[go: up one dir, main page]

WO2018159264A1 - 電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置 - Google Patents

電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置 Download PDF

Info

Publication number
WO2018159264A1
WO2018159264A1 PCT/JP2018/004621 JP2018004621W WO2018159264A1 WO 2018159264 A1 WO2018159264 A1 WO 2018159264A1 JP 2018004621 W JP2018004621 W JP 2018004621W WO 2018159264 A1 WO2018159264 A1 WO 2018159264A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
reservoir
channel
analysis chip
flow path
electrophoresis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2018/004621
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
一木　隆範
知 鬼柳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokyo NUC
Original Assignee
University of Tokyo NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Tokyo NUC filed Critical University of Tokyo NUC
Priority to EP18761639.6A priority Critical patent/EP3591391A4/en
Priority to US16/485,365 priority patent/US20190369046A1/en
Publication of WO2018159264A1 publication Critical patent/WO2018159264A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
    • G01N27/44726—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means using specific dyes, markers or binding molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/50273—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the means or forces applied to move the fluids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44791—Microapparatus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0887—Laminated structure
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B01L2400/0421—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic electrophoretic flow

Definitions

  • the present invention relates to an electrophoresis analysis chip and an electrophoresis analysis apparatus.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2017-037652 for which it applied to Japan on February 28, 2017, and uses the content here.
  • an analysis chip including two reservoirs each provided with an electrode and a microchannel connecting the two reservoirs is used.
  • the analysis is performed, for example, by measuring a sample introduced into the microchannel via the reservoir.
  • the present invention has been made in consideration of the above points, and an object thereof is to provide an electrophoresis analysis chip and an electrophoresis analysis apparatus capable of analyzing a sample with high accuracy.
  • a first reservoir and a second reservoir provided on a base material, an electrophoresis channel that connects the first reservoir and the second reservoir, and allows a sample to migrate, A liquid having a cross-sectional area larger than a cross-sectional area of the migration channel, the liquid held in the first reservoir by connecting the first reservoir and the second reservoir, and the liquid held in the second reservoir;
  • an electrophoretic analysis chip comprising a liquid level adjusting flow path capable of adjusting the liquid level difference.
  • an electrophoretic analysis chip for analyzing a sample, in which the first reservoir, the second reservoir, the first reservoir, and the second reservoir are connected and the sample migrates.
  • a migration structure comprising a migration member having a flow path and a substrate that supports the migration member, the migration member having a cross-sectional area larger than a cross-sectional area of the migration flow path, Electrophoresis comprising a liquid level adjusting flow path that connects the first reservoir and the second reservoir to adjust the liquid level difference between the liquid held in the first reservoir and the liquid held in the second reservoir.
  • an electrophoretic analyzer comprising the electrophoretic analysis chip according to the first aspect or the second aspect of the present invention, and a measuring unit for measuring the zeta potential of the specimen. Is done.
  • the sample can be analyzed with high accuracy in a short time.
  • FIG. 1B is a cross-sectional view taken along line AA in FIG. 1A.
  • 3 is an enlarged perspective view of an electrophoresis unit 310.
  • FIG. FIG. 3 is a sectional view taken along line BB in FIG. 2. It is a figure which shows the relationship between the voltage at the time of supplying with electricity to HEPES and an electric current. It is a figure which shows the relationship between the voltage at the time of energizing PBS and an electric current. It is a figure which shows the relationship between an electrophoretic mobility and the number of particles in the electrophoresis analysis chip of a parallel flow path format.
  • FIG. 3 is a diagram showing the relationship between electrophoretic mobility and the number of particles in a single-channel electrophoresis analysis chip.
  • FIG. 3 is a diagram showing the relationship between electrophoretic mobility and the number of particles in a single-channel electrophoresis analysis chip. It is a figure which shows the relationship between an electrophoretic mobility and the number of particles in the electrophoresis analysis chip of a parallel flow path format. It is a figure which shows the relationship between an electrophoretic mobility and the number of particles in the electrophoresis analysis chip of a parallel flow path format.
  • FIG. 3 is a diagram showing the relationship between electrophoretic mobility and the number of particles in a single-channel electrophoresis analysis chip.
  • FIG. 3 is a diagram showing the relationship between electrophoretic mobility and the number of particles in a single-channel electrophoresis analysis chip.
  • FIG. 3 is a diagram showing the relationship between electrophoretic mobility and the number of particles in a single-channel electrophoresis analysis chip.
  • 6 is a cross-sectional view showing a modification of the electrophoresis analysis chip 300.
  • the present invention provides an electrophoresis analysis chip for use in analyzing a specimen.
  • the sample include cells, extracellular vesicles, fine particles, latex particles (including latex particles modified with antibodies and further modified with cells), polymer micelles, and the like.
  • an extracellular endoplasmic reticulum analysis chip for analyzing extracellular endoplasmic reticulum is used as an electrophoresis analysis chip.
  • an extracellular vesicle means a lipid vesicle including exosome (exosome), apoptotic body, microvesicle and the like.
  • the extracellular endoplasmic reticulum analysis chip (electrophoresis analysis chip) according to the present embodiment will be described by taking as an example the case of analyzing exosomes.
  • Exosomes are lipid vesicles having a diameter of about 30 to 100 nm.
  • various cells such as tumor cells, dendritic cells, T cells, B cells, blood, urine, It is secreted into body fluids such as saliva.
  • Abnormal cells such as cancer cells existing in the body express a protein specific to the cell membrane.
  • An exosome is a secreted product of a cell and expresses a cell-derived protein as a secretory source on its surface.
  • the surface of the exosome is a membrane surface of a lipid vesicle secreted from a cell, and refers to a portion where the secreted exosome is in contact with the environment in the living body.
  • exosomes are detected in blood circulating in the living body, abnormalities in the living body can be detected by analyzing the exosomes without performing a biopsy test.
  • analysis of exosomes using an extracellular endoplasmic reticulum analysis chip can be performed as follows. First, the exosome to be detected is purified. Next, the exosome is brought into contact with the specific binding substance.
  • the specific binding substance means a substance that can specifically bind to a molecule present on the surface of the exosome, and will be described in detail later.
  • the zeta potential of exosome is measured and analyzed using an extracellular endoplasmic reticulum analysis chip. This analysis can be applied not only to exosomes but also to analyzes of the extracellular endoplasmic reticulum in general.
  • Specific binding substances include, for example, antibodies, modified antibodies, aptamers, ligand molecules, and the like.
  • antibodies include IgG, IgA, IgD, IgE, IgM and the like.
  • IgG include IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4.
  • IgA include IgA1 and IgA2.
  • IgM include IgM1 and IgM2.
  • the modified antibody include Fab, F (ab ′) 2 , scFv and the like.
  • Examples of aptamers include peptide aptamers and nucleic acid aptamers.
  • Examples of the ligand molecule include a ligand of the receptor protein when the molecule to be detected present on the surface of the exosome is a receptor protein.
  • examples of the ligand molecule include G protein.
  • the specific binding substance may be labeled with a labeling substance.
  • labeling substances include biotin, avidin, streptavidin, neutravidin, glutathione-S-transferase, glutathione, fluorescent dyes, polyethylene glycol, charged molecules such as melittic acid, and the like.
  • the exosome is purified from a sample containing exosome.
  • the sample include blood, urine, breast milk, bronchoalveolar lavage fluid, amniotic fluid, malignant exudate, saliva, cell culture fluid and the like depending on the purpose. Especially, it is easy to purify exosomes from blood and urine.
  • Examples of the method for purifying exosomes include ultracentrifugation, ultrafiltration, continuous flow electrophoresis, chromatography, and a method using a ⁇ -TAS (Micro-Total Analysis Systems) device.
  • ⁇ -TAS Micro-Total Analysis Systems
  • a specific binding substance antibody, aptamer, etc.
  • a specific binding substance an abnormality associated with a disease such as cancer, obesity, diabetes, or neurodegenerative disease can be detected. Details will be described later.
  • the zeta potential of the exosome reacted with the antibody is measured.
  • the zeta potential is the surface charge of the fine particles in the solution.
  • exosomes are negatively charged while antibodies are positively charged.
  • the zeta potential of the antibody-exosome complex is shifted positively compared to the zeta potential of the exosome alone. Therefore, by measuring the zeta potential of the exosome reacted with the antibody, the expression of the antigen on the exosome membrane surface can be detected. This is true not only for antibodies but also for positively charged specific binding substances.
  • the exosome zeta potential ⁇ is obtained by performing exosome electrophoresis in the micro-channel of the extracellular endoplasmic reticulum analysis chip, optically measuring the exosome electrophoresis speed S, and measuring the measured exosome electrophoresis. Based on the speed S, it can be calculated using the Smolkovsky equation shown in the following equation (1).
  • U ( ⁇ / ⁇ ) ⁇ (1)
  • U is the electrophoretic mobility of the exosome to be measured
  • ⁇ and ⁇ are the dielectric constant and viscosity coefficient of the sample solution, respectively.
  • the electrophoretic mobility U can be calculated by dividing the electrophoretic velocity S by the electric field strength in the microchannel.
  • the exosome electrophoresis speed S is obtained by electrophoresing exosomes in a microchannel of an extracellular endoplasmic reticulum analysis chip, and as an example, irradiating a laser beam on exosomes flowing in the microchannel, Measurement can be performed by obtaining a particle image by scattered light.
  • the laser beam one having a wavelength of 488 nm and an intensity of 50 mW can be given.
  • FIG. 1A is a plan view showing an electrophoretic analyzer 400 according to one embodiment.
  • 1B is a cross-sectional view taken along line AA in FIG. 1A.
  • the electrophoretic analyzer 400 includes an electrophoretic analysis chip 300 and a measurement unit 420.
  • the electrophoresis analysis chip 300 of the present embodiment has a similar configuration, and a plurality (four in FIG. 1A) of electrophoresis units 310 each capable of measuring a sample are arranged along the Y direction.
  • the electrophoresis analysis chip 300 includes a reservoir member 10, a channel member 30, a substrate 50, and electrodes 13 and 14 that are sequentially stacked.
  • the reservoir member 10 and the flow path member 30 constitute an electrophoresis member.
  • the electrophoresis analysis chip 300 in the present embodiment has a laminated structure (laminated body) composed of at least the reservoir member 10, the flow path member 30, and the substrate 50.
  • the laminated structure of the electrophoresis analysis chip 300 has a three-layer structure. Further, for example, such a laminated structure of the electrophoresis analysis chip 300 is formed by bonding the reservoir member 10, the flow path member 30, and the substrate 50 to each other.
  • the direction in which the reservoir member 10, the flow path member 30 and the substrate 50 are sequentially stacked is the Z direction (Z axis), and the length direction of the reservoir member 10, the flow path member 30 and the substrate 50 is the Y direction.
  • the width direction of the reservoir member 10, the flow path member 30, and the substrate 50 orthogonal to the (Y axis), the Z direction, and the Y direction will be appropriately described as the X direction (X axis).
