[go: up one dir, main page]

WO2016031971A1 - 細胞捕捉方法、特定細胞捕捉済デバイスの製造方法、及び特定細胞含有溶液の製造方法 - Google Patents

細胞捕捉方法、特定細胞捕捉済デバイスの製造方法、及び特定細胞含有溶液の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2016031971A1
WO2016031971A1 PCT/JP2015/074457 JP2015074457W WO2016031971A1 WO 2016031971 A1 WO2016031971 A1 WO 2016031971A1 JP 2015074457 W JP2015074457 W JP 2015074457W WO 2016031971 A1 WO2016031971 A1 WO 2016031971A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
liquid
cell
flowing
filter
introduction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2015/074457
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
理美 八木
高井　健次
得仁 菊原
アンソニー エイチ ツァイ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Resonac Corp
Original Assignee
Hitachi Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hitachi Chemical Co Ltd filed Critical Hitachi Chemical Co Ltd
Priority to SG11201701562WA priority Critical patent/SG11201701562WA/en
Priority to KR1020177006879A priority patent/KR20170042685A/ko
Priority to JP2016545642A priority patent/JPWO2016031971A1/ja
Priority to CN201580046028.1A priority patent/CN106795476A/zh
Priority to US15/507,346 priority patent/US20170282180A1/en
Priority to EP15835573.5A priority patent/EP3187578A4/en
Publication of WO2016031971A1 publication Critical patent/WO2016031971A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G01N33/491—Blood by separating the blood components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/14—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus with filters, sieves or membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/02—Separating microorganisms from the culture medium; Concentration of biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
    • C12N5/0087—Purging against subsets of blood cells, e.g. purging alloreactive T cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
    • C12N5/0093—Purging against cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4044—Concentrating samples by chemical techniques; Digestion; Chemical decomposition
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48728—Investigating individual cells, e.g. by patch clamp, voltage clamp
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/0074—Biological products
    • B01J2219/00743—Cells
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • G01N2001/4088—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids filtration

