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WO2014007190A1 - 細胞展開用デバイスおよび希少細胞の検出方法 - Google Patents

細胞展開用デバイスおよび希少細胞の検出方法 Download PDF

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WO2014007190A1
WO2014007190A1 PCT/JP2013/067978 JP2013067978W WO2014007190A1 WO 2014007190 A1 WO2014007190 A1 WO 2014007190A1 JP 2013067978 W JP2013067978 W JP 2013067978W WO 2014007190 A1 WO2014007190 A1 WO 2014007190A1
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WO
WIPO (PCT)
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microchamber
cell
cells
flow path
chip
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2013/067978
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English (en)
French (fr)
Inventor
淳吾 荒木
久美子 星
山村　昌平
聖基 八代
正俊 片岡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Konica Minolta Inc
Original Assignee
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Konica Minolta Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST, Konica Minolta Inc filed Critical National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority to US14/411,191 priority Critical patent/US10584367B2/en
Priority to JP2014523725A priority patent/JP6218185B2/ja
Priority to EP13812976.2A priority patent/EP2871232B1/en
Publication of WO2014007190A1 publication Critical patent/WO2014007190A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
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    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0652—Sorting or classification of particles or molecules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1404—Handling flow, e.g. hydrodynamic focusing
    • G01N2015/1415—Control of particle position

Definitions

  • the present invention relates to a microchamber chip having a microchamber on the surface capable of storing and holding cells, a flow channel forming frame, and an inlet portion and an outlet portion of a cell suspension provided in the flow channel forming frame. And a method for detecting rare cells from a cell suspension using the device.
  • CTC circulating tumor cell
  • FDA US Food and Drug Administration
  • CTC has a very low blood concentration
  • high detection power is required to detect CTC.
  • a detection region for example, an observation field of a microscope
  • FIG. 7 shows a state in which red blood cells are stored in the microchamber in three types of microarray chips A to C each having a microchamber having a specific inner diameter and depth.
  • the gaps between the micro chambers are large. Therefore, when a sample is simply added on the surface of the microarray chip, it can be easily estimated that a large amount of cells remain outside the microchamber.
  • Other such microarray chips are disclosed in Patent Documents 2 and 3 and Non-Patent Document 1, respectively.
  • microchamber type device in view of industrial mass productivity, molding (or production) using a mold is common.
  • the microchambers are in close contact with each other, that is, the area outside the microchamber is minimized.
  • Limited micro-chamber type devices are also conceivable, but it is not realistic to assume that the micro-chamber type device is "extracted" from the mold during mold production. it is obvious.
  • the present invention develops a cell suspension on the surface of a microchamber chip when detecting rare cells (for example, CTC) from a cell suspension containing a large amount of various types of cells such as blood.
  • CTC rare cells
  • the ratio of the total number of cells that can be held in each microchamber relative to the total number of cells contained in the cell suspension (hereinafter also referred to as “cell recovery rate”) is extremely high.
  • An object of the present invention is to provide a cell deployment device having a microchamber chip that can be produced.
  • the present inventors have found that the cell suspension is on the surface of a microchamber chip on which the microchamber is arranged under specific conditions. When it was allowed to flow down, it was found that the cell recovery rate was extremely high, and the present invention was completed.
  • the cell deployment device stores and holds cells according to, for example, FIG.
  • a device for deployment (10), in which the opening of the microchamber (6) is vertically projected onto the vertical width (20) of the microchamber chip (1) Is the ratio of the sum of the voids (40), which is the length of the portion where the projected opening of the micro chamber (6) does not exist with respect to the vertical width (20), to the vertical width (20).
  • the porosity is 5% or less.
  • the cell expansion device When the cell expansion device according to the present invention is used, for example, when all cells contained in a cell suspension such as blood are expanded on a microchamber chip, the cells are almost discharged from the outlet of the cell expansion device. Almost all cells can be kept in the microchamber. Moreover, since such a thing can be performed after maintaining a fixed space
  • the cells stored and retained in the microchamber may be retained in the microchamber even after the staining process or the washing process. Almost no leakage from
  • FIG. 1 schematically shows a cross-sectional view parallel to the direction in which a cell suspension flows when the cell suspension flows through the flow path (5) of the cell deployment device (10) according to the present invention.
  • FIG. 1 (A) shows an embodiment in which the bottom surface of the flow path (5) is made of the surface of the microchamber chip (1)
  • FIG. 1 (B) shows that the bottom surface of the flow path is the micro chamber chip (1 ) And a part of the flow path forming frame (2).
  • a dotted arrow indicates a direction in which the cell suspension flows when the cell suspension is introduced into the cell deployment device (10) according to the present invention.
  • FIG. 1 schematically shows a cross-sectional view parallel to the direction in which a cell suspension flows when the cell suspension flows through the flow path (5) of the cell deployment device (10) according to the present invention.
  • FIG. 1 (A) shows an embodiment in which the bottom surface of the flow path (5) is made of the surface of the microchamber chip (1)
  • FIG. 1 (B) shows that the bottom surface of
  • FIG. 2 is a schematic view of a part of one embodiment of the microchamber chip (1) used in the present invention as seen from directly above, and shows the vertical width (20) and the gap (40) of the microchamber chip (1). Show the relationship. Note that the direction indicated by the dotted arrow is as described in FIG.
  • FIG. 3 is a schematic view of one embodiment of the microchamber chip (1) used in the present invention viewed from directly above, and the pitch (50) indicates the distance between the centers of two adjacent microchambers (6). Show. The points in the figure represent a microchamber similar to the microchamber (6). Note that the direction indicated by the dotted arrow is as described in FIG. FIG.
  • FIG. 4 is a schematic view in which a specific embodiment of the cell deployment device (10) according to the present invention is viewed from directly above.
  • FIG. 4 (A) and FIG. 4 (A) are cross-sectional schematic views taken along the line A ′. B) is shown.
  • the direction indicated by the dotted arrow is as described with reference to FIG. 1.
  • the reservoir (60) (capacity is, for example, 500 ⁇ L) is disposed on the outlet (4), and the direction from the inlet (3)
  • the flow-in cell suspension is discharged from the outlet (4) and temporarily stored in the reservoir (60).
