[go: up one dir, main page]

WO2016031980A1 - 電気泳動デバイス、電気泳動デバイス製造方法および細胞外小胞体分離装置 - Google Patents

電気泳動デバイス、電気泳動デバイス製造方法および細胞外小胞体分離装置 Download PDF

Info

Publication number
WO2016031980A1
WO2016031980A1 PCT/JP2015/074497 JP2015074497W WO2016031980A1 WO 2016031980 A1 WO2016031980 A1 WO 2016031980A1 JP 2015074497 W JP2015074497 W JP 2015074497W WO 2016031980 A1 WO2016031980 A1 WO 2016031980A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
flow path
sample
substrate
base material
gel material
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2015/074497
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
一木　隆範
貴則 赤木
涼介 久保田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokyo NUC
Original Assignee
University of Tokyo NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Tokyo NUC filed Critical University of Tokyo NUC
Priority to JP2016545649A priority Critical patent/JP6730682B2/ja
Priority to US15/503,215 priority patent/US10429345B2/en
Publication of WO2016031980A1 publication Critical patent/WO2016031980A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/50273—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the means or forces applied to move the fluids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/02—Devices for withdrawing samples
    • G01N1/10—Devices for withdrawing samples in the liquid or fluent state
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1429—Signal processing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1429—Signal processing
    • G01N15/1433—Signal processing using image recognition
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44713—Particularly adapted electric power supply
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44743—Introducing samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44791—Microapparatus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N2001/4038—Concentrating samples electric methods, e.g. electromigration, electrophoresis, ionisation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N2015/0003—Determining electric mobility, velocity profile, average speed or velocity of a plurality of particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44769—Continuous electrophoresis, i.e. the sample being continuously introduced, e.g. free flow electrophoresis [FFE]

