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WO2018048205A1 - 회전환 증폭 기반 분자 진단 방법 - Google Patents

회전환 증폭 기반 분자 진단 방법 Download PDF

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WO2018048205A1
WO2018048205A1 PCT/KR2017/009783 KR2017009783W WO2018048205A1 WO 2018048205 A1 WO2018048205 A1 WO 2018048205A1 KR 2017009783 W KR2017009783 W KR 2017009783W WO 2018048205 A1 WO2018048205 A1 WO 2018048205A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
target gene
template
beads
bead
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2017/009783
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English (en)
French (fr)
Inventor
이혁진
최보람
김지수
정일영
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ewha Womans University
Original Assignee
Ewha Womans University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ewha Womans University filed Critical Ewha Womans University
Publication of WO2018048205A1 publication Critical patent/WO2018048205A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6846—Common amplification features
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
    • C12Q2521/101—DNA polymerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/204—Modifications characterised by specific length of the oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/125—Rolling circle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/149—Particles, e.g. beads

Definitions

  • the present invention relates to a rotating circle amplification-based beads for detecting a target gene, a method for preparing the same, a composition for detecting a target gene using the same, a kit, and a method for detecting a target gene using the same.
  • the PCR process goes through three stages: denaturation, annealing, and elongation.
  • denaturation two strands of DNA are heated and separated. Each isolated DNA serves as a template.
  • primers bind to the template DNA.
  • the temperature in the binding step is an important factor in determining the accuracy of the reaction. If the temperature is too high, the primer binds too weakly to the template DNA, resulting in very little product amplified DNA. If the temperature is too low, unwanted primers can be amplified because the primers bind nonspecifically.
  • the kidney stage heat-resistant DNA polymerases make new DNA from template DNA.
  • substances such as DNA or RNA (hereinafter, referred to as 'target substances') that are subject to a PCR process are separated and purified by pretreatment of a sample containing a target substance.
  • pretreatment of a sample is performed by adsorbing a target material to the capture means by flowing the sample through a capture means, such as silica beads, and then rinsing the buffer buffer by the capture means to remove components other than the target material from the capture means, and then removing the elution buffer solution. This is achieved by separating the target substance flowing into the trapping means and adsorbed to the trapping means.
  • PCR-based system is difficult to use in an environment with limited resources, such as developing countries, because it requires a multi-step reaction and set and maintain a variety of temperature conditions as described above. That is, there are many limitations in PCR analysis because of the high cost and experimentation by well-trained analysts. Techniques such as ELISA can also be used to replace this, but have similar drawbacks to PCR for long analysis and limited antigen detection.
  • Rotating ring amplification is a single-stranded circular DNA as a template, and the polymerization is carried out isothermally using primers complementary thereto, so that the template DNA is continuously synthesized.
  • infinite rotation amplification and amplification on a first-order scale have the advantage of overcoming the disadvantages of PCR, which requires cumbersome thermal cycling and expensive equipment.
  • various new analytical methods performed by isothermal processes, including rotation amplification still require much research and development in terms of cost reduction and development into commercial devices that can be used by the public.
  • the present invention provides a DNA template comprising a binding site that complements a target gene, a binding site that complements a probe for binding to a bead, and a complementary binding site in a template to form a dumbbell form;
  • a probe complementarily hybridizing to the DNA template, wherein the marker bound to the binder of the bead is bound to the 5 ′ end;
  • It provides a bead for rotating circle amplification (Rolling Circle Amplification) based target gene detection comprising a bead comprising a binding agent that binds to the marker.
  • the present invention also provides a method for preparing beads for detecting the rolling circle amplification-based target gene.
  • the present invention also provides a target gene detection composition comprising the target gene detection beads, DNA polymerase, reaction buffer and dNTPs.
  • the present invention also provides a target gene detection kit comprising a rolling circle amplification-based target gene detection beads, a DNA polymerase, a reaction buffer solution and a target gene detection composition comprising dNTPs.
  • the present invention also provides a target gene detection method using the rotating circle amplification based target gene detection beads.
  • the present invention provides a rolling circle amplification-based target gene detection beads, a method for preparing the same, a composition, a kit comprising the same, and a detection method using the same.
  • a rolling circle amplification-based target gene detection beads a method for preparing the same, a composition, a kit comprising the same, and a detection method using the same.
  • the term “template” refers to a binding site (D) that complementarily binds to a target gene at one circular site in a dumbbell form, and a binding site (P) that complementarily binds to a probe for binding to beads at the opposite circular site. It refers to a nucleotide having a dumbbell shape having a binding site (S) in the template for forming a center dumbbell shape.
  • target gene refers to any nucleotide sequence that encodes a known or putative gene product.
  • the target gene may be a gene derived from an animal, a plant, a bacterium, a virus, a fungus, or the like, or a mutated gene accompanying a genetic disease.
  • the target gene may be DNA or RNA, for example, a nucleic acid sequence or molecule may be single or double stranded and may represent a sense or antisense strand.
  • the nucleic acid sequence is dsDNA, A-, B-, or Z-DNA, triple-stranded DNA, RNA, ssRNA made of dsDNA, ssDNA, mixed ssDNA, mixed dsDNA, ssDNA (eg, by fusion, denaturation, helicase, etc.) , dsRNAs, mixed ssRNAs and dsRNAs, dsRNAs made from ssRNAs (eg, via fusion, denaturation, helicase, etc.), messenger RNAs (mRNAs), ribosomal RNAs (rRNAs), transfer RNAs (tRNAs), catalytic RNAs, snRNAs, micros RNA, or protein nucleic acid (PNA).
  • mRNAs messenger RNAs
  • rRNAs ribosomal RNAs
  • tRNAs transfer RNAs
  • catalytic RNAs snRNAs
  • micros RNA micros RNA, or
  • combination site that binds complementarily or “complementary binding site” refers to a site capable of forming complementary base pairs between nucleotide sequences.
  • the term “bead” refers to a material having a spherical substrate and includes nanoparticles, microparticles, nanobeads, or microbeads.
  • the beads may have a diameter of 2 ⁇ m to 7 ⁇ m, specifically the diameter of the particles or beads is 4 ⁇ m to 5 ⁇ m.
  • Beads include resin beads, magnetic beads, metal fine particles and the like.
  • probe refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA, which corresponds to a few bases to several tens of bases, which can achieve specific binding with a nucleotide sequence. All probes, which may be bound to a marker, and are capable of binding to binding sites that complementarily bind to probes for binding to beads in a template, are all within the scope of the present invention.
  • labeler is not limited to any of the various materials known in the art without limitation as long as it can be used to pair with a label for binding to a gene label, preferably a bead, without disturbing the hybridization of the probe with the gene product. Can be used.
  • binding agent is a substance that recognizes and binds a marker without interfering with the hybridization of the gene product.
  • binding agent is not limited as long as it is easy to bind to beads and has high binding ability with the marker, and various materials known in the art. Can be used.
  • conversion amplification refers to a single-stranded circular DNA as a template, and to perform the polymerization at isothermal temperature using a complementary probe, so that the template DNA is continuously synthesized.
  • sample includes, but is not limited to, samples such as tissues, cells, blood, serum, or plasma.
  • the term “detection”, “detection” or “diagnosis” refers to the identification of the presence or characteristic of the target gene, and thus the pathological state.
  • the present invention provides a DNA template comprising a binding site that complements a target gene, a binding site that complements a probe for binding to a bead, and a complementary binding site in a template to form a dumbbell form;
  • a probe complementarily hybridizing to the DNA template, wherein the marker bound to the binder of the bead is bound to the 5 ′ end;
  • It provides a bead for rotating circle amplification (Rolling Circle Amplification) based target gene detection comprising a bead comprising a binding agent that binds to the marker.
  • the rotating circle amplification-based target gene detection beads according to the present invention have a characteristic of not drying by capturing water molecules through hydrophilic properties by forming a DNA hydrogel while rotating ring amplification proceeds in the presence of a target gene. .
  • the target gene can be quickly identified by visually confirming the volume change, confirming the aggregation of DNA strands, confirming the color change by staining or fluorescence, confirming the viscosity change, confirming the change in the degree of aggregation of the beads, and confirming the change in the sedimentation degree of the beads. Detection is possible.
  • Rolling circle amplification based target gene detection beads are prepared by immobilization on beads after hybridization of the template and probe.
  • the rolling circle amplification-based target gene detection beads form a hydrogel by entanglement while forming long DNA strands while cyclic amplification is performed simultaneously with ligation in the presence of a target gene.