  • the ceiling portion and the side surface portion of the flow path forming frame (2) are formed from a flow path top plate (2a) and a flow path seal (2b), respectively.
  • FIG. 5 shows an image of the surface of the microchamber chip after introducing the cell suspension into the flow path of the device for cell deployment in Example 1 and allowing it to stand for 5 minutes.
  • FIG. 1 shows an image of the surface of a microchamber chip after intermittent liquid feeding in Example 1.
  • FIG. 5C shows an arrangement pattern of the concave portions (110a) (holding portions (110)) of the plate (100) of the chemical microdevice described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-212048 (Patent Document 2).
  • (D) shows the arrangement pattern of the microchamber (6) of the microchamber chip (1) used in Example 1, and each arrow represents the path and direction in which the cells contained in the cell suspension move. .
  • FIG. 6 shows the formation of a large number of fine recesses (110a) as holding parts (110) for holding a sample on the surface of a chemical microdevice plate (100) described in JP 2004-212048 (Patent Document 2).
  • FIG. 2 is a schematic plan view showing the state (see FIG. 1 of the publication, with the reference numerals changed).
  • FIG. 7 is FIG. 7 described in International Publication No. 2010/027003 (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 In the top image of each of the microarray chips A to C having microchambers having different inner diameters and depths, A state in which red blood cells are stored is shown.
  • the "cell deployment device” (10) has a “microchamber” (6) that can store and hold cells on the surface.
  • the opening of the microchamber (6) is projected perpendicularly to the ⁇ longitudinal width of the microchamber chip (1) '' (20)
  • the opening of the microchamber (6) is When projected perpendicularly to the vertical width (20) of the microchamber chip (1) (not the vertical width of the flow path), the projected opening of the microchamber (6) is in relation to the vertical width (20).
  • the “void ratio”, which is the ratio of the sum of the voids (40), which is the length of the nonexistent portion, to the vertical width (20) is 5% or less, preferably 0%.
  • the above “longitudinal width of the micro chamber chip (1)” (20) is defined as the width in the short direction of the micro chamber chip (1) as shown in FIG.
  • the width in the longitudinal direction of the microchamber chip (1) is defined as the lateral width (30).
  • the direction in which the cell suspension flows in the channel that is, the direction of the straight line connecting the inlet portion (3) and the outlet portion (4)
  • the vertical width (20) of (1) is the width in the direction perpendicular to it.
  • the device for cell development By using the device for cell development according to the present invention, a series of steps of developing a cell suspension on a microchamber chip, storing and holding cells in the microchamber, and staining and detecting specific rare cells are performed. It can also be automated.
  • the microchamber chip (1) used in the present invention has one or more microchambers (6) capable of storing and holding one or more cells on its surface, and the porosity is preferably 5% or less, preferably Is 0%.
  • the microchamber in the present invention refers to a concave fine hole (microwell) that can “store” and “hold” one or more cells, and has a bottom (that is, not a through hole). preferable.
  • “storing” means that when a cell suspension is added to the surface of the microchamber chip for cell deployment according to the present invention, cells enter (accommodate) the microchamber, and “holding” means This means that the cells stored in the microchamber do not come out of the microchamber due to a staining solution or a washing solution added to the surface of the microchamber chip for cell development.
  • FIG. 5 (C) shows a typical plate (chemical microdevice plate described in Japanese Patent Laid-Open No. 2004-212048 (Patent Document 2)) (100) in a concave portion (11a) (holding portion). (110)) shows the arrangement pattern, and when the cells contained in the cell suspension move along the path indicated by the arrow, the cells are stored in the recess (110a) when passing over the recess (110a). (Indicated by “ ⁇ ”), but the cells pass through the plate (indicated by “x”) if they do not pass over the recess (110a) at all. Note that the porosity of this plate is about 50%.
  • FIG. 5 (D) shows a preferable arrangement pattern of the microchamber (6) according to the present invention, and the porosity of the microchamber chip having such an arrangement in the transverse direction of the channel is shown. Is 0% by eye.
  • FIG. 5 (D) when the cells contained in the cell suspension move along the path indicated by the arrow, the cells are added on the microchamber (6) in any path. It can be seen that the possibility of being stored in the microchamber (6) is extremely high.
  • the cells that can be held in each microchamber with respect to the total number of cells contained in the cell suspension It can be seen that the total number ratio (cell recovery rate) is extremely high.
  • the pitch (50) of the microchamber (6) is preferably 1.5 times or more the diameter of the microchamber (6).
  • the pitch is preferably the same as the diameter of the chamber (that is, the chambers are in contact with each other).
  • the microchamber chip (1) is mass-produced using a mold, the chip is removed from the mold. The minimum pitch that can be removed is preferred.
  • the diameter of the microchamber (6) is preferably 20 to 150 ⁇ m. When the diameter of the chamber exceeds 150 ⁇ m, the cell holding power of the chamber tends to be weakened, and when the diameter of the chamber is less than 20 ⁇ m, the cells may not be stored in the chamber.
  • the depth of the microchamber (6) is preferably varied depending on the diameter of the microchamber (6), and those skilled in the art will be able to store about 10 to 15 cells per chamber.
  • the thickness can be determined as appropriate.
  • the depth of the microchamber (6) is 20 ⁇ m or more and 100 ⁇ m.
  • the shape of the microchamber (6) is an inverted conical shape with a flat bottom in FIGS. 1 to 3 (the longitudinal section indicates a trapezoid), but the present invention is not limited to this embodiment.
  • the bottom of the microchamber is typically flat, but may be curved.
  • the material for the microchamber chip the same material as that of a conventionally known microplate can be used, and any material that can be molded using a mold is preferable.
  • any material that can be molded using a mold is preferable.
  • examples thereof include polymers such as siloxane [PDMS], polymethyl methacrylate [PMMA], and cyclic olefin copolymer [COC].
  • the microchamber chip may be a combination of a plurality of materials in which a molded polymer is bonded to a substrate made of metal, glass, quartz glass, or the like.
  • the manufacturing method of the microchamber chip (1) may be a method of forming using a mold having a convex portion corresponding to the shape of the microchamber (6) on the surface of the substrate, such as the polymer, metal, glass, etc.