Definitions

  • the present invention relates to an electrophoresis device, an electrophoresis device manufacturing method, and an extracellular endoplasmic reticulum separation apparatus.
  • Molecular bodies such as nucleic acids, proteins, and lipids derived from living bodies, intracellular organelles, extracellular endoplasmic reticulum, and cells are used to elucidate the mechanisms of physiological and pathological phenomena, and to be effective in drug treatment. It is an analysis target when performing quantitative evaluation.
  • a sample extracted from a living body usually contains a plurality of different components such as molecules, molecular aggregates, particles, and cells, it is necessary to separate and purify only the components to be analyzed.
  • Physical properties such as size, specific gravity, water / oil partition coefficient, isoelectric point, surface potential, or molecular affinity (affinity) can be used as an index for separating and purifying components in a sample. is there.
  • free flow electrophoresis As a method for separation / purification by surface potential, free flow electrophoresis is known (see Non-Patent Document 1).
  • free flow electrophoresis a sample is flowed in a laminar flow from upstream to downstream along with a buffer in the separation tank, and a voltage is applied to the electrodes provided on both sides of the separation tank, thereby buffering the buffer in the separation tank.
  • free zone electrophoresis is performed by applying an electric field in a direction perpendicular to the flow of the liquid, and the components in the sample are separated according to the difference in electrophoretic mobility.
  • components mixed in the sample can be separated and purified by the difference in surface potential (electrophoretic degree) of each component.
  • molecular tags with specific affinity such as antibodies, are bound to the components in the sample, and the separation of specific components is arbitrarily performed using changes in the surface potential resulting from the binding between the antibody and the components. It is also possible to do this.
  • a conventional free-flow electrophoresis apparatus is large and requires a large amount of sample to separate components mixed in the sample, for example, extracellular vesicles such as exosomes (exosomes) (see Non-Patent Document 2). ). Further, the conventional free flow electrophoresis apparatus is expensive. In order to solve these problems, in recent years, research and development of a small free-flow electrophoresis device (micro-free flow electrophoresis chip) using microfluidic device technology has been conducted, and a small-sized free-flow electrophoresis device prototyped. Has been shown to be effective for the separation of a small amount of sample (see Non-Patent Document 3).
  • the agarose gel and acrylamide gel used in the above-mentioned documents are not chemically bonded to silicon or glass, which is a substrate on which micro free flow electrophoresis is performed, and peeling occurs at the interface between the hydrogel and the substrate. There is a problem that it is easy to occur and it is difficult to perform stable operation for a long time.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object thereof is to provide an electrophoretic device, an electrophoretic device manufacturing method and an extracellular endoplasmic reticulum separation apparatus capable of stable operation for a long time.
  • a first channel that extends in the first direction and in which the sample and the buffer flow, and a sample recovery unit that is provided at an end of the first channel and collects the sample
  • An electrode that is disposed on each side of the first flow path in a second direction orthogonal to the first direction and applies a voltage to the first flow path along the second direction; and The electrode is accommodated on both sides of the second direction, and the second flow path through which the second buffer solution flows, and the connection portion between the first flow path and the second flow path have a predetermined bonding strength.
  • a partition wall that is fixed in the first flow path and blocks the movement of an object between the first flow path and the second flow path, and the partition wall is an electrophoretic device formed of a gel material having ion permeability.
  • the electrophoresis device of the first aspect of the present invention a sample supply system for supplying a sample containing an extracellular vesicle to the first channel, and the first channel
  • a buffer supply system for supplying the buffer solution to the sample
  • a sample recovery system for recovering the sample via the sample recovery section
  • a second buffer for supplying the second buffer solution to one end of the second flow path.
  • An extracellular endoplasmic reticulum separation device is provided.
  • the first buffer that extends in the first direction and through which the sample and the buffer flow, and the both sides of the first channel in the second direction are respectively connected to the second buffer.
  • a step of preparing a base material including a second flow path through which the fluid flows, and a communication portion between the first flow path and the second flow path, between the first flow path and the second flow path.
  • an electrophoretic device manufacturing method including a step of fixing a gel material having ion permeability with a predetermined bonding strength as a partition wall that blocks movement of an object.
  • an electrophoretic device it is possible to provide an electrophoretic device, an electrophoretic device manufacturing method, and an extracellular endoplasmic reticulum separation apparatus capable of stable operation for a long time.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of an extracellular endoplasmic reticulum separation device according to an embodiment.
  • 1 is an external perspective view of an electrophoresis device DV according to an embodiment.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG. 2. It is the bottom view which looked at the 2nd substrate 2 from the lower surface 2a side.
  • FIG. 5 is a partially enlarged view of an end portion on the ⁇ X side of the separation tank 8 in FIG. It is the elements on larger scale of the + X side edge part of the separation tank 8 in FIG. It is the bottom view which looked at the 1st substrate 1 from the lower surface 1a side. It is the figure which showed typically the circumference
  • FIG. It is the figure which showed typically the circumference
  • FIG. It is the figure which showed typically the circumference
  • FIG. It is a figure for demonstrating the manufacturing method of the electrophoresis device DV.
  • Embodiments of an electrophoresis device, an electrophoresis device manufacturing method, and an extracellular vesicle separation apparatus according to the present invention will be described below with reference to FIGS.
  • the following embodiment shows one aspect of the present invention and does not limit the present invention, and can be arbitrarily changed within the scope of the technical idea of the present invention.
  • the actual structure is different from the scale and number of each structure.
  • the present invention provides an electrophoresis device for use in separating a sample (analyte).
  • the sample include cells, extracellular vesicles, fine particles, latex particles (including latex particles modified with antibodies and further modified with cells), polymer micelles, and the like.
  • an extracellular vesicle separation device for separating extracellular vesicles is used as an electrophoresis device.
  • an extracellular vesicle means a lipid vesicle including exosome (exosome), apoptotic body, microvesicle and the like.
  • the extracellular endoplasmic reticulum separation apparatus and the electrophoresis device according to the present embodiment will be described using the case of separating exosomes as an example.
  • Exosomes are lipid vesicles having a diameter of about 30 to 100 nm.
  • various cells such as tumor cells, dendritic cells, T cells, B cells, blood, urine, It is secreted into body fluids such as saliva.
  • Abnormal cells such as cancer cells existing in the body express a protein specific to the cell membrane.
  • An exosome is a secreted product of a cell and expresses a cell-derived protein as a secretory source on its surface.
  • the surface of the exosome is a membrane surface of a lipid vesicle secreted from a cell, and refers to a portion where the secreted exosome is in contact with the environment in the living body.
  • exosomes are detected in blood circulating in the living body, abnormalities in the living body can be detected by analyzing the exosomes without performing a biopsy test.
  • [Analysis of exosomes] Analysis of exosomes using an electrophoresis device can be performed as follows as an example. First, exosomes to be detected are separated and purified. Next, the exosome is brought into contact with the specific binding substance.
  • the specific binding substance means a substance that can specifically bind to a molecule present on the surface of the exosome. Next, the zeta potential of the exosome is measured and analyzed using an electrophoresis device. This analysis can be applied not only to exosomes but also to analyzes of the extracellular endoplasmic reticulum in general.
  • Specific binding substances include, for example, antibodies, modified antibodies, aptamers, ligand molecules, and the like.
  • antibodies include IgG, IgA, IgD, IgE, IgM and the like.
  • IgG include IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4.
  • IgA include IgA1 and IgA2.
  • IgM include IgM1 and IgM2.
  • the modified antibody include Fab, F (ab ′) 2 , scFv and the like.
  • Examples of aptamers include peptide aptamers and nucleic acid aptamers.
  • Examples of the ligand molecule include a ligand of the receptor protein when the molecule to be detected present on the surface of the exosome is a receptor protein.
  • examples of the ligand molecule include G protein.
  • the specific binding substance may be labeled with a labeling substance.
  • labeling substances include biotin, avidin, streptavidin, neutravidin, glutathione-S-transferase, glutathione, fluorescent dyes, polyethylene glycol, charged molecules such as melittic acid, and the like.
  • the exosome is purified from a sample containing exosome.
  • the sample include blood, urine, breast milk, bronchoalveolar lavage fluid, amniotic fluid, malignant exudate, saliva, cell culture fluid and the like depending on the purpose. Especially, it is easy to purify exosomes from blood and urine.
  • the electrophoresis device DV As a method for purifying exosomes, as described later, the electrophoresis device DV according to this embodiment is used.
  • a specific binding substance antibody, aptamer, etc.
  • a specific binding substance an abnormality associated with a disease such as cancer, obesity, diabetes, or neurodegenerative disease can be detected. Details will be described later.
  • the zeta potential of the exosome reacted with the antibody is measured.
  • the zeta potential is the surface charge of the fine particles in the solution.
  • exosomes are negatively charged while antibodies are positively charged.
  • the zeta potential of the antibody-exosome complex is shifted positively compared to the zeta potential of the exosome alone. Therefore, by measuring the zeta potential of the exosome reacted with the antibody, the expression of the antigen on the exosome membrane surface can be detected. This is true not only for antibodies but also for positively charged specific binding substances.
  • the zeta potential ⁇ of the exosome is obtained by performing exosome electrophoresis in the microchannel of the electrophoresis device, optically measuring the exosome electrophoresis speed S, and measuring the measured exosome electrophoresis speed S. Based on this, it is possible to calculate using the Smolkovsky formula shown in the following formula (1).
  • U ( ⁇ / ⁇ ) ⁇ (1)
  • U is the electrophoretic mobility of the exosome to be measured
  • ⁇ and ⁇ are the dielectric constant and viscosity coefficient of the sample solution, respectively.
  • the electrophoretic mobility U can be calculated by dividing the electrophoretic velocity S by the electric field strength in the microchannel.
  • the exosome electrophoresis speed S is obtained by causing exosomes to migrate in a microchannel of an extracellular endoplasmic reticulum analysis chip, and as an example, irradiating laser light to exosomes flowing in the microchannel, Measurement can be performed by obtaining a particle image by scattered light.
  • the laser beam one having a wavelength of 488 nm and an intensity of 50 mW can be given.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of an extracellular endoplasmic reticulum separation apparatus 100.
  • the extracellular endoplasmic reticulum separation apparatus 100 includes an electrophoresis device DV, a voltage adjustment unit (adjustment unit) 40, a microscope 50, a sample supply system 61, a buffer solution supply system 62, a sample recovery system 70, a second buffer solution supply system 80, A second flow path recovery system 90 and a control part CONT are provided.
  • FIG. 2 is an external perspective view of the electrophoresis device DV.
  • 3 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG. In FIG. 2, the components of the electrophoresis device DV are shown by solid lines for easy understanding.
