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WO2016058126A9 - 一种核酸的转座酶打断一站式处理方法及试剂 - Google Patents

一种核酸的转座酶打断一站式处理方法及试剂 Download PDF

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WO2016058126A9
WO2016058126A9 PCT/CN2014/088541 CN2014088541W WO2016058126A9 WO 2016058126 A9 WO2016058126 A9 WO 2016058126A9 CN 2014088541 W CN2014088541 W CN 2014088541W WO 2016058126 A9 WO2016058126 A9 WO 2016058126A9
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transposase
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nucleic acid
solution
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耿春雨
郭荣荣
陈若莹
张迎新
阿莱克谢耶夫⋅安德烈
蒋慧
章文蔚
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BGI Shenzhen Co Ltd
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the invention relates to the technical field of molecular biology, in particular to a one-stop processing method and reagent for transposing enzymes of nucleic acids.
  • NEB Next dsDNA Fragmentase from NEB.
  • the reagent firstly generates a random nicking site in the double-stranded DNA, and then recognizes the nicking site by another enzyme to cleave the complementary DNA strand, thereby achieving the purpose of interruption.
  • the way in which the transposase is interrupted is undoubtedly far superior to other methods in terms of throughput and ease of operation, but this method of interruption also has its own disadvantages: the transposase is embedded in The subsequent enzymatic reaction is inhibited on the target sequence, although the relevant transposase kit manufacturer provides some reagents for transposase treatment of low starting amounts (eg 5 ng of starting genomic DNA) samples to achieve post-breaking No purification is required. However, for a 50 ng starting amount, which requires an increase in the amount of transposase, it is necessary to remove the transposase by column or magnetic bead purification, which undoubtedly increases the cost and flow of the experimental operation (Fig. 1A).
  • the invention provides a one-stop treatment method and reagent for transposase breaking of nucleic acid, which can realize one-stop treatment from transposase interruption of nucleic acid to downstream PCR amplification reaction, without Column or magnetic bead purification simplifies the experimental procedure and reduces the cost of the experiment.
  • the nucleic acid is randomly interrupted using a transposase-embedded complex, wherein the transposase-embedded complex comprises a transposase and a first linker comprising a transposase recognition sequence;
  • the PCR reaction is carried out by using the product treated with the second reagent as a template component, and a PCR product having a linker attached to both ends of the interrupted nucleic acid fragment is obtained.
  • the first reagent is used to treat the reaction product after the transposase is interrupted, so as to break the adsorption of the target sequence of the transposase and the nucleic acid, instead of the traditional complicated and high cost column.
  • the magnetic bead purification step and then treated with the second reagent to attenuate the influence of the first reagent on the subsequent enzymatic reaction, and ensure that the downstream PCR amplification proceeds smoothly.
  • the first reagent comprises one or more of a protease solution, a sodium dodecyl sulfate (SDS) solution, and an NT buffer. These solutions cause degradation or denaturation of the transposase to be released from the target sequence of the nucleic acid.
  • the first reagent may be one or more of the above solutions, and the plurality of may be two or three, such as a protease solution and an SDS solution, an SDS solution and an NT buffer, a protease solution and an NT buffer. Liquid, protease solution, SDS solution and NT buffer.
  • the NT buffer can be used in the NT buffer of the Tuprep kit S5 series.
  • the first reagent comprises a protease solution
  • the first reagent is added for treatment, and further treated with an ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution.
  • EDTA inhibits the activity of proteases and prevents proteases from degrading enzymes in subsequent PCR reactions.
  • the second reagent comprises a Triton-X100 solution.
  • Triton-X100 also known as Triton X-100, chemically known as octyl phenyl ethoxylate, acts as a nonionic surfactant in the present invention to attenuate the effect of the first reagent on subsequent enzymatic reactions. .
  • a second reagent comprising a Triton-X100 solution is used to attenuate the effect of the first reagent on subsequent enzymatic reactions.
  • the first reagent may be one or more of a protease solution, an SDS solution and an NT buffer, and a plurality of them may be two or three kinds, such as a protease solution and an SDS solution, an SDS solution and an NT buffer. Liquid, protease solution and NT buffer, protease solution, SDS solution and NT buffer. Among them, the NT buffer can be used in the NT buffer of the Tuprep kit S5 series.
  • the first reagent if the first reagent comprises a protease solution, the first reagent further comprises an additional reagent comprising EDTA.
  • EDTA inhibits the activity of proteases and prevents proteases from degrading enzymes in subsequent PCR reactions.
  • An additional reagent containing EDTA is provided as a component of the first reagent separately from the protease solution.
