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WO2017061528A1 - 血小板製造用デバイス、血小板製造装置及び血小板製造方法 - Google Patents

血小板製造用デバイス、血小板製造装置及び血小板製造方法 Download PDF

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Publication number
WO2017061528A1
WO2017061528A1 PCT/JP2016/079738 JP2016079738W WO2017061528A1 WO 2017061528 A1 WO2017061528 A1 WO 2017061528A1 JP 2016079738 W JP2016079738 W JP 2016079738W WO 2017061528 A1 WO2017061528 A1 WO 2017061528A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
platelet
depth
flow path
megakaryocyte
platelet production
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2016/079738
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
臣耶 佐久間
新井　史人
啓太郎 伊藤
和也 田代
浩之 江藤
壮 中村
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nagoya University NUC
Kyoto University NUC
Original Assignee
Nagoya University NUC
Kyoto University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nagoya University NUC, Kyoto University NUC filed Critical Nagoya University NUC
Priority to JP2017544215A priority Critical patent/JPWO2017061528A1/ja
Publication of WO2017061528A1 publication Critical patent/WO2017061528A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion

Definitions

  • the present invention relates to a platelet production device, a platelet production apparatus, and a platelet production method, and in particular, a platelet production device, a platelet production apparatus, and a platelet production method for producing platelets efficiently and stably using megakaryocytes.
  • a platelet production device a platelet production apparatus, and a platelet production method for producing platelets efficiently and stably using megakaryocytes.
  • Platelets are blood cells that play an important role in hemostasis, and are produced by separation from cells called megakaryocytes. They circulate in the blood and are used for hemostasis or disintegrate with a certain lifespan. Since platelets cannot divide themselves, they are always made from megakaryocytes and supplemented with the required amount. However, patients with blood diseases that cause serious anemia and a predisposition to bleeding require blood transfusion of platelets, and currently blood transfusions using donated blood products are performed.
  • platelets need to be stored at room temperature in order to maintain their functions. Therefore, there is a problem that the storage period is as short as 4 days. Therefore, there is a need for a device and a manufacturing method for stably supplying a large amount of platelets outside the body without relying on blood donation.
  • a megakaryocyte is held in a holding part having a porous structure through which a culture solution can pass, and from the front chamber part provided on one side of the holding part, the holding part
  • a platelet production method is known in which the megakaryocytes are cultured while allowing the culture solution to pass through the holding portion through a flow channel provided on the other side of the plate (see Patent Document 1).
  • Non-patent document 1 a method of producing platelets by holding megakaryocytes between micropillars formed on a substrate and applying shear force to the megakaryocytes is also known ( Non-patent document 1). Furthermore, as shown in FIG. 2, a method for producing platelets by providing a slit in a flow path formed on a substrate, holding a megakaryocyte in the slit, and applying a shearing force to the megakaryocyte is also known. (See Non-Patent Document 2).
  • each invention forms and holds a holding site for holding megakaryocytes.
  • Platelets are produced from megakaryocytes by applying shear force to the prepared megakaryocytes. Therefore, the invention described in the above-mentioned document needs to prepare a megakaryocyte holding site in advance on a substrate.
  • the number of megakaryocytes that can be held per unit area is limited by the number of holding sites. As a result, there is a problem that although it depends on the structure of the holding site, it is difficult to improve the production efficiency per unit area when producing platelets from megakaryocytes.
  • the size of megakaryocytes varies between about 25 ⁇ m and 160 ⁇ m. Therefore, in the conventional device, if the interval between the holding parts is too large, the megakaryocytes flow from the gap between the holding parts together with the shear flow, and conversely, if the distance between the holding parts is too small, the megakaryocytes cannot be held. . Therefore, there is also a problem that the production efficiency of platelets per unit area cannot be increased.
  • the flow path for sending megakaryocytes to the holding site and the flow path for applying shear force to the megakaryocytes are separate flow paths. For this reason, there is a problem that at least two or more pump systems for feeding the liquid to the flow path are necessary, and the apparatus and control are complicated.
  • the present invention was made in order to solve the above problems, and as a result of extensive research, (1) the depth was adjusted so that one end could receive megakaryocytes and the other end could pass platelets.
  • the megakaryocyte can be held in the channel without any special preparation of the megakaryocyte holding site, and (2) the produced platelets flow out from the depth of the channel on the side where the megakaryocyte can be introduced.
  • the megakaryocytes can be held anywhere in the flow path even if the size of the megakaryocytes is different.
  • megakaryocytes stretched and reduced by shearing force can be held downstream of the flow path, and platelets can be continuously produced.
  • the shear force applied to the megakaryocyte When the inclination (depth) of the flow path is adjusted to be equal, the shearing force applied to the megakaryocyte is the same, so that the quality of the platelets to be manufactured can be made uniform, (5) the megakaryocyte and the It was newly found that the apparatus and the control can be simplified because the flow path (injection hole) for supplying the liquid for applying the shearing force to the megakaryocyte can be made one.
  • an object of the present invention is to provide a platelet production device, a platelet production apparatus, and a platelet production method for producing platelets efficiently and stably using megakaryocytes.
  • the present invention relates to the following platelet production device, platelet production apparatus and platelet production method.
  • a platelet production device used for producing platelets from megakaryocytes wherein the platelet production device includes at least a first member and a channel depth adjusting member,
  • the first member can hold a megakaryocyte by being combined with the second member, can flow a liquid for applying a shearing force to the megakaryocyte, and includes a manufactured platelet outlet Forming a flow path,
  • the channel depth adjusting member has a depth at which one end of the channel can pass through the megakaryocyte and the other end of the channel. Adjust the depth of the channel so that the outlet of the platelet is shallower, Platelet production device.
  • the flow path depth adjusting member is a wall portion or a pillar formed in the first member.
  • the flow path depth adjusting member can be inserted into the charging hole, and a megakaryocyte and an opening for charging a liquid for applying a shearing force to the megakaryocyte are input to the flow path.
  • the platelet production device according to the above (3) which is a cylindrical body.
  • (6) The platelet production device according to any one of (1) to (5), wherein the channel depth adjusting member adjusts the depth of the platelet outlet to 0.5 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less. .
  • (7) The platelet production device according to (6), wherein the flow path depth adjusting member adjusts the depth of the platelet outlet to 2 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less.
  • the platelet production device according to any one of the above (1) to (10), comprising a second member that forms a flow path for holding megakaryocytes by being combined with the first member.
  • a capture pillar capable of trapping a platelet precursor formed by stretching megakaryocytes is formed on the first member and / or the second member, When the first member and the second member are combined, the capturing pillar is disposed at a part of the flow channel on the platelet outlet side, as described in (11) or (12) above. Platelet production device.
  • the platelet production device according to any one of the above (1) to (13), a liquid capable of feeding megakaryocytes into the platelet production device, and applying shearing force to the megakaryocytes
  • a platelet production apparatus comprising at least a pump for feeding liquid.
  • a method for producing platelets comprising at least
  • the platelet production apparatus When using the platelet production device, the platelet production apparatus, and the platelet production method of the present invention, it is not necessary to prepare a holding site for megakaryocytes, and the megakaryocytes elongated by shearing force are also downstream of the flow path. Can be retained. Therefore, the production space for the holding site is not required, and the inserted megakaryocytes can be used for the production of platelets without loss, so that the production efficiency of platelets per unit area can be improved.
  • the structure of the device for producing platelets can be simplified, and design and processing are facilitated.
  • the shearing force applied to the megakaryocyte is the same, the quality of manufactured platelets can be made more uniform.
  • the device 1 of the present invention can have a single megakaryocyte and a channel (injection hole) for supplying a liquid for applying a shearing force to the megakaryocyte, a single liquid feed pump can be used.
  • a platelet production apparatus can be produced. Therefore, the platelet production apparatus and the control of the apparatus can be simplified.
  • FIG. 1 is a diagram of a conventional device for producing platelets described in Non-Patent Document 1.
  • FIG. 2 is a diagram of a conventional platelet production device described in Non-Patent Document 2.
  • FIG. 3 shows an example of an embodiment of a device for producing platelets.
  • FIG. 3 (1) is a top view of the device
  • FIG. 3 (2) is a cross-sectional view along AA ′
  • FIG. B 'sectional drawing is represented.
  • 4 shows another embodiment of the device 1
  • FIG. 4 (1) is a top view of the device
  • FIG. 4 (2) is a cross-sectional view along CC ′
  • FIG. 4 (3) is DD. 'Represents a cross-sectional view.
  • FIG. 4 (1) is a top view of the device
  • FIG. 4 (2) is a cross-sectional view along CC ′
  • FIG. 4 (3) is DD. 'Represents a cross-sectional view.
  • FIG. 4 (1) is a top view of the device
  • FIG. 5 is a cross-sectional view showing an example of an embodiment in which a plurality of first members 2 are combined in still another embodiment of the device 1.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view showing still another embodiment in which a plurality of first members 2 are combined.
  • 7A is a top view of an example of the stopper 92
  • FIGS. 7B and 7C are top views of the first member 2.
  • FIG. 8 is a cross-sectional view of still another embodiment of the device 1.
  • 9 shows still another embodiment of the device 1.
  • FIG. 9 (1) is a top view of the device 1
  • FIG. 9 (2) is a cross-sectional view taken along the line EE ′
  • FIG. 9 (1) is a top view of the device 1
  • FIG. 9 (2) is a cross-sectional view taken along the line EE ′
  • FIG. 10 shows still another embodiment of the device 1.
  • FIG. 10 (1) is a top view of the device 1
  • FIG. 10 (2) is a cross-sectional view along GG ′
  • FIG. 10 (3) is HH. 'Represents a cross-sectional view.
  • FIG. 11 shows the positions of the symbols in the formula (1).
  • FIG. 12 shows a procedure for manufacturing the first member 2 using a mold and then manufacturing the device 1.
  • FIG. 13 is a diagram showing still another embodiment of the device 1.
  • FIG. 14 shows a procedure for forming the capture pillar 71 on the first member 2 and then manufacturing the device 1.
  • FIG. 15 shows a procedure for forming the capturing pillar 71 on the second member 5 and then manufacturing the device 1.
  • FIG. 10 (1) is a top view of the device 1
  • FIG. 10 (2) is a cross-sectional view along GG ′
  • FIG. 10 (3) is HH. 'Represents a cross-sectional view.
  • FIG. 11 shows the positions of the symbols in
  • FIG. 16 is a photograph substituted for a drawing, and a photograph of the mold produced in Example 1.
  • FIG. 17 is a graph of design values and measured values of the depth of the mold produced in Example 1.
  • FIG. 18 is a drawing-substituting photograph and a photograph of the device 1 produced in Example 1.
  • FIG. 19 is a drawing-substituting photograph, FIG. 19 (1) is a photograph of a megakaryocyte captured in the flow path 6, and FIG. 19 (2) is a photograph when a shearing force is applied. The arrow in the photograph is a megakaryocyte. Is a platelet precursor formed by stretching.
  • FIG. 20A is a design diagram of the capturing pillar 71, and FIG. 20B is an enlarged view.
  • FIG. 20A is a design diagram of the capturing pillar 71
  • FIG. 20B is an enlarged view.
  • FIG. 20 (3) is a drawing substitute photograph, a photograph of the device 1 produced in Example 3, and
  • FIG. 20 (4) is a drawing substitute photograph, which is an enlarged photograph of a portion where the capturing pillar 71 is arranged.
  • FIGS. 21 (1) and (2) are photographs substituted for drawings, and are photographs of the same place during application of shear force in Example 4.
  • FIG. 21 (1) and (2) are photographs substituted for drawings, and are photographs of the same place during application of shear force in Example 4.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of an embodiment of a device for producing platelets of the present invention (hereinafter sometimes referred to as “device”).
  • FIG. 3 (1) is a top view of the device, and FIG. ) Is a cross-sectional view along AA ′, and FIG. 3 (3) is a cross-sectional view along BB ′.