  • the electrophoretic device DV is sequentially stacked in the thickness direction, and each of the first substrate (second base material) 1, the second substrate (base material) 2, and the third substrate is rectangular in plan view. (Third substrate) 3 is provided. Positioning through holes H are provided at the corners of the first substrate 1, the second substrate 2, and the third substrate 3, and a shaft member (not shown) is fitted into the through holes H, whereby the first substrate 1, the second substrate 2 and the third substrate 3 are positioned relative to each other.
  • the electrophoresis device DV includes a buffer solution introduction port 4, a sample introduction port 5, a buffer solution introduction channel 6, a sample introduction channel 7, a separation tank (first channel) 8, an electrode tank 9, a sample recovery unit 10, and a sample.
  • a recovery channel 11, a second buffer solution inlet 12, a second buffer recovery port 13, and an electrode 15 are provided.
  • the stacking direction of the first substrate 1, the second substrate 2, and the third substrate 3 is the Z direction, for example, the extending direction of the separation tank 8 is the X direction, and is orthogonal to the Z direction and the X direction.
  • the width direction of the separation tank 8 will be described as the Y direction.
  • the Z direction is appropriately set as the vertical direction, the side on which the first substrate 1 is disposed with respect to the second substrate 2 is described as the upper side, and the side on which the third substrate 3 is disposed with respect to the second substrate 2 is described as the lower side. To do. This defines the vertical direction for the convenience of explanation, and does not limit the installation posture when the electrophoretic device DV of the present invention is actually used.
  • the first substrate 1, the second substrate 2, and the third substrate 3 various industrial synthetic resins can be used.
  • the first substrate 1, the second substrate 2, and the third substrate 3 are made of polymethacrylstyrene, which is a synthetic resin material.
  • Polymethacrylstyrene is a resin extruded plate of polymethacrylstyrene (MS) obtained by copolymerizing methacrylate (MMA) and styrene.
  • MS polymethacrylstyrene
  • MMA methacrylate
  • the main features of polymethacrylstyrene are transparency and weather resistance equivalent to polymethacrylic plate, low water absorption compared to polymethacrylic plate, excellent dimensional stability and resistance to deformation, and about half the specific gravity of glass.
  • the first substrate 1, the second substrate 2, and the third substrate 3 are not limited to polymethacrylstyrene, and are preferably formed of polystyrene, polymethyl methacrylate resin, polycarbonate, polycycloolefin, or the like having excellent transparency. can do.
  • the first substrate 1 and the third substrate 3 have a length in the X direction of 100 mm, a length in the Y direction of 80 mm, and a length (thickness) in the Z direction of 2 mm.
  • the second substrate 2 has a length in the X direction of 100 mm, a length in the Y direction of 80 mm, and a length (thickness) in the Z direction of 5 mm.
  • the separation tank 8 is a flow path through which the buffer solution and the sample flow, and extends in the X direction as shown in FIG. As shown in FIG. 3, the separation tank 8 is formed by a recess provided at the center in the Y direction on the lower surface 2 a of the second substrate 2.
  • the width of the separation tank 8 in the Y direction is, for example, 10 mm.
  • the depth of the separation tank 8 is, for example, 0.1 mm.
  • FIG. 4 is a bottom view of the second substrate 2 as viewed from the bottom surface 2a side.
  • FIG. 5 is a partially enlarged view of the end portion on the ⁇ X side of the separation tank 8 in FIG. 6 is a partially enlarged view of the + X side end portion of the separation tank 8 in FIG.
  • the length of the separation tank 8 in the X direction is, for example, 50 mm.
  • a buffer solution introduction channel 6 and a sample introduction channel 7 are connected to the ⁇ X side end of the separation tank 8.
  • the sample introduction channel 7 extends in the X direction, and one end is connected to the central portion of the separation tank 8 in the Y direction.
  • the depth of the sample introduction channel 7 is the same as the depth of the separation tank 8.
  • the other end of the sample introduction channel 7 is connected to the sample introduction port 5.
  • FIG. 7 is a bottom view of the first substrate 1 viewed from the lower surface 1a side.
  • the sample introduction port 5 extends in the vertical direction and is formed so as to penetrate through the first substrate 1 and the second substrate 2.
  • the sample introduction port 5 includes a through hole 5a formed in the first substrate 1 and a through hole 5b formed in the second substrate 2 at the same position in the XY plane.
  • the sample introduction port 5 is a part for introducing the above-described sample into the sample introduction channel 7.
  • the buffer solution introduction channel 6 has one end connected to the separation tank 8 on both sides in the Y direction across the sample introduction channel 7.
  • the buffer solution introduction flow path 6 joins at the other end side and is connected to the buffer solution introduction port 4.
  • the buffer solution introduction port 4 extends in the vertical direction, and is formed so as to penetrate through the first substrate 1 and the second substrate 2.
  • the buffer solution introduction port 4 includes a through hole 4a formed in the first substrate 1 and a through hole 4b formed in the second substrate 2 at the same position in the XY plane.
  • the buffer solution introduction port 4 is a part for introducing a buffer solution (buffer) for flowing the separation tank 8 together with the above-described sample into the buffer solution introduction channel 6.
  • the sample collection channel 11 is provided with a plurality (five in FIG. 4) of which one end is connected to the + X side end of the separation tank 8.
  • the sample collection flow paths 11 are provided at intervals in the Y direction.
  • the position in the Y direction where the sample recovery channel 11 is connected to the separation tank 8 is set based on the mobility of the sample (exosome), as will be described later.
  • the other end of the sample collection channel 11 is connected to the sample collection unit 10.
  • sample collection unit 10 extends in the vertical direction and is formed so as to penetrate through the first substrate 1 and the second substrate 2.
  • the sample collection unit 10 includes a through hole 10a formed in the first substrate 1 and a through hole 10b formed in the second substrate 2 at the same position on the XY plane.
  • the sample collection unit 10 is a part for collecting a sample (exosome) separated according to the electrophoretic mobility.
  • the electrode tank 9 is arranged in communication with both sides of the separation tank 8 in the Y direction.
  • the electrode tank 9 penetrates the second substrate 2 in the vertical direction.
  • the electrode tank 9 has a length in the X direction of 50 mm, a length in the Y direction of 2 mm, and a length (depth) in the Z direction of 5 mm.
  • a partition wall 17 is provided at the bottom of the electrode tank 9, that is, at the communicating part with the separation tank 8. Above the partition wall 17 in the electrode tank 9 is a second flow path 30 through which the second buffer solution flows.
  • the partition wall 17 blocks the movement of the object between the separation tank 8 and the electrode tank 9.
  • the lower surface of the partition wall 17 is an inclined surface 17a that goes downward as it goes outward in the Y direction.
  • the inclined surface 17a includes a position where the inner side surface 9a facing the electrode tank 9 intersects the bottom surface 8a of the separation tank 8, the outer side surface 9b facing the electrode tank 9, and the lower surface 2a of the second substrate 2. Connect the crossing positions.
  • the partition wall 17 is formed of a gel material having ion permeability.
  • a gel material hydrogel having high mechanical strength and high uniformity is used.
  • hydrogel for example, Tetra-PEG gel, slide-ring (SR) gel, nanocomposite (NC) gel, double network (DN) gels and the like can be used.
  • SR slide-ring
  • NC nanocomposite
  • DN double network
  • the terminal functional groups include amino groups, isothiocyanate groups, isocyanate groups, acyl azide groups, N-hydroxysuccinimide ester groups, sulfonyl chloride groups, aldehyde groups, epoxide groups, oxirane groups, carbonate groups, aryl groups, imide ester groups, Carbodiimide group, anhydride group, thiol group, haloacetyl group, alkyl halide group, maleimide group, aziridine group, acryloyl group, disulfide group, diazoalkane group, diazoacetyl group, carbonyldiimidazole group, N, N'-disuccini Examples thereof include a midyl carbonate group, an N-hydroxysuccinimidyl chloroformate group, a hydrazine group, and a hydrazide group. Among them, those having 4 or more functional groups are preferable, and polymer species having 4 or more branche
  • FIGS. 8 to 10 are diagrams schematically showing the periphery of the separation tank 8 and the electrode tank 9.
  • the second flow path 30 accommodates the electrode 15 and the second buffer solution 16 flows.
  • the electrode 15 is formed of, for example, a platinum wire.
  • the second substrate 2 is provided with an electrode insertion port 14 extending in the X direction at a position on the ⁇ X side of the electrode tank 9. The distal end side of the electrode 15 inserted from the electrode insertion port 14 is accommodated in the second flow path 30.
  • the second buffer solution inlet 12 communicating with the second channel 30 is located at the ⁇ X side end of the second channel 30 in the first substrate 1. Are provided penetrating in the vertical direction.
  • a second buffer solution recovery port 13 that communicates with the second flow path 30 is provided at the position of the + X side end of the second flow path 30 in the first substrate 1 so as to penetrate in the vertical direction.
  • the sample supply system 61 supplies a sample to the sample introduction port 5 of the electrophoresis device DV via the tube 61a.
  • the sample supply system 61 supplies a sample containing exosomes.
  • the buffer solution supply system 62 supplies a buffer solution to the buffer solution introduction flow path 6 of the electrophoresis device DV via the tube 62a.
  • the sample collection system 70 individually collects the sample and buffer solution collected in the sample collection unit 10 of the electrophoresis device DV for each of the plurality of sample collection units 10.
  • the second buffer solution supply system 80 supplies the second buffer solution to the second buffer solution inlet 12 of the electrophoresis device DV.
  • the second buffer solution supply system 80 supplies the second buffer solution stored in the storage portion 81 to the two second buffer solution inlets 12 via the tubes 80a and 80b by driving the pump 82, respectively. Supply.
  • the second flow path collection system 90 collects objects (second buffer solution, bubbles, etc.) in the second flow path 30 in the electrophoresis device DV.
  • the second flow path recovery system 90 draws an object in the second flow path 30 from the two second buffer liquid recovery ports 13 in the electrophoresis device DV through the tube 90a by driving the pump 91, to the waste liquid section 92. to recover.
  • the voltage adjusting unit 40 applies a voltage to the electrode 15.
  • the voltage to be applied is controlled by the control unit CONT, for example.
  • the voltage adjustment unit 40 applies a positive voltage to one electrode 15 and a negative voltage to the other electrode 15 of the two electrodes 15 under the control of the control unit CONT.
  • the microscope 50 irradiates a sample flowing in the separation tank 8 with laser light and acquires a particle image by Rayleigh scattered light.
  • the microscope 50 outputs the acquired image information to the control unit CONT.
  • the control unit CONT calculates the electrophoresis speed, zeta potential, and the like of the sample from the input image information.
  • the microscope 50 and the control unit CONT constitute a detection device that detects electrophoretic mobility.
  • the manufacturing method of the electrophoresis device DV includes a step of preparing the second substrate 2, a step of providing a mask material on the lower surface 2 a of the second substrate 2, and a second flow path 30 ( A step of introducing a gel material solution before gelation into the electrode tank 9), a step of removing the mask material after gelation of the gel material, and a step of laminating the first substrate 1 and the third substrate 3 on the second substrate 2. Including.
  • the step of preparing the second substrate 2 includes the separation tank 8, the electrode tank 9, the buffer solution introduction channel 6, the sample introduction channel 7, the sample recovery channel 11, the electrode insertion port 14, and the second substrate 2. Including a step of forming the through holes 4b, 5b, and 10b.
  • a separation tank 8, an electrode tank 9, a buffer solution introduction channel 6, a sample introduction channel 7, a sample collection channel 11, an electrode insertion port 14, and through holes 4 b, 5 b, 10 b are formed on the second substrate 2.