  • the nucleic acid to be interrupted may be genomic DNA, whole genome amplification product or PCR product, may be DNA or cDNA, and has no limitation on the source of the nucleic acid, and may be a nucleic acid sample of animal, plant or microbial origin.
  • the method of the invention uses the first reagent and the second reagent to treat the product after the transposase breaks the nucleic acid, instead of the traditional column or magnetic bead purification, thereby realizing the transposition enzyme breaking from the nucleic acid to the downstream PCR amplification.
  • One-stop processing of the increase reaction the whole process is carried out in a single tube, which simplifies the experimental operation process and reduces the experiment cost and shortens the processing cycle, thus making high-throughput sample processing possible.
  • Example 2 is a result of electrophoresis detection of a PCR product of a single adaptor double-linker transposase complex of Example 1 of the present invention, wherein D2000 is a DNALadder lane; Lane 1 is a 1 ⁇ PBI, 1.3 ⁇ Ampure XP beads purification treatment result; Lane 2 The results were treated with 2 ⁇ L protease + 14 mM EDTA + 1% Triton-X100; Lane 3 was 1% SDS + 1% Triton-X100 + 0.5% Tween-20 treatment; Lane 4 was treated with NT buffer + 1% Triton-X100 Results; Lane 5 was the result of 2 ⁇ L of protease + 1% Triton-X100 treatment.
  • the operation sequence of the present invention corresponding to the optimization of the second-linker introduction scheme without purification one-stop reaction mainly includes: (1) using the transposase to embed a specific modification sequence of the first linker for the genome sequence. Nucleic acid sequences such as whole genome amplification sequences and PCR product sequences are randomly interrupted; (2) the adsorption of the transposase and the target sequence is broken by protease or other specific ratio of No. 1 reagent to achieve no purification operation; (3) Adding No. 2 reagent to attenuate the influence of No. 1 reagent on the subsequent enzymatic reaction; (4) Realizing the second method by connecting the No.
  • linker (referred to as a second joint or a void joint elsewhere in the present invention) at the 9nt gap
  • the introduction of a linker changes the sequence of the linker adjacent to the fragmented target sequence, so that the sequences on both sides of the target sequence are completely different, one of which retains the first linker sequence containing the transposase recognition sequence, and the other is completely arbitrary.
  • Designed the second linker sequence (5) Directly carry out a special primer (primer-targeted to bind to the first linker and the second linker) to mediate the PCR reaction, thereby obtaining the target sequence
  • the PCR product is completely different sequences, this product can be used in subsequent molecular biology experiments.
  • the present invention simultaneously selects two embedding modes: the first one is a transposase-encapsulated one-joint double-joined-forming enzyme-embedded complex (Fig. 1B), both of which are Contains a special 19 bp transposase recognition sequence, but also contains different other sequences; the second is a transposase-encapsulated single-joint single-linker to form a complex (Fig. 1C), through special modification of the embedded junction, One of the embedded adaptor sequences contains a special 19 bp transposase recognition sequence, while avoiding the unembedded number one
  • the first and the second linker are ligated to each other to affect the PCR.
  • the linker is subjected to a 3'-end dideoxy modification, i.e., the 3' end is a dideoxynucleotide.
  • the two annealed joints were mixed in equal volume for embedding the transposase complex.
  • the sample processing method after interruption has the following options: Method 1: Add 1 volume of PBI (a commercial reagent in Qiagen PCR purification kit), mix and then purify with 1.3 times of Ampure XP beads. Pure water is used for remelting; Method 2: 0.1-5 ⁇ L protease (750 mAU/mL) is added for treatment, and then EDTA is added at a final concentration of 1-50 mM.
  • PBI a commercial reagent in Qiagen PCR purification kit
  • This example is preferably 2 ⁇ L protease and EDTA at a final concentration of 14 mM, and simultaneously 0.1
  • the test was carried out by combining ⁇ L protease with 1 mM EDTA and 5 ⁇ L protease plus 50 mM EDTA; Method 3: Adding 0.01%-1.5% (by volume) of SDS, this example preferably 1% (by volume) of SDS, and 0.01% (volume) The ratio and the 1.5% (volume ratio) concentration were tested separately; Method 4: Add the final concentration of commercial 1 ⁇ NT buffer (the matching reagent in the Sup series of Supupre Kit S5 series); Method 5: Add 0.1-5 ⁇ L of protease for treatment, This example is preferably 2 [mu]L protease and tested separately for 0.1 [mu]L and 5 [mu]L protease.
  • PCR amplification was carried out according to the following PCR reaction system (Table 4) and reaction conditions (Table 5).
  • a specific concentration of Tween-20 was also added to the PCR system to partially increase the efficiency of the PCR.