  • the device 1 of the present invention includes at least a first member 2 and a flow path depth adjusting member 3.
  • the first member 2 has an insertion hole 21 for introducing a megakaryocyte and a liquid for applying a shearing force to the megakaryocyte, and is used in combination with the second member 5 to hold the megakaryocyte.
  • a flow path 6 can be formed.
  • the flow channel depth adjusting member 3 has a depth (h 1 ) through which the megakaryocyte can pass on the inlet hole 21 side of the flow channel 6. The depth of the flow path 6 is adjusted so that the depth of the flow path 6 becomes shallower toward the platelet outlet 23 (depth h 2 ) on the other end side.
  • the megakaryocyte (indicated as “MK” in the drawing) introduced from the introduction hole 21 is held at any location of the flow channel 6 depending on the size. be able to. Then, by flowing a liquid from the insertion hole 21 and applying a shearing force to the megakaryocyte, platelets (indicated as “PL” in the drawing) can be produced.
  • the first member 2 has a substantially cylindrical shape.
  • the upper surface of the first member 2 is circular, and a charging hole 21 is formed at the center of the circle.
  • the first member 2 is formed with an inclined surface from the charging hole 21 toward the outlet 23, and as shown in FIGS. 3 (1) and 3 (3).
  • a wall portion for adjusting the height is set so that the depth of the flow path 6 on the inlet hole 21 side is h 1 and the depth of the outlet 23 is h 2. It is formed radially. Therefore, when the first member 2 is combined with the second member 5, the wall (flow path depth adjusting member 3) comes into contact with the second member 5.
  • the outlet 23 is formed by the adjacent wall portion, the inclined surface of the first member 2 and the second member 5. It can be depth to form a flow path 6 of h 2.
  • the wall 3 is formed in at least three places in consideration of stability of the distance. do it.
  • the flow path depth adjusting member 3 is integrally formed with the first member 2, but may be separated if the flow path 6 can be formed.
  • the depth (h 1 ) through which the megakaryocyte can pass may be set on the inlet hole 21 side of the flow path 6. Since the size of megakaryocytes is about 25 ⁇ m to 160 ⁇ m, h 1 should be at least 25 ⁇ m or more. Considering the efficiency, such as 160 ⁇ m, 200 ⁇ m, 250 ⁇ m, 300 ⁇ m or more, the size of megakaryocytes can be passed without difficulty. If there is no particular limitation.
  • the diameter of the insertion hole 21 is not particularly limited as long as it is at least a width that can pass through the megakaryocyte, and may be a numerical value in the same range as h 1 .
  • the megakaryocyte needs to be held in any part of the flow path 6. Therefore, the platelet outlet 23 (depth h 2 ) needs to be set to a depth at which all the input megakaryocytes do not flow out, and may be, for example, 150 ⁇ m, 100 ⁇ m, or 50 ⁇ m or less.
  • the megakaryocytes flow out from the outlet 23 in addition to platelets, only the megakaryocytes may be removed using a filter.
  • the outlet 23 depth h 2
  • the outlet 23 depth h 2
  • the depth which is hard to flow out such as 9 micrometers, 8 micrometers, 5 micrometers or less, etc.
  • the lower limit of the outlet 23 may be any size that platelets can pass.
  • the size of platelets is said to be about 1 ⁇ m to 4 ⁇ m, but the size of platelets artificially produced in vitro has a maximum diameter of 8 ⁇ m.
  • the shape of platelets is indeterminate because the cytoplasm of megakaryocytes is generated by shearing. Therefore, considering the flow velocity of the shear flow at the time of producing platelets, the outlet 23 (depth h 2 ) is 0.5 ⁇ m, 1 ⁇ m, 2 ⁇ m, 3 ⁇ m or more, etc., which allows platelets produced from megakaryocytes to pass through. Just do it.
  • the outlet 23 (depth h 2 ) is preferably 0.5 ⁇ m to 100 ⁇ m, and preferably 2 ⁇ m to 30 ⁇ m. More preferably, it is more preferably 3 ⁇ m or more and 9 ⁇ m or less.
  • an outer wall 8 for storing a liquid containing platelets flowing out from the outlet 23 may be formed around the outlet 23.
  • the liquid containing platelets can be stored between the first member 2 and the outer wall 8, so that the platelets can be easily collected.
  • the outer wall 8 may be formed as a separate member from the first member using a material described later and attached to the second member 5.
  • the device 1 of the present invention may be another embodiment as long as the size of the flow path 6 is obtained when the first member 2 and the second member 5 are combined by the flow path depth adjusting member 3. .
  • FIG. 4 is a view showing another embodiment of the device 1 of the present invention.
  • FIG. 4 (1) is a top view of the device 1
  • FIG. 4 (2) is a cross-sectional view along CC ′
  • FIG. DD 'sectional drawing is represented.
  • FIG. 4 an example in which pillars are formed on the first member 2 as the flow path depth adjusting member 3 instead of the wall portion is shown.
  • the height of the pillar is adjusted so that the size of the flow path 6 is obtained when the first member 2 is brought into contact with the second member 5 as in the embodiment shown in FIG. That's fine.
  • the number of pillars is not particularly limited as long as the number of pillars is 3 or more in consideration of the stability of the distance between the first member 2 and the second member 5. Further, the place where the pillar is formed is not particularly limited.
  • the upper surface part of the 1st member shown in FIG.3 and FIG.4 is planar.
  • the upper surface of the first member 2 is preferably a flat surface.
  • the upper surface of the first member 2 may be inclined, or a tube insertion port may be formed on the upper surface of the first member 2 in order to make it easy to connect a tube or the like to the insertion hole 21. Good.
  • the inclined surface of the first member 2 shown in FIGS. 3 and 4 is curved, the depth of the flow path 6 may be reduced linearly.
  • FIG. 3 and 4 show an example in which the first member 2 is one, a plurality of the first members 2 may be combined.
  • FIG. 5 is a view showing another embodiment of the device 1, and is a cross-sectional view showing an example of an embodiment in which a plurality of first members 2 are combined.
  • the upper surface of the first member 2 is formed in a planar shape. Therefore, when the first member 2 is further stacked on the first member 2, the first member 2 on the lower side also serves as the second member 5, so the second member 5 is the first member 2 on the lowermost layer. And only need to be combined.
  • the charging holes 21 are at the same position.
  • a megakaryocyte charged from the charging hole 21 of the uppermost first member 2 and a liquid for applying a shearing force are poured, each layer The megakaryocytes can be held in the flow path 6 to produce platelets. Therefore, platelets can be mass-produced.
  • a tube insertion port may be formed on the upper surface of the uppermost first member 2.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view showing another embodiment in which a plurality of first members 2 are combined.
  • a cylindrical body 9 having an opening 91 for introducing a megakaryocyte and a liquid for applying a shearing force to the megakaryocyte into the channel 6 is inserted into the charging hole 21.
  • the first member 2 can be fixed by frictional force, so that the first member will not be displaced even if a plurality of the first members 2 are stacked. , The convenience of handling improves.
  • the cylindrical body 9 may be inserted through the first member 2 in which the wall portion or pillar, which is the flow path depth adjusting member 3, is formed.
  • the adjusting member 3 may be used.
  • a stopper 92 may be formed on the cylindrical body 9 in order to adjust the delicate interval of the flow path 6.
  • 7A is a top view of an example of the stopper 92
  • FIGS. 7B and 7C are top views of the first member 2.
  • FIG. 7 (1) for example, two stoppers 92 are formed in the direction of 180 degrees from the cylindrical body 9, and the notch 22 is sized so that the stopper 92 can be inserted into the insertion hole 21 of the first member 2.
  • the movement of the first member 2 may be stopped by rotating the first member 2 as shown in FIG. 7 (3).
  • the cylindrical body 9 may be used as the flow path depth adjusting member 3 even when the first member 2 is a single layer.
  • FIG. 8 is a cross-sectional view of another embodiment of the device 1 of the present invention.
  • the first member 2 is stacked in the same direction, but the flow path depth adjusting members 3 of the first member 2 are brought into contact with each other, thereby allowing the flow path to flow. 6 may be formed.
  • the shape of the flow path 6 is different from the shape shown in FIGS. 5 and 6, but the megakaryocytes can be held in any of the flow paths 6 by adjusting the platelet outlet 23 to have the depth shown above.
  • Can do That is, since the inclined surface of the first member 2 serves as the second member 5, it is not necessary to prepare another member as the second member 5, and the device 1 of the present invention is manufactured using only the first member 2. Can do.
  • the device 1 shown in FIG. 8 when the flow path depth adjusting members 3 of the first member 2 are brought into contact with each other, the planar portion of the first member 2 is down. Therefore, for example, the device 1 is placed on the flat table 10 or the like, and platelets flowing out from the outlet 23 and a liquid for applying shearing force are dropped along the side surface of the device 1 and collected. Also good.
  • the first member 2 is formed in a substantially cylindrical shape having an inclined surface, but instead of the cylindrical shape, for example, a triangular column, a quadrangular column, a pentagonal column, a hexagonal column, etc. It may be a polygonal column.
  • FIG. 9 shows another embodiment of the device 1 of the present invention.
  • FIG. 9 (1) is a top view of the device 1
  • FIG. 9 (2) is a cross-sectional view taken along the line EE ′, FIG. 4) represents a cross-sectional view along the line FF ′.
  • FIG. 9 (1) is a top view of the device 1
  • the insertion hole 21 is formed near one side of the substantially quadrangular first member 2, the wall-like flow path depth adjusting member 3 is formed in the first member 2, and the second member 5. And the first member 2 are combined to form the flow path 6.
  • the liquid introduced from the introduction hole 21 flows in only one direction of the outlet 23, not in a radial shape. Therefore, as shown in FIG. 9 (3), the first member 2 is formed in a substantially L-shape including the upper surface portion 24 and the vertical portion 25 so that the liquid introduced from the introduction hole 21 does not flow out from other than the outflow port 23. do it.
  • the injection hole 21 is formed in the upper surface portion 24 of the first member 2, but as shown in FIG.
  • the injection hole 21 is formed in the vertical portion 25 of the first member 2. May be formed. Further, in order to prevent the liquid from leaking from the lateral direction, the injection hole 21 may be formed between the two flow path depth adjusting members 3 located on the outermost side.
  • the upper surface portion 24 of the first member 2 is an inclined surface. However, when a plurality of layers are formed, the upper surface portion 24 of the first member 2 is preferably flat.
  • the device 1 may be formed by only the first member 2 by combining the channel depth adjusting members 3 of the first member 2 so as to contact each other without using the second member 5.
  • FIG. 10 shows another embodiment of the device 1 of the present invention.
  • FIG. 10 (1) is a top view of the device 1
  • FIG. 10 (2) is a cross-sectional view along GG ′
  • FIG. HH ′ sectional view is shown.
  • the meganuclear sphere and the introduction hole 21 for introducing a liquid for applying a shearing force to the meganuclear sphere are formed in the first member 2. It is not necessary to provide the injection hole 21 in one member 2.
  • the insertion hole 21 is not provided, as shown in FIG. 10 (3), one end of the tube is directly connected to the opening 26 of the flow path formed by combining the first member 2 and the second member 5, and the other tube The end may be connected to the pump.
  • the megakaryocyte and the liquid for applying a shearing force to the megakaryocyte can be directly introduced into the flow path through the tube.
  • a tube having substantially the same shape as the opening 26 of the flow path formed by the first member 2, the second member 5 and the flow path depth adjusting member 3 may be connected.
  • the upper surface portion 24 of the first member 2 is an inclined surface.
  • the upper surface portion 24 of the first member 2 is preferably flat.
  • the device 1 may be formed by only the first member 2 by combining the channel depth adjusting members 3 of the first member 2 so as to contact each other without using the second member 5.
  • the depth of the flow path 6 may be such that one end side can pass megakaryocytes, and the platelet outlet 23 on the other end side has a shallower flow path depth.