  • the material for forming the reservoir member 10 is not particularly limited.
  • Examples of the material of the reservoir member 10 include elastomers such as silicone rubber and PDMS (polydimethylsiloxane).
  • FIG. 2 is an enlarged perspective view of the electrophoresis unit 310.
  • 3 is a cross-sectional view taken along line BB in FIG.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view taken along a plane parallel to the YZ plane including a line segment connecting the center of the first holding space 31 and the center of the second holding space 32 described later.
  • the reservoir member 10 includes a first reservoir 11, a second reservoir 21, and a liquid level adjusting flow path 15.
  • reserver 21 are arrange
  • a sample eg, exosome to be analyzed
  • a buffer is introduced into the other of the first reservoir 11 and the second reservoir 21.
  • the first reservoir 11 includes a first holding space 12 having a circular cross section in a plane parallel to the XY plane and extending in the Z direction.
  • the first holding space 12 penetrates the reservoir member 10 in the Z direction.
  • the second reservoir 21 includes a second holding space 22 having a circular cross section in a plane parallel to the XY plane and extending in the Z direction.
  • the second holding space 22 penetrates the reservoir member 10 in the Z direction.
  • the liquid level adjusting flow path 15 is a flow path for adjusting the liquid level difference between the liquid held in the first reservoir 11 and the liquid held in the second reservoir 21.
  • the liquid level adjusting flow path 15 extends in the Y direction and connects the first reservoir 11 and the second reservoir 21.
  • the position of the liquid level adjusting flow path 15 in the XY plane is on a line connecting the center position of the first holding space 12 and the center position of the second holding space 22.
  • the liquid level adjusting flow path 15 is formed in a V-shaped cross section that opens to the upper surface 10 a of the reservoir member 10.
  • the width of the liquid level adjusting flow path 15 on the upper surface 10 a is smaller than the diameters of the first holding space 12 and the second holding space 22.
  • the liquid level adjusting flow path 15 connects and communicates with the upper end of the first holding space 12 and the upper end of the second holding space 22.
  • the electrode 13 is disposed in the first holding space 12 along the Z direction.
  • the electrode 14 is disposed in the second holding space 22 along the Z direction.
  • the flow path member 30 includes a first holding space 31, a second holding space 32, and an electrophoresis flow path 33.
  • the first holding space 31 is formed in a circular cross section and extends in the Z direction.
  • the first holding space 31 penetrates the flow path member 30 in the Z direction.
  • the diameter of the first holding space 31 is smaller than the diameter of the first holding space 31.
  • the first holding space 31 is connected to the first holding space 12.
  • the center position of the first holding space 31 in the XY plane is arranged more biased toward the ⁇ X side than the center position of the first holding space 12.
  • the second holding space 32 is formed in a circular cross section and extends in the Z direction. The second holding space 32 penetrates the flow path member 30 in the Z direction.
  • the diameter of the second holding space 32 is smaller than the diameter of the second holding space 22.
  • the second holding space 32 is connected to the second holding space 22.
  • the center position of the second holding space 32 in the XY plane is arranged more biased toward the ⁇ X side than the center position of the second holding space 22.
  • the electrophoresis channel 33 is, for example, a millimeter channel or a micro channel.
  • the electrophoresis channel 33 is a specific binding substance formed by the interaction between an extracellular vesicle or a specific binding substance that specifically binds to a molecule present on the surface of the extracellular vesicle and the extracellular vesicle.
  • -Electrophoresis of an extracellular endoplasmic reticulum complex for example, an antibody-exosome complex.
  • An example of a specific binding substance includes an antibody, an aptamer, or a combination thereof.
  • Aptamers are, for example, nucleic acid aptamers, peptide aptamers and the like.
  • molecules recognized by the specific binding substance include antigens, membrane proteins, nucleic acids, sugar chains, glycolipids and the like.
  • the migration channel 33 is provided along the Y direction so as to connect the first holding space 31 and the second holding space 32 to the surface 30 a of the channel member 30 on the side facing the substrate 50.
  • the electrophoresis channel 33 has a rectangular cross section with a width of 200 ⁇ m and a height of 50 ⁇ m, and is formed with a length of about 1000 ⁇ m.
  • the cross-sectional area of the migration channel 33 is smaller than the cross-sectional area of the liquid level adjusting channel 15. In other words, the cross-sectional area of the liquid level adjusting channel 15 is larger than the cross-sectional area of the migration channel 33. Therefore, the liquid level adjusting flow path 15 has a higher conductance with respect to the liquid flow than the migration flow path 33.
  • the flow path member 30 is formed of PDMS, similar to the reservoir member 10.
  • the flow path member 30 is preferably transparent to laser light from a measurement unit 420 described later.
  • the substrate 50 supports the flow path member 30 from the ⁇ Z side.
  • the substrate 50 is formed of PDMS, similarly to the reservoir member 10 and the flow path member 30.
  • the substrate 50 is preferably transparent to laser light from a measurement unit 420 described later.
  • the reservoir member 10, the flow path member 30, and the substrate 50 are stacked so that the surfaces on the ⁇ X side are flush with each other.
  • the channel member 30 is formed in a size that extends to both sides in the Y direction and to the + X side with respect to the edge of the reservoir member 10.
  • the substrate 50 is formed to have a size that extends to both sides in the Y direction and to the + X side with respect to the edge of the flow path member 30.
  • the reservoir member 10 is, for example, PDMS (SILPOT 184, manufactured by Toray Dow Corning Co., Ltd.) and a cross-linking agent mixed at a ratio of 10: 1 and degassed, and PDMS is cast into a resin mold. And by solidifying by heating at 80 ° C. for 7 hours.
  • the flow path member 30 is prepared by pouring PDMS having the same composition as the PDMS used in the preparation of the reservoir member 10 into a glass material having a flow path mold made of a cube having a width of 200 ⁇ m and a length of 40 mm, and being cured by heating. And can be produced by peeling from the flow path mold after curing.
  • the reservoir member 10, the flow path member 30 and the substrate 50 are each plasma-irradiated and bonded to each other, whereby the first holding spaces 12 and 31 of the first reservoir 11, the second holding space 22 of the second reservoir 21,
  • an electrophoresis analysis chip 300 is prepared in which 32 is connected via the electrophoresis channel 33.
  • the electrophoresis analysis chip 300 may be provided with a cover that covers the opening of the first holding space 12, the opening of the second holding space 22, and the liquid level adjusting flow path 15. .
  • the cover does not seal the opening of the first holding space 12, the opening of the second holding space 22, and the liquid level adjusting channel 15, but the opening of the first holding space 12, the second holding space 22.
  • the opening and the liquid level adjusting flow path 15 are covered with being opened to the atmosphere.
  • the measurement unit 420 includes a light irradiation unit 421, a detection unit 422, and a mobility calculation unit (not shown).
  • the light irradiation unit 421 irradiates the migration channel 33 with light from the ⁇ X side via the through hole 16.
  • the irradiated light is, for example, laser light.
  • the detection unit 422 includes, for example, an objective lens and a light receiving sensor (for example, a high sensitivity camera).
  • the detection unit 422 is disposed on the ⁇ Z side of the electrophoresis analysis chip 300.
  • the detection unit 422 detects light (scattered light) irradiated from the light irradiation unit 421 and reflected by the specimen in the migration channel 33.
  • the mobility calculation unit calculates the zeta potential from the mobility of the specimen based on the detection result of the detection unit 422.
  • the zeta potential can be calculated for each electrophoretic unit 310 by moving the electrophoretic analysis chip 300 in the Y direction so that the electrophoretic unit 310 faces the light irradiation unit 421 and the detection unit 422.
  • the specimen is an exosome.
  • the exosome to be analyzed may have been reacted with a specific binding substance.
  • the exosome is extracted from, for example, a culture supernatant or serum, and the sample solution is an exosome suspension in which the exosome is suspended in a buffer solution.
  • the buffer preferably has a conductivity of 17800 ⁇ S / cm or less.
  • the conductivity of the buffer solution exceeds the above upper limit value, an excessive current flows through the liquid level adjusting flow path 15, and an undesirable degree of Joule heat generation or electrolysis of the buffer solution may occur.
  • a liquid containing a specimen (hereinafter, appropriately referred to as a specimen liquid) is dropped into the first holding space 12 of the first reservoir 11, for example.
  • the sample liquid is introduced into the first holding space 12 through the opening (sample inlet) of the first holding space 12 on the upper surface 10a.
  • the sample liquid is introduced into the migration channel 33 by inserting, for example, a syringe into the second holding space 22 of the second reservoir 21 to aspirate the sample liquid.
  • the same sample liquid as the sample liquid dropped into the first holding space 12 of the first reservoir 11 is dropped into the second holding space 22 of the second reservoir 21, and the first holding space is sandwiched between the migration flow paths 33. 12 and 31 and the second holding spaces 22 and 32 are connected by the sample liquid.
  • the sample liquid is introduced at the liquid level loaded in the liquid level adjusting flow path 15. More specifically, the sample liquid is supplied to the liquid level adjusting channel 15 so that the cross-sectional area of the sample liquid introduced into the liquid level adjusting channel 15 is larger than the cross-sectional area of the sample liquid introduced into the migration channel 33. Is introduced.
  • the hydrostatic pressure in the electrophoresis channel 33 is caused.
  • the sample liquid containing the sample flows from the second holding spaces 22 and 32 toward the first holding spaces 12 and 31.
  • the liquid level difference is eliminated (adjusted) by the sample liquid introduced into the liquid level adjusting flow path 15 flowing into the holding space on the lower liquid level side. As a result, it is possible to prevent the generation of a hydrostatic pressure flow that occurs in the migration channel 33 and improve the accuracy of zeta potential measurement.
  • the electrophoresis channel 33 is irradiated with laser light, and the scattered light that has passed through the exosome, which is emitted from the electrophoresis channel 33, is collected using an objective lens or the like. Photograph exosomes or specific binding substance-exosome complexes. The magnification of the objective lens is about 60 times as an example.
  • the mobility calculation unit calculates the electrophoresis speed S of the exosome or the specific binding substance-exosome complex based on the photographed image. Then, the mobility calculation unit calculates the electrophoresis mobility U by dividing the electrophoresis speed S by the electric field strength. Subsequently, the mobility calculation unit calculates the zeta potential of the exosome or the specific binding substance-exosome complex using the above-mentioned Smolkovsky equation.
  • FIG. 4A is a diagram showing a relationship between voltage and current when HEPES is energized. From the relationship shown in FIG. 4A, the electrical resistance value of HEPES is about 24.4 M ⁇ .
  • FIG. 4B is a figure which shows the relationship between the voltage at the time of supplying with electricity to the phosphate buffer (Phosphate Buffered Saline, PBS) used as a buffer solution. From the relationship shown in FIG. 4A, the electrical resistance value of PBS is about 0.32 M ⁇ . Since the electric resistance value of HEPES is larger than the electric resistance value of PBS, it is considered that the conductivity of HEPES is smaller than the electric conductivity of PBS. When the conductivity of HEPES was measured, it was about 250 ⁇ S / cm for the 10 mM HEPES.
  • PBS phosphate Buffered Saline
  • the mobility was measured.
