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CN109069636A - 用于调节体重的组合物和方法 - Google Patents

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CN109069636A
CN109069636A CN201780025052.6A CN201780025052A CN109069636A CN 109069636 A CN109069636 A CN 109069636A CN 201780025052 A CN201780025052 A CN 201780025052A CN 109069636 A CN109069636 A CN 109069636A
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leu
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CN201780025052.6A
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许哲源
陈宇
苏珊妮·克里斯汀·克劳利
田晖
沈文彦
唐杰
杰瑞德·马丁·希格比
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NGM Biopharmaceuticals Inc
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Abstract

本公开内容提供在体重调节中起作用的蛋白质复合物，包括蛋白质复合物的三维结构。另外，蛋白质复合物及其组分，包括其三维结构，应用于鉴定可用来控制体重的药剂。

Description

用于调节体重的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月4日提交的美国临时申请号62/304,141的优先权的权益，其完整内容通过引用并入本文。
引言
体重减轻与许多疾病和病症有关。例如，非刻意体重减轻与某些消耗病(例如恶病质)有关和/或可能与全身性炎症或急性炎症反应有关。恶病质，通常以体重减轻、肌肉萎缩、疲劳、衰弱和严重食欲不振为特征，可大大提高患有某些慢性疾病(例如癌症、慢性肾病、慢性阻塞性肺病、AIDS、结核病、慢性炎性疾病、脓毒症和全身性炎症的其它形式、例如肌肉萎缩等肌肉消耗和称为神经性厌食症的进食障碍)的患者的发病率。例如，在晚期癌症中，恶病质是普遍的(发生于最末期癌症患者中)，全部癌症相关死亡的大约四分之一由其造成。代谢过程(例如对肌肉起直接作用的代谢过程，减少其质量和/或形成)和食物摄入减少(例如导致脂肪和/或肌肉丢失的食物摄入减少)会促使恶病质的发生和/或发展。恶病质可通过名为前恶病质、恶病质和难治性恶病质的阶段发展。
体重调节是一个复杂的多因素过程，可以调节体重和控制非刻意体重减轻的药剂，包括例如可以调节体重和控制非刻意体重减轻的药剂，以及鉴定这类药剂的方法都十分引人关注。
发明概述
本公开内容提供在体重调节中起作用的蛋白质复合物。本公开内容的蛋白质复合物的成分可用于调节体重。另外，蛋白质复合物及其成分应用于鉴定可用来控制体重的药剂。本文还提供用于治疗和/或预防非刻意体重减轻的方法。另外，还公开了用于降低GDF15水升高或有发生GDF15水平升高的风险的对象的GDF15活性的方法。
在某些实施方案中，提供包括GDNF家族受体α样(GFRAL)蛋白和GDF15蛋白的分离的复合物。GFRAL蛋白可存在于经遗传修饰表达GFRAL的细胞的表面。在某些实施方案中，GFRAL蛋白从经遗传修饰表达GFRAL的细胞中纯化。GFRAL蛋白可固定在支持物上。在某些实施方案中，分离的复合物还可包括RET蛋白。
在某些实施方案中，GDF15、GFRAL和RET蛋白的至少一种可与异源蛋白质融合。与GDF15、GFRAL和RET蛋白融合的异源蛋白质可独立选自Ig Fc、白蛋白和麦芽糖结合蛋白。在某些实施方案中，与GDF15、GFRAL和RET蛋白的至少一种融合的白蛋白可以是人血清白蛋白。
在某些实施方案中，GDF15蛋白质和GFRAL蛋白的至少一种可被可检测地标记。
在某些实施方案中，复合物是晶体。在某些方面，晶体具有本文所述的原子坐标。晶体可具有的晶胞尺寸，和/或具有约的分辨率。
本文还提供包括分离的GDF15蛋白的组合物和经遗传修饰表达GFRAL蛋白的重组细胞。在某些实施方案中，重组细胞可经遗传修饰表达RET。
在某些实施方案中，重组细胞可包括报道分子构建体(reporter construct)。报道分子构建体可包括与编码报道分子的核酸序列有效连接的启动子序列，其中启动子通过GDF15蛋白与GFRAL结合在RET激活时指导报道分子的表达。
还公开了鉴定与GFRAL蛋白的胞外域结合的药剂的方法。所述方法可包括测定候选药剂与GFRAL的胞外域结合，其中结合GFRAL蛋白的候选药剂被鉴定为结合GFRAL蛋白的药剂，其中将候选药剂的结合与GDF15蛋白与GFRAL蛋白的胞外域的结合进行比较。在某些实施方案中，候选药剂以类似于GDF15蛋白的亲和力与GFRAL蛋白的胞外域结合。在另一个实施方案中，所述方法可包括构建具有由本文所述原子坐标界定的GDF15蛋白的复合物的三维结构；利用三维结构和建模方法鉴定与GFRAL蛋白结合的候选药剂；测定与GFRAL蛋白的胞外域结合的候选药剂；并将候选药剂的结合与GDF15蛋白与GFRAL蛋白的胞外域的结合进行比较，其中当候选药剂以类似于GDF15蛋白的亲和力结合时，候选药剂被鉴定为与GFRAL蛋白的胞外域结合的药剂。在某些情况下，GDF15可被可检测地标记。
在示例性方法中，GFRAL可固定在支持物上或由经遗传修饰表达GFRAL的重组细胞表达。在某些情况下，重组细胞可经遗传修饰表达RET。
在另一个实施方案中，重组细胞可包括包含与编码报道分子的核酸序列有效连接的启动子序列的报道分子构建体，其中启动子在RET激活时指导报道分子表达，且其中所述方法可包括测定报道分子的表达，其中与阴性对照相比报道分子的表达增加鉴定该药剂为与GFRAL结合并激活RET的药剂。
在又一个另外的实施方案中，GFRAL蛋白的胞外域包含与在GFRAL蛋白和GDF15蛋白之间的界面缔合(associated with)的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基。在该实施方案中，GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基可与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQID NO:9的GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197和GLN200。此外或备选，GFRAL蛋白的胞外域包含与在GFRAL蛋白和RET蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基。在该实施方案中，GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基可与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、GLN298和SER299。
公开了经遗传修饰表达GFRAL蛋白和RET蛋白的重组细胞。在某些实例中，GFRAL蛋白或RET蛋白的至少一种可与异源蛋白质融合。在一些实例中，GFRAL可与异源蛋白质融合。在其它情况下，RET可与异源蛋白质融合。在一些情况下，GFRAL和RET两者可与异源蛋白质融合，所述异源蛋白质可独立选自Ig Fc、白蛋白和麦芽糖结合蛋白。在一些实施方案中，GFRAL蛋白或RET蛋白的至少一种可被可检测地标记。
还提供鉴定调节GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合的药剂的方法，所述方法可包括使候选药剂与经遗传修饰表达GFRAL的重组细胞接触，其中所述接触在GDF15存在下；测定GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合的水平，其中与在候选药剂不存在时GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合的水平相比在候选药剂存在时GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合的水平的变化，将候选药剂鉴定为调节GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合的药剂。在另一个实施方案中，所述方法包括构建具有由本文所述原子坐标界定的GDF15蛋白的复合物的三维结构；利用三维结构和建模方法鉴定调节GDF15蛋白与GFRAL蛋白的结合的候选药剂；使候选药剂与经遗传修饰表达GFRAL蛋白的重组细胞接触，其中所述接触在GDF15蛋白存在下；测定GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合的水平，其中与在候选药剂不存在时GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合的水平相比在候选药剂存在时GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合的水平的变化，将候选药剂鉴定为调节GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合的药剂。在某些情况下，重组细胞可经遗传修饰表达RET。
在某些实施方案中，重组细胞可包括包含与编码报道分子的核酸序列有效连接的启动子序列的报道分子构建体，其中启动子在RET激活时指导报道分子表达，其中所述测定包括测定报道分子的表达，其中与药剂不存在时的表达相比报道基因表达的变化鉴定药剂为调节GDF15与GFRAL结合的药剂。
在某些实施方案中，药剂可抑制GDF15与GFRAL结合且药剂被鉴定为GDF15-GFRAL结合的拮抗剂。在其它实施方案中，当药剂提高GDF15与GFRAL的结合时，药剂被鉴定为GDF15-GFRAL结合的激动剂。
在又一个另外的实施方案中，由重组细胞表达的GFRAL蛋白包括GFRAL蛋白的胞外域。因此，在一些实施方案中，GFRAL蛋白的胞外域包含与在GFRAL蛋白和GDF15蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基。在该实施方案中，GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基可与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197和GLN200。此外或备选，GFRAL蛋白的胞外域包含与在GFRAL蛋白和RET蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基。在该实施方案中，GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基可与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ IDNO:9的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、GLN298和SER299。
还提供鉴定调节GFRAL蛋白与RET蛋白结合的药剂的方法。所述方法可包括使用候选药剂与经遗传修饰表达GFRAL和RET的重组细胞接触；测定GFRAL与RET结合的水平；其中与在候选药剂不存在时GFRAL蛋白和RET蛋白的结合水平相比在候选药剂存在时GFRAL蛋白和RET蛋白的结合水平的变化，将候选药剂鉴定为调节GFRAL蛋白与RET蛋白的结合的药剂。在另一个实施方案中，所述方法包括构建具有由本文所述原子坐标界定的GDF15蛋白的复合物的三维结构；利用三维结构和建模方法鉴定调节GFRAL蛋白与RET蛋白的结合的候选药剂；使候选药剂与经遗传修饰表达GFRAL蛋白和RET蛋白的重组细胞接触；测定GFRAL蛋白和RET蛋白的结合水平，其中与在候选药剂不存在时GFRAL蛋白和RET蛋白的结合水平相比在候选药剂存在时GFRAL蛋白和RET蛋白的结合水平的变化，将候选药剂鉴定为调节GFRAL蛋白与RET蛋白的结合的药剂。
另外，在一些实施方案中，由重组细胞表达的GFRAL蛋白包含GFRAL蛋白的胞外域。在某些方面，GFRAL蛋白的胞外域包含与在GFRAL蛋白和RET蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基。在该实施方案中，GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基可与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297和GLN298。
在某些实施方案中，公开了治疗对象的非刻意体重减轻或预防有发生非刻意体重减轻风险的对象的非刻意体重减轻的方法。所述方法可包括给予对象以下之一：i)结合GFRAL蛋白的胞外域的药剂；和ii)GFRAL的胞外域(GFRAL-ECD)，其中以有效量给予药剂或GFRAL-ECD以治疗对象的非刻意体重减轻或预防其发生。
本文还提供降低出现GDF15蛋白活性升高或有发生GDF15蛋白活性升高的风险的对象的GDF15蛋白活性的方法。所述方法可包括给予对象以下之一：i)结合GFRAL蛋白的胞外域的药剂；和ii)GFRAL的胞外域(GFRAL-ECD)，其中以有效量给予药剂或GFRAL-ECD以降低对象的GDF15蛋白活性。
提供治疗对象的恶病质或预防有恶病质风险的对象的恶病质的方法。所述方法可包括给予对象以下的至少一种：i)结合GFRAL蛋白的胞外域的药剂；和ii)可溶性GFRAL的胞外域(GFRAL-ECD)，其中以有效量给予药剂或GFRAL-ECD以治疗对象的恶病质或预防其发生。
在某些实施方案中，当给予GFRAL-ECD时，GFRAL-ECD包含与在GFRAL蛋白和GDF15蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基。在该实施方案中，GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基可与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197和GLN200。此外或备选，GFRAL-ECD包含与在GFRAL蛋白和RET蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基，其中GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297和GLN298。
在某些实施方案中，药剂可包括可溶性GFRAL-ECD。在某些实施方案中，GFRAL-ECD可与异源蛋白质融合。异源蛋白质可以选自Ig Fc、白蛋白和麦芽糖结合蛋白。例如，白蛋白可以是人血清白蛋白。
在其它实施方案中，当给予药剂时，药剂可以是与GFRAL的胞外域结合的抗体。在一些实施方案中，抗体与之结合的GFRAL蛋白的胞外域包含与在GFRAL蛋白和GDF15蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基。在该实施方案中，GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基可与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197和GLN200。此外或备选，抗体与之结合的GFRAL蛋白的胞外域包含与在GFRAL蛋白和RET蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基。在该实施方案中，GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基可与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297和GLN298。
本文还提供包含GFRAL蛋白和GDF15蛋白的晶体。在一些实施方案中，所述晶体衍射X射线辐射以产生表示具有大致下列晶胞常数的复合物的三维结构的衍射图：空间群P21。在一些实施方案中，所述晶体衍射分辨率约的X射线辐射。所述晶体还可包括具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的GFRAL蛋白，和/或呈同二聚体形式的GDF15蛋白。所述晶体还可具有本文所述的原子坐标。本文提供的晶体可用于筛选测定法以鉴定GDF15蛋白的拮抗剂。
本文还提供包含本文提供的晶体的组合物。
还进一步提供鉴定具有结合GDF15蛋白的能力的变异GFRAL蛋白的方法。所述方法可包括构建包含由本文提供的原子坐标界定的GFRAL蛋白和GDF15蛋白的复合物的三维结构；利用三维结构和建模方法鉴定使GFRAL蛋白突变的位点并使该位点突变以产生变异GFRAL蛋白；产生变异GFRAL蛋白；并测定变异GFRAL蛋白以确定其结合GDF15蛋白的能力。
在一些实施方案中，使GFRAL蛋白突变的位点位于与在GFRAL蛋白和GDF15蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域。在该实施方案中，该结构域可包含选自以下的一个或多个氨基酸残基：SEQ ID NO 9的GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197和GLN200。
在一些实施方案中，使GFRAL蛋白突变的位点位于与选自以下位置一致的氨基酸处：SEQ ID NO 9的GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197和GLN200。
还进一步提供鉴定具有结合RET蛋白的能力的变异GFRAL蛋白的方法。所述方法可包括构建包含由本文所述原子坐标界定的GFRAL蛋白和GDF15蛋白的复合物的三维结构；利用三维结构和建模方法鉴定使GFRAL蛋白突变的位点并使该位点突变以产生变异GFRAL蛋白；产生变异GFRAL蛋白；并测定变异GFRAL蛋白以确定其结合RET蛋白的能力。
在一些实施方案中，使GFRAL蛋白突变的位点位于与在GFRAL蛋白和RET蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域。在该实施方案中，该结构域可包含选自以下的一个或多个氨基酸残基：SEQ ID NO 9的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS25、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297和GLN298。
在一些实施方案中，使GFRAL突变的位点位于与选自以下位置一致的氨基酸处：SEQ ID NO 9的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS25、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297和GLN298。
甚至还进一步提供鉴定具有结合GFRAL蛋白的能力的变异GDF15蛋白的方法。所述方法可包括构建包含由本文所述原子坐标界定的GFRAL蛋白和GDF15蛋白的复合物的三维结构；利用三维结构和建模方法鉴定使GDF15蛋白突变的位点并使该位点突变以产生变异GDF15蛋白；产生变异GDF15蛋白；并测定变异GDF15蛋白以确定其结合GFRAL蛋白的能力。
在一些实施方案中，使GDF15蛋白突变的位点位于与在GDF15蛋白和GFRAL蛋白之间的界面缔合的GDF15结构域。在该实施方案中，该结构域可包含选自以下的一个或多个氨基酸残基：SEQ ID NO 6的SER35、LEU34、THR94、GLY95、GLN40、VAL96、LEU98、PRO36、VAL87、LEU88、ILE89、ASP102、THR100、PRO85和MET86。
在一些实施方案中，使GDF15蛋白突变的位点位于与选自以下位置一致的氨基酸处：SEQ ID NO 6的SER35、LEU34、THR94、GLY95、GLN40、VAL96、LEU98、PRO36、VAL87、LEU88、ILE89、ASP102、THR100、PRO85和MET86。
本文还提供产生抑制包含GFRAL蛋白和GDF15蛋白的复合物(GFRAL/GDF15复合物)或包含GFRAL蛋白和RET蛋白的复合物(GFRAL/RET复合物)的形成的药剂的方法。所述方法可包括获得包含GFRAL蛋白和两种或更多种药剂之一的复合物(GFRAL/药剂复合物)的两个或更多个三维结构；将三维GFRAL/药剂复合物结构的每一个与GFRAL/GDF15复合物的三维结构或与GFRAL/RET复合物的三维结构进行比较；根据GFRAL/药剂复合物与GFRAL/GDF15复合物的三维结构或与GFRAL/RET复合物的三维结构的结构相似性选择两种或更多种药剂的至少一种；并生产至少1g的药剂。
在一些实施方案中，如果至少一种药剂以与其结合GDF15蛋白或RET蛋白相同或较高的亲和力与GFRAL蛋白结合，则选出至少一种药剂。
另外，上述方法包括比较步骤，其包括将两种或更多种GFRAL/药剂复合物中的GFRAL蛋白的氨基酸与选自以下的GFRAL/GDF15复合物中的GFRAL蛋白的氨基酸进行比较：SEQ ID NO:9的GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197和GLN200。此外或备选，该比较可包括将两种或更多种GFRAL/药剂复合物中的GFRAL蛋白的氨基酸与选自以下的GFRAL/GDF15复合物中的GDF15蛋白的氨基酸进行比较：SEQ ID NO:6的SER35、LEU34、THR94、GLY95、GLN40、VAL96、LEU98、PRO36、VAL87、LEU88、ILE89、ASP102、THR100、PRO85和MET86。更进一步地，此外或备选，比较步骤可包括将两种或更多种GFRAL/药剂复合物中的GFRAL蛋白的氨基酸与选自以下的GFRAL/RET复合物中的GFRAL蛋白的氨基酸进行比较：SEQID NO 9的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS25、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297和GLN298。
在一些实施方案中，GFRAL/GDF15复合物的三维结构由本文提供的原子坐标界定。
在一些实施方案中，所述比较包括应用建模程序。
在一些实施方案中，通过所述方法鉴定的药剂在重组细胞中产生。在该实施方案中，所产生的药剂的量为至少10g、至少100g或至少1,000g。
附图简述
图1A、1B和1C表示人GDF15蛋白(图1A；SEQ ID NO:6)、Fc-hGDF15(图1B；SEQ IDNOS:7和8)和HSA-hGDF15(图1C；SEQ ID NO:24)的氨基酸序列。
图2A-2D表示人GFRAL蛋白(图2A；SEQ ID NO:9)，小鼠GFRAL蛋白(图2B；SEQ IDNO:10)、大鼠GFRAL蛋白(图2C；SEQ ID NO:11)和猴GFRAL蛋白(图2D；SEQ ID NO:12)蛋白质序列。图2E表示人、小鼠、大鼠和猴的GFRAL蛋白的比对(SEQ ID NO:9-12)。
图3A-3H表示各种RET9和RET51蛋白序列(SEQ ID NO:13-20)。
图4说明GFRAL-Fc蛋白序列(SEQ ID NO:21)。
图5表示Fc-GDF15蛋白与小鼠GFRAL蛋白的特异性结合。
图6A和6B说明小鼠组织中GFRAL mRNA表达的分析结果。
图7A和7B表示125I-GDF15与表达人GFRAL蛋白的细胞的结合。
图8说明由GDF15通过GFRAL-RET受体复合物介导的细胞反应。
图9A-9D说明由人GDF15蛋白通过来自4种物种(图9A：人，图9B：食蟹猴，图9C：大鼠，图9D：小鼠)的GFRAL-RET受体复合物所介导的细胞反应。
图10表示GDF15蛋白、GFRAL-Fc蛋白和抗体1M03与125I-GDF15竞争结合GFRAL表达细胞。
图11表示GFRAL-GDF15结合的抑制剂(GFRAL-Fc和1M03抗体)对GDF15的细胞反应的作用。
图12说明抗GFRAL ECD抗体与GDF15蛋白竞争结合GFRAL ECD蛋白。
图13说明抗GFRAL ECD抗体抑制GDF15介导的GFRAL-RET受体复合物活化。
图14显示GFRAL不依赖GDF15地与RET相互作用。
图15显示具有GFRAL蛋白和GDF15蛋白的复合物的示例性晶体。
图16说明示例性GFRAL电子密度图。
图17显示不对称GFRAL/GDF15晶体单元中形成的GFRAL/GDF15二聚体的示例性条带图。GFRAL蛋白结构域D2和D3被标为GFRAL D2和GFRAL D3。
图18显示不对称GFRAL/GDF15晶体单元中形成的GFRAL/GDF15异二聚体的二聚体的示例性条带图。GFRAL蛋白结构域D2和D3被标为GFRAL D2和GFRAL D3。
图19A-19B显示GFRAL/GDF15异二聚体的二聚体不同的表曲面图。
图20说明与GDF15相互作用的GFRAL残基。
图21A-21D说明GFRAL/GDF15界面。GFRAL蛋白结构域D2和D3被标为GFRAL D2和GFRAL D3。
图22A-22B显示如条带图所示GFRAL蛋白和GFRα1的重叠的不同方面。
图23A-23D说明RET/GFRAL/GDF15模型中GFRAL蛋白与RET蛋白相互作用的不同方面。
图24A-24B说明GFRAL蛋白的RET界面上的氨基酸。
图25显示不同的GFRAL蛋白的序列比对。显示了SEQ ID NO:9和31-40。
图26显示不同GDF15蛋白的序列比对。显示了SEQ ID NO:25和41-51。
在进一步描述本发明之前，要了解本发明不限于所描述的具体实施方案，因为这当然是可变的。还要了解本文所用术语仅用于描述具体实施方案的目的，且无意是限制性的，因为本发明的范围只受随附权利要求书的限制。
当提供数值范围时，要了解介于该范围的上限和下限之间的各中间值，到下限单位的十分位(除非上下文中另有明确规定)和该陈述范围内的任何其它陈述值或中间值均包括在本发明内。这些更小范围的上限和下限可以独立地包括在更小范围内，并且也包括在本发明内，受限于陈述范围内的任何具体的排除限制。当陈述范围包括限制的一个或两个时，排除那些所包括的限制的任一个或两个的范围也包括在本发明内。除非另有定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文描述的那些相似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或检验，但是在本文中描述了优选的方法和材料。本文提及的所有出版物通过引用并入，连同所引用的出版物公开和描述方法和/或材料。
必须注意，正如本文和随附权利要求书中所用，单数形式(“a”、“an”和“the”)包括复数指代，除非上下文中另有明确规定。因此，例如提及“蛋白质”包括提及一种或多种蛋白质，如此类推。还要注意，权利要求可以撰写成不包括任何任选元素。因此，这种陈述旨在用作前置基础供与描述权项要求元素相关的如“唯一地”、“仅仅”等这类排他性术语的使用或“负”限制的使用。
提供本文所述出版物纯粹出于其公开在本申请的申请日之前。本文不得解释为承认本发明由于在先发明而无资格先于所述出版物。此外，所提供的出版物日期可能与实际的出版物日期不相同，这可能需要单独予以确认。
发明详述
本公开内容提供在体重调节中起作用的蛋白质复合物。本公开内容的蛋白质复合物的成分可用于调节体重。另外，蛋白质复合物及其成分应用于鉴定可用来控制体重的药剂。本文还提供用于治疗和/或预防非刻意体重减轻的方法。另外，本文还公开了降低发生GDF15活性升高或有发生GDF15活性升高风险的对象的GDF15活性的方法。
本公开内容还提供使GDF15蛋白和GFRAL蛋白结晶的方法，所述蛋白质是之前未知的且是新鉴定的GDF15的受体。本公开内容首次提供了GDF15蛋白和GFRAL蛋白的晶体。本文提供的晶体以足够高的分辨率衍射X射线以供测定GDF15配体-GFRAL受体复合物的三维结构，包括原子坐标。三维结构(例如包括如计算机可读介质所提供的)可用于GDF15相关模拟物或GFRAL相关配体，以及干扰GDF15蛋白与其受体GFRAL蛋白的相互作用，和/或干扰GFRAL蛋白与RET蛋白相互作用的药剂的合理药物设计。这类药剂包括在GFRAL结构域中与GFRAL蛋白结合和与GFRAL蛋白竞争结合GDF15蛋白，从而完全或部分阻断GDF15-GFRAL复合物形成的抗体。这类药剂还包括在GFRAL结构域中与GFRAL蛋白结合和干扰RET蛋白与GFRAL蛋白结合，从而完全或部分阻断GDF15介导的RET蛋白活化(例如细胞信号转导)的抗体。
因此，本公开内容提供调节体重的组合物和方法，包括包含新鉴定的GDF15受体的组合物和包括其使用的方法。本文首次提供的是可结晶的GDF15受体(例如GFRAL蛋白)及GDF15受体(例如GFRAL蛋白)和GDF15蛋白的复合物的晶体结构，其分辨率为所述晶体的新的原子坐标可用来构建三维结构，其进而用于分子建模并用于鉴定与GFRAL蛋白和/或GDF15蛋白结合的药剂。这类药剂可用于调节体重和/或治疗和/或预防GDF15介导的疾病、疾病或病况。
定义
术语“患者”或“对象”在治疗的情况下可互换使用，是指人和非人动物，作为治疗或预防性治疗的接受者。
术语“治疗”、“医治”、“医疗”等是指在疾病、疾病或病况或其症状已经确诊、观察等之后开始的作用过程(如给予药剂，例如多肽或包含多肽的药物组合物)以便消除、减轻、阻止、缓解或改善(或暂时地或永久地)殃及对象的疾病、疾病或病况的基础病因中的至少一种或与殃及对象的疾病、紊乱、病症相关的症状中的至少一种。因此，治疗包括抑制(即制止疾病、疾病或病况或与其相关的临床症状的发生或进一步发展)活动性疾病。
本文所用术语“需要治疗”是指由医生或其他护理人员做出对象需要治疗或者将获益于治疗的判断。这个判断根据医生或护理人员专业知识领域中的各种因素做出。
术语“预防”、“防止”、“防护”等是指以某一种方式(例如在疾病、疾病或病况或其症状发作之前)开始的作用过程(如给予药剂，例如多肽或包含多肽的药物组合物)以预防、阻抑、抑制或减轻(或暂时地或永久地)对象发生疾病、疾病或病况等的风险(如通过例如临床症状不存在确定)或延迟其发作，一般在易患有特定疾病、疾病或病况的对象的情况下。在某些情况下，该术语也指减缓疾病、疾病或病况的进展或者抑制其进展以消除有害的或否则非期望的状态。
本文所用术语“需要预防”是指由医生或其他护理人员做出对象需要治疗或者将获益于预防性治疗的判断。这个判断根据医生或护理人员专业知识领域中的各种因素做出。
短语“治疗有效量”是指给予对象药剂，单独或作为药物组合物的一部分，在单次剂量中或作为系列剂量的一部分，呈能够在给予患者时对疾病、疾病或病况的任何症状、方面或特征具有任何可检测的积极作用的量。治疗有效量可结合给药方案和对象病况的诊断分析等予以调整。
短语“以引起变化的足够量”意指在给予特定疗法之前(例如基线水平)和之后测量的指标的水平之间存在可检测的差异。指标包括任何客观参数(例如体重或食物摄取)或主观参数(例如对象的良好感觉或食欲)。
术语“非刻意体重减轻”是指例如恶病质、肝硬化、甲状腺功能亢进、慢性肾病、帕金森病、癌症、进食障碍和肌肉衰减综合征(sarcopenia)等许多病况中观察到的非有意的体重减轻。
术语“恶病质”是指在没有主动尝试减轻体重的人中以体重减轻(例如非刻意体重减轻)、肌肉萎缩、疲劳、衰弱、脂肪质量丢失、瘦肉质量丢失、肌肉蛋白质分解增加、胰岛素抵抗和/或严重食欲不振为标志的消耗综合征。恶病质可大大提高患有例如某些慢性疾病(例如癌症、慢性肾病、慢性阻塞性肺病、AIDS、结核病、慢性炎性疾病、脓毒症和全身性炎症的其它形式、例如肌肉萎缩等肌肉消耗和称为神经性厌食症的进食障碍)的患者的发病率。例如，在晚期癌症中，恶病质是普遍的(发生于最末期癌症患者中)，且全部癌症相关死亡的大约四分之一由其造成。代谢过程(例如对肌肉起直接作用的代谢过程、减少其质量和/或形成)和食物摄入减少(例如导致脂肪和/或肌肉丢失的食物摄入减少)可促使恶病质的发生和/或发展。恶病质可通过名为前恶病质、恶病质和难治性恶病质的阶段发展。
术语“激活剂”是指例如刺激、增加、激活、促进、提高活化、敏化或上调一种或多种药剂(例如用于治疗或预防代谢障碍的多肽)的功能或活性的药剂。另外，激活剂包括通过与本发明的多肽相同的作用机制(即与类似于所述多肽的方式调节与所述多肽相同的信号转导途径的药剂)和能够引起相当于(或大于)所述多肽的生物应答的药剂。激活剂的实例包括激动剂例如小分子化合物。
术语“天然的”或“野生型”，在提及GDF15时，是指有生物活性的天然存在的GDF15。该术语包括112个氨基酸的人GDF15成熟序列(图1A)。
如本文所用，“同源物”或“变体”是指基于其氨基酸或核酸序列分别是相似的蛋白质或DNA序列。同源物或变体包括天然存在的DNA序列和由其编码的蛋白质及其同种型。同源物还包括蛋白质/基因的已知的等位基因或剪接变体。同源物和变体还包括以一个或多个碱基不同于天然存在的DNA序列但因遗传密码简并仍翻译成与天然存在的蛋白质一致的氨基酸序列的核酸序列。同源物和变体也可指因一个或多个保守取代和/或标签和/或缀合物而不同于天然存在的序列的那些。
本文所用术语“晶体”和“结晶的”是指以晶体形式存在的一种或多种蛋白质或其片段。晶体是物质的一种固态形式，其不同于例如非晶形固态或液晶态等其它形式。晶体由原子、离子、分子(例如蛋白质例如抗体)或分子装配体(例如配体/受体或抗原/抗体复合物)的有规则的重复三维阵列组成。这些三维阵列按照本领域周知的特定的数学关系排列。以晶体重复的基本单元或构件被称为不对称单元。在符合给定的分界清晰的晶体学不对称性的排列中不对称单元的重复提供晶体的“晶胞”。在所有3个维度中晶胞通过有规则的平移的重复提供晶体。参见Giege,R.and Ducruix,A.Barrett,Crystallization of NucleicAcids and Proteins,a Practical Approach,2nd ea.,pp.20 1-16,Oxford UniversityPress,New York,N.Y.,(1999)。
在本文互换使用的术语“多肽”和“蛋白质”是指氨基酸的聚合形式，其可包括遗传编码和非遗传编码的氨基酸、化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸并具有修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于与异源氨基酸序列的融合蛋白、与异源和同源前导序列的融合物，含或不含N端甲硫氨酸残基；免疫标记的蛋白质；等等。
应认识到在本公开内容中，按照单字母或三字母代码引用氨基酸。出于读者方便，下面提供单字母或三字母代码：
术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，或脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸的非限制性实例包括线性和环状核酸、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、载体、探针和引物。
术语“异源的”是指根据来自不同来源的结构界定的两种组分。例如，在“异源的”用于多肽的情况下，多肽可以包括来源于不同多肽的有效连接的氨基酸序列(例如第一组分由标签肽或蛋白质组成，第二组分来源于GFRAL多肽)。同样，“异源的”在编码嵌合多肽的多核苷酸的情况下，包括可来源于不同基因的有效连接的核酸序列(例如按照本文公开的一个实施方案，第一组分来自编码肽的核酸，第二组分来自编码载体多肽的核酸)。其它示例性的“异源的”核酸包括表达构建体，其中包含编码序列的核酸与调节元件(例如启动子)有效连接，调节元件来自不同于编码序列的遗传来源(例如以供在目标宿主细胞中表达，所述细胞可具有与启动子、编码序列或两者不同的遗传来源)。例如，与编码GFRAL或RET多肽或其结构域的多核苷酸有效连接的T7启动子被称为是异源核酸。“异源的”在重组细胞的情况下，可指存在与在其所存在的宿主细胞不同的遗传来源的核酸(或基因产物，例如多肽)。
术语“有效连接的”是指分子间的功能性连接以提供所需功能。例如，“有效连接的”在核酸的情况下，是指核酸序列之间的功能性连接以提供例如转录、翻译等所需功能，例如核酸表达控制序列(例如启动子或转录因子结合位点的阵列)和第二多核苷酸之间的功能性连接，其中所述表达控制序列影响第二多核苷酸的转录和/或翻译。“有效连接的”在多肽的情况下，是指氨基酸序列(例如不同的结构域)之间的功能性连接以提供所述的多肽活性。
正如在本文多肽结构的情况下所用的，“N端”和“C端”分别是指多肽最末的氨基和羧基末端，而“N端的”和“C端的”分别指多肽的氨基酸序列朝向N端和C端的相对位置，可分别包括位于N端和C端的残基。
“来源于”在氨基酸序列或多核苷酸序列(例如“来源于”GFRAL、RET或GDF15多肽的氨基酸序列)的情况下意在表明多肽或核酸具有基于参比多肽或核酸(例如天然存在的GFRAL、RET或GDF15多肽或GFRAL、RET或GDF15编码核酸)的序列，而无意按照来源或其中制备蛋白质或核酸的方法是限制性的。
“分离的”是指目标蛋白质如果天然存在的话，是在不同于其中它天然存在的环境中。“分离的”意在包括这样的蛋白质，其在目标蛋白质被充分富集的样品中和/或其中目标蛋白质被部分或充分纯化。如果蛋白质不是天然存在的，则“分离的”表示蛋白质已被从在其中通过合成或重组方法制备的环境中分离出来。
“富集的”意指对样品进行了非天然操作(例如由科学家或临床医师进行)使得与例如生物样品等起始样品(例如其中蛋白质天然存在的样品或其中在给药后存在的样品)中、或其中制备蛋白质的环境(例如像在细菌蛋白质等中一样)中的蛋白质的浓度相比，目标蛋白质以更高的浓度(例如高至少3倍、高至少4倍、高至少8倍、高至少64倍或更高的浓度)存在。
“基本上纯的”表示实体(例如多肽)构成大于组合物总含量(例如组合物的总蛋白质)的约50％，通常构成大于总蛋白质含量的约60％。更通常，“基本上纯的”是指其中总组合物的至少75％、至少85％、至少90％或更高为目标实体(例如95％的总蛋白质)的组合物。优选地，蛋白质将构成大于组合物总含量的约90％，更优选地，蛋白质将构成大于组合物总蛋白质的约95％。
“可检测标记的”在可检测标记的蛋白质的情况下，是指通过连接可检测部分修饰的蛋白质。可检测部分可直接或间接产生信号。直接产生信号的可检测部分的实例包括荧光分子、化学发光分子和放射性分子。间接产生信号的可检测部分包括在暴露于检测试剂例如底物、酶或抗体等时产生信号的部分。直接产生信号的可检测部分可任选通过间接方法(例如通过使用与所述部分结合的标记的抗体)检测。信号可以是通过以下可检测的：放射测量仪器，例如闪烁计数器；光电探测器，例如光学显微镜、分光光度计、荧光显微镜、荧光样品读取器或荧光激活细胞分选仪等。
术语“内源的”在提及基因时，表明基因对细胞是天然的，即，基因存在于未改性细胞基因组的特定基因座。内源基因可以是存在于野生型细胞中的该基因座的野生型基因(如天然存在的)。内源蛋白质是由内源基因表达的蛋白质。
术语“构建体”是指为表达特定核苷酸序列的目的产生，或用来构建其它重组核苷酸序列的重组核酸，通常为重组DNA。构建体可存在于载体或基因组中。
术语“重组体”是指非天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或多肽。重组分子可含有以天然不存在的方式连接在一起的两个或更多个天然存在的序列。重组细胞含有重组多核苷酸或多肽。
术语“编码序列”是指当置于合适调节元件的控制下，一旦例如体内转录和翻译便产生蛋白质的核酸序列。本文所用编码序列可具有连续的ORF或可能具有被存在的内含子或非编码序列中断的ORF。在该实施方案中，非编码序列从前mRNA中剪出以产生成熟mRNA。
分离的蛋白质复合物
提供包括GDF15蛋白和GFRAL蛋白的分离的复合物。GDF15，亦称MIC-1(巨噬细胞抑制性细胞因子-1)、PDF、PLAB、NAG-1、TGF-PL和PTGFB，是转化生长因子β(TGF-β)超家族的成员。本发明人发现GDF15与GFRAL结合并介导GFRAL-Ret受体复合物的活化。分离复合物的蛋白质应用于调节体重以及调节体重的药剂的鉴定。
“GDNF家族受体α样”(GFRAL)亦称为GRAL。如本文所用，“GFRAL”是指具有与SEQ IDNO:1的氨基酸序列有至少65％同一性的氨基酸序列的蛋白质。SEQ ID NO:1是缺乏信号肽的成熟人GFRAL的序列：
qtnnctylreqclrdangckhawrvmedacndsdpgdpckmrnssycnlsiqylvesnfqfkeclctddfyctvnkllgkkcinksdnvkedkfkwnlttrshhgfkgmwsclevaeacvgdvvcnaqlasylkacsangnpcdlkqcqaairffyqnipfniaqmlafcdcaqsdipcqqskealhsktcavnmvppptclsvirscqndelcrrhyrtfqskcwqrvtrkchedencistlskqdltcsgsddckaayidilgtvlqvqctcrtitqseeslckifqhmlhrkscfnyptlsnvkgmalytrkhankitltgfhspfngeviyaamcmtvtcgilllvmvklrtsrisskardpssiqipgel(SEQ IDNO:1)
以下提供全长前体人GFRAL蛋白的氨基酸序列，其包括信号肽序列(加下划线和小写字母残基)：
mivfiflamglsleneytsQTNNCTYLREQCLRDANGCKHAWRVMEDACNDSDPGDPCKMRNSSYCNLSIQYLVESNFQFKECLCTDDFYCTVNKLLGKKCINKSDNVKEDKFKWNLTTRSHHGFKGMWSCLEVAEACVGDVVCNAQLASYLKACSANGNPCDLKQCQAAIRFFYQNIPFNIAQMLAFCDCAQSDIPCQQSKEALHSKTCAVNMVPPPTCLSVIRSCQNDELCRRHYRTFQSKCWQRVTRKCHEDENCISTLSKQDLTCSGSDDCKAAYIDILGTVLQVQCTCRTITQSEESLCKIFQHMLHRKSCFNYPTLSNVKGMALYTRKHANKITLTGFHSPFNGEVIYAAMCMTVTCGILLLVMVKLRTSRISSKARDPSSIQIPGEL
(SEQ ID NO:9)
因此，本文所用“GFRAL”包括人GFRAL及其变体，包括但不限于其直向同源物，例如鼠GFRAL、大鼠GFRAL、食蟹猴GFRAL等。图2显示了GFRAL的这类序列。GFRAL不是TGFβRII(Acc.Nos.：NM_001024847.2；NM_003242.5)或其直向同源物。GFRAL不同于TGFβRI(Acc.Nos.：NP_001124388.1；NP_004603.1)或其直向同源物。在某些实施方案中，GFRAL可以是具有与SEQ ID NO:1有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的蛋白质。这类示例性GFRAL蛋白包括黑猩猩(99％)、食蟹猴(92％)、大熊猫(82％)、狗(81％)、猫(80％)、猪(77％)、牛(75％)、小鼠(70％)、大鼠(70％)、中华仓鼠(65％)和鸭嘴兽(59％)，见图25。
GFRAL蛋白或GFRAL也指在氨基酸残基中(例如在变体和/或物种间非保守的位置处)具有一个或多个变化同时保持保守的结构域并具有类似于天然存在的GFRAL的生物活性的蛋白质。由于遗传密码的简并，GFRAL可由因一个或多个碱基不同于天然存在的DNA序列的核酸序列编码但仍翻译成相当于天然存在的蛋白质的氨基酸序列。GFRAL也可指因一个或多个保守取代和/或标签和/或缀合物不同于GFRAL的天然存在的序列的那些蛋白质。
本公开内容的蛋白质含有来源于GFRAL的任何长度的连续氨基酸残基。连续氨基酸残基的充分长度可随蛋白质来源于其中的具体的天然存在的氨基酸序列而变化。例如，蛋白质可为长至少100个氨基酸-150个氨基酸残基、长度至少150个氨基酸-200个氨基酸残基或至少220个氨基酸直到全长蛋白质(例如250个氨基酸、300个氨基酸、319个氨基酸、333个氨基酸、376个氨基酸)。
含有基本上类似于GFRAL多肽的氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白质包括包含约100个氨基酸(aa)-约150aa、约150aa-约200aa、约200aa-约250aa、约250aa-约300或约300aa直到天然存在的GFRAL多肽全长的连续的一段有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％、氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽。例如，主题组合物和方法的GFRAL多肽可包括与约100个氨基酸(aa)-约150aa、约150aa-约200aa、约200aa-约250aa、约250aa-约300或约300aa直到约350aa、约350aa-约图2A-2D所述GFRAL多肽氨基酸序列全长的连续的一段有至少约71％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
相对于天然存在的全长GFRAL多肽，该蛋白质可能缺少5个、至少10个直到至少50个或更多个aa。例如，蛋白质可不含天然存在的GFRAL多肽的氨基酸序列基础上的信号序列。该蛋白质还可含有与天然存在的GFRAL多肽相同或类似的翻译后修饰或可不含翻译后修饰。例如，蛋白质可具有与天然存在的GFRAL多肽的相同或类似的糖基化形式或可不含糖基化。在其它实施方案中，GFRL蛋白可包括相对于天然存在的GFRAL蛋白的序列的突变，其在不存在于天然存在的GFRAL蛋白的位置引入糖基化位点。
GFRAL的许多DNA和蛋白质序列在本领域是已知的，稍后将论述某些序列。某些GFRAL蛋白序列见图2A-2E。图2E显示图2A-2D所示GFRAL序列的比对。
在某些实施方案中，GFRAL可通过经遗传修饰表达GFRAL蛋白的重组细胞在其细胞表面上表达。细胞可存在于包括分离的GDF15蛋白的组合物中。在某些情况下，细胞可另外表达RET—例如细胞可在无遗传修饰时内源表达RET以包括编码RET的外源序列。在其它实施方案中，细胞可能不表达可检测水平的RET且可经遗传修饰表达来自外源序列的RET。
本文还公开了GFRAL的片段，例如缺乏存在于天然GFRAL(例如图2A-2D所示天然GFRAL)的胞内域或存在于天然GFRAL的胞内域和跨膜结构域的GFRAL片段。如上所述，GFRAL的片段还可缺乏存在于天然GFRAL的信号序列且可以包括或不包括异源信号序列。所述片段可缺乏存在于天然GFRAL的胞内域但包括跨膜结构域。
在某些实施方案中，提供分离的GFRAL-胞外域(GFRAL-ECD)多肽。当存在于本公开内容的分离的蛋白质复合物中时，GFRAL-ECD可与配体例如GDF15结合。术语“GFRAL-胞外域”(“GFRAL-ECD”)包括全长GFRAL ECD、GFRAL ECD片段和GFRAL ECD变体。如本文所用，术语“GFRAL ECD”是指含或不含信号肽、缺乏胞内和跨膜结构域的GFRAL多肽。在一些实施方案中，GFRAL ECD是指与具有以下氨基酸序列的人全长GFRAL ECD的氨基酸序列有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白质：
qtnnctylreqclrdangckhawrvmedacndsdpgdpckmrnssycnlsiqylvesnfqfkeclctddfyctvnkllgkkcinksdnvkedkfkwnlttrshhgfkgmwsclevaeacvgdvvcnaqlasylkacsangnpcdlkqcqaairffyqnipfniaqmlafcdcaqsdipcqqskealhsktcavnmvppptclsvirscqndelcrrhyrtfqskcwqrvtrkchedencistlskqdltcsgsddckaayidilgtvlqvqctcrtitqseeslckifqhmlhrkscfnyptlsnvkgmalytrkhankitltgfhspfnge(SEQ ID NO:2)