  • the template may have various lengths and lengths in consideration of the length of a target gene such as a gene derived from an animal, a plant, a virus, a bacterium, a pathogen, a length of a mutated gene accompanying a genetic disease, a length of a primer, and the like. Sequences can be designed.
  • the template may have a length of 40 to 160 mer. If the length of the template is too short, the template itself may become unstable and if too long, the RCA efficiency may decrease.
  • the template according to the present invention comprises a binding site (D) that binds complementarily with the target gene.
  • a binding site that complementarily binds to the target gene is formed separately at both ends of the template.
  • the template may comprise a binding site of 5 to 50 mer, preferably 15 to 25 mer in length.
  • the target gene to be detected of the present invention is present in or derived from animals, plants, bacteria, viruses, fungi, etc., preferably present in genetic material including mRNA, dsDNA, and cDNA, mutated genes involved in genetic diseases Or derived therefrom.
  • the target gene to be detected may be, for example, a pathogen gene.
  • the target gene can be targeted to any pathogen that knows the nucleic acid sequence.
  • the pathogen is avian influenza, Dermalogica virus, E. coli and SARS (SARS), hemolytic uremic syndrome (hemolytic uremic syndrome) and hematochezia (bloddy diarrhea) (Escherichia coli O157 : H7), tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis), anthrax (Bacillus anthracis ), Pneumonia ( Streptococcus pneumonia ), malaria (Plasmodium), Salmonella, Hepatitis (Hepatitis A, B, C, D and E virus), Yattobacteria ( Francisella) tularensis ), Yersinia pestis ), Yersinia enterocolitica , Ebola virus, MERS-Cov virus, pneumococcal, enterococci, staphylococcus
  • the template according to the invention comprises a binding site (P) which complementarily binds to a probe for binding to the beads.
  • a binding site that complementarily binds to the probe for binding to the gastric beads is formed between complementary binding sites in the template to form a dumbbell shape.
  • the template may comprise a binding site that complementarily binds to a probe for binding to beads of 5 to 50 mer, preferably 10 to 25 mer in length.
  • the binding site that complementarily binds to the probe for binding to the beads may be used as long as the marker that binds to the binding agent of the bead can complementarily bind to the probe bound to the 5 'end without interfering with the detection of the target gene. It is possible.
  • the template according to the invention comprises complementary binding sites (S) in the template for forming a dumbbell shape.
  • Complementary binding sites in the template for forming the stomach dumbbell form the target gene at the opposite end from the binding site that complements the probe for binding to the beads Dumbbell forms through complementary binding in the sequence to include a binding site that binds complementarily with.
  • the template has a total length of 40 to 160 mer
  • the complementary binding site S in the template for forming the dumbbell shape has a total of 10 to 80 mer length, and preferably 15 for forming the dumbbell shape.
  • Complementary binding sites (self-assembled binding sites) of about 40 to 40 mer in length.
  • Table 1 below shows the sequence of the DNA template comprising a binding site that complements the target gene, a binding site that complements the probe for binding to the beads and a complementary binding site in the template to form a dumbbell form Exemplary (bold: binding site that complements the target gene complementarily, light gray background: complementary binding site in the template to form a dumbbell form, dark gray background: complementary to the probe for binding to the beads Binding site).
  • the rolling circle amplification-based target gene detection beads according to the present invention include a probe complementarily hybridizing to the DNA template in which the marker bound to the binder of the beads is bound to the 5 ′ end.
  • the probe sequence may be used as long as the sequence binds to a binding site that complements the probe of the template and does not interfere with the detection of the target gene.
  • the sequence of SEQ ID NO: 25 is used.
  • the marker and the binder of the beads may be a pair of different and complementary molecules, for example biotin, preferably as a marker, and streptavidin, avidin, neutravidin as binders, preferably binding agents to the bead surface.
  • biotin preferably as a marker
  • streptavidin avidin
  • neutravidin as binders
  • binding agents to the bead surface preferably binding agents to the bead surface.
  • Captavidin, polystreptavidin or any other protein capable of binding to biotin can be used.
  • Rolling circle amplification based target gene detection beads includes a bead comprising a binding agent to the marker.
  • the beads may assist in entanglement of the DNA strands as the rotation amplification proceeds depending on the presence of the target gene. Accordingly, by forming the DNA hydrogel, it may be helpful to check the volume change of the naked eye, the aggregation or the fluorescence change according to the RCA reaction.
  • the beads hybridize to the template via a probe in which a binder that binds to the marker is bound to the surface of the bead so that the marker that binds to the binder of the beads complementarily hybridizes to the DNA template bound to the 5 ′ end.
  • the beads are spherical substrates and include nanoparticles, microparticles, nanobeads or microbeads, preferably magnetic beads.
  • the present invention also provides a method for preparing beads for detecting the rolling circle amplification-based target gene.
  • a DNA template comprising a binding site that complements a target gene, a binding site that complements a probe for binding to a bead, and a complementary binding site in a template to form a dumbbell form Hybridizing a marker bound to the binder of the beads with a probe complementarily hybridizing to the DNA template bound to the 5 'end;
  • step (b) providing a method for producing beads for rotating circle amplification-based target gene detection comprising immobilizing a template hybridized with a probe to a bead comprising a binder that binds to a marker in step (a). do.
  • composition for detecting a target gene comprising the rolling circle amplification-based target gene detection beads, DNA polymerase, reaction buffer and deoxynucleotides (dNTPs).
  • the DNA polymerase according to the present invention is selected from the group consisting of E. coli DNA polymerase I, Klenow fragment, phi29 DNA polymerase, vent DNA polymerase, T4, T7 DNA polymerase, Taq polymerase and Splint R polymerase. It may be.
  • the buffer (buffer) is NEB (New England Biolab) buffer series, such as NEB buffer 4, Bst DNA polypolymerase buffer, T4 DNA ligase buffer, T7 DNA ligase buffer Solutions, Splint R ligase buffer, and the like can be used, but is not limited thereto.
  • NEB New England Biolab
  • composition for detecting a target gene may further include a dyeing reagent and a fluorescent reagent to help visually identify the amplified gene product.
  • a dyeing reagent for example, gel-red and trypane blue die may be used.
  • dyes Evans Blue dyes, hematoxylin-eosin stains, crystal violet or methylene blue, but are not limited thereto.
  • the present invention also provides a kit for detecting a target gene comprising a composition for detecting a target gene comprising the rolling circle amplification-based target gene detection beads, a DNA polymerase, a reaction buffer, and dNTPs.
  • the target gene detection kit has a characteristic that the beads do not dry by capturing water molecules through hydrophilic properties by forming a DNA hydrogel while the ring amplification proceeds in the presence of the target gene.
  • the target gene can be rapidly identified by visually confirming the volume change, confirming the aggregation of DNA strands, confirming the color change by staining or fluorescence, confirming the viscosity change, confirming the change of the degree of aggregation of the beads, and confirming the change of the sedimentation degree of the beads. Detection is possible.
  • the kit for detecting a target gene according to the present invention may be a kit including essential elements necessary for performing rotation ring amplification.
  • the target gene detection kit according to the present invention may be used in a capillary tube by packing the rotating circle amplification-based target gene detection beads into a capillary tube using a capillary phenomenon. More specifically, the manufactured detection beads may be packed in a capillary tube using a capillary phenomenon, and the detection bead may be performed through a rotation ring amplification reaction in the capillary tube after blocking the lower portion of the capillary tube so that the detection beads do not escape from the capillary tube.
  • kits may further comprise staining reagents or fluorescent reagents to more reliably confirm the presence or absence of a target gene.
  • the present invention also provides a target gene detection method using the rotating circle amplification based target gene detection beads.
  • a DNA template comprising a binding site that complements a target gene, a binding site that complements a probe for binding a bead, and a complementary binding site in a template to form a dumbbell form;
  • a probe complementarily hybridizing to the DNA template, wherein the marker bound to the binder of the bead is bound to the 5 ′ end;
  • target beads including a rotating circle amplification-based target gene detection beads, DNA polymerase, reaction buffer, and deoxynucleotides (dNTPs). Reacting the sample with the composition;
  • dNTPs deoxynucleotides
  • It provides a target gene detection method comprising; (b) confirming the gene amplification by performing a rotation ring amplification in response to the sample.
  • step (a) may be carried out in a capillary tube, and accordingly, in step (b), visually confirm the volume change, confirm the aggregation of DNA strands, confirm the color change by staining or fluorescence, confirm the viscosity change, The presence or absence of the target gene can be confirmed by confirming the change in the degree of aggregation of the beads and the change in the degree of sedimentation of the beads.
  • the target gene detection method can detect a target gene quickly and easily through a reaction at a constant temperature even without a device for temperature change.
