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WO2018159817A1 - 低体重誘導剤のスクリーニング方法、低体重誘導剤、及び低体重モデル動物 - Google Patents

低体重誘導剤のスクリーニング方法、低体重誘導剤、及び低体重モデル動物 Download PDF

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WO2018159817A1
WO2018159817A1 PCT/JP2018/008036 JP2018008036W WO2018159817A1 WO 2018159817 A1 WO2018159817 A1 WO 2018159817A1 JP 2018008036 W JP2018008036 W JP 2018008036W WO 2018159817 A1 WO2018159817 A1 WO 2018159817A1
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WO
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gprc5c
gene
protein
low
weight
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PCT/JP2018/008036
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English (en)
French (fr)
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喜朗 石丸
啓子 阿部
富子 朝倉
道大 谷下
創一 田辺
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Nissin Foods Holdings Co Ltd
Original Assignee
Nissin Foods Holdings Co Ltd
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention mainly relates to a screening method for a low-weight inducer, a low-weight inducer, and a low-weight model animal.
  • Non-Patent Document 1 discloses that the transcriptional regulatory factor Skn-1a is essential not only for sweet taste cells, bitter taste cells and umami cells, but also for determining the fate of small intestinal brush cells. It is also disclosed that although the amount of food intake is unchanged in Skn-1-deficient mice, energy consumption increases due to hypersecretion of catecholamine, so that it exhibits a markedly low body weight with a low body fat percentage. Based on the above, it has been proposed to control energy metabolism of peripheral tissues (liver, muscle, adipose tissue, etc.) via the brain, starting from brush cells and taste cells.
  • peripheral tissues liver, muscle, adipose tissue, etc.
  • An object of the present invention is to provide a novel method for screening a low-weight inducer, a low-weight inducer, and a low-weight model animal.
  • the present inventors conducted extensive studies to solve the above problems, and found that a non-human animal in which the GPRC5C gene was knocked out showed low weight.
  • the present invention has been completed by making further improvements based on these findings.
  • the present invention provides the following aspects of the invention.
  • a low-weight inducer comprising a compound capable of suppressing the functional expression of GPRC5C gene or GPRC5C protein.
  • Item 2 The low-weight-inducing agent according to Item 1, wherein the compound is a food-derived component.
  • a screening method for an active ingredient of a low-weight inducer comprising the following steps: (I) a step of determining whether the test substance is a compound capable of suppressing the functional expression of GPRC5C gene or GPRC5C protein; and (ii) a compound capable of suppressing the functional expression of GPRC5C gene or GPRC5C protein in step (i) A step of selecting a test substance determined to be as an active ingredient of a low-weight inducer.
  • Item 4 A low-weight animal model that is a non-human animal in which the GPRC5C gene is knocked out.
  • Item 5 The low-weight animal model according to Item 4, which is a mouse.
  • a novel method for screening for a low-weight inducer, a low-weight inducer, and a low-weight model animal are provided.
  • the low-weight inducer provided by the present invention can be expected to have effects such as not getting fat even when eaten in large quantities and suppressing visceral fat mass, and has high significance in the food industry and health science.
  • the low-weight animal model of the present invention is useful as a research and development tool, and can contribute to further development of the food industry and health science.
  • FIG. 2 shows a black and white reversal image of FIG.
  • GPRC5C gene GPRC5C protein GPRC5C gene is a known gene, and GPRC5C protein is a known protein.
  • the GPRC5C gene encodes the GPRC5C protein, which is one of the trimeric G protein coupled receptors with a 7-transmembrane motif.
  • the cDNA base sequence of GPRC5C gene and the amino acid sequence of GPRC5C protein of human (Homo sapiens) and mouse (Mus musculus) can be obtained from GenBank provided by the National Center for Biotechnology Information (NCBI) as follows: Registered with an accession number of (if multiple revisions are registered, it is understood to refer to the latest revision): Human GPRC5C gene: NM_018653, NM_022036 Human GPRC5C protein: NP_061123, NP_061123 Mouse GPRC5C gene: NM_001110337, NM_001110338, NM_147217 Mouse GPRC5C protein: NP_001103807.1, NP_001103808, NP_671750.
  • GenBank National Center for Biotechnology Information
  • vitamin As for example, retinoic acid
  • ligands of the GPRC5C gene are presumed as ligands of the GPRC5C gene, but are not limited thereto.
  • the low body weight inducer of the present invention contains a compound capable of suppressing the functional expression of the GPRC5C gene or GPRC5C protein.
  • Any compound that can suppress the functional expression of the GPRC5C gene or GPRC5C protein can be used as long as the functional expression of the GPRC5C gene or GPRC5C protein can be suppressed.
  • Examples of compounds that can suppress the functional expression of GPRC5C gene or GPRC5C protein include, but are not limited to, specific inhibitors for GPRC5C protein and nucleic acids that can suppress the expression of GPRC5C gene.
  • “suppressing the functional expression of GPRC5C gene or GPRC5C protein” refers to all aspects of suppressing the functional expression of GPRC5C gene or GPRC5C protein.
  • inhibiting the function of GPRC5C protein, suppressing the expression of GPRC5C protein are not limited thereto.
  • Examples of the mode of inhibiting the function of GPRC5C protein include a mode of inhibiting the binding between GPRC5C protein as a receptor and a ligand, but are not limited thereto.
  • the compound that inhibits the binding between the GPRC5C protein and the ligand is an antagonist of the GPRC5C protein and is one of the preferred embodiments of the present invention.
  • “can suppress the expression of GPRC5C gene” means that the expression level of GPRC5C protein is reduced, such as destruction of mRNA encoding GPRC5C protein transcribed from GPRC5C gene (RNA interference action) and suppression of translation into GPRC5C protein.
  • the present invention is not limited to this.
  • any known or specific inhibitor for any GPRC5C protein to be developed in the future can be used.
  • another embodiment of the specific inhibitor for the GPRC5C protein includes an antibody specific for the GPRC5C protein.