  • a sample liquid containing polystyrene particles having an average particle diameter of about 100 nm was introduced into each of a parallel channel electrophoresis analysis chip and a single channel electrophoresis analysis chip using a 1 mL syringe.
  • a laser beam processed into a planar shape using a cylindrical lens is applied to each of the parallel channel type electrophoresis analysis chip and the single channel type electrophoresis analysis chip from the light irradiation unit 421.
  • the path 33 was irradiated, and the scattered light from the migration channel 33 was observed by the detection unit 422.
  • Observation of particles as a specimen was performed in an electric field with an electric field strength of 10 V / cm and an electric field with an electric field strength of 20 V / cm, and the apparent electrophoretic mobility was determined for each electric field strength.
  • FIG. 5A is a diagram showing the relationship between the electrophoretic mobility and the number of particles obtained from the results observed in an electric field having an electric field strength of 10 V / cm in the parallel flow channel type electrophoresis analysis chip.
  • FIG. 5B is a diagram showing the relationship between the electrophoretic mobility and the number of particles obtained from the results observed in an electric field with an electric field strength of 20 V / cm in the parallel flow path type electrophoresis analysis chip.
  • FIG. 6A is a diagram showing the relationship between the electrophoretic mobility and the number of particles obtained from the results observed in an electric field having an electric field strength of 10 V / cm in a single-channel electrophoresis analysis chip.
  • FIG. 6B is a diagram showing the relationship between the electrophoretic mobility and the number of particles (distribution) obtained from the results observed in an electric field with an electric field strength of 20 V / cm in a single-channel electrophoresis analysis chip.
  • a sample liquid containing polystyrene particles having an average particle diameter of about 100 nm was introduced into each of a parallel channel electrophoresis analysis chip and a single channel electrophoresis analysis chip using a 1 mL syringe.
  • both types of electrophoretic analysis chips are irradiated with the laser light processed into the above-described planar shape from the light irradiation unit 421 to the migration channel 33, and the scattered light from the migration channel 33 is observed by the detection unit 422. did.
  • the observation of the particles as the specimen was performed in an electric field with an electric field strength of 10 V / cm, and the apparent electrophoretic mobility was determined for each type of electrophoresis analysis chip.
  • the sample liquid is removed from the flow path by a syringe operation, and a cleaning liquid (for example, 10 mM HEPES) is introduced into and removed from each flow path by a syringe operation in the same manner as the sample liquid.
  • a cleaning liquid for example, 10 mM HEPES
  • the test was repeated alternately several times (for example, 3 to 4 times).
  • a sample liquid containing uncharged beads as a sample was introduced into a parallel flow path type electrophoresis analysis chip and a single flow path type electrophoresis analysis chip using a 1 mL syringe, respectively.
  • a laser beam processed into a flat shape is irradiated from the light irradiation unit 421 to the migration channel 33, and the scattered light from the migration channel 33 is observed by the detection unit 422.
  • Apparent electrophoretic mobility was determined for each type of electrophoresis analysis chip.
  • the electrophoretic mobility obtained using the sample solution containing uncharged beads is considered to be the flow velocity of the electroosmotic flow
  • the electrophoretic mobility obtained using the sample solution containing polystyrene particles By subtracting the electrophoretic mobility obtained from the sample solution containing the uncharged beads from the electrophoretic mobility, the electrophoretic mobility of the polystyrene particles excluding the influence of the electroosmotic flow can be obtained.
  • FIG. 7A is a diagram showing the relationship between the electrophoretic mobility and the number of particles obtained from the results observed when an uncharged bead is used as a specimen in an electrophoretic analysis chip in a parallel flow channel format.
  • FIG. 7B shows the electrophoretic mobility determined using uncharged beads from the electrophoretic mobility determined when 100 nm polystyrene particles were used as the specimen in the parallel flow path type electrophoresis analysis chip. It is a figure which shows the relationship between the subtracted electrophoretic mobility and the number of particles.
  • FIG. 8A is a diagram showing the relationship between the electrophoretic mobility and the number of particles determined from the results observed when an uncharged bead is used as a specimen in an electrophoretic analysis chip of a single channel format.
  • FIG. 8B shows the electrophoretic mobility determined using non-charged beads from the electrophoretic mobility determined when 100 nm polystyrene particles were used as a specimen in a single-channel electrophoresis analysis chip. It is a figure which shows the relationship between the subtracted electrophoretic mobility and the number of particles.
  • the electrophoretic mobility obtained using the uncharged beads is 3.1 ⁇ 0.5. [ ⁇ m ⁇ cm / V ⁇ s].
  • the electrophoretic mobility determined using polystyrene particles was ⁇ 1.7 ⁇ 0.3 [ ⁇ m ⁇ cm / V ⁇ s].
  • the electrophoretic mobility obtained using the uncharged beads was 4.2 ⁇ 0.5 [ ⁇ m ⁇ cm / V ⁇ s].
  • the electrophoretic mobility determined using polystyrene particles was ⁇ 1.8 ⁇ 0.3 [ ⁇ m ⁇ cm / V ⁇ s].
  • the electrophoresis analysis chip 300 By using the electrophoresis analysis chip 300 in this embodiment, not only the average value of the zeta potential of the specific binding substance-exosome complex but also the zeta potential of the specific binding substance-exosome complex is measured at the level of one particle. be able to. Therefore, from the average value of the zeta potential, even if it seems that there is no exosome having a molecule (for example, antigen) recognized by the specific binding substance in the sample, it exists as a minor population. An exosome having the antigen can be detected.
  • a molecule for example, antigen
  • the liquid level adjustment channel 15 having a larger cross-sectional area than the cross-sectional area of the electrophoresis channel 33 is provided.
  • the liquid level difference between the sample liquid held in the first reservoir 11 and the sample liquid held in the second reservoir 21 is adjusted in a short time. It becomes possible. Therefore, in the electrophoresis analysis chip 300 and the electrophoresis analysis apparatus 400 in the present embodiment, the measurement error of the electrophoresis mobility caused by the liquid level difference between the sample liquids held in the first and second reservoirs 11 and 21. Therefore, it is possible to analyze the sample with high accuracy in a short time.
  • the influence of Joule heat generated by applying a voltage between the electrode 13 and the electrode 14 is introduced into the liquid level adjusting flow path 15.
  • HEPES having a conductivity of 17800 ⁇ S / cm or less and a high resistance is used as a buffer solution contained in the sample liquid.
  • HEPES having a conductivity of 17800 ⁇ S / cm or less and a high resistance is used as a buffer solution contained in the sample liquid.
  • the electrophoresis channel 33 is closer to the light irradiation unit 421 than the line segment connecting the centers of the first reservoir 11 and the second reservoir 21. Since they are arranged, the optical path length of the laser light irradiated toward the migration channel 33 can be shortened. Therefore, in the electrophoresis analysis chip 300 and the electrophoresis analysis apparatus 400 in the present embodiment, the output of the laser light can be lowered, the scattered light generated from other than the specimen can be suppressed, and the analysis accuracy can be improved. .
  • the migration flow path 33 and the liquid level adjustment flow path 15 are arranged so as to be shifted in the height direction (Z direction). It is possible to avoid scattered light from being detected in the sample liquid in the liquid level adjusting flow path 15 by being irradiated with the laser light transmitted through the path 33 and detected as noise by the detection unit 422, and further improve the analysis accuracy.
  • the configuration using HEPES as a buffer solution having a conductivity of 17800 ⁇ S / cm or less is exemplified, but the present invention is not limited to this configuration.
  • As the buffer solution another liquid may be used as long as the conductivity is 17800 ⁇ S / cm or less.
  • the influence of Joule heat generated by applying a voltage between the electrode 13 and the electrode 14 is suppressed by using a buffer solution having a high electric resistance.
  • the present invention is not limited to this structure.
  • the second liquid OL having an electric resistance higher than the electric resistance of the buffer solution BS is arranged at a position sandwiched between the buffer solutions BS in the liquid level adjusting channel 15. Also good.
  • the liquid level adjusting channel 15 and the migration channel 33 are illustrated in the same cross section.
  • an oil agent such as silicone oil or fluorine oil can be used as the second liquid OL.
  • the second liquid OL is generated by the pressure generated in the sample liquid in the liquid level adjusting channel 15 according to the liquid level difference between the sample liquid held in the first reservoir 11 and the sample liquid held in the second reservoir 21.
  • the viscosity is preferably movable in the Y direction.
  • the viscosity of the second liquid OL may be set according to the ratio of the flow conductance in the liquid level adjusting flow path 15 and the flow conductance in the migration flow path 33. Specifically, when the ratio of the cross-sectional area of the liquid level adjusting channel 15 to the cross-sectional area of the migration channel 33 is R, the viscosity of the second liquid OL is a liquid whose ratio to the viscosity of the buffer solution is less than R. Use it.
  • the buffer solution can flow in the liquid level adjusting channel 15 with a larger conductance than the migration channel 33. Further, by interposing the second liquid OL having a high electric resistance in the buffer solution in the liquid level adjusting flow path 15, it is not necessary to use a buffer solution having a high electric resistance. Therefore, for example, it is possible to use a buffer solution having a low electrical resistance, such as the PBS described above, and the versatility is expanded.
  • the opening of the first holding space 12 the opening of the second holding space 22, and the liquid level adjusting flow
  • a cover covering the channel 15 preferably seals the liquid level adjusting channel 15.
  • the configuration in which the axial electrodes 13 and 14 are arranged in the first reservoir 11 and the second reservoir 21 along the Z direction is exemplified, but the present invention is not limited to this configuration.
  • substrate 50 may be sufficient.
  • the configuration in which the cross-sectional shape of the liquid level adjusting channel 15 is V-shaped is exemplified, but the configuration is not limited to this configuration.
  • the cross-sectional shape of the liquid level adjusting channel 15 may be, for example, a polygonal shape such as a rectangular shape.
  • the cross-sectional shape of the liquid level adjusting channel 15 is preferably a shape having a small contact area with the liquid level adjusting channel 15 in order to increase the flow conductance of the sample liquid, and more preferably a semicircular cross section including an arc as an example. .
  • the configuration in which the reservoir member 10 and the flow path member 30 are stacked is illustrated as the migration member, but the configuration is not limited to this configuration.
  • the migration member for example, the first reservoir 11, the first holding space 12, the second reservoir 21, the second holding space 22, the migration channel 33, and the liquid level adjusting channel 15 are provided on a single base material.
  • substrate 50 may be sufficient.
  • the present invention can be applied to an electrophoresis analysis chip and an electrophoresis analysis apparatus.
  • SYMBOLS 10 DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 ... Reservoir member, 11 ... 1st reservoir, 12 ... 1st holding space, 13, 14 ... Electrode, 15 ... Liquid level adjustment flow path, 21 ... 2nd reservoir, 22 ... 2nd holding space, 30 ... Flow path member 33 ... electrophoresis channel, 50 ... substrate, 300 ... extracellular endoplasmic reticulum analysis chip (electrophoresis analysis chip), 400 ... electrophoresis analyzer, 420 ... measuring unit, OL ... second liquid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)