Definitions

  • the present invention when only specific cells are captured and detected from a cell-containing solution containing two or more types of cells and blood by a filtration system, the specified cells are identified without causing damage.
  • the present invention relates to a method for capturing specific cells, a method for capturing specific cells, a method for manufacturing a specific cell-captured device after capturing the captured specific cells, and a method for manufacturing a solution containing the captured specific cells.
  • CTC circulating tumor cells
  • Patent Document 1 a method for efficiently detecting a small amount of CTC by using a resin filter using parylene has been proposed.
  • Patent Document 2 a method of improving the strength of the filter by using a filter using metal instead of resin and separating it by the difference in leukocyte and cancer cell deformability has been proposed (Patent Document 2).
  • the specific cell In the process of extracting a specific cell such as a rare cell from a cell-containing solution containing blood and two or more types of cells using filtration technology, the specific cell is not damaged. It is desired to capture and concentrate only cells.
  • conventionally known filtering methods can efficiently remove white blood cells, red blood cells, and plasma plates in blood, but since white blood cells are close in size to cancer cells, they cannot remove all.
  • the filter method is a method of separation based on the difference in leukocyte size and cancer cell size and deformability.
  • leukocytes and cancer cells can be separated considerably by devising the filter material, pore shape, pore diameter, aperture ratio, and flow rate.
  • the present invention includes a cell capturing method for capturing specific cells by filtration without taking out damage to the captured cells, a method for producing a specific cell-captured device for extraction, and the captured cells It is an object of the present invention to provide a method for producing a specific cell-containing solution.
  • the inventors have continuously replaced the liquid in the cartridge (cell trapping device) without pulling it out until the cell is analyzed and detected after the cell is trapped by filtration. It was possible to take out the cells without damaging them. According to the method of the present invention, it is possible to prevent the cells from being caught in the pores and the deformation of the cells, so that it is possible to expect a high recovery efficiency of the cells and recovery of the cells with less damage.
  • the treatment is carried out with the liquid level left above the average surface diameter of the target captured cells from the filter surface. It becomes possible to take out without damaging the cell by preventing the cell from being deformed by being caught in the cell.
  • the cell trapping method has a predetermined volume and a liquid selected from a cell-containing solution containing two or more types of cells and a treatment liquid for treating cells in the cell-containing solution. Provided on the flow path between the introduction area and the discharge flow path, and a liquid passage through which the liquid passes. And filtering the liquid using a cell trapping device having a plurality of through-holes formed in the thickness direction, thereby allowing specific cells contained in the cell-containing solution on the filter surface.
  • a cell capturing method for selectively capturing the method comprising flowing the liquid to the cell capturing device n times (n is a natural number), wherein the liquid is passed from the first time to the nth time.
  • the liquid level of the liquid in the introduction region on the filter maintains a predetermined liquid level height, and the liquid level having a predetermined height is applied to the filter at the end of the nth flow of the liquid.
  • the discharge of the liquid from the cell capture device is stopped in a state having
  • the casing may include an upper lid installed above the introduction area and the liquid introduction flow path.
  • the cleaning liquid Before the first flow of the liquid, the cleaning liquid may be filled upstream from the filter including the inside of the introduction region of the housing in advance.
  • the step of flowing the liquid includes a step of flowing a fixing solution, a step of flowing a permeate, a step of flowing a staining solution, and a step of flowing a washing solution, and a step of flowing the cell-containing solution. It can be set as the aspect containing.
  • the n may be 1, and the step of flowing the liquid may be a step of flowing the cell-containing solution.
  • the liquid to be flown at the first time may be a cell-containing solution
  • the liquid to be flowed at the second time may be a cleaning liquid
  • At least a part of cells to be captured may be immersed in the liquid in the introduction region on the filter.
  • the liquid level of the liquid in the introduction region on the filter may be larger than the size of the cell to be captured.
  • the liquid level of the liquid in the introduction region on the filter may be 50 ⁇ m or more.
  • the solvent of the cell-containing solution may be an embodiment consisting of mammalian whole blood, serum, plasma, or an aqueous solution containing a protein derived therefrom.
  • the filter may be processed using a polymer material or a metal.
  • the liquid in the step of flowing the liquid, can be introduced into the cell capturing device at a speed of 50 to 1000 ⁇ L / min.
  • the method for manufacturing a specific cell-trapped device includes a cell-containing solution having a predetermined volume and containing two or more types of cells, and a process for processing the cells in the cell-containing solution.
  • a housing including an introduction area for introducing a liquid selected from the liquid into the interior, a discharge flow path for discharging the liquid to the outside
  • a filter in which a plurality of through-holes for allowing the liquid to pass are formed in a thickness direction, and the liquid is filtered using a cell trapping device, and is included in the cell-containing solution on the filter surface.
  • a specific cell-captured device for producing a specific cell-captured device that selectively captures specific cells wherein the step of flowing the liquid to the cell-capture device is performed n times ( Is a natural number), and the liquid level of the liquid in the introduction region on the filter is maintained at a predetermined liquid level in the first to nth flow of the liquid.
  • the discharge of the liquid from the cell trapping device is stopped in a state where the filter has a liquid surface having a predetermined height at the end of the n-th flow of the liquid.
  • the casing may include an upper lid installed above the introduction area and the liquid introduction flow path.
  • the cleaning liquid Before the first flow of the liquid, the cleaning liquid may be filled upstream from the filter including the inside of the introduction region of the housing in advance.
  • the step of flowing the liquid includes a step of flowing a fixing solution, a step of flowing a permeate, a step of flowing a staining solution, and a step of flowing a washing solution, and a step of flowing the cell-containing solution. It can be set as the aspect containing.
  • the n may be 1, and the step of flowing the liquid may be a step of flowing the cell-containing solution.
  • the liquid to be flown at the first time may be a cell-containing solution
  • the liquid to be flowed at the second time may be a cleaning liquid
  • At least a part of cells to be captured may be immersed in the liquid in the introduction region on the filter.
  • the liquid level of the liquid in the introduction region on the filter may be larger than the size of the cell to be captured.
  • the liquid level of the liquid in the introduction region on the filter may be 50 ⁇ m or more.
  • the solvent of the cell-containing solution may be an embodiment consisting of mammalian whole blood, serum, plasma, or an aqueous solution containing a protein derived therefrom.
  • the filter may be processed using a polymer material or a metal.
  • the liquid in the step of flowing the liquid, can be introduced into the cell capturing device at a speed of 50 to 1000 ⁇ L / min.
  • the method for producing a specific cell-containing solution includes a cell-containing solution having a predetermined volume and containing two or more types of cells, and a treatment liquid for treating cells in the cell-containing solution.
  • a housing including an introduction area for introducing the liquid selected from the above, a discharge flow path for discharging the liquid to the outside, A filter in which a plurality of through-holes through which the liquid passes are formed in the thickness direction, and the liquid is filtered using a cell trapping device, so that the liquid is contained in the cell-containing solution on the filter surface.
  • a method for producing a specific cell-containing solution obtained by selectively capturing specific cells wherein the liquid is flown through the cell-capturing device n times (n is a natural number).
  • the step of flowing the liquid from the step of flowing the liquid to the nth time the step of flowing the liquid in the nth time while maintaining the liquid level of the liquid in the introduction region on the filter at a predetermined liquid level.
  • the step of collecting the liquid present in the casing may include a step of sucking the liquid in the introduction region from the introduction region side.
  • the housing includes an upper lid installed above the introduction region and the liquid introduction flow path, and the step of recovering the liquid existing in the housing is directed from the discharge flow path toward the introduction flow path. It can be set as the aspect including the process of performing liquid feeding.
  • the liquid flow rate from the discharge channel to the introduction channel may be 50 to 1000 ⁇ L / min.
  • the case includes an upper lid installed above the introduction region and two or more liquid introduction channels, and the step of recovering the liquid existing in the case includes two or more introduction channels. It can be set as the aspect including the process of sending the liquid from the 1st introduction flow path contained to the introduction flow path different from the 1st introduction flow path among the two or more introduction flow paths.
  • the flow rate of liquid feeding from the first introduction flow path included in the two or more introduction flow paths to the introduction flow path different from the first introduction flow path among the two or more introduction flow paths is 50 to 1000 ⁇ L / min. It can be set as the aspect which is.
  • the cleaning liquid Before the first flow of the liquid, the cleaning liquid may be filled upstream from the filter including the inside of the introduction region of the housing in advance.
  • the step of flowing the liquid includes a step of flowing a fixing solution, a step of flowing a permeate, a step of flowing a staining solution, and a step of flowing a washing solution, and a step of flowing the cell-containing solution. It can be set as the aspect containing.
  • the n may be 1, and the step of flowing the liquid may be a step of flowing the cell-containing solution.
  • the liquid to be flown at the first time may be a cell-containing solution
  • the liquid to be flowed at the second time may be a cleaning liquid
  • At least a part of cells to be captured may be immersed in the liquid in the introduction region on the filter.
  • the liquid level of the liquid in the introduction region on the filter may be larger than the size of the cell to be captured.
  • the liquid level of the liquid in the introduction region on the filter may be 50 ⁇ m or more.
  • the cell capturing method is a method for selectively capturing specific cells from a cell-containing solution containing two or more types of cells.
  • a cell capture device is used.
  • a housing including an introduction region having a predetermined volume, a discharge channel for discharging the liquid introduced from the introduction region to the outside, the introduction region and the discharge channel And a filter in which a plurality of through-holes for allowing the liquid to pass therethrough are formed in the thickness direction.
  • a treatment solution such as a fixing solution, a permeation solution, a staining solution, or a washing solution is passed through the cell capture device to perform a process for observing the captured cells.
  • a treatment solution such as a fixing solution, a permeation solution, a staining solution, or a washing solution is passed through the cell capture device to perform a process for observing the captured cells.
  • a treatment solution such as a fixing solution, a permeation solution, a staining solution, or a washing solution is passed through the cell capture device to perform a process for observing the captured cells.
  • a specific cell captured device A cell capture device in which specific cells are captured on a filter is referred to as a specific cell captured device.
  • the cell-containing solution is defined as a solution containing two or more types of cells.
  • Examples of the cell-containing solution include human blood and a solution containing human blood.
  • the cells in the cell-containing solution are cells existing in human blood, and two or more types of cells are targets. Specifically, human leukocytes, circulating tumor cells (CirculatingcTumor Cell: CTC), circulating endothelial cells (Circulating Endothelial Cell: CEC), and cancer stem cells.
  • CTC circulating tumor cells
  • CEC circulating endothelial cells
  • cancer stem cells circulating endothelial cells.
  • the solvent of the cell-containing solution is preferably composed of mammalian whole blood, serum or plasma, or an aqueous solution containing a protein derived therefrom, more preferably a protein derived from bovine, horse, or human, more preferably derived from human. More preferably, it is a protein.
  • the aqueous solution preferably contains a phosphate buffer as a main component.
  • an anticoagulant is added to the aqueous solution containing the protein.
  • the anticoagulant is preferably EDTA, heparin, sodium citrate, or sodium fluoride.
  • Specified cells to be captured by the cell capturing device are cells existing in human blood. Specifically, human leukocytes, circulating tumor cells in blood, circulating endothelial cells, and cancer stem cells.
  • the specific cell-containing solution is defined as a solution prepared after capturing specific cells from a cell-containing solution containing two or more types of cells using a cell capturing device.
  • the ratio of the trapped specific cells to the cells other than the specific cells is higher than that of the original cell-containing solution.
  • the specific cell-containing solution is obtained by collecting the liquid remaining in the specific cell-captured device after the specific cell is captured in the cell-capture device.
  • the cell trapping device will be described with reference to FIG. 1 and FIG.
  • the cell trapping device has a housing and a filter. First, the case will be described.
  • the casing in the cell trapping device of the present embodiment can introduce a liquid into the inside and discharge the liquid that has passed through the filter to the outside. Furthermore, an introduction region having a predetermined volume is provided in the housing so that the liquid level of the liquid staying on the filter can be maintained at a predetermined height.
  • the shape of the cell trapping device is not limited to the one shown in FIG. 1 or FIG.
  • the configuration of the apparatus is not particularly limited as long as specific cells can be captured by filtration of a cell-containing solution using a filter.
  • FIG. 1 shows a cell capture device 10 having an open housing.
  • the cell trapping device 10 includes a filter 11 having a through-hole extending in the thickness direction (vertical direction), an introduction region 12 provided above the filter 11, and a discharge channel 13 provided below the filter.
  • the introduction region 12 and the discharge channel 13 are formed by a casing.
  • the liquid to be introduced is introduced from the introduction region 12 present on the upper part of the filter 11. Since the introduction region 12 is open at the top, it can be introduced directly.
  • the medium for introducing the liquid it is preferable to use a case where the measurement is performed by a measurer and a device for automatically introducing a certain amount of liquid.
  • a device for introducing a certain amount of liquid a semi-automatic device such as a burette and a mechanically controlled automatic device are preferable.
  • the second casing is a sealed casing of a type including an upper lid having one or more introduction flow paths for introducing liquid above the filter and a discharge flow path for discharging liquid to the outside.
  • FIG. 2 shows a cell capture device 20 having a sealed housing.
  • the cell trapping device 20 includes a filter 21 having a through-hole extending in the thickness direction (vertical direction), an introduction region 22 provided above the filter 21, and a discharge channel 23 provided below the filter 21.
  • an upper lid 24 is installed above the introduction region 22, and two introduction passages 25 and 26 are provided for introducing liquid into the introduction region 22 covered by the upper lid 24. Between the upper lid 24 and the filter 21, an introduction region 22 that is a space having a predetermined volume for holding liquid and cells is formed.
  • the introduction channels 25 and 26 are preferably attached above the upper lid 24 or on the side of the upper lid 24.
  • the introduction channel 25 is provided on the side of the upper lid 24 at the connection portion with the introduction region, but the example in which the channel extends upward is shown.
  • a plurality of introduction channels 25 and 26 are provided, contamination between liquids introduced into the cell trapping device 20 (for example, a cell-containing solution and a treatment solution) can be prevented. Therefore, a configuration having two or more introduction channels is preferable.
  • the material is preferably a metal or a polymer material.
  • the main component of the metal any of nickel, silver, palladium, copper, iridium, or an alloy thereof is preferable.
  • the main component of the polymer material those mainly composed of polyethylene terephthalate, polycarbonate, polyimide, polytetrafluoroethylene, polyurethane, polylactic acid, and parylene are preferable.
  • the “main component” means that the proportion of the component in the material constituting the filter is 50% by weight or more.
  • the filters 11 and 21 are formed with a plurality of through holes 11a and 21a through which the liquid passes in the thickness direction. By adjusting the shape and size of these through holes 11a and 21a, specific cells to be captured can be selectively captured.
  • the step of flowing a liquid in the present embodiment refers to introducing a target liquid above the filters 11 and 21 or from a dedicated introduction channel (for example, the introduction channel 25). Thereafter, the liquid is discharged from the discharge passages 13 and 23 after passing through the filters 11 and 21.
  • a method of flowing the liquid suction is desirable, and it is preferable to use a peristaltic pump as power for sucking the liquid.
  • the process of flowing a liquid is performed n times (n is a natural number).
  • the number of steps of flowing the liquid is the number of steps of flowing the cell-containing solution and the step of flowing the treatment solution (the step of flowing the fixing solution, the step of flowing the permeate, the step of flowing the staining solution, and the step of flowing the washing solution) It varies based on the number of one or more steps. That is, when n is 1, only the step of flowing the cell-containing solution is performed.
  • the liquid to be flowed in the first time as a cell-containing solution and the liquid to be flowed in the second time as a cleaning liquid
  • the liquid to be flowed in the first time as a cell-containing solution
  • the liquid to be flowed in the second time as a cleaning liquid
  • processing with various processing liquids can be carried out, so that the effect of processing with a processing liquid other than the cleaning liquid can be improved.
  • the liquid level of the liquid staying in the introduction regions 12 and 22 on the filters 11 and 21 is maintained at a predetermined height in the first to n-th liquid flow processes. It is characterized by that.
  • region on a filter is realizable.
  • the cells staying in the introduction regions 12 and 22 on the filters 11 and 21 have a predetermined liquid level, and the cells It is characterized by stopping the discharge of the liquid from the capturing devices 10 and 20.
  • the predetermined height preferably has a height equal to or greater than the average particle size of the cells intended for capture, and more preferably equal to or greater than the size of the cells to be captured.
  • the liquid level height of the liquid staying in the introduction regions 12 and 22 on the filters 11 and 21 is preferably 50 ⁇ m or more, and more preferably 30 ⁇ m or more.
  • the cleaning liquid is filled in advance in the introduction area and the flow path (introduction flow path, discharge flow path) in the housing, that is, upstream of the filter including the introduction area.
  • the washing solution is preferably a phosphate buffer solution containing bovine serum, and more preferably a phosphate buffer solution containing fetal calf serum.
  • the concentration of bovine serum is preferably 0.1 w / v% to 20 w / v%, more preferably 0.5 w / v% to 10 w / v%.
  • the flow rate at which the cell-containing solution and various treatment solutions pass through the pores of the filter is preferably in the range of 100 to 800 ⁇ L / min, and more preferably in the range of 200 to 600 ⁇ L / min.
  • the shape of the trapped cells is stopped after the liquid is stopped from being discharged from the discharge channel 23 in a state where the casing is filled with liquid after trapping the cells. It becomes possible to use as a container which stores in the state which hold
  • the method of recovering the cell-containing solution present in the casing as a specific cell-containing solution after capturing the cells on the filter of the cell trapping device differs depending on whether it is an open casing or a sealed casing.
  • an aspirator such as a pipette.
  • first method there is a method used when two or more introduction passages are held as in the introduction passages 25 and 26.
  • the one introduction channel (first introduction channel) is the liquid introduction side, and the introduction channel different from the introduction channel used as the liquid introduction side is the liquid discharge side. Liquid.
  • the cell-containing solution containing the specific cells captured by the filter 21 can be recovered from the introduction flow path on the discharge side, and the specific cell-containing solution can be obtained.
  • the liquid feeding speed at this time is preferably in the range of 50 to 1000 ⁇ L / min, and more preferably in the range of 200 to 800 ⁇ L / min. By setting the liquid feeding speed within the above range, the recovery efficiency of specific cells on the filter 21 can be enhanced without damaging the specific cells.
  • the second method includes a method that can be used even when there is only one introduction channel.
  • the discharge flow path is the liquid introduction side
  • the introduction flow path is the liquid discharge side
  • the liquid is fed to collect the cell-containing solution from the discharge flow path set as the discharge side.
  • the liquid feeding speed at this time is preferably in the range of 50 to 1000 ⁇ L / min, and more preferably in the range of 200 to 800 ⁇ L / min.
  • the cell-containing solution when the cell-containing solution is recovered from the sealed casing, it is preferable to give a constant vibration to the casing before feeding.
  • a medium for applying vibration it is preferable to use a mixer, a shaker, or the like.
  • the third method there is a method of sucking in the same manner as the cell trapping device 10 having an open housing.
  • a suction device such as a pipette
  • FIG. 3 is a schematic cross-sectional view showing a method of manufacturing a metal thin film filter using a substrate in which peelable copper foil (Ni foil when copper plating is performed) is bonded to MCL.
  • FIG. 3A shows a substrate in which peelable copper foil 2 (Ni foil when copper plating is performed) is laminated on MCL1. First, this substrate is prepared.
  • the material used as the substrate for producing the filter is preferably copper (nickel when the plating is copper). Copper can be easily removed by chemical dissolution with a chemical solution, and is superior to other materials in adhesion to the photoresist.
  • a photoresist 3 is formed on the peelable copper foil 2 of the substrate.
  • the thickness of this photoresist is preferably 1.0 to 2.0 times the thickness of the subsequent conductor. If this thickness is thin, resist peeling will be difficult later, and if it is thick, circuit formability will be difficult.
  • the photoresist 3 preferably has a thickness of 15 to 50 ⁇ m.
  • a negative photosensitive resin composition is preferable.
  • the negative photosensitive resin composition preferably contains at least a binder resin, a photopolymerizable compound having an unsaturated bond, and a photopolymerization initiator.
  • the photoresist is exposed. Thereby, the exposure part 3a is formed in the area
  • the photoresist development and removal of the unexposed portion 3b is performed with an alkaline solution or the like. Thereby, the exposure part 3a remains in the position corresponding to the through-hole of a filter.
  • a plating layer 5 is formed by performing electrolytic plating on a portion not covered with the photoresist. This plated portion becomes the material of the filter.
  • peelable copper foil 2 on which plating layer 5 has been formed by electrolytic plating is peeled off from MCL1.
  • the peelable copper foil 2 is removed by chemical dissolution with a chemical solution, and the free-standing film formed by the exposed portion 3a and the plating layer 5 is taken out.
  • the exposed portion 3 a made of the photoresist remaining in the free-standing film is removed, and a through hole 6 is formed in the plating layer 5.
  • electroless gold plating is performed to form a gold plating layer 7 on the filter surface.
  • the filters 11 and 21 used for the cell capture devices 10 and 20 can be manufactured.
  • FIG. 4 is a schematic cross-sectional view showing a method of manufacturing a metal thin film filter using a copper plate (Ni plate when copper plating is performed).
  • the method shown in FIG. 4 is the same as the manufacturing method shown in FIG. 2 except that a copper plate (or Ni plate) 2 'is used instead of the MCL 1 and the peelable copper foil 2 in the method shown in FIG.
  • FIG. 4 (A) shows a step of preparing a copper plate 2 'used as a substrate.
  • FIG. 4B shows a process of laminating the photoresist 3 on the copper plate 2 ′.
  • FIG. 4C shows the photoresist exposure with the photomask 4 overlaid.
  • FIG. 4D shows development removal of the photoresist in the unexposed portion 3b.
  • FIG. 4E shows a step of forming a plating layer by electrolytic plating on a portion of the photoresist not covered with the exposed portion 3a.
  • FIG. 4F shows a process of removing the copper plate 2 ′ by chemical dissolution (chemical etching) with a chemical solution and taking out a self-supporting film formed by the exposed portion 3 a and the plating layer 5.
  • FIG. 4G shows a step of removing the exposed portion 3 a of the photoresist remaining in the free-standing film and forming a through hole 6 in the plating layer 5.
  • FIG. 4H shows a process of performing electroless gold plating and forming a gold plating layer 7 on the filter surface.
  • the filters 11 and 21 used in the cell trapping devices 10 and 20 can be manufactured by using any of the method shown in FIG. 3 and the method shown in FIG.
  • the material of the filter is preferably metal.
  • the main component of the metal any of nickel, silver, palladium, copper, iridium, or an alloy thereof is preferable. These metals can be electroplated.
  • the “main component” indicates that the weight ratio of the component to the total weight of the filter 105 is 50% or more.
  • Palladium and iridium have high redox potential, poor solubility and good characteristics, but have the disadvantage of being expensive.
  • Nickel has a lower oxidation-reduction potential than hydrogen, so it is easily dissolved but is inexpensive.
  • Silver and palladium are noble metals and are relatively inexpensive compared to iridium.
  • the material used as the substrate (copper plate 2 ': see FIG. 4) for producing the filter is preferably copper (nickel when the filter material is copper). Copper can be easily removed by chemical dissolution with a chemical solution, and is superior to other materials in adhesion to the photoresist.
  • copper when the material of a filter is copper is preferable.
  • the formation of the plating layer 5 shown in FIGS. 3E and 4E is performed by electrolytic plating.
  • electrolytic nickel plating Watts bath (mainly nickel sulfate, nickel chloride, boric acid), sulfamic acid bath (mainly nickel sulfamate, boric acid), strike bath (mainly nickel chloride, hydrogen chloride) Etc.
  • Examples of electrolytic silver plating include a bath mainly composed of potassium silver cyanide or potassium tartrate.
  • electrolytic palladium plating examples include a bath made of a water-soluble palladium salt and a naphthalene sulfonic acid compound.
  • Electrolytic iridium plating includes a bath containing a soluble iridium salt containing halogen and alcohols.
  • Examples of the electrolytic copper plating include a bath mainly composed of copper sulfate, sulfuric acid, and chloride ions.
  • Electrolytic plating is performed using these plating baths.
  • the current density during electroplating is preferably in the range of 0.3 to 4 A / dm 2 , and more preferably in the range of 0.5 to 3 A / dm 2 .
  • the location of the resist when plating is the location of the through hole.
  • the opening shape of the through hole include a circle, an ellipse, a square, a rectangle, a rounded rectangle, and a polygon. From the viewpoint of efficiently capturing the target component, a circle, rectangle, or rounded rectangle is preferable. In addition, a rounded rectangle is particularly preferable from the viewpoint of preventing clogging of the filter.
  • the hole diameter of the through hole 6 is set according to the size of the component to be captured.
  • the hole diameter in a shape other than a circle such as an ellipse, a rectangle, or a polygon is the maximum value of the diameter of a sphere that can pass through each through hole.
  • the opening shape is rectangular, as shown in FIG. 5, the short hole diameter on the short side and the long hole diameter on the long side can be defined, but the hole diameter of the through hole 6 is the short hole diameter.
  • the diameter of the through hole is the length of the short side of the rectangle, and when the opening shape is a polygon, the diameter is the diameter of the inscribed circle of the polygon.
  • the opening shape is a rectangle or a rounded rectangle, a gap is formed in the opening in the long side direction of the opening shape even when the cells to be captured are captured by the through-hole 6. Since the liquid can pass through the gap, clogging of the filter can be prevented.
  • the length of the short hole diameter of the metal filter is preferably 5 to 15 ⁇ m, more preferably 7 to 9 ⁇ m.
  • the average aperture ratio of the through holes of the filters 11 and 21 is preferably 3 to 50%, more preferably 3 to 20%, and particularly preferably 3 to 10%.
  • the aperture ratio refers to the ratio of the area occupied by the through hole to the area of the region functioning as a filter (see FIG. 5). That is, the area of the region functioning as a filter is a region (region A1 surrounded by a broken line in FIG. 5) obtained by connecting the outermost portions of the through holes among the plurality of through holes included in the filter. If the aperture ratio is too high, the pressure applied to the white blood cells decreases, and the white blood cell residue increases. If the aperture ratio is low, the amount of blood that can flow is reduced.
  • the thickness of the filters 11 and 21 is preferably 3 ⁇ m to 50 ⁇ m, more preferably 5 ⁇ m to 30 ⁇ m, and particularly preferably 8 ⁇ m to 20 ⁇ m.
  • the film thickness of the filters 11 and 21 is less than 3 ⁇ m, the strength of the filter may be lowered, and handling may be difficult.
  • it exceeds 50 ⁇ m there is a concern that the processing time will be long and the productivity will be reduced, the cost will be disadvantageous due to excessive consumption of materials, and the fine processing itself will be difficult. It becomes difficult for cells other than these cells to pass.
  • the resin layer is peeled off, and the copper foil is etched (FIG. 3) or the copper plate is removed (FIG. 4), thereby plating as shown in FIG. 3 (H) or FIG. 4 (G).
  • the filter with layer 5 is completed.
  • the resist (exposed portion 3a) remaining on the filter is removed with strong alkali.
  • strong alkali 0.1 wt% to 10 wt% NaOH or KOH aqueous solution is preferable.
  • Monoethanolamine (1 to 20 vol%) or the like may be added to promote peeling.
  • the resist can be removed with a solution obtained by adding alkali (0.1 wt% to 10 wt% NaOH or KOH) to sodium permanganate or potassium permanganate.
  • ⁇ Precious metal plating should be applied to the filter from which the resist has been removed.
  • noble metal plating gold, palladium, platinum, ruthenium, indium and the like are desirable.
  • gold is said to have the highest oxidation-reduction potential among all metals as described above, and has no cytotoxicity. There is almost no discoloration during long-term storage.
  • Gold plating can be performed electrolessly or electrolyzed. In the case of electrolysis, it is desirable to carry out electrolysis because the thickness variation becomes large and the pore diameter accuracy of the filter tends to be affected. However, electrolytic gold plating can improve the coverage.
  • Gold plating is effective only by displacement plating, but the combination of displacement plating and reduction plating is more effective.
  • the surface of the metal filter before gold plating may be oxidized. Therefore, the oxide film is removed, but here it is preferable to wash with an aqueous solution containing a compound that forms a complex with a metal ion.
  • an aqueous solution containing cyanides, EDTAs, or citric acids is preferable.
  • citric acids are most suitable as a pretreatment for gold plating.
  • citric acid anhydride, citric acid hydrate, citrate or citrate hydrate may be used.
  • citric acid anhydride, citric acid monohydrate, Sodium citrate, potassium citrate and the like can be used.
  • the concentration is preferably 0.01 mol / L to 3 mol / L, more preferably 0.03 mol / L to 2 mol / L, and particularly preferably in the range of 0.05 mol / L to 1 mol / L. preferable.
  • the adhesiveness of an electroless gold plating layer and a metal filter improves. When it exceeds 3 mol / L, the effect is not improved and it is economically undesirable.
  • the immersion in a solution containing citric acid is preferably performed at 70 ° C. to 95 ° C. for 1 to 20 minutes.
  • the solution containing citric acid it is possible to add a buffer such as a reducing agent and a pH adjusting agent contained in the plating solution as long as the effects of the invention can be obtained.
  • a buffer such as a reducing agent and a pH adjusting agent contained in the plating solution
  • an aqueous solution of citric acid alone is most preferred.
  • the pH of the solution containing citric acid is preferably 5 to 10, more preferably 6 to 9.
  • the pH adjuster is not particularly limited as long as it is an acid or an alkali.
  • As the acid hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid and the like can be used.
  • As the alkali alkali metals such as sodium hydroxide, potassium hydroxide and sodium carbonate can be used. Or the alkaline-earth metal hydroxide solution is mentioned. As described above, it can be used as long as the effect of citric acid is not inhibited.
  • the nitric acid is contained at a high concentration of 100 ml / L in the solution containing citric acid, the effect of improving the adhesiveness is reduced as compared with the case where the solution is treated with the solution containing only citric acid.
  • the reducing agent is not particularly limited as long as it is reducible, and examples thereof include hypophosphorous acid, formaldehyde, dimethylamine borane, and sodium borohydride.
  • the displacement gold plating includes a cyan bath and a non-cyan bath, but the non-cyan bath is desirable in view of environmental load or remaining cytotoxicity.
  • the gold salt contained in the non-cyan bath include chloroaurate, gold sulfite, gold thiosulfate, and gold thiomalate. Only one type of gold salt may be used, or two or more types may be used in combination.
  • a cyan bath has an effect of dissolving a metal too much, some metals are liable to be dissolved to cause pinholes.
  • a non-cyan plating bath is preferable.
  • Gold sulfite is particularly preferred as the gold source.
  • gold sulfite sodium gold sulfite, potassium gold sulfite, gold ammonium sulfite and the like are preferable.
  • the gold concentration is preferably in the range of 0.1 g / L to 5 g / L. If it is less than 0.1 g / L, gold is difficult to precipitate, and if it exceeds 5 g / L, the liquid tends to decompose.
  • the displacement gold plating bath may contain an ammonium salt or ethylenediaminetetraacetate as a gold complexing agent.
  • the ammonium salt include ammonium chloride and ammonium sulfate.
  • the ethylenediaminetetraacetate include ethylenediaminetetraacetic acid, sodium ethylenediaminetetraacetate, potassium ethylenediaminetetraacetate, and ammonium ethylenediaminetetraacetate.
  • the concentration of the ammonium salt is preferably used in the range of 7 ⁇ 10 ⁇ 3 mol / L to 0.4 mol / L. If the concentration of the ammonium salt is outside this range, the liquid tends to become unstable.
  • the concentration of ethylenediaminetetraacetate is preferably used in the range of 2 ⁇ 10 ⁇ 3 mol / L to 0.2 mol / L. If the concentration of ammonium salt is outside this range, the liquid tends to become unstable. .
  • sulfite In order to keep the liquid stable, 0.1 g / L to 50 g / L of sulfite should be contained.
  • the sulfite include sodium sulfite, potassium sulfite, and ammonium sulfite.
  • hydrochloric acid or sulfuric acid When reducing the pH as a pH adjuster, it is preferable to use hydrochloric acid or sulfuric acid. Moreover, when raising pH, it is preferable to use sodium hydroxide, potassium hydroxide, and aqueous ammonia. The pH should be adjusted to 6-7. Outside this range, the stability of the solution or the appearance of the plating is adversely affected.
  • Replacement plating is preferably used at a liquid temperature of 30 to 80 degrees. Outside this range, the stability of the liquid or the appearance of the plating is adversely affected.
  • displacement plating is performed as described above, it is difficult to completely cover the metal with displacement plating. Therefore, next, reduction-type gold plating containing a reducing agent is performed.
  • the thickness of the displacement plating is preferably in the range of 0.02 to 0.1 ⁇ m.
  • gold sulfite and thiosulfate are preferable, and the content thereof is preferably in the range of 1 to 10 g / L as gold. If the gold content is less than 1 g / L, the gold precipitation reaction decreases, and if it exceeds 10 g / L, the stability of the plating solution decreases and the amount of gold consumed increases due to the removal of the plating solution. It is not preferable.