  • the antibody is preferably an antibody that specifically binds to the extracellular domain of GPRC5C protein, more preferably an antibody that can specifically bind to the extracellular domain of GPRC5C protein and inhibit the binding of GPRC5C protein to the ligand. Although there is, it is not limited to this.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibody When the antibody is a monoclonal antibody, it may be a chimeric antibody, a humanized antibody, a human antibody, or the like.
  • the above antibody can be prepared by a known technique. Or a commercially available thing can also be used.
  • the nucleic acid capable of suppressing the expression of the GPRC5C gene is preferably an RNA molecule having RNA interference (RNAi) action targeting mRNA encoding GPRC5C protein such as siRNA, shRNA, dsRNA, or mRNA encoding GPRC5C protein.
  • RNAi RNA interference
  • Examples include miRNA that can suppress translation.
  • it may be an RNA molecule having the above RNA interference (RNAi) action or a DNA molecule such as a vector capable of expressing the above miRNA.
  • the nucleic acid capable of suppressing the expression of the GPRC5C gene can be prepared by a known method based on the base sequence of the gene encoding the GPRC5C protein. Or a commercially available thing can also be used.
  • a compound capable of suppressing the functional expression of GPRC5C gene or GPRC5C protein can be obtained, for example, by the screening method described below.
  • the compounds capable of suppressing the functional expression of the GPRC5C protein can be used singly or in combination of two or more.
  • the low weight inducer of the present invention can be provided as, for example, a pharmaceutical composition or a food (food composition). It can also be provided as a food-derived component, such as a food metabolite or a chemical or physical degradation product (such as sugar, amino acid, peptide, lipid, or a complex thereof).
  • a food-derived component such as a food metabolite or a chemical or physical degradation product (such as sugar, amino acid, peptide, lipid, or a complex thereof).
  • the low-weight inducer of the present invention is taken orally in various forms such as tablets, pills, powders (powder), granules (fine granules), and capsules.
  • Various preparation forms can be prepared.
  • the low-weight inducer of the present invention includes a carrier, a solvent, a dispersant, an emulsifier, a buffer, a stabilizer, an excipient, and a binder in addition to a compound that can suppress the functional expression of the GPRC5C gene or GPRC5C protein as an active ingredient.
  • Base materials such as disintegrants and lubricants, excipients, additives, auxiliary materials, extenders and the like can be contained. Said component will not be limited if it does not impair the effect of this invention, and it is preferable that it is pharmaceutically acceptable.
  • the low-weight inducer of the present invention when provided as a food composition, it can be prepared in a form in which a compound capable of suppressing the functional expression of the GPRC5C gene or GPRC5C protein as an active ingredient is added to a food or drink.
  • the form of the food or drink is not particularly limited, but it is a seasoning mainly composed of seasonings such as soy sauce, miso, sauce, ketchup, animal and plant protein hydrolysates (HAP, HVP), yeast extract, amino acids, peptides, etc.
  • seasoned foods used for seasoning foods such as sauce, noodle soup, sauce, roux, dressing, processed cereals such as noodles, bread and snacks, processed meat products such as ham sausage and fish paste products, soup , Pickles, side dishes and the like.
  • instant food that can be cooked by adding hot water or water (eg powder and liquid instant noodle soup, instant consomme soup, potage soup, Chinese soup, miso soup, soup, soup type instant noodles) Etc.).
  • the content of the compound capable of suppressing the functional expression of the GPRC5C gene or GPRC5C protein, which is an active ingredient in the low-weight inducer is generally in the range of 0.01 to 100% by weight.
  • the daily dose of the compound capable of suppressing the functional expression of the GPRC5C gene or GPRC5C protein, which is an active ingredient in the low-weight inducer is about 0.1 mg to 30 g as a daily dose per adult (60 kg body weight). be able to.
  • the low-weight inducer of the present invention is ingested by subjects requiring weight reduction, such as obesity, metabolic syndrome, bulimia patients, and its reserve group, and thereby induces low weight to treat or improve symptoms.
  • the low weight inducer is a therapeutic agent for obesity.
  • the screening method of the present invention comprises the following steps: (I) a step of determining whether the test substance is a compound capable of suppressing the functional expression of GPRC5C gene or GPRC5C protein; and (ii) a compound capable of suppressing the functional expression of GPRC5C gene or GPRC5C protein in step (i) A step of selecting a test substance determined to be as an active ingredient of a low-weight inducer.
  • test substance to be screened is a compound that can suppress the functional expression of the GPRC5C gene or GPRC5C protein.
  • the test substance is not particularly limited as long as it is a compound that can be a candidate compound for an active ingredient of a low-weight inducer.
  • the test substance may be a natural compound (for example, a biological substance) or a synthetic compound.
  • the test substance is a food-derived compound.
  • Specific examples of the test substance include a low molecular weight compound, a protein such as an antibody, a nucleic acid capable of suppressing protein expression (eg, siRNA, shRNA, dsRNA, miRNA, etc.), a sugar chain or a complex carbohydrate. It is not limited to.
  • Means for determining whether or not a compound capable of suppressing the functional expression of the GPRC5C gene or GPRC5C protein includes a test substance to be determined, and a functional expression of the GPRC5C gene or GPRC5C protein that is determined to be suppressed. Accordingly, within the scope of achieving the object, those skilled in the art can appropriately select from all means known and developed in the future.
  • a method of searching for a known G protein-coupled receptor antagonist can be employed.
  • it can be carried out according to the methods described in the literature: THE JOURNAL OF OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 285, NO. 36, pp. 28373-28378, September 3, 2010.
  • a cell expresses a fusion protein of a trimeric G protein-coupled receptor (GPRC5C protein) and a trimeric G protein ⁇ subunit (G ⁇ , particularly Gq that stimulates phospholipase C).
  • G ⁇ trimeric G protein-coupled receptor
  • G ⁇ trimeric G protein ⁇ subunit
  • Examples of cells used at this time include HEK293T cells, but are not limited thereto.
