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WO2013042824A1 - 비뇨생식기 감염 질환 진단용 dna칩 - Google Patents

비뇨생식기 감염 질환 진단용 dna칩 Download PDF

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WO2013042824A1
WO2013042824A1 PCT/KR2011/009150 KR2011009150W WO2013042824A1 WO 2013042824 A1 WO2013042824 A1 WO 2013042824A1 KR 2011009150 W KR2011009150 W KR 2011009150W WO 2013042824 A1 WO2013042824 A1 WO 2013042824A1
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WO
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seq
dna
nos
primer set
nucleotide sequence
Prior art date
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PCT/KR2011/009150
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English (en)
French (fr)
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박현규
정예림
정원영
박기수
정철희
신성철
조대연
황상준
박효원
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
LABGENOMICS CO Ltd
Original Assignee
Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
LABGENOMICS CO Ltd
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Publication date
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    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
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    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to a DNA chip for diagnosing genitourinary tract infection diseases. More specifically, the present invention relates to a DNA chip for diagnosing genitourinary tract infection diseases in which oligonucleotide probes for 14 species of the genitourinary tract infection diseases are fixed.
  • DNA microarrays or DNA chips capable of automatic analysis of a large number of specimens are in the spotlight, and infection diagnosis using genetic analysis has many advantages over existing infection diagnosis methods, and can solve problems of the existing methods, and thus, secondary test methods or replacements. Use is increasing by inspection method.
  • Genetic diagnostics can clearly identify the template and subtype of target bacteria through analysis of DNA and RNA sequences, detect dead bacteria without difficulty in sample processing and transport, and amplify target genes through PCR amplification Because of the high level of sensitivity, only a small amount of samples can be used for diagnosis. In addition, it is excellent in all aspects such as sensitivity as well as specificity and reproducibility. In most cases, results are available quickly and accurately within 24 hours, further reducing manpower and costs.
  • the use of the DNA chip has the advantage that it can quickly retrieve a large number of samples.
  • PCR amplification method As the PCR amplification method, a multiplex PCR method for performing several polymerase chain reactions in one tube has been developed and widely used for diagnosis of infectious bacteria (McNulty et al., Sex. Transm. Infec., 80: 207,2004).
  • sexually transmitted diseases are sample surveillance, which refers to specific diseases in the past, but in recent years a number of diseases have been found to be mediated by sexual activity or sexual contact, and thus have a systemic meaning instead of a localized sexually transmitted disease. It has been collectively called Sexually transmitted disease (STD).
  • STD Sexually transmitted disease
  • sexually transmitted disease is a word that spreads through sexually transmitted disease, and the cause of STD is urethritis, prostatitis or epididymitis in men, and cervicitis, vaginitis, and pelvic inflammatory disease in women. pelvic inflammatory disease) and Chlamydia trachomatis, ureaplasma urearachidum, mycoplasma genitarium, mycoplasma hominis, trichomonas pannilis and herpes simplex virus, and ulcerative syphilis Fungi (Treponema Palidum), herpes simplex virus, Haemophilus duclay.
  • pelvic inflammatory disease Chlamydia trachomatis, ureaplasma urearachidum, mycoplasma genitarium, mycoplasma hominis, trichomonas pannilis and herpes simplex virus, and ulcerative syphilis Fungi (Treponem
  • HPV human papillomavirus
  • E. coli, Gardnerella pannalis and the fungus Candida albicans are the germs that should be done.
  • the present inventors have made diligent efforts to develop a method capable of simultaneously detecting a multiplicity of urogenital infection disease bacteria having a high prevalence, thereby producing a DNA chip in which an oligonucleotide probe capable of hybridizing with 14 species of urogenital infection disease bacteria is immobilized. By doing so, it was confirmed that the infection of 14 kinds of urogenital infectious diseases, including multiple infections, including various infections can be quickly and accurately analyzed and completed the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a DNA chip for diagnosing genitourinary tract infection diseases capable of detecting the causative agent of the genitourinary tract infection diseases.
  • the present invention provides a DNA chip for diagnosing genitourinary tract infection disease in which an oligonucleotide probe having SEQ ID NOS: 1 to 14 is fixed.
  • the present invention also comprises a DNA chip for diagnosing the genitourinary tract infection disease; Primer set for amplifying beta-globin, which is a DNA and a test verifier of a genitourinary tract infectious agent; And it provides a kit for diagnosing the genitourinary tract infection disease comprising Anti PM, an oligomer having a nucleotide sequence complementary to the hybridization verification group.
  • Figure 1 shows a schematic diagram (a) of the screening test DNA chip for selecting a new probe and the results of fluorescence scanning (b) of the screening test using amplification products of each causative organism.
  • Figure 3 shows a schematic diagram of the shape of the DNA chip and the immobilization of the probe according to the present invention.
  • Figure 4 shows the results of the electrophoresis of multiplex PCR amplification products using the causal gene extracted from the sample of patients with complex infection of GV, UU, HSV2 and TV.
  • Figure 5 shows a fluorescence scanning photograph after the DNA chip hybridization reaction.
  • Figure 6 schematically shows the entire analysis process of multiplex PCR, DNA chip hybridization and fluorescence scanning for the detection of the causative agent of the genitourinary tract infection disease.
  • FIG. 7 is a graphical representation of fluorescence scanning images and SV values for GV standards in the 0-10 7 copy range to confirm the minimum detection limit.
  • the present invention relates to a DNA chip for diagnosing urogenital infection disease in which an oligonucleotide probe having a nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 14 is immobilized.
  • the oligonucleotide probe having the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 1 to 14 may be characterized in that the hybridization with the DNA of the genus of the genitourinary tract infection disease (hybridization), the causative agent of the genitourinary disease is Escherichia coli (EC, Escherichiacoli ), Klebsiellapneumoniae (KP), Staphylococcusaureus (SA), Enterococcus fecalis (EF, Enterococcus fecalis), Gonorrhea (NG, Neisseriagonorrhea ), Chlamydia trachomatis (CT, Chlamydiaetrachomatis), urea plasma Yu reahra itty-Kum (UU, Ureaplasmaurealyticum), mycoplasma hoe Nice (MH, Mycoplasmahominis), mycoplasma Iglesia de Leeum (
  • test verification group Internal Control
  • hybridization verification group Purge Marker
  • the 'test verification group IC, Internal Control
  • the test verification group is a beta-globin and always detected in everyone regardless of whether or not bacterial infection
  • the oligonucleotide probe having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 that can be hybridized.
  • the hybridization verification group refers to a probe that is fixed on the chip to verify that the hybridization reaction is performed properly, the oligomer having a Cy3-dUTP and complementary to the hybridization verification group Anti PM was added immediately before the hybridization reaction, and the hybridization reaction was performed to confirm that the hybridization reaction was properly performed.
  • the hybridization verification group may be an oligonucleotide probe having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16.
  • a target site of each genitourinary tract infectious disease causative organism is selected, and for this purpose, it is commonly used to identify a lineage.
  • Progeny-specific sequences of 16S rRNA (Eukaryote Candida albicans 18S rRNA) and 23S rRNA genes are determined first, and if there is no appropriate sequence at this site, genes and sequences specific to the causative organism are identified.
  • the target site was selected. GenBank numbers of genes and nucleotide sequences of target sites corresponding to each causative organism are shown in Table 1 below.
  • the base sequences of each causative bacterium and beta globin obtained through the BLAST engine were cross-checked with the base sequences of the primers designed using the Primer 3 (Whitehead Institude / MT Center for Genome Research) program.
  • Two or more optimal probe candidates designed to minimize nonspecific hybridization for each causative organism were designed with a 35mer length using the OligoArray 2.0 program, and then screened by actual DNA chip hybridization reactions to evaluate the target causal agent's diagnostic ability. The test was carried out to select the optimal probe having the nucleotide sequence shown in Table 2 for 14 causative bacteria and test validation group.
  • each probe has a linker consisting of 9 Ts in front and 35 STD causative bacteria-specific probe sequences attached to the front, and the T-linker is inserted into a spacer to hybridize the PCR product and the probe. It increases the efficiency.
  • each probe having a nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 1 to 16 is spotted on an aldehyde-coated glass substrate using SMP3 pins by operating a microspotter.
  • a DNA chip was prepared by attaching a reaction chamber serving as a reaction well and a transparent film cover for preventing evaporation on a glass substrate on which the probe was immobilized.