Abstract

本発明は、検体の分析を短時間で高精度に行える電気泳動分析チップを提供することを目的とする。基材（１０）に設けられた第１リザーバー（１１）及び第２リザーバー（２１）と、第１リザーバーと第２リザーバーとを接続し、検体が泳動可能な泳動流路（３３）と、泳動流路の断面積よりも大きな断面積を有し、第１リザーバーと第２リザーバーとを接続して第１リザーバーに保持された液体と第２リザーバーに保持された液体との液位差を調整可能な液位調整流路（１５）と、を備える。

Description

電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置
　本発明は、電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置に関する。
　本願は、２０１７年２月２８日に、日本に出願された特願２０１７－０３７６５２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　検体の分析においては、例えば、それぞれに電極が配された二つのリザーバーと、二つのリザーバーを接続するマイクロ流路とを備える分析チップが用いられる。分析は、例えば、リザーバーを介してマイクロ流路内に導入した検体を計測することにより行われる。
米国特許第５，４８２，６０８号明細書
　しかしながら、上述したような従来技術には、以下のような問題が存在する。
　二つのリザーバーにおける液位が異なると、静水圧流によってマイクロ流路における検体に流れが生じる可能性がある。検体の計測においては、電極に電圧を印加する前にマイクロ流路における検体が移動すると、高精度の計測に支障を来す可能性がある。
　本発明は、以上のような点を考慮してなされたもので、検体の分析を高精度に行える電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置を提供することを目的とする。
　本発明の第１の態様に従えば、基材に設けられた第１リザーバー及び第２リザーバーと、前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとを接続し、検体が泳動可能な泳動流路と、前記泳動流路の断面積よりも大きな断面積を有し、前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとを接続して前記第１リザーバーに保持された液体と前記第２リザーバーに保持された液体との液位差を調整可能な液位調整流路と、を備える電気泳動分析チップが提供される。
　本発明の第２の態様に従えば、検体を分析する電気泳動分析チップであり、第１リザーバーと、第２リザーバーと、前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとを接続し検体が泳動する泳動流路と、を有する泳動部材と、前記泳動部材を支持する基板と、で構成される積層構造であり、前記泳動部材は、前記泳動流路の断面積よりも大きな断面積を有し、前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとを接続して前記第１リザーバーに保持された液体と前記第２リザーバーに保持された液体との液位差を調整可能な液位調整流路を備える電気泳動分析チップが提供される。
　本発明の第３の態様に従えば、本発明の第１の態様または第２の態様の電気泳動分析チップと、前記検体のゼータ電位を計測する計測部と、を備える電気泳動分析装置が提供される。
　本発明では、検体の分析を短時間で高精度に行うことができる。
実施形態に係る電気泳動分析装置４００を示す平面図である。 図１ＡにおけるＡ－Ａ線視断面図である。 電気泳動部３１０を拡大した斜視図である。 図２におけるＢ－Ｂ線視断面図である。 ＨＥＰＥＳに通電した際の電圧と電流との関係を示す図である。 ＰＢＳに通電した際の電圧と電流との関係を示す図である。 並行流路形式の電気泳動分析チップにおいて、電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。 並行流路形式の電気泳動分析チップにおいて、電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。 単流路形式の電気泳動分析チップにおいて、電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。 単流路形式の電気泳動分析チップにおいて、電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。 並行流路形式の電気泳動分析チップにおいて、電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。 並行流路形式の電気泳動分析チップにおいて、電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。 単流路形式の電気泳動分析チップにおいて、電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。 単流路形式の電気泳動分析チップにおいて、電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。 電気泳動分析チップ３００の変形例を示す断面図である。
　一実施態様において、本発明は、検体を分析する際に用いられる電気泳動分析チップを提供する。検体としては、細胞、細胞外小胞体、微粒子、ラテックス粒子（抗体で修飾され、さらに細胞で修飾されたラテックス粒子を含む）、高分子ミセル等が挙げられる。本実施形態では、電気泳動分析チップとして、細胞外小胞体を分析するための細胞外小胞体分析チップを用いる場合について説明する。本明細書において、細胞外小胞体とは、エクソソーム（エキソソーム）、アポトーシス小体、マイクロベシクル等を含む、脂質小胞を意味するものとする。以下に、エクソソームを分析する場合を例として、本実施形態に係る細胞外小胞体分析チップ（電気泳動分析チップ）について説明する。
［エクソソーム］
　エクソソーム（エキソソーム）は、直径３０～１００ｎｍ程度の脂質小胞であり、エンドソームと細胞膜との融合体として、腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞等、種々の細胞から、血液、尿、唾液等の体液中に分泌される。
　生体内に存在する癌細胞等の異常細胞は、その細胞膜に特有のタンパク質を発現している。エクソソームは細胞の分泌物であり、その表面に分泌源の細胞由来のタンパク質を発現している。
　そこで、エクソソームの表面に発現しているタンパク質を分析することで、分泌源の細胞の異常を検出することができる。ここで、エクソソームの表面とは、細胞から分泌される脂質小胞の膜表面であって、分泌されたエクソソームが生体内の環境と接する部分をいう。
　エクソソームは、生体内で循環している血液中で検出されるため、エクソソームを分析することで、バイオプシー検査をしなくとも、生体内の異常を検出することができる。
　［エクソソームの分析］
　細胞外小胞体分析チップを用いたエクソソームの分析は、一例として次のようにして行うことができる。まず、検出対象のエクソソームを精製する。次に、エクソソームと特異的結合物質とを接触させる。ここで、特異的結合物質とは、エクソソームの表面に存在する分子に特異的に結合することができる物質を意味し、詳細は後述する。次に、細胞外小胞体分析チップを用いて、エクソソームのゼータ電位を計測し、分析を行う。本分析は、エクソソームに限らず、広く細胞外小胞体一般の分析にも適用できる。
（特異的結合物質）
　特異的結合物質としては、例えば、抗体、改変抗体、アプタマー、リガンド分子等が挙げられる。抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等が挙げられる。ＩｇＧとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等が挙げられる。ＩｇＡとしては、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等が挙げられる。ＩｇＭとしては、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２等が挙げられる。改変抗体としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ等が挙げられる。アプタマーとしては、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー等が挙げられる。リガンド分子としては、エクソソームの表面に存在する検出対象分子が、レセプタータンパク質である場合の、当該レセプタータンパク質のリガンド等が挙げられる。例えば、エクソソームの表面に存在する分子がインターロイキンである場合、リガンド分子としてはＧタンパク質等が挙げられる。
　また、特異的結合物質は、標識物質で標識されていてもよい。標識物質としては、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、グルタチオン、蛍光色素、ポリエチレングリコール、メリト酸等の電荷分子等が挙げられる。
（エクソソームの精製）
　本分析の各工程について説明する。まず、エクソソームを含有する試料から該エクソソームを精製する。試料としては、目的に応じて、血液、尿、母乳、気管支肺胞洗浄液、羊水、悪性滲出液、唾液、細胞培養液等が挙げられる。中でも、血液及び尿からは、エクソソームを精製しやすい。