  • the fusion protein is cultured in the presence of a calcium indicator, and then a ligand and a test substance are added, and a stimulus response indicated by the difference in fluorescence intensity of the fluorescently labeled calcium indicator before and after the addition is detected.
  • the molecular mechanism is a method of detecting an increase in the concentration of calcium ions released from the endoplasmic reticulum by IP 3 produced by activated phospholipase C.
  • a test substance for which no stimulus response is detected can be selected as an antagonist of GPRC5C protein. This method is so-called “calcium imaging”.
  • fluorescently labeled calcium indicators include, but are not limited to, Fura-2, Fluo-3, Fluo-4, Rhod-2, Indo-1.
  • the active ingredient of the low weight inducer is selected by the above step (ii).
  • Model animal The non-human animal used as a low-weight model animal in the present invention is a non-human animal in which the GPRC5C gene is knocked out.
  • the non-human animal may be any kind of animal as long as it is non-human and can be used as an experimental animal, preferably a rodent, and more preferably a mouse.
  • GPRC5C gene is knocked out means that the GPRC5C gene expression product is not expressed at all due to modification of the base sequence of the GPRC5C gene described above, or is normal even if expressed. It refers to a state in which the function of the product cannot be shown and the function of the GPRC5C gene is deficient.
  • the non-human animal used in the present invention is not particularly limited as to a specific mode in which the function of the GPRC5C gene is lost.
  • the non-human animal used in the present invention is not particularly limited as to a specific mode in which the function of the GPRC5C gene is lost.
  • at least a part of the GPRC5C gene is modified.
  • the GPRC5C gene promoter is inactivated.
  • “at least part of the GPRC5C gene is altered” means that at least part of the base sequence of the GPRC5C gene is altered to cause deletion, substitution or addition.
  • one or more mutations among deletion, substitution, and addition may be combined with the GPRC5C gene.
  • “deletion” of at least a part of the base sequence of the GPRC5C gene means that the GPRC5C gene expression product functions as a GPRC5C protein by deleting part or all of the GPRC5C gene. It means to modify so as not to.
  • “replacement” of at least a part of the base sequence of the GPRC5C gene means that a part or all of the GPRC5C gene is replaced with a separate sequence unrelated to the GPRC5C gene, whereby the expression product of the GPRC5C gene is changed. This refers to modifying the GPRC5C protein so that its function is not expressed.
  • “adding” to at least a part of the base sequence of the GPRC5C gene means that the GPRC5C gene expression product does not function as a GPRC5C protein by adding a sequence other than the GPRC5C gene to the GPRC5C gene. Is to be modified as follows.
  • the non-human animal to which the GPRC5C gene is knocked out used in the present invention may be a heterozygous knockout animal in which any one of the alleles (allyl) in the GPRC5C gene is knocked out. It may be a homozygous knockout animal in which both functions are knocked out.
  • the non-human animal used in the present invention may be either female or male.
  • a non-human animal in which the GPRC5C gene is knocked out can be produced by a known method.
  • methods include, but are not limited to, genome editing techniques such as the TALEN method and CRISPR / Cas9 method, and gene disruption techniques using homologous recombination methods.
  • the non-human animal in which the GPRC5C gene has been knocked out can be used as a low-weight model animal because it exhibits a low-weight phenotype as will be demonstrated in the examples described later.
  • ⁇ Food conditions for use as a low-weight model animal are not limited.
  • the diet conditions can be a normal diet, a high fat diet, a low fat diet, and the like.
  • ⁇ Low weight is not limited as long as the body weight is small compared to the wild type.
  • the body weight is about 1 to 20%, preferably about 5 to 15%, more preferably about 8 to 12% compared to the wild type.
  • the body weight is about 10 to 40%, preferably about 15 to 35%, more preferably about 20 to 30% compared to the wild type.
  • the low-weight animal model of the present invention can be used for research and development, for example, analysis of the effects of low weight on life, behavioral patterns, lifespan, etc., and development of a technique for increasing weight without impairing health.
  • mice those described in Matsumoto et al., 2011. Nature, Neuroscience, 14 (6), 685-687 were used.
  • Example 1 Production of Knockout Mice GPRC5C gene mutant mice were produced using the genome editing technology TALEN method.
  • GPRC5C gene mutant mice The creation of GPRC5C gene mutant mice was commissioned to the Special Immunology Research Institute. The resulting heterozygous mutant mice were self-bred, and the heterozygous was born by performing backcrossing twice or more with wild-type mice (C57BL / 61J strain; purchased from Japan Claire Co., Ltd.) The offspring of mutant mice were used.
  • GPRC5C protein As a result of producing a peptide antibody that recognizes the intracellular C-terminal region of GPRC5C protein and performing immunostaining using a small intestine section, GPRC5C protein was found at the apex of the cell in contact with the small intestinal lumen in wild type (WT) mice. It became clear that it was localized (the upper part of FIG. 2). On the other hand, it was confirmed that no signal was observed in GPRC5C gene mutation (KO) mice. In addition, antibodies against TRPM5 and DCLK1 known as brush cell markers (Bezencon, C. et al., 2008. Journal of Comparative Neurology, 509 (5), 514-525 .; Saqui-Salces, M et al., 2011. As a result of immunostaining using Histochemistry and Cell Biology, 136 (2), 191-204.), KO detected a signal in the same manner as WT, indicating that it holds brush cells. This became clear (middle and bottom in FIG. 2).
  • Example 2 Measurement of weight change and weight gain GPRC5C +/- Litter mice born by mating of (hetero) mice were wild-type (WT) mice, hetero mice, GPRC5C mutant mice (KO) 3 weeks old The body weight was measured from 1 to 16 weeks of age.
  • mice were grouped with 2 to 5 mice, and body weight was measured once a week at 3 to 16 weeks of age.