  • the DNA chip includes three identical spots for each genus of the genus of the genitourinary tract infectious disease, and the entire probe including the repeated spots of the test verification group and the hybridization verification group at an intermediate position is integrated. It may be characterized in that it comprises one or more sections, In one embodiment of the present invention, four samples are prepared by preparing a 4-plex (DNA) -type DNA chip containing a section four times the entire probe is integrated Although it is possible to apply at the same time, depending on the number of samples to be applied at the same time, the number of the entire probe integrated section may be flexible.
  • the present invention in another aspect, the DNA chip for diagnosing the genitourinary tract infection disease; Primer set for amplifying beta-globin, which is a DNA and a test verifier of a genitourinary tract infectious agent; And a kit for diagnosing a genitourinary tract infection disease comprising Anti PM, an oligomer having a nucleotide sequence complementary to the hybridization verification group.
  • the primer set is a primer set for enterococcus pecalis DNA amplification having a nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 17 and 18, a primer set for Candida albicans DNA amplification having a nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 19 and 20, SEQ ID NO: A primer set for Mycoplasma hominis DNA amplification having a nucleotide sequence of 21 and 22, and a primer set for Gardella pannalis DNA amplification having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 and 24, Chlamydia having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 and 26 A set of primers for amplifying trachomatis DNA, a beta-globin having a nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 27 and 28 A set of primers for amplifying DNA, a beta-globin having a nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 29 and 30 Primer set for DNA amplification
  • the primer may be characterized in that it further comprises a labeling means for detecting amplified DNA that complementarily binds to the DNA chip at the 5 'end, wherein the labeling means are Cy5, Cy3, It may be characterized in that it is selected from the group consisting of FAM, TAMRA, Alexa Fluor and Texas Red.
  • the gene of the causative bacteria extracted from the sample of the actual patient is amplified by performing multiplex PCR by dividing into three groups using primer sets specific for each causal gene as shown in Table 3.
  • the amplification products were hybridized with the DNA chip according to the present invention, and SV and SBR values were obtained for each spot on the DNA chip using a fluorescence scanner.
  • 'SV spot vlaue
  • spot vlaue spot vlaue
  • 'SBR Signal to Background Ratio
  • Item and B532 median item can be used to calculate F532 median / B532 median values in the program and apply them to the analysis.
  • SV and SBR can be obtained using a wavelength of 635 nm instead of 532 nm.
  • the assay cut-off value was used to distinguish between positive and negative for each spot.
  • the 'cut-off value' refers to a criterion for determining whether the spot is positive or negative for each spot
  • the values applied to the pass-through criteria are two items, SV and SBR, and SV of any spot. If the value is 1000 or more and the SBR value is 2.5 or more, the spot may be determined as a positive spot, and if the SV value of any spot is less than 1000 or the SBR value is less than 2.5, the spot may be determined as a voice spot.
  • the present invention is to determine whether each spot is positive or negative by using the above analysis pass criteria, and then the number of positive or negative spots for the same three spots for each cause of the genitourinary tract infection disease As a result, it was determined whether or not the infection of the genitourinary tract infectious disease bacteria.
  • whether the genitourinary tract infectious agent is infected is determined that if all three of the same spots for each genitourinary tract infectious agent on the DNA chip are positive spots, there is an infection of the causative bacterium corresponding to each spot. If all three of the same probe spots are negative spots, it is determined that there is no infection of the causative bacterium corresponding to each spot, but if only one or two of the same three spots are positive spots, the infection can be determined by rediagnosing the infection. .
  • the DNA chip for diagnosing urogenital infection disease includes three identical spots for each causative agent of urogenital infection disease, thereby maximizing sensitivity, specificity, and reproducibility.
  • the present invention in order to confirm the clinical validity of the detection method of the causative agent of the genitourinary tract infection disease using the DNA chip according to the present invention, sequencing 70 positive samples and 5 negative samples confirmed the results by PCR
  • the STD DNA chip has a sensitivity of 95% and a specificity of 100% compared to the PCR detection method of 50% sensitivity and 80% specificity. It was confirmed that this is very high, and furthermore, the comparative experiments between the probe according to the present invention and a probe that is already known and used confirmed that the probe according to the present invention has superior sensitivity than the probe which is already known and used.
  • 16S rRNA eukaryote Candida , commonly used for phylogenetic identification
  • albicans primarily determined the sequence of the probe from the pathogen-specific sequences of the 18S rRNA) and 23S rRNA genes, and in the absence of an appropriate sequence, albicans selected genes and nucleotide sequences specific to the pathogen as target sites.
  • GenBank numbers of genes and nucleotide sequences of target sites corresponding to each causative organism are shown in Table 1.
  • each probe has a linker consisting of 9 Ts in front and 35 STD causative bacteria-specific probe sequences attached to the front, and the T-linker is inserted into a spacer to hybridize the PCR product and the probe. It increases the efficiency.
  • GV single band was identified by PCR detection method using a clinical sample infected with GV, and then GV probe without T-linker and GV with T-linker.
  • the hybridization reaction with the DNA chip to which the probe was immobilized confirmed the fluorescence signal intensity value of the chip reaction between the probe without T-linker and the probe with T-linker.
  • both of the cut-off value for the SV value and SBR value was determined to be positive.
  • the signal strength value of the chip is 1016, 1765 for probes without T-linker, and the deviation of signal strength between two identical spots is large and unstable, whereas for probes with T-linker, it is 1517, 1575.
  • a stable signal strength value was reproducibly shown between spots. Therefore, when the probe has a T-linker, it was confirmed that the efficiency of the hybridization reaction was increased to show reproducible fluorescence signal intensity. This means that if a pathogen detection method using DNA chips is applied to clinical diagnosis by applying cutoff values, it is possible to reduce errors in the determination step.
  • DNA chip production method, gene amplification method, DNA chip hybridization method and hybridization detection method was carried out in the same manner as in Example 2, the target causal gene amplification using a primer having a nucleotide sequence of Table 3.
  • a glass substrate coated with an aldehyde was used as a slide for integrating the probe, and a high pressure dust remover was used to remove the surface dust, and then the slide mounting position of the microspotter. Mounted on.
  • the SMP3 pins were washed in an ultrasonicator containing tertiary distilled water, and then dried and mounted on the pin mounting portion of the microspotter.
  • the microspotter was operated at 25 ° C. and 70% humidity after mounting the pins and slides for integration.
  • Each probe was prepared at 25 pmol / ⁇ l, 50% DMSO concentration, and then stabilized at -20 ° C. for 16 hours or more, and the base sequences of each probe are shown in Table 2. Then, the microspotter was operated to fix each probe by spotting onto the aldehyde-coated glass substrate three times in the form of a 4-plex using the SMP3 pin (FIG. 3). Next, a reaction chamber serving as a reaction well and a transparent film cover for preventing evaporation were attached onto a glass substrate on which a probe was fixed.
  • muxplex PCR was performed by dividing into three groups, and beta-globin was used as a test verification group.
  • multiplex PCR was performed as described above using the causal gene extracted from a sample of the actual infected patients of GV, UU, HSV2 and TV.
  • Causative gene extracted from actual patient sample 0.2 ⁇ M primer set, 1X PCR reaction buffer (30 mM Tris-HCl, 30 mM KCl, 30 mM (NH) 4 ) 2 SO 4 , 2 mM MgCl 2 ), 0.4 mM dNTPs and 1.0 U i-star Taq polymerase (iNtRON Biotechnology, Korea) were mixed to prepare a reaction mixture, and amplified DNA using Perkin-Elmer 9200 thermo-cycler (Perkin-Elmer, Norwalk, CT). I was.
  • PCR conditions were 5 minutes at 94 °C for denaturation of the double-stranded DNA, 50 seconds at 94 °C, 45 seconds at 57 ° C, 50 seconds at 72 °C repeated 38 times, then 10 °C at 72 °C After the final extension process, the PCR product was confirmed by PCR agarose gel electrophoresis (agarose gel electrophoresis) and the size (Fig. 4).
  • a hybridization solution (5X SSC, 25% formamide, 25ug / ml Human HybMasker Cot-1 DNA, 10) stored in a -20 ° C freezer 30 minutes prior to the hybridization reaction was first performed. % Dextran sulfate, 0.1% SDS) was taken out and placed in a 42 °C reactor for pre-warming. After removing and dissolving Anti PM (100nM) stored in a -20 °C freezer, centrifuged at 6000xg for 10 seconds and the solution was placed on the bottom of the tube. After collecting, it was put on ice.