  • the working concentration of Tween-20 can be adjusted to be different, such as 0.1%-2% (volume ratio). In the present embodiment, 0.5% by volume is preferred, while Tween-20 at a working concentration of 0.1% by volume and 2% by volume is tested.
  • Linker duplexer primer 1 AATGACATCGGCGACCACCGA (SEQ ID NO: 4);
  • Linker duplexer primer 2 CAAGCAGAAGACGGCATACGA (SEQ ID NO: 5).
  • PCR primer was used for amplification, and a certain concentration of Triton X-100 was added to the PCR reaction system.
  • Linker single linker sequence A TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG (SEQ ID NO: 6);
  • Linker single linker sequence B CTGTCTCTTATACACATC ddT (SEQ ID NO: 7, dd indicates dideoxy modification).
  • the first linker and the transposase were embedded into a transposase complex, gently mixed for 20 times, and incubated at 30 ° C for 1 hour to complete the complex embedding.
  • the complex was stored at -20 °C.
  • Method 1 Add 0.1-5 ⁇ L protease (750 mAU/mL) for treatment. This method is preferably 2 ⁇ L protease, and 0.1 ⁇ L and 5 ⁇ L protease are tested separately.
  • Method 2 Add a final concentration of commercial 1 ⁇ NT buffer (matching reagent in the Trouprep kit S5 series);
  • Method 3 Add 0.01%-1.5% (by volume) of SDS, preferably 1% by volume in this example.
  • Triton-X100 0.1% to 2% by volume of Triton-X100 is added, preferably 1% by volume in this embodiment, and 0.1% by volume and 2% by volume. The test was carried out using a Triton-X100.

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Abstract

本发明公开了一种核酸的转座酶打断一站式处理方法及试剂。本发明的方法，包括如下步骤：使用转座酶包埋复合体对核酸进行随机打断，其中转座酶包埋复合体包含转座酶和含转座酶识别序列的第一接头；加入第一试剂进行处理，打破转座酶对核酸的靶序列的吸附作用；加入第二试剂进行处理，减弱第一试剂对后续酶促反应的影响；以第二试剂处理后的产物为模板成分进行PCR反应，得到打断的核酸片段两端连接有接头的PCR产物。

Description

一种核酸的转座酶打断一站式处理方法及试剂 技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种核酸的转座酶打断一站式处理方法及试剂。
背景技术
自从罗氏发明了焦磷酸测序方法开辟了二代测序以来，直至现在，二代测序经历了一段高速发展期。但随着高通量测序的发展，高通量和低成本的样本制备环节逐渐成了测序领域的一个重点考虑的因素。各种原理的样本处理方法及自动化装置不断被研发出来，主要包括：样本片段化、核酸分子的末端处理及接头连接并最终的出库。
