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WO2015146938A1 - 組織評価方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラム - Google Patents

組織評価方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラム Download PDF

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Publication number
WO2015146938A1
WO2015146938A1 PCT/JP2015/058813 JP2015058813W WO2015146938A1 WO 2015146938 A1 WO2015146938 A1 WO 2015146938A1 JP 2015058813 W JP2015058813 W JP 2015058813W WO 2015146938 A1 WO2015146938 A1 WO 2015146938A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fluorescent
luminance
bright spot
value
brightness
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2015/058813
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
泰宏 渡辺
武寿 磯田
秀樹 郷田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Konica Minolta Inc
Original Assignee
Konica Minolta Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Konica Minolta Inc filed Critical Konica Minolta Inc
Priority to JP2015536331A priority Critical patent/JP5835536B1/ja
Publication of WO2015146938A1 publication Critical patent/WO2015146938A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Definitions

  • the present invention relates to a tissue evaluation method, an image processing apparatus, a pathological diagnosis support system, and a program using luminance information of a fluorescent substance.
  • Patent Document 1 proposes a method of quantifying the amount of a biomarker with high reproducibility by staining a tissue sample with a fluorescent dye and obtaining the fluorescence intensity.
  • the biomarker is stained using a fluorescent dye, the fluorescence intensity corresponding to one biomarker molecule is very weak, and it is difficult to accurately grasp the number of biomarkers.
  • Patent Document 2 an average per particle is obtained by staining a tissue using fluorescent dye-integrated particles to which a biological substance recognition site is bound, and analyzing the peak of the luminance distribution of the fluorescent emission points.
  • a method for obtaining and calculating the number of particles in each bright spot has been proposed (see Example 1-2 of Patent Document 2). According to the method described in Patent Document 2, since a luminance value per particle at the time of fluorescence observation is increased, a trace amount of biological material can be detected quantitatively.
  • the main object of the present invention is to provide a tissue evaluation method, an image processing apparatus, a pathological diagnosis support system, and a program capable of accurately quantifying the number of specific biological substances in a tissue specimen.
  • the invention described in claim 1 In the tissue evaluation method for evaluating the expression level of the biological material based on the fluorescence information of a tissue specimen in which a specific biological material is stained using fluorescent particles in which a plurality of fluorescent materials are accumulated as a staining reagent, A fluorescence image input step of inputting a fluorescence image obtained by imaging the tissue specimen; A first calculation step of extracting a bright spot region from the fluorescent image and calculating a brightness value of the bright spot region; A brightness distribution is created based on the brightness value of the bright spot area, and an average brightness value per fluorescent particle is calculated by a preset method based on the brightness value of a predetermined low brightness area in the brightness distribution.
  • the low luminance region is a luminance region having a luminance value equal to or less than a luminance value of a point where the gradient of the tangent is maximum in a luminance distribution curve having a horizontal axis as a luminance value and a vertical axis as a frequency.
  • the invention according to claim 2 is the tissue evaluation method according to claim 1,
  • the average luminance value is calculated based on a predetermined low luminance region in the luminance distribution and a particle size distribution of the fluorescent particles measured in advance.
  • the invention according to claim 3 is the tissue evaluation method according to claim 2,
  • the second calculation step From the brightness distribution, the brightness value of the bright spot area with the lowest brightness derived by a predetermined method is calculated as the lowest bright spot value, The average luminance value is calculated based on the lowest bright spot value and the particle size distribution of the fluorescent particles measured in advance.
  • the invention according to claim 4 is the tissue evaluation method according to claim 3,
  • the luminance value at the intersection of the tangent line having the maximum inclination and the horizontal axis among the tangent lines of the luminance distribution curve is defined as the lowest bright spot value.
  • the invention according to claim 5 is the tissue evaluation method according to claim 3 or 4,
  • the average luminance value S (a) is calculated from the following equation (1).
  • S (a) S (m) / (1 ⁇ k ⁇ c) 3 (where 1.6 ⁇ k ⁇ 3.3) (1)
  • S (m) the lowest bright spot value c: coefficient of variation of the particle diameter of the fluorescent particles measured in advance
  • k in the luminance distribution of the single particle of the fluorescent particles
  • S (m) is in the luminance range where the significance level is p%. It is a critical value corresponding to the significance level p% and the degree of freedom ⁇ in the t distribution when the minimum luminance value is assumed.
  • the invention according to claim 6 is the tissue evaluation method according to any one of claims 1 to 5,
  • a bright-field image input step for inputting a bright-field image representing the form of cells in the tissue specimen obtained by imaging the same visual field range as the fluorescent image of the tissue specimen;
  • the invention described in claim 7 In an image processing apparatus that evaluates the expression level of the biological material based on fluorescence information of a tissue specimen in which a specific biological material is stained using fluorescent particles in which a plurality of fluorescent materials are accumulated as a staining reagent, A fluorescence image input means for inputting a fluorescence image obtained by imaging the tissue specimen; First calculation means for extracting a bright spot region from the fluorescent image and calculating a luminance value of the bright spot region; A brightness distribution is created based on the brightness value of the bright spot area, and an average brightness value per fluorescent particle is calculated by a preset method based on the brightness value of a predetermined low brightness area in the brightness distribution.
  • the low luminance region is a luminance region having a luminance value equal to or less than a luminance value of a point where the gradient of the tangent is maximum in a luminance distribution curve having a horizontal axis as a luminance value and a vertical axis as a frequency. .
  • the invention according to claim 8 is a pathological diagnosis support system, An image processing apparatus according to claim 7; An image acquisition device for acquiring the fluorescent image used in the image processing device; It is characterized by providing.
  • the invention according to claim 9 is a program, A computer that evaluates the expression level of the biological material based on fluorescence information of a tissue specimen stained with a specific biological material using fluorescent particles in which a plurality of fluorescent materials are accumulated as a staining reagent, A fluorescence image input means for inputting a fluorescence image obtained by imaging the tissue specimen; First calculation means for extracting a bright spot area from the fluorescent image and calculating a brightness value of the bright spot area; A brightness distribution is created based on the brightness value of the bright spot area, and an average brightness value per fluorescent particle is calculated by a preset method based on the brightness value of a predetermined low brightness area in the brightness distribution.
  • the low luminance region is a luminance region having a luminance value equal to or less than a luminance value of a point where the gradient of the tangent is maximum in a luminance distribution curve having a horizontal axis as a luminance value and a vertical axis as a frequency.
  • the number of specific biological substances in the tissue specimen can be accurately quantified.
  • FIG.5 S4 It is a figure which shows the system configuration
  • FIG. 10B is an enlarged view of one bright spot region surrounded by a square in FIG. 10A. It is a fluorescence image of the site
  • FIG. 10B is a second fluorescence image generated by masking the image of FIG. 10C with FIG. 10B. It is a figure which shows the luminance distribution of the 2nd fluorescence image of FIG. 10D.
  • FIG. 1 shows an example of the overall configuration of a pathological diagnosis support system 100 using the tissue evaluation method of the present invention.
  • the pathological diagnosis support system 100 obtains a microscopic image of a tissue specimen stained with a predetermined staining reagent and analyzes the acquired microscopic image to quantitatively express the expression of a specific biological material in the tissue specimen to be observed. This is a system that outputs the feature amount represented by
  • the pathological diagnosis support system 100 is configured by connecting a microscope image acquisition apparatus 1A and an image processing apparatus 2A so as to be able to transmit and receive data via an interface such as a cable 3A.
  • the connection method between the microscope image acquisition device 1A and the image processing device 2A is not particularly limited.
  • the microscope image acquisition device 1A and the image processing device 2A may be connected via a LAN (Local Area Network) or may be configured to be connected wirelessly.
  • LAN Local Area Network
  • the microscope image acquisition apparatus 1A is a known optical microscope with a camera, and acquires a microscope image of a tissue specimen on a slide placed on a slide fixing stage, and transmits the microscope image to the image processing apparatus 2A.
  • the microscope image acquisition apparatus 1A includes an irradiation unit, an imaging unit, an imaging unit, a communication I / F, and the like.
  • the irradiation means includes a light source, a filter, and the like, and irradiates the tissue specimen on the slide placed on the slide fixing stage with light.
  • the imaging means is composed of an eyepiece lens, an objective lens, and the like, and forms an image of transmitted light, reflected light, or fluorescence emitted from the tissue specimen on the slide by the irradiated light.
  • the imaging means is a microscope-installed camera that includes a CCD (Charge Coupled Device) sensor and the like, captures an image formed on the imaging surface by the imaging means, and generates digital image data of the microscope image.
  • the communication I / F transmits image data of the generated microscope image to the image processing apparatus 2A.