  • the rolling circle amplification-based target gene detection beads of the present invention have an advantage of detecting genes such as viruses, bacterial infections, and cancer at a low price by detecting genes quickly and easily.
  • Figure 1 shows a schematic diagram of the process of forming a long DNA strand in the beads in the presence of the target circle for rotating circle amplification (Rolling Circle Amplification) target gene detection.
  • Figure 2 shows a schematic diagram of a dumbbell-shaped template according to the present invention.
  • Figure 3 shows a schematic diagram of target gene detection using a capillary tube containing beads for rotating circle amplification-based target gene detection.
  • Figure 4 shows the overall schematic diagram of the template for the analysis of the target gene cyclic amplification-based molecular diagnostic method according to the present invention, the preparation of beads, the preparation of a solution for the cyclic amplification reaction, packing and diagnostic methods.
  • 5 shows a schematic of hybridization between biotinylated probes and templates.
  • Figure 6 E.Coli having ampicillin resistance according to an embodiment of the present invention The hybridization of the template and biotinylated probe that can bind to the gene is shown through electrophoresis.
  • FIG. 7 shows a schematic diagram of a process for preparing beads for detecting target genes based on rolling circle amplification through immobilization of biotinylated probes and hybridized templates on the bead surface.
  • Figure 8 shows the electrophoresis results showing that the template and biotinylated probes bindable to E.Coli pathogens having ampicillin resistance in accordance with an embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a diagram showing E. ampicillin resistance using a rotating circle amplification-based target gene detection beads comprising a template capable of binding to the E.Coli gene having ampicillin resistance according to an embodiment of the present invention. The result of detecting Coli is shown.
  • FIG. 11 shows a result of detecting Zika virus using a rotating circle amplification-based target gene detection beads including a template capable of binding to Zika virus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 shows a schematic diagram of packing a rotating circle amplification-based target gene detection bead into a capillary tube through a capillary phenomenon and visually observing it.
  • FIG. 13 E.Coli having ampicillin resistance according to an embodiment of the present invention The result of visually confirming the presence of E.Coli having ampicillin resistance by using a capillary packed with a rolling circle amplification-based target gene detection bead containing a template capable of binding to a gene is shown.
  • FIG. 14 shows a long tandem RCA product formed by rotating ring amplification in capillaries packed with target gene detection beads, and the resulting DNA products are entangled with each other by physical entanglement. Accordingly, when the capillary is inverted, the degree of dropping of the amplification mixture including the beads is different due to gravity, and when the amplification occurs, the amplification mixture does not flow due to entanglement.
  • FIG. 15 illustrates a gene using a capillary packed with a bead-packed bead-based target gene detection capillary including a template capable of binding to an E. Coli gene having ampicillin resistance according to an embodiment of the present invention. Indicates the presence or absence of the result by fluorescence.
  • Template_Zika virus is a template for forming a binding site that complements a target gene (the pathogen gene of Zika virus), that is, a complementary site of a pathogen (Pathogen complementary site (SEQ ID NOs: 9, 20 mer, bold), and a dumbbell shape).
  • Template_Ampicillin resistant E.coli ie, template that specifically binds to E.Coli with ampicillin resistance, based on the E.Coli gene sequence with Ampicillin resistance (Template_Ampicillin resistant E. coli, SEQ ID NO: 2) was prepared.
  • Template_Ampicillin resistant E. coli is a binding site that complementarily binds to a target gene (the pathogen gene of E.
  • coli ie, the pathogen complementary site (SEQ ID NO: 13, 23 mer, bold), Complementary binding sites in the template to form a dumbbell shape, ie, complementary regions in the template (SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, total 47 mer, light gray background), which complementarily bind to the probe for binding to the beads Consisting of binding sites (SEQ ID NOs: 16, 17 mer, dark gray background).
  • FIG. 5 A schematic diagram of the preparation of a template hybridized with a marker bound (eg biotin) probe is shown in FIG. 5.
  • a marker bound probe eg biotin
  • Example 2 Bead On the surface Biotinylated With probe Hybridized Template Through immobilization A rotary ring Preparation of Beads for Detection of Targeting Circle Amplification
  • the template hybridized with the biotinylated probe prepared in Example 1 was fixed to the magnetic beads, thereby immobilizing the template on the magnetic beads.
  • a schematic diagram of the above immobilization step is shown in FIG. 7.
  • the binder (eg streptavidin) beads were discarded by centrifugation after Vortexing, and the supernatant was discarded, and the mixed template with the probe prepared in Example 1 was kept at room temperature for about 15 minutes. Immobilize the template on the beads.
  • the target gene was detected using the rotating ring amplification-based target gene detection beads prepared in Example 2.
  • a schematic diagram of the above detection step is shown in FIG. 9. Complementary binding of the target gene detection beads to the spin ring amplification of the target gene results in the formation of a closed form dumbbell-shaped template by the enzyme T4 ligase. Long strands of DNA strands are formed.
  • ligation of 10 uM Zika virus RNA pathogen (SEQ ID NO: 5, Bioneer) was carried out simultaneously using ligation and rolling circle amplification (RCA) reaction using a beta-based target gene detection beads.
  • FIG. 10 shows the detection results for ampicillin resistant E. coli. As shown in FIG. 10, it was confirmed that the target gene was detected by the reaction of the gel well by the long DNA strand formation and entanglement through amplification (SP), and the product produced over time was confirmed to be large. . In addition, it was confirmed that the amplification was not performed even if the target gene exists in the bead (NC) to which the non-target template was fixed, and the target gene was detected using the rotating ring amplification-based target gene detection beads of the present invention. It became.
  • Example 3 a mixture of the mixed solution in the tube and the rotating ring amplification-based target gene detection beads (for detecting ampicillin-resistant E. coli) was packed onto a capillary tube using capillary action and lysed at 25 ° C for 15 minutes. The gate and the RCA (rolling circle amplification) reaction were performed at the same time, and then the capillary tube was turned upside down. Then, the detection of the target gene was visually confirmed by aggregation of the magnetic beads in the control group and the sample group. For reference, a schematic diagram of the above process is shown in FIG. 12.
  • Figure 13 shows the detection results for ampicillin resistant E. coli.
  • hydrophilic long-stranded DNA strands formed by spin ring amplification do not trap water molecules and are dried and maintained in volume, while long-stranded DNA strands are not formed if spin ring amplification does not proceed. It was found that it did not form and was easily dried to reduce volume (NC). That is, the target gene was detected by visually confirming the volume change.
  • the target gene was detected by confirming aggregation and fluorescence changes through entanglement of DNA strands as in FIGS. 14 and 15.
  • FIG. 14 shows a long tandem RCA product formed by rotating ring amplification in capillaries packed with target gene detection beads, and the resulting DNA products are entangled with each other by physical entanglement. Accordingly, when the inverted capillary is inverted, the degree of dropping of the amplification mixture including the beads is changed by gravity, and when the amplification occurs, the amplification mixture does not flow due to entanglement.
  • FIG. 15 shows the presence of the gene in the capillary packed with beads for target gene detection based on rolling circle amplification comprising a template capable of binding to the E.Coli gene having ampicillin resistance according to an embodiment of the present invention. It is the result of confirming the presence or absence by fluorescence. As a result of the rotational amplification in the presence of the pathogen gene, a long strand of DNA was produced, and its presence was confirmed by fluorescence using SYBR dye (eg, SYBR gold) (SP-Sample, NC-Negative control). )).
  • SYBR dye eg, SYBR gold

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Abstract

본 발명은 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드, 이의 제조방법, 이를 이용한 표적 유전자 검출용 조성물, 키트 및 이를 이용한 표적 유전자 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 빠르고 간편하게 유전자를 검출하여 바이러스, 세균성감염, 암과 같은 질환을 저렴한 가격으로 빠르게 진단할 수 있다.

Description

회전환 증폭 기반 분자 진단 방법
본 발명은 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드, 이의 제조방법, 이를 이용한 표적 유전자 검출용 조성물, 키트 및 이를 이용한 표적 유전자 검출 방법에 관한 것이다.
