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WO2016158756A1 - 再生医療用皮内投与製剤 - Google Patents

再生医療用皮内投与製剤 Download PDF

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Publication number
WO2016158756A1
WO2016158756A1 PCT/JP2016/059633 JP2016059633W WO2016158756A1 WO 2016158756 A1 WO2016158756 A1 WO 2016158756A1 JP 2016059633 W JP2016059633 W JP 2016059633W WO 2016158756 A1 WO2016158756 A1 WO 2016158756A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
intradermal
regenerative medicine
stem cells
preparation
skin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2016/059633
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English (en)
French (fr)
Inventor
田中　哲夫
平原　一郎
陽一郎 岩瀬
一倫 小岩井
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Terumo Corp
Original Assignee
Terumo Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Terumo Corp filed Critical Terumo Corp
Priority to JP2017509909A priority Critical patent/JPWO2016158756A1/ja
Publication of WO2016158756A1 publication Critical patent/WO2016158756A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
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    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators

Definitions

  • the present invention relates to an intradermal preparation for regenerative medicine that is used to regenerate and treat tissues for diseases such as lymphedema, skin ulcer, skin acne, and skin damage by being administered intradermally.
  • lymphedema skin ulcers caused by ischemia of the lower limbs, skin acne, skin damage, etc.
  • lymph fluid skin inflammation, infection caused by loss of lymph vessels and blood vessels Is.
  • lymphedema is surgically excised and dissected from the primary tumor and lymph nodes when removing cancer such as breast cancer or uterine cancer, and then treated with anticancer drugs or X-rays to prevent recurrence of the cancer. It is known that the lymphatic vessel disappears after the radiation treatment, and it occurs after the fact. Particularly in breast cancer patients, if the axillary lymph nodes are removed, brachial lymphedema frequently occurs after surgery. In patients with uterine cancer, lymphedema of the lower limb often occurs after surgery if the peripheral lymph nodes are removed.
  • Lymphedema is a condition in which lymph accumulates at an early stage and infection or cellulitis occurs later. When edema develops, the upper arm and lower limbs are swollen, and the daily life of the patient is suppressed, and the quality of life (QOL) is significantly reduced. On the other hand, there are only symptomatic treatments such as massage for moving lymph fluid accumulated in the skin and compression therapy with a compression tape as treatment of lymphedema, and there is no curative treatment at present.
  • Lower limb ischemia is asymptomatic at an early stage, but symptoms such as numbness and cold sensation can be observed when the pathology progresses somewhat. As it progresses further, symptoms such as ulcers appear.
  • Cutaneous pressure ulcers are irreversible tissue necrosis caused by continuous pressure on the skin and soft tissues, and disruption of blood flow, increased circulatory disturbance, and continued ischemia.
  • Skin damage may occur due to burns or physical damage, but it is often caused by a combination of damages such as venous capillaries and lymphatic networks, mainly in the destruction of arterial capillaries. It is thought to occur.
  • HGF human growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • sprays, patches, ointments and the like containing bioactive ingredients such as these growth factors (proteins) produced using these genes by biotechnology are being developed.
  • These genes and their growth factors have been studied for their roles using animal models and are known to be involved in angiogenesis and lymphangiogenesis (Non-patent Document 1).
  • FGF fibroblast growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • these gene therapies have just begun to be applied clinically and are in the clinical research stage, and it is not clear about long-term safety.
  • these genes and proteins derived from them are used for the treatment of diseases such as lymphedema, skin ulcers caused by ischemia of the lower limbs, skin acne, and skin damage by subcutaneous and intramuscular administration.
  • diseases such as lymphedema, skin ulcers caused by ischemia of the lower limbs, skin acne, and skin damage by subcutaneous and intramuscular administration.
  • the details of internal distribution and localization are not clear, and it is thought that the pharmacological effect disappears quickly because it is quickly washed away from the target site by simple diffusion rather than distribution / localization.
  • lymph node transplantation In the field of plastic surgery in the treatment of lymphedema, treatment is performed by lymph node transplantation. It has been reported in rat experiments that lymphatic tissues such as lymphatic vessels including import / export lymphatic vessels are born by administering platelet-rich plasma around transplanted lymph nodes by the Manto method (Non-patent Document 2).
  • the present inventors have administered specific platelet-rich plasma (PRP) and stem cells into the skin, so that capillary lymphatic vessels, capillaries, and skin are injected into the skin. It was found that granulation tissue was regenerated, regenerated and matured.
  • specific platelet-rich plasma or stem cells are administered into the skin, multiple proteins possessing physiological activities such as growth factors are released, and capillary lymphatic vessels grow in the skin and skin fibroblasts migrate Regeneration of capillary lymph vessels, capillaries, and dermal granulation tissue was confirmed by experiments, and the present invention was completed.
  • the present invention has been made in order to solve the above-mentioned problems, and has not been effective for diseases such as lymphedema, skin ulcers, skin pressure ulcers, and skin injuries that have occurred during lower limb ischemia. It is an object of the present invention to provide an intradermal preparation for regenerative medicine for inducing maturation by inducing regeneration and neoplasia of lymphatic vessels, blood vessels and granulations in a safe, simple and reliable manner. Furthermore, the present invention provides a production method capable of easily preparing an intradermal preparation for regenerative medicine, and an intradermal administration device for regenerative medicine for safely, simply and reliably administering the intradermal preparation for regenerative medicine into the skin. For the purpose.
  • the intradermal preparation for regenerative medicine of the present invention which has been made to achieve the above object, is an intradermal preparation, comprising platelet-rich plasma, adipose stem cells, myeloid stem cells, blood stem cells, and artificial It contains a growth factor released from at least one of at least one stem cell selected from pluripotent stem cells.
  • the intradermal preparation for regenerative medicine is a therapeutic preparation for at least any disease selected from, for example, lymphedema, skin ulcer, skin acne, and skin damage.
  • the intradermal preparation for regenerative medicine can induce, for example, regeneration or neoplasia of lymphatic vessels, blood vessels, and / or granulations.
  • the growth factor is at least selected from platelet-derived growth factor, vascular endothelial growth factor, transforming growth factor, epidermal growth factor, fibroblast growth factor, and hepatocyte growth factor Either is preferable.
  • the intradermal preparation for regenerative medicine is preferably administered into the skin having a depth of 1 to 4 mm from the surface of the skin epidermis.
  • the growth factor is preferably released by stimulating the platelet-rich plasma and / or the stem cells.
  • the intradermal preparation for regenerative medicine is a product in which the growth factor is released from the platelet-rich plasma by either cooling treatment or addition treatment of thrombin and / or calcium chloride, or the fat
  • the growth factor is released from at least one of the stem cells selected from a stem cell, the myeloid stem cell, the blood stem cell, and the induced pluripotent stem cell.
  • the stem cells release the growth factor even if they are not activated.
  • the adipose stem cells are separated by collagenase at the time of collection and release the growth factor.
  • the intradermal preparation for regenerative medicine is derived from the platelet-rich plasma and / or the stem cells collected from a patient who is subjected to regenerative medicine.
  • the platelet count of the platelet-rich plasma and / or the number of stem cells is preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 5 to 1 ⁇ 10 ⁇ 7 cells / ⁇ l.
  • the amount of the intradermal preparation for regenerative medicine is preferably 1 to 40 ml.
  • the platelet-rich plasma and / or the stem cells may be uncultured.
  • the method for producing the intradermal preparation for regenerative medicine of the present invention made to achieve the above object is selected from platelet-rich plasma, adipose stem cells, myeloid stem cells, blood stem cells, and induced pluripotent stem cells. It is prepared by stimulating at least one of at least one kind of stem cells to release growth factors.
  • the method for producing an intradermal preparation for regenerative medicine comprises the step of releasing the growth factor by stimulating the platelet-rich plasma with either cooling and addition of thrombin and / or calcium chloride, or fat
  • the growth factor is released from at least one stem cell selected from a stem cell, a myeloid stem cell, a blood stem cell, and an induced pluripotent stem cell.
  • the adipose stem cells are separated by collagenase at the time of collection and release the growth factor.
  • the intradermal administration device for regenerative medicine of the present invention made to achieve the above object is a device for intradermal administration, comprising platelet-rich plasma, adipose stem cells, myeloid stem cells, blood stem cells, and artificial multiples.
  • a drug room containing a regenerative medical intradermal preparation containing a released growth factor from at least one of at least one stem cell selected from pluripotent stem cells, and administering the regenerative medical intradermal preparation A needle and / or a cannula.
  • the injection needle and / or the cannula are adjusted to a length capable of administering the intradermal preparation for regenerative medicine into the skin having a depth of 1 to 4 mm from the skin epidermis. Preferably it is.
  • the intradermal preparation for regenerative medicine of the present invention is a release of growth factors such as platelet-rich plasma, stem cells such as adipose stem cells, myeloid stem cells, blood stem cells, and induced pluripotent stem cells.
  • growth factors such as platelet-rich plasma, stem cells such as adipose stem cells, myeloid stem cells, blood stem cells, and induced pluripotent stem cells.
  • the capillary lymph network and the capillary network can be efficiently regenerated by locally reaching the inner compartment and locally distributing within the skin skin.
  • intradermal preparation for regenerative medicine for lymphedema, skin ulcer, skin acne, skin damage, by intradermal administration, compared to intradermal and external administration such as subcutaneous, muscle, topical spray, etc. Since the capillary lymphatic network and the capillary network can be locally distributed to the pathological site in the skin to be regenerated, a high therapeutic effect can be expected.