  • the microscope image acquisition apparatus 1A includes a bright field unit that combines an irradiation unit and an imaging unit suitable for bright field observation, and a fluorescence unit that combines an irradiation unit and an imaging unit suitable for fluorescence observation. It is possible to switch between bright field / fluorescence by switching units.
  • the microscope image acquisition apparatus 1A is not limited to a microscope with a camera.
  • a virtual microscope slide creation apparatus for example, a special microscope microscope
  • Table 2002-514319 may be used.
  • the virtual microscope slide creation device it is possible to acquire image data that allows the entire tissue specimen image on the slide to be viewed on the display unit at a time.
  • the image processing apparatus 2A calculates the expression distribution of a specific biological substance in the tissue specimen to be observed by analyzing the microscope image transmitted from the microscope image acquisition apparatus 1A.
  • FIG. 2 shows a functional configuration example of the image processing apparatus 2A.
  • the image processing apparatus 2 ⁇ / b> A includes a control unit 21, an operation unit 22, a display unit 23, a communication I / F 24, a storage unit 25, and the like, and each unit is connected via a bus 26. Yes.
  • the control unit 21 includes a CPU (Central Processing Unit), a RAM (Random Access Memory), and the like.
  • the control unit 21 executes various processes in cooperation with various programs stored in the storage unit 25, and performs image processing 2A. Overall control of the operation.
  • the control unit 21 executes image analysis processing (see FIG. 5) in cooperation with a program stored in the storage unit 25, and performs a first calculation step, a second calculation step, a third calculation step, and a display.
  • a function as means for executing the control process is realized.
  • the operation unit 22 includes a keyboard having character input keys, numeric input keys, various function keys, and the like, and a pointing device such as a mouse, and a key pressing signal pressed by the keyboard and an operation signal by the mouse. Are output to the control unit 21 as an input signal.
  • the display unit 23 includes, for example, a monitor such as a CRT (Cathode Ray Tube) or an LCD (Liquid Crystal Display), and displays various screens in accordance with display signal instructions input from the control unit 21.
  • the display unit 23 functions as output means for outputting an image analysis result, for example.
  • the communication I / F 24 is an interface for transmitting and receiving data to and from external devices such as the microscope image acquisition device 1A.
  • the communication I / F 24 functions as a bright field image and fluorescent image input unit.
  • the storage unit 25 includes, for example, an HDD (Hard Disk Drive), a semiconductor nonvolatile memory, or the like. As described above, the storage unit 25 stores various programs, various data, and the like.
  • the image processing apparatus 2A may include a LAN adapter, a router, and the like and be connected to an external device via a communication network such as a LAN.
  • the image processing apparatus 2A in the present embodiment preferably performs analysis using the bright field image and the fluorescence image transmitted from the microscope image acquisition apparatus 1A.
  • the bright field image is obtained by enlarging and photographing a tissue specimen stained with H (hematoxylin) staining reagent and HE (hematoxylin-eosin) staining reagent in a bright field in the microscope image acquisition apparatus 1A. It is an image and is a cell form image showing the form of the cell in the tissue specimen.
  • Hematoxylin is a blue-violet pigment that stains cell nuclei, bone tissue, part of cartilage tissue, serous components, etc. (basophilic tissue, etc.).
  • Eosin is a red to pink pigment that stains the cytoplasm, connective tissue of soft tissues, red blood cells, fibrin, endocrine granules, etc. (eosinophilic tissues, etc.).
  • FIG. 3 shows an example of a bright field image obtained by photographing a tissue specimen subjected to HE staining.
  • the fluorescent image uses a staining reagent including nanoparticles encapsulating a fluorescent substance bound with a biological substance recognition site that specifically binds and / or reacts with a specific biological substance (referred to as fluorescent substance-encapsulated nanoparticles or fluorescent particles).
  • Microscope obtained by irradiating fluorescent material-containing nanoparticles by irradiating excitation light having a predetermined wavelength in the microscope image acquisition device 1A to the tissue sample stained in this manner, and emitting and photographing the fluorescence. It is an image. That is, the fluorescence appearing in the fluorescence image indicates the expression of a specific biological material corresponding to the biological material recognition site in the tissue specimen.
  • FIG. 4 shows an example of the fluorescence image.
  • a method for acquiring a fluorescent image including a staining reagent (fluorescent substance-containing nanoparticles) used for acquiring the fluorescent image, a staining method for a tissue specimen using the staining reagent, and the like.
  • fluorescent substance examples include fluorescent organic dyes and quantum dots (semiconductor particles). When excited by ultraviolet to near infrared light having a wavelength in the range of 200 to 700 nm, it preferably emits visible to near infrared light having a wavelength in the range of 400 to 1100 nm.
  • Fluorescent organic dyes include fluorescein dye molecules, rhodamine dye molecules, Alexa Fluor (Invitrogen) dye molecules, BODIPY (Invitrogen) dye molecules, cascade dye molecules, coumarin dye molecules, and eosin dyes. Molecule, NBD dye molecule, pyrene dye molecule, Texas Red dye molecule, cyanine dye molecule, and the like.
  • quantum dots containing II-VI group compounds, III-V group compounds, or group IV elements as components ("II-VI group quantum dots”, "III-V group quantum dots”, " Or “Group IV quantum dots”). You may use individually or what mixed multiple types.
  • CdSe CdS, CdS, CdTe, ZnSe, ZnS, ZnTe, InP, InN, InAs, InGaP, GaP, GaAs, Si, and Ge, but are not limited thereto.
  • a quantum dot having the above quantum dot as a core and a shell provided thereon.
  • CdSe / ZnS when the core is CdSe and the shell is ZnS, it is expressed as CdSe / ZnS.
  • CdSe / ZnS, CdS / ZnS, InP / ZnS, InGaP / ZnS, Si / SiO 2 , Si / ZnS, Ge / GeO 2 , Ge / ZnS, and the like can be used, but are not limited thereto.
  • the quantum dots those subjected to surface treatment with an organic polymer or the like may be used as necessary. Examples thereof include CdSe / ZnS having a surface carboxy group (manufactured by Invitrogen), CdSe / ZnS having a surface amino group (manufactured by Invitrogen), and the like.
  • the fluorescent substance-encapsulating nanoparticles are those in which the fluorescent substance is dispersed inside the nanoparticles, and the fluorescent substance and the nanoparticles themselves may or may not be chemically bonded.
  • the material constituting the nanoparticles is not particularly limited, and examples thereof include polystyrene, polylactic acid, silica, and melamine.
  • Fluorescent substance-containing nanoparticles used in the present embodiment can be produced by a known method.
  • silica nanoparticles encapsulating a fluorescent organic dye can be synthesized with reference to the synthesis of FITC-encapsulated silica particles described in Langmuir 8, Vol. 2921 (1992).
  • Various fluorescent organic dye-containing silica nanoparticles can be synthesized by using a desired fluorescent organic dye in place of FITC.
  • Silica nanoparticles encapsulating quantum dots can be synthesized with reference to the synthesis of CdTe-encapsulated silica nanoparticles described in New Journal of Chemistry, Vol. 33, p. 561 (2009).
  • Polystyrene nanoparticles encapsulating a fluorescent organic dye may be copolymerized using an organic dye having a polymerizable functional group described in US Pat. No. 4,326,008 (1982) or polystyrene described in US Pat. No. 5,326,692 (1992). It can be produced using a method of impregnating nanoparticles with a fluorescent organic dye.
  • Polymer nanoparticles encapsulating quantum dots can be prepared using the method of impregnating polystyrene nanoparticles with quantum dots described in Nature Biotechnology, Vol. 19, page 631 (2001).
  • the average particle diameter of the fluorescent substance-containing nanoparticles used in the present embodiment is not particularly limited, but those having a large particle diameter are difficult to access the antigen, and those having a small particle diameter and a low luminance value are signals of the fluorescent substance-containing nanoparticles. Are buried in the background noise (camera noise and cell autofluorescence), and those of about 50 to 300 nm are preferable.
  • the average particle diameter is obtained by taking an electron micrograph using a scanning electron microscope (SEM), measuring the cross-sectional area of a sufficient number of particles, and taking each measured value as the area of the circle. As sought. In the present application, the arithmetic average of the particle sizes of 1000 particles is defined as the average particle size. The coefficient of variation was also a value calculated from the particle size distribution of 1000 particles.
  • the amount of the fluorescent dye per particle is proportional to the volume of the nanoparticle, that is, proportional to the cube of the particle size. Further, since the luminance value and the amount of the fluorescent dye are proportional, the luminance value per particle is also proportional to the cube of the particle diameter. That is, there is a positive correlation between the luminance value per fluorescent particle and the particle size.
  • the particle size distribution of nanoparticles produced in the chemical industry is a t distribution, and the luminance distribution can be easily obtained from the particle size distribution.