  • the content is more preferably 2 to 5 g / L.
  • the reducing agent examples include hypophosphorous acid, formaldehyde, dimethylamine borane, sodium borohydride, and the like, but a phenyl compound-based reducing agent is more preferable.
  • diamine, p-phenylenediamine, o-toluidine, o-ethylaniline, and p-ethylaniline One or more of these can be used.
  • the content of the reducing agent is preferably 0.5 g / L to 50 g / L. If the content of the reducing agent is less than 0.5 g / L, it tends to be difficult to obtain a practical deposition rate, and if it exceeds 50 g / L, the stability of the plating solution tends to decrease. .
  • the content of the reducing agent is more preferably 2 g / L to 10 g / L, and particularly preferably 2 g / L to 5 g / L.
  • the electroless gold plating solution may contain a heavy metal salt.
  • the heavy metal salt is preferably at least one selected from the group consisting of thallium salt, lead salt, arsenic salt, antimony salt, tellurium salt and bismuth salt.
  • thallium salt examples include inorganic compound salts such as thallium sulfate salt, thallium chloride salt, thallium oxide salt, and thallium nitrate salt, and organic complex salts such as dithallium malonate salt.
  • Lead salts include lead sulfate salt, nitric acid salt, and the like. Examples thereof include inorganic compound salts such as lead salts and organic acetate salts such as acetates.
  • arsenic salts include inorganic compound salts such as arsenic salts and arsenic arsenate trioxide, and organic complex salts.
  • antimony salts include organic complex salts such as antimony tartrate, antimony chloride salts, and antimony oxysulfate. And inorganic compound salts such as salts and antimony trioxide.
  • tellurium salts include inorganic compound salts such as tellurite and tellurate, and organic complex salts.
  • examples of bismuth salts include bismuth (III) sulfate, bismuth chloride (III), and bismuth nitrate (III).
  • organic complex salts such as bismuth (III) oxalate.
  • the above-mentioned heavy metal salts can be used singly or in combination, but the total amount added is preferably 1 to 100 ppm, more preferably 1 to 10 ppm, based on the total capacity of the plating solution. If it is less than 1 ppm, the effect of improving the deposition rate may not be sufficient, and if it exceeds 100 ppm, the stability of the plating solution tends to deteriorate.
  • the electroless gold plating solution may contain a sulfur compound.
  • a sulfur compound in an electroless gold plating solution containing a phenyl compound reducing agent and a heavy metal salt, a sufficient deposition rate can be obtained even at a low temperature of about 60 to 80 ° C.
  • the stability of the plating solution is particularly excellent.
  • sulfur compounds include sulfide salts, thiocyanates, thiourea compounds, mercaptan compounds, sulfide compounds, disulfide compounds, thioketone compounds, thiazole compounds, and thiophene compounds.
  • Examples of the sulfide salt include potassium sulfide, sodium sulfide, sodium polysulfide, potassium polysulfide, and the like.
  • Examples of the thiocyanate include sodium thiocyanate, potassium thiocyanate, potassium dithiocyanate, and the like.
  • Examples of the thiourea compound include thiourea, methylthiourea, dimethylthiourea and the like.
  • Mercaptan compounds include 1,1-dimethylethanethiol, 1-methyl-octanethiol, dodecanethiol, 1,2-ethanedithiol, thiophenol, o-thiocresol, p-thiocresol, o-dimercaptobenzene, m -Dimercaptobenzene, p-dimercaptobenzene, thioglycol, thiodiglycol, thioglycolic acid, dithioglycolic acid, thiomalic acid, mercaptopropionic acid, 2-mercaptobenzozoimidazole, 2-mercapto1-methylimidazole, 2- Examples include mercapto-5-methylbenzimidazole.
  • Examples of the sulfide compound include diethyl sulfide, diisopropyl sulfide, ethyl isopropyl sulfide, diphenyl sulfide, methyl phenyl sulfide, rhodanine, thiodiglycolic acid, thiodipropionic acid, and the like.
  • Examples of the disulfide compound include dimethyl disulfide, diethyl disulfide, disulfide. Examples thereof include propyl disulfide and the like.
  • examples of the thioketone compound include thiosemicarbazide
  • examples of the thiazole compound include thiazole, benzothiazole, 2-mercaptobenzothiazole, 6-ethoxy-2-mercaptobenzothiazole, 2-aminothiazole, 2,1,3- Examples include benzothiadiazole, 1,2,3-benzothiadiazole, (2-benzothiazolylthio) acetic acid, 3- (2-benzothiazolylthio) propionic acid and the like.
  • examples of thiophene compounds include thiophene and benzothiophene. It can be illustrated.
  • Sulfur compounds may be used alone or in combination of two or more.
  • the content of the sulfur compound is preferably 1 ppm to 500 ppm, more preferably 1 ppm to 30 ppm, and particularly preferably 1 ppm to 10 ppm. If the content of the sulfur-based compound is less than 1 ppm, the deposition rate is reduced, poor plating adhesion occurs, and the coating appearance deteriorates. If it exceeds 500 ppm, the concentration management becomes difficult and the plating solution becomes unstable.
  • the electroless gold plating solution preferably contains at least one of a complexing agent, a pH buffering agent and a metal ion concealing agent in addition to the above-described gold salt, reducing agent, heavy metal salt and sulfur compound. Etc. are more preferable.
  • the electroless gold plating solution of this embodiment preferably contains a complexing agent.
  • a complexing agent include non-cyanide complexing agents such as sulfites, thiosulfates, and thiomalates.
  • the content of the complexing agent is preferably 1 g / L to 200 g / L based on the total capacity of the plating solution. When the content of the complexing agent is less than 1 g / L, the gold complexing power decreases and the stability decreases. If it exceeds 200 g / L, the plating stability is improved, but recrystallization occurs in the solution, which is not economically good.
  • the content of the complexing agent is more preferably 20 g / L to 50 g / L.
  • the electroless gold plating solution preferably contains a pH buffer.
  • the pH buffering agent has an effect of keeping the deposition rate constant and stabilizing the plating solution.
  • a plurality of buffering agents may be mixed. Examples of pH buffering agents include phosphates, acetates, carbonates, borates, citrates, sulfates, etc. Among these, boric acid and sulfates are particularly preferable.
  • the content of the pH buffering agent is preferably 1 g / L to 100 g / L based on the total capacity of the plating solution.
  • the content of the pH buffering agent is less than 1 g / L, there is no pH buffering effect, and when it exceeds 100 g / L, recrystallization may occur.
  • a more preferable content is 20 g / L to 50 g / L.
  • a concealing agent in the gold plating solution.
  • a benzotriazole-based compound can be used, and examples of the benzotriazole-based compound include benzotriazole sodium, benzotriazole potassium, tetrahydrobenzotriazole, methylbenzotriazole, and nitrobenzotriazole.
  • the content of the metal ion concealing agent is preferably 0.5 g / L to 100 g / L based on the total capacity of the plating solution.
  • the content of the metal ion concealing agent is less than 0.5 g / L, there is a tendency that the effect of concealing impurities is small and sufficient liquid stability cannot be ensured.
  • it exceeds 100 g / L recrystallization may occur in the plating solution.
  • the range of 2 g / L to 10 g / L is most preferable.
  • the pH of the gold plating solution is preferably in the range of 5-10.
  • the pH of the plating solution is less than 5, sulfite or thiosulfate, which is a complexing agent of the plating solution, may be decomposed to generate toxic sulfite gas.
  • the pH exceeds 10 the stability of the plating solution tends to decrease.
  • the pH of the electroless gold plating solution is preferably in the range of 8-10.
  • gold plating is performed by immersing the filter after replacement gold plating.
  • the plating solution temperature is preferably 50 ° C to 95 ° C. If it is less than 50 ° C., the deposition efficiency is poor, and if it is 95 ° C. or more, the liquid tends to become unstable.
  • the outermost gold plating layer 7 thus formed is preferably made of gold having a purity of 99% by weight or more.
  • the gold purity of the gold plating layer 7 is less than 99% by weight, the cytotoxicity of the contact portion is increased. From the viewpoint of improving reliability, the gold purity of the gold plating layer 7 is more preferably 99.5% by weight or more.
  • the thickness of the gold plating layer 7 is preferably 0.005 to 3 ⁇ m, more preferably 0.05 to 1 ⁇ m, and further preferably 0.1 ⁇ m to 0.5 ⁇ m. By making the thickness of the gold plating layer 7 0.005 ⁇ m or more, elution of the gold plating layer 7 can be suppressed to some extent. On the other hand, even if the thickness exceeds 3 ⁇ m, the effect is not greatly improved.
  • the filter can replace with a metal filter and the filter comprised from a polymeric material can also be used.
  • a polymer material is used as the material of the filter, the shape and hole diameter of the through hole can be controlled more finely because, for example, the moldability is better than that of a metal.
  • polyethylene terephthalate, polycarbonate, polyimide, polytetrafluoroethylene, polyurethane, polylactic acid, parylene, etc. are used as the main component of a filter composed of a polymer material, these materials are characterized by strong antithrombogenicity. Have.
  • a method for producing a filter made of a polymer material is not particularly limited, and for example, a track etching method can be used. Specifically, a polymer film having a thickness corresponding to the thickness of the filter is prepared, and through holes are formed by irradiating the polymer film with an ion beam, medium particle beam, laser light, or the like. To do. Moreover, you may form a through-hole by chemical etching after irradiation as needed. A filter made of a polymer material can be obtained by cutting the polymer film in which the through holes are formed according to the shape of the filter.
  • the filter used in the cell trapping device according to this embodiment can be changed as appropriate.
  • the liquid surface height on the filter may be 30 ⁇ m or more.
  • the whole blood, serum or plasma of mammals is derived from any of bovine, horse and human.
  • the whole blood, serum or plasma of mammals can be in a form derived from human.
  • aqueous solution containing the protein is mainly composed of a phosphate buffer.
  • aqueous solution containing the protein contains an anticoagulant can be used.
  • anticoagulant is any of EDTA, heparin, sodium citrate and sodium fluoride.
  • the cells in the cell-containing solution may be in the form of cells existing in human blood.
  • the cells in the cell-containing solution may include any of human leukocytes, circulating blood tumor cells, circulating vascular endothelial cells, and cancer stem cells.
  • the filter may be formed by molding using polyethylene terephthalate, polycarbonate, or parylene.
  • the filter surface may be gold, platinum, palladium, or an alloy thereof.
  • the filter may have an aspect in which nickel, copper, or palladium is a main component and gold, platinum, palladium, or an alloy thereof is plated on the surface thereof.
  • the outermost layer of the filter may be a noble metal plating having a thickness of 0.05 ⁇ m to 1 ⁇ m.
  • the shape that forms the through hole of the filter may be any of a circle, an ellipse, a rounded rectangle, a rectangle, and a square.
  • the shape in which the through hole of the filter is formed includes one or more of a rectangle and a rounded rectangle, and the length of the short side is 5 ⁇ m to 15 ⁇ m.
  • the film thickness of the filter may be 3 ⁇ m to 50 ⁇ m.
  • the average opening ratio of the through holes may be 0.1% to 50%.
  • the liquid surface height on the filter may be 30 ⁇ m or more.
  • the whole blood, serum, or plasma of mammals can be in an embodiment derived from any of bovine, horse and human.
  • the whole blood, serum or plasma of mammals can be in a form derived from human.
  • aqueous solution containing the protein is mainly composed of a phosphate buffer.
  • aqueous solution containing the protein contains an anticoagulant can be used.
  • anticoagulant is any of EDTA, heparin, sodium citrate and sodium fluoride.
  • the cells in the cell-containing solution may be in the form of cells existing in human blood.
  • the cells in the cell-containing solution may include any of human leukocytes, circulating blood tumor cells, circulating vascular endothelial cells, and cancer stem cells.
  • the filter may be formed by molding using polyethylene terephthalate, polycarbonate, or parylene.
  • the filter surface can be made of gold, platinum, palladium, or an alloy thereof.
  • the filter may be made of nickel, copper, or palladium as a main component, and the surface thereof is plated with gold, platinum, palladium, or an alloy thereof.
  • the outermost layer of the filter may be gold plated.
  • the outermost layer of the filter may be a noble metal plating having a thickness of 0.05 ⁇ m to 1 ⁇ m.
  • the shape that forms the through hole of the filter may be any of a circle, an ellipse, a rounded rectangle, a rectangle, and a square.
  • the shape that forms the through-hole of the filter includes one or more of a rectangle and a rounded rectangle, and the length of the short side may be 5 ⁇ m to 15 ⁇ m.
  • the film thickness of the filter may be 3 ⁇ m to 50 ⁇ m.
  • the average opening ratio of the through holes may be 0.1% to 50%.
  • the liquid surface height on the filter may be 30 ⁇ m or more.
  • the solvent of the cell-containing solution may be an embodiment composed of mammalian whole blood, serum, plasma, or an aqueous solution containing a protein derived therefrom.
  • the embodiment may be such that the whole blood, serum or plasma of mammals is derived from any of bovine, horse and human.
  • the whole blood, serum or plasma of mammals can be in a form derived from human.
  • aqueous solution containing the protein is mainly composed of a phosphate buffer.
  • aqueous solution containing the protein contains an anticoagulant can be used.
  • anticoagulant is any of EDTA, heparin, sodium citrate and sodium fluoride.
  • the cells in the cell-containing solution may be in the form of cells existing in human blood.
  • the cell in the cell-containing solution may be any one of human leukocytes, circulating tumor cells in the blood, circulating vascular endothelial cells, and cancer stem cells.
  • the filter can be in a form that is molded using a polymer or metal.
  • the filter may be molded using polyethylene terephthalate, polycarbonate, or parylene.
  • the filter surface may be gold, platinum, palladium, or an alloy thereof.
  • the filter is mainly composed of nickel, copper, or palladium, and the surface thereof is plated with gold, platinum, palladium, or an alloy thereof.
  • the outermost layer of the filter may be gold plated.
  • the outermost layer of the filter may be a noble metal plating having a thickness of 0.05 ⁇ m to 1 ⁇ m.
  • the shape that forms the through hole of the filter may be any of a circle, an ellipse, a rounded rectangle, a rectangle, and a square.
  • the shape that forms the through-hole of the filter includes one or more of a rectangle and a rounded rectangle, and the length of the short side may be 5 ⁇ m to 15 ⁇ m.
  • the film thickness of the filter may be 3 ⁇ m to 50 ⁇ m.
  • the average opening ratio of the through holes may be 0.1% to 50%.
  • the cell solution and the treatment solution can be introduced at a rate of 50 ⁇ L / min to 1000 ⁇ L / min.
  • Photosensitive resin composition (PHOTEC RD-1225: thickness 25 ⁇ m, manufactured by Hitachi Chemical Co., Ltd.) 250 mm square substrate (MCL-E679F: substrate in which peelable copper foil is bonded to the surface of MCL, manufactured by Hitachi Chemical Co., Ltd.) Laminated on one side. Lamination conditions were performed at a roll temperature of 90 ° C., a pressure of 0.3 MPa, and a conveyor speed of 2.0 m / min.
  • a glass mask designed so that the light transmitting portion has a rounded rectangular shape, a size of 7.8 (short hole diameter) ⁇ 100 (long hole diameter) ⁇ m, and an aperture ratio of 6.7% is used as a substrate photoresist. It was left to stand on the laminate surface.
  • a glass mask in which rounded rectangles facing in the same direction are arranged at a constant pitch in the major axis and minor axis directions was used.
  • ultraviolet rays having an exposure amount of 30 mJ / cm 2 were irradiated from above the substrate on which the glass mask was placed by an ultraviolet irradiation device.
  • the obtained nickel plating layer is peeled off together with the peelable copper foil of the substrate, and this peelable copper foil is chemically dissolved by a chemical solution in a stirring process at a temperature of 40 ° C. for about 120 minutes (MEC BRIGHT SF-5420B, MEC shares).
  • the self-supporting membrane (20 mm ⁇ 20 mm) to be a metal filter was removed.
  • the photoresist remaining in the free-standing film was removed by resist stripping by ultrasonic treatment (P3 Poleve, Henkel) at a temperature of 60 ° C. for about 40 minutes to produce a metal filter having fine through holes.
  • ultrasonic treatment P3 Poleve, Henkel
  • the metal filter was immersed in acidic degreasing solution Z-200 (manufactured by World Metal: trade name), and organic substances on the metal filter were removed (40 ° C. for 3 minutes).
  • HGS-100 (trade name, manufactured by Hitachi Chemical Co., Ltd.), which is a non-cyan substitutional electroless Au plating, at 80 ° C. for 20 minutes to perform substitution gold plating.
  • the thickness of the displacement gold plating was 0.05 ⁇ m.
  • HGS-5400 (trade name, manufactured by Hitachi Chemical Co., Ltd.), which is non-cyan reduced electroless Au plating, at 65 ° C. for 10 minutes, plated with gold, washed with water and dried.
  • the total thickness of the gold plating was 0.2 ⁇ m.
  • Evaluation example 2 A filter according to Evaluation Example 2 was produced in the same manner as in Evaluation Example 1 except that electric palladium plating was used instead of electric Ni plating.
  • Paradix LF-5 (Nippon Electroplating Engineers Co., Ltd .: trade name) was used as the electropalladium plating solution.
  • Plating is performed under the same conditions as in Evaluation Example 1 except that the plating temperature is 50 ° C., the current density is 1 A / dm 2, and the electroplating is performed so as to be about 20 ⁇ m under the condition of about 4.2 minutes / ⁇ m. Went.
  • Evaluation example 4 A filter according to Evaluation Example 4 was produced in the same manner as Evaluation Example 1 except that gold plating was not performed.
  • Evaluation example 5 A filter according to Evaluation Example 5 was produced in the same manner as in Evaluation Example 1 except that one-stage electroless palladium plating was performed instead of the two-stage gold plating.
  • Paradex Strike 3 (manufactured by Nippon Electroplating Engineering Co., Ltd .: trade name) was used as the electroless palladium plating solution.
  • the thickness of palladium was 0.1 ⁇ m.
  • Evaluation example 6 A filter according to Evaluation Example 6 was produced in the same manner as in Evaluation Example 1 except that one-stage electroless platinum plating was performed instead of the two-stage gold plating. Rectres Pt100 (Nippon Electroplating Engineers Co., Ltd. product name) was used as the electroless platinum plating solution. The thickness of platinum was 0.1 ⁇ m.
  • NCI-H358 cells a non-small cell carcinoma cell line, were statically cultured in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • FBS fetal bovine serum
  • Cells were detached from the culture dish by trypsin treatment and recovered, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then washed with 10 ⁇ M CellTracker Red CMTPX (Life Technologies Japan, Inc.) at 37 ° C. for 30 minutes.
  • NCI-H358 cells were stained by allowing to stand. Thereafter, the cells were washed with PBS and allowed to stand at 37 ° C.
  • PBS phosphate buffered saline
  • product code 166-23555 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • BSA bovine serum albumin
  • SIGMA-ALDRICH Product Name: Albumin from bovine serum-Lyophilized powder, Bio Reagent for cell culture.
  • EDTA 2Na (ethylenediamine-N, N, N ′, N′-4 acetic acid disodium salt dihydrate) (product code 345-01865 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
  • Example 1 ⁇ Evaluation of cell morphology when the liquid is continuously extracted without pulling out the liquid> (Example 1) An experiment was performed using a CTC recovery apparatus: CT6000 (trade name, manufactured by Hitachi Chemical Co., Ltd.) in which the filter of Evaluation Example 1 was set in a cartridge (corresponding to the cell trapping device according to this embodiment).
  • the CTC recovery device has a flow channel for introducing a blood sample and a reagent, and the inlet of the flow channel is connected to a reservoir produced by processing a syringe. By sequentially putting blood samples and reagents into this reservoir, operations such as CTC capture, staining, and washing can be performed easily and continuously.
  • a blood sample was introduced into a CTC recovery device to concentrate cancer cells.
  • a blood sample a sample obtained by containing 1000 cancer cells per mL of blood in blood of a healthy person collected in an EDTA-containing vacuum blood collection tube was used.
  • a cancer cell the above human non-small cell lung cancer cell line NCI-H358 was used. The blood used was 6 hours after blood collection.
  • EDTA-0.5% BSA (bovine serum albumin) -PBS (Gibco PBS pH 7.4) 1 ml (hereinafter referred to as a washing solution) was introduced into the reservoir, filled on the filter, and left for 10 minutes. Subsequently, liquid feeding was started at a flow rate of 200 ⁇ L / min using a peristaltic pump. Thereafter, 3 ml of blood was introduced. After about 5 minutes, 9 mL of the washing solution was introduced into the reservoir to wash the cells.
  • BSA bovine serum albumin
  • PBS Gibco PBS pH 7.4
  • the pump flow rate was changed to 20 ⁇ L / min, and 600 ⁇ L of cell staining solution (Hoechst 33342: 30 ⁇ L, Wash buffer: 300 ml) was introduced into the reservoir, and the cancer cells or leukocytes on the filter were fluorescently stained. The cells captured on the filter were stained for 30 minutes, and then 1 mL of 2 mM EDTA-0.5% BSA-PBS was introduced into the reservoir to wash the cells.
  • cell staining solution Hoechst 33342: 30 ⁇ L, Wash buffer: 300 ml
  • a fluorescence microscope BX61, Olympus Corporation
  • DP70 cooled digital camera
  • images were acquired using WU and WIG filters (Olympus Corporation), respectively.
  • Lumina Vision Mitsubishi Corporation was used as image acquisition and analysis software. Image analysis of the captured cells was performed, and the cells were classified into two types: a square cell sandwiched in the hole and a cell holding a circle on the filter.
  • Example 2 The experiment was performed under the same conditions as in Example 1 except that the blood introduction rate was 400 ⁇ L / min.
  • Example 3 The experiment was performed under the same conditions as in Example 1 except that the blood introduction rate was 600 ⁇ L / min.
  • Example 4 The experiment was performed under the same conditions as in Example 1 except that the blood introduction rate was 800 ⁇ L / min.
  • cleaning solution 1 ml of cleaning solution (hereinafter referred to as cleaning solution) was introduced into the reservoir, filled the filter, and allowed to stand for 10 minutes. Subsequently, liquid feeding was started at a flow rate of 200 ⁇ L / min using a perista pump. Thereafter, 3 ml of blood was introduced. After about 5 minutes, 9 mL of the washing solution was introduced into the reservoir to wash the cells. Thereafter, an experiment was performed in the same manner as in Example 1 to stain the cells, and then the liquid in the cell capture device (cartridge) was pulled out at a rate of 200 ⁇ L / min and photographed with a fluorescence microscope. Image analysis of the imaged cells was performed, and the cells were classified into two types: cells sandwiched in the holes and cells holding a circle.
  • Comparative Example 2 Experiments were performed in the same manner as in Comparative Example 1, and the liquid in the cell trapping device was drawn out at a rate of 50 ⁇ L / min and photographed with a fluorescence microscope.
  • Comparative Example 3 Experiments were performed in the same manner as in Comparative Example 1, and the liquid in the cell trapping device was drawn out at a rate of 2 ⁇ L / min and photographed with a fluorescence microscope.
  • Example 1 a photograph of the cells after capturing in Example 1 is shown in FIG. In Example 1, it was confirmed that the cells were circular, and the particle size of the cells was about 18 ⁇ m, which is the theoretical average particle size. From this, it was suggested that by storing the cells without draining the solution after capturing the cells, it was possible to maintain the morphology of the cells, and it was possible to remove them without being caught in the pores.
  • FIG. 7 shows a photograph of the cells after capturing in Example 4. As in Example 1, it was confirmed that the cells were circular, and the cell particle size was about 18 ⁇ m, which is the theoretical particle size.
  • FIG. 8 shows a photograph of the cells after capturing in Comparative Example 1.
  • Comparative Example 1 after the liquid is drawn out, the cells trapped on the filter are fitted into the through-hole of the filter due to the suction pressure of the liquid, and the cells are deformed into a square shape and sandwiched between the pore diameters. It was confirmed.
  • FIG. 9 shows a photograph of the cell after capturing in Comparative Example 4. As in Comparative Example 1, it was confirmed that the cells were squarely deformed and sandwiched in the holes.
  • Table 2 shows the results obtained by classifying each of Examples 1 to 6 and Comparative Examples 1 to 4 into a cell sandwiched in a hole and a cell having a circular shape.
  • Example 7 ⁇ Evaluation of cell morphology when the liquid level on the filter is changed> (Example 7) Using the same method as in Example 1, operations such as cell capture, staining, and washing were performed. The height of the liquid from the filter surface was set to 50 ⁇ m, and the liquid replacement operation was performed. The height of the liquid level from the filter surface was calculated from the filter surface area and mass, and the liquid level was set to 50 ⁇ m.
  • Example 2 Image analysis of cells imaged using a microscope in the same manner as in Example 1 was performed, and the cells were classified into two types: a square cell sandwiched in the hole and a cell holding a circle on the filter.
  • Example 8 Using the same method as in Example 7, the height of the liquid from the filter surface was set to 30 ⁇ m, and a liquid replacement operation was performed. The height of the liquid level from the filter surface was calculated from the filter surface area and mass, and the liquid level was set to 30 ⁇ m.
  • Example 9 Using the same method as in Example 7, the height of the liquid from the filter surface was set to 20 ⁇ m, and a liquid replacement operation was performed. The height of the liquid level from the filter surface was calculated from the filter surface area and mass, and the liquid level was set to 20 ⁇ m.
  • Example 10 Using the same method as in Example 7, the liquid replacement operation was performed by setting the liquid height from the filter surface to 10 ⁇ m. The height of the liquid level from the filter surface was calculated from the filter surface area and mass, and the liquid level was set to 10 ⁇ m.
  • Example 5 (Comparative Example 5) Using the same method as in Example 7, the liquid replacement operation was performed by setting the liquid height from the filter surface to 0 ⁇ m. When the liquid was exchanged, the liquid level was set to 0 ⁇ m by removing the liquid from the cell trapping device and performing the treatment.
  • the height of the liquid surface capable of maintaining a circular shape without deforming more than half of the cells must be 30 ⁇ m or more. It was also confirmed that when the height of the liquid surface was 50 ⁇ m or more, it was possible to further increase the ratio of retaining the circular shape without the cells being deformed.
  • Example 11 ⁇ Experiment for removing cells trapped on the filter 1: Removal by reverse washing (discharge channel ⁇ introduction channel)> (Example 11)
  • a CTC recovery apparatus CT6000 (trade name, manufactured by Hitachi Chemical Co., Ltd.) in which the filter of Evaluation Example 1 was set in a cartridge (corresponding to the cell trapping device according to this embodiment).
  • the CTC recovery device has a flow channel for introducing a blood sample and a reagent, and the inlet of the flow channel is connected to a reservoir produced by processing a syringe. By sequentially putting blood samples and reagents into this reservoir, operations such as CTC capture, staining, and washing can be performed easily and continuously.
  • a blood sample was introduced into a CTC recovery device to concentrate cancer cells.
  • a blood sample a sample obtained by containing 1000 cancer cells per mL of blood in blood of a healthy person collected in an EDTA-containing vacuum blood collection tube was used.
  • a cancer cell the above human non-small cell lung cancer cell line NCI-H358 was used. The blood used was 6 hours after blood collection.
  • EDTA-0.5% BSA (bovine serum albumin) -PBS (Gibco PBS pH 7.4) 1 ml (hereinafter referred to as a washing solution) was introduced into the reservoir, filled on the filter, and left for 10 minutes. Subsequently, liquid feeding was started at a flow rate of 200 ⁇ L / min using a peristaltic pump. Thereafter, 3 ml of blood was introduced. After about 5 minutes, 9 mL of the washing solution was introduced into the reservoir to wash the cells.
  • BSA bovine serum albumin
  • PBS Gibco PBS pH 7.4
  • the pump flow rate was changed to 20 ⁇ L / min, and 600 ⁇ L of cell staining solution (Hoechst 33342: 30 ⁇ L, Wash buffer: 300 ml) was introduced into the reservoir, and the cancer cells or leukocytes on the filter were fluorescently stained. The cells captured on the filter were stained for 30 minutes, and then 1 mL of 2 mM EDTA-0.5% BSA-PBS was introduced into the reservoir to wash the cells.
  • cell staining solution Hoechst 33342: 30 ⁇ L, Wash buffer: 300 ml
  • a fluorescence microscope BX61, Olympus Corporation
  • DP70 cooled digital camera
  • images were acquired using WU and WIG filters (Olympus Corporation), respectively.
  • Lumina Vision Mitsubishi Corporation was used as image acquisition and analysis software. Image analysis of the imaged cells was performed, and the number of cancer cells captured on the filter was counted.
  • a syringe pump TE-351 (Terumo Corporation) was connected to the discharge channel 23 side, and liquid feeding (back washing) was performed at a speed of 200 ⁇ L / min for 6 minutes. About 1 ml of the solution discharged from the introduction channel was collected in the centrifugal sedimentation tube.
  • the CTC recovery device has a flow channel for introducing a blood sample and a reagent, and the inlet of the flow channel is connected to a reservoir produced by processing a syringe.
  • the recaptured cells were counted using the same fluorescence microscope.
  • the number of cancer cells captured after backwashing divided by the number of cancer cells initially captured the recovery rate of cancer cells by backwashing.
  • Example 12 An experiment was performed using the same method as in Example 11 except that the speed during backwashing was 400 ⁇ L / min.
  • Example 13 The experiment was performed using the same method as in Example 11 except that the speed during back washing was 800 ⁇ L / min.
  • Example 14 Using the same method as in Example 11, except that the specific cell-captured device was subjected to vibration at 200 rpm for 5 seconds using Voltex (F202A0175) (manufactured by VELP Scientific) before liquid feeding by back washing. The experiment was conducted.
  • Example 15 An experiment was performed using the same method as in Example 14 except that the speed during back washing was 400 ⁇ L / min.
  • Example 16 An experiment was performed using the same method as in Example 14 except that the speed during back washing was 800 ⁇ L / min.
  • Example 6 After the cell staining was completed, the experiment was performed in the same manner as in Example 11 except that the liquid in the cell trapping device was drawn out at a rate of 50 ⁇ L / min and photographed with a fluorescence microscope.
  • Example 7 After the cell staining was completed, the experiment was performed in the same manner as in Example 14 except that the liquid in the cell trapping device was drawn out at a rate of 50 ⁇ L / min and photographed with a fluorescence microscope.
  • Example 17 An experiment was performed using a CTC recovery apparatus: CT6000 (trade name, manufactured by Hitachi Chemical Co., Ltd.) in which the filter of Evaluation Example 1 was set in a cartridge (corresponding to the cell trapping device according to this embodiment).
  • the CTC recovery device has a flow channel for introducing a blood sample and a reagent, and the inlet of the flow channel is connected to a reservoir produced by processing a syringe. By sequentially putting blood samples and reagents into this reservoir, operations such as CTC capture, staining, and washing can be performed easily and continuously.
  • a blood sample was introduced into a CTC recovery device to concentrate cancer cells.
  • a blood sample a sample obtained by containing 1000 cancer cells per mL of blood in blood of a healthy person collected in an EDTA-containing vacuum blood collection tube was used.
  • a cancer cell the above human non-small cell lung cancer cell line NCI-H358 was used. The blood used was 6 hours after blood collection.
  • EDTA-0.5% BSA (bovine serum albumin) -PBS (Gibco PBS pH 7.4) 1 ml (hereinafter referred to as a washing solution) was introduced into the reservoir, filled on the filter, and left for 10 minutes. Subsequently, liquid feeding was started at a flow rate of 200 ⁇ L / min using a peristaltic pump. Thereafter, 3 ml of blood was introduced. After about 5 minutes, 9 mL of the washing solution was introduced into the reservoir to wash the cells.
  • BSA bovine serum albumin
  • PBS Gibco PBS pH 7.4
  • the pump flow rate was changed to 20 ⁇ L / min, and 600 ⁇ L of cell staining solution (Hoechst 33342: 30 ⁇ L, Wash buffer: 300 ml) was introduced into the reservoir, and the cancer cells or leukocytes on the filter were fluorescently stained. The cells captured on the filter were stained for 30 minutes, and then 1 mL of 2 mM EDTA-0.5% BSA-PBS was introduced into the reservoir to wash the cells.
  • cell staining solution Hoechst 33342: 30 ⁇ L, Wash buffer: 300 ml
  • a fluorescence microscope BX61, Olympus Corporation
  • DP70 cooled digital camera
  • images were acquired using WU and WIG filters (Olympus Corporation), respectively.
  • Lumina Vision Mitsubishi Corporation was used as image acquisition and analysis software. Image analysis of the imaged cells was performed, and the number of cancer cells captured on the filter was counted.
  • a syringe pump TE-351 (Terumo Corporation) was connected to the discharge channel 23 side, and liquid feeding (back washing) was performed at a speed of 200 ⁇ L / min for 6 minutes. About 1 ml of the solution discharged from the introduction channel was collected in the centrifugal sedimentation tube.
  • the CTC recovery device has a flow channel for introducing a blood sample and a reagent, and the inlet of the flow channel is connected to a reservoir produced by processing a syringe.
  • the recaptured cells were counted using the same fluorescence microscope.
  • the number of cancer cells captured after backwashing divided by the number of cancer cells initially captured the recovery rate of cancer cells by backwashing.
  • Example 18 An experiment was performed using the same method as in Example 18 except that the speed during back washing was 400 ⁇ L / min.
  • Example 19 An experiment was performed using the same method as in Example 18 except that the speed during back washing was 800 ⁇ L / min.
  • Example 20 The same method as in Example 18 was used, except that Voltex (F202A0175) (manufactured by VELP Scientific) was used to vibrate the specific cell-trapped device at 200 rpm for 5 seconds before liquid feeding by back washing. The experiment was conducted.
  • Voltex F202A0175
  • VELP Scientific manufactured by VELP Scientific
  • Example 21 An experiment was performed using the same method as in Example 21 except that the speed during back washing was 400 ⁇ L / min.
  • Example 22 An experiment was performed using the same method as in Example 21 except that the speed during backwashing was 800 ⁇ L / min.
  • Example 8 After the cell staining was completed, the experiment was performed in the same manner as in Example 17 except that the liquid in the cartridge was pulled out at a rate of 50 ⁇ L / min and photographed with a fluorescence microscope.
  • Example 9 After the cell staining was completed, the experiment was performed in the same manner as in Example 20 except that the liquid in the cartridge was pulled out at a rate of 50 ⁇ L / min and photographed with a fluorescence microscope.
  • Table 5 shows the results of Examples 17 to 22 and Comparative Examples 8 and 9.
  • Example 23 Cell collection method by liquid collection (aspiration) (open casing)> (Example 23)
  • the filter of Evaluation Example 1 was set in the housing of FIG. 1, and liquid was sucked using a peristaltic pump (SJ-1215) (Ato Co., Ltd.) to capture cells on the filter.
  • a peristaltic pump SJ-1215
  • a washing solution were introduced from separate syringes using a three-way stopcock (TS-TL1K) (manufactured by Terumo).
  • EDTA-0.5% BSA (bovine serum albumin) -PBS (Gibco PBS pH 7.4) 1 ml (hereinafter referred to as a washing solution) was introduced into the reservoir, filled on the filter, and left for 10 minutes. Subsequently, liquid feeding was started at a flow rate of 200 ⁇ L / min using a peristaltic pump. Thereafter, 3 ml of blood was introduced. After about 5 minutes, 9 mL of the washing solution was introduced into the reservoir to wash the cells.
  • BSA bovine serum albumin
  • PBS Gibco PBS pH 7.4
  • the blood sample was introduced into the first syringe and the cancer cells were concentrated on the filter.
  • a sample obtained by containing 1000 cancer cells per mL of blood in blood of a healthy person collected in an EDTA-containing vacuum blood collection tube was used.
  • a cancer cell the above human non-small cell lung cancer cell line NCI-H358 was used. The blood used was 6 hours after blood collection.
  • the pump flow rate was changed to 20 ⁇ L / min, and 600 ⁇ L of cell staining solution (Hoechst 33342: 30 ⁇ L, Wash buffer: 300 ml) was introduced into the reservoir, and the cancer cells or leukocytes on the filter were fluorescently stained. The cells captured on the filter were stained for 30 minutes, and then 1 mL of 2 mM EDTA-0.5% BSA-PBS was introduced into the reservoir to wash the cells. Until the final cleaning liquid was introduced, the liquid was continuously introduced without drawing the liquid once.
  • cell staining solution Hoechst 33342: 30 ⁇ L, Wash buffer: 300 ml
  • the CTC recovery device has a flow channel for introducing a blood sample and a reagent, and the inlet of the flow channel is connected to a reservoir produced by processing a syringe.
  • the recaptured cells were counted using the same fluorescence microscope.
  • the number of cancer cells captured after backwashing divided by the number of cancer cells introduced at the beginning the cancer cell recovery rate by backwashing was calculated.
  • the CTC recovery device has a flow channel for introducing a blood sample and a reagent, and the inlet of the flow channel is connected to a reservoir produced by processing a syringe.
  • the recaptured cells were counted using the same fluorescence microscope.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Fluid Mechanics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