  • WT, hetero, and KO were 9.33 ⁇ 0.25 g, 9.10 ⁇ 0.20 g9.0, and 9.04 ⁇ 0.22 g at 3 weeks of age, respectively, and there was no difference. However, at the age of 16 weeks, they were 29.33 ⁇ 0.34 g, 28.53 ⁇ 0.37 g, and 27.29 ⁇ 0.40 g ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , respectively, and a significant difference was seen in the combination of WT and KO, and hetero and KO. A comparison of WT and KO was made below. KO also showed significantly lower body weight compared with WT at 10 to 15 weeks of age except for 13 weeks of age. There was no difference between the two groups at 3-5 weeks of age, but there was a difference between the two groups at 6-9 weeks of age.
  • WT, hetero, and KO were 8.41 ⁇ 0.29 g, 8.40 ⁇ 0.20 g8.1, and 8.10 ⁇ 0.25 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ g, respectively, and there was no difference.
  • they were 22.14 ⁇ 0.34 g, 22.39 ⁇ 0.37 g, and 21.44 ⁇ 0.41 g, respectively, and no significant difference was found in any combination of WT and KO, hetero and KO, and WT and hetero. Since WT and heterozygous body weights are similar, WT and KO were compared in females as well as males. KO mice tended to be lower in weight than those of wild-type mice at 5 to 16 weeks of age, and significant differences were seen at 6, 7, 10, and 11 weeks of age.
  • the 16-week-old body weight of Skn-1-deficient mice that lost brush cells was 21.40 ⁇ 0.36 g, and it was found that KO mice and Skn-1-deficient mice showed similar trends in females. .
  • KO mice remained at the same weight as Skn-1-deficient mice after 6 weeks of age. Moreover, it turned out that the tendency of a low body weight is shown compared with a wild type mouse
  • Nb Nippostrongylus brasiliensis
  • Nb was provided to Associate Professor Ishiwatari of the Department of Tropical Medicine, Jikei University School of Medicine. Nb is cultured while attached to activated carbon (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The activated carbon to which Nb was attached was floated in PBS at 37 ° C. to sink Nb. After about 20 minutes, the supernatant was discarded, the volume of the solution was reduced, and after stirring gently, the density was measured by microscopic observation. The liquid volume was calculated so that the Nb dose would be 250 or 500, and subcutaneous injection was performed on the back of the neck of the mouse under anesthesia by isoflurane suction. The mice used were 10-20 weeks of age.
  • the total number of Nb parasitized in the intestine of the mouse can be calculated as b ⁇ 1000a / 60.
  • Nb 250 mice were administered to the mice, and after 9 days, the abdomen was opened and the number of Nb remaining in the intestine was counted (Fig. 3.10 A).
  • 134 ⁇ 5 mice and a large number of Nb were detected from Skn-1-deficient mice, whereas 1.7 ⁇ 1.7 mice and 0 mice were detected from WT and KO, respectively. That is, it was shown that KO mice have an immune mechanism starting from brush cells and have an immune function comparable to that of WT mice until 9 days later.
  • the GPRC5C protein receptor is not essential for the mechanism of brush cell proliferation after Nb infection.

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Abstract

本発明は、GPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制できる化合物を含む、低体重誘導剤を提供する。

Description

低体重誘導剤のスクリーニング方法、低体重誘導剤、及び低体重モデル動物
　本発明は、主に低体重誘導剤のスクリーニング方法、低体重誘導剤、及び低体重モデル動物に関する。