  • the luminance distribution created from the particle size distribution of the fluorescent particles is compared with the luminance distribution obtained from the fluorescent image, whereby the average luminance value per fluorescent particle can be calculated.
  • the luminance value of one fluorescent substance-containing nanoparticle is compared with the luminance distribution obtained from the fluorescent image, whereby the average luminance value per fluorescent particle can be calculated.
  • the biological material recognition site is a site that specifically binds and / or reacts with the target biological material.
  • the target biological substance is not particularly limited as long as a substance that specifically binds to the target biological substance exists, but typically, protein (peptide), nucleic acid (oligonucleotide, polynucleotide), antibody, etc. Is mentioned. Accordingly, substances that bind to the target biological substance include antibodies that recognize the protein as an antigen, other proteins that specifically bind to the protein, and nucleic acids having a base sequence that hybridizes to the nucleic acid. Is mentioned.
  • an anti-HER2 antibody that specifically binds to HER2 which is a protein present on the cell surface
  • an anti-ER antibody that specifically binds to an estrogen receptor (ER) present in the cell nucleus and actin that forms a cytoskeleton
  • an anti-actin antibody that specifically binds to are preferable.
  • the mode of binding between the biological substance recognition site and the fluorescent substance-encapsulating nanoparticles is not particularly limited, and examples thereof include covalent bonding, ionic bonding, hydrogen bonding, coordination bonding, physical adsorption, and chemical adsorption.
  • a bond having a strong bonding force such as a covalent bond is preferred from the viewpoint of bond stability.
  • an organic molecule that connects between the biological substance recognition site and the fluorescent substance-containing nanoparticle.
  • a polyethylene glycol chain can be used to suppress non-specific adsorption with a biological substance, and SM (PEG) 12 (succinimidyl-[(N-maleomidopropionamid) -dodecaethyleneglycol] ester: manufactured by Thermo Scientific) Can be used.
  • a silane coupling agent that is a compound widely used for bonding an inorganic substance and an organic substance can be used.
  • This silane coupling agent is a compound having an alkoxysilyl group that gives a silanol group by hydrolysis at one end of the molecule and a functional group such as a carboxyl group, an amino group, an epoxy group, an aldehyde group at the other end, Bonding with an inorganic substance through an oxygen atom of the silanol group.
  • silane coupling agent having a polyethylene glycol chain (for example, PEG-silane no. SIM6492.7 manufactured by Gelest), etc. Is mentioned.
  • silane coupling agent you may use 2 or more types together.
  • a publicly known method can be used for the reaction procedure of the fluorescent organic dye-encapsulated silica nanoparticles and the silane coupling agent.
  • the obtained fluorescent organic dye-encapsulated silica nanoparticles are dispersed in pure water, aminopropyltriethoxysilane is added, and the mixture is reacted at room temperature for 12 hours.
  • fluorescent organic dye-encapsulated silica nanoparticles whose surface is modified with an aminopropyl group can be obtained by centrifugation or filtration.
  • the antibody can be bound to the fluorescent organic dye-encapsulated silica nanoparticles via an amide bond.
  • a condensing agent such as EDC (1-Ethyl-3- [3-Dimethylaminopropyl] carbodiimide Hydrochloride: manufactured by Pierce (registered trademark) may be used.
  • a linker compound having a site that can be directly bonded to the fluorescent organic dye-encapsulated silica nanoparticles modified with organic molecules and a site that can be bonded to the molecular target substance can be used.
  • sulfo-SMCC Sulfosuccinimidyl 4 [N-maleimidomethyl] -cyclohexane-1-carboxylate: manufactured by Pierce
  • sulfo-SMCC Sulfosuccinimidyl 4 [N-maleimidomethyl] -cyclohexane-1-carboxylate: manufactured by Pierce
  • the same procedure can be applied regardless of whether the fluorescent substance is a fluorescent organic dye or a quantum dot. That is, by impregnating a polystyrene nanoparticle having a functional group such as an amino group with a fluorescent organic dye or a quantum dot, a fluorescent substance-containing polystyrene nanoparticle having a functional group can be obtained, and thereafter, EDC or sulfo-SMCC is used. In this way, antibody-bound fluorescent substance-encapsulated polystyrene nanoparticles can be produced.
  • Antibodies that recognize specific antigens include M. actin, MS actin, SM actin, ACTH, Alk-1, ⁇ 1-antichymotrypsin, ⁇ 1-antitrypsin, AFP, bcl-2, bcl-6, ⁇ -catenin, BCA 225, CA19-9, CA125, calcitonin, calretinin, CD1a, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD15, CD20, CD21, CD23, CD30, CD31, CD34, CD43, CD45, CD45R, CD56, CD57, CD61, CD68, CD79a, "CD99, MIC2", CD138, chromogranin, c-KIT, c-MET, collagen type IV, Cox-2, cyclin D1, keratin, cytokeratin (high molecular weight), pankeratin, pankeratin, cytokeratin 5/6, cytokeratin 7, cytokeratin 8, cytokeratin
  • tissue specimen staining method The tissue specimen staining method will be described below.
  • the staining method described below is not limited to tissue specimens and can also be applied to cell staining.
  • staining method demonstrated below is not specifically limited, What was produced by the well-known method can be used.
  • the operator immerses the tissue specimen in a container containing xylene to remove paraffin.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. If necessary, xylene may be exchanged during the immersion.
  • the tissue specimen is immersed in a container containing ethanol to remove xylene.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. Further, if necessary, ethanol may be exchanged during the immersion.
  • the tissue specimen is immersed in a container containing water to remove ethanol.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. Moreover, you may exchange water in the middle of immersion as needed.
  • the activation conditions are not particularly defined, but as the activation liquid, 0.01 M citrate buffer (pH 6.0), 1 mM EDTA solution (pH 8.0), 5% urea, 0.1 M Tris-HCl buffer, etc. Can be used.
  • the heating device an autoclave, a microwave, a pressure cooker, a water bath, or the like can be used.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature. The temperature can be 50 to 130 ° C. and the time can be 5 to 30 minutes.
  • the specimen after the activation treatment is immersed in a container containing PBS (Phosphate Buffered Saline) and washed.
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. If necessary, the PBS may be replaced during the immersion.
  • each fluorescent substance-encapsulated nanoparticle PBS dispersion may be mixed in advance or separately placed on a tissue specimen separately. Also good.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the reaction time is preferably 30 minutes or more and 24 hours or less.
  • a known blocking agent such as BSA-containing PBS
  • the stained tissue specimen is immersed in a container containing PBS to remove unreacted fluorescent substance-containing nanoparticles.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. If necessary, the PBS may be replaced during the immersion. Place the cover glass on the tissue specimen and enclose it. A commercially available encapsulant may be used as necessary.
  • staining using a HE dyeing reagent HE dyeing is performed before enclosure with a cover glass.
  • a microscope image (fluorescence image) with a wide field of view is acquired from the stained tissue specimen using the microscope image acquisition device 1A.
  • an excitation light source and a fluorescence detection optical filter corresponding to the absorption maximum wavelength and fluorescence wavelength of the fluorescent material used for the staining reagent are selected.
  • the magnification of the objective lens is preferably 4 to 100 times
  • the numerical aperture (NA) is preferably 0.6 or more, more preferably 0.8 or more.
  • the sampling pitch of the camera for imaging is preferably 400 nm or less, and more preferably 150 nm or less.
  • the visual field of the fluorescent image is preferably 3 mm 2 or more, more preferably 30 mm 2 or more, and further preferably 300 mm 2 or more.
  • a tissue specimen stained with a staining reagent containing fluorescent particles bound to a biological substance recognition site that recognizes a specific protein hereinafter referred to as a specific protein.
  • a specific protein hereinafter referred to as a specific protein.
  • the present invention is not limited to this.
  • an operator stains a tissue specimen using two types of staining reagents, a hematoxylin staining reagent and a staining reagent using fluorescent particles combined with a biological substance recognition site that recognizes a specific protein as a fluorescent labeling material.
  • a bright field image and a fluorescence image are acquired by the procedures (a1) to (a5).
  • A1 An operator places a tissue specimen stained with a hematoxylin staining reagent and a staining reagent containing fluorescent particles on a slide, and places the slide on a slide fixing stage of the microscope image acquisition apparatus 1A.
  • (A2) Set to the bright field unit, adjust the imaging magnification and focus, and place the observation target area on the tissue in the field of view.
  • (A3) Shooting is performed by the imaging unit to generate bright field image data, and the image data is transmitted to the image processing apparatus 2A.
  • (A4) Change the unit to a fluorescent unit.
  • (A5) Shooting is performed by the imaging means without changing the field of view and the shooting magnification to generate image data of a fluorescent image, and the image data is transmitted to the image processing apparatus 2A.
  • FIG. 5 shows a flowchart of image analysis processing in the image processing apparatus 2A.