本文所用术语“全长GFRAL ECD”是指延伸至胞外域的最后一个氨基酸，且可以包括或不包括N端信号肽的GFRAL ECD。然而，要注意“全长GFRAL ECD”还包括在C端延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸以包括跨膜结构域的氨基酸残基的GFRAL-ECD，条件是该多肽是可溶解的。换句话说，GFRAL ECD缺乏跨膜结构域的足够长度使得它不锚定在细胞膜上。短语“全长GFRAL ECD”还包括在N端延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸以包括信号肽的氨基酸残基的GFRAL-ECD。在某些实施方案中，GFRAL ECD片段是指与图2A-2D所示连续氨基酸序列有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性并在图2A-2D所示GFRAL序列的C端缺乏至少30、33、35、40、45、50或55个氨基酸以上的连续氨基酸序列。
GFRAL ECD不是TGFβRII(Acc.Nos.：NM_001024847.2；NM_003242.5)或其直向同源物的ECD。GFRAL ECD不同于TGFβRI(Acc.Nos.：NP_001124388.1；NP_004603.1)或其直向同源物的ECD。在某些实施方案中，GFRAL ECD可以是具有与SEQ ID NO:2有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的蛋白质。
如本文所用，术语“GFRAL ECD片段”是指在全长ECD的N和/或C端缺失一个或多个残基并保持与GDF15结合的能力的GFRAL ECD。在某些情况下，GFRAL ECD片段可以包括或不包括N端信号肽。在某些情况下，GFRAL ECD片段是缺乏存在于序列的N端的1、5、10、15、16、17、18或19个残基的人GFRAL ECD片段：
mivfiflamglsleneytsqtnnctylreqclrdangckhawrvmedacndsdpgdpckmrnssycnlsiqylvesnfqfkeclctddfyctvnkllgkkcinksdnvkedkfkwnlttrshhgfkgmwsclevaeacvgdvvcnaqlasylkacsangnpcdlkqcqaairffyqnipfniaqmlafcdcaqsdipcqqskealhsktcavnmvppptclsvirscqndelcrrhyrtfqskcwqrvtrkchedencistlskqdltcsgsddckaayidilgtvlqvqctcrtitqseeslckifqhmlhrkscfnyptlsnvkgmalytrkhankitltgfhspfnge(SEQ ID NO:4)
另一个示例性GFRAL ECD片段包含下列氨基酸序列，其对应于全长人前体GFRAL蛋白的Q20-C316：
qtnnctylreqclrdangckhawrvmedacndsdpgdpckmrnssycnlsiqylvesnfqfkeclctddfyctvnkllgkkcinksdnvkedkfkwnlttrshhgfkgmwsclevaeacvgdvvcnaqlasylkacsangnpcdlkqcqaairffyqnipfniaqmlafcdcaqsdipcqqskealhsktcavnmvppptclsvirscqndelcrrhyrtfqskcwqrvtrkchedencistlskqdltcsgsddckaayidilgtvlqvqctcrtitqseeslckifqhmlhrksc(SEQ ID NO:22)
又一个示例性GFRAL ECD片段包含下列氨基酸序列，其对应于全长人前体GFRAL蛋白的W115-E351：
wnlttrshhgfkgmwsclevaeacvgdvvcnaqlasylkacsangnpcdlkqcqaairffyqnipfniaqmlafcdcaqsdipcqqskealhsktcavnmvppptclsvirscqndelcrrhyrtfqskcwqrvtrkchedencistlskqdltcsgsddckaayidilgtvlqvqctcrtitqseeslckifqhmlhrkscfnyptlsnvkgmalytrkhankitltgfhspfnge(SEQ ID NO:23)。
上述示例性GFRAL ECD片段用于实施例所述方法中以产生包含GFRAL蛋白和GDF15蛋白的复合物的晶体。
在GFRAL ECD内，有三个不同的结构域—结构域1(D1)、结构域2(D2)和结构域3(D3)。在一些实施方案中，界定GFRAL ECD的D1的为SEQ ID NO:9的残基Q20-S130。在一些实施方案中，界定GFRAL ECD的D2的氨基酸序列为SEQ ID NO:9的残基C131-C210。在一些实施方案中，界定GFRAL ECD的D3的氨基酸序列是残基C220-C316。GFRAL的某些性质可归因于ECD内的这些结构域的活性和/或结合。例如，如本文所述，GFRAL ECD的D2内的氨基酸残基被鉴定为GFRAL与GDF15结合的核心相互作用界面氨基酸和/或边界相互作用界面氨基酸。同样，如本文所述，GFRAL ECD的D3内的氨基酸残基被鉴定为GFRAL与RET结合的核心相互作用界面氨基酸和/或边界相互作用界面氨基酸。
术语“核心相互作用界面氨基酸”或其语法等同词是指在距相互作用蛋白上小于或等于以内具有至少一个原子的指定蛋白质的氨基酸残基(例如与GDF15或RET相互作用的GFRAL上的氨基酸)。的距离允许范德华半径内的原子加可能的水分子中间的氢键与相互作用蛋白形成键。
术语“边界相互作用界面氨基酸”或其语法等同词是指在距指定蛋白质上的核心界面氨基酸上小于或等于以内具有至少一个原子的指定蛋白质的氨基酸残基(例如在与GDF15或RET相互作用的GFRAL的核心相互作用界面氨基酸上的内的GFRAL上的氨基酸)。小于或等于的距离允许蛋白质与远离指定蛋白质上的核心相互作用界面氨基酸小于的残基结合位于相互作用蛋白的范德华半径内。
如本文所用，术语“GFRAL ECD变体”是指含有氨基酸添加、缺失或取代且保持能够与GDF15结合的GFRAL ECD。这类变体可与亲本GFRAL ECD有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性。可应用算法，例如具有测定相似性的默认值设置的Bestfit程序，通过比较两个多肽的氨基酸序列测定的相似性分数，来测量两个多肽的％同一性。Bestfit应用Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)的局部同源算法以找出两个序列之间相似性的最佳区段。
在某些实施方案中，GFRAL-ECD可包括包括长度约100-340个残基(例如100、150、200、250、300、310、320、330、333或335个残基长)的连续氨基酸序列、与以下人可溶性GFRAL-ECD有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的可溶性多肽：
qtnnctylreqclrdangckhawrvmedacndsdpgdpckmrnssycnlsiqylvesnfqfkeclctddfyctvnkllgkkcinksdnvkedkfkwnlttrshhgfkgmwsclevaeacvgdvvcnaqlasylkacsangnpcdlkqcqaairffyqnipfniaqmlafcdcaqsdipcqqskealhsktcavnmvppptclsvirscqndelcrrhyrtfqskcwqrvtrkchedencistlskqdltcsgsddckaayidilgtvlqvqctcrtitqseeslckifqhmlhrkscfnyptlsnvkgmalytrkhankitltgfhspfnge(SEQ ID NO:5)
在某些实施方案中，可溶性GFRAL-ECD可以是约325、329、330、331、332、335、340个氨基酸长且可与人可溶性GFRAL-ECD、小鼠可溶性GFRAL-ECD或大鼠可溶性GFRAL-ECD有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性。
在某些情况下，GFRAL-胞外域可在经遗传修饰表达含跨膜结构域的GFRAL-ECD细胞的表面上表达。在某些情况下，可溶性GFRAL-ECD可固定在支持物上。如本文所述，本公开内容的多肽可以是包括与异源蛋白质序列缀合的多肽的融合蛋白。
合适的支持物可具有多种形式和组成，且可来源于天然存在的材料、经合成改性的天然存在的材料，或合成材料。合适材料的实例包括但不限于硝酸纤维素、玻璃、二氧化硅、特氟隆和金属(例如金、铂等)。合适的材料还包括聚合材料，包括塑料(例如聚四氟乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯及其混合物等)、多糖例如琼脂糖(例如可作为市购获取的琼脂糖，Pharmacia)和葡聚糖(例如以和为商品名市购获取的那些，也来自Pharmacia)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇、甲基丙烯酸羟甲酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物等。
本文还预期包括RET蛋白和GDF15蛋白的组合物。在某些情况下，这类组合物可进一步包括GFRAL。在某些情况下，RET可与支持物连接或在经遗传修饰表达RET的重组细胞的细胞表面表达。在某些情况下，组合物可包括经遗传修饰表达RET的重组细胞、GDF15和载体，例如药学上可接受的载体。
在某些实施方案中，组合物可包括GFRAL和RET。在某些情况下，组合物可包括经遗传修饰表达RET和GFRAL的重组细胞和载体，例如药学上可接受的载体。
在某些情况下，组合物可包括经遗传修饰表达RET和GFRAL的重组细胞、GDF15、载体，例如药学上可接受的载体。
如本文所用，“Ret”或“RET”是指具有与SEQ ID NO:3的氨基酸序列有至少75％同一性，例如77％、79％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的蛋白质。RET不同于TGFβRI和TGFβRII。SEQ ID NO:3是缺乏信号肽的成熟人RET9的序列：
KVALGLYFSRDAYWEKLYVDQAAGTPLLYVHALRDAPEEVPSFRLGQHLYGTYRTRLHENNWICIQEDTGLLYLNRSLDHSSWEKLSVRNRGFPLLTVYLKVFLSPTSLREGECQWPGCARVYFSFFNTSFPACSSLKPRELCFPETRPSFRIRENRPPGTFHQFRLLPVQFLCPNISVAYRLLEGEGLPFRCAPDSLEVSTRWALDREQREKYELVAVCTVHAGAREEVVMVPFPVTVYDEDDSAPTFPAGVDTASAVVEFKRKEDTVVATLRVFDADVVPASGELVRRYTSTLLPGDTWAQQTFRVEHWPNETSVQANGSFVRATVHDYRLVLNRNLSISENRTMQLAVLVNDSDFQGPGAGVLLLHFNVSVLPVSLHLPSTYSLSVSRRARRFAQIGKVCVENCQAFSGINVQYKLHSSGANCSTLGVVTSAEDTSGILFVNDTKALRRPKCAELHYMVVATDQQTSRQAQAQLLVTVEGSYVAEEAGCPLSCAVSKRRLECEECGGLGSPTGRCEWRQGDGKGITRNFSTCSPSTKTCPDGHCDVVETQDINICPQDCLRGSIVGGHEPGEPRGIKAGYGTCNCFPEEEKCFCEPEDIQDPLCDELCRTVIAAAVLFSFIVSVLLSAFCIHCYHKFAHKPPISSAEMTFRRPAQAFPVSYSSSGARRPSLDSMENQVSVDAFKILEDPKWEFPRKNLVLGKTLGEGEFGKVVKATAFHLKGRAGYTTVAVKMLKENASPSELRDLLSEFNVLKQVNHPHVIKLYGACSQDGPLLLIVEYAKYGSLRGFLRESRKVGPGYLGSGGSRNSSSLDHPDERALTMGDLISFAWQISQGMQYLAEMKLVHRDLAARNILVAEGRKMKISDFGLSRDVYEEDSYVKRSQGRIPVKWMAIESLFDHIYTTQSDVWSFGVLLWEIVTLGGNPYPGIPPERLFNLLKTGHRMERPDNCSEEMYRLMLQCWKQEPDKRPVFADISKDLEKMMVKRRDYLDLAASTPSDSLIYDDGLSEEETPLVDCNNAPLPRALPSTWIENKLYGRISHAFTRF(SEQ ID NO:3)
下面提供全长前体人RET蛋白的氨基酸序列，其包括信号肽序列(加下划线和小写字母残基)：
makatsgaaglrlllllllpllgKVALGLYFSRDAYWEKLYVDQAAGTPLLYVHALRDAPEEVPSFRLGQHLYGTYRTRLHENNWICIQEDTGLLYLNRSLDHSSWEKLSVRNRGFPLLTVYLKVFLSPTSLREGECQWPGCARVYFSFFNTSFPACSSLKPRELCFPETRPSFRIRENRPPGTFHQFRLLPVQFLCPNISVAYRLLEGEGLPFRCAPDSLEVSTRWALDREQREKYELVAVCTVHAGAREEVVMVPFPVTVYDEDDSAPTFPAGVDTASAVVEFKRKEDTVVATLRVFDADVVPASGELVRRYTSTLLPGDTWAQQTFRVEHWPNETSVQANGSFVRATVHDYRLVLNRNLSISENRTMQLAVLVNDSDFQGPGAGVLLLHFNVSVLPVSLHLPSTYSLSVSRRARRFAQIGKVCVENCQAFSGINVQYKLHSSGANCSTLGVVTSAEDTSGILFVNDTKALRRPKCAELHYMVVATDQQTSRQAQAQLLVTVEGSYVAEEAGCPLSCAVSKRRLECEECGGLGSPTGRCEWRQGDGKGITRNFSTCSPSTKTCPDGHCDVVETQDINICPQDCLRGSIVGGHEPGEPRGIKAGYGTCNCFPEEEKCFCEPEDIQDPLCDELCRTVIAAAVLFSFIVSVLLSAFCIHCYHKFAHKPPISSAEMTFRRPAQAFPVSYSSSGARRPSLDSMENQVSVDAFKILEDPKWEFPRKNLVLGKTLGEGEFGKVVKATAFHLKGRAGYTTVAVKMLKENASPSELRDLLSEFNVLKQVNHPHVIKLYGACSQDGPLLLIVEYAKYGSLRGFLRESRKVGPGYLGSGGSRNSSSLDHPDERALTMGDLISFAWQISQGMQYLAEMKLVHRDLAARNILVAEGRKMKISDFGLSRDVYEEDSYVKRSQGRIPVKWMAIESLFDHIYTTQSDVWSFGVLLWEIVTLGGNPYPGIPPERLFNLLKTGHRMERPDNCSEEMYRLMLQCWKQEPDKRPVFADISKDLEKMMVKRRDYLDLAASTPSDSLIYDDGLSEEETPLVDCNNAPLPRALPSTWIENKLYGRISHAFTRF(SEQID NO:26)
因此，本文所用的“RET”包括人RET及其变体，包括但不限于其直向同源物，例如鼠RET、食蟹猴RET等。RET的这类序列描述于图3。在某些实施方案中，RET可以是具有与SEQ IDNO:3有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的蛋白质。
在某些实施方案中，提供分离的RET-胞外域(RET-ECD)多肽。RET-ECD当存在于本公开内容的分离的蛋白质复合物中时可与配体例如GFRAL结合。术语“RET-胞外域”(“RET-ECD”)包括全长RET ECD、RET ECD片段和RET ECD变体。如本文所用，术语“RET ECD”是指缺乏胞内和跨膜结构域含或不含信号肽的RET多肽。在一些实施方案中，RET ECD是指具有以下氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列与具有以下氨基酸序列的人全长RET ECD的氨基酸序列有至少75％同一性的氨基酸序列：
KVALGLYFSRDAYWEKLYVDQAAGTPLLYVHALRDAPEEVPSFRLGQHLYGTYRTRLHENNWICIQEDTGLLYLNRSLDHSSWEKLSVRNRGFPLLTVYLKVFLSPTSLREGECQWPGCARVYFSFFNTSFPACSSLKPRELCFPETRPSFRIRENRPPGTFHQFRLLPVQFLCPNISVAYRLLEGEGLPFRCAPDSLEVSTRWALDREQREKYELVAVCTVHAGAREEVVMVPFPVTVYDEDDSAPTFPAGVDTASAVVEFKRKEDTVVATLRVFDADVVPASGELVRRYTSTLLPGDTWAQQTFRVEHWPNETSVQANGSFVRATVHDYRLVLNRNLSISENRTMQLAVLVNDSDFQGPGAGVLLLHFNVSVLPVSLHLPSTYSLSVSRRARRFAQIGKVCVENCQAFSGINVQYKLHSSGANCSTLGVVTSAEDTSGILFVNDTKALRRPKCAELHYMVVATDQQTSRQAQAQLLVTVEGSYVAEEAGCPLSCAVSKRRLECEECGGLGSPTGRCEWRQGDGKGITRNFSTCSPSTKTCPDGHCDVVETQDINICPQDCLRGSIVGGHEPGEPRGIKAGYGTCNCFPEEEKCFCEPEDIQDPLCDELCR(SEQID NO:27)
在另一个示例性实施方案中，RET ECD是指具有以下氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列与具有以下氨基酸序列的人全长RET ECD的氨基酸序列有至少75％同一性：
LYFSRDAYWEKLYVDQAAGTPLLYVHALRDAPEEVPSFRLGQHLYGTYRTRLHENNWICIQEDTGLLYLNRSLDHSSWEKLSVRNRGFPLLTVYLKVFLSPTSLREGECQWPGCARVYFSFFNTSFPACSSLKPRELCFPETRPSFRIRENRPPGTFHQFRLLPVQFLCPNISVAYRLLEGEGLPFRCAPDSLEVSTRWALDREQREKYELVAVCTVHAGAREEVVMVPFPVTVYDEDDSAPTFPAGVDTASAVVEFKRKEDTVVATLRVFDADVVPASGELVRRYTSTLLPGDTWAQQTFRVEHWPNETSVQANGSFVRATVHDYRLVLNRNLSISENRTMQLAVLVNDSDFQGPGAGVLLLHFNVSVLPVSLHLPSTYSLSVSRRARRFAQIGKVCVENCQAFSGINVQYKLHSSGANCSTLGVVTSAEDTSGILFVNDTKALRRPKCAELHYMVVATDQQTSRQAQAQLLVTVEGSYVAEEAGCPLSCAVSKRRLECEECGGLGSPTGRCEWRQGDGKGITRNFSTCSPSTKTCPDGHCDVVETQDINICPQDCLRGSIVGGHEPGEPRGIKAGYGTCNCFPEEEKCFCEPEDIQDPLCDELCR(SEQ IDNO:28)
本文所用术语“全长RET ECD”，是指延伸至胞外域的最后一个氨基酸且可以包括或不包括N端信号肽的RET ECD。然而，要注意“全长RET ECD”还包括在C端延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸以包括跨膜结构域的氨基酸残基的RET-ECD，条件是该多肽是可溶解的。换句话说，RET ECD缺乏跨膜结构域的足够长度使得它不锚定在细胞膜上。短语“全长RET ECD”还包括在N端延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸以包括信号肽的氨基酸残基的RET-ECD。在某些实施方案中，RET ECD片段是指与图3A-3H所示连续氨基酸序列有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性且在图3A-3H所示RET序列的C端缺乏至少30、33、35、40、45、50或55个氨基酸或更多个氨基酸的连续氨基酸序列。
如本文所用，术语“RET ECD片段”是指在全长ECD的N和/或C端缺失一个或多个残基且保持与GFRAL结合的能力的RET ECD。在某些情况下，RET ECD片段可以包括或不包括N端信号肽。在某些情况下，RET ECD片段是缺乏存在于序列N端的1、5、10、15、16、17、18或19个残基的人RET ECD片段：
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上述示例性RET ECD片段用于实施例所述方法中以产生包含RET蛋白、GFRAL蛋白和GDF15蛋白的复合物的模型。
在RET ECD的备选实施方案中，在SEQ ID NO 27的RET ECD序列中，RET-ECD包含C64R、N75Q、N166Q或C183S突变。
在本公开内容的方法中描述的蛋白质包括含有任何天然存在的GFRAL的连续氨基酸序列的蛋白质，以及具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或以上通常不超过40、30、20、10或5个氨基酸取代的蛋白质，其中取代通常是保守氨基酸取代。短语“保守氨基酸取代”一般是指下列组别内的氨基酸残基的取代：
1)L、I、M、V、F；
2)R、K；
3)F、Y、H、W、R；
4)G、A、T、S；
5)Q、N；和
6)D、E。
在本文公开的肽或蛋白质的情况下，选择保守氨基酸取代使得保持蛋白质的公认活性。这种情况可通过用具有类似于被取代的氨基酸侧链的酸性、碱性、电荷、极性或大小的侧链的氨基酸取代来保持。取代、插入和缺失的指导可基于不同的变异蛋白质或来自不同物种的蛋白质的氨基酸序列的比对。半保守的(.或:)的残基可容许保持电荷、极性和/或大小的改变。例如参见图2E。
本公开内容提供上述多肽的任一种。蛋白质可从天然来源(例如是在其天然存在的环境以外的环境)中分离。主题蛋白质还可在例如遗传修饰的宿主细胞(例如细菌；酵母；昆虫；哺乳动物—鼠、人细胞等)中重组制备，其中遗传修饰的宿主细胞用包含编码主题蛋白质的核苷酸序列的核酸进行遗传修饰。主题蛋白质包括合成多肽，例如主题合成多肽在实验室中化学合成的(例如通过不含细胞的体外合成或化学合成进行)。下面更详细地描述了生产方法。
核酸和蛋白质序列
主题多肽可采用操作不同的GFRAL、RET或GDF15蛋白的核酸的重组技术产生以提供编码目标蛋白质的构建体。应认识到，鉴于遗传密码的知识，氨基酸序列一经提供，普通技术人员将立即认出编码这类氨基酸序列的各种不同核酸。
为了产生来源于天然存在的多肽的主题蛋白质，要注意编码各种不同多肽的核酸是本领域已知的和可获得的。还按以下登记号提供各种GFRAL、RET和GDF15多肽的核酸(和氨基酸序列)：GFRAL：i)人(Homo sapiens)：氨基酸序列NP_997293.2；核苷酸序列：NM_207410.2；ii)小家鼠(Mus musculus)：氨基酸序列NP_995316.2；核苷酸序列NM_205844；iii)褐鼠(Rattus norvegicus)：氨基酸序列：NP_001178927.1；核苷酸序列：NM_001191998.1；iv)食蟹猴(Macaca fascicularis)：氨基酸序列：G7P2W4；v)原鸡(Gallusgallus)：氨基酸序列XP_419904.4；核苷酸序列XM_419904.4。RET：i)人RET51：氨基酸序列：NP_066124.1；核苷酸序列：NM_020975.4；ii)人RET9：氨基酸序列：NP_065681.1；核苷酸序列：NM_020630.4；iii)小家鼠RET51：氨基酸序列：P35546；核苷酸序列：NM_001080780.1；iv)小家鼠RET9：氨基酸序列：P35546-2；核苷酸序列：NM_001080780.1；v)褐鼠RET51：氨基酸序列：NP_036775.2；核苷酸序列：NM_012643.2；vi)褐鼠RET9：氨基酸序列：NP_001103569.1；核苷酸序列：NM_001110099.1；vii)食蟹猴RET51：氨基酸序列：XP_005565094.1；核苷酸序列：XM_005565037.1；viii)食蟹猴RET9：氨基酸序列：XP_005565095.1；核苷酸序列：XM_005565038.1。图2和3分别显示了示例性的GFRAL和RET氨基酸序列。
“生长分化因子15”或“GDF15”，本领域亦称为MIC-1(巨噬细胞抑制性细胞因子-1)、PDF(前列腺分化因子)、PLAB(胎盘骨形态发生蛋白)、NAG-1(非甾体抗炎药物(NSAID)活化基因)、TGF-PL和PTGFB，是转化生长因子β(TGF-β)超家族的成员。GDF15，以62kDa胞内前体蛋白质合成，随后被弗林蛋白酶样蛋白酶切割，作为25kDa二硫键连接的蛋白质分泌(参见例如Fairlie et al.,J.Leukoc.Biol 65:2-5(1999))。GDF15mRNA见于若干组织中，包括肝、肾、胰腺、结肠和胎盘，肝中的GDF15表达在例如肝、肾、心脏和肺等器官损伤时可显著上调。
GDF15前体是308个氨基酸多肽(NCBI Ref.Seq.NP_004855.2；GI:153792495)，含有29个氨基酸信号肽、167个氨基酸前域和被弗林蛋白酶样蛋白酶从前域切离112个氨基酸的成熟结构域。
下面提供前体人GDF15多肽的氨基酸序列：
MPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:25)
308-氨基酸GDF15多肽被称为“全长”GDF15多肽；112-氨基酸GDF15多肽(“全长”GDF15的氨基酸197-308)是“成熟的”GDF15多肽。
本文所用“GDF15”包括与SEQ ID NO:6的氨基酸序列有至少65％同一性的氨基酸序列的蛋白质。下面提供成熟人GDF15多肽的氨基酸序列：
ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:6)
上述示例性的成熟人GDF15用于实施例所述方法中以产生包含GFRAL蛋白和GDF15蛋白的复合物的晶体。
除非另有说明，否则术语“GDF15”是指112个氨基酸的成熟人序列。另外，特定GDF15残基的数字基准是指112个氨基酸的成熟序列(即残基1是Ala(A)，残基112是Ile(I)；参见SEQ ID NO:6)。值得注意的，虽然GDF15前体氨基酸序列预测了3个切割位点，产生3个公认形式的“成熟的”人GDF15(即110、112和115个氨基酸)，但112个氨基酸的成熟序列被公认为是正确的。
在一些实施方案中，GDF15蛋白是同二聚体(例如包含SEQ ID NO:6的两个多肽链每一个)。
GDF15前体是308个氨基酸的多肽(NCBI Ref.Seq.NP_004855.2)，含有29个氨基酸的信号肽、167个氨基酸的前域和被弗林蛋白酶样蛋白酶从前域切离112个氨基酸的成熟结构域。308-氨基酸GDF15多肽被称为“全长”GDF15多肽；112-氨基酸GDF15多肽(参见图1A)是“成熟的”GDF15多肽。除非另有说明，否则术语“GDF15”是指112个氨基酸的成熟序列。另外，特定GDF15残基的数字基准是指112个氨基酸的成熟序列(即残基1是Ala(A)，残基112是Ile(I)；参见图1A)。
本公开内容的范围包括来自其它哺乳动物物种的GDF15直向同源物及其修饰形式及其用途，包括小鼠(NP_035949)、黑猩猩(XP_524157)、猩猩(XP_002828972)、食蟹猴(EHH29815)、大熊猫(XP_002912774)，长臂猿(XP_003275874)、豚鼠(XP_003465238)、白鼬(AER98997)、牛(NP_001193227)、猪(NP_001167527)和狗(XP_541938)。图26显示了这类示例性的GDF15蛋白，其包括各种示例性的GDF15蛋白的比对。人GDF15的成熟形式与鼠直向同源物有约67％氨基酸同一性。
应认识到，编码蛋白质的核苷酸序列可被修饰以使得密码子选择优化以促进在目标宿主细胞(例如大肠杆菌(Escherichia coli)等)中表达。产生密码子优化序列的方法是本领域已知的。
蛋白质修饰
本公开内容使用的蛋白质可作为相对于天然存在的蛋白质被修饰的蛋白质提供。修饰的目的可以是为经配制用于治疗的蛋白质增加所需要的性质(例如血清半寿期)、产生用于检测测定法和/或用于蛋白质纯化的抗体，等等。
修饰主题蛋白质的一种方法是使一个或多个其它元件在蛋白质例如另一种蛋白质(例如具有与主题蛋白质异源的氨基酸序列)的N端和/或C端和/或载体分子缀合(例如连接)。因此，示例性的蛋白质可作为与来源于免疫球蛋白Fc多肽的多肽的融合蛋白提供。
对蛋白质的缀合修饰可产生保持所需活性，同时开发缀合物的第二分子的性质赋予和/或提供某些性质(例如治疗应用所需性质)的蛋白质。例如，可使多肽与某一分子缀合，例如以提高溶解度、贮存、半寿期、免疫原性降低、组织或其它身体部位(例如血液或其它具体器官等)中的控制释放。
缀合的蛋白质的其它特征可包括其中相对于非缀合的蛋白质所述缀合物降低毒性的特征。另一个特征是缀合物可比与未缀合的物质更有效地靶向细胞或器官的某一类型。蛋白质可任选与药物连接以进一步对抗与代谢障碍有关的原因或作用(例如用于肌肉萎缩的药物)，和/或可任选被修饰以提供改进的药代动力学概况(例如通过聚乙二醇化、高糖基化等)。
当主题蛋白质是包含GFRAL或GDF15或RET多肽和异源融合配偶体多肽的融合蛋白时，主题融合蛋白可具有相当于GFRAL或GDF15或RET多肽和异源融合配偶体多肽和接头(如存在的话)的总和的总长度。示例性GDF15融合蛋白显示于图1B(Fc融合物)和图1C(人血清白蛋白融合物)中。
用来修饰本公开内容的多肽序列的任一种前述组分和分子可任选通过接头缀合。合适的接头包括“柔性接头”，其通常足够长以允许在修饰的多肽序列和连接的组分和分子之间有一些移动。接头分子长可为约6-50个原子。接头分子也可以是例如芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇低聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。合适的接头可容易地选择并且可以是任何合适的长度，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50个氨基酸。
示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如(GmSo)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:52)、(GmSoGm)n、(GmSoGmSoGm)n(SEQ ID NO:53)、(GSGGSm)n(SEQ ID NO:54)、(GSGSmG)n(SEQ ID NO:55)和(GGGSm)n(SEQ ID NO:56)及其组合，其中m、n和o各自独立地选自至少1-20的整数，例如1-18、2-16、3-14、4-12、5-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)，以及其它柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可用作组分之间的中性系链。示例性柔性接头包括但不限于GGSG(SEQ ID NO:57)、GGSGG(SEQ ID NO:58)、GSGSG(SEQ ID NO:59)、GSGGG(SEQ ID NO:60)、GGGSG(SEQ ID NO:61)和GSSSG(SEQ ID NO:62)。
其它的柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n或甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:63)、(GGGS)n(SEQ ID NO:64)和(GGGGS)n(SEQ ID NO:65)，其中n＝1-50，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50。示例性柔性接头包括但不限于GGGS(SEQ ID NO:66)、GGGGS(SEQ ID NO:67)、GGSG(SEQ ID NO:57)、GGSGG(SEQ ID NO:58)、GSGSG(SEQ ID NO:59)、GSGGG(SEQ ID NO:60)、GGGSG(SEQ ID NO:61)和GSSSG(SEQ ID NO:62)。这些接头序列的多聚体(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30或30-50个)可连接在一起提供可用来使异源氨基酸序列与本文公开的多肽缀合的柔性接头。如本文所述，异源氨基酸序列可以是信号序列和/或融合配偶体，例如白蛋白、Fc序列等。
生产方法
可通过任何合适的方法，包括重组和非重组方法(例如化学合成)生产本公开内容的蛋白质。在多肽经化学合成时，合成可通过液相或固相进行。固相合成(SPPS)允许掺入非天然的氨基酸和/或肽/蛋白质主链修饰。各种形式的SPPS，例如Fmoc和Boc，可用于合成本公开内容的肽。化学合成的详情在本领域是已知的(例如Ganesan A.2006Mini Rev.MedChem.6:3-10and Camarero JA et al.2005Protein Pept Lett.12:723-8)。简单地说，小的不溶性多孔珠粒用肽链在其上构建的功能单元处理。在偶联/脱保护的重复循环后，所连接的固相的游离N端胺与单一N-被保护的氨基酸单元偶联。然后使这个单元脱保护，露出另外的氨基酸可与之连接的新的N端胺。肽在固相上保持固定，并在切除前进行过滤步骤。
在蛋白质采用重组技术生产时，蛋白质可作为胞内蛋白质或作为分泌的蛋白质，采用任何合适的构建体和任何合适的宿主细胞，其分别可为原核或真核细胞，例如细菌(例如大肠杆菌)或酵母宿主细胞来生产。
可用作宿主细胞的真核细胞的其它实例包括昆虫细胞、哺乳动物细胞和/或植物细胞。在使用哺乳动物宿主细胞时，细胞可包括以下的一种或多种：人细胞(例如HeLa、293、H9和Jurkat细胞)；小鼠细胞(例如NIH3T3、L细胞和C127细胞)；灵长类动物细胞(例如Cos1、Cos 7和CV1)和仓鼠细胞(例如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞)。
可按照本领域已知的标准方法使用适于主题蛋白质表达的各种宿主-载体系统。参见例如Sambrook et al.1989Current Protocols in Molecular Biology Cold SpringHarbor Press,New York和Ausubel et al.1995Current Protocols in MolecularBiology,Eds.Wiley and Sons。
将遗传物质导入宿主细胞的方法包括例如转化、电穿孔、缀合、磷酸钙方法等。可选择转移的方法以提供导入的GFRAL和/或RET编码核酸的稳定表达。多肽编码核酸可作为可遗传的附加型元件(例如质粒)提供或可被基因组整合。用于目标多肽生产的多种合适载体是市购可获得的。
载体可提供在宿主细胞中的染色体外维持或可供整合进入宿主细胞基因组中。表达载体提供转录和翻译调节序列，并可提供诱导型或组成型表达，其中编码区在转录起始区及转录和翻译终止区的转录控制下有效连接。一般而言，转录和翻译调节序列可包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列及增强子或激活剂序列。启动子可以是组成型或诱导型的，并且可以是强组成型启动子(例如T7、CMV等)。在某些实施方案中，本公开内容的蛋白质可从异源启动子与核酸序列编码蛋白质有效连接的核酸构建体表达。
表达构建体通常具有位于启动子序列附近的合适的限制位点以供插入编码目标蛋白质的核酸序列。在表达宿主中有效的可选择标记可以存在以促进含有载体的细胞的选择。另外，表达构建可包括其它元件。例如，表达载体可具有一个或两个复制系统，因此允许它保留在生物体(例如哺乳动物或昆虫细胞)中以表达和保留在原核宿主用于克隆和扩增。另外，表达构建可含有选择标记基因以供选择转化的宿主细胞。可选择的基因是本领域众所周知的，将随所使用的宿主细胞而变化。
蛋白质的分离和纯化可按照本领域已知方法实现。例如，可通过免疫亲和纯化，将蛋白质可以从经遗传修饰组成型和/或在诱导时表达蛋白质的细胞的裂解物或从合成反应混合物中分离，这通常包括使样品与抗蛋白质抗体接触，洗涤除去非特异性结合的物质，洗脱特异性结合的蛋白质。分离的蛋白质可通过透析和通常用于蛋白质纯化方法中的其它方法进一步纯化。在一个实施方案中，蛋白质可采用金属螯合层析方法分离。本公开内容的蛋白质可含有如上所述促进分离的修饰。
可以按基本上纯的或分离的形式(例如没有其它多肽)分离主题蛋白质。蛋白质可存在于相对于可能存在的其它组分(例如其它多肽或其它宿主细胞组分)富集了肽的组合物中。可提供纯化的蛋白质，使得蛋白质存在于基本上没有其它表达的蛋白质的组合物，例如小于90％、通常小于60％和更通常小于50％的组合物构成其它表达的蛋白质。
重组细胞
如上所述，公开了经遗传修饰表达GFRAL蛋白的重组细胞。如上所述，由细胞表达的GFRAL蛋白可以是图1C-1E所示的全长GFRAL蛋白或其变体或片段。例如，GFRAL蛋白可缺乏存在于天然GFRAL中的胞内域和/或可包括异源信号序列。重组细胞可内源地表达RET和/或可经遗传修饰表达RET。
在某些情况下，重组细胞可包括包含与编码报道分子的核酸序列有效连接的启动子序列的报道分子构建体，其中启动子通过GDF15蛋白与GFRAL结合在RET激活时指导报道分子的表达。
在某些实施方案中，重组细胞可包括转录激活剂，例如Elk蛋白或其可以被激活的RET磷酸化的功能活性片段片段。当结合与编码报道分子的核酸序列有效连接的启动子时，磷酸化Elk可诱导报道分子转录，而不被磷酸化的Elk不能够诱导转录。Elk蛋白可与异源蛋白质的DNA结合结构域(DBD)融合，异源蛋白质例如与GAL4上游激活性序列(GAL4-UAS)特异性结合的GAL4DBD。在某些实施方案中，报道分子构建体的启动子序列可包括GAL4-UAS。在某些实施方案中，通过GFRAL与GDF15结合激活RET可导致通过被激活的RET的磷酸化激活Elk。在某些实施方案中，磷酸化Elk当通过GAL4DBD与GAL4-UAS结合时可介导报道分子的转录。
许多报道分子构建体可用于检测RET活化。例如，报道分子序列可编码是直接或间接可检测的报道蛋白质。例如，报道分子可以是荧光蛋白、酶或可使用抗体检测的蛋白质。
重组细胞可包括包括指导Elk-GAL4蛋白表达的启动子序列的质粒或稳定整合的核酸。启动子可以是组成型或诱导型启动子。在某些实施方案中，在不存在RET活化时，Elk-GAL4蛋白不会有效地被磷酸化，并且不会激活与GAL4-UAS启动子序列有效连接的报道分子的转录。
本文公开的重组细胞可用于鉴定与GFRAL的胞外域结合的药剂。在其它实施方案中，表达GFRAL和RET的重组细胞可用来鉴定与GFRAL结合并导致RET活化的药剂。另外，经遗传修饰表达GFRAL和RET的重组细胞可用来鉴定调节GFRAL和RET之间结合的药剂。下面论述了鉴定这类药剂的方法。
本文还公开了包括本文所述重组细胞和分离的GDF15蛋白的组合物。如下文所述，这类组合物可用于筛选方法以鉴定GFRAL-GDF15受体-配体复合物的调节剂。
筛选方法
公开了使用本文所述分离的蛋白质复合物和/或本文所述重组细胞用于鉴定与GFRAL的胞外域结合的药剂的方法。
用于筛选的目标候选药剂包括多种化学类别(主要为有机分子)的生物活性剂，然而在某些情况下，包括无机分子、有机金属分子、免疫球蛋白、基因序列等。同样有价值的是小有机分子，其包含与蛋白质结构性相互作用所需的官能团，特别是氢键结合，且通常包括至少一个胺、羰基、羟基或羧基，通常官能化学基团的至少两个。候选药剂常常包含被一个或多个上述官能团取代的环状的碳或杂环结构和/或芳族或多芳族结构。候选药剂还存在于生物分子中，包括肽、多核苷酸、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或其组合。
化合物可获自多种来源，包括合成或天然化合物的文库。例如，可获得多种有机化合物(包括生物分子)的随机和定向合成，包括随机化寡核苷酸和寡肽的表达的多种方法。或者，呈细菌、真菌、植物和动物提取物的形式的天然化合物的文库是可获得的或容易地生产。另外，天然或合成产生的文库和化合物容易通过常规的化学、物理和生物化学方法修饰，并且可用来生产组合文库。已知的药剂可以是经过定向或随机化学修饰，例如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等以产生结构类似物。
多种测定法可以不同的浓度平行进行以获得对不同浓度的反应。如本领域已知的，测定药剂的有效浓度通常使用产生于1:10或其它对数尺度的稀释液的各种浓度。需要时，浓度可以用第二系列的稀释液进一步细化。通常，这些浓度之一用作阳性对照，即在零浓度下或药剂检测水平以下。
在某些实施方案中，公开了鉴定与GFRAL的胞外域结合的药剂的方法。所述方法可包括测定候选药剂与GFRAL的胞外域结合，其中结合GFRAL的候选药剂被鉴定为与GFRAL结合的药剂，同时将候选药剂的结合与GDF15与GFRAL的胞外域的结合进行比较。
在某些情况下，其含有GFRAL或ECD的片段可在细胞表面上表达。在其它情况下，其含有GFRAL或ECD的片段可固定在支持物上。在其它情况下，在细胞表面表达的表达其含有GFRAL或ECD的片段的细胞可固定在支持物上。测定可包括将细胞和/或支持物与候选药剂接触，测定候选药剂是否与GFRAL的胞外域结合。可采用测定结合的任何标准技术。例如，候选药剂可被标记，在洗涤除去非特异性结合物后，标记保留在细胞或固体支持物上可表示候选药剂与GFRAL的胞外域结合。如上所述，可将结合与在类似条件下GDF15的结合进行比较，其中以类似于GDF15的亲和力结合GFRAL的胞外域的候选药剂可被鉴定为候选药剂。
在某些情况下，测定可包括使在细胞表面表达GFRAL的重组细胞与候选药剂接触，其中重组细胞可经遗传修饰表达RET。重组细胞还可包括含有与编码报道分子的核酸序列有效连接的启动子序列的报道分子构建体，其中启动子在RET激活时指导报道分子表达，且其中所述方法包括测定报道分子的表达，其中与阴性对照相比报道分子的表达增加鉴定该药剂为与GFRAL结合并激活RET的药剂。
在某些情况下，可将使重组细胞与候选药剂接触时报道分子的表达与在单独的测定中在使重组细胞与GDF15接触时报道基因的表达进行比较，这可与筛选方法平行进行。在某些情况下，以类似于被GDF15诱导的水平诱导报道分子表达的候选药剂被鉴定为与GFRAL结合并激活RET的药剂。
本文还提供鉴定调节GDF15与GFRAL结合的药剂的方法。在某些实施方案中，所述方法可包括使候选药剂与经遗传修饰表达GFRAL的重组细胞接触，其中所述接触在GDF15存在下；测定GDF15与GFRAL结合的水平；其中在药剂存在时GDF15与GFRAL结合的水平与在药剂不存在时GDF15与GFRAL结合的水平相比较的变化鉴定药剂GDF15与GFRAL结合的调节剂。
在某些实施方案中，GDF15可被可检测地标记，且在候选药剂存在下与重组细胞结合的标记的量的降低可鉴定其为与GDF15竞争结合GFRAL的药剂。在备选的实施方案中，候选药剂可被可检测地标记，且所述测定可包括在可以是未标记的GDF15存在下测定与GFRAL结合的候选药剂。
在某些情况下，如上所述，用于在GDF15存在下筛选的重组细胞可经遗传修饰表达RET，并包括含有与编码报道分子的核酸序列有效连接的启动子序列的报道分子构建体，其中启动子在RET激活时指导报道分子表达，其中所述测定包含测定报道分子的表达，其中报道分子的表达与在药剂不存在时的表达相比较的变化鉴定药剂为调节GDF15与GFRAL结合的药剂。
在某些情况下，药剂可抑制GDF15与GFRAL结合，并可鉴定为GDF15-GFRAL结合的拮抗剂。在其它情况下，药剂可增加GDF15与GFRAL的结合，并可鉴定为GDF15-GFRAL结合的激动剂。
在某些实施方案中，药剂可与GDF15竞争结合GFRAL。在某些情况下，药剂当与GFRAL结合时可导致RET的活化和报道分子表达。
本文还提供鉴定调节GFRAL和RET之间的结合的药剂的测定法。所述测定法可包括使经遗传工程改造在细胞表面表达GFRAL和RET的重组细胞与候选药剂接触，评价GFRAL和RET之间的结合。在某些情况下，GFRAL和RET之间的结合在药剂存在下与阳性对照相比较可增加或减少，这可鉴定药剂为GFRAL和RET结合的调节剂。GFRAL和RET之间的结合可以采用评价蛋白质-蛋白质结合的标准方法进行评价。
评价蛋白质-蛋白质结合的示例性方法包括免疫沉淀、免疫染色、生物发光共振能量转移(BRET)、荧光共振能量转移(FRET)、TR-FRET(时间分辨FRET)或HTRF(均相时间分辨荧光)。
如本文所述，一种或多种蛋白质，例如GFRAL、RET和GDF15可与异源序列例如标签(例如聚组氨酸标签、谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签、FLAG标签、HA标签、Fc标签、HSA标签等)；荧光蛋白(GFP、YFP、RFP等)、生物发光蛋白(例如萤光素酶)缀合。
在某些实施方案中，结合对(例如蛋白质对)的成员之间的结合或药剂(非蛋白质药剂)与蛋白质间的结合可使用FRET或BRET评价。例如，结合对的一个成员可与第一荧光团(例如CFP)或生物发光蛋白(例如萤光素酶)缀合，另一成员可与第二荧光团(例如YFP)缀合。
组合物
本公开内容提供包含主题蛋白质的组合物，可将其给予需要治疗或预防非刻意体重减轻或需要降低GDF15活性的对象。在某些情况下，组合物可包括本文所述的多肽，例如GFRAL ECD、GFRAL ECD片段、GFRAL ECD变体或其组合。
本公开内容的多肽可为适于给予对象的组合物的形式。一般而言，这类组合物是“药物组合物”，包含一种或多种多肽和一种或多种药学上可接受的或生理学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。在某些实施方案中，多肽以治疗有效量存在。药物组合物可用于本公开内容的方法；因此，例如，药物组合物可以离体或体内给予对象以实践本文所述的治疗和预防方法及用途。
可配制本公开内容的药物组合物与预期的方法或给药途径相容；本文列出了示例性给药途径。此外，药物组合物可与其它治疗活性剂或化合物(例如食欲增强剂)联用以治疗或预防本公开内容预期的疾病、病症和病况。
药物组合物通常包含治疗有效量的本公开内容预期的至少一种多肽和一种或多种药学上和生理学上可接受的制剂。合适的药学上可接受的或生理学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂包括但不限于抗氧化剂(例如抗坏血酸和硫酸氢钠)、防腐剂(例如苯甲醇、羟苯甲酯、对羟苯甲酸乙酯或正丙酯)、乳化剂、助悬剂、分散剂、溶剂、填充剂、增量剂(bulking agent)、去垢剂、缓冲剂、溶媒、稀释剂和/或助剂。例如，对于胃肠外给药，合适的溶媒可以是生理盐水溶液或柠檬酸盐缓冲盐水，可能补充了药物组合物中常见的其它材料用于胃肠外给药。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是更多的示例性溶媒。本领域技术人员将容易地识别可以用于药物组合物和剂型的各种缓冲剂。典型的缓冲剂包括但不限于药学上可接受的弱酸、弱碱或其混合物。例如，缓冲剂组分也包括水溶性材料如磷酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、谷氨酸及其盐。可接受的缓冲剂包括例如Tris缓冲剂、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N'-(2-乙烷磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)和N-三[羟基甲基]甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)。