　小腸上皮細胞の約0.4%を占める刷子細胞は、60年以上前からその存在が知られていたが、その分化制御機構及び細胞機能は長い間不明であった。非特許文献１は、転写調節因子Skn-1aが、味蕾の甘味細胞、苦味細胞、うま味細胞だけでなく、小腸刷子細胞への運命決定にも必須であることを開示している。また、Skn-1欠損マウスでは摂餌量は不変であるが、カテコールアミンの過分泌によって消費エネルギーが増加するために、低体脂肪率を伴う顕著な低体重を示すことも開示されている。以上より、刷子細胞や味細胞を起点とし、脳を介して末梢組織（肝臓、筋肉、脂肪組織など）のエネルギー代謝を制御することが提唱された。
　しかし、刷子細胞の細胞機能はまだ明らかでない点が多く、更なる解析が必要である。
Ushiama S, et al. EBioMedicine, Volume 8, 60 -71 (2016)
　本発明は、新規な低体重誘導剤のスクリーニング方法、低体重誘導剤、及び低体重モデル動物を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、GPRC5C遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物は、低体重を示すことを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。
　即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
　項１、GPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制できる化合物を含む、低体重誘導剤。
　項２、前記化合物が食品由来の成分である項１に記載の低体重誘導剤。
　項３、低体重誘導剤の有効成分のスクリーニング方法であって、下記の工程を含むスクリーニング方法：
（ｉ）被験物質が、GPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制できる化合物であるか否かを判定する工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）においてGPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制できる化合物であると判定された被験物質を、低体重誘導剤の有効成分として選択する工程。
　項４、GPRC5C遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物である、低体重モデル動物。
　項５、マウスである、項４に記載の低体重モデル動物。
　本発明により、新規な低体重誘導剤のスクリーニング方法、低体重誘導剤、及び低体重モデル動物が提供される。
　本発明により提供される低体重誘導剤は、たくさん食べても太らない、内臓脂肪量を抑えるなどの効果が期待でき、食品産業及び健康科学における意義が高い。また、本発明の低体重モデル動物は、研究開発のツールとして有用であり、食品産業及び健康科学のさらなる発展に貢献することができる。
GPRC5C遺伝子変異マウスのゲノム配列の解析。 小腸におけるWT、KOの組織学的解析。矢印の先端にシグナルを示す。左の列は野生型（WT）、右の列はGPRC5C変異マウス（KO）を示す。WTはGPRC5Cタンパク質受容体が小腸内腔と接した細胞頂端部に局在している。一方でKOはGPRC5Cタンパク質受容体が消失している（上段）。WT、KOとも刷子細胞マーカーであるTRPM5とDCLK1でシグナルが見られた。いずれも刷子細胞を有していることが認められた（中段、下段）。スケールバーは 100 μm を示す。 図２－１の白黒反転像を示す。 遺伝子型ごとの体重の変化の測定結果を示す。（Ａ）オスマウスの体重変化、（Ｂ）メスマウスの体重変化。数値は平均±標準誤差で示す。オス WT, オス Hetero, オス KO の順で n≧19, n≧13, n=13；メスWT, メス Hetero, メス KO の順で n≧20, n≧13, n≧20；オス、メスいずれもWTとKOで統計解析を行った。*はp < 0.05, **はp < 0.01 を示す。 寄生虫感染実験の結果を示す。Nb感染9日後において腸内から検出されたNbの匹数(Worm burden)を示す。Skn-1欠損マウスとは異なり、WT、KOではNbはほとんど検出されなかった。数値は平均±標準誤差で示す。各群n=3, **はp<0.01を示す。
　GPRC5C遺伝子、GPRC5Cタンパク質
　GPRC5C遺伝子は、公知の遺伝子であり、GPRC5Cタンパク質は公知のタンパク質である。GPRC5C遺伝子は、7回膜貫通モチーフを有する三量体Gタンパク質共役受容体の１つであるGPRC5Cタンパク質をコードする。
　例えば、ヒト（Homo sapiens）及びマウス（Mus musculus）のGPRC5C遺伝子のcDNAの塩基配列及びGPRC5Cタンパク質のアミノ酸配列は、米国生物工学情報センター（NCBI; National Center for Biotechnology Information）が提供するGenBankに、下記のアクセッション番号で登録されている（複数のリビジョン（revision）が登録されている場合、最新のリビジョンを指すと理解される。）：
　ヒトGPRC5C遺伝子：NM_018653、NM_022036
　ヒトGPRC5Cタンパク質：NP_061123、NP_061123
　マウスGPRC5C遺伝子：NM_001110337、NM_001110338、NM_147217
　マウスGPRC5Cタンパク質：NP_001103807.1、NP_001103808、NP_671750。
　なお、GPRC5C遺伝子のリガンドとしてはビタミンＡ類（例えば、レチノイン酸）が推定されるが、これに限定されない。
　低体重誘導剤
　本発明の低体重誘導剤は、GPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制できる化合物を含む。
　GPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制できる化合物は、GPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制できる範囲内において、あらゆる化合物を用いることができる。GPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制できる化合物として、GPRC5Cタンパク質に対する特異的な阻害剤およびGPRC5C遺伝子の発現を抑制できる核酸などが例示されるが、これに限定されるものではない。
　ここで、「GPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制」とは、GPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制するあらゆる態様を指し、例えばGPRC5Cタンパク質の機能を阻害すること、GPRC5Cタンパク質の発現を抑制すること（GPRC5C遺伝子の転写の抑制、GPRC5Cタンパク質の翻訳の抑制など）などが例示されるが、これに限定されるものではない。GPRC5Cタンパク質の機能を阻害する態様としては、受容体であるGPRC5Cタンパク質とリガンドとの結合を阻害する態様などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
　GPRC5Cタンパク質とリガンドとの結合を阻害する化合物は、GPRC5Cタンパク質のアンタゴニストであり、本発明の好ましい態様の１つである。
　また、「GPRC5C遺伝子の発現を抑制できる」とは、GPRC5C遺伝子から転写されるGPRC5Cタンパク質をコードするｍＲＮＡの破壊（ＲＮＡ干渉作用）、GPRC5Cタンパク質ヘの翻訳の抑制などのGPRC5Cタンパク質の発現量が低減される態様が例示されるが、これに限定されるものではない。
　上記GPRC5Cタンパク質に対する特異的な阻害剤としては、公知のおよび今後開発されるあらゆるGPRC5Cタンパク質に対する特異的な阻害剤を用いることができる。