  • the PCR amplification products for each of the three groups were added to the microtubes in total, each of 10 ⁇ l, and 30 ⁇ l of the PCR amplification products were added, mixed well using a pipette, and left at 95 ° C. for 5 minutes.
  • 40 ⁇ l of a prewarmed hybridization solution was added to the tube using a pipette, and 1 ⁇ l of Anti PM was added thereto.
  • 70 ⁇ l of the hybridization reaction solution in 71 ⁇ l was slowly injected into the injection hole in the film cover attached to the DNA chip surface, and then the hybridization chamber was assembled. At this time, if there was a bubble between the chip and the reaction well, the bubble was removed by sweeping the bubble with a glove-like hand.
  • the hybridization chamber was taken out and disassembled in the reaction tank to remove the chip, and the reaction chamber and the transparent film cover of the chip were removed.
  • the chip was placed in a dry 50ml tube and centrifuged at 100xg for 5 minutes to remove the remaining wash solution on the chip.
  • the chip was fluorescence scanned using a fluorescence scanner GenePix 4000B (Axon Instruments, Union City, CA) (FIG. 5), and the signal value of each spot was analyzed for result determination from the image of the scanned chip.
  • the spot value (SV) and signal to background ratio (SBR) values for each spot were obtained.
  • the SV value is a difference between the pixel of each spot image and the pixel value of the background image surrounding the spot, and is a value excluding the 532 nm background pixel intensity value from the 532 nm median pixel intensity value based on the value scanned at the 532 nm wavelength.
  • the 'F532median-B532median' item of the gpr file which is a microarray data file, corresponds to this.
  • the SBR value is the ratio of the pixel of each spot image and the pixel value of the background image surrounding the spot, which means 532 nm median pixel intensity / 532 nm background median pixel intensity, and uses the F532 median and B532 median items in the gpr file.
  • F532 median / B532 median value in the program can be calculated and applied to the analysis.
  • SV is less than 1000 or SBR is less than 2.5
  • each spot was positive or negative by using the above analysis pass criteria.
  • all three identical spots were positive spots, it was determined that there was an infection of the causative bacteria corresponding to each spot, and all three identical spots Is a negative spot, it was determined that there was no infection of the causative bacterium corresponding to each spot.
  • only one or two of the same three spots were identified as positive spots, it was determined that it was not sufficient to make a reliable judgment and re-diagnosed.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing the entire analysis process of multiplex PCR, DNA chip hybridization, and fluorescence scanning for detection of the causative agent of the genitourinary tract infection disease.
  • Figure 8 shows an example of the results of the experiment using the clinical sample to compare the sensitivity of the PCR and DNA chip, as shown in Figure 8, as an example of false negative, PCR detection method using agarose electrophoresis
  • GV, MG, UU, IC was confirmed, as a detection method using a DNA chip according to the present invention, CA pathogens were additionally identified along with GA, MG, UU, IC.
  • GV, MG, UU, IC and CA exist together in the clinical sample. This means that the detection of infected pathogens is also possible.
  • CT, SA, UU, and IC were identified as PCR detection methods, while SA, UU, and IC were detected as a detection method using a DNA chip according to the present invention, and a sequencing method was used.
  • CT confirmed by PCR detection method was confirmed as false negative. This can be confirmed that the specificity of the DNA chip is excellent because it can make an error that a tester judges the result of false positives for a nonspecific PCR product in the reading step through agarose electrophoresis.
  • the DNA chip according to the present invention had a high sensitivity of 95% and a specificity of 100% compared to the PCR detection method having a sensitivity of 50% and a specificity of 80%.
  • Table 6 shows the signal strength values of each spot.
  • the signal strength values of known probes have SV values of 2417 and 2329 and SBR values of 7.71 and 7.73, according to the present invention.
  • the signal strength value of the probe was 4896, 4634, and the SBR value was 15.49, 14.63.
  • both probes were determined to be positive spots beyond the assay pass criteria, but according to the present invention, Since the signal intensity value of the probe was higher, it was confirmed that the sensitivity of the probe according to the present invention was better.
  • the probe intensity which was already known and used, was low and was determined as a voice spot. In the probe according to the present invention, it was confirmed that it was determined as a positive spot.
  • the probe according to the present invention exhibited high sensitivity through a comparative experiment between the probe according to the present invention and a probe which is already known and used.
  • the DNA chip for urogenital disease diagnosis according to the present invention has excellent sensitivity, specificity, and reproducibility, as well as complex infections for various specimens to detect 14 bacterial genitourinary infections. Rapid and accurate analysis can be useful for the diagnosis and treatment of primary care institutions for urogenital infections.

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Abstract

본 발명은 비뇨생식기 감염 질환 진단을 위한 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 DNA칩에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 비뇨생식기 감염 질환 원인균 14종에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩에 관한 것이다. 본 발명에 따른 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩은 민감도, 특이도 및 재현성이 우수할 뿐만 아니라 다양한 검체를 대상으로 복합감염까지 포함하여 14종의 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 감염 여부를 신속 정확하게 분석할 수 있어 비뇨생식기 감염 질환에 대한 1차 진료기관의 진단 및 처치에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

[규칙 제91조에 의한 정정 28.02.2012]　비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩
본 발명은 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 비뇨생식기 감염 질환 원인균 14종에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩에 관한 것이다.
전통적으로 감염 질환의 진단을 위해서는 도말 및 염색에 의한 현미경적 검사, 세균 배양 및 항생제 감수성 검사, 항원항체검사, 면역학적 검사법 등의 여러 방법이 사용되고 있다. 그러나 실제 이러한 전통적 진단법은 많은 한계가 있는 것이 사실이다. 기존 방법을 이용할 경우, 상당수의 세균은 검색이 불가능하거나 어렵고, 시간과 비용 및 인력이 너무 많이 소요되며, 한 번에 처리할 수 있는 검체 수에 한계가 있고, 흔히 한 번의 검사로 한 가지 밖에 검사를 못 하고, 판독이 자동화가 되어 있지 않아서 임상 적용에 어려움이 많다. 또한 살아 있는 균을 대상으로 하므로, 검사할 때까지 균을 살려야 하며, 이에 따라 검체 처리와 이송에 어려움이 따르며, 그 비용도 만만치 않다.
이에 따라 최근에는 감염 질환의 진단에 분자유전학적 분석방법이 사용되기 시작하였으며, 기존 진단법을 급속하게 대체해 나가는 추세이다. 특히, 다수 검체의 자동 분석이 가능한 DNA 마이크로어레이 또는 DNA칩이 각광을 받고 있으며, 유전자 분석을 이용한 감염진단은 기존의 감염진단법에 비해 장점이 많고, 기존 방법의 문제점을 해결할 수 있어서 보조 검사법 내지 대체 검사법으로 이용이 증가하고 있다. 유전자 진단법은 DNA 및 RNA 염기서열의 분석을 통해 대상 세균의 주형과 아형도 명확하게 알 수 있으며, 검체 처리와 이송에 까다로움이 없이 죽은 세균도 검색이 가능하고, PCR 증폭을 통해 표적 유전자를 증폭시켜 검색하므로 민감도가 높을 뿐 아니라 극소량의 검체만 있어도 진단이 가능하다. 또한, 민감도 뿐 아니라 특이도와 재현성 등 모든 부분에서 우수하다. 대부분의 경우 24시간 이내에 신속하고 정확하게 결과를 알 수 있으며, 인력과 비용도 더 절감된다. 아울러 DNA칩을 이용하면 다수의 검체를 신속하게 다량으로 검색할 수 있는 장점이 있다.
상기 PCR 증폭방법으로는 여러 개의 중합효소연쇄반응을 한 튜브에서 수행하는 Multiplex PCR 방법이 개발되어 감염균 진단에 널리 쓰이고 있다 (McNulty et al., Sex. Transm. Infec., 80:207,2004).