  • a method of forming a micro chamber by directly processing for example, fine processing by lithography, excavation processing, LIGA process, etc.
  • a manufacturing method of forming using a mold is preferable.
  • the microchamber chip (1) can be subjected to a surface treatment if necessary.
  • the surface treatment include plasma treatment (oxygen plasma treatment, etc.), corona discharge treatment, treatment with a hydrophilic polymer, protein, lipid, and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the flow path (5) formed in the cell deployment device (10) according to the present invention has a microchamber chip (1) surface as a bottom surface, for example, as shown in FIG.
  • the flow path forming frame (2) provided integrally with (1) forms the side surface and the ceiling, and flows from the inlet (3) provided in the flow path forming frame (2).
  • the cell suspension is allowed to flow in the direction indicated by the dotted arrow, and then the cell suspension flows out from the outlet (4) provided in the flow path forming frame (2).
  • the flow path (5) has, for example, as shown in FIG. 1 (B), the bottom surface is the surface of the microchamber chip (1) and other members (in FIG. 1 (B), the flow path forming frame (2) ) May be formed.
  • members other than the microchamber chip (1) are arranged in the short direction of the microchamber chip (1) in order to prevent cell loss due to flowing down the area without the microchamber (1). It is desirable not to form the bottom surface.
  • microchamber chip (1) and the flow path forming frame (2) are integrated with each other, they can be detached from each other. It is also possible to remove only the ceiling (flow path top plate), leaving only the side surface from (2).
  • the height (7) of the flow path (5) that is, the distance from the surface of the microchamber chip (1) other than the surface of the microchamber (6) to the ceiling (hereinafter also referred to as “ceiling height”). Is preferably 50 to 500 ⁇ m.
  • the height of the ceiling is within the above range, it is easy to move cells attached to the surface of the microchamber chip (1) other than the surface of the microchamber (6) by the force of water flow, and the cells are microscopic. It is preferable because the time until it settles on the surface of the chamber chip (1) can be shortened, and the cells in the flow path are less likely to be clogged, so that the cells are smoothly developed.
  • Examples of the material of the flow path forming frame (2) include the same materials as those of the micro chamber chip (1) as described above, and it is preferable to use the same material as the micro chamber chip (1). Further, the same surface treatment as that of the microchamber chip (1) as described above may be performed.
  • the flow path (5) is, for example, as shown in FIG. 4 (B), between the flow path top plate (2a) and the microchamber chip (1), a silicon sheet having adhesiveness on both sides, that is, a flow.
  • the channel forming frame (2) can also be formed by sandwiching the channel seal (2b).
  • the cell suspension may contain rare cells, for example, blood such as human, lymph fluid, tissue fluid, body cavity fluid, etc., and may be appropriately diluted with a diluent or the like.
  • the cell suspension is not limited to those derived from living organisms, and may be a cell dispersion prepared by suspending cells artificially for testing and research.
  • rare cells examples include cancer cells.
  • the rare cells may be CTC [circulating tumor cells or circulating cancer cells].
  • the diameter of various cells contained in such a cell suspension is preferably 10 to 100 ⁇ m.
  • a rare cell detection method can be used to change a cell suspension from a cell suspension to a cell suspension.
  • a method for detecting a rare cell that may be contained by introducing a cell suspension into a flow path (5) from an inlet (3) of a cell deployment device (10), and A step of spreading on the surface of the chip (1); and a step of storing the developed cells in the microchamber (6), typically including the following steps.
  • physiological saline such as PBS [phosphate buffered saline] from the inlet (3) of the cell deployment device (10) (preferably the same solvent as the cell suspension used in step (b)
  • the cross-sectional area of the channel is 1 to 1,000 mm 2
  • the flow rate is 1 to 1,000 ⁇ L / sec.
  • the flow rate per second should be adjusted so that the flow rate is 1 mm / sec or less.
  • the liquid is fed from the inlet (3) and allowed to stand for 1 to 30 seconds (for example, 10 seconds).
  • This step is preferably repeated twice or more, more preferably 10 times. In this step, when liquid feeding and standing are repeated, this liquid feeding is particularly referred to as “intermittent liquid feeding” in this specification.
  • a washing liquid of introducing the washing liquid from the inlet part (3) and discharging it from the outlet part (4) at least once.
  • the cells are held in the microchamber (6), it is difficult to be discharged from the outlet (4) together with the staining solution and the washing solution, whereas the microchamber (6) is not held in the microchamber (6).
  • the cells attached to the surface other than) are easily discharged from the outlet part (4) together with the staining solution and the washing solution (this is referred to as “loss”).
  • Example 1 A microchamber chip (made of polystyrene and molded using a predetermined mold) in which the microchamber (6) was arranged as shown in FIG. 5 (D) was used for a cell deployment device.
  • the diameter of the microchamber of this microchamber chip was 100 ⁇ m
  • the depth of the microchamber was 50 ⁇ m
  • the shape of the microchamber was an inverted conical shape with a flat bottom.
  • the pitch representing the distance between the centers of adjacent microchambers was 200 ⁇ m
  • the porosity was 0%.
  • the flow path of the cell development device was filled with PBS containing 3% by weight of bovine serum albumin [BSA] (hereinafter also referred to as “PBS containing 3% BSA”).
  • PBS containing 3% BSA bovine serum albumin
  • FIG. 1 An enlarged image of the microchamber chip surface at that time is shown in FIG.
  • the cells were dispersed and settled inside and outside the microchamber. Thereafter, intermittent liquid feeding (1 ⁇ L of 3% BSA-containing PBS was fed at a flow rate of 0.1 mL / min and then allowed to stand for 5 seconds) was performed 10 times.
  • FIG. 5 (B) Magnified image of the microchamber surface at this time is shown in FIG. 5 (B). Most of the cells scattered outside the microchamber before intermittent feeding could be stored in the microchamber. When the total number of cells that flowed into the cell expansion device was taken as 100%, cells corresponding to 98% could be stored in the microchamber. That is, the cell recovery rate was 98%.
  • Example 2 In Example 1, the cell recovery rate was determined in the same manner as in Example 1 except that the porosity of the microchamber chip was changed to 1% and 5%, respectively. The intermittent liquid feeding was further performed 10 times (20 times in total), and the cell recovery rate was determined. The results are shown in Table 1.