　２種類以上の細胞を含む細胞含有溶液及び該細胞含有溶液中の細胞を処理するための処理液から選ばれる液体を内部に導入する導入領域と、液体を外部に排出するための排出流路とを含む筐体と、導入領域と排出流路との間の流路上に設けられ、液体が通過するための複数の貫通孔が厚み方向に形成されたフィルタと、を有する細胞捕捉デバイスを用いて液体をフィルトレーションすることにより、フィルタ表面において細胞含有溶液に含まれる特定の細胞を選択的に捕捉する細胞捕捉方法であって、液体を流す工程をｎ回（ｎは自然数）有し、第１回目の液体を流す工程から第ｎ回目の液体を流す工程において、フィルタ上の導入領域における液体の液面が所定の液面高さを維持し、第ｎ回目の液体を流す工程の終了時にフィルタに所定の高さの液面を有する状態で細胞捕捉デバイスからの液体の排出を止める。

Description

細胞捕捉方法、特定細胞捕捉済デバイスの製造方法、及び特定細胞含有溶液の製造方法
　本発明は、フィルトレーションシステムによって２種類以上の細胞を含有する細胞含有溶液および血液から特定の細胞のみを捕捉、検出する際に、選択的に捕捉した細胞に対してダメージを与えることなく特定の細胞のみを捕捉・濃縮する、特定細胞の捕捉方法、捕捉した特定細胞を捕捉した後の特定細胞捕捉済デバイスの製造方法、捕捉した特定細胞を含有する溶液の製造方法に関する。
　近年、血液の分野において、溶液中から特定の細胞のみを捕捉・検出する技術の開発が多く進められている。輸血する際に白血球のみを除去する技術や、免疫療法において特定の白血球を取り出す技術においては多くの研究が行われている。その中でも特に注目されているのが、血中循環腫瘍細胞（以下ＣＴＣ）の検出技術である。ＣＴＣは、臨床的な意義の高さから多くの研究が行われ、近年では特に、抗がん剤のスクリーニングや、癌を早期発見する診断技術へ応用することが期待されている。
　近年、パリレンを用いた樹脂フィルタを使用することで、少量のＣＴＣを効率的に検出する方法が提案されている（特許文献１）。
　或いは、樹脂の代わりに金属を用いたフィルタを使用することで、フィルタの強度を向上させ、白血球と癌細胞変形能の違いにより分離する方法も提案されている（特許文献２）。
国際公開第２０１０／１３５６０３号 特開２０１３／４２６８９号
　フィルトレーション技術を用い２種類以上の細胞を含有する細胞含有溶液、及び血液中から希少細胞等の特定の細胞を取り出す過程において、選択的に捕捉する細胞に対してダメージを与えることなく特定の細胞のみを捕捉・濃縮することが望まれている。
　例えば、従来から知られているフィルタ法は血液中の白血球や赤血球、血しょう板を効率よく除去できるが、白血球はがん細胞と近い大きさであるので、すべてを除去することはできない。
　フィルタ法は白血球の大きさとがん細胞の大きさの違い、変形能の違いで分離する方法である。この方法において、フィルタの材質、孔形状、孔径、開口率、流速を工夫することで、白血球とがん細胞をかなり分離可能である。
　しかしながら、フィルトレーションを行い白血球とがん細胞の分離を行った後に、捕捉したがん細胞をフィルタ上から取り出すことは容易ではなく、取出し時に細胞にダメージを与える可能性があった。
　本発明は、フィルトレーションによって特定の細胞を捕捉した後、捕捉した細胞にダメージを与えることなく取り出す細胞捕捉方法、取り出すための特定細胞捕捉済デバイスを製造する方法、及び、捕捉した細胞を含有する特定細胞含有溶液を製造する方法を提供することを課題とする。
　発明者らは検討を重ねた結果、フィルトレーションにより細胞を捕捉した後から細胞を解析・検出するまでの間、カートリッジ（細胞捕捉デバイス）内の液体を一度も引き抜くことなく連続的に液置換の処理を行うことで、細胞にダメージを与えずに取り出すことを可能とした。本発明の方法によれば、細胞の孔内への挟まれと細胞の変形を防ぐことができるので、細胞の高い回収効率とよりダメージの少ない細胞の回収が期待出来る。
　フィルトレーションによって細胞含有溶液から特定の細胞のみを捕捉する際に、液面をフィルタ表面から目的の捕捉細胞の平均粒径以上の高さまで残した状態で処理を行うことで、細胞の孔内への挟み込まれと細胞の変形を防ぐことにより細胞にダメージを与えずに取り出すことが可能となる。
　すなわち、本発明の一形態に係る細胞捕捉方法は、所定の容積を有し、２種類以上の細胞を含む細胞含有溶液及び該細胞含有溶液中の細胞を処理するための処理液から選ばれる液体を内部に導入する導入領域と、前記液体を外部に排出するための排出流路とを含む筐体と、前記導入領域と前記排出流路との間の流路上に設けられ、前記液体が通過するための複数の貫通孔が厚み方向に形成されたフィルタと、を有する細胞捕捉デバイスを用いて前記液体をフィルトレーションすることにより、前記フィルタ表面において前記細胞含有溶液に含まれる特定の細胞を選択的に捕捉する細胞捕捉方法であって、前記細胞捕捉デバイスに対して前記液体を流す工程をｎ回（ｎは自然数）有し、第１回目の前記液体を流す工程から第ｎ回目の前記液体を流す工程において、前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体の液面が所定の液面高さを維持し、第ｎ回目の前記液体を流す工程の終了時に前記フィルタに所定の高さの液面を有する状態で前記細胞捕捉デバイスからの前記液体の排出を止めることを特徴とする。
　ここで、前記筐体は、前記導入領域の上方に設置される上蓋及び前記液体の導入流路を含む態様とすることができる。
　第１回目の前記液体を流す工程の前に、予め前記筐体の前記導入領域内を含む前記フィルタよりも上流側に洗浄液を満たしている態様とすることができる。
　前記液体を流す工程が、固定液を流す工程と、透過液を流す工程、染色液を流す工程、及び洗浄液を流す工程のうちの１以上の工程と、前記細胞含有溶液を流す工程と、を含む態様とすることができる。
　前記ｎは１であり、前記液体を流す工程が前記細胞含有溶液を流す工程である態様とすることができる。
　前記液体を流す工程において、第１回目に流す前記液体が細胞含有溶液であり、第２回目に流す前記液体が洗浄液である態様とすることができる。
　前記液体を流す工程において、捕捉対象の細胞の少なくとも一部が前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体に浸漬している態様とすることができる。
　前記液体を流す工程において、前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体の液面の高さが捕捉対象の細胞の大きさ以上である態様とすることができる。
　前記液体を流す工程において、前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体の液面の高さが５０μｍ以上である態様とすることができる。
　前記細胞含有溶液の溶媒が、哺乳動物の全血、血清、血漿、又はそれらが由来のたんぱく質を含む水溶液からなる態様とすることができる。
　前記フィルタが、高分子材料又は金属を用いて加工される態様とすることができる。
　前記液体を流す工程において、前記細胞捕捉デバイスに対して前記液体を導入する速度が、５０～１０００μＬ／ｍｉｎである態様とすることができる。
　また、本発明の一形態に係る特定細胞捕捉済デバイスの製造方法は、所定の容積を有し、２種類以上の細胞を含む細胞含有溶液及び該細胞含有溶液中の細胞を処理するための処理液から選ばれる液体を内部に導入する導入領域と、前記液体を外部に排出するための排出流路とを含む筐体と、前記導入領域と前記排出流路との間の流路上に設けられ、前記液体が通過するための複数の貫通孔が厚み方向に形成されたフィルタと、を有する細胞捕捉デバイスを用いて前記液体をフィルトレーションすることにより、前記フィルタ表面において前記細胞含有溶液に含まれる特定の細胞を選択的に捕捉した特定細胞捕捉済デバイスを製造する特定細胞捕捉済デバイスの製造方法であって、前記細胞捕捉デバイスに対して前記液体を流す工程をｎ回（ｎは自然数）有し、第１回目の前記液体を流す工程から第ｎ回目の前記液体を流す工程において、前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体の液面が所定の液面高さを維持し、第ｎ回目の前記液体を流す工程の終了時に前記フィルタに所定の高さの液面を有する状態で前記細胞捕捉デバイスからの前記液体の排出を止めることを特徴とする。
　ここで、前記筐体は、前記導入領域の上方に設置される上蓋及び前記液体の導入流路を含む態様とすることができる。
　第１回目の前記液体を流す工程の前に、予め前記筐体の前記導入領域内を含む前記フィルタよりも上流側に洗浄液を満たしている態様とすることができる。
　前記液体を流す工程が、固定液を流す工程と、透過液を流す工程、染色液を流す工程、及び洗浄液を流す工程のうちの１以上の工程と、前記細胞含有溶液を流す工程と、を含む態様とすることができる。
　前記ｎは１であり、前記液体を流す工程が前記細胞含有溶液を流す工程である態様とすることができる。
　前記液体を流す工程において、第１回目に流す前記液体が細胞含有溶液であり、第２回目に流す前記液体が洗浄液である態様とすることができる。
　前記液体を流す工程において、捕捉対象の細胞の少なくとも一部が前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体に浸漬している態様とすることができる。
　前記液体を流す工程において、前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体の液面の高さが捕捉対象の細胞の大きさ以上である態様とすることができる。
　前記液体を流す工程において、前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体の液面の高さが５０μｍ以上である態様とすることができる。
　前記細胞含有溶液の溶媒が、哺乳動物の全血、血清、血漿、又はそれらが由来のたんぱく質を含む水溶液からなる態様とすることができる。
　前記フィルタが、高分子材料又は金属を用いて加工される態様とすることができる。
　前記液体を流す工程において、前記細胞捕捉デバイスに対して前記液体を導入する速度が、５０～１０００μＬ／ｍｉｎである態様とすることができる。
　また、本発明の一形態に係る特定細胞含有溶液の製造方法は、所定の容積を有し、２種類以上の細胞を含む細胞含有溶液及び該細胞含有溶液中の細胞を処理するための処理液から選ばれる液体を内部に導入する導入領域と、前記液体を外部に排出するための排出流路とを含む筐体と、前記導入領域と前記排出流路との間の流路上に設けられ、前記液体が通過するための複数の貫通孔が厚み方向に形成されたフィルタと、を有する細胞捕捉デバイスを用いて前記液体をフィルトレーションすることにより、前記フィルタ表面において前記細胞含有溶液に含まれる特定の細胞を選択的に捕捉することにより得られる特定細胞含有溶液の製造方法であって、前記細胞捕捉デバイスに対して前記液体を流す工程をｎ回（ｎは自然数）有し、第１回目の前記液体を流す工程から第ｎ回目の前記液体を流す工程において、前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体の液面が所定の液面高さを維持し、第ｎ回目の前記液体を流す工程の終了時に前記フィルタに所定の高さの液面を有する状態で前記細胞捕捉デバイスからの前記液体の排出を止め、前記細胞捕捉デバイスに対して前記液体を流す工程の後に、前記筐体内に存在する液体を回収する工程を有することを特徴とする。
　前記筐体内に存在する液体を回収する工程が、前記導入領域側から前記導入領域内の液体を吸引する工程を含む態様とすることができる。
　前記筐体は、前記導入領域の上方に設置される上蓋及び前記液体の導入流路を含み、前記筐体内に存在する液体を回収する工程が、前記排出流路から前記導入流路へ向けて送液を行う工程を含む態様とすることができる。
　前記排出流路から前記導入流路へ向けた送液の流速が５０～１０００μＬ／ｍｉｎである態様とすることができる。
　前記排出流路から前記導入流路へ向けた送液の前に、前記筐体に振動を与える態様とすることができる。
　前記筐体は、前記導入領域の上方に設置される上蓋及び、２以上の前記液体の導入流路を含み、前記筐体内に存在する液体を回収する工程が、２以上の前記導入流路に含まれる第１の導入流路から２以上の前記導入流路のうち第１の導入流路とは異なる導入流路への送液を行う工程を含む態様とすることができる。
　２以上の前記導入流路に含まれる第１の導入流路から２以上の前記導入流路のうち第１の導入流路とは異なる導入流路への送液の流速が５０～１０００μＬ／ｍｉｎである態様とすることができる。
　２以上の前記導入流路に含まれる第１の導入流路から２以上の前記導入流路のうち第１の導入流路とは異なる導入流路への送液の前に、前記筐体に振動を与える態様とすることができる。
　第１回目の前記液体を流す工程の前に、予め前記筐体の前記導入領域内を含む前記フィルタよりも上流側に洗浄液を満たしている態様とすることができる。
　前記液体を流す工程が、固定液を流す工程と、透過液を流す工程、染色液を流す工程、及び洗浄液を流す工程のうちの１以上の工程と、前記細胞含有溶液を流す工程と、を含む態様とすることができる。
　前記ｎは１であり、前記液体を流す工程が前記細胞含有溶液を流す工程である態様とすることができる。
　前記液体を流す工程において、第１回目に流す前記液体が細胞含有溶液であり、第２回目に流す前記液体が洗浄液である態様とすることができる。
　前記液体を流す工程において、捕捉対象の細胞の少なくとも一部が前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体に浸漬している態様とすることができる。
　前記液体を流す工程において、前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体の液面の高さが捕捉対象の細胞の大きさ以上である態様とすることができる。
　前記液体を流す工程において、前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体の液面の高さが５０μｍ以上である態様とすることができる。
　本発明によれば、フィルトレーションによって特定の細胞を捕捉した後、捕捉した細胞にダメージを与えることなく取り出す細胞捕捉方法、取り出すための特定細胞捕捉済デバイスを製造する方法、及び、捕捉した細胞を含有する特定細胞含有溶液を製造する方法が提供される。
細胞捕捉デバイス（開放型筐体）の概略構成を説明する図である。 細胞捕捉デバイス（密閉型筐体）の概略構成を説明する図である。 フィルタの製造方法を説明する概略断面図である。 銅板（銅めっきを行う場合はＮｉ板）を使用してフィルターを製造する方法を示す概略断面図である。 フィルタにおける長孔径、短孔径、及び開口率の定義を説明する図である。 実施例１の捕捉後の細胞の写真である。 実施例４の捕捉後の細胞の写真である。 比較例１の捕捉後の細胞の写真である。 比較例４の捕捉後の細胞の写真である。
　以下に本発明の一実施形態に係る詳細な説明を行う。本実施形態に係る細胞捕捉方法とは、２種類以上の細胞を含む細胞含有溶液から特定の細胞を選択的に捕捉する方法である。特定の細胞を捕捉する際には、細胞捕捉デバイスを用いる。細胞捕捉デバイスについては後述するが、所定の容積を有する導入領域と、導入領域から内部に導入された液体を外部に排出するための排出流路とを含む筐体と、導入領域と排出流路との間の流路上に設けられた前記液体が通過するための複数の貫通孔が厚み方向に形成されたフィルタと、を備える。この細胞捕捉デバイスを用いて、細胞含有溶液のフィルトレーションを行うことで、特定の細胞をフィルタ上で捕捉する。細胞含有溶液のフィルトレーションの際には、固定液、透過液、染色液又は洗浄液等の処理液を細胞捕捉デバイスに流すことで、捕捉された細胞について観察等を行うための処理を行うことができる。なお、特定の細胞がフィルタ上に捕捉された細胞捕捉デバイスを特定細胞捕捉済デバイスという。
　本実施形態において、細胞含有溶液とは、２種類以上の細胞が存在する溶液と定義する。細胞含有溶液の例としては、ヒト血液及びヒト血液を含む溶液が挙げられる。
　本実施形態において、細胞含有溶液がヒト血液である場合、細胞含有溶液中の細胞とは、ヒト血液中に存在する細胞であり２種類以上の細胞が対象である。具体的には、ヒト白血球、血中循環腫瘍細胞（Circulating Tumor Cell：CTC）、循環血管内内皮細胞（Circulating Endothelial Cell：CEC）、癌幹細胞である。
　細胞含有溶液の溶媒は、哺乳動物の全血、血清或いは血漿、或いはそれらが由来のたんぱく質を含む水溶液からなることが好ましく、ウシ、ウマ、ヒト由来のたんぱく質であることがより好ましく、ヒト由来のたんぱく質であることが更に好ましい。水溶液は、リン酸緩衝液を主成分とすることが好ましい。
たんぱく質を含む水溶液内に、抗凝固剤を添加する場合もある。抗凝固剤は、ＥＤＴＡ、ヘパリン、クエン酸ナトリウム、フッ化ナトリウムのいずれかであることが好ましい。
　細胞捕捉デバイスにより捕捉する対象である特定の細胞とは、ヒト血液中に存在する細胞である。具体的には、ヒト白血球、血中循環腫瘍細胞、循環血管内内皮細胞、癌幹細胞である。
　また、本実施形態において、特定細胞含有溶液とは、細胞捕捉デバイスを用いて２種類以上の細胞が存在する細胞含有溶液から特定の細胞を捕捉した後に作製された溶液と定義する。特定細胞含有溶液中では、特定の細胞以外の細胞に対する捕捉された特定の細胞の存在割合が元の細胞含有溶液のそれに比べ高くなっている。特定細胞含有溶液は、細胞捕捉デバイスにおいて特定の細胞を捕捉した後の特定細胞捕捉済デバイスに残留する液体を回収することによって得られる。
　細胞捕捉デバイスについて、図１及び図２を参照しながら説明する。細胞捕捉デバイスは、筐体及びフィルタを有する。まず、筐体の説明を行う。本実施形態の細胞捕捉デバイスにおける筐体とは、内部に液体を導入可能であり、且つフィルタを通過した液体を外部に排出可能である。さらに、筐体内には、フィルタ上で滞留する液体の液面を所定の高さで維持することが可能となるように、所定の容積を有する導入領域を備える。このような、筐体は２種類のタイプが存在する。なお、細胞捕捉デバイスの形状は、図１又は図２に示すものに上記に限定されない。フィルタを用いた細胞含有溶液のフィルトレーションによって、特定の細胞を捕捉することができるのであれば、その装置構成は特に限定されない。
　まず１つめは、フィルタより上部に上蓋を備えないタイプの開放型の筐体である。図１には、開放型の筐体を有する細胞捕捉デバイス１０を示す。細胞捕捉デバイス１０は、厚み方向（上下方向）に延びる貫通孔を有するフィルタ１１と、フィルタ１１の上方に設けられる導入領域１２と、フィルタの下方に設けられる排出流路１３と、を有する。導入領域１２及び排出流路１３は、筐体によって形成されている。開放型の筐体を有する細胞捕捉デバイス１０においては、導入する液体を、フィルタ１１の上部に存在する導入領域１２より導入する。導入領域１２は上方が開口しているので、直接導入することができる。液体を導入するための媒体は、測定者の手技で行う場合と、一定量の液体を自動で導入するための機器を用いることが好ましい。液体を一定量導入するための機器としては、ビュレットのような半自動によるものと、機械的に制御された自動によるものが好ましい。
　２つめの筐体は、フィルタより上部に液体を導入するための１つ以上の導入流路を備えた上蓋と液体を外部に排出するための排出流路とを備えるタイプの密閉型の筐体である。図２には、密閉型の筐体を有する細胞捕捉デバイス２０を示す。細胞捕捉デバイス２０は、厚み方向（上下方向）に延びる貫通孔を有するフィルタ２１と、フィルタ２１の上方に設けられる導入領域２２と、フィルタ２１の下方に設けられる排出流路２３と、を有する。さらに導入領域２２の上方には上蓋２４が設置されると共に、上蓋２４によって覆われた導入領域２２に対して液体を導入するための２つの導入流路２５，２６が設けられる。上蓋２４とフィルタ２１との間には、液体及び細胞を保持するための所定の容積を有する空間である導入領域２２が形成される。導入流路２５，２６は、上蓋２４よりも上方もしくは、上蓋２４の横側に取り付けることが好ましい。図２の細胞捕捉デバイス２０では、導入流路２５は、導入領域との接続部分は、上蓋２４の横側に設けられているが、流路が上方に延びている例を示している。導入流路２５，２６を複数備えている場合、細胞捕捉デバイス２０に導入する液体同士（例えば、細胞含有溶液と処理液）のコンタミネーションを防ぐことができる。したがって、導入流路を２つ以上有する構成であることが好ましい。
　細胞捕捉デバイス１０，２０に用いられるフィルタ１１，２１について、詳細は後述するが、材質は金属又は高分子材料であることが好ましい。金属の主成分としては、ニッケル、銀、パラジウム、銅、イリジウムのいずれか、もしくはこれらの合金が好ましい。高分子材料の主成分としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタン、ポリ乳酸、パリレンを主成分としたものが好ましい。なお「主成分」とは、フィルタを構成する材料における当該成分の割合が５０重量％以上であることをいう。
　また、フィルタ１１，２１には、液体が通過するための複数の貫通孔１１ａ，２１ａが厚み方向に形成されている。これらの貫通孔１１ａ，２１ａの形状及び大きさを調整することで、捕捉対象となる特定の細胞を選択的に捕捉することができる。
　次に、細胞捕捉デバイスにおいて細胞を捕捉する方法について説明する。まず、細胞捕捉デバイス１０又は細胞捕捉デバイス２０に対して液体を流す工程について説明する。本実施形態でいう液体を流す工程とは、フィルタ１１，２１より上方もしくは専用の導入流路（例えば、導入流路２５）より目的の液の導入を行う。その後、フィルタ１１，２１を通過させた後に、排出流路１３，２３より液を排出することである。液を流す方法としては、吸引が望ましく、液を吸引するための動力としては、ペリスタポンプを用いることが好ましい。
　本実施形態に係る細胞捕捉に係る処理では、液体を流す工程がｎ回（ｎは自然数）行われる。液体を流す工程の数は、細胞含有溶液の流す工程の数及び処理液を流す工程（固定液を流す工程と、透過液を流す工程、染色液を流す工程、及び洗浄液を流す工程のうちの１以上の工程）の数に基づいて変動する。すなわち、ｎが１である場合には、細胞含有溶液の流す工程のみが行われる。なお、第１回目に流す液体が細胞含有溶液とし、第２回目に流す前記液体が洗浄液である構成とすることで、細胞含有溶液に含まれる成分のうち、捕捉対象の特定の細胞以外の成分を洗浄液によって洗浄（排出流路側へ移動）した後に、各種の処理液による処理を実施することができるため、洗浄液以外の処理液による処理の効果を向上させることができる。
　液体を流す工程をｎ回有する際に、第１回目から第ｎ回目の液体を流す工程において、フィルタ１１，２１上の導入領域１２，２２に滞留する液体の液面が所定の高さを維持していることを特徴とする。このような構成とすることで、捕捉対象の細胞の少なくとも一部がフィルタ上の導入領域における液体に浸漬している状態を実現することができる。また、第ｎ回目の最終の液を流す工程の後（終了時）に、フィルタ１１，２１上の導入領域１２，２２に滞留する液体が所定の液面の高さを有した状態で、細胞捕捉デバイス１０，２０からの液体の排出を止めることを特徴とする。所定の高さとは、捕捉を目的としている細胞の平均粒径以上の高さを有することが好ましく、捕捉対象の細胞の大きさ以上であるとより好ましい。具体的には、フィルタ１１，２１上の導入領域１２，２２に滞留する液体の液面高さは、５０μｍ以上であることが好ましく、３０μｍ以上であるとより好ましい。液体の高さを捕捉対象の細胞の平均粒径以上の高さとすることで、フィルタ上に滞留する特定の細胞の移動性を十分確保し、フィルタ又は他の細胞との衝突によって細胞がダメージを受けることを防止することができる。