지금까지 유전자를 검출하는 기술은 PCR 방법을 기초로 하는 방법들이 주로 보고되어 왔다. PCR 공정은 변성(denaturation), 결합(annealing), 신장(elongation)으로 이루어지는 3 단계를 거치게 된다. 첫 번째 단계인 변성 단계에서는 두 가닥의 DNA가 가열되어서 분리된다. 분리된 각각의 DNA는 주형(template)으로서 역할을 하게 된다. 두 번째 단계인 결합 단계에서는 프라이머(primer)들이 주형 DNA에 결합을 하게 된다. 결합 단계에서의 온도는 반응의 정확성을 결정하는 중요한 요소인데 만약 온도를 너무 높게 하면 시발체가 주형 DNA에 너무 약하게 결합되어서 증폭된 DNA의 산물이 매우 적어진다. 또 만약 온도를 너무 낮게 하면 시발체가 비특이적으로 결합하기 때문에 원하지 않는 DNA가 증폭될 수 있다. 세 번째 단계인 신장 단계에서는 열에 강한 DNA 중합 효소가 주형 DNA에서 새로운 DNA를 만들게 된다. 일반적으로 PCR 공정의 대상이 되는 DNA나 RNA와 같은 물질(이하, '표적 물질'이라 함)은 표적 물질을 포함하는 시료에 대한 전처리를 통해 분리, 정제된다. 일반적으로 시료에 대한 전처리는 시료를 실리카 비드와 같은 포획 수단으로 흘려서 표적 물질을 포획 수단에 흡착시키고, 포획 수단으로 세척 버퍼액을 흘려서 표적 물질을 제외한 성분을 포획 수단으로부터 제거한 후, 용리 버퍼액을 포획 수단으로 흘려서 포획 수단에 흡착된 표적 물질을 분리함으로써 이루어지고 있다.
위와 같은 PCR 기반 시스템은 위 살핀 바와 같이 여러 단계의 반응이 필요하고 다양한 온도 조건 설정 및 유지가 필요하기 때문에 개발도상국 등의 제한된 리소스를 가진 환경에서 사용이 어려운 문제점이 있다. 즉, 값비싼 비용이 필요하고 잘 교육된 분석가에 의한 실험이 필요하기 때문에 PCR을 이용한 분석에는 제한 사항이 많이 있다. 또한 이를 대체하기 위해 ELISA와 같은 기술들이 사용될 수 있으나 긴 분석 과정과 제한된 항원 검출에 있어서 PCR과 유사한 단점을 가진다.
이러한 배경 하에 증진된 감도 및 산업적 적용가능성을 가진 새로운 진단 플랫폼에 대한 연구 개발이 이루어지고 있다. 예를 들어, 최근에는 회전환 증폭 (Rolling circle amplification; 이하 RCA라고도 함)이 다양한 연구 분야에서 이용되고 있다. 회전환 증폭은 단일가닥 환형 DNA를 주형으로 하고, 여기에 상보적인 프라이머를 사용하여 등온에서 중합반응을 수행하여, 주형 DNA가 연속적으로 합성되도록 하는 것이다. 등온, 상온 조건에서 프로브와 annealing 후 무한 회전 증폭을 하게 되며 일차 함수 스케일로 증폭하기 때문에, 번거로운 thermal cycling 및 값비싼 장비가 필요한 PCR의 단점을 극복할 수 있다는 장점이 있다. 그런데 회전환 증폭을 비롯하여 등온 과정으로 수행되는 다양한 신규 분석 방법들은 비용 절감 및 대중이 사용할 수 있는 상업적 기기로의 개발 측면에서 여전히 많은 연구 개발이 필요한 실정이다.
더욱이, 질병에 초기 대처 및 질병의 진행, 확산을 막기 위해서는 질병을 일으키는 인자에 대한 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단하는 것이 필요하다. 감염 후 증상이 나타나기 전에 질환을 진단할 수 있다면 질환의 진행을 효과적으로 예방하여 큰 피해를 막을 수 있다. 이에 따라, 검출 비용과 시간을 절감하면서도 간편하고 정확하게 표적 유전자를 육안으로도 확인할 수 있는 새로운 방법의 개발이 요구되고 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
대한민국 공개공보 제2016-0034305호
[비특허문헌]
이혁진 등, Advanved Materials. Volume.27, Issue.23, 35133517 (2015. 6. 17.)
본 발명은 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위, 비드에 결합을 위한 프로브에 상보적으로 결합하는 결합 부위 및 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위를 포함하는 DNA 템플레이트;
비드의 결합제에 결합되는 표지자가 5’말단에 결합된 상기 DNA 템플레이트에 상보적으로 혼성하는 프로브; 및
상기 표지자와 결합하는 결합제를 포함하는 비드;를 포함하는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 표적 유전자 검출용 비드, DNA 중합효소, 반응 완충용액 및 dNTPs를 포함하는 표적 유전자 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드, DNA 중합효소, 반응 완충용액 및 dNTPs를 포함하는 표적 유전자 검출용 조성물을 포함하는 표적 유전자 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드를 이용하는 표적 유전자 검출 방법을 제공한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드, 이의 제조 방법, 이를 포함하는 조성물, 키트 및 이들을 이용한 검출 방법을 제공한다. 이하에서는 각각의 발명에 대하여 상세히 살펴본다.
본 발명에서 용어 “템플레이트”란 덤벨 형태의 한쪽 원형 부위에 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위(D), 반대쪽 원형 부위에 비드에 결합을 위한 프로브에 상보적으로 결합하는 결합 부위(P)를 가지며, 가운데 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위(S)를 가지는 덤벨 형태를 가지는 뉴클레오티드를 지칭한다.
본 발명에서 용어 "표적 유전자"는 공지 또는 추정 유전자 산물을 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 표적 유전자는 동물, 식물, 세균, 바이러스,진균 등으로부터 유래되는 유전자, 또는 유전 질환에 수반되는 돌연변이된 유전자 등일 수 있다. 본 발명에서 표적 유전자는 예컨대 핵산 서열 또는 분자는 단일 또는 이중 가닥일 수 있고 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낼 수 있는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 따라서 핵산 서열은 dsDNA, ssDNA, 혼합 ssDNA, 혼합 dsDNA, ssDNA(예컨대, 융해, 변성, 헬리케이즈 등에 의해)로 만들어진 dsDNA, A-, B-, 또는 Z-DNA, 삼중-가닥 DNA, RNA, ssRNA, dsRNA, 섞인 ssRNA 및 dsRNA, ssRNA(예컨대, 융해, 변성, 헬리케이즈 등을 통해)로 만들어진 dsRNA, 메신저 RNA(mRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 전달 RNA(tRNA), 촉매 RNA, snRNA, 마이크로RNA, 또는 단백질 핵산(PNA)일 수 있다.
본 발명에서 용어 “상보적으로 결합하는 결합 부위” 또는 “상보적인 결합 부위”는 뉴클레오티드 서열 간에 상보적 염기쌍을 형성할 수 있는 부위를 지칭한다.
본 발명에서 용어 “비드(Bead)”는 구형의 기재를 가진 물질로 나노입자, 마이크로입자, 나노비드 또는 마이크로 비드를 포함한다. 비드는 2 μm 내지 7 μm의 직경을 가질 수 있으며，구체적으로 상기 입자 또는 비드의 직경은 4 μm 내지 5 μm이다. 비드는 수지 비드, 자기 비드, 금속 미립자 등을 포함한다.
본 발명에서 용어 “프로브”는 뉴클레오티드 서열과 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수십 개 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 표지자와 결합되어 있을 수 있으며, 어떤 서열의 프로브라도 템플레이트 내 비드에 결합을 위한 프로브에 상보적으로 결합하는 결합 부위에 결합 가능하다면 모두 본원 발명의 범주에 포함된다.
본 발명에서 용어 “표지자”는 프로브와 유전자 산물과의 교잡을 방해하지 않고 유전자 표지, 바람직하게 비드에 결합하기 위한 결합제와 쌍을 이루기 위해 사용할 수 있는 것이라면 한정되지 않고 당업계에 공지된 다양한 물질을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 “결합제”는 유전자 산물과의 교잡을 방해하지 않고 표지자를 인지하여 결합하는 물질로 바람직하게 비드에 결합이 용이하고 표지자와 높은 결합능을 가지는 것이라면 한정되지 않고 당업계에 공지된 다양한 물질을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 “회전환 증폭”이란 단일가닥 환형 DNA를 주형으로 하고, 여기에 상보적인 프로브를 사용하여 등온에서 중합반응을 수행하여, 주형 DNA가 연속적으로 합성되도록 하는 것을 지칭한다.
본 발명에서 용어 “시료”란 조직, 세포, 혈액, 혈청 또는 혈장과 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 “검출”, “탐지” 또는 “진단”이란 표적 유전자의 유무, 이에 따른 병리 상태의 존재 또는 특징에 대한 확인을 지칭한다.
본 발명은 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위, 비드에 결합을 위한 프로브에 상보적으로 결합하는 결합 부위 및 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위를 포함하는 DNA 템플레이트;
비드의 결합제에 결합되는 표지자가 5’말단에 결합된 상기 DNA 템플레이트에 상보적으로 혼성하는 프로브; 및
상기 표지자와 결합하는 결합제를 포함하는 비드;를 포함하는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드를 제공한다.