  • the method can take cutting and injection molding.
  • the cut or injection-molded second substrate 2 is immersed in ethanol, and is cleaned for a predetermined time (for example, 1 minute) using an ultrasonic cleaner. Thereafter, the second substrate 2 is rinsed with ultrapure water and blown with nitrogen. Thereafter, toluene is exposed to the second substrate 2 (for example, about 12 to 13 minutes).
  • the polymethacrylstyrene constituting the first substrate 1 to the third substrate 3 was (Acryase (registered trademark) MS, Nippon Acrease, Japan).
  • oxygen plasma treatment is performed on the second substrate 2.
  • the processing conditions are, for example, using a plasma cleaner (PDC210, Yamato Kagaku) to irradiate oxygen plasma 19 for 1 minute from the lower surface 2a side at an oxygen amount of 30 cc and an output of 100 W as shown in FIG.
  • the surface of the second substrate 2 made of high polymethacryl styrene is made lyophilic.
  • a mask material 21 is attached to the second substrate 2 whose surface is made lyophilic across the bottom surface 8 a and the bottom surface 2 a of the separation tank 8, thereby closing the bottom of the electrode tank 9.
  • a solution of the gel material is introduced by the pipette 20 from the opening of the electrode tank 9 (second flow path 30) opened to the upper surface 2b.
  • Tetra-PEG gel is used as the gel material.
  • Tetrapeg gel is a two-part solution consisting of a 4-arm type polyethylene glycol (TA-PEG) solution having an amino group at the end and a 4-arm type polyethylene glycol (TN-PEG) solution having an N-hydroxysuccinimidyl group at the end.
  • Tetrapeg gel has a uniform network structure and excellent mechanical strength due to the amide bond that occurs between the amino group of TA-PEG and the N-hydroxysuccinimidyl group of TN-PEG. Furthermore, the tetrapeg gel can be firmly bonded to the hydroxyl group or carbonyl group on the surface of the second substrate 2 described above by these functional groups, thereby immobilizing the gel. Moreover, since Tetra-PEG gel has biocompatibility, suppression of adsorption of the biological material to the gel is expected when the biological material is separated as a sample. Furthermore, since it can be easily manufactured by two-liquid mixing, the device manufacturing process is not complicated.
  • SUNBRIGHT registered trademark
  • ITE-100HS Naippon Yushi
  • the second substrate 2 and the third substrate 3 are bonded.
  • the third substrate 3 Prior to bonding, the third substrate 3 is immersed in ethanol as a pretreatment, and is cleaned for a predetermined time (for example, 1 minute) using an ultrasonic cleaner. Thereafter, the second substrate 2 is rinsed with ultrapure water and blown with nitrogen. Thereafter, toluene is exposed to the third substrate 3 (for example, about 12 to 13 minutes). Further, similarly to the second substrate 2, the oxygen plasma treatment is performed on the third substrate 3. Thereafter, the second substrate 2 and the third substrate 3 were overlapped and bonded by pressing at a normal temperature for 30 minutes at a pressure of 20 kN using a nanoimprint apparatus (NanoimPro; graphene platform, Sakai Japan).
  • the first substrate 1 is bonded to the second substrate 2 and the third substrate 3 bonded in this way.
  • the first substrate 1 in which the second buffer solution inlet 12, the second buffer solution recovery port 13, and the through holes 4a, 5a, 10a are formed Similar to the second substrate 3 and the third substrate 3, after ethanol cleaning, exposure to toluene or dichloroethane, oxygen plasma treatment, and a pressure of 20 kN for 30 minutes at room temperature using a nanoimprint apparatus. Apply and bond.
  • the electrode 15 is inserted from the electrode insertion port 14 and the electrode 15 is accommodated in the second flow path 30, whereby the electrophoresis device DV is manufactured.
  • the sample introduction port 5 and the sample supply system 61 in the electrophoresis device DV are connected via a tube 61a, and similarly, the buffer solution introduction port 4 and the buffer solution supply system 62 are connected via a tube 62a.
  • the second buffer solution inlet 12 and the pump 82 are connected via tubes 80a and 80b, the second buffer solution recovery port 13 and the pump 91 are connected via a tube 90a, and the electrode 15 is By connecting to the voltage adjustment unit 40, the preparation for separation of the sample by the extracellular endoplasmic reticulum separation apparatus 100 is completed.
  • the hydrogel forming the gel material is firmly fixed to the second substrate 2 by a chemical bond.
  • the electrophoretic device DV is formed at the interface between the gel material and the second substrate 2 even when the gel material is dried in a dry environment due to the high mechanical strength of the Tetra-PEG gel derived from the homogeneous network structure. No destruction occurs. Even when the gel material is dried, it is possible to return the hydrogel to a wet state without causing mechanical defects by impregnating the buffer immediately before using the electrophoresis device DV.
  • the sample flow rate was 2 ⁇ L / min, and the buffer flow rate was 50 ⁇ L / min.
  • a voltage of 0 to 80 V was applied to the electrode 15.
  • the phosphate buffer solution was introduced from the second buffer solution inlet 12, and the phosphate buffer solution was collected from the second buffer solution collector 13.
  • bubbles 18 are generated by electrolysis as shown in FIG. 9, but as shown in FIG. 10, by sucking the inside of the second flow path 30 by driving the pump 91.
  • the bubbles 18 can be collected and eliminated together with the phosphate buffer, and the bubbles 18 can be prevented from being mixed into the separation tank 8 and adversely affecting the separation of the sample.
  • the fluid pressure in the second channel 30 is increased by the introduction and flow of the phosphate buffer solution. Even when added, the movement of the objects (buffer solution and bubbles 18) between the separation tank 8 and the second flow path 30 can be blocked.
  • the microscope 50 observed fluorescence at a position of 40 mm from the sample introduction port 5 to the + X side, and imaged with a digital camera for microscope.
  • the excitation wavelength in the microscope 50 was 540 to 580 nm, and the fluorescence wavelength was 600 to 660 nm.
  • FIG. 13 is a diagram schematically showing movement trajectories of rhodamine B24 and sulforhodamine B25 when an electric field 26 is formed in a direction across the separation tank 8 by applying a voltage to the electrode 15.
  • the uncharged rhodamine B24 flows to the + X side (downstream side), which is the introduction direction from the sample introduction channel 7 without being affected by the electric field, but the sulforhodamine B25 having a negative charge is It was confirmed that the fluid flowed to the downstream side while moving to the positive electrode side.
  • FIG. 14 is a fluorescence image obtained when the applied voltage to the electrode 15 is changed every 10 V from 0 to 80 V to stabilize the sample movement trajectory
  • FIG. 15 is a diagram showing the migration distance (fluorescence intensity distribution) of the sample. It is. As shown in FIGS. 14 and 15, the peak position of the fluorescence intensity of rhodamine B did not change with the increase of the applied voltage, whereas the peak position of the fluorescence intensity of sulforhodamine B moved to the positive electrode side. was observed.
  • the fluorescence intensity profile was analyzed. Assuming that the fluorescence intensity distribution follows a normal distribution, peak separation was performed, the migration distance was calculated from both peak positions, and the resolution R was determined from the following equation.
  • d (d1, d2) is a position in the Y direction that becomes a peak
  • W (W1, W2) is a half width
  • FIG. 16 is a diagram showing the relationship between the applied voltage and the migration distance of the sample.
  • FIG. 17 is a diagram showing the relationship between the applied voltage and the degree of sample separation. As shown in FIGS. 16 and 17, it was confirmed that both the migration distance and the resolution were in a linear relationship at an applied voltage of 50 V or less.
  • ⁇ the zeta potential
  • ⁇ the viscosity
  • ⁇ 0 the vacuum dielectric constant
  • ⁇ r is the relative dielectric constant.
  • the viscosity and relative permittivity of the phosphate buffer are the same as those of water at 25 ° C.
  • the gel material having ion permeability is provided as the partition wall 17 with a predetermined bonding strength at the communication portion between the separation layer 8 and the electrode tank 9 (second flow path 30). Therefore, it is possible to prevent the buffer solution and bubbles from moving between the separation layer 8 and the electrode tank 9, and it is possible to stably perform electrophoresis and separation of the sample over a long period of time.
  • the gel material is formed of hydrogel, the gel material is chemically bonded to the second substrate 2 and firmly bonded, and the flow of the sample and the buffer in the separation tank 8 or in the second flow path.
  • the hydrogel can be returned to a wet state without causing mechanical defects by impregnating the buffer solution before carrying out separation of the sample even after being dried. It is easy to store in a dry state. For example, it can be stored by a simple method in a medical field.
  • a plurality of types of exosomes can be obtained by appropriately setting the positions of the sample collection unit 10 and the sample collection channel 11 in the Y direction according to the electric mobility of the sample. Even in the case of using a sample mixed with, it can be easily separated and collected in the sample collection unit 10 and the sample collection channel 11 corresponding to the electric mobility of each exosome.
  • the electrophoresis device DV when using the electrophoresis device DV whose position in the Y direction of the sample collection unit 10 and the sample collection channel 11 is a predetermined voltage, a voltage having a magnitude that can sufficiently separate a plurality of types of exosomes is applied, or It is also possible to adjust the flow rate of the sample in the separation tank 8.
  • the first substrate 1 to the third substrate 3 are formed of polymethacryl styrene which is a synthetic resin material, various shapes can be easily obtained by a method such as cutting or injection molding. At the same time, the cost for manufacturing can be reduced.
  • the manufacturing method of the electrophoretic device DV of this modification includes a step of preparing the first substrate 1 and the second substrate 2, a step of providing the mask material 21 on the upper surface 2b of the second substrate 2, and a second substrate provided with the mask material. 2, the step of introducing a gel material solution before gelation into the second flow path 30 (electrode tank 9), the step of removing the mask material 21 after gelation of the gel material, the first substrate as the second substrate 2 Including a step of laminating the first and third substrates 3.
  • the separation tank 8, the electrode tank 9, the buffer solution introduction channel 6, the sample introduction channel 7, the sample collection channel 11, the electrode insertion port 14, and the through holes 4b, 5b, and 10b were prepared.
  • the second substrate 2 was immersed in ethanol and cleaned for 10 minutes using an ultrasonic cleaner. Thereafter, the substrate was rinsed twice with ultrapure water, and dichloroethane was exposed to the second substrate 2 blown with nitrogen for 3 minutes. Thereafter, as shown in FIG. 18, oxygen plasma treatment is performed on the second substrate 2.
  • a mask material 21 is attached to the upper surface 2 b of the second substrate 2.
  • the pipette 20 uses the pipette 20 from the opening of the electrode tank 9 opened on the lower surface 2a.
  • the solution of the gel material thus prepared is introduced.
  • the amount of the gel solution introduced into the electrode tank 9 is, for example, an amount such that the gelled partition wall 17 is flush with the bottom surface 8a of the separation tank 8.
  • the mask material 21 is peeled off so that the gel material does not adhere.
  • the partition wall 17 is formed of a gel material, and one end on the Z side is formed flush with the upper surface 2b of the second substrate 2, and the other end is formed flush with the bottom surface 8a.
  • FIG. 21 shows an inverted view again so that the upper surface 2b of the second substrate 2 is on the upper side.
  • the first substrate 1 has grooves extending in the X direction as second flow paths 30 ⁇ / b> A at positions facing the partition walls 17.
  • the electrode 15 is inserted and accommodated in the second flow path 30 ⁇ / b> A from the electrode insertion port 14.
  • the second flow path 30A is formed on the first substrate 1 and the distance from the separation tank 8 is increased. It becomes easy to block the movement of the buffer solution and the bubbles between the separation tank 8 and the second flow path 30A.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Power Engineering (AREA)
  • Hydrology & Water Resources (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Electrostatic Separation (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)