　第１回目の液を流す工程の前に、予め筐体内の導入領域内及び流路（導入流路、排出流路）内、すなわち、導入領域内を含むフィルタよりも上流側に洗浄液を満たしていることが好ましい。洗浄液とは、ウシ由来の血清を含む燐酸緩衝溶液を用いることが好まく、ウシ胎児血清を含む燐酸緩衝溶液を用いることがより好ましい。ウシ血清の濃度としては、０．１ｗ／ｖ％～２０ｗ／ｖ％が好まく、０．５ｗ／ｖ％～１０ｗ／ｖ％がより好ましい。
　細胞含有溶液、各種処理液がフィルタの孔を通過する流速としては、１００～８００μＬ／ｍｉｎの範囲であることが好ましく、２００～６００μＬ／ｍｉｎの範囲であることがより好ましい。
　密閉型の筐体を有する細胞捕捉デバイス２０においては、細胞を捕捉後に筐体内部に液体を充填させた状態で、排出流路２３からの液体の排出を止めた後は、捕捉した細胞の形を保持した状態で保管する容器として用いることが可能となる。
　なお、細胞捕捉デバイスのフィルタ上に細胞を捕捉した後に、筐体内に存在する細胞含有溶液を特定細胞含有溶液として回収する方法は、開放型の筐体と密閉型の筐体によって異なる。
　例えば、開放型の筐体を有する細胞捕捉デバイス１０から細胞含有溶液を回収するための方法としては、ピペットなどの吸引器を用いることが好ましい。
　密閉型の筐体を有する細胞捕捉デバイス（例えば細胞捕捉デバイス２０）から細胞含有溶液を回収するための方法として、３つ例示する。まず、１つめの方法としては、導入流路２５，２６のように導入流路を２つ以上保有する場合に用いる方法が挙げられる。一方側の導入流路（第１の導入流路）を液体の導入側とし、液体の導入側として用いる導入流路とは異なる導入流路を液体の排出側とし、液体として、例えば処理液等を送液する。これにより、排出側とした導入流路から、フィルタ２１により捕捉された特定の細胞を含む細胞含有溶液を回収し、特定細胞含有溶液を得ることができる。この時の送液速度は、５０～１０００μＬ／ｍｉｎの範囲であることが好ましく、２００～８００μＬ／ｍｉｎの範囲であることがより好ましい。送液速度を上記の範囲とすることで、特定の細胞に対してダメージを与えることなく、フィルタ２１上の特定の細胞の回収効率を高めることができる。
　２つめの方法としては、導入流路が１つのみである場合にも用いることができる方法が挙げられる。排出流路を液体の導入側とし、導入流路を液体の排出側とし、液体を送液することにより、排出側とした導入流路から細胞含有溶液の回収を行う。この時の送液速度は、５０～１０００μＬ／ｍｉｎの範囲であることが好ましく、２００～８００μＬ／ｍｉｎの範囲であることがより好ましい。
　なお、密閉型の筐体から細胞含有溶液を回収する時に、送液の前に筐体に対して一定の振動を与えることが好ましい。振動を与える媒体としては、ＭｉｘｅｒやＳｈａｋｅｒなどを用いることが好ましい。
　３つめの方法としては、開放型の筐体を有する細胞捕捉デバイス１０と同様に、吸引をする方法が挙げられる。この場合には、ピペットなどの吸引器を導入流路の１つに接続して吸引を行うことが考えられる。
　以下、図３及び図４を参照しながら、細胞捕捉デバイス１０，２０において好適に用いられるフィルタの一種である金属フィルタの作製方法を例示すると共に、この金属フィルタの説明を行う。
　図３は、ＭＣＬにピーラブル銅箔（銅めっきを行う場合はＮｉ箔）を貼り合わせた基板を使用し、金属製薄膜フィルタを製造する方法を示す概略断面図である。
　図３（Ａ）は、ＭＣＬ１上にピーラブル銅箔２（銅めっきを行う場合はＮｉ箔）が積層された基板を示している。まずこの基板を準備する。
　フィルタを作製するための基板として使用する材料は銅（めっきが銅の場合はニッケル）が好ましい。銅は薬液による化学的溶解で容易に除去可能であり、フォトレジストとの密着力においても他の材料に比べると優れている。
　次に、図３（Ｂ）に示すように、基板のピーラブル銅箔２上にフォトレジスト３を形成する。このフォトレジストの厚みは後の導体の厚みの１．０倍～２．０倍が好ましい。この厚みが薄いと、後にレジスト剥離が困難になり、厚いと回路形成性が困難になる。具体的には、フォトレジスト３は、１５～５０μｍの厚みが好ましい。フォトレジスト３を形成する感光性樹脂組成物としてはネガ型感光性樹脂組成物が好ましい。ネガ型感光性樹脂組成物は少なくともバインダー樹脂、不飽和結合を有する光重合性化合物、光重合開始剤を含むものが好ましい。
　次に、図３（Ｃ）に示すように、フォトレジスト３上にフォトマスク４を重ねた後にフォトレジスト露光を行う。これにより、フォトマスク４が重ねられていない領域に露光部３ａが形成される。
　次に、図３（Ｄ）に示すように、アルカリ溶液等で未露光部３ｂのフォトレジスト現像除去を行う。これにより、フィルタの貫通孔に対応する位置に露光部３ａが残る。
　次に、図３（Ｅ）に示すように、フォトレジストで覆われていない部分への電解めっきを行うことで、めっき層５を形成する。このめっきの部分がフィルタの材質となる。
　次に、図３（Ｆ）に示すように、ＭＣＬ１から、電解めっきによりめっき層５が形成された施したピーラブル銅箔２を剥離する。
　次に、図３（Ｇ）に示すように、薬液による化学的溶解により、ピーラブル銅箔２を除去し、露光部３ａ及びめっき層５により形成される自立膜を取り出す。
　次に、図３（Ｈ）に示すように、自立膜内に残ったフォトレジストによる露光部３ａを除去し、めっき層５に対して貫通孔６を形成する。
　次に、図３（Ｉ）に示すように、無電解金めっきを行い、フィルタ表面に金めっき層７を形成する。以上により、細胞捕捉デバイス１０，２０に用いられるフィルタ１１，２１を製造することができる。
　図４は、銅板（銅めっきを行う場合はＮｉ板）を使用して金属製薄膜フィルタを製造する方法を示す概略断面図である。
　図４に示す方法では、図３に示す方法におけるＭＣＬ１とピーラブル銅箔２に代えて銅板（又はＮｉ板）２’を使用している点以外は、図２に示す製造方法と同じである。
　すなわち、図４（Ａ）は基板として使用する銅板２’を準備する工程を示している。また、図４（Ｂ）は銅板２’へのフォトレジスト３のラミネートする工程を示している。また、図４（Ｃ）はフォトマスク４を重ねてのフォトレジスト露光を示している。また、図４（Ｄ）は未露光部３ｂのフォトレジストの現像除去を示している。また、図４（Ｅ）はフォトレジストの露光部３ａで覆われていない部分への電解めっきによりめっき層を形成する工程を示している。また、図４（Ｆ）は薬液による化学的溶解（ケミカルエッチング）によって銅板２’を除去し、露光部３ａ及びめっき層５により形成される自立膜を取り出す工程を示している。また、図４（Ｇ）は自立膜内に残ったフォトレジストによる露光部３ａを除去し、めっき層５に対して貫通孔６を形成する工程を示している。また、図４（Ｈ）は無電解金めっきを行い、フィルタ表面に金めっき層７を形成する工程を示している。
　このように、図３に示す方法及び図４に示す方法の何れを用いても細胞捕捉デバイス１０，２０に用いられるフィルタ１１，２１を製造することができる。
　フィルタの材質は金属であることが好ましい。金属の主成分としては、ニッケル、銀、パラジウム、銅、イリジウムのいずれか、もしくはこれらの合金が好ましい。以上の金属は電気めっき可能である。なお、「主成分」とは、フィルタ１０５の総重量に対する当該成分の重量割合が５０％以上であることを示す。
　パラジウム及びイリジウムは酸化還元電位が高く、難溶性で特性良好だが、高価である欠点がある。ニッケルは水素よりも酸化還元電位が低いため、溶解しやすいが、安価である。銀及びパラジウムは貴金属であり、イリジウムに比べると比較的安価である。
　フィルタを作製するための基板（銅板２’：図４参照）として使用する材料は銅（フィルタの材質が銅である場合はニッケル）が好ましい。銅は薬液による化学的溶解で容易に除去可能であり、フォトレジストとの密着力においても他の材料に比べると優れている。なお、ＭＣＬ１に対して積層する金属箔２（図３参照）についても、銅（フィルタの材質が銅である場合はニッケル）が好ましい。
　また、図３（Ｅ）及び図４（Ｅ）に示すめっき層５の形成は電解めっきにより行われる。例えば、電解ニッケルめっきとしてはワット浴（硫酸ニッケル、塩化ニッケル、ホウ酸が主成分）、スルファミン酸浴（スルファミン酸ニッケル、ホウ酸が主成分）、ストライク浴（塩化ニッケル、塩化水素が主成分）などが挙げられる。
　電解銀めっきとしては、シアン化銀カリウム又は酒石酸カリウムを主成分とする浴が挙げられる。
　電解パラジウムめっきとしては、水溶性パラジウム塩とナフタレンスルホン酸化合物よりなる浴が挙げられる。
　電解イリジウムめっきとしては、ハロゲンを含む可溶性イリジウム塩およびアルコール類を含有する浴が挙げられる。
　電解銅めっきとしては、硫酸銅と硫酸、塩化物イオンを主成分とする浴が挙げられる。
　これらのめっき浴を用いて、電解めっきを行う。電解めっきの際の電流密度は、０．３～４Ａ／ｄｍ２の範囲がよく、０．５～３Ａ／ｄｍ２の範囲であることがより好ましい。電流密度を４Ａ／ｄｍ２以下とすることで、ざらつきの発生を抑制でき、電流密度を０．３Ａ／ｄｍ２以上とすることで、金属の結晶粒が充分に成長し、バリア層としての効果が高まるため、本実施形態の効果が良好に得られるようになる。
めっきを行う際のレジストの箇所が貫通孔の箇所となる。貫通孔の開口形状として円、楕円、正方形、長方形、角丸長方形、多角形等が例示できる。効率良く対象とする成分を捕獲できる観点からは円、長方形又は角丸長方形が好ましい。また、フィルタの目詰まり防止の観点からは角丸長方形が特に好ましい。
　貫通孔６の孔径は捕捉対象とする成分のサイズに応じて孔径を設定される。本明細書において開口形状が楕円、長方形、多角形等の円以外の形状における孔径とはそれぞれの貫通孔を通過できる球の直径の最大値とする。例えば開口形状が長方形の場合、図５に示すように、短辺側の短孔径と、長辺側の長孔径とを定義することができるが、貫通孔６の孔径は短孔径となる。また、貫通孔の孔径は例えば開口形状が長方形の場合、その長方形の短辺の長さとなり、開口形状が多角形の場合、その多角形の内接円の直径となる。開口形状が長方形又は角丸長方形の場合、捕捉対象とする細胞が貫通孔６に捕獲された状態であっても開口部において開口形状の長辺方向に隙間ができる。この隙間を通して液体が通過可能である為、フィルタの目詰まりを防止することができる。金属フィルタの短孔径の長さは５～１５μｍが好ましく、７～９μｍがさらに好ましい。
　フィルタ１１，２１の貫通孔の平均開口率は３～５０％が好ましく、３～２０％がより好ましく、３～１０％が特に好ましい。ここで、開口率とは、フィルターとして機能する領域の面積に対する貫通孔が占める面積の割合をいう（図５参照）。すなわち、フィルタとして機能する領域の面積とは、フィルタに含まれる複数の貫通孔のうち、貫通孔の最外部を結んで得られる領域（図５において破線で囲まれた領域Ａ１）である。開口率が高すぎると白血球にかかる圧力が低下し、白血球残が増加する。開口率が低いと流せる血液量が低下する。
　フィルタ１１，２１の厚さは３μｍ～５０μｍであることが好ましく、５μｍ～３０μｍであることがより好ましく、８μｍ～２０μｍであることが特に好ましい。フィルタ１１，２１の膜厚が３μｍ未満の場合はフィルタの強度が低下し、取り扱い性が困難になる場合がある。逆に、５０μｍを超えると加工時間が長くなることによる生産性低下、必要以上の材料消費によるコスト的な不利や微細加工そのものが困難になることが懸念される上、白血球等の捕捉対象の特定の細胞以外の細胞が通過しにくくなる。
　以上回路形成後、樹脂層を剥離し、銅箔をエッチング（図３）か、又は銅板を除去する（図４）ことで、図３（Ｈ）又は図４（Ｇ）に示すように、めっき層５によるフィルタが完成する。
　次に、フィルタに残っているレジスト（露光部３ａ）を強アルカリにより除去する。強アルカリとしては、０．１ｗｔ％～１０ｗｔ％のＮａＯＨ又はＫＯＨ水溶液が好ましい。剥離を促進するためにモノエタノールアミン（１～２０ｖｏｌ％）等を添加しても良い。剥離が困難な場合は過マンガン酸ナトリウム又は過マンガン酸カリウム等にアルカリ（０．１ｗｔ％～１０ｗｔ％のＮａＯＨ又はＫＯＨ）を加えた液でレジストを除去することもできる。
　レジストを除去したフィルタに対しては貴金属めっきを行うと良い。
　貴金属めっきとしては、金、パラジウム、白金、ルテニウム、インジウムなどが望ましい。
　貴金属めっきの中でも金は前出の様に全ての金属の中で最も酸化還元電位が高く、細胞毒性がないとされている。長期保存での変色等も殆どない。
　金めっきは無電解で行うことも出来るし、電解で行うことも出来る。電解で行う場合は厚みばらつきが大きくなり、フィルタの孔径精度に影響出やすい為、無電解で行うことが望ましい。但し、電解金めっきは被覆率を向上できる。
　金めっきは置換めっきで行うだけでも効果があるが、置換めっきと還元めっきを組み合わせた方が、効果が大きい。
　金めっき前の金属フィルタは表面が酸化していることがある。そこで、酸化皮膜の除去を行うのであるが、ここでは金属イオンと錯体を形成する化合物の入った水溶液で洗浄すると良い。
　具体的にはシアン類やＥＤＴＡ類、又はクエン酸類の入った水溶液がよい。
　中でもクエン酸類は金めっきの前処理として最適である。具体的にはクエン酸の無水物、クエン酸の水和物、クエン酸塩あるいはクエン酸塩の水和物であればよく、具体的には、クエン酸無水物、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム等を使用することができる。その濃度は０．０１ｍｏｌ／Ｌ～３ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．０３ｍｏｌ／Ｌ～２ｍｏｌ／Ｌであることがより好ましく、０．０５ｍｏｌ／Ｌ～１ｍｏｌ／Ｌの範囲であることが特に好ましい。０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上とすることで、無電解金めっき層と金属フィルタの密着性が向上する。
３ｍｏｌ／Ｌを超えた場合、効果が向上しない上、経済的に好ましくない。
　クエン酸を含む溶液への浸漬は、７０℃～９５℃で、１～２０分間行うと良い。
　クエン酸を含む溶液は、発明の効果が得られる範囲でめっき液などに含まれる還元剤、ｐＨ調整剤等の緩衝剤を加えることも可能であるが、還元剤、ｐＨ調整剤などは少量が望ましく、クエン酸のみの水溶液が最も好ましい。クエン酸を含む溶液のｐＨは、好ましくは５～１０であり、より好ましくは６～９である。
　ｐＨ調整剤としては、酸又はアルカリであれば特に限定されず、酸としては、塩酸、硫酸、硝酸などが使用でき、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、等のアルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物溶液が挙げられる。前述したように、クエン酸の効果を阻害しない範囲で使用することができる。また、クエン酸を含む溶液に、硝酸を１００ｍｌ／Ｌといった高濃度で含有させると、クエン酸のみを含む溶液で処理した場合と比較して、接着性を改善する効果が低下する。
　還元剤としては、還元性のあるものであれば特に限定されず、次亜リン酸、ホルムアルデヒド、ジメチルアミンボラン、水素化ホウ素ナトリウムなどが挙げられる。
　次に、置換金めっきを行う。置換金めっきにはシアン浴と非シアン浴とがあるが、環境負荷又は残存時の細胞毒性を考えると非シアン浴が望ましい。非シアン浴に含まれる金塩としては、塩化金酸塩、亜硫酸金塩、チオ硫酸金塩、チオリンゴ酸金塩が例示可能である。金塩は一種類のみ用いてもよく、二種以上を組み合わせて用いても良い。
　さらに、シアン系の浴は、金属を溶解する効果が強すぎるため、金属によっては溶解してピンホールが発生しやすい。上記のように前処理を十分に行う場合は非シアン系のめっき浴が好ましい。
　金の供給源としては亜硫酸金が特に好ましい。亜硫酸金としては、亜硫酸金ナトリウム、亜硫酸金カリウム、亜硫酸金アンモニウム、などがよい。
　金濃度は０．１ｇ／Ｌ～５ｇ／Ｌの範囲が好ましい。０．１ｇ／Ｌ未満では金が析出しにくく、５ｇ／Ｌを超えると液が分解しやすくなる。
　置換金めっき浴には金の錯化剤としてアンモニウム塩又はエチレンジアミンテトラ酢酸塩が入っているとよい。アンモニウム塩としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムが挙げられ、エチレンジアミンテトラ酢酸塩としては、エチレンジアミンテトラ酢酸、エチレンジアミンテトラ酢酸ナトリウム、エチレンジアミンテトラ酢酸カリウム、エチレンジアミンテトラ酢酸アンモニウムを使用する。アンモニウム塩の濃度は、７×１０－３ｍｏｌ／Ｌ～０．４ｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することが好ましく、アンモニウム塩の濃度がこの範囲外だと液が不安定になる傾向がある。エチレンジアミンテトラ酢酸塩の濃度は、２×１０－３ｍｏｌ／Ｌ～０．２ｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することが好ましく、アンモニウム塩の濃度がこの範囲外だと液が不安定になる傾向がある。
　液を安定に保つために０．１ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌの亜硫酸塩が入っているとよい。亜硫酸塩としては亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、又は亜硫酸アンモニウムなどが挙げられる。
　ｐＨ調整剤としてｐＨを下げる場合には、塩酸或いは硫酸を使用するのが好ましい。また、ｐＨを上げる場合には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水を使用することが好ましい。ｐＨは６～７に調整するとよい。この範囲外では液の安定性又はめっきの外観に悪影響を与える。
　置換めっきは液温３０度～８０度で使用することが好ましく、この範囲外では液の安定性又はめっきの外観に悪影響を与える。
　以上のようにして置換めっきを行うわけであるが、置換めっきでは完全に金属を覆うのが難しい。そこで、次に還元剤の入った還元型の金めっきを行う。置換めっきの厚みは０．０２～０．１μｍの範囲が好ましい。
　還元型の金めっきの金塩としては、亜硫酸金塩及びチオ硫酸塩が好ましく、その含有量は金として１～１０ｇ／Ｌの範囲であることが好ましい。金の含有量が１ｇ／Ｌ未満であると、金の析出反応が低下し、１０ｇ／Ｌを超えると、めっき液の安定性が低下すると共に、めっき液の持ち出しにより金消費量が多くなるため好ましくない。含有量は２～５ｇ／Ｌにすることがより好ましい。
　還元剤としては次亜リン酸、ホルムアルデヒド、ジメチルアミンボラン、水素化ホウ素ナトリウムなどが挙げられるが、フェニル化合物系還元剤がより好ましい。例えば、フェノール、ｏ－クレゾール、ｐ－クレゾール、ｏ－エチルフェノール、ｐ－エチルフェノール、ｔ－ブチルフェノール、ｏ－アミノフェノール、ｐ－アミノフェノール、ヒドロキノン、カテコール、ピロガロール、メチルヒドロキノン、アニリン、ｏ－フェニレンジアミン、ｐ－フェニレンジアミン、ｏ－トルイジン、ｏ－エチルアニリン、ｐ－エチルアニリン等が挙げられ、これらの１種又は２種以上を用いることが出来る。
　還元剤の含有量は、０．５ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌであることが好ましい。還元剤の含有量が０．５ｇ／Ｌ未満であると、実用的な析出速度を得ることが困難となる傾向があり、５０ｇ／Ｌを超えると、めっき液の安定性が低下する傾向がある。還元剤の含有量は２ｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌとすることがより好ましく、２ｇ／Ｌ～５ｇ／Ｌであることが特に望ましい。
　無電解金めっき液は重金属塩を含んでいても良い。析出速度を促進する観点から、重金属塩はタリウム塩、鉛塩、砒素塩、アンチモン塩、テルル塩及びビスマス塩からなる群より選ばれる少なくとも一つであることが好ましい。
　タリウム塩としては、硫酸タリウム塩、塩化タリウム塩、酸化タリウム塩、硝酸タリウム塩等の無機化合物塩、マロン酸二タリウム塩等の有機錯体塩が挙げられ、鉛塩としては、硫酸鉛塩、硝酸鉛塩等の無機化合物塩、酢酸塩等の有機酢酸塩が挙げられる。
　また、砒素塩としては、亜砒素塩、砒酸塩三酸化砒素等の無機化合物塩又は有機錯体塩が挙げられ、アンチモン塩としては、酒石酸アンチモニル塩等の有機錯体塩、塩化アンチモン塩類、オキシ硫酸アンチモン塩、三酸化アンチモン等の無機化合物塩類が挙げられる。
　テルル塩としては、亜テルル酸塩、テルル酸塩等の無機化合物塩又は有機錯体塩が挙げられ、ビスマス塩としては、硫酸ビスマス（III）、塩化ビスマス（III）、硝酸ビスマス（III）、等の無機化合物塩、シュウ酸ビスマス（III）等の有機錯体塩が挙げられる。
　上述の重金属塩は、１種類又はそれ以上用いることが出来るが、その添加量の合計はめっき液全容量を基準として１～１００ｐｐｍが好ましく、１～１０ｐｐｍがより好ましい。１ｐｐｍ未満では、析出速度向上効果が十分でない場合があり、１００ｐｐｍを越す場合はめっき液安定性が悪くなる傾向にある。
　無電解金めっき液は硫黄系化合物を含んでいても良い。フェニル化合物系還元剤及び重金属塩を含む無電解金めっき液中に、硫黄化合物を更に含有させることにより、液温６０～８０℃程度の低温であっても十分な析出速度が得られ、被膜外観も良好である上、めっき液の安定性が特に優れるようになる。
　硫黄系化合物としては、硫化物塩、チオシアン酸塩、チオ尿素化合物、メルカプタン化合物、スルフィド化合物、ジスルフィド化合物、チオケトン化合物、チアゾール化合物、チオフェン化合物等が挙げられる。
　硫化物塩としては、例えば、硫化カリウム、硫化ナトリウム、多硫化ナトリウム、多硫化カリウム等が挙げられ、チオシアン酸塩としては、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、ジチオシアン酸カリウム等が挙げられ、また、チオ尿素化合物としては、チオ尿素、メチルチオ尿素、ジメチルチオ尿素等が挙げられる。
　メルカプタン化合物としては、１，１－ジメチルエタンチオール、１－メチル－オクタンチオール、ドデカンチオール、１，２－エタンジチオール、チオフェノール、ｏ－チオクレゾール、ｐ－チオクレゾール、ｏ－ジメルカプトベンゼン、ｍ－ジメルカプトベンゼン、ｐ－ジメルカプトベンゼン、チオグリコール、チオジグリコール、チオグリコール酸、ジチオグリコール酸、チオリンゴ酸、メルカプトプロピオン酸、２－メルカプトベンゾオゾイミダゾール、２－メルカプト１－メチルイミダゾール、２－メルカプト－５－メチルベンゾイミダゾール、等が例示できる。
　スルフィド化合物としては、ジエチルスルフィド、ジイソプロピルスルフィド、エチルイソプロピルスルフィド、ジフェニルスルフィド、メチルフェニルスルフィド、ローダニン、チオジグリコール酸、チオジプロピオン酸等が例示でき、ジスルフィド化合物としては、ジメチルジスルフィド、ジエチルジスルフィド、ジプロピルジスルフィド、等が例示できる。