  • the image analysis processing shown in FIG. 5 is executed in cooperation with the control unit 21 and the program stored in the storage unit 25.
  • step S1 when a bright field image is input from the microscope image acquisition device 1A through the communication I / F 24 (step S1), the control unit 21 extracts a cell nucleus region from the bright field image (step S2).
  • FIG. 6 shows a detailed flow of the process in step S2. The process of step S2 is executed in cooperation with the control unit 21 and the program stored in the storage unit 25.
  • step S2 first, a bright-field image is converted into a monochrome image (step S201).
  • FIG. 7A shows an example of a bright field image.
  • threshold processing is performed on the monochrome image using a predetermined threshold, and the value of each pixel is binarized (step S202).
  • noise processing is performed (step S203).
  • the noise process can be performed by performing a closing process on the binary image.
  • the closing process is a process in which the contraction process is performed the same number of times after the expansion process is performed.
  • the expansion process is a process of replacing a target pixel with white when at least one pixel in the range of n ⁇ n pixels (n is an integer of 2 or more) from the target pixel is white.
  • the contraction process is a process of replacing a target pixel with black when at least one pixel in the range of n ⁇ n pixels from the target pixel contains black.
  • FIG. 7B shows an example of an image after noise processing. As shown in FIG. 7B, after noise processing, an image (cell nucleus image) from which cell nuclei are extracted is generated.
  • the labeling process is a process for identifying an object in an image by assigning the same label (number) to connected pixels. By labeling, each cell nucleus can be identified from the image after noise processing and a label can be applied.
  • step S4 when a fluorescent image is input from the microscope image acquisition apparatus 1A through the communication I / F 24 (step S3), a bright spot region is extracted from the fluorescent image by the control unit 21 (step S4: first calculation step). .
  • FIG. 8 shows a detailed flow of the process in step S4. The process of step S4 is executed in cooperation with the control unit 21 and the program stored in the storage unit 25.
  • step S4 first, a color component corresponding to the wavelength of the fluorescent bright spot is extracted from the fluorescent image (step S401).
  • FIG. 9A shows an example of a fluorescence image.
  • step S401 for example, when the emission wavelength of the fluorescent particles is 550 nm, only the fluorescent bright spot having the wavelength component is extracted as an image.
  • threshold processing is performed on the extracted image to generate a binarized image, and a bright spot region is extracted (step S402).
  • noise removal processing such as cell autofluorescence and other unnecessary signal components may be performed before the threshold processing, and a low-pass filter such as a Gaussian filter or a high-pass filter such as a second derivative is preferably used.
  • FIG. 9B shows an example of a bright spot area image from which bright spot areas have been extracted. As shown in FIG. 9B, a bright spot region centered on the fluorescent bright spot is extracted from such an image.
  • step S403 a labeling process is performed on the bright spot area, and a label is assigned to each of the extracted bright spot areas.
  • FIG. 10A is an example of an image in which the bright spot region is extracted from the fluorescence image by the control unit 21 in step S402.
  • step S5 on the basis of the image from which the bright spot area has been extracted, for each bright spot area, the image from which the bright spot area has been extracted and the fluorescence image (FIG. 10C) of the part corresponding to the bright spot area are superimposed. Is done.
  • FIG. 10B is an enlarged view of a region surrounded by a square in FIG. 10A and shows one bright spot region.
  • FIG. 10C is a fluorescence image of a portion corresponding to the bright spot region of FIG. 10B.
  • a second fluorescent image (FIG. 10D) corresponding to the bright spot region is generated from the fluorescent image (eg, FIG. 10C) using the image from which the bright spot region is extracted (eg, FIG. 10B) as a mask.
  • the luminance value of the second fluorescent image is measured for each pixel and displayed at the X coordinate position and the Y coordinate position is, for example, a luminance distribution as shown in FIG. 10E.
  • a luminance integrated value is obtained by integrating the luminance values shown in FIG. 10E for each bright spot region.
  • FIG. 11A is created based on the luminance integrated value calculated in step S5, with the horizontal axis representing the luminance integrated value and the vertical axis representing the frequency (ratio to the total number of bright spot regions in the fluorescent image, or the number of bright spot regions). It is a brightness distribution curve.
  • one bright spot region includes one or a plurality of fluorescent particles, for example, a bright spot region including one fluorescent particle, two bright spot regions, and three bright spots.
  • the luminance integrated values of the regions indicate distribution curves having shapes close to the t distribution, respectively.
  • a curve (a thick line in FIG. 11A) in which values obtained by adding all these distributions are plotted is a luminance distribution curve actually measured from the fluorescence image.
  • FIGS. 12A to 12F and FIGS. 13A to 13F are diagrams simulating distribution curves of luminance integrated values according to the coefficient of variation of the particle diameter.
  • FIGS. 12A to 12F show the case where the target biological material is expressed at a low density, and 80% or more of the total number of bright spot areas is a bright spot area containing one fluorescent particle. This is a case where the target biological material is expressed at a high density, and the bright spot region including one fluorescent particle is 40% or less of the total number of bright spot regions.
  • the variation in the particle size of the fluorescent particles is relatively small, for example, when the variation coefficient of the particle size is 5%, as shown in FIGS. 12A and 13A, one fluorescent particle is included in one bright spot region.
  • the distribution of the luminance integrated values in the three cases is almost separated, so that the peak in each case clearly appears in the luminance distribution curve (thick line), and the luminance integrated value of each peak is accurate. Can be read.
  • the peak having the smallest luminance integrated value coincides with the peak of the luminance integrated value distribution in the bright spot region including one fluorescent particle.
  • the distribution of the luminance integrated value per fluorescent particle coincides with the cube of the particle size distribution of the fluorescent particles, and since both are t distributions, the peak luminance integrated value is an average. Matches the brightness value.
  • the luminance integrated value of the peak with the smallest luminance integrated value in the measured luminance distribution curve is read, and this luminance Assuming that the integrated value is an average luminance value per fluorescent particle, the number of fluorescent particles in the bright spot region is calculated.
  • the peak of the luminance integrated value distribution of the bright spot region including one fluorescent particle and the distribution of the luminance integrated value distribution of two bright spot regions increase.
  • the peak with a small integrated value is shifted in the high luminance direction with respect to the peak of the distribution of the luminance integrated value in the bright spot region including one fluorescent particle (FIGS. 12C, 12D, 13C, and 13D).
  • the peak with the smallest luminance integrated value in the luminance distribution curve is the distribution of the luminance integrated value in the bright spot region including one fluorescent particle. It appears at a position shifted in the high luminance direction with respect to the peak (FIG. 13C).
  • the variation coefficient is 20%, the number of fluorescent particles contained in one bright spot region is one, two cases, and three cases, and since the overlap of the distribution region of the luminance integrated value is large, it is included in the bright spot region.
  • the peak corresponding to the number of fluorescent particles cannot be read from the luminance distribution curve (FIG. 13D).
  • the peak of the lowest luminance integrated value appearing in the luminance distribution curve is shifted from the peak of the luminance integrated value distribution of the bright spot region including one fluorescent particle. In some cases, it is impossible to accurately calculate the average luminance value per fluorescent particle.
  • FIGS. 12A to 12E and FIGS. As shown in FIG. 13E, in the low luminance region, the measured luminance distribution curve and the distribution of the luminance region luminance integrated value including one fluorescent particle substantially overlap each other. Therefore, if the control unit 21 calculates the average luminance value per fluorescent particle based on the low luminance region portion of the luminance distribution curve in step S6 of the present invention, the average luminance value per fluorescent particle. Can be calculated accurately.
  • the low luminance region refers to a luminance region that is equal to or less than the luminance integrated value at a point where the slope of the tangent is maximum in the luminance distribution curves as shown in FIGS. 12A to 12E and FIGS. 13A to 13E, for example. .
  • the coefficient of variation exceeds 30%, as shown in FIGS. 12F and 13F, for example, even in the low luminance region, the distribution of the measured luminance distribution curve and the luminance point luminance integrated value including one fluorescent particle is distributed.
  • fluorescent particles having a coefficient of variation of 30% or less, and more preferably 20% or less.
  • the expression density of the specific protein in the specimen to be observed is low, even when the coefficient of variation is 30% or more, the measured luminance distribution curve in the low luminance region portion and one fluorescent particle are used.
  • the distribution of the luminance integrated value does not shift. In that case, the average luminance value per fluorescent particle can be accurately calculated by suitably using the method of the present invention.
  • the variation in the particle size of the fluorescent particles is large, use a particle with a coefficient of variation of 30% or less from the viewpoint that the larger the particle size of the fluorescent particles, the less likely it is to bind to the antigen and the access to the antigen varies. It is more preferable to use 20% or less.