  • it may be shallowly inclined from one end side to the other end side, shallow in a curved shape, shallow in a staircase shape, or shallow in a combination of a slanted shape, a curved shape, or a staircase shape.
  • the first member 2 is formed in a cylindrical shape, when the input hole 21 formed in the center of the circle, in order to equalize the flow rate of anywhere of the passage 6, anywhere depth h r is, What is necessary is just to design so that it may become the following formula
  • FIG. 11 has shown the position of the symbol of Formula (1) shown below.
  • R is the radius of the circle of the first member 2
  • W R is the sum of the thickness w R of the channel depth adjustment member in the radius R of the circle
  • r is the distance from the center
  • h r are the depth at the distance r
  • w r is the sum of the thickness w r of the channel depth adjustment member at a distance r
  • h 2 represents the depth of the outlet.
  • the flow rate (Q) it is preferable to make the flow rate (Q) constant because it is possible to simplify the control of feeding a liquid for applying a shearing force.
  • the flow velocity (v) can be made constant when the cross-sectional area (A) is made constant. That is, as expressed by the following formula (3), the cross-sectional area (A) obtained by multiplying the flow path width (2 ⁇ r ⁇ w r ) at an arbitrary r by the depth hr at the position may be constant.
  • the cross-sectional area of the outlet 23 can be expressed by the following formula (4). Since A is constant as shown in the above formula (3), the above formula (1) can be derived. If the depth of the outlet 23 and the radius of the first member 2 and the thickness and number of the flow path depth adjusting members are determined, the inclined surface of the first member 2 can be designed.
  • the shape of the first member 2 is not particularly limited from the viewpoint of holding the megakaryocyte at any position of the flow path 6.
  • the shape of the first member 2 is formed with the insertion hole 21 at the center of the polygonal column. More preferably, the injection hole 21 is formed in the center of the.
  • the first member 2 is not particularly limited as long as the first member 2 can be manufactured to have the above shape, and may be manufactured by a known method such as manufacturing by a 3D printer, transfer by a mold, or the like.
  • FIG. 12 shows a procedure for manufacturing the first member 2 using a mold and then manufacturing the device 1. 1.
  • the substrate 31 is cleaned.
  • a positive or negative photoresist 32 is applied on the substrate 31 by spin coating.
  • a photomask is prepared, and exposure and development are performed so that the preliminarily designed inclined surface of the first member 2 and the flow path depth adjusting member are arranged by gray scale exposure. 4).
  • By etching the substrate 31 by dry etching the mold of the first member 2 is produced.
  • the procedures described in the above 1 to 3 show the procedure for producing a template by photolithography, but there is no particular limitation on the producing method as long as the template can be finally produced.
  • the mold may be manufactured by mechanical processing such as cutting. 5).
  • the material for forming the first member 2 is transferred to the mold prepared in 4 above.
  • the transfer to the mold is not particularly limited as long as the mold can be transferred to the first member 2 by pressing the first member 2 against the mold or by nanoimprinting or injection formation. 6).
  • the material for forming the first member 2 is peeled from the mold, and the input hole 21 is punched and formed to produce the first member 2.
  • the outer wall 8 and the tube insertion port 27 are produced by the following procedure. 1-1. The same material as the first member 2 is poured into a container and hardened. 2-1. A hollow tube insertion port 27 disposed on the upper surface of the outer wall 8 and the insertion hole 21 is cut out.
  • the first member 2 and the outer wall 8 produced in the above 6 are bonded to the second member 5 by an adhesive or a covalent bond, and the tube insertion port 27 is bonded to the insertion hole 21 of the first member 2, so that the device 1 Is made.
  • the mold substrate 31 is not particularly limited as long as it is a material generally used in the field of photolithography technology or machining.
  • SU-8, KMPR, OFPR, AZ, PMER, silicon silicon
  • silicon silicon
  • examples thereof include carbide, sapphire, gallium phosphide, gallium arsenide, gallium nitride, aluminum, aluminum alloy, copper, copper alloy, cast iron, and cast steel.
  • the cleaning of the substrate 31 is not particularly limited as long as it is a cleaning agent generally used in the semiconductor manufacturing field, such as acetone or ethanol.
  • the negative photoresist 32 is not particularly limited as long as it is a material generally used in the photolithography technical field, and examples thereof include SU-8 and KMPR.
  • the positive photoresist is not particularly limited as long as it is a material generally used in the photolithography technical field, and examples thereof include PMER, AZ, OFPR, and the like.
  • the resist removing solution is not particularly limited as long as it is a common removing solution in the semiconductor field, such as dimethylformamide and acetone.
  • Thermoplastic resins such as styrene resin), AS resin, acrylic resin (PMMA); heat of phenol resin, epoxy resin, melamine resin, urea resin, unsaturated polyester resin, alkyd resin, polyurethane, thermosetting polyimide, silicone rubber, etc.
  • a curable resin is mentioned.
  • the first member 2 is made of a light transmissive material (also biocompatible), for example, cycloolefin polymer (COP), polydimethyl Examples thereof include siloxane (PDMS), polymethyl methacrylate (PMMA), polycarbonate (PC), plastic made of hard polyethylene, silicon, and the like.
  • a light transmissive material also biocompatible
  • COP cycloolefin polymer
  • PDMS siloxane
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • PC polycarbonate
  • plastic made of hard polyethylene, silicon, and the like plastic made of hard polyethylene, silicon, and the like.
  • the second member 5 is not particularly limited as long as it is a material on which the first member 2 can be adhered, and examples thereof include glass, plastic, and silicon.
  • the first member 2 and the outer wall 8 and the second member 5 and the first member 2 and the tube insertion port 27 are not particularly limited as long as each member can be adhered.
  • each member may be attached using a known adhesive.
  • each member may be bonded by chemical bonding, and examples thereof include covalent bonding by O 2 plasma excitation.
  • the produced first member 2 may be used as it is, but may be surface-treated as necessary.
  • the surface treatment include hydrophilic treatment.
  • the hydrophilization treatment method include plasma treatment, surfactant treatment, PVP (polyvinylpyrrolidone) treatment, photocatalyst and the like.
  • the surface of the first member 2 is subjected to plasma treatment for 10 to 30 seconds, whereby a hydroxyl group is formed on the surface. Can be introduced.
  • the tube insertion port is formed on the uppermost layer as necessary. What is necessary is just to adhere
  • the cylindrical body 9 is produced by machining, laser processing, and chemical treatment, and the cylindrical body 9 is fixed to the second member 5. Then, the first member 2 produced in the same procedure except that the drawing pattern is changed during the gray scale exposure in the procedure 3 or the stopper 92 is also cut when the insertion hole 21 is cut. 9 may be inserted.
  • the first member 2 may be manufactured by changing the shape of the mold by changing the drawing pattern of the gray scale exposure in the procedure 3 described above. Or what is necessary is just to produce using a 3D printer.
  • FIG. 13 is a diagram showing another embodiment of the device 1 of the present invention.
  • a platelet precursor 71 for capturing a platelet precursor (indicated as “PR” in the drawing) is formed in the vicinity of the platelet outlet 23 in the flow path 6.
  • PR platelet precursor
  • megakaryocytes produce platelets
  • megakaryocytes form elongated platelet precursors, which may be cut by shear forces. Therefore, by forming the capture pillar 71 in the vicinity of the outlet 23 for catching and catching the stretched cord-like platelet precursor, the platelet precursor flows out from the outlet 23. Prevent and continue to produce platelets.
  • the size and interval of the capture pillar 71 are not particularly limited as long as the platelet precursor can be captured, and may be appropriately determined in consideration of the flow rate of the liquid flowing through the flow path 6 and the like.
  • the interval between the capture pillars 71 is too large, the platelet precursor slips through without being caught, but if the interval is reduced and the capture pillars 71 are formed densely, the resistance of the fluid flowing through the flow path 6 increases.
  • the interval between the capturing pillars 71 may be appropriately determined in consideration of the pressure of the liquid flowing through the flow path 6 and the like.
  • the flow velocity of the liquid flowing through the portion where the capture pillar 71 is arranged is the same so that the shearing force applied to the captured platelet precursor is the same.
  • the cross-sectional area at an arbitrary distance r from the injection hole 21 is the same.
  • the depth of the flow path becomes shallower as it approaches the outflow port 23
  • the height of the capture pillar 71 to be arranged becomes lower as it approaches the outflow port 23
  • the volume of the capture pillar 71 decreases. Therefore, the volume reduction of the capture pillar 71 is calculated, and the capture pillar 71 may be arranged so as to become denser as it approaches the outlet 23.
  • the capturing pillar 71 may be disposed not on the entire surface of the flow path 6 but on the outlet 23 side of the flow path 6.
  • one end side of the flow path 6 is deep enough to allow megakaryocytes to pass, and the depth of the outlet 23 on the other end side of the flow path 6 is sized to allow platelets to flow out. But megakaryocytes are being captured. Therefore, it is not necessary to arrange the capturing pillar 71 at least in a portion for capturing the megakaryocyte, and it may be formed in a portion where the depth of the flow path 6 is smaller (shallow) than the size of the megakaryocyte.
  • the specific place where the capturing pillar 71 is arranged may be determined according to the size of the megakaryocyte and the shape of the flow path 6 (straight, curved, stepped, etc.).
  • the capturing pillar 71 may be formed on one of the first member 2 and the second member 5, or may be formed on the first member 2 and the second member 5.
  • FIG. 14 shows a procedure for forming the capture pillar 71 on the first member 2 and then manufacturing the device 1.
  • a positive or negative photoresist 32 is applied on the first member 2 by spin coating. In this method, Si, silicon carbide, sapphire, gallium phosphide, gallium arsenide, gallium nitride, aluminum, aluminum alloy, copper, copper alloy, cast iron, cast steel, or the like can be used as the first member 2. .
  • a photomask is prepared, exposed and developed so that the preliminarily designed inclined surface of the first member 2 and the flow path depth adjusting member are arranged by gray scale exposure.
  • the photoresist 32 and the first member 2 are etched by a deep reactive etching (DRIE) technique.
  • DRIE deep reactive etching
  • a positive or negative photoresist 33 is applied by spin coating.
  • a mask designed so that the periphery of the capturing pillar 71 can be etched is prepared, and exposure and development are performed.
  • the capturing pillar 71 is formed on the first member 2 by etching the photoresist 33 and the first member 2 by DRIE.
  • the photoresist 33 is removed.
  • a positive or negative photoresist 34 is applied by spin coating.
  • a mask designed to etch the portion where the input hole 21 is to be formed is prepared, and exposure and development are performed.
  • the injection hole 21 is formed in the first member 2 by etching the first member 2 by DRIE. (11)
  • the photoresist 34 is removed.
  • the first member 2 in which the capturing pillar 71 is formed is manufactured by the above procedure.
  • (12) The produced first member 2 and second member 5 are bonded together.
  • the glass 51 is bonded onto the first member 2.
  • the glass 51 is formed in order to connect via the glass 51, when the material of the 1st member 2 and the hollow tube insertion port 27 mentioned later differs. Even if the materials of the first member 2 and the hollow tube insertion port 27 are different, the glass 51 may not be provided as long as they can be bonded.
  • the separately prepared outer wall 8 and a hollow tube insertion port 27 disposed on the upper surface of the insertion hole 21 are bonded. With the above procedure, the device 1 in which the capturing pillar 71 is arranged can be manufactured.
  • the material for forming the outer wall 8 and the hollow tube insertion port 27 may be the same material as the outer wall 8 and the hollow tube insertion port 27 shown in FIG.
  • FIG. 15 shows a procedure for forming the capturing pillar 71 on the second member 5 and then manufacturing the device 1.
  • (1) to (3) The same procedure as in FIGS. 14 (1) to (3).
  • a positive or negative photoresist 34 is applied on the second member 5 by spin coating.
  • a mask designed so that portions other than the portion for forming the capturing pillar 71 can be etched is prepared, and exposure and development are performed, and the photoresist 34 other than the portion for forming the capturing pillar 71 is removed.