　エクソソームを精製する方法としては、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、クロマトグラフィー、μ－ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｔａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）デバイスを使用する方法等が挙げられる。
（エクソソームと特異的結合物質との反応）
　次に、エクソソームと特異的結合物質（抗体、アプタマー等）とを接触させる。エクソソームの表面に検出対象の分子が存在した場合、特異的結合物質－エクソソーム複合体が形成される。特異的結合物質を適切に選択することにより、例えば、癌、肥満、糖尿病、神経変性疾患等の疾患に関連する異常を検出することができる。詳細については後述する。
　（ゼータ電位の計測）
　一例として、特異的結合物質として抗体を使用した場合について説明する。エクソソームと抗体とを反応させた後、抗体と反応させたエクソソームのゼータ電位を計測する。ゼータ電位とは、溶液中の微粒子の表面電荷である。例えば、エクソソームが負に帯電しているのに対し、抗体は正に帯電している。このため、抗体－エクソソーム複合体のゼータ電位は、エクソソーム単独のゼータ電位と比較して正にシフトしている。したがって、抗体と反応させたエクソソームのゼータ電位を測定することによって、エクソソームの膜表面における抗原の発現を検出することができる。これは、抗体に限らず、正に帯電した特異的結合物質でも同様である。
　エクソソームのゼータ電位ζは、一例として、細胞外小胞体分析チップのマイクロ流路内で、エクソソームの電気泳動を行い、エクソソームの電気泳動速度Ｓを光学的に測定し、測定されたエクソソームの電気泳動速度Ｓに基づいて、以下の式（１）に示すスモルコフスキー（Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ）の式を用いて算出することができる。
　Ｕ＝（ε／η）ζ　…（１）
　式（１）中、Ｕは測定対象のエクソソームの電気泳動移動度、ε及びηは、それぞれ、サンプル溶液の誘電率及び粘性係数である。また、電気泳動移動度Ｕは、電気泳動速度Ｓをマイクロ流路内の電界強度で除して算出することができる。
　エクソソームの電気泳動速度Ｓは、一例として、エクソソームを、細胞外小胞体分析チップのマイクロ流路内で電気泳動し、一例として、レーザー光を、マイクロ流路内を流れるエクソソームに照射して、レイリー散乱光による粒子画像を取得することにより、測定することができる。レーザー光としては、一例として、波長４８８ｎｍ、強度５０ｍＷのものが挙げられる。
［電気泳動分析装置］
　図１Ａは、一実施態様に係る電気泳動分析装置４００を示す平面図である。図１Ｂは、図１ＡにおけるＡ－Ａ線視断面図である。
　電気泳動分析装置４００は、電気泳動分析チップ３００および計測部４２０を備えている。
［電気泳動分析チップ］
　本実施形態の電気泳動分析チップ３００は、同様の構成を有しそれぞれにおいて検体の計測が可能な複数（図１Ａでは四つ）の電気泳動部３１０がＹ方向に沿って配置されている。
　電気泳動分析チップ３００は、順次積み重ねられたリザーバー部材１０、流路部材３０、基板５０および電極１３、１４を備えている。リザーバー部材１０および流路部材３０は、泳動部材を構成する。例えば、本実施形態における電気泳動分析チップ３００は、少なくともリザーバー部材１０、流路部材３０及び基板５０で構成された、積層構造（積層体）である。この場合、電気泳動分析チップ３００の積層構造は三層構造となっている。また、例えば、このような電気泳動分析チップ３００の積層構造は、リザーバー部材１０と、流路部材３０と、基板５０とを互いに貼りあわせて形成される。
　なお、以下の説明においては、リザーバー部材１０、流路部材３０及び基板５０が順次積み重ねられる方向をＺ方向（Ｚ軸）、リザーバー部材１０、流路部材３０及び基板５０の長さ方向をＹ方向（Ｙ軸）、Ｚ方向及びＹ方向と直交するリザーバー部材１０、流路部材３０及び基板５０の幅方向をＸ方向（Ｘ軸）として適宜説明する。
　リザーバー部材１０を形成する材料としては、特に限定されない。リザーバー部材１０の材料には、一例として、エラストマーであり、シリコーンゴム、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）などが挙げられる。
　図２は、電気泳動部３１０を拡大した斜視図である。図３は、図２におけるＢ－Ｂ線視断面図である。図３は、後述する第１保持空間３１の中心と第２保持空間３２の中心とを結ぶ線分を含むＹＺ平面と平行な面で断面した図である。
　リザーバー部材１０は、第１リザーバー１１、第２リザーバー２１および液位調整流路１５を備えている。第１リザーバー１１及び第２リザーバー２１は、後述する泳動流路３３の流路方向であるＹ方向に間隔をあけて配置されている。一例として、第１リザーバー１１と第２リザーバー２１との一方は、検体（例、分析対象のエクソソーム）が導入され、第１リザーバー１１と第２リザーバー２１との他方は、緩衝液が導入される。
　第１リザーバー１１は、ＸＹ平面と平行な面での断面が円形状でＺ方向に延在する第１保持空間１２を備えている。第１保持空間１２は、リザーバー部材１０をＺ方向に貫通している。第２リザーバー２１は、ＸＹ平面と平行な面での断面が円形状でＺ方向に延在する第２保持空間２２を備えている。第２保持空間２２は、リザーバー部材１０をＺ方向に貫通している。
　液位調整流路１５は、第１リザーバー１１に保持された液体と第２リザーバー２１に保持された液体との液位差を調整するための流路である。液位調整流路１５は、Ｙ方向に延びて第１リザーバー１１と第２リザーバー２１とを接続している。ＸＹ平面における液位調整流路１５の位置は、第１保持空間１２の中心位置と第２保持空間２２の中心位置とを結ぶ線上である。液位調整流路１５は、リザーバー部材１０の上面１０ａに開口する断面Ｖ字状に形成されている。上面１０ａにおける液位調整流路１５の幅は、第１保持空間１２および第２保持空間２２の直径よりも小さい。液位調整流路１５は、第１保持空間１２の上端と第２保持空間２２の上端とを接続して連通させている。
　電極１３は、Ｚ方向に沿って第１保持空間１２に配置されている。電極１４は、Ｚ方向に沿って第２保持空間２２に配置されている。
　流路部材３０は、第１保持空間３１、第２保持空間３２及び泳動流路３３を備えている。第１保持空間３１は、断面円形状に形成されＺ方向に延在している。第１保持空間３１は、流路部材３０をＺ方向に貫通している。第１保持空間３１の直径は、第１保持空間３１の直径よりも小さい。第１保持空間３１は、第１保持空間１２に接続されている。ＸＹ平面における第１保持空間３１の中心位置は、第１保持空間１２の中心位置よりも－Ｘ側に偏って配置されている。第２保持空間３２は、断面円形状でに形成され、Ｚ方向に延在している。第２保持空間３２は、流路部材３０をＺ方向に貫通している。第２保持空間３２の直径は、第２保持空間２２の直径よりも小さい。第２保持空間３２は、第２保持空間２２に接続されている。ＸＹ平面における第２保持空間３２の中心位置は、第２保持空間２２の中心位置よりも－Ｘ側に偏って配置されている。
　泳動流路３３は、例えば、ミリ流路やマイクロ流路である。泳動流路３３は、細胞外小胞体、あるいは、細胞外小胞体の表面に存在する分子に特異的に結合する特異的結合物質と細胞外小胞体とが相互作用してなる、特異的結合物質－細胞外小胞体複合体（一例として、抗体－エクソソーム複合体）を電気泳動するものである。特異的結合物質の一例として、抗体、アプタマー、またはこれらの組み合わせからなるものが挙げられる。アプタマーは例えば、核酸アプタマー、ペプチドアプタマーなどである。特異的結合物質が認識する分子としては、例えば抗原、膜タンパク質、核酸、糖鎖、糖脂質等が挙げられる。
　泳動流路３３は、流路部材３０において基板５０と対向する側の面３０ａに第１保持空間３１と第２保持空間３２とを接続するようにＹ方向に沿って設けられている。泳動流路３３は、一例として、幅２００μｍ、高さ５０μｍの断面矩形状で、長さ１０００μｍ程度の大きさに形成されている。泳動流路３３の断面積は、液位調整流路１５の断面積よりも小さい。換言すると、液位調整流路１５の断面積は、泳動流路３３の断面積よりも大きい。従って、液位調整流路１５は、泳動流路３３と比較して、液体の流動に関して高いコンダクタンスを有している。流路部材３０は、一例として、リザーバー部材１０と同様に、ＰＤＭＳで形成されるている。流路部材３０としては、後述する計測部４２０のレーザ光に対して透明であることが好ましい。
　基板５０は、流路部材３０を－Ｚ側から支持する。基板５０は、一例として、リザーバー部材１０および流路部材３０と同様に、ＰＤＭＳで形成されるている。基板５０としては、後述する計測部４２０のレーザ光に対して透明であることが好ましい。
　リザーバー部材１０、流路部材３０および基板５０は、－Ｘ側の面が面一で重ねられている。流路部材３０は、リザーバー部材１０の端縁に対してＹ方向の両側、および＋Ｘ側に延出する大きさに形成されている。基板５０は、流路部材３０の端縁に対してＹ方向の両側、および＋Ｘ側に延出する大きさに形成されている。
　上記のリザーバー部材１０は、一例として、ＰＤＭＳ（東レダウコーニング（株）製　SILPOT 184）主剤と架橋剤を１０：１の割合に混合し脱気させることと、ＰＤＭＳを樹脂製の鋳型に注型することと、８０℃で７時間加熱して固化させることで作製される。上記の流路部材３０は、一例として、リザーバー部材１０の作製で用いたＰＤＭＳと同じ組成のＰＤＭＳを、幅２００μｍ、長さ４０ｍｍの立方体からなる流路モールドを有するガラス材に流して込み加熱硬化させ、硬化後に流路モールドから引き剥がすことにより作製することができる。一例として、リザーバー部材１０、流路部材３０及び基板５０をそれぞれプラズマ照射して貼り合わせることにより、第１リザーバー１１の第１保持空間１２、３１と、第２リザーバー２１の第２保持空間２２、３２とが泳動流路３３を介して接続された電気泳動分析チップ３００が作製される。