  • Example 1 the cell recovery rate was determined in the same manner as in Example 1 except that the porosity of the microchamber chip was changed to 10%. The results are shown in Table 1.
  • Example 2 the cell recovery rate was determined in the same manner as in Example 1 except that the plate shown in FIG. 6 having a porosity of 75% was used. As a result, the recovery rate of cells at the end of 10 intermittent liquid feedings was 26%.

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Description

細胞展開用デバイスおよび希少細胞の検出方法
　本発明は、細胞を格納、保持することができるマイクロチャンバーを表面に有するマイクロチャンバーチップと、流路形成枠体と、流路形成枠体に設けられた細胞懸濁液の入口部および出口部とを有する細胞展開用デバイスおよび該デバイスを用いて細胞懸濁液から希少細胞を検出する方法に関する。
　希少細胞を検出するためのアプリケーションとして代表的なＣＴＣ〔循環腫瘍細胞〕検出として、例えば、米国食品医薬品局〔ＦＤＡ〕により認可されたセルサーチ(登録商標)システムでは、血液7.5ｍＬ中に含まれる全細胞を検査し、乳癌および前立腺癌では5個以上、大腸癌では3個以上のＣＴＣの発見をもって、転移性の乳癌、大腸癌または前立腺癌が陽性であると判定されている。
　ＣＴＣはその血中濃度が極めて低いが故に、ＣＴＣを検出するには高い検出力が必要とされる。検出するための最初の段階として、ＣＴＣ等の希少細胞を、極めて高い確率で検出領域（例えば、顕微鏡の観察視野等）に出現させることが重要である。
　細胞を検出するための方法として、多数のマイクロチャンバー内に細胞を格納する技術が、いくつか知られている。例えば、特許文献1では、血中のマラリア細胞検出を目的として、大量の赤血球細胞を、ウェル構造を有するマイクロチャンバーを備えたチップ上に添加し、ウェルに格納された赤血球のみを検出対象としている。図7（特許文献1の図7）には、特定の内径および深さを有するマイクロチャンバーをそれぞれ備えた三種類のマイクロアレイチップＡ～Ｃにおいて、マイクロチャンバーに赤血球細胞が格納されている様子が示されているが、それぞれのマイクロチャンバー同士の隙間はいずれも大きい。そのため、マイクロアレイチップ表面上に試料を単純に添加した場合、マイクロチャンバー外に大量の細胞が残存してしまうものと容易に推測できる。このようなマイクロアレイチップとしては他にも、特許文献2,3および非特許文献1にそれぞれ開示されている。
　例えば、乳癌を患っていると診断された被験者の血液から、特許文献1に記載のマイクロアレイチップを用いてその悪性度を判定しようとする場合、仮にその血液7.5ｍＬ中にＣＴＣが6個含まれており、特許文献1に記載のマイクロアレイチップ表面に添加した全細胞のうち80％に相当する細胞数の細胞がマイクロチャンバー内に格納できるとすると、マイクロチャンバー内に格納されるＣＴＣは4.8個すなわち5個未満となり、セルサーチ(登録商標)システムの判定（すなわち血液7.5ｍＬに含まれるＣＴＣが5個以上であると乳癌であると判定）に照らし合わせると「陰性」と判定され、「偽陰性」が発生してしまう。
　ところで、工業的量産性を鑑みてマイクロチャンバー型デバイスを生産する場合、金型を用いた成形（または生産）が一般的である。血液試料に含まれる全細胞数に対する、マイクロチャンバー内に格納された細胞数の割合、すなわち細胞の回収率を向上させる一つの方策として、マイクロチャンバー同士が密接した、すなわちマイクロチャンバー外の領域を最小限としたマイクロチャンバー型デバイスも考えられるが、金型生産時に金型からマイクロチャンバー型デバイスを"抜く"ことを想定すると現実的ではなく、マイクロチャンバー間にはある程度の隙間が必要となることは明らかである。
　このようなマイクロチャンバー型デバイスを、希少細胞の検出に応用するには、細胞の高い回収率と、金型生産できるという効率的な量産性とを考慮した細胞展開用のマイクロチャンバーデバイスを開発する必要がある。
国際公開第2010/027003号 特開第2004-212048号公報 特開第2004-330038号公報
High-Efficiency Single-Cell Entrapment and Fluorescence in Situ Hybridization Analysis Using a Poly(dimethylsiloxane) Microfluidic DeviceIntegrated with a Black Poly(ethylene terephthalate) Micromesh Anal. Chem., 2008, 80, 5139-5145
　本発明は、例えば血液などのような、様々な種類の細胞を大量に含む細胞懸濁液から希少細胞（例えばＣＴＣなど）を検出する場合に、細胞懸濁液をマイクロチャンバーチップ表面上に展開したとき、細胞懸濁液に含まれる全細胞数に対する、各マイクロチャンバーに保持することができる細胞数合計の割合（以下「細胞の回収率」ともいう。）が極めて高く、また金型による大量生産が可能なマイクロチャンバーチップを有する細胞展開用デバイスを提供することを目的とする。
　本発明者らは、細胞懸濁液から希少細胞を検出するための細胞展開用デバイスについて検討した結果、特定の条件でマイクロチャンバーが配置されているマイクロチャンバーチップの表面上を細胞懸濁液が流下するようにすると、細胞の回収率が極めて高くなることを見出し、本発明の完成に至った。
