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WO2016035772A1 - 生体物質捕獲用フィルター及び生体物質捕獲システム - Google Patents

生体物質捕獲用フィルター及び生体物質捕獲システム Download PDF

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Publication number
WO2016035772A1
WO2016035772A1 PCT/JP2015/074768 JP2015074768W WO2016035772A1 WO 2016035772 A1 WO2016035772 A1 WO 2016035772A1 JP 2015074768 W JP2015074768 W JP 2015074768W WO 2016035772 A1 WO2016035772 A1 WO 2016035772A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
filter
metal
biological material
polymer
plating
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2015/074768
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
高井　健次
理美 八木
達也 松永
鈴木　崇裕
アンソニー エイチ ツァイ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Resonac Corp
Original Assignee
Hitachi Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hitachi Chemical Co Ltd filed Critical Hitachi Chemical Co Ltd
Priority to JP2016546646A priority Critical patent/JP6390707B2/ja
Publication of WO2016035772A1 publication Critical patent/WO2016035772A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/26—Inoculator or sampler

Definitions

  • the present invention relates to a biological material capturing filter and a biological material capturing system that can efficiently capture biological materials such as circulating tumor cells (hereinafter referred to as CTC).
  • CTC circulating tumor cells
  • CTC cancer prognosis and treatment
  • Detecting CTC is a useful means of determining the progression of cancer pathology when the initial spread of cancer cells extends into peripheral blood.
  • blood components such as red blood cells and white blood cells are overwhelmingly present in blood, it is difficult to detect a very small amount of CTC.
  • Patent Document 1 a method for efficiently detecting a small amount of CTC by using a resin filter using parylene has been proposed.
  • Patent Document 2 a method of improving the strength of the filter by using a metal filter instead of a resin and separating it by the difference in leukocyte and cancer cell deformability has been proposed (Patent Document 2).
  • the inventors found that the following problems existed while studying a filter using a metal.
  • Metals have low biocompatibility, so blood components such as white blood cells and red blood cells are easily adsorbed, and clogging easily occurs. Furthermore, since the metal surface has high water repellency and easily repels water, bubbles are likely to be generated on the filter.
  • the present invention improves a conventional biological material capturing filter, and maintains a pressure resistance while preventing cell adsorption to the filter and efficiently capturing the biological material and biological body
  • a material capture system is provided.
  • a biological material capturing filter includes a metal filter made of gold, platinum, palladium, or an alloy thereof, and biocompatibility chemically bonded to the surface of the metal filter. And a polymer.
  • a mode in which the contact angle of pure water on the surface of the filter is 60 degrees or less can be employed.
  • the metal ratio on the surface of the metal filter obtained by measurement with an X-ray photoelectron spectrometer may be 10 at% or less.
  • the biocompatible polymer may be a 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine homopolymer (MPC) or a copolymer containing the MPC.
  • MPC 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine homopolymer
  • the biocompatible polymer and the metal filter surface may be bonded by an amide bond.
  • the copolymer containing the MPC has a carboxyl group, and the surface is bonded to the metal filter having an amino group.
  • the metal filter having an amino group on the surface may be an embodiment of the metal filter in which a polymer having an amino group is adsorbed on the surface.
  • the polymer having an amino group may be polyethyleneimine.
  • the polymer having an amino group may be bonded to the metal filter having a carboxyl group on the surface.
  • the metal filter having a carboxyl group may be an embodiment in which the metal surface is treated with a thiol having a carboxyl group.
  • the MPC-containing copolymer may have an amino group and be bonded to the metal filter having a carboxyl group on the surface.
  • the metal filter having a carboxyl group on the surface may be an embodiment of the metal filter in which a polymer having a carboxyl group adsorbed on the surface is adsorbed.
  • the polymer having a carboxyl group may be polyacrylic acid.
  • the polymer having a carboxyl group may be bonded to the metal filter having an amino group on the surface.
  • the metal filter having an amino group on the surface can be an embodiment in which the metal surface is treated with a thiol having an amino group.
  • a biological material capturing system is characterized by using the biological material capturing filter described above.
  • a biological material capturing filter and a biological material capturing system capable of efficiently capturing biological material while maintaining pressure resistance and preventing cell adsorption to the filter.
  • the biological material capture cartridge 100 is connected to an inlet 130 to which an inflow pipe 125 into which a sample liquid containing biological material flows is connected, and an outflow pipe 135 from which the sample liquid containing biological material flows out.
  • a housing 120 having an outflow port 140 and a filter 105 (a biological material capturing filter) disposed in the housing 120 and having a capturing region for capturing the biological material contained in the sample liquid.
  • Biological material which is a capture target in the biological material capture system, refers to a specific type of cells contained in a biological sample. Examples of such a biological substance include cells in a living body. Examples of cells in the living body include cells in blood. Among cells in blood, examples of cells that can be captured include circulating cancer cells in the blood (CTC: Circulating Tumor Cell) and circulating endothelial cells (CEC: Circulating Endothelial Cell). CTCs are cancer (cancer) cells in the blood. When cells in blood are capture targets, they can be captured even if the cells are alive. The biological material capturing system is suitably used for capturing cancer cells in blood including CTC.
  • CTC Circulating Tumor Cell
  • CEC Circulating Endothelial Cell
  • CEC is an endothelial cell of a blood vessel and becomes a mature cell that has been detached from the blood vessel wall by metabolism.
  • CTC is said to increase in pathological conditions such as cardiovascular diseases (such as myocardial infarction).
  • the biological material capture system has a function of selectively capturing specific types of cells contained in a biological sample such as CTC and CEC.
  • CTC or CEC is a capture target, blood or a liquid obtained by adding an additive such as a buffer to blood can be used as a sample liquid containing a biological substance.
  • the housing 120 is a member for holding the filter 105 and includes an upper member 110 and a lower member 115.
  • the shape of the housing 120 may be a rectangular parallelepiped or a cylinder, and is not particularly limited.
  • a processing solution such as a sample solution or a cleaning solution is connected upstream of the inflow pipe 125. Further, by connecting the pump P downstream of the outflow pipe 135, the sample liquid and the like are supplied from the inflow pipe 125 to the inside of the housing 120 by driving the pump P. Then, it is discharged from the outflow pipe 135 to the outside.
  • a through hole 106 is formed in the filter 105.
  • the filter 105 includes a metal filter 105A made of gold, platinum, palladium, or an alloy thereof, and a biocompatible polymer 105B that is chemically bonded to the surface of the metal filter. This point will be described later.
  • the shape of the biological material capturing cartridge 100 is not limited to the above.
  • the configuration of the apparatus is not particularly limited as long as the biological material can be captured by filtration using a filter.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view showing a method for producing a metal thin film filter using a substrate in which peelable copper foil (Ni foil in the case of performing copper plating) is bonded to MCL.
  • FIG. 2A shows a substrate in which peelable copper foil 2 (Ni foil when copper plating is performed) is laminated on MCL1. First, this substrate is prepared.
  • the material used as the substrate for producing the filter is preferably copper (nickel when the plating is copper). Copper can be easily removed by chemical dissolution with a chemical solution, and is superior to other materials in adhesion to the photoresist.
  • a photoresist 3 is formed on the peelable copper foil 2 of the substrate.
  • the thickness of this photoresist is preferably 1.0 to 2.0 times the thickness of the subsequent conductor. If this thickness is thin, resist peeling will be difficult later, and if it is thick, circuit formability will be difficult. Specifically, a thickness of 15 ⁇ m to 50 ⁇ m is preferable.
  • a photomask is overlapped to perform photoresist exposure.
  • the photoresist development and removal of the unexposed portion is performed with an alkaline solution or the like.
  • plating is performed on a portion not covered with the photoresist by pattern electroplating. This plated portion becomes the material of the filter.
  • the photosensitive resin composition that is a photoresist is preferably a negative photosensitive resin composition.
  • the negative photosensitive resin composition preferably contains at least a binder resin, a photopolymerizable compound having an unsaturated bond, and a photopolymerization initiator.
  • the photoresist is exposed. Thereby, the exposure part 3a is formed in the area
  • the photoresist development and removal of the unexposed portion 3b is performed with an alkaline solution or the like. Thereby, the exposure part 3a remains in the position corresponding to the through-hole of the filter.
  • the plating layer 5 is formed by performing electrolytic plating on the portion not covered with the photoresist. This plated portion becomes the material of the filter.
  • peelable copper foil 2 on which plating layer 5 has been formed by electrolytic plating is peeled off from MCL1.
  • the peelable copper foil 2 is removed by chemical dissolution with a chemical solution, and the free-standing film formed by the exposed portion 3a and the plating layer 5 is taken out.
  • the exposed portion 3 a made of the photoresist remaining in the free-standing film is removed, and a through hole 6 is formed in the plating layer 5.
  • electroless gold plating is performed to form a gold plating layer 7 on the filter surface.
  • the filter 105 used in the biological material capturing cartridge 100 can be manufactured.
  • FIG. 3 is a schematic cross-sectional view showing a method for producing a metal thin film filter using a copper plate (Ni plate when copper plating is performed).
  • the method shown in FIG. 3 is the same as the manufacturing method shown in FIG. 2 except that a copper plate (or Ni plate) 2 ′ is used instead of the MCL 1 and the peelable copper foil 2 in the method shown in FIG. 2.
  • FIG. 3A shows a process of preparing a copper plate 2 'used as a substrate.
  • FIG. 3B shows a process of laminating the photoresist 3 on the copper plate 2 ′.
  • FIG. 3C shows the photoresist exposure with the photomask 4 overlaid.
  • FIG. 3D shows development removal of the photoresist in the unexposed portion 3b.
  • FIG. 3E shows a step of forming a plating layer by electrolytic plating on a portion of the photoresist not covered with the exposed portion 3a.
  • FIG. 3F shows a process of removing the copper plate 2 ′ by chemical dissolution (chemical etching) with a chemical solution and taking out a free-standing film formed by the exposed portion 3 a and the plating layer 5.
  • FIG. 3B shows a process of laminating the photoresist 3 on the copper plate 2 ′.
  • FIG. 3C shows the photoresist exposure with the photomask 4 overlaid.
  • FIG. 3D shows development removal of the photoresist in the unexposed portion 3b.
  • FIG. 3E shows
  • FIG. 3G shows a step of removing the exposed portion 3 a of the photoresist remaining in the free-standing film and forming a through hole 6 in the plating layer 5.
  • FIG. 3H shows a process of performing electroless gold plating to form a gold plating layer 7 on the filter surface.
  • the metal filter 105A in the filter 105 used in the biological material capturing cartridge 100 can be manufactured by using any of the method shown in FIG. 2 and the method shown in FIG.
  • the material of the metal filter 105A in the filter 105 is metal.
  • metal any of nickel, silver, palladium, copper, and iridium is preferable. These metals can be electroplated.
  • the main component of the metal is preferably nickel, silver, palladium, copper, iridium, or an alloy thereof. These metals can be electroplated.
  • the “main component” indicates that the weight ratio of the component to the total weight of the metal filter 105A is 50% or more.
  • Palladium and iridium have high redox potential, poor solubility and good characteristics, but have the disadvantage of being expensive.
  • Nickel has a lower oxidation-reduction potential than hydrogen, so it is easily dissolved but is inexpensive.
  • Silver and palladium are noble metals and are relatively inexpensive compared to iridium.
  • the material used as the substrate (copper plate 2 ': see FIG. 3) for producing the filter is preferably copper (nickel when the filter material is copper). Copper can be easily removed by chemical dissolution with a chemical solution, and is superior to other materials in adhesion to the photoresist.
  • copper when the filter material is copper, nickel is preferable.
  • the formation of the plating layer 5 shown in FIGS. 2E and 3E is performed by electrolytic plating.
  • electrolytic nickel plating Watts bath (mainly nickel sulfate, nickel chloride, boric acid), sulfamic acid bath (mainly nickel sulfamate, boric acid), strike bath (mainly nickel chloride, hydrogen chloride) Etc.
  • Examples of electrolytic silver plating include a bath mainly composed of potassium silver cyanide or potassium tartrate.
  • electrolytic palladium plating examples include a bath made of a water-soluble palladium salt and a naphthalene sulfonic acid compound.
  • Electrolytic iridium plating includes a bath containing a soluble iridium salt containing halogen and alcohols.
  • Examples of the electrolytic copper plating include a bath mainly composed of copper sulfate, sulfuric acid, and chloride ions.
  • Electrolytic plating is performed using these plating baths.
  • the current density during electroplating is preferably in the range of 0.3 to 4 A / dm 2 , and more preferably in the range of 0.5 to 3 A / dm 2 .
  • the location of the resist when plating is the location of the through hole.
  • the opening shape of the through hole include a circle, an ellipse, a square, a rectangle, a rounded rectangle, and a polygon. From the viewpoint of efficiently capturing the target component, a circle, rectangle, or rounded rectangle is preferable. In addition, a rounded rectangle is particularly preferable from the viewpoint of preventing clogging of the filter.
  • the hole diameter of the through hole 6 is set according to the size of the component to be captured.
  • the hole diameter in a shape other than a circle such as an ellipse, rectangle, or polygon is the maximum value of the diameter of a sphere that can pass through each through hole.
  • the opening shape is a rectangle or a rounded rectangle, as shown in FIG. 4, the short hole diameter on the short side and the long hole diameter on the long side can be defined, but the hole diameter of the through hole 6 is the short hole diameter. It becomes.
  • the diameter is the diameter of the inscribed circle of the polygon.
  • the length of the short pore diameter of the filter is preferably 5 ⁇ m to 15 ⁇ m, more preferably 7 ⁇ m to 9 ⁇ m.
  • the average aperture ratio of the through holes of the metal filter 105A in the filter 105 is preferably 3% to 50%, more preferably 3% to 20%, and particularly preferably 3% to 10%.
  • the aperture ratio refers to the ratio of the area occupied by the through hole to the area of the region functioning as a filter (see FIG. 4).
  • the area of the region functioning as a filter is a region (region A1 surrounded by a broken line in FIG. 4) obtained by connecting the outermost portions of the through holes among the plurality of through holes included in the filter. If the aperture ratio is too high, the pressure applied to the white blood cells decreases, and the white blood cell residue increases. If the aperture ratio is low, the amount of blood that can flow is reduced. Note that the aperture ratio of the filter 105 is smaller than that of the metal filter 105A due to adhesion of a biocompatible polymer described later, but it can be considered as an error level.
  • the thickness of the metal filter 105A in the filter 105 is preferably 3 ⁇ m to 50 ⁇ m, more preferably 5 ⁇ m to 30 ⁇ m, and particularly preferably 8 ⁇ m to 20 ⁇ m.