  • capillary vessels such as skin capillary lymph vessels and capillaries, and lymphedema, skin ulcer, skin pressure ulcer, skin damage Skin regeneration, early recovery, and healing of patients with such diseases are possible.
  • the therapeutic method using this intradermal preparation for regenerative medicine is to selectively administer growth factors derived from specific platelet-rich plasma or hepatocytes to the skin, for example, to the dermis to regenerate capillaries and capillaries.
  • this is a new treatment method in which capillary lymph vessels and capillaries regenerate and regenerate in the dermis to induce thicker lymph vessels and blood vessels. Lymphedema, in particular, develops due to broken capillary tubules due to radiation therapy after cancer treatment or anticancer drug treatment. Therefore, it is necessary to quickly regenerate this microcirculation. Also, if the microcirculation is regenerated, the lymph fluid flows in a certain direction, leading to thicker lymphatic vessels.
  • a preparation containing a growth factor as an active ingredient for regenerating capillary lymphatic vessels and capillaries while maintaining high safety in a simple and reliable manner It can be quickly prepared with good reproducibility.
  • the intradermal administration device for regenerative medicine according to the present invention can be applied to the intradermal area for regenerative medicine into a very limited skin having a depth of 1 to 4 mm from the skin epidermis without the need for advanced and specialized skilled administration skills. It is possible to selectively administer the administration preparation without leakage, and to regenerate and regenerate capillaries and capillaries to mature.
  • a rat tail lymphedema model was prepared, and a regenerative medical intradermal administration formulation to which the present invention was applied was administered intradermally, in a comparison group administered subcutaneously, and in a control group that was not administered, in the peripheral region of tail skin resection. It is a photograph showing the state. It is a photograph which shows the result of having produced the skin damage model of a rat back
  • a skin damage model of the rat spine was prepared, and the intradermal administration preparation for regenerative medicine to which the present invention was applied was administered subcutaneously or intradermally to PRP, or administered intradermally to bFGF, and then histopathological examination was conducted to regenerate epidermis. It is the scored graph.
  • a preferred form of the intradermal preparation for regenerative medicine according to the present invention contains a growth factor released from platelet-rich plasma.
  • Platelet-rich plasma can regenerate capillaries and capillaries by stimulation, platelet-derived growth factor (PDGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming growth factor (eg TGF- ⁇ ), stromal cell-derived It releases growth factors such as factors (eg, SDF-1a), epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), and hepatocyte growth factor (HGF).
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • TGF- ⁇ transforming growth factor
  • stromal cell-derived It releases growth factors such as factors (eg, SDF-1a), epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), and hepatocyte growth factor (HGF).
  • the intradermal preparation for regenerative medicine contains a plurality of physiologically active substances such as growth factors as active ingredients. Since these physiologically active substances such as growth factors are stable unlike cells, the intradermal preparation for regenerative medicine can be used by dissolving
  • platelet rich plasma is preferably collected from the patient to be treated.
  • platelet rich plasma of the same species as the animal to be treated.
  • This intradermal preparation for regenerative medicine is manufactured as follows.
  • Blood is collected from patients and target animals, and 1000-5000 rpm. For 1 to 60 minutes at room temperature, eg 20 to 30 ° C. to obtain platelet rich plasma. For example, about 4 ml of platelet-rich plasma is obtained from 10-20 ml of human blood.
  • thrombin was added to a concentration of 50 to 1000 U / ml at 20 to 30 ° C. and calcium chloride was further added to a concentration of 1 to 100 mM
  • platelets were synergistically influenced by both effects. As a result of being stimulated and activated to release a physiologically active substance such as a growth factor, an intradermal preparation for regenerative medicine is obtained. In addition, you may activate only with thrombin and may activate only with calcium chloride.
  • the platelet-rich plasma collected in this way is activated by stimulation of platelets at room temperature, for example, 20-30 ° C., preferably 20 ° C., and releases physiologically active substances such as growth factors. May be used as an intradermal preparation for regenerative medicine. It may be activated in combination with the addition of thrombin and / or calcium chloride to form an intradermal preparation for regenerative medicine.
  • low-temperature treatment PRP in which platelet-rich plasma is stimulated by standing at a low temperature, for example, 0 to 10 ° C., preferably 3 to 5 ° C., more preferably 4 ° C. for a certain time or more, preferably 30 minutes or more, is also used for platelets. When activated, it releases physiologically active substances such as growth factors.
  • a physiologically active substance such as a released growth factor is more important as an active ingredient than activated platelets, for example, as a preparation for intradermal administration for regenerative medicine while leaving platelets remaining or filtering off platelets, It may be administered to a patient.
  • Intradermal preparations for regenerative medicine are prepared by freeze-dried platelet-rich plasma containing growth factors, etc. that has been stimulated and dissolved or suspended in saturated saline or the like when administered to patients. May be.
  • This intradermal preparation for regenerative medicine is preferably prepared so that the platelet count of the platelet-rich plasma is 1 ⁇ 10 ⁇ 5 to 1 ⁇ 10 ⁇ 7 / ⁇ l. If it is thinner than this concentration range, it is too dilute and sufficient growth factors and the like are not calculated. If this concentration range is exceeded, the effect reaches its peak and valuable preparations are wasted. It is preferably 0.5 ⁇ 10 ⁇ 6 to 5 ⁇ 10 ⁇ 6 pieces / ⁇ l, and more preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 6 pieces / ⁇ l.
  • an intradermal administration device for regenerative medicine is used.
  • the intradermal administration device 1 for regenerative medicine is composed of a syringe body 10 and a needle assembly 20 as described with reference to FIG. 1 which is an exploded front view thereof.
  • the syringe body 10 includes a syringe outer cylinder 12 of a regenerative medical intradermal administration device, a pusher 11 in which a gasket 13 is screwed into the distal end and the gasket 13 is inserted into the syringe outer cylinder 12 and the proximal end side is exposed, A cylinder tip 17 that extends from the syringe outer cylinder 12 and has an inner space that communicates from the inside of the syringe outer cylinder 12 to the outside, and an intradermal dosage form 15 for regenerative medicine that is sandwiched between the cylinder tip 17 and the gasket 13 and becomes a drug solution in the syringe outer cylinder 12.
  • a lock mechanism 16 which is a female screw attached to the syringe outer cylinder 12 on the outer periphery of the cylinder tip 17.
  • a tube tip 17 having a tube hole that can discharge the intradermal administration preparation 15 for regenerative medicine is sealed with a cap 18 and / or hermetically sealed together with the syringe body 10.
  • the injection needle assembly 20 has a needle hole that communicates from the needle tip to the needle proximal end in the fitting tube 22 provided on the outer periphery with a male screw that engages with the lock mechanism 16, and has a blade surface at the needle tip.
  • An injection needle 27 composed of a needle tube, a needle hub 24 that holds the injection needle 27 at the tip, and an elastic body 23 that fills the gap between the tube tip 17 and the needle hub 24 by screwing of the lock mechanism 16 are fitted ( (See FIG. 2).
  • the injection needle 27 protrudes from the adjustment portion 25 at the center of the needle hub 24 and protrudes from the end surface on the needle tip side of the adjustment portion 25 of the needle hub 24 to reach the needle tip so that the needle can be administered into the skin 32.
  • a length L 1 and 2mm at the longest, and 1mm for a minimum of Haridocho L 2 is of 26-35 gauge (corresponding to the diameter 0.45 ⁇ 0.15 mm).
  • the needle hub 24 surrounds the adjusting portion 25 and a cylindrical stabilizing portion 26 protrudes.
  • the injection needle assembly 20 is sealed in a packaging container 21b covered with a packaging lid 21a until just before use, and the packaging lid 21a is peeled off during use.
  • the intradermal administration preparation 15 for regenerative medicine is administered as follows using the intradermal administration device 1 for regenerative medicine.
  • the intradermal preparation 15 for regenerative medicine which is platelet-rich plasma
  • the amount of one shot that can administer the intradermal preparation 15 for regenerative medicine to one place in the skin 32 is 500 ⁇ l (0.5 ml), preferably 300 ⁇ l at most, so the inhalation amount is 500 ⁇ l (0.5 ml). Preferably, it is 300 ⁇ l or less.
  • the maximum dose for a single dose is 500 ⁇ l (0.5 ml), preferably 300 ⁇ l for the patient, and the total continuous dose is 500 ⁇ l (maximum for the patient in 2 to 3 consecutive doses at the same site ( 0.5 ml) preferably 300 ⁇ l.
  • the packaging lid 21a is peeled off, and the needle base with the needle is replaced with the injection needle assembly 20 while sandwiching the packaging container 21b.
  • FIG. 2 which is a partially enlarged cross-sectional view of the intradermal administration device 1 for regenerative medicine
  • the tube tip 17 of the syringe body 10 is lightly pushed into the insertion tube 22 of the injection needle assembly 20, and then the tube tip
  • the locking mechanism 16 of the female screw surrounding 17 is screwed into the male screw on the outer periphery of the insertion tube 22 of the injection needle assembly 20 and tightened.
  • the tube tip 17 is further inserted into the inner portion of the fitting tube 22, and the elastic body 23 is compressed, so that there is no gap with the tube tip 17, thereby becoming liquid-tight.
  • the lock mechanism 16 is sufficiently tightened, the packaging container 21b is removed.
  • the needle tip side of the injection needle 27 of the regenerative medical intradermal administration device 1 is directed to the skin 30 as a treatment target site for a disease of lymphedema, skin ulcer, skin acne, or skin damage.
  • a disease of lymphedema skin ulcer, skin acne, or skin damage.
  • the skin 30 is affected skin for lymphedema, and for other diseases, the skin 30 is skin around the diseased area.