  • the second member 5 on which the photoresist 34 is not formed is etched by RIE.
  • the capturing pillar 71 is formed on the second member 5 by removing the photoresist 34.
  • (10 to (12) The same procedure as in FIGS. 14 (12) to (14).
  • the procedure shown in FIG. 12 is useful when the device 1 is mass-produced because the first member 2 can be produced using a mold. 14 and 15 can use a hard material such as Si as the first member 2, so that the first member 2 is hardly deformed even if the pressure of the liquid flowing through the flow path 6 is increased. Therefore, it is useful for manufacturing the device 1 in which the capture pillar 71 is formed in the flow path 6.
  • the procedure shown in FIGS. 14 and 15 is an example of a manufacturing method of the device 1 in which the capturing pillar 71 is formed in the flow path 6, and if the device 1 in which the capturing pillar 71 is formed can be manufactured, another method is used. There may be.
  • the platelet production apparatus of the present invention includes at least a pump for feeding a suspension of megakaryocytes and a liquid for applying a shearing force to the megakaryocytes to the channel 6 in the device 1 manufactured by the above procedure.
  • the pump is not particularly limited as long as a certain amount of liquid can be fed, and a commercially available liquid feeding pump may be used.
  • a suction pump for sucking the produced platelets, a container for storing collected platelets, a liquid for applying a shearing force, and the like, a microscope for platelet observation, and the like may be included.
  • a step of putting megakaryocytes into the channel 6 of the device 1 manufactured by the above procedure, a step of putting a liquid into the channel 6 and applying a shearing force to the megakaryocytes, and a platelet outlet 23 of the channel 6 At least a step of collecting platelets that have flowed out of.
  • the megakaryocyte may be a megakaryocyte cultured by a known method, such as a megakaryocyte derived from iPS cells. "Pripotent stem cells", Cell Stem Cell. 2014 Feb 12; 14 (4): 535-548. doi: 10.1016 / j. stem. 2014.1.01.011 "etc. are used. That's fine.
  • the prepared megakaryocyte may be poured into the flow path 6 together with the culture solution.
  • Examples of the liquid for applying a shearing force to the megakaryocyte include a known megakaryocyte culture solution or a liquid that is not toxic to the megakaryocyte. If the shear force applied to the megakaryocyte is too large, platelets are activated, and if the shear force is too small, platelets cannot be produced. For this reason, the amount of liquid to be supplied may be adjusted as appropriate so as to obtain an appropriate shearing force in consideration of the shape and size of the flow path 6.
  • a step of removing the megakaryocytes using a filter that allows platelets to pass through but remove the megakaryocytes may be included.
  • Any filter may be used as long as it cannot pass megakaryocytes but can pass platelets.
  • a filter that can pass particles having a size of 3 to 9 ⁇ m or less but cannot pass particles having a size larger than that may be used.
  • a mold was prepared according to the procedure shown in FIG. 12 using silicon as a material for forming the mold, positive PMER as a photoresist, and gray scale exposure.
  • the insertion hole 21 is a circle having a diameter of 1 mm
  • the depth of the flow path 6 on the side of the injection hole 21 is 70 ⁇ m
  • the depth of the outlet 23 of the flow path 6 is 5 ⁇ m
  • the distance from the end to the outlet 23 was 10 mm
  • the flow path depth adjusting member 3 was formed radially from the end of the charging hole 21 and the individual thickness was 100 ⁇ m.
  • the depth h r of the inclined surface at a distance r from the center was designed to be a depth calculated from the values and formulas (1).
  • FIG. 16 is a photograph of the produced mold. Moreover, the depth of the casting_mold
  • FIG. 17 is a graph of design values and measurement values. As shown in FIG. 17, it was confirmed that the mold could be produced almost as designed.
  • FIG. 18 is a photograph of the device 1 produced in Example 1.
  • Example 2 [Production of platelet production equipment and production of platelets]
  • a platelet production apparatus was produced.
  • 1 ml of a megakaryocyte suspension having a concentration of 1.5 ⁇ 10 5 cells / ml was prepared and introduced into a pump.
  • the megakaryocytes were prepared from iPS cells by the method described in “Nakamura S. et al.,” Above.
  • the iPS cell is a mutant GFP VENUS (Nagai T, et al., Nat Biotechnol.
  • FIG. 19 (1) is a photograph of a megakaryocyte held in the flow path 6.
  • the arrow in the photograph is a flow path depth adjusting member, and the small particles surrounded by circles are megakary spheres.
  • the pressure of the pump was kept at 101.6 kPa, and a shearing force was continuously applied to the megakaryocyte for 4 hours.
  • the culture solution was used as the liquid for applying the shearing force.
  • FIG. 19 (2) is a photograph when shearing force is applied (after 4 hours), and the arrow in the photograph indicates a platelet precursor formed by stretching megakaryocytes.
  • FACS flow cytometry
  • the device 1 of the present invention it is possible to easily produce platelets from megakaryocytes using a single liquid feeding pump without particularly preparing a holding site for holding megakaryocytes. I confirmed that I can do it.
  • FIG. 20A is a design diagram of the capturing pillar 71
  • FIG. 20B is an enlarged view.
  • the capture pillar 71 has a diameter of about 10 ⁇ m and is designed to become denser toward the platelet outlet 23.
  • the inlet hole 21 is a circle having a diameter of 1 mm, the depth of the channel 6 on the side of the inlet hole 21 is 70 ⁇ m, the depth of the outlet 23 of the channel 6 is 5 ⁇ m, and from the end of the inlet hole 21 to the outlet 23.
  • the distance was 10 mm, and the channel depth adjusting member 3 was formed in a radial manner from the end of the injection hole 21 and the individual thickness was 100 ⁇ m.