한편, 비뇨생식기 감염 질환은 감염성 질환 중 호흡기 감염 다음으로 가장 빈번한 세균 감염 질환으로서 전 세계적으로 매년 7천 8백만 ~ 3억 3천만 건이 새롭게 진단되고 있으며(Lee et al., J. Microbiol., 45:453,2007), 이러한 감염 질환 중 일부는 법정전염병 제 3군인 성병에 속하며, 간헐적으로 유행할 가능성이 있어서 지속적으로 그 발생을 감시하고 방역 대책의 수립이 필요한 전염병으로 분류되고 있다. 특히, 성병은 표본 감시를 행하고 있는데, 과거에는 특정 질환을 지칭하였으나 최근들어 무수히 많은 질병들이 성행위 또는 성적 접촉에 의하여 매개되는 사실이 밝혀짐에 따라 국소적 의미의 성병 대신에 전신적 의미를 내포하는 성전파성 질환(Sexually transmitted disease, STD)이라고 총칭하게 되었다.
즉, 성전파성 질환(STD)이란 성행위로 인해 전파되는 질병을 통틀어 이르는 말로서 STD의 원인균으로는 남자의 경우, 요도염, 전립선염 또는 부고환염을 일으키고, 여자의 경우에는 자궁경부염이나 질염, 골반염증성질환(pelvic inflammatory disease)을 일으키는 임균과 클라마이디아 트라코마티스, 유레아플라스마 유레아라이티쿰, 마이코플라스마 제니탈리움, 마이코플라스마 호미니스, 트리코모나스 바지날리스 및 헤르페스심플렉스바이러스가 있으며, 외성기에 궤양을 일으키는 매독균(트레포네마 팔리둠), 헤르페스심플렉스바이러스, 헤모필루스 듀클레이가 있다. 또한, 외성기에 사마귀(wart)나 자궁경부, 홍문, 음경 등에 암을 야기하는 인체유두종바이러스(HPV)가 있으며, 이와 함께 정확한 의미에서 STD는 아니나 STD와 유사하게 질염 등의 병태를 나타내므로, 감별해야 할 균으로서 대장균, 가드네렐라 바지날리스와 진균인 칸디다 알비칸스가 있다.
미국의 경우 매년 1,500명 이상이 STD에 새로 감염이 되며, 6,500만명 이상이 바이러스성 STD에 이환되어 있다고 보고되고 있다. 이렇게 비뇨생식기 감염 질환은 높은 유병률에도 불구하고 흔히 증상이 없어서 모르고 지내는 경우가 많으며, 진행되면 불임이나 전립선염, 부고환염, 면역결핍, 암 등의 합병증을 야기할 수 있다. 특히, 바이러스성 STD는 유효한 치료법이 없는 경우가 많아서 STD는 정확한 진단과 예방이 무엇보다 중요하며, 아울러 무증상의 환자를 찾아서 치료하고 감염 확산을 방지하는 것이 중요하다 (Campbell-WalshUrology, 2007).
이에, 본 발명자들은 유병률이 높은 비뇨생식기 감염 질환 원인균들을 동시에 다중 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 비뇨생식기 감염 질환 원인균 14종과 혼성화가 가능한 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 DNA칩을 제조함으로써, 다양한 검체를 대상으로 복합감염까지 포함하여 비뇨생식기 감염 질환 원인균 14종의 감염 여부를 신속 정확하게 분석할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 비뇨생식기 감염 질환 원인균을 검출할 수 있는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 14 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩; 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 DNA 및 시험 검증군인 베타-글로빈을 증폭하기 위한 프라이머 세트; 및 혼성화 검증군과 상보적인 염기서열을 가지는 올리고머인 Anti PM을 포함하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 키트를 제공한다.
도 1은 신규 프로브 선정을 위한 스크리닝 테스트용 DNA 칩의 모식도(a) 및 각 원인균의 증폭산물을 이용한 스크리닝 테스트의 형광 스캐닝 결과(b)를 나타낸 것이다.
도 2는 T-linker를 통해 형광 신호세기의 안정성이 향상되는 것을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 DNA칩의 형태 및 프로브의 고정화 양상을 모식도로 나타낸 것이다.
도 4는 실제 GV, UU, HSV2 및 TV의 복합감염자 환자의 샘플에서 추출한 원인균 유전자를 이용한 멀티플렉스 PCR 증폭산물의 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 DNA칩 혼성화 반응 이후 형광 스캐닝한 사진을 나타낸 것이다.
도 6은 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 검출을 위한 멀티플렉스 PCR, DNA칩 혼성화 및 형광 스캐닝의 전체 분석 과정을 개략도로 나타낸 것이다.
도 7은 최소 검출 한계를 확인하기 위하여 0-107카피 범위의 GV 표준물질에대한 형광스캐닝 사진 및 SV값을 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 PCR을 이용한 검출방법과 본 발명에 따른 DNA칩을 이용한 검출방법의 민감도 및 특이도를 비교한 실험결과를 나타낸 것이다.
도 9는 이미 공지되어 있는 프로브와 본 발명에 따른 프로브의 민감도를 비교한 실험결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1 내지 14의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 14의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프로브는 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 DNA와 하이브리다이제이션(hybridization) 되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 비뇨생식기 감염 질환 원인균은 대장균(EC, Escherichiacoli), 클랩시엘라 프네우모니아이(KP, Klebsiellapneumoniae), 스태필로코쿠스 아우레우스(SA, Staphylococcusaureus), 엔테로코커스 페칼리스(EF, Enterococcusfecalis), 임질균(NG, Neisseriagonorrhea), 클라미디아 트라코마티스(CT, Chlamydiaetrachomatis), 유레아플라즈마 유레아라이티쿰(UU, Ureaplasmaurealyticum), 마이코플라즈마 호미니스(MH, Mycoplasmahominis), 마이코플라즈마 제니탈리움(MG, Mycoplasmagenitalium), 트리코모나스 바지날리스(TV, Trichomonasvaginalis), 칸디다 알비칸스(CA, Candidaalbicans), 가드넬라 바지날리스(GV, Gardnerellavaginalis), 헤르페스심플렉스바이러스 유형 1(HSV 1, Herpessimplexvirus-type1) 및 헤르페스심플렉스바이러스 유형 2(HSV 2, Herpessimplexvirus-type2)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 시험 검증군(Internal Control) 및 혼성화 검증군(Position Marker)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 여기서 '시험 검증군(IC, Internal Control)'이란 DNA칩의 혼성화 반응 이전의 PCR 등과 같은 시험 과정들이 제대로 이루어졌는지를 검증하기 위해 칩 위에 고정되어 있는 프로브를 의미하며, 본 발명에서, 상기 시험 검증군은 세균 감염 여부와 관계없이 모든 사람에게서 항상 검출되는 베타-글로빈과 하이브리다이제이션이 가능한 서열번호 15의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프로브인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, '혼성화 검증군(PM, Position Marker)'이란 혼성화 반응이 제대로 이루어졌는지 검증하기 위해 칩 위에 고정되어 있는 프로브를 의미하며, Cy3-dUTP가 달려있고 상기 혼성화 검증군과 상보적인 서열을 가지는 올리고머인 Anti PM을 혼성화 반응 직전에 정해진 양을 첨가하여 혼성화 반응을 진행하여 양성인 것을 확인함으로써 혼성화 반응이 제대로 이루어졌는지 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혼성화 검증군은 서열번호 16의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프로브인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 일 양태에서, 각 비뇨생식기 감염 질환 원인균에 대해 특이성이 우수한 신규의 프로브를 개발하기 위하여, 먼저, 각 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 타겟 부위를 선정하였으며, 이를 위하여, 계통 파악에 흔히 사용되는 16S rRNA (진핵생물인 Candida albicans는 18S rRNA) 및 23S rRNA 유전자의 원인균 특이적인 서열에서 프로브의 서열을 1차적으로 결정하고, 이 부위에 적절한 서열이 없을 경우에는 원인균에 특이적인 유전자와 염기서열을 타겟 부위로 선택하였다. 각 원인균에 해당하는 타겟 부위의 유전자와 염기서열의 GenBank 번호는 하기 표 1과 같다.