본 발명에 따른 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드는 표적 유전자 존재 시 회전환 증폭이 진행되면서 DNA hydrogel을 형성하여 hydrophilic한 성질을 통해 물 분자를 포획하여 건조되지 않는 특성을 가진다. 이러한 특성을 이용하여 예컨대 육안으로 부피 변화의 확인, DNA 가닥의 응집 확인, 염색이나 형광에 의한 색깔 변화 확인, 점도 변화 확인, 비드의 뭉침 정도 변화 확인, 비드의 침강정도 변화 확인으로 표적 유전자의 빠른 검출이 가능하다.
이러한 본 발명에 따른 표적 유전자의 빠른 검출에 대해서는 도 1에 모식도로 나타내었다. 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드는 템플레이트와 프로브의 혼성화 후 비드에 고정시켜 제조된다. 이러한 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드는 표적 유전자 존재 시 라이게이션과 동시에 회전환 증폭이 수행되면서 긴 DNA 가닥을 형성하면서 엉김으로써 hydrogel을 형성하게 된다.
본 발명에 따른 덤벨 형태의 템플레이트의 모식도는 도 2에 나타내었다. 본 발명에 따르면, 상기 템플레이트는 표적 유전자, 예컨대 동물, 식물, 바이러스, 세균, 병원균으로부터 유래되는 유전자의 길이, 유전 질환에 수반되는 돌연변이된 유전자의 길이, 프라이머의 길이 등을 고려하여 다양하게 길이와 서열을 디자인할 수 있다. 예를 들어, 상기 템플레이트의 길이는 40 내지 160 머(mer)일 수 있다. 상기 템플레이트의 길이가 너무 짧으면 템플레이트 자체가 불안정해지며 너무 길면 RCA 효율이 감소 할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 템플레이트는 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위(D)를 포함한다. 위 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위는 템플레이트의 양 말단에 분리되어 형성된다. 예를 들어, 템플레이트는 5 내지 50 mer, 바람직하게 15 내지 25 mer 길이의 결합부위를 포함할 수 있다. 본 발명의 검출하고자 하는 표적 유전자는 동물, 식물, 세균, 바이러스, 진균 등에 존재하거나 이로부터 유래되는 것으로 바람직하게는 mRNA, dsDNA, 및 cDNA 를 포함한 유전자 물질, 유전 질환에 수반되는 돌연변이된 유전자에 존재하거나 이로부터 유래되는 것일 수 있다.
상기 검출하고자 하는 표적 유전자는 예를 들어 병원균 유전자일 수 있다. 상기 표적 유전자로는 핵산 서열을 아는 모든 병원균을 대상으로 할 수 있다. 예컨대, 상기 병원균은 조류독감, 지카 바이러스, 대장균, 사스(SARS), 용혈성 요독 증후군(hemolytic uremic syndrome) 및 혈변(bloddy diarrhea)(Escherichia coli O157:H7), 결핵(Mycobacterium tuberculosis), 탄저병(Bacillus anthracis), 폐렴(Streptococcus pneumonia), 말라리아(Plasmodium), 살모넬라(Salmonella), 간염(Hepatitis A,B,C,D 및 E virus), 야토병균(Francisella tularensis), 페스트균(Yersinia pestis), 에르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 출혈열(Ebola virus), 메르스 코로나 바이러스(MERS-Cov virus), 폐렴상구균, 장내구균, 포도상구균, 열대열원충, 및 결핵 또는 말라리아 박테리아와 같은 항생제 저항을 가지는 균주로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 템플레이트는 비드에 결합을 위한 프로브에 상보적으로 결합하는 결합 부위(P)를 포함한다. 위 비드에 결합을 위한 프로브에 상보적으로 결합하는 결합 부위는 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위 사이에 형성된다. 예를 들어, 템플레이트는 5 내지 50 mer, 바람직하게는 10 내지 25 mer 길이의 비드에 결합을 위한 프로브에 상보적으로 결합하는 결합 부위를 포함할 수 있다. 비드에 결합을 위한 프로브에 상보적으로 결합하는 결합 부위는 표적 유전자 검출을 방해하지 않고 비드의 결합제에 결합되는 표지자가 5’말단에 결합된 프로브와 상보적으로 결합할 수 있는 것이라면 어떠한 것이라도 사용가능하다.
본 발명에 따른 상기 템플레이트는 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위(S)를 포함한다. 위 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위는 덤벨 형태 양 말단, 즉 원형 형태를 가지는 한쪽 말단의 템플레이트는 비드에 결합을 위한 프로브에 상보적으로 결합하는 결합 부위와 반대 쪽 말단의 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위를 포함할 수 있도록 서열 내에서 상보적 결합을 통해 덤벨 형태를 형성한다. 예를 들어, 템플레이트는 총 40 내지 160 mer 길이를 가지며, 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위(S)는 총 10 내지 80 mer 길이를 가지며, 바람직하게는 덤벨 형태를 형성하기 위한 15 내지 40 mer 길이의 상보적인 결합 부위(자기조립 결합부위)를 포함할 수 있다.
하기 표 1은 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위, 비드에 결합을 위한 프로브에 상보적으로 결합하는 결합 부위 및 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위를 포함하는 DNA 템플레이트의 서열을 예시적으로 나타낸다(굵은 글씨: 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위, 연한 회색 바탕: 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위, 진한 회색 바탕: 비드에 결합을 위한 프로브에 상보적으로 결합하는 결합 부위).
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본 발명에 따른 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드는 비드의 결합제에 결합되는 표지자가 5’말단에 결합된 상기 DNA 템플레이트에 상보적으로 혼성하는 프로브를 포함한다.
위 프로브 서열은 템플레이트의 프로브에 상보적으로 결합하는 결합 부위에 결합하고 표적 유전자 검출에 방해가 되지 않는 서열이라면 어떠한 서열이라도 사용가능하다. 예를 들어, 본 발명의 일실시예에 따르면 서열번호 25의 서열을 사용한다.
상기 표지자 및 비드의 결합제는 한 쌍의 상이하고 상보적인 분자들로, 예를 들어 표지자로 바람직하게 비오틴을 사용할 수 있으며, 결합제, 바람직하게 비드 표면에 결합하는 결합제로 스트렙타비딘, 아비딘, 뉴트라비딘, 캡타비딘, 폴리스트렙타비딘 또는 비오틴과 결합 가능한 임의의 다른 단백질을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드는 상기 표지자와 결합하는 결합제를 포함하는 비드를 포함한다.
상기 비드는 표적 유전자 존재에 따라 회전환 증폭이 진행될 때 DNA 가닥의 엉김을 도울 수도 있다. 이에 따라 DNA hydrogel 형성을 도움으로써 육안 상 부피 변화, RCA 반응에 따른 응집 여부 또는 형광 변화 확인 등에 도움을 줄 수 있다. 상기 비드는 표지자와 결합하는 결합제가 비드 표면에 결합되어 있어 비드의 결합제에 결합되는 표지자가 5’말단에 결합된 상기 DNA 템플레이트에 상보적으로 혼성하는 프로브를 통해 템플레이트와 혼성화된다. 상기 비드는 구형의 기재를 가진 물질로 나노입자, 마이크로입자, 나노비드 또는 마이크로 비드를 포함하며, 바람직하게 자기 비드(magnetic bead)이다.
본 발명은 또한 상기 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드의 제조방법을 제공한다.
구체적으로, (a) 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위, 비드에 결합을 위한 프로브에 상보적으로 결합하는 결합 부위 및 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위를 포함하는 DNA 템플레이트를 비드의 결합제에 결합되는 표지자가 5’말단에 결합된 상기 DNA 템플레이트에 상보적으로 혼성하는 프로브와 혼성화하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 프로브와 혼성화된 템플레이트를 표지자와 결합하는 결합제를 포함하는 비드에 고정화하는 단계를 포함하는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드의 제조방법을 제공한다.