在配制药物组合物后，可将其保存在为溶液剂、混悬剂、凝胶剂、乳液剂、固体制剂或脱水或冻干的粉针剂贮存于无菌小瓶中。这类制剂可以即用形式、冻干形式(临用前需要复溶)、液体形式(临用前需要稀释)或其他可接受的形式贮存。在一些实施方式中，药物组合物在一次用容器(例如一次用小瓶、安瓿、注射器或自我注射器(类似于例如))中提供，而在其它的实施方案中提供多次使用容器(例如多次使用小瓶)。任何药物递送器可用于递送多肽和其他药剂，包括植入物(例如可植入泵)和导管系统，它们两者都为技术人员熟知。贮库注射剂(depot injection)(一般皮下或肌内给予)也可以用于在一段规定的时间内释放本文公开的多肽。贮库注射剂通常是固体或油基的，并且通常包含本文所列制剂组分中的至少一种。技术人员熟悉贮库注射剂的可能配方和用途。
药物组合物可以呈无菌的注射用水性或油性混悬剂的形式。这种混悬剂可以采用已知技术使用本文提及的合适分散剂或润湿剂和助悬剂进行配制。无菌注射制剂也可是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射用溶液剂或混悬剂，例如，作为1,3-丁二醇中的溶液剂。可以使用的可接受的稀释剂、溶剂和分散介质包括水、林格氏液(Ringer’s solution)、等渗氯化钠溶液、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲的盐水(PBS)、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其合适的混合物。另外，无菌固定油按照惯例用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸(例如油酸)可用于制备注射剂。特定注射用制剂的延长吸收可以通过包括延长吸收的药剂(例如单硬脂酸铝或明胶)来实现。
含有活性剂(例如本公开内容的多肽)的药物组合物可呈适合于口服使用的形式，例如，作为片剂、胶囊剂、锭剂、糖锭、水性或油性混悬剂、可分散性粉剂或颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊剂、或糖浆剂、溶液剂、微珠剂或酏剂。可以按照药物组合物制备领域已知的任何方法制备预期用于口服使用的药物组合物，且这类组合物可以含有一种或多种作用剂，如甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂，以提供药物学精美且适口的制剂。片剂、胶囊剂等含有活性成分以及适于片剂制备的无毒的药学上可接受的赋形剂。这些赋形剂可以是例如稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
适于口服给药的片剂、胶囊剂等可以是未包衣的或可以通过已知技术包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供持续作用。例如，可以使用时间延迟材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它们还可以通过本领域已知技术包衣以形成用于控制释放的渗透性治疗片剂。其它作用剂包括生物可降解或生物相容性颗粒或聚合物质，例如聚酯、聚胺酸、水凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚酐、聚乙醇酸、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白或丙交酯/乙交酯共聚物、聚丙交酯-乙交酯共聚物或乙烯乙酸乙烯酯共聚物，以控制所给予的组合物的递送。例如，可通过凝聚技术或通过界面聚合，将口服药剂包封在通过分别使用羟甲基纤维素或明胶-微胶囊或聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)制备的微胶囊剂中，或包封在胶体药物递送系统中。胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球体、微珠和脂质基系统，其包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。制备脂质体的方法描述于例如美国专利号4,235,871、4,501,728和4,837,028。上述制剂的制备方法对于本领域技术人员将是显而易见的。
口服使用的制剂也可以作为硬明胶胶囊剂存在，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙、高岭土或微晶纤维素)混合；或者为软明胶胶囊剂存在，其中活性成分与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
水性混悬剂含有活性材料以及与之混合的适于其制备的赋形剂。这类赋形剂是助悬剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂(例如卵磷脂)、或环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、或环氧乙烷与长链脂肪族醇的缩合产物(例如十七碳乙烯氧基十六烷醇)、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。水性混悬剂也可以含有一种或多种防腐剂。
油性混悬剂可以通过将活性成分悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)中或在矿物油(例如液体石蜡)中来配制。油性混悬剂可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。也可添加甜味剂(例如如上文列出的那些)和矫味剂以提供适口的口服制剂。
适于通过加水制备水性混悬剂的可分散粉剂和颗粒剂提供活性成分及与其混合的分散剂或润湿剂、助悬剂和一种或多种防腐剂。本文列举了合适的分散剂或润湿剂和助悬剂。
本公开内容的药物组合物也可以呈水包油乳液的形式。油相可以是植物油(例如橄榄油或花生油)或矿物油(例如液体石蜡)或其混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或西黄蓍胶；天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂和衍生自脂肪酸的酯或偏酯；己糖醇酐，例如脱水山梨糖醇单油酸酯；以及偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。
制剂也可以包括载体以保护组合物免于体内快速降解或消除，例如控释制剂，包括植入物、脂质体、水凝胶、前药和微胶囊化递送系统。例如，时间延迟材料(例如单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯)可以单独使用或者与蜡混合使用。
本公开内容预期给予用于直肠给药的呈栓剂形式的多肽。栓剂可以通过将药物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，其在常温下是固体但在直肠温度下是液体，因此将在直肠内融化以释放药物。这类材料包括但不限于可可脂和聚乙二醇。
本公开内容预期的可以呈目前已知的或未来开发的任何其它合适的药物组合物的形式(例如鼻用或吸入用喷雾剂)。
制剂中多肽或其片段的浓度可大大变化(例如以重量计小于约0.1％，通常在约2％或至少约2％至多达20％-50％或更高)，并且通常主要根据流体体积、粘度和基于对象的因素以及例如所选的具体给药方式来选择。
本文考虑了Nano Precision Medical的贮库递送技术(Nano PrecisionMedical；Emeryville,CA)的应用。该技术采用了二氧化钛纳米管膜(titania nanotubemembrane)，该膜产生大分子(如蛋白质和肽治疗剂)的零级释放速率。生物相容性膜被封装在小的皮下植入物中，该植入物提供治疗性大分子的长期(例如长达1年)的恒速递送。该技术目前正在对用于治疗II型糖尿病GLP-1激动剂的递送进行评价。在某些实施方案中，本文公开的多肽可以是含膜制剂。例如，可将多肽浸入膜中或用膜包围。膜可以呈圆盘、管或球的形状。在某些实施方案中，管可以是纳米管或球可以是纳米球。
主题药物组合物可包括GFRAL、GFRAL胞外域或可溶性GFRAL-ECD多肽和药学上可接受的赋形剂。
患者群
本公开内容提供治疗患有非刻意体重减轻的患者的方法。合适的患者的实例可以是诊断为患有消耗病或恶病质的患者。合适的患者包括患有肝硬化、甲状腺功能亢进、慢性肾病、帕金森病、癌症、进食障碍(例如神经性厌食症)、慢性炎性疾病(例如类风湿性关节炎)、脓毒症或全身性炎症的其它形式、慢性阻塞性肺病、AIDS、结核病和肌肉消耗(例如肌肉萎缩或多发性硬化)或肌肉衰减综合征的患者。
本公开内容还提供预防由于以下疾病可能有非刻意体重减轻风险的患者的非刻意体重减轻的方法：慢性疾病例如肝硬化、甲状腺功能亢进、慢性肾病、帕金森病、癌症、进食障碍(例如神经性厌食症)、慢性炎性疾病(例如类风湿性关节炎)、脓毒症或全身性炎症的其它形式、慢性阻塞性肺病、AIDS、结核病和肌肉消耗(例如肌肉萎缩或多发性硬化)或肌肉衰减综合征。这类患者可包括GDF15水平升高、正在进行癌症等治疗的患者。
本公开内容提供治疗患有恶病质的患者的方法。合适的患者的实例可以是诊断为恶病质的患者。本公开内容还提供预防由于恶病质发生可能有非刻意体重减轻风险的患者的非刻意体重减轻的方法。这类患者包括GDF15水平升高、患有癌症、正在进行癌症治疗、患有进食障碍等的患者。
还公开了降低GDF15活性升高的患者的GDF15活性的方法。如本文所用，“GDF15活性升高”是指与正常对象相比对象生物流体中GDF15的活性或量增加。多种病况与GDF15血清水平升高有关，其中GDF15升高导致许多症状例如食欲不振、体重减轻等。与GDF15血清水平升高的病况的实例包括癌症，例如黑素瘤、胃癌、胰腺癌、前列腺癌；自身免疫性疾病例如关节炎和炎症；心血管疾病像动脉粥样硬化、心力衰竭、高血压、心肌梗死、胸痛和心血管事件；代谢疾病像贫血、恶病质、厌食症、肾病以及地中海贫血等。
患有任何上述病症的患者可以是接受结合GFRAL蛋白的胞外域的药剂或包括GFRAL胞外域的GFRAL的片段(例如可溶性GFRAL ECD)或药剂和GFRAL片段的组合的合适的候选人。
在这类个体中给予主题GFRAL蛋白片段，例如GFRAL ECD、GFRAL ECD片段和/或GFRAL ECD变体可降低或预防与所述病症有关的一种或多种症状。例如，给予本公开内容的蛋白质可增加对象的体重和/或食欲。
方法
主题方法包括将主题蛋白质给予存在非刻意体重减轻或有发生非刻意体重减轻的风险的患者。主题方法包括将本文公开的蛋白质给予GDF15血清水平升高的对象。本文公开的方法包括给予以下之一：结合GFRAL蛋白的胞外域的药剂；和包括GFRAL胞外域的GFRAL的片段，例如可溶性GFRAL-ECD。
在某些情况下，药剂可以是与GDF15竞争结合的抗GFRAL抗体。在某些情况下，药剂可以是与GFRAL蛋白的胞外域结合但不激活RET的药剂。例如，药剂可以是在与GFRAL结合时与GDF15竞争结合但不激活RET的抗GFRAL抗体。这类抗体可如下产生：通过用GFRAL ECD使实验室动物敏化，在本文所述GFRAL结合测定法和/或GFRAL信号转导测定法中筛选所产生的抗体。可采用标准方法，对这类抗GFRAL抗体进行修饰以产生嵌合或人源化抗体。
在某些情况下，给予患有恶病质或有发生恶病质的风险的患者的GFRAL的片段可以是本文所述GFRAL ECD、GFRAL ECD片段和/或GFRAL ECD变体。
考虑了患有、疑似患有或有发生恶病质的风险的对象适于本文所述疗法。
在本公开内容的方法中，可向对象(例如人类患者)给予本文所述蛋白质组合物以例如达到目标体重和/或维持体重；达到目标体重指数(BMI)和/或维持BMI；增加食欲等。正常成人具有范围为18.5-24.9Kg/m2的BMI。
主题治疗方法可增加患者的体重、BMI、肌肉重量和/或食物摄取达至少约5％，例如10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高。
在某些情况下，药剂可以是通过GFRAL结合剂的筛选方法(例如本文公开的筛选方法)鉴定的药剂。
与治疗或预防本文预期的恶病质有关的方法包括例如单独或与其它类型的疗法组合使用用于治疗/预防的上述蛋白质。所述方法包括给予对象主题蛋白质(例如皮下、皮内或静脉内)。
在一些实施方案中，将药剂给予经历肌肉质量丢失(例如与基础疾病有关的肌肉质量丢失)的患者。与恶病质有关的基础疾病包括但不限于癌症、慢性肾病、慢性阻塞性肺病、AIDS、结核病、慢性炎性疾病、脓毒症和全身性炎症的其它形式，例如肌肉萎缩等肌肉消耗和称为神经性厌食症的进食障碍。在一些实施方案中，药剂抑制瘦肉质量(例如肌肉质量)和或脂肪丢失达至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％。
在一些实施方案中，瘦肉质量(例如肌肉质量)丢失伴有脂肪质量丢失。在一些实施方案中，药剂可抑制脂肪质量丢失达至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％。
在一些实施方案中，将药剂给予诊断为体重减轻(例如非刻意体重减轻)的患者。在一些实施方案中，药剂可逆转体重减轻(例如非刻意体重减轻)达至少2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％或35％。
在一些实施方案中，将药剂给予诊断为器官质量丢失(例如与基础疾病有关的器官质量丢失)的患者。与恶病质有关的基础疾病包括但不限于癌症、慢性肾病、慢性阻塞性肺病、AIDS、结核病、慢性炎性疾病、脓毒症和全身性炎症的其它形式，例如肌肉萎缩等肌肉消耗和称为神经性厌食症的进食障碍。在一些实施方案中，药剂可抑制器官质量丢失达至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，器官质量丢失见于心脏、肝、肾和/或脾。在一些实施方案中，器官质量丢失伴有肌肉质量丢失、脂肪质量丢失和/或非刻意体重减轻。
肌肉衰减综合征、肌肉消耗病症和明显的肌肉体重减轻可发生不存在恶病质、食欲不振或体重减轻时。在一些实施方案中，药剂可用于治疗诊断为肌肉衰减综合征、肌肉消耗病症和/或明显肌肉体重减轻的对象，不论对象是否患有或曾诊断为恶病质或食欲不振。这类方法包括给予有需要的对象治疗有效量的一种或多种药剂。
在一些实施方案中，将药剂给予诊断为肥胖症的患者。在一些实施方案中，药剂可抑制体重增加或减轻体重达至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。使用药剂治疗患者的肥胖症包括给予患者治疗有效量的药剂。
给药途径
本公开内容预期以任何合适的方式给予所公开的多肽及其组合物。合适的给药途径包括胃肠外(例如肌内、静脉内、皮下(例如注射或植入)、腹膜内、脑池内、关节内、腹膜内、大脑内(实质内)和脑室内)、口服、经鼻、阴道、舌下、眼内、直肠、局部(例如经皮)、舌下和吸入。
贮库注射剂，一般经皮下或肌内给予，也可以用于在规定的一段时间内释放本文公开的多肽。贮库注射剂通常是基于固体或油的，通常包含本文所列出的制剂组分中的至少一种。技术人员熟悉贮库注射剂的可能配方和用途。
至于抗体，在示例性实施方案中，将本公开内容的抗体或抗体片段以10mg/ml保存在4℃下的注射用无菌等渗水性盐水溶液中，并在给予对象之前稀释于100ml或200ml注射用0.9％氯化钠中。以0.2和10mg/kg间的剂量在1小时进程内通过静脉内输注给予抗体。在其它实施方案中，在15分钟和2小时的一段时间内通过静脉内输注给予抗体。在另外的其它实施方案中，给药方法是通过皮下推注。
本公开内容考虑了这样的方法，其中将本公开内容的多肽或抗体或抗体片段给予对象至少每日两次、至少每日一次、至少每48小时一次、至少每72小时一次、至少每周一次、至少每2周一次、至少每月一次、至少每2个月一次或至少每3个月一次或更不频繁。
组合疗法
定向治疗或预防恶病质的多种疗法的任一种可与含主题蛋白质的组合物或治疗方法组合。
本文所用的“组合”欲包括可单独给予的疗法，例如单独配制用于单独给药(例如可以在药盒中提供)，以及用于以单一制剂给药(即“共配制的”)。可在组合疗法中提供的药剂的实例包括结合GFRAL蛋白的胞外域和与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的药剂，例如，与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的抗体。示例性组合疗法可包括给予抗GFRAL ECD抗体和包括GFRAL胞外域的GFRAL的片段，例如可溶性GFRAL-ECD。
当GFRAL-ECD蛋白与一种或多种其它疗法组合给予时，可以大致同时在给予主题蛋白质之前或之后多达5小时或以上，例如10小时、15小时、20小时或以上给予组合疗法。在某些实施方案中，主题蛋白质和其它治疗介入序贯给予或施用，例如其中主题蛋白质在另一种治疗性治疗之前或之后给予。在另外的其它实施方案中，主题蛋白质和其它疗法同时给予，例如其中主题蛋白质和第二疗法在同一时间给予，例如当第二疗法是药物时，它可与主题蛋白质一起作为两种单独的制剂或组合成为给予对象的单一组合物给予。不论是否如上所述序贯或同时给药，出于本公开内容的目的，所述治疗被视为共同或组合给予。
涉及恶病质的细胞因子包括激活素A和IL-6。激活素水平升高与癌症相关恶病质和性腺肿瘤有关。参见例如Marino et al.(2013)CYTOKINE&GROWTH FACTOR REV.24:477-484。激活素A是TGF-β家族的成员，并且是激活素2型受体ActRIIB的配体。参见例如Zhou etal.(2010)CELL 142:531-543。已表明IL-6的循环水平与癌症患者体重减轻以及与生存其缩短有关。参见例如Fearon et al.(2012)CELL METABOLISM 16:153-166。
因此，在一些实施方案中，激活素-A或激活素-A受体ActRIIB、IL-6或IL-6受体(IL-6R)的一种或多种抑制剂可与结合GFRAL蛋白的胞外域和/或与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的药剂(例如与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的抗体)组合给予(例如与之同时给予、在之前给予或在之后给予)。激活素A或ActRIIB的示例性抑制剂，包括例如抗激活素-A抗体或其抗原结合片段、抗ActRIIB抗体或其抗原结合片段、激活素-A的小分子抑制剂、ActRIIB的小分子抑制剂和ActRIIB的“诱杀型”受体('decoy'receptor)例如可溶性ActRIIB受体和可溶性ActRIIB受体与Fc分子的融合物(ActRIIB-Fc)。参见例如Zhou et al.(2010)，同上。IL-6或IL-6R的合适抑制剂，包括抗IL-6抗体或其抗原结合片段、抗IL-6R抗体或其抗原结合片段、IL-6的小分子抑制剂、IL-6R的小分子抑制剂和IL-6R的“诱杀型”受体例如可溶性IL-6受体和可溶性IL-6受体与Fc分子的融合物(IL6R-Fc)。参见例如Enomoto et al.(2004)BlOCHEM.AND BIOPHYS.RES.COMM.323:1096-1 102；Argiles et al.(2011)EUR.J.PHARMACOL.668:S81-S86；Tuca et al.(2013)ONCOLOGY/HEMATOLOGY 88:625-636。IL-6或IL-6R的合适抑制剂可包括例如托珠单抗(Hoffmann-LaRoche)，一种经批准用于治疗类风湿性关节炎的人源化抗IL-6R单克隆抗体；Sarilumab/REGN88(Regeneron)，一种在临床开发中用于治疗类风湿性关节炎的人源化抗IL6R抗体；和Selumetinib/AZD6244(AstraZeneca)，MEK的变构抑制剂，已表明它抑制IL-6产生。Pradoet al.(2012)BRITISH J.CANCER 106:1583-1586。
TNFα和IL-1是已知的参与介导促炎反应的细胞因子，它也涉及肌肉消耗、厌食症和恶病质。TNFα的循环水平升高显得抑制肌生成。TNFα，亦称“恶液质素”，刺激白介素-1分泌，涉及恶病质的诱导。IL-1是急性期炎症反应的强力引发剂，已表明输注IL-1可导致显著的体重减轻和食欲不振。已显示IL-1在荷有鼠结肠-26腺癌的小鼠中促使癌症恶病质的引发(Strassmann et al.(1993)J.IMMUNOL.150:2341)。另参见Mathys and Billiau(1997)NUTRITION 13:763-770；Fong et al.(1989)AM.J.PHYSIOL.-REGULATORY,INTEGRATIVEAND COMPARATIVE PHYSIOL.,256:R659-R665。因此，用于治疗类风湿性关节炎的TNFα抑制剂和IL-1抑制剂也可用于治疗恶病质。
因此，在一些实施方案中，TNFα或IL-1的一种或多种抑制剂可与结合GFRAL蛋白的胞外域和/或与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的药剂(例如与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的抗体)组合给予(例如与之同时给予、在之前给予或在之后给予)。TNFα或IL-1的合适抑制剂包括抗TNFα抗体或其抗原结合片段、抗IL-1抗体或其抗原结合片段、TNFα或IL-1的小分子抑制剂和TNFα或IL-1的“诱杀型”受体例如可溶性TNFα或IL-1受体和可溶形式的TNFα或IL-1与Fc分子的融合物。TNFα的融合物包括例如依那西普(Pfizer/Amgen)、英利昔单抗(Janssen Biotech)、阿达木单抗(Abbvie)、戈利木单抗(Johnson和Johnson/Merck)和培舍珠单抗(UCB)。合适的IL-1抑制剂包括例如靶向IL-1a的抗体(XBiotech)、anikinra(Amgen)、canakinumab(Novartis)和利洛西普(Regeneron)。在某些实施方案中，一般全身给药用于治疗类风湿性关节炎的TNFa抑制剂或IL-1抑制剂，可以局部和直接施予肿瘤部位。
肌肉生长抑制素，亦称GDF-8，是作为肌肉质量负调节剂(如肌肉生长抑制缺陷型哺乳动物中肌肉质量增加所示)的肽的TGF-β家族的成员。肌肉生长抑制素是激活素2型受体ActIIB的配体。
因此，在一些实施方案中，肌肉生长抑制素或其受体的一种或多种抑制剂可与结合GFRAL蛋白的胞外域和/或与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的药剂(例如与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的抗体)组合给予(例如与之同时给予、在之前给予或在之后给予)。肌肉生长抑制素或ActIIB的合适抑制剂包括抗肌肉生长抑制素抗体或其抗原结合片段、抗ActRIIB抗体或其抗原结合片段、肌肉生长抑制素的小分子抑制剂、ActIIB的小分子抑制剂和GDF-8的“诱杀型”受体，例如可溶性ActIIB和可溶形式的ActIIB与Fc分子的融合物。参见例如Lokireddy et al.(2012)BlOCHEM.J.446(l):23-26。可适于本发明方法的肌肉生长抑制素抑制剂包括REGN1033(Regeneron)；参见Bauerlein et al.(2013)J.CACHEXIA SARCOPENIAMUSCLE:Abstracts of the 7th Cachexia Conference,Kobe/Osaka,Japan,December 9-11,2013,Abstract 4-06；LY2495655(Lilly)，一种由Eli Lilly在临床上开发的人源化抗肌肉生长抑制素抗体；另参见“A PHASE 2STUDY OF LY2495655IN PARTICIPANTS WITHPANCREATIC CANCER”，可获自万维网clinicaltrials.gov/ct2/NCT01505530；NML标识符：NCT01505530；ACE-031(Acceleron Pharma)；和司他莫单抗(Pfizer)。
例如生长素释放肽或生长素释放肽模拟物或能够激活GHS受体(GHS-Rla)(亦称生长素释放肽受体)的其它生长激素促分泌素(GHS)等药剂，可用于增加人的食物摄取和体重。参见Guillory et al.(2013)载于VITAMINS AND HORMONES vol.92,chap.3；和Steinman and DeBoer(2013)VITAMINS AND HORMONES vol.92,chap.8。因此，在一些实施方案中，一种或多种生长素释放肽或生长素释放肽模拟物或者其它生长激素促分泌素(GHS)可与结合GFRAL蛋白的胞外域和/或与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的药剂(例如与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的抗体)组合给予(例如与之同时给予、在之前给予或在之后给予)。合适的生长素释放肽模拟物包括anamorelin(Helsinn，Lugano，CH)；参见Temel etal.(2013)J.CACHEXIA SARCOPENIA MUSCLE:Abstracts of the 7th CachexiaConference,Kobe/Osaka,Japan,December 9-11,2013,Abstract 5-01。例如，可采用描述于PCT公布号WO2011/117254和WO2012/113103的生长激素促分泌素受体生长素释放肽竞争测定法，鉴定其它合适的GHS分子。
雄激素受体的激动剂，包括小分子和其它选择性雄激素受体调节剂(SARM)可用于治疗恶病质和/或肌肉衰减综合征。参见例如Mohler et al.(2009)J.MED.CHEM.52:3597-3617；Nagata et al.(2011)BlOORGANIC AND MED.CHEM.LETTERS 21:1744-1747；和Chenet al.(2005)MOL.INTERV.5:173-188。理想的是，SARM在合成的目标组织(例如肌肉和骨)中应起完全激动剂(像睾酮)的作用，但在前列腺组织中显示仅部分或单纯的雄激素受体拮抗活性。参见例如Bovee et al.(2010)J.STEROID BlOCHEM.&MOL.BIOL.118:85-92。例如，可采用描述于Zhang et al.(2006)BlOORG.MED.CHEM.LETT.16:5763-5766；和Zhang etal.(2007)BlOORG.MED.CHEM.LETT.17:439-443的方法和测定法鉴定合适的SARM。
因此，在一些实施方案中，一种或多种雄激素受体激动剂可与结合GFRAL蛋白的胞外域和/或与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的药剂(例如与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的抗体)组合给予(例如与之同时给予、在之前给予或在之后给予)。合适的SARM包括例如GTx-024(enobosarm，GTx，Inc.)，一种由GTx，Inc进行的II期临床开发中的SARM。另参见Dalton et al.(2011)J.CACHEXIA SARCOPENIA MUSCLE 2:153-161。其它合适的SARM包括2-(2,2,2)-三氟乙基-苯并咪唑(Ng et al.(2007)BlOORG.MED.CHEM.LETT.17:1784-1787)和JNJ-26146900(Allan et al.(2007)J.STEROID BlOCHEM.&MOL.BIOL.103:76-83)。
β-肾上腺素能阻滞药或β-阻滞药，已针对其对恶病质对象体重的作用进行了研究，并且与充血性心力衰竭患者的恶病质的部分逆转有关。参见例如Hryniewicz et al.(2003)J.CARDIAC FAILURE 9:464-468。在患有癌症恶病质的对象的2期临床试验中评价了β-阻滞药MT-102(PsiOxus Therapeutics,Ltd.)。参见Coats et al.(2011)J.CACHEXIASARCOPENIA MUSCLE 2:201-207。因此，在一些实施方案中，一种或多种β-肾上腺素能阻滞药或β-阻滞药可与结合GFRAL蛋白的胞外域和/或与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的药剂(例如与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的抗体)组合给予(例如与之同时给予、在之前给予或在之后给予)。
在黑皮质素信号转导中有遗传缺陷的黑皮质素受体敲除小鼠显示恶病质的表型对立面：食欲增强、瘦体重增加和代谢降低。因此，黑皮质素拮抗作为与慢性疾病有关的恶病质的有效治疗脱颖而出(DeBoer and Marks(2006)TRENDS IN ENDOCRINOLOGY ANDMETABOLISM 17:199-204)。
因此，在一些实施方案中，黑皮质素肽或黑皮质素受体的一种或多种抑制剂可与结合GFRAL蛋白的胞外域和/或与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的药剂(例如与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的抗体)组合给予(例如与之同时给予、在之前给予或在之后给予)。黑皮质素或黑皮质素受体的合适抑制剂包括抗黑皮质素肽抗体或其抗原结合片段、抗黑皮质素受体抗体或其抗原结合片段、黑皮质素肽的小分子抑制剂、黑皮质素受体的小分子抑制剂和黑皮质素受体的“诱杀型”受体例如可溶性黑皮质素受体和可溶性黑皮质素受体与Fc分子的融合物。合适的黑皮质素受体抑制剂包括例如黑皮质素受体拮抗剂agouri相关肽(AgRP(83-132))，已表明其在癌症相关恶病质小鼠模型中预防恶病质相关症状(Joppa et al.(2007)PEPTIDES 28:636-642)。
抗癌剂，尤其可能引起恶病质和提高GDF-15水平的那些，例如顺铂，可与结合GFRAL蛋白的胞外域和/或与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的药剂(例如与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的抗体)组合在本文公开的方法中使用(例如与之同时给予、在之前给予或在之后给予)。许多癌症患者因放射疗法和/或化学疗法的艰辛历程变虚弱，这可能限制患者耐受这类疗法的能力，因此限制了剂量方案。某些抗癌剂本身，例如氟尿嘧啶、阿霉素、甲氨蝶呤和顺铂，可通过例如引起重度胃肠并发症而造成恶病质。参见例如Inui(2002)CANCERJ.FOR CLINICIANS 52:72-91。通过本公开内容的方法，其中抗癌剂与本公开内容的抗GDF-15抗体组合给予，可能降低恶病质的发病率和/或严重程度，最终提高这类抗癌剂的最大耐受剂量。因此可通过降低作为剂量限制不良作用的恶病质的发病率，并通过允许给予较高剂量的指定抗癌剂，来改进用可引起恶病质的抗癌剂治疗的功效。
因此，本文提供包含结合GFRAL蛋白的胞外域和/或与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的药剂(例如与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的抗体)与选自以下的药剂组合的药物组合物：激活素-A的抑制剂、ActRIIB的抑制剂、IL-6的抑制剂或IL-6R的抑制剂、生长素释放肽、生长素释放肽模拟物或GHS-Rla激动剂、SARM、TNFα抑制剂、IL-la抑制剂、肌肉生长抑制素抑制剂、β-阻滞药、黑皮质素肽抑制剂、黑皮质素受体抑制剂和抗癌剂。本公开内容还包括治疗、预防哺乳动物的恶病质和/或肌肉衰减综合征或使之减至最轻的方法，所述方法包括给予有需要的哺乳动物包含有效量的本公开内容的抗GDF-15抗体与有效量的以下成分组合的药物组合物或组合物：激活素-A的抑制剂、ActRIIB的抑制剂、IL-6的抑制剂或IL-6R的抑制剂、生长素释放肽、生长素释放肽模拟物或GHS-Rla激动剂、SARM、TNFα抑制剂、IL-la抑制剂、肌肉生长抑制素抑制剂、β-阻滞药、黑皮质素肽抑制剂或黑皮质素受体抑制剂。
另一方面，本文提供抑制与基础疾病有关的肌肉质量丢失的方法，所述方法包括给予有需要的哺乳动物包含有效量的结合GFRAL蛋白的胞外域和/或与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的药剂(例如与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的抗体)与有效量的以下成分组合的药物组合物或组合物：激活素-A的抑制剂、ActRIIB的抑制剂、IL-6的抑制剂或IL-6R的抑制剂、生长素释放肽、生长素释放肽模拟物或GHS-Rla激动剂、SARM、TNFα抑制剂、IL-lα抑制剂、肌肉生长抑制素抑制剂、β-阻滞药、黑皮质素肽抑制剂或黑皮质素受体抑制剂以预防或减少肌肉质量丢失。基础疾病可选自癌症、慢性心力衰竭、慢性肾病、慢性阻塞性肺病、AIDS、多发性硬化、类风湿性关节炎、脓毒症和结核病。另外，在一些实施方案中，肌肉质量丢失伴有脂肪质量丢失。
另一方面，本文提供抑制或降低哺乳动物的非刻意体重减轻的方法，所述方法包括给予有需要的哺乳动物包含有效量的本公开内容的抗GDF-15抗体与以下有效量的成分组合的药物组合物或药物组合物：激活素-A的抑制剂，ActRIIB的抑制剂、IL-6的抑制剂或IL-6R的抑制剂、生长素释放肽、生长素释放肽模拟物或GHS-Rla激动剂、SARM、TNFα抑制剂、IL-lα抑制剂、肌肉生长抑制素抑制剂、β-阻滞药、黑皮质素肽抑制剂或黑皮质素受体抑制剂。
某些抗癌剂(例如顺铂)具有涉及引起或加重例如恶病质、肌肉衰减综合征、肌肉消耗、骨消耗或非刻意体重减轻等一种或多种综合征的一种或多种不良副作用。因此，另一方面，本文提供治疗癌症，同时预防、极小化或降低哺乳动物的恶病质、肌肉衰减综合征或肌肉消耗、骨消耗或非刻意体重减轻的发生、频率或严重程度的方法，所述方法包括给予有需要的哺乳动物包含有效量的结合GFRAL蛋白的胞外域和/或与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的药剂(例如与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的抗体)与一种或多种抗癌剂组合的药物组合物。在一些实施方案中，治疗癌症，同时预防、极小化或降低哺乳动物的恶病质、肌肉衰减综合征或肌肉消耗、骨消耗或非刻意体重减轻的发生、频率或严重程度的方法包括给予有需要的哺乳动物包含有效量的结合GFRAL蛋白的胞外域和/或与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的药剂(例如与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的抗体)与已知引起或增加哺乳动物的恶病质、肌肉衰减综合征或肌肉消耗、骨消耗或非刻意体重减轻的发生、频率或严重程度的一种或多种抗癌剂组合的药物组合物。
剂量
在所述方法中，将治疗有效量的主题蛋白质给予有需要的对象。例如，当将主题蛋白质以有效量递送至在治疗前相对于健康个体没有正常体重的患者的血流时，主题蛋白质引起体重恢复到相对于健康个体的正常水平。所给予的量随给药目的、待治疗的个体的健康和身体状况、年龄、需要解决问题的程度、主题蛋白质的制剂、所用主题蛋白质的活性、治疗临床医师的医疗情况评价、对象的状况和对象的体重以及恶病质的严重程度和其它相关因素而变化。剂量的大小也将根据给予特定蛋白质可能附带的任何毒副作用的存在、性质和程度来确定。
预期量将落入可通过常规试验确定的相对宽大的范围。例如，用来恢复体重和/或食欲的主题蛋白质的量不超过大致否则可能对对象有不可逆的毒性的量(即最大耐受剂量)。在其它情况下，量在毒性阈值附近或甚至大大低于毒性阈值，但仍在有效浓度范围内，或甚至低至阈值剂量。
各剂量通常不小于对对象产生可测量的作用所需要的量，并且可根据主题蛋白质或其副产品的吸收、分布、代谢和分泌(“ADME”)的药代动力学和药理学并因此根据对象内组合物的分布来确定。这包括考量给药途径以及剂量，这可针对肠内(通过消化道施用用于全身作用或当保留在消化道的部分时的局部作用)或胃肠外(通过消化道以外途径施用用于全身和局部作用)应用来调整。例如，主题蛋白质的给予通常通过注射，常常为静脉内、肌内或其组合。
有效剂量(ED)是在服用药剂的对象的某一比例中产生治疗反应或所需作用的药剂的剂量或量。药剂的“有效剂量中值”或ED50是向其给予药剂的50％群体中产生治疗反应或所需作用的药剂的剂量或量。虽然ED50常常用作药剂效果的合理的预期度量，但不必是临床医师考虑所有相关因素将视为合适的剂量。
在一些实施方案中，有效量与计算出的ED50一致，而在某些实施方案中，有效量大于计算出的ED50的量。在某些实施方案中，有效量是小于计算出的ED50的量。
有效量的蛋白质还可以是与在治疗之前的个体的体重相比，当以一个或多个剂量给药时有效增加个体的体重达至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或大于80％的量。
每次给药的剂量的更多实例可以是小于10μg、小于2μg或小于1μg。每次给药的剂量还可以是大于50μg、大于100μg、大于300μg直到600μg或更多。剂量/体重的实例范围为约0.1μg/kg-约1μg/kg、直到约1mg/kg或更多。有效量和剂量方案可以试验为依据容易地从测定法、安全与递增和剂量范围试验、各临床医师-患者关系以及本领域已知的体外和体内测定法测定。
本文所用术语“单位剂型”是指适于作为人和动物对象的单位剂量的物理离散单位，各单位含有经计算量足以产生所需作用的预定量的本公开内容的蛋白质以及药学上可接受的稀释剂、载体或溶媒。新的单位剂型的规格取决于所用的具体蛋白质和要达到的作用及与宿主中的各种蛋白质有关的药效学。
在一些实施方案中，治疗有效量的主题蛋白质(例如与GDF15竞争结合GFRAL的ECD的抗体)的范围为0.1mg/kg-100mg/kg、1mg/kg-100mg/kg、1mg/kg-10mg/kg或2.0mg/kg-10mg/kg。所给予的量可取决于例如待治疗的疾病或适应征的类型或程度、患者的总体健康状况、抗体或融合蛋白的体内功效、药物制剂、抗体或融合蛋白的血清半寿期和给药途径等变量。起始剂量可增加到上部水平以上以快速达到所需的血液水平或组织水平。或者，起始剂量可小于最适量，并且剂量在治疗进程中可逐步增加。可在例如经设计从0.5mg/kg-20mg/kg运行的常规I期剂量递增研究中使人的剂量最优化。给药频率可随例如给药途径、剂量、抗体或融合蛋白的血清半寿期和治疗中的疾病等因素而变化。示例性给药频率为每天一次、每周一次和每两周一次。在一些实施方案中，给药是每两周一次。优选的给药途径是胃肠外，例如静脉内输注。单克隆抗体型药物和融合蛋白型药物的配制为本领域普通技术人员所掌握。在一些实施方案中，抗体或融合蛋白被冻干，然后在给药时在缓冲盐水中复溶。第二活性剂例如抗癌剂或本文所述另一种药剂的有效量也遵循上述原则，并且可被选择以在患者中引出所需的治疗益处。
药盒
本公开内容还提供使用本文公开的组合物和实施本文上述方法的药盒。可以提供药盒用于在需要治疗或预防恶病质的对象中给予主题蛋白质。药盒可包括本文公开的蛋白质的一种或多种，其可以无菌容器提供，并且可以在给予对象的与合适的药学上可接受的赋形剂的制剂中提供。蛋白质以容易原样使用或可以复溶以具有所需浓度的制剂提供。当提供待通过用户复溶的蛋白质时，药盒还可提供与主题蛋白质分别包装的缓冲剂、药学上可接受的赋形剂等。本发明药盒的蛋白质可分别或与其它药物组合配制。
除上述组分以外，药盒可进一步包括使用药盒的组分以实施主题方法的说明书。用于实施主题方法的说明书通常记录在合适的记录介质中。例如，说明书可印刷在基底(例如纸或塑料等)中。因此，说明书可作为包装说明书存在于药盒中、在药盒或其组分等容器的标签上(即附在包装或分包上)。在其它实施方案中，说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如CD-ROM、磁盘等)中的电子存储数据文件存在。在另外的其它实施方案中，实际说明书不存在于药盒中，但提供从远程来源(例如通过互联网)获取说明书的方式。该实施方案的实例是包括网址的药盒，其中可从中浏览说明书和/或下载说明书。如同说明书一样，获取说明书的方式记录在合适的基质中。
实施例
列出以下实施例以便向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整内容和描述，并且无意限制发明人视之为他们的发明的范围，也无意表示进行了以下所有的或仅有的实验。付出了很多努力以确保有关所用数字(例如量、温度等)的准确性，但是应考虑某些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份是重量份，分子量是重均分子量，温度以摄氏度表示，压力是在大气压下或接近大气压。可使用标准缩写，例如bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒钟；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸(s)；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸(s)；i.m.，肌内(ly)；i.p.，腹膜内(ly)；s.c.，皮下等。
材料与方法
下列方法和材料用于下列实施例。
HEK239-GFRAL细胞系的产生。使用Lipofectamine 2000(Life Technology)将HEK293细胞转染至含有人GFRAL的质粒。转染后两天，将细胞与含有10％FBS和潮霉素(0.2mg/mL)的DMEM一起孵育直到看得见集落。挑出克隆，采用间接免疫荧光染色对Fc-GDF15进行评价。
RT-PCR。从C57/BL6小鼠中收获组织，通过Trizol(Life Technology)提取总RNA。使用Quantitect Multiplex RT-PCR试剂盒(Qiagen)对250μg总RNA进行RT-qPCR分析。小鼠GFRAL的PCR引物购自Life Technology(目录号Mm 02344885-m1)。根据使用小鼠GFRALcDNA作为模板生成的标准曲线，计算转录物的拷贝数。
原位杂交。由Advanced Cell Diagnostics(Hayward，CA)利用其Assay技术进行小鼠GFRAL的RNA原位杂交。从C57BL/6小鼠中切下全脑，在最适切割温度(OCT)化合物(VWR International)中新鲜冷冻。制备20微米冷冻切片，在载玻片上干燥约1小时，并保存在-20℃下直到在Advanced Cell Diagnostics处理。
小鼠脑切片的免疫荧光染色。将来自C57BL/6小鼠的全脑在4％低聚甲醛:PBS中在4℃下固定过夜。将组织在PBS中洗涤，用振动切片机切片。通过所有的封闭、抗体温育和洗涤步骤，将50μm切片在2％BSA+0.2％Triton X-100:PBS溶液中进行自由浮动处理。将切片与第一抗体：鸡抗酪氨酸羟化酶(Aves Labs)、兔抗降钙素受体(Thermo Scientific)和绵羊抗GFRAL抗体(R&D Systems)一起在4℃下温育过夜。在洗涤后，将切片与第二Alexa缀合的抗体(Invitrogen)一起在4℃下温育过夜。将组织切片轻触转移并用Fluoromount-G(Southern Biotech)铺在载玻片上。使用装有Leica DFC 500相机的Leica DM 4000B获取落射荧光图像。重叠和额外的图像处理应用Image J软件进行。
125I-GDF15与人GFRAL的结合。将HEK293或HEK293-人GFRAL细胞悬浮于冰冷的结合缓冲液(含有2mg/ml BSA和25mM HEPES的Dulbecco改良Eagle培养基，pH 7.4)中，并转移到预湿的Multiscreen滤板(96孔Dura PVDF 0.65um Opaque；Millipore)上，使滤板保持在冰上。通常，每孔使用25μl的1X105个细胞。将细胞在有或没有未标记的GDF15(500nM最终反应浓度)时与25μl含有连续稀释的125I-GDF15(从1000pM到0.1pM最终反应浓度的2倍连续稀释)的结合缓冲液在4℃下温育2小时。然后将板转移到真空过滤歧管(Pall Corporation)中，过滤上清液。将各孔用100μl冰冷的结合缓冲液洗涤4次。使用MicroΒ2Plate Counter(Perkin Elmer)通过闪烁计数(150μl/孔的EcoLite，MP Biomedicals，Santa Anna，CA)测量结合的125I-GDF15。根据使CPM和摩尔浓度的125I-GDF15关联的标准曲线，计算结合的(分子/细胞)。
GFRAL-Fc的表达和纯化。成熟的GFRAL-Fc蛋白分泌到用含有GFRAL-Fc的质粒瞬时转染的HEK293细胞的培养基中。重组GFRAL-Fc使用在苯基疏水相互作用层析法后俘获的蛋白A纯化。
GDF15介导的细胞反应。对PathDetect Trans-reporting System(AgilentTechnology)进行改动。简单地说，使用Fugene 6(Promega)，将HEK293T细胞用下列质粒对共转染：pFA-Elk/pFR-Luc(反式激活剂/反式报道分子(trans-Activator/trans-Reporter)；Agilent Technology)和GFRAL/RET9表达构建体(来自人、食蟹猴、大鼠或小鼠)。将转染的细胞在含10％FBS的DMEM中在37℃下培养过夜。在抑制剂(例如GFRAL-Fc或抗GDF15抗体(1M03))存在或不存在时，将细胞用配体例如GDF15或GDNF(Peprotech)在37℃下处理6小时。在其中包括抗GFRAL抗体的实验中(图12和13)，在与GDF15温育之前将细胞用抗体预处理1小时。报道分子萤光素酶活性使用Bright Glo(Promega)作为底物测定，并通过EnSpire Multimode Plate Reader(Perkin Elmer)检测。在非线性回归曲线拟合(GraphPad Prism)时，对于人、食蟹猴、大鼠和小鼠受体，GDF15活性的EC50分别为2.1pM、5.2pM、6.2pM和1.5pM。
按以下浓度(nM)加入GFRAL-Fc或抗GDF15抗体(1M03)：100、33.33、11.11、3.7、1.23、0.41、0.14、0.05、0.02和0.01。按以下浓度(nM)加入抗GFRAL抗体(12B10、16J20、24G2、29G7、44I10)：500、166.67、55.56、18.52、6.17、2.06、0.69、0.23、0.08和0.03。抑制1nM GDF15介导的受体活化的GFRAL-Fc和1M03的IC50分别为9.5nM和11.7nM。按照应用GraphPad Prizm的非线性回归曲线拟合，对于16J20、24G2、29G7和44I10，抑制10pM的GDF15介导的受体活化的IC50为61.1nM、55.9nM、25.7nM和31.4nM。抗体1M03是使用成熟hGDF15蛋白作为抗原产生的小鼠单克隆抗体。
放射性配体竞争结合。将HEK293-GFRAL细胞悬浮于冰冷的结合缓冲液(含有2mg/ml BSA和25mM HEPES的Dulbecco改良Eagle培养基，pH 7.4)中，并转移到预湿的Multiscreen滤板(96孔Dura PVDF 0.65um Opaque；Millipore)上，将滤板保留在冰上。通常，每孔使用25μl的1X105个细胞。加入12.5μl/孔含有0.6nM 125I-GDF15的结合缓冲液。然后加入12.5μl/孔不同浓度的未标记的抑制剂，在4℃下温育2小时。然后将板转移到真空过滤歧管(Pall Corporation)中，过滤上清液。将各孔用100μl冰冷的结合缓冲液洗涤4次。使用MicroΒ2Plate Counter(Perkin Elmer)通过闪烁计数(150μl/孔的EcoLite，MPBiomedicals，Santa Anna，CA)测量结合的125I-GDF15(CPM)。该实验中使用的未标记的抑制剂的浓度(单位nM)如下。GDF15和GFRAL-Fc：100、25、6.25、1.56、0.39、0.098、0.024、0.006；1M03：1000、250、62.5、15.63、3.91、0.98、0.24、0.06。按照应用GraphPad Prism的非线性回归曲线拟合，对于GDF15、GFRAL-Fc和1MO3，抑制0.15nM的125I-GDF15与HEK-293-GFRAL细胞结合的IC50分别为0.4nM、0.56nM和0.66nM。