표 1
Figure PCTKR2011009150-appb-T000001
타겟 부위 선정 후, BLAST engine을 통해 확보한 각 원인균 및 베타글로빈의 염기 서열을 Primer 3 (Whitehead Institude/MT Center for Genome Research) 프로그램을 사용하여 디자인한 프라이머들의 염기서열과 cross-checking 한 후, 각 원인균마다 비특이적 혼성화를 최소화 할 수 있는 최적의 프로브 후보 2 종 이상을 OligoArray 2.0 프로그램을 이용하여 35mer 길이로 설계한 다음, 이러한 후보 프로브들의 목적 원인균 진단 능력을 평가하기 위해 실제 DNA칩 혼성화 반응을 통한 스크리닝 테스트를 수행하여 14종의 원인균 및 시험 검증군에 대해 표 2와 같은 염기서열을 가지는 최적의 프로브를 선정하였다. 이 때, 각 프로브는 9개 T로 이루어진 linker가 앞쪽에 있고, 뒤에 35개의 STD 원인균 특이적 프로브 서열이 붙어 있는 형태로 이루어져 있으며, T-linker는 스페이서로 삽입되어 PCR 산물과 프로브 간의 혼성화반응의 효율을 높이는 역할을 한다.
본 발명은 다른 양태에서, 표 2에 나타난 바와 같이, 서열번호 1 내지 16의 염기서열을 가지는 각각의 프로브를 마이크로스팟터를 작동시켜 SMP3 핀을 이용하여 알데히드가 코팅되어 있는 유리 기판 위에 스팟팅하여 각각의 프로브를 고정화시킨 다음, 프로브가 고정화된 유리 기판 위에 반응 웰 역할을 하는 반응 챔버와 증발방지 목적의 투명 필름커버를 부착하여 DNA칩을 제조하였다.
본 발명에 있어서, 상기 DNA칩은 각 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 유전자별로 3 개의 동일한 스팟(spot)을 포함하며, 중간 위치에 시험 검증군 및 혼성화 검증군의 반복적인 스팟을 포함하는 전체 프로브가 집적된 구간을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는, 전체 프로브가 집적된 구간을 4번 포함하는 4-플렉스(plex) 형태의 DNA칩을 제조하여 4 개의 검체를 동시에 적용 가능하도록 하였으나, 동시에 적용하고자 하는 검체 수에 따라 전체 프로브가 집적된 구간의 개수는 유동적일 수 있다.
표 2
Figure PCTKR2011009150-appb-T000002
본 발명은 다른 관점에서, 상기 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩; 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 DNA 및 시험 검증군인 베타-글로빈을 증폭하기 위한 프라이머 세트; 및 혼성화 검증군과 상보적인 염기서열을 가지는 올리고머인 Anti PM을 포함하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 17 및 18의 염기서열을 가지는 엔테로코커스 페칼리스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 19 및 20의 염기서열을 가지는 칸디다 알비칸스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 21 및 22의 염기서열을 가지는 마이코플라즈마 호미니스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 23 및 24의 염기서열을 가지는 가드넬라 바지날리스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 25 및 26의 염기서열을 가지는 클라미디아 트라코마티스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 27 및 28의 염기서열을 가지는 베타-글로빈(beta-globin) DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 29 및 30의 염기서열을 가지는 베타-글로빈(beta-globin) DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 31 및 32의 염기서열을 가지는 대장균 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 33 및 34의 염기서열을 가지는 스태필로코쿠스 아우레우스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 35 및 36의 염기서열을 가지는 마이코플라즈마 제니탈리움 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 37 및 38의 염기서열을 가지는 헤르페스심플렉스바이러스 유형 1 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 39 및 40의 염기서열을 가지는 헤르페스심플렉스바이러스 유형 1 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 41 및 42의 염기서열을 가지는 트리코모나스 바지날리스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 43 및 44의 염기서열을 가지는 트리코모나스 바지날리스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 45 및 46의 염기서열을 가지는 임질균 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 47 및 48의 염기서열을 가지는 유레아플라즈마 유레아라이티쿰 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 49 및 50의 염기서열을 가지는 클랩시엘라 프네우모니아이 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 51 및 52의 염기서열을 가지는 헤르페스심플렉스바이러스 유형 2 DNA 증폭용 프라이머 세트 및 서열번호 53 및 54의 염기서열을 가지는 헤르페스심플렉스바이러스 유형 2 DNA 증폭용 프라이머 세트를 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 5' 말단에 상기 DNA칩과 상보적으로 결합하는 증폭된 DNA를 검출하기 위한 표지수단을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 표지수단은 Cy5, Cy3, FAM, TAMRA, Alexa Fluor 및 Texas Red로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 일 양태에서, 실제 환자의 샘플에서 추출한 원인균의 유전자를 표 3에 나타난 바와 같이, 각 원인균의 유전자에 특이적인 프라이머 세트들을 이용하여 3 개의 그룹으로 나누어 멀티플렉스 PCR을 수행하여 증폭시킨 다음, 상기 증폭 산물을 본 발명에 따른 DNA칩과 혼성화시키고, 형광 스캐너를 이용하여 DNA칩 위의 각 스팟에 대하여 SV 값 및 SBR 값을 얻었다.
본 발명에서, 'SV(spot vlaue)'란 각 스팟 영상의 화소와 스팟을 둘러싼 배경 영상의 화소 값의 차이로, Cy3 사용인 경우 532 nm 파장으로 스캐닝한 값을 기준으로 532 nm median pixel intensity 값에서 532 nm background pixel intensity 값을 제외한 값을 의미하며, 마이크로어레이 데이터 파일인 gpr 파일의 'F532median-B532median' 항목이 이에 해당한다. 또한, 'SBR(Signal to Background Ratio)'란 각 스팟 영상의 화소와 스팟을 둘러싼 배경 영상의 화소값의 비로 532 nm median pixel intensity / 532 nm background median pixel intensity를 의미하며, gpr파일의 F532 median의 항목과 B532 median항목을 이용하여 프로그램 내에서 F532 median / B532 median 값을 계산하여 분석에 적용할 수 있다. 표지 수단으로 Cy5를 사용할 경우에는 532 nm 대신에 635 nm 파장을 이용하여 SV 및 SBR를 얻을 수 있다.
표 3
Figure PCTKR2011009150-appb-T000003
본 발명은 다른 양태에서, 분석 통과 기준(cut-off value)을 이용하여 각각의 스팟에 대하여 양성인지 음성인지를 구분하였다.
여기서, '분석 통과 기준(cut-off value)'이란 각 스팟에 대하여 양성인지 음성인지를 판별하는 기준을 의미하며, 분석 통과 기준에 적용되는 값은 상기 SV 및 SBR 두 항목이며, 어떠한 스팟의 SV 값이 1000 이상, SBR 값이 2.5 이상이면 그 스팟은 양성스팟으로 판단하고, 어떠한 스팟의 SV 값이 1000 미만이거나, SBR 값이 2.5 미만이면 그 스팟은 음성스팟으로 판단할 수 있다.
본 발명은 또 다른 양태에서, 상기와 같은 분석 통과 기준을 이용하여 각각의 스팟이 양성인지 음성인지를 확인한 다음, 각각의 비뇨생식기 감염 질환 원인균 별로 동일한 스팟 3개에 대하여 양성스팟 또는 음성스팟의 개수를 확인하여 결과적으로 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 감염 여부를 판정하였다.
본 발명에 있어서, 상기 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 감염 여부는 DNA칩 위에 각 비뇨생식기 감염 질환 원인균에 대한 동일한 스팟 3개 모두가 양성스팟일 경우, 각 스팟에 해당하는 원인균의 감염이 있다고 판정하고, 동일한 프로브 스팟 3개 모두가 음성스팟일 경우에는 각 스팟에 해당하는 원인균의 감염이 없다고 판정하되, 동일한 스팟 3개 중 1개 또는 2개만 양성스팟일 경우에는 재진단하여 감염 여부를 판정할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩은 각각의 비뇨생식기 감염 질환 원인균 별로 3개의 동일한 스팟을 포함하고 있어 민감도, 특이도 및 재현성을 극대화할 수 있다.