　また、上記GPRC5Cタンパク質に対する特異的な阻害剤の別の態様として、GPRC5Cタンパク質に対する特異的な抗体が挙げられる。該抗体は、好ましくはGPRC5Cタンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合するもの、さらに好ましくはGPRC5Cタンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合して、GPRC5Cタンパク質とリガンドとの結合を阻害するできる抗体であるが、これに限定されるものではない。
　上記抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよい。上記抗体がモノクローナル抗体である場合、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などであってもよい。上記抗体は、公知の手法により作成することができる。あるいは、市販のものを用いることもできる。
　上記GPRC5C遺伝子の発現を抑制できる核酸は、好適にはsiRNA、shRNA、dsRNAなどのGPRC5Cタンパク質をコードするｍＲＮＡを標的としたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）作用を有するＲＮＡ分子や、GPRC5Cタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制することができるmiRNAが挙げられる。あるいは、上記のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）作用を有するＲＮＡ分子または上記のmiRNAを発現できるベクター等のＤＮＡ分子であってもよい。上記GPRC5C遺伝子の発現を抑制できる核酸は、GPRC5Cタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて、公知の手法より作成することができる。あるいは、市販のものを用いることもできる。
　GPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制できる化合物は、例えば後述のスクリーニング方法により取得することができる。
　上記GPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制できる化合物は、１種単独でまたは２種以上を組み合わせて用いることができる。
　本発明の低体重誘導剤は、例えば医薬組成物、食品（食品組成物）として提供されることができる。また、食品由来成分、例えば、食品の代謝物又は化学的若しくは物理的分解物（糖、アミノ酸、ペプチド、脂質等又はこれらの複合体等）として提供されることも可能である。
　本発明の低体重誘導剤は、例えば医薬組成物として提供される場合は、錠剤、丸剤、散剤（粉末剤）、顆粒剤（細粒剤）、及びカプセル剤などの各種の経口摂取される種々の製剤形態に調製することができる。
　本発明の低体重誘導剤は、有効成分であるGPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制できる化合物に加えて、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等基材、賦形剤、添加剤、副素材、増量剤等を含有することができる。上記の成分は、本発明の効果を損なわないものであれば限定されず、薬学的に許容されるものであることが好ましい。
　本発明の低体重誘導剤が食品組成物として提供される場合、有効成分であるGPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制できる化合物を飲食品に添加した形態に調製することができる。飲食品の形態は特に限定されるものではないが、醤油、味噌、ソース、ケチャップ等の調味料、動植物タンパク加水分解物（ＨＡＰ，ＨＶＰ）、酵母エキス、アミノ酸、ペプチド等を主成分とする調味料、ダシのもとや麺つゆ、タレ、ルー、ドレッシング等の食品の味付けに用いる調味食品、麺類やパン、スナック菓子等の穀類加工品、ハムソーセージ、魚肉練製品等の蓄肉魚肉加工品、スープ、漬物、惣菜類等が挙げられる。また、飲食品には、熱湯や水を加えることで調理可能な即席食品（例えば、粉末および液体即席めん用スープ、即席のコンソメスープ、ポタージュスープ、中華スープ、味噌汁、吸い物、汁物タイプの即席麺など）が含まれる。
　さらに、当該食品組成物の生体内における代謝の過程で生じる物質（糖、アミノ酸、ペプチド、脂質等）として提供されることも可能である。
　低体重誘導剤における有効成分であるGPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制できる化合物の含有量は、一般に、０．０１～１００重量％の範囲である。低体重誘導剤における有効成分であるGPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制できる化合物の１日あたりの投与量は、大人一人（６０ｋｇ体重）当たり一日量として、０．１ｍｇ～３０ｇ程度とすることができる。
　本発明の低体重誘導剤は、肥満症、メタボリック症候群、過食症の患者及びその予備群などの体重低減を必要とする対象が摂取することで、低体重が誘導され症状が治療又は改善される。本発明の好ましい態様において、低体重誘導剤は肥満症の治療薬である。
　スクリーニング方法
　本発明のスクリーニング方法は、下記の工程を含む、：
（ｉ）被験物質が、GPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制できる化合物であるか否かを判定する工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）においてGPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制できる化合物であると判定された被験物質を、低体重誘導剤の有効成分として選択する工程。
　上記工程（ｉ）により、スクリーニング対象の被験物質が、GPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制できる化合物であるか否かが判定される。
　上記被験物質は、低体重誘導剤の有効成分の候補化合物となり得る化合物であれば、特に限定されるものではない。上記被験物質は、天然化合物（例えば、生体由来物質）または合成化合物のいずれであってもよい。好ましくは、上記被験物質は、食品由来の化合物である。上記被験物質の具体例として、低分子化合物、抗体などのタンパク質、タンパク質の発現を抑制できる核酸（例えば、siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA等）、糖鎖もしくは複合糖質などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
　上記GPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制できる化合物であるか否かを判定するための手段は、判定の対象とする被験物質、および、抑制が判定されGPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現などに応じて、目的が達成される範囲内において、当業者が公知のおよび将来開発されるあらゆる手段の中から、適宜選択することができる。
　例えば、GPRC5Cタンパク質のアンタゴニストは、公知のGタンパク質共役受容体のアンタゴニストを探索する方法を採用することができる。一例としては、文献：THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 285, NO. 36, pp. 28373-28378, September 3, 2010に記載の方法に準じて行うことができる。