상기 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드, DNA 중합효소, 반응 완충용액 및 데옥시뉴클레오티드(dNTPs)를 포함하는 표적 유전자 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 DNA 중합효소는 대장균 DNA 중합효소 I, 클레나우 단편, phi29 DNA 중합효소, vent DNA 중합효소, T4, T7 DNA 중합효소, Taq 중합효소 및 Splint R 중합효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른, 상기 완충용액(버퍼)은 NEB(New England Biolab) 완충용액 계열, 예를 들면 NEB 완충용액 4, Bst DNA 폴중합효소 완충용액, T4 DNA 리가아제 완충용액, T7 DNA 리가아제 완충용액, Splint R 리가아제 완충용액 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 표적 유전자 검출용 조성물은 증폭된 유전자 산물의 육안 식별을 돕기 위하여 염색시약, 형광 시약을 더 포함할 수 있으며, 예를 들어 겔 레드(Gel-red), 트리판 블루 다이(trypane blue dye), 에반스 블루 다이(Evans Blue dye), 헤마톡실린-에오신 염색(hematoxylin-eosin stain), 크리스탈 바이올릿(crystal violet) 또는 메틸렌 블루(methylene blue)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 상기 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드, DNA 중합효소, 반응 완충용액 및 dNTPs를 포함하는 표적 유전자 검출용 조성물을 포함하는 표적 유전자 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 표적 유전자 검출용 키트는 비드가 표적 유전자 존재 시 회전환 증폭이 진행되면서 DNA hydrogel을 형성하여 hydrophilic한 성질을 통해 물 분자를 포획하여 건조되지 않는 특성을 가진다. 이러한 특성을 이용하여 예컨대 육안으로 부피 변화의 확인, DNA 가닥의 응집 확인, 염색이나 형광에 의한 색깔 변화 확인, 점도 변화 확인, 비드의 뭉침 정도 변화 확인, 비드의 침강 정도 변화 확인으로 표적 유전자의 빠른 검출이 가능하다.
본 발명에 따른 표적 유전자 검출용 키트는 회전환 증폭 수행을 위해 필요한 필수적 요소들을 포함하는 키트일 수 있다.
바람직하게 본 발명에 따른 표적 유전자 검출용 키트는 상기 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드를 모세관 튜브에 모세관 현상을 이용하여 패킹함으로써 모세관 튜브 내에서 이용할 수 있다. 보다 구체적으로, 제조된 검출용 비드는 모세관 현상을 이용해 모세관 튜브 안에 패킹하고 모세관에서 검출용 비드가 빠져나오지 않도록 모세관의 하부를 막은 후 모세관 내에서 회전환 증폭 반응을 통해 검출을 수행할 수 있다.
이러한 본원 발명에 따른 모세관 튜브를 이용한 키트에서의 검출 반응에 대해서는 도 3에 모식도로 기재하였다.
즉 모세관 내에서 회전환 증폭이 진행되면 표적 유전자 존재 시 hydrophilic한 DNA hydrogel이 형성되어 물 분자를 포획하여 건조되지 않는 특성을 가짐으로써 부피가 줄어들지 않고 유지되는 현상을 나타낸다. 이에 따라 육안으로 부피 변화의 확인, DNA 가닥의 응집 확인, 염색이나 형광에 의한 색깔 변화 확인, 점도 변화 확인, 비드의 뭉침 정도 변화 확인, 비드의 침강 정도 변화 확인 등으로 표적 유전자의 검출이 가능하다. 이를 위해 이러한 키트는 표적 유전자의 유무를 보다 더 확실히 확인하기 위하여 염색 시약 또는 형광 시약을 추가로 더 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드를 이용하는 표적 유전자 검출 방법을 제공한다.
구체적으로, (a) 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위, 비드에 결합을 위한 프로브에 상보적으로 결합하는 결합 부위 및 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위를 포함하는 DNA 템플레이트; 비드의 결합제에 결합되는 표지자가 5’말단에 결합된 상기 DNA 템플레이트에 상보적으로 혼성하는 프로브; 및 상기 표지자와 결합하는 결합제를 포함하는 비드;를 포함하는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드, DNA 중합효소, 반응 완충용액 및 데옥시뉴클레오티드(dNTPs)를 포함하는 표적 유전자 검출용 조성물과 시료를 반응시키는 단계; 및
(b) 상기 시료와의 반응에 따라 회전환 증폭을 수행하여 유전자 증폭을 확인하는 단계;를 포함하는 표적 유전자 검출 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계의 반응은 모세관 튜브에서 수행될 수 있으며, 이에 따라 상기 (b) 단계에서 육안으로 부피 변화의 확인, DNA 가닥의 응집 확인, 염색이나 형광에 의한 색깔 변화 확인, 점도 변화 확인, 비드의 뭉침 정도 변화 확인, 비드의 침강 정도 변화 확인 등을 통해 표적 유전자 유무를 확인할 수 있다.
위 표적 유전자 검출 방법은 온도 변화를 위한 장치 등이 없어도 항온 상태에서 반응을 통해 빠르고간편하게 표적 유전자를 검출할 수 있다.
본 발명의 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드는 빠르고간편하게유전자를검출하여바이러스,세균성감염,암과 같은 질환을 저렴한 가격으로 진단할 수 있게 하는 장점을 가진다.
도 1은 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드가 표적 유전자 존재 시 비드에서 긴 DNA 가닥을 형성하는 과정의 모식도를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 덤벨 형태의 템플레이트의 모식도를 나타낸다.
도 3은 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드를 포함하는 모세관 튜브를 이용한 표적 유전자 검출의 모식도를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 표적 유전자 회전환 증폭 기반 분자 진단 방법의 분석을 위한 템플레이트 제조, 비드의 제조, 회전환 증폭 반응을 위한 용액의 제조, 패킹 및 진단 방법의 전체 모식도를 나타낸다.
도 5는 비오틴화된 프로브와 템플레이트 간 혼성화의 모식도를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 암피실린 저항성을 가진 E.Coli 유전자에 대하여 결합 가능한 템플레이트와 비오틴화된 프로브의 혼성화를 전기영동을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 비드 표면에서 비오틴화된 프로브와 혼성화된 템플레이트의 고정화를 통한 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드의 제조 과정의 모식도를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 암피실린 저항성을 가진 E.Coli 병원균에 대하여 결합 가능한 템플레이트와 비오틴화된 프로브가 비드에 고정되었음을 보여주는 전기영동 결과를 나타낸다.
도 9는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드가 표적 유전자 존재 시 라이게이션 및 증폭을 통해 긴 DNA 가닥을 형성하는 것을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 암피실린 저항성을 가진 E.Coli 유전자에 대하여 결합 가능한 템플레이트를 포함하는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드를 이용하여 암피실린 저항성을 가진 E.Coli를 검출한 결과를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 지카 바이러스에 대하여 결합 가능한 템플레이트를 포함하는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드를 이용하여 지카 바이러스를 검출한 결과를 나타낸다.
도 12는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드를 모세관 현상을 통해 모세관에 패킹하고 이를 육안으로 관찰하는 모식도를 나타낸다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 암피실린 저항성을 가진 E.Coli 유전자에 대하여 결합 가능한 템플레이트를 포함하는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드가 패킹된 모세관을 이용하여 암피실린 저항성을 가진 E.Coli의 존재 유무를 육안으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 14는 표적 유전자 검출용 비드가 패킹된 모세관에서 회전환 증폭을 통해 긴 가닥의 DNA 산물(long tandem RCA product)를 형성하고 이렇게 생성된 DNA 산물은 물리적 얽힘(physical entanglement)에 의해 서로 엉기는데, 이에 따라 해당 모세관을 뒤집으면 중력에 의해 비드를 포함한 증폭 혼합물이 떨어지는 정도가 다르게 되고 증폭이 일어나면 엉김에 의해 증폭 혼합물이 흐르지 않게 되어 육안으로 증폭 여부를 확인 할 수 있음을 보여주는 모식도이다.
도 15는 본 발명의 일실시예에 따른 암피실린 저항성을 가진 E. Coli 유전자에 대하여 결합 가능한 템플레이트를 포함하는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드가 패킹된 모세관을 이용하여 해당 유전자의 존재 유무를 형광을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 도면을 참조하여 실시예에 대해 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니며 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 또한, 도면들에 있어서, 구성요소의 폭, 길이, 두께 등은 편의를 위하여 과장되어 표현될 수도 있다.
본 발명에 따른 표적 유전자 검출을 위한 i) 템플레이트 혼성화, ii) 비드 표면에 템플레이트의 혼성화를 통한 고정, iii) 마그네틱 비드 용액 및 RCA 반응을 위한 용액 혼합, iv) 모세관 튜브로의 패킹 및 v) 검출의 전반적 모식도는 도 4에 나타내었으며, 이하 이에 대해 상세히 살펴본다.