　更に、チオケトン化合物としては、チオセミカルバジド等が例示でき、チアゾール化合物としてはチアゾール、ベンゾチアゾール、２－メルカプトベンゾチアゾール、６－エトキシ－２－メルカプトベンゾチアゾール、２－アミノチアゾール、２，１，３－ベンゾチアジアゾール、１，２，３－ベンゾチアジアゾール、（２－ベンゾチアゾリルチオ）酢酸、３－（２－ベンゾチアゾリルチオ）プロピオン酸等が例示でき、チオフェン化合物としては、チオフェン、ベンゾチオフェン等が例示できる。
　硫黄系化合物は、単独で用いてもよく、２種類以上を用いても良い。硫黄系化合物の含有量は１ｐｐｍ～５００ｐｐｍであることが好ましく、１ｐｐｍ～３０ｐｐｍであることがより好ましく、１ｐｐｍ～１０ｐｐｍであることが特に好ましい。硫黄系化合物の含有量が１ｐｐｍ未満では、析出速度が低下し、めっき付きまわり不良が生じ、皮膜外観が悪化する。５００ｐｐｍを超えると、濃度管理に困難を生じ、めっき液が不安定になる。
　無電解金めっき液には、上述の金塩、還元剤、重金属塩及び硫黄系化合物に加えて、錯化剤、ｐＨ緩衝剤及び金属イオン隠蔽剤の少なくとも１つを含有することが好ましく、これ等すべてを含有することがより好ましい。
　本実施形態の無電解金めっき液には、錯化剤を含有させることが好ましい。具体的には亜硫酸塩、チオ硫酸塩、チオリンゴ酸塩等の非シアン系錯化剤が挙げられる。錯化剤の含有量は、めっき液の全容量を基準として１ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌが好ましい。錯化剤の含有量が１ｇ／Ｌ未満である場合、金錯化力は低下し、安定性が低下する。２００ｇ／Ｌを超えると、めっき安定性は向上するが、液中に再結晶が発生し、経済的に芳しくない。錯化剤の含有量は２０ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌとすることがより好ましい。
無電解金めっき液には、ｐＨ緩衝剤を含有させることが好ましい。ｐＨ緩衝剤により析出速度を一定値に保ち、めっき液を安定化させる効果がある。緩衝剤は複数のものを混ぜても良い。ｐＨ緩衝剤としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、硼酸塩、クエン酸塩、硫酸塩等が挙げられ、これ等の中では硼酸、硫酸塩が特に好ましい。
　ｐＨ緩衝剤の含有量は、めっき液の全容量を基準として１ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌであることが好ましい。ｐＨ緩衝剤の含有量が１ｇ／Ｌ未満であると、ｐＨの緩衝効果がなく、１００ｇ／Ｌを超えると再結晶化してしまう恐れがある。より好ましい含有量は２０ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌである。
　金めっき液には隠蔽剤を含有させることが好ましい。隠蔽剤としては、ベンゾトリアゾール系化合物を用いることができ、ベンゾトリアゾール系化合物としては、例えばベンゾトリアゾールナトリウム、ベンゾトリアゾールカリウム、テトラヒドロベンゾトリアゾール、メチルベンゾトリアゾール、ニトロベンゾトリアゾール等が例示できる。
　金属イオン隠蔽剤の含有量は、めっき液の全容量を基準として０．５ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌであることが好ましい。金属イオン隠蔽剤の含有量が０．５ｇ／Ｌ未満であると、不純物の隠蔽効果が少なく、十分な液安定性を確保できない傾向がある。一方、１００ｇ／Ｌを超えると、めっき液中で再結晶化が生じる場合がある。コスト及び効果を鑑みると、２ｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌの範囲がもっとも好ましい。
　金めっき液のｐＨは５～１０の範囲であることが好ましい。めっき液のｐＨが５未満の場合、めっき液の錯化剤である亜硫酸塩又はチオ硫酸塩が分解し、毒性の亜硫酸ガスが発生する恐れがある。ｐＨが１０を超える場合、めっき液の安定性が低下する傾向がある。還元剤の析出効率を向上させ、速い析出速度を得るために、無電解金めっき液のｐＨは８～１０の範囲とすることが好ましい。
　無電解めっきの方法としては、置換金めっきが終了したフィルタを浸漬して金めっきを行う。
　めっきの液温は５０℃～９５℃がよい。５０℃未満では析出効率が悪く、９５℃以上では液が不安定になりやすい。
　このようにして形成される最外層の金めっき層７は、９９重量％以上の純度の金からなることが好ましい。金めっき層７の金の純度が９９重量％未満であると、接触部の細胞毒性が高くなる。信頼性を高める観点からは、金めっき層７の金の純度は、９９．５重量％以上であることがより好ましい。
　また、金めっき層７の厚さは、０．００５～３μｍとすることが好ましく、０．０５～１μｍとすることがより好ましく、０．１μｍ～０．５μｍとすることが更に好ましい。金めっき層７の厚さを０．００５μｍ以上とすることで、金めっき層７の溶出をある程度抑制できる。一方、３μｍを超えても、それ以上効果が大きく向上しないため、経済的な観点からも３μｍ以下とすることが好ましい。
　なお、金属フィルタに代えて高分子材料から構成されるフィルタを用いることもできる。高分子材料をフィルタの材質として用いる場合、金属と比較して成形加工性に優れるため、例えば貫通孔の形状や孔径をより細かく制御することができる。また、高分子材料から構成されるフィルタの主成分としてポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタン、ポリ乳酸、パリレン等を採用する場合、これらの材料は抗血栓性が強いという特徴を有する。
　高分子材料から構成されるフィルタの製造方法は特に限定されないが、例えば、トラックエッチング法を用いることができる。具体的には、フィルタの厚さに対応した厚さの高分子フィルムを準備し、当該高分子フィルムに対して、イオンビーム、中粒子線又はレーザ光等を照射することにより、貫通孔を形成する。また、必要に応じて、照射後、ケミカルエッチングにより貫通孔を形成してもよい。貫通孔が形成された高分子フィルムを、フィルタの形状に応じて裁断することで、高分子材料から構成されるフィルタを得ることができる。
　このように、本実施形態に係る細胞捕捉デバイスに用いられるフィルタは、適宜変更することができる。
　以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明に係る細胞捕捉方法、特定細胞捕捉済デバイスの製造方法、及び、特定細胞含有溶液の製造方法は適宜変更することができる。
　例えば、本発明の一形態に係る細胞捕捉方法において、液を流す工程において、フィルタ上の液面の高さが３０μｍ以上である態様とすることができる。
　また、哺乳動物の全血、血清或いは血漿が、ウシ、ウマ及びヒトの何れかの由来である態様とすることができる。
　哺乳動物の全血、血清或いは血漿が、ヒト由来である態様とすることができる。
　たんぱく質を含む水溶液がリン酸緩衝液を主成分とする態様とすることができる。
　たんぱく質を含む水溶液が抗凝固剤を含む態様とすることができる。
　抗凝固剤がＥＤＴＡ、ヘパリン、クエン酸ナトリウム及びフッ化ナトリウムのいずれかである態様とすることができる。
　細胞含有溶液中の細胞が、ヒト血液中に存在する細胞である態様とすることができる。
　細胞含有溶液中の細胞が、ヒト白血球、血中循環腫瘍細胞、循環血管内皮細胞及び癌幹細胞のいずれかを含む態様とすることができる。
　フィルタが、ポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネート又はパリレンを用いて成型加工されたものである態様とすることができる。
　フィルタ表面が金、白金、パラジウム又はそれらの合金である態様とすることができる。
フィルタがニッケル、銅又はパラジウムを主成分とし、その表面に金、白金、パラジウム又はそれらの合金がめっきされている態様とすることができる。
　フィルタの最外層が金である態様とすることができる。
　フィルタの最外層は厚さが０．０５μｍ～１μｍの貴金属めっきである態様とすることができる。
　フィルタの貫通孔を形成する形状が円、楕円、角丸長方形、長方形、正方形のいずれかである態様とすることができる。
　フィルタの貫通孔を形成する形状が長方形及び角丸長方形のいずれか一つ以上の形状を含み、その短辺の長さが５μｍ～１５μｍである態様とすることができる。
　フィルタの膜厚が３μｍ～５０μｍである態様とすることができる。
　前記貫通孔の平均開口率は０．１％～５０％である態様とすることができる。
　また、本発明の一形態に係る特定細胞捕捉済デバイスの製造方法においては、前記液を流す工程において、フィルタ上の液面の高さが３０μｍ以上である態様とすることができる。
　ここで、哺乳動物の全血、血清或いは血漿が、ウシ、ウマ及びヒトの何れかの由来である態様とすることができる。
　哺乳動物の全血、血清或いは血漿が、ヒト由来である態様とすることができる。
　たんぱく質を含む水溶液がリン酸緩衝液を主成分とする態様とすることができる。
　たんぱく質を含む水溶液が抗凝固剤を含む態様とすることができる。
　抗凝固剤がＥＤＴＡ、ヘパリン、クエン酸ナトリウム及びフッ化ナトリウムのいずれかである態様とすることができる。
　細胞含有溶液中の細胞が、ヒト血液中に存在する細胞である態様とすることができる。
　細胞含有溶液中の細胞が、ヒト白血球、血中循環腫瘍細胞、循環血管内皮細胞及び癌幹細胞のいずれかを含む態様とすることができる。
　フィルタが、ポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネート又はパリレンを用いて成型加工されたものである態様とすることができる。
　フィルタ表面が金、白金、パラジウム又はそれらの合金である態様とすることができる。
　フィルタがニッケル、銅又はパラジウムを主成分とし、その表面に金、白金、パラジウム又はそれらの合金がめっきされている態様とすることができる。
　フィルタの最外層が金めっきである態様とすることができる。
　フィルタの最外層は厚さが０．０５μｍ～１μｍの貴金属めっきである態様とすることができる。
　フィルタの貫通孔を形成する形状が円、楕円、角丸長方形、長方形、正方形のいずれかである態様とすることができる。
　フィルタの貫通孔を形成する形状が長方形、又は角丸長方形のいずれか一つ以上の形状を含み、その短辺の長さが５μｍ～１５μｍである態様とすることができる。
　フィルタの膜厚が３μｍ～５０μｍである態様とすることができる。
　前記貫通孔の平均開口率は０．１％～５０％である態様とすることができる。
　また、本発明の一形態に係る特定細胞含有溶液の製造方法においては、前記液を流す工程において、フィルタ上の液面の高さが３０μｍ以上である態様とすることができる。
　ここで、細胞含有溶液の溶媒が、哺乳動物の全血、血清、血漿、またはそれらが由来のたんぱく質を含む水溶液からなる態様とすることができる。
　哺乳動物の全血、血清或いは血漿が、ウシ、ウマ、及びヒトの何れかの由来である態様とすることができる。
　哺乳動物の全血、血清或いは血漿が、ヒト由来である態様とすることができる。
　たんぱく質を含む水溶液がリン酸緩衝液を主成分とする態様とすることができる。
　たんぱく質を含む水溶液が抗凝固剤を含む態様とすることができる。
　抗凝固剤がＥＤＴＡ、ヘパリン、クエン酸ナトリウム及びフッ化ナトリウムのいずれかである態様とすることができる。
　細胞含有溶液中の細胞が、ヒト血液中に存在する細胞である態様とすることができる。
　細胞含有溶液中の細胞が、ヒト白血球、血中循環腫瘍細胞、循環血管内皮細胞、及び癌幹細胞のいずれかである態様とすることができる。
　フィルタが、高分子又は金属を用いて成型加工される態様とすることができる。
　フィルタが、ポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネート、パリレンを用いて成型加工される態様とすることができる。
　フィルタ表面が金、白金、パラジウム、又はそれらの合金である態様とすることができる。
　フィルタがニッケル、銅又はパラジウムを主成分とし、その表面に金、白金、パラジウム、又はそれらの合金がめっきされている態様とすることができる。
　フィルタの最外層が金めっきである態様とすることができる。
　フィルタの最外層は厚さが０．０５μｍ～１μｍの貴金属めっきである態様とすることができる。
　フィルタの貫通孔を形成する形状が円、楕円、角丸長方形、長方形、正方形のいずれかである態様とすることができる。
　フィルタの貫通孔を形成する形状が長方形、又は角丸長方形のいずれか一つ以上の形状を含み、その短辺の長さが５μｍ～１５μｍである態様とすることができる。
　フィルタの膜厚が３μｍ～５０μｍである態様とすることができる。
　前記貫通孔の平均開口率は０．１％～５０％である態様とすることができる。
　前記細胞溶液、前記処理液を導入する速度が、５０μＬ／ｍｉｎ～１０００μＬ／ｍｉｎである態様とすることができる。
（評価例１）
　感光性樹脂組成物（ＰＨＯＴＥＣ　ＲＤ－１２２５：厚さ２５μｍ、日立化成株式会社製）を２５０ｍｍ角の基板（ＭＣＬ－Ｅ６７９Ｆ：ＭＣＬの表面にピーラブル銅箔を貼り合わせた基板、日立化成株式会社製）の片面にラミネートした。ラミネート条件はロール温度９０℃、圧力０．３ＭＰａ、コンベア速度２．０ｍ／分で行った。
次に、光の透過部の形状が角丸長方形、サイズが７．８（短孔径）×１００（長孔径）μｍで開口率６．７％となるように設計したガラスマスクを基板のフォトレジストラミネート面に静置した。本実施例においては同一の方向を向いた角丸長方形が長軸及び短軸方向に一定のピッチで整列したガラスマスクを使用した。
　続いて、６００ｍｍＨｇ以下の真空下において、ガラスマスクを載置した基板上部から紫外線照射装置によって露光量３０ｍＪ／ｃｍ２の紫外線を照射した。
　次に、１．０％炭酸ナトリウム水溶液で現像を行い、基板上に長方形のフォトレジストが垂直に立ったレジスト層を形成した。このレジスト付き基板の銅露出部分にｐＨが４．５になるように調整したニッケルめっき液中温度５５℃、約２０分間約２０μｍめっきを行った。ニッケルめっき液の組成を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　次に、得られたニッケルめっき層を基板のピーラブル銅箔とともに剥離し、このピーラブル銅箔を温度４０℃で約１２０分間、攪拌処理での薬液による化学的溶解（メックブライトＳＦ－５４２０Ｂ、メック株式会社）によって除去することにより金属フィルタとなる自立膜（２０ｍｍ×２０ｍｍ）を取り出した。
　最後に、自立膜内に残ったフォトレジストを温度６０℃で約４０分間、超音波処理でのレジスト剥離（Ｐ３　Ｐｏｌｅｖｅ、Ｈｅｎｋｅｌ）によって除去し、微細貫通孔を有する金属フィルタを作製した。
　これによって、シワ・折れ・キズ・カール等のダメージはなく、十分な精度の貫通孔を有する金属フィルタを作製した。
　次に、酸性脱脂液Ｚ－２００（ワールドメタル製：商品名）に金属フィルタを浸漬し、金属フィルタ上の有機物の除去を行った（４０℃３分）。
　水洗後、非シアン系の無電解ＡｕめっきであるＨＧＳ－１００（日立化成製：商品名）から金供給源である亜硫酸金を抜いた液により８０℃１０分の条件で置換金めっき前処理を行った。
　次に非シアン系の置換型無電解ＡｕめっきであるＨＧＳ－１００（日立化成製商品名）に８０℃２０分浸漬し、置換金めっきを行った。置換金めっきの厚みは０．０５μｍであった。
水洗後、非シアン系還元型無電解ＡｕめっきであるＨＧＳ－５４００（日立化成製商品名）に６５℃１０分浸漬し、金めっきを行い、水洗後乾燥を行った。金めっきのトータル厚みは０．２μｍであった。以上により評価例１に係るフィルタを作成した。
（評価例２）
　電気Ｎｉめっきの変わりに電気パラジウムめっきを用いた以外は評価例１と同様に評価例２に係るフィルタを作製した。電気パラジウムめっき液はパラディックスＬＦ－５（日本エレクトロプレイティング・エンジニヤース株式会社：商品名）を用いた。めっき温度は５０℃、電流密度１Ａ／ｄｍ２の条件でめっきを行い、約４．２分／μｍの条件で約２０μｍとなるように電気めっきを行った以外は評価例１と同様の条件でめっきを行った。
（評価例３）
　ＭＣＬのピーラブル銅箔の代わりにピーラブルニッケル箔を用いた（電気めっき後はニッケル箔を除去）。さらに電気Ｎｉめっきの変わりに電気銅めっきを用いた以外は評価例１と同様に表面に評価例３に係るフィルタを作製した。を作製した。電気銅めっき液はミクロファブＣｕ２００（日本エレクトロプレイティング・エンジニヤース株式会社：商品名）を用いた。めっき温度は２５℃、電流密度３Ａ／ｄｍ２の条件でめっきを行い、約１．５分／μｍの条件で約２０μｍとなるように電気めっきを行った以外は評価例１と同様の条件でめっきを行った。
（評価例４）
　金めっきを行わなかったこと以外は評価例１と同様に評価例４に係るフィルタを作製した。
　（評価例５）
　２段階の金めっきの代わりに１段階の無電解パラジウムめっきを行った以外は評価例１と同様に評価例５に係るフィルタを作製した。無電解パラジウムめっき液にはパラデックスストライク３（日本エレクトロプレイティング・エンジニヤース株式会社製：商品名）を用いた。パラジウムの厚みは０．１μｍであった。
（評価例６）
　２段階の金めっきの代わりに１段階の無電解白金めっきを行った以外は評価例１と同様に評価例６に係るフィルタを作製した。無電解白金めっき液にはレクトレスＰｔ１００（日本エレクトロプレイティング・エンジニヤース株式会社製：商品名）を用いた。白金の厚みは０．１μｍであった。
（実験）
（非小細胞癌細胞株の調製）
　非小細胞癌細胞株であるＮＣＩ－Ｈ３５８細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地にて、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて静置培養した。トリプシン処理により培養皿から細胞を剥離させて回収し、リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）を用いて洗浄した後に、１０μＭ　ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ　Ｒｅｄ　ＣＭＴＰＸ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）にて３７℃、３０分間静置させることで、ＮＣＩ－Ｈ３５８細胞を染色した。その後、ＰＢＳにて洗浄し、トリプシン処理にて３７℃にて３分間静置させることで、細胞塊を解離させた。その後、培地にてトリプシン処理を停止させ、ＰＢＳにて洗浄後、２ｍＭＥＤＴＡ及び０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（以下２ｍＭ　ＥＤＴＡ－０．５％　ＢＳＡ－ＰＢＳという。）に懸濁して、調整用の懸濁液を得た。なお、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水であり和光純薬工業製製品コード１６６－２３５５５を用いた。ＢＳＡはＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製（Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎａｍｅ　：　Ａｌｂｕｍｉｎ　ｆｒｏｍ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ－Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ　ｐｏｗｄｅｒ，　Ｂｉｏ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ｆｏｒ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ）のものを用いた。ＥＤＴＡは２Ｎａ（エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，，Ｎ’－４酢酸二ナトリウム塩二水和物）（和光純薬工業製製品コード３４５－０１８６５）を用いた。
＜液体を一度も引き抜かずに連続的に処理を行った場合の細胞形態評価＞
（実施例１）
　評価例１のフィルタをカートリッジ（本実施形態に係る細胞捕捉デバイスに相当する）にセットしたＣＴＣ回収装置：ＣＴ６０００（日立化成製商品名）を用いて実験を行った。ＣＴＣ回収装置は血液サンプルや試薬を導入するための流路を備えており、流路の入り口は、シリンジを加工して作製したリザーバーに接続した。このリザーバーに、血液サンプルや試薬を順次投入していくことで、ＣＴＣの捕捉、染色、洗浄などの操作を連続的に容易に行えるようにした。
　ＣＴＣ回収装置に血液サンプルを導入して癌細胞を濃縮した。血液サンプルとして、ＥＤＴＡ含有真空採血管に採血した健常者血液に、血液１ｍＬあたり１０００個の癌細胞を含有させたサンプルを用いた。癌細胞としては、上記のヒト非小細胞肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ３５８を使用した。なお、血液は採血後６時間のものを用いた。
　まず、リザーバーに、２ｍＭ　ＥＤＴＡ－０．５％　ＢＳＡ（牛血清アルブミン）－ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ製ＰＢＳｐＨ７．４）　１ｍｌ（以下洗浄液）を導入し、フィルタ上を満たし、１０分放置した。続いて、ぺリスタルティックポンプを使用して流速２００μＬ／分で送液を開始した。その後、血液３ｍｌを投入した。約５分後、リザーバーに９ｍＬの洗浄液を導入して細胞の洗浄を行った。
　次に洗浄液に４％ＰＦＡを溶かした液をカートリッジに入れ、細胞を１５分浸した。洗浄後、洗浄液に０．２％ＴｒｉｔｏｎＸを溶かした液をカートリッジに入れ、細胞を１５分浸した。
　さらに１０分後、ポンプ流速を２０μＬ／分に変更し、リザーバーに６００μＬの細胞染色液（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２：３０μＬ、Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ：３００ｍｌ）を導入し、フィルタ上の癌細胞または白血球を蛍光染色した。フィルタ上に捕捉された細胞に対して３０分間染色を行った後、リザーバーに１ｍＬの２ｍＭ　ＥＤＴＡ－０．５％　ＢＳＡ－ＰＢＳを導入して細胞の洗浄を行った。
　続いて、コンピュータ制御式電気ステージ及び冷却デジタルカメラ（ＤＰ７０、オリンパス株式会社）を装備した蛍光顕微鏡（ＢＸ６１、オリンパス株式会社）を使用して、フィルタ上の癌細胞及び白血球の撮像を行った。Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２及びＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ　Ｒｅｄ　ＣＭＴＰＸ由来の蛍光を観察するために、それぞれＷＵ及びＷＩＧフィルタ（オリンパス株式会社）を用いて画像を取得した。画像取得及び解析ソフトにはＬｕｍｉｎａ　Ｖｉｓｉｏｎ（三谷商事株式会社）を用いた。撮像した細胞の画像解析を行い、孔内に挟み込まれた四角形の細胞と、フィルタ上で円形を保持している細胞の２つに分類した。
（実施例２）
　血液の導入速度を４００μＬ／ｍｉｎで行った以外は、実施例１と同様の条件で実験を行った。
（実施例３）
血液の導入速度を６００μＬ／ｍｉｎで行った以外は、実施例１と同様の条件で実験を行った。
（実施例４）
　血液の導入速度を８００μＬ／ｍｉｎで行った以外は、実施例１と同様の条件で実験を行った。
（比較例１）