  • the film thickness of the metal filter 105A is less than 3 ⁇ m, the strength of the filter may be lowered, and handling may be difficult.
  • the thickness exceeds 50 ⁇ m there is a concern that productivity decreases due to a longer processing time, cost disadvantage due to unnecessarily consuming materials, and difficulty in fine processing itself, and leukocytes are difficult to escape.
  • the thickness of the filter 105 is larger than that of the metal filter 105A due to adhesion of a biocompatible polymer described later, but it can be considered as an error level.
  • the resin layer is peeled off and the copper foil is etched (FIG. 2), or the copper plate is removed (FIG. 3), so that plating is performed as shown in FIG. 2 (H) or FIG. 3 (G).
  • the filter with layer 5 is completed.
  • the resist (exposed portion 3a) remaining on the filter is removed with strong alkali.
  • strong alkali 0.1 wt% to 10 wt% NaOH or KOH aqueous solution is preferable.
  • Monoethanolamine (1 vol% to 20 vol%) or the like may be added to promote peeling.
  • the resist can be removed with a solution obtained by adding alkali (0.1 wt% to 10 wt% NaOH or KOH) to sodium permanganate or potassium permanganate.
  • ⁇ Precious metal plating should be applied to the filter from which the resist has been removed.
  • noble metal plating gold, palladium, platinum, ruthenium, indium and the like are desirable.
  • gold is said to have the highest oxidation-reduction potential among all metals as described above, and has no cytotoxicity. There is almost no discoloration during long-term storage.
  • a plating method in the case of performing gold plating will be described.
  • Gold plating can be performed electrolessly or electrolyzed. In the case of performing electrolysis, it is desirable to perform the electroless process because the thickness variation increases and the accuracy of the hole diameter of the filter 105 is easily affected. However, electrolytic gold plating can improve the coverage.
  • Gold plating is effective only by displacement plating, but the combination of displacement plating and reduction plating is more effective.
  • the surface of the filter before gold plating may be oxidized. Therefore, the oxide film is removed, but here it is preferable to wash with an aqueous solution containing a compound that forms a complex with a metal ion.
  • an aqueous solution containing cyanides, EDTAs or citric acids is preferable.
  • citric acids are most suitable as a pretreatment for gold plating.
  • citric acid anhydride, citric acid hydrate, citrate or citrate hydrate may be used.
  • citric acid anhydride, citric acid monohydrate, Sodium citrate, potassium citrate and the like can be used.
  • the concentration is preferably 0.01 mol / L to 3 mol / L, more preferably 0.03 mol / L to 2 mol / L, and particularly preferably in the range of 0.05 mol / L to 1 mol / L. preferable.
  • the immersion in a solution containing citric acid is preferably performed at 70 ° C. to 95 ° C. for 1 to 20 minutes.
  • the solution containing citric acid it is possible to add a buffer such as a reducing agent and a pH adjusting agent contained in the plating solution as long as the effects of the invention can be obtained.
  • a buffer such as a reducing agent and a pH adjusting agent contained in the plating solution
  • an aqueous solution of citric acid alone is most preferred.
  • the pH of the solution containing citric acid is preferably 5 to 10, more preferably 6 to 9.
  • the pH adjuster is not particularly limited as long as it is an acid or an alkali.
  • As the acid hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid and the like can be used.
  • As the alkali alkali metals such as sodium hydroxide, potassium hydroxide and sodium carbonate can be used. Or the alkaline-earth metal hydroxide solution is mentioned. As described above, it can be used as long as the effect of citric acid is not inhibited.
  • the nitric acid is contained at a high concentration of 100 ml / L in the solution containing citric acid, the effect of improving the adhesiveness is reduced as compared with the case where the solution is treated with the solution containing only citric acid.
  • the reducing agent is not particularly limited as long as it is reducible, and examples thereof include hypophosphorous acid, formaldehyde, dimethylamine borane, and sodium borohydride.
  • the displacement gold plating includes a cyan bath and a non-cyan bath, but the non-cyan bath is desirable in view of environmental load or remaining cytotoxicity.
  • the gold salt contained in the non-cyan bath include chloroaurate, gold sulfite, gold thiosulfate, and gold thiomalate. Only one type of gold salt may be used, or two or more types may be used in combination.
  • a cyan bath has an effect of dissolving a metal too much, some metals are liable to be dissolved to cause pinholes.
  • a non-cyan plating bath is preferable.
  • Gold sulfite is particularly preferred as the gold source.
  • gold sulfite sodium gold sulfite, potassium gold sulfite, gold ammonium sulfite and the like are preferable.
  • the gold concentration is preferably in the range of 0.1 g / L to 5 g / L. If it is less than 0.1 g / L, gold is difficult to precipitate, and if it exceeds 5 g / L, the liquid tends to decompose.
  • the displacement gold plating bath may contain an ammonium salt or ethylenediaminetetraacetate as a gold complexing agent.
  • the ammonium salt include ammonium chloride and ammonium sulfate.
  • the ethylenediaminetetraacetate include ethylenediaminetetraacetic acid, sodium ethylenediaminetetraacetate, potassium ethylenediaminetetraacetate, and ammonium ethylenediaminetetraacetate.
  • the concentration of the ammonium salt is preferably used in the range of 7 ⁇ 10 ⁇ 3 mol / L to 0.4 mol / L. If the concentration of the ammonium salt is outside this range, the liquid tends to become unstable.
  • the concentration of ethylenediaminetetraacetate is preferably used in the range of 2 ⁇ 10 ⁇ 3 mol / L to 0.2 mol / L. If the concentration of ammonium salt is outside this range, the liquid tends to become unstable. .
  • sulfite In order to keep the liquid stable, 0.1 g / L to 50 g / L of sulfite should be contained.
  • the sulfite include sodium sulfite, potassium sulfite, and ammonium sulfite.
  • hydrochloric acid or sulfuric acid When reducing the pH as a pH adjuster, it is preferable to use hydrochloric acid or sulfuric acid. Moreover, when raising pH, it is preferable to use sodium hydroxide, potassium hydroxide, or aqueous ammonia. The pH should be adjusted to 6-7. Outside this range, the stability of the solution or the appearance of the plating is adversely affected.
  • Replacement plating is preferably used at a liquid temperature of 30 to 80 degrees. Outside this range, the stability of the liquid or the appearance of the plating is adversely affected.
  • displacement plating is performed as described above, it is difficult to completely cover the metal with displacement plating. Therefore, next, reduction-type gold plating containing a reducing agent is performed.
  • the thickness of the displacement plating is preferably in the range of 0.02 ⁇ m to 0.1 ⁇ m.
  • gold sulfite and thiosulfate are preferable, and the content thereof is preferably in the range of 1 g / L to 10 g / L as gold. If the gold content is less than 1 g / L, the gold precipitation reaction decreases, and if it exceeds 10 g / L, the stability of the plating solution decreases and the amount of gold consumed increases due to the removal of the plating solution. It is not preferable.
  • the content is more preferably 2 g / L to 5 g / L.
  • the reducing agent examples include hypophosphorous acid, formaldehyde, dimethylamine borane, sodium borohydride, and the like, but a phenyl compound-based reducing agent is more preferable.
  • diamine, p-phenylenediamine, o-toluidine, o-ethylaniline, and p-ethylaniline One or more of these can be used.
  • the content of the reducing agent is preferably 0.5 to 50 g / L. If the content of the reducing agent is less than 0.5 g / L, it tends to be difficult to obtain a practical deposition rate, and if it exceeds 50 g / L, the stability of the plating solution tends to decrease. .
  • the content of the reducing agent is more preferably 2 to 10 g / L, and particularly preferably 2 to 5 g / L.
  • the electroless gold plating solution may contain a heavy metal salt.
  • the heavy metal salt is preferably at least one selected from the group consisting of thallium salt, lead salt, arsenic salt, antimony salt, tellurium salt and bismuth salt.
  • thallium salt examples include inorganic compound salts such as thallium sulfate salt, thallium chloride salt, thallium oxide salt, and thallium nitrate salt, and organic complex salts such as dithallium malonate salt.
  • Lead salts include lead sulfate salt, nitric acid salt, and the like. Examples thereof include inorganic compound salts such as lead salts and organic acetate salts such as acetates.
  • arsenic salts include inorganic compound salts such as arsenic salts and arsenic arsenate trioxide, and organic complex salts.
  • antimony salts include organic complex salts such as antimony tartrate, antimony chloride salts, and antimony oxysulfate. And inorganic compound salts such as salts and antimony trioxide.
  • tellurium salt examples include inorganic compound salts such as tellurite and tellurate, and organic complex salts.
  • examples of the bismuth salt include bismuth sulfate (III), bismuth chloride (III), and bismuth nitrate (III). And organic complex salts such as bismuth (III) oxalate.
  • the total addition amount is preferably 1 ppm to 100 ppm, more preferably 1 ppm to 10 ppm, based on the total capacity of the plating solution. If it is less than 1 ppm, the effect of improving the deposition rate may not be sufficient, and if it exceeds 100 ppm, the stability of the plating solution tends to deteriorate.
  • the electroless gold plating solution may contain a sulfur compound.
  • a sulfur compound in an electroless gold plating solution containing a phenyl compound reducing agent and a heavy metal salt, a sufficient deposition rate can be obtained even at a low temperature of about 60 to 80 ° C.
  • the stability of the plating solution is particularly excellent.
  • sulfur compounds include sulfide salts, thiocyanates, thiourea compounds, mercaptan compounds, sulfide compounds, disulfide compounds, thioketone compounds, thiazole compounds, and thiophene compounds.
  • Examples of the sulfide salt include potassium sulfide, sodium sulfide, sodium polysulfide, potassium polysulfide, and the like.
  • Examples of the thiocyanate include sodium thiocyanate, potassium thiocyanate, potassium dithiocyanate, and the like.
  • Examples of the thiourea compound include thiourea, methylthiourea, dimethylthiourea and the like.
  • Mercaptan compounds include 1,1-dimethylethanethiol, 1-methyl-octanethiol, dodecanethiol, 1,2-ethanedithiol, thiophenol, o-thiocresol, p-thiocresol, o-dimercaptobenzene, m -Dimercaptobenzene, p-dimercaptobenzene, thioglycol, thiodiglycol, thioglycolic acid, dithioglycolic acid, thiomalic acid, mercaptopropionic acid, 2-mercaptobenzozoimidazole, 2-mercapto1-methylimidazole, 2- Examples include mercapto-5-methylbenzimidazole.
  • Examples of the sulfide compound include diethyl sulfide, diisopropyl sulfide, ethyl isopropyl sulfide, diphenyl sulfide, methyl phenyl sulfide, rhodanine, thiodiglycolic acid, thiodipropionic acid, and the like.
  • Examples of the disulfide compound include dimethyl disulfide, diethyl disulfide, disulfide. A propyl disulfide etc. can be illustrated.
  • examples of the thioketone compound include thiosemicarbazide
  • examples of the thiazole compound include thiazole, benzothiazole, 2-mercaptobenzothiazole, 6-ethoxy-2-mercaptobenzothiazole, 2-aminothiazole, 2,1,3- Examples include benzothiadiazole, 1,2,3-benzothiadiazole, (2-benzothiazolylthio) acetic acid, 3- (2-benzothiazolylthio) propionic acid and the like.
  • examples of thiophene compounds include thiophene and benzothiophene. It can be illustrated.
  • Sulfur compounds may be used alone or in combination of two or more.
  • the content of the sulfur compound is preferably 1 ppm to 500 ppm, more preferably 1 ppm to 30 ppm, and particularly preferably 1 ppm to 10 ppm. If the content of the sulfur-based compound is less than 1 ppm, the deposition rate is reduced, poor plating adhesion occurs, and the coating appearance deteriorates. If it exceeds 500 ppm, the concentration management becomes difficult and the plating solution becomes unstable.
  • the electroless gold plating solution preferably contains at least one of a complexing agent, a pH buffering agent and a metal ion concealing agent in addition to the above-described gold salt, reducing agent, heavy metal salt and sulfur compound. Etc. are more preferable.
  • the electroless gold plating solution of the present invention preferably contains a complexing agent.
  • a complexing agent include non-cyanide complexing agents such as sulfites, thiosulfates, and thiomalates.
  • the content of the complexing agent is preferably 1 g / L to 200 g / L based on the total capacity of the plating solution. When the content of the complexing agent is less than 1 g / L, the gold complexing power decreases and the stability decreases. If it exceeds 200 g / L, the plating stability is improved, but recrystallization occurs in the solution, which is not economically good.
  • the content of the complexing agent is more preferably 20 g / L to 50 g / L.
  • the electroless gold plating solution preferably contains a pH buffer.
  • the pH buffering agent has an effect of keeping the deposition rate constant and stabilizing the plating solution.
  • a plurality of buffering agents may be mixed. Examples of pH buffering agents include phosphates, acetates, carbonates, borates, citrates, sulfates, etc. Among these, boric acid and sulfates are particularly preferable.
  • the content of the pH buffering agent is preferably 1 g / L to 100 g / L based on the total capacity of the plating solution.
  • the content of the pH buffering agent is less than 1 g / L, there is no pH buffering effect, and when it exceeds 100 g / L, recrystallization may occur.
  • a more preferable content is 20 g / L to 50 g / L.
  • a concealing agent in the gold plating solution.
  • a benzotriazole-based compound can be used, and examples of the benzotriazole-based compound include benzotriazole sodium, benzotriazole potassium, tetrahydrobenzotriazole, methylbenzotriazole, and nitrobenzotriazole.
  • the content of the metal ion concealing agent is preferably 0.5 g / L to 100 g / L based on the total capacity of the plating solution.
  • the content of the metal ion concealing agent is less than 0.5 g / L, there is a tendency that the effect of concealing impurities is small and sufficient liquid stability cannot be ensured.
  • it exceeds 100 g / L recrystallization may occur in the plating solution.
  • the range of 2 g / L to 10 g / L is most preferable.
  • the pH of the gold plating solution is preferably in the range of 5-10.
  • the pH of the plating solution is less than 5, sulfite or thiosulfate, which is a complexing agent of the plating solution, may be decomposed to generate toxic sulfite gas.
  • the pH exceeds 10 the stability of the plating solution tends to decrease.
  • the pH of the electroless gold plating solution is preferably in the range of 8-10.
  • gold plating is performed by immersing the filter after replacement gold plating.
  • the plating solution temperature is preferably 50 ° C to 95 ° C. If it is less than 50 ° C., the deposition efficiency is poor, and if it is 95 ° C. or more, the liquid tends to become unstable.