  • the intradermal administration device 1 for regenerative medicine is pressed so that the injection needle 27 is perpendicular to the skin 30. Then, the needle tip of the injection needle 27 is first punctured into the skin 30.
  • the stabilizing portion 26 presses the skin epidermis 33 of the skin 30 and the adjusting portion 25 contacts the skin epidermis 33.
  • the regenerative medical intradermal administration device 1 is stabilized so as not to shift.
  • the injection needle 27 penetrates the skin epidermis 33 by the sharp blade surface of the needle tip, and the opening of the needle hole on the blade surface is exactly 1 to 5 from the surface of the skin epidermis 33 in the intradermal (dermis layer) 32 of the upper skin layer.
  • the 4 mm relatively shallow intradermal target site 32 a to be injected is reached, but the subcutaneous tissue 31 is not reached.
  • the pusher 11 is pushed out, and the intradermal administration preparation 15 for regenerative medicine is injected.
  • the intradermal preparation 15 for regenerative medicine reaches the intradermal 32 having a depth of 1 to 4 mm from the surface of the skin epidermis 33.
  • the intradermal preparation 15 for regenerative medicine is preferably administered over a wide range, for example, 100 to 500 ⁇ l (0.1 to 0.5 ml) per shot at 1 to 10 mm intervals in the range of the upper arm and lower limb to be treated. ) And 1 to 40 shots, preferably a plurality of times. Administration is preferably performed at 7-28 day intervals.
  • the intradermal administration device 1 for regenerative medicine is sealed again with the packaging lid 21a (see FIG. 1) and then discarded as medical waste.
  • lymphatic endothelial cells migrate by vascular endothelial cell growth factor (VEGF) contained in the intradermal preparation 15 for regenerative medicine, and further by platelet-derived growth factor (PDGF), smooth muscle and It is inferred that tight junctions migrated and capillary lymphatic vessels regenerated, resulting in the formation of mature lymphatic vessels. Actually, regeneration of neolymphatic vessels and the effect of improving edema have been confirmed in a tail lymphedema model using rats. Therefore, the intradermal preparation 15 for regenerative medicine is effective in improving lymphedema in the clinic.
  • VEGF vascular endothelial cell growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • lymphatic vessels it is considered that regeneration and neoplasia are promoted in a complex manner by the interaction of platelet-derived growth factor (PDGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF), among others. It is thought that another factor also promotes regeneration / neogenesis by some interaction.
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • granulation cells migrate by transforming growth factors (eg TGF- ⁇ ), resulting in lymphangiogenesis and granulation.
  • TGF- ⁇ transforming growth factors
  • lymphangiogenesis and granulation have been confirmed in a rat skin defect model. Accordingly, the intradermal preparation 15 for regenerative medicine is effective in improving clinical skin ulcers, skin acne and skin damage diseases.
  • the intradermal preparation 15 for regenerative medicine When the intradermal preparation 15 for regenerative medicine is administered to a site having a depth of 1 to 4 mm from the surface of the skin epidermis 33, the regeneration and renewal of capillary lymph vessels, capillaries and granulations, and their maturation effects are high. . If it is this depth, the growth factor in the intradermal preparation 15 for regenerative medicine is locally administered, and it stays distributed in the skin for a long time without being diffused unnecessarily. Capillary lymphatic vessels, capillaries and other vessels and granulation cells can be regenerated and regenerated to mature.
  • the corner growth factor does not form lymph vessels and granulations to be born, but also leaks from the skin epidermis.
  • the growth factor at the corner is diffused, and lymphatic vessels, blood vessels and granulations to be regenerated / neoplastic cannot be formed.
  • the adipose stem cell, the myeloid stem cell, the blood A physiologically active substance such as a growth factor can also be released using at least one stem cell selected from stem cells and the above-mentioned induced pluripotent stem cells.
  • these stem cells and suspensions thereof can be used.
  • collagenase is used for recovery of adipose stem cells among these stem cells.
  • blood stem cells are identified after being cultivated and increased to the required number. Thereby, the intradermal preparation 15 for regenerative medicine which released the growth factor can be obtained.
  • the myeloid stem cells may be used as they are without being degraded.
  • platelets such as platelets, adipose stem cells, myeloid stem cells, blood stem cells, and induced pluripotent stem cells all possess pluripotency and proliferative ability and are useful for treatments such as tissue regeneration.
  • These cells release many physiologically active substances such as growth factors (for example, proteins that are growth-inducing factors) and regenerate lymphatic vessels and blood vessels by subcutaneous administration.
  • growth factors for example, proteins that are growth-inducing factors
  • platelets contained in platelet-rich plasma contain ⁇ granules and ⁇ granules.
  • granules include platelet derived growth factor (PDGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming growth factor (eg TGF- ⁇ ), stromal cell derived factor (eg SDF-1a), epithelial cell factor (EGF) And physiologically active substances such as growth factors such as fibroblast growth factor (FGF) and hepatocyte growth factor (HGF).
  • PDGF platelet derived growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • TGF- ⁇ transforming growth factor
  • stromal cell derived factor eg SDF-1a
  • epithelial cell factor EGF
  • physiologically active substances such as growth factors such as fibroblast growth factor (FGF) and hepatocyte growth factor (HGF).
  • FGF fibroblast growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • the platelet-rich plasma has already been used in a treatment method for regenerating skin tissue by injecting subcutaneously for anti-aging and cosmetics, and has been found to be highly safe.
  • the therapeutic method of administering the intradermal preparation 15 for regenerative medicine into the skin, particularly into the dermis layer, is due to a synergistic effect with physiologically active substances such as a plurality of growth factors, and capillary lymphatic vessels, capillaries and granulations of broken skin. It can be a treatment for lymphedema that efficiently regenerates and regenerates, matures to induce regeneration of thick lymphatic vessels and blood vessels, and drains the accumulated skin lymph.
  • a plurality of physiologically active substances such as growth factors are distributed and staying in the skin of the target site to be treated, thereby causing lymphedema.
  • diseases such as skin ulcers, skin pressure ulcers, and skin damage caused by lower limb ischemia can be safely treated in a short time.
  • the papillary dermis is a tissue in which the capillary lymph network and the capillary network are dense
  • the reticular dermis is a tissue that becomes the passage of the capillary lymph vessels and the capillary vessels.
  • the pathology of diseases such as lymphedema, skin ulcers, skin pressure sores, and skin damage develops due to the accumulation of lymph in the skin due to the destruction of these vascular networks, and the accumulation of lymph in the subcutaneous tissue.
  • It is desirable to administer the intradermal preparation 15 for regenerative medicine intradermally because growth factors and cells necessary for regeneration of capillary lymphatic vessels and capillaries in the skin are locally distributed and dispersed and retained.
  • an intradermal administration device for regenerative medicine as shown in FIG. 1 may be used, or a syringe equipped with a needle base with a needle for general-purpose Manto method may be used.
  • injecting intradermally with the Manto method requires very skilled skills, and the regenerative medicine shown in FIG. 1 is more suitable than a syringe for the Manto method suitable for administering 0.5 to several ml to the target site.
  • the intradermal administration device 1 is more suitable for clinical use.
  • Platelet rich plasma was prepared from whole mammalian blood by multiple centrifugations. A kit for preparing PRP and a centrifuge may be used. The platelet-rich plasma was adjusted to a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / ⁇ l by using a blood cell counter, and then the platelet-rich plasma was allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes or more for stimulation at 4 ° C.
  • the test method of this model is a follow-up observation in which the diameter of the tail skin resection peripheral portion is measured over time, and further, the healing of the tail skin resection peripheral portion is observed over time.
  • the surgical group positive control
  • spontaneous healing is observed without administering the intradermal preparation for regenerative medicine after excision surgery
  • healthy untreated An untreated group (negative control) that was followed up without administration of an intradermal preparation for regenerative medicine was used.
  • FIG. 3 shows the results of measuring the diameter of the peripheral portion of the tail skin resection over time until the fourth week after the rat tail edema lymph model was prepared. Moreover, the healing progress state of the peripheral part of the tail skin resection in the surgical group and the PRP-administered group (4 ° C. cooling treatment PRP group) after one week has elapsed since the preparation of the rat tail edema lymph model is shown in FIG. As apparent from FIGS. 3 and 4, the PRP-administered group had both edematous lymphs suppressed and tail swelling less than the surgical group in which the edema lymphs were produced and the tails were swollen. Was clearly observed, and granulation tissue regeneration and wound healing were confirmed rapidly and remarkably.
  • Test Example 2 PRP intradermal / subcutaneous administration effectiveness comparison
  • the 4 ° C. cooled PRP prepared in Example 1 was used as an intradermal administration preparation for regenerative medicine. 500 ⁇ l each was intradermally administered with a syringe using a certain 27G needle, and 100 ⁇ l ⁇ 5 sites (total amount 500 ⁇ l) were subcutaneously administered.
  • the test method of this model is a follow-up observation in which the diameter of the tail skin resection peripheral portion is measured over time, and further, the healing of the tail skin resection peripheral portion is observed over time.
  • control group after the preparation of the rat tail edema lymph model, the surgical group (positive control) in which spontaneous healing is observed without administering the intradermal preparation for regenerative medicine after excision surgery, and healthy untreated An untreated group (negative control) that was followed up without administration of an intradermal preparation for regenerative medicine was used.