  • the depth hr of the inclined surface at the distance r from the center was designed to be the depth calculated from the numerical value and the equation (1).
  • 20 (3) is a photograph of the device 1 produced in Example 3
  • FIG. 20 (4) is an enlarged photograph of a portion where the capturing pillar 71 is disposed.
  • FIGS. 21 (1) and (2) are photographs of the same place where a shearing force is being applied, and (2) is a photograph after time has passed since (1).
  • the black portion at the tip of the arrow (chain line) is the capture pillar 71, and it was confirmed that the string-like platelet precursor was captured so as to be caught by the capture pillar 71. Further, by continuously applying the shearing force, the tip portion of the platelet precursor (arrow (solid line) in FIG.
  • platelets can be efficiently and stably produced from megakaryocytes. Therefore, platelets necessary for blood transfusion can be efficiently produced, which is useful for the medical industry.

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Abstract

巨核球を用いて血小板を効率よく、且つ安定的に製造するための血小板製造用デバイス、血小板製造装置及び血小板製造方法を提供する。　巨核球から血小板を製造するために用いられる血小板製造用デバイスであって、前記血小板製造用デバイスは、第１部材及び流路深さ調整部材を少なくとも含み、前記第１部材は、第２部材と組み合すことで巨核球を保持することができ、前記巨核球にせん断力を付与するための液体を流すことができ、且つ製造した血小板の流出口を含む流路を形成し、前記流路深さ調整部材は、前記第１部材を前記第２部材と組み合わせた際に、前記流路の一端側は前記巨核球が通過できる深さで、且つ前記流路の他端側の血小板の流出口の方が流路の深さが浅くなるように流路の深さを調整する、血小板製造用デバイスにより、課題が解決できる。

Description

血小板製造用デバイス、血小板製造装置及び血小板製造方法
　本発明は、血小板製造用デバイス、血小板製造装置及び血小板製造方法に関し、特に、巨核球を用いて血小板を効率よく、且つ安定的に製造するための血小板製造用デバイス、血小板製造装置及び血小板製造方法に関する。
　血小板は止血に重要な役割を果たす血液細胞で、巨核球という細胞から分離することで生み出され、血液の中を循環しながら、止血で利用されるか一定の寿命で崩壊する。血小板は自ら分裂することはできないので、常に巨核球から作られ、必要量が補充されている。しかしながら、深刻な貧血および出血素因をもたらすような血液疾患の患者には血小板の輸血が必要で、現状では献血による血液製剤を用いた輸血を行っている。
　ところで、血小板は機能を維持するために室温で保存する必要がある。そのため、保存期間が４日間と非常に短いという問題がある。そのため、献血に頼らず、体外で血小板を大量且つ安定的に供給するためのデバイス、製造方法が求められている。
　体外で血小板を製造するデバイス・製造方法としては、培養液が通過可能な多孔構造を有する保持部に巨核球を保持し、前記保持部の一方側に設けられた前室部から、前記保持部の他方側に設けられた流路部へ、前記保持部を介して前記培養液を通過させながら前記巨核球を培養する、血小板産生方法が知られている（特許文献１参照）。
　また、図１に示すように、基板上に形成したマイクロピラーの間に巨核球を保持し、巨核球にせん断力（Ｓｈｅａｒ　ｓｔｒｅｓｓ）を付与することで血小板を製造する方法も知られている（非特許文献１参照）。更に、図２に示すように、基板上に形成した流路内にスリットを設け、当該スリットに巨核球を保持し、巨核球にせん断力を付与すことで血小板を製造する方法も知られている（非特許文献２参照）。
特開２０１３－３１４２６号公報
Ｙ．Ｎａｋａｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，"Ｔｗｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗｓ　ｉｎ　ａ　ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ　ｐｒｏｍｏｔｅｄ　ｐｌａｔｅｌｅｔ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ"，　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　２０１３；４１：７４２－７４８ Ｊｏｎａｔｈａｎ　ＮＴ　ｅｔ　ａｌ．，"Ｐｌａｔｅｌｅｔ　ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ"，ＢＬＯＯＤ，Ｓｅｐｔ．　２０１４、Ｖｏｌ．１２４，Ｎｏ．１２、ｐ１８５７－１８６７
　上記特許文献１並びに非特許文献１及び２に記載されている発明は、多孔構造、マイクロピラー、スリットと手段は異なるものの、何れの発明も巨核球を保持するための保持部位を形成し、保持した巨核球にせん断力を付与することで巨核球から血小板を製造している。そのため、前記文献に記載されている発明は、基板上に巨核球の保持部位を予め作製する必要がある。しかしながら、予め巨核球の保持部位を作製する場合、単位面積当たりに保持できる巨核球の数は保持部位の数で制限される。その結果、保持部位の構造により異なるものの、巨核球から血小板を製造する際の単位面積当たりの製造効率の向上が難しいという問題がある。
　また、一旦製造したデバイス上の多孔構造の孔の大きさ、マイクロピラーの間隔、スリットの大きさを変えることはできない。一方、巨核球の大きさは約２５μｍ～１６０μｍの間でばらつきがある。そのため、従来のデバイスは、保持部位の間隔が大きすぎると巨核球がせん断流と一緒に保持部位の隙間から流れてしまい、逆に保持部位の間隔が小さすぎると巨核球を保持することができない。そのため、単位面積当たりの血小板の製造効率を高めることができないという問題もある。
　更に、非特許文献１及び２に記載されている発明は、巨核球を保持部位に送るための流路と、巨核球にせん断力を付与するための流路が別流路となっている。そのため、流路に液体を送液するためのポンプ系が少なくとも２以上必要で、装置及び制御が煩雑であるという問題がある。
　本発明は、上記問題点を解決するためになされたもので、鋭意研究を行ったところ、（１）一端は巨核球を投入でき、他端は血小板が通過できるように、深さを調整した流路に巨核球を投入すると、巨核球の保持部位を特に作製することなく巨核球を流路で保持できること、（２）巨核球を投入できる側の流路の深さより、製造した血小板を流出する側の流路の深さを浅くすることで、流路に投入する巨核球のサイズが異なっていても、流路の何れかの場所で巨核球を保持できること、（３）巨核球にせん断力を付与することで血小板を製造している際に、せん断力により引き延ばされて小さくなった巨核球も流路の下流で保持することができ、引き続き血小板の製造ができること、（４）巨核球に付与するせん断力を流路の場所によらず均一となるように流路の傾斜（深さ）を調整した場合には、巨核球に付与するせん断力が同じになるので、製造する血小板の品質を均一化できること、（５）巨核球と該巨核球にせん断力を付与するための液体を投入するための流路（投入孔）を一つにできるので、装置及び制御を簡素化できること、を新たに見出した。
　すなわち、本発明の目的は、巨核球を用いて血小板を効率よく、且つ安定的に製造するための血小板製造用デバイス、血小板製造装置及び血小板製造方法を提供することにある。
　本発明は以下に示す、血小板製造用デバイス、血小板製造装置及び血小板製造方法に関する。
（１）巨核球から血小板を製造するために用いられる血小板製造用デバイスであって、前記血小板製造用デバイスは、第１部材及び流路深さ調整部材を少なくとも含み、
　前記第１部材は、第２部材と組み合すことで巨核球を保持することができ、前記巨核球にせん断力を付与するための液体を流すことでき、且つ製造した血小板の流出口を含む流路を形成し、
　前記流路深さ調整部材は、前記第１部材を前記第２部材と組み合わせた際に、前記流路の一端側は前記巨核球が通過できる深さで、且つ前記流路の他端側の血小板の流出口の方が流路の深さが浅くなるように流路の深さを調整する、
血小板製造用デバイス。
（２）前記第１部材が、前記巨核球を投入することができ、且つ該巨核球にせん断力を付与するための液体を投入する投入孔を含む上記（１）に記載の血小板製造用デバイス。
（３）前記第１部材の上面が円形で、前記投入孔が円の中心に形成されている上記（２）に記載の血小板製造用デバイス。
（４）前記流路深さ調整部材が、前記第１部材に形成された壁部又はピラーである上記（１）～（３）の何れか一に記載の血小板製造用デバイス。
（５）前記流路深さ調整部材が、前記投入孔に挿通することができ、且つ前記流路に巨核球及び該巨核球にせん断力を付与するための液体を投入するための開口部を有する筒体である上記（３）に記載の血小板製造用デバイス。
（６）前記流路深さ調整部材が、前記血小板の流出口の深さを０．５μｍ以上、１００μｍ以下に調整する上記（１）～（５）の何れか一に記載の血小板製造用デバイス。
（７）前記流路深さ調整部材が、前記血小板の流出口の深さを２μｍ以上、３０μｍ以下に調整する上記（６）に記載の血小板製造用デバイス。
（８）前記流路深さ調整部材が、前記血小板の流出口の深さを３μｍ以上、９μｍ以下に調整する上記（７）に記載の血小板製造用デバイス。
（９）前記流路の任意の場所の深さｈrが、下記式（１）で表される上記（３）～（８）の何れか一に記載の血小板製造用デバイス。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 （上記式（１）中、Ｒは第１部材２の円の半径、ΣｗRは円の半径Ｒにおける流路深さ調整部材の厚みｗRの総和、ｒは中心からの距離、ｈrは距離ｒにおける深さ、Σｗrは距離ｒにおける流路深さ調整部材の厚みｗrの総和、ｈ2は流出口の深さ、を表す。）
（１０）前記第１部材を複数含む上記（１）～（９）の何れか一に記載の血小板製造用デバイス。
（１１）前記第１部材と組み合すことで巨核球を保持するための流路を形成する第２部材を含む上記（１）～（１０）の何れか一に記載の血小板製造用デバイス。
（１２）前記血小板流出口の周囲に形成され、前記血小板の流出口から流出した血小板を含む液体を貯めるための外壁を含む上記（１１）に記載の血小板製造用デバイス。
（１３）巨核球が引き延ばされて形成された血小板前駆体をトラップできる捕捉用ピラーが、前記第１部材及び／又は前記第２部材に形成され、
　前記第１部材及び前記第２部材を組み合わせた際に、前記捕捉用ピラーが、前記流路の血小板の流出口側の一部に配置されている、上記（１１）又は（１２）に記載の血小板製造用デバイス。
（１４）上記（１）～（１３）の何れか一に記載の血小板製造用デバイス、前記血小板製造用デバイスに巨核球を送り込むことができ、且つ該巨核球にせん断力を付与するための液体を送液するためのポンプ、を少なくとも含む血小板製造装置。
（１５）上記（１）～（１３）の何れか一に記載の血小板製造用デバイスの流路に巨核球を投入する工程、
　前記流路に液体を投入し前記巨核球にせん断力を付与する工程、
　前記流路の血小板の流出口から流出した血小板を回収する工程、
を少なくとも含む血小板の製造方法。
　本発明の血小板製造用デバイス、血小板製造装置及び血小板製造方法を用いると、巨核球の保持部位の作製が不要で、更に、せん断力により引き延ばされ小さくなった巨核球も流路の下流側で保持できる。したがって、保持部位の作製スペースが不要で、且つ投入した巨核球をロスなく血小板の製造に使うことができるので、単位面積当たりの血小板の製造効率を向上することができる。
　また、巨核球を保持するためのスリット等の作製が不要であることから、血小板製造用デバイスの構造が単純化でき、設計及び加工が容易となる。
　更に、巨核球に付与するせん断力を流路の場所によらず均一となるように流路の傾斜（深さ）を調整した場合には、巨核球に付与するせん断力が同じになるので、製造する血小板の品質をより均一化できる。
　加えて、本発明のデバイス１は、巨核球と該巨核球にせん断力を付与するための液体を投入するための流路（投入孔）を一つにできるので、送液ポンプを一つで血小板製造装置を製造することができる。したがって、血小板製造装置及び装置の制御を簡素化することができる。