其中样本片段化主要分为物理方法(如超声剪切)或酶学方法(即非特异的核酸内切酶处理)来实现。其中物理方法以基于专利的自适应聚焦超声(Adaptive Focused Acoustic，AFA)技术的Covaris为主。在等温的条件下，利用几何聚焦声波能量，通过＞400kHz的球面固态超声传感器，将波长为1mm的声波能量聚焦在样品上。该方法确保了核酸样品的完整性得以保留，并能实现高回收率。Covaris的仪器包括经济的M系列、单管全功率的S系列以及更高通量的E和L系列。基于物理方法打断的片段随机性良好，但是通量上也要依赖大量的Covaris打断仪，同时需要后续单独进行末端处理、加接头和PCR以及各种纯化操作。其中酶学方法有一种NEB公司推出的NEB Next dsDNA Fragmentase。该试剂首先在双链DNA产生随机的切刻位点，然后通过另一种酶识别切刻位点来切割互补的DNA链，从而实现打断的目的。这种试剂可以用于基因组DNA、全基因组扩增产物和PCR产物等，随机性也较好，但是会产生一些人工短片段插入和缺失，同时也不可避免的需要后续单独进行末端处理、加接头和PCR以及相应的纯化操作。另外以Epicentra公司(已被Illumina收购)的Nextera试剂盒领衔的转座酶打断试剂盒，利用转座酶同时完成DNA片段化和接头的添加，从而减少样品处理的时间。
从各种操作的简便性来看，转座酶打断的方式无疑在通量及操作简便性上远远胜过其它方法，但是这种打断方式也有自身的缺点：转座酶包埋在靶序列上会抑制后续的酶反应，虽然相关转座酶试剂盒生产商提供了一些试剂用于低起始量(如5ng起始量基因组DNA)样本的转座酶处理，从而实现打断后无需纯化。但是对于50ng起始量这种需要提高转座酶用量的方法，则需要通过过柱或磁珠纯化的方式将转座酶去除，这无疑加大了实验操作的成本和流程(图1A)。
发明内容
本发明提供一种核酸的转座酶打断一站式处理方法及试剂，该方法和试剂能够实现从核酸的转座酶打断到下游的PCR扩增反应的一站式处理，不需要过柱或磁珠纯化，从而简化了实验操作流程并降低实验成本。
根据本发明的第一方面，本发明提供一种核酸的转座酶打断一站式处理方法，包括如下步骤：
使用转座酶包埋复合体对核酸进行随机打断，其中转座酶包埋复合体包含转座酶和含转座酶识别序列的第一接头；
加入第一试剂进行处理，打破转座酶与核酸的靶序列的吸附作用；
加入第二试剂进行处理，减弱第一试剂对后续酶促反应的影响；
以第二试剂处理后的产物为模板成分进行PCR反应，得到打断的核酸片段两端连接有接头的PCR产物。
在本发明的方法中，采用第一试剂处理转座酶打断核酸后的反应产物，以打破转座酶与核酸的靶序列的吸附作用，替代了传统的流程复杂且成本较高的过柱或磁珠纯化步骤，然后采用第二试剂处理，以减弱第一试剂对后续酶促反应的影响，保证下游的PCR扩增顺利进行。
作为本发明的优选方案，第一试剂包含蛋白酶溶液、十二烷基硫酸钠(SDS)溶液和NT缓冲液中的一种或多种。这些溶液使得转座酶发生降解或变性而从核酸的靶序列上解脱下来。需要说明的是：第一试剂可以是上述溶液中的一种或多种，其中多种可以是两种或三种，比如蛋白酶溶液和SDS溶液，SDS溶液和NT缓冲液，蛋白酶溶液和NT缓冲液，蛋白酶溶液、SDS溶液和NT缓冲液。其中，NT缓冲液可以采用Truprep试剂盒S5系列中配套的NT缓冲液。
作为本发明的优选方案，如果第一试剂包含蛋白酶溶液，则加入第一试剂进行处理后，进一步加入乙二胺四乙酸(EDTA)溶液处理。EDTA抑制蛋白酶的活性，防止蛋白酶对后续PCR反应中的酶产生降解作用。
作为本发明的优选方案，第二试剂包含Triton-X100溶液。Triton-X100又称曲拉通X-100，化学名为辛基苯基聚氧乙烯醚，作为非离子型表面活性剂，在本发明中的作用是减弱第一试剂对后续酶促反应的影响。
作为本发明的优选方案，如果第一试剂包含SDS溶液，则第二试剂还包含吐温-20溶液。吐温-20的加入能够进一步减弱SDS对后续酶促反应的影响，提升PCR效果。需要说明的是：吐温-20可以以与Triton-X100混合的形式作为第二试剂使用；也可以以与Triton-X100分离的形式单独提供，在这种情况下第二试剂指Triton-X100溶液和吐温-20溶液。应当理解，本发明中第一试剂和第二 试剂并不限定指单一的对象，也可以指多个对象的组合。并且，本发明中，任何情况下使用的“第一”和“第二”等概念都不应当理解为具有页序和技术的含义，其作用仅在于将其与其它对象区别开来。
作为本发明的优选方案，在加入第二试剂进行处理之后并且在进行PCR反应之前还包括：通过连接酶在缺口处连接上第二接头，其中缺口是在打断的核酸两端连接第一接头后形成的9bp碱基缺失。第二接头的加入，使得通过使用分别靶向结合第一接头的引物和靶向结合第二接头的引物进行PCR时，能够得到两端带有不同接头序列的PCR产物，从而打断后的核酸片段的应用不再受限于两侧共有转座酶识别序列的影响。第二接头的序列不受限制，可以是任何序列。
作为本发明的优选方案，第二接头的3’端为双脱氧核苷酸，以防止第二接头与第一接头互连。