  • FIG. 5 shows the results of measuring the diameter of the tail skin resection portion over time until 4 weeks after the rat tail edema lymph model was prepared. Moreover, the healing progress state of the peripheral part of the tail skin resection in the PRP intradermal administration group and the PRP subcutaneous administration group after 3 weeks from preparation of the rat tail edema lymph model is shown in FIG. As is clear from FIG. 5 and FIG. 6, the PRP intradermal administration group has suppressed edema lymph and the edema lymph is suppressed compared to the surgical group in which edema lymph is produced and the tail is swollen and the PRP subcutaneous administration group in which improvement of edema lymph is not observed. Swelling was small, new granulation was clearly observed in the peripheral part of the tail skin resection, and granulation tissue regeneration and wound healing were confirmed rapidly and remarkably.
  • Epidermal regeneration was compared by different skin injury models. Using a rat (SD, male, 8 weeks old), shaving the back, using a scalpel with a 20mm diameter circular skin at the center and left and right of the midline, and excising the skin at 2 sites per animal I did it. PRP (adjusted to 10 6 / ⁇ l) was cooled at 4 ° C. for 30 minutes or more, and further administered 100 ⁇ l ⁇ 5 sites intradermally and subcutaneously (administration was performed twice every 5 days).
  • bFGF Fiblast spray 250 ⁇ g: Trafermin / Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.
  • administration was performed once a day for a total of 5 times.
  • autopsy was performed, the skin was collected, and histopathological examination was performed after HE staining.
  • the pathological evaluation was performed by scoring epidermal regeneration. The scoring is evaluated in 4 stages of ⁇ : slight, +: regeneration is observed, ++: sufficient regeneration, and +++: complete (excision of the entire excision).
  • FIG. 7 shows a photograph of the pathological tissue after HE staining of PRP intradermal administration.
  • FIG. 8 shows the results of scoring after PRP subcutaneous / intradermal administration or bFGF intradermal administration.
  • epidermal tissue was significantly regenerated by intradermal administration of PRP as compared to subcutaneous administration of PRP or intradermal administration of bFGF.
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • TGF- ⁇ stromal cell-derived factor
  • EGF epidermal growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • the preparation for intradermal use for regenerative medicine of the present invention is a skin ulcer / cutaneous pressure ulcer / skin caused by lymphedema after the dissection of the primary cancer and lymph nodes, lymphedema caused by anticancer drug treatment or X-ray radiation treatment, and lower limb ischemia It can be used to treat diseases such as injury.
  • the method for producing an intradermal preparation for regenerative medicine of the present invention is used when preparing an intradermal preparation for regenerative medicine and efficiently administering it to the skin at the time of treatment or in advance.
  • the intradermal administration device for regenerative medicine of the present invention is used to administer an intradermal administration preparation for regenerative medicine exclusively intradermally.
  • 1 intradermal administration device for regenerative medicine
  • 10 syringe body
  • 11 pusher
  • 12 syringe barrel
  • 13 gasket
  • 14 drug room
  • 15 intradermal administration preparation for regenerative medicine
  • 16 lock mechanism
  • 17 cylinder tip
  • 18 cap
  • 20 injection needle assembly
  • 21a packaging lid
  • 21b packaging container
  • 22 fitting cylinder
  • 23 elastic body
  • 24 needle hub
  • 25 adjustment section
  • 26 stabilization section
  • 27 Injection needle
  • 30 Skin
  • 32 Intradermal
  • 32a Intradermal target site
  • 33 Skin epidermis

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Abstract

　有効な治療方法がなかったリンパ浮腫や、下肢虚血時に発生する皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷等の疾病に対して、安全で簡易かつ確実に、リンパ管や血管や肉芽の再生や新生を誘導して成熟させて治療するための再生医療用皮内投与製剤、及び再生医療用皮内投与デバイスを提供する。　再生医療用皮内投与製剤は、皮内に投与される製剤であり、多血小板血漿と、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも１種の幹細胞との少なくとも何れかから、放出された成長因子を含有するというものである。再生医療用皮内投与デバイス(１)は、再生医療用皮内投与製剤(１５)を収容する薬室(１４)と、前記再生医療用皮内投与製剤(１５)を投与する注射針(２４)及び／又はカニューレとを有している。

Description

再生医療用皮内投与製剤
　本発明は、皮内に投与することにより、リンパ浮腫、皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷等の疾患に対し組織を再生して治療するのに用いられる再生医療用皮内投与製剤に関する。
　リンパ浮腫や、下肢虚血に起因する皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷等の疾患は、リンパ管や血管の喪失に起因して発生するリンパ液の貯留、皮膚の炎症、又は感染等により、発症するものである。
　これら疾患の多くは、皮膚内に豊富にある毛細リンパ管や毛細血管の物理的・化学的・生物学的な損傷、消失により発生する。さらに広範な毛細リンパ管や毛細血管が、炎症等によって、消失して、これらの疾患の病態が、発生したり悪化したりする。
　中でも、リンパ浮腫の多くは、乳癌や子宮癌のような癌摘出の際、癌原発巣とリンパ節とを外科的に切除し郭清してから、癌再発防止のために抗癌剤治療やＸ線放射線治療を施すことにより、リンパ管が消失するために、事後的に発生することが知られている。特に乳癌患者の場合、腋窩リンパ節を切除してしまうと、術後に、上腕リンパ浮腫が多発する。また子宮癌患者の場合、周辺リンパ節を切除してしまうと、術後に、下肢のリンパ浮腫がしばしば発生する。
　リンパ浮腫は、初期でリンパ液が貯留し、後期で感染や蜂窩織炎を起こすという病態である。浮腫が発現すると上腕や下肢が腫れ上がる所為で、患者の日常生活は抑制され、クオリティ・オブ・ライフ（ＱＯＬ）が著しく低下する。一方、リンパ浮腫の治療としては、皮膚に貯留したリンパ液を移動させるマッサージや圧迫テープでの圧迫療法等の対症療法しかなく、今のところ根治治療法が無い。
　下肢虚血は、初期で無症状だが、病態が幾分進行すると、しびれ、冷感等の症状が認められるようになる。さらに進行すると、潰瘍等の症状が現れる。
　皮膚褥瘡は、皮膚および軟部組織への持続的圧迫の所為で、血流が途絶え、循環障害が増大し、阻血状態が続くことにより不可逆的な組織壊死が生じたものである。
　また皮膚損傷は、火傷や物理的な障害等から発生することがあるが、多くは、動脈系毛細血管の破壊を中心に、静脈系毛細血管やリンパ網等の障害との複合的な原因で発生すると考えられている。
　これらの疾患を治療するため、毛細リンパ管や毛細血管を再生させる治療薬については、ヒト成長因子（ＨＧＦ）遺伝子、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）遺伝子、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）遺伝子や、バイオテクノロジー技術によりそれら遺伝子を用いて製造されたこれら成長因子（蛋白質）のようなバイオ有効成分を含有するスプレー剤、貼付剤、軟膏等が開発されつつある。これら遺伝子やそれの成長因子は、その役割について動物モデルを使用して検討されており、また血管新生やリンパ管新生に関与していることが知られている（非特許文献１）。繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）については、臨床で使用されているが、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成細胞長因子（ＶＥＧＦ）等を含めたこれら成長因子、又はそれを産生する遺伝子が、患者に対して単一のバイオ有効成分で実際にどの程度の治療効果があるのか、明らかでない。まして複数のバイオ有効成分の効果については、未だ明らかになっていない。
　また、これらの遺伝子治療については、現在臨床上で応用が検討され始めたばかりで、臨床研究段階であり、長期安全性等について、明らかでない。さらにこれら遺伝子やそれに由来する蛋白質は、皮下、筋肉内投与により、リンパ浮腫、下肢虚血に起因する皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷等疾患の治療に使用されるが、これら遺伝子や蛋白質の筋肉内分布や局在性の詳細が明らかでなく、分布・局在よりむしろ、単純拡散等により標的部位から速やかに流失し、薬理効果が消失するのが早いと考えられる。
　一方、リンパ浮腫治療における形成外科分野では、リンパ節移植で治療が施されている。移植リンパ節周囲に多血小板血漿をマントー法で投与することで、輸出入リンパ管を含むリンパ管のようなリンパ組織が新生されることがラット実験で報告されている（非特許文献２）
　何れも破壊された皮膚の毛細リンパ管や毛細血管や皮膚肉芽を再生・新生させるものではなく、毛細脈管等の組織を効果的に形成できる有効な治療法が求められていた。
ネーチャー メディスン(Nature Medicine), 2007年, 第13巻, 第12号, p.1458-1466. ジャーナル オブ バスキュラー リサーチ(Journal of Vascular Research), 2009年, 第46巻, 第5号, p389-396.