　すなわち、上述した目的のうち、少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した、本発明に係る細胞展開用デバイスは、例えば図1(Ａ)によると、細胞を格納、保持することができるマイクロチャンバー(6)を表面に有するマイクロチャンバーチップ(1)と；マイクロチャンバー(6)上に流路(5)が形成されるようにしてマイクロチャンバーチップ(1)と一体化して設けられた流路形成枠体(2)と；細胞懸濁液を流路(5)に流入させるために流路形成枠体(2)に設けられた入口部(3)と；入口部(3)から流路(5)に流入された細胞懸濁液を流路(5)から流出させるために流路形成枠体(2)に設けられた出口部(4)と；を少なくとも有する細胞展開用デバイス(10)であって、マイクロチャンバー(6)の開口部をマイクロチャンバーチップ(1)の縦幅(20)に垂直に投影したとき、投影されたマイクロチャンバー(6)の開口部が該縦幅(20)に対して存在しない部分の長さである空隙(40)の総和の、該縦幅(20)に対する割合である空隙率が、5％以下である。
　本発明に係る細胞展開用デバイスを用いると、例えば血液などの細胞懸濁液に含有される全細胞をマイクロチャンバーチップ上に展開する際、細胞展開用デバイスの出口部から細胞をほとんど流出させることなく、ほぼすべての細胞をマイクロチャンバー内に保持することができる。また、そのようなことを、マイクロチャンバー同士が一定の間隔を保った上で行うことができるので、マイクロチャンバーデバイスを金型生産する場合にも支障をきたさない。
　細胞を展開した後、希少細胞を検出するために、希少細胞を染色する工程やその後の洗浄工程などを実施する際に、マイクロチャンバーチップ表面のうちマイクロチャンバー以外の表面に残存していた細胞は、染色液や洗浄液とともに出口部から流出するおそれがあるが、マイクロチャンバー内に格納、保持された細胞は、染色工程や洗浄工程を実施しても、マイクロチャンバー内に保持されるため、出口部からほとんど流出することがない。
図1は、本発明に係る細胞展開用デバイス(10)の、流路(5)に細胞懸濁液を流した場合に細胞懸濁液が流れる方向に平行な断面図を模式的に示したものであり、図1(Ａ)は、流路(5)の底面がマイクロチャンバーチップ(1)の表面からなる態様を示し、図1(Ｂ)は、流路の底面がマイクロチャンバーチップ(1)の表面と流路形成枠体(2)の一部とからなる態様を示す。点線の矢印は、本発明に係る細胞展開用デバイス(10)に細胞懸濁液を流入させた場合、細胞懸濁液が流れる方向を示す。 図2は、本発明で用いるマイクロチャンバーチップ(1)の一態様の一部を真上から見た模式図であり、マイクロチャンバーチップ(1)の縦幅(20)と空隙(40)との関係を示す。なお、点線の矢印が示す方向は、図1で説明したとおりである。 図3は、本発明で用いるマイクロチャンバーチップ(1)の一態様を真上から見た模式図であり、ピッチ(50)は、隣接する二個のマイクロチャンバー(6)の中心間の距離を示す。図中の点は、マイクロチャンバー(6)と同様のマイクロチャンバーを表わす。なお、点線の矢印が示す方向は、図1で説明したとおりである。 図4は、本発明に係る細胞展開用デバイス(10)の具体的な態様を真上から俯瞰した模式図4(Ａ)および(Ａ)をＡ'の線で切った断面の模式図4(Ｂ)を示す。なお、点線の矢印が示す方向は、図1で説明したとおりであり、出口部(4)の上にリザーバー(60)（容量は例えば500μＬ）が配設されており、入口部(3)から流入された細胞懸濁液は出口部(4)から排出されリザーバー(60)に一時的に貯留される。また、流路形成枠体(2)の天井部および側面部が、それぞれ流路天板(2a)および流路シール(2b)から形成されている。 図5(Ａ)は、実施例1において、細胞懸濁液を細胞展開用デバイスの流路に導入し、5分間静置した後のマイクロチャンバーチップ表面の画像を示し、図5(Ｂ)は、実施例1において、間欠送液した後のマイクロチャンバーチップ表面の画像を示す。図5(Ｃ)は、特開2004-212048号公報（特許文献2）に記載の化学マイクロデバイスのプレート(100)の凹部(110a)（保持部(110)）の配置パターンを示し、図5(Ｄ)は、実施例1で用いたマイクロチャンバーチップ(1)のマイクロチャンバー(6)の配置パターンを示し、それぞれの矢印は細胞懸濁液に含有される細胞が移動する経路と方向を表わす。なお、図5(Ｃ)および(Ｄ)では、それぞれ凹部(110a)およびマイクロチャンバー(6)しか図示していないが、それらの上には流路が形成されており、矢印の末端と先端と結ぶ線の延長方向にはそれぞれ流路の入口部と出口部とが存在するため、細胞懸濁液が流入し排出する経路と方向は、図中の矢印が示す経路と方向に相当する。 図6は、特開2004-212048号公報（特許文献2）に記載の化学マイクロデバイスのプレート(100)の表面に、試料を保持させる保持部(110)として微細な凹部(110a)を多数形成した状態を示した概略平面図である（該公報の図1を参照、ただし符号は変更した）。 図7は、国際公開第2010/027003号（特許文献1）に記載された図7であり、内径および深さが異なるマイクロチャンバーを備えたマイクロアレイチップＡ～Ｃそれぞれの上面画像において、マイクロチャンバーに赤血球細胞が格納されている様子を示す。
　以下、本発明について、詳細に説明する。
　・細胞展開用デバイス
　例えば図1(Ａ)に示されるように、本発明に係る「細胞展開用デバイス」(10)は、細胞を格納、保持することができる「マイクロチャンバー」(6)を表面に有する「マイクロチャンバーチップ」(1)と；マイクロチャンバー(6)上に「流路」(5)が形成されるようにしてマイクロチャンバーチップ(1)と一体化して設けられた「流路形成枠体」(2)と；細胞懸濁液を流路(5)に流入させるために流路形成枠体(2)に設けられた「入口部」(3)と；入口部(3)から流路(5)に流入された細胞懸濁液を流路(5)から流出させるために流路形成枠体(2)に設けられた「出口部」(4)と；を少なくとも有し、図2に示すように、マイクロチャンバー(6)の開口部を「マイクロチャンバーチップ(1)の縦幅」(20)に垂直に投影したとき、マイクロチャンバー(6)の開口部を、マイクロチャンバーチップ(1)の縦幅(20)（流路の縦幅ではない。）に垂直に投影したとき、投影されたマイクロチャンバー(6)の開口部が該縦幅(20)に対して存在しない部分の長さである空隙(40)の総和の、該縦幅(20)に対する割合である「空隙率」が5％以下、好ましくは0％である。