根据本发明的第二方面，本发明提供一种核酸的转座酶打断一站式处理试剂，包括如下组成部分：
第一试剂，包含蛋白酶溶液、SDS溶液和NT缓冲液中的一种或多种，用于打破转座酶与核酸的靶序列的吸附作用；
第二试剂，包含Triton-X100溶液，用于减弱第一试剂对后续酶促反应的影响。
需要说明的是：第一试剂可以是蛋白酶溶液、SDS溶液和NT缓冲液中的一种或多种，其中多种可以是两种或三种，比如蛋白酶溶液和SDS溶液，SDS溶液和NT缓冲液，蛋白酶溶液和NT缓冲液，蛋白酶溶液、SDS溶液和NT缓冲液。其中，NT缓冲液可以采用Truprep试剂盒S5系列中配套的NT缓冲液。
作为本发明的优选方案，如果第一试剂包括蛋白酶溶液，则第一试剂还包括含有EDTA的附加试剂。EDTA抑制蛋白酶的活性，防止蛋白酶对后续PCR反应中的酶产生降解作用。含有EDTA的附加试剂作为第一试剂的组成部分，与蛋白酶溶液分开单独提供。
作为本发明的优选方案，如果第一试剂包括SDS溶液，则第二试剂还包含吐温-20溶液。吐温-20可以以与Triton-X100混合的形式作为第二试剂提供；也可以以与Triton-X100分离的形式单独提供。
作为本发明的优选方案，试剂还包括：转座酶和含转座酶识别序列的第一接头，用于形成转座酶包埋复合体以对核酸进行随机打断。
作为本发明的优选方案，试剂还包括PCR组分，用于以第二试剂处理后的产物为模板成分进行PCR反应。其中，PCR组分公知地包括DNA聚合酶、PCR 缓冲液、dNTPs、Mg2+溶液和引物等。
作为本发明的优选方案，试剂还包括第二接头组分，用于连入打断的核酸两端连接第一接头后形成的缺口处。
作为本发明的优选方案，试剂还包括连接酶组分，用于在打断的核酸两端连接第一接头后形成的缺口处连接上第二接头。
本发明中，待打断的核酸可以是基因组DNA、全基因组扩增产物或PCR产物，可以是DNA或cDNA，并且对于核酸的来源没有限制，可以是动物、植物或微生物来源的核酸样品。
本发明中，第一试剂和第二试剂的工作浓度，可由本领域技术人员根据经验确定。一般地，在第一试剂中，蛋白酶的工作浓度以50～5000mAU/mL为佳，优选75～3750mAU/mL，最优选1500mAU/mL；EDTA的工作浓度以1～50mmol/L为佳，优选14mmol/L；SDS的工作浓度以0.01％～1.5％(体积比)为佳，优选1％(体积比)；NT缓冲液的终浓度按照1×使用即可。在第二试剂中，Triton-X100的工作浓度以0.1％～2％(体积比)为佳，优选1％(体积比)；吐温-20的工作浓度以0.1％～2％(体积比)为佳，优选0.5％(体积比)。
本发明的方法采用第一试剂和第二试剂对转座酶打断核酸后的产物进行处理，代替传统的过柱或磁珠纯化，从而实现从核酸的转座酶打断到下游的PCR扩增反应的一站式处理，整个过程在单管内进行，简化了实验操作流程并降低实验成本，缩短处理周期，从而使得高通量的样本处理成为可能。
附图说明
图1为传统的转座酶试剂盒打断到PCR反应的操作流程示意图(A)、本发明的无需纯化一站式反应的操作流程示意图(B)和本发明的对应于二号接头引入方案优化的无需纯化一站式反应的操作流程示意图(C)。
图2为本发明实施例1的一号接头双接头转座酶复合体的PCR产物电泳检测结果，其中D2000为DNALadder泳道；泳道1为1×PBI，1.3×Ampure XP beads纯化处理结果；泳道2为2μL蛋白酶+14mM EDTA+1％Triton-X100处理结果；泳道3为1％SDS+1％Triton-X100+0.5％吐温-20处理结果；泳道4为NT缓冲液+1％Triton-X100处理结果；泳道5为2μL蛋白酶+1％Triton-X100处理结果。
图3为本发明实施例2的一号接头单接头转座酶复合体的PCR产物电泳检测结果，其中D2000为DNA Ladder泳道；泳道1为2μL蛋白酶+1％Triton-X100处理结果；泳道2为NT缓冲液+1％Triton-X100处理结果；泳道3为1％SDS+1％Triton-X100+0.5％吐温-20处理结果；泳道4为2μL蛋白酶+14mM EDTA+1％Triton-X100处理结果；泳道5为1×PBI，1.3×Ampure XP beads+1％Triton-X100 处理结果；泳道6为阴性对照(未加模板)结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。除非特别说明，下面实施例中所使用的技术均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备和试剂等，均为本领域内的技术人员可以通过公共途径如商购等获得的。