본 발명은 일 양태에서, 본 발명에 따른 DNA칩을 이용한 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 검출방법의 임상유효성을 확인하기 위하여, PCR기법으로 결과를 확인 한 양성 샘플 70개와 음성 샘플 5개를 대상으로 시퀀싱을 기준으로 하여 본 발명에 따른 DNA칩을 이용한 검출 결과의 정확성을 분석한 결과, 민감도 50%, 특이도 80%의 PCR 검출방법에 비해 STD DNA 칩은 민감도 95%, 특이도 100%로 그 유효성이 매우 높은 것을 확인하였으며, 또한, 본 발명에 따른 프로브와 이미 공지되어 사용되고 있는 프로브와의 비교 실험을 통해 본 발명에 따른 프로브가 이미 공지되어 사용되고 있는 프로브보다 민감도가 우수한 것을 확인하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1
비뇨생식기 감염 질환 원인균에 대해 특이성이 우수한 신규 프로브의 제조
각 비뇨생식기 감염 질환 원인균에 대해 특이성이 우수한 신규의 프로브를 개발하기 위하여, 먼저, 각 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 타겟 부위를 선정하였으며, 이를 위하여, 계통 파악에 흔히 사용되는 16S rRNA (진핵생물인 Candida albicans는 18S rRNA) 및 23S rRNA 유전자의 원인균 특이적인 서열에서 프로브의 서열을 1차적으로 결정하고, 이 부위에 적절한 서열이 없을 경우에는 원인균에 특이적인 유전자와 염기서열을 타겟 부위로 선택하였다. 각 원인균에 해당하는 타겟 부위의 유전자와 염기서열의 GenBank 번호는 표 1과 같다. 타겟 부위 선정 후, BLAST engine (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)을 통해 확보한 각 원인균 및 베타글로빈의 염기 서열을 Primer 3 (Whitehead Institude/MT Center for Genome Research) 프로그램을 사용하여 디자인한 프라이머들의 염기서열과 cross-checking 한 후, 각 원인균마다 비특이적 혼성화를 최소화 할 수 있는 최적의 프로브 후보 2 종 이상을 OligoArray 2.0 (http://berry.engin.umich.edu/oligoarray) 프로그램을 이용하여 35mer 길이로 설계하였다.
이러한 후보 프로브들의 목적 원인균 진단 능력을 평가하기 위해 실제 DNA칩 혼성화 반응을 통한 스크리닝 테스트를 수행하였다. 도 1의 (a)와 같이 설계된 DNA칩을 이용하여 각 원인균의 증폭산물과 각각 혼성화 시킨 결과, 도 1의 (b)에 나타난 바와 같이, 14종의 원인균에 대한 각각의 후보 프로브들 중 EC, EF, GV, MH의 후보 프로브인 EC_2, EF_1, GV_1 및 MH_1이 다른 원인균 유전자의 증폭산물과 비특이적으로 혼성화하는 것을 확인하였으며, 이러한 비특이적 혼성화를 야기하는 프로브들은 제거하고, 각 목적 원인균 및 베타글로빈의 증폭산물에 대한 후보 중 더 강한 형광 세기를 보이는 프로브들을 선택하여 14종 원인균 및 시험 검증군에 대해 표 2와 같은 염기서열을 가지는 최적의 프로브를 선정하였다. 이 때, 각 프로브는 9개 T로 이루어진 linker가 앞쪽에 있고, 뒤에 35개의 STD 원인균 특이적 프로브 서열이 붙어 있는 형태로 이루어져 있으며, T-linker는 스페이서로 삽입되어 PCR 산물과 프로브 간의 혼성화반응의 효율을 높이는 역할을 한다.
T-linker의 유무에 따른 혼성화 반응의 효능을 확인하기 위하여, GV에 단일 감염된 임상검체를 이용하여 PCR 검출 방법으로 GV 단일 밴드를 확인한 후, T-linker가 없는 GV 프로브 및 T-linker가 있는 GV 프로브가 고정되어 있는 DNA 칩과 혼성화 반응을 시켜 T-linker가 없는 프로브와 T-linker가 있는 프로브의 칩 반응의 형광 신호세기 값을 확인하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, T-linker의 존재 유무와 상관없이 모두 SV값 및 SBR값에 대한 컷오프 수치를 넘어 양성으로 판정되었다. 그러나, 칩의 신호세기 값은 T-linker가 없는 프로브의 경우, 1016, 1765로 두 동일 스팟 간의 신호세기의 편차가 크고 불안정하게 나타난 반면, T-linker가 있는 프로브의 경우에는 1517, 1575로 두 스팟 간에 안정된 신호세기 값을 재현성 있게 보여주었다. 따라서, 프로브에 T-linker가 있는 경우, 혼성화 반응의 효율을 높여 재현성 있는 형광 신호세기를 나타내는 것을 확인하였다. 이는, DNA칩을 이용한 병원체 검출 방법을 컷오프 수치를 적용하여 임상진단에 적용할 경우, 판정 단계의 오류를 줄일 수 있음을 의미한다.
DNA칩의 제조방법, 유전자 증폭방법, DNA칩 혼성화 방법 및 혼성화 검출방법은 하기 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였으며, 목적 원인균 유전자 증폭은 표 3의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용하였다.
실시예 2
DNA칩을 이용한 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 검출
(1) DNA칩의 제조
DNA칩을 제조하기 위하여, 프로브를 집적시킬 슬라이드로 알데히드가 코팅되어 있는 유리 기판을 사용하였으며, 고압의 먼지 제거기를 이용하여 표면의 먼지를 제거한 다음 집적기기인 마이크로스팟터(Microspotter)의 슬라이드 장착 위치에 장착하였다. 그리고 SMP3 핀을 3차 증류수가 담긴 초음파기에서 세척한 다음 건조시켜 마이크로스팟터의 핀 장착 부위에 장착하였다. 집적용 핀과 슬라이드를 장착한 후 25℃ 및 70% 습도에서 마이크로스팟터를 작동시켰다.
각각의 프로브는 25pmol/μl, 50% DMSO 농도로 제조한 다음, -20℃에서 16시간 이상 안정화시켰으며, 각 프로브의 염기서열은 표 2에 나타난 바와 같다. 그 다음, 마이크로스팟터를 작동시켜 상기 SMP3 핀을 이용하여 각각의 프로브를 3회씩 4-플렉스(plex) 형태로 상기 알데히드가 코팅되어 있는 유리 기판 위에 스팟팅하여 고정하였다 (도 3). 그 다음, 프로브가 고정된 유리 기판 위에 반응 웰 역할을 하는 반응 챔버와 증발방지 목적의 투명 필름커버를 부착하였다.
(2) DNA의 증폭
검출하고자 하는 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 DNA를 증폭하기 위하여, 표 3에 나타난 바와 같이, 3개의 그룹으로 나누어 멀티플렉스(mutiplex) PCR을 수행하였으며, 시험 검증군으로 베타-글로빈을 이용하였다. 베타-글로빈을 증폭하기 위해 사용된 전방향(F) 프라이머 및 역방향(R) 프라이머의 염기서열, 각각의 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 DNA를 증폭하기 위하여 사용된 전방향(F) 프라이머 및 역방향(R) 프라이머의 염기서열 및 상기 프라이머 세트(전방향(F) 프라이머 및 역방향(R) 프라이머)를 이용하여 증폭되는 산물의 크기는 표 3과 같으며, 상기 제조된 DNA칩과 상보적으로 결합하는 증폭된 DNA를 검출하기 위하여, 각각의 역방향 프라이머의 5' 말단은 Cy3로 표지하였다.
계속해서, 실제 GV, UU, HSV2 및 TV의 복합감염자 환자의 샘플에서 추출한 원인균 유전자를 이용하여 상기와 같이 멀티플렉스 PCR을 수행하였다. 실제 환자의 샘플에서 추출한 원인균 유전자, 0.2 μM의 프라이머 세트, 1X PCR reaction buffer(30 mM Tris-HCl, 30 mM KCl, 30 mM (NH4)2SO4 , 2 mM MgCl2), 0.4 mM dNTPs 및 1.0 U i-star Taq polymerase (iNtRON Biotechnology, Korea)을 혼합하여 반응 혼합물을 제조하였으며, Perkin-Elmer 9200 thermo-cycler (Perkin-Elmer, Norwalk, CT)를 이용하여 DNA를 증폭시켰다. PCR의 조건은 이중가닥 DNA를 denaturation 시키기 위하여 94℃에서 5분간 heating한 다음, 94℃에서 50초, 57ㅀC에서 45초, 72℃에서 50초의 사이클을 38번 반복한 뒤, 72℃에서 10분간의 마지막 extension 과정을 거쳤으며, 상기 PCR 산물은 아가로오스 전기영동 (agarose gel electrophoresis)을 이용하여 PCR 여부와 사이즈를 확인하였다 (도 4).