基于ELISA的竞争结合测定法。将1μg/ml PBS中人Fc的抗体(JacksonImmunoResearch)在96孔Nunc Maxisorp板(Fisher Scientific)上在4℃下包被过夜。将各孔用自PBS-TWEEN片(EMD Chemicals)制备的洗涤缓冲液洗涤3次。通过用1％BSA/PBS在室温下温育1小时将各孔封闭。在洗涤后，加入1μg/ml的GFRAL-Fc，在室温下温育2小时。将各孔洗涤3次，加入剂量滴定的纯化的抗GFRAL抗体，在室温下温育1小时。然后将生物素化GDF15加至100ng/ml，在室温下温育1小时。将各孔洗涤3次，用HRP缀合的链霉抗生物素(1:5000稀释液，Life Technology)在室温下温育1小时。将各孔洗涤并用TMB(LifeTechnology)在室温下处理15分钟。使用SpectroMax读板仪(Molecular Devices)测量OD450。按下列浓度(nM)加入抗体：62.5、20.8、6.9、2.3、0.8、0.3、0.09、0.03。对于抗体12B10、16J20、24G2、29G7和44I10，抑制4nM生物素化GDF15与固定化GFRAL-Fc结合的IC50分别为(单位nM)4.9、0.6、0.9、0.8和0.4。
GFRAL-RET复合物。按照生产商说明书，使用2000(LifeTechnology)，将HEK293细胞用编码RET51的cDNA(对照)或编码GFRAL和RET51的cDNA转染。转染后两天，使细胞在无血清DMEM中饥饿1小时，然后用100ng/ml的GDF15处理15分钟。吸出培养基，使细胞在含有蛋白质磷酸酶抑制剂混合物I和II(Sigma)、蛋白酶抑制剂混合物(Roche)、NaF(1mM)和NaVO4(1mM)的冰冷的RIPA缓冲液(Sigma)中裂解。使1mg等量的细胞裂解物与20μg抗RET51抗体(Santa Cruz Biotechnology)一起在4℃下温育45分钟。加入100μl蛋白G(Life Technology)，在4℃下温育1.5小时。珠粒用PBS洗涤3次，结合的蛋白质用60μl SDS-PAGE缓冲液洗脱。对15μl洗脱的裂解物进行SDS-PAGE，接着使用抗Ret51抗体(Santa Cruz Biotechnology)或抗GFRAL抗体(R&D Systems)进行蛋白质印迹法。
抗GFRAL抗体产生。含有GFRAL ECD的重组蛋白质用作免疫原使B6/129小鼠免疫。使用高容量成像系统Cell InSight(Thermo Scientific)或通过使用ELISA的与GFRAL-Fc的结合，针对与表达GFRAL的CHO细胞的结合，对杂交瘤上清液进行筛选。
实施例1：GDF15受体的鉴定
为了鉴定成熟人GDF15的结合配偶体，进行了多种测定法。为了鉴定表达与GDF15结合的蛋白质的组织，使用125I-GDF15对来自小鼠和大鼠的组织切片(包括脑组织切片)染色。另外，针对GDF15结合配偶体，测定了人的生物流体包括尿液、腹水流体和羊膜流体。将FLAG标记的GDF15(FLAG-GDF15)与人尿液、腹水流体和羊膜流体一起温育，通过质谱法对与FLAG-GDF15结合的蛋白质进行了分析。对人尿液、腹水流体和羊膜流体中存在的蛋白质进行层析法分级，接着通过与125I-GDF15的结合进行检测。
还针对与GDF15的结合，对来自小鼠丘脑下部和人胎盘的cDNA文库和膜蛋白质的cDNA克隆进行筛选。膜蛋白质的一部分(37种)的～4000cDNA克隆在HEK293T细胞中表达，并针对与Fc-GDF15的结合进行筛选(图1B；如公开于PCT/US2013/023465的DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+)的二聚体)。按照生产商说明书，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)，在384孔聚-D-赖氨酸包被板(Greiner)上在HEK-293T细胞(ATCC)中使膜蛋白质cDNA表达构建体(0.08μg/孔)反转录。将转染的细胞培养3天。将细胞用DMEM(无酚红；Corning Cellgro)洗涤3次，与Fc-GDF15(5μg/ml)在相同的培养基中在室温下温育1.5小时。将Alexa647缀合的山羊抗人Fc抗体(JacksonImmunologicals)加至0.33ng/mL，将Hoescht33342(6.7ng/ml)(Sigma)加入细胞中，温育40分钟。将板用冷的HBSS/M2+(Cellgro)洗涤3次，用含3.7％福尔马林的PBS固定5分钟。使用Cell InSight(Thermo Scientific)测量荧光强度。
小鼠GFRAL被鉴定为与Fc-GDF15结合的膜蛋白质。筛选的一组cDNA克隆还包括不与GDF15结合的TGFγ家族受体和GDNF家族受体(GFRA)。(图5)。
实施例2：GFRAL在脑干中表达
通过定量RT-PCR分析小鼠的组织以鉴定表达GFRAL的器官。GFRAL RNA几乎专门在脑干中表达(图6A)。通过RT-PCR分析了从中枢神经系统的不同区域以及眼收获的组织，证实了GFRAL在脑干中表达(图6B)。
利用RNA原位杂交，检查了小鼠脑矢状切面中GFRAL mRNA的表达。当仔细检查时，在脑干极后区(area postrema)区域中观察到GFRAL明确的阳性染色。因此，小鼠GFRAL似乎只在脑干的极后区表达。
使用间接免疫荧光染色，检查了小鼠脑矢状切面中GFRAL蛋白的表达。当仔细检查时，脑干的极后区观察到GFRAL蛋白明确的阳性染色。进行了GFRAL与神经元标志物包括酪氨酸羟化酶(TH)、降钙素受体(CT)和GLP-1受体的共染色。GFRAL表达与TH-或GLP-1受体的神经元部分重叠，但排除在CT阳性神经元以外。这些数据表明GFRAL在极后区中的一组独特的神经元中表达。
实施例3：GDF15以亚纳摩尔亲和力与GFRAL结合
为了测定GDF15与GFRAL的结合亲和力，放射性标记的125I-GDF15被用来在平衡条件下结合表达人GFRAL的HEK293细胞(图2A)。如图7A所示，125I-GDF15与HEK293-GFRAL细胞的结合遵循典型的配体-受体结合双曲线；相比之下，125I-GDF15与对照HEK293T细胞的结合是线性的，表明非特异性相互作用。过量的未标记的GDF15(500nM)降低125I-GDF15-GFRAL结合到‘非特异性’的背景水平。这进一步支持125I-GDF15和GFRAL相互作用的特异性。125I-GDF15-GFRAL的结合亲和力约为200pM(图7B)，这也是高亲和力配体-受体相互作用特有的。
实施例4：GDF15通过GFRAL和RET刺激ERK信号转导途径
GFRAL的胞外域与GDNF家族受体α(GFRA)家族受体具有序列同源性。GFRA受体通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞表面。GFRA受体，在与其配体结合时，与受体酪氨酸激酶RET缔合，并介导RET的活化。激活的RET变成酪氨酸被磷酸化，这诱导包括转录因子ELK1磷酸化在内的胞内信号转导级联。
为了检验GDF15通过GFRAL-RET受体复合物介导细胞反应(例如ELK1磷酸化)的假设，针对对GDF15的反应，测定了表达hGFRAL和人RET9两者的细胞(图3B)。将HEK293T细胞用hGFRAL和hRET9的表达质粒连同包括GAL4DBD-ELK1融合质粒和GAL4-UAS-萤光素酶报道基因(PathDetect Trans-Reporting Systems，Agilent Technology)的报道分子系统共转染。
如图8所示，GDF15以剂量依赖性方式介导萤光素酶的表达。相比之下，GDNF，其通过与GFRA1结合介导RET活化，不激活GFRAL-RET。GFRAL和RET两者是GDF15介导的细胞反应所必需的，因为省去这些受体的任一个都会消除萤光素酶表达。该结果GDF15通过GFRAL-RET受体系统发挥其生物功能的假设。
实施例5：人GDF15激活来自人，食蟹猴、大鼠和小鼠的GFRAL-RET受体系统
采用描述于实施例4的报道分子测定法，检查了GFRAL-RET受体系统在响应GDF15治疗的保守性。将来自人、食蟹猴、大鼠和小鼠的GFRAL和RET9受体转染至HEK293T细胞，测量了在响应人GDF15时的报道基因活化。
如图9A-9D所示，GDF15通过来自所测的所有4种物种的GFRAL-RET受体复合物剂量依赖性地介导的细胞反应。这些数据表明GDF15/GFRAL-RET配体/受体系统是保守的。
实施例6：GFRAL-FC和抗GDF15抗体1M03抑制GDF15与GFRAL结合
采用竞争结合实验，鉴定出抑制GDF15与GFRAL结合的分子。将与125I-GDF15(0.15nM)结合的HEK293-GFRAL细胞与未标记的GDF15、GFRAL-Fc或抗体1M03一起温育。
GFRAL-Fc包括hGFRAL的胞外域。如图4所示，GFRAL-Fc包括异源信号肽：IgK信号肽，其替换了内源信号肽(参见图2A)。GFRAL-Fc与信号肽一起表达，信号肽在从细胞分泌时被切割。GFRAL-Fc包括GFRAL的胞外域，但不包括GFRAL的跨膜结构域或胞内域。
未标记的GDF15、GFRAL-Fc或抗体1M03以剂量依赖性方式抑制125I-GDF15(0.15nM)与HEK293-GFRAL细胞结合(图10)。GDF15、GFRAL-Fc和1M03的IC50分别为0.4nM、0.56nM和0.66nM。
实施例7：GFRAL-FC和抗GDF15抗体抑制GDF15介导的受体活化
GFRAL-Fc或抗GDF15抗体(1M03)与GDF15的结合抑制GDF15介导的GFRAL-Ret受体复合物的活化。采用描述于实施例4的报道分子测定法，检查了GFRAL-Fc和1M03对GDF15介导的GFRAL-Ret受体复合物活化的作用。GFRAL-Fc和1M03在表达GFRAL和RET的HEK293T细胞中剂量依赖性地抑制GDF15(1nM)介导的报道分子活化(图11)。GFRAL-Fc和1M03的IC50分别为9.5nM和11.7nM。
实施例8：抗GFRAL抗体抑制GDF15与GFRAL结合
抗GFRAL抗体使用描述于材料与方法中的GFRAL ECD产生。针对其干扰GDF15与GFRAL结合的能力，检查了了几种单克隆抗GFRAL抗体。将GFRAL-Fc(图4)固定在板上以进行描述于材料与方法中的基于ELISA的结合测定法。如图12所示，生物素化GDF15(4nM)与固定在板上的GFRAL-Fc结合受这些抗GFRAL抗体呈剂量依赖性方式的竞争。抗GFRAL ECD抗体：12B10、16J20、24G2、29G7和44I10的IC50分别为4.9nM、0.6nM、0.9nM、0.8nM和0.4nM。
实施例9：抗GFRAL抗体抑制GDF15介导的受体活化
采用描述于实施例4的报道分子测定法，检查了抗GFRAL抗体对GDF15介导的GFRAL-RET受体复合物活化的作用。4种抗GFRAL ECD抗体16J20、24G2、29G7和44I10，在表达GFRAL和RET的HEK293T细胞中剂量依赖性地抑制GDF15(10pM)介导的报道分子活化(图13)。如图12所示，12B10抗体，与其它抗GFRAL ECD抗体相比不太有效地抑制生物素化GDF15与GFRAL-Fc结合，无法抑制GDF15介导的受体活化。
实施例10：GFRAL与RET独立于GDF15地相互作用
为了检查GFRAL和RET间的相互作用，进行了RET的免疫沉淀。用编码RET的质粒单独转染或用编码RET和GFRAL的质粒共转染的HEK293细胞用仅PBS或100ng/ml GDF15处理15分钟。使用抗Ret51抗体对处理细胞的全细胞裂解物进行免疫沉淀接着蛋白质印迹分析。
如图14所示，GFRAL当在HEK293细胞中与RET共表达时，被抗Ret抗体牵出。这种相互作用独立于GDF15，因为同等的GFRAL从用GDF15或用PBS处理的GFRAL/RET表达细胞中被牵出。这个结果表明，GFRAL-Ret复合物独立于GDF15地在细胞表面上形成。
实施例11：复合物形成和GFRAL/GDF15复合物的结晶
将1.2摩尔浓度过量的GFRAL(W115-E351)蛋白与1摩尔浓度GDF15蛋白亚基(0.5摩尔浓度GDF15，其是通过一对二硫键连接的两个GDF15亚基的同二聚体)混合，制备GFRAL蛋白和GDF15蛋白的复合物。将复合物通过大小排阻层析法纯化以除去过量的GFRAL。通过将1μL蛋白质以5mg/ml与0.5μL贮存溶液和0.5μL结晶液滴中的晶种混合，使GFRAL/GDF15复合物结晶，其中贮存溶液含有1.0mL 0.1M Bis-Tris pH 6.0、1.5M(NH4)2SO4和10％乙二醇。晶种获自包括0.1M Bis-Tris pH 6.0和1.5M(NH4)2SO4的贮存溶液的结晶条件。在室温下将结晶装置保存在Rigaku 24孔三叶草叶板上。在3天温育后，结晶液滴显示小针状晶体。
GFRAL蛋白和GDF15蛋白的示例性小针状晶体见图15。
未获得GFRAL的分子模型，因此采用NaBr浸泡测定晶体定相。将如上所述获得的GFRAL/GDF15晶体用含有0.5M NaBr和0.75M NaBr的贮存溶液浸泡。30分钟后，0.5M NaBr浸泡的晶体处于良好状态，而0.75M NaBr浸泡得到有裂纹的晶体。将来自两种浸渍剂的晶体和未浸泡晶体用30％EG作为冷冻保护剂封片。
本文所述模型提供GFRAL蛋白和GFRAL蛋白与GDF15蛋白结合的首次结构信息。
实施例12：数据采集和结构确定
GFRAL/GDF15复合物晶体从0.1M Bis-Tris pH 6.0，1.5M(NH4)2SO4和10％乙二醇贮存条件中得到并收获作为0.5M和0.7M NaBr浸渍剂的浸泡和未浸泡晶体。晶体用补充20％乙二醇作为冷冻保护剂的母液处理并在液氮中速冻。然后在同步加速器束线IMCA-CAT(Advanced Photon Source,Argonne National Lab)下检查这些晶体的X射线衍射。晶体衍射直到 分辨率。
示例性GFRAL/GDF15复合物晶体的X射线衍射统计数据见表1。
表1
圆括号是单位为的最高分辨shell。
应用具有之前以分辨率解析的GFRAL/GDF15复合物为起始模型的标定数据集和刚体精修(参见Vagin,A.A.,et al.,(2004)“REFMAC5 dictionary:Organization ofprior chemical knowledge and guidelines for its use.”Acta Crystallogr.D 60:2284-2295)，进行GFRAL/GDF15的分子置换，并且如在CCP4中实施的REFMAC5中完成起始位置精修。几轮模型重建产生GFRAL/GDF15复合物的结构。
GFRAL蛋白和GDF15蛋白的复合物的示例性结构见例如图17–24B。
初始电子密度图的检查显示明确的GFRAL和GDF15密度。在刚体精修后，几轮的模型构建和约束精修应用COOT(参见Emsley,P.and Cowtan,K.(2004)“COOT:model-buildingtools for molecular graphics.”Acta Crystallogr.D 60:2126-2132)进行。在溶剂分子置换后，完成最终精修。
来自X射线衍射图案的原子坐标见表6。
示例性晶体的精修统计数据见表2。
表2
示例性GFRAL/GDF15复合物晶体中GFRAL的清晰电子密度见图16。图16显示以分辨率数据计算和以1σ水平成形的GFRAL分子的电子密度图(2fo-fc)。GFRAL残基清晰可见。
实施例13：GFRAL/GDF15复合物的晶体结构
测定了GFRAL蛋白和GDF15蛋白的复合物的晶体结构。
核心相互作用界面氨基酸被定义为是具有距GFRAL相互作用蛋白(例如GDF15)小于或等于的至少一个原子的氨基酸残基(在蛋白质例如GFRAL上)。选择作为核心区截止距离以允许落在范德华半径内的原子加可能的水分子中的氢键内。
边界相互作用界面氨基酸被定义为具有距与GFRAL相互作用蛋白(例如GDF15)相互作用的GFRAL上的核心相互作用界面氨基酸小于或等于的至少一个原子的氨基酸残基(在蛋白质例如GFRAL上)。选择小于或等于 作为边界区截止距离，因为蛋白质与距GFRAL上的核心相互作用界面氨基酸小于的残基结合将落GFRAL相互作用蛋白的范德华半径内。
满足这些距离标准的氨基酸用来自CCG(Chemical Computing Group)的Molecular Operating Environment(MOE)程序计算。
图17显示异二聚体GFRAL/GDF15复合物(如存在于GFRAL/GDF15蛋白晶体的不对称单元中)的示例性实例。二聚分子GDF15具有一个分子间二硫键，发现其因辐射损伤变弱。GDF15分子的一侧可在不对称单元中形成二聚体。图18显示GFRAL/GDF15晶体中GFRAL/GDF15异二聚体的示例性二聚体排列。
图19A-19B说明GFRAL-GDF15界面上蛋白质-蛋白质接触的范围。GFRAL上的接触区用浅灰色箭头标示；GDF15上的接触区用黑色箭头标示。
图20显示参与GFRAL/GDF15界面的GFRAL的3个α-螺旋。多个二硫桥似乎稳定3个GFRALα-螺旋的结构排列。
图21A-21D说明GFRAL/GDF15界面的不同方面和参与形成GFRAL/GDF15界面的GFRAL蛋白和GDF15蛋白的核心和边界氨基酸残基。GFRAL蛋白和GDF15蛋白表示为具有空间实心的曲面图中所示GFRAL/GDF15界面的残基的条带。图21A-21C显示GFRAL蛋白和GDF15蛋白的核心相互作用界面氨基酸。图21D显示边界相互作用界面氨基酸。
全长前体人GFRAL蛋白的氨基酸序列表示如下：
SEQ ID NO:9
GFRAL/GDF15复合物界面处的GFRAL氨基酸见表3。
表3
*按照SEQ ID NO:9的GFRAL氨基酸编号
成熟人GDF15的氨基酸序列如下所示：
ARNGDHCPLG PGRCCRLHTV RASLEDLGWA DWVLSPREVQ VTMCIGACPS
QFRAANMHAQ IKTSLHRLKP DTVPAPCCVP ASYNPMVLIQ KTDTGVSLQT
YDDLLAKDCH CI(SEQ ID NO:6)
GFRAL/GDF15复合物界面处的GDF15残基见表4。
表4
*按照SEQ ID NO:6的GDF15个氨基酸编号
实施例14：GFRAL/RET/GDF15复合物的模型
Goodman et al.(2014)CELL REPORTS 8,1894-1904(PDB 4UX8)描述的RET/GFRα1/GDNF三元复合物用作建立GFRAL/GDF15/RET的复合物的模型的模板(来自GFRAL/GDF15结构，参见例如实施例11-13)。RET/GFRα1/GDNF模板产生于再造的哺乳动物RET(ECD)-GDNF-GFRα1三元复合物的电子显微镜重建(Goodman等，同上)。
为了比较实施例13的GFRAL/GDF15晶体结构和RET/GFRα1/GDNF模板中GFRα1/GDNF的结构的结构相似性，利用来自CCG的MOE，将GFRAL/GDF15晶体中的GFRAL结构与GFRα1/GDNF/RET模型(PDB 4UX8)中的GFRα1重叠。由的GFRAL/GFRα1主链残基的RMSD表明高质量的重叠，因此GFRAL/GFRα1和GFRAL/GDF15复合物的结构相似性。使用这个三元复合物对GFRAL和RET之间的相互作用作图。
图22A-B说明4XU8中GFRAL和GFRα1重叠的示例性方面。主链残基的RMSD为
图23A-D说明RET/GFRAL/GDF15模型中GFRAL蛋白与RET蛋白相互作用的示例性方面。在图23A中，模型化GFRAL/GDF15界面上的相互作用GFRAL和GDF15残基用棒状模型表示。在图23B中，在空间实心的曲面模型中显示了GFRAL上的RET-相互作用残基。在图23C中，在GFRAL和RET上突出显示了核心相互作用残基的空间实心的曲面模型。在图23D中，在GFRAL和RET上突出显示了边界相互作用残基的空间实心的曲面模型。
图24A-B说明模型化RET界面上以空间实心的曲面模型确立的GFRAL蛋白上的核心和边界氨基酸残基。在图24A中，如模型化的GFRAL上的核心残基在空间实心的曲面模型中以较暗的灰色表示。在图24B中，如模型化的GFRAL的边界残基在空间实心的曲面模型中以较浅的灰色表示。
根据该建模，多个GFRAL残基被鉴定为与RET残基相互作用，如表5A所示。另外，多个RET残基被鉴定为与GFRAL残基相互作用，如表5B所示。
表5A
表5B
表6
第1栏—记录名称；第2栏—原子序号；第3栏—原子名称；第4栏—氨基酸残基名称；第5栏—链标识；第6栏—氨基酸残基序列号；第7栏—X的正交坐标，单位埃；第8栏—Y的正交坐标，单位埃；第9栏—Z的正交坐标，单位埃；第10栏—占用；第11栏—温度因子；第11栏11-区段标识；第13栏—元素符号。
虽然参考其具体的实施方案描述了本发明，但本领域技术人员应了解可以进行多种改变，可以替换等同内容而不偏离本发明的精神和范围。另外，可进行许多修改以使具体的情况、材料、组合物、方法、一个或多个方法步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有这类修改意在随附权利要求书的范围内。
序列表
<110> 恩格姆生物制药公司
<120> 用于调节体重的组合物和方法
<130> 13370-052-228
<140> To Be Assigned
<141> Herewith
<150> 62/304,141
<151> 2016-03-04
<160> 67
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 375
<212> PRT
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<220>
<223> 成熟人GFRAL多肽
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Trp Gln Ile Ser Gln Gly Met Gln Tyr Leu Ala Glu Met Lys Leu Val
835 840 845
His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Ala Glu Gly Arg Lys
850 855 860
Met Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg Asp Val Tyr Glu Glu Asp
865 870 875 880
Ser Tyr Val Lys Arg Ser Gln Gly Arg Ile Pro Val Lys Trp Met Ala
885 890 895
Ile Glu Ser Leu Phe Asp His Ile Tyr Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp
900 905 910
Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Val Thr Leu Gly Gly Asn Pro
915 920 925
Tyr Pro Gly Ile Pro Pro Glu Arg Leu Phe Asn Leu Leu Lys Thr Gly
930 935 940
His Arg Met Glu Arg Pro Asp Asn Cys Ser Glu Glu Met Tyr Arg Leu
945 950 955 960
Met Leu Gln Cys Trp Lys Gln Glu Pro Asp Lys Arg Pro Val Phe Ala
965 970 975
Asp Ile Ser Lys Asp Leu Glu Lys Met Met Val Lys Arg Arg Asp Tyr
980 985 990
Leu Asp Leu Ala Ala Ser Thr Pro Ser Asp Ser Leu Ile Tyr Asp Asp
995 1000 1005
Gly Leu Ser Glu Glu Glu Thr Pro Leu Val Asp Cys Asn Asn Ala
1010 1015 1020
Pro Leu Pro Arg Ala Leu Pro Ser Thr Trp Ile Glu Asn Lys Leu
1025 1030 1035
Tyr Gly Arg Ile Ser His Ala Phe Thr Arg Phe
1040 1045
<210> 4
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GFRAL ECD片段
<400> 4
Met Ile Val Phe Ile Phe Leu Ala Met Gly Leu Ser Leu Glu Asn Glu
1 5 10 15
Tyr Thr Ser Gln Thr Asn Asn Cys Thr Tyr Leu Arg Glu Gln Cys Leu
20 25 30
Arg Asp Ala Asn Gly Cys Lys His Ala Trp Arg Val Met Glu Asp Ala
35 40 45
Cys Asn Asp Ser Asp Pro Gly Asp Pro Cys Lys Met Arg Asn Ser Ser
50 55 60
Tyr Cys Asn Leu Ser Ile Gln Tyr Leu Val Glu Ser Asn Phe Gln Phe
65 70 75 80
Lys Glu Cys Leu Cys Thr Asp Asp Phe Tyr Cys Thr Val Asn Lys Leu
85 90 95
Leu Gly Lys Lys Cys Ile Asn Lys Ser Asp Asn Val Lys Glu Asp Lys
100 105 110
Phe Lys Trp Asn Leu Thr Thr Arg Ser His His Gly Phe Lys Gly Met
115 120 125
Trp Ser Cys Leu Glu Val Ala Glu Ala Cys Val Gly Asp Val Val Cys
130 135 140
Asn Ala Gln Leu Ala Ser Tyr Leu Lys Ala Cys Ser Ala Asn Gly Asn
145 150 155 160
Pro Cys Asp Leu Lys Gln Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe Tyr Gln
165 170 175
Asn Ile Pro Phe Asn Ile Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp Cys Ala
180 185 190
Gln Ser Asp Ile Pro Cys Gln Gln Ser Lys Glu Ala Leu His Ser Lys
195 200 205
Thr Cys Ala Val Asn Met Val Pro Pro Pro Thr Cys Leu Ser Val Ile
210 215 220
Arg Ser Cys Gln Asn Asp Glu Leu Cys Arg Arg His Tyr Arg Thr Phe
225 230 235 240
Gln Ser Lys Cys Trp Gln Arg Val Thr Arg Lys Cys His Glu Asp Glu
245 250 255
Asn Cys Ile Ser Thr Leu Ser Lys Gln Asp Leu Thr Cys Ser Gly Ser
260 265 270
Asp Asp Cys Lys Ala Ala Tyr Ile Asp Ile Leu Gly Thr Val Leu Gln
275 280 285
Val Gln Cys Thr Cys Arg Thr Ile Thr Gln Ser Glu Glu Ser Leu Cys
290 295 300
Lys Ile Phe Gln His Met Leu His Arg Lys Ser Cys Phe Asn Tyr Pro
305 310 315 320
Thr Leu Ser Asn Val Lys Gly Met Ala Leu Tyr Thr Arg Lys His Ala
325 330 335
Asn Lys Ile Thr Leu Thr Gly Phe His Ser Pro Phe Asn Gly Glu
340 345 350
<210> 5
<211> 332
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GFRAL ECD
<400> 5
Gln Thr Asn Asn Cys Thr Tyr Leu Arg Glu Gln Cys Leu Arg Asp Ala
1 5 10 15
Asn Gly Cys Lys His Ala Trp Arg Val Met Glu Asp Ala Cys Asn Asp
20 25 30
Ser Asp Pro Gly Asp Pro Cys Lys Met Arg Asn Ser Ser Tyr Cys Asn
35 40 45
Leu Ser Ile Gln Tyr Leu Val Glu Ser Asn Phe Gln Phe Lys Glu Cys
50 55 60
Leu Cys Thr Asp Asp Phe Tyr Cys Thr Val Asn Lys Leu Leu Gly Lys
65 70 75 80
Lys Cys Ile Asn Lys Ser Asp Asn Val Lys Glu Asp Lys Phe Lys Trp
85 90 95
Asn Leu Thr Thr Arg Ser His His Gly Phe Lys Gly Met Trp Ser Cys
100 105 110
Leu Glu Val Ala Glu Ala Cys Val Gly Asp Val Val Cys Asn Ala Gln
115 120 125
Leu Ala Ser Tyr Leu Lys Ala Cys Ser Ala Asn Gly Asn Pro Cys Asp
130 135 140
Leu Lys Gln Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe Tyr Gln Asn Ile Pro
145 150 155 160
Phe Asn Ile Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp Cys Ala Gln Ser Asp
165 170 175
Ile Pro Cys Gln Gln Ser Lys Glu Ala Leu His Ser Lys Thr Cys Ala
180 185 190
Val Asn Met Val Pro Pro Pro Thr Cys Leu Ser Val Ile Arg Ser Cys
195 200 205
Gln Asn Asp Glu Leu Cys Arg Arg His Tyr Arg Thr Phe Gln Ser Lys
210 215 220
Cys Trp Gln Arg Val Thr Arg Lys Cys His Glu Asp Glu Asn Cys Ile
225 230 235 240
Ser Thr Leu Ser Lys Gln Asp Leu Thr Cys Ser Gly Ser Asp Asp Cys
245 250 255
Lys Ala Ala Tyr Ile Asp Ile Leu Gly Thr Val Leu Gln Val Gln Cys
260 265 270
Thr Cys Arg Thr Ile Thr Gln Ser Glu Glu Ser Leu Cys Lys Ile Phe
275 280 285
Gln His Met Leu His Arg Lys Ser Cys Phe Asn Tyr Pro Thr Leu Ser
290 295 300
Asn Val Lys Gly Met Ala Leu Tyr Thr Arg Lys His Ala Asn Lys Ile
305 310 315 320
Thr Leu Thr Gly Phe His Ser Pro Phe Asn Gly Glu
325 330
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 成熟人GDF15多肽
<400> 6
Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
1 5 10 15
Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
20 25 30
Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105 110
<210> 7
<211> 367
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Fc-hGDF15蛋白序列
<400> 7
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
20 25 30
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
35 40 45
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
50 55 60
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
65 70 75 80
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
85 90 95
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
100 105 110
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
115 120 125
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
130 135 140
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
165 170 175
Glu Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
180 185 190
Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
195 200 205
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
210 215 220
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
245 250 255
Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
260 265 270
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
275 280 285
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
290 295 300
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
305 310 315 320
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
325 330 335
Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
340 345 350
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
355 360 365
<210> 8
<211> 274
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> Fc蛋白序列
<400> 8
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
20 25 30
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
35 40 45
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
50 55 60
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
65 70 75 80
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
85 90 95
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
100 105 110
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
115 120 125
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
130 135 140
Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
165 170 175
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser
180 185 190
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
195 200 205
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
210 215 220
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Leu Thr Val Asp
225 230 235 240
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
245 250 255
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
260 265 270
Gly Lys
<210> 9
<211> 394
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 具有信号肽序列的全长前体人GFRAL
<400> 9
Met Ile Val Phe Ile Phe Leu Ala Met Gly Leu Ser Leu Glu Asn Glu
1 5 10 15
Tyr Thr Ser Gln Thr Asn Asn Cys Thr Tyr Leu Arg Glu Gln Cys Leu
20 25 30
Arg Asp Ala Asn Gly Cys Lys His Ala Trp Arg Val Met Glu Asp Ala
35 40 45
Cys Asn Asp Ser Asp Pro Gly Asp Pro Cys Lys Met Arg Asn Ser Ser
50 55 60
Tyr Cys Asn Leu Ser Ile Gln Tyr Leu Val Glu Ser Asn Phe Gln Phe
65 70 75 80
Lys Glu Cys Leu Cys Thr Asp Asp Phe Tyr Cys Thr Val Asn Lys Leu
85 90 95
Leu Gly Lys Lys Cys Ile Asn Lys Ser Asp Asn Val Lys Glu Asp Lys
100 105 110
Phe Lys Trp Asn Leu Thr Thr Arg Ser His His Gly Phe Lys Gly Met
115 120 125
Trp Ser Cys Leu Glu Val Ala Glu Ala Cys Val Gly Asp Val Val Cys
130 135 140
Asn Ala Gln Leu Ala Ser Tyr Leu Lys Ala Cys Ser Ala Asn Gly Asn
145 150 155 160
Pro Cys Asp Leu Lys Gln Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe Tyr Gln
165 170 175
Asn Ile Pro Phe Asn Ile Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp Cys Ala
180 185 190
Gln Ser Asp Ile Pro Cys Gln Gln Ser Lys Glu Ala Leu His Ser Lys
195 200 205
Thr Cys Ala Val Asn Met Val Pro Pro Pro Thr Cys Leu Ser Val Ile
210 215 220
Arg Ser Cys Gln Asn Asp Glu Leu Cys Arg Arg His Tyr Arg Thr Phe
225 230 235 240
Gln Ser Lys Cys Trp Gln Arg Val Thr Arg Lys Cys His Glu Asp Glu
245 250 255
Asn Cys Ile Ser Thr Leu Ser Lys Gln Asp Leu Thr Cys Ser Gly Ser
260 265 270
Asp Asp Cys Lys Ala Ala Tyr Ile Asp Ile Leu Gly Thr Val Leu Gln
275 280 285
Val Gln Cys Thr Cys Arg Thr Ile Thr Gln Ser Glu Glu Ser Leu Cys
290 295 300
Lys Ile Phe Gln His Met Leu His Arg Lys Ser Cys Phe Asn Tyr Pro
305 310 315 320
Thr Leu Ser Asn Val Lys Gly Met Ala Leu Tyr Thr Arg Lys His Ala
325 330 335
Asn Lys Ile Thr Leu Thr Gly Phe His Ser Pro Phe Asn Gly Glu Val
340 345 350
Ile Tyr Ala Ala Met Cys Met Thr Val Thr Cys Gly Ile Leu Leu Leu
355 360 365
Val Met Val Lys Leu Arg Thr Ser Arg Ile Ser Ser Lys Ala Arg Asp
370 375 380
Pro Ser Ser Ile Gln Ile Pro Gly Glu Leu
385 390
<210> 10
<211> 393
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> 小鼠GFRAL蛋白序列
<400> 10
Met Leu Val Phe Ile Phe Leu Ala Val Thr Leu Ser Ser Glu Asn Glu
1 5 10 15
Ser Ser Ser Gln Thr Asn Asp Cys Ala His Leu Ile Gln Lys Cys Leu
20 25 30
Ile Asp Ala Asn Gly Cys Glu Gln Ser Trp Arg Ser Met Glu Asp Thr
35 40 45
Cys Leu Thr Pro Gly Asp Ser Cys Lys Ile Asn Asn Ser Leu His Cys
50 55 60
Asn Leu Ser Ile Gln Ala Leu Val Glu Lys Asn Phe Gln Phe Lys Glu
65 70 75 80
Cys Leu Cys Met Asp Asp Leu His Cys Thr Val Asn Lys Leu Phe Gly
85 90 95
Lys Lys Cys Thr Asn Lys Thr Asp Asn Met Glu Lys Asp Asn Lys Asp
100 105 110
Lys Trp Asn Leu Thr Thr Thr Pro Phe Tyr His Gly Phe Lys Gln Met
115 120 125
Gln Ser Cys Leu Glu Val Thr Glu Ala Cys Val Gly Asp Val Val Cys
130 135 140
Asn Ala Gln Leu Ala Leu Tyr Leu Lys Ala Cys Ser Ala Asn Gly Asn
145 150 155 160
Leu Cys Asp Val Lys His Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe Tyr Gln
165 170 175
Asn Met Pro Phe Asn Thr Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp Cys Ala
180 185 190
Gln Ser Asp Ile Pro Cys Gln Gln Ser Lys Glu Thr Leu His Ser Lys
195 200 205
Pro Cys Ala Leu Asn Ile Val Pro Pro Pro Thr Cys Leu Ser Val Ile
210 215 220
His Thr Cys Arg Asn Asp Glu Leu Cys Arg Thr His Tyr Arg Thr Phe
225 230 235 240
Gln Thr Glu Cys Trp Pro His Ile Thr Gly Lys Cys His Glu Asp Glu
245 250 255
Thr Cys Ile Ser Met Leu Gly Lys Gln Asp Leu Thr Cys Ser Gly Ser
260 265 270
Glu Ser Cys Arg Ala Ala Phe Leu Gly Thr Phe Gly Thr Val Leu Gln
275 280 285
Val Pro Cys Ala Cys Arg Gly Val Thr Gln Ala Glu Glu His Val Cys
290 295 300
Met Ile Phe Gln His Met Leu His Ser Lys Ser Cys Phe Asn Tyr Pro
305 310 315 320
Thr Pro Asn Val Lys Asp Ile Ser Ser Tyr Glu Lys Lys Asn Ser Lys
325 330 335
Glu Ile Thr Leu Thr Gly Phe Asn Ser Phe Phe Asn Gly Glu Leu Leu
340 345 350
Tyr Val Val Val Cys Met Ala Val Thr Cys Gly Ile Leu Phe Leu Val
355 360 365
Met Leu Lys Leu Arg Ile Gln Ser Glu Lys Arg Asp Pro Ser Ser Ile
370 375 380
Glu Ile Ala Gly Gly Val Ile Ile Gln
385 390
<210> 11
<211> 394
<212> PRT
<213> 褐家鼠
<220>
<223> 大鼠GFRAL蛋白序列