　本発明者らは、前記課題を解決すべく、鋭意研究を行った結果、特定の多血小板血漿（ＰＲＰ）や幹細胞を皮膚内に投与することにより、皮膚内に毛細リンパ管や毛細血管及び皮膚肉芽組織を再生・新生し成熟させることを見出した。特定の多血小板血漿や幹細胞を、皮膚内に投与すると、成長因子等の生理活性を保有する複数の蛋白質を放出し、皮膚内に毛細リンパ管が増生しまた皮膚線維芽細胞が遊走することから、毛細リンパ管や毛細血管及び皮膚新生肉芽組織を再生することが、実験で確かめられ、本発明を完成させた。
　本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、これまで、有効な治療方法がなかったリンパ浮腫や、下肢虚血時に発生する皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷等の疾病に対して、安全で簡易かつ確実に、リンパ管や血管や肉芽の再生や新生を誘導して成熟させて治療するための再生医療用皮内投与製剤を提供することを目的とする。さらにその再生医療用皮内投与製剤を簡便に調製できる製造方法、及びその再生医療用皮内投与製剤を安全で簡易かつ確実に皮内へ投与するための再生医療用皮内投与デバイスを提供することを目的とする。
　前記の目的を達成するためになされた本発明の再生医療用皮内投与製剤は、皮内に投与される製剤であり、多血小板血漿と、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも１種の幹細胞との少なくとも何れかから、放出された成長因子を含有するというものである。
　再生医療用皮内投与製剤は、例えばリンパ浮腫、皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、及び皮膚損傷から選ばれる少なくとも何れかの疾患の治療製剤である。
　再生医療用皮内投与製剤は、例えばリンパ管、血管、及び／又は肉芽の再生又は新生を誘導することができるものである。
　再生医療用皮内投与製剤は、前記成長因子が、血小板由来成長因子、血管内皮細胞成長因子、トランスフォーミング増殖因子、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、及び肝細胞増殖因子から選ばれる少なくとも何れかであることが好ましい。
　再生医療用皮内投与製剤は、皮膚表皮表面より１～４ｍｍの深さである前記皮内に投与されるものであることが好ましい。
　再生医療用皮内投与製剤は、前記成長因子が、前記多血小板血漿、及び／又は前記幹細胞を刺激することによって、放出されたものであることが好ましい。
　再生医療用皮内投与製剤は、前記多血小板血漿に対し、冷却処理と、トロンビン及び／又は塩化カルシウムの添加処理との何れかにより、前記成長因子が放出されたものであり、又は、前記脂肪系幹細胞、前記骨髄系幹細胞、前記血液幹細胞、及び前記人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも何れかの前記幹細胞から、前記成長因子が放出されたものであることが好ましい。この幹細胞は活性化処理をしなくとも、前記成長因子を放出する。例えば、前記脂肪系幹細胞は、採取時にコラゲナーゼで分離され、前記成長因子を、放出する。
　再生医療用皮内投与製剤は、前記多血小板血漿、及び／又は前記幹細胞が、再生医療を施す患者から採取されて由来しているものであると、一層好ましい。
　再生医療用皮内投与製剤は、前記多血小板血漿の血小板数、及び／又は前記幹細胞の数が、１×１０－５～１×１０－７個／μｌであることが好ましい。
　そのとき、再生医療用皮内投与製剤は、１～４０ｍｌであることが好ましい。
　再生医療用皮内投与製剤は、前記多血小板血漿及び／又は前記幹細胞が、未培養であってもよい。
　前記の目的を達成するためになされた本発明の再生医療用皮内投与製剤の製造方法は、多血小板血漿と、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも１種の幹細胞との少なくとも何れかを刺激して、成長因子を放出させることにより、調製するというものである。
　再生医療用皮内投与製剤の製造方法は、前記多血小板血漿を、冷却と、トロンビン及び／又は塩化カルシウムの添加との何れかで刺激処理することにより、前記成長因子を放出させ、又は、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも１種の幹細胞前記幹細胞から、前記成長因子を放出させることが好ましい。前記脂肪系幹細胞は、採取時にコラゲナーゼで分離され、前記成長因子を、放出する。
　前記の目的を達成するためになされた本発明の再生医療用皮内投与デバイスは、皮内に投与するデバイスであり、多血小板血漿と、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも１種の幹細胞との少なくとも何れかから、放出された成長因子を含有する再生医療用皮内投与製剤を収容する薬室と、前記再生医療用皮内投与製剤を投与する注射針及び／又はカニューレとを有しているというものである。
　再生医療用皮内投与デバイスは、前記注射針及び／又は前記カニューレが、皮膚表皮より１～４ｍｍの深さの前記皮内に前記再生医療用皮内投与製剤を投与できる長さに調整されていることが好ましい。
　本発明の再生医療用皮内投与製剤は、多血小板血漿や、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、人工多能性幹細胞等の幹細胞のように成長因子を放出させたもので、皮膚皮内区画に限局的に到達させ、皮膚皮内で限局的に分布させることにより、毛細リンパ管網及び毛細血管網を効率的に再生させることができる。
　この再生医療用皮内投与製剤によれば、リンパ浮腫、皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷に対して、皮内投与によって、皮下、筋肉、局所噴霧等の皮内外への投与に比較して、毛細リンパ管網及び毛細血管網を再生させるべき皮内の病態部位へ限局分布させることができるので、高い治療効果が期待できる。
　この再生医療用皮内投与製剤を用いた治療方法によれば、皮膚毛細リンパ管や毛細血管等の毛細脈管の確実で迅速な再生が可能となり、リンパ浮腫、皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷のような疾患の患者の皮膚再生、早期回復、治癒が、可能となる。
　この再生医療用皮内投与製剤を用いた治療方法は、特定の多血小板血漿や肝細胞に由来する成長因子を、皮内、例えば毛細リンパ管や毛細血管を再生すべき真皮に選択的に投与し、真皮で毛細リンパ管や毛細血管が再生・新生してより太いリンパ管や血管を誘導するという新しい治療方法となる。特にリンパ浮腫は、癌治療後の放射線治療や抗癌剤治療により、毛細リンパ管が壊れて発症する。よってこの微小循環を速やかに再生する必要がある。また、微小循環が再生されれば、リンパ液が一定の方向に流れることから、より太いリンパ管が誘導される。
　本発明の再生医療用皮内投与製剤の製造方法によれば、簡便かつ確実に、高い安全性を保ちつつ、毛細リンパ管や毛細血管を再生する有効成分となる成長因子を含有した製剤を、再現性良く速やかに調製することができる。
　本発明の再生医療用皮内投与デバイスは、高度で専門的な熟練した投与技能を備えなくても、皮膚表皮より１～４ｍｍの深さという極めて限定的な皮内へ、再生医療用皮内投与製剤を選択的に、漏れることなく且つ確実に投与し、毛細リンパ管や毛細血管を確実に再生・新生させて成熟させることができる。
本発明を適用する再生医療用皮内投与製剤が収容された再生医療用皮内投与デバイスを示す分解正面図である。 本発明を適用する再生医療用皮内投与製剤が収容された再生医療用皮内投与デバイスの使用途中を示す部分拡大断面図である。 ラット尾リンパ浮腫モデルを作製し、本発明を適用する再生医療用皮内投与製剤を投与した投与群と、投与しない対照群とにおいて、尾皮膚切除末梢部直径計測結果を示すグラフである。 ラット尾リンパ浮腫モデルを作製し、本発明を適用する再生医療用皮内投与製剤を投与した投与群と、投与しない陽性対照群とにおいて、尾皮膚切除末梢部の状態を示す写真である。 ラット尾リンパ浮腫モデルを作製し、本発明を適用する再生医療用皮内投与製剤を皮内投与した投与群と、皮下投与した比較群と、投与しない対照群とにおいて、尾皮膚切除末梢部直径計測結果を示すグラフである。 ラット尾リンパ浮腫モデルを作製し、本発明を適用する再生医療用皮内投与製剤を皮内投与した投与群と、皮下投与した比較群と、投与しない対照群とにおいて、尾皮膚切除末梢部の状態を示す写真である。 ラット背の皮膚損傷モデルを作製し、本発明を適用する再生医療用皮内投与製剤を皮内投与した後、ＨＥ染色し病理組織学的検討をした結果を示す写真である。 ラット背の皮膚損傷モデルを作製し、本発明を適用する再生医療用皮内投与製剤をＰＲＰ皮下・皮内投与し、又はｂＦＧＦ皮内投与した後、病理組織学的検討をし、表皮再生をスコア化したグラフである。
　以下、本発明を実施するための形態について、詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの形態に限定されるものではない。
　本発明の再生医療用皮内投与製剤の好ましい形態は、多血小板血漿から放出された成長因子を、含有するというものである。
　多血小板血漿が、刺激によって、毛細リンパ管や毛細血管を再生させ得る、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（例えばＴＧＦ－β）、ストロマ細胞由来因子（例えばＳＤＦ－１ａ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のような成長因子を放出している。再生医療用皮内投与製剤には、これら成長因子などの生理活性物質が、有効成分として複数含有されている。これら成長因子などの生理活性物質が細胞と異なり安定であるから、再生医療用皮内投与製剤は、水や生理食塩水等に溶解又は懸濁し低温保存しても使用でき、凍結乾燥しておき用時に水や生理食塩水等に溶解又は懸濁しても使用できる。