请参考图1B，本发明的无需纯化一站式反应的操作流程主要包括：(1)利用转座酶包埋特定修饰序列(含转座酶识别序列)的一号接头(本发明中其它地方称为第一接头)于对基因组序列、全基因组扩增序列或PCR产物序列等核酸序列进行随机打断；(2)通过蛋白酶或其它特定比例的一号试剂(本发明中其它地方称为第一试剂)处理，打破转座酶和靶序列的吸附作用实现无纯化操作；(3)向上一步反应的产物中加入二号试剂(本发明中其它地方称为第二试剂)，以减弱一号试剂对于后续酶促反应的影响；(4)无需纯化直接进行特殊引物(引物靶向结合一号接头，一号接头包括两个接头部分，每个接头部分含有共同的转座酶识别序列和彼此不同的其它序列)介导的PCR反应，从而得到靶序列两端连接有除转座酶识别序列之外完全不同序列的PCR产物，这种产物可以用于后续的分子生物学实验。
请参考图1C，本发明的对应于二号接头引入方案优化的无需纯化一站式反应的操作流程主要包括：(1)利用转座酶包埋特定修饰序列的一号接头用于对基因组序列、全基因组扩增序列和PCR产物序列等核酸序列进行随机打断；(2)通过蛋白酶或其它特定比例的一号试剂处理打破转座酶和靶序列的吸附作用实现无纯化操作；(3)加入二号试剂，以减弱一号试剂对后续酶促反应的影响；(4)通过在9nt缺口进行二号接头(本发明中其它地方称为第二接头或空隙接头)连接的方式，实现二号接头的引入，改变片段化的靶序列毗邻的接头碱基序列，使得靶序列两侧的序列完全不同，其中一段保留有含转座酶识别序列的一号接头序列，而另一段完全是任意设计的二号接头序列；(5)直接进行特殊引物(引物分别靶向结合一号接头和二号接头)介导的PCR反应，从而得到靶序列两端连接有完全不同的序列的PCR产物，这种产物可以用于后续的分子生物学实验。
在转座酶包埋阶段，本发明同时选择了两种包埋方式：第一种为转座酶包埋一号接头双接头形成座酶包埋复合体(图1B)，两个接头中都含有特殊的19bp转座酶识别序列，但分别还含有不同的其它序列；第二种为转座酶包埋一号接头单接头形成复合体(图1C)，通过对包埋接头的特殊修饰，使得包埋的一号接头序列中有一段含有特殊的19bp转座酶识别序列，同时为避免未包埋的一号接 头与二号接头的互相连接而影响PCR，本发明中对接头进行3’端双脱氧修饰，即3’端为双脱氧核苷酸。
本发明中采用了一家国产(南京诺唯赞公司的Truprep试剂盒的S50系列)的转座酶试剂盒进行实验，试剂盒包含5ng基因组DNA和50ng基因组DNA用量两种，本实施方案采用50ng基因组用量进行实验。
实施例1
本实施例首先用包埋的转座酶复合体将50ng高质量的基因组DNA进行打断操作，经过蛋白酶、SDS、NT或蛋白酶和EDTA组合物来处理，去除结合在DNA上的转座酶蛋白；然后直接用PCR引物进行扩增，PCR反应体系中加入一定浓度的TritonX-100。
1、设计订购带有19bp转座酶识别序列的三条引物序列，序列A、序列B和序列C，用于制备包埋用的一号接头双接头(本发明中称为一号接头)，其中序列A+序列B组成一号接头双接头5端；序列A+序列C组成一号接头双接头3端：
一号接头双接头序列A：CTGTCTCTTATACACATCT(SEQ ID NO：1)；
一号接头双接头序列B：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO：2)；
一号接头双接头序列C：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO：3)。
2、将序列A、序列B和序列C分别稀释到100μM，序列A+序列B组合，序列A+序列C组合，充分混合后离心，于PCR仪中按如下程序(表1)退火得到一号接头(储存于-20℃)，用于包埋复合体的制备。
表1
Figure PCTCN2014088541-appb-000001
反应后将两组退火后的接头等体积混合，用于包埋转座酶复合体。
3、按照如下体系(表2)将一号接头与转座酶包埋成转座酶包埋复合体，轻轻吹打20次混合，30℃孵育1小时后完成复合体包埋。该复合体储存于-20℃。
表2
组分 含量
转座酶S50试剂 47μL
一号接头 2μL
偶联缓冲液 47μL
合计 96μL
4、按照如下体系(表3)将50ng的高质量基因组和转座酶复合体进行混合，轻轻吹打20次混合，55℃孵育10分钟后降温至4℃，完成基因组的打断。
表3
组分 含量
水 5μL
5×打断缓冲液 2μL
gDNA(50ng/μL) 1μL
打断酶复合体 2μL
合计 10μL
5、打断后的样本处理方法有以下几种选择，方法1：加入1倍体积的PBI(Qiagen PCR纯化试剂盒中的一种商业试剂)混匀后再用1.3倍数的Ampure XP beads纯化，回融采用纯水；方法2：加入0.1-5μL蛋白酶(750 mAU/mL)进行处理，然后加入终浓度1-50mM的EDTA，本实施例优选2μL蛋白酶和终浓度14mM的EDTA，并且同时对0.1μL蛋白酶加1mM EDTA和5μL蛋白酶加50mM EDTA组合进行测试；方法3：加入0.01％-1.5％(体积比)的SDS，本实施例优选1％(体积比)的SDS，并且对0.01％(体积比)和1.5％(体积比)浓度分别进行了测试；方法4：加入终浓度的商业1×NT缓冲液(Truprep试剂盒S5系列中配套试剂)；方法5：加入0.1-5μL蛋白酶进行处理，本实施优选2μL蛋白酶，并且对0.1μL和5μL蛋白酶用量分别进行了测试。