<실시예 1> 비오틴화된 프로브와 혼성화된 템플레이트(Template)의 제조
(1) 지카 바이러스 템플레이트 제조 및 혼성화
지카바이러스 유전자 서열을 바탕으로 지카 바이러스에 특이적인 템플레이트(Template_Zika virus), 즉, 지카 바이러스에 특이적으로 결합하는 템플레이트(Template_Zika virus, 서열번호 1)를 제조하였다 (표 1 참조). Template_Zika virus는 표적 유전자(지카 바이러스의 병원균 유전자)와 상보적으로 결합하는 결합 부위, 즉 병원균의 상보적 부위(Pathogen complementary site, 서열번호 9, 20 mer, 진한 글씨), 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위, 즉, 템플레이트 내 상보적인 영역(서열번호 10 및 서열번호 11, 21 mer X 2 = 총 42 mer, 연한 회색 바탕), 및 비드에 결합을 위한 프로브에 상보적으로 결합하는 결합 부위(서열번호 12, 17 mer, 진한 회색 바탕)으로 구성된다.
200 ul 튜브 안에 10 uM 비오틴화 프로브 [서열번호 25(5’-Biotin-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AGG GAC GTC GAT ACT AGC ATG CTA-3’), Bioneer] 2 ul, 10X PBS 0.7 ul 및 상기 제조된 4 uM Zika annealed template(Template_Zika virus) 5 ul (mBiotech)를 각각 첨가하여 총 7.7 ul 혼합용액을 제조하였다. 제조된 7.7 ul 혼합용액을 3분간 빠르게 냉각하고, 안정하게 혼성화된 템플레이트를 얻었다.
(2) E.coli 템플레이트 제조 및 혼성화
암피실린(Ampicillin) 저항성을 가진 E.Coli 유전자 서열을 바탕으로 암피실린 저항성을 가진 E.Coli에 특이적인 템플레이트(Template_Ampicillin resistant E.coli), 즉, 암피실린 저항성을 가진 E.Coli에 특이적으로 결합하는 템플레이트(Template_Ampicillin resistant E.coli, 서열번호 2)를 제조하였다. Template_Ampicillin resistant E.coli는 다음과 같이 표적 유전자(E.coli의 병원균 유전자)와 상보적으로 결합하는 결합 부위, 즉 병원균의 상보적 부위(Pathogen complementary site, 서열번호 13, 23 mer, 굵은 글씨), 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위, 즉, 템플레이트 내 상보적인 영역(서열번호 14 및 서열번호 15, 총 47 mer, 연한 회색 바탕), 비드에 결합을 위한 프로브에 상보적으로 결합하는 결합 부위(서열번호 16, 17 mer, 진한 회색 바탕)으로 구성된다.
200 ul 튜브 안에 10 uM 비오틴화 프로브 [서열번호 25(5’-Biotin-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AGG GAC GTC GAT ACT AGC ATG CTA-3’), Bioneer] 2 ul, 10X PBS 0.7 ul 및 상기 제조된 4 uM E.coli annealed template(Template_Ampicillin resistant E.coli) 5 ul (mBiotech)를 각각 첨가하여 총 7.7 ul 혼합용액을 제조하였다. 제조된 7.7 ul 혼합용액을 3분간 빠르게 냉각하고, 안정하게 혼성화된 템플레이트를 얻었다.
(3) 비오틴화된 프로브와 혼성화된 템플레이트(Template)의 제조
표지자가 결합된(예를 들어 비오틴) 프로브와 혼성화된 템플레이트(Template)의 제조 과정의 모식도는 도 5에 나타내었다. 앞서 언급된 바와 같이, 제조된 템플레이트와 표지자가 결합된(예를 들어 비오틴) 프로브가 튜브 내에서 혼합되었을 때 템플레이트의 프라이머 상보적 결합 부위와 표지자가 결합된 프로브 서열이 혼성화된다.
위와 같은 비오틴화된 프로브와 템플레이트의 혼성화를 전기영동을 통해서 확인하였다. DNA Ladder(Quick-Load® LMW Ladder/Biolabs, Ladd)를 기준으로 하여 상기 (2)에서 제조된 템플레이트(Template_Ampicillin resistant E.coli, Temp), 비오틴화된 프로브(Prim), 또는 템플레이트 및 비오틴화된 프로브의 혼합물(Hybri)을 각각 0.8 pmole 씩 로딩하여 전기영동한 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 확인되는 바와 같이, 템플레이트(Template)와 비오틴화된 프로브의 혼성화가 확인되었다.
< 실시예 2> 비드 표면에서 비오틴화된 프로브와 혼성화된 템플레이트의 고정화를 통한 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드의 제조
(1) 비드 표면에서 비오틴화된 프로브와 혼성화된 템플레이트의 고정화
상기 실시예 1에서 제조된 비오틴화된 프로브와 혼성화된 템플레이트를 마그네틱 비드에 고정하여, 마그네틱 비드 상에 템플레이트를 고정화하였다. 위 고정화 단계의 모식도는 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 결합제(예를 들어 스트렙타비딘) 비드는 Vortexing 후 원심분리를 하여 상등액을 버리고, 상기 실시예 1에서 제조된 프로브와 혼성화된 템플레이트를 혼합하여 15 분 정도 상온에서 유지함으로써 비드 상에 템플레이트를 고정화한다.
구체적으로, 200 ul 튜브 안에 마그네틱 비드 현탁액 (Takara) 5 ul 넣고, 1X PBS 5 ul로 세척해주고 세척한 마그네틱 비드 현탁액을 원심분리한 후, 상등액을 취하여 제거하였으며, 이 과정을 3회 반복하였다. 그리고 나서, 혼성화된 템플레이트 용액 7.7 ul를 첨가하였고(상기 실시예 1의 (1), 1의 (2)를 별도로 각각 제조함), 상온에서 15분 동안 배양해준 후, 마지막으로 두 번 이상 1X PBS로 세척해줌으로써, 마그네틱 비드 상에 템플레이트를 고정화함으로써 회전환 증폭 기반 표적 유전자 검출용 비드를 제조하였다.
(2) 회전환 증폭 기반 표적 유전자 검출용 비드의 제조 확인
상기 (1)에서 제조된 회전환 증폭 기반 표적 유전자 검출용 비드의 고정화를 전기영동을 통해서 확인하였다. DNA Ladder(Quick-Load® LMW Ladder/Biolabs, Ladd, 1 lane)를 기준으로 하여, 비오틴화된 프로브(2 lane), 템플레이트(3 lane), 상기 실시예 1의 (2)에서 제조된 비오틴화된 프로브와 혼성화된 템플레이트(4 lane) 및 상기 실시예 2의 (1)에서 비드 표면에 비오틴화된 프로브와 혼성화된 템플레이트(Template_Ampicillin resistant E.coli)가 고정된 마이크로 비드(5 lane)을 각각 0.8 pmole 씩 로딩하여 전기영동한 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 확인되는 바와 같이, 비드 표면에서 비오틴화된 프로브와 혼성화된 템플레이트의 고정화에 의해 비오틴화된 프로브와 혼성화된 템플레이트의 밴드가 사라지는 것이 확인되었다. 이로부터 회전환 증폭 기반 표적 유전자 검출용 비드가 제조되었음이 확인되었다.
<실시예 3> 비드 표면에서 표적 유전자의 증폭 확인
상기 실시예 2에서 제조된 회전환 증폭 기반 표적 유전자 검출용 비드를 이용하여 표적 유전자를 검출하였다. 위 검출 단계의 모식도는 도 9에 나타내었다. 회전환 증폭 기반 표적 유전자 검출용 비드를 표적 유전자와 상보적 결합함으로써 효소인 T4 리가아제에 의해 닫힌 형태(closed form) 아령 모양의 템플레이트가 형성되는 동시에 Phi 29 중합효소에 의해 회전환 증폭이 발생함으로써 긴 가닥의 DNA strands 증폭 산물이 형성된다.
상기와 같은 검출을 위하여 구체적으로 10 uM E.coli RNA 병원균 1 ul (서열번호 6, Bioneer), 10X T4 리가아제 반응 완충용액 (Biolabs) 1 ul, 10X phi 29 중합효소 반응 버퍼 (Biolabs) 1 ul, 2.5 mM dNTP 0.5 ul (Epicentre), T4 리가아제 2.5 ul (Biolabs), phi 29 중합효소 (10 unit/ul) 2.5 ul (Biolabs), 피로포스파타아제(pyrophosphatase) 0.5 ul (Biolabs), 100 mM DTT 0.4 ul (Epicentre) 및 DEPC 0.6 ul가 혼합된 총 10 ul 올인원(all in one) 혼합 용액을 제조하였다. 상기 혼합 용액을 회전환 증폭 기반 표적 유전자 검출용 비드가 들어 있는 튜브 안에 첨가하였다. 그리고 나서, 25 ℃에서 15 분 동안 라이게이션과 RCA(Rolling circle amplification) 반응을 동시에 진행시켰다.