　遺伝子組換え技術で製造した単独の成長因子に比べ、刺激した多血小板血漿からは、簡便に各種成長因子などの生理活性物質を同時に複数種放出されている。再生医療用皮内投与製剤は、成長因子等の複数種の有効成分が、高濃度で局所へ分布し、相乗的に作用するから、皮膚再生、早期回復、治癒の期間を短くさせる。ヒトには免疫原性があるので、多血小板血漿は治療すべき患者本人から採取したものであることが好ましい。非ヒト動物では、治療すべき動物と同種の動物の多血小板血漿を用いることが好ましい。
　この再生医療用皮内投与製剤は、以下のようにして製造される。
　患者や対象動物から血液を採取し、１０００～５０００ｒｐｍ．で１～６０分間、室温、例えば２０～３０℃で遠心分離し、多血小板血漿を得る。例えば、ヒト血液１０～２０ｍｌから多血小板血漿が約４ｍｌ得られる。これに、２０～３０℃で、トロンビンを５０～１０００Ｕ／ｍｌの濃度となるように添加し、さらに塩化カルシウムを１～１００ｍＭの濃度となるように添加すると、両者の影響で相乗的に血小板が刺激されて活性化して、成長因子などの生理活性物質を放出する結果、再生医療用皮内投与製剤が得られる。なお、トロンビンだけで活性化させてもよく、塩化カルシウムだけで活性化させてもよい。
　また、このようにして採取された多血小板血漿は、室温、例えば２０～３０℃、好ましくは２０℃で、血小板が刺激されて活性化して、成長因子などの生理活性物質を放出するので、それを用いて、再生医療用皮内投与製剤としてもよい。トロンビン及び／又は塩化カルシウムの添加と組み合わせて活性化させて、再生医療用皮内投与製剤としてもよい。また、多血小板血漿を低温、例えば０～１０℃、好ましくは３～５℃、より好ましくは４℃で、一定時間以上、好ましくは３０分間以上静置して刺激した低温処理ＰＲＰも、血小板が刺激されて活性化して、成長因子などの生理活性物質を放出する。
　なお、活性化した血小板よりも放出された成長因子などの生理活性物質の方が、有効成分として重要なので、例えば、血小板を残存させたまま又は血小板を濾別して再生医療用皮内投与製剤として、患者に投与してもよい。再生医療用皮内投与製剤は、刺激されて成長因子等を含んだ多血小板血漿を、凍結乾燥製剤にしておき、患者に投与する用時に飽和食塩水等で溶解又は懸濁させたものであってもよい。
　この再生医療用皮内投与製剤は、前記多血小板血漿の血小板数が、１×１０－５～１×１０－７個／μｌに調製されていることが好ましい。この濃度範囲よりも薄いと、希薄過ぎて、十分に成長因子等が算出されず、この濃度範囲を超えると、効果が頭打ちとなり、貴重な製剤が無駄となる。０．５×１０－６～５×１０－６個／μｌであると好ましく、１×１０－６個／μｌであると一層好ましい。
　この再生医療用皮内投与製剤を使用するには、例えば再生医療用皮内投与デバイスが用いられる。
　その再生医療用皮内投与デバイス１は、その分解正面図である図１を参照して説明すると、シリンジ本体１０と注射針組立体２０とからなる。
　シリンジ本体１０は、再生医療用皮内投与デバイスのシリンジ外筒１２と、先端にガスケット１３が捻じ込まれガスケット１３ごとシリンジ外筒１２に挿入されて基端側が露出している押し子１１と、シリンジ外筒１２から延びておりシリンジ外筒１２内部から外界へ通じる内空を有する筒先１７と、筒先１７及びガスケット１３に挟まれシリンジ外筒１２内で薬液となる再生医療用皮内投与製剤１５を収容する薬室１４と、筒先１７の外周でシリンジ外筒１２に取り付けられた雌螺子であるロック機構１６とを有する。再生医療用皮内投与製剤１５を排出できる筒孔を有する筒先１７は、キャップ１８で封止され、及び／又はシリンジ本体１０ごと密閉包装されている。
　注射針組立体２０は、ロック機構１６と螺合する雄螺子が外周に設けられた嵌入筒２２の内部に、針先から針基端に連通する針穴が設けられ針先に刃面を有する針管からなる注射針２７と、先端部で注射針２７を保持する針ハブ２４と、ロック機構１６の螺合により筒先１７及び針ハブ２４の隙間を埋める弾性体２３とが、嵌め込まれている（図２参照）。注射針２７は、針ハブ２４の中央の調整部２５から突出しており、皮内３２に投与できるように、針ハブ２４の調整部２５の針先側端面から針先に到るまでの突出針長Ｌ１を最長でも２ｍｍとし、針胴長Ｌ２を最短でも１ｍｍとし、２６～３５ゲージ（直径０．４５～０．１５ｍｍに相当）のものである。針ハブ２４は、調整部２５を取り巻いて筒状の安定部２６が突き出している。注射針組立体２０は、使用直前まで、包装蓋２１ａで覆われる包装容器２１ｂに封入され、使用時に包装蓋２１ａを剥がして、取り出されるようになっている。
　再生医療用皮内投与製剤１５は、再生医療用皮内投与デバイス１を用いて、以下のようにして投与される。
　先ず、用時に、トロンビンと塩化カルシウムとを添加し刺激して活性因子等を放出させた多血小板血漿である再生医療用皮内投与製剤１５を、シリンジ本体１０へ針付き針基（不図示）を介して吸入する。再生医療用皮内投与製剤１５を皮内３２の一箇所へ投与できるワンショット量は、患者に対してせいぜい５００μｌ（０．５ｍｌ）好ましくは３００μｌであるので、吸入量を５００μｌ（０．５ｍｌ）好ましくは３００μｌ以下にする。単回投与で投与量は患者に対して最大で５００μｌ（０．５ｍｌ）好ましくは３００μｌ、同一部位での２～３回の複数回連続投与で患者に対して連続投与量合計が最大で５００μｌ（０．５ｍｌ）好ましくは３００μｌとする。次いで、包装蓋２１ａを剥がして、包装容器２１ｂを挟みながら針付き針基を注射針組立体２０に付け替える。
　再生医療用皮内投与デバイス１の使用途中を示す部分拡大断面図である図２に示すように、シリンジ本体１０の筒先１７を、注射針組立体２０の嵌入筒２２へ軽く押し込んだ後、筒先１７を取り囲む雌螺子のロック機構１６を、注射針組立体２０の嵌入筒２２の外周の雄螺子に螺合させ、締め付ける。すると、筒先１７が、更に嵌入筒２２の奥へ、挿入され、弾性体２３が圧縮されて筒先１７との隙間が無くなって液密となる。ロック機構１６を十分に締め付けたら、包装容器２１ｂを取り去る。
　再生医療用皮内投与デバイス１の注射針２７の針先側を、リンパ浮腫、皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷の疾患の治療対象部位の皮膚３０に向ける。例えば、これらの疾患のうちリンパ浮腫に対して皮膚３０は、患部皮膚であり、その他の疾患に対して皮膚３０は、病態部周辺皮膚である。注射針２７が皮膚３０に対し垂直となるように、再生医療用皮内投与デバイス１を押し付ける。すると、注射針２７の針先が先ず皮膚３０に穿刺される。それと共に、安定部２６が皮膚３０の皮膚表皮３３を押し当て、調整部２５が皮膚表皮３３に接触する結果、調整部２５と安定部２６とで皮膚表皮３３表面を引っ張り、針ハブ２４で、再生医療用皮内投与デバイス１がずれないように安定化する。注射針２７がその針先の鋭角な刃面により皮膚表皮３３を貫通し、刃面の針穴の開口が丁度皮膚上層部の皮内（真皮層）３２のうち、皮膚表皮３３表面から１～４ｍｍの比較的浅い注入すべき皮内標的部位３２ａに達するが、皮下組織３１に達しない。この状態で、押し子１１を押し切って、再生医療用皮内投与製剤１５を注入する。すると、皮膚表皮３３の表面より１～４ｍｍの深さである皮内３２へ再生医療用皮内投与製剤１５が到達する。
　再生医療用皮内投与製剤１５の投与は、広範に行なうことが好ましいので、例えば治療すべき上腕や下肢の範囲に１～１０ｍｍ間隔で、１ショット当たり１００～５００μｌ（０．１～０．５ｍｌ）の容量で、１～４０ショット、好ましくは複数回繰り返して行なう。投与は、７～２８日間隔で行なうことが好ましい。再生医療用皮内投与デバイス１を、包装蓋２１ａ（図１参照）で再度封鎖してから、医療廃棄物として、廃棄する。
　再生医療用皮内投与製剤１５の効能は、以下のように説明される。
　リンパ浮腫に対しては、再生医療用皮内投与製剤１５に含まれていた血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）により、リンパ内皮細胞が遊走し、さらに血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）により、平滑筋やタイトジャンクションが遊走し、毛細リンパ管が再生する結果、成熟したリンパ管を形成するようになったと推察される。現に、ラットを使用した尾リンパ浮腫モデルにおいて、新生リンパ管の再生や、浮腫の改善効果が確認されている。従って、再生医療用皮内投与製剤１５は、臨床におけるリンパ浮腫の改善に有効である。例えばリンパ管については、とりわけ血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）の相互作用によって、再生・新生を複合的に促していると考えられる。さらに別な因子も何らかの相互作用によって、再生・新生を複合的に促していると考えられる。
　一方、下肢虚血に起因する皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷疾患に対しては、毛細リンパ管や毛細血管の欠如が要因で発生し、特に肉芽組織の再生が重要と考えられているから、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）や血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）による脈管の新生のみならず、トランスフォーミング増殖因子（例えばＴＧＦ－β）により肉芽細胞が遊走し、リンパ管新生及び肉芽新生が起こる結果、成熟したリンパ管や肉芽を形成するようになったと推察される。現に、ラット皮膚欠損モデルにおいて、リンパ管新生及び肉芽新生が確認されている。従って、再生医療用皮内投与製剤１５は、臨床における皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷疾患の改善に有効である。
　再生医療用皮内投与製剤１５は、皮膚表皮３３表面より１～４ｍｍの深さの部位に投与されると、毛細リンパ管や毛細血管や肉芽の再生や新生、さらにそれらの成熟の効果が高い。この深さであれば、再生医療用皮内投与製剤１５内の成長因子等が、限局的に投与され、不必要に拡散せずに、確実に皮膚内に長期間分布したまま滞在するので、毛細リンパ管・毛細血管等の脈管や肉芽等の細胞を再生・新生させて成熟させることができる。皮膚表皮から１ｍｍよりも浅い部位に投与されても、折角の成長因子が、新生すべきリンパ管や肉芽を形成させないばかりか、皮膚表皮から液漏れしてしまう。一方、皮膚表皮から４ｍｍよりも深い部位である皮下に投与されると、折角の成長因子が、拡散してしまい、再生・新生すべきリンパ管や血管や肉芽を形成させることができない。