6、在上述处理以后的产物中，加入0.1％-2％(体积比)的Triton-X100，本实施例中优选1％(体积比)，同时对0.1％(体积比)和2％(体积比)用量的 Triton-X100进行测试。
7、按照如下PCR反应体系(表4)及反应条件(表5)进行PCR扩增。对于加入了SDS的实验组，在该PCR体系中还加入特定浓度的吐温-20来部分提高PCR的效率，吐温-20的工作浓度可以调整到不同，如0.1％-2％(体积比)，本实施例优选0.5％(体积比)，同时对0.1％(体积比)和2％(体积比)工作浓度的吐温-20进行了测试。
表4
组分 含量
处理后的DNA样品 30μL
5×PCR缓冲液(含Mg2+) 10μL
10mM dNTP 1μL
引物1(10μM) 2μL
引物2(10μM) 2μL
PCR酶(DNA聚合酶) 1μL
纯水 4μL
总量 50μL
注：一号接头双接头引物1：AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID NO：4)；一号接头双接头引物2：CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO：5)。
表5
Figure PCTCN2014088541-appb-000002
8、一号接头双接头转座酶复合体的PCR产物检测如图2所示，PCR产物浓度测定结果如表6所示：
表6
Figure PCTCN2014088541-appb-000003
实施例2
本实施例首先用包埋的转座酶复合体将50ng高质量的基因组DNA进行打断操作，经过蛋白酶、SDS、NT或蛋白酶和EDTA组合物来处理，去除结合在DNA上的转座酶蛋白；通过空隙接头连接后，直接用PCR引物进行扩增，PCR反应体系中加入一定浓度的TritonX-100。
1、设计订购带有19bp转座酶识别序列的一对引物序列，序列A和序列B，用于制备包埋用的一号接头单接头(本发明中称为一号接头)：
一号接头单接头序列A：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO：6)；
一号接头单接头序列B：CTGTCTCTTATACACATC ddT(SEQ ID NO：7，dd表示双脱氧修饰)。
2、将序列A和序列B稀释到100μM，充分混合后离心，于PCR仪中按如下程序(表7)退火得到一号接头(储存于-20℃)，用于包埋复合体的制备。
表7
Figure PCTCN2014088541-appb-000004
Figure PCTCN2014088541-appb-000005
3、按照如下体系(表8)将一号接头与转座酶包埋成转座酶复合体，轻轻吹打20次混合，30℃孵育1小时后完成复合体包埋。该复合体储存于-20℃。
表8
组分 含量
转座酶 85μL
一号接头 30μL
偶联缓冲液 85μL
合计 200μL
4、按照如下体系(表9)将50ng的高质量基因组和转座酶复合体进行混合，轻轻吹打20次混合，55℃孵育10分钟后降温至4℃，完成基因组的打断。
表9
组分 含量
水 5μL
5×打断缓冲液 2μL
gDNA(50ng/μL) 1μL
打断酶复合体 2μL
合计 10μL
5、打断后的样本处理方法有以下几种选择，方法1：加入0.1-5μL蛋白酶(750 mAU/mL)进行处理，本实施优选2μL蛋白酶，同时对0.1μL和5μL蛋白酶用量分别进行了测试；方法2：加入终浓度的商业1×NT缓冲液(Truprep试剂盒S5系列中配套试剂)；方法3：加入0.01％-1.5％(体积比)的SDS，本实施例优选1％(体积比)的SDS，同时对0.01％(体积比)和1.5％(体积比)浓度分别进行了测试；方法4：加入0.1-5μL蛋白酶进行处理，然后加入终浓度1-50mM的EDTA，本实施例优选2μL蛋白酶和终浓度14mM的EDTA，同时 对0.1μL蛋白酶加1mM EDTA和5μL蛋白酶加50mM EDTA组合进行测试；方法5：加入1倍体积的PBI(Qiagen PCR纯化试剂盒中的一种商业试剂)混匀后再用1.3倍数的Ampure XP beads纯化，回融采用纯水。
6、在上述处理以后的产物中，加入0.1％-2％(体积比)的Triton-X100，本实施例中优选1％(体积比)，同时对0.1％(体积比)和2％(体积比)用量的Triton-X100进行测试。
7、上述Triton-X100处理后的产物按照如下体系(表10)进行退火后空隙接头(二号接头)的连接，25℃孵育60分钟完成接头连接。
表10
组分 含量
水 8μL
3×连接buffer 20μL
二号接头(5μM) 10μL
连接酶 2μL
DNA 20μL