(3) DNA칩 혼성화
DNA칩 혼성화 반응을 수행하기 위하여, 먼저 혼성화 반응을 수행하기 30분 전에 -20℃ 냉동고에 보관되어 있는 혼성화 용액(Hybridization solution; 5X SSC, 25% formamide, 25ug/ml Human HybMasker Cot-1 DNA, 10% Dextran sulfate, 0.1% SDS)을 꺼내어 42℃ 반응조에 넣어 Pre-warming시키고, -20℃ 냉동고에 보관되어 있는 Anti PM(100nM)을 꺼내어 녹인 후, 6000xg에서 10초간 원심분리하여 용액을 튜브 바닥에 모은 후 얼음에 박아 두었다.
마이크로 튜브에 상기 3개의 그룹에 대한 PCR 증폭 산물을 각각 10μl씩 총 30μl의 PCR 증폭 산물을 첨가한 후 피펫을 이용하여 잘 섞어 준 다음, 95℃에서 5분간 방치하였다. 그리고 상기 튜브에 Pre-warming된 혼성화 용액(hybridization solution) 40μl를 피펫을 이용하여 첨가하고, Anti PM 1μl를 첨가하였다. 그 다음, 71μl 중에서 혼성화 반응액으로 70μl를 DNA칩 표면에 부착된 필름 커버에 있는 주입구에 천천히 주입한 다음 혼성화 챔버를 조립하였다. 이때, 칩과 반응 웰 사이에 기포가 있으면 글러브를 낀 손으로 기포를 밀어내듯이 쓸어내어 기포를 제거하였다. 그 다음, 42℃ 반응조에서 2시간 동안 혼성화 반응시킨 후, 반응조에서 혼성화 챔버를 꺼내 해체하여 칩을 꺼내고 칩의 반응 챔버와 투명 필름커버를 제거하였다.
세척용 용기로 50ml 튜브를 이용하여 세척액 1(2X SSC, 0.1% SDS)을 칩이 잠길 수 있게 튜브에 부은 다음, 칩을 넣고 핀셋을 이용하여 위아래로 1초에 2회 왕복속도로 10~15회 흔든 후 세척액 1과 칩이 담겨있는 상기 50ml 튜브를 50℃ 반응조에 넣고 5분간 방치하였다. 계속해서, 새 50ml 튜브에 세척액 2(0.1X SSC)를 칩이 잠길 수 있게 부은 다음, 칩을 넣고 핀셋을 이용하여 위아래로 1초에 2회 왕복속도로 10~15회 흔들어 준 다음 실온에서 1분간 방치 후 사용한 세척액 2를 버리고 새로운 세척액 2를 이용하여 상기와 같이 1회 더 반복하여 칩을 세척하였다.
세척 후 칩에 남아 있는 물기를 제거하기 위하여 물기가 없는 50ml 튜브에 칩을 넣고 100xg에서 5분간 원심분리하여 칩에 남은 세척액을 제거하였다.
계속해서, 상기 칩을 형광 스캐너 GenePix 4000B (Axon Instruments, Union City, CA)를 이용하여 형광 스캐닝하고 (도 5), 스캔한 칩의 영상으로부터 결과판정을 위한 각 스팟의 시그날(intensity) 값을 분석하여 각 스팟에 대한 SV(Spot value) 및 SBR(Signal to Background Ratio) 값을 얻었다.
여기서, SV값이란 각 스팟 영상의 화소와 스팟을 둘러싼 배경 영상의 화소 값의 차이로 532 nm 파장으로 스캐닝한 값을 기준으로 532 nm median pixel intensity 값에서 532 nm background pixel intensity 값을 제외한 값을 의미하며, 마이크로어레이 데이터 파일인 gpr 파일의 'F532median-B532median' 항목이 이에 해당한다. 또한, SBR값은 각 스팟 영상의 화소와 스팟을 둘러싼 배경 영상의 화소값의 비로 532 nm median pixel intensity / 532 nm background median pixel intensity를 의미하며, gpr파일의 F532 median의 항목과 B532 median항목을 이용하여 프로그램 내에서 F532 median / B532 median 값을 계산하여 분석에 적용할 수 있다.
(4) 결과판정
비뇨생식기 감염 질환 원인균의 감염 여부를 확인하기 위하여, 각각의 스팟에 대하여 양성인지 음성인지를 판단하였으며, 이를 위한 분석 통과 기준(cut-off value)은 다음과 같다:
양성스팟 : SV값이 1000 이상, SBR 값이 2.5 이상
음성스팟 : SV값이 1000 미만이거나 SBR 값이 2.5 미만
상기와 같은 분석 통과 기준을 이용하여 각각의 스팟이 양성인지 음성인지를 확인하였으며, 동일한 스팟 3개 모두가 양성스팟일 경우, 각 스팟에 해당하는 원인균의 감염이 있다고 판정하였으며, 동일한 스팟 3개 모두가 음성스팟일 경우, 각 스팟에 해당하는 원인균의 감염이 없다고 판정하였다. 또한, 동일한 스팟 3개 중 1개 또는 2개만 양성스팟으로 확인된 경우에는 신뢰성 있는 판단을 내리기에 충분치 않다고 판정하고 재진단하였다.
그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이, 각각의 비뇨생식기 감염 질환 원인균에 해당하는 스팟에 대한 SV값 및 SBR값을 얻었으며, GV의 경우, 3개의 스팟의 SV값은 각각 1688, 1674, 1763을 나타내었고, SBR값은 9.75, 9.81, 10.23을 나타내어 3개의 스팟 모두 상기 분석 통과 기준을 통해 양성스팟으로 확인되었으며, GV가 검출되었다고 판정하였다. 같은 방법으로 나머지 13종의 비뇨생식기 감염 질환 원인균에 대해 확인한 결과, UU, HSV2, TV가 검출된 것을 확인할 수 있었으며, 나머지 원인균은 검출되지 않은 것을 확인하였다.
비뇨생식기 감염 질환 원인균의 검출을 위한 멀티플렉스 PCR, DNA칩 혼성화 및 형광 스캐닝의 전체 분석 과정을 나타낸 개략도는 도 6에 나타내었다.
표 4
Figure PCTKR2011009150-appb-T000004
또한, 본 발명에 따른 DNA칩을 이용한 검출방법의 검출 한계를 확인하기 위하여, GV 에 대한 최소 검출 한계를 10-107카피 범위에서 SV(Singnal value) 값을 확인한 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 최소 검출 한계가 102카피임을 확인하였다. 또한, GV 이외의 나머지 13종 원인균에 대해서도 표적 유전자 부위의 클론을 이용하여 최소검출 한계를 확인한 결과, 102~103카피 범위에서 모든 검출이 가능한 것을 확인하였다.
실시예 3
DNA칩을 이용한 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 검출의 민감도 및 특이도
본 발명에 따른 DNA칩을 이용한 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 검출방법의 임상유효성을 확인하기 위하여, PCR기법으로 결과를 확인 한 양성 샘플 70개와 음성 샘플 5개를 대상으로 시퀀싱을 기준으로 하여 본 발명에 따른 DNA칩을 이용한 검출 결과의 정확성을 분석하였다.
도 8은 PCR과 DNA 칩의 민감도 비교를 위해 임상샘플을 이용하여 실험한 결과의 일 예를 나타낸 것이며, 도 8에 나타난 바와 같이, 위음성의 예로서, PCR 검출방법으로는 아가로오즈 전기영동을 통해 GV, MG, UU, IC의 검출이 확인되었으며, 본 발명에 따른 DNA칩을 이용한 검출방법으로는 GA, MG, UU, IC와 함께 CA 병원체가 추가로 확인이 되었다. 이러한 두 검출방법의 민감도 차이를 염기서열 분석방법을 시행하여 확인한 결과, 임상샘플 상에 GV, MG, UU, IC와 CA가 함께 존재하는 것을 확인하였으며, 이는 민감도가 높은 DNA칩을 통한 시험으로 극소량 감염된 병원체의 검출도 가능하다는 것을 의미한다.
또한 위양성의 임상 예로서, PCR 검출 방법으로는 CT, SA, UU, IC를 확인한 반면, 본 발명에 따른 DNA칩을 이용한 검출 방법으로는 SA, UU, IC이 검출 되었고, 염기서열 분석 방법을 이용하여 확인 한 결과, PCR 검출방법에서 확인된 CT는 위음성으로 확인되었다. 이는 아가로오즈 전기영동을 통한 판독 단계에서 비특이적인 PCR 산물에 대해 자칫 검사자가 위양성의 결과를 양성으로 판단하게 되는 오류를 범할 수 있으므로 그 특이도 또한 DNA 칩이 우수함을 확인할 수 있다.