Abstract

　この電気泳動デバイスは、第１方向に延び、試料および緩衝液が流動する第１流路と、第１流路の端部に設けられ試料が回収される試料回収部と、第１流路の第１方向と直交する第２方向の両側にそれぞれ配置され第１流路に第２方向に沿って電圧を印加する電極と、第１流路の前記第２方向の両側にそれぞれ連通し電極を収容するとともに、第２緩衝液が流動する第２流路と、第１流路と第２流路との連通部に所定の接合強度で固定され第１流路と第２流路との間の物体の移動を遮断する隔壁と、を備える。隔壁は、イオン透過性を有するゲル材で形成されている。

Description

電気泳動デバイス、電気泳動デバイス製造方法および細胞外小胞体分離装置
　本発明は、電気泳動デバイス、電気泳動デバイス製造方法および細胞外小胞体分離装置に関する。
　本願は、２０１４年８月２８日に出願された米国特許仮出願６２／０４３，１４９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　生体に由来する核酸、タンパク質、脂質などの分子、細胞内小器官、細胞外小胞体などの分子集合体、および細胞は、生理現象、病理現象の機序の解明や、薬物治療の際の効果の定量的評価を行う際の分析対象である。
　生体から抽出された試料には、通常、分子、分子集合体、粒子、細胞などの複数の異なる成分が混在しているため、解析の対象となる成分のみを分離・精製する必要がある。試料中の成分を分離・精製する際の指標として、サイズ、比重、水／油分配係数、等電点、表面電位などの物理的性質、あるいは分子親和性(アフィニティー)を利用することが可能である。
　表面電位によって分離・精製する方法として、フリーフロー電気泳動法が知られている（非特許文献１参照）。
　フリーフロー電気泳動法は、分離槽内で試料を緩衝液とともに上流から下流に層流状に流しながら、分離槽の両脇に設けられた電極に電圧を加えることにより、分層槽内の緩衝液の流れに垂直方向に電界を印加して，自由ゾーン電気泳動を行い、試料中の成分の電気泳動度の違いにより分離する技術である。
　フリーフロー電気泳動法を用いれば、試料中に混在する成分を、それぞれの成分が有する表面電位(電気泳動度)の違いによって分離・精製することができる。また、抗体等のように特異的親和性を有する分子タグを試料中の成分に結合させ、抗体と成分が結合した結果として生じる表面電位の変化を利用して特定の成分の分離を恣意的に行うことも可能である。
　従来のフリーフロー電気泳動装置は大型であり、試料中に混在する成分、例えば、エクソソーム（エキソソーム）等の細胞外小胞体を分離するには大量の試料が必要であった（非特許文献２参照）。また、従来のフリーフロー電気泳動装置は高価であった。これらの課題を解決するために、近年、マイクロ流体デバイス技術を応用した小型のフリーフロー電気泳動装置（マイクロフリーフロー電気泳動チップ）の開発研究が行われ、試作された小型のフリーフロー電気泳動装置は、少量の試料の分離に有効であることが示されている（非特許文献３参照）。
　マイクロ流体デバイス技術を用いたフリーフロー電気泳動装置においては、電気分解により電極上で生じる気泡の影響が大きく、長時間の安定な動作がしばしば困難であるといった問題があった。この問題を解決するため、分離槽と電極槽をイオン透過性のゲルで分離し、分離槽内の層流を擾乱することなく、電極槽を還流することで気泡を除去する方法が提案されている（非特許文献４参照）。
D Kohlheyer, et al., Electrophoresis, 29, 977-993, 2008; RT Turgeon, et al., Anal Bioanal Chem, 394, 187-198, 2009 K Hannig, Anal Chem, 181, 244-254, 1961 DE Raymond, et al., Anal Chem, 66, 2858-2865, 1994 JW Albrecht, et al., Electrophoresis 27, 4960-4969, 2006; DP de Jesus, et al., Electrophoresis, 27, 4935-4942, 2006; D Kohlheyer, et al., Lab Chip 6, 374-380, 2006
　上述した文献において用いられたアガロースゲルやアクリルアミドゲルは、マイクロフリーフロー電気泳動法が行われる基材であるシリコンやガラスと化学的に結合しておらず、ハイドロゲルと基材の界面で剥離が生じやすく、長時間の安定な動作が困難であるという問題があった。
　本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、長時間の安定した動作が可能な電気泳動デバイス、電気泳動デバイス製造方法および細胞外小胞体分離装置を提供することを目的とする。
　本発明の第１の態様に従えば、第１方向に延び、試料および緩衝液が流動する第１流路と、前記第１流路の端部に設けられ前記試料が回収される試料回収部と、前記第１流路の前記第１方向と直交する第２方向の両側にそれぞれ配置され前記第１流路に前記第２方向に沿って電圧を印加する電極と、前記第１流路の前記第２方向の両側にそれぞれ連通し前記電極を収容するとともに、第２緩衝液が流動する第２流路と、前記第１流路と前記第２流路との連通部に所定の接合強度で固定され前記第１流路と前記第２流路との間の物体の移動を遮断する隔壁と、を備え、前記隔壁は、イオン透過性を有するゲル材で形成されている電気泳動デバイスが提供される。
　本発明の第２の態様に従えば、本発明の第１の態様の電気泳動デバイスと、前記第１流路に細胞外小胞体を含む試料を供給する試料供給系と、前記第１流路に前記緩衝液を供給する緩衝液供給系と、前記試料回収部を介して前記試料を回収する試料回収系と、前記第２流路の一端側に前記第２緩衝液を供給する第２緩衝液供給系と、前記第２流路の他端側から前記第２流路内の物体を回収する第２流路回収系と、前記電極により印加される前記電圧を調整する調整部と、を備える細胞外小胞体分離装置が提供される。
　本発明の第３の態様に従えば、第１方向に延び、試料および緩衝液が流動する第１流路と、前記第１流路の第２方向の両側にそれぞれ連通し、第２緩衝液が流動する第２流路とを備える基材を準備する工程と、前記第１流路と前記第２流路との連通部に、前記第１流路と前記第２流路との間の物体の移動を遮断する隔壁として、イオン透過性を有するゲル材を所定の接合強度で固定する工程と、を含む電気泳動デバイス製造方法が提供される。
　本発明によれば、長時間の安定した動作が可能な電気泳動デバイス、電気泳動デバイス製造方法および細胞外小胞体分離装置を提供することことができる。
実施形態に係る細胞外小胞体分離装置の概略的な構成図である。 実施形態に係る電気泳動デバイスＤＶの外観斜視図である。 図２におけるＡ－Ａ線視断面図である。 第２基板２を下面２ａ側から視た下面図である。 図４における分離槽８の－Ｘ側端部の部分拡大図である。 図４における分離槽８の＋Ｘ側端部の部分拡大図である。 第１基板１を下面１ａ側から視た下面図である。 分離槽８および電極槽９の周辺を模式的に示した図である。 分離槽８および電極槽９の周辺を模式的に示した図である。 分離槽８および電極槽９の周辺を模式的に示した図である。 電気泳動デバイスＤＶの製造方法を説明するための図である。 電気泳動デバイスＤＶの製造方法を説明するための図である。 電界２６が形成されたときのローダミンＢ２４、スルホローダミンＢ２５の移動軌跡を示す図である。 印加電圧を変化させ試料の移動軌跡が安定したときの蛍光像である。 印加電圧を変化させたときの試料の蛍光強度分布を示す図である。 印加電圧と試料の泳動距離の関係を示す図である。 印加電圧と試料の分離度の関係を示す図である。 電気泳動デバイスＤＶの製造方法の変形例を説明するための図である。 電気泳動デバイスＤＶの製造方法の変形例を説明するための図である。 電気泳動デバイスＤＶの製造方法の変形例を説明するための図である。 電気泳動デバイスＤＶの製造方法の変形例を説明するための図である。
　以下、本発明の電気泳動デバイス、電気泳動デバイス製造方法および細胞外小胞体分離装置の実施の形態を、図１ないし図２１を参照して説明する。
　なお、以下の実施の実施形態は、本発明の一態様を示すものであり、この発明を限定するものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で任意に変更可能である。また、以下の図面においては、各構成をわかりやすくするために、実際の構造と各構造における縮尺や数等を異ならせている。
　一実施態様において、本発明は、試料（検体）を分離する際に用いられる電気泳動デバイスを提供する。検体としては、細胞、細胞外小胞体、微粒子、ラテックス粒子（抗体で修飾され、さらに細胞で修飾されたラテックス粒子を含む）、高分子ミセル等が挙げられる。本実施形態では、電気泳動デバイスとして、細胞外小胞体を分離するための細胞外小胞体分離デバイスを用いる場合について説明する。本明細書において、細胞外小胞体とは、エクソソーム（エキソソーム）、アポトーシス小体、マイクロベシクル等を含む、脂質小胞を意味するものとする。以下に、エクソソームを分離する場合を例として、本実施形態に係る細胞外小胞体分離装置および電気泳動デバイスについて説明する。
　［エクソソーム］
　エクソソーム（エキソソーム）は、直径３０～１００ｎｍ程度の脂質小胞であり、エンドソームと細胞膜との融合体として、腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞等、種々の細胞から、血液、尿、唾液等の体液中に分泌される。
　生体内に存在する癌細胞等の異常細胞は、その細胞膜に特有のタンパク質を発現している。エクソソームは細胞の分泌物であり、その表面に分泌源の細胞由来のタンパク質を発現している。
　そこで、エクソソームの表面に発現しているタンパク質を分析することで、分泌源の細胞の異常を検出することができる。ここで、エクソソームの表面とは、細胞から分泌される脂質小胞の膜表面であって、分泌されたエクソソームが生体内の環境と接する部分をいう。
　エクソソームは、生体内で循環している血液中で検出されるため、エクソソームを分析することで、バイオプシー検査をしなくとも、生体内の異常を検出することができる。
　［エクソソームの分析］
　電気泳動デバイスを用いたエクソソームの分析は、一例として次のようにして行うことができる。まず、検出対象のエクソソームを分離・精製する。次に、エクソソームと特異的結合物質とを接触させる。ここで、特異的結合物質とは、エクソソームの表面に存在する分子に特異的に結合することができる物質を意味する。次に、電気泳動デバイスを用いて、エクソソームのゼータ電位を計測し、分析を行う。本分析は、エクソソームに限らず、広く細胞外小胞体一般の分析にも適用できる。
（特異的結合物質）
　特異的結合物質としては、例えば、抗体、改変抗体、アプタマー、リガンド分子等が挙げられる。抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等が挙げられる。ＩｇＧとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等が挙げられる。ＩｇＡとしては、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等が挙げられる。ＩｇＭとしては、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２等が挙げられる。改変抗体としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ等が挙げられる。アプタマーとしては、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー等が挙げられる。リガンド分子としては、エクソソームの表面に存在する検出対象分子が、レセプタータンパク質である場合の、当該レセプタータンパク質のリガンド等が挙げられる。例えば、エクソソームの表面に存在する分子がインターロイキンである場合、リガンド分子としてはＧタンパク質等が挙げられる。
　また、特異的結合物質は、標識物質で標識されていてもよい。標識物質としては、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、グルタチオン、蛍光色素、ポリエチレングリコール、メリト酸等の電荷分子等が挙げられる。
（エクソソームの分離・精製）
　本分析の各工程について説明する。まず、エクソソームを含有する試料から該エクソソームを精製する。試料としては、目的に応じて、血液、尿、母乳、気管支肺胞洗浄液、羊水、悪性滲出液、唾液、細胞培養液等が挙げられる。中でも、血液及び尿からは、エクソソームを精製しやすい。
　エクソソームを精製する方法としては、後述するように、本実施形態に係る電気泳動デバイスＤＶを用いて行う。
（エクソソームと特異的結合物質との反応）
　次に、エクソソームと特異的結合物質（抗体、アプタマー等）とを接触させる。エクソソームの表面に検出対象の分子が存在した場合、特異的結合物質－エクソソーム複合体が形成される。特異的結合物質を適切に選択することにより、例えば、癌、肥満、糖尿病、神経変性疾患等の疾患に関連する異常を検出することができる。詳細については後述する。
　（ゼータ電位の計測）
　一例として、特異的結合物質として抗体を使用した場合について説明する。エクソソームと抗体とを反応させた後、抗体と反応させたエクソソームのゼータ電位を計測する。ゼータ電位とは、溶液中の微粒子の表面電荷である。例えば、エクソソームが負に帯電しているのに対し、抗体は正に帯電している。このため、抗体－エクソソーム複合体のゼータ電位は、エクソソーム単独のゼータ電位と比較して正にシフトしている。したがって、抗体と反応させたエクソソームのゼータ電位を測定することによって、エクソソームの膜表面における抗原の発現を検出することができる。これは、抗体に限らず、正に帯電した特異的結合物質でも同様である。