　なお、図示はしていないが、電気泳動分析チップ３００には第１保持空間１２の開口部、第２保持空間２２の開口部および液位調整流路１５を覆うカバーが設けられていてもよい。ただし、カバーは、第１保持空間１２の開口部、第２保持空間２２の開口部および液位調整流路１５を密封するものではなく、第１保持空間１２の開口部、第２保持空間２２の開口部および液位調整流路１５を大気開放した状態で覆う構成となっている。第１保持空間１２の開口部、第２保持空間２２の開口部および液位調整流路１５がカバーで覆われることにより、検体による周囲の汚染又は周囲環境による検体の汚染を防止することができる。
　図１Ａに戻り、計測部４２０は、光照射部４２１と検出部４２２と移動度算出部（図示せず）とを含む。光照射部４２１は、貫通孔１６を介して－Ｘ側から泳動流路３３に光を照射する。照射される光は、例えば、レーザー光である。検出部４２２は、例えば、対物レンズおよび受光センサ（例、高感度カメラ）を有している。検出部４２２は、電気泳動分析チップ３００の－Ｚ側に配置されている。検出部４２２は、光照射部４２１から照射され泳動流路３３における検体で反射した光（散乱光）を検出する。移動度算出部は、検出部４２２の検出結果に基づき検体の移動度からゼータ電位を算出する。電気泳動分析チップ３００をＹ方向に移動させて、電気泳動部３１０を光照射部４２１および検出部４２２と対向させることにより、電気泳動部３１０毎にゼータ電位を算出することが可能である。
　次に、上記の電気泳動分析チップ３００を用いて検体を計測・分析する手順について説明する。
　検体は、エクソソームである。分析対象のエクソソームは、特異的結合物質と反応させたものであってもよい。エクソソームは、例えば培養上清や血清から抽出したものであり、検体液は、緩衝液にエクソソームが懸濁されたエクソソーム懸濁液である。
　緩衝液は、導電率が１７８００μＳ／ｃｍ以下であることが好ましい。緩衝液の導電率が上記の上限値を超える場合には、液位調整流路１５に過大な電流が流れ、好ましくない程度のジュール発熱や緩衝液の電気分解が生じる可能性がある。
　まず、検体を含む液体（以下、適宜、検体液と称する）を、例えば、第１リザーバー１１の第１保持空間１２に滴下する。このとき、検体液は、上面１０ａにおける第１保持空間１２の開口部（検体導入口）を介して第１保持空間１２に導入される。次に、第２リザーバー２１の第２保持空間２２に、例えばシリンジを挿して検体液を吸引することにより、泳動流路３３に検体液を導入する。
　次に、第１リザーバー１１の第１保持空間１２に滴下した検体液と同じ検体液を、第２リザーバー２１の第２保持空間２２に滴下して、泳動流路３３を挟んで第１保持空間１２、３１及び第２保持空間２２、３２が検体液でつながった状態とする。また、検体液については、液位調整流路１５に装填される液位で導入する。より詳細には、液位調整流路１５に導入された検体液の断面積が、泳動流路３３に導入された検体液の断面積よりも大きくなるように液位調整流路１５に検体液を導入する。
　ここで、第２保持空間２２、３２に保持された検体液の液位が第１保持空間１２、３１に保持された検体液の液位よりも高いと、泳動流路３３においては静水圧により第２保持空間２２、３２から第１保持空間１２、３１に向けて検体を含む検体液が流動する可能性がある。本実施形態では、第２保持空間２２、３２に保持された検体液の液位と、第１保持空間１２、３１に保持された検体液の液位との間に液位差が生じる場合でも、液位調整流路１５に導入された検体液が液位が低い側の保持空間に流動することにより液位差が解消（調整）される。これにより、泳動流路３３に生じる静水圧流の発生を防ぎ、ゼータ電位測定の精度を向上させることが可能となる。
　続いて、電極１３及び電極１４の間に電圧を印加し、エクソソームを電気泳動する。電気泳動中に、泳動流路３３にレーザー光を照射し、泳動流路３３からの出射光であるエクソソームを介した散乱光を、対物レンズ等を用いて集光し、受光センサを用いて、エクソソーム又は特異的結合物質－エクソソーム複合体を撮影する。対物レンズの倍率は、一例として６０倍程度である。
　続いて、移動度算出部は、撮影した画像をもとに、エクソソーム又は特異的結合物質－エクソソーム複合体の電気泳動速度Ｓを算出する。そして、移動度算出部は、電気泳動速度Ｓを電界強度で除して、電気泳動移動度Ｕを算出する。続いて、移動度算出部は、上述したスモルコフスキーの式を用いて、エクソソーム又は特異的結合物質－エクソソーム複合体のゼータ電位を算出する。
　上記の電気泳動分析チップ３００を用いて検体を計測・分析を行う際には、電極１３及び電極１４の間に電圧を印加することでジュール熱が生じる。検体液においては、ジュール熱による電気伝導度の変動（上昇）や渦流の発生により、液位調整流路１５に導入されている検体液を介して泳動流路３３における電気泳動移動度の計測に影響を与える可能性がある。そこで、電気泳動分析チップ３００に液位調整流路１５を設けることによる電気泳動移動度の計測（ゼータ電位の算出）に与える影響を確認した。
　平均粒子径約１００ｎｍのポリスチレン製粒子（Thermo Fisher Scientific Inc. 3100A）を検体として用い、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid；pKa=7.55 (20℃)、0.02μmフィルター済み)を緩衝液として用いた。
　図４Ａは、ＨＥＰＥＳに通電した際の電圧と電流との関係を示す図である。図４Ａに示される関係から、ＨＥＰＥＳの電気抵抗値は約２４．４ＭΩである。一方、図４Ｂは、緩衝液として用いられるリン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）に通電した際の電圧と電流との関係を示す図である。図４Ａに示される関係から、ＰＢＳの電気抵抗値は約０．３２ＭΩである。ＨＥＰＥＳの電気抵抗値がＰＢＳの電気抵抗値よりも大きいことから、ＨＥＰＥＳの導電率はＰＢＳの導電率よりも小さいと考えられる。ＨＥＰＥＳの導電率を実測したところ、上記１０ｍＭのＨＥＰＥＳでは、およそ２５０μＳ／ｃｍであった。
　上記の液位調整流路１５および泳動流路３３の双方を有する並行流路形式の電気泳動分析チップと、泳動流路３３のみを有する単流路形式の電気泳動分析チップとを用いて電気泳動移動度の計測を行った。まず、並行流路形式の電気泳動分析チップおよび単流路形式の電気泳動分析チップに１ｍＬシリンジを用いて平均粒子径約１００ｎｍのポリスチレン製粒子を含む検体液をそれぞれ導入した。
　次いで、並行流路形式の電気泳動分析チップおよび単流路形式の電気泳動分析チップのぞれぞれに対して、シリンドリカルレンズを用いて平面状に加工したレーザー光を光照射部４２１から泳動流路３３に照射し、泳動流路３３からの散乱光を検出部４２２により観察した。検体としての粒子の観察は、電界強度１０Ｖ／ｃｍの電場中、および電界強度２０Ｖ／ｃｍの電場中のそれぞれで行い、各電界強度毎に見掛けの電気泳動移動度を求めた。
　図５Ａは、並行流路形式の電気泳動分析チップにおいて電界強度１０Ｖ／ｃｍの電場中で観察された結果から求められた電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。図５Ｂは、並行流路形式の電気泳動分析チップにおいて電界強度２０Ｖ／ｃｍの電場中で観察された結果から求められた電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。
　図６Ａは、単流路形式の電気泳動分析チップにおいて電界強度１０Ｖ／ｃｍの電場中で観察された結果から求められた電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。図６Ｂは、単流路形式の電気泳動分析チップにおいて電界強度２０Ｖ／ｃｍの電場中で観察された結果から求められた電気泳動移動度と粒子数（分布）との関係を示す図である。
　図５Ａ、図５Ｂ、図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、並行流路形式と単流路形式の電気泳動分析チップのいずれの計測結果についても、電気泳動移動度に関する平均値の変化は見られなかった。すなわち、本実施形態の電気泳動分析チップ３００のように、液位調整流路１５を設けたことに伴い泳動流路３３における電気泳動移動度の計測結果に影響が及ぶことは観察されなかった。
　また、液位調整流路１５を設けることによる電気泳動移動度の計測（ゼータ電位の算出）に与える影響に関して、電極１３及び電極１４の間に電圧を印加した際の電気浸透流の影響を排除した状態での確認を行った。この確認には、検体として上述の平均粒子径約１００ｎｍのポリスチレン製粒子と、無電荷ビーズ（大塚電子製）とを用いた。
　まず、並行流路形式の電気泳動分析チップおよび単流路形式の電気泳動分析チップに１ｍＬシリンジを用いて平均粒子径約１００ｎｍのポリスチレン製粒子を含む検体液をそれぞれ導入した。次いで、両形式の電気泳動分析チップに対して、上述した平面状に加工したレーザー光を光照射部４２１から泳動流路３３に照射し、泳動流路３３からの散乱光を検出部４２２により観察した。検体としての粒子の観察は、電界強度１０Ｖ／ｃｍの電場中で行い、両形式の電気泳動分析チップのそれぞれで見掛けの電気泳動移動度を求めた。
　次いで、各形式の電気泳動分析チップにおいて、流路から検体液をシリンジ操作によって取り除き、各流路に対して洗浄液（例えば、上記１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ）を検体液と同様にシリンジ操作により導入と除去とを複数回（例えば、３～４回）交互に繰り返し行った。