　まず、リザーバーに、洗浄液１ｍｌ（以下洗浄液）を導入し、フィルタ上を満たし、１０分放置した。続いて、ぺリスタポンプを使用して流速２００μＬ／分で送液を開始した。その後、血液３ｍｌを投入した。約５分後、リザーバーに９ｍＬの洗浄液を導入して細胞の洗浄を行った。その後、実施例１と同様の方法で実験を行い、細胞を染色した後、細胞捕捉デバイス（カートリッジ）内の液体を２００μＬ／ｍｉｎの速度で引き抜き、蛍光顕微鏡で撮影を行った。撮像した細胞の画像解析を行い、孔内に挟み込まれている細胞と、円形を保持している細胞の２つに分類を行った。
（比較例２）
比較例１と同様の方法で実験を行い、細胞捕捉デバイス内の液体を５０μＬ／ｍｉｎの速度で引き抜き、蛍光顕微鏡で撮影を行った。
（比較例３）
比較例１と同様の方法で実験を行い、細胞捕捉デバイス内の液体を２μＬ／ｍｉｎの速度で引き抜き、蛍光顕微鏡で撮影を行った。
＜１回目～ｎ回目の液体を流す工程の間において、一度液体を完全に引き抜いた後に、再度液体を導入した場合の細胞形態評価＞
（比較例４）
　実施例１と同様の方法で実験を行い、染色液導入後の洗浄が終了した後に、５０μＬ／ｍｉｎの速度で細胞捕捉デバイス内の液体を完全に引き抜いた。液体を完全に引き抜いた後、再度リザーバーから洗浄液を２００μ／ｍｉｎの速度で導入した。その後、蛍光顕微鏡で撮影を行い、撮像した細胞の画像解析を行い、孔内に挟み込まれている細胞と、円形を保持している細胞の２つに分類を行った。
（結果）
　まず、実施例１の捕捉後の細胞の写真を図６に示す。実施例１では、細胞が円形であることを確認でき、細胞の粒径も理論平均粒径の１８μｍ前後であった。これより、細胞捕捉後に液を抜ききらずに細胞を保存することで、細胞の形態を維持することが可能となり、孔内に挟まることもなく取り出すことが可能であることが示唆された。
　実施例４の捕捉後の細胞の写真を図７に示す。実施例１と同様に、細胞が円形であることを確認でき、細胞の粒径も理論粒径の１８　μｍ前後であった。
　比較例１の捕捉後の細胞の写真を図８に示す。比較例１では、液を引き抜かれた後、フィルタ上に捕捉された細胞は、液の吸引の圧力によって、フィルタの貫通孔に細胞が嵌まってしまい、細胞が四角く変形し、孔径に挟み込まれている様子が確認された。
　比較例４の捕捉後の細胞の写真を図９に示す。比較例１と同様に、細胞が四角く変形し、孔内に挟み込まれている様子が確認された。
　次に、各実施例１～６及び比較例１～４について、孔内に挟み込まれている細胞と、円形を保持している細胞の２つに分類を行った結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、液体の引き抜きを行わなかった実施例１～６においては、９５％以上の細胞が円形であり、四角形の細胞はわずかに５％以下であった。それに対して、液体の引き抜きを行った比較例１，２においては、９８％以上の細胞が孔内に挟み込まれて四角形であった。また、比較例３において２μＬ／ｍｉｎの低速度で液体を引き抜いた場合においても、８０％の細胞が四角形であった。更に、比較例４において液体を引き抜いた後に、液体を再導入した場合においても、全ての細胞が四角形であった。
　評価対象の特定の細胞（例えば、ＣＴＣ）が孔内に挟み込まれた場合、特定の細胞を検出する際に形態学的に判断することが困難となり、誤診につながる恐れがある。また、孔内に挟み込まれることにより、フィルタ上から特定の細胞を取り出すことが困難となり、細胞の解析・診断を行うことが難しくなる。このことより、細胞捕捉デバイス内の液体を最終工程まで一度も引き抜くことなく、連続的に行うことで、細胞の形を安定的に保持することが可能であることが示唆された。
＜フィルタ上の液体の液面の高さを変えた場合の細胞形態評価＞
（実施例７）
　実施例１と同様の方法を用いて、細胞の捕捉、染色、洗浄などの操作を行った。フィルタ表面からの液の高さを５０μｍに設定し液置換の操作を行った。フィルタ表面からの液面の高さは、フィルタ表面積と質量より算出し、液面を５０μｍに設定した。
　液面の高さは次式を用いて算出した。
液面の高さ（μｍ）＝体積（μｍ３）÷表面積（μｍ２）
体積（μｍ３）＝質量（μｇ）÷比重
　実施例１と同様の操作で顕微鏡を用いて撮像した細胞の画像解析を行い、孔内に挟み込まれた四角形の細胞と、フィルタ上で円形を保持している細胞の２つに分類した。
（実施例８）
　実施例７と同様の方法を用いて、フィルタ表面からの液の高さを３０μｍに設定し、液置換の操作を行った。フィルタ表面からの液面の高さは、フィルタ表面積と質量より算出し、液面を３０μｍに設定した。
（実施例９）
　実施例７と同様の方法を用いて、フィルタ表面からの液の高さを２０μｍに設定し、液置換の操作を行った。フィルタ表面からの液面の高さは、フィルタ表面積と質量より算出し、液面を２０μｍに設定した。
（実施例１０）
　実施例７と同様の方法を用いて、液置換の操作をフィルタ表面からの液の高さを１０μｍに設定し処理を行った。フィルタ表面からの液面の高さは、フィルタ表面積と質量より算出し、液面を１０μｍに設定した。
（比較例５）
　実施例７と同様の方法を用いて、液置換の操作をフィルタ表面からの液の高さを０μｍに設定し処理を行った。液を交換する時に、液体を全て細胞捕捉デバイス内から抜いてから処理を行うことで液面の高さを０μｍと設定した。
（結果）
　実施例７～実施例１０及び比較例５の結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示すように、液面の高さを５０μｍに設定した場合においては、９８％以上の細胞が円形であり、四角形の細胞は２％以下であった。一方で、液面の高さを３０μｍ，２０μｍ，１０μｍに下げていくことにより、円形の細胞の割合が低下し、四角形の細胞の割合が上昇した。比較例４の液面の高さが０μｍの場合においては、全ての細胞が孔内に挟み込まれ変形していた。
　このことより、半分以上の細胞が変形せずに円形を保持することが可能な液面の高さは、３０μｍ以上である必要性が示された。また、液面の高さを５０μｍ以上とした場合には、さらに細胞が変形せずに円形を保持する割合を高めることができることも確認された。
＜フィルタ上に捕捉した細胞を取り出す実験１：逆洗浄による取り出し（排出流路→導入流路）＞
（実施例１１）
　評価例１のフィルタをカートリッジ（本実施形態に係る細胞捕捉デバイスに相当する）にセットしたＣＴＣ回収装置：ＣＴ６０００（日立化成製商品名）を用いて実験を行った。ＣＴＣ回収装置は血液サンプルや試薬を導入するための流路を備えており、流路の入り口は、シリンジを加工して作製したリザーバーに接続した。このリザーバーに、血液サンプルや試薬を順次投入していくことで、ＣＴＣの捕捉、染色、洗浄などの操作を連続的に容易に行えるようにした。
　ＣＴＣ回収装置に血液サンプルを導入して癌細胞を濃縮した。血液サンプルとして、ＥＤＴＡ含有真空採血管に採血した健常者血液に、血液１ｍＬあたり１０００個の癌細胞を含有させたサンプルを用いた。癌細胞としては、上記のヒト非小細胞肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ３５８を使用した。尚、血液は採血後６時間のものを用いた。
　まず、リザーバーに、２ｍＭ　ＥＤＴＡ－０．５％　ＢＳＡ（牛血清アルブミン）－ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ製ＰＢＳｐＨ７．４）　１ｍｌ（以下洗浄液）を導入し、フィルタ上を満たし、１０分放置した。続いて、ぺリスタルティックポンプを使用して流速２００μＬ／分で送液を開始した。その後、血液３ｍｌを投入した。約５分後、リザーバーに９ｍＬの洗浄液を導入して細胞の洗浄を行った。
　次に洗浄液に４％ＰＦＡを溶かした液をカートリッジに入れ、細胞を１５分浸した。洗浄後、洗浄液に０．２％ＴｒｉｔｏｎＸを溶かした液をカートリッジに入れ、細胞を１５分浸した。
　さらに１０分後、ポンプ流速を２０μＬ／分に変更し、リザーバーに６００μＬの細胞染色液（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２：３０μＬ、Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ：３００ｍｌ）を導入し、フィルタ上の癌細胞または白血球を蛍光染色した。フィルタ上に捕捉された細胞に対して３０分間染色を行った後、リザーバーに１ｍＬの２ｍＭ　ＥＤＴＡ－０．５％　ＢＳＡ－ＰＢＳを導入して細胞の洗浄を行った。
　続いて、コンピュータ制御式電気ステージ及び冷却デジタルカメラ（ＤＰ７０、オリンパス株式会社）を装備した蛍光顕微鏡（ＢＸ６１、オリンパス株式会社）を使用して、フィルタ上の癌細胞及び白血球の撮像を行った。Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２及びＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ　Ｒｅｄ　ＣＭＴＰＸ由来の蛍光を観察するために、それぞれＷＵ及びＷＩＧフィルタ（オリンパス株式会社）を用いて画像を取得した。画像取得及び解析ソフトにはＬｕｍｉｎａ　Ｖｉｓｉｏｎ（三谷商事株式会社）を用いた。撮像した細胞の画像解析を行い、フィルタ上に捕捉されたがん細胞の数を計数した。
　撮像が終了したカートリッジ（本実施形態に係る特定細胞捕捉済デバイスに相当する）のバルブを全て閉めた後に、排出流路２３（図２参照）から導入流路２５（図２参照）へ液体が流れるように組み換えを行った。排出流路２３側にシリンジポンプＴＥ－３５１（テルモ株式会社）を接続し、２００μＬ／ｍｉｎの速度で６分間送液（逆洗浄）を行った。導入流路から排出された溶液を約１ｍｌを遠心沈殿管内に回収した。
　新しいカートリッジをセットしたＣＴＣ回収装置：ＣＴ６０００（日立化成製商品名）を用いて、逆洗浄で回収した細胞含有溶液をシリンジに導入することにより、フィルタ上で細胞の再捕捉を行い、回収できた細胞数の計数を行った。ＣＴＣ回収装置は血液サンプルや試薬を導入するための流路を備えており、流路の入り口は、シリンジを加工して作製したリザーバーに接続した。
　再捕捉した細胞を同様の蛍光顕微鏡を用いて計数を行った。
　逆洗浄後のがん細胞の捕捉数÷始めに捕捉したがん細胞＝逆洗浄によるがん細胞の回収率を算出した。
（実施例１２）
　逆洗浄時の速度を４００μＬ／ｍｉｎで行った以外は、実施例１１と同様の方法を用いて、実験を行った。
（実施例１３）
　逆洗浄時の速度を８００μＬ／ｍｉｎで行った以外は、実施例１１と同様の方法を用いて、実験を行った。
（実施例１４）
　逆洗浄による送液を行う前に、Ｖｏｌｔｅｘ　（Ｆ２０２Ａ０１７５）（ＶＥＬＰ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａ製）を用いて特定細胞捕捉済デバイスに対して２００ｒｐｍの振動を５秒間与える以外は、実施例１１と同様の方法を用いて、実験を行った。
（実施例１５）
　逆洗浄時の速度を４００μＬ／ｍｉｎで行った以外は、実施例１４と同様の方法を用いて、実験を行った。
（実施例１６）
　逆洗浄時の速度を８００μＬ／ｍｉｎで行った以外は、実施例１４と同様の方法を用いて、実験を行った。
（比較例６）
　細胞染色が終了した後に、細胞捕捉デバイス内の液体を５０μＬ／ｍｉｎの速度で引き抜き、蛍光顕微鏡で撮影を行った以外は、実施例１１と同様の方法で実験を行った。
（比較例７）
　細胞染色が終了した後に、細胞捕捉デバイス内の液体を５０μＬ／ｍｉｎの速度で引き抜き、蛍光顕微鏡で撮影を行った以外は、実施例１４と同様の方法で実験を行った。
（結果）
　実施例１１～実施例１６及び比較例６，７の結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　
　表４の結果から、細胞捕捉デバイス内の液体を残した状態で、逆洗浄を行った場合（実施例１１～１６）においては、逆洗浄後の細胞の回収率が５０％以上であった。さらに、逆洗浄前に振動を加えた場合においては（実施例１４～１６）、振動を加えない場合よりも細胞の回収率が向上した。一方で、細胞捕捉デバイス内の液体を全て引き抜いた状態で、逆洗浄を行った場合（比較例６，７）においては、逆洗浄による回収率が１０～３０％と低い結果となった。これより、逆洗浄を行う場合において、細胞捕捉デバイス内の液体を引き抜かない状態で逆洗浄を行うことの重要性が示唆された。
＜フィルタ上に捕捉した細胞を取り出す実験２：逆洗浄による取り出し（導入流路１→導入流路２）＞
（実施例１７）
　評価例１のフィルタをカートリッジ（本実施形態に係る細胞捕捉デバイスに相当する）にセットしたＣＴＣ回収装置：ＣＴ６０００（日立化成製商品名）を用いて実験を行った。ＣＴＣ回収装置は血液サンプルや試薬を導入するための流路を備えており、流路の入り口は、シリンジを加工して作製したリザーバーに接続した。このリザーバーに、血液サンプルや試薬を順次投入していくことで、ＣＴＣの捕捉、染色、洗浄などの操作を連続的に容易に行えるようにした。
　ＣＴＣ回収装置に血液サンプルを導入して癌細胞を濃縮した。血液サンプルとして、ＥＤＴＡ含有真空採血管に採血した健常者血液に、血液１ｍＬあたり１０００個の癌細胞を含有させたサンプルを用いた。癌細胞としては、上記のヒト非小細胞肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ３５８を使用した。尚、血液は採血後６時間のものを用いた。
　まず、リザーバーに、２ｍＭ　ＥＤＴＡ－０．５％　ＢＳＡ（牛血清アルブミン）－ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ製ＰＢＳｐＨ７．４）　１ｍｌ（以下洗浄液）を導入し、フィルタ上を満たし、１０分放置した。続いて、ぺリスタルティックポンプを使用して流速２００μＬ／分で送液を開始した。その後、血液３ｍｌを投入した。約５分後、リザーバーに９ｍＬの洗浄液を導入して細胞の洗浄を行った。
　次に洗浄液に４％ＰＦＡを溶かした液をカートリッジに入れ、細胞を１５分浸した。洗浄後、洗浄液に０．２％ＴｒｉｔｏｎＸを溶かした液をカートリッジに入れ、細胞を１５分浸した。
　さらに１０分後、ポンプ流速を２０μＬ／分に変更し、リザーバーに６００μＬの細胞染色液（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２：３０μＬ、Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ：３００ｍｌ）を導入し、フィルタ上の癌細胞または白血球を蛍光染色した。フィルタ上に捕捉された細胞に対して３０分間染色を行った後、リザーバーに１ｍＬの２ｍＭ　ＥＤＴＡ－０．５％　ＢＳＡ－ＰＢＳを導入して細胞の洗浄を行った。
　続いて、コンピュータ制御式電気ステージ及び冷却デジタルカメラ（ＤＰ７０、オリンパス株式会社）を装備した蛍光顕微鏡（ＢＸ６１、オリンパス株式会社）を使用して、フィルタ上の癌細胞及び白血球の撮像を行った。Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２及びＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ　Ｒｅｄ　ＣＭＴＰＸ由来の蛍光を観察するために、それぞれＷＵ及びＷＩＧフィルタ（オリンパス株式会社）を用いて画像を取得した。画像取得及び解析ソフトにはＬｕｍｉｎａ　Ｖｉｓｉｏｎ（三谷商事株式会社）を用いた。撮像した細胞の画像解析を行い、フィルタ上に捕捉されたがん細胞の数を計数した。
　撮像が終了したカートリッジ（本実施形態に係る特定細胞捕捉済デバイスに相当する）のバルブを全て閉めた後に、排出流路２３（図２参照）から導入流路２５（図２参照）へ液体が流れるように組み換えを行った。排出流路２３側にシリンジポンプＴＥ－３５１（テルモ株式会社）を接続し、２００μＬ／ｍｉｎの速度で６分間送液（逆洗浄）を行った。導入流路から排出された溶液を約１ｍｌを遠心沈殿管内に回収した。
　新しいカートリッジをセットしたＣＴＣ回収装置：ＣＴ６０００（日立化成製商品名）を用いて、逆洗浄で回収した細胞含有溶液をシリンジに導入することにより、フィルタ上で細胞を再捕捉を行い、回収できた細胞数の計数を行った。ＣＴＣ回収装置は血液サンプルや試薬を導入するための流路を備えており、流路の入り口は、シリンジを加工して作製したリザーバーに接続した。
　再捕捉した細胞を同様の蛍光顕微鏡を用いて計数を行った。
　逆洗浄後のがん細胞の捕捉数÷始めに捕捉したがん細胞＝逆洗浄によるがん細胞の回収率を算出した。
（実施例１８）
　逆洗浄時の速度を４００μＬ／ｍｉｎで行った以外は、実施例１８と同様の方法を用いて、実験を行った。
（実施例１９）
　逆洗浄時の速度を８００μＬ／ｍｉｎで行った以外は、実施例１８と同様の方法を用いて、実験を行った。
（実施例２０）
　逆洗浄による送液を行う前に、Ｖｏｌｔｅｘ　（Ｆ２０２Ａ０１７５）（ＶＥＬＰ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａ製）を用いて特定細胞捕捉済デバイスに対して２００ｒｐｍの振動を５秒間与える以外は、実施例１８と同様の方法を用いて、実験を行った。
（実施例２１）
　逆洗浄時の速度を４００μＬ／ｍｉｎで行った以外は、実施例２１と同様の方法を用いて、実験を行った。
（実施例２２）
　逆洗浄時の速度を８００μＬ／ｍｉｎで行った以外は、実施例２１と同様の方法を用いて、実験を行った。
（比較例８）
　細胞染色が終了した後に、カートリッジ内の液体を５０μＬ／ｍｉｎの速度で引き抜き、蛍光顕微鏡で撮影を行った以外は、実施例１７と同様の方法で実験を行った。
（比較例９）
　細胞染色が終了した後に、カートリッジ内の液体を５０μＬ／ｍｉｎの速度で引き抜き、蛍光顕微鏡で撮影を行った以外は、実施例２０と同様の方法で実験を行った。
（結果）
　実施例１７～実施例２２及び比較例８，９の結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５の結果から、細胞捕捉デバイス内の液体を残した状態で、逆洗浄を行った場合（実施例１７～２２）においては、逆洗浄後の細胞の回収率が５０％以上であった。さらに、逆洗浄前に振動を加えた場合においては（実施例２０～２２）、振動を加えない場合よりも細胞の回収率が向上した。一方で、細胞捕捉デバイス内の液体を全て引き抜いた状態で、逆洗浄を行った場合（比較例８，９）においては、逆洗浄による回収率が低い結果となった。これより、逆洗浄を行う場合において、細胞捕捉デバイス内の液体を引き抜かない状態で逆洗浄を行うことの重要性が示唆された。
＜フィルタ上に捕捉した細胞を取り出す実験３：液採取（吸引）による細胞回収方法（開放型筐体）＞
（実施例２３）
　評価例１のフィルタを図１の筐体にセットし、ペリスタポンプ（ＳＪ－１２１５）（アトー株式会社）を用いて液体の吸引を行い、フィルタ上に細胞の捕捉を行った。血液の導入は、２つのシリンジにシリコンチューブを接続し、三方活栓（ＴＳ－ＴＬ１Ｋ）（テルモ社製）を用いてそれぞれ別のシリンジから血液と洗浄溶液の導入を行った。
　まず、リザーバーに、２ｍＭ　ＥＤＴＡ－０．５％　ＢＳＡ（牛血清アルブミン）－ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ製ＰＢＳｐＨ７．４）　１ｍｌ（以下洗浄液）を導入し、フィルタ上を満たし、１０分放置した。続いて、ぺリスタルティックポンプを使用して流速２００μＬ／分で送液を開始した。その後、血液３ｍｌを投入した。約５分後、リザーバーに９ｍＬの洗浄液を導入して細胞の洗浄を行った。
　第一のシリンジに血液サンプルを導入して癌細胞をフィルタ上に濃縮した。血液サンプルとして、ＥＤＴＡ含有真空採血管に採血した健常者血液に、血液１ｍＬあたり１０００個の癌細胞を含有させたサンプルを用いた。癌細胞としては、上記のヒト非小細胞肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ３５８を使用した。尚、血液は採血後６時間のものを用いた。
　次に洗浄液に４％ＰＦＡを溶かした液をカートリッジに入れ、細胞を１５分浸した。洗浄後、洗浄液に０．２％ＴｒｉｔｏｎＸを溶かした液をカートリッジに入れ、細胞を１５分浸した。
　さらに１０分後、ポンプ流速を２０μＬ／分に変更し、リザーバーに６００μＬの細胞染色液（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２：３０μＬ、Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ：３００ｍｌ）を導入し、フィルタ上の癌細胞または白血球を蛍光染色した。フィルタ上に捕捉された細胞に対して３０分間染色を行った後、リザーバーに１ｍＬの２ｍＭ　ＥＤＴＡ－０．５％　ＢＳＡ－ＰＢＳを導入して細胞の洗浄を行った。最後の洗浄液を導入するまでの間、一度も液体を引き抜くことなく、連続的に液体を導入する方法で行った。
　続いて、液体の導入を止め、液面を筐体の枠組みの高さで保持させた状態で停止した。その状態で、マイクロピペットを用いてフィルタ上の液体を採取（吸引）した。採取した液体を、新しいカートリッジをセットしたＣＴＣ回収装置：ＣＴ６０００（日立化成製商品名）を用いて、逆洗浄で回収した細胞含有溶液をシリンジに導入することにより、フィルタ上で細胞を再捕捉を行い、回収できた細胞数の計数を行った。ＣＴＣ回収装置は血液サンプルや試薬を導入するための流路を備えており、流路の入り口は、シリンジを加工して作製したリザーバーに接続した。
　再捕捉した細胞を同様の蛍光顕微鏡を用いて計数を行った。
　逆洗浄後のがん細胞の捕捉数÷始めに導入したがん細胞（理論値）＝逆洗浄によるがん細胞の回収率を算出した。
（比較例１０）
　実施例２３と同様の方法で実験を行い、染色液導入後の洗浄が終了した後に、５０μＬ／ｍｉｎの速度で筐体内の液体を完全に引き抜いた。液体を完全に引き抜いた後、再度リザーバーから洗浄液を２００μ／ｍｉｎの速度で導入した。
　続いて、液体の導入を止め、液面を筐体の枠組みの高さで保持させた状態で停止した。その状態で、マイクロピペットを用いてフィルタ上の液体を採取した。採取した液体を、新しいカートリッジをセットしたＣＴＣ回収装置：ＣＴ６０００（日立化成製商品名）を用いて、逆洗浄で回収した細胞含有溶液をシリンジに導入することにより、フィルタ上で細胞を再捕捉を行い、回収できた細胞数の計数を行った。ＣＴＣ回収装置は血液サンプルや試薬を導入するための流路を備えており、流路の入り口は、シリンジを加工して作製したリザーバーに接続した。
　再捕捉した細胞を同様の蛍光顕微鏡を用いて計数を行った。
　逆洗浄後のがん細胞の捕捉数÷始めに導入したがん細胞（理論値）＝液採取によるがん細胞の回収率を算出した。
（結果）
　実施例２３及び比較例１０の結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６より、液採取（吸引）による細胞回収方法においても、途中の工程で液体を筐体内から引き抜かない場合においては、細胞の回収率が７０％以上と高い値であった。一方で、液体を導入する工程の途中で、液体を一度引き抜いた場合においては、細胞の回収率が１８％と低い値であった。これより、液採取（吸引）による細胞回収方法においても、液体を導入する工程の途中で液体を一度も引きぬかずに連続的に液体を導入することの重要性が示唆された。
　１…ＭＣＬ、２…ピーラブル銅箔、２’…銅板、３…フォトレジスト、３ａ…フォトレジスト露光部分（露光部）、３ｂ…フォトレジスト現像部分、４…フォトマスク、５…めっき層、６…貫通孔、７…金めっき層、１０，２０…細胞捕捉デバイス、１１，１２…フィルタ、１２，２２…導入領域、１３，２３…排出流路、２４…上蓋、２５，２６…導入流路。
 