  • the outermost gold plating layer 7 thus formed is preferably made of gold having a purity of 99% by weight or more.
  • the gold purity of the gold plating layer 7 is less than 99% by weight, the cytotoxicity of the contact portion is increased. From the viewpoint of improving reliability, the purity of the gold layer is more preferably 99.5% by weight or more.
  • the thickness of the gold plating layer 7 is preferably 0.005 ⁇ m to 3 ⁇ m, more preferably 0.05 ⁇ m to 1 ⁇ m, and still more preferably 0.1 ⁇ m to 0.5 ⁇ m.
  • the gold surface (metal surface) of the metal filter 105A formed as described above has no cytotoxicity and is stable in the air or most aqueous solutions containing blood. However, since the gold surface is relatively hydrophobic and has low biocompatibility, a treatment for improving biocompatibility is performed.
  • a treatment for improving biocompatibility is performed.
  • an example of the process for chemically bonding biocompatible polymer 105B to the surface of metal filter 105A is shown.
  • the biocompatible polymer is chemically and strongly adsorbed to the surface of the metal filter 105A (the surface of the gold plating layer 7).
  • Biocompatible polymers include vertebrate albumin or artificial synthetic polymers, and artificial synthetic polymers are preferred in view of filter storage stability and lot differences in polymer properties.
  • vertebrate albumin it is necessary to perform a filter treatment immediately before blood treatment, which complicates the work.
  • the artificial synthetic polymer has better characteristics.
  • the artificial synthetic polymer examples include silicone, various polyurethanes, polyphosphazene, and the like, and particularly excellent is a homopolymer of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (abbreviation: MPC) or a copolymer containing MPC.
  • MPC 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine
  • the structural formula is shown below.
  • MPC polymer can also be used.
  • MPC polymers include Biolipideure 103, Biolipidure 203, Biolipidure 206, Biolipidure 405, Biolipidure 502, Biolipidure 702, Biolipidure 802, Biolipidure 1002, Biolipidure 1201, Biolipidure 1301, and the like.
  • the MPC polymers those in which R is hydrogen in the chemical formula or those containing an amino group are preferable because the bondability with the filter is improved. That is, when the biocompatible polymer contains an amino group or a carboxyl group, an alternating lamination method using electrostatic adsorption can be used and the cytotoxicity is low.
  • the surface of the gold plating layer 7 of the filter (the surface of the metal filter 105A) and the biocompatible polymer are preferably bonded by an amide bond.
  • the gold plating layer 7 is treated with a compound having a mercapto group (thiol group). Thereby, a mercapto group is formed on the surface of the gold plating layer 7.
  • the mercapto group on the surface of the gold plating layer 7 is reacted with a biocompatible polymer containing a structural unit having an amide group at its terminal. Thereby, the surface of the gold plating layer 7 and the biocompatible polymer are bonded by an amide bond. In this case, the connectivity between the two is improved.
  • a method of forming a polymer having a carboxyl group or an amino group on the surface of the gold plating layer 7 of the filter 105 (the surface of the metal filter 105A: the same for other materials such as palladium or platinum) will be shown.
  • the gold surface can be modified with a compound having any of a mercapto group, a sulfide group, and a disulfide group that forms a coordinate bond with gold.
  • the compounds used for modifying the gold surface include 2-aminoethanethiol, o-fluorobenzenethiol, m-hydroxybenzenethiol, 2-methoxybenzenethiol, 4-aminobenzenethiol, cysteamine, cysteine , Dimethoxythiophenol, furfuryl mercaptan, thioacetic acid, thiobenzoic acid, thiosalicylic acid, or dithiodipropionic acid.
  • the method for modifying the gold surface using the above compound is not particularly limited, but a compound such as mercaptoacetic acid is dispersed in an organic solvent such as methanol or ethanol in an amount of about 10 mmol / L to 100 mmol / L, and the gold is contained therein. Conductive particles having a surface are dispersed.
  • the polymer may be coated using electrostatic interaction.
  • Such a method is called an alternating lamination method (Layer-by-Layer assembly).
  • the alternate lamination method is described in G.H. This is a method for forming an organic thin film published in 1992 by Decher et al. (Thin Solid Films, 210/211, p831 (1992)).
  • a polycation adsorbed on a substrate by electrostatic attraction by alternately immersing the base material in an aqueous solution of a polymer electrolyte having a positive charge (polycation) and a polymer electrolyte having a negative charge (polyanion).
  • a combination of polyanions is laminated to obtain a composite film (alternate laminated film).
  • the film is grown by attracting the charge of the material formed on the substrate and the material having the opposite charge in the solution by electrostatic attraction, so that the adsorption proceeds and the charge is neutralized. When this occurs, no further adsorption occurs. Therefore, when reaching a certain saturation point, the film thickness does not increase any more.
  • polymers examples include polyethylene glycol, poly (2-hydroxyl methacrylate), polyacrylic acid, polyethyleneimine, and polyallylamine, and are not particularly limited.
  • the polymer may be copolymerized with acrylic acid or methacrylic acid. From the viewpoint of charge density and cost, polyethyleneimine is preferable for a cation, and polyacrylic acid is preferable for an anion.
  • the concentration of the polymer electrolyte in the aqueous polymer electrolyte solution is generally preferably about 0.01% to 10% (weight). Further, the pH of the polymer electrolyte solution is not particularly limited.
  • the coverage can be controlled by adjusting the type, molecular weight, and concentration of the polymer electrolyte thin film.
  • concentration of the polymer in the aqueous polymer electrolyte solution is preferably in the range of 0.1% to 5.0%.
  • a biocompatible polymer having a carboxyl group or an amino group After coating a cationic or anionic polymer in this way, it is preferable to finally coat a biocompatible polymer having a carboxyl group or an amino group.
  • the filter surface When the filter surface is coated with a polymer having an amino group, it is preferable to coat a biocompatible polymer having a carboxyl group. Conversely, when the filter surface is coated with a polymer having a carboxyl group, a biocompatible polymer having an amino group may be coated.
  • a biocompatible polymer having a carboxyl group may be coated on the biocompatible polymer having an amino group.
  • the thickness of the biocompatible polymer thus produced is desirably 20 mm (angstrom) or more.
  • the thickness of the biocompatible polymer can be controlled by the treatment concentration and the number of treatments.
  • the thickness of the biocompatible polymer is 20 mm or less, the effect tends to be insufficient.
  • the upper limit of the thickness of the biocompatible polymer is not particularly limited, but if it exceeds 0.1 ⁇ m, the pore diameter of the filter is affected, and leukocytes are difficult to escape.
  • the contact angle may be measured with an apparatus conforming to JIS R3265 “Testing method for wettability of substrate glass surface”.
  • the contact angle on the filter surface after treatment with the biocompatible polymer is preferably 90 degrees or less, and more preferably 60 degrees or less.
  • the contact angle of pure water is said to be wet when it is below 90 degrees, but it is not perfect.
  • bubbles are generated and a part of the filter tends to become unusable.
  • the biocompatible polymer should be completely covered with the metal surface of the filter. Specifically, when analysis is performed using XPS (X-ray Photoelectron Spectroscopy), the lower the surface metal (Au, Pd, Pt) ratio, the better. Desirably, it is more desirable that it is 5 at% or less. When the proportion of surface metal is high, the coverage of the biocompatible polymer is low and the effect is reduced.
  • XPS X-ray Photoelectron Spectroscopy
  • the measurement result by XPS also differs strictly depending on the measuring device. Therefore, in this embodiment, it shall measure on the conditions shown in Table 1.
  • the blood collection tube examples include an EDTA blood collection tube that preserves cells alive and a fixed blood collection tube, but a fixed blood collection tube is preferable.
  • a blood collection tube examples include Cyto-Cex, Cell-Free-DNA (trade name, manufactured by Streck).
  • it is preferable to use a fixed blood collection tube because a fixed blood collection tube can be used for a long time after blood collection compared to an EDTA blood collection tube.
  • the filter 105 is attached to a device such as the biological material capturing cartridge 100 to allow blood to pass therethrough.
  • the blood may be treated with a negative pressure from below the filter, may be treated with pressure from above the filter, or may be treated with a centrifugal force like centrifugation. In either method, it is important to control the linear velocity at which blood passes through the pores of the filter.
  • the linear velocity (blood volume / total area of the pores) through which the blood passes through the pores of the filter is preferably in the range of 0.5 cm / min to 100 cm / min, and in the range of cm / min to 5 to 20 cm / min. Is more desirable.
  • rare cells such as CTC concentrated can be concentrated.
  • a biocompatible polymer to the filter chemically and firmly, it is possible to exclude components such as red blood cells, white blood cells, and plasma plates.
  • Photosensitive resin composition PHOTEC RD-1225: thickness 25 ⁇ m, manufactured by Hitachi Chemical Co., Ltd.
  • MCL-E679F substrate in which peelable copper foil is bonded to the surface of MCL, manufactured by Hitachi Chemical Co., Ltd.
  • Lamination conditions were performed at a roll temperature of 90 ° C., a pressure of 0.3 MPa, and a conveyor speed of 2.0 m / min.
  • a glass mask having a light-transmitting portion with a rounded rectangular shape, a size of 8.8 ⁇ 30 ⁇ m, and a pitch of 60 ⁇ m in both the minor axis and major axis directions was allowed to stand on the photoresist laminate surface of the substrate.
  • a glass mask in which rounded rectangles facing in the same direction are arranged at a constant pitch in the major axis and minor axis directions was used.
  • ultraviolet rays having an exposure amount of 30 mJ / cm 2 were irradiated from above the substrate on which the glass mask was placed by an ultraviolet irradiation device.
  • the obtained nickel plating layer is peeled off together with the peelable copper foil of the substrate, and this peelable copper foil is chemically dissolved by a chemical solution in a stirring process at a temperature of 40 ° C. for about 120 minutes (MEC BRIGHT SF-5420B, MEC shares).
  • the self-supporting membrane (20 mm ⁇ 20 mm) to be a metal filter was removed by removing it by the company.
  • the photoresist remaining in the free-standing film was removed by resist stripping (P3 Poleve, Henkel) by ultrasonic treatment at a temperature of 60 ° C. for about 40 minutes to produce a metal filter having fine through holes.
  • the metal filter was immersed in an acidic degreasing solution Z-200 (manufactured by World Metal: trade name) to remove organic substances on the metal filter (40 ° C. for 3 minutes).
  • Z-200 manufactured by World Metal: trade name
  • immersion gold plating was performed by immersing in HGS-100 (trade name, manufactured by Hitachi Chemical Co., Ltd.), which is a non-cyan substitutional electroless Au plating, at 80 ° C. for 20 minutes.
  • the thickness of the displacement gold plating was 0.05 ⁇ m.
  • HGS-5400 (trade name, manufactured by Hitachi Chemical Co., Ltd.), which is non-cyan reduced electroless Au plating, at 65 ° C. for 10 minutes, plated with gold, washed with water and dried. The total thickness of the gold plating was 0.2 ⁇ m. Thereby, a metal filter is created.
  • reaction solution was prepared by dissolving 8 mmol of dithiodipropionic acid having a carboxyl group in the molecule in 200 mL of methanol. Next, a metal filter after gold plating was added to the reaction solution, reacted at room temperature for 2 hours, and then washed with methanol to prepare a filter having a carboxyl group on the surface.
  • a filter having an amino group on the surface was prepared by immersing in a metal filter having a carboxyl group in a 0.3 wt% polyethyleneimine 0.3 wt% aqueous solution having a large number of amino groups in the molecule for 15 minutes and washing.
  • the filter having an amino group on the surface is immersed for 15 minutes in a methanol solution containing 0.3 wt% of a copolymer polymer BL405 (manufactured by NOF CORPORATION: trade name) of an MPC monomer and a carboxyl group-containing monomer. Finally, a 30 minute treatment at 80 ° C in a vacuum dryer facilitates dehydration condensation of carboxyl groups and amino groups, and captures biological materials in which biocompatible polymers are firmly chemically bonded to the surface of the metal filter.
  • a filter 1 was prepared.
  • a reaction solution was prepared by dissolving 8 mmol of 2-aminoethanethiol having an amino group in the molecule in 200 mL of methanol. Next, a metal filter after gold plating was added to the reaction solution, reacted at room temperature for 2 hours, and then washed with methanol to prepare a filter having an amino group on the surface.
  • a filter having a carboxyl group on the surface was prepared by immersing in a metal filter having a carboxyl group in a 0.3 wt% polyacrylic acid 0.3 wt% aqueous solution having a number of carboxyl groups in the molecule for 15 minutes and washing. .
  • the filter having a carboxyl group on the surface is immersed for 15 minutes in a methanol solution containing 0.3 wt% of a copolymer polymer BL502 (manufactured by NOF Corporation: trade name) of a monomer having an MPC monomer and an amino group for washing. Finally, by performing a treatment at 80 ° C. for 30 minutes in a vacuum dryer, it promotes dehydration condensation of carboxyl groups and amino groups, and for capturing biological substances in which the biocompatible polymer is firmly chemically bonded to the filter surface. Filter 4 was produced.
  • Filter 5 A filter was produced in the same manner as Filter 1 except that one-stage electroless platinum plating was performed instead of the two-stage gold plating. Rectres Pt100 (Nippon Electroplating Engineers Co., Ltd. product name) was used as the electroless platinum plating solution. The thickness of platinum was 0.1 ⁇ m.
  • a filter 6 was prepared in the same manner as the filter 1 except that one-stage electroless palladium plating was performed instead of the two-stage gold plating.
  • Paradex Strike 3 (manufactured by Nippon Electroplating Engineering Co., Ltd .: trade name) was used as the electroless palladium plating solution.
  • the thickness of palladium was 0.1 ⁇ m.
  • a filter 7 was produced in the same manner as the filter 1 except that electrolytic palladium plating was used instead of electrical Ni plating.
  • Paradix LF-5 (Nippon Electroplating Engineers Co., Ltd .: trade name) was used as the electropalladium plating solution.
  • Plating is performed under the same conditions as filter 1 except that the plating temperature is 50 ° C., the current density is 1 A / dm 2, and the electroplating is performed to be about 20 ⁇ m under the condition of about 4.2 minutes / ⁇ m. went.
  • a peelable nickel foil was used in place of the MCL peelable copper foil (the nickel foil was removed after electroplating). Further, a surface-treated filter 8 was produced in the same manner as the filter 1 except that electrolytic copper plating was used instead of electrical Ni plating.