　上記「マイクロチャンバーチップ(1)の縦幅」(20)は、図3に示すように、マイクロチャンバーチップ(1)の短手方向の幅として規定される。これに対して、マイクロチャンバーチップ(1)の長手方向の幅は横幅(30)として規定される。一般的には、流路中を細胞懸濁液が流れる方向（すなわち入口部(3)と出口部(4)とを結ぶ直線の方向）は、マイクロチャンバーチップの長手方向であり、マイクロチャンバーチップ(1)の縦幅(20)はそれに垂直な方向の幅となる。
　本発明に係る細胞展開用デバイスを用いることによって、マイクロチャンバーチップ上への細胞懸濁液の展開、マイクロチャンバー内への細胞の格納および保持、特定の希少細胞の染色および検出という一連の工程を自動化することも可能である。
　　　　　　　　　　　＜マイクロチャンバーチップ＞
　本発明で用いるマイクロチャンバーチップ(1)は、その表面に、一個以上の細胞を格納し、保持することができるマイクロチャンバー(6)を一個以上有し、その上記空隙率が5％以下、好ましくは0％である。
　本発明におけるマイクロチャンバーとは、一個以上の細胞を「格納」し、「保持」することができる凹状の微細穴（マイクロウェル）をいい、有底である（すなわち貫通した穴ではない）ことが好ましい。ここで、「格納」とは、本発明に係る細胞展開用マイクロチャンバーチップ表面に細胞懸濁液を添加した際に細胞がマイクロチャンバーに入る（収容）されることをいい、「保持」とは、マイクロチャンバーに格納された細胞が、細胞展開用マイクロチャンバーチップ表面に添加された染色液や洗浄液等によってマイクロチャンバー外に出ないことをいう。
　例えば図5(Ｃ)は、従来使用されている典型的なプレート（特開2004-212048号公報（特許文献2）に記載の化学マイクロデバイスのプレート）(100)の凹部(11a)（保持部(110)）の配置パターンを示しており、細胞懸濁液に含有される細胞が矢印に示す経路に沿って移動する場合、凹部(110a)上を通過すると細胞は凹部(110a)に格納される（「○」で示す。）が、凹部(110a)上を一切通過しないと細胞はプレートを素通りしてしまう（「×」で示す）。なお、このプレートの空隙率は目測で50％程度である。
　それに対して、例えば図5(Ｄ)は、本発明に係るマイクロチャンバー(6)の好ましい配置パターンを示しており、流路の横断方向に渡って、このような配置のマイクロチャンバーチップの空隙率は目測で0％である。図5(Ｄ)において、細胞懸濁液に含有される細胞が矢印に示す経路に沿って移動する場合、いずれの経路であっても細胞はマイクロチャンバー(6)上を追加するため、細胞がマイクロチャンバー(6)に格納される可能性は極めて高いことがわかる。
　このように、本発明に係る細胞展開用デバイスが備えるマイクロチャンバーチップ上に細胞懸濁液を展開したとき、細胞懸濁液に含まれる全細胞数に対する、各マイクロチャンバーに保持することができる細胞数の合計の割合（細胞の回収率）が極めて高いことがわかる。
　図3に示すように、マイクロチャンバー(6)のピッチ(50)は、該マイクロチャンバー(6)の直径の1.5倍以上であることが好ましい。理論上ピッチは該チャンバーの直径と限りなく同じ（すなわち、該チャンバー同士が接している）方が好ましいが、マイクロチャンバーチップ(1)は金型を用いて量産するため、金型から該チップが抜けられる最小限のピッチが好ましい。
　また、マイクロチャンバー(6)の直径は、20～150μｍであると好ましい。該チャンバーの直径が150μｍを超えると、該チャンバーの細胞保持力が弱まる傾向を示し、また該チャンバーの直径が20μｍ未満であると、細胞が該チャンバーに格納されない場合がある。
　マイクロチャンバー(6)の深さは、マイクロチャンバー(6)の直径によって変動させることが好ましく、当業者であれば、該チャンバー1つあたり細胞を10～15個程度格納できるように該チャンバーの深さを適宜決定することができる。典型的には、マイクロチャンバー(6)の深さは、20μｍ以上100μｍである。
　マイクロチャンバー(6)の形状は、図1～3では、底部が平坦な逆円錐形である（縦断面が台形を示している。）が、本発明ではこの態様に限定されず、例えば、円筒形、逆半球形、逆角錐形（逆四角形錐や逆六角形錐等の逆多角形錐）、直方体などが挙げられる。マイクロチャンバーの底部は、典型的には平坦であるが、曲面であってもよい。
　マイクロチャンバーチップの材料としては、従来公知のマイクロプレート等と同じ材料を使用でき、かつ、金型を用いて成形できる材料であれば好ましく、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕、ポリメチルメタクリレート〔ＰＭＭＡ〕、環状オレフィンコポリマー〔ＣＯＣ〕などのポリマーが挙げられる。マイクロチャンバーチップは、成形されたポリマーに、金属、ガラス、石英ガラスなどからなる基板を張り合わせたような複数の材料を組み合わせたものであってもよい。
　マイクロチャンバーチップ(1)の製造方法は、基板の表面にマイクロチャンバー(6)の形状に対応する凸部を有する金型を用いて成形する方法であってもよく、上記ポリマーや金属、ガラスなどからなる基板に直接加工（例えばリソグラフィーによる微細加工、掘削加工、ＬＩＧＡプロセスなど）を施しマイクロチャンバーを形成する方法であってもよいが、金型を用いて成形する製造方法が好ましい。
　マイクロチャンバーチップ(1)は、必要に応じて、表面処理を施すことができる。表面処理としては、例えばプラズマ処理（酸素プラズマ処理など）やコロナ放電処理、または親水性ポリマーやタンパク質、脂質等でコーティングする処理などが挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。
　　　　　　　　　　　　　　　　　＜流路＞