図１は、非特許文献１に記載されている従来の血小板製造用デバイスの図である。 図２は、非特許文献２に記載されている従来の血小板製造用デバイスの図である。 図３は、血小板製造用デバイスの実施形態の一例を示す図で、図３（１）はデバイスの上面図、図３（２）はＡ－Ａ’断面図、図３（３）はＢ－Ｂ’断面図を表す。 図４は、デバイス１の他の実施形態を示す図で、図４（１）はデバイス１の上面図、図４（２）はＣ－Ｃ’断面図、図４（３）はＤ－Ｄ’断面図を表す。 図５は、デバイス１の更に他の実施形態で、第１部材２を複数組み合わせた実施形態の一例を示す断面図である。 図６は、第１部材２を複数組み合わせた更に他の実施形態を示す断面図である。 図７（１）はストッパー９２の一例の上面図で、図７（２）及び（３）は第１部材２の上面図である。 図８は、デバイス１の更に他の実施形態の断面図である。 図９はデバイス１の更に他の実施形態を示しており、図９（１）はデバイス１の上面図、図９（２）はＥ－Ｅ’断面図、図９（３）及び（４）はＦ－Ｆ’断面図を表す。 図１０はデバイス１の更に他の実施形態を示しており、図１０（１）はデバイス１の上面図、図１０（２）はＧ－Ｇ’断面図、図１０（３）はＨ－Ｈ’断面図を表す。 図１１は、式（１）の記号の位置を示している。 図１２は鋳型により第１部材２を作製し、次いでデバイス１を作製する手順を示している。 図１３は、デバイス１の更に他の実施形態を示す図である。 図１４は、第１部材２に捕捉用ピラー７１を形成し、次いでデバイス１を作製する手順を示している。 図１５は、第２部材５に捕捉用ピラー７１を形成し、次いでデバイス１を作製する手順を示している。 図１６は、図面代用写真で、実施例１で作製した鋳型の写真である。 図１７は、実施例１で作製した鋳型の深さの設計値と計測値のグラフである。 図１８は、図面代用写真で、実施例１で作製したデバイス１の写真である。 図１９は、図面代用写真で、図１９（１）は流路６で捕捉された巨核球の写真、図１９（２）はせん断力を付与した時の写真で、写真中の矢印は巨核球が引き延ばされて形成した血小板前駆体である。 図２０（１）は捕捉用ピラー７１の設計図で、図２０（２）は拡大図である。図２０（３）は、図面代用写真で、実施例３で作製したデバイス１の写真、図２０（４）は、図面代用写真で、捕捉用ピラー７１を配置した部分の拡大写真である 図２１（１）及び（２）は、図面代用写真で、実施例４でせん断力を付与中の同じ場所の写真である。
　以下に、本発明の血小板製造用デバイス、血小板製造装置及び血小板製造方法について詳しく説明する。図３は、本発明の血小板製造用デバイス（以下、「デバイス」と記載することがある。）の実施形態の一例を示す図で、図３（１）はデバイスの上面図、図３（２）はＡ－Ａ’断面図、図３（３）はＢ－Ｂ’断面図を表す。
　本発明のデバイス１は、第１部材２及び流路深さ調整部材３を少なくとも含んでいる。第１部材２は、巨核球及び巨核球にせん断力を付与するための液体を投入するための投入孔２１を有し、且つ第２部材５と組み合すことで巨核球を保持するための流路６を形成することができる。流路深さ調整部材３は、第１部材２を第２部材５と組み合わせた際に、流路６の投入孔２１側は巨核球が通過できる深さ（ｈ1）で、且つ流路６の他端側の血小板の流出口２３（深さｈ2）に向かって流路６の深さが浅くなるように流路６の深さを調整する。流路６を上記のように形成することで、投入孔２１から投入した巨核球（図面においては「ＭＫ」と記載する。）は、サイズに応じて流路６の何れかの場所に保持することができる。そして、投入孔２１から液体を流入し、巨核球にせん断力を付与することで、血小板（図面においては「ＰＬ」と記載する。）を製造することができる。
　図３に示すデバイス１の場合、第１部材２は略円柱状である。図３（１）に示すように第１部材２の上面は円形で、円の中心に投入孔２１が形成されている。また、第１部材２には、図３（２）に示すように、投入孔２１から流出口２３に向かって傾斜面が形成されるとともに、図３（１）及び（３）に示すように、第２部材５と組み合した際に、流路６の投入孔２１側の深さがｈ1、流出口２３の深さがｈ2となるように高さを調整するための壁部が放射状に形成されている。そのため、第１部材２を第２部材５と組み合わせると、壁部（流路深さ調整部材３）が第２部材５と当接する。一方、第１部材２の壁部が形成されている以外の面は傾斜面が形成されていることから、隣り合う壁部、第１部材２の傾斜面及び第２部材５で、流出口２３の深さがｈ2の流路６を形成することができる。図３に示す実施形態の場合、壁部３で第１部材２と第２部材５との間隔を調整することから、間隔の安定性を考慮すれば、壁部３は少なくとも３か所以上形成すればよい。なお、図３に示す例では、流路深さ調整部材３は第１部材２と一体成型しているが、流路６を形成できれば別体としてもよい。
　上記のとおり、流路６の投入孔２１側は巨核球が通過できる深さ（ｈ1）とすればよい。巨核球の大きさは約２５μｍ～１６０μｍであるので、ｈ1は少なくとも２５μｍ以上とすればよく、効率を考えると、１６０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ以上等、巨核球が無理なく通過できる大きさであれば特に制限はない。また、投入孔２１の直径も、少なくとも巨核球を通過できる幅であれば特に制限はなく、前記ｈ1と同じ範囲の数値とすればよい。
　一方、本発明では、巨核球は流路６の何れかの部分に保持する必要がある。そのため、血小板の流出口２３（深さｈ2）は、投入した巨核球が全て流出しない深さにする必要があり、例えば、１５０μｍ、１００μｍ、５０μｍ以下であればよい。流出口２３から血小板に加え巨核球が流出した場合は、フィルターを用いて巨核球のみを除去すればよい。また、フィルターによる除去を省略し製造効率を上げる場合は、流出口２３から巨核球が流出し難い深さにすることが好ましく、流出口２３（深さｈ2）を、３０μｍ、１５μｍ、１０μｍ、９μｍ、８μｍ、５μｍ以下等、せん断力により引き延ばされて小さくなった巨核球も流出し難い深さにすればよい。
　また、流出口２３（深さｈ2）の下限は、血小板が通過できる大きさであればよい。血小板の大きさは約１μｍ～４μｍと言われているが、人工的に生体外で製造する血小板の大きさは、最大８μｍの直径を有している。また、血小板は巨核球の細胞質がせん断力により千切れて生成することから、形状は不定形である。そのため、血小板を製造する際のせん断流の流速等を考慮し、流出口２３（深さｈ2）は、０．５μｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ以上等、巨核球から製造した血小板が通過できる大きさとすればよい。巨核球の流出量を少なくし且つ製造した血小板をより多く流出口２３を通して回収するためには、流出口２３（深さｈ2）を０．５μｍ以上１００μｍ以下とすることが好ましく、２μｍ以上３０μｍ以下とすることがより好ましく、３μｍ以上９μｍ以下とすることが特に好ましい。
　また、図３に示すとおり、流出口２３の周囲には、流出口２３から流出した血小板を含む液体を貯めるための外壁８を形成してもよい。外壁８を形成することで、血小板を含む液体は第１部材２と外壁８の間に貯めることができるので、血小板の回収がし易くなる。外壁８は、後述する材料で第１部材とは別体として形成し、第２部材５に貼り付ければよい。
　本発明のデバイス１は、流路深さ調整部材３により、第１部材２と第２部材５を組み合わせた際に、上記の流路６のサイズになれば他の実施形態であってもよい。図４は、本発明のデバイス１の他の実施形態を示す図で、図４（１）はデバイス１の上面図、図４（２）はＣ－Ｃ’断面図、図４（３）はＤ－Ｄ’断面図を表す。図４に示す実施形態では、流路深さ調整部材３として、壁部に換え、第１部材２にピラーを形成した例を示している。ピラーを形成した場合も図３に示す実施形態と同様に、第１部材２を第２部材５に当接した際に、上記流路６のサイズとなるように、ピラーの高さを調整すればよい。また、ピラーの数は第１部材２と第２部材５との間隔の安定性を考慮すれば、３本以上とすれば数は特に制限はない。また、ピラーを形成する場所も、特に制限はない。
　なお、図３及び図４に示す第１部材の上面部分は平面状になっている。後述する第１部材２を複数用いる場合は、第１部材２の上面は平面とすることが好ましいが、第１部材２を単層で用いる場合は、第２部材５と組み合わせた際に、流路６を形成することができれば平面でなくてもよい。例えば、第１部材２の上面が傾斜状になっていてもよく、また、投入孔２１にチューブ等を接続し易くするために、第１部材２の上面にチューブ差込口を形成してもよい。更に、第３及び図４に示す第１部材２の傾斜面は湾曲しているが、直線状に流路６の深さを浅くしてもよい。
　図３及び図４に示す実施形態は、第１部材２が一つの例を示しているが、第１部材２を複数組み合わせてもよい。図５は、デバイス１の他の実施形態を示す図で、第１部材２を複数組み合わせた実施形態の一例を示す断面図である。図５に示す実施形態では、第１部材２の上面が平面状に形成されている。そのため、第１部材２の上に更に第１部材２を重ねた場合、下側の第１部材２が第２部材５の役割もすることから、第２部材５は最下層の第１部材２とのみ組み合わせればよい。第１部材２を複数重ねた場合、投入孔２１は同じ位置になるので最上層の第１部材２の投入孔２１から投入した巨核球及びせん断力を付与するための液体を流し込めば、各層の流路６で巨核球を保持し、血小板を製造することができる。したがって、血小板を大量生産することができる。なお、図５に図示はしていないが、最上層の第１部材２の上面にチューブ差込口を形成してもよい。
　図６は、第１部材２を複数組み合わせた他の実施形態を示す断面図である。図６に示す実施形態では、流路６に巨核球及び巨核球にせん断力を付与するための液体を投入するための開口部９１を有する筒体９を、投入孔２１に挿通している。また、筒体９の大きさを投入孔２１とほぼ同じ大きさにすると、摩擦力で第１部材２を固定できるので、第１部材２を複数積層しても第１部材がずれることは無く、取扱いの利便性が向上する。
　図６に示す実施形態の場合、流路深さ調整部材３である壁部又はピラーが形成された第１部材２に筒体９を挿通してもよいが、筒体９を流路深さ調整部材３として用いてもよい。その場合、流路６の微妙な間隔を調整するために、筒体９にストッパー９２を形成してもよい。図７（１）はストッパー９２の一例の上面図で、図７（２）及び（３）は第１部材２の上面図である。図７（１）に示すように、例えば、筒体９からストッパー９２を１８０度の方向に２本形成し、第１部材２の投入孔２１にもストッパー９２を挿通できる大きさの切欠き２２を形成する。そして、第１部材２を筒体９に挿通した後、図７（３）に示すように第１部材２を回転することで、第１部材２の移動をストップさせればよい。なお、筒体９の先端は、必要に応じて第２部材５に貼り付けて固定してもよい。また、筒体９は、第１部材２が単層の場合でも、流路深さ調整部材３として用いてもよい。
　図８は、本発明のデバイス１の他の実施形態の断面図である。図５及び図６に示す実施形態では、上記のとおり、第１部材２を同じ方向に積層しているが、第１部材２の流路深さ調整部材３同士を当接することで、流路６を形成してもよい。流路６の形状は図５及び図６に示す形状と異なるが、血小板の流出口２３が上記に示した深さとなるように調整すれば、流路６の何れかで巨核球を保持することができる。つまり、第１部材２の傾斜面が第２部材５の役割をすることから、第２部材５として別部材を用意する必要はなく、第１部材２のみで本発明のデバイス１を作製することができる。また、図８に示すデバイス１は、第１部材２の流路深さ調整部材３同士を当接すると、第１部材２の平面部分が下になる。そのため、例えば、デバイス１を平面台１０等の上に載置し、流出口２３から流出した血小板及びせん断力を付与するための液体をデバイス１の側面を伝って落下させ、回収するようにしてもよい。
　図３～６、８に示すデバイス１は、第１部材２は傾斜面を有した略円柱状に形成されているが、円柱に換え、例えば、３角柱、４角柱、５角柱、６角柱等の多角柱としてもよい。
　上記図３～６、８に示すデバイス１は、投入孔２１を円柱又は多角柱の中心部に設け、放射状に流路６を形成しているが、流路６に巨核球を保持し、流路６の投入孔２１側及び流出口２３を上記の大きさとすれば、第１部材２は他の形状であってもよい。図９は本発明のデバイス１の他の実施形態を示しており、図９（１）はデバイス１の上面図、図９（２）はＥ－Ｅ’断面図、図９（３）及び（４）はＦ－Ｆ’断面図を表す。図９に示すデバイス１は、略４角形の第１部材２の一辺付近に投入孔２１を形成し、壁状の流路深さ調整部材３を第１部材２に形成し、第２部材５と第１部材２を組み合わせて流路６を形成している。なお、図９に示す実施形態の場合、投入孔２１から投入した液体は、放射状ではなく流出口２３の一方向のみに流れることになる。そのため、投入孔２１から投入した液体が流出口２３以外から流出しないように、図９（３）に示すように、第１部材２は上面部２４と垂直部２５を含む略Ｌ字型に形成すればよい。また、図９（３）では、第１部材２の上面部２４に投入孔２１を形成しているが、図９（４）に示すように、第１部材２の垂直部２５に投入孔２１を形成してもよい。また、横方向から液体が漏れないようにするために、投入孔２１は、最も外側に位置する２つの流路深さ調整部材３の間に形成すればよい。なお、図９に示す例では、第１部材２の上面部２４は傾斜面となっているが、複数層形成する場合は、第１部材２の上面部２４を平面状にすることが好ましい。また、第２部材５を用いず、第１部材２の流路深さ調整部材３同士が当接するように組み合わすことで、第１部材２のみでデバイス１を形成してもよい。