<400> 11
Met Leu Val Phe Ile Phe Leu Ala Val Arg Leu Ser Ser Glu Asn Glu
1 5 10 15
Ser Ser Ser Gln Thr Asn Asp Cys Ala Tyr Phe Met Arg Gln Cys Leu
20 25 30
Thr Asp Thr Asp Gly Cys Lys Gln Ser Trp Arg Ser Met Glu Asp Ala
35 40 45
Cys Leu Val Ser Gly Asp Ser Cys Lys Ile Asn Asn Pro Leu Pro Cys
50 55 60
Asn Leu Ser Ile Gln Ser Leu Val Glu Lys His Phe Gln Phe Lys Gly
65 70 75 80
Cys Leu Cys Thr Asp Asp Leu His Cys Thr Val Asn Lys Ile Phe Gly
85 90 95
Lys Lys Cys Thr Asn Lys Thr Asp Ser Met Lys Lys Asp Asn Lys Tyr
100 105 110
Lys Arg Asn Leu Thr Thr Pro Leu Tyr His Asp Thr Gly Phe Lys Gln
115 120 125
Met Gln Ser Cys Leu Glu Val Thr Glu Ala Cys Val Gly Asp Val Val
130 135 140
Cys Asn Ala Gln Leu Ala Leu Tyr Leu Lys Ala Cys Thr Ala Asn Gly
145 150 155 160
Asn Leu Cys Asp Val Lys His Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe Tyr
165 170 175
Gln Asn Met Pro Phe Asn Thr Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp Cys
180 185 190
Ala Gln Ser Asp Ile Pro Cys Gln Gln Ser Lys Glu Thr Leu His Ser
195 200 205
Lys Pro Cys Ala Leu Asn Val Val Pro Pro Pro Thr Cys Leu Ser Val
210 215 220
Ile His Thr Cys Arg Asn Asp Glu Leu Cys Arg Thr Tyr Tyr Arg Thr
225 230 235 240
Phe Gln Thr Glu Cys Trp Pro His Val Ala Gly Lys Cys Arg Glu Asp
245 250 255
Glu Thr Cys Ile Ser Met Leu Gly Lys Gln Asp Leu Thr Cys Ser Gly
260 265 270
Ser Asp Ser Cys Arg Ala Ala Tyr Leu Gly Thr Phe Gly Thr Val Leu
275 280 285
Gln Val Pro Cys Ala Cys Arg Ser Ile Thr Gln Gly Glu Glu Pro Leu
290 295 300
Cys Met Ala Phe Gln His Met Leu His Ser Lys Ser Cys Phe Asn Tyr
305 310 315 320
Pro Thr Pro Asn Val Lys Asp Ile Ser Ser Tyr Glu Arg Lys His Ser
325 330 335
Lys Glu Ile Thr Leu Thr Gly Phe Asn Ser Pro Phe Ser Gly Glu Leu
340 345 350
Ile Tyr Val Val Val Cys Met Val Val Thr Ser Gly Ile Leu Ser Leu
355 360 365
Val Met Leu Lys Leu Arg Ile Pro Ser Lys Lys Arg Asp Pro Ala Pro
370 375 380
Ile Glu Ile Ala Gly Ala Val Ile Ile Gln
385 390
<210> 12
<211> 394
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<220>
<223> 食蟹猴GFRAL蛋白序列
<400> 12
Phe Val Val Val Val Ile Gln Ala Leu Gly Leu Ser Leu Glu Asn Glu
1 5 10 15
Tyr Thr Ser Gln Thr Asn Asn Cys Thr Tyr Leu Arg Glu Gln Cys Leu
20 25 30
His Asp Ala Asn Gly Cys Lys His Ala Trp Arg Ile Met Glu Asp Ala
35 40 45
Cys Asn Asp Ser Asp Pro Gly Asp Pro Cys Lys Met Asn Asn Ser Ser
50 55 60
Tyr Cys Asn Leu Ser Ile Gln Tyr Leu Val Glu Ser Asn Phe Arg Phe
65 70 75 80
Lys Glu Cys Leu Cys Thr Asp Asp Phe Tyr Cys Thr Val Asn Lys Leu
85 90 95
Leu Gly Lys Glu Cys Val Asn Lys Ser Asp Asn Met Arg Glu Asp Lys
100 105 110
Phe Lys Trp Asn Leu Thr Thr His Ser His His Gly Phe Lys Gly Met
115 120 125
Trp Ser Cys Leu Glu Val Ala Glu Ala Cys Val Gly Asp Val Val Cys
130 135 140
Asn Ala Gln Leu Ala Ser Tyr Leu Lys Ala Cys Ser Ala Asn Gly Asn
145 150 155 160
Pro Cys Asp Val Lys His Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe Tyr Gln
165 170 175
Asn Ile Pro Phe Asn Ile Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp Cys Ser
180 185 190
Gln Ser Asp Ile Pro Cys Gln Gln Ser Lys Glu Ala Leu His Ser Lys
195 200 205
Pro Cys Ala Leu Asn Met Val Pro Pro Pro Thr Cys Leu Asn Val Ile
210 215 220
Arg Ser Cys Gln Asn Asp Glu Leu Cys Arg Arg His Tyr Arg Thr Phe
225 230 235 240
Gln Ser Lys Cys Trp Gln Arg Val Thr Arg Lys Cys His Glu Asp Glu
245 250 255
Asn Cys Ile Ser Ala Leu Ser Lys Gln Asp Leu Thr Cys Ser Gly Ser
260 265 270
Asp Asp Cys Lys Ala Ala Tyr Ile Asp Ile Leu Gly Thr Val Leu Gln
275 280 285
Val Gln Cys Asn Cys Arg Thr Ile Thr Gln Ser Glu Glu Ser Leu Cys
290 295 300
Lys Ile Phe Gln His Met Leu His Arg Lys Ser Cys Phe Asn Tyr Pro
305 310 315 320
Thr Leu Ser Asn Val Lys Ser Met Ala Leu Tyr Thr Arg Lys His Thr
325 330 335
Asn Lys Ile Thr Leu Thr Gly Phe Gln Ser Pro Phe Asn Gly Glu Val
340 345 350
Ile Tyr Ala Ala Met Cys Met Thr Val Thr Cys Gly Ile Leu Leu Leu
355 360 365
Val Met Val Lys Leu Arg Thr Ser Arg Ile Ser Ser Lys Ala Arg Asp
370 375 380
Pro Ser Leu Ser Gln Val Pro Gly Glu Leu
385 390
<210> 13
<211> 1114
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人RET51蛋白序列
<400> 13
Met Ala Lys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Gly Leu Arg Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Lys Val Ala Leu Gly Leu Tyr Phe Ser
20 25 30
Arg Asp Ala Tyr Trp Glu Lys Leu Tyr Val Asp Gln Ala Ala Gly Thr
35 40 45
Pro Leu Leu Tyr Val His Ala Leu Arg Asp Ala Pro Glu Glu Val Pro
50 55 60
Ser Phe Arg Leu Gly Gln His Leu Tyr Gly Thr Tyr Arg Thr Arg Leu
65 70 75 80
His Glu Asn Asn Trp Ile Cys Ile Gln Glu Asp Thr Gly Leu Leu Tyr
85 90 95
Leu Asn Arg Ser Leu Asp His Ser Ser Trp Glu Lys Leu Ser Val Arg
100 105 110
Asn Arg Gly Phe Pro Leu Leu Thr Val Tyr Leu Lys Val Phe Leu Ser
115 120 125
Pro Thr Ser Leu Arg Glu Gly Glu Cys Gln Trp Pro Gly Cys Ala Arg
130 135 140
Val Tyr Phe Ser Phe Phe Asn Thr Ser Phe Pro Ala Cys Ser Ser Leu
145 150 155 160
Lys Pro Arg Glu Leu Cys Phe Pro Glu Thr Arg Pro Ser Phe Arg Ile
165 170 175
Arg Glu Asn Arg Pro Pro Gly Thr Phe His Gln Phe Arg Leu Leu Pro
180 185 190
Val Gln Phe Leu Cys Pro Asn Ile Ser Val Ala Tyr Arg Leu Leu Glu
195 200 205
Gly Glu Gly Leu Pro Phe Arg Cys Ala Pro Asp Ser Leu Glu Val Ser
210 215 220
Thr Arg Trp Ala Leu Asp Arg Glu Gln Arg Glu Lys Tyr Glu Leu Val
225 230 235 240
Ala Val Cys Thr Val His Ala Gly Ala Arg Glu Glu Val Val Met Val
245 250 255
Pro Phe Pro Val Thr Val Tyr Asp Glu Asp Asp Ser Ala Pro Thr Phe
260 265 270
Pro Ala Gly Val Asp Thr Ala Ser Ala Val Val Glu Phe Lys Arg Lys
275 280 285
Glu Asp Thr Val Val Ala Thr Leu Arg Val Phe Asp Ala Asp Val Val
290 295 300
Pro Ala Ser Gly Glu Leu Val Arg Arg Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro
305 310 315 320
Gly Asp Thr Trp Ala Gln Gln Thr Phe Arg Val Glu His Trp Pro Asn
325 330 335
Glu Thr Ser Val Gln Ala Asn Gly Ser Phe Val Arg Ala Thr Val His
340 345 350
Asp Tyr Arg Leu Val Leu Asn Arg Asn Leu Ser Ile Ser Glu Asn Arg
355 360 365
Thr Met Gln Leu Ala Val Leu Val Asn Asp Ser Asp Phe Gln Gly Pro
370 375 380
Gly Ala Gly Val Leu Leu Leu His Phe Asn Val Ser Val Leu Pro Val
385 390 395 400
Ser Leu His Leu Pro Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Val Ser Arg Arg Ala
405 410 415
Arg Arg Phe Ala Gln Ile Gly Lys Val Cys Val Glu Asn Cys Gln Ala
420 425 430
Phe Ser Gly Ile Asn Val Gln Tyr Lys Leu His Ser Ser Gly Ala Asn
435 440 445
Cys Ser Thr Leu Gly Val Val Thr Ser Ala Glu Asp Thr Ser Gly Ile
450 455 460
Leu Phe Val Asn Asp Thr Lys Ala Leu Arg Arg Pro Lys Cys Ala Glu
465 470 475 480
Leu His Tyr Met Val Val Ala Thr Asp Gln Gln Thr Ser Arg Gln Ala
485 490 495
Gln Ala Gln Leu Leu Val Thr Val Glu Gly Ser Tyr Val Ala Glu Glu
500 505 510
Ala Gly Cys Pro Leu Ser Cys Ala Val Ser Lys Arg Arg Leu Glu Cys
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<213> 褐家鼠
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545 550 555 560
Asp Gly His Cys Asp Val Val Glu Thr Gln Asp Ile Asn Ile Cys Pro
565 570 575
Gln Asp Cys Leu Arg Gly Ser Ile Val Gly Gly His Glu Pro Gly Glu
580 585 590
Pro Arg Gly Ile Lys Ala Gly Tyr Gly Thr Cys Asn Cys Phe Pro Glu
595 600 605
Glu Glu Lys Cys Phe Cys Glu Pro Glu Asp Ile Gln Asp Pro Leu Cys
610 615 620
Asp Glu Leu Cys Arg Thr Val Ile Ala Ala Ala Val Leu Phe Ser Phe
625 630 635 640
Ile Val Ser Val Leu Leu Ser Ala Phe Cys Ile His Arg Tyr His Lys
645 650 655
Phe Ala His Lys Pro Pro Ile Pro Ser Ala Glu Met Thr Phe Arg Arg
660 665 670
Pro Ala Gln Ala Phe Pro Val Ser Tyr Ser Ser Ser Gly Ala Arg Arg
675 680 685
Pro Ser Leu Asp Ser Met Glu Asn Gln Val Ser Val Asp Ala Phe Lys
690 695 700
Ile Pro Glu Asp Pro Lys Trp Glu Phe Pro Arg Lys Asn Leu Val Leu
705 710 715 720
Gly Lys Thr Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly Lys Val Val Lys Ala Thr
725 730 735
Ala Phe Arg Leu Lys Gly Arg Ala Gly Tyr Thr Thr Val Ala Val Lys
740 745 750
Met Leu Lys Glu Asn Ala Ser Pro Ser Glu Leu Arg Asp Leu Leu Ser
755 760 765
Glu Phe Asn Leu Leu Lys Gln Val Asn His Pro His Val Ile Lys Leu
770 775 780
Tyr Gly Ala Cys Ser Gln Asp Gly Pro Leu Leu Leu Ile Val Glu Tyr
785 790 795 800
Ala Lys Tyr Gly Ser Leu Arg Gly Phe Leu Arg Glu Ser Arg Lys Val
805 810 815
Gly Pro Gly Tyr Leu Gly Ser Gly Gly Ser Arg Asn Ser Ser Ser Leu
820 825 830
Asp His Pro Asp Glu Arg Ala Leu Thr Met Gly Asp Leu Ile Ser Phe
835 840 845
Ala Trp Gln Ile Ser Arg Gly Met Gln Tyr Leu Ala Glu Met Lys Leu
850 855 860
Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Ala Glu Gly Arg
865 870 875 880
Lys Met Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg Asp Val Tyr Glu Glu
885 890 895
Asp Ser Tyr Val Lys Arg Ser Lys Gly Arg Ile Pro Val Lys Trp Met
900 905 910
Ala Ile Glu Ser Leu Phe Asp His Ile Tyr Thr Thr Gln Ser Asp Val
915 920 925
Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Val Thr Leu Gly Gly Asn
930 935 940
Pro Tyr Pro Gly Ile Pro Pro Glu Arg Leu Phe Asn Leu Leu Lys Thr
945 950 955 960
Gly His Arg Met Glu Arg Pro Asp Asn Cys Ser Glu Glu Met Tyr Arg
965 970 975
Leu Met Leu Gln Cys Trp Lys Gln Glu Pro Asp Lys Arg Pro Val Phe
980 985 990
Ala Asp Ile Ser Lys Asp Leu Glu Lys Met Met Val Lys Ser Arg Asp
995 1000 1005
Tyr Leu Asp Leu Ala Ala Ser Thr Pro Ser Asp Ser Leu Leu Tyr
1010 1015 1020
Asp Asp Gly Leu Ser Glu Glu Glu Thr Pro Leu Val Asp Cys Asn
1025 1030 1035
Asn Ala Pro Leu Pro Arg Ala Leu Pro Ser Thr Trp Ile Glu Asn
1040 1045 1050
Lys Leu Tyr Gly Arg Ile Ser His Ala Phe Thr Arg Phe
1055 1060 1065
<210> 21
<211> 586
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gfral-Fc序列
<400> 21
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Thr Asn Asn Cys Thr Tyr Leu Arg Glu
20 25 30
Gln Cys Leu Arg Asp Ala Asn Gly Cys Lys His Ala Trp Arg Val Met
35 40 45
Glu Asp Ala Cys Asn Asp Ser Asp Pro Gly Asp Pro Cys Lys Met Arg
50 55 60
Asn Ser Ser Tyr Cys Asn Leu Ser Ile Gln Tyr Leu Val Glu Ser Asn
65 70 75 80
Phe Gln Phe Lys Glu Cys Leu Cys Thr Asp Asp Phe Tyr Cys Thr Val
85 90 95
Asn Lys Leu Leu Gly Lys Lys Cys Ile Asn Lys Ser Asp Asn Val Lys
100 105 110
Glu Asp Lys Phe Lys Trp Asn Leu Thr Thr Arg Ser His His Gly Phe
115 120 125
Lys Gly Met Trp Ser Cys Leu Glu Val Ala Glu Ala Cys Val Gly Asp
130 135 140
Val Val Cys Asn Ala Gln Leu Ala Ser Tyr Leu Lys Ala Cys Ser Ala
145 150 155 160
Asn Gly Asn Pro Cys Asp Leu Lys Gln Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe
165 170 175
Phe Tyr Gln Asn Ile Pro Phe Asn Ile Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys
180 185 190
Asp Cys Ala Gln Ser Asp Ile Pro Cys Gln Gln Ser Lys Glu Ala Leu
195 200 205
His Ser Lys Thr Cys Ala Val Asn Met Val Pro Pro Pro Thr Cys Leu
210 215 220
Ser Val Ile Arg Ser Cys Gln Asn Asp Glu Leu Cys Arg Arg His Tyr
225 230 235 240
Arg Thr Phe Gln Ser Lys Cys Trp Gln Arg Val Thr Arg Lys Cys His
245 250 255
Glu Asp Glu Asn Cys Ile Ser Thr Leu Ser Lys Gln Asp Leu Thr Cys
260 265 270
Ser Gly Ser Asp Asp Cys Lys Ala Ala Tyr Ile Asp Ile Leu Gly Thr
275 280 285
Val Leu Gln Val Gln Cys Thr Cys Arg Thr Ile Thr Gln Ser Glu Glu
290 295 300
Ser Leu Cys Lys Ile Phe Gln His Met Leu His Arg Lys Ser Cys Phe
305 310 315 320
Asn Tyr Pro Thr Leu Ser Asn Val Lys Gly Met Ala Leu Tyr Thr Arg
325 330 335
Lys His Ala Asn Lys Ile Thr Leu Thr Gly Phe His Ser Pro Phe Asn
340 345 350
Gly Glu Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
355 360 365
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
370 375 380
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
385 390 395 400
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
405 410 415
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
420 425 430
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
435 440 445
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
450 455 460
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
465 470 475 480
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
485 490 495
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
500 505 510
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
515 520 525
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
530 535 540
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
545 550 555 560
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
565 570 575
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580 585
<210> 22
<211> 297
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> GFRAL ECD片段
<400> 22
Gln Thr Asn Asn Cys Thr Tyr Leu Arg Glu Gln Cys Leu Arg Asp Ala
1 5 10 15
Asn Gly Cys Lys His Ala Trp Arg Val Met Glu Asp Ala Cys Asn Asp
20 25 30
Ser Asp Pro Gly Asp Pro Cys Lys Met Arg Asn Ser Ser Tyr Cys Asn
35 40 45
Leu Ser Ile Gln Tyr Leu Val Glu Ser Asn Phe Gln Phe Lys Glu Cys
50 55 60
Leu Cys Thr Asp Asp Phe Tyr Cys Thr Val Asn Lys Leu Leu Gly Lys
65 70 75 80
Lys Cys Ile Asn Lys Ser Asp Asn Val Lys Glu Asp Lys Phe Lys Trp
85 90 95
Asn Leu Thr Thr Arg Ser His His Gly Phe Lys Gly Met Trp Ser Cys
100 105 110
Leu Glu Val Ala Glu Ala Cys Val Gly Asp Val Val Cys Asn Ala Gln
115 120 125
Leu Ala Ser Tyr Leu Lys Ala Cys Ser Ala Asn Gly Asn Pro Cys Asp
130 135 140
Leu Lys Gln Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe Tyr Gln Asn Ile Pro
145 150 155 160
Phe Asn Ile Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp Cys Ala Gln Ser Asp
165 170 175
Ile Pro Cys Gln Gln Ser Lys Glu Ala Leu His Ser Lys Thr Cys Ala
180 185 190
Val Asn Met Val Pro Pro Pro Thr Cys Leu Ser Val Ile Arg Ser Cys
195 200 205
Gln Asn Asp Glu Leu Cys Arg Arg His Tyr Arg Thr Phe Gln Ser Lys
210 215 220
Cys Trp Gln Arg Val Thr Arg Lys Cys His Glu Asp Glu Asn Cys Ile
225 230 235 240
Ser Thr Leu Ser Lys Gln Asp Leu Thr Cys Ser Gly Ser Asp Asp Cys
245 250 255
Lys Ala Ala Tyr Ile Asp Ile Leu Gly Thr Val Leu Gln Val Gln Cys
260 265 270
Thr Cys Arg Thr Ile Thr Gln Ser Glu Glu Ser Leu Cys Lys Ile Phe
275 280 285
Gln His Met Leu His Arg Lys Ser Cys
290 295
<210> 23
<211> 237
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> GFRAL ECD片段
<400> 23
Trp Asn Leu Thr Thr Arg Ser His His Gly Phe Lys Gly Met Trp Ser
1 5 10 15
Cys Leu Glu Val Ala Glu Ala Cys Val Gly Asp Val Val Cys Asn Ala
20 25 30
Gln Leu Ala Ser Tyr Leu Lys Ala Cys Ser Ala Asn Gly Asn Pro Cys
35 40 45
Asp Leu Lys Gln Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe Tyr Gln Asn Ile
50 55 60
Pro Phe Asn Ile Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp Cys Ala Gln Ser
65 70 75 80
Asp Ile Pro Cys Gln Gln Ser Lys Glu Ala Leu His Ser Lys Thr Cys
85 90 95
Ala Val Asn Met Val Pro Pro Pro Thr Cys Leu Ser Val Ile Arg Ser
100 105 110
Cys Gln Asn Asp Glu Leu Cys Arg Arg His Tyr Arg Thr Phe Gln Ser
115 120 125
Lys Cys Trp Gln Arg Val Thr Arg Lys Cys His Glu Asp Glu Asn Cys
130 135 140
Ile Ser Thr Leu Ser Lys Gln Asp Leu Thr Cys Ser Gly Ser Asp Asp
145 150 155 160
Cys Lys Ala Ala Tyr Ile Asp Ile Leu Gly Thr Val Leu Gln Val Gln
165 170 175
Cys Thr Cys Arg Thr Ile Thr Gln Ser Glu Glu Ser Leu Cys Lys Ile
180 185 190
Phe Gln His Met Leu His Arg Lys Ser Cys Phe Asn Tyr Pro Thr Leu
195 200 205
Ser Asn Val Lys Gly Met Ala Leu Tyr Thr Arg Lys His Ala Asn Lys
210 215 220
Ile Thr Leu Thr Gly Phe His Ser Pro Phe Asn Gly Glu
225 230 235
<210> 24
<211> 733
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSA-hGDF15蛋白序列
<400> 24
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg
20 25 30
Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala
35 40 45
Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu
50 55 60
Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser
65 70 75 80
Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu
85 90 95
Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys
100 105 110
Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys
115 120 125
Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val
130 135 140
Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr
145 150 155 160
Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu
165 170 175
Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln
180 185 190
Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg
195 200 205
Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser
210 215 220
Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg
225 230 235 240
Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu
245 250 255
Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu
260 265 270
Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu
275 280 285
Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro
290 295 300
Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met
305 310 315 320
Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp
325 330 335
Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe
340 345 350
Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu
355 360 365
Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala
370 375 380
Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys
385 390 395 400
Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu
405 410 415
Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg
420 425 430
Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val
435 440 445
Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu
450 455 460
Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn
465 470 475 480
Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr
485 490 495
Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala
500 505 510
Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr
515 520 525
Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln
530 535 540
Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys
545 550 555 560
Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe
565 570 575
Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu
580 585 590
Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly
595 600 605
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Glu Gly Arg Ala Arg Asn
610 615 620
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
625 630 635 640
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
645 650 655
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
660 665 670
Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
675 680 685
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
690 695 700
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln
705 710 715 720
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
725 730
<210> 25
<211> 308
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 前体人GDF15多肽
<400> 25
Met Pro Gly Gln Glu Leu Arg Thr Val Asn Gly Ser Gln Met Leu Leu
1 5 10 15
Val Leu Leu Val Leu Ser Trp Leu Pro His Gly Gly Ala Leu Ser Leu
20 25 30
Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro Gly Pro Ser Glu Leu His Ser
35 40 45
Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu
50 55 60
Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln Ser Trp Glu Asp Ser Asn Thr Asp Leu
65 70 75 80
Val Pro Ala Pro Ala Val Arg Ile Leu Thr Pro Glu Val Arg Leu Gly
85 90 95
Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile Ser Arg Ala Ala Leu Pro Glu
100 105 110
Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg Leu His Arg Ala Leu Phe Arg Leu Ser
115 120 125
Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp Asp Val Thr Arg Pro Leu Arg Arg Gln
130 135 140
Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln Ala Pro Ala Leu His Leu Arg Leu Ser
145 150 155 160
Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp Gln Leu Leu Ala Glu Ser Ser Ser Ala
165 170 175
Arg Pro Gln Leu Glu Leu His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg
180 185 190
Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly
195 200 205
Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly
210 215 220
Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys
225 230 235 240
Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln
245 250 255
Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro
260 265 270
Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr
275 280 285
Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp
290 295 300
Cys His Cys Ile
305
<210> 26
<211> 1072
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 全长前体人RET蛋白
<400> 26
Met Ala Lys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Gly Leu Arg Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Lys Val Ala Leu Gly Leu Tyr Phe Ser
20 25 30
Arg Asp Ala Tyr Trp Glu Lys Leu Tyr Val Asp Gln Ala Ala Gly Thr
35 40 45
Pro Leu Leu Tyr Val His Ala Leu Arg Asp Ala Pro Glu Glu Val Pro
50 55 60
Ser Phe Arg Leu Gly Gln His Leu Tyr Gly Thr Tyr Arg Thr Arg Leu
65 70 75 80
His Glu Asn Asn Trp Ile Cys Ile Gln Glu Asp Thr Gly Leu Leu Tyr
85 90 95
Leu Asn Arg Ser Leu Asp His Ser Ser Trp Glu Lys Leu Ser Val Arg
100 105 110
Asn Arg Gly Phe Pro Leu Leu Thr Val Tyr Leu Lys Val Phe Leu Ser
115 120 125
Pro Thr Ser Leu Arg Glu Gly Glu Cys Gln Trp Pro Gly Cys Ala Arg
130 135 140
Val Tyr Phe Ser Phe Phe Asn Thr Ser Phe Pro Ala Cys Ser Ser Leu
145 150 155 160
Lys Pro Arg Glu Leu Cys Phe Pro Glu Thr Arg Pro Ser Phe Arg Ile
165 170 175
Arg Glu Asn Arg Pro Pro Gly Thr Phe His Gln Phe Arg Leu Leu Pro
180 185 190
Val Gln Phe Leu Cys Pro Asn Ile Ser Val Ala Tyr Arg Leu Leu Glu
195 200 205
Gly Glu Gly Leu Pro Phe Arg Cys Ala Pro Asp Ser Leu Glu Val Ser
210 215 220
Thr Arg Trp Ala Leu Asp Arg Glu Gln Arg Glu Lys Tyr Glu Leu Val
225 230 235 240
Ala Val Cys Thr Val His Ala Gly Ala Arg Glu Glu Val Val Met Val
245 250 255
Pro Phe Pro Val Thr Val Tyr Asp Glu Asp Asp Ser Ala Pro Thr Phe
260 265 270
Pro Ala Gly Val Asp Thr Ala Ser Ala Val Val Glu Phe Lys Arg Lys
275 280 285
Glu Asp Thr Val Val Ala Thr Leu Arg Val Phe Asp Ala Asp Val Val
290 295 300