  • FIG. 14 shows an example of a detailed flow of processing in step S6.
  • the control unit 21 creates a luminance distribution curve based on the luminance integrated value calculated in step S5 (step S601).
  • the particle size distribution (FIG. 11B) and the average value based on the particle size data of the fluorescent particles stored in the storage unit 25 are collated with the luminance distribution curve (step S602).
  • the low-luminance region portion of the luminance distribution curve reflects the low-luminance region portion of the luminance integrated value distribution of the bright spot region including one fluorescent particle, and further includes one fluorescent particle as described above.
  • the distribution of the luminance integrated value and the particle size distribution of a certain bright spot region substantially coincide with each other, it is created from the low luminance region portion of the luminance distribution curve created in step S601 and the particle size data stored in the storage unit 25.
  • the shape of the small particle size portion of the obtained particle size distribution curve can be superimposed as shown in FIG. 11A.
  • the control unit 21 calculates the average luminance value S (a) per fluorescent particle in the fluorescent image acquired in step S3 by collating the particle size distribution curve with the luminance distribution curve.
  • Step S603 second calculation step.
  • the control unit 21 has a region having a lower luminance than a portion where the gradient of the tangent is maximum in the luminance distribution curve, and the gradient of the tangent is maximum in the particle size distribution curve.
  • a region having a particle size smaller than that of the portion is overlapped, and the position of the average particle size (arrow in FIG. 11B) on the luminance distribution curve is calculated as the average luminance value S (a) per fluorescent particle ( Step S603).
  • control unit 21 calculates the number of fluorescent particles included in each bright spot region by dividing the luminance integrated value of each bright spot region by the average luminance value S (a) per fluorescent particle (step S604).
  • Third calculation step The calculated information on the number of fluorescent particles for each bright spot region is added to the information on the label of the bright spot region given in step S403 (step S605), and the number of fluorescent particles in the fluorescent image can be calculated.
  • step S7 the processing returns to the processing of FIG. 5, and the control unit 21 performs addition processing of the cell nucleus image (FIG. 7B) and the bright spot region image (FIG. 9B) (step S7).
  • the image displayed on the display unit 23 is arbitrary as long as it combines an image showing the expression of a specific protein in a tissue specimen and an image showing the form of a cell (in this embodiment, for example, the form of a cell nucleus).
  • the control unit 21 may add and display the bright spot region image (FIG. 9B) and the bright field image (FIG. 7A), or the fluorescence image (FIG. 9A) and the cell nucleus image (FIG. 7B).
  • control unit 21 may display the number of fluorescent particles per bright spot area calculated in step S604 on the fluorescent image or bright spot area image, and further display the cell nucleus image. This is preferable because the operator can know the distribution of the fluorescent particles in more detail.
  • the method of displaying the number of fluorescent particles contained in each bright spot region is arbitrary, but for example, the number of fluorescent particles may be displayed in the vicinity of the bright spot region with characters or symbols, or the number of fluorescent particles contained Accordingly, arbitrary parameters such as the color and size of the bright spot area may be changed and displayed.
  • the position of each fluorescent particle in each bright spot region may be calculated by any known method, an image displaying the position may be created, and added to the cell nucleus image for display.
  • the number of fluorescent particles per cell nucleus is calculated (step S8).
  • cell nuclei are extracted by the processing of steps S1 to S2, the number of fluorescent particles in each bright spot region is calculated by the processing of steps S3 to S6, and the processing of steps S7 to S8 is performed.
  • the distribution of bright spot areas on the cell nucleus is specifically displayed and grasped. In this way, by calculating the average luminance value per fluorescent particle based on the low luminance region portion of the luminance distribution curve, the number of fluorescent particles in each bright spot region is large even when the particle size variation is large. And the expression number of the specific biological substance on the observation cell nucleus can be accurately quantified.
  • the low-luminance region portion of the luminance distribution curve reflects the low-luminance region portion of the luminance integrated value distribution of the bright spot region in which one fluorescent particle is included.
  • the distribution of the integrated luminance value of the bright spot region including the two and the cube distribution of the particle diameters are almost the same, and both are t distributions.
  • the tangent line and the horizontal axis (frequency 0 straight line) having the maximum inclination in the low luminance region portion of the luminance distribution curve.
  • the luminance integrated value at the intersection with is the lowest bright spot value (S (m)) in the captured fluorescent image.
  • the following formula (1) derived based on the t distribution is used to calculate the average luminance value S (a) per fluorescent particle based on the lowest bright spot value S (m).
  • S (a) S (m) / (1 ⁇ k ⁇ c) 3 (where 1.6 ⁇ k ⁇ 3.3) (1)
  • c is a variation coefficient of a particle size.
  • K is a value determined according to the method of deriving the lowest bright spot value S (m).
  • the t The critical value corresponding to the significance level p% and the degree of freedom ⁇ in the distribution is k.
  • the minimum bright spot value S (m) derived by the above-described method using the tangent line corresponds to the minimum value in the luminance range of the significance level 95% of the luminance distribution of one fluorescent particle, and therefore k at this time is ,
  • a significance level of 95% in the t distribution, and a critical value corresponding to the degree of freedom ⁇ is set to 1.9.
  • the preferable range of k was 1.6 ⁇ k ⁇ 3.3.
  • the deviation of the average luminance value S (a) per fluorescent particle was further smaller.
  • the more preferable range of was 1.6 ⁇ k ⁇ 2.6.
  • the number of fluorescent particles contained in each bright spot region is calculated by dividing the luminance integrated value of each bright spot region calculated in step S5 by the average brightness value per fluorescent particle in step S6.
  • the luminance integrated value of the bright spot area per cell nucleus is added from the distribution of bright spot areas on the cell nucleus displayed in step S8, and divided by the average brightness value per fluorescent particle, thereby obtaining
  • the total number of fluorescent particles may be calculated.
  • the total number of fluorescent particles per image may be calculated by adding the luminance values of the bright spot regions in the entire fluorescent image and dividing by the average luminance value per fluorescent particle.
  • the calculation of the minimum bright spot value S (m) is not limited to the method using a tangent drawn in the low luminance region of the luminance distribution curve.
  • the autofluorescence or the cell of the cell in the fluorescence image is shown.
  • a method using the ratio of the luminance value of the low luminance region to the luminance value of the background noise calculated from the luminance value of the non-existing portion a method of calculating the luminance integrated value of the darkest bright spot region observed in the fluorescent image, luminance distribution curve Calculated by any method such as a method of obtaining a luminance integrated value (5 ⁇ x ⁇ 50) obtained by multiplying a luminance integrated value at a point where the inclination of the tangential line becomes maximum by a predetermined value x%. Can do.
  • Ki67 protein in a breast cancer was mentioned as an example of a specific protein, However, It is not limited to this.
  • the biological material recognition site when acquiring a fluorescence image is different, the feature quantity that quantitatively indicates the expression level of the specific protein corresponding to the lesion type It can be provided to a doctor.
  • the said embodiment although only 1 type of specific protein was made into object, you may use 2 or more types of fluorescent particles from which a light emission wavelength mutually differs with respect to several specific protein.
  • each color component is extracted using a filter work or the like in step S401, and the processing of steps S402 to S6 is executed for each extracted color component (wavelength component).
  • step S7 the cell nucleus image and the color component are extracted. What is necessary is just to add with the fluorescent particle image produced for every.
  • the fluorescent particles may be directly bound to a biological substance recognition site that binds to a specific protein as in the above embodiment, but indirectly through another substance, as in a known indirect method in immunostaining. May be combined.
  • a secondary antibody having the primary antibody as an antigen may be reacted with a fluorescent particle bound thereto and stained.
  • a fluorescent particle modified with streptavidin is reacted with streptavidin. You may dye
  • an HDD or a semiconductor non-volatile memory is used as a computer-readable medium of the program according to the present invention, but the present invention is not limited to this example.
  • a portable recording medium such as a CD-ROM can be applied.
  • a carrier wave carrier wave is also applied as a medium for providing program data according to the present invention via a communication line.
  • Step (1) 1 mg of fluorescent particles was dispersed in 5 mL of pure water. Next, 100 ⁇ L of aminopropyltriethoxysilane aqueous dispersion (LS-3150, manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) was added and stirred at room temperature for 12 hours. Step (2): The reaction mixture was centrifuged at 10,000 G for 60 minutes, and the supernatant was removed. Step (3): Ethanol was added to disperse the sediment, followed by centrifugation again. Washing with ethanol and pure water was performed once by the same procedure. When the FT-IR measurement was performed on the resulting amino group-modified fluorescent particles, absorption derived from the amino group could be observed, confirming that the amino group was modified.
  • Step (2) The reaction mixture was centrifuged at 10,000 G for 60 minutes, and the supernatant was removed.
