度変化割合値を示すものであり、マスクロマトグラム上の該当成分エリア値（成分量とほぼ同義である）の変化割合（Ｆｏｌｄ　Ｃｈａｎｇｅ）を底２の対数表示で示したものである。各図中の網掛け部分はｌｏｇ2（Ｆｏｌｄ　Ｃｈａｎｇｅ）の値が１以上である差がある部分で、植物機能性成分含有量向上剤の付与前と付与後とで該当成分のエリア値に２倍以上の差が見られることを示している。そして、各図上の左側の網掛け部分が、植物機能性成分含有量向上剤の付与前と比較して付与後の機能性成分のエリア値が２倍以上高値であることを示している。なお、ここで、－２倍未満の領域は、植物機能性成分含有量向上剤の付与前と付与後のエリア値に有為差があるとは便宜上考えない。
　縦軸は、統計的信頼度ｐ値を示すものであり、そのときの統計的なｐ値の逆数の対数（１０を底とする）を示している。一般的に、ｐ値が０．０５未満である場合に信頼性があると判断される。－ｌｏｇ10０．０５は、１．３であるので、網掛け領域は縦軸の１．３以上の領域となる。つまり、図１～図３における図面上の左側の網掛け領域は、本発明の植物機能性成分含有量向上剤を付与することで、マススペクトルで検出される成分が有為に増え、その成分が存在し、かつ増加しているという事象の信頼度が高い領域である。この領域に存在しているプロット数が、本発明の植物機能性成分含有量向上剤を付与することで特異的に増加した成分数であると言える。
　図１に示されるように、小松菜の抽出液のＬＣＭＳのボルケーノプロットにおいて量とそのばらつきにおいて明確に増加した成分が２１個見出された。図２に示されるように、水菜の抽出液のＬＣＭＳのボルケーノプロットにおいて量とそのばらつきにおいて明確に増加した成分が２３個見出された。図３に示されるように、ルッコラの抽出液のＬＣＭＳのボルケーノプロットにおいて量とそのばらつきにおいて明確に増加した成分が１８個見出された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　それぞれの植物において特異的に増加した成分のうちの代表的な機能性成分とその増加量が表１に示されている。グルコシノレート類の含有量は、試験用植物機能性成分含有量向上剤で処理した小松菜において９．８倍、そして水菜において５．５倍有意に増加していた。また、ルッコラにおいては、ルテオリン配糖体が１．５倍有意に増加していた。グルコシノレートは硫黄を含むグルコース配糖体であり、発がん抑制作用のあるイソチアシネートなどの前駆体ともなる機能性成分である。また、ルテオリン配糖体は、抗炎症活性や抗酸化活性を有することが報告されている。また、ポリフェノール類の有意な増加も検出され、例えば、試験用植物機能性成分含有量向上剤で処理した小松菜において２．７倍（クロロゲン酸）および１．８倍（スコポレチン）、ルッコラにおいて１．５倍（シナピルアルデヒド）および１．９倍（シナピン酸）、水菜において２．１倍（シナピルアルデヒド）増加していた。これらのポリフェノール類は機能性成分として抗酸化作用や脂肪燃焼作用の効果が報告されているものである。その他、アミノ酸等の増加も検出された。この結果より、本発明の植物機能性成分含有量向上剤が、様々な植物に含まれる種々の機能性成分の生成を促進、および／または分解を抑制して、それらの成分量を増大させることができることがわかる。
　栽培後の各植物の形質を観察した結果、水菜において、針状トライコームの形成固体が増加していた。ルッコラでは、茎部分を中心に赤系色素が増加していた。これらの形質の変化は、植物のストレス応答反応を由来とするものであり、したがって、本発明の植物機能性成分含有量向上剤が、植物のストレス耐性機能を強化すること、そしてその結果、植物機能性成分含有量を増加させていることがわかる。
ハウス栽培トマトにおける植物機能性成分含有量向上効果
・実施例３
　屋外一般圃場にて、トマト（品種：レイカ）の第８葉まで展開した苗３６株を６月に圃場に定植した。圃場は３つの畝にそれぞれマルチングシートを敷いて栽培した。試験区は試験用植物機能性成分含有量向上剤を水で５０～１００倍希釈した希釈液を１株あたり２００ｍｌになるように２週間に１回根元に灌注し、与えた。対照区として無処理区を設けた。試験区および対照区ともに、水は散水チューブにて適宜トマト苗の状態に応じて与えた。試験を開始してから２か月後に、トマト果実を試験区および無処理区から同時期に開花した第一花房から実を無作為に５個体ずつ採取して植物機能性成分の含有量を評価した。評価は、採取したトマト果実の果肉を破砕し、絹ごしして得られたろ液を凍結乾燥して乾燥させ、これをアセトニトリル：水＝１：１の溶液にて抽出した成分の、サーモフィッシャー製のＱ－ＥＸＡＣＴＩＶＥ－ＦＯＣＵＳ－ＬＣＭＳを用いたＬＣＭＳ多変量解析により行った。なお、ＬＣＭＳは、下記の方法で測定した。
　ＬＣＭＳの移動相としては、移動相Ａを０．１％ぎ酸＋超純水、および、移動相Ｂを０．１％ぎ酸＋アセトニトリルとして、グラジエント法を用い、測定開始後０分から２分までが、移動相Ａ：移動相Ｂ＝９８：２、その後組成を変化させ、６分後における移動相Ａと移動相Ｂとの比が移動相Ａ：移動相Ｂ＝２：９８となるようにして２０分後まで、０．３ｍＬ／分の流量で流した。カラムは、ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　ＢＥＨ　Ｃ１８カラム（１．７μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ）（ウォーターズ社製）を用いた。
　その結果、試験用植物機能性成分含有量向上剤で処理したトマト果実において、プロリン、ＧＡＢＡ、およびグルタミン酸等の機能性成分の含有量が増加していた。増加した代表的な成分およびその増加量を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　試験用植物機能性成分含有量向上剤で処理することにより、トマト果実の糖度が増加し、グルタミン酸の蓄積が促進され、さらにＧＡＢＡの分解が抑制されていることがわかる。また、コラーゲンの合成促進などの機能性のあるプロリンも２．１倍に増加していた。この結果より、本発明の植物機能性成分含有量向上剤は、顕著な植物機能性成分生成促進および／または植物機能性成分分解抑制効果を有しており、このため、植物体内の植物機能性成分含有量の向上に優れた効果を有していることがわかる。