　エクソソームのゼータ電位ζは、一例として、電気泳動デバイスのマイクロ流路内で、エクソソームの電気泳動を行い、エクソソームの電気泳動速度Ｓを光学的に測定し、測定されたエクソソームの電気泳動速度Ｓに基づいて、以下の式（１）に示すスモルコフスキー（Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ）の式を用いて算出することができる。
　Ｕ＝（ε／η）ζ　…（１）
　式（１）中、Ｕは測定対象のエクソソームの電気泳動移動度、ε及びηは、それぞれ、サンプル溶液の誘電率及び粘性係数である。また、電気泳動移動度Ｕは、電気泳動速度Ｓをマイクロ流路内の電界強度で除して算出することができる。
　エクソソームの電気泳動速度Ｓは、一例として、エクソソームを、細胞外小胞体分析チップのマイクロ流路内で電気泳動させ、一例として、レーザー光を、マイクロ流路内を流れるエクソソームに照射して、レイリー散乱光による粒子画像を取得することにより、測定することができる。レーザー光としては、一例として、波長４８８ｎｍ、強度５０ｍＷのものが挙げられる。
［細胞外小胞体分離装置の基本構造］
　図１は、細胞外小胞体分離装置１００の概略的な構成図である。
　細胞外小胞体分離装置１００は、電気泳動デバイスＤＶ、電圧調整部（調整部）４０、顕微鏡５０、試料供給系６１、緩衝液供給系６２、試料回収系７０、第２緩衝液供給系８０、第２流路回収系９０および制御部ＣＯＮＴを備えている。
［電気泳動デバイスＤＶ］
　図２は、電気泳動デバイスＤＶの外観斜視図である。図３は、図２におけるＡ－Ａ線視断面図である。なお、図２においては、理解を容易にするために、電気泳動デバイスＤＶの構成要素を実線で示している。
　図２に示すように、電気泳動デバイスＤＶは、厚さ方向に順次積層され、それぞれが平面視矩形の第１基板（第２基材）１、第２基板（基材）２、第３基板（第３基材）３を有している。第１基板１、第２基板２、第３基板３の角部には、位置決め用の貫通孔Ｈが設けられており、図示しない軸部材を貫通孔Ｈに嵌合させることにより、第１基板１、第２基板２、第３基板３が互いに位置決めされる。
　電気泳動デバイスＤＶは、緩衝液導入口４、試料導入口５、緩衝液導入流路６、試料導入流路７、分離槽（第１流路）８、電極槽９、試料回収部１０、試料回収流路１１、第２緩衝液導入口１２、第２緩衝液回収口１３、電極１５（図３、８乃至図１０参照）を備えている。
　なお、以下の説明においては、第１基板１、第２基板２、第３基板３の積層方向をＺ方向とし、例えば、分離槽８の延びる方向をＸ方向とし、Ｚ方向およびＸ方向と直交する方向であり、分離槽８の幅方向をＹ方向として説明する。また、適宜Ｚ方向を上下方向とし、第２基板２に対して第１基板１が配置される側を上側、第２基板２に対して第３基板３が配置される側を下側として説明する。これは、あくまで説明の便宜のために上下方向を定義したものであって、本発明の電気泳動デバイスＤＶが実際に用いられるときの設置姿勢を限定するものではない。
　第１基板１、第２基板２および第３基板３としては、各種の工業用合成樹脂を用いることができる。第１基板１、第２基板２および第３基板３は、一例として、合成樹脂材料であるポリメタクリルスチレンが用いられる。ポリメタクリルスチレンは、メタクリレート(MMA)とスチレンを共重合したポリメタクリルスチレン(MS)の樹脂押出板である。ポリメタクリルスチレンの主な特長としては、ポリメタクリル板に相当する透明性や耐候性、ポリメタクリル板に比べて吸水性が小さいため寸法安定性に優れ変形しにくい点、ガラスの約半分の比重であるポリメタクリル板よりもさらに比重が小さく軽い点、機械加工が容易である点などが挙げられる。ただし、第１基板１、第２基板２および第３基板３は、ポリメタクリルスチレンに限定されず、好ましくは、透明性にすぐれるポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル樹脂、ポリカーボネイト、ポリシクロオレフィンなどにより形成することができる。第１基板１および第３基板３は、一例として、Ｘ方向の長さが１００ｍｍ、Ｙ方向の長さが８０ｍｍ、Ｚ方向の長さ（厚さ）が２ｍｍである。第２基板２は、一例として、Ｘ方向の長さが１００ｍｍ、Ｙ方向の長さが８０ｍｍ、Ｚ方向の長さ（厚さ）が５ｍｍである。
　分離槽８は、緩衝液および試料が流動する流路であり、図２に示されるように、Ｘ方向に延びている。図３に示されるように、分離槽８は、第２基板２の下面２ａにおけるＹ方向中央部に設けられた凹部によって形成されている。分離槽８のＹ方向の幅は、例えば、１０ｍｍである。分離槽８の深さは、例えば０．１ｍｍである。
　図４は、第２基板２を下面２ａ側から視た下面図である。図５は、図４における分離槽８の－Ｘ側端部の部分拡大図である。図６は、図４における分離槽８の＋Ｘ側端部の部分拡大図である。
　分離槽８のＸ方向の長さは、例えば、５０ｍｍである。
　図４に示されるように、分離槽８の－Ｘ側端部には、緩衝液導入流路６および試料導入流路７が接続されている。試料導入流路７は、Ｘ方向に延び、一端が分離槽８のＹ方向の中央部に接続されている。試料導入流路７の深さは、分離槽８の深さと同一である。試料導入流路７の他端は、試料導入口５に接続されている。図７は、第１基板１を下面１ａ側から視た下面図である。試料導入口５は、上下方向に延びており、第１基板１および第２基板２に亘って貫通して形成されている。試料導入口５は、第１基板１に形成された貫通孔５ａと、第２基板２に貫通孔５ａとＸＹ平面において同一位置に形成された貫通孔５ｂとを含む。試料導入口５は、上述した試料を試料導入流路７に導入するための部位である。
　緩衝液導入流路６は、試料導入流路７を挟んだＹ方向の両側において、一端がそれぞれ分離槽８に接続されている。緩衝液導入流路６は、他端側で合流して緩衝液導入口４に接続されている。緩衝液導入口４は、上下方向に延びており、第１基板１および第２基板２に亘って貫通して形成されている。緩衝液導入口４は、第１基板１に形成された貫通孔４ａと、第２基板２に貫通孔４ａとＸＹ平面において同一位置に形成された貫通孔４ｂとを含む。緩衝液導入口４は、上述した試料とともに分離槽８を流動させる緩衝液（バッファー）を緩衝液導入流路６に導入するための部位である。
　試料回収流路１１は、一端が分離槽８の＋Ｘ側端部に接続して複数（図４では５つ）設けられている。試料回収流路１１は、Ｙ方向に互いに間隔をあけて設けられている。試料回収流路１１が分離槽８に接続されるＹ方向の位置は、後述するように、試料（エクソソーム）の移動度に基づいて設定されている。試料回収流路１１の他端は、試料回収部１０に接続されている。
　試料回収部１０は、試料回収流路１１毎に複数（図４では５つ）設けられている。試料回収部１０は、上下方向に延びており、第１基板１および第２基板２に亘って貫通して形成されている。試料回収部１０は、第１基板１に形成された貫通孔１０ａと、第２基板２に貫通孔１０ａとＸＹ平面において同一位置に形成された貫通孔１０ｂとを含む。試料回収部１０は、電気泳動度に応じて分離された試料（エクソソーム）を回収するための部位である。
　電極槽９は、図３および図４に示すように、分離槽８のＹ方向両側にそれぞれ連通して配置されている。電極槽９は、第２基板２を上下方向に貫通する。電極槽９は、一例として、Ｘ方向の長さが５０ｍｍ、Ｙ方向の長さが２ｍｍ、Ｚ方向の長さ（深さ）が５ｍｍである。電極槽９における底部、すなわち分離槽８との連通部には、隔壁１７が設けられている。電極槽９における隔壁１７より上側は、第２緩衝液が流動する第２流路３０である。
　隔壁１７は、分離槽８と電極槽９との間の物体の移動を遮断する。隔壁１７の下面は、Ｙ方向の外側に向かうに従って下側に向かう傾斜面１７ａである。傾斜面１７ａは、電極槽９に臨むＹ方向内側の側面９ａと分離槽８の底面８ａとが交差する位置と、電極槽９に臨むＹ方向外側の側面９ｂと第２基板２の下面２ａとが交差する位置を繋ぐ。
　隔壁１７は、イオン透過性を有するゲル材で形成されている。ゲル材としては、一例として、機械強度および均一性が高いハイドロゲルが用いられる。ハイドロゲルとしては、例えば、Tetra-PEGゲル、slide-ring (SR) ゲル, nanocomposite (NC) ゲル, double network(DN) gelsなどを用いることができる。
　また、ゲル高分子の末端に基材と化学結合ができる官能基を有することが望ましい。末端の官能基としては、アミノ基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、アシルアジド基、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル基、スルフォニルクロライド基、アルデヒド基、エポキシド基、オキシラン基、カーボネート基、アリール基、イミドエステル基、カルボジイミド基、アンハイドライド基、チオール基、ハロアセチル基、アルキルハライド基、マレイミド基、アジリジン基、アクリロイル基、ジスルフィド基、ジアゾアルカン基、ジアゾアセチル基、カルボニルジイミダゾール基、、N, N'-ジスクシニミジルカーボネート基、N-ヒドロキシスクインイミジルクロロフォメート基、ヒドラジン基、ヒドラジド基などが挙げられる。
　中でも、官能基の数が４以上のものが好ましく、４つ以上のポリエチレングリコール骨格の分岐鎖であって、末端に官能基を有するものを有するポリマー種がより好ましい。係るポリマー種としては、Tetra-PEGゲルが挙げられる。
　図８乃至図１０は、分離槽８および電極槽９の周辺を模式的に示した図である。第２流路３０には、電極１５が収容されるとともに、第２緩衝液１６が流動する。電極１５は、例えば、白金ワイヤーで形成されている。図２に示されるように、第２基板２には、電極槽９よりも－Ｘ側の位置にＸ方向に延びる電極挿入口１４が設けられている。電極挿入口１４から挿入された電極１５の先端側は、第２流路３０内に収容される。
　図２、図７乃至図１０に示されるように、第１基板１における第２流路３０の－Ｘ側端部の位置には、第２流路３０に連通する第２緩衝液導入口１２が上下方向に貫通して設けられている。第１基板１における第２流路３０の＋Ｘ側端部の位置には、第２流路３０に連通する第２緩衝液回収口１３が上下方向に貫通して設けられている。
　図１に戻り、試料供給系６１は、電気泳動デバイスＤＶの試料導入口５に対してチューブ６１ａを介して試料を供給する。本実施形態では、試料供給系６１は、エクソソームを含有する試料を供給する。
　緩衝液供給系６２は、電気泳動デバイスＤＶの緩衝液導入流路６に対してチューブ６２ａを介して緩衝液を供給する。
　試料回収系７０は、電気泳動デバイスＤＶの試料回収部１０に回収された試料および緩衝液を、複数の試料回収部１０毎に個別に回収する。
　第２緩衝液供給系８０は、電気泳動デバイスＤＶの第２緩衝液導入口１２に第２緩衝液を供給する。第２緩衝液供給系８０は、貯溜部８１に貯溜された第２緩衝液をポンプ８２の駆動により、二つの第２緩衝液導入口１２にチューブ８０ａ、８０ｂを介してそれぞれ第２緩衝液を供給する。
　第２流路回収系９０は、電気泳動デバイスＤＶにおける第２流路３０内の物体（第２緩衝液、気泡等）を回収する。第２流路回収系９０は、ポンプ９１の駆動により電気泳動デバイスＤＶにおける二つの第２緩衝液回収口１３からチューブ９０ａを介して第２流路３０内の物体を吸引して廃液部９２に回収する。
　電圧調整部４０は、電極１５に対して電圧を印加する。印加する電圧は、例えば、制御部ＣＯＮＴによって制御される。電圧調整部４０は、制御部ＣＯＮＴの制御下で二つの電極１５のうち、一方の電極１５に正の電圧、他方の電極１５に負の電圧を印加する。
　顕微鏡５０は、分離槽８を流動する試料に対してレーザー光を照射して、レイリー散乱光による粒子画像を取得する。顕微鏡５０は、取得した画像情報を制御部ＣＯＮＴに出力する。制御部ＣＯＮＴは、入力した画像情報から試料の電気泳動速度、ゼータ電位等を算出する。顕微鏡５０および制御部ＣＯＮＴにより、電気泳動移動度を検出する検出装置が構成される。
［電気泳動デバイスＤＶの製造方法］
　次に、上述した電気泳動デバイスＤＶの製造方法について、図１１および図１２を参照して説明する。
　電気泳動デバイスＤＶの製造方法は、第２基板２を準備する工程、第２基板２の下面２ａにマスク材を設ける工程、マスク材を設けた第２基板２に対して第２流路３０（電極槽９）にゲル化前のゲル材の溶液を導入する工程、ゲル材のゲル化後にマスク材を除去する工程、第２基板２に第１基板１および第３基板３を積層する工程を含む。
　以下、各工程について詳細に説明する。
　第２基板２を準備する工程は、第２基材２に対して分離槽８、電極槽９、緩衝液導入流路６、試料導入流路７、試料回収流路１１、電極挿入口１４および貫通孔４ｂ、５ｂ、１０ｂを形成する工程を含む。第２基材２に対して分離槽８、電極槽９、緩衝液導入流路６、試料導入流路７、試料回収流路１１、電極挿入口１４および貫通孔４ｂ、５ｂ、１０ｂを形成する方法は、切削加工や射出成形を採ることができる。
　続いて、切削加工または射出成形された第２基板２をエタノールに浸漬し、超音波洗浄機を用いて所定時間（例えば１分間）洗浄する。その後、第２基板２を超純水でリンスをし、窒素ブローする。その後、第２基板２に対してトルエンを暴露する（例えば１２～１３分程度）。
　なお、第１基板１～第３基板３を構成するポリメタクリルスチレンは、（アクリエース（登録商標）MS、日本アクリエース, Japan)を使用した。
　次に、第２基板２に対して酸素プラズマ処理を施す。処理条件は、例えば、プラズマクリーナー(PDC210、ヤマト科学)を用いて、酸素量３０ｃｃ、出力１００Ｗにて、図１１に示すように、下面２ａ側から１分間酸素プラズマ１９を照射して、疎水性の高いポリメタクリルスチレンじゃらなる第２基板２の表面を親液化させる。