Pro Ala Ser Gly Glu Leu Val Arg Arg Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro
305 310 315 320
Gly Asp Thr Trp Ala Gln Gln Thr Phe Arg Val Glu His Trp Pro Asn
325 330 335
Glu Thr Ser Val Gln Ala Asn Gly Ser Phe Val Arg Ala Thr Val His
340 345 350
Asp Tyr Arg Leu Val Leu Asn Arg Asn Leu Ser Ile Ser Glu Asn Arg
355 360 365
Thr Met Gln Leu Ala Val Leu Val Asn Asp Ser Asp Phe Gln Gly Pro
370 375 380
Gly Ala Gly Val Leu Leu Leu His Phe Asn Val Ser Val Leu Pro Val
385 390 395 400
Ser Leu His Leu Pro Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Val Ser Arg Arg Ala
405 410 415
Arg Arg Phe Ala Gln Ile Gly Lys Val Cys Val Glu Asn Cys Gln Ala
420 425 430
Phe Ser Gly Ile Asn Val Gln Tyr Lys Leu His Ser Ser Gly Ala Asn
435 440 445
Cys Ser Thr Leu Gly Val Val Thr Ser Ala Glu Asp Thr Ser Gly Ile
450 455 460
Leu Phe Val Asn Asp Thr Lys Ala Leu Arg Arg Pro Lys Cys Ala Glu
465 470 475 480
Leu His Tyr Met Val Val Ala Thr Asp Gln Gln Thr Ser Arg Gln Ala
485 490 495
Gln Ala Gln Leu Leu Val Thr Val Glu Gly Ser Tyr Val Ala Glu Glu
500 505 510
Ala Gly Cys Pro Leu Ser Cys Ala Val Ser Lys Arg Arg Leu Glu Cys
515 520 525
Glu Glu Cys Gly Gly Leu Gly Ser Pro Thr Gly Arg Cys Glu Trp Arg
530 535 540
Gln Gly Asp Gly Lys Gly Ile Thr Arg Asn Phe Ser Thr Cys Ser Pro
545 550 555 560
Ser Thr Lys Thr Cys Pro Asp Gly His Cys Asp Val Val Glu Thr Gln
565 570 575
Asp Ile Asn Ile Cys Pro Gln Asp Cys Leu Arg Gly Ser Ile Val Gly
580 585 590
Gly His Glu Pro Gly Glu Pro Arg Gly Ile Lys Ala Gly Tyr Gly Thr
595 600 605
Cys Asn Cys Phe Pro Glu Glu Glu Lys Cys Phe Cys Glu Pro Glu Asp
610 615 620
Ile Gln Asp Pro Leu Cys Asp Glu Leu Cys Arg Thr Val Ile Ala Ala
625 630 635 640
Ala Val Leu Phe Ser Phe Ile Val Ser Val Leu Leu Ser Ala Phe Cys
645 650 655
Ile His Cys Tyr His Lys Phe Ala His Lys Pro Pro Ile Ser Ser Ala
660 665 670
Glu Met Thr Phe Arg Arg Pro Ala Gln Ala Phe Pro Val Ser Tyr Ser
675 680 685
Ser Ser Gly Ala Arg Arg Pro Ser Leu Asp Ser Met Glu Asn Gln Val
690 695 700
Ser Val Asp Ala Phe Lys Ile Leu Glu Asp Pro Lys Trp Glu Phe Pro
705 710 715 720
Arg Lys Asn Leu Val Leu Gly Lys Thr Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly
725 730 735
Lys Val Val Lys Ala Thr Ala Phe His Leu Lys Gly Arg Ala Gly Tyr
740 745 750
Thr Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Asn Ala Ser Pro Ser Glu
755 760 765
Leu Arg Asp Leu Leu Ser Glu Phe Asn Val Leu Lys Gln Val Asn His
770 775 780
Pro His Val Ile Lys Leu Tyr Gly Ala Cys Ser Gln Asp Gly Pro Leu
785 790 795 800
Leu Leu Ile Val Glu Tyr Ala Lys Tyr Gly Ser Leu Arg Gly Phe Leu
805 810 815
Arg Glu Ser Arg Lys Val Gly Pro Gly Tyr Leu Gly Ser Gly Gly Ser
820 825 830
Arg Asn Ser Ser Ser Leu Asp His Pro Asp Glu Arg Ala Leu Thr Met
835 840 845
Gly Asp Leu Ile Ser Phe Ala Trp Gln Ile Ser Gln Gly Met Gln Tyr
850 855 860
Leu Ala Glu Met Lys Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile
865 870 875 880
Leu Val Ala Glu Gly Arg Lys Met Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser
885 890 895
Arg Asp Val Tyr Glu Glu Asp Ser Tyr Val Lys Arg Ser Gln Gly Arg
900 905 910
Ile Pro Val Lys Trp Met Ala Ile Glu Ser Leu Phe Asp His Ile Tyr
915 920 925
Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile
930 935 940
Val Thr Leu Gly Gly Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Pro Pro Glu Arg Leu
945 950 955 960
Phe Asn Leu Leu Lys Thr Gly His Arg Met Glu Arg Pro Asp Asn Cys
965 970 975
Ser Glu Glu Met Tyr Arg Leu Met Leu Gln Cys Trp Lys Gln Glu Pro
980 985 990
Asp Lys Arg Pro Val Phe Ala Asp Ile Ser Lys Asp Leu Glu Lys Met
995 1000 1005
Met Val Lys Arg Arg Asp Tyr Leu Asp Leu Ala Ala Ser Thr Pro
1010 1015 1020
Ser Asp Ser Leu Ile Tyr Asp Asp Gly Leu Ser Glu Glu Glu Thr
1025 1030 1035
Pro Leu Val Asp Cys Asn Asn Ala Pro Leu Pro Arg Ala Leu Pro
1040 1045 1050
Ser Thr Trp Ile Glu Asn Lys Leu Tyr Gly Arg Ile Ser His Ala
1055 1060 1065
Phe Thr Arg Phe
1070
<210> 27
<211> 612
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RET-ECD
<400> 27
Lys Val Ala Leu Gly Leu Tyr Phe Ser Arg Asp Ala Tyr Trp Glu Lys
1 5 10 15
Leu Tyr Val Asp Gln Ala Ala Gly Thr Pro Leu Leu Tyr Val His Ala
20 25 30
Leu Arg Asp Ala Pro Glu Glu Val Pro Ser Phe Arg Leu Gly Gln His
35 40 45
Leu Tyr Gly Thr Tyr Arg Thr Arg Leu His Glu Asn Asn Trp Ile Cys
50 55 60
Ile Gln Glu Asp Thr Gly Leu Leu Tyr Leu Asn Arg Ser Leu Asp His
65 70 75 80
Ser Ser Trp Glu Lys Leu Ser Val Arg Asn Arg Gly Phe Pro Leu Leu
85 90 95
Thr Val Tyr Leu Lys Val Phe Leu Ser Pro Thr Ser Leu Arg Glu Gly
100 105 110
Glu Cys Gln Trp Pro Gly Cys Ala Arg Val Tyr Phe Ser Phe Phe Asn
115 120 125
Thr Ser Phe Pro Ala Cys Ser Ser Leu Lys Pro Arg Glu Leu Cys Phe
130 135 140
Pro Glu Thr Arg Pro Ser Phe Arg Ile Arg Glu Asn Arg Pro Pro Gly
145 150 155 160
Thr Phe His Gln Phe Arg Leu Leu Pro Val Gln Phe Leu Cys Pro Asn
165 170 175
Ile Ser Val Ala Tyr Arg Leu Leu Glu Gly Glu Gly Leu Pro Phe Arg
180 185 190
Cys Ala Pro Asp Ser Leu Glu Val Ser Thr Arg Trp Ala Leu Asp Arg
195 200 205
Glu Gln Arg Glu Lys Tyr Glu Leu Val Ala Val Cys Thr Val His Ala
210 215 220
Gly Ala Arg Glu Glu Val Val Met Val Pro Phe Pro Val Thr Val Tyr
225 230 235 240
Asp Glu Asp Asp Ser Ala Pro Thr Phe Pro Ala Gly Val Asp Thr Ala
245 250 255
Ser Ala Val Val Glu Phe Lys Arg Lys Glu Asp Thr Val Val Ala Thr
260 265 270
Leu Arg Val Phe Asp Ala Asp Val Val Pro Ala Ser Gly Glu Leu Val
275 280 285
Arg Arg Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Gly Asp Thr Trp Ala Gln Gln
290 295 300
Thr Phe Arg Val Glu His Trp Pro Asn Glu Thr Ser Val Gln Ala Asn
305 310 315 320
Gly Ser Phe Val Arg Ala Thr Val His Asp Tyr Arg Leu Val Leu Asn
325 330 335
Arg Asn Leu Ser Ile Ser Glu Asn Arg Thr Met Gln Leu Ala Val Leu
340 345 350
Val Asn Asp Ser Asp Phe Gln Gly Pro Gly Ala Gly Val Leu Leu Leu
355 360 365
His Phe Asn Val Ser Val Leu Pro Val Ser Leu His Leu Pro Ser Thr
370 375 380
Tyr Ser Leu Ser Val Ser Arg Arg Ala Arg Arg Phe Ala Gln Ile Gly
385 390 395 400
Lys Val Cys Val Glu Asn Cys Gln Ala Phe Ser Gly Ile Asn Val Gln
405 410 415
Tyr Lys Leu His Ser Ser Gly Ala Asn Cys Ser Thr Leu Gly Val Val
420 425 430
Thr Ser Ala Glu Asp Thr Ser Gly Ile Leu Phe Val Asn Asp Thr Lys
435 440 445
Ala Leu Arg Arg Pro Lys Cys Ala Glu Leu His Tyr Met Val Val Ala
450 455 460
Thr Asp Gln Gln Thr Ser Arg Gln Ala Gln Ala Gln Leu Leu Val Thr
465 470 475 480
Val Glu Gly Ser Tyr Val Ala Glu Glu Ala Gly Cys Pro Leu Ser Cys
485 490 495
Ala Val Ser Lys Arg Arg Leu Glu Cys Glu Glu Cys Gly Gly Leu Gly
500 505 510
Ser Pro Thr Gly Arg Cys Glu Trp Arg Gln Gly Asp Gly Lys Gly Ile
515 520 525
Thr Arg Asn Phe Ser Thr Cys Ser Pro Ser Thr Lys Thr Cys Pro Asp
530 535 540
Gly His Cys Asp Val Val Glu Thr Gln Asp Ile Asn Ile Cys Pro Gln
545 550 555 560
Asp Cys Leu Arg Gly Ser Ile Val Gly Gly His Glu Pro Gly Glu Pro
565 570 575
Arg Gly Ile Lys Ala Gly Tyr Gly Thr Cys Asn Cys Phe Pro Glu Glu
580 585 590
Glu Lys Cys Phe Cys Glu Pro Glu Asp Ile Gln Asp Pro Leu Cys Asp
595 600 605
Glu Leu Cys Arg
610
<210> 28
<211> 607
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RET-ECD
<400> 28
Leu Tyr Phe Ser Arg Asp Ala Tyr Trp Glu Lys Leu Tyr Val Asp Gln
1 5 10 15
Ala Ala Gly Thr Pro Leu Leu Tyr Val His Ala Leu Arg Asp Ala Pro
20 25 30
Glu Glu Val Pro Ser Phe Arg Leu Gly Gln His Leu Tyr Gly Thr Tyr
35 40 45
Arg Thr Arg Leu His Glu Asn Asn Trp Ile Cys Ile Gln Glu Asp Thr
50 55 60
Gly Leu Leu Tyr Leu Asn Arg Ser Leu Asp His Ser Ser Trp Glu Lys
65 70 75 80
Leu Ser Val Arg Asn Arg Gly Phe Pro Leu Leu Thr Val Tyr Leu Lys
85 90 95
Val Phe Leu Ser Pro Thr Ser Leu Arg Glu Gly Glu Cys Gln Trp Pro
100 105 110
Gly Cys Ala Arg Val Tyr Phe Ser Phe Phe Asn Thr Ser Phe Pro Ala
115 120 125
Cys Ser Ser Leu Lys Pro Arg Glu Leu Cys Phe Pro Glu Thr Arg Pro
130 135 140
Ser Phe Arg Ile Arg Glu Asn Arg Pro Pro Gly Thr Phe His Gln Phe
145 150 155 160
Arg Leu Leu Pro Val Gln Phe Leu Cys Pro Asn Ile Ser Val Ala Tyr
165 170 175
Arg Leu Leu Glu Gly Glu Gly Leu Pro Phe Arg Cys Ala Pro Asp Ser
180 185 190
Leu Glu Val Ser Thr Arg Trp Ala Leu Asp Arg Glu Gln Arg Glu Lys
195 200 205
Tyr Glu Leu Val Ala Val Cys Thr Val His Ala Gly Ala Arg Glu Glu
210 215 220
Val Val Met Val Pro Phe Pro Val Thr Val Tyr Asp Glu Asp Asp Ser
225 230 235 240
Ala Pro Thr Phe Pro Ala Gly Val Asp Thr Ala Ser Ala Val Val Glu
245 250 255
Phe Lys Arg Lys Glu Asp Thr Val Val Ala Thr Leu Arg Val Phe Asp
260 265 270
Ala Asp Val Val Pro Ala Ser Gly Glu Leu Val Arg Arg Tyr Thr Ser
275 280 285
Thr Leu Leu Pro Gly Asp Thr Trp Ala Gln Gln Thr Phe Arg Val Glu
290 295 300
His Trp Pro Asn Glu Thr Ser Val Gln Ala Asn Gly Ser Phe Val Arg
305 310 315 320
Ala Thr Val His Asp Tyr Arg Leu Val Leu Asn Arg Asn Leu Ser Ile
325 330 335
Ser Glu Asn Arg Thr Met Gln Leu Ala Val Leu Val Asn Asp Ser Asp
340 345 350
Phe Gln Gly Pro Gly Ala Gly Val Leu Leu Leu His Phe Asn Val Ser
355 360 365
Val Leu Pro Val Ser Leu His Leu Pro Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Val
370 375 380
Ser Arg Arg Ala Arg Arg Phe Ala Gln Ile Gly Lys Val Cys Val Glu
385 390 395 400
Asn Cys Gln Ala Phe Ser Gly Ile Asn Val Gln Tyr Lys Leu His Ser
405 410 415
Ser Gly Ala Asn Cys Ser Thr Leu Gly Val Val Thr Ser Ala Glu Asp
420 425 430
Thr Ser Gly Ile Leu Phe Val Asn Asp Thr Lys Ala Leu Arg Arg Pro
435 440 445
Lys Cys Ala Glu Leu His Tyr Met Val Val Ala Thr Asp Gln Gln Thr
450 455 460
Ser Arg Gln Ala Gln Ala Gln Leu Leu Val Thr Val Glu Gly Ser Tyr
465 470 475 480
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Arg Leu Glu Cys Glu Glu Cys Gly Gly Leu Gly Ser Pro Thr Gly Arg
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Ser Ile Val Gly Gly His Glu Pro Gly Glu Pro Arg Gly Ile Lys Ala
565 570 575
Gly Tyr Gly Thr Cys Asn Cys Phe Pro Glu Glu Glu Lys Cys Phe Cys
580 585 590
Glu Pro Glu Asp Ile Gln Asp Pro Leu Cys Asp Glu Leu Cys Arg
595 600 605
<210> 29
<211> 607
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RET-ECD片段
<400> 29
Leu Tyr Phe Ser Arg Asp Ala Tyr Trp Glu Lys Leu Tyr Val Asp Gln
1 5 10 15
Ala Ala Gly Thr Pro Leu Leu Tyr Val His Ala Leu Arg Asp Ala Pro
20 25 30
Glu Glu Val Pro Ser Phe Arg Leu Gly Gln His Leu Tyr Gly Thr Tyr
35 40 45
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50 55 60
Gly Leu Leu Tyr Leu Asn Arg Ser Leu Asp His Ser Ser Trp Glu Lys
65 70 75 80
Leu Ser Val Arg Asn Arg Gly Phe Pro Leu Leu Thr Val Tyr Leu Lys
85 90 95
Val Phe Leu Ser Pro Thr Ser Leu Arg Glu Gly Glu Cys Gln Trp Pro
100 105 110
Gly Cys Ala Arg Val Tyr Phe Ser Phe Phe Asn Thr Ser Phe Pro Ala
115 120 125
Cys Ser Ser Leu Lys Pro Arg Glu Leu Cys Phe Pro Glu Thr Arg Pro
130 135 140
Ser Phe Arg Ile Arg Glu Asn Arg Pro Pro Gly Thr Phe His Gln Phe
145 150 155 160
Arg Leu Leu Pro Val Gln Phe Leu Cys Pro Asn Ile Ser Val Ala Tyr
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Arg Leu Leu Glu Gly Glu Gly Leu Pro Phe Arg Cys Ala Pro Asp Ser
180 185 190
Leu Glu Val Ser Thr Arg Trp Ala Leu Asp Arg Glu Gln Arg Glu Lys
195 200 205
Tyr Glu Leu Val Ala Val Cys Thr Val His Ala Gly Ala Arg Glu Glu
210 215 220
Val Val Met Val Pro Phe Pro Val Thr Val Tyr Asp Glu Asp Asp Ser
225 230 235 240
Ala Pro Thr Phe Pro Ala Gly Val Asp Thr Ala Ser Ala Val Val Glu
245 250 255
Phe Lys Arg Lys Glu Asp Thr Val Val Ala Thr Leu Arg Val Phe Asp
260 265 270
Ala Asp Val Val Pro Ala Ser Gly Glu Leu Val Arg Arg Tyr Thr Ser
275 280 285
Thr Leu Leu Pro Gly Asp Thr Trp Ala Gln Gln Thr Phe Arg Val Glu
290 295 300
His Trp Pro Asn Glu Thr Ser Val Gln Ala Asn Gly Ser Phe Val Arg
305 310 315 320
Ala Thr Val His Asp Tyr Arg Leu Val Leu Asn Arg Asn Leu Ser Ile
325 330 335
Ser Glu Asn Arg Thr Met Gln Leu Ala Val Leu Val Asn Asp Ser Asp
340 345 350
Phe Gln Gly Pro Gly Ala Gly Val Leu Leu Leu His Phe Asn Val Ser
355 360 365
Val Leu Pro Val Ser Leu His Leu Pro Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Val
370 375 380
Ser Arg Arg Ala Arg Arg Phe Ala Gln Ile Gly Lys Val Cys Val Glu
385 390 395 400
Asn Cys Gln Ala Phe Ser Gly Ile Asn Val Gln Tyr Lys Leu His Ser
405 410 415
Ser Gly Ala Asn Cys Ser Thr Leu Gly Val Val Thr Ser Ala Glu Asp
420 425 430
Thr Ser Gly Ile Leu Phe Val Asn Asp Thr Lys Ala Leu Arg Arg Pro
435 440 445
Lys Cys Ala Glu Leu His Tyr Met Val Val Ala Thr Asp Gln Gln Thr
450 455 460
Ser Arg Gln Ala Gln Ala Gln Leu Leu Val Thr Val Glu Gly Ser Tyr
465 470 475 480
Val Ala Glu Glu Ala Gly Cys Pro Leu Ser Cys Ala Val Ser Lys Arg
485 490 495
Arg Leu Glu Cys Glu Glu Cys Gly Gly Leu Gly Ser Pro Thr Gly Arg
500 505 510
Cys Glu Trp Arg Gln Gly Asp Gly Lys Gly Ile Thr Arg Asn Phe Ser
515 520 525
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530 535 540
Val Glu Thr Gln Asp Ile Asn Ile Cys Pro Gln Asp Cys Leu Arg Gly
545 550 555 560
Ser Ile Val Gly Gly His Glu Pro Gly Glu Pro Arg Gly Ile Lys Ala
565 570 575
Gly Tyr Gly Thr Cys Asn Cys Phe Pro Glu Glu Glu Lys Cys Phe Cys
580 585 590
Glu Pro Glu Asp Ile Gln Asp Pro Leu Cys Asp Glu Leu Cys Arg
595 600 605
<210> 30
<211> 394
<212> PRT
<213> 黑猩猩
<220>
<223> 黑猩猩GFRAL蛋白
<400> 30
Met Ile Val Phe Ile Phe Leu Ala Met Gly Leu Ser Leu Glu Asn Glu
1 5 10 15
Tyr Thr Ser Gln Thr Asn Asn Cys Thr Tyr Leu Arg Glu Gln Cys Leu
20 25 30
Arg Asp Ala Asn Gly Cys Lys His Ala Trp Arg Val Met Glu Asp Ala
35 40 45
Cys Asn Asp Ser Asp Pro Gly Asp Pro Cys Lys Met Arg Asn Ser Ser
50 55 60
Tyr Cys Asn Leu Ser Ile Gln Tyr Leu Val Glu Ser Asn Phe Gln Phe
65 70 75 80
Lys Glu Cys Leu Cys Thr Asp Asp Phe Tyr Cys Thr Val Asn Lys Leu
85 90 95
Leu Gly Lys Lys Cys Ile Asn Lys Ser Asp Asn Val Lys Glu Asp Lys
100 105 110
Phe Lys Trp Asn Leu Thr Thr Arg Ser His His Gly Phe Lys Gly Met
115 120 125
Trp Ser Cys Leu Glu Val Ala Glu Ala Cys Val Gly Asp Val Val Cys
130 135 140
Asn Ala Gln Leu Ala Ser Tyr Leu Lys Ala Cys Ser Ala Asn Gly Asn
145 150 155 160
Pro Cys Asp Val Lys Gln Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe Tyr Gln
165 170 175
Asn Ile Pro Phe Asn Ile Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp Cys Ala
180 185 190
Gln Ser Asp Ile Pro Cys Gln Gln Ser Lys Glu Ala Leu His Ser Lys
195 200 205
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210 215 220
Arg Ser Cys Gln Asn Asp Glu Leu Cys Arg Arg His Tyr Arg Thr Phe
225 230 235 240
Gln Ser Lys Cys Trp Gln Arg Val Thr Arg Lys Cys His Glu Asp Glu
245 250 255
Asn Cys Ile Ser Ala Leu Ser Lys Gln Asp Leu Thr Cys Ser Gly Ser
260 265 270
Asp Asp Cys Lys Ala Ala Tyr Ile Asp Ile Leu Gly Thr Val Leu Gln
275 280 285
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290 295 300
Lys Ile Phe Gln His Met Leu His Arg Lys Ser Cys Phe Asn Tyr Pro
305 310 315 320
Thr Leu Ser Asn Val Lys Gly Met Ala Leu Tyr Thr Arg Lys His Ala
325 330 335
Asn Lys Ile Thr Leu Thr Gly Phe His Ser Pro Phe Asn Gly Glu Val
340 345 350
Ile Tyr Ala Ala Met Cys Met Thr Val Thr Cys Gly Ile Leu Leu Leu
355 360 365
Val Met Val Lys Leu Arg Thr Ser Arg Ile Ser Ser Lys Ala Arg Asp
370 375 380
Pro Ser Pro Ile Gln Ile Pro Gly Glu Leu
385 390
<210> 31
<211> 394
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<220>
<223> 食蟹猴GFRAL蛋白
<400> 31
Phe Val Val Val Val Ile Gln Ala Leu Gly Leu Ser Leu Glu Asn Glu
1 5 10 15
Tyr Thr Ser Gln Thr Asn Asn Cys Thr Tyr Leu Arg Glu Gln Cys Leu
20 25 30
His Asp Ala Asn Gly Cys Lys His Ala Trp Arg Ile Met Glu Asp Ala
35 40 45
Cys Asn Asp Ser Asp Pro Gly Asp Pro Cys Lys Met Asn Asn Ser Ser
50 55 60
Tyr Cys Asn Leu Ser Ile Gln Tyr Leu Val Glu Ser Asn Phe Arg Phe
65 70 75 80
Lys Glu Cys Leu Cys Thr Asp Asp Phe Tyr Cys Thr Val Asn Lys Leu
85 90 95
Leu Gly Lys Glu Cys Val Asn Lys Ser Asp Asn Met Arg Glu Asp Lys
100 105 110
Phe Lys Trp Asn Leu Thr Thr His Ser His His Gly Phe Lys Gly Met
115 120 125
Trp Ser Cys Leu Glu Val Ala Glu Ala Cys Val Gly Asp Val Val Cys
130 135 140
Asn Ala Gln Leu Ala Ser Tyr Leu Lys Ala Cys Ser Ala Asn Gly Asn
145 150 155 160
Pro Cys Asp Val Lys His Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe Tyr Gln
165 170 175
Asn Ile Pro Phe Asn Ile Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp Cys Ser
180 185 190
Gln Ser Asp Ile Pro Cys Gln Gln Ser Lys Glu Ala Leu His Ser Lys
195 200 205
Pro Cys Ala Leu Asn Met Val Pro Pro Pro Thr Cys Leu Asn Val Ile
210 215 220
Arg Ser Cys Gln Asn Asp Glu Leu Cys Arg Arg His Tyr Arg Thr Phe
225 230 235 240
Gln Thr Lys Cys Trp Gln Arg Val Thr Arg Lys Cys His Glu Asp Glu
245 250 255
Asn Cys Ile Ser Ala Leu Ser Lys Gln Asp Leu Thr Cys Ser Gly Ser
260 265 270
Asp Asp Cys Lys Ala Ala Tyr Ile Asp Ile Leu Gly Thr Val Leu Gln
275 280 285
Val Gln Cys Asn Cys Arg Thr Ile Thr Gln Ser Glu Glu Ser Leu Cys
290 295 300
Lys Ile Phe Gln His Met Leu His Arg Lys Ser Cys Phe Asn Tyr Pro
305 310 315 320
Thr Leu Ser Asn Val Lys Ser Met Ala Leu Tyr Thr Arg Lys His Thr
325 330 335
Asn Lys Ile Thr Leu Thr Gly Phe Gln Ser Pro Phe Asn Gly Glu Val
340 345 350
Ile Tyr Ala Ala Met Cys Met Thr Val Thr Cys Gly Ile Leu Leu Leu
355 360 365
Val Met Val Lys Leu Arg Thr Ser Arg Ile Ser Ser Lys Ala Arg Asp
370 375 380
Pro Ser Leu Ser Gln Val Pro Gly Glu Leu
385 390
<210> 32
<211> 395
<212> PRT
<213> 大熊猫
<220>
<223> 大熊猫GFRAL蛋白
<400> 32
Met Val Val Phe Ile Phe Leu Ala Val Ala Leu Cys Leu Glu Asn Glu
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Thr Ile Asp Cys Thr Tyr Leu Arg Glu Gln Cys Leu
20 25 30
Arg Asp Ala Asn Gly Cys Lys His Ala Trp Arg Ile Met Glu Asp Ser
35 40 45
Cys Asn Val Ser Glu Pro Gly Asn Pro Cys Lys Met Lys Asp Ser Ser
50 55 60
Lys Cys Asn Leu Ser Ile Gln Ser Leu Val Glu Ser Asn Phe Gln Phe
65 70 75 80
Glu Asp Cys Leu Cys Thr Asp Asn Leu Tyr Cys Thr Ile Asn Lys Leu
85 90 95
Leu Gly Glu Gln Cys Ile Asn Glu Ser Gly Asn Val Lys Glu Asp Asn
100 105 110
Gln Ser Lys Trp Asn Leu Thr Thr Leu Pro Tyr Gln Gly Ile Lys Gly
115 120 125
Ile Gln Ser Cys Leu Glu Val Ala Glu Ala Cys Val Gly Asp Val Val
130 135 140
Cys Asn Ala Gln Leu Ala Pro Tyr Leu Lys Ala Cys Ser Ala Asn Gly
145 150 155 160
Asn Leu Cys Asp Val Lys His Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe Tyr
165 170 175
Gln Asn Met Pro Phe Asn Ile Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp Cys
180 185 190
Ala Gln Ser Asp Ile Pro Cys Gln Gln Ser Arg Glu Ala Leu His Ser
195 200 205
Lys Pro Cys Ala Val Asn Val Val Pro Pro Pro Thr Cys Leu Asp Val
210 215 220
Ile His Ser Cys Arg Asn Asp Glu Leu Cys Arg Arg Arg Tyr Arg Thr
225 230 235 240
Phe Gln Ser Lys Cys Trp Gln His Val Thr Arg Lys Cys His Glu Asp
245 250 255
Glu Leu Cys Ile Ser Thr Leu Ser Gln Gln Asp Leu Ile Cys Ser Gly
260 265 270
Ser Asp Asp Cys Lys Ala Ala Tyr Ile Gly Thr Phe Gly Thr Val Leu
275 280 285
Gln Val Gln Cys Thr Cys Arg Thr Ile Thr Gln Ser Glu Glu Ser Leu
290 295 300
Cys Lys Ile Phe Gln His Met Leu His Arg Arg Ser Cys Phe Asp Tyr
305 310 315 320
Leu Thr Leu Ser Asn Val Lys Gly Met Ala Leu His Lys Arg Lys Pro
325 330 335
Ala Lys Glu Ile Thr Leu Ser Gly Phe His Ser Pro Phe Asn Gly Glu
340 345 350
Val Ile Tyr Ala Val Met Cys Met Thr Val Thr Cys Gly Ile Leu Leu
355 360 365
Leu Val Met Leu Lys Leu Arg Thr Ser Arg Ile Ser Ser Gln Thr Arg
370 375 380
Asp His Ser Pro Ile Arg Ile Pro Gly Gly Leu
385 390 395
<210> 33
<211> 395
<212> PRT
<213> 家犬
<220>
<223> 狗GFRAL蛋白
<400> 33
Met Ile Val Phe Ile Phe Leu Ala Met Val Leu Cys Leu Glu Asn Glu
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gln Thr Ile Asp Cys Thr His Leu Arg Glu Gln Cys Leu
20 25 30
Ser Asp Ala Asp Gly Cys Lys His Ala Trp Arg Ile Met Glu Tyr Ser
35 40 45
Cys Asn Val Ser Val Pro Gly Asn Pro Cys Lys Met Lys Asp Ser Ser
50 55 60
Asn Cys Asn Leu Ser Ile Gln Ser Leu Val Glu Asn Asn Phe Gln Phe
65 70 75 80
Glu Asp Cys Leu Cys Thr Asp Asn Ile Tyr Cys Thr Ile Asn Lys Leu
85 90 95
Leu Gly Glu Gln Cys Met Asn Glu Ser Asp Asn Met Lys Glu Asp Asn
100 105 110
Gln Tyr Lys Trp Asn Leu Thr Thr Leu Pro Tyr His Gly Ile Lys Gly
115 120 125
Ile Gln Ser Cys Leu Glu Val Ala Glu Ala Cys Val Gly Asp Val Val
130 135 140
Cys Asn Thr Gln Leu Ala Ala Tyr Leu Lys Ala Cys Ser Ala Asn Gly
145 150 155 160
Asn Leu Cys Asp Val Lys His Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe Tyr
165 170 175
Gln Asn Met Pro Phe Asn Ile Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp Cys
180 185 190
Ala Pro Ser Asp Ile Pro Cys Gln Gln Ser Lys Glu Ala Leu His Ser
195 200 205
Lys Pro Cys Ala Val Asn Val Val Pro Pro Pro Ser Cys Leu Asp Val
210 215 220
Ile His Ser Cys Arg Asn Asp Glu Leu Cys Arg Arg Arg Tyr Arg Thr
225 230 235 240
Phe Gln Ser Lys Cys Trp Gln His Met Ile Arg Lys Cys His Glu Asp
245 250 255
Glu Leu Cys Ile Ser Thr Leu Ser Gln Gln Asp Leu Thr Cys Ser Gly
260 265 270
Ser Asp Asp Cys Lys Ala Ala Tyr Ile Gly Thr Phe Gly Thr Val Leu
275 280 285
Gln Val Gln Cys Thr Cys Arg Thr Thr Thr Gln Asn Glu Glu Ser Leu
290 295 300
Cys Lys Ile Phe Gln His Met Leu His Gly Arg Ser Cys Phe Asp Tyr
305 310 315 320
Pro Thr Leu Ser Asn Val Lys Gly Met Ala Leu His Glu Arg Lys His
325 330 335
Ala Lys Glu Ile Thr Leu Ser Gly Phe His Ser Pro Phe Asn Gly Glu
340 345 350
Val Ile Tyr Ala Val Met Cys Met Thr Val Thr Cys Gly Ile Leu Leu
355 360 365
Leu Val Met Leu Lys Leu Arg Thr Ser Arg Ile Ser Ser Gln Thr Arg
370 375 380
Asp His Ser Pro Ile Gln Ile Pro Gly Gly Leu
385 390 395
<210> 34
<211> 395
<212> PRT
<213> 家猫
<220>
<223> 猫GFRAL蛋白
<400> 34
Ser Val Leu Ile Val Ile Ser Ala Met Val Leu Cys Leu Glu Asn Glu
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gln Thr Ile Asp Cys Thr Tyr Leu Arg Glu Gln Cys Leu
20 25 30
Ser Asp Thr Asn Gly Cys Lys Leu Ala Trp Arg Lys Met Glu Asp Ser
35 40 45
Cys Asn Val Ser Asp Pro Gly Asn Pro Cys Lys Met Lys Asp Ser Ser
50 55 60
Asn Cys Asn Leu Ser Ile Gln Ser Leu Val Glu Asn Asn Phe Gln Phe
65 70 75 80