  • electrolytic copper plating solution Microfab Cu200 (Nippon Electroplating Engineers Co., Ltd .: trade name) was used. Plating is performed under the same conditions as filter 1 except that the plating temperature is 25 ° C. and the current density is 3 A / dm 2, and the electroplating is performed so as to be about 20 ⁇ m at about 1.5 minutes / ⁇ m. went.
  • a filter 9 was produced in the same manner as the filter 1 except that the surface treatment was not performed.
  • a filter 10 was produced in the same manner as the filter 1 except that gold plating was not performed.
  • a filter 11 was prepared in the same manner as the filter 1 except that CM5206 (manufactured by NOF Corporation: trade name), which is an MPC-containing polymer having no hydrophobic and reactive functional group, was used instead of BL405.
  • CM5206 manufactured by NOF Corporation: trade name
  • NOF Corporation trade name
  • Filter 12 was prepared in the same manner as filter 1 except that the dithiodipropionic acid treatment was omitted.
  • a filter 13 was prepared in the same manner as the filter 1 except that the dithiodipropionic acid treatment and the polyethyleneimine treatment were omitted.
  • a filter 14 was prepared in the same manner as the filter 1 except that BL203 (manufactured by NOF Corporation: trade name), which is a pure MPC polymer having no hydrophobic and reactive functional groups, was used instead of BL405.
  • NCI-H358 cells a non-small cell carcinoma cell line, were statically cultured in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37 ° C. and 5% CO2. Cells were detached from the culture dish by trypsin treatment and recovered, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then washed with 10 ⁇ M CellTracker Red CMTPX (Life Technologies Japan, Inc.) at 37 ° C. for 30 minutes. NCI-H358 cells were stained by allowing to stand. Thereafter, the cells were washed with PBS and allowed to stand at 37 ° C.
  • PBS phosphate buffered saline
  • PBS is phosphate buffered saline, and product code 166-23555 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used.
  • BSA bovine serum albumin
  • SIGMA-ALDRICH Product Name: Albumin from bovine serum-Lyophilized powder, Bio Reagent for cell culture.
  • EDTA 2Na (ethylenediamine-N, N, N ′, N′-4 acetic acid disodium salt dihydrate) (product code 345-01865 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
  • a blood sample was introduced into a CTC recovery device to concentrate cancer cells.
  • a sample containing 1000 cancer cells per mL of blood was used in healthy blood sampled in Cell Free DNA (manufactured by Streck Inc .: trade name), which is a vacuum blood collection tube containing a cell stabilizer as a blood sample.
  • Cell Free DNA manufactured by Streck Inc .: trade name
  • As a cancer cell the above human non-small cell lung cancer cell line NCI-H358 was used.
  • the blood used was 6 hours after blood collection.
  • a washing solution 2 mM EDTA-0.5% BSA-PBS
  • a washing solution 1 mL of 2 mM EDTA-0.5% BSA-PBS
  • liquid feeding was started using a peristaltic pump at a flow rate of 200 ⁇ L / min. Thereafter, 1 mL of blood was added. After about 5 minutes, 2 mL of 2 mM EDTA-0.5% BSA-PBS was introduced into the reservoir to wash the cells.
  • the pump flow rate was changed to 20 ⁇ L / min, and 600 ⁇ L of cell staining solution (Hoechst 33342: 30 ⁇ l, Wash buffer: 300 mL) was introduced into the reservoir, and the cancer cells or leukocytes on the filter were fluorescently stained. After staining the cells captured on the filter for 30 minutes, 1 mL of 2 mM EDTA-0.5% BSA-PBS was introduced into the reservoir to wash the cells.
  • cell staining solution Hoechst 33342: 30 ⁇ l, Wash buffer: 300 mL
  • the filter was observed using a fluorescence microscope (BX61, Olympus Corporation) equipped with a computer-controlled electric stage and a cooled digital camera (DP70, Olympus Corporation), and the number of cancer cells and leukocytes on the filter was determined. I counted.
  • Tables 5 and 6 show the filter type, material, and information on surface treatments 1 to 3 according to each evaluation example, and Table 6 shows the contact angle, the results of elemental analysis on Au, the white blood cell count, and the NCI-H358 recovery rate. And the result of the evaluation which concerns on a bubble is shown. Note that “A” related to bubbles indicates that almost no bubbles were generated in the cartridge. “B” indicates that bubbles are generated in a part (less than 5% by volume) of the cartridge. “C” indicates that more bubbles than the result B (5% by volume or more in the cartridge) were generated.
  • Evaluation Example 4 the treatment order of cations and anions is changed, and a biocompatible polymer is chemically bonded onto the gold plating filter.
  • the number of white blood cells is relatively small and the recovery rate of cancer cells is high.
  • Evaluation examples 5 and 6 perform Pt and Pd plating instead of gold plating. In the case of Pt and Pd, an effect close to that of Au plating can be obtained.
  • Evaluation examples 7 and 8 change the bulk metal from Ni to Pd, Cu.
  • the characteristics are slightly better than Ni.
  • Evaluation Example 9 is a case where the surface treatment of the metal filter was not performed. In this case, the white blood cell count increases and the recovery rate decreases. The hydrophobicity was high and bubbles were generated.
  • Evaluation Example 10 is a case where Au plating was not performed. In this case, the polymer coverage is low (the gold element ratio is high) due to the influence of the Ni oxide film, and the white blood cell count increases and the recovery rate decreases.
  • Evaluation Example 11 is a case where MPC polymer (CM5206) having no reactive functional group is coated. In this case, the contact angle becomes extremely high and bubbles are likely to be generated. The white blood cell count increases and the recovery rate decreases.
  • Evaluation examples 12 and 13 are cases where some or more of the surface treatments are omitted.
  • the evaluation example 13 has low chemical adsorption, and the polymer is easily peeled off.
  • Evaluation Example 14 is a case where a homopolymer of MPC was used. The chemical reactivity with the filter was slightly reduced, and the polymer coverage was low (the gold element ratio was high).

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Abstract

　生体物質捕獲用フィルターは、金、白金、パラジウム、又はこれらの合金から成る金属フィルターと、前記金属フィルターの表面に化学結合された生体適合性ポリマーと、を有する。

Description

生体物質捕獲用フィルター及び生体物質捕獲システム
　本発明は、血中循環癌細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅｌｌ、以下、ＣＴＣという）等の生体物質を効率良く捕捉できる生体物質捕獲用フィルター及び生体物質捕獲システムに関する。
　癌細胞濃縮の研究・臨床的意義は極めて大きく、血液中の癌細胞を濃縮することもできれば、癌の診断に応用することができる。例えば、癌の予後および治療の最も重要な要因は、初診時および処置時における癌細胞の転移の有無である。癌細胞の初期の拡散が抹消血中に及んだ場合、ＣＴＣを検出することは、癌の病状進行を判断する有用な手段である。しかしながら、血液中には、赤血球や白血球などの血液成分が圧倒的に多く存在するため、極めて少量のＣＴＣの検出は困難である。
　近年、パリレンを用いた樹脂フィルターを使用することで、少量のＣＴＣを効率的に検出する方法が提案されている（特許文献１）。
　或いは、樹脂の代わりに金属を用いたフィルターを使用することで、フィルターの強度を向上させ、白血球と癌細胞変形能の違いにより分離する方法も提案されている（特許文献２）。