　表面が親液化された第２基板２に対しては、図１２に示すように、分離槽８の底面８ａおよび下面２ａに跨ってマスク材２１を貼り付け、電極槽９の底部を閉塞する。この後、上面２ｂに開口する電極槽９（第２流路３０）の開口部からピペット２０によりゲル材の溶液を導入する。本実施形態ではゲル材としてテトラペグ（Tetra-PEG）ゲルを用いる。テトラペグゲルは、末端にアミノ基を有する4腕型のポリエチレングリコール(TA-PEG)溶液と、末端にN-ヒドロキシスクシンイミジル基を有する4腕型のポリエチレングリコール(TN-PEG)溶液の二液混合型のハイドロゲルである。テトラペグゲルは、TA-PEGのアミノ基とTN-PEGのN-ヒドロキシスクシンイミジル基との間で起こるアミド結合により、均質な網目構造が形成され、優れた力学的強度を有する。さらに、テトラペグゲルは、これらの官能基により、上述した第２基板２の表面のヒドロキシル基やカルボニル基と強固に化学結合し、ゲルを固定化できる。
また、Tetra-PEG ゲルは生体適合性を有するため、試料として生体物質の分離時に、生体物質のゲルへの吸着の抑制が期待される。
さらに、二液混合により容易に作製可能なため、デバイスの作製工程が複雑化されないという効果を奏する。
　TA-PEGは、SUNBRIGHT（登録商標）PTE-100PA (日本油脂)を、最終濃度１００ｍｇ／ｍＬになるように0.2Mリン酸ナトリウムバッファー, pH=7.4に溶解した。
また、TN-PEGは、SUNBRIGHT（登録商標）ITE-100HS (日本油脂)を、最終濃度１００ｍｇ／ｍＬになるように0.2Mクエン酸リン酸ナトリウムバッファー pH=5.8に溶解した。
調整したTA-PEG溶液と、TN-PEG溶液とを１：１に混合すると、１０分以内に混合液の粘度が上昇し、ゲル化反応が確認される。
　電極槽９の開口部から上記の二液混合溶液（ゲル溶液）を導入した後に、ゲル溶液から空気（気泡）が残らないように除去し、安定した強度でゲル化されるまで１時間程度静置する。その後、ゲル材が付着しないようにマスク材２１を剥離する。
　次に、第２基板２と第３基板３とを接着する。接着前には、前処理として第３基板３をエタノールに浸漬し、超音波洗浄機を用いて所定時間（例えば１分間）洗浄する。その後、第２基板２を超純水でリンスをし、窒素ブローする。その後、第３基板３に対してトルエンを暴露する（例えば１２～１３分程度）。さらに、第２基板２と同様に、第３基板３に対して酸素プラズマ処理を施す。この後、第２基板２と第３基板３とを重ねて、ナノインプリント装置（NanoimPro；グラフェンプラットフォーム, Japan)を用いて、２０ｋＮの圧力で３０分間常温で加圧して接着した。
　このように接着した第２基板２および第３基板３に対して第１基板１を接着する。予め、切削加工または射出成形で図７に示すように、第２緩衝液導入口１２、第２緩衝液回収口１３、貫通孔４ａ、５ａ、１０ａを形成した第１基板１に対しては、第２基板２および第３基板３と同様に、エタノール洗浄した後、トルエンまたはジクロロエタンで暴露し、酸素プラズマ処理を行った後に、ナノインプリント装置を用いて常温の条件下で３０分間、２０ｋＮの圧力を印加して接着する。
　この後、電極挿入口１４から電極１５を挿入して第２流路３０内に電極１５を収容することにより、電気泳動デバイスＤＶが製造される。また、電気泳動デバイスＤＶにおける試料導入口５と試料供給系６１とをチューブ６１ａを介して接続し、同様に、緩衝液導入口４と緩衝液供給系６２とをチューブ６２ａを介して接続し、同様に、第２緩衝液導入口１２とポンプ８２とをチューブ８０ａ、８０ｂを介して接続し、第２緩衝液回収口１３とポンプ９１とをチューブ９０ａを介して接続し、さらに、電極１５を電圧調整部４０に接続することにより細胞外小胞体分離装置１００による試料の分離準備が整う。
　この電気泳動デバイスＤＶは、ゲル材を形成するハイドロゲルが第２基板２と化学結合で強力に固着している。また、電気泳動デバイスＤＶは、均質網目構造に由来したTetra-PEGゲルの高い機械強度に起因して、乾燥環境でゲル材を乾燥させた場合にも、ゲル材と第２基板２の界面で破壊が生じない。また、ゲル材が乾燥した場合でも、電気泳動デバイスＤＶを使用する直前に緩衝液を含侵させることで、ハイドロゲルは機械的な欠陥を生じることなく、湿潤状態に戻すことが可能である。
［細胞外小胞体分離方法］
　次に、上記の細胞外小胞体分離装置１００を用いて、細胞外小胞体を分離する方法について説明する。
　ここでは、試料として、電荷を持たない蛍光色素であるローダミンＢ、負電荷を有するスルホローダミンＢの分離実験を行った。
　試料供給系６１から試料導入口５に１ｍＭローダミンＢと１ｍＭスルホローダミンＢの混合液を導入した。その際、緩衝液供給系６２から緩衝液導入口４に１０ｍＭリン酸緩衝液を導入し、ローダミンＢとスルホローダミンＢの混合液の流れを整えた。
　試料の流速は２μＬ／ｍｉｎとし、緩衝液の流速は５０μＬ／ｍｉｎとした。
　電極１５に対しては、０～８０Ｖの電圧を印加した。
　第２流路３０に対しては、第２緩衝液導入口１２からリン酸緩衝液を導入するとともに、第２緩衝液回収口１３からリン酸緩衝液を回収した。電極１５に電圧を印加した際には電気分解によって、図９に示すように、気泡１８が生じるが、ポンプ９１の駆動により第２流路３０内を吸引することにより、図１０に示されるように、リン酸緩衝液とともに気泡１８を回収・排除することができ、気泡１８が分離槽８に混入して、試料の分離に悪影響を及ぼすことを防止できる。
　特に、本実施形態では、隔壁１７を構成するゲル材が第２基板２に化学的に強固に結合しているため、リン酸緩衝液の導入・流動により第２流路３０内の液圧が加わった場合でも、分離槽８と第２流路３０との間の物体（緩衝液および気泡１８）の移動を遮断可能である。
　顕微鏡５０は、試料導入口５から＋Ｘ側へ４０ｍｍの位置を蛍光観察し、顕微鏡用デジタルカメラにて撮像した。
　顕微鏡５０における励起波長は５４０～５８０ｎｍ、蛍光波長は６００～６６０ｎｍとした。
　図１３は、電極１５への電圧印加により、分離槽８を横切る方向に電界２６が形成されたときのローダミンＢ２４、スルホローダミンＢ２５の移動軌跡を概略的に示す図である。図１３に示すように、無電荷のローダミンＢ２４は電界の影響を受けずに試料導入流路７からの導入方向である＋Ｘ側（下流側）に流動するが、負電荷を有するスルホローダミンＢ２５は、正極側に移動しつつ下流側に流動することが確認できた。
　図１４は、電極１５への印加電圧を０～８０Ｖまで１０Ｖ毎に変化させ試料の移動軌跡が安定したときの蛍光像であり、図１５は、試料の泳動距離（蛍光強度分布）を示す図である。図１４および図１５に示されるように、印加電圧の増加に伴ってローダミンＢの蛍光強度のピーク位置は変化しない一方で、スルホローダミンＢの蛍光強度のピーク位置は、正電極側に移動したことが観察された。
　印加電圧と両試料間のピーク間距離との関係を調べるために、蛍光強度プロファイルを解析した。
　蛍光強度分布が正規分布に従うと仮定してピーク分離を行い、双方のピーク位置から泳動距離を算出し、以下の式から分離度Ｒを求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 　上式において、ｄ（ｄ１、ｄ２）はピークとなるＹ方向の位置であり、Ｗ（Ｗ１、Ｗ２）は半値幅である。
　図１６は、印加電圧と試料の泳動距離の関係を示す図である。また、図１７は、印加電圧と試料の分離度の関係を示す図である。
図１６および図１７に示されるように、５０Ｖ以下の印加電圧では、泳動距離および分離度の双方が線形関係になっていることが確認された。
　一方で、５０Ｖより大きい印加電圧では泳動距離および分離度の双方が線形関係から外れることが確認できた。これはジュール熱の影響による可能性が考えられる。
この結果より、分離槽８に対して乱れのない電界が印加でき、５０Ｖまでの電圧範囲に対して電気泳動デバイスＤＶが良好な分離動作が行えていることが確認できた。
　また、グラフの傾き、印加電圧、電圧効率５５．４％および印加時間２９．５ｓであることから、スルホローダミンＢの電気泳動度が１．６×１０－８ｍ２Ｖ－１ｓ－１であると算出された。
　この電気泳動度から、以下のスモルコフスキーの式からゼータ電位ξを算出した。
ξ=η×μ/(ε0 ×εr)
ここで、ξはゼータ電位、ηは粘性率、ε0は真空の誘電率、εrは比誘電率である。リン酸緩衝液の粘性率、比誘電率が２５℃の水と同じ値であると仮定して、粘性率は、η=０．８９× １０－３ｋｇ／ｍ２ｓ、比誘電率は、εr=７８．５、真空の誘電率はε0=８．８５４×１０－１２ｍ－３ｋｇ－１ｓ４Ａ２であるため、スルホローダミンＢのゼータ電位はξ＝２０．５ｍＶ と算出された。
　以上説明したように、本実施形態では、分離層８と電極槽９（第２流路３０）との連通部に、イオン透過性を有するゲル材が隔壁１７として所定の接合強度で設けられているため、分離層８と電極槽９との間で緩衝液や気泡の移動することを防止でき、長時間に亘って安定して試料の電気泳動および分離動作を実施することが可能になる。特に、本実施形態では、ゲル材がハイドロゲルで形成されているため、第２基板２に化学結合して強固に接合され、分離槽８における試料および緩衝液の流動、あるいは第２流路における緩衝液の流動に伴う液圧が加わった場合でも、分離層８と第２流路３０との間での緩衝液や気泡の移動を長時間安定した遮断することが可能である。また、ハイドロゲルは、一旦、乾燥させた後でも試料の分離を実施する前に緩衝液を含侵させることで、機械的な欠陥を生じることなく、湿潤状態に戻すことが可能であるため、乾燥状態で保存しておくことが容易であり、例えば、医療現場では簡便な方法で保管することも可能である。
　また、本実施形態に係る電気泳動デバイスＤＶにおいては、試料回収部１０および試料回収流路１１のＹ方向の位置を試料の電気移動度に応じて適宜設定することにより、例えば、複数種類のエクソソームが混在する試料を用いた場合でも、各エクソソームの電気移動度に対応する試料回収部１０および試料回収流路１１に容易に分離して回収することも可能である。また、試料回収部１０および試料回収流路１１のＹ方向の位置が既定の電気泳動デバイスＤＶを用いる場合には、複数種類のエクソソームが十分に分離できる大きさの電圧を印加したり、あるいは、分離槽８における試料の流速を調整することも可能である。また、本実施形態では、第１基板１～第３基板３が合成樹脂材であるポリメタクリルスチレンで形成されているため、切削加工や射出成型等の方法で各種形状を容易に得ることができるとともに、製造に係るコストの低減も可能である。
［電気泳動デバイスＤＶの製造方法の変形例］
　次に、上述した電気泳動デバイスＤＶの製造方法の変形例に　ついて、図１８乃至図２１を参照して説明する。なお、上述した電気泳動デバイスＤＶの製造方法と同一の手順については、その説明を簡略化または省略する。
　本変形例の電気泳動デバイスＤＶの製造方法は、第１基板１および第２基板２を準備する工程、第２基板２の上面２ｂにマスク材２１を設ける工程、マスク材を設けた第２基板２に対して第２流路３０（電極槽９）にゲル化前のゲル材の溶液を導入する工程、ゲル材のゲル化後にマスク材２１を除去する工程、第２基板２に第１基板１および第３基板３を積層する工程を含む。
　上述したように、分離槽８、電極槽９、緩衝液導入流路６、試料導入流路７、試料回収流路１１、電極挿入口１４および貫通孔４ｂ、５ｂ、１０ｂを形成して準備した第２基板２をエタノールに浸漬し、超音波洗浄機を用いて１０分間洗浄した。その後、超純水で２度リンスをし、窒素ブローした第２基板２に対してジクロロエタンを３分間暴露した。その後、第２基板２に対して、図１８に示すように、酸素プラズマ処理を施す。
　次に、図１９に示すように、第２基板２の上面２ｂにマスク材２１を貼り付ける。次に、マスク材２１および上面２ｂが下側になるように第２基板２を反転させた後に、図２０に示すように、下面２ａに開口する電極槽９の開口部からピペット２０により、上述したゲル材の溶液を導入する。電極槽９に導入するゲル溶液の量は、一例として、ゲル化した隔壁１７が分離槽８の底面８ａと面一となる量である。ゲル溶液がゲル化すると、ゲル材が付着しないようにマスク材２１を剥離する。これにより、ゲル材で形成されて隔壁１７は、Ｚ側の一端が第２基板２の上面２ｂと面一に形成され、他端が底面８ａと面一に形成される。
　次に、上述した製造方法と同様に、前処理を実施した第３基板３を第２基板２と接着する。次いで、接着した第２基板２および第３基板３に対して第１基板１を接着する。図２１には、第２基板２の上面２ｂが上側になるように、再度反転した図が示されている。
　第１基板１は、図２１に示すように、隔壁１７と対向する位置に第２流路３０Ａとして、Ｘ方向に延びる溝が形成されている。第２流路３０Ａには、電極１５が電極挿入口１４から挿入されて収容される。
　本変形例の製造方法では、上記の製造方法と同様の作用・効果が得られることに加えて、第２流路３０Ａが第１基板１に形成され、分離槽８との距離が大きくなるため、分離槽８と第２流路３０Ａとの間での緩衝液および気泡の移動を遮断することが容易になる。
　以上、本発明の好ましい実施の形態について詳述したが、本発明はかかる特定の実施の形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲内に記載された本発明の要旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能である。
　１…第１基板（第２基材）、　２…第２基板（基材）、　３…第３基板（第３基材）、　８…分離槽（第１流路）、　９…電極槽、　１０…試料回収部、　１５…電極、　１７…隔壁、　３０、３０Ａ…第２流路、　４０…電圧調整部（調整部）、　６１…試料供給系、　６２…緩衝液供給系、　７０…試料回収系、　８０…第２緩衝液供給系、　９０…第２流路回収系、　１００…細胞外小胞体分離装置、　ＤＶ…電気泳動デバイス