또한, 10 uM 지카 바이러스 RNA 병원균 1 ul (서열번호 5, Bioneer)에 대해서도 위와 동일하게 회전환 증폭 기반 표적 유전자 검출용 비드를 이용하여 라이게이션과 RCA(Rolling circle amplification) 반응을 동시에 진행시켰다.
위에서 수행된 RCA 반응에 따른 긴 DNA 가닥 형성을 전기영동을 통해서 확인하였다. DNA Ladder(Quick-Load® LMW Ladder/Biolabs, Ladd)를 기준으로 하여, 시료를 0.8 pmole 씩 로딩하여 전기영동을 수행하였다.
그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.
도 10은 암피실린 저항성 E.coli에 대한 검출 결과를 나타낸다. 도 10에서 확인되는 바와 같이, 증폭을 통한 긴 DNA 가닥 형성 및 엉킴에 의해 gel well에 반응물이 걸림으로써 표적 유전자가 검출되는 것이 확인(SP)되었고, 시간 경과에 따라 생성된 산물이 커짐이 확인되었다. 또한, 비표적 템플레이트가 고정된 비드(NC)에서는 표적 유전자가 존재해도 증폭이 이루어지지 않음이 확인되어, 본원발명의 회전환 증폭 기반 표적 유전자 검출용 비드를 이용하여 표적 유전자의 검출이 이루어짐이 확인되었다.
이러한 결과는 도 11에 나타낸 바와 같이, 지카 바이러스 검출에서도 동일하게 확인되었다. 도 11에서 확인되는 바와 같이, 지카 바이러스 존재에 따라 증폭을 통한 긴 DNA 가닥 형성 및 엉킴에 의해 gel well에 반응물이 걸림으로써 표적 유전자가 검출되는 것이 확인되었다.
<실시예 4> 모세관 튜브에 마그네틱 비드 패킹 및 이를 이용한 표적 유전자의 육안 상 검출 확인
상기 실시예 3에서 튜브 내 혼합 용액과 회전환 증폭 기반 표적 유전자 검출용 비드(암피실린 저항성 E.coli 검출용)의 혼합물을 모세관 현상을 이용하여 모세관 튜브 상에 패킹하였으며, 25 ℃에서 15 분 동안 라이게이션과 RCA(Rolling circle amplification) 반응을 동시에 진행시킨 후, 모세관 튜브를 거꾸로 뒤집어 주었다. 그리고 나서, 대조군과 샘플군에 있는 자성 비드들의 응집에 따라 표적 유전자의 검출을 육안으로 확인하였다. 참고를 위하여, 위 과정에 대한 모식도는 도 12에 나타내었다.
위 제조된 마그네틱 비드 용액이 패킹된 모세관 튜브를 이용하여 육안 상으로 표적 유전자의 유무를 확인하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13은 암피실린 저항성 E.coli에 대한 검출 결과를 나타낸다. 도 13에서 확인되는 바와 같이, 회전환 증폭에 의해 형성된 hydrophilic한 긴 가닥 DNA 가닥들이 물 분자를 포획하여 건조되지 않으며 부피가 유지(SP)되는 반면, 회전환 증폭이 진행 되지 않으면 긴 가닥 DNA 가닥들이 형성되지 않아 쉽게 건조되어 부피가 감소(NC)하는 것이 확인되었다. 즉, 부피 변화를 육안 상으로 확인함으로써 표적 유전자를 검출하였다.
또한 위와 유사한 방법으로 도 14 및 도 15에서와 같이 DNA 가닥의 엉김을 통한 응집 및 형광 변화를 확인함으로써 표적 유전자를 검출하였다.
도 14는 표적 유전자 검출용 비드가 패킹된 모세관에서 회전환 증폭을 통해 긴 가닥의 DNA 산물 (long tandem RCA product)를 형성하고 이렇게 생성된 DNA 산물은 물리적 얽힘(physical entanglement)에 의해 서로 엉기는데, 이에 따라 해당 모세관을 뒤집으면 중력에 의해 비드를 포함한 증폭 혼합물이 떨어지는 정도가 다르게 되고 증폭이 일어나면 엉김에 의해 증폭 혼합물이 흐르지 않게 되어 육안으로 증폭 여부를 확인 할 수 있음을 모식도로 기재하였다.
도 15는 본 발명의 일실시예에 따른 암피실린 저항성을 가진 E.Coli 유전자에 대하여 결합 가능한 템플레이트를 포함하는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드가 패킹된 모세관에서 해당 유전자의 존재 유무를 형광을 통해 확인한 결과이다. 병원균 유전자 존재 하에 회전환 증폭이 일어난 결과 긴 가닥의 DNA가 생성되고, 이의 존재를 SYBR dye (예컨대, SYBR gold)를 이용하여 형광으로 확인하였다(SP-샘플(Sample), NC-대조군(Negative control)).

Claims (17)

  1. 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위, 비드에 결합을 위한 프로브에 상보적으로 결합하는 결합 부위 및 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위를 포함하는 DNA 템플레이트;
    비드의 결합제에 결합되는 표지자가 5’말단에 결합된 프로브로 상기 템플레이트에 상보적으로 혼성하는 프로브; 및
    상기 표지자와 결합하는 결합제를 포함하는 비드;를 포함하는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위는 5 내지 50 mer 길이를 가지는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 표적 유전자는 동물, 식물, 세균, 바이러스 및 진균으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나에 존재하거나 이로부터 유래된 것인 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 비드에 결합을 위한 프로브에 상보적으로 결합하는 결합 부위는 5 내지 50 mer 길이를 가지는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드.
  5. 제1항에 있어서, 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위는 총 10 내지 80 mer 길이를 가지는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 비드의 결합제에 결합되는 표지자는 비오틴인 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 표지자와 결합하는 결합제는 스트렙타비딘, 아비딘, 뉴트라비딘, 캡타비딘 및 폴리스트렙타비딘으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드.
  8. (a) 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위, 비드에 결합을 위한 프로브에 상보적으로 결합하는 결합 부위 및 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위를 포함하는 DNA 템플레이트를 비드의 결합제에 결합되는 표지자가 5’말단에 결합된 프로브와 혼성화하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 프로브와 혼성화된 템플레이트를 표지자와 결합하는 결합제를 포함하는 비드에 고정화하는 단계를 포함하는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드의 제조방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드, DNA 중합효소, 반응 완충용액 및 데옥시뉴클레오티드(dNTPs)를 포함하는 표적 유전자 검출용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 DNA 중합효소는 phi29 DNA 중합효소인 표적 유전자 검출용 조성물.
  11. 제9항에 따른 표적 유전자 검출용 조성물을 포함하는 표적 유전자 검출용 키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 표적 유전자 검출용 키트는 모세관 튜브 형태를 가지는 것인 표적 유전자 검출용 키트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 표적 유전자 검출용 키트는 상기 모세관 튜브에 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드, DNA 중합효소, 반응 완충용액 및 데옥시뉴클레오티드(dNTPs)가 포함되는 것인 표적 유전자 검출용 키트.
  14. (a) 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 결합 부위, 비드에 결합을 위한 프로브에 상보적으로 결합하는 결합 부위 및 덤벨 형태를 형성하기 위한 템플레이트 내 상보적인 결합 부위를 포함하는 DNA 템플레이트; 비드의 결합제에 결합되는 표지자가 5’말단에 결합된 상기 DNA 템플레이트에 상보적으로 혼성하는 프로브; 및 상기 표지자와 결합하는 결합제를 포함하는 비드;를 포함하는 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification) 기반 표적 유전자 검출용 비드, DNA 중합효소, 반응 완충용액 및 데옥시뉴클레오티드(dNTPs)를 포함하는 표적 유전자 검출용 조성물과 시료를 반응시키는 단계; 및
    (b) 상기 시료와의 반응에 따라 회전환 증폭을 수행하여 유전자 증폭을 확인하는 단계;를 포함하는 표적 유전자 검출 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 (b) 단계의 유전자 증폭을 확인하는 단계는 육안으로 수행되는 것인 표적 유전자 검출 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 (a) 단계의 표적 유전자 검출용 조성물과 시료를 반응시키는 단계는 모세관 튜브에서 수행되는 것인 표적 유전자 검출 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 회전환 증폭을 수행하여 유전자 증폭을 확인하는 단계는 시료의 부피 변화, 점도 변화, 비드의 뭉침 정도 변화 및 비드의 침강 정도 변화로부터 선택되는 어느 하나 이상의 확인을 통해 표적 유전자의 존재 유무를 판단하는 것인 표적 유전자 검출 방법.
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