国際公開第２０１０／１３５６０３号 特開２０１３／４２６８９号
　発明者らは、金属を用いたフィルターの検討を進めるうち、以下に示す課題が存在することが分かった。
　金属は生体適合性が低いため、白血球や赤血球といった血液成分が吸着しやすく、容易に目詰まりが発生する。さらに、金属表面は撥水性が高く、水をはじきやすいのでフィルター上に気泡が発生しやすい。
　この際、生体適合性の高いポリマーを事前に処理するということが考えられる。しかしながら、貴金属以外の金属は表面の酸化皮膜の影響でポリマーの表面処理が難しい。また、金属酸化皮膜はサンプルによって異なる上、金属酸化皮膜とポリマーを化学的に強固に結合させるのは難しい。さらに、ポリマーを処理したとしても、結合性が不十分であると十分な効果が得られない。
　本発明は従来の生体物質捕捉用フィルターを改善するものであり、耐圧性を維持しつつ、フィルターへの細胞吸着を防ぎ、効率的に生体物質を捕獲することができる生体物質捕獲用フィルター及び生体物質捕獲システムを提供するものである。
　上記目的を達成するため、本発明の一形態に係る生体物質捕獲用フィルターは、金、白金、パラジウム、又はこれらの合金から成る金属フィルターと、前記金属フィルターの表面に化学結合された生体適合性ポリマーと、を有することを特徴とする。
　ここで、前記フィルター表面の純水の接触角が６０度以下である態様とすることができる。
　また、Ｘ線光電子分光装置による測定で求められる前記金属フィルター表面における金属の割合が１０ａｔ％以下である態様とすることができる。
　前記生体適合性ポリマーが２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンのホモポリマー（ＭＰＣ）、又は、当該ＭＰＣを含む共重合体である態様とすることができる。
　前記生体適合性ポリマーと前記金属フィルター表面がアミド結合によって結合している態様とすることができる。
　前記ＭＰＣを含む共重合体がカルボキシル基を有し、表面にアミノ基を有する前記金属フィルターと結合している態様とすることができる。
　前記表面にアミノ基を有する前記金属フィルターとは、表面にアミノ基を有するポリマーが吸着されている前記金属フィルターである態様とすることができる。
　前記アミノ基を有するポリマーが、ポリエチレンイミンである態様とすることができる。
　前記アミノ基を有するポリマーが、表面にカルボキシル基を有する前記金属フィルターに対して結合している態様とすることができる。
　前記カルボキシル基を有する前記金属フィルターとは、金属表面が、カルボキシル基を有するチオールにより処理されている前記金属フィルターである態様とすることができる。
　また、前記ＭＰＣを含む共重合体がアミノ基を有し、表面にカルボキシル基を有する前記金属フィルターと結合している態様とすることができる。
　前記表面にカルボキシル基を有する前記金属フィルターとは、表面に吸着したカルボキシル基を有するポリマーが吸着されている前記金属フィルターである態様とすることができる。
　前記カルボキシル基を有するポリマーが、ポリアクリル酸である態様とすることができる。
　前記カルボキシル基を有するポリマーが、表面にアミノ基を有する前記金属フィルターに対して結合している態様とすることができる。
　表面にアミノ基を有する前記金属フィルターとは、金属表面が、アミノ基を有するチオールにより処理されている態様とすることができる。
　また、本発明の一形態に係る生体物質捕獲システムは、上記の生体物質捕獲用フィルターを用いたことを特徴とする。
　本発明によれば、耐圧性を維持しつつ、フィルターへの細胞吸着を防ぎ、効率的に生体物質を捕獲することができる生体物質捕獲用フィルター及び生体物質捕獲システムが提供される。
細胞捕捉カートリッジの概略構成を説明する図である。 フィルターの製造方法を説明する図である。 銅板（銅めっきを行う場合はＮｉ板）を使用してフィルターを製造する方法を示す概略断面図である。 フィルターにおける長孔径、短孔径、及び開口率の定義を説明する図である。
　以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。
　本実施形態に係る生体物質捕獲システムではフィルターによるフィルトレーションを行う。フィルトレーションを行うための装置構成は特に限定されないが、一例としてフィルターを備えた生体物質捕獲カートリッジを用いる場合について説明する。生体物質捕獲カートリッジ１００は、図１に示すように、生体物質を含む試料液が流入する流入管１２５が接続された流入口１３０と、生体物質を含む試料液が流出する流出管１３５が接続された流出口１４０とを有する筐体１２０と、筐体１２０内に配置され、試料液に含まれる生体物質を捕捉する捕捉領域を有するフィルター１０５（生体物質捕獲用フィルター）とを備える。
　生体物質捕獲システムにおける捕獲対象である「生体物質」とは、生体試料に含まれる特定種類の細胞を指す。このような生体物質としては、例えば、生体中の細胞が挙げられる。生体中の細胞としては、例えば血液中の細胞が挙げられる。血液中の細胞のうち、捕獲対象となり得る細胞としては、例えば、血中循環癌細胞（ＣＴＣ：Circulating　Tumor　Cell）、及び、循環血管内皮細胞（ＣＥＣ：Circulating　Endothelial　Cell）が挙げられる。ＣＴＣは、血液中のがん（癌）細胞である。血液中の細胞が捕獲対象である場合、細胞が生きている場合であっても捕獲対象とすることができる。生体物質捕獲システムは、ＣＴＣを始めとする血液中のがん細胞の捕獲に好適に用いられる。また、ＣＥＣは、血管の内皮細胞であり、代謝によって血管壁から剥がれ落ちた成熟細胞となるものである。ＣＴＣは、循環器系の疾患（心筋梗塞等）などの病態で増加すると言われている。生体物質捕獲システムでは、ＣＴＣ及びＣＥＣ等のように生体試料に含まれる特定種類の細胞を選択的に捕獲する機能を有する。なお、ＣＴＣやＣＥＣが捕獲対象である場合、生体物質が含まれる試料液として、血液又は血液に対して緩衝液等の添加剤を添加した液体を用いることができる。
　筐体１２０は、フィルター１０５を保持するための部材であり、上部部材１１０及び下部部材１１５から構成される。筐体１２０の形状は直方体又は円筒等であってよく、特に制約はない。
　流入管１２５の上流には、例えば、試料液又は洗浄液等の処理液等が接続される。また、流出管１３５の下流に、ポンプＰが接続することで、ポンプＰの駆動により、流入管１２５から筐体１２０の内部に試料液等が供給され。その後、流出管１３５から外部に排出される。
　フィルター１０５には貫通孔１０６が形成されている。試料液として血液を生体物質捕獲カートリッジ１００内に導入すると、血液の赤血球等は貫通孔１０６を通過するが、捕獲対象の生体物質である血中希少細胞は貫通孔１０６を通過できず、フィルター１０５表面に滞留する。これにより、血中希少細胞を回収することができる。なお、フィルター１０５は、金、白金、パラジウム、又はこれらの合金から成る金属フィルター１０５Ａと、当該金属フィルターの表面に化学結合された生体適合性ポリマー１０５Ｂとを有する。この点は後述する。
　なお、生体物質捕獲カートリッジ１００の形状は上記に限定されない。フィルターによるフィルトレーションによって、生体物質を捕捉することができるのであれば、その装置構成は特に限定されない。
　次に、図２及び図３を参照しながら、本実施形態に係る生体物質捕獲用のフィルターの基材となる金属フィルター１０５Ａ（図１参照）の作製方法を例示すると共に、金属フィルターの説明を行う。
　図２は、ＭＣＬにピーラブル銅箔（銅めっきを行う場合はＮｉ箔）を貼り合わせた基板を使用し、金属製薄膜フィルターを製造する方法を示す概略断面図である。
　図２（Ａ）は、ＭＣＬ１上にピーラブル銅箔２（銅めっきを行う場合はＮｉ箔）が積層された基板を示している。まずこの基板を準備する。
　フィルターを作製するための基板として使用する材料は銅（めっきが銅の場合はニッケル）が好ましい。銅は薬液による化学的溶解で容易に除去可能であり、フォトレジストとの密着力においても他の材料に比べると優れている。
　次に、図２（Ｂ）に示すように、基板のピーラブル銅箔２上にフォトレジスト３を形成する。このフォトレジストの厚みは後の導体の厚みの１．０倍～２．０倍が好ましい。この厚みが薄いと、後にレジスト剥離が困難になり、厚いと回路形成性が困難になる。具体的には１５μｍ～５０μｍの厚みが好ましい。次に、フォトマスクを重ねてフォトレジスト露光を行う。次に、アルカリ溶液等で未露光部のフォトレジスト現像除去を行う。次にパターン電気めっきによりフォトレジストに覆われていない部分にめっきを行う。このめっきの部分がフィルターの材質となる。フォトレジストである感光性樹脂組成物としてはネガ型感光性樹脂組成物が好ましい。ネガ型感光性樹脂組成物は少なくともバインダー樹脂、不飽和結合を有する光重合性化合物、光重合開始剤を含むものが好ましい。
　次に、図２（Ｃ）に示すように、フォトレジスト３上にフォトマスク４を重ねた後にフォトレジスト露光を行う。これにより、フォトマスク４が重ねられていない領域に露光部３ａが形成される。
　次に、図２（Ｄ）に示すように、アルカリ溶液等で未露光部３ｂのフォトレジスト現像除去を行う。これにより、フィルターの貫通孔に対応する位置に露光部３ａが残る。
　次に、図２（Ｅ）に示すように、フォトレジストで覆われていない部分への電解めっきを行うことで、めっき層５を形成する。このめっきの部分がフィルターの材質となる。
　次に、図２（Ｆ）に示すように、ＭＣＬ１から、電解めっきによりめっき層５が形成された施したピーラブル銅箔２を剥離する。
　次に、図２（Ｇ）に示すように、薬液による化学的溶解により、ピーラブル銅箔２を除去し、露光部３ａ及びめっき層５により形成される自立膜を取り出す。
　次に、図２（Ｈ）に示すように、自立膜内に残ったフォトレジストによる露光部３ａを除去し、めっき層５に対して貫通孔６を形成する。
　次に、図２（Ｉ）に示すように、無電解金めっきを行い、フィルター表面に金めっき層７を形成する。以上により、生体物質捕獲カートリッジ１００に用いられるフィルター１０５を製造することができる。
　図３は、銅板（銅めっきを行う場合はＮｉ板）を使用して金属製薄膜フィルターを製造する方法を示す概略断面図である。
　図３に示す方法では、図２に示す方法におけるＭＣＬ１とピーラブル銅箔２に代えて銅板（又はＮｉ板）２’を使用している点以外は、図２に示す製造方法と同じである。
　すなわち、図３（Ａ）は基板として使用する銅板２’を準備する工程を示している。
　また、図３（Ｂ）は銅板２’へのフォトレジスト３のラミネートする工程を示している。また、図３（Ｃ）はフォトマスク４を重ねてのフォトレジスト露光を示している。また、図３（Ｄ）は未露光部３ｂのフォトレジストの現像除去を示している。また、図３（Ｅ）はフォトレジストの露光部３ａで覆われていない部分への電解めっきによりめっき層を形成する工程を示している。また、図３（Ｆ）は薬液による化学的溶解（ケミカルエッチング）によって銅板２’　を除去し、露光部３ａ及びめっき層５により形成される自立膜を取り出す工程を示している。また、図３（Ｇ）は自立膜内に残ったフォトレジストによる露光部３ａを除去し、めっき層５に対して貫通孔６を形成する工程を示している。また、図３（Ｈ）は無電解金めっきを行い、フィルター表面に金めっき層７を形成する工程を示している。
　このように、図２に示す方法及び図３に示す方法の何れを用いても生体物質捕獲カートリッジ１００に用いられるフィルター１０５における金属フィルター１０５Ａを製造することができる。
　フィルター１０５における金属フィルター１０５Ａの材質は金属である。金属の主成分としては、ニッケル、銀、パラジウム、銅、イリジウムのいずれかが好ましい。以上の金属は電気めっき可能である。
　また、金属の主成分としては、ニッケル、銀、パラジウム、銅、イリジウムのいずれか、もしくはこれらの合金が好ましい。以上の金属は電気めっき可能である。なお、「主成分」とは、金属フィルター１０５Ａの総重量に対する当該成分の重量割合が５０％以上であることを示す。
　パラジウム及びイリジウムは酸化還元電位が高く、難溶性で特性良好だが、高価である欠点がある。ニッケルは水素よりも酸化還元電位が低いため、溶解しやすいが、安価である。銀及びパラジウムは貴金属であり、イリジウムに比べると比較的安価である。
　フィルターを作製するための基板（銅板２’：図３参照）として使用する材料は銅（フィルターの材質が銅である場合はニッケル）が好ましい。銅は薬液による化学的溶解で容易に除去可能であり、フォトレジストとの密着力においても他の材料に比べると優れている。なお、ＭＣＬ１に対して積層する金属箔２（図２参照）についても、銅（フィルターの材質が銅である場合はニッケル）が好ましい。
　また、図２（Ｅ）及び図３（Ｅ）に示すめっき層５の形成は電解めっきにより行われる。例えば、電解ニッケルめっきとしてはワット浴（硫酸ニッケル、塩化ニッケル、ホウ酸が主成分）、スルファミン酸浴（スルファミン酸ニッケル、ホウ酸が主成分）、ストライク浴（塩化ニッケル、塩化水素が主成分）などが挙げられる。
　電解銀めっきとしては、シアン化銀カリウム又は酒石酸カリウムを主成分とする浴が挙げられる。
　電解パラジウムめっきとしては、水溶性パラジウム塩とナフタレンスルホン酸化合物よりなる浴が挙げられる。
　電解イリジウムめっきとしては、ハロゲンを含む可溶性イリジウム塩およびアルコール類を含有する浴が挙げられる。
　電解銅めっきとしては、硫酸銅と硫酸、塩化物イオンを主成分とする浴が挙げられる。
　これらのめっき浴を用いて、電解めっきを行う。電解めっきの際の電流密度は、０．３～４Ａ／ｄｍ２の範囲がよく、０．５～３Ａ／ｄｍ２の範囲であることがより好ましい。電流密度を４Ａ／ｄｍ２以下とすることで、ざらつきの発生を抑制でき、電流密度を０．３Ａ／ｄｍ２以上とすることで、金属の結晶粒が充分に成長し、バリア層としての効果が高まるため、本実施形態の効果が良好に得られるようになる。
　めっきを行う際のレジストの箇所が貫通孔の箇所となる。貫通孔の開口形状として円、楕円、正方形、長方形、角丸長方形、多角形等が例示できる。効率良く対象とする成分を捕獲できる観点からは円、長方形又は角丸長方形が好ましい。また、フィルターの目詰まり防止の観点からは角丸長方形が特に好ましい。
　貫通孔６の孔径は捕獲対象とする成分のサイズに応じて設定される。本明細書において開口形状が楕円、長方形、多角形等の円以外の形状における孔径とは、それぞれの貫通孔を通過できる球の直径の最大値とする。例えば開口形状が長方形又は角丸長方形の場合、図４に示すように、短辺側の短孔径と、長辺側の長孔径とを定義することができるが、貫通孔６の孔径は短孔径となる。また、開口形状が多角形の場合、その多角形の内接円の直径となる。開口形状が長方形又は角丸長方形の場合、捕獲対象とする成分が貫通孔６に捕獲された状態であっても開口部において開口形状の長辺方向に隙間ができる。この隙間を通して液体が通過可能であるため、フィルターの目詰まりを防止することができる。フィルターの短孔径の長さは５μｍ～１５μｍが好ましく、７μｍ～９μｍがさらに好ましい。
　フィルター１０５における金属フィルター１０５Ａの貫通孔の平均開口率は３％～５０％が好ましく、３％～２０％がより好ましく、３％～１０％が特に好ましい。ここで、開口率とは、フィルターとして機能する領域の面積に対する貫通孔が占める面積の割合をいう（図４参照）。即ち、フィルターとして機能する領域の面積とは、フィルターに含まれる複数の貫通孔のうち、貫通孔の最外部を結んで得られる領域（図４において破線で囲まれた領域Ａ１）である。開口率が高すぎると白血球にかかる圧力が低下し、白血球残が増加する。開口率が低いと流せる血液量が低下する。なお、フィルター１０５の開口率は、後述の生体適合性ポリマーの付着により金属フィルター１０５Ａよりも小さくなるが、誤差程度と考えることができる。