Claims (13)

  1. 　第１方向に延び、試料および緩衝液が流動する第１流路と、
    　前記第１流路の端部に設けられ前記試料が回収される試料回収部と、
    　前記第１流路の前記第１方向と直交する第２方向の両側にそれぞれ配置され前記第１流路に前記第２方向に沿って電圧を印加する電極と、
    　前記第１流路の前記第２方向の両側にそれぞれ連通し前記電極を収容するとともに、第２緩衝液が流動する第２流路と、
    　前記第１流路と前記第２流路との連通部に所定の接合強度で固定され前記第１流路と前記第２流路との間の物体の移動を遮断する隔壁と、
    　を備え、
    　前記隔壁は、イオン透過性を有するゲル材で形成されている電気泳動デバイス。
  2. 　前記第１流路および前記第２流路は、基材に形成され、
    　前記ゲル材は、前記基材と化学的に結合している
    　請求項１記載の電気泳動デバイス。
  3. 　前記ゲル材は、ハイドロゲルであり、
    　前記基材は、合成樹脂である
    　請求項２記載の電気泳動デバイス。
  4. 　前記基材における前記第１方向および前記第２方向と直交する第３方向の一方側の面には、前記第２流路の開口部が設けられ、
    　前記基材における前記第３方向の他方側の面には、前記第１流路の開口部および前記第２流路の開口部が設けられ、
    　前記基材の前記一方側の面には、第２基材が積層されており、
    　前記基材の前記他方側の面には、第３基材が積層されている
    　請求項２または請求項３に記載の電気泳動デバイス。
  5. 　前記ゲル材は、前記緩衝液または前記第２緩衝液の液圧の大きさに応じた接合強度を有する請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の電気泳動デバイス。
  6. 　前記回収部は、前記電圧の印加による前記試料の移動度に基づいた前記第２方向の位置に配置される請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の電気泳動デバイス。
  7. 　請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の電気泳動デバイスと、
    　前記第１流路に細胞外小胞体を含む試料を供給する試料供給系と、
    　前記第１流路に前記緩衝液を供給する緩衝液供給系と、
    　前記試料回収部を介して前記試料を回収する試料回収系と、
    　前記第２流路の一端側に前記第２緩衝液を供給する第２緩衝液供給系と、
    　前記第２流路の他端側から前記第２流路内の物体を回収する第２流路回収系と、
    　前記電極により印加される前記電圧を調整する調整部と、
    　を備える細胞外小胞体分離装置。
  8. 　前記電圧の印加による前記細胞外小胞体の移動度を検出する検出装置を備える
    　請求項７記載の細胞外小胞体分離装置。
  9. 　第１方向に延び、試料および緩衝液が流動する第１流路と、前記第１流路の第２方向の両側にそれぞれ連通し、第２緩衝液が流動する第２流路とを備える基材を準備する工程と、
    　前記第１流路と前記第２流路との連通部に、前記第１流路と前記第２流路との間の物体の移動を遮断する隔壁として、イオン透過性を有するゲル材を所定の接合強度で固定する工程と、
    　を含む電気泳動デバイス製造方法。
  10. 　前記基材における前記第１方向および前記第２方向と直交する第３方向の一方側の面に、前記第２流路の開口部を設け、
    　前記基材における前記第３方向の他方側の面に、前記第１流路の開口部および前記第２流路の開口部を設け、
    　前記ゲル材を固定する工程は、前記他方側の面を下側にしたときの前記ゲル材と前記第１流路との境界にマスク材を設ける工程と、
    　前記他方側の面が下側の前記基材に対して、前記一方側の面の前記第２流路の開口部からゲル化前の前記ゲル材の溶液を導入する工程と、
    　前記ゲル材のゲル化後に、前記マスク材を除去する工程と、
    　を含む請求項９記載の電気泳動デバイス製造方法。
  11. 　前記基材における前記第１方向および前記第２方向と直交する第３方向の一方側の面に、前記第２流路の開口部を設け、
    　前記基材における前記第３方向の他方側の面に、前記第１流路の開口部および前記第２流路の開口部を設け、
    　前記ゲル材を固定する工程は、前記一方側の面にマスク材を設けて前記第２流路の開口部を閉塞する工程と、
    　前記一方側の面が下側の前記基材に対して、前記他方側の面の前記第２流路の開口部からゲル化前の前記ゲル材の溶液を導入する工程と、
    　前記ゲル材のゲル化後に、前記マスク材を除去する工程と、
    　を含む請求項９記載の電気泳動デバイス製造方法。
  12. 　前記ゲル材を固定する工程の前に、前記基材の表面をゲル化前の前記ゲル材の溶液に対して親液化する工程を含む請求項９から請求項１１のいずれか一項に記載の電気泳動デバイス製造方法。
  13. 　前記ゲル材を固定する工程の後に、前記基材の前記一方側の面に第２基材を積層し、前記基材の前記他方側の面に第３基材を積層する工程を含む請求項９から請求項１２のいずれか一項に記載の電気泳動デバイス製造方法。
PCT/JP2015/074497 2014-08-28 2015-08-28 電気泳動デバイス、電気泳動デバイス製造方法および細胞外小胞体分離装置 Ceased WO2016031980A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016545649A JP6730682B2 (ja) 2014-08-28 2015-08-28 電気泳動デバイス、電気泳動デバイス製造方法および細胞外小胞体分離装置
US15/503,215 US10429345B2 (en) 2014-08-28 2015-08-28 Electrophoresis device, method for manufacturing electrophoresis device, and device for separating extracellular vesicles

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462043149P 2014-08-28 2014-08-28
US62/043,149 2014-08-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016031980A1 true WO2016031980A1 (ja) 2016-03-03

Family

ID=55399862

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/074497 Ceased WO2016031980A1 (ja) 2014-08-28 2015-08-28 電気泳動デバイス、電気泳動デバイス製造方法および細胞外小胞体分離装置

Country Status (3)

Country Link
US (1) US10429345B2 (ja)
JP (1) JP6730682B2 (ja)
WO (1) WO2016031980A1 (ja)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021003392A1 (en) * 2019-07-02 2021-01-07 The Texas A&M University System Microfluidic platform for selective exosome isolation
CN113189067B (zh) * 2021-04-27 2023-04-25 浙江大学 一种细胞外囊泡的富集和检测方法及装置
CN113776919B (zh) * 2021-09-02 2022-07-15 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于正负电荷吸附原理的外泌体分离装置
WO2025059762A1 (en) * 2023-09-19 2025-03-27 Uti Limited Partnership Method and device for electroseparation of charged particles
CN119950371B (zh) * 2024-12-27 2025-09-02 齐鲁工业大学(山东省科学院) 肉苁蓉外泌体样纳米囊泡的制备方法及其在丰胸产品中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003066005A (ja) * 2001-08-23 2003-03-05 Kikuchi Jun 細胞の電気泳動方法及び装置
JP2004294334A (ja) * 2003-03-27 2004-10-21 Olympus Corp フリーフロー電気泳動素子、及びフリーフロー電気泳動法
WO2014030590A1 (ja) * 2012-08-24 2014-02-27 国立大学法人東京大学 エキソソームの分析方法、エキソソーム分析装置、抗体－エキソソーム複合体、及びエキソソーム電気泳動チップ

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0313197D0 (en) * 2003-06-09 2003-07-16 Imp College Innovations Ltd Free flow electrophoresis microchip, system and method

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003066005A (ja) * 2001-08-23 2003-03-05 Kikuchi Jun 細胞の電気泳動方法及び装置
JP2004294334A (ja) * 2003-03-27 2004-10-21 Olympus Corp フリーフロー電気泳動素子、及びフリーフロー電気泳動法
WO2014030590A1 (ja) * 2012-08-24 2014-02-27 国立大学法人東京大学 エキソソームの分析方法、エキソソーム分析装置、抗体－エキソソーム複合体、及びエキソソーム電気泳動チップ

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DIETMAR PUCHBERGER-ENENGL ET AL.: "Microfluidic concentration of bacteria by on-chip electrophoresis", BIOMICROFLUIDICS, vol. 5, 2011, pages 044111 *
JACOB W.ALBRECHT ET AL.: "Micro free-flow IEF enhanced by active cooling and functionalized gels,", ELECTROPHORESIS, vol. 27, 2006, pages 4960 - 4969 *
STETAN KOHLER ET AL.: "PDMS tree-flow electrophoresis chips with integrated partitioning bars for bubble segregation", LAB ON A CHIP, vol. 11, 2011, pages 309 - 314 *
YONG-AK SONG ET AL.: "Free-Flow Zone Electrophoresis of Peptides and Proteins in PDMS Microchip for Narrow pI Range Sample Prefractionation Coupled with Mass Spectrometry", ANAL CHEM., vol. 82, no. 6, 2010, pages 2317 - 2325 *

Also Published As

Publication number Publication date
US10429345B2 (en) 2019-10-01
US20170234832A1 (en) 2017-08-17
JP6730682B2 (ja) 2020-07-29
JPWO2016031980A1 (ja) 2017-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6230027B2 (ja) エキソソームの分析方法、エキソソーム分析装置、抗体−エキソソーム複合体、及びエキソソーム電気泳動チップ
Patabadige et al. Micro total analysis systems: fundamental advances and applications
US9494500B2 (en) Collection and concentration system for biologic substance of interest and use thereof
Kwak et al. Continuous-flow biomolecule and cell concentrator by ion concentration polarization
CN102725060B (zh) 流路装置以及包含流路装置的样品处理装置
Hu et al. Precise and non-invasive circulating tumor cell isolation based on optical force using homologous erythrocyte binding
KR102437408B1 (ko) 물질 봉입 방법 및 타깃 분자를 검출하는 방법
JP6730682B2 (ja) 電気泳動デバイス、電気泳動デバイス製造方法および細胞外小胞体分離装置
US20110081674A1 (en) Continuous-flow deformability-based cell separation
Rogers et al. Single-monomer formulation of polymerized polyethylene glycol diacrylate as a nonadsorptive material for microfluidics
JP2010540940A (ja) 動電学的な濃縮装置及びその使用方法
WO2007149111A2 (en) Continuous biomolecule separation in a nanofilter
JPWO2015029979A1 (ja) エキソソームの分析方法、エキソソーム分析チップ、及びエキソソーム分析装置
US20080067079A1 (en) Method of Analyzing Sample and Analyzing Apparatus
de los Santos‐Ramirez et al. Trends and challenges in microfluidic methods for protein manipulation—A review
JP6814474B2 (ja) 電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置
US10113948B2 (en) Particle detection method, particle detection device and particle detection system
WO2015163194A1 (ja) 細胞外小胞体分析チップ、細胞外小胞体分析方法、細胞外小胞体分析装置
EP3061807B1 (en) Membrane vesicle recovery device, membrane vesicle recovery method, and membrane vesicle analysis method
KR20140073051A (ko) 미세 채널을 이용한 세포 분리 장치
Nakajima et al. Detection and analysis of targeted biological cells by electrophoretic Coulter method
Evstrapov Micro-and nanofluidic systems in devices for biological, medical and environmental research
Kazoe et al. Nanofluidic Technologies for Drug Screening and Drug Delivery
Khodayaribavil Capillary-driven Microfluidic Biosensing Platforms for Digital Biomolecule Detection
Boutonnet et al. Check for updates Chapter 2

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15835196

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016545649

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15835196

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1