　本発明に係る細胞展開用デバイス(10)の中に形成されている流路(5)は、例えば図1(Ａ)に示すように、マイクロチャンバーチップ(1)表面を底面とし、マイクロチャンバーチップ(1)と一体化して設けられた流路形成枠体(2)が側面部と天井部を形成しており、流路形成枠体(2)に設けられた入口部(3)から流入された細胞懸濁液を、点線の矢印が示す方向に流すためのものであり、その後、細胞懸濁液は流路形成枠体(2)に設けられた出口部(4)から流出される。
　また、流路(5)は、例えば図1(Ｂ)に示すように、底面をマイクロチャンバーチップ(1)の表面とそれ以外の部材（図1(Ｂ)では流路形成枠体(2)）から形成される態様であってもよい。ただし、この場合、マイクロチャンバー(1)の備わっていない領域を流下することによる細胞の損失を防ぐため、マイクロチャンバーチップ(1)の短手方向には、マイクロチャンバーチップ(1)以外の部材が底面を形成しないようにすることが望ましい。
　マイクロチャンバーチップ(1)と流路形成枠体(2)とは、それぞれが一体化した後であっても、互いに取り外すことは可能であり、さらに流路を形成した後、流路形成枠体(2)から側面部のみを残し、天井部（流路天板）だけ取り外すことも可能である。
　流路(5)の高さ(7)、すなわち、マイクロチャンバーチップ(1)表面のうちマイクロチャンバー(6)の表面以外の表面から天井までの距離（以下「天井の高さ」ともいう。）は、50～500μｍであると好ましい。天井の高さが上記範囲内であると、マイクロチャンバーチップ(1)表面のうちマイクロチャンバー(6)の表面以外の表面に付着した細胞を水流の力で動かすことが容易であり、細胞がマイクロチャンバーチップ(1)の表面に沈降するまでを時間を短縮することができ、また、流路内の細胞の目詰まり等が発生しにくいため、細胞が円滑に展開するので好ましい。
　流路形成枠体(2)の材料としては、例えば、上記のようなマイクロチャンバーチップ(1)の材料と同じ材料が挙げられ、マイクロチャンバーチップ(1)と同じ材料を用いることが好ましい。また、上記のようなマイクロチャンバーチップ(1)と同様の表面処理を施してもよい。
　また、流路(5)は、例えば図4(Ｂ)に示すように、流路天板(2a)とマイクロチャンバーチップ(1)との間に、両面に粘着性を有するシリコンシート、すなわち流路シール(2b)を挟持させることによって、流路形成枠体(2)を形成することもできる。
　　　　　　　　　　　　　　　＜細胞懸濁液＞
　細胞懸濁液は、希少細胞を含んでいる可能性がある、例えばヒトなどの血液、リンパ液、組織液、体腔液などであり、希釈液などで適宜希釈されていてもよい。また、細胞懸濁液は、生体由来のものに限定されず、試験・研究等のために人工的に細胞を懸濁させて調製した細胞の分散液であってもよい。
　希少細胞としては、例えば癌細胞などが挙げられる。特に、細胞懸濁液が血液または血液由来検体である場合、希少細胞はＣＴＣ〔循環腫瘍細胞または循環癌細胞〕であってもよい。このような細胞懸濁液に含まれる種々の細胞の直径は、10～100μｍであることが好ましい。
　・希少細胞の検出方法
　本発明に係る希少細胞の検出方法は、例えば図1(Ａ)によると、上記の細胞展開用デバイス(10)を用いて、細胞懸濁液から、細胞懸濁液に含有されている可能性のある希少細胞を検出する方法であって、細胞展開用デバイス(10)の入口部(3)から細胞懸濁液を流路(5)に導入し、細胞をマイクロチャンバーチップ(1)表面上に展開する工程；および、展開された細胞をマイクロチャンバー(6)内に格納する工程を少なくとも含み、典型的には、下記の工程を含む。
　工程(a)：細胞展開用デバイス(10)の入口部(3)からＰＢＳ〔リン酸緩衝生理食塩水〕等の生理食塩水（好ましくは工程(b)で用いる細胞懸濁液と同じ溶媒）で流路(5)を満たす。
　工程(b)：入口部(3)から細胞懸濁液を導入し、工程(a)で流路を満たしていた生理食塩水と置換するようにして、細胞懸濁液で流路(5)を満たす。入口部(3)から細胞懸濁液を導入するのと同時に、出口部(4)から生理食塩水が排出される。
　工程(c)：1～15分間（例えば5分間）静置させることによって、細胞懸濁液に含有される細胞を沈降させる。このとき、例えば図5(Ａ)に示されるように、マイクロチャンバー(6)内に格納される細胞もあるが、マイクロチャンバーチップ(1)表面のうちマイクロチャンバー(6)表面以外の表面に付着する細胞もある。
　工程(d)：細胞懸濁液の体積の1/100～1/2程度（例えば1/50）の生理食塩水（好ましくは工程(b)で用いる細胞懸濁液と同じ溶媒）を、流路の断面積が1～1,000ｍｍ2である場合、1～1,000μＬ/秒の流量（1秒間あたりの流量は、流速が1ｍｍ/秒か、またはそれより小さくなるように該流量を調整することが好ましい。）で、入口部(3)から送液し、1～30秒間（例えば10秒間）静置させる。この工程を2回以上繰り返すことが好ましく、より好ましくは10回繰り返す。この工程において、送液と静置を繰り返す場合、この送液を本明細書では特に「間欠送液」という。
　図5(Ｂ)に示されるように、間欠送液することによって、工程(c)の、マイクロチャンバー(6)内に格納されずにマイクロチャンバー(6)表面以外の表面に付着された細胞が、マイクロチャンバー(6)内に格納されやすくなる。
　工程(e)：特定の希少細胞のみを染色することが可能な染色液（例えば、蛍光色素が標識された抗体の溶液）を入口部(3)から導入し、特定の条件で細胞と反応させた後、出口部(4)から排出する。さらに、細胞や流路(5)内を洗浄するために、洗浄液を入口部(3)から導入し出口部(4)から排出させるという洗浄工程を1回以上実施することが好ましい。
　細胞はマイクロチャンバー(6)内に保持されているため、染色液や洗浄液とともに出口部(4)から排出されにくいのに対して、マイクロチャンバー(6)内に保持されずに、マイクロチャンバー(6)以外の表面に付着していた細胞は、染色液や洗浄液とともに出口部(4)から排出されやすい（このことを細胞が「ロス」（損失）するという）。
　工程(f)：顕微鏡下で観察するなどして、染色された希少細胞を検出する。