　フィルター１０５における金属フィルター１０５Ａの厚さは３μｍ～５０μｍであることが好ましく、５μｍ～３０μｍであることがより好ましく、８μｍ～２０μｍであることが特に好ましい。金属フィルター１０５Ａの膜厚が３μｍ未満の場合はフィルターの強度が低下し、取り扱い性が困難になる場合がある。逆に、５０μｍを超えると加工時間が長くなることによる生産性低下、必要以上の材料消費によるコスト的な不利や微細加工そのものが困難になることが懸念される上、白血球が抜けにくくなる。なお、フィルター１０５の厚さは、後述の生体適合性ポリマーの付着により金属フィルター１０５Ａよりも大きくなるが、誤差程度と考えることができる。
　以上回路形成後、樹脂層を剥離し銅箔をエッチングする（図２）か、又は銅板を除去する（図３）ことで、図２（Ｈ）又は図３（Ｇ）に示すように、めっき層５によるフィルターが完成する。
　次に、フィルターに残っているレジスト（露光部３ａ）を強アルカリにより除去する。強アルカリとしては、０．１ｗｔ％～１０ｗｔ％のＮａＯＨ又はＫＯＨ水溶液が好ましい。剥離を促進するためにモノエタノールアミン（１ｖｏｌ％～２０ｖｏｌ％）等を添加しても良い。剥離が困難な場合は過マンガン酸ナトリウム又は過マンガン酸カリウム等にアルカリ（０．１ｗｔ％～１０ｗｔ％のＮａＯＨ又はＫＯＨ）を加えた液でレジストを除去することもできる。
　レジストを除去したフィルターに対しては貴金属めっきを行うと良い。
　貴金属めっきとしては、金、パラジウム、白金、ルテニウム、インジウムなどが望ましい。
　貴金属めっきの中でも金は前出の様に全ての金属の中で最も酸化還元電位が高く、細胞毒性がないとされている。長期保存での変色等も殆どない。以下の実施形態では、金めっきを行う場合のめっき方法について説明する。
　金めっきは無電解で行うことも出来るし、電解で行うことも出来る。電解で行う場合は厚みばらつきが大きくなり、フィルター１０５の孔径精度に影響出やすい為、無電解で行うことが望ましい。但し、電解金めっきは被覆率を向上できる。
　金めっきは置換めっきで行うだけでも効果があるが、置換めっきと還元めっきを組み合わせた方が、効果が大きい。
　金めっき前のフィルターは表面が酸化していることがある。そこで、酸化皮膜の除去を行うのであるが、ここでは金属イオンと錯体を形成する化合物の入った水溶液で洗浄すると良い。
　具体的にはシアン類、ＥＤＴＡ類又はクエン酸類の入った水溶液がよい。
　中でもクエン酸類は金めっきの前処理として最適である。具体的にはクエン酸の無水物、クエン酸の水和物、クエン酸塩あるいはクエン酸塩の水和物であればよく、具体的には、クエン酸無水物、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム等を使用することができる。その濃度は０．０１ｍｏｌ／Ｌ～３ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．０３ｍｏｌ／Ｌ～２ｍｏｌ／Ｌであることがより好ましく、０．０５ｍｏｌ／Ｌ～１ｍｏｌ／Ｌの範囲であることが特に好ましい。０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上とすることで、無電解金めっき層とフィルターの密着性が向上する。また、３ｍｏｌ／Ｌを超えた場合、効果が向上しない上、経済的に好ましくない。
　クエン酸を含む溶液への浸漬は、７０℃～９５℃で、１～２０分間行うと良い。
　クエン酸を含む溶液は、発明の効果が得られる範囲でめっき液などに含まれる還元剤、ｐＨ調整剤等の緩衝剤を加えることも可能であるが、還元剤、ｐＨ調整剤などは少量が望ましく、クエン酸のみの水溶液が最も好ましい。クエン酸を含む溶液のｐＨは、好ましくは５～１０であり、より好ましくは６～９である。
　ｐＨ調整剤としては、酸又はアルカリであれば特に限定されず、酸としては、塩酸、硫酸、硝酸などが使用でき、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、等のアルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物溶液が挙げられる。前述したように、クエン酸の効果を阻害しない範囲で使用することができる。また、クエン酸を含む溶液に、硝酸を１００ｍｌ／Ｌといった高濃度で含有させると、クエン酸のみを含む溶液で処理した場合と比較して、接着性を改善する効果が低下する。
　還元剤としては、還元性のあるものであれば特に限定されず、次亜リン酸、ホルムアルデヒド、ジメチルアミンボラン、水素化ホウ素ナトリウムなどが挙げられる。
　次に、置換金めっきを行う。置換金めっきにはシアン浴と非シアン浴があるが、環境負荷又は残存時の細胞毒性を考えると非シアン浴が望ましい。非シアン浴に含まれる金塩としては、塩化金酸塩、亜硫酸金塩、チオ硫酸金塩、チオリンゴ酸金塩が例示可能である。金塩は一種類のみ用いてもよく、二種以上を組み合わせて用いても良い。
　さらに、シアン系の浴は、金属を溶解する効果が強すぎるため、金属によっては溶解してピンホールが発生しやすい。上記のように前処理を十分に行う場合は非シアン系のめっき浴が好ましい。
　金の供給源としては亜硫酸金が特に好ましい。亜硫酸金としては、亜硫酸金ナトリウム、亜硫酸金カリウム、亜硫酸金アンモニウム、などがよい。
　金濃度は０．１ｇ／Ｌ～５ｇ／Ｌの範囲が好ましい。０．１ｇ／Ｌ未満では金が析出しにくく、５ｇ／Ｌを超えると液が分解しやすくなる。
　置換金めっき浴には金の錯化剤としてアンモニウム塩又はエチレンジアミンテトラ酢酸塩が入っているとよい。アンモニウム塩としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムが挙げられ、エチレンジアミンテトラ酢酸塩としては、エチレンジアミンテトラ酢酸、エチレンジアミンテトラ酢酸ナトリウム、エチレンジアミンテトラ酢酸カリウム、エチレンジアミンテトラ酢酸アンモニウムを使用する。アンモニウム塩の濃度は、７×１０－３ｍｏｌ／Ｌ～０．４ｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することが好ましく、アンモニウム塩の濃度がこの範囲外だと液が不安定になる傾向がある。エチレンジアミンテトラ酢酸塩の濃度は、２×１０－３ｍｏｌ／Ｌ～０．２ｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することが好ましく、アンモニウム塩の濃度がこの範囲外だと液が不安定になる傾向がある。
　液を安定に保つために０．１ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌの亜硫酸塩が入っているとよい。亜硫酸塩としては亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム又は亜硫酸アンモニウムなどが挙げられる。
　ｐＨ調整剤としてｐＨを下げる場合には、塩酸或いは硫酸を使用するのが好ましい。また、ｐＨを上げる場合には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、又はアンモニア水を使用することが好ましい。ｐＨは６～７に調整するとよい。この範囲外では液の安定性又はめっきの外観に悪影響を与える。
　置換めっきは液温３０度～８０度で使用することが好ましく、この範囲外では液の安定性又はめっきの外観に悪影響を与える。
　以上のようにして置換めっきを行うわけであるが、置換めっきでは完全に金属を覆うのが難しい。そこで、次に還元剤の入った還元型の金めっきを行う。置換めっきの厚みは０．０２μｍ～０．１μｍの範囲が好ましい。
　還元型の金めっきの金塩としては、亜硫酸金塩および及びチオ硫酸塩が好ましく、その含有量は金として１ｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌの範囲であることが好ましい。金の含有量が１ｇ／Ｌ未満であると、金の析出反応が低下し、１０ｇ／Ｌを超えると、めっき液の安定性が低下すると共に、めっき液の持ち出しにより金消費量が多くなるため、好ましくない。含有量は２ｇ／Ｌ～５ｇ／Ｌにすることがより好ましい。
　還元剤としては次亜リン酸、ホルムアルデヒド、ジメチルアミンボラン、水素化ホウ素ナトリウムなどが挙げられるが、フェニル化合物系還元剤がより好ましい。例えば、フェノール、ｏ－クレゾール、ｐ－クレゾール、ｏ－エチルフェノール、ｐ－エチルフェノール、ｔ－ブチルフェノール、ｏ－アミノフェノール、ｐ－アミノフェノール、ヒドロキノン、カテコール、ピロガロール、メチルヒドロキノン、アニリン、ｏ－フェニレンジアミン、ｐ－フェニレンジアミン、ｏ－トルイジン、ｏ－エチルアニリン、ｐ－エチルアニリン等が挙げられ、これらの１種又は２種以上を用いることが出来る。
　還元剤の含有量は、０．５～５０ｇ／Ｌであることが好ましい。還元剤の含有量が０．５ｇ／Ｌ未満であると、実用的な析出速度を得ることが困難となる傾向があり、５０ｇ／Ｌを超えると、めっき液の安定性が低下する傾向がある。還元剤の含有量は２～１０ｇ／Ｌとすることがより好ましく、２～５ｇ／Ｌであることが特に望ましい。
　無電解金めっき液は重金属塩を含んでいても良い。析出速度を促進する観点から、重金属塩はタリウム塩、鉛塩、砒素塩、アンチモン塩、テルル塩及びビスマス塩からなる群より選ばれる少なくとも一つであることが好ましい。
　タリウム塩としては、硫酸タリウム塩、塩化タリウム塩、酸化タリウム塩、硝酸タリウム塩等の無機化合物塩、マロン酸二タリウム塩等の有機錯体塩が挙げられ、鉛塩としては、硫酸鉛塩、硝酸鉛塩等の無機化合物塩、酢酸塩等の有機酢酸塩が挙げられる。
　また、砒素塩としては、亜砒素塩、砒酸塩三酸化砒素等の無機化合物塩又は有機錯体塩が挙げられ、アンチモン塩としては、酒石酸アンチモニル塩等の有機錯体塩、塩化アンチモン塩類、オキシ硫酸アンチモン塩、三酸化アンチモン等の無機化合物塩類が挙げられる。
　テルル塩としては、亜テルル酸塩、テルル酸塩等の無機化合物塩、又は有機錯体塩が挙げられ、ビスマス塩としては、硫酸ビスマス（ＩＩＩ）、塩化ビスマス（ＩＩＩ）、硝酸ビスマス（ＩＩＩ）等の無機化合物塩、シュウ酸ビスマス（ＩＩＩ）等の有機錯体塩が挙げられる。
　上述の重金属塩は、１種類又はそれ以上用いることが出来るが、その添加量の合計はめっき液全容量を基準として１ｐｐｍ～１００ｐｐｍが好ましく、１ｐｐｍ～１０ｐｐｍがより好ましい。１ｐｐｍ未満では、析出速度向上効果が十分でない場合があり、１００ｐｐｍを越す場合はめっき液安定性が悪くなる傾向にある。
　無電解金めっき液は硫黄系化合物を含んでいても良い。フェニル化合物系還元剤及び重金属塩を含む無電解金めっき液中に、硫黄化合物を更に含有させることにより、液温６０～８０℃程度の低温であっても十分な析出速度が得られ、被膜外観も良好である上、めっき液の安定性が特に優れるようになる。
　硫黄系化合物としては、硫化物塩、チオシアン酸塩、チオ尿素化合物、メルカプタン化合物、スルフィド化合物、ジスルフィド化合物、チオケトン化合物、チアゾール化合物、チオフェン化合物等が挙げられる。
　硫化物塩としては、例えば、硫化カリウム、硫化ナトリウム、多硫化ナトリウム、多硫化カリウム等が挙げられ、チオシアン酸塩としては、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、ジチオシアン酸カリウム等が挙げられ、また、チオ尿素化合物としては、チオ尿素、メチルチオ尿素、ジメチルチオ尿素等が挙げられる。
　メルカプタン化合物としては、１，１－ジメチルエタンチオール、１－メチル－オクタンチオール、ドデカンチオール、１，２－エタンジチオール、チオフェノール、ｏ－チオクレゾール、ｐ－チオクレゾール、ｏ－ジメルカプトベンゼン、ｍ－ジメルカプトベンゼン、ｐ－ジメルカプトベンゼン、チオグリコール、チオジグリコール、チオグリコール酸、ジチオグリコール酸、チオリンゴ酸、メルカプトプロピオン酸、２－メルカプトベンゾオゾイミダゾール、２－メルカプト１－メチルイミダゾール、２－メルカプト－５－メチルベンゾイミダゾール等が例示できる。
　スルフィド化合物としては、ジエチルスルフィド、ジイソプロピルスルフィド、エチルイソプロピルスルフィド、ジフェニルスルフィド、メチルフェニルスルフィド、ローダニン、チオジグリコール酸、チオジプロピオン酸等が例示でき、ジスルフィド化合物としては、ジメチルジスルフィド、ジエチルジスルフィド、ジプロピルジスルフィド等が例示できる。
　更に、チオケトン化合物としては、チオセミカルバジド等が例示でき、チアゾール化合物としてはチアゾール、ベンゾチアゾール、２－メルカプトベンゾチアゾール、６－エトキシ－２－メルカプトベンゾチアゾール、２－アミノチアゾール、２，１，３－ベンゾチアジアゾール、１，２，３－ベンゾチアジアゾール、（２－ベンゾチアゾリルチオ）酢酸、３－（２－ベンゾチアゾリルチオ）プロピオン酸等が例示でき、チオフェン化合物としては、チオフェン、ベンゾチオフェン等が例示できる。
　硫黄系化合物は、単独で用いてもよく、２種類以上を用いても良い。硫黄系化合物の含有量は１ｐｐｍ～５００ｐｐｍであることが好ましく、１ｐｐｍ～３０ｐｐｍであることがより好ましく、１ｐｐｍ～１０ｐｐｍであることが特に好ましい。硫黄系化合物の含有量が１ｐｐｍ未満では、析出速度が低下し、めっき付きまわり不良が生じ、皮膜外観が悪化する。５００ｐｐｍを超えると、濃度管理に困難を生じ、めっき液が不安定になる。
　無電解金めっき液には、上述の金塩、還元剤、重金属塩及び硫黄系化合物に加えて、錯化剤、ｐＨ緩衝剤及び金属イオン隠蔽剤の少なくとも１つを含有することが好ましく、これ等すべてを含有することがより好ましい。
　本発明の無電解金めっき液には、錯化剤を含有させることが好ましい。具体的には亜硫酸塩、チオ硫酸塩、チオリンゴ酸塩等の非シアン系錯化剤が挙げられる。錯化剤の含有量は、めっき液の全容量を基準として１ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌが好ましい。錯化剤の含有量が１ｇ／Ｌ未満である場合、金錯化力は低下し、安定性が低下する。２００ｇ／Ｌを超えると、めっき安定性は向上するが、液中に再結晶が発生し、経済的に芳しくない。錯化剤の含有量は２０ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌとすることがより好ましい。
　無電解金めっき液には、ｐＨ緩衝剤を含有させることが好ましい。ｐＨ緩衝剤により析出速度を一定値に保ち、めっき液を安定化させる効果がある。緩衝剤は複数のものを混ぜても良い。ｐＨ緩衝剤としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、硼酸塩、クエン酸塩、硫酸塩等が挙げられ、これ等の中では硼酸、硫酸塩が特に好ましい。
　ｐＨ緩衝剤の含有量は、めっき液の全容量を基準として１ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌであることが好ましい。ｐＨ緩衝剤の含有量が１ｇ／Ｌ未満であると、ｐＨの緩衝効果がなく、１００ｇ／Ｌを超えると再結晶化してしまう恐れがある。より好ましい含有量は２０ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌである。
　金めっき液には隠蔽剤を含有させることが好ましい。隠蔽剤としては、ベンゾトリアゾール系化合物を用いることができ、ベンゾトリアゾール系化合物としては、例えばベンゾトリアゾールナトリウム、ベンゾトリアゾールカリウム、テトラヒドロベンゾトリアゾール、メチルベンゾトリアゾール、ニトロベンゾトリアゾール等が例示できる。
　金属イオン隠蔽剤の含有量は、めっき液の全容量を基準として０．５ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌであることが好ましい。金属イオン隠蔽剤の含有量が０．５ｇ／Ｌ未満であると、不純物の隠蔽効果が少なく、十分な液安定性を確保できない傾向がある。一方、１００ｇ／Ｌを超えると、めっき液中で再結晶化が生じる場合がある。コスト及び効果を鑑みると、２ｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌの範囲がもっとも好ましい。