　その後、検体として無電荷ビーズを含む検体液を並行流路形式の電気泳動分析チップおよび単流路形式の電気泳動分析チップに１ｍＬシリンジを用いてそれぞれ導入した。そして、検体がポリスチレン製粒子の場合と同様に、平面状に加工したレーザー光を光照射部４２１から泳動流路３３に照射し、泳動流路３３からの散乱光を検出部４２２により観察し両形式の電気泳動分析チップのそれぞれで見掛けの電気泳動移動度を求めた。
　ここで、無電荷ビーズを含む検体液を用いて求めた電気泳動移動度の平均値は、電気浸透流の流速と考えられるため、ポリスチレン製粒子を含む検体液を用いて求めた電気泳動移動度から無電荷ビーズを含む検体液を用いて求めた電気泳動移動度を差し引くことで、電気浸透流の影響を排除したポリスチレン製粒子の電気泳動移動度を求めることができる。
　図７Ａは、並行流路形式の電気泳動分析チップにおいて、検体として無電荷ビーズを用いた場合に観察された結果から求められた電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。図７Ｂは、並行流路形式の電気泳動分析チップにおいて、検体として１００ｎｍのポリスチレン製粒子を用いた場合に求められた電気泳動移動度から、無電荷ビーズを用いて求められた電気泳動移動度を差し引いた電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。
　図８Ａは、単流路形式の電気泳動分析チップにおいて、検体として無電荷ビーズを用いた場合に観察された結果から求められた電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。図８Ｂは、単流路形式の電気泳動分析チップにおいて、検体として１００ｎｍのポリスチレン製粒子を用いた場合に求められた電気泳動移動度から、無電荷ビーズを用いて求められた電気泳動移動度を差し引いた電気泳動移動度と粒子数との関係を示す図である。
　図７Ａ、図７Ｂ、図８Ａおよび図８Ｂに示されるように、並行流路形式の電気泳動分析チップにおいて、無電荷ビーズを用いて求められた電気泳動移動度は、３．１±０．５［μｍ・ｃｍ／Ｖ・ｓ］であった。並行流路形式の電気泳動分析チップにおいて、ポリスチレン製粒子を用いて求められた電気泳動移動度は、－１．７±０．３［μｍ・ｃｍ／Ｖ・ｓ］であった。単流路形式の電気泳動分析チップにおいて、無電荷ビーズを用いて求められた電気泳動移動度は、４．２±０．５［μｍ・ｃｍ／Ｖ・ｓ］であった。単流路形式の電気泳動分析チップにおいて、ポリスチレン製粒子を用いて求められた電気泳動移動度は、－１．８±０．３［μｍ・ｃｍ／Ｖ・ｓ］であった。
　これらの結果から、液位調整流路１５を設けることによる電気泳動移動度の計測（ゼータ電位の算出）に与える影響はほぼ無いと考えられる。
　本実施形態における電気泳動分析チップ３００を用いることにより、特異的結合物質－エクソソーム複合体のゼータ電位の平均値だけでなく、特異的結合物質－エクソソーム複合体のゼータ電位を１粒子レベルで計測することができる。そのため、ゼータ電位の平均値からは、特異的結合物質が認識する分子（例えば、抗原等）を有するエクソソームが試料中に存在しないように思われる場合であっても、マイナーポピュレーションとして存在する、該抗原を有するエクソソームを検出することができる。
　以上、説明したように、本実施形態における電気泳動分析チップ３００および電気泳動分析装置４００では、泳動流路３３の断面積よりも断面積が大きい液位調整流路１５が設けられているため、液位調整流路１５に検体液を導入することにより第１リザーバー１１に保持された検体液と第２リザーバー２１に保持された検体液との液位差を短時間で解消するように調整することが可能となる。そのため、本実施形態における電気泳動分析チップ３００および電気泳動分析装置４００では、第１、第２リザーバー１１、２１に保持された検体液の液位差に起因して生じる電気泳動移動度の測定誤差を最小限に抑えることが可能になり、検体の分析を短時間で高精度に行うことが可能になる。
　また、本実施形態における電気泳動分析チップ３００および電気泳動分析装置４００では、電極１３及び電極１４の間に電圧を印加することで生じるジュール熱の影響が液位調整流路１５に導入されている検体液を介して泳動流路３３における電気泳動移動度の計測結果に及ぶ可能性があるが、検体液に含まれる緩衝液として導電率が１７８００μＳ／ｃｍ以下で高抵抗のＨＥＰＥＳを用いているため、電極１３及び電極１４への通電に伴って生じる泳動流路３３における電気泳動移動度の計測への悪影響を抑えることが可能になる。
　また、本実施形態における電気泳動分析チップ３００および電気泳動分析装置４００では、泳動流路３３が第１リザーバー１１と第２リザーバー２１の中心同士を結ぶ線分よりも光照射部４２１に近い側に配置されているため、泳動流路３３に向けて照射されたレーザー光の光路長を短くできる。そのため、本実施形態における電気泳動分析チップ３００および電気泳動分析装置４００では、レーザー光の出力を低くできるとともに、検体以外から生じる散乱光を抑制することができ、分析精度の向上を図ることができる。
　また、本実施形態における電気泳動分析チップ３００および電気泳動分析装置４００では、泳動流路３３と液位調整流路１５とが高さ方向（Ｚ方向）にずれて配置されているため、泳動流路３３を透過したレーザー光の照射により液位調整流路１５の検体液で散乱光が生じノイズとして検出部４２２に検出されることを回避でき、さらに分析精度の向上を図ることができる。
　以上、添付図面を参照しながら本発明に係る好適な実施形態について説明したが、本発明は係る例に限定されないことは言うまでもない。上述した例において示した各構成部材の諸形状や組み合わせ等は一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲において設計要求等に基づき種々変更可能である。
　上記実施形態では、導電率が１７８００μＳ／ｃｍ以下の緩衝液としてＨＥＰＥＳを用いる構成を例示したが、この構成に限定されない。緩衝液としては、導電率が１７８００μＳ／ｃｍ以下であれば他の液体を用いる構成であってもよい。
　また、上記実施形態では、電極１３及び電極１４の間に電圧を印加することで生じるジュール熱の影響を、電気抵抗が高い緩衝液を用いることで抑える構成としたが、この構成に限定されない。例えば、図９に示されるように、液位調整流路１５において緩衝液ＢＳに挟まれた位置に緩衝液ＢＳの電気抵抗よりも高い電気抵抗を有する第２液体ＯＬを配置する構成であってもよい。なお、図９においては、便宜上、液位調整流路１５と泳動流路３３とを同一断面にて図示している。第２液体ＯＬとしては、シリコン系オイルまたはフッ素系オイル等の油剤を用いることができる。
　第２液体ＯＬは、第１リザーバー１１に保持された検体液と第２リザーバー２１に保持された検体液との間の液位差に応じて液位調整流路１５の検体液で生じる圧力によってＹ方向に移動可能な粘度であることが好ましい。第２液体ＯＬの粘度は、液位調整流路１５における流動コンダクタンスと、泳動流路３３における流動コンダクタンスとの比に応じて設定すればよい。具体的には、泳動流路３３の断面積に対する液位調整流路１５の断面積の比をＲとすると、第２液体ＯＬの粘度は、緩衝液の粘度に対する比がＲ未満である液体を用いればよい。この範囲の粘度を有する第２液体ＯＬを用いることにより、液位調整流路１５は、泳動流路３３よりも大きなコンダクタンスで緩衝液が流動することが可能になる。また、液位調整流路１５における緩衝液において高い電気抵抗を有する第２液体ＯＬを介在させることにより、高い電気抵抗を有する緩衝液を用いる必要がなくなる。そのため、例えば、上述したＰＢＳ等の低い電気抵抗を有する緩衝液を用いることが可能となり汎用性が広がる。
　なお、液位調整流路１５において緩衝液ＢＳに挟まれた位置に第２液体ＯＬを配置する場合には、１保持空間１２の開口部、第２保持空間２２の開口部および液位調整流路１５を覆うカバーは液位調整流路１５を密閉することが好ましい。
　また、上記実施形態では、軸状の電極１３、１４を第１リザーバー１１および第２リザーバー２１にそれぞれＺ方向に沿って配置する構成を例示したが、この構成に限定されない。例えば、基板５０における第１保持空間３１の底部および第２保持空間３２の底部にそれ設ける構成であってもよい。電極を液位調整流路１５から離れた位置に配置することにより、電極への通電により液位調整流路１５の検体液におよぶ影響を抑制することが可能になる。
　また、上記実施形態では、液位調整流路１５の断面形状がＶ字状である構成を例示したが、この構成に限定されない。液位調整流路１５の断面形状としては、例えば、矩形状等の多角形であってもよい。液位調整流路１５の断面形状としては、検体液の流動コンダクタンスを大きくするために液位調整流路１５との接触面積が小さい形状が好ましく、一例として円弧を含む断面半円形状がより好ましい。
　また、上記実施形態では、泳動部材がリザーバー部材１０および流路部材３０が積層された構成を例示したが、この構成に限定されない。泳動部材としては、例えば、第１リザーバー１１、第１保持空間１２、第２リザーバー２１、第２保持空間２２、泳動流路３３及び液位調整流路１５が単一の基材に設けられて基板５０に支持される構成であってもよい。
　本発明は、電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置に適用できる。
　１０…リザーバー部材、　１１…第１リザーバー、　１２…第１保持空間、　１３、１４…電極、　１５…液位調整流路、　２１…第２リザーバー、　２２…第２保持空間、　３０…流路部材、　３３…泳動流路、　５０…基板、　３００…細胞外小胞体分析チップ（電気泳動分析チップ）、　４００…電気泳動分析装置、　４２０…計測部、　ＯＬ…第２液体