　これらの成長因子の遺伝子をバイオテクノロジーで作製し投与する場合には、皮下、筋肉内に投与しなければ、必要な成長因子蛋白質は、発現しないことが公知であるから、皮膚表皮より１～４ｍｍの深さの真皮にリンパ管や血管や肉芽を再生・新生させることができない。
　再生医療用皮内投与製剤１５として、多血小板血漿を刺激することによって成長因子を放出させている例を示したが、多血小板血漿に代えて、前記脂肪系幹細胞、前記骨髄系幹細胞、前記血液幹細胞、及び前記人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも何れかの幹細胞を用いても、成長因子などの生理活性物質を放出することができる。この場合、多血小板血漿と同様に、これら幹細胞やその懸濁液を用いることができる。例えば、これら幹細胞のうち脂肪系幹細胞に対し、回収にコラゲナーゼを使用する。また、血液幹細胞は、血液循環後、幹細胞を同定し、その後培養し、必要数まで増やす。これにより、成長因子を放出した再生医療用皮内投与製剤１５を得ることができる。骨髄系幹細胞は、分解せずにそのまま用いてもよい。
　これらの血小板、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、人工多能性幹細胞のような細胞は、何れも、多分化能及び増殖能を保有し、組織再生等の治療に有用である。これらの細胞は、多くの成長因子などの生理活性物質（例えば成長誘導因子である蛋白質等）を放出し、さらに皮下投与でリンパ管や血管を再生する。例えば、多血小板血漿に含有される血小板は、α顆粒及びβ顆粒を含有している。これら顆粒には、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（例えばＴＧＦ－β）、ストロマ細胞由来因子（例えばＳＤＦ－１ａ）、上皮細胞因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増埴因子（ＨＧＦ）のような成長因子などの生理活性物質を含有している。血小板への刺激によってα顆粒やβ顆粒から、これらの成長因子等を複数種放出する。血小板の他、幹細胞でも同様である。
　既に多血小板血漿については、アンチエイジングや美容のため皮下に注射し皮膚組織を再生する治療法に用いられており、安全性が高いことが分かっている。
　再生医療用皮内投与製剤１５を皮内、とりわけ真皮層に投与するという治療方法は、複数の成長因子などの生理活性物質との相乗効果により、壊れた皮膚の毛細リンパ管や毛細血管や肉芽を効率的に新生・再生させ、成熟させて太いリンパ管や血管の再生を誘導し、貯留した皮膚のリンパ液を排出させるというリンパ浮腫の治療となり得る。
　また、この再生医療用皮内投与製剤１５を用いた治療方法によれば、複数の成長因などの生理活性物質が、治療すべき対象部位の皮膚皮内に分布し滞留することで、リンパ浮腫や、下肢虚血に起因する皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷等の疾患を、短期で安全に治療することができる。
　この再生医療用皮内投与製剤１５を投与には、再生医療用皮内投与製剤１５が、皮膚の乳頭真皮ならびに網状真皮へ到達するような形態で投与するのが望ましい。乳頭真皮は、毛細リンパ網や毛細血管網が密である組織であり、網状真皮は、毛細リンパ管や毛細血管の通り道となる組織である。毛細リンパ管や毛細血管が再生・新生し、また肉芽が再生・新生すると、リンパ浮腫の改善や損傷組織の再生に繋がり、皮膚等の再生医療に役立つ。
　リンパ浮腫、皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、皮膚損傷等の疾患の病態は、これら脈管網の破壊が原因でリンパ液が皮膚に貯留し、さらに貯留できないリンパ液が皮下組織に貯留して、発症する。再生医療用皮内投与製剤１５を皮内に投与すると、皮内の毛細リンパ管や毛細血管の再生に必要な成長因子や細胞が限局的に分布し、分散して滞留するため、望ましい。投与には、図１のような再生医療用皮内投与デバイスを用いてもよいが、汎用のマントー法用の針付き針基を装着したシリンジを用いてもよい。但し、マントー法で皮内に注射するには非常に熟練した技能を要するうえ、対象部位へ０．５～数ｍｌ投与するのに適したマントー法用シリンジよりも、図１で示した再生医療用皮内投与デバイス１の方が、臨床的な使用に、一層適している。
　以下、本発明を適用する再生医療用皮内投与製剤を使用した実施例と、対照のため本発明の再生医療用皮内投与製剤を使用しなかった対照例及び比較例とについて、具体的に説明する。
（実施例１：再生医療用皮内投与製剤の調製）
　哺乳動物の全血から、複数回遠心分離することにより多血小板血漿（ＰＲＰ）を調製した。なお、ＰＲＰ作製用のキット及び遠心分離器を使用してもよい。この多血小板血漿に対し、血球カウンターを使用することにより、血小板数を１×１０６個／μｌの濃度に調整後、その多血小板血漿を４℃で３０分間以上静置して刺激した４℃冷却処理ＰＲＰと、その多血小板血漿に３００Ｕｎｉｔ／ｍｌ　０．３ｍｌ　トロンビン液モチダ　ソフトボトル５千　５ｍｌ（持田製薬株式会社製）＋塩化カルシウム（ナカライテスク株式会社製　１ｍＭ／１ｍｌ　最終濃度）を加えて２０℃で３０分間静置して刺激したトロンビン／ＣａＣｌ２添加処理ＰＲＰとを、再生医療用皮内投与製剤として調製した。
　これらのようにして刺激したＰＲＰの２種類の再生医療用皮内投与製剤を用いて、ラット浮腫モデルにより、ＰＲＰ皮内投与有効性について、検討した。
（作製例１：ラット尾浮腫リンパモデルの作製）
　ＰＲＰ皮内投与有効性を比較検討するため、既知のラット尾浮腫リンパモデルを使用して、検討した。ラット尾浮腫リンパモデルは、８週令ＳＤラットに対し、吸入麻酔下で、尾つけ根より５ｍｍから尾先へ１ｃｍだけ尾皮膚を切除手術して、尾浮腫モデルを作製した。
（試験例１：ＰＲＰ皮内投与有効性検討）
　ラット尾浮腫リンパモデルの作製後、再生医療用皮内投与製剤として、実施例１で調製した４℃冷却処理ＰＲＰと、トロンビン／ＣａＣｌ２添加処理ＰＲＰとを、別々なラット尾浮腫リンパモデルのラット尻部皮膚に、通常のシリンジである２７Ｇ針を使用したシリンジでマントー法にて、それぞれ１００μｌ×１０箇所（総量１０００μｌ）ずつ、皮内投与した。このモデルの試験方法は、尾皮膚切除末梢部の直径を経時的に計測し、さらに尾皮膚切除末梢部の治癒を経時的に観察するという、経過観察である。なお、対照群として、ラット尾浮腫リンパモデルの作製後、切除手術したまま再生医療用皮内投与製剤を投与することなく自然治癒を経過観察する手術群（陽性対照）と、健常な未処置で再生医療用皮内投与製剤を投与せずに経過観察する未処置群（陰性対照）とを、用いた。
　ラット尾浮腫リンパモデル作製後、４週目まで、尾皮膚切除末梢部の直径を経時的に計測した結果を、図３に示す。また、ラット尾浮腫リンパモデル作製後１週間経過時での手術群とＰＲＰ投与群（４℃冷却処理ＰＲＰ群）との尾皮膚切除末梢部の治癒経過状態を、図４に示す。図３及び図４から明らかな通り、ＰＲＰ投与群は、何れも、浮腫リンパを生じ尾が腫れた手術群に比べ、浮腫リンパが抑制され尾の腫れが小さく、尾皮膚切除末梢部の新生肉芽が明瞭に観察され、肉芽組織再生及び創傷治癒が、速やかであり且つ顕著に確認された。
（試験例２：ＰＲＰ皮内／皮下投与有効性比較）
　ラット尾浮腫リンパモデルの作製後、再生医療用皮内投与製剤として、実施例１で調製した４℃冷却処理ＰＲＰとを、別々なラット尾浮腫リンパモデルのラット尻部皮膚に、通常のシリンジである２７Ｇ針を使用したシリンジでマントー法にて、それぞれ５００μｌずつ皮内投与、それぞれ１００μｌ×５箇所（総量５００μｌ）ずつ皮下投与した。このモデルの試験方法は、尾皮膚切除末梢部の直径を経時的に計測し、さらに尾皮膚切除末梢部の治癒を経時的に観察するという、経過観察である。なお、対照群として、ラット尾浮腫リンパモデルの作製後、切除手術したまま再生医療用皮内投与製剤を投与することなく自然治癒を経過観察する手術群（陽性対照）と、健常な未処置で再生医療用皮内投与製剤を投与せずに経過観察する未処置群（陰性対照）とを、用いた。
　ラット尾浮腫リンパモデル作製後、４週目まで、尾皮膚切除末梢部の直径を経時的に計測した結果を、図５に示す。また、ラット尾浮腫リンパモデル作製後３週間経過時でのＰＲＰ皮内投与群とＰＲＰ皮下投与群との尾皮膚切除末梢部の治癒経過状態を、図６に示す。図５及び図６から明らかな通り、ＰＲＰ皮内投与群は、浮腫リンパを生じ尾が腫れた手術群や浮腫リンパの改善が認められないＰＲＰ皮下投与群に比べ、浮腫リンパが抑制され尾の腫れが小さく、尾皮膚切除末梢部の新生肉芽が明瞭に観察され、肉芽組織再生及び創傷治癒が、速やかであり且つ顕著に確認された。
（試験例３：ＰＲＰ皮下／皮内投与・ｂＦＧＦ皮内投与の表皮再生比較）
　別な皮膚障害モデルによって、表皮再生を比較した。ラット（ＳＤ、雄、８週齢）を使用し、背部を剃毛し、正中部中央左右の皮膚を直径２０ｍｍ正円でメスを使用し、２ヵ所／１匹皮膚を切除し、モデル作製を行なった。ＰＲＰ（１０６個／μｌ　に調整）を４℃、３０分以上冷却し、さらに皮内、皮下に１００μｌ×５カ所それぞれ投与した（投与は、５日間隔で、計２回）。陽性対照としてｂＦＧＦ（フィブラストスプレー２５０μｇ：トラフェルミン／科研製薬）を１０μｇ／ｈｅａｄ皮膚採取部位周辺に投与した（投与は、１日間隔で、計５回）。上記被検物質を投与開始後１１日間観察した後、剖検を行ない、皮膚を採取し、ＨＥ染色後病理組織学的検討を実施した。病理評価は、表皮再生をスコア化して行った。スコア化は、±：僅かにある、＋：再生が見られる、＋＋：十分な再生、＋＋＋：完全（切除部全面）に再生の４段階で評価したものである。
　ＰＲＰ皮内投与のＨＥ染色後の病理組織の写真を、図７に示す。また、ＰＲＰ皮下・皮内投与し、又はｂＦＧＦ皮内投与した後、スコア化した結果を、図８に示す。
　図７及び８から明らかな通り、ＰＲＰ皮内投与では、ＰＲＰ皮下投与やｂＦＧＦ皮内投与に比べ、有意に表皮組織が再生していた。