Glu Asp Cys Leu Cys Thr Gly Asn Leu His Cys Thr Ile Asn Lys Leu
85 90 95
Leu Gly Lys Lys Cys Ile Asn Glu Ser Asp Asn Met Lys Glu Asp Asn
100 105 110
Gln Ser Lys Trp Asn Leu Thr Thr Leu Pro Tyr Asn Gly Ile Lys Gly
115 120 125
Ile Gln Ser Cys Leu Glu Val Ala Glu Ala Cys Val Gly Asp Val Val
130 135 140
Cys Asn Ala Gln Leu Ala Pro Tyr Leu Lys Ala Cys Ser Ala Asn Gly
145 150 155 160
Asn Leu Cys Asp Val Lys His Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe Tyr
165 170 175
Gln Ser Met Pro Phe Asn Ile Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp Cys
180 185 190
Ala Pro Ser Asp Ile Pro Cys Gln Gln Ser Lys Glu Ala Leu His Ser
195 200 205
Lys Pro Cys Ala Val Asn Ile Val Pro Pro Pro Thr Cys Leu Asn Val
210 215 220
Ile His Ser Cys Arg Asn Asp Glu Leu Cys Arg Arg Arg Tyr Arg Thr
225 230 235 240
Phe Gln Trp Lys Cys Trp Gln Gln Val Thr Arg Lys Cys His Glu Asp
245 250 255
Glu Phe Cys Ile Ser Thr Leu Ser Lys Gln Asp Leu Thr Cys Ser Gly
260 265 270
Ser Asp Asp Cys Lys Ala Ala Tyr Ile Gly Ile Leu Gly Thr Val Leu
275 280 285
Gln Ala Gln Cys Thr Cys Arg Thr Ile Thr Gln Gly Glu Glu Ser Leu
290 295 300
Cys Lys Ile Phe Gln His Met Leu His Arg Arg Ser Cys Phe Asn Tyr
305 310 315 320
Pro Thr Leu Ser Asn Val Lys Gly Ile Ala Leu His Lys Arg Lys His
325 330 335
Ala Lys Glu Ile Thr Leu Ser Gly Phe His Ser Pro Phe Asn Gly Glu
340 345 350
Val Ile Tyr Ala Val Met Cys Met Thr Val Thr Cys Gly Ile Leu Leu
355 360 365
Leu Val Met Leu Lys Leu Arg Thr Ser Arg Ile Ser Ser Gln Thr Arg
370 375 380
Asp His Ser Pro Val Gln Ile Leu Glu Glu Leu
385 390 395
<210> 35
<211> 395
<212> PRT
<213> 野猪
<220>
<223> 猪GFRAL蛋白
<400> 35
Ser Val Ile Ala Val Leu Gln Ala Val Gly Leu Tyr Leu Glu Asn Glu
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gln Thr Thr Asp Cys Thr Tyr Leu Arg Glu Leu Cys Leu
20 25 30
Asn Asp Thr Asp Gly Cys Lys Gln Ala Trp Arg Ile Met Glu Asp Ala
35 40 45
Cys Asn Val Ser Asp Pro Gly Asn Thr Cys Gln Met Lys Asp Ser Ser
50 55 60
Ser Cys Asn Gln Ser Ile Gln Ser Leu Ala Glu Ser Asn Phe Gln Phe
65 70 75 80
Lys Asp Cys Leu Cys Ser Asp Asp Leu Tyr Cys Thr Val Asn Asn Leu
85 90 95
Ile Gly Lys Lys Cys Thr Asn Glu Ser Asp Asn Met Lys Glu Asp Gly
100 105 110
Val Phe Lys Arg Asn Leu Thr Ala Pro Ser Tyr His Gly Ile Arg Gly
115 120 125
Ile Gln Ser Cys Leu Glu Val Ala Glu Ala Cys Val Arg Asp Thr Val
130 135 140
Cys Asn Ala Gln Leu Ala Leu Tyr Leu Lys Ala Cys Ser Ala Asn Gly
145 150 155 160
Asn Leu Cys Asp Val Lys His Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe Tyr
165 170 175
Gln Asn Met Pro Phe Asn Val Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp Cys
180 185 190
Ala Pro Ser Asp Ile Pro Cys Gln Gln Ser Lys Glu Ala Leu His Ser
195 200 205
Lys Pro Cys Ala Leu Asn Arg Val Pro Ala Pro Thr Cys Leu Asp Val
210 215 220
Ile Arg Ser Cys Gln Asn Asp Glu Leu Cys Arg Arg Arg Tyr Arg Ile
225 230 235 240
Phe Gln Ala Lys Cys Trp Gln His Val Thr Ala Lys Cys His Asp Asp
245 250 255
Glu Thr Cys Ile Ser Thr Leu Asn Lys Gln Asp Phe Thr Cys Ser Arg
260 265 270
Ser Asp Asp Cys Lys Ala Ala Tyr Met Gly Thr Leu Gly Thr Ala Leu
275 280 285
Gln Gly Gln Cys Thr Cys Arg Thr Thr Thr Gln Ser Glu Glu Ser Leu
290 295 300
Cys Lys Ile Phe Gln His Met Leu His Gly Lys Ser Cys Phe Asn Tyr
305 310 315 320
Pro Thr Leu Ser Asn Val Lys Gly Ile Ala Leu His Lys Arg Lys His
325 330 335
Ala Lys Glu Ile Ser Leu Ser Gly Cys Gln Ser Pro Phe Asn Gly Glu
340 345 350
Val Ile Tyr Ala Val Met Cys Met Thr Val Thr Cys Gly Ile Leu Leu
355 360 365
Leu Val Met Phe Lys Leu Arg Asn Phe Arg Ile Ser Ser Gln Thr Arg
370 375 380
Asp Pro Ser Pro Ile Gln Ile Pro Gly Glu Pro
385 390 395
<210> 36
<211> 324
<212> PRT
<213> 牛
<220>
<223> 牛GFRAL蛋白
<400> 36
Pro Leu Ile Val Val Ile Gln Ala Val Gly Leu Cys Leu Asn Lys Ser
1 5 10 15
Ala Ser Gln Thr Thr Asp Cys Thr Tyr Leu Arg Glu Leu Cys Leu Ser
20 25 30
Asp Ala Asp Gly Cys Lys His Ala Trp Arg Ile Met Glu Asp Ala Cys
35 40 45
Asn Val Ser Gly Asn Thr Cys Gln Met Lys Asn Ser Ser Ser Cys Gly
50 55 60
Leu Ser Ile Gln Ser Leu Val Glu Ser Asn Leu Gln Phe Lys Asp Cys
65 70 75 80
Leu Cys Phe Asp Asp Leu Tyr Cys Thr Phe Asn Lys Leu Leu Gly Lys
85 90 95
Lys Cys Ile Asn Glu Ser Asp Asn Ile Lys Glu Asp Asn Lys Tyr Lys
100 105 110
Trp Asn Leu Thr Thr Leu Ser Tyr His Gly Gly Arg Gly Val Gln Ser
115 120 125
Cys Leu Glu Val Ala Glu Val Cys Ile Gly Asp Ala Leu Cys Asn Ala
130 135 140
Gln Leu Ala Leu Tyr Leu Lys Ala Cys Ser Ala Asp Gly Lys Leu Cys
145 150 155 160
Asp Val Lys His Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe Tyr Gln Asn Met
165 170 175
Pro Phe Asn Ile Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp Cys Ala Pro Ala
180 185 190
Asp Glu Pro Cys Gln Gln Ser Arg Glu Ala Leu His Ser Arg Pro Cys
195 200 205
Ala Val Asn Arg Val Pro Thr Pro Thr Cys Leu Asp Val Ile His Ser
210 215 220
Cys Gln Asp Asp Glu Leu Cys Arg Arg Arg Tyr Arg Ile Phe Gln Ala
225 230 235 240
Lys Cys Trp Gln His Val Met Arg Lys Cys His Glu Asp Glu Thr Cys
245 250 255
Ile Gly Thr Leu Ser Lys Gln Asp Leu Ala Cys Ser Gly Ser Asp Asp
260 265 270
Cys Lys Ala Ala Tyr Ile Gly Thr Leu Gly Thr Val Leu Gln Gly Gln
275 280 285
Cys Thr Cys Arg Thr Ile Thr Gln Ser Glu Glu Ser Leu Cys Lys Thr
290 295 300
Phe Gln His Met Leu His Arg Lys Ser Cys Phe Asn Asn Lys Pro Thr
305 310 315 320
Gln Asn Leu Lys
<210> 37
<211> 393
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> 小鼠GFRAL蛋白
<400> 37
Met Leu Val Phe Ile Phe Leu Ala Val Thr Leu Ser Ser Glu Asn Glu
1 5 10 15
Ser Ser Ser Gln Thr Asn Asp Cys Ala His Leu Ile Gln Lys Cys Leu
20 25 30
Ile Asp Ala Asn Gly Cys Glu Gln Ser Trp Arg Ser Met Glu Asp Thr
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Cys Leu Thr Pro Gly Asp Ser Cys Lys Ile Asn Asn Ser Leu His Cys
50 55 60
Asn Leu Ser Ile Gln Ala Leu Val Glu Lys Asn Phe Gln Phe Lys Glu
65 70 75 80
Cys Leu Cys Met Asp Asp Leu His Cys Thr Val Asn Lys Leu Phe Gly
85 90 95
Lys Lys Cys Thr Asn Lys Thr Asp Asn Met Glu Lys Asp Asn Lys Asp
100 105 110
Lys Trp Asn Leu Thr Thr Thr Pro Phe Tyr His Gly Phe Lys Gln Met
115 120 125
Gln Ser Cys Leu Glu Val Thr Glu Ala Cys Val Gly Asp Val Val Cys
130 135 140
Asn Ala Gln Leu Ala Leu Tyr Leu Lys Ala Cys Ser Ala Asn Gly Asn
145 150 155 160
Leu Cys Asp Val Lys His Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe Tyr Gln
165 170 175
Asn Met Pro Phe Asn Thr Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp Cys Ala
180 185 190
Gln Ser Asp Ile Pro Cys Gln Gln Ser Lys Glu Thr Leu His Ser Lys
195 200 205
Pro Cys Ala Leu Asn Ile Val Pro Pro Pro Thr Cys Leu Ser Val Ile
210 215 220
His Thr Cys Arg Asn Asp Glu Leu Cys Arg Thr His Tyr Arg Thr Phe
225 230 235 240
Gln Thr Glu Cys Trp Pro His Ile Thr Gly Lys Cys His Glu Asp Glu
245 250 255
Thr Cys Ile Ser Met Leu Gly Lys Gln Asp Leu Thr Cys Ser Gly Ser
260 265 270
Glu Ser Cys Arg Ala Ala Phe Leu Gly Thr Phe Gly Thr Val Leu Gln
275 280 285
Val Pro Cys Ala Cys Arg Gly Val Thr Gln Ala Glu Glu His Val Cys
290 295 300
Met Ile Phe Gln His Met Leu His Ser Lys Ser Cys Phe Asn Tyr Pro
305 310 315 320
Thr Pro Asn Val Lys Asp Ile Ser Ser Tyr Glu Lys Lys Asn Ser Lys
325 330 335
Glu Ile Thr Leu Thr Gly Phe Asn Ser Phe Phe Asn Gly Glu Leu Leu
340 345 350
Tyr Val Val Val Cys Met Ala Val Thr Cys Gly Ile Leu Phe Leu Val
355 360 365
Met Leu Lys Leu Arg Ile Gln Ser Glu Lys Arg Asp Pro Ser Ser Ile
370 375 380
Glu Ile Ala Gly Gly Val Ile Ile Gln
385 390
<210> 38
<211> 394
<212> PRT
<213> 褐家鼠
<220>
<223> 大鼠GFRAL蛋白
<400> 38
Met Leu Val Phe Ile Phe Leu Ala Val Arg Leu Ser Ser Glu Asn Glu
1 5 10 15
Ser Ser Ser Gln Thr Asn Asp Cys Ala Tyr Phe Met Arg Gln Cys Leu
20 25 30
Thr Asp Thr Asp Gly Cys Lys Gln Ser Trp Arg Ser Met Glu Asp Ala
35 40 45
Cys Leu Val Ser Gly Asp Ser Cys Lys Ile Asn Asn Pro Leu Pro Cys
50 55 60
Asn Leu Ser Ile Gln Ser Leu Val Glu Lys His Phe Gln Phe Lys Gly
65 70 75 80
Cys Leu Cys Thr Asp Asp Leu His Cys Thr Val Asn Lys Ile Phe Gly
85 90 95
Lys Lys Cys Thr Asn Lys Thr Asp Ser Met Lys Lys Asp Asn Lys Tyr
100 105 110
Lys Arg Asn Leu Thr Thr Pro Leu Tyr His Asp Thr Gly Phe Lys Gln
115 120 125
Met Gln Ser Cys Leu Glu Val Thr Glu Ala Cys Val Gly Asp Val Val
130 135 140
Cys Asn Ala Gln Leu Ala Leu Tyr Leu Lys Ala Cys Thr Ala Asn Gly
145 150 155 160
Asn Leu Cys Asp Val Lys His Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe Tyr
165 170 175
Gln Asn Met Pro Phe Asn Thr Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp Cys
180 185 190
Ala Gln Ser Asp Ile Pro Cys Gln Gln Ser Lys Glu Thr Leu His Ser
195 200 205
Lys Pro Cys Ala Leu Asn Val Val Pro Pro Pro Thr Cys Leu Ser Val
210 215 220
Ile His Thr Cys Arg Asn Asp Glu Leu Cys Arg Thr Tyr Tyr Arg Thr
225 230 235 240
Phe Gln Thr Glu Cys Trp Pro His Val Ala Gly Lys Cys Arg Glu Asp
245 250 255
Glu Thr Cys Ile Ser Met Leu Gly Lys Gln Asp Leu Thr Cys Ser Gly
260 265 270
Ser Asp Ser Cys Arg Ala Ala Tyr Leu Gly Thr Phe Gly Thr Val Leu
275 280 285
Gln Val Pro Cys Ala Cys Arg Ser Ile Thr Gln Gly Glu Glu Pro Leu
290 295 300
Cys Met Ala Phe Gln His Met Leu His Ser Lys Ser Cys Phe Asn Tyr
305 310 315 320
Pro Thr Pro Asn Val Lys Asp Ile Ser Ser Tyr Glu Arg Lys His Ser
325 330 335
Lys Glu Ile Thr Leu Thr Gly Phe Asn Ser Pro Phe Ser Gly Glu Leu
340 345 350
Ile Tyr Val Val Val Cys Met Val Val Thr Ser Gly Ile Leu Ser Leu
355 360 365
Val Met Leu Lys Leu Arg Ile Pro Ser Lys Lys Arg Asp Pro Ala Pro
370 375 380
Ile Glu Ile Ala Gly Ala Val Ile Ile Gln
385 390
<210> 39
<211> 388
<212> PRT
<213> 灰仓鼠
<220>
<223> 中国仓鼠GFRAL蛋白
<400> 39
Met Asp Val Leu Leu Asn His Ser Phe Thr Ser Phe Ile Glu Glu Ser
1 5 10 15
Thr Leu Pro Ser Asp Leu Val Pro Arg Ser Asn Val Thr Gln Gly Phe
20 25 30
Leu Arg Glu Asp Thr Phe Leu Thr Ala Glu Arg Lys Asp Asp Cys Val
35 40 45
Ala Ala Ala Glu Ala Cys Gln Glu Ser Val His Cys Ser Leu Leu His
50 55 60
Glu Asn Phe Lys Lys Ala Cys Gly Lys Gly Thr Ala Gln Cys His Thr
65 70 75 80
Leu Ser Gly Gln Gln Phe Cys Val Ala Leu Arg Glu Ser Leu Arg Glu
85 90 95
Thr Val Leu Trp Asp Cys Gln Cys Gly Phe Pro Leu Glu Gly Asp Cys
100 105 110
Ile Arg Ile Trp Lys Gly Leu Phe Glu Asp Ile Cys Ile Glu Asp Thr
115 120 125
Gln Ile Asn Gln Ile Ala Thr Phe Ser Gln Asp Asn Glu Asp Arg Leu
130 135 140
Lys Glu Asp Ile Ala Ser Asp Asn Leu Lys Lys Asp Asn Lys Phe Lys
145 150 155 160
Trp Asp Leu Thr Thr Leu His His Ala Cys Ser Ala Asn Gly Asn Leu
165 170 175
Cys Asp Val Lys His Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe Tyr Gln Asn
180 185 190
Met Pro Phe Asn Thr Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp Cys Ala Gln
195 200 205
Ser Asp Ile Pro Cys Gln Gln Ser Lys Glu Thr Leu His Ser Lys Pro
210 215 220
Cys Ala Leu Asn Val Val Pro Pro Pro Thr Cys Leu Ser Val Ile His
225 230 235 240
Thr Cys Arg Asn Asp Glu Leu Cys Arg Thr Arg Tyr Gln Thr Phe Gln
245 250 255
Ser Glu Cys Trp Phe His Val Met Gly Lys Cys His Glu Asp Glu Thr
260 265 270
Cys Ile Gly Thr Leu Gly Lys Gln Asp Leu Ile Cys Ser Gly Ser Asp
275 280 285
Ser Cys Arg Ala Ala Tyr Leu Gly Thr Phe Gly Thr Val Leu Gln Val
290 295 300
Pro Cys Ala Cys Arg Ser Ile Thr Gln Asp Glu Glu Pro Leu Cys Met
305 310 315 320
Thr Phe Gln His Met Leu Gln Ser Lys Ser Cys Phe Asn Tyr Pro Thr
325 330 335
Pro Asn Val Lys Asp Ile Ser Ser Tyr Lys Gly Lys His Ser Lys Glu
340 345 350
Ile Thr Leu Thr Gly Phe Glu Ser Pro Phe Asn Gly Glu Leu Val Tyr
355 360 365
Ala Val Leu Cys Met Val Val Thr Cys Gly Ile Leu Phe Leu Val Met
370 375 380
Leu Lys Leu Arg
385
<210> 40
<211> 319
<212> PRT
<213> 鸭嘴兽
<220>
<223> 鸭嘴兽GFRAL蛋白
<400> 40
Met Lys His Tyr Phe Leu Phe Val Val Leu Met Leu Gly Phe Lys Cys
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Leu Thr Thr Gly Cys Leu His Leu Arg Lys Gln Cys
20 25 30
Val Ser Ala Met Asp Gly Cys Glu Ser Ala Trp Ala Val Ile Glu Asp
35 40 45
Val Cys Asn Val Ser Gly His Asn Cys Thr Met Lys Glu Ser Leu Asn
50 55 60
Cys Asn Leu Ser Ile Gln Leu Leu Ala Asp Arg Tyr Pro Ala Phe Lys
65 70 75 80
Asp Cys Leu Cys Ala Glu Asp Ile Ser Cys Ser Ala Thr Asn Phe Leu
85 90 95
Gly Arg Lys Cys Ile Ile Lys Thr Glu Asn Glu His Lys Asp Lys Asn
100 105 110
Ile Lys Ser Leu Trp Asn Ser Thr Ser Leu Leu Gln His Gly Phe Lys
115 120 125
Gly Thr Arg Ser Cys Leu Glu Val Thr Val Ala Cys Val Gly Asp Thr
130 135 140
Val Cys Asn Lys Gln Leu Ala Arg Phe Leu Lys Asp Cys Ser Thr His
145 150 155 160
Gly Ser Leu Cys Asn Met Asn Gln Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe
165 170 175
Tyr Gln Asn Ile Pro Phe Asn Ile Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp
180 185 190
Cys Ala Gln Ser Asp Ile Pro Cys Gln Gln Ser Lys Glu Ala Leu His
195 200 205
Ser Lys Pro Cys Ala Val Asn Val Val Pro Thr Pro Ser Cys Leu Asn
210 215 220
Val Ile Arg Ser Cys Arg Asp Asp Glu Leu Cys Arg Gln Arg Phe Glu
225 230 235 240
Thr Phe Gln Ser Lys Cys Trp Gln Asp Met Asp Lys Cys Ser Asp Asp
245 250 255
Glu Thr Cys Ile Val Thr Leu Asn Lys Glu Asn Ile Thr Cys Ser Arg
260 265 270
Asn Glu Glu Cys Arg Glu Ala Tyr Ile Gly Thr Leu Gly Thr Tyr Leu
275 280 285
His Val Gln Cys Thr Cys Ser Thr Leu Ser Leu Thr Glu Glu Tyr Leu
290 295 300
Cys Lys Ile Phe His His Ile Leu His Ser Arg Ser Cys Phe Ser
305 310 315
<210> 41
<211> 308
<212> PRT
<213> 猕猴
<220>
<223> 猕猴GDF15蛋白
<400> 41
Met Pro Gly Gln Glu Leu Lys Thr Leu Asn Gly Ser Gln Met Leu Leu
1 5 10 15
Val Leu Leu Val Leu Leu Trp Pro Pro His Gly Gly Ala Met Ser Leu
20 25 30
Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro Gly Pro Ser Asp Leu His Ser
35 40 45
Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu
50 55 60
Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln Ser Trp Glu Asp Ser Asn Thr Asp Leu
65 70 75 80
Ile Gln Ala Pro Glu Val Arg Ile Leu Thr Pro Glu Val Arg Leu Gly
85 90 95
Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile Ser Arg Ala Val Leu Pro Glu
100 105 110
Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg Ile His Arg Ala Leu Phe Arg Leu Ser
115 120 125
Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp Asp Val Thr Arg Pro Leu Arg Arg Gln
130 135 140
Leu Arg Leu Ala Arg Pro Gln Ala Pro Ala Leu His Leu Arg Leu Ser
145 150 155 160
Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp Gln Leu Leu Val Lys Ser Ser Ser Ser
165 170 175
Arg Pro Gln Leu Glu Leu His Leu Arg Leu Arg Ala Ala Arg Gly Arg
180 185 190
Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp Arg Cys Pro Leu Gly Pro Gly
195 200 205
Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val His Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly
210 215 220
Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys
225 230 235 240
Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Glu Ala Asn Met His Ala Gln
245 250 255
Ile Lys Met Asn Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro
260 265 270
Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr
275 280 285
Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp
290 295 300
Cys His Cys Val
305
<210> 42
<211> 308
<212> PRT
<213> 长臂猿
<220>
<223> 长臂猿GDF15蛋白
<400> 42
Met Pro Arg Gln Glu Pro Arg Met Leu Asn Gly Ser Gln Met Leu Leu
1 5 10 15
Val Leu Leu Val Leu Ser Trp Pro Pro His Gly Gly Ala Leu Ser Leu
20 25 30
Ala Glu Ala Ser Pro Ala Ser Phe Pro Gly Pro Ser Glu Leu His Ser
35 40 45
Lys Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu
50 55 60
Thr Arg Leu Arg Val Asn Gln Ser Trp Glu Asp Leu Asn Thr Asp Leu
65 70 75 80
Val Pro Ala Pro Ala Val Arg Ile Leu Thr Pro Glu Val Arg Leu Gly
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Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile Ser Arg Ala Ala Leu Pro Glu
100 105 110
Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg Leu His Arg Ala Leu Phe Arg Leu Ser
115 120 125
Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp Asp Val Thr Arg Pro Leu Arg Arg Gln
130 135 140
Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln Ala Pro Ala Leu His Leu Arg Leu Ser
145 150 155 160
Pro Pro Arg Ser Arg Ser Asp Gln Leu Leu Ala Glu Ser Ser Ser Ala
165 170 175
Arg Pro Gln Leu Glu Leu His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg
180 185 190
Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly
195 200 205
Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly
210 215 220
Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys
225 230 235 240
Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln
245 250 255
Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro
260 265 270
Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr
275 280 285
Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp
290 295 300
Cys His Cys Ile
305
<210> 43
<211> 308
<212> PRT
<213> 黑猩猩
<220>
<223> 黑猩猩GDF15蛋白
<400> 43
Met Pro Arg Gln Glu Leu Arg Thr Leu Asn Gly Ser Gln Met Leu Leu
1 5 10 15
Val Leu Leu Val Leu Ser Trp Pro Pro His Gly Gly Ala Leu Ser Leu
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Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Ser Gly Pro Ser Glu Leu His Ser
35 40 45
Glu Asp Ala Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu
50 55 60
Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln Ser Trp Glu Asp Ser Asn Thr Asp Leu
65 70 75 80
Val Pro Ala Pro Ala Val Arg Ile Leu Thr Pro Glu Val Arg Leu Gly
85 90 95
Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile Ser Arg Ala Ala Leu Pro Glu
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Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg Leu His Arg Ala Leu Phe Arg Leu Ser
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Pro Thr Ala Ala Arg Ser Trp Asp Val Thr Arg Pro Leu Arg Arg Gln
130 135 140
Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln Ala Pro Ala Leu His Leu Arg Leu Ser
145 150 155 160
Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp Gln Leu Leu Ala Glu Ser Ser Ser Ala
165 170 175
Arg Pro Gln Leu Glu Leu His Leu Arg Ser Arg Ala Ala Arg Gly Leu
180 185 190
Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly
195 200 205
Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly
210 215 220
Trp Ser Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys
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Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln
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Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro
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Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr
275 280 285
Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp
290 295 300
Cys His Cys Ile
305
<210> 44
<211> 308
<212> PRT
<213> 猩猩
<220>
<223> 猩猩GDF15蛋白
<400> 44
Met Pro Arg Gln Glu Leu Arg Thr Leu Asn Gly Phe Gln Met Leu Leu
1 5 10 15
Val Leu Leu Val Leu Ser Trp Pro Pro His Gly Gly Ala Leu Ser Leu
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Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro Gly Pro Ser Asp Leu His Ser
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Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu
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65 70 75 80
Val Pro Ala Pro Ala Val Arg Ile Leu Thr Pro Glu Val Arg Leu Gly
85 90 95
Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile Ser Arg Ala Ala Leu Pro Glu
100 105 110
Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg Leu His Arg Ala Leu Phe Arg Leu Ser
115 120 125
Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp Asp Val Thr Arg Leu Leu Arg Arg Gln
130 135 140
Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln Ala Pro Ala Leu His Leu Arg Leu Ser
145 150 155 160
Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp Gln Leu Leu Ala Glu Ser Ser Ser Ala
165 170 175
Arg Pro Gln Leu Glu Leu His Leu Arg Pro Arg Ala Ala Arg Gly Arg
180 185 190
Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly
195 200 205
Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly
210 215 220
Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys
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Cys His Cys Ile
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<210> 45
<211> 308
<212> PRT
<213> 牛
<220>
<223> 奶牛GDF15蛋白
<400> 45
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Met Leu Leu Met Phe Ser Trp Leu Arg Ser Gly Gly Ala Leu Ser Leu
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Ser Pro Asp Ile Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp
50 55 60
Leu Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln Thr Trp Glu Asp Ser Asn Pro
65 70 75 80
Asp Leu Ile Pro Pro Pro Gln Val Arg Ile Val Thr Pro Lys Leu Arg
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Leu Gly Pro Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile Pro Arg Val Asn Leu
100 105 110
Thr Glu Gly Leu Pro Ala Ala Ser Arg Leu His Arg Ala Leu Leu Arg
115 120 125
Leu Ser Pro Lys Ala Trp Ser Ser Trp Asp Val Thr Arg Pro Leu Arg
130 135 140
Arg Gln Leu Arg Leu Gly Gly Ser Arg Gly Pro Ser Ile Arg Leu Arg
145 150 155 160
Leu Leu Ala Arg Pro Asp Gln Leu Gln Glu Ala Leu Pro Ser Ala Pro
165 170 175
Pro Gln Leu Glu Leu His Trp Arg Pro Ser Ala Thr Arg Gly Arg Arg
180 185 190
His Ala His Ala His Thr Arg Asp Gly Cys Pro Leu Gly Glu Gly Arg
195 200 205
Cys Cys His Leu Gln Ser Leu Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp
210 215 220
Ala Asp Trp Val Leu Ala Pro Arg Glu Leu Asp Val Arg Met Cys Ile
225 230 235 240
Gly Ala Cys Pro Ser His Phe Arg Ser Ala Asn Thr His Ala Gln Met
245 250 255
Gln Ala Arg Leu His Gly Leu Asn Pro Asp Ala Ala Pro Ala Pro Cys
260 265 270
Cys Val Pro Ala Ser Tyr Glu Pro Val Val Leu Met His Gln Asp Ser
275 280 285
Asp Gly Arg Val Ser Leu Thr Pro Phe Asp Asp Leu Val Ala Lys Asp
290 295 300
Cys His Cys Val
305
<210> 46
<211> 308
<212> PRT
<213> 野猪
<220>
<223> 猪GDF15蛋白