Claims (13)

  1. 　基材に設けられた第１リザーバー及び第２リザーバーと、
    　前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとを接続し、検体が泳動可能な泳動流路と、
    　前記泳動流路の断面積よりも大きな断面積を有し、前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとを接続して前記第１リザーバーに保持された液体と前記第２リザーバーに保持された液体との液位差を調整可能な液位調整流路と、
    　を備える電気泳動分析チップ。
  2. 　前記液体の導電率が１７８００μＳ／ｃｍ以下である
    　請求項１記載の電気泳動分析チップ。
  3. 　前記液位調整流路において前記液体に挟まれた位置に、前記液体の電気抵抗よりも大きい電気抵抗を有するとともに、前記液体の粘度に対する比が、前記泳動流路の断面積に対する前記液位調整流路の断面積の比未満の粘度を有する第２液体が配置されている
    　請求項１または２記載の電気泳動分析チップ。
  4. 　前記第２液体は、油剤である
    　請求項３記載の電気泳動分析チップ。
  5. 　平面視において前記泳動流路は、前記第１リザーバーの中心と前記第２リザーバーの中心とを結ぶ線分に対して離間した位置で前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとを接続している
    　請求項１～４のいずれか一項に記載の電気泳動分析チップ。
  6. 　前記泳動流路と前記液位調整流路とは、高さ方向に関して重ならない位置にずれて配置されている
    　請求項１～５のいずれか一項に記載の電気泳動分析チップ。
  7. 　 前記液位調整流路の断面形状は円弧を含む
    　請求項１～６のいずれか一項に記載の電気泳動分析チップ。
  8. 　前記検体は、細胞外小胞体、あるいは、前記細胞外小胞体の表面に存在する分子に特異的に結合する特異的結合物質と前記細胞外小胞体とが相互作用してなる、特異的結合物質－細胞外小胞体複合体を含む
    　請求項１～７のいずれか一項に記載の電気泳動分析チップ。
  9. 　検体を分析する電気泳動分析チップであり、
    　第１リザーバーと、第２リザーバーと、前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとを接続し検体が泳動する泳動流路と、を有する泳動部材と、
    　前記泳動部材を支持する基板と、で構成される積層構造であり、
    　前記泳動部材は、前記泳動流路の断面積よりも大きな断面積を有し、前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとを接続して前記第１リザーバーに保持された液体と前記第２リザーバーに保持された液体との液位差を調整可能な液位調整流路を備える電気泳動分析チップ。
  10. 　前記泳動部材は、前記第１リザーバー、前記第２リザーバー及び前記液位調整流路を有するリザーバー部材と、
    　前記泳動流路を有し前記基板に支持される流路部材と、で構成される積層構造である請求項９記載の電気泳動分析チップ。
  11. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載の電気泳動分析チップと、
    　前記検体のゼータ電位を計測する計測部と、
    　を備える電気泳動分析装置。
  12. 　前記計測部は、前記泳動流路に光を照射する光照射部を有し、
    　前記泳動流路と前記液位調整流路とは、前記光の照射方向で重ならない位置に配置されている
    　請求項１１記載の電気泳動分析装置。
  13. 　前記計測部は、前記泳動流路に光を照射する光照射部を有し、
    　前記泳動流路は、前記第１リザーバーの中心と前記第２リザーバーの中心とを結ぶ線分よりも前記光照射部に近い位置で前記第１リザーバーと前記第２リザーバーとを接続している
    　請求項１１または１２記載の電気泳動分析装置。
PCT/JP2018/004621 2017-02-28 2018-02-09 電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置 Ceased WO2018159264A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18761639.6A EP3591391A4 (en) 2017-02-28 2018-02-09 ELECTROPHORETIC ANALYSIS CHIP AND ELECTROPHORETIC ANALYSIS DEVICE
US16/485,365 US20190369046A1 (en) 2017-02-28 2018-02-09 Electrophoretic analysis chip and electrophoretic analysis apparatus

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017037652A JP6814474B2 (ja) 2017-02-28 2017-02-28 電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置
JP2017-037652 2017-02-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018159264A1 true WO2018159264A1 (ja) 2018-09-07

Family

ID=63370911

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/004621 Ceased WO2018159264A1 (ja) 2017-02-28 2018-02-09 電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20190369046A1 (ja)
EP (1) EP3591391A4 (ja)
JP (1) JP6814474B2 (ja)
WO (1) WO2018159264A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12345618B2 (en) * 2020-03-24 2025-07-01 Kyocera Corporation Flow path device for separating target particles in a fluid
JP7440331B2 (ja) 2020-04-16 2024-02-28 大塚電子株式会社 ゼータ電位測定用治具

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5482608A (en) 1993-01-19 1996-01-09 Hewlett Packard Company Capillary electrophoresis flow control system
JP2000314719A (ja) * 1999-04-30 2000-11-14 Shimadzu Corp 電気泳動チップ
JP2012230004A (ja) * 2011-04-26 2012-11-22 Otsuka Denshi Co Ltd 電気泳動移動度測定用セル並びにそれを用いた測定装置及び測定方法
JP2013195240A (ja) * 2012-03-19 2013-09-30 Shimadzu Corp キャピラリー組立品
WO2014030590A1 (ja) * 2012-08-24 2014-02-27 国立大学法人東京大学 エキソソームの分析方法、エキソソーム分析装置、抗体－エキソソーム複合体、及びエキソソーム電気泳動チップ
WO2015163194A1 (ja) * 2014-04-25 2015-10-29 国立大学法人東京大学 細胞外小胞体分析チップ、細胞外小胞体分析方法、細胞外小胞体分析装置
JP2016024021A (ja) * 2014-07-18 2016-02-08 国立大学法人 東京大学 電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置
WO2016171198A1 (ja) * 2015-04-21 2016-10-27 国立大学法人東京大学 微粒子検出システム及び微粒子検出プログラム
JP2017037652A (ja) 2015-08-13 2017-02-16 トムソン ライセンシングＴｈｏｍｓｏｎ Ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ Ｈｄｒ−ｈｄｒ逆トーンマッピングのための方法、システム、および装置

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100394171C (zh) * 2000-08-02 2008-06-11 卡钳技术有限公司 基于分离的高处理量分析系统
US20060062696A1 (en) * 2001-07-27 2006-03-23 Caliper Life Sciences, Inc. Optimized high throughput analytical systems
JP4601423B2 (ja) * 2004-12-28 2010-12-22 独立行政法人科学技術振興機構 細胞計測および分離チップ
WO2015179712A1 (en) * 2014-05-22 2015-11-26 University Of Notre Dame Du Lac Integrated membrane sensor for rapid molecular detection

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5482608A (en) 1993-01-19 1996-01-09 Hewlett Packard Company Capillary electrophoresis flow control system
JP2000314719A (ja) * 1999-04-30 2000-11-14 Shimadzu Corp 電気泳動チップ
JP2012230004A (ja) * 2011-04-26 2012-11-22 Otsuka Denshi Co Ltd 電気泳動移動度測定用セル並びにそれを用いた測定装置及び測定方法
JP2013195240A (ja) * 2012-03-19 2013-09-30 Shimadzu Corp キャピラリー組立品
WO2014030590A1 (ja) * 2012-08-24 2014-02-27 国立大学法人東京大学 エキソソームの分析方法、エキソソーム分析装置、抗体－エキソソーム複合体、及びエキソソーム電気泳動チップ
WO2015163194A1 (ja) * 2014-04-25 2015-10-29 国立大学法人東京大学 細胞外小胞体分析チップ、細胞外小胞体分析方法、細胞外小胞体分析装置
JP2016024021A (ja) * 2014-07-18 2016-02-08 国立大学法人 東京大学 電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置
WO2016171198A1 (ja) * 2015-04-21 2016-10-27 国立大学法人東京大学 微粒子検出システム及び微粒子検出プログラム
JP2017037652A (ja) 2015-08-13 2017-02-16 トムソン ライセンシングＴｈｏｍｓｏｎ Ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ Ｈｄｒ−ｈｄｒ逆トーンマッピングのための方法、システム、および装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3591391A4

Also Published As

Publication number Publication date
EP3591391A1 (en) 2020-01-08
JP6814474B2 (ja) 2021-01-20
JP2018141760A (ja) 2018-09-13
US20190369046A1 (en) 2019-12-05
EP3591391A4 (en) 2020-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6337295B2 (ja) 電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置
Song et al. Electrophoretic concentration of proteins at laser-patterned nanoporous membranes in microchips
Kohlheyer et al. Microfluidic high-resolution free-flow isoelectric focusing
JP6230027B2 (ja) エキソソームの分析方法、エキソソーム分析装置、抗体−エキソソーム複合体、及びエキソソーム電気泳動チップ
Herr et al. On-chip coupling of isoelectric focusing and free solution electrophoresis for multidimensional separations
Li et al. Cascaded microfluidic circuits for pulsatile filtration of extracellular vesicles from whole blood for early cancer diagnosis
Kim et al. Self-sealed vertical polymeric nanoporous-junctions for high-throughput nanofluidic applications
JP6781989B2 (ja) 微粒子検出システム及び微粒子検出プログラム
US20080067079A1 (en) Method of Analyzing Sample and Analyzing Apparatus
Gholinejad et al. Design and application of ion concentration polarization for preconcentrating charged analytes
Zhao et al. Droplet-based in situ compartmentalization of chemically separated components after isoelectric focusing in a Slipchip
CN110506201A (zh) 粒子检测装置和粒子检测方法
JP6814474B2 (ja) 電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置
WO2016031980A1 (ja) 電気泳動デバイス、電気泳動デバイス製造方法および細胞外小胞体分離装置
Sabaté del Río et al. Microfluidic Dielectrophoretic Purification of Extracellular Vesicles from Plasma Lipoproteins
US10113948B2 (en) Particle detection method, particle detection device and particle detection system
Sun et al. Concentration-gradient stabilization with segregated counter-and co-ion paths: A quasistationary depletion front for robust molecular isolation or concentration
WO2015163194A1 (ja) 細胞外小胞体分析チップ、細胞外小胞体分析方法、細胞外小胞体分析装置
Jen et al. Sample preconcentration utilizing nanofractures generated by junction gap breakdown assisted by self-assembled monolayer of gold nanoparticles
Arter et al. Microchip free-flow electrophoresis for bioanalysis, sensing, and purification
CN110741250B (zh) 改变电场的电泳方法
KR101776134B1 (ko) 미세유체칩 기반의 병원균 검출에서 계면동전기 흐름전위에 의한 비표지 센싱 방법 및 장치
Yamamoto et al. Nylon Monofilament Mold Three-dimensional Microfluidic Chips for Size-exclusion Microchip Electrophoresis: Application to Specific Online Preconcentration of Proteins
US20220016627A1 (en) Detection of components
KR101568362B1 (ko) 바이오 측정 시스템

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18761639

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018761639

Country of ref document: EP

Effective date: 20190930