　以上の結果から明らかな通り、再生医療用皮内投与製剤によれば、多血小板血漿に由来するような血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（例えばＴＧＦ－β）、ストロマ細胞由来因子（例えばＳＤＦ－１ａ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等の成長因子が、毛細リンパ管や毛細血管の脈管や損傷細胞等のような欠損組織を修復すべき生体部位である皮内とりわけ真皮に投与されると、これら毛細リンパ管・毛細血管や肉芽の再生・新生を複合的に促し、それらが輸出入リンパ管の形成を促進したり動脈・静脈へ繋がる太い血管の形成を促したりして、新たな細胞が熟成する結果、リンパ浮腫ならびに皮膚損傷を効率的に治療できることが示された。
　本発明の再生医療用皮内投与製剤は、癌原発巣とリンパ節との郭清後や抗癌剤治療やＸ線放射線治療により発生したリンパ浮腫、下肢虚血に起因する皮膚潰瘍・皮膚褥瘡・皮膚損傷等の疾患の治療に、用いることができる。本発明の再生医療用皮内投与製剤の製造方法は、治療の用時に又は事前に、再生医療用皮内投与製剤を調製して、効率よく皮内に投与する際に、使用される。本発明の再生医療用皮内投与デバイスは、再生医療用皮内投与製剤を専ら皮内に投与するのに、使用される。
　１：再生医療用皮内投与デバイス、１０：シリンジ本体、１１：押し子、１２：シリンジ外筒、１３：ガスケット、１４：薬室、１５：再生医療用皮内投与製剤、１６：ロック機構、１７：筒先、１８：キャップ、２０：注射針組立体、２１ａ：包装蓋、２１ｂ：包装容器、２２：嵌入筒、２３：弾性体、２４：針ハブ、２５：調整部、２６：安定部、２７：注射針、３０：皮膚、３１：皮下組織、３２：皮内、３２ａ：皮内標的部位、３３：皮膚表皮

Claims (15)

  1. 　皮内に投与される製剤であり、多血小板血漿と、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも１種の幹細胞との少なくとも何れかから、放出された成長因子を含有することを特徴とする再生医療用皮内投与製剤。
  2. 　リンパ浮腫、皮膚潰瘍、皮膚褥瘡、及び皮膚損傷から選ばれる少なくとも何れかの疾患の治療製剤であることを特徴とする請求項１に記載の再生医療用皮内投与製剤。
  3. 　リンパ管再生、リンパ管、血管、及び／又は肉芽の再生又は新生を誘導することを特徴とする請求項１に記載の再生医療用皮内投与製剤。
  4. 　前記成長因子が、血小板由来成長因子、血管内皮細胞成長因子、トランスフォーミング増殖因子、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、及び肝細胞増殖因子から選ばれる少なくとも何れかであることを特徴とする請求項１に記載の再生医療用皮内投与製剤。
  5. 　皮膚表皮表面より１～４ｍｍの深さである前記皮内に投与されることを特徴とする請求項１に記載の再生医療用皮内投与製剤。
  6. 　前記成長因子が、前記多血小板血漿、及び／又は前記幹細胞を刺激することによって、放出されたものであることを特徴とする請求項１に記載の再生医療用皮内投与製剤。
  7. 　前記多血小板血漿に対し、冷却処理と、トロンビン及び／又は塩化カルシウムの添加処理との何れかにより、前記成長因子が放出されたものであり、又は
    　前記脂肪系幹細胞、前記骨髄系幹細胞、前記血液幹細胞、及び前記人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも何れかの前記幹細胞から、前記成長因子が放出されたものであることを特徴とする請求項１に記載の再生医療用皮内投与製剤。
  8. 　前記前記多血小板血漿、及び／又は前記幹細胞が、再生医療を施す患者から採取されて由来しているものであることを特徴とする請求項１に記載の再生医療用皮内投与製剤。
  9. 　前記多血小板血漿の血小板数、及び／又は前記幹細胞の数が、１×１０－５～１×１０－７個／μｌであることを特徴とする請求項１に記載の再生医療用皮内投与製剤。
  10. 　１～４０ｍｌであることを特徴とする請求項９に記載の再生医療用皮内投与製剤。
  11. 　前記多血小板血漿及び／又は前記幹細胞が、未培養であることを特徴とする請求項１に記載の再生医療用皮内投与製剤。
  12. 　多血小板血漿と、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも１種の幹細胞との少なくとも何れかを刺激して、成長因子を放出させることにより、調製することを特徴とする再生医療用皮内投与製剤の製造方法。
  13. 　前記多血小板血漿を、冷却と、トロンビン及び／又は塩化カルシウムの添加との何れかで刺激処理することにより、前記成長因子を放出させ、
    　又は、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも１種の幹細胞前記幹細胞から、前記成長因子を放出させることを特徴とする請求項１２に記載の再生医療用皮内投与製剤の製造方法。
  14. 　皮内に投与するデバイスであり、多血小板血漿と、脂肪系幹細胞、骨髄系幹細胞、血液幹細胞、及び人工多能性幹細胞から選ばれる少なくとも１種の幹細胞との少なくとも何れかから、放出された成長因子を含有する再生医療用皮内投与製剤を収容する薬室と、前記再生医療用皮内投与製剤を投与する注射針及び／又はカニューレとを有していることを特徴とする再生医療用皮内投与デバイス。
  15. 　前記注射針及び／又は前記カニューレが、皮膚表皮より１～４ｍｍの深さの前記皮内に前記再生医療用皮内投与製剤を投与できる長さに調整されていることを特徴とする請求項１４に記載の再生医療用皮内投与デバイス。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013046868A1 (ja) * 2011-09-29 2013-04-04 テルモ株式会社 シリンジ
WO2013046867A1 (ja) * 2011-09-29 2013-04-04 テルモ株式会社 シリンジ
WO2013065017A2 (en) * 2011-11-03 2013-05-10 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (C.H.U.V.) Platelet rich plasma (prp) and prominin-1 derived peptide stimulate lymphangiogenesis

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013046868A1 (ja) * 2011-09-29 2013-04-04 テルモ株式会社 シリンジ
WO2013046867A1 (ja) * 2011-09-29 2013-04-04 テルモ株式会社 シリンジ
WO2013065017A2 (en) * 2011-11-03 2013-05-10 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (C.H.U.V.) Platelet rich plasma (prp) and prominin-1 derived peptide stimulate lymphangiogenesis

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIANG D ET AL.: "The effect of adipose tissue derived MSCs delivered by a chemically defined carrier on full-thickness cutaneous wound healing", BIOMATERIALS, vol. 34, no. 10, pages 2501 - 2515, XP055315716, ISSN: 0142-9612 *
KENJI KUSUMOTO: "Treatment of chronic ulcers applying platelet-rich plasma (PRP", JOURNAL OF CLINICAL AND EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 237, no. 1, 2 April 2011 (2011-04-02), pages 141 - 145, ISSN: 0039-2359 *
KUNIHISA TSUKADA: "Wakatta! Nichijo Shinryo no Kihon Koza Hitome de Wakaru! Saiketsu no Shikata·Chusha no Shikata no Kihon to Chuiten", RESIDENT NOTE, vol. 6, no. 2, May 2004 (2004-05-01), pages 139 - 149, ISSN: 1344-6746 *
MAHARLOOEI MK ET AL.: "Adipose tissue derived mesenchymal stem cell (AD-MSC) promotes skin wound healing in diabetic rats", DIABETES RESEARCH AND CLINICAL PRACTICE, vol. 93, no. 2, 31 May 2011 (2011-05-31), pages 228 - 234, XP028260761, ISSN: 0168-8227 *
TOYSERKANI MM ET AL.: "Stem cells snow promising results for lymphoedema treatment-a literature review", JOURNAL OF PLASTIC SURGERY AND HAND SURGERY, vol. 49, no. 2, pages 65 - 71, ISSN: 2000-6764 *
YUDAI NISHINO: "Skin regenerative therapy to apply growth factors from stem cell", JOURNAL OF CLINICAL AND EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 239, no. 8, 19 November 2011 (2011-11-19), pages 851 - 854, ISSN: 0039-2359 *

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