　以下、本発明について実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
　［実施例1］
　マイクロチャンバー(6)が図5(Ｄ)に示すように配置されたマイクロチャンバーチップ（ポリスチレン製であり、所定の金型を用いて成形した。）を細胞展開用デバイスに用いた。このマイクロチャンバーチップのマイクロチャンバーの直径は100μｍ、マイクロチャンバーの深さは50μｍであり、マイクロチャンバーの形状は、底部が平坦な逆円錐形であった。隣接するマイクロチャンバー同士の中心間の距離を表わすピッチは200μｍであり、また、空隙率は0％であった。マイクロチャンバーチップの縦幅および横幅はそれぞれ25ｍｍおよび70ｍｍであって、また、細胞展開用デバイスの流路の高さは100μｍ、流路の幅は15ｍｍ、流路の長さは40ｍｍであった。すなわち、細胞展開用デバイスの流路の断面は1.5ｍｍ2であり、流路の容積は60ｍｍ3（＝0.06ｍＬ）となる。
　まず、細胞展開用デバイスの流路を、ウシ血清アルブミン〔ＢＳＡ〕を3重量％含有するＰＢＳ（以下「3％ＢＳＡ含有ＰＢＳ」ともいう。）で満たした。次に、0.4％ホルムアルデヒドで細胞固定したＪｕｒｋａｔを3％ＢＳＡ含有ＰＢＳに溶解させた細胞懸濁液（細胞濃度は1×107cells/ｍＬ）70μＬ（約7×105cells）を、入口部から0.05ｍＬ/分（＝50μＬ/分）の流量条件で流路へ導入し、5分間静置させた。これによって、流路を満たしていたＰＢＳのほとんどは出口部から排出された。
　そのときのマイクロチャンバーチップ表面の拡大画像を図5(Ａ)に示す。細胞はマイクロチャンバー内外に分散して沈降していた。その後、間欠送液（0.1ｍＬ/分の流速で1μＬの3％ＢＳＡ含有ＰＢＳを送液後、5秒間静置する。）を10回実施した。
　このときのマイクロチャンバー表面の拡大画像を図5(Ｂ)に示す。間欠送液前にはマイクロチャンバー外に散らばっていた細胞のほとんどが、マイクロチャンバー内に格納できた。細胞展開用デバイスに流入させた全細胞数を100％とするとき、98％に相当する細胞数の細胞をマイクロチャンバー内に格納できた。すなわち、細胞の回収率は98％であった。
　［実施例2］
　実施例1において、マイクロチャンバーチップの空隙率をそれぞれ1％および5％に変更した以外は実施例1と同様にして細胞の回収率を求めた。間欠送液をさらに10回（全20回）実施し、細胞の回収率を求めた。その結果を表1に示す。
　［比較例1］
　実施例1において、マイクロチャンバーチップの空隙率を10％に変更した以外は実施例1と同様にして細胞の回収率を求めた。その結果を表1に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　［比較例2］
　実施例1において、空隙率が75％である図6に示すプレートを用いた以外は実施例1と同様にして細胞の回収率を求めた。その結果、間欠送液10回終了時の細胞の回収率は26％であった。
　  1 ・・・マイクロチャンバーチップ
　  2 ・・・流路形成枠体
　  2a・・・流路天板
　  2b・・・流路シール
　  3 ・・・入口部
　  4 ・・・出口部
　  5 ・・・流路
　  6 ・・・マイクロチャンバー
　  7 ・・・流路(5)の高さ
　 10 ・・・細胞展開用デバイス
　 20 ・・・マイクロチャンバーチップ(1)の縦幅
　 30 ・・・マイクロチャンバーチップ(1)の横幅（マイクロチャンバーチップ(1)の長手方向）
　 40 ・・・空隙（マイクロチャンバー(6)の開口部をマイクロチャンバーチップ(1)の縦幅(20)に垂直に投影したとき、該縦幅(20)から、投影されたマイクロチャンバー(6)の開口部に相当する幅を差し引いた長さ）
　 50 ・・・ピッチ
　 60 ・・・リザーバー
　100 ・・・プレート
　110 ・・・保持部
　110a・・・凹部

Claims (7)

  1. 　細胞を格納、保持することができるマイクロチャンバー(6)を表面に有するマイクロチャンバーチップ(1)と、
    　マイクロチャンバー(6)上に流路(5)が形成されるようにしてマイクロチャンバーチップ(1)と一体化して設けられた流路形成枠体(2)と、
    　細胞懸濁液を流路(5)に流入させるために流路形成枠体(2)に設けられた入口部(3)と、
    　入口部(3)から流路(5)に流入された細胞懸濁液を流路(5)から流出させるために流路形成枠体(2)に設けられた出口部(4)とを少なくとも有する細胞展開用デバイス(10)であって、
    　マイクロチャンバー(6)の開口部をマイクロチャンバーチップ(1)の縦幅(20)に垂直に投影したとき、投影されたマイクロチャンバー(6)の開口部が該縦幅(20)に対して存在しない部分の長さである空隙(40)の総和の、該縦幅(20)に対する割合である空隙率が、5％以下である細胞展開用デバイス。
  2. 　上記空隙率が0％である、請求項1に記載の細胞展開用デバイス。
  3. 　上記マイクロチャンバー(6)のピッチ(50)が、該マイクロチャンバー(6)の直径の1.5倍以上である、請求項1または2に記載の細胞展開用デバイス。
  4. 　上記マイクロチャンバー(6)の直径が、20μｍ以上150μｍ以下である、請求項1～3のいずれか一項に記載の細胞展開用デバイス。
  5. 　上記流路(5)の高さ(7)が、50μｍ以上500μｍ以下である、請求項1～4のいずれか一項に記載の細胞展開用デバイス。
  6. 　請求項1～5のいずれか一項に記載の細胞展開用デバイス(10)を用いて、細胞懸濁液から、細胞懸濁液に含有されている可能性のある希少細胞を検出する方法であって、
    　細胞展開用デバイス(10)の入口部(3)から細胞懸濁液を流路(5)に導入し、細胞をマイクロチャンバーチップ(1)表面上に展開する工程；および、
    　展開された細胞をマイクロチャンバー(6)内に格納する工程
    を含む希少細胞の検出方法。
  7. 　上記細胞懸濁液に含まれる細胞の直径が、10μｍ以上100μｍ以下である、請求項6に記載の希少細胞の検出方法。
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