合计 30μL
注：二号接头序列A：5’-pAAGTCGGAGGCCAAGCGGTCGT ddC-3’(SEQ ID NO：8)；二号接头序列B：5’-TTGGCCTCCGACT ddT-3’(SEQ ID NO：9)(p表示磷酸化修饰；dd表示双脱氧修饰)。
8、按照如下PCR反应体系(表11)及反应条件(表12)进行PCR扩增。对于加入了SDS的实验组，在该PCR体系中还需要加入特定浓度的吐温-20来部分提高PCR的效率，吐温-20的工作浓度可以调整到不同，如0.1％-2％(体积比)，本实施例优选0.5％，同时对0.1％(体积比)和2％(体积比)工作浓度的吐温-20进行了测试。
表11
组分 含量
处理后的DNA样品 30μL
5×PCR缓冲液 10μL
10mM dNTP 1μL
引物1 2μL
引物2 2μL
PCR酶(DNA聚合酶) 1μL
纯水 4μL
合计 50μL
注：一号接头单接头引物1：
AGACAAGCTCGAGCTCGAGCGATCGGGATCTACACGACTCACTGATCGTCGGCAGCGTC(SEQ ID NO：10)；一号接头单接头引物2：TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACT(SEQ ID NO：11)。
表12
9、单接头包埋复合体打断及空隙接头连接后PCR产物检测结果如图3所示，PCR产物浓度测定结果如表13。
表13
Figure PCTCN2014088541-appb-000007
Figure PCTCN2014088541-appb-000008
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (10)

  1. 一种核酸的转座酶打断一站式处理方法，包括如下步骤：
    使用转座酶包埋复合体对核酸进行随机打断，其中所述转座酶包埋复合体包含转座酶和含转座酶识别序列的第一接头；
    加入第一试剂进行处理，打破所述转座酶与所述核酸的靶序列的吸附作用；
    加入第二试剂进行处理，减弱所述第一试剂对后续酶促反应的影响；
    以所述第二试剂处理后的产物为模板成分进行PCR反应，得到打断的核酸片段两端连接有接头的PCR产物。
  2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一试剂包含蛋白酶溶液、SDS溶液和NT缓冲液中的一种或多种。
  3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，如果第一试剂包含蛋白酶溶液，则加入第一试剂进行处理后，进一步加入EDTA溶液处理。
  4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第二试剂包含Triton-X100溶液。
  5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，如果第一试剂包含SDS溶液，则所述第二试剂还包含吐温-20溶液。
  6. 根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，在加入第二试剂进行处理之后并且在进行PCR反应之前还包括：通过连接酶在缺口处连接上第二接头，其中所述缺口是在打断的核酸两端连接所述第一接头后形成的9bp碱基缺失。
  7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第二接头的3’端为双脱氧核苷酸，以防止所述第二接头与所述第一接头互连。
  8. 一种核酸的转座酶打断一站式处理试剂，包括如下组成部分：
    第一试剂，包含蛋白酶溶液、SDS溶液和NT缓冲液中的一种或多种，用于打破所述转座酶与所述核酸的靶序列的吸附作用；
    第二试剂，包含Triton-X100溶液，用于减弱所述第一试剂对后续酶促反应的影响。
  9. 根据权利要求8所述的试剂，其特征在于，所述第一试剂还包括含有EDTA的附加试剂；
    优选地，所述第二试剂还包含吐温-20溶液。
  10. 根据权利要求8或9所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括：
    转座酶和含转座酶识别序列的第一接头，用于形成转座酶包埋复合体以对核酸进行随机打断；
    优选地，所述试剂还包括PCR组分，用于以所述第二试剂处理后的产物为 模板成分进行PCR反应；
    优选地，所述试剂还包括第二接头组分，用于连入打断的核酸两端连接所述第一接头后形成的缺口处；
    优选地，所述试剂还包括连接酶组分，用于在打断的核酸两端连接所述第一接头后形成的缺口处连接上第二接头。
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