  • Step (3) Ethanol was added to disperse the sediment, followed by centrifugation again. Washing with ethanol and pure water was performed once by the same procedure
  • Step (4) The amino group-modified fluorescent particles obtained in step (3) were adjusted to 3 nM using PBS containing 2 mM of EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid).
  • Step (6) The reaction mixture was centrifuged at 10,000 G for 60 minutes, and the supernatant was removed.
  • Step (7) PBS containing 2 mM of EDTA was added, the precipitate was dispersed, and centrifuged again. The washing
  • Step (8) When 100 ⁇ g of anti-Ki67 antibody was dissolved in 100 ⁇ L of PBS, 1 M dithiothreitol (DTT) was added and reacted for 30 minutes.
  • Step (10) Using the fluorescent particles as a starting material, the particle dispersion obtained in step (7) and the reduced anti-Ki67 antibody solution obtained in step (9) were mixed in PBS and allowed to react for 1 hour. .
  • Step (11) 4 ⁇ L of 10 mM mercaptoethanol was added to stop the reaction.
  • staining reagent a The fluorescent particles to which the anti-Ki67 antibody obtained by using the nanoparticles as a starting material in the above steps (1) to (12) is bound are referred to as “staining reagent a”.
  • Step (1) The tissue specimen was immersed in a container containing xylene for 30 minutes. The xylene was changed three times during the process.
  • Step (2) The tissue specimen was immersed in a container containing ethanol for 30 minutes. The ethanol was changed three times during the process.
  • Step (3) The tissue specimen was immersed in a container containing water for 30 minutes. The water was changed three times along the way.
  • Step (4) The tissue specimen was immersed in 10 mM citrate buffer (pH 6.0) for 30 minutes.
  • Step (6) The tissue specimen after the autoclave treatment was immersed in a container containing PBS for 30 minutes.
  • Step (7) PBS containing 1% BSA was placed on the tissue specimen and allowed to stand for 1 hour.
  • Step (8) Staining reagent a bound with anti-Ki67 antibody diluted to 0.05 nM with PBS containing 1% BSA was placed on a tissue specimen and left for 3 hours.
  • Step (10) After fixing with a 4% neutral paraformaldehyde solution for 10 minutes, hematoxylin staining was performed.
  • Step (11) After adding Aquatex made by Merck Chemicals, a cover glass was placed and sealed.
  • the tissue specimen was reacted with an anti-Ki67 monoclonal antibody as a primary antibody, and then reacted with a 0.8 nm gold colloid-labeled secondary antibody as a secondary antibody.
  • the particle size of the gold colloid was amplified with a silver sensitizing reagent to visualize the gold colloid.
  • the obtained specimen was fixed with 1% osmium tetroxide at 4 ° C. for 1 hour, dehydrated in an ethanol ascending series, and then frozen in a freeze-drying apparatus JFD-300 (manufactured by JEOL Ltd.) using t-butyl alcohol. After drying, palladium deposition was performed with ion sputtering E-1010 (manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation).
  • Example 1 the image analysis processing of FIG. 5 is performed on an image obtained from a tissue specimen having a Ki67 expression rate of about 30%, and the gradient in the low-luminance region portion of the luminance distribution curve described in the above modification is maximum.
  • the minimum bright spot value S (m) was calculated by a method using tangent lines, and the average luminance value per fluorescent particle and the number of fluorescent particles per cell nucleus were calculated.
  • Comparative Example 2 a tissue specimen labeled with Ki67 with a colloidal gold was subjected to immuno SEM observation with a Hitachi scanning electron microscope S-3000N, and the number of fluorescent particles per cell nucleus was measured. Note that the method of Comparative Example 2 can derive a value close to the true value.
  • Table 1 shows the number of fluorescent particles per cell nucleus calculated by Example 1 and Comparative Examples 1 and 2.
  • the number of fluorescent particles per cell nucleus calculated by the method of Example 1 almost coincided with the number of fluorescent particles per cell nucleus measured by the method of Comparative Example 2.
  • the number of fluorescent particles per cell nucleus calculated by the method of Comparative Example 1 is smaller than that of Example 1 and Comparative Example 2, and the number of bright spots in the cluster-like bright spot region can be accurately calculated. There wasn't.
  • Example 2 Using the same materials and methods as in (A-1) of Example 1, fluorescent particles having different average particle diameters and variation coefficients as shown in Table 2 were prepared. The methods of (A-2) antibody binding to fluorescent particles and (B) tissue staining using fluorescent particles are the same as in Example 1.
  • C) Image analysis processing As Example 2, the lowest brightness calculated by the same method as in Example 1 from tissue samples with low expression of Ki67 (expression rate: 10% or less) and high expression (expression rate: 60% or more). The average luminance value per fluorescent particle and the number of fluorescent particles per cell nucleus were calculated using the point value S (m) and further equation (1). In the formula (1), the calculation was performed with k 1.9. Table 2 shows the number of fluorescent particles per cell nucleus calculated by Example 2 and Comparative Examples 1 and 2.