　金めっき液のｐＨは５～１０の範囲であることが好ましい。めっき液のｐＨが５未満の場合、めっき液の錯化剤である亜硫酸塩や、チオ硫酸塩が分解し、毒性の亜硫酸ガスが発生する恐れがある。ｐＨが１０を超える場合、めっき液の安定性が低下する傾向がある。還元剤の析出効率を向上させ、速い析出速度を得るために、無電解金めっき液のｐＨは８～１０の範囲とすることが好ましい。
　無電解めっきの方法としては、置換金めっきが終了したフィルターを浸漬して金めっきを行う。
　めっきの液温は５０℃～９５℃がよい。５０℃未満では析出効率が悪く、９５℃以上では液が不安定になりやすい。
　このようにして形成される最外層の金めっき層７は、９９重量％以上の純度の金からなることが好ましい。金めっき層７の金の純度が９９重量％未満であると、接触部の細胞毒性が高くなる。信頼性を高める観点からは、金層の純度は、９９．５重量％以上であることがより好ましい。
　また、金めっき層７の厚さは、０．００５μｍ～３μｍとすることが好ましく、０．０５μｍ～１μｍとすることがより好ましく、０．１μｍ～０．５μｍとすることが更に好ましい。金層の厚さを０．００５μｍ以上とすることで、金属の溶出をある程度抑制できる。一方、３μｍを超えても、それ以上効果が大きく向上しないため、経済的な観点からも３μｍ以下とすることが好ましい。
　以上のように形成した金属フィルター１０５Ａの金表面（金属表面）は細胞毒性がなく、大気中又は血液を含む殆どの水溶液中で安定である。しかしながら、金表面は比較的疎水性であり、生体適合性が低いので、生体適合性を向上させる処理が施される。以下、生体適合性を向上させるために、金属フィルター１０５Ａの表面に生体適合性ポリマー１０５Ｂを化学結合するための処理の一例を示す。
　血液中の成分である白血球、赤血球、血小板は異物に対して拒絶反応を示す。したがって、金属表面に前処理を施すのがよい。この場合、生体適合性のポリマーを金属フィルター１０５Ａの表面（金めっき層７の表面）に対して化学的に強固に吸着させるのが良い。
　生体適合性ポリマーとしては、脊椎動物のアルブミン又は人口合成ポリマーが挙げられるが、フィルターの保存性やポリマーの特性のロット差を鑑みると、人口合成ポリマーが好ましい。脊椎動物のアルブミンを用いる場合は、血液処理直前にフィルター処理を行う必要があり、作業が煩雑になる。特に血球細胞が固定化されている場合（生物的に死んでいる場合）は、人工合成ポリマーの方が特性がよい。
　人工合成ポリマーとしてはシリコーン、各種ポリウレタン、ポリフォスファゼン等が挙げられるが、特に優れているのが２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（略称：　ＭＰＣ）のホモポリマー、もしくはＭＰＣを含む共重合体である。以下にその構造式を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　なお、上記化学式はＭＰＣポリマーを示すものであるが、Ｒには、アルキル基、水素、アミノ基、ヒドロキシアルキル基等を適用することができる。
　市販のＭＰＣポリマーを用いることもできる。市販のＭＰＣポリマーとしては、Ｂｉｏｌｉｐｉｄｕｒｅ１０３、Ｂｉｏｌｉｐｉｄｕｒｅ２０３、Ｂｉｏｌｉｐｉｄｕｒｅ２０６、Ｂｉｏｌｉｐｉｄｕｒｅ４０５、Ｂｉｏｌｉｐｉｄｕｒｅ５０２、Ｂｉｏｌｉｐｉｄｕｒｅ７０２、Ｂｉｏｌｉｐｉｄｕｒｅ８０２、Ｂｉｏｌｉｐｉｄｕｒｅ１００２、Ｂｉｏｌｉｐｉｄｕｒｅ１２０１、Ｂｉｏｌｉｐｉｄｕｒｅ１３０１等が挙げられる。
　なかでも、ＭＰＣポリマーのうち、化学式においてＲが水素である場合やアミノ基を含むものは、フィルターとの結合性が向上するので好ましい。即ち、生体適合性ポリマーはアミノ基やカルボキシル基を含有していると、静電吸着を用いた交互積層法が用いることができる上、細胞毒性が少ない。
　また、フィルターの金めっき層７の表面（金属フィルター１０５Ａの表面）と生体適合性ポリマーとは、アミド結合により結合されていることが好ましい。なお、金めっき層７と生体適合性ポリマーとの間にアミド結合を形成するには、まず、金めっき層７を、メルカプト基（チオール基）を有する化合物で処理をする。これにより、金めっき層７表面にメルカプト基が形成される。この金めっき層７表面のメルカプト基に対して、生体適合性ポリマーのうち、その末端にアミド基を有する構造単位を含むものを反応させる。これにより、金めっき層７の表面と生体適合性ポリマーとの間がアミド結合により結合される。この場合、両者間の結合性が向上する。
　ここで、例えば、カルボキシル基やアミノ基を有するポリマーをフィルター１０５の金めっき層７の表面（金属フィルター１０５Ａの表面：パラジウム又は白金等の他の材料でも同じ）に形成する方法を示す。
　金に対して配位結合を形成するメルカプト基、スルフィド基、ジスルフィド基のいずれかを有する化合物で金表面を改質することができる。
　具体的には、金表面の改質に用いられる化合物としては、２－アミノエタンチオール、ｏ－フルオロベンゼンチオール、ｍ－ヒドロキシベンゼンチオール、２－メトキシベンゼンチオール、４－アミノベンゼンチオール、システアミン、システイン、ジメトキシチオフェノール、フルフリルメルカプタン、チオ酢酸、チオ安息香酸、チオサリチル酸、又は、ジチオジプロピオン酸等が挙げられる。
　上記化合物を用いて金表面を改質処理する方法としては特に限定しないが、メタノールやエタノール等の有機溶媒中にメルカプト酢酸等の化合物を１０ｍｍｏｌ／Ｌ～１００ｍｍｏｌ／Ｌ程度分散し、その中に金表面を有する導電粒子を分散させる。
　次に被覆率を高めるため、高分子等を被覆するのが望ましい。高分子は静電的相互作用を用いて被覆するのが良い。
　このような方法は、交互積層法（Ｌａｙｅｒ－ｂｙ－Ｌａｙｅｒ　ａｓｓｅｍｂｌｙ）と呼ばれる。交互積層法は、Ｇ．Ｄｅｃｈｅｒらによって１９９２年に発表された有機薄膜を形成する方法である（Ｔｈｉｎ　Ｓｏｌｉｄ　Ｆｉｌｍｓ，　２１０／２１１，　ｐ８３１（１９９２））。この方法では、正電荷を有するポリマー電解質（ポリカチオン）と負電荷を有するポリマー電解質（ポリアニオン）の水溶液に、基材を交互に浸漬することで基板上に静電的引力によって吸着したポリカチオンとポリアニオンの組が積層して複合膜（交互積層膜）が得られるものである。
　交互積層法では、静電的な引力によって、基材上に形成された材料の電荷と、溶液中の反対電荷を有する材料が引き合うことにより膜成長するので、吸着が進行して電荷の中和が起こるとそれ以上の吸着が起こらなくなる。したがって、ある飽和点までに至れば、それ以上膜厚が増加することはない。
　このような高分子としては、ポリエチレングリコール、ポリメタクリル酸２ヒドロキシルエチル、ポリアクリル酸、ポリエチレンイミン、又はポリアリルアミン等があり、特に限定しない。ポリマーにはアクリル酸やメタクリル酸を共重合させても良い。電荷密度とコストの観点から、カチオンであればポリエチレンイミンが、アニオンであればポリアクリル酸が好ましい。
　これらの高分子は、種類により一概には定めることができないが、一般に、５００～１，０００，０００程度のものが好ましく、５，０００～２００，０００の範囲がより好ましい。なお、ポリマー電解質の水溶液中の高分子電解質の濃度は、一般に、０．０１％～１０％（重量）程度が好ましい。また、高分子電解質溶液のｐＨは、特に限定されない。
　なお、高分子電解質薄膜の種類や分子量、濃度を調整することにより被覆率をコントロールすることが出来る。ポリマー電解質の水溶液中のポリマーの濃度は０．１％～５．０％の範囲が好ましい。
　このようにカチオン性或いはアニオン性のポリマーを被覆した後、最後にカルボキシル基或いはアミノ基を有する生体適合性ポリマーを被覆すると良い。
　フィルター表面がアミノ基を有するポリマーで被覆されている場合は、カルボキシル基を有する生体適合性ポリマーを被覆すると良い。逆にフィルター表面がカルボキシル基を有するポリマーで被覆されている場合は、アミノ基を有する生体適合性ポリマーを被覆すると良い。
　生体適合性ポリマーの吸着厚みを増やす場合、アミノ基を有する生体適合性ポリマーの上にカルボキシル基を有する生体適合性ポリマーを被覆しても良い。
　こうしてできた生体適合性ポリマーの厚みは２０Å（オングストローム）以上であることが望ましい。生体適合性ポリマーの厚みは処理濃度や処理回数などでコントロールすることができる。
　生体適合性ポリマーの厚みが２０Å以下であると効果が不十分になりやすい。
　生体適合性ポリマーの厚みの上限は特に無いが、０．１μｍを超えるとフィルターの孔径に影響を与え、白血球が抜けにくくなるので好ましくない。
　生体適合性ポリマーを処理することで、金属表面の水の接触角が減少する。接触角はＪＩＳ　Ｒ３２６５「基板ガラス表面の濡れ性試験方法」に準拠した装置で測定を行うとよい。生体適合性ポリマーにより処理を行った後のフィルター表面における接触角は９０度以下が好ましく、６０度以下がさらに好ましい。
　一般的に純水の接触角は９０度を下回ると濡れる状態といわれるが、完全ではない。濡れ性が悪い状態でフィルトレーションを行うと、気泡が発生し、フィルターの一部が使用不能の状態になりやすい。
　生体適合性ポリマーは、フィルターの金属表面を完全に覆った状態にするのがよい。具体的には、ＸＰＳ（Ｘ－ｒａｙ　Ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｘ線光電子分光装置）により分析を行った場合、表面金属（Ａｕ、Ｐｄ、Ｐｔ）の割合が低いほどよく、１０ａｔ％（原子の割合）以下であることが望ましく、５ａｔ％以下であることが更に望ましい。表面金属の割合が高い場合、生体適合性ポリマーの被覆率が低いことになり、効果が減少する。
　ＸＰＳによる測定結果も測定装置等により厳密には異なる。したがって、本実施形態においては表１に示す条件で測定するものとする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　こうして生体適合性ポリマーを処理したフィルターに血液を流す（フィルトレーション）。血液の採血管としては細胞を生きたまま保存するＥＤＴＡ採血管や固定型の採血管が挙げられるが、固定型の採血管が好ましい。このような採血管として、Ｃｙｔｏ－Ｃｈｅｘ、Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ－ＤＮＡ、（Ｓｔｒｅｃｋ社製、商品名）などがある。本発明においてはＥＤＴＡ採血管にくらべ固定型の採血管は採血後、長時間使用できることから固定型の採血管を用いるのが好ましい。
　フィルトレーションとしては、フィルター１０５を生体物質捕獲カートリッジ１００のような装置に対して取り付けて血液を通過させる。血液はフィルターの下方から陰圧で処理しても、フィルターの上方から加圧で処理しても、遠心分離のように遠心力で処理しても構わない。いずれの方法においても血液がフィルターの孔を通過する線速度をコントロールすることが重要になる。
　血液がフィルターの孔を通過する線速度（血液の体積／孔の総面積）は０．５ｃｍ／ｍｉｎ～１００ｃｍ／ｍｉｎの範囲であることが望ましく、ｃｍ／ｍｉｎ５～２０ｃｍ／ｍｉｎの範囲であることが更に望ましい。
　以上のようにして濃縮したＣＴＣ等の希少細胞を濃縮できる。生体適合性ポリマーを化学的に強固にフィルターに被覆することで、赤血球、白血球、血しょう板といった成分を除外することが可能になる。
　以下、実施例及び比較例に基づき本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
（フィルター１）
　感光性樹脂組成物（ＰＨＯＴＥＣ　ＲＤ－１２２５：厚さ２５μｍ、日立化成株式会社製）を２５０ｍｍ角の基板（ＭＣＬ－Ｅ６７９Ｆ：ＭＣＬの表面にピーラブル銅箔を貼り合わせた基板、日立化成株式会社製）の片面にラミネートした。ラミネート条件はロール温度９０℃、圧力０．３ＭＰａ、コンベア速度２．０ｍ／分で行った。
　次に、光の透過部の形状が角丸長方形、サイズが８．８×３０μｍでそのピッチが短軸及び長軸方向いずれも６０μｍとしたガラスマスクを基板のフォトレジストラミネート面に静置した。本実施例においては同一の方向を向いた角丸長方形が長軸及び短軸方向に一定のピッチで整列したガラスマスクを使用した。続いて、６００ｍｍＨｇ以下の真空下において、ガラスマスクを載置した基板上部から紫外線照射装置によって露光量３０ｍＪ／ｃｍ２の紫外線を照射した。
　次に、１．０％炭酸ナトリウム水溶液で現像を行い、基板上に長方形のフォトレジストが垂直に立ったレジスト層を形成した。このレジスト付き基板の銅露出部分にｐＨが４．５になるように調整したニッケルめっき液中温度５５℃、約２０分間厚さが約２０μｍとなるようにめっきを行った。ニッケルめっき液の組成を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　次に、得られたニッケルめっき層を基板のピーラブル銅箔とともに剥離し、このピーラブル銅箔を温度４０℃で約１２０分間、攪拌処理での薬液による化学的溶解（メックブライトＳＦ－５４２０Ｂ、メック株式会社）によって除去することにより金属フィルターとなる自立膜（２０ｍｍ×２０ｍｍ）を取り出した。
　最後に、自立膜内に残ったフォトレジストを温度６０℃で約４０分間、超音波処理でのレジスト剥離（Ｐ３　Ｐｏｌｅｖｅ、Ｈｅｎｋｅｌ）によって除去し、微細貫通孔を有する金属フィルターを作製した。
　これによって、シワ・折れ・キズ・カール等のダメージはなく、十分な精度の貫通孔を有する金属フィルターを作製した。
　次に、酸性脱脂液Ｚ－２００（ワールドメタル製：商品名）に金属フィルターを浸漬し、金属フィルター上の有機物の除去を行った（４０℃３分）。
　水洗後、非シアン系の無電解ＡｕめっきであるＨＧＳ―１００（日立化成製商品名）から金供給源である亜硫酸金を抜いた液により８０℃１０分の条件で置換金めっき前処理を行った。
　次に非シアン系の置換型無電解ＡｕめっきであるＨＧＳ―１００（日立化成製商品名）に８０℃２０分浸漬し、置換金めっきを行った。置換金めっきの厚みは０．０５μｍであった。
　水洗後、非シアン系還元型無電解ＡｕめっきであるＨＧＳ―５４００（日立化成製商品名）に６５℃１０分浸漬し、金めっきを行い、水洗後乾燥を行った。金めっきのトータル厚みは０．２μｍであった。これにより、金属フィルターが作成される。
（表面処理）
　分子内にカルボキシル基を有するジチオジプロピオン酸８ｍｍｏｌをメタノール２００ｍＬに溶解させて反応液を作製した。次に金めっき後の金属フィルターを上記反応液に加え、室温で２時間反応させた後、メタノールで洗浄することで表面にカルボキシル基を有するフィルターを作製した。
　分子内に多数のアミノ基を有する分子量７万のポリエチレンイミン０．３ｗｔ％水溶液に上記カルボキシル基を有する金属フィルターに１５分浸漬し、洗浄することで、表面にアミノ基を有するフィルターを作製した。
　ＭＰＣモノマーとカルボキシル基を有するモノマーの共重合体ポリマーのＢＬ４０５（日油株式会社製：商品名）を０．３ｗｔ％含むメタノール溶液に上記表面にアミノ基を有するフィルターを１５分浸漬し、洗浄を行い、最後に真空乾燥機にて８０℃３０分処理を行うことで、カルボキシル基とアミノ基の脱水縮合を促し、金属フィルターの表面に生体適合性ポリマーが強固に化学結合している生体物質捕獲用のフィルター１を作製した。
（フィルター２）
　ＢＬ４０５の処理濃度を０．１ｗｔ％にした以外はフィルター１と同様の条件で生体物質捕獲用のフィルター２を作製した。
（フィルター３）
　ＢＬ４０５の処理濃度を０．０３ｗｔ％にした以外はフィルター１と同様の条件で生体物質捕獲用のフィルター３を作製した。
（フィルター４）
　表面処理の工程を以下に示す方法に変更した以外はフィルター１と同様の条件で生体物質捕獲用のフィルター４を作製した。
（フィルター４の表面処理）
　分子内にアミノ基を有する２－アミノエタンチオール８ｍｍｏｌをメタノール２００ｍＬに溶解させて反応液を作製した。次に金めっき後の金属フィルターを上記反応液に加え、室温で２時間反応させた後、メタノールで洗浄することで表面にアミノ基を有するフィルターを作製した。
　分子内に多数のカルボキシル基を有する分子量１０万のポリアクリル酸０．３ｗｔ％水溶液に上記カルボキシル基を有する金属フィルターに１５分浸漬し、洗浄することで、表面にカルボキシル基を有するフィルターを作製した。