　具体的には、細胞に三量体Gタンパク質共役受容体（GPRC5Cタンパク質）と三量体Gタンパク質のαサブユニット（Gα、特にホスホリパーゼＣを刺激するGq)との融合タンパク質を細胞に発現させる。この際に使用する細胞としては、例えばHEK293T細胞が例示されるが、これに限定されない。上記融合タンパク質をカルシウム指示薬の存在下で培養し、その後リガンド及び被験物質を添加し、添加の前後での蛍光標識カルシウム指示薬の蛍光強度の差により示される刺激応答を検出する。分子機構としては、活性化されたホスホリパーゼＣが生成するIP3が小胞体から遊離させるカルシウムイオンの濃度上昇を検出する方法である。刺激応答が検出されない被験物質は、GPRC5Cタンパク質のアンタゴニストとして選定することができる。当該方法は、いわゆる「カルシウムイメージング」である。
　蛍光標識カルシウム指示薬としては、Fura-2、Fluo-3、Fluo-4、Rhod-2、Indo-1などが例示されるがこれに限定されない。
　その他、三量体Gタンパク質のαサブユニットとしてアデニル酸シクラーゼを活性化するGsを用いて、ルシフェラーゼアッセイなどによりcAMP合成の活性化を検出する方法、Biacoreシステムにより直接アンタゴニストを探索する方法なども挙げられる。
　次いで、上記工程（ｉｉ）により、低体重誘導剤の有効成分が選択される。
　モデル動物
　本発明において低体重のモデル動物として使用される非ヒト動物は、GPRC5C遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物である。
　上記非ヒト動物は、非ヒトであって実験動物として使用できるものであれば、如何なる種の動物でもよいが、好ましくは齧歯目動物、更に好ましくはマウスである。
　本明細書において、「GPRC5C遺伝子がノックアウトされた」とは、上記に記載したGPRC5C遺伝子の塩基配列の改変等により、GPRC5C遺伝子の発現産物が全く発現しないか、または発現しても正常なGPRC5C遺伝子産物が有する機能を示すことができず、GPRC5C遺伝子の機能が欠損している状態を指す。
　本発明で使用される非ヒト動物は、GPRC5C遺伝子がノックアウトされたものである限り、GPRC5C遺伝子の機能を欠損させる具体的態様については、特に制限されないが、例えば、GPRC5C遺伝子の少なくとも一部が改変されている、或いはGPRC5C遺伝子のプロモーターが不活性化されている等の態様が含まれる。
　本明細書において、「GPRC5C遺伝子の少なくとも一部が改変」とはGPRC5C遺伝子の塩基配列の少なくとも一部に、欠失、置換又は付加を生じさせる改変を加えることをいう。GPRC5C遺伝子をノックアウトさせるためには、GPRC5C遺伝子に対して欠失、置換及び付加の内、１又は２以上の変異を組み合わせてもよい。
　また、本明細書においてGPRC5C遺伝子の塩基配列の少なくとも一部を「欠失」させるとは、GPRC5C遺伝子の一部または全部を欠失させることにより、GPRC5C遺伝子の発現産物がGPRC5Cタンパク質として機能が発現しないように改変することをいう。本明細書においてGPRC5C遺伝子の塩基配列の少なくとも一部を「置換」するとは、GPRC5C遺伝子の一部又は全部をGPRC5C遺伝子とは関係のない別個の配列に置換することにより、GPRC5C遺伝子の発現産物がGPRC5Cタンパク質として機能が発現しないように改変することをいう。さらに、本明細書においてGPRC5C遺伝子の塩基配列の少なくとも一部に「付加」するとは、GPRC5C遺伝子中にGPRC5C遺伝子以外の配列を付加することにより、GPRC5C遺伝子の発現産物がGPRC5Cタンパク質として機能が発現しないように改変することをいう。
　本発明で使用されるGPRC5C遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物は、GPRC5C遺伝子における対立遺伝子（アリル）のいずれか一方がノックアウトされているヘテロ接合体のノックアウト動物であってもよく、また対立遺伝子の双方の機能がノックアウトされているホモ接合体のノックアウト動物であってもよい。
　本発明で使用される非ヒト動物は、雌又は雄のいずれであってもよい。
　GPRC5C遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物は、公知の手法により作製することができる。このような手法として、TALEN法、CRISPR/Cas9法などのゲノム編集技術、並びに、相同組み換え法による遺伝子破壊技術が挙げられるが、これに限定されない。
　GPRC5C遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物は、後述の実施例で実証するように低体重の表現型を示すため、低体重モデル動物として使用することができる。
　低体重モデル動物として使用する場合の食餌条件は限定されない。例えば、食餌条件は通常食、高脂肪食、低脂肪食等とすることができる。
　低体重は、野生型に比して体重が少なければ限定されるものではない。例えば通常食を与えた場合、野生型に比して１～２０％程度、好ましくは５～１５％程度、より好ましくは８～１２％程度の低体重である。また、高脂肪食を与えた場合、野生型に比して１０～４０％程度、好ましくは１５～３５％程度、より好ましくは２０～３０％程度の低体重である。
　本発明の低体重モデル動物は、例えば低体重が生活、行動パターン、寿命などに与える影響の解析、健康を損なわずに体重を増加させる技術の開発などの研究開発に使用することができる。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を限定するものではない。
　なお、Skn-1欠損マウスは、Matsumoto et al., 2011. Nature Neuroscience, 14(6), 685-687に記載のものを用いた。
　実施例１　ノックアウトマウスの作製
　ゲノム編集技術TALEN法を用いてGPRC5C遺伝子変異マウスを作出した。
　GPRC5C遺伝子変異マウスの作出は株式会社特殊免疫研究所に依頼した。得られたキメラ変異マウスを自家繁殖させ、解析にはキメラ変異マウスから数えて野生型マウス(C57BL/61J系統; 日本クレア株式会社より購入)との戻し交配が2回以上行われて誕生したヘテロ変異マウス同士の産子を用いた。
　TALEN法を用いた結果、開始コドンを含むエキソン2にフレームシフト変異を生じるファウンダーマウスを2匹得た。ファウンダーマウスを野生型マウスと交配して継代を続けた結果、TALEN法で得られたファウンダーマウスから2塩基欠損のホモ変異マウスが誕生し、GPRC5C遺伝子変異マウスを１系統獲得することに成功した。
　また、CRISPR/Cas9システムによってもGPRC5C遺伝子変異マウスを11塩基欠損及び2塩基挿入の２系統獲得することに成功した。
　得られた2塩基欠損ヘテロマウス同士を交配した結果、一定期間に誕生した12腹分の産仔の遺伝子型は野生型、ヘテロ変異、ホモ変異の匹数がそれぞれ25匹、37匹、22匹となり、メンデルの法則に近い割合で産仔が生まれることがわかった。以下の解析には、2塩基欠損マウスを用いた。
　ゲノム情報によると、2塩基欠損マウスは18番目のアミノ酸からフレームシフトが生じ、GPRC5Cタンパク質受容体を正しくコードするDNA配列を持たないことが示された（図１）。
　GPRC5Cタンパク質の細胞内C末端領域を認識するペプチド抗体を作製して、小腸切片を用いた免疫染色を行った結果、野生型（WT）マウスではGPRC5Cタンパク質が小腸内腔と接する細胞の頂端部に局在することが明らかとなった（図２上段)。一方、GPRC5C遺伝子変異（KO）マウスではシグナルが観察されないことが確認された。また、刷子細胞マーカーとして知られるTRPM5及びDCLK1のそれぞれに対する抗体（Bezencon, C. et al., 2008. Journal of Comparative Neurology, 509(5), 514-525.; Saqui-Salces, M et al.,2011. Histochemistry and Cell Biology, 136(2), 191-204.）を用いた免疫染色を行った結果、KOはWTと同様にシグナルが検出されたことから、刷子細胞を保持していることが明らかとなった（図２中段、下段）。