  • Example 2 when the variation coefficient of the particle diameter of the fluorescent particles is large and Ki67 is highly expressed, the calculated number of fluorescent particles is slightly smaller than that of Comparative Example 2 (tissue samples 306 and 315). Even when compared with the number of fluorescent particles (tissue specimens 316 to 321) when the coefficient of variation calculated by the method of Comparative Example 1 is small, it was calculated with high accuracy. Particularly when the coefficient of variation is 30% or less, the number of fluorescent particles (tissue samples 301 to 305, 310 to 314) calculated by the method of Example 2 is the number of fluorescent particles (tissue samples 322 to 323) measured in Comparative Example 2. It is considered that the number of fluorescent particles in the bright spot region including a plurality of fluorescent particles is accurately calculated. When the variation coefficient is 16% or less, even if Ki67 is highly expressed, the number of fluorescent particles can be calculated more accurately according to the method of Example 2 (tissue samples 310 to 312). .
  • the present invention is characterized in that the number of specific biological substances in a tissue specimen can be accurately quantified, and can be particularly suitably used for generating highly accurate pathological diagnosis information.

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Abstract

　蛍光物質を複数集積した蛍光粒子を染色試薬として用いて特定の生体物質が染色された組織標本の蛍光情報に基づいて前記生体物質の発現レベルを評価する組織評価方法において、前記組織標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する蛍光画像入力工程と、前記蛍光画像から輝点領域を抽出し、前記輝点領域の輝度値を算出する第１算出工程と、前記輝点領域の輝度値に基づいて輝度分布を作成し、当該輝度分布における所定の低輝度領域の輝度値に基づいて、予め設定された手法により一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出する第２算出工程と、前記平均輝度値に基づいて、前記輝点領域内の前記蛍光粒子の数を算出する第３算出工程と、を備え、前記低輝度領域は、横軸を前記輝点領域の輝度値、縦軸を頻度とする輝度分布曲線において、接線の傾きが最大となる点の輝度値以下の輝度領域であることを特徴とする。

Description

組織評価方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラム
　本発明は、蛍光物質の輝度情報を用いた組織評価方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラムに関する。
　近年、抗体医薬を中心とした分子標的薬治療の広がりに伴い、分子標的薬をより効果的に設計するため、観察対象細胞上の生体物質（抗原）の定量が求められている。生体物質の存在を確認する方法として、生体物質認識部位が結合された蛍光物質と、当該生体物質認識部位に対応した生体物質の結合に基づく、組織分析方法が知られている。
　特許文献１では、蛍光色素を用いて組織サンプルを染色し、蛍光強度を求めることで、バイオマーカーの量を再現性よく定量する方法が提案されている。
　しかし、当該方法では、蛍光染料を用いてバイオマーカーを染色しているため、バイオマーカー一分子に対応する蛍光強度が非常に弱く、バイオマーカーの数を正確に把握することは難しい。
　これに対して、特許文献２では、生体物質認識部位が結合された蛍光色素集積粒子を用いて組織を染色し、蛍光発光輝点の輝度分布のピークを解析することで一粒子当りの平均を求め、各輝点内の粒子数を算出する方法が提案されている（特許文献２の実施例１－２参照）。
　特許文献２に記載の方法によれば、蛍光観察時の一粒子当りの輝度値が高くなるため、微量の生体物質を定量的に検出することができる。
特表２０１２－５０３１８０号公報 国際公開第２０１２／０２９３４２号
　しかし、蛍光発光輝点の輝度分布のピークを解析する特許文献２に記載の従来手法では、蛍光色素集積粒子の粒径のばらつきの程度や、目的とする生体物質の種類や発現量によっては、蛍光色素集積粒子のクラスタを１つの輝点と換算して粒子数を低く見積もったり、計測された輝度分布から一粒子の輝度値に相当するピーク値を読み取り難いために一粒子当りの平均輝度値の誤差が生じて、正確な粒子数を算出できない場合があるという問題があった。
　本発明の主な目的は、組織標本内の特定の生体物質の数を正確に定量できる組織評価方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラムを提供することにある。
　上記課題を解決するため、請求項１に記載の発明は、
　蛍光物質を複数集積した蛍光粒子を染色試薬として用いて特定の生体物質が染色された組織標本の蛍光情報に基づいて前記生体物質の発現レベルを評価する組織評価方法において、
　前記組織標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する蛍光画像入力工程と、
　前記蛍光画像から輝点領域を抽出し、前記輝点領域の輝度値を算出する第１算出工程と、
　前記輝点領域の輝度値に基づいて輝度分布を作成し、当該輝度分布における所定の低輝度領域の輝度値に基づいて、予め設定された手法により一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出する第２算出工程と、
　前記平均輝度値に基づいて、前記輝点領域内の前記蛍光粒子の数を算出する第３算出工程と、
　を備え、
　前記低輝度領域は、横軸を前記輝点領域の輝度値、縦軸を頻度とする輝度分布曲線において、接線の傾きが最大となる点の輝度値以下の輝度領域であることを特徴とする。
　請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の組織評価方法において、
　前記第２算出工程において、
　前記輝度分布における所定の低輝度領域及び予め計測された前記蛍光粒子の粒径分布に基づいて、前記平均輝度値を算出することを特徴とする。
　請求項３に記載の発明は、請求項２に記載の組織評価方法において、
　前記第２算出工程において、
　前記輝度分布から、所定の方法によって導出される最も輝度が小さい前記輝点領域の輝度値を最低輝点値として算出し、
　前記最低輝点値及び予め計測された前記蛍光粒子の粒径分布に基づいて、前記平均輝度値を算出することを特徴とする。
　請求項４に記載の発明は、請求項３に記載の組織評価方法において、
　前記輝度分布曲線の接線のうち傾きが最大である接線と横軸の交点の輝度値を、前記最低輝点値とすることを特徴とする。
　請求項５に記載の発明は、請求項３又は４に記載の組織評価方法において、
　前記第２算出工程において、前記平均輝度値Ｓ（ａ）を下記の式（１）から算出することを特徴とする。
　Ｓ（ａ）＝Ｓ（ｍ）／（１－ｋ×ｃ）３、（ただし、１．６≦ｋ≦３．３）・・・（１）
　ただし、
　Ｓ（ｍ）：前記最低輝点値
　ｃ：予め計測された前記蛍光粒子の粒径の変動係数
　ｋ：前記蛍光粒子一粒子の輝度分布において、Ｓ（ｍ）が有意水準ｐ％の輝度範囲の最小輝度値であるとした時の、ｔ分布における有意水準ｐ％、自由度∞に対応する臨界値
である。
　請求項６に記載の発明は、請求項１～５の何れか一項に記載の組織評価方法において、
　前記組織標本の前記蛍光画像と同一視野範囲を撮像して得られた、前記組織標本における細胞の形態を表す明視野画像を入力する明視野画像入力工程と、
　前記蛍光画像から抽出された前記輝点領域の画像及び前記明視野画像を重ね合わせて表示部に表示させる表示制御工程と、
　を備えることを特徴とする。
　請求項７に記載の発明は、
　蛍光物質を複数集積した蛍光粒子を染色試薬として用いて特定の生体物質が染色された組織標本の蛍光情報に基づいて前記生体物質の発現レベルを評価する画像処理装置において、
　前記組織標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する蛍光画像入力手段と、
　前記蛍光画像から輝点領域を抽出し、前記輝点領域の輝度値を算出する第１算出手段と、
　前記輝点領域の輝度値に基づいて輝度分布を作成し、当該輝度分布における所定の低輝度領域の輝度値に基づいて、予め設定された手法により一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出する第２算出手段と、
　前記平均輝度値に基づいて、前記輝点領域内の前記蛍光粒子の数を算出する第３算出手段と、
　を備え、
　前記低輝度領域は、横軸を前記輝点領域の輝度値、縦軸を頻度とする輝度分布曲線において、接線の傾きが最大となる点の輝度値以下の輝度領域であることを特徴とする。
　請求項８に記載の発明は、病理診断支援システムであって、
　請求項７に記載の画像処理装置と、
　前記画像処理装置で使用される前記蛍光画像を取得する画像取得装置と、
　を備えることを特徴とする。
　請求項９に記載の発明は、プログラムであって、
　蛍光物質を複数集積した蛍光粒子を染色試薬として用いて特定の生体物質が染色された組織標本の蛍光情報に基づいて前記生体物質の発現レベルを評価するコンピュータを、
　前記組織標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する蛍光画像入力手段、
　前記蛍光画像から輝点領域を抽出し、前記輝点領域の輝度値を算出する第１算出手段、
　前記輝点領域の輝度値に基づいて輝度分布を作成し、当該輝度分布における所定の低輝度領域の輝度値に基づいて、予め設定された手法により一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出する第２算出手段、
　前記平均輝度値に基づいて、前記輝点領域内の前記蛍光粒子の数を算出する第３算出手段、
　として機能させ、
　前記低輝度領域は、横軸を前記輝点領域の輝度値、縦軸を頻度とする輝度分布曲線において、接線の傾きが最大となる点の輝度値以下の輝度領域であることを特徴とする。
　本発明によれば、組織標本内の特定の生体物質の数を正確に定量することができる。
本発明の組織評価方法を用いた病理診断支援システムのシステム構成を示す図である。 図１の画像処理装置の機能的構成を示すブロック図である。 明視野画像の一例を示す図である。 蛍光画像の一例を示す図である。 図２の制御部により実行される画像解析処理を示すフローチャートである。 図５のステップＳ２の処理の詳細を示すフローチャートである。 明視野画像を示す図である。 細胞核が抽出された画像を示す図である。 図５のステップＳ４の処理の詳細を示すフローチャートである。 蛍光画像を示す図である。 輝点領域が抽出された画像を示す図である。 輝点領域が抽出された画像の一例を示す図である。 図１０Ａの□で囲まれた１つの輝点領域の拡大図である。 図１０Ｂの輝点領域に対応する部位の蛍光画像である。 図１０Ｃの画像を図１０Ｂでマスクすることにより生成された第２の蛍光画像である。 図１０Ｄの第２の蛍光画像の輝度分布を示す図である。 撮影された蛍光画像から測定された輝度積算値の分布を示す図である。 予め測定した蛍光粒子一粒子の粒径分布を示す図である。 生体物質の発現量が少なく、粒径の変動係数が５％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。 生体物質の発現量が少なく、蛍光粒子の粒径の変動係数が１０％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。 生体物質の発現量が少なく、蛍光粒子の粒径の変動係数が１５％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。 生体物質の発現量が少なく、蛍光粒子の粒径の変動係数が２０％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。 生体物質の発現量が少なく、蛍光粒子の粒径の変動係数が３０％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。 生体物質の発現量が少なく、蛍光粒子の粒径の変動係数が３５％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。 生体物質の発現量が多く、蛍光粒子の粒径の変動係数が５％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。 生体物質の発現量が多く、蛍光粒子の粒径の変動係数が１０％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。 生体物質の発現量が多く、蛍光粒子の粒径の変動係数が１５％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。 生体物質の発現量が多く、蛍光粒子の粒径の変動係数が２０％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。 生体物質の発現量が多く、蛍光粒子の粒径の変動係数が３０％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。 生体物質の発現量が多く、蛍光粒子の粒径の変動係数が３５％の場合の輝度積算値の分布を示す図である。 図５のステップＳ６の処理の詳細を示すフローチャートである。 最低輝点値を算出する方法の例を示す図である。