　上記の結果より、本発明の植物機能性成分含有量向上剤および本発明の製造方法により製造される植物機能性成分含有量向上剤が、植物における機能性成分含有量向上効果に優れた植物機能性成分含有量向上剤であることがわかる。

Claims (22)

  1. 炭素数４～３０の脂肪酸を０．１～８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含む植物機能性成分含有量向上剤。
  2. 前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である請求項１記載の植物機能性成分含有量向上剤。
  3. 前記代謝が、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下での代謝である請求項１または２記載の植物機能性成分含有量向上剤。
  4. 前記プロテオバクテリアが、前培養されたプロテオバクテリアである請求項１～３のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤。
  5. 前記前培養されたプロテオバクテリアが、菌数１×１０8～９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌに前培養されたプロテオバクテリアである請求項４記載の植物機能性成分含有量向上剤。
  6. バイオサーファクタントを含む請求項１～５のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤。
  7. 前記代謝が、２０～３０℃の条件下での代謝である請求項１～６のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤。
  8. 植物の茎葉もしくは根に接触させる噴霧剤もしくは浸漬用薬剤、または、土壌灌注用薬剤として用いられる請求項１～７のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤。
  9. 前記植物機能性成分が、ポリフェノール類、アミノ酸、テルペノイドおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される請求項１～８のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤。
  10. 前記アミノ酸が、プロリン、グルタミン酸およびγ－アミノ酪酸からなる群より選択される請求項９記載の植物機能性成分含有量向上剤。
  11. ナス科、アブラナ科、キク科またはアカザ科の植物に対して使用されることを特徴とする請求項１～１０のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤。
  12. 炭素数４～３０の脂肪酸を０．１～８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含む、脂肪酸代謝物を含む植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
  13. 前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である請求項１２記載の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
  14. 前記脂肪酸代謝工程を、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下で実施する請求項１２または１３記載の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
  15. 前記プロテオバクテリアが、前培養されたプロテオバクテリアである請求項１２～１４のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
  16. 前記前培養されたプロテオバクテリアが、菌数１×１０8～９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌに前培養されたプロテオバクテリアである請求項１５記載の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
  17. バイオサーファクタントを含む植物機能性成分含有量向上剤の製造方法である請求項１２～１６のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
  18. 前記脂肪酸代謝工程を、２０～３０℃の条件下で実施する請求項１２～１７のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
  19. 植物の茎葉もしくは根に接触させる噴霧剤もしくは浸漬用薬剤、または、土壌灌注用薬剤として機能する植物機能性成分含有量向上剤の製造方法である請求項１２～１８のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
  20. ポリフェノール類、アミノ酸、テルペノイドおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される植物機能性成分の含有量を向上させる薬剤として機能する植物機能性成分含有量向上剤の製造方法である請求項１２～１９のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
  21. プロリン、グルタミン酸およびγ－アミノ酪酸からなる群より選択される前記アミノ酸の含有量を向上させる薬剤として機能する植物機能性成分含有量向上剤の製造方法である請求項２０記載の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
  22. ナス科、アブラナ科、キク科またはアカザ科の植物に使用される植物機能性成分含有量向上剤の製造方法である請求項１２～２１のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
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