Claims (39)

  1. 　所定の容積を有し、２種類以上の細胞を含む細胞含有溶液及び該細胞含有溶液中の細胞を処理するための処理液から選ばれる液体を内部に導入する導入領域と、前記液体を外部に排出するための排出流路とを含む筐体と、前記導入領域と前記排出流路との間の流路上に設けられ、前記液体が通過するための複数の貫通孔が厚み方向に形成されたフィルタと、を有する細胞捕捉デバイスを用いて前記液体をフィルトレーションすることにより、前記フィルタ表面において前記細胞含有溶液に含まれる特定の細胞を選択的に捕捉する細胞捕捉方法であって、
    　前記細胞捕捉デバイスに対して前記液体を流す工程をｎ回（ｎは自然数）有し、第１回目の前記液体を流す工程から第ｎ回目の前記液体を流す工程において、前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体の液面が所定の液面高さを維持し、第ｎ回目の前記液体を流す工程の終了時に前記フィルタに所定の高さの液面を有する状態で前記細胞捕捉デバイスからの前記液体の排出を止める細胞捕捉方法。
  2. 　前記筐体は、前記導入領域の上方に設置される上蓋及び前記液体の導入流路を含む請求項１に記載の細胞捕捉方法。
  3. 　第１回目の前記液体を流す工程の前に、予め前記筐体の前記導入領域内を含む前記フィルタよりも上流側に洗浄液を満たしている請求項１又は２に記載の細胞捕捉方法。
  4. 　前記液体を流す工程が、固定液を流す工程と、透過液を流す工程、染色液を流す工程、及び洗浄液を流す工程のうちの１以上の工程と、前記細胞含有溶液を流す工程と、を含む請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞捕捉方法。
  5. 　前記ｎは１であり、前記液体を流す工程が前記細胞含有溶液を流す工程である請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞捕捉方法。
  6. 　前記液体を流す工程において、第１回目に流す前記液体が細胞含有溶液であり、第２回目に流す前記液体が洗浄液である請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞捕捉方法。
  7. 　前記液体を流す工程において、捕捉対象の細胞の少なくとも一部が前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体に浸漬している請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞捕捉方法。
  8. 　前記液体を流す工程において、前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体の液面の高さが捕捉対象の細胞の大きさ以上である請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞捕捉方法。
  9. 　前記液体を流す工程において、前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体の液面の高さが５０μｍ以上である請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞捕捉方法。
  10. 　前記細胞含有溶液の溶媒が、哺乳動物の全血、血清、血漿、又はそれらが由来のたんぱく質を含む水溶液からなる請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞捕捉方法。
  11. 　前記フィルタが、高分子材料又は金属を用いて加工される請求項１～１０のいずれか一項に記載の細胞捕捉方法。
  12. 　前記液体を流す工程において、前記細胞捕捉デバイスに対して前記液体を導入する速度が、５０～１０００μＬ／ｍｉｎである請求項１～１１のいずれか一項に記載の細胞捕捉方法。
  13. 　所定の容積を有し、２種類以上の細胞を含む細胞含有溶液及び該細胞含有溶液中の細胞を処理するための処理液から選ばれる液体を内部に導入する導入領域と、前記液体を外部に排出するための排出流路とを含む筐体と、前記導入領域と前記排出流路との間の流路上に設けられ、前記液体が通過するための複数の貫通孔が厚み方向に形成されたフィルタと、を有する細胞捕捉デバイスを用いて前記液体をフィルトレーションすることにより、前記フィルタ表面において前記細胞含有溶液に含まれる特定の細胞を選択的に捕捉した特定細胞捕捉済デバイスを製造する特定細胞捕捉済デバイスの製造方法であって、
    　前記細胞捕捉デバイスに対して前記液体を流す工程をｎ回（ｎは自然数）有し、第１回目の前記液体を流す工程から第ｎ回目の前記液体を流す工程において、前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体の液面が所定の液面高さを維持し、第ｎ回目の前記液体を流す工程の終了時に前記フィルタに所定の高さの液面を有する状態で前記細胞捕捉デバイスからの前記液体の排出を止める特定細胞捕捉済デバイスの製造方法。
  14. 　前記筐体は、前記導入領域の上方に設置される上蓋及び前記液体の導入流路を含む請求項１３に記載の特定細胞捕捉済デバイスの製造方法。
  15. 　第１回目の前記液体を流す工程の前に、予め前記筐体の前記導入領域内を含む前記フィルタよりも上流側に洗浄液を満たしている請求項１３又は１４に記載の特定細胞捕捉済デバイスの製造方法。
  16. 　前記液体を流す工程が、固定液を流す工程と、透過液を流す工程、染色液を流す工程、及び洗浄液を流す工程のうちの１以上の工程と、前記細胞含有溶液を流す工程と、を含む請求項１３～１５のいずれか一項に記載の特定細胞捕捉済デバイスの製造方法。
  17. 　前記ｎは１であり、前記液体を流す工程が前記細胞含有溶液を流す工程である請求項１３～１５のいずれか一項に記載の特定細胞捕捉済デバイスの製造方法。
  18. 　前記液体を流す工程において、第１回目に流す前記液体が細胞含有溶液であり、第２回目に流す前記液体が洗浄液である請求項１３～１５のいずれか一項に記載の特定細胞捕捉済デバイスの製造方法。
  19. 　前記液体を流す工程において、捕捉対象の細胞の少なくとも一部が前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体に浸漬している請求項１３～１８のいずれか一項に記載の特定細胞捕捉済デバイスの製造方法。
  20. 　前記液体を流す工程において、前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体の液面の高さが捕捉対象の細胞の大きさ以上である請求項１３～１９のいずれか一項に記載の特定細胞捕捉済デバイスの製造方法。
  21. 　前記液体を流す工程において、前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体の液面の高さが５０μｍ以上である請求項１３～２０のいずれか一項に記載の特定細胞捕捉済デバイスの製造方法。
  22. 　前記細胞含有溶液の溶媒が、哺乳動物の全血、血清、血漿、又はそれらが由来のたんぱく質を含む水溶液からなる請求項１３～２１のいずれか一項に記載の特定細胞捕捉済デバイスの製造方法。
  23. 　前記フィルタが、高分子材料又は金属を用いて加工される請求項１３～２２のいずれか一項に記載の特定細胞捕捉済デバイスの製造方法。
  24. 　前記液体を流す工程において、前記細胞捕捉デバイスに対して前記液体を導入する速度が、５０～１０００μＬ／ｍｉｎである請求項１３～２３のいずれか一項に記載の特定細胞捕捉済デバイスの製造方法。
  25. 　所定の容積を有し、２種類以上の細胞を含む細胞含有溶液及び該細胞含有溶液中の細胞を処理するための処理液から選ばれる液体を内部に導入する導入領域と、前記液体を外部に排出するための排出流路とを含む筐体と、前記導入領域と前記排出流路との間の流路上に設けられ、前記液体が通過するための複数の貫通孔が厚み方向に形成されたフィルタと、を有する細胞捕捉デバイスを用いて前記液体をフィルトレーションすることにより、前記フィルタ表面において前記細胞含有溶液に含まれる特定の細胞を選択的に捕捉することにより得られる特定細胞含有溶液の製造方法であって、
    　前記細胞捕捉デバイスに対して前記液体を流す工程をｎ回（ｎは自然数）有し、第１回目の前記液体を流す工程から第ｎ回目の前記液体を流す工程において、前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体の液面が所定の液面高さを維持し、第ｎ回目の前記液体を流す工程の終了時に前記フィルタに所定の高さの液面を有する状態で前記細胞捕捉デバイスからの前記液体の排出を止め、
    　前記細胞捕捉デバイスに対して前記液体を流す工程の後に、前記筐体内に存在する液体を回収する工程を有する特定細胞含有溶液の製造方法。
  26. 　前記筐体内に存在する液体を回収する工程が、前記導入領域側から前記導入領域内の液体を吸引する工程を含む請求項２５に記載の特定細胞含有溶液の製造方法。
  27. 　前記筐体は、前記導入領域の上方に設置される上蓋及び前記液体の導入流路を含み、前記筐体内に存在する液体を回収する工程が、前記排出流路から前記導入流路へ向けて送液を行う工程を含む請求項２５に記載の特定細胞含有溶液の製造方法。
  28. 　前記排出流路から前記導入流路へ向けた送液の流速が５０～１０００μＬ／ｍｉｎである請求項２７に記載の特定細胞含有溶液の製造方法。
  29. 　前記排出流路から前記導入流路へ向けた送液の前に、前記筐体に振動を与える請求項２７又は２８に記載の特定細胞含有溶液の製造方法。
  30. 　前記筐体は、前記導入領域の上方に設置される上蓋及び、２以上の前記液体の導入流路を含み、前記筐体内に存在する液体を回収する工程が、２以上の前記導入流路に含まれる第１の導入流路から２以上の前記導入流路のうち前記第１の導入流路とは異なる導入流路への送液を行う工程を含む請求項２５に記載の特定細胞含有溶液の製造方法。
  31. 　２以上の前記導入流路に含まれる前記第１の導入流路から２以上の前記導入流路のうち前記第１の導入流路とは異なる導入流路への送液の流速が５０～１０００μＬ／ｍｉｎである請求項３０に記載の特定細胞含有溶液の製造方法。
  32. 　２以上の前記導入流路に含まれる前記第１の導入流路から２以上の前記導入流路のうち前記第１の導入流路とは異なる導入流路への送液の前に、前記筐体に振動を与える請求項３０又は３１に記載の特定細胞含有溶液の製造方法。
  33. 　第１回目の前記液体を流す工程の前に、予め前記筐体の前記導入領域内を含む前記フィルタよりも上流側に洗浄液を満たしている請求項２５～３２のいずれか一項に記載の特定細胞含有溶液の製造方法。
  34. 　前記液体を流す工程が、固定液を流す工程と、透過液を流す工程、染色液を流す工程、及び洗浄液を流す工程のうちの１以上の工程と、前記細胞含有溶液を流す工程と、を含む請求項２５～３３のいずれか一項に記載の特定細胞含有溶液の製造方法。
  35. 　前記ｎは１であり、前記液体を流す工程が前記細胞含有溶液を流す工程である請求項２５～３４のいずれか一項に記載の特定細胞含有溶液の製造方法。
  36. 　前記液体を流す工程において、第１回目に流す前記液体が細胞含有溶液であり、第２回目に流す前記液体が洗浄液である請求項２５～３５のいずれか一項に記載の特定細胞含有溶液の製造方法。
  37. 　前記液体を流す工程において、捕捉対象の細胞の少なくとも一部が前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体に浸漬している請求項２５～３６のいずれか一項に記載の特定細胞含有溶液の製造方法。
  38. 　前記液体を流す工程において、前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体の液面の高さが捕捉対象の細胞の大きさ以上である請求項２５～３７のいずれか一項に記載の特定細胞含有溶液の製造方法。
  39. 　前記液体を流す工程において、前記フィルタ上の前記導入領域における前記液体の液面の高さが５０μｍ以上である請求項２５～３８のいずれか一項に記載の特定細胞含有溶液の製造方法。
     
PCT/JP2015/074457 2014-08-29 2015-08-28 細胞捕捉方法、特定細胞捕捉済デバイスの製造方法、及び特定細胞含有溶液の製造方法 Ceased WO2016031971A1 (ja)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SG11201701562WA SG11201701562WA (en) 2014-08-29 2015-08-28 Cell trapping method, method for producing specific cell-trapping device, and method for producing specific cell-containing solution
KR1020177006879A KR20170042685A (ko) 2014-08-29 2015-08-28 세포 포착 방법, 특정 세포 포착 완료 디바이스의 제조 방법 및 특정 세포 함유 용액의 제조 방법
JP2016545642A JPWO2016031971A1 (ja) 2014-08-29 2015-08-28 細胞捕捉方法、特定細胞捕捉済デバイスの製造方法、及び特定細胞含有溶液の製造方法
CN201580046028.1A CN106795476A (zh) 2014-08-29 2015-08-28 细胞捕获方法、已捕获特定细胞的器件的制造方法及含特定细胞溶液的制造方法
US15/507,346 US20170282180A1 (en) 2014-08-29 2015-08-28 Cell trapping method, method for producing specific cell- trapping device, and method for producing specific cell-containing solution
EP15835573.5A EP3187578A4 (en) 2014-08-29 2015-08-28 Cell trapping method, method for producing specific cell-trapping device, and method for producing specific cell-containing solution

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462043454P 2014-08-29 2014-08-29
US62/043454 2014-08-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016031971A1 true WO2016031971A1 (ja) 2016-03-03

Family

ID=55399854

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/074457 Ceased WO2016031971A1 (ja) 2014-08-29 2015-08-28 細胞捕捉方法、特定細胞捕捉済デバイスの製造方法、及び特定細胞含有溶液の製造方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20170282180A1 (ja)
EP (1) EP3187578A4 (ja)
JP (1) JPWO2016031971A1 (ja)
KR (1) KR20170042685A (ja)
CN (1) CN106795476A (ja)
SG (1) SG11201701562WA (ja)
WO (1) WO2016031971A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3395432A1 (en) * 2017-04-26 2018-10-31 Murata Manufacturing Co., Ltd. Filter for filtering nucleated cells and filtering method using the same
US10519416B2 (en) 2016-03-18 2019-12-31 Murata Manufacturing Co., Ltd. Filter for filtration of nucleated cells and filtration method using the same
JP2020144007A (ja) * 2019-03-06 2020-09-10 マルヤス工業株式会社 自動ろ過装置
US20220026324A1 (en) * 2015-11-18 2022-01-27 Beckman Coulter, Inc. Filtering device for analyzing instrument
US11299727B2 (en) 2016-09-05 2022-04-12 Hitachi, Ltd. System for analyzing single cell
US12030002B2 (en) 2018-07-03 2024-07-09 Murata Manufacturing Co., Ltd. Filtration recovery device and filtration recovery method

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6863484B2 (ja) 2017-12-28 2021-04-21 株式会社村田製作所 分離回収システム及び分離回収方法
WO2020145096A1 (ja) * 2019-01-07 2020-07-16 株式会社村田製作所 濾過フィルタ
WO2021065765A1 (ja) * 2019-09-30 2021-04-08 東京応化工業株式会社 細胞スクリーニングデバイスおよび細胞スクリーニングキット
KR102385077B1 (ko) 2019-11-20 2022-04-12 주식회사 한국바이오 셀프 세포 포획 분리 필터, 이를 이용한 세포 분리 장치 및 방법

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05336996A (ja) * 1992-06-12 1993-12-21 Koken Co Ltd 培養細胞を用いた細胞毒性試験法
JP2000146782A (ja) * 1998-11-12 2000-05-26 Yoshio Kawai 自動固定標本作製装置および方法
JP2005532030A (ja) * 2001-10-12 2005-10-27 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 生体試料を輸送する方法及びバスケット装置
JP2008054521A (ja) * 2006-08-29 2008-03-13 Canon Inc 細胞培養処理装置及び細胞培養処理方法
JP2009031300A (ja) * 2001-10-12 2009-02-12 Becton Dickinson & Co 生体試料を輸送する方法及び装置
JP2013000088A (ja) * 2011-06-20 2013-01-07 Olympus Corp 細胞計測装置および生体組織処理装置
WO2013176106A1 (ja) * 2012-05-24 2013-11-28 Ｙｓｅｃ株式会社 細胞シート搬送用容器
JP2014140313A (ja) * 2013-01-22 2014-08-07 Hitachi Chemical Co Ltd 循環がん細胞捕捉装置

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002055673A1 (en) * 2001-01-10 2002-07-18 Biopore, Inc. Cell concentrator and washer
JP4705439B2 (ja) * 2005-09-09 2011-06-22 富士通株式会社 細胞捕捉シャーレ
JP2007319019A (ja) * 2006-05-30 2007-12-13 Sysmex Corp 細胞処理方法及び細胞処理装置
US20070278154A1 (en) * 2006-05-30 2007-12-06 Sysmex Corporation Cell processing method and cell processing apparatus
JP5515701B2 (ja) * 2009-12-04 2014-06-11 ソニー株式会社 送電装置、受電装置、および送電制御方法
JP5963159B2 (ja) * 2012-01-05 2016-08-03 日立化成株式会社 細胞捕捉デバイス
EP2956541B1 (en) * 2013-02-15 2018-12-26 Douglas T. Gjerde Devices and methods for purification of biological cells

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05336996A (ja) * 1992-06-12 1993-12-21 Koken Co Ltd 培養細胞を用いた細胞毒性試験法
JP2000146782A (ja) * 1998-11-12 2000-05-26 Yoshio Kawai 自動固定標本作製装置および方法
JP2005532030A (ja) * 2001-10-12 2005-10-27 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 生体試料を輸送する方法及びバスケット装置
JP2009031300A (ja) * 2001-10-12 2009-02-12 Becton Dickinson & Co 生体試料を輸送する方法及び装置
JP2008054521A (ja) * 2006-08-29 2008-03-13 Canon Inc 細胞培養処理装置及び細胞培養処理方法
JP2013000088A (ja) * 2011-06-20 2013-01-07 Olympus Corp 細胞計測装置および生体組織処理装置
WO2013176106A1 (ja) * 2012-05-24 2013-11-28 Ｙｓｅｃ株式会社 細胞シート搬送用容器
JP2014140313A (ja) * 2013-01-22 2014-08-07 Hitachi Chemical Co Ltd 循環がん細胞捕捉装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3187578A4 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220026324A1 (en) * 2015-11-18 2022-01-27 Beckman Coulter, Inc. Filtering device for analyzing instrument
US11982605B2 (en) * 2015-11-18 2024-05-14 Beckman Coulter, Inc. Filter device for fluid flow in an analyzing instrument
US10519416B2 (en) 2016-03-18 2019-12-31 Murata Manufacturing Co., Ltd. Filter for filtration of nucleated cells and filtration method using the same
US11485951B2 (en) 2016-03-18 2022-11-01 Murata Manufacturing Co., Ltd. Filter for filtration of nucleated cells and filtration method using the same
US11299727B2 (en) 2016-09-05 2022-04-12 Hitachi, Ltd. System for analyzing single cell
US12018277B2 (en) 2017-04-26 2024-06-25 Murata Manufacturing Co., Ltd. Filter for filtering nucleated cells and filtering method using the same
CN108795723A (zh) * 2017-04-26 2018-11-13 株式会社村田制作所 用于过滤有核细胞的过滤器和使用了其的过滤方法
EP3395432A1 (en) * 2017-04-26 2018-10-31 Murata Manufacturing Co., Ltd. Filter for filtering nucleated cells and filtering method using the same
US10858624B2 (en) 2017-04-26 2020-12-08 Murata Manufacturing Co., Ltd. Filter for filtering nucleated cells and filtering method using the same
CN108795723B (zh) * 2017-04-26 2022-06-10 株式会社村田制作所 用于过滤有核细胞的过滤器和使用了其的过滤方法
US12030002B2 (en) 2018-07-03 2024-07-09 Murata Manufacturing Co., Ltd. Filtration recovery device and filtration recovery method
JP2020144007A (ja) * 2019-03-06 2020-09-10 マルヤス工業株式会社 自動ろ過装置
JP7317522B2 (ja) 2019-03-06 2023-07-31 マルヤス工業株式会社 自動ろ過装置

Also Published As

Publication number Publication date
KR20170042685A (ko) 2017-04-19
SG11201701562WA (en) 2017-04-27
CN106795476A (zh) 2017-05-31
US20170282180A1 (en) 2017-10-05
EP3187578A1 (en) 2017-07-05
JPWO2016031971A1 (ja) 2017-06-08
EP3187578A4 (en) 2018-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6176406B2 (ja) 血中循環癌細胞捕獲方法
WO2016031971A1 (ja) 細胞捕捉方法、特定細胞捕捉済デバイスの製造方法、及び特定細胞含有溶液の製造方法
JP6540842B2 (ja) 生体物質捕獲用のフィルター
CN202730123U (zh) 癌细胞浓缩过滤器
JP2016052300A (ja) 生体物質捕獲システム
CN108884431B (zh) 有核细胞的过滤用过滤器以及使用该过滤器的过滤方法
JP6390707B2 (ja) 生体物質捕獲用フィルター及び生体物質捕獲システム
US20190338234A1 (en) Cell trapping filter, cell trapping device, cell trapping method, cell observation method, and cell culturing method
JP6028563B2 (ja) 金属フィルターの製造方法
US20160169781A1 (en) Cell-trapping system
JP2016086736A (ja) 血中希少細胞含有液の製造方法
JP2016032469A (ja) 血中希少細胞捕獲方法
WO2016017756A1 (ja) 血中希少細胞捕獲方法
JPWO2017130563A1 (ja) 希少細胞を捕捉する方法
WO2018211706A1 (ja) 希少細胞の捕捉方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15835573

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016545642

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15507346

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20177006879

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2015835573

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2015835573

Country of ref document: EP