　実施例２　体重変化と体重増加量の測定
　GPRC5C+/-（ヘテロ）マウス同士の交配で生まれた同腹仔マウスについて、野生型（WT）マウス、ヘテロマウス、GPRC5C変異マウス（KO）を3週齢から16週齢までの間、体重測定を行った。
　マウスは2匹～5匹で群飼いにし、3週齢～16週齢において1週間に1回体重測定を行った。
　結果を図３に示す。
　オスは、3週齢時はWT、ヘテロ、KOがそれぞれ9.33±0.25 g 、9.10±0.20 g 、9.04±0.22 g となっており差は見られなかった。しかし、16週齢時にはそれぞれ29.33±0.34 g 、28.53±0.37 g 、 27.29±0.40 g となっており、WTとKO、ヘテロとKOの組み合わせにおいて有意な差が見られた。以下WTとKOの比較を行った。13週齢を除く10週齢～15週齢においても、KOはWTと比較して有意に低体重を示した。また、3～5週齢は二群間に差は見られないが、6～9週齢においては二群間に差がある傾向が見られた。
　なお、刷子細胞を消失したSkn-1欠損マウスの16週齢における体重は27.37±0.45 g となっていたため、成長後においてKOとSkn-1欠損マウスはほぼ同じ体重を示すことが分かった。
　一方メスは、3週齢時はWT、ヘテロ、KOがそれぞれ8.41±0.29 g 、8.40±0.20 g 、8.10±0.25 g となっており差は見られなかった。16週齢時にはそれぞれ22.14±0.34 g 、22.39±0.37 g 、 21.44±0.41 g となっており、WTとKO、ヘテロとKO、WTとヘテロのいずれの組み合わせにおいて有意な差は見られなかった。WTとヘテロは同様の体重を示すことから、オスと同様にメスでもWTとKOを比較した。5週齢～16週齢においてKOマウスが野生型マウスと比較して低体重となる傾向を示し、6、7、10、11週齢において有意差が見られた。
　なお、刷子細胞を消失したSkn-1欠損マウスの16週齢における体重は21.40±0.36 g となっており、メスにおいてもKOマウスとSkn-1欠損マウスは良く似た傾向を示すことが分かった。
　以上のように、KOマウスは6週齢以降においてSkn-1欠損マウスと同様の体重で推移した。また、雌雄関わらず野生型マウスと比較して低体重の傾向を示すことが分かった。
　実施例３　寄生虫感染実験
　感染用の寄生虫にはNippostrongylus brasiliensis (Nb)を用いた。Nbは東京慈恵医科大学熱帯医学講座の石渡准教授に提供して頂いた。Nbは活性炭素(和光純薬株式会社)に付着させて培養している。Nbが付着した活性炭素を37℃のPBSに浮かせ、Nbを沈ませた。約20分後、上清を捨てて液量をボリュームダウンし、軽く撹拌した後顕微鏡観察で密度測定を行った。Nb投与量が250匹あるいは500匹となるように液量を計算し、イソフルラン吸引による麻酔下のマウス頸背部に皮下注射した。使用したマウスは10～20週齢であった。
　（線虫残存量測定）マウスを頸椎脱臼の後開腹し、十二指腸～大腸を摘出した。ハサミで管を開き、37℃のPBSに浮かせた。ヘモグロビンを吸収して赤く変色したNbは投与前よりも重くなっており、早く底へ沈む特性がある。15分間PBSに浸した後、Nbを含まない上清を捨てて、溶液量を3ml程度にボリュームダウンした(a mlとする)。Nbが沈んだPBS溶液を軽く撹拌してNbが均一に分布するようにした後、ピペットマンで素早く20μlを抽出し、スライドガラス上に滴下して顕微鏡で匹数を計測した。この計測を3回行い、計60μlに含まれるNbの合計匹数を計測した(b匹とする)。マウスの腸内に寄生していたNbの全匹数は b×1000a/60で算出できる。
　結果を図４に示す。
　Nb 250匹をマウスに投与し、9日後に開腹して腸内に残存するNbの匹数を計測した(図3.10 A)。既報の通りSkn-1欠損マウスからは134±5匹と、多数のNbが検出されたのに対して、WTとKOからそれぞれ1.7±1.7 匹、0匹が検出された。すなわち、KOマウスは刷子細胞を起点とした免疫機構を保持しており、9日後まではWTマウスと同程度の免疫機能を有することが示された。つまり、Nb感染後の刷子細胞増殖機構にGPRC5Cタンパク質受容体は必須ではないことが示唆された。 

Claims (5)

  1. 　GPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制できる化合物を含む、低体重誘導剤。
  2. 　前記化合物が食品由来の成分である請求項１に記載の低体重誘導剤。
  3. 　低体重誘導剤の有効成分のスクリーニング方法であって、下記の工程を含むスクリーニング方法：
    （ｉ）被験物質が、GPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制できる化合物であるか否かを判定する工程、および
    （ｉｉ）工程（ｉ）においてGPRC5C遺伝子又はGPRC5Cタンパク質の機能発現を抑制できる化合物であると判定された被験物質を、低体重誘導剤の有効成分として選択する工程。
  4. 　GPRC5C遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物である、低体重モデル動物。
  5. 　マウスである、請求項４に記載の低体重モデル動物。 
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114807358A (zh) * 2022-05-30 2022-07-29 北京体育大学 一种与肌腱损伤相关的生物标志物

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007119623A1 (ja) * 2006-03-31 2007-10-25 Riken Ｇ蛋白質共役型受容体およびそのリガンドの新規用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007119623A1 (ja) * 2006-03-31 2007-10-25 Riken Ｇ蛋白質共役型受容体およびそのリガンドの新規用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RAJKUMAR, P. ET AL.: "A Novel GPRC in the Renal Proximal Tubules, Gprc5c, Is Involved in Systemic pH Regulation", FASEB J, vol. 30, no. 1 suppl., 1 April 2016 (2016-04-01), XP055543577, ISSN: 1530-6860 *
SANO, T. ET AL.: "Comparative characterization of GPRC5B and GPRC5C Lacz knock in mice; behavioral abnormalities in GPRC5B-deficient mice", BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN, vol. 412, no. 3, 5 August 2011 (2011-08-05), pages 460 - 5, XP028281758, ISSN: 0006-291X, Retrieved from the Internet <URL:doi:10.1016/j.bbrc.2011.07.118> *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114807358A (zh) * 2022-05-30 2022-07-29 北京体育大学 一种与肌腱损伤相关的生物标志物
CN114807358B (zh) * 2022-05-30 2023-02-28 北京体育大学 一种与肌腱损伤相关的生物标志物

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