　図１０は、本発明のデバイス１の他の実施形態を示しており、図１０（１）はデバイス１の上面図、図１０（２）はＧ－Ｇ’断面図、図１０（３）はＨ－Ｈ’断面図を表す。図３～６、８～９に示した実施形態では、巨核球及び巨核球にせん断力を付与するための液体を投入するための投入孔２１が第１部材２に形成されているが、第１部材２に投入孔２１を設けなくてもよい。投入孔２１を設けない場合、図１０（３）に示すように、第１部材２及び第２部材５を組み合わせて形成した流路の開口部２６にチューブの一端を直接接続し、チューブの他端をポンプに接続すればよい。巨核球及び巨核球にせん断力を付与するための液体は、チューブを通して直接流路に投入することができる。また、液体が漏れないようにするために、第１部材２、第２部材５及び流路深さ調整部材３で形成する流路の開口部２６と略同形状のチューブを接続すればよい。なお、図１０に示す例では、第１部材２の上面部２４は傾斜面となっているが、複数層形成する場合は、第１部材２の上面部２４を平面状にすることが好ましい。また、第２部材５を用いず、第１部材２の流路深さ調整部材３同士が当接するように組み合わすことで、第１部材２のみでデバイス１を形成してもよい。
　流路６の深さは、上記のとおり、一端側は巨核球が通過できる深さで、他端側の血小板の流出口２３の方が流路の深さが浅くなっていればよい。例えば、一端側から他端側に向かって傾斜状に浅くする、湾曲状に浅くする、階段状に浅くする、傾斜状・湾曲状・階段状を組み合わせて浅くする、等が挙げられる。ところで、巨核球にせん断力を付与して血小板を製造する際に、せん断力が強すぎると血小板が活性化してしまい、逆に、せん断力が弱すぎると、巨核球から細胞質が千切れないので血小板が製造できない。したがって、血小板の品質を均一化するために、流路６のどこでも流速が同じとなり、巨核球が保持される場所に関係なく巨核球に付与されるせん断力が同じになるように流路を設計することがより好ましい。
　第１部材２を円柱状に形成し、投入孔２１を円の中心に形成した場合、流路６の任意の場所の流速を同じにするためには、任意の場所の深さｈrが、以下の式（１）となるように設計すればよい。なお、図１１は、以下に示す式（１）の記号の位置を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
 （上記式（１）中、Ｒは第１部材２の円の半径、ΣｗRは円の半径Ｒにおける流路深さ調整部材の厚みｗRの総和、ｒは中心からの距離、ｈrは距離ｒにおける深さ、Σｗrは距離ｒにおける流路深さ調整部材の厚みｗrの総和、ｈ2は流出口の深さ、を表す。）
　上記式（１）は次の手順で求めることができる。先ず、流速は下記式（２）で表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
 （上記式（２）中、ｖは流速、Ｑは流量、Ａは断面積、を表す。）
　本発明においては、せん断力を付与するための液体を送液する制御を単純化できることから、流量（Ｑ）を一定にすることが好ましい。そうすると、上記式（２）から明らかなように、断面積（Ａ）を一定にすると流速（ｖ）を一定にすることができる。つまり、下記式（３）で表すように、任意のｒにおける流路幅（２πｒ－Σｗr）に当該位置における深さｈrを乗じた断面積（Ａ）が一定になればよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
　そして、流出口２３の断面積は、下記式（４）で表すことができ、上記式（３）のとおり、Ａは一定になることから、上記式（１）を導くことができる。流出口２３の深さ及び第１部材２の半径、流路深さ調整部材の厚み及び本数を決めれば、第１部材２の傾斜面を設計することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
　以上のとおり、巨核球を流路６の何れかの位置で保持するとの観点では、第１部材２の形状は特に制限はない。一方、保持した巨核球に同じせん断力を付与し、製造した血小板の品質を均一化するという観点では、第１部材２の形状は多角柱の中心に投入孔２１を形成することが好ましく、円柱の中心に投入孔２１を形成することがより好ましい。
　第１部材２は、上記の形状となるように製造できれば、製造方法に特に制限はなく、３Ｄプリンターによる製造、鋳型による転写等、公知の方法で製造すればよい。図１２は鋳型により第１部材２を作製し、次いでデバイス１を作製する手順を示している。
１．基板３１を洗浄する。
２．基板３１上にポジ型、又はネガ型フォトレジスト３２をスピンコートにより塗布する。
３．グレースケール露光により、予め設計した第１部材２の傾斜面及び流路深さ調整部材の配置となるように、フォトマスクを作製し、露光及び現像を行う。
４．ドライエッチングにより、基板３１をエッチングすることで、第１部材２の鋳型を作製する。なお、上記１～３に記載の手順は、フォトリソグラフィーによる鋳型の作製手順を示しているが、最終的に鋳型を作製できれば作製方法に特に制限はない。例えば、切削加工等の機械的な加工により鋳型を作製してもよい。
５．第１部材２を形成する材料を、上記４で作製した鋳型に転写する。なお、鋳型への転写は、第1部材２を鋳型に押し付けて転写、又はナノインプリント、インジェクション形成等、第１部材２に鋳型を転写できれば特に制限はない。
６．鋳型から第１部材２を形成する材料を剥離し、投入孔２１を打ち抜き形成することで、第１部材２を作製する。
　上記１～６とは別に、以下の手順で外壁８とチューブ差込口２７を作製する。
１－１．第１部材２と同じ材料を、容器に注入し固める。
２－１．外壁８、投入孔２１の上面に配置する中空のチューブ差込口２７を切り出す。
７．上記６で作製した第１部材２、外壁８を第２部材５に接着剤もしくは共有結合等で接着し、チューブ差込口２７を第１部材２の投入孔２１に接着することで、デバイス１を作製する。
　鋳型用の基板３１としては、フォトリソグラフィー技術分野又は機械加工で一般的に用いられている材料であれば特に限定はされず、例えば、ＳＵ－８、ＫＭＰＲ、ＯＦＰＲ、ＡＺ、ＰＭＥＲ、シリコン、シリコンカーバイド、サファイア、リン化ガリウム、ヒ化ガリウム、窒化ガリウム、アルミ、アルミ合金、銅、銅合金、鋳鉄、鋳鋼等が挙げられる。また、基板３１の洗浄は、アセトン、エタノール等、半導体製造分野で一般的に用いられている洗浄剤であれば特に制限はされない。
　ネガ型フォトレジスト３２も、フォトリソグラフィー技術分野で一般的に用いられている材料であれば特に制限は無く、例えば、ＳＵ－８、ＫＭＰＲ等が挙げられる。また、ポジ型フォトレジストもフォトリソグラフィー技術分野で一般的に用いられている材料であれば特に制限は無く、例えば、ＰＭＥＲ、ＡＺ、ＯＦＰＲ等が挙げられる。また、レジストの除去液としては、ジメチルホルムアミドとアセトン等、半導体分野で一般的な除去液であれば特に制限はない。
　また、第１部材２、外壁８、チューブ差込口２７を作製する材料としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ＡＢＳ樹脂（アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂）、ＡＳ樹脂、アクリル樹脂（ＰＭＭＡ）等の熱可塑性樹脂；フェノール樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、アルキド樹脂、ポリウレタン、熱硬化性ポリイミド、シリコーンゴム等の熱硬化性樹脂が挙げられる。なお、顕微鏡等により血小板の製造過程を観察する場合は光透過性がある（生体適合性もある）材料で第１部材２を作製することが好ましく、例えば、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、硬質ポリエチレン製等のプラスチック、シリコン等が挙げられる。
　第２部材５は、第１部材２を貼着できる材料であれば特に制限はなく、ガラス、プラスチック、シリコン等が挙げられる。
　第１部材２及び外壁８と第２部材５との貼着、並びに、第１部材２とチューブ差込口２７との貼着は、各部材を貼着できれば特に制限はない。例えば、公知の接着剤を用いて各部材を貼着すればよい。また、接着剤に換え、化学結合により各部材を結合してもよく、例えば、Ｏ2プラズマ励起による共有結合等が挙げられる。
　作製した第１部材２はそのまま用いてもよいが、必要に応じて表面処理をしてもよい。表面処理としては、親水化処理が挙げられる。親水化処理方法としては、プラズマ処理、界面活性剤処理、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）処理、光触媒等が挙げられ、例えば、第１部材２の表面を１０～３０秒間プラズマ処理することで、表面に水酸基を導入することができる。
　図５に示す第１部材２を複数層形成するデバイス１の場合は、上記手順７において、６で作製した第１部材２を複数層積層後に、必要に応じてチューブ差込口を最上層の第１部材２に接着すればよい。
　また、図６に示すデバイス１の場合は、機械加工、レーザー加工、化学的処理により筒体９を作製し、該筒体９を第２部材５に固定する。そして、上記手順３のグレースケール露光の際に描画パターンを変える、又は、投入孔２１を切削する際にストッパー９２の部分も切削する以外は同様の手順で作製した第１部材２を、筒体９に挿入すればよい。
　図９に示すデバイス１の場合も、上記手順３のグレースケール露光の描画パターンを変えることで鋳型の形状を変え、第１部材２を作製すればよい。又は、３Ｄプリンターを用いて作製すればよい。
　図１３は、本発明のデバイス１の他の実施形態を示す図である。図１３に示すデバイス１は、流路６の血小板の流出口２３付近に血小板前駆体（図面においては「ＰＲ」と記載する。）の捕捉用ピラー７１が形成されている。巨核球が血小板を製造する際には、巨核球が引き延ばされた血小板前駆体を形成するが、この血小板前駆体は、せん断力により切断される場合がある。そのため、引き延ばされた紐状の血小板前駆体を引掛けて捕捉する捕捉用ピラー７１を流出口２３付近に形成しておくことで、血小板前駆体が流出口２３から流出してしまうことを防ぎ、引き続き、血小板を製造することができる。
　捕捉用ピラー７１のサイズ及び間隔は、血小板前駆体を捕捉できれば特に制限は無く、流路６に流す液体の流速等を考慮して適宜決めればよい。また、捕捉用ピラー７１の間隔が大きすぎると血小板前駆体が引っ掛からずにすり抜けてしまうが、間隔を狭くして捕捉用ピラー７１を密に形成すると流路６を流す流体の抵抗が大きくなる。捕捉用ピラー７１の間隔は、流路６に流す液体の圧力等を考慮して適宜決めればよい。
　なお、捕捉用ピラー７１を形成する場合、捕捉した血小板前駆体に付与されるせん断力が同じとなるように、捕捉用ピラー７１が配置されている部分を流れる液体の流速が同じとなるように設計してもよい。例えば、図１３に示すように、捕捉用ピラー７１を配置する部分の流路の深さがほぼ同じ場合は、投入孔２１から流出口２３に向かうにしたがって、断面積は大きくなる。したがって、流出口２３側に近い程、捕捉用ピラー７１を密となるように設計すればよい。
　また、捕捉用ピラー７１を配置する部分の流路６が、上記数（１）に示す曲面で設計されている場合は、投入孔２１から任意の距離rにおける断面積は同じとなっている。しかしながら、流路の深さは流出口２３に近付くほど浅くなるため、配置する捕捉用ピラー７１の高さは流出口２３に近付くほど低くなり、捕捉用ピラー７１の体積が少なくなる。したがって、捕捉用ピラー７１の体積減少分を計算し、流出口２３に近付くほど密となるように捕捉用ピラー７１を配置すればよい。
　捕捉用ピラー７１は、流路６の全面ではなく、流路６の流出口２３側に配置されていればよい。本発明のデバイス１は、流路６の一端側は巨核球が通過できる深さで、流路６の他端側の流出口２３の深さは血小板が流出できるサイズとし、流路６の何れかで巨核球が捕捉されるようになっている。したがって、捕捉用ピラー７１は、少なくとも巨核球を捕捉するための部分には配置する必要は無く、流路６の深さが巨核球の大きさより小さく（浅く）なる部分に形成すればよい。捕捉用ピラー７１を配置する具体的な場所は、巨核球の大きさ及び流路６の形状（直線状、曲線状、階段状等）に応じて決めればよい。
　捕捉用ピラー７１は、第１部材２、第２部材５の何れか一方に形成、又は、第１部材２及び第２部材５に形成されていてもよい。
　図１４は、第１部材２に捕捉用ピラー７１を形成し、次いでデバイス１を作製する手順を示している。
（１）第１部材２の上に、ポジ型又はネガ型フォトレジスト３２をスピンコートにより塗布する。なお、本方法では、第１部材２として、Ｓｉ、シリコンカーバイド、サファイア、リン化ガリウム、ヒ化ガリウム、窒化ガリウム、アルミ、アルミ合金、銅、銅合金、鋳鉄、鋳鋼等を使用することができる。
（２）グレースケール露光により、予め設計した第１部材２の傾斜面及び流路深さ調整部材の配置となるように、フォトマスクを作製し、露光及び現像を行う。
（３）深堀エッチング技術（Ｄｅｅｐ　Ｒｅａｃｔｉｖｅ　Ｉｏｎ　Ｅｔｃｈｉｎｇ；ＤＲＩＥ）により、フォトレジスト３２及び第１部材２をエッチングする。
（４）ポジ型又はネガ型フォトレジスト３３をスピンコートにより塗布する。
（５）捕捉用ピラー７１の周囲をエッチングできるよう設計したマスクを作製し、露光及び現像を行う。
（６）ＤＲＩＥにより、フォトレジスト３３及び第１部材２をエッチングすることで、第１部材２に捕捉用ピラー７１を形成する。
（７）フォトレジスト３３を除去する。
（８）ポジ型又はネガ型フォトレジスト３４をスピンコートにより塗布する。
（９）投入孔２１を形成する部分をエッチングできるよう設計したマスクを作製し、露光及び現像を行う。
（１０）ＤＲＩＥにより、第１部材２をエッチングすることで、第１部材２に投入孔２１を形成する。
（１１）フォトレジスト３４を除去する。以上の手順により、捕捉用ピラー７１を形成した第１部材２を作製する。
（１２）作製した第１部材２と第２部材５を貼り合わせる。
（１３）第１部材２の上にガラス５１を貼り合わせる。なお、ガラス５１は、第１部材２と後述する中空のチューブ差込口２７の材料が異なる場合、ガラス５１を介して接続するために形成している。第１部材２と中空のチューブ差込口２７の材料が異なっていても、両者を接着することができれば、ガラス５１は設けなくてもよい。
（１４）別途作製した外壁８、投入孔２１の上面に配置する中空のチューブ差込口２７を接着する。以上の手順により、捕捉用ピラー７１を配置したデバイス１を作製することができる。外壁８、中空のチューブ差込口２７を形成する材料は、図１２に示す外壁８、中空のチューブ差込口２７と同様の材料を用いればよい。