　ＭＰＣモノマーとアミノ基を有するモノマーの共重合体ポリマーのＢＬ５０２（日油株式会社製：商品名）を０．３ｗｔ％含むメタノール溶液に上記表面にカルボキシル基を有するフィルターを１５分浸漬し、洗浄を行い、最後に真空乾燥機にて８０℃３０分処理を行うことで、カルボキシル基とアミノ基の脱水縮合を促し、フィルター表面に生体適合性ポリマーが強固に化学結合している生体物質捕獲用のフィルター４を作製した。
（フィルター５）
　２段階の金めっきの代わりに１段階の無電解白金めっきを行った以外はフィルター１と同様にフィルターを作製した。無電解白金めっき液にはレクトレスＰｔ１００（日本エレクトロプレイティング・エンジニヤース株式会社製：商品名）を用いた。白金の厚みは０．１μｍであった。
（フィルター６）
　２段階の金めっきの代わりに１段階の無電解パラジウムめっきを行った以外はフィルター１と同様にフィルター６を作製した。無電解パラジウムめっき液にはパラデックスストライク３（日本エレクトロプレイティング・エンジニヤース株式会社製：商品名）を用いた。パラジウムの厚みは０．１μｍであった。
（フィルター７）
電気Ｎｉめっきの変わりに電気パラジウムめっきを用いた以外はフィルター１と同様にフィルター７を作製した。電気パラジウムめっき液はパラディックスＬＦ－５（日本エレクトロプレイティング・エンジニヤース株式会社：商品名）を用いた。めっき温度は５０℃、電流密度１Ａ／ｄｍ２の条件でめっきを行い、約４．２分／μｍの条件で約２０μｍとなるように電気めっきを行った以外はフィルター１と同様の条件でめっきを行った。
（フィルター８）
　ＭＣＬのピーラブル銅箔の代わりにピーラブルニッケル箔を用いた（電気めっき後はニッケル箔を除去）。さらに電気Ｎｉめっきの変わりに電気銅めっきを用いた以外はフィルター１と同様に表面処理フィルター８を作製した。電気銅めっき液はミクロファブＣｕ２００（日本エレクトロプレイティング・エンジニヤース株式会社：商品名）を用いた。めっき温度は２５℃、電流密度３Ａ／ｄｍ２の条件でめっきを行い、約１．５分／μｍの条件で約２０μｍとなるように電気めっきを行った以外はフィルター１と同様の条件でめっきを行った。
（フィルター９）
　表面処理を行わなかったこと以外はフィルター１と同様にフィルター９を作製した。
（フィルター１０）
　金めっきを行わなかったこと以外はフィルター１と同様にフィルター１０を作製した。
（フィルター１１）
　ＢＬ４０５の代わりに疎水性で反応性の官能基を有さないＭＰＣ含有ポリマーであるＣＭ５２０６（日油株式会社製：商品名）を用いた以外はフィルター１と同様にフィルター１１を作製した。
（フィルター１２）
　ジチオジプロピオン酸処理を省略した以外はフィルター１と同様にフィルター１２を作製した。
（フィルター１３）
　ジチオジプロピオン酸処理とポリエチレンイミン処理を省略した以外はフィルター１と同様にフィルター１３を作製した。
（フィルター１４）
　ＢＬ４０５の代わりに疎水性で反応性の官能基を有さない純粋なＭＰＣポリマーであるＢＬ２０３（日油株式会社製：商品名）を用いた以外はフィルター１と同様にフィルター１４を作製した。
（実験）
（非小細胞癌細胞株の調整）
　非小細胞癌細胞株であるＮＣＩ－Ｈ３５８細胞を１０％、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地にて、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて静置培養した。トリプシン処理により培養皿から細胞を剥離させて回収し、リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）を用いて洗浄した後に、１０μＭ　ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ　Ｒｅｄ　ＣＭＴＰＸ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）にて３７℃、３０分間静置させることで、ＮＣＩ－Ｈ３５８細胞を染色した。その後、ＰＢＳにて洗浄し、トリプシン処理にて３７℃にて３分間静置させることで、細胞塊を解離させた。その後、培地にてトリプシン処理を停止させ、ＰＢＳにて洗浄後、２ｍＭＥＤＴＡ及び０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（以下２ｍＭ　ＥＤＴＡ－０．５％　ＢＳＡ－ＰＢＳという。）に懸濁した。尚、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水であり和光純薬工業製製品コード１６６－２３５５５を用いた。ＢＳＡはＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製（Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎａｍｅ　：　Ａｌｂｕｍｉｎ　ｆｒｏｍ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ－Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ　ｐｏｗｄｅｒ，　Ｂｉｏ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ｆｏｒ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ）のものを用いた。ＥＤＴＡは２Ｎａ（エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，，Ｎ’－４酢酸二ナトリウム塩二水和物）（和光純薬工業製製品コード３４５－０１８６５）を用いた。
（血液サンプル中のＣＴＣの濃縮）
（評価例１）
　フィルター１をカートリッジにセットしたＣＴＣ回収装置：ＣＴ６０００（日立化成製商品名）を用いて実験を行った。ＣＴＣ回収装置は血液サンプルや試薬を導入するための流路を備えており、流路の入り口は、シリンジを加工して作製したリザーバーに接続した。フィルターがセットされたカートリッジは、上記実施形態における生体物質捕獲システムに相当する。このリザーバーに、血液サンプルや試薬を順次投入していくことで、ＣＴＣの捕捉、染色、洗浄などの操作を連続的に容易に行えるようにした。
　ＣＴＣ回収装置に血液サンプルを導入して癌細胞を濃縮した。血液サンプルとして細胞安定液を含む真空採血管であるＣｅｌｌ　Ｆｒｅｅ　ＤＮＡ（Ｓｔｒｅｃｋ社製：商品名）に採血した健常者血液に、血液１ｍＬあたり１０００個の癌細胞を含有させたサンプルを用いた。癌細胞としては、上記のヒト非小細胞肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ３５８を使用した。尚、血液は採血後６時間のものを用いた。
　リザーバーに、２ｍＭ　ＥＤＴＡ－０．５％　ＢＳＡ－ＰＢＳ　１ｍＬ（以下洗浄液）を導入し、フィルター上を満たした。連続して、ぺリスタルティックポンプを使用して流速２００μＬ／分で送液を開始した。その後、血液１ｍＬを投入した。約５分後、リザーバーに２ｍＬの２ｍＭ　ＥＤＴＡ－０．５％　ＢＳＡ－ＰＢＳを導入して細胞の洗浄を行った。
　次に洗浄液に４％ＰＦＡを溶かした液をカートリッジに入れ、細胞を１５分浸した。
　洗浄後、洗浄液に０．２％ＴｒｉｔｏｎＸを溶かした液をカートリッジに入れ、細胞を１５分浸した。
　さらに１０分後、ポンプ流速を２０μＬ／分に変更し、リザーバーに６００μＬの細胞染色液（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２：３０μｌ、Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ：３００ｍＬ）を導入し、フィルター上の癌細胞または白血球を蛍光染色した。フィルター上に捕捉された細胞に対して３０分間染色を行った後、リザーバーに１ｍＬの２ｍＭ　ＥＤＴＡ－０．５％　ＢＳＡ－ＰＢＳを導入して細胞の洗浄を行った。
　続いて、コンピューター制御式電気ステージ及び冷却デジタルカメラ（ＤＰ７０、オリンパス株式会社）を装備した蛍光顕微鏡（ＢＸ６１、オリンパス株式会社）を使用してフィルターを観察し、フィルター上の癌細胞及び白血球の数をカウントした。
　Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２及びＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ　Ｒｅｄ　ＣＭＴＰＸ由来の蛍光を観察するために、それぞれＷＵ及びＷＩＧフィルター（オリンパス株式会社）を用いて画像を取得した。画像取得及び解析ソフトにはＬｕｍｉｎａ　Ｖｉｓｉｏｎ（三谷商事株式会社）を用いた。結果を表１に示す。細胞回収率（％）＝フィルターに回収された癌細胞数／血液サンプルに混合した癌細胞数×１００％。白血球の数はＨｏｅｃｈｓｔ　３３３４２で染色された細胞数からがん細胞数を引くことで算出した。以上の方法で評価例１に係る実験を行った。
（評価例２～１４）
　評価例１で使用したフィルター１の代わりにフィルター２～１４を用いた以外は評価例１と同様の条件で評価例２～１４に係る実験を行った。
（ＸＰＳの測定）
　表３に示す条件で、フィルター１について表面の元素分析を行った。その測定結果例を表４に示す。表４に示すように、ほぼＡｕが覆われていることが確認できた。以下Ａｕに注目してフィルター２～１４の測定を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（接触角）
　評価例１～１４それぞれについて、フィルターの接触角の測定を行った。測定はＪＩＳ　Ｒ３２６５　「基板ガラス表面の濡れ性試験方法」に準拠した装置（ＤＭ７０１　協和界面科学株式会社製、商品名）で行った。液滴の大きさは２μＬ、液滴投下から測定までの時間は３０秒とした。
（結果）
結果を表５及び表６に示す。表５では、各評価例に係るフィルターの種類、材質、表面処理１～３に係る情報を示し、表６では、接触角、Ａｕに係る元素分析の結果、白血球数、ＮＣＩ－Ｈ３５８の回収率及び気泡に係る評価の結果を示している。なお、気泡に係る「Ａ」とは、カートリッジ内にほとんど気泡が発生しなかったことを示す。また、「Ｂ」とはカートリッジ内の一部（５体積％未満）に気泡が発生したことを示す。また、「Ｃ」とは結果Ｂよりも多く（カートリッジ内の５体積％以上）気泡が発生したことを示している。
　評価例１に示すように、金めっきフィルター（金属フィルター）上に生体適合性ポリマーを化学的結合させるべく処理すると、白血球数が比較的少なく、がん細胞の回収率も高い。この場合、ポリマーの金属フィルターに対する被覆率も高い（金の元素比率が低い）。接触角も低いので、気泡発生が抑制できる。
　評価例２～３ではＢＬ４０５処理時のポリマー濃度を薄くし、生体適合性ポリマーによる吸着厚を薄くしている。この場合、ポリマーの被覆率が低い（金の元素比率が高い）。金の元素比率が５ａｔ％を超えると、白血球数が増え回収率が低下する（評価例３）。
　評価例４ではカチオンとアニオンの処理順を変更し、金めっきフィルター上に生体適合性ポリマーを化学的結合させている。この場合も評価例１同様に白血球数が比較的少なく、がん細胞の回収率も高い。
　評価例５、６は金めっきの代わりにＰｔ、Ｐｄめっきを行っている。Ｐｔ、Ｐｄの場合もＡｕめっきに近い効果が得られる。
　評価例７、８はバルクの金属をＮｉからＰｄ、Ｃｕに変更している。バルクの金属がＰｄ、Ｃｕの場合、Ｎｉよりもやや特性が良好である。
　評価例９は金属フィルターの表面処理を行わなかった場合である。この場合、白血球数が増え回収率が低下する。疎水性も高く、気泡が発生した。
　評価例１０はＡｕめっきを行わなかった場合である。この場合、Ｎｉ酸化皮膜の影響でポリマーの被覆率が低く（金の元素比率が高い）、白血球数が増え回収率が低下する。評価例１１は反応性官能基を有さないＭＰＣポリマー（ＣＭ５２０６）を被覆した場合である。この場合、接触角が極端に高くなり、気泡が発生しやすくなる。白血球数が増え回収率が低下する。
　評価例１２、１３はそれぞれ表面処理の一部或いは複数を省略した場合である。特に評価例１３は化学吸着性が低く、ポリマーが剥離しやすくなるので、特性が低下する。評価例１４はＭＰＣのホモポリマーを用いた場合である。若干フィルターとの化学反応性が低下し、ポリマーの被覆率が低く（金の元素比率が高い）なった。
　以上示したように、貴金属表面に生体適合性ポリマーを化学的に反応させることで、従来のフィルターよりも特性が向上することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　１…ＭＣＬ、２…ピーラブル銅箔、２’…銅板、３…フォトレジスト、３ａ…フォトレジスト露光部分（露光部）、３ｂ…フォトレジスト現像部分、４…フォトマスク、５…めっき層、６…貫通孔、７…金めっき層。
 

Claims (16)

  1. 　金、白金、パラジウム、又はこれらの合金から成る金属フィルターと、
    　前記金属フィルターの表面に化学結合された生体適合性ポリマーと、
    　を有する生体物質捕獲用フィルター。
  2. 　前記フィルター表面の純水の接触角が６０度以下である請求項１に記載の生体物質捕獲用フィルター。
  3. 　Ｘ線光電子分光装置による測定で求められる前記金属フィルター表面における金属の割合が１０ａｔ％以下である請求項１又は２に記載の生体物質捕獲用フィルター。
  4. 　前記生体適合性ポリマーが２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンのホモポリマー（ＭＰＣ）、又は、当該ＭＰＣを含む共重合体である請求項１～３のいずれか一項に記載の生体物質捕獲用フィルター。
  5. 　前記生体適合性ポリマーと前記金属フィルター表面がアミド結合によって結合している請求項１～３のいずれか一項に記載の生体物質捕獲用フィルター。
  6. 　前記ＭＰＣを含む共重合体がカルボキシル基を有し、表面にアミノ基を有する前記金属フィルターと結合している請求項４に記載の生体物質捕獲用フィルター。
  7. 　前記表面にアミノ基を有する前記金属フィルターとは、表面にアミノ基を有するポリマーが吸着されている前記金属フィルターである請求項５に記載の生体物質捕獲用フィルター。
  8. 　前記アミノ基を有するポリマーが、ポリエチレンイミンである請求項６に記載の生体物質捕獲用フィルター。
  9. 　前記アミノ基を有するポリマーが、表面にカルボキシル基を有する前記金属フィルターに対して結合している請求項７に記載の生体物質捕獲用フィルター。
  10. 　前記カルボキシル基を有する前記金属フィルターとは、金属表面が、カルボキシル基を有するチオールにより処理されている前記金属フィルターである請求項８に記載の生体物質捕獲用フィルター。
  11. 　前記ＭＰＣを含む共重合体がアミノ基を有し、表面にカルボキシル基を有する前記金属フィルターと結合している請求項４に記載の生体物質捕獲用フィルター。
  12. 　前記表面にカルボキシル基を有する前記金属フィルターとは、表面に吸着したカルボキシル基を有するポリマーが吸着されている前記金属フィルターである請求項１０に記載の生体物質捕獲用フィルター。
  13. 　前記カルボキシル基を有するポリマーが、ポリアクリル酸である請求項１１に記載の生体物質捕獲用フィルター。
  14. 　前記カルボキシル基を有するポリマーが、表面にアミノ基を有する前記金属フィルターに対して結合している請求項１２に記載の生体物質捕獲用フィルター。
  15. 　表面にアミノ基を有する前記金属フィルターとは、金属表面が、アミノ基を有するチオールにより処理されている前記金属フィルターである請求項１４に記載の生体物質捕獲用フィルター。
  16. 　請求項１～１５のいずれか一項に記載の生体物質捕獲用フィルターを用いた生体物質捕獲システム。
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