<400> 46
Met Pro Gly Gln Leu Pro Ser Pro Pro Arg Arg Ser Pro Thr Leu Leu
1 5 10 15
Met Leu Leu Met Leu Ser Trp Leu Pro Ser Gly Gly Ala Leu Ser Leu
20 25 30
Ala Gln Glu His Leu Pro Ala Leu Pro Gly Pro Ser Asp Val His Ser
35 40 45
Ser Ser Asp Val Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp
50 55 60
Leu Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln Thr Trp Glu Asp Ser Asn Pro
65 70 75 80
Asn Leu Ile Pro Ala Pro Gln Val Arg Ile Val Thr Pro Lys Phe Arg
85 90 95
Leu Gly Pro Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile Pro Arg Val Asn Leu
100 105 110
Thr Glu Gly Leu Pro Ala Ala Ser Arg Leu His Arg Ala Leu Leu Arg
115 120 125
Leu Ser Pro Thr Ala Arg Ser Ser Trp Asp Val Thr Arg Pro Leu Arg
130 135 140
Arg Gln Leu Ser Val Gly Gly Ser Arg Gly Ser Ala Ile His Leu Arg
145 150 155 160
Leu Leu Gln Arg Pro Asp Gln Leu Leu Glu Ala Leu Pro Ala Gly Gln
165 170 175
Pro Gln Leu Glu Leu His Trp Arg Pro Ser Ser Thr Arg Gly Arg Arg
180 185 190
Asn Thr His Ala His Thr Arg Asp Gly Cys Pro Leu Gly Thr Gly Arg
195 200 205
Cys Cys Arg Leu Gln Ser Leu Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp
210 215 220
Ala Asp Trp Val Leu Ala Pro Arg Glu Leu Asp Val Arg Met Cys Val
225 230 235 240
Gly Ala Cys Pro Ser His Phe Arg Ser Ala Asn Thr His Ala Gln Met
245 250 255
Gln Ala Arg Leu His Gly Leu Asn Pro Asp Ala Ala Pro Ala Pro Cys
260 265 270
Cys Val Pro Ala Ser Tyr Glu Pro Val Val Leu Met His Gln Asp Ser
275 280 285
Asp Gly Arg Val Ser Leu Thr Pro Phe Asp Asp Leu Val Ala Lys Asp
290 295 300
Cys His Cys Val
305
<210> 47
<211> 307
<212> PRT
<213> 家犬
<220>
<223> 狗GDF15蛋白
<400> 47
Met Pro Gly Gln Gly Pro Ala Pro Ala His Cys Ser Pro Met Leu Val
1 5 10 15
Ile Leu Val Met Leu Ser Trp Leu Pro Ser Gly Gly Ala Leu Ser Leu
20 25 30
Ala Gln Glu His Leu Pro Ala Phe Pro Gly Pro Ser Asp Pro His Ser
35 40 45
Ser Thr Asp Val Ser Arg Ile Gln Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu His
50 55 60
Leu Gln Thr Lys Leu Arg Leu Asn Gln Gly Trp Ala Asp Ser Asn Pro
65 70 75 80
Asp Leu Val Pro Ala Thr Arg Val Arg Ile Leu Thr Pro Lys Leu Arg
85 90 95
Leu Gly Pro Arg Gly His Leu His Leu Arg Ile Ala Arg Ala Asp Leu
100 105 110
Thr Ala Gly Leu Pro Ala Ala Ser Arg Leu His Arg Ala Leu Leu Arg
115 120 125
Leu Ser Pro Thr Glu Pro Ser Ser Trp Asp Val Thr Arg Pro Leu Gln
130 135 140
Arg Gln Leu Ser Arg Val Gly Ser Arg Thr Pro Thr Leu Arg Leu Arg
145 150 155 160
Leu Leu Pro Arg Trp Asp Arg Ser Arg Ala Leu Pro Ser Ala Arg Pro
165 170 175
Gln Leu Glu Leu His Trp Arg Pro Arg Ala Ala Arg Gly Arg Arg Asn
180 185 190
Ala His Ala His Ala Arg Asp Gly Cys Pro Leu Gly Glu Gly Arg Cys
195 200 205
Cys Arg Leu Gln Ser Leu Arg Ala Ser Leu Gln Asp Leu Gly Trp Ala
210 215 220
Asn Trp Val Val Ala Pro Arg Glu Leu Asp Val Arg Met Cys Val Gly
225 230 235 240
Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ser Ala Asn Thr His Ala Gln Met Gln
245 250 255
Ala Arg Leu His Gly Leu Asn Pro Asp Ala Ala Pro Ala Pro Cys Cys
260 265 270
Val Pro Ala Ser Tyr Glu Pro Val Val Leu Met His Gln Asp Ser Asp
275 280 285
Gly Arg Val Ser Leu Thr Pro Phe Asp Asp Leu Val Ala Lys Asp Cys
290 295 300
His Cys Val
305
<210> 48
<211> 308
<212> PRT
<213> 大熊猫
<220>
<223> 大熊猫GDF15蛋白
<400> 48
Met Pro Gly Gln Gly Leu Thr Pro Pro Pro Gly Ser Pro Met Leu Leu
1 5 10 15
Met Leu Leu Met Phe Ser Trp Leu Pro Ser Gly Gly Ala Leu Ser Leu
20 25 30
Ala Gln Glu His Leu Pro Ala Phe Pro Gly Pro Ser Asp Thr His Ser
35 40 45
Ser Thr Asp Val Ser Arg Ala Gln Glu Phe Arg Lys Arg Tyr Ala His
50 55 60
Leu Gln Thr Arg Leu Trp Leu Asn Gln Ser Arg Ala Asp Ser Asn Ser
65 70 75 80
Asp Leu Ile Pro Ala Ala Gln Val Arg Ile Leu Thr Pro Lys Leu Arg
85 90 95
Leu Gly Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile Ala Arg Ala Asp Leu
100 105 110
Thr Glu Gly Leu Pro Ala Ala Ser Arg Leu His Arg Ala Leu Leu Arg
115 120 125
Leu Ser Pro Thr Glu Pro Ser Ser Trp Asp Val Thr Arg Pro Leu Gln
130 135 140
Arg Gln Leu Ser Leu Gly Gly Ser Arg Ala Pro Val Leu Arg Leu Arg
145 150 155 160
Leu Leu Pro Gln Trp Asp Pro Leu Gly Ala Thr Leu Pro Ser Ala Arg
165 170 175
Pro Gln Leu Glu Leu His Trp Arg Pro Arg Ala Ala Arg Gly Arg Arg
180 185 190
Asn Ala His Ala His Gly Gly Asp Gly Cys Pro Leu Gly Glu Gly Arg
195 200 205
Cys Cys Arg Leu Gln Ser Leu Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp
210 215 220
Ala Asp Trp Val Val Ala Pro Arg Glu Leu Asp Val Arg Met Cys Val
225 230 235 240
Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ser Ala Asn Thr His Ala Gln Met
245 250 255
Gln Ala Arg Leu His Gly Leu Asn Pro Glu Ala Ala Pro Ala Pro Cys
260 265 270
Cys Val Pro Ala Ser Tyr Glu Pro Val Val Leu Met His Gln Asp Ser
275 280 285
Asp Gly Arg Val Ser Leu Thr Pro Phe Asp Asp Leu Val Ala Lys Asp
290 295 300
Cys His Cys Val
305
<210> 49
<211> 298
<212> PRT
<213> 雪貂
<220>
<223> 雪貂GDF15蛋白
<400> 49
His Ser Ser Pro Met Leu Pro Val Leu Leu Met Phe Ser Trp Leu Pro
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ala Leu Ser Leu Ala Gln Glu Arg Leu Pro Ala Phe Pro
20 25 30
Gly Pro Ser Asp Ala His Ser Ser Met Asp Ile Ser Arg Ala Gln Glu
35 40 45
Phe Arg Lys His Tyr Glu His Leu Gln Thr Arg Leu Arg Leu Asn Gln
50 55 60
Ser Trp Gly Asp Ser Asn Ser Asp Leu Asn Leu Thr Ala Pro Val Arg
65 70 75 80
Ile Leu Thr Pro Lys Leu Arg Leu Gly Pro Gly Gly His Leu His Leu
85 90 95
Arg Ile Ala Leu Ala Asp Leu Thr Glu Gly Leu Pro Ala Thr Ser Arg
100 105 110
Leu His Gln Ala Leu Leu Arg Leu Ser Pro Met Glu Pro Ser Ser Trp
115 120 125
Asp Val Thr Arg Pro Leu Gln Arg Gln Leu Ser Leu Gly Gly Ser Arg
130 135 140
Ala Ser Ala Leu His Leu Arg Leu Leu Pro Arg Leu Asn Arg Leu Arg
145 150 155 160
Ala Thr Leu Pro Ser Ala Arg Pro Gln Leu Glu Leu His Trp Arg Pro
165 170 175
Ser Ala Ala Arg Gly Arg Arg Asp Ala His Ala His Ala Gly Asp Gly
180 185 190
Cys Pro Leu Gly Glu Gly Arg Cys Cys Arg Leu Gln Ser Leu Arg Ala
195 200 205
Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asn Trp Val Val Ala Pro Arg Glu
210 215 220
Leu Asp Val Arg Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ser
225 230 235 240
Ala Asn Thr His Ala Gln Met Gln Ala Arg Leu His Gly Leu Asn Pro
245 250 255
Asp Ala Ala Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Glu Pro Val
260 265 270
Val Leu Leu His Gln Asp Ser Asp Gly Arg Val Ser Leu Thr Pro Phe
275 280 285
Asp Asp Leu Val Ala Lys Asp Cys His Cys
290 295
<210> 50
<211> 303
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> 小鼠GDF15蛋白
<400> 50
Met Ala Pro Pro Ala Leu Gln Ala Gln Pro Pro Gly Gly Ser Gln Leu
1 5 10 15
Arg Phe Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Trp Pro
20 25 30
Ser Gln Gly Asp Ala Leu Ala Met Pro Glu Gln Arg Pro Ser Gly Pro
35 40 45
Glu Ser Gln Leu Asn Ala Asp Glu Leu Arg Gly Arg Phe Gln Asp Leu
50 55 60
Leu Ser Arg Leu His Ala Asn Gln Ser Arg Glu Asp Ser Asn Ser Glu
65 70 75 80
Pro Ser Pro Asp Pro Ala Val Arg Ile Leu Ser Pro Glu Val Arg Leu
85 90 95
Gly Ser His Gly Gln Leu Leu Leu Arg Val Asn Arg Ala Ser Leu Ser
100 105 110
Gln Gly Leu Pro Glu Ala Tyr Arg Val His Arg Ala Leu Leu Leu Leu
115 120 125
Thr Pro Thr Ala Arg Pro Trp Asp Ile Thr Arg Pro Leu Lys Arg Ala
130 135 140
Leu Ser Leu Arg Gly Pro Arg Ala Pro Ala Leu Arg Leu Arg Leu Thr
145 150 155 160
Pro Pro Pro Asp Leu Ala Met Leu Pro Ser Gly Gly Thr Gln Leu Glu
165 170 175
Leu Arg Leu Arg Val Ala Ala Gly Arg Gly Arg Arg Ser Ala His Ala
180 185 190
His Pro Arg Asp Ser Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys His Leu
195 200 205
Glu Thr Val Gln Ala Thr Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ser Asp Trp Val
210 215 220
Leu Ser Pro Arg Gln Leu Gln Leu Ser Met Cys Val Gly Glu Cys Pro
225 230 235 240
His Leu Tyr Arg Ser Ala Asn Thr His Ala Gln Ile Lys Ala Arg Leu
245 250 255
His Gly Leu Gln Pro Asp Lys Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ser
260 265 270
Ser Tyr Thr Pro Val Val Leu Met His Arg Thr Asp Ser Gly Val Ser
275 280 285
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Val Ala Arg Gly Cys His Cys Ala
290 295 300
<210> 51
<211> 301
<212> PRT
<213> 豚鼠
<220>
<223> 豚鼠GDF15蛋白
<400> 51
Met Pro Ala Leu Gly Phe Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ala Val Ser Arg
1 5 10 15
Pro Pro Pro Gly Gly Ala Ser Gly Pro Ala Glu Lys Leu Pro Ala Glu
20 25 30
Pro Asp Pro Asp Leu Asp Pro Asp Arg Asp Pro Asp Pro Ala Ala His
35 40 45
Pro Ala Arg Glu Leu Arg Arg Arg Phe Glu Asp Leu Leu Ala Arg Leu
50 55 60
Arg Ala Asn Arg Ser Ala Asp Ala Leu Pro Ala Glu Arg Ser Pro Ala
65 70 75 80
Pro Val Val His Thr Leu Thr Pro Asp Val Arg Arg Gly His Asp Gly
85 90 95
Ser Leu His Leu Arg Ile Pro Arg Ala Ser Leu Pro Pro Gly Val Pro
100 105 110
Arg Ala Ser Arg Val Gln His Ala Leu Leu Arg Leu Ser Pro Glu Thr
115 120 125
Arg Glu Pro Trp Asp Val Thr Arg Pro Leu Gln Arg Gln Leu Arg Leu
130 135 140
Leu Asp Pro Arg Ala Pro Ala Leu Leu Leu His Leu Trp Pro Pro Ser
145 150 155 160
Asp Arg Trp Arg Glu Leu Ser Ser Ala Pro Pro Arg Leu Glu Leu His
165 170 175
Leu Arg Thr Arg Ser Ala Arg Gly Arg Arg Ser Thr Arg Met Arg Thr
180 185 190
Arg Asp Asp Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
195 200 205
Val Arg Ala Ser Leu Gln Asp Leu Gly Trp Thr Asp Trp Val Leu Ser
210 215 220
Pro Arg Glu Leu His Val Gly Ile Cys Met Gly Glu Cys Pro Ser Leu
225 230 235 240
Tyr Arg Ser Ala Asn Thr His Ala Gln Val Lys Ala Arg Leu His Gly
245 250 255
Leu Lys Pro Asp Ser Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ser Ser Tyr
260 265 270
Asp Leu Val Val Leu Met His Lys Thr Asp Gly Gly Ile Ala Leu His
275 280 285
Thr Tyr Asp Asp Leu Ile Ala Lys Gly Cys His Cys Ala
290 295 300
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(5)
<223> 重复1 - 20次
<400> 52
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 53
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(1)
<223> 重复 1-20次
<220>
<221> 重复
<222> (2)..(2)
<223> 重复 1-20次
<220>
<221> 重复
<222> (3)..(3)
<223> 重复 1-20次
<220>
<221> 重复
<222> (4)..(4)
<223> 重复 1-20次
<220>
<221> 重复
<222> (5)..(5)
<223> 重复 1-20次
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(5)
<223> 重复 1-20次
<400> 53
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> 重复
<222> (5)..(5)
<223> 重复 1 - 20次
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(5)
<223> 重复 1 - 20次
<400> 54
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 55
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> 重复
<222> (4)..(4)
<223> 重复 1 - 20次
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(5)
<223> 重复 1 - 20次
<400> 55
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 56
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> 重复
<222> (4)..(4)
<223> 重复 1 - 20次
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(4)
<223> 重复 1 - 20次
<400> 56
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 57
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 57
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 58
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 59
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 59
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 60
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 60
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 61
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 61
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 62
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 62
Gly Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 63
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(5)
<223> 重复 1 - 50次
<400> 63
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 64
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(4)
<223> 重复 1 - 50次
<400> 64
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 65
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(5)
<223> 重复 1 - 50次
<400> 65
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 66
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 66
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 67
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 67
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5

Claims (68)

1.一种鉴定与GFRAL蛋白的胞外域结合的药剂的方法，所述方法包括：
a)构建具有由表6的原子坐标界定的GDF15蛋白的复合物的三维结构；
b)利用三维结构和建模方法鉴定与GFRAL蛋白结合的候选药剂；
c)测定与GFRAL蛋白的胞外域结合的候选药剂；和
d)将候选药剂的结合同GDF15蛋白与GFRAL蛋白的胞外域的结合进行比较，
其中当所述候选药剂以类似于GDF15蛋白的亲和力结合时，候选药剂被鉴定为与GFRAL蛋白的胞外域结合的药剂。
2.权利要求1的方法，其中所述GDF15蛋白是可检测标记的。
3.权利要求1或2的方法，其中所述GFRAL蛋白被固定在支持物上。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述GFRAL蛋白由经遗传修饰表达GFRAL蛋白的重组细胞表达。
5.权利要求4的方法，其中所述重组细胞经遗传修饰表达RET蛋白。
6.权利要求4或5的方法，其中所述重组细胞包含含有与编码报道分子的核酸序列有效连接的启动子序列的报道分子构建体，其中所述启动子在RET蛋白活化时指导报道分子表达，和
其中所述方法包括测定报道分子的表达，
其中与阴性对照相比报道分子的表达增加鉴定药剂为与GFRAL蛋白结合并激活RET蛋白的药剂。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述GFRAL蛋白的胞外域包含与在GFRAL蛋白和GDF15蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基，其中所述GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197和GLN200。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述GFRAL蛋白的胞外域包含与在GFRAL蛋白和RET蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基，其中所述GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、GLN298和SER299。
9.一种鉴定调节GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合的药剂的方法，所述方法包括：
a)使候选药剂与经遗传修饰表达GFRAL蛋白的重组细胞接触，其中所述GFRAL蛋白的胞外域包含与在GFRAL蛋白和GDF15蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基，其中所述GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197和GLN200，和
其中所述接触在GDF15蛋白存在下；和
b)测定GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合的水平；
其中与在候选药剂不存在时GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合的水平相比在候选药剂存在时GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合的水平的变化，将候选药剂鉴定为调节GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合的药剂。
10.权利要求9的方法，其中所述重组细胞经遗传修饰表达RET蛋白。
11.权利要求9或10的方法，其中所述GFRAL蛋白的胞外域包含与在GFRAL蛋白和RET蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基，其中所述GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297和GLN298。
12.权利要求9-11中任一项的方法，其中所述重组细胞包含含有与编码报道分子的核酸序列有效连接的启动子序列的报道分子构建体，其中所述启动子在RET蛋白活化时指导报道分子表达，
其中所述测定包括测定报道分子的表达，其中与在候选药剂不存在时的表达相比报道分子表达的变化将候选药剂鉴定为调节GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合的药剂。
13.权利要求9-12中任一项的方法，其中当所述药剂抑制GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合时，所述药剂被鉴定为GDF15蛋白-GFRAL蛋白结合的拮抗剂。
14.权利要求9-12中任一项的方法，其中当所述药剂增加GDF15蛋白与GFRAL蛋白的结合时，所述药剂被鉴定为GDF15蛋白-GFRAL蛋白结合的激动剂。
15.一种鉴定调节GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合的药剂的方法，所述方法包括：
a)构建具有由表6的原子坐标界定的GDF15蛋白的复合物的三维结构；
b)利用三维结构和建模方法鉴定调节GDF15蛋白与GFRAL蛋白的结合的候选药剂；
c)使候选药剂与经遗传修饰表达GFRAL蛋白的重组细胞接触，其中所述接触在GDF15蛋白存在下；和
d)测定GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合的水平，
其中与在候选药剂不存在时GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合的水平相比在候选药剂存在时GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合的水平的变化，将候选药剂鉴定为调节GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合的药剂。
16.权利要求15的方法，其中所述重组细胞经遗传修饰表达RET蛋白。
17.权利要求15或16的方法，其中所述重组细胞包含含有与编码报道分子的核酸序列有效连接的启动子序列的报道分子构建体，其中所述启动子在RET蛋白活化时指导报道分子表达，
其中所述测定包括测定报道分子的表达，其中与在候选药剂不存在时的表达相比报道分子表达的变化，将候选药剂鉴定为调节GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合的药剂。
18.权利要求15-17中任一项的方法，其中当所述药剂抑制GDF15蛋白与GFRAL蛋白结合时，所述药剂被鉴定为GDF15-GFRAL结合的拮抗剂。
19.权利要求15-17中任一项的方法，其中当所述药剂增加GDF15蛋白与GFRAL蛋白的结合时，所述药剂被鉴定为GDF15蛋白-GFRAL蛋白结合的激动剂。
20.权利要求15-19中任一项的方法，其中由重组细胞表达的GFRAL蛋白包含GFRAL蛋白的胞外域。
21.权利要求20的方法，其中所述GFRAL蛋白的胞外域包含与在GFRAL蛋白和GDF15蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基，其中所述GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197和GLN200。
22.权利要求20或21的方法，其中所述GFRAL蛋白的胞外域包含与在GFRAL蛋白和RET蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基，其中所述GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297和GLN298。
23.一种鉴定调节包含胞外域的GFRAL蛋白与RET蛋白结合的药剂的方法，所述方法包括：
a)使候选药剂与经遗传修饰表达GFRAL蛋白和RET蛋白的重组细胞接触，其中所述GFRAL蛋白的胞外域包含与在GFRAL蛋白和RET蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基，其中所述GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297和GLN298；和
b)测定GFRAL蛋白和RET蛋白的结合水平；
其中与在候选药剂不存在时GFRAL蛋白和RET蛋白的结合水平相比，在候选药剂存在时GFRAL蛋白和RET蛋白的结合水平的变化将候选药剂鉴定为调节GFRAL蛋白与RET蛋白的结合的药剂。
24.一种鉴定调节GFRAL蛋白与RET蛋白结合的药剂的方法，所述方法包括：
a)构建具有由表6的原子坐标界定的GDF15蛋白的复合物的三维结构；
b)利用三维结构和建模方法鉴定调节GFRAL蛋白与RET蛋白的结合的候选药剂；
c)使候选药剂与经遗传修饰表达GFRAL蛋白和RET蛋白的重组细胞接触；和
d)测定GFRAL蛋白和RET蛋白的结合水平；
其中与在候选药剂不存在时GFRAL蛋白和RET蛋白的结合水平相比在候选药剂存在时GFRAL蛋白和RET蛋白的结合水平的变化将候选药剂鉴定为调节GFRAL蛋白与RET蛋白的结合的药剂。
25.权利要求24的方法，其中由重组细胞表达的GFRAL蛋白包含GFRAL蛋白的胞外域。
26.权利要求25的方法，其中所述GFRAL蛋白的胞外域包含与在GFRAL蛋白和RET蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基，其中所述GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297和GLN298。
27.一种治疗对象的非刻意体重减轻或预防有非刻意体重减轻风险的对象的非刻意体重减轻的方法，所述方法包括：
给予对象以下之一：
a)结合GFRAL蛋白的胞外域的药剂，其中所述GFRAL-ECD包含(i)与在GFRAL蛋白和GDF15蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基，其中所述GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197和GLN200，和/或(ii)与在GFRAL蛋白和RET蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基，其中所述GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297和GLN298；和
b)GFRAL蛋白的胞外域(GFRAL-ECD)，
其中以有效量给予所述药剂或GFRAL-ECD以治疗或预防对象的非刻意体重减轻的发生。
28.权利要求27的方法，其中给予所述GFRAL-ECD。
29.权利要求28的方法，其中所述GFRAL-ECD与异源蛋白质融合。
30.权利要求29的方法，其中所述异源蛋白质独立选自Ig Fc、白蛋白和麦芽糖结合蛋白。
31.权利要求30的方法，其中所述白蛋白是人血清白蛋白。
32.权利要求27的方法，其中所述药剂包含与GFRAL结合蛋白的胞外域的抗体。
33.权利要求32的方法，其中所述抗体与之结合的GFRAL蛋白的胞外域包含与在GFRAL蛋白和GDF15蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基，其中所述GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197和GLN200。
34.权利要求32或33的方法，其中所述抗体与之结合的GFRAL蛋白的胞外域包含与在GFRAL蛋白和RET蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基，其中所述GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297和GLN298。
35.一种降低出现GDF15蛋白活性升高或有发生GDF15蛋白活性升高的风险的对象的GDF15蛋白活性的方法，所述方法包括：
给予对象以下之一：
a)结合GFRAL蛋白的胞外域的药剂，其中所述GFRAL-ECD包含(i)与在GFRAL蛋白和GDF15蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基，其中所述GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197和GLN200；和/或(ii)与在GFRAL蛋白和RET蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基，其中所述GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297和GLN298；和
b)GFRAL蛋白的胞外域(GFRAL-ECD)，
其中以有效量给予所述药剂或GFRAL-ECD以降低对象的GDF15蛋白活性。
36.权利要求35的方法，其中给予所述GFRAL-ECD。
37.权利要求36的方法，其中所述GFRAL-ECD与异源蛋白质融合。
38.权利要求37的方法，其中所述异源蛋白质独立选自Ig Fc、白蛋白和麦芽糖结合蛋白。
39.权利要求38的方法，其中所述白蛋白是人血清白蛋白。
40.权利要求35的方法，其中所述药剂包含与GFRAL结合蛋白的胞外域的抗体和/或与GDF15蛋白竞争结合GFRAL蛋白。
41.权利要求40的方法，其中所述抗体与之结合的GFRAL蛋白的胞外域包含与在GFRAL蛋白和GDF15蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基，其中所述GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197和GLN200。
42.权利要求40或41的方法，其中所述抗体与之结合的GFRAL蛋白的胞外域包含与在GFRAL蛋白和RET蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基，其中所述GFRAL结构域的一个或多个氨基酸残基与选自以下位置的氨基酸残基一致：SEQ ID NO:9的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297和GLN298。
43.一种包含GFRAL蛋白和GDF15蛋白的晶体。
44.权利要求43的晶体，其中所述晶体衍射X射线辐射以产生呈现具有大致下列晶胞常数的复合物的三维结构的衍射图： 和空间群P21。
45.权利要求43的晶体，其衍射分辨率约的X射线辐射。
46.权利要求43的晶体，其中所述GFRAL蛋白包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
47.权利要求43的晶体，其中所述GDF15蛋白是同二聚体。
48.权利要求43的具有表6的原子坐标的晶体。
49.权利要求43的晶体用于鉴定GDF15蛋白的拮抗剂的筛选测定法。
50.一种包含权利要求43-48中任一项的晶体的组合物。
51.一种鉴定具有结合GDF15蛋白的能力的变异GFRAL蛋白的方法，所述方法包括：
a)构建包含由表6的原子坐标界定的GFRAL蛋白和GDF15蛋白的复合物的三维结构；
b)利用三维结构和建模方法鉴定使GFRAL蛋白突变的位点并使该位点突变以产生变异GFRAL蛋白；
c)产生变异GFRAL蛋白；和
d)测定变异GFRAL蛋白以确定其结合GDF15蛋白的能力。
52.权利要求51的方法，其中所述突变的位点位于与在GFRAL蛋白和GDF15蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域，其中所述结构域包含选自以下的一个或多个氨基酸残基：SEQ IDNO 9的GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197和GLN200。
53.权利要求51的方法，其中所述突变的位点位于与选自以下位置一致的氨基酸处：SEQ ID NO 9的GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197和GLN200。
54.一种鉴定具有结合RET蛋白的能力的变异GFRAL蛋白的方法，所述方法包括：
a)构建包含由表6的原子坐标界定的GFRAL蛋白和GDF15蛋白的复合物的三维结构；
b)利用三维结构和建模方法鉴定使GFRAL蛋白突变的位点并使该位点突变以产生变异GFRAL蛋白；
c)产生变异GFRAL蛋白；和
d)测定变异GFRAL蛋白以确定其结合RET蛋白的能力。
55.权利要求54的方法，其中所述突变的位点位于与在GFRAL蛋白和RET蛋白之间的界面缔合的GFRAL结构域，其中所述结构域包含选自以下的一个或多个氨基酸残基：SEQ IDNO 9的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS25、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297和GLN298。
56.权利要求54的方法，其中所述突变的位点位于与选自以下位置一致的氨基酸处：SEQ ID NO 9的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS25、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297和GLN298。
57.一种鉴定具有结合GFRAL蛋白的能力的变异GDF15蛋白的方法，所述方法包括：
a)构建包含由表6的原子坐标界定的GFRAL蛋白和GDF15蛋白的复合物的三维结构；
b)利用三维结构和建模方法鉴定使GDF15蛋白突变的位点并使该位点突变以产生变异GDF15蛋白；
c)产生变异GDF15蛋白；和
d)测定变异GDF15蛋白以确定其结合GFRAL蛋白的能力。
58.权利要求57的方法，其中所述突变的位点位于与在GDF15蛋白和GFRAL蛋白之间的界面缔合的GDF15结构域，其中所述结构域包含选自以下的一个或多个氨基酸残基：SEQ IDNO 6的SER35、LEU34、THR94、GLY95、GLN40、VAL96、LEU98、PRO36、VAL87、LEU88、ILE89、ASP102、THR100、PRO85和MET86。
59.权利要求57的方法，其中所述突变的位点位于与选自以下位置一致的氨基酸处：SEQ ID NO 6的SER35、LEU34、THR94、GLY95、GLN40、VAL96、LEU98、PRO36、VAL87、LEU88、ILE89、ASP102、THR100、PRO85和MET86。
60.一种产生抑制包含GFRAL蛋白和GDF15蛋白的复合物(GFRAL/GDF15复合物)或包含GFRAL蛋白和RET蛋白的复合物(GFRAL/RET复合物)形成的药剂的方法，所述方法包括：
a)获得包含GFRAL蛋白和两种或更多种药剂之一的复合物(GFRAL/药剂复合物)的两个或更多个三维结构；
b)将三维GFRAL/药剂复合物结构的每一个与GFRAL/GDF15复合物的三维结构或与GFRAL/RET复合物的三维结构进行比较；
c)根据GFRAL/药剂复合物与GFRAL/GDF15复合物的三维结构或与GFRAL/RET复合物的三维结构的结构相似性，选择两种或更多种药剂的至少一种；和
d)产生药剂。
61.权利要求60的方法，其中如果至少一种药剂以与其结合GDF15蛋白或RET蛋白相同或较高的亲和力与GFRAL蛋白结合，则选出至少一种药剂。
62.权利要求60的方法，其中步骤b)的比较包括将两种或更多种GFRAL/药剂复合物中的GFRAL蛋白的氨基酸与选自以下的GFRAL/GDF15复合物中的GFRAL蛋白的氨基酸进行比较：SEQ ID NO:9的GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197和GLN200。
63.权利要求60的方法，其中步骤b)的比较包括将两种或更多种GFRAL/药剂复合物中的GFRAL蛋白的氨基酸与选自以下的GFRAL/GDF15复合物中的GDF15蛋白的氨基酸进行比较：SEQ ID NO:6的SER35、LEU34、THR94、GLY95、GLN40、VAL96、LEU98、PRO36、VAL87、LEU88、ILE89、ASP102、THR100、PRO85和MET86。
64.权利要求60的方法，其中步骤b)的比较包括将两种或更多种GFRAL/药剂复合物中的GFRAL蛋白的氨基酸与选自以下的GFRAL/RET复合物中的GFRAL蛋白的氨基酸进行比较：SEQ ID NO 9的GLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS25、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297和GLN298。
65.权利要求60的方法，其中所述GFRAL/GDF15复合物的三维结构由表6的原子坐标界定。
66.权利要求60的方法，其中比较包括应用建模程序。
67.权利要求60的方法，其中所述药剂在重组细胞中产生。
68.权利要求60的方法，其中产生至少1g、至少10g、至少100g或至少1,000g药剂。
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