　図１５は、第２部材５に捕捉用ピラー７１を形成し、次いでデバイス１を作製する手順を示している。
（１）～（３）：図１４（１）～（３）の手順と同様である。
（４）～（６）：一部省略してあるが図１４（８）～（１１）の手順と同様である。
（７）第２部材５上にポジ型又はネガ型フォトレジスト３４をスピンコートにより塗布する。次いで、捕捉用ピラー７１を形成する部分以外の部分をエッチングできるよう設計したマスクを作製し、露光及び現像を行い、捕捉用ピラー７１を形成する部分以外のフォトレジスト３４を除去する。
（８）ＲＩＥにより、フォトレジスト３４が形成されていない第２部材５をエッチングする。
（９）フォトレジスト３４を除去することで、第２部材５に捕捉用ピラー７１を形成する。
（１０）～（１２）：図１４（１２）～（１４）の手順と同様である。
　なお、図１２に示す手順は、鋳型を用いて第１部材２を作製できるので、デバイス１を大量生産する際に有用である。また、図１４及び図１５に示す手順は、第１部材２としてＳｉ等の固い材料を使用できることから、流路６に流す液体の圧力を高くしても第１部材２が変形し難くなる。したがって、流路６に捕捉用ピラー７１を形成したデバイス１の作製に有用である。なお、図１４及び図１５に示す手順は、流路６に捕捉用ピラー７１を形成したデバイス１の作製方法の例示であって、捕捉用ピラー７１を形成したデバイス１を作製できれば他の方法であってもよい。
　本発明の血小板製造装置は、上記の手順で作製したデバイス１に、巨核球の懸濁液及び巨核球にせん断力を付与するための液体を流路６に送液するためのポンプを少なくとも含んでいればよい。ポンプは、一定量の液体を送液できるものであれば特に制限はなく、市販の送液ポンプを用いればよい。また、必要に応じて、製造した血小板を吸引する吸引ポンプ、回収した血小板やせん断力を付与するための液体等を貯める容器、血小板観察のための顕微鏡等を含んでいてもよい。
　血小板は、上記の手順により作製したデバイス１の流路６に巨核球を投入する工程、流路６に液体を投入し巨核球にせん断力を付与する工程、流路６の血小板の流出口２３から流出した血小板を回収する工程、を少なくとも含んでいる。
　巨核球は、ｉＰＳ細胞から誘導した巨核球等、公知の方法により培養した巨核球を用いればよく、例えば、「Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ　ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｅｎａｂｌｅ　ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ－ａｐｌｉｃａｂｌｅ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｔｅｌｅｔｓ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ”，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．　２０１４　Ｆｅｂ　１２；１４（４）：５３５－５４８．　ｄｏｉ：　１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１４．０１．０１１」等に記載の方法により作製した巨核球を用いればよい。作製した巨核球は、培養液とともに流路６に流し込めばよい。
　巨核球にせん断力を付与するための液体としては、公知の巨核球の培養液、もしくは巨核球に毒性のない液体等が挙げられる。巨核球に与えるせん断力が大きすぎると血小板が活性化し、また、せん断力が小さすぎると血小板を作製できなくなる。そのため、流路６の形状・大きさを考慮し適切なせん断力となるように、液体を供給する量は適宜調整すればよい。
　なお、流出口２３から流出した液体に巨核球が含まれる場合は、血小板は通過するが巨核球は除去できるフィルターを用いて巨核球を除去する工程を含んでいてもよい。フィルターとしては、巨核球は通過できないが血小板は通過できるものであればよい。例えば、３～９μｍ以下のサイズの粒子は通過できるが、それ以上のサイズの粒子は通過できないフィルターを用いればよい。
　以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
＜実施例１＞
［デバイス１の作製］
　鋳型を作製する材料としてシリコン、フォトレジストとしてポジ型のＰＭＥＲ、グレースケール露光を用い、図１２の手順にしたがって先ず鋳型を作製した。なお、鋳型を作製する際には、投入孔２１は直径１ｍｍの円、流路６の投入孔２１側の深さは７０μｍ、流路６の流出口２３の深さは５μｍ、投入孔２１の端部から流出口２３までの距離は１０ｍｍ、流路深さ調整部材３は投入孔２１の端部から放射状に１６本形成し個々の厚みは１００μｍとした。また、中心からの距離ｒにおける傾斜面の深さｈrは、前記数値及び式（１）から算出した深さとなるように設計した。図１６は作製した鋳型の写真である。また、微細形状測定器（サーフコーダ　ＥＴ２００）を用いて作製した鋳型の深さを計測した。図１７は設計値と計測値のグラフである。図１７に示すように、ほぼ設計値どおりに鋳型が作製できたことを確認した。
　次に、第１部材２、外壁８及びチューブ差込口２７を形成するための材料としてＰＤＭＳ、第２部材５としてガラス板を用い、図１２に示す手順でデバイス１を作製した。図１８は、実施例１で作製したデバイス１の写真である。
＜実施例２＞
［血小板製造装置の作製及び血小板の製造］
　実施例１で作製したデバイス１のチューブ差込口２７とポンプをシリコンチューブで接続することで、血小板製造装置を作製した。
　次に、１．５×１０5個／ｍｌ濃度の巨核球懸濁液を１ｍｌ準備し、ポンプに導入した。なお、巨核球は上記“Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，”に記載の方法によりｉＰＳ細胞より作製した巨核球を用いた。当該ｉＰＳ細胞は、巨核球特有のタンパクであるｂｅｔａ１－ｔｕｂｕｌｉｎのＥｘｏｎ　４の３‘側へ２Ａ配列に機能的に連結した変異型ＧＦＰであるＶＥＮＵＳ（Ｎａｇａｉ　Ｔ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　２０：８７－９０，　２００２）をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて組み込んだ。従って、当該ｉＰＳ細胞から誘導した巨核球は、成熟した血小板放出準備に達した段階の巨核球でのみＧＦＰタンパクが発現する。ポンプの圧力を１０１．６ｋＰａに保ち、巨核球懸濁液をデバイス１の流路６に導入し、流路６で巨核球を保持した。図１９（１）は流路６で保持された巨核球の写真で、写真中の矢印は流路深さ調整部材、〇で囲ってある小さな粒が巨核球である。次に、ポンプの圧力を１０１．６ｋＰａに保ち、巨核球に４時間せん断力をかけ続けた。なお、せん断力を付与するための液体としては、培養液を用いた。図１９（２）はせん断力を付与した時（４時間後）の写真で、写真中の矢印は巨核球が引き延ばされて形成した血小板前駆体を示している。最後に、第１部材２と外壁８の間に貯まった血小板を含む溶液を回収し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析にかけたところ、多くの血小板の生産を確認した。
　以上の結果より、本発明のデバイス１を用いることで、巨核球を保持する為の保持部位を特に作製することなく、又、単一の送液ポンプを用いて簡単に巨核球から血小板を製造できることを確認した。
＜実施例３＞
［デバイス１の作製］
　図１５に示す手順でデバイス１を作製した。材料は、第１部材２はシリコン、フォトレジスト３２はポジ型のＰＭＥＲ、フォトレジスト３４はネガ型のＳＵ－８、第２部材５はガラス、外壁８及びチューブ差込口２７はＰＤＭＳを用いた。図２０（１）は捕捉用ピラー７１の設計図で、図２０（２）は拡大図である。捕捉用ピラー７１は直径が約１０μｍで、血小板の流出口２３に向かうにしたがって密となるように設計した。また、投入孔２１は直径１ｍｍの円、流路６の投入孔２１側の深さは７０μｍ、流路６の流出口２３の深さは５μｍ、投入孔２１の端部から流出口２３までの距離は１０ｍｍ、流路深さ調整部材３は投入孔２１の端部から放射状に１６本形成し個々の厚みは１００μｍとした。また、中心からの距離ｒにおける傾斜面の深さｈrは、前記数値及び式（１）から算出した深さとなるように設計した。図２０（３）は、実施例３で作製したデバイス１の写真、図２０（４）は、捕捉用ピラー７１を配置した部分の拡大写真である。
＜実施例４＞
［血小板製造装置の作製及び血小板の製造］
　実施例３で作製したデバイス１を用いた以外は、実施例２と同様の手順で血小板製造装置を作製し、血小板の製造を行った。図２１（１）及び（２）はせん断力を付与中の同じ場所の写真で、（２）は（１）より時間が経過した後の写真である。図２１（１）及び（２）中の矢印（鎖線）の先の黒い部分は捕捉用ピラー７１で、紐状の血小板前駆体が捕捉用ピラー７１に引っ掛かるように捕捉されたことを確認した。また、せん断力を付与し続けることで、捕捉用ピラー７１で捕捉された血小板前駆体の先端部分（図２１（１）の矢印（実線））が短くなり（図２１（２）の矢印（実線））、捕捉用ピラー７１に捕捉された血小板前駆体から血小板が製造されたことを確認した。
　以上の結果より、デバイス１の流出口２３側の流路６の一部に血小板前駆体を捕捉するための捕捉用ピラー７１を配置することで、捕捉された血小板前駆体から引き続き血小板を製造することができ、血小板製造装置の製造効率を向上できることが明らかとなった。
　本発明の血小板製造用デバイス、血小板製造装置及び血小板製造方法を用いると、巨核球から血小板を効率よく、且つ安定的に製造することができる。したがって、輸血に必要な血小板を効率よく製造することができるので、医療産業にとって有用である。

Claims (15)

  1. 　巨核球から血小板を製造するために用いられる血小板製造用デバイスであって、
    　前記血小板製造用デバイスは、第１部材及び流路深さ調整部材を少なくとも含み、
    　前記第１部材は、第２部材と組み合すことで巨核球を保持することができ、前記巨核球にせん断力を付与するための液体を流すことができ、且つ製造した血小板の流出口を含む流路を形成し、
    　前記流路深さ調整部材は、前記第１部材を前記第２部材と組み合わせた際に、前記流路の一端側は前記巨核球が通過できる深さで、且つ前記流路の他端側の血小板の流出口の方が流路の深さが浅くなるように流路の深さを調整する、
    血小板製造用デバイス。
  2. 　前記第１部材が、前記巨核球を投入することができ、且つ該巨核球にせん断力を付与するための液体を投入する投入孔を含む請求項１に記載の血小板製造用デバイス。
  3. 　前記第１部材の上面が円形で、前記投入孔が円の中心に形成されている請求項２に記載の血小板製造用デバイス。
  4. 　前記流路深さ調整部材が、前記第１部材に形成された壁部又はピラーである請求項１～３の何れか一項に記載の血小板製造用デバイス。
  5. 　前記流路深さ調整部材が、前記投入孔に挿通することができ、且つ前記流路に巨核球及び該巨核球にせん断力を付与するための液体を投入するための開口部を有する筒体である請求項３に記載の血小板製造用デバイス。
  6. 　前記流路深さ調整部材が、前記血小板の流出口の深さを０．５μｍ以上、１００μｍ以下に調整する請求項１～５の何れか一項に記載の血小板製造用デバイス。
  7. 　前記流路深さ調整部材が、前記血小板の流出口の深さを２μｍ以上、３０μｍ以下に調整する請求項６に記載の血小板製造用デバイス。
  8. 　前記流路深さ調整部材が、前記血小板の流出口の深さを３μｍ以上、９μｍ以下に調整する請求項７に記載の血小板製造用デバイス。
  9. 　前記流路の任意の場所の深さｈrが、下記式（１）で表される請求項３～８の何れか一項に記載の血小板製造用デバイス。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
     （上記式（１）中、Ｒは第１部材２の円の半径、ΣｗRは円の半径Ｒにおける流路深さ調整部材の厚みｗRの総和、ｒは中心からの距離、ｈrは距離ｒにおける深さ、Σｗrは距離ｒにおける流路深さ調整部材の厚みｗrの総和、ｈ2は流出口の深さ、を表す。）
  10. 　前記第１部材を複数含む請求項１～９の何れか一項に記載の血小板製造用デバイス。
  11. 　前記第１部材と組み合すことで巨核球を保持するための流路を形成する第２部材を含む請求項１～１０の何れか一項に記載の血小板製造用デバイス。
  12. 　前記血小板の流出口の周囲に形成され、前記血小板の流出口から流出した血小板を含む液体を貯めるための外壁を含む請求項１１に記載の血小板製造用デバイス。
  13. 　巨核球が引き延ばされて形成された血小板前駆体をトラップできる捕捉用ピラーが、前記第１部材及び／又は前記第２部材に形成され、
    　前記第１部材及び前記第２部材を組み合わせた際に、前記捕捉用ピラーが、前記流路の血小板の流出口側の一部に配置されている、請求項１１又は１２に記載の血小板製造用デバイス。
  14. 　請求項１～１３の何れか一項に記載の血小板製造用デバイス、前記血小板製造用デバイスに巨核球を送り込むことができ、且つ該巨核球にせん断力を付与するための液体を送液するためのポンプ、を少なくとも含む血小板製造装置。
  15. 　請求項１～１３の何れか一項に記載の血小板製造用デバイスの流路に巨核球を投入する工程、
    　前記流路に液体を投入し前記巨核球にせん断力を付与する工程、
    　前記流路の血小板の流出口から流出した血小板を回収する工程、
    を少なくとも含む血小板の製造方法。
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