이러한 실험들을 반복한 결과, 민감도 50%, 특이도 80%의 PCR 검출방법에 비해 본 발명에 따른 DNA 칩은 민감도 95%, 특이도 100%로 그 유효성이 매우 높은 것을 확인할 수 있었다.
표 5
Figure PCTKR2011009150-appb-T000005
또한, 본 발명에 따른 신규 프로브들이 이미 공지되어 사용되고 있는 프로브 서열들과 비교하여 민감도 및 특이도가 우수하다는 것을 입증하기 위하여, 표 5에 나타난 바와 같이, 이미 공지되어 있는 프로브로서, 진단키트 제조회사로 알려진 굿젠에서 출원한 대한민국 공개특허 제10-2010-0058919호에 기재되어 있는 프로브 염기서열을 이용하여 제조된 프로브와 본 발명에 따른 신규 프로브를 각각 2번씩 반복 스팟팅하여 실시예 2와 동일한 방법으로 DNA 칩을 제조하였으며(도 9), 이미 공지되어 있는 프로브에 대한 PCR은 대한민국 공개특허 제10-2010-0058919호에 명시되어있는 프라이머를 사용하였으며, Cy3-dCTP를 이용한 바디 레이블링 방법을 이용하여 대한민국 공개특허 제10-2010-0058919호에 명시되어있는 PCR 조건에 맞추어 수행하였다. 그 다음, DNA칩 혼성화 및 결과판정은 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다. 이 때, 샘플은 12종의 검출 여부를 확인할 수 있도록 단일 PCR 검사 및 시퀀싱으로 감염이 확인된 임상샘플의 혼합체를 사용하였다.
그 결과, 도 9 및 표 6에 나타난 바와 같이, DNA칩의 형광 신호세기 값에서 차이가 많이 나는 것을 볼 수 있으며 대부분의 경우에서 본 발명에 따른 프로브는 양성 스팟으로 판정된 반면, 이미 공지되어 있는 프로브는 음성 스팟으로 판정된 것을 확인하였다.
표 6
Figure PCTKR2011009150-appb-T000006
표 6은 각 스팟의 신호세기 값을 나타낸 것으로, MH의 경우, 이미 공지되어 있는 프로브의 신호세기 값은 SV 값이 2417, 2329 이고 SBR 값은 7.71, 7.73의 값을 나타낸 반면, 본 발명에 따른 프로브의 신호세기 값은 SV 값이 4896, 4634이고, SBR 값은 15.49, 14.63의 값을 나타내는 것을 확인하였으며, 이를 통해, 두 프로브 모두 분석 통과 기준 수치를 넘어 양성 스팟으로 판정되었으나, 본 발명에 따른 프로브의 신호세기 값이 더 높게 나타났으므로 본 발명에 따른 프로브의 민감도가 더 우수한 것을 확인하였으며, MG의 경우에는 이미 공지되어 사용되고 있는 프로브 경우에서는 신호세기 값이 낮게 나와 음성 스팟으로 판정된 반면, 본 발명에 따른 프로브에서는 양성스팟으로 판정된 것으로 확인하였다.
즉, 본 발명에 따른 프로브와 이미 공지되어 사용되고 있는 프로브와의 비교 실험을 통해 본 발명에 따른 프로브가 높은 민감도를 나타낸 것을 확인할 수 있었다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩은 민감도, 특이도 및 재현성이 우수할 뿐만 아니라 다양한 검체를 대상으로 복합감염까지 포함하여 14종의 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 감염 여부를 신속 정확하게 분석할 수 있어 비뇨생식기 감염 질환에 대한 1차 진료기관의 진단 및 처치에 유용하게 사용할 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음,

Claims (12)

  1. 서열번호 1 내지 14의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정되어 있는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 14의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프로브는 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 DNA와 하이브리다이제이션(hybridization)되는 것을 특징으로 하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩.
  3. 제2항에 있어서, 상기 비뇨생식기 감염 질환 원인균은 대장균(Escherichiacoli), 클랩시엘라 프네우모니아이(Klebsiellapneumoniae), 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcusaureus), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcusfecalis), 임질균(Neisseriagonorrhea), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydiaetrachomatis), 유레아플라즈마 유레아라이티쿰(Ureaplasmaurealyticum), 마이코플라즈마 호미니스(Mycoplasmahominis), 마이코플라즈마 제니탈리움(Mycoplasmagenitalium), 트리코모나스 바지날리스(Trichomonasvaginalis), 칸디다 알비칸스(Candidaalbicans), 가드넬라 바지날리스(Gardnerellavaginalis), 헤르페스심플렉스바이러스 유형 1(Herpessimplexvirus-type1) 및 헤르페스심플렉스바이러스 유형 2(Herpessimplexvirus-type2)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩.
  4. 제1항에 있어서, 시험 검증군 및 혼성화 검증군을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩.
  5. 제4항에 있어서, 상기 시험 검증군은 베타-글로빈과 하이브리다이제이션이 가능한 서열번호 15의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프로브인 것을 특징으로 하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩.
  6. 제4항에 있어서, 상기 혼성화 검증군(Position Marker)은 서열번호 16의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프로브인 것을 특징으로 하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩.
  7. 제1항에 있어서, 상기 DNA칩은 각 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 유전자당 3 개의 동일한 스팟(spot)을 포함하며, 중간 위치에 시험 검증군 및 혼성화 검증군의 반복적인 스팟을 포함하는 전체 프로브가 집적된 구간을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩.
  8. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 DNA칩 기판에 고정화되기 위하여 5'말단에 T-링커를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 DNA칩.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 DNA칩; 비뇨생식기 감염 질환 원인균의 DNA 및 시험 검증군인 베타-글로빈을 증폭하기 위한 프라이머 세트; 및 혼성화 검증군과 상보적인 염기서열을 가지는 올리고머인 Anti PM을 포함하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 17 및 18의 염기서열을 가지는 엔테로코커스 페칼리스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 19 및 20의 염기서열을 가지는 칸디다 알비칸스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 21 및 22의 염기서열을 가지는 마이코플라즈마 호미니스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 23 및 24의 염기서열을 가지는 가드넬라 바지날리스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 25 및 26의 염기서열을 가지는 클라미디아 트라코마티스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 27 및 28의 염기서열을 가지는 베타-글로빈(beta-globin) DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 29 및 30의 염기서열을 가지는 베타-글로빈(beta-globin) DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 31 및 32의 염기서열을 가지는 대장균 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 33 및 34의 염기서열을 가지는 스태필로코쿠스 아우레우스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 35 및 36의 염기서열을 가지는 마이코플라즈마 제니탈리움 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 37 및 38의 염기서열을 가지는 헤르페스심플렉스바이러스 유형 1 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 39 및 40의 염기서열을 가지는 헤르페스심플렉스바이러스 유형 1 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 41 및 42의 염기서열을 가지는 트리코모나스 바지날리스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 43 및 44의 염기서열을 가지는 트리코모나스 바지날리스 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 45 및 46의 염기서열을 가지는 임질균 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 47 및 48의 염기서열을 가지는 유레아플라즈마 유레아라이티쿰 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 49 및 50의 염기서열을 가지는 클랩시엘라 프네우모니아이 DNA 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 51 및 52의 염기서열을 가지는 헤르페스심플렉스바이러스 유형 2 DNA 증폭용 프라이머 세트 및 서열번호 53 및 54의 염기서열을 가지는 헤르페스심플렉스바이러스 유형 2 DNA 증폭용 프라이머 세트를 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 키트.
  11. 제9항에 있어서, 상기 프라이머는 5' 말단에 상기 DNA칩과 상보적으로 결합하는 증폭된 DNA를 검출하기 위한 표지수단을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 표지수단은 Cy5, Cy3, FAM, TAMRA, Alexa Fluor 및 Texas Red로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 비뇨생식기 감염 질환 진단용 키트.
PCT/KR2011/009150 2011-09-23 2011-11-29 비뇨생식기 감염 질환 진단용 dna칩 Ceased WO2013042824A1 (ko)

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