　以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
＜病理診断支援システム１００の構成＞
　図１に、本発明の組織評価方法を用いた病理診断支援システム１００の全体構成例を示す。病理診断支援システム１００は、所定の染色試薬で染色された組織標本の顕微鏡画像を取得し、取得された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織標本における特定の生体物質の発現を定量的に表す特徴量を出力するシステムである。
　図１に示すように、病理診断支援システム１００は、顕微鏡画像取得装置１Ａと、画像処理装置２Ａと、がケーブル３Ａ等のインターフェースを介してデータ送受信可能に接続されて構成されている。なお、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２Ａとの接続方式は特に限定されない。例えば、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２ＡはＬＡＮ（Local　Area　Network）により接続されることとしてもよいし、無線により接続される構成としてもよい。
　顕微鏡画像取得装置１Ａは、公知のカメラ付き光学顕微鏡であり、スライド固定ステージ上に載置されたスライド上の組織標本の顕微鏡画像を取得し、画像処理装置２Ａに送信するものである。
　顕微鏡画像取得装置１Ａは、照射手段、結像手段、撮像手段、通信Ｉ／Ｆ等を備えて構成されている。照射手段は、光源、フィルター等により構成され、スライド固定ステージに載置されたスライド上の組織標本に光を照射する。結像手段は、接眼レンズ、対物レンズ等により構成され、照射した光によりスライド上の組織標本から発せられる透過光、反射光、又は蛍光を結像する。撮像手段は、ＣＣＤ(Charge　Coupled　Device)センサー等を備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して顕微鏡画像のデジタル画像データを生成する顕微鏡設置カメラである。通信Ｉ／Ｆは、生成された顕微鏡画像の画像データを画像処理装置２Ａに送信する。本実施形態において、顕微鏡画像取得装置１Ａは、明視野観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた明視野ユニット、蛍光観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた蛍光ユニットが備えられており、ユニットを切り替えることにより明視野／蛍光を切り替えることが可能である。
　なお、顕微鏡画像取得装置１Ａとしては、カメラ付き顕微鏡に限定されず、例えば、顕微鏡のスライド固定ステージ上のスライドをスキャンして組織標本全体の顕微鏡画像を取得するバーチャル顕微鏡スライド作成装置（例えば、特表２００２－５１４３１９号公報参照）等を用いてもよい。バーチャル顕微鏡スライド作成装置によれば、スライド上の組織標本全体像を表示部で一度に閲覧可能な画像データを取得することができる。
　画像処理装置２Ａは、顕微鏡画像取得装置１Ａから送信された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織標本における特定の生体物質の発現分布を算出する。
　図２に、画像処理装置２Ａの機能構成例を示す。図２に示すように、画像処理装置２Ａは、制御部２１、操作部２２、表示部２３、通信Ｉ／Ｆ２４、記憶部２５等を備えて構成され、各部はバス２６を介して接続されている。
　制御部２１は、ＣＰＵ（Central　Processing　Unit）、ＲＡＭ（Random　Access　Memory）等を備えて構成され、記憶部２５に記憶されている各種プログラムとの協働により各種処理を実行し、画像処理装置２Ａの動作を統括的に制御する。例えば、制御部２１は、記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により画像解析処理（図５参照）を実行し、第１算出工程、第２算出工程、及び第３算出工程、表示制御工程を実行する手段としての機能を実現する。
　操作部２２は、文字入力キー、数字入力キー、及び各種機能キー等を備えたキーボードと、マウス等のポインティングデバイスを備えて構成され、キーボードで押下操作されたキーの押下信号とマウスによる操作信号とを、入力信号として制御部２１に出力する。
　表示部２３は、例えば、ＣＲＴ（Cathode　Ray　Tube）やＬＣＤ（Liquid　Crystal　Display）等のモニタを備えて構成されており、制御部２１から入力される表示信号の指示に従って、各種画面を表示する。本実施形態において、表示部２３は、例えば、画像解析結果を出力するための出力手段として機能する。
　通信Ｉ／Ｆ２４は、顕微鏡画像取得装置１Ａをはじめとする外部機器との間でデータ送受信を行なうためのインターフェースである。通信Ｉ／Ｆ２４は、明視野画像と蛍光画像の入力手段として機能する。
　記憶部２５は、例えばＨＤＤ（Hard　Disk　Drive）や半導体の不揮発性メモリー等で構成されている。記憶部２５には、前述のように各種プログラムや各種データ等が記憶されている。
　その他、画像処理装置２Ａは、ＬＡＮアダプターやルーター等を備え、ＬＡＮ等の通信ネットワークを介して外部機器と接続される構成としてもよい。
　本実施形態における画像処理装置２Ａは、顕微鏡画像取得装置１Ａから送信された明視野画像及び蛍光画像を用いて解析を行うことが好ましい。
　明視野画像は、Ｈ（ヘマトキシリン）染色試薬、ＨＥ（ヘマトキシリン－エオジン）染色試薬を用いて染色された組織標本を、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて明視野で拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像であって、当該組織標本における細胞の形態を表す細胞形態画像である。ヘマトキシリンは青紫色の色素であり、細胞核、骨組織、軟骨組織の一部、漿液成分など（好塩基性の組織等）を染色する。エオジンは赤～ピンク色の色素であり、細胞質、軟部組織の結合組織、赤血球、線維素、内分泌顆粒など（好酸性の組織等）を染色する。図３に、ＨＥ染色を行った組織標本を撮影した明視野画像の一例を示す。
　蛍光画像は、特定の生体物質と特異的に結合及び／又は反応する生体物質認識部位が結合した蛍光物質を内包したナノ粒子（蛍光物質内包ナノ粒子又は蛍光粒子と呼ぶ）を含む染色試薬を用いて染色された組織標本に対し、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて所定波長の励起光を照射して蛍光物質内包ナノ粒子を発光（蛍光）させ、この蛍光を拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像である。即ち、蛍光画像に現れる蛍光は、組織標本における、生体物質認識部位に対応する特定の生体物質の発現を示すものである。図４に、蛍光画像の一例を示す。
＜蛍光画像の取得＞
　ここで、蛍光画像の取得方法について、この蛍光画像の取得に際して用いられる染色試薬（蛍光物質内包ナノ粒子）、染色試薬による組織標本の染色方法等も含めて詳細に説明する。
〔蛍光物質〕
　蛍光画像の取得のための染色試薬に用いられる蛍光物質としては、蛍光有機色素及び量子ドット（半導体粒子）を挙げることができる。２００～７００ｎｍの範囲内の波長の紫外～近赤外光により励起されたときに、４００～１１００ｎｍの範囲内の波長の可視～近赤外光の発光を示すことが好ましい。
　蛍光有機色素としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Alexa　Fluor（インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ＮＢＤ系色素分子、ピレン系色素分子、Texas　Red系色素分子、シアニン系色素分子等を挙げることができる。
　具体的には、５－カルボキシ－フルオレセイン、６－カルボキシ－フルオレセイン、５，６－ジカルボキシ－フルオレセイン、６－カルボキシ－２’，４，４’，５’，７，７’－ヘキサクロロフルオレセイン、６－カルボキシ－２’，４，７，７’－テトラクロロフルオレセイン、６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５－カルボキシ－ローダミン、６－カルボキシ－ローダミン、５，６－ジカルボキシ－ローダミン、ローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ－ローダミン、及びAlexa　Fluor　350、Alexa　Fluor　405、Alexa　Fluor　430、Alexa　Fluor　488、Alexa　Fluor　500、Alexa　Fluor　514、Alexa　Fluor　532、Alexa　Fluor　546、Alexa　Fluor　555、Alexa　Fluor　568、Alexa　Fluor　594、Alexa　Fluor　610、Alexa　Fluor　633、Alexa　Fluor　635、Alexa　Fluor　647、Alexa　Fluor　660、Alexa　Fluor　680、Alexa　Fluor　700、Alexa　Fluor　750、BODIPY　FL、BODIPY　TMR、BODIPY　493／503、BODIPY　530／550、BODIPY　558／568、BODIPY　564／570、BODIPY　576／589、BODIPY　581／591、BODIPY　630／650、BODIPY　650／665（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Cy5、Cy5.5、Cy7等を挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。
　量子ドットとしては、II－VI族化合物、III－V族化合物、又はIV族元素を成分として含有する量子ドット（それぞれ、「II－VI族量子ドット」、「III－V族量子ドット」、「IV族量子ドット」ともいう。）のいずれかを用いることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。
　具体的には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅが挙げられるが、これらに限定されない。
　上記量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを用いることもできる。以下、本明細書中シェルを有する量子ドットの表記法として、コアがＣｄＳｅ、シェルがＺｎＳの場合、ＣｄＳｅ／ＺｎＳと表記する。例えば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ、Ｓｉ／ＳｉＯ２、Ｓｉ／ＺｎＳ、Ｇｅ／ＧｅＯ２、Ｇｅ／ＺｎＳ等を用いることができるが、これらに限定されない。
　量子ドットは必要に応じて、有機ポリマー等により表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、表面カルボキシ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）、表面アミノ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）等が挙げられる。
〔蛍光物質内包ナノ粒子〕
　本実施形態において蛍光物質内包ナノ粒子とは、蛍光物質がナノ粒子内部に分散されたものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していても、結合していなくてもよい。
　ナノ粒子を構成する素材は特に限定されるものではなく、ポリスチレン、ポリ乳酸、シリカ、メラミン等を挙げることができる。
　本実施形態で用いられる蛍光物質内包ナノ粒子は、公知の方法により作製することが可能である。例えば、蛍光有機色素を内包したシリカナノ粒子は、ラングミュア　８巻　２９２１ページ（１９９２）に記載されているＦＩＴＣ内包シリカ粒子の合成を参考に合成することができる。ＦＩＴＣの代わりに所望の蛍光有機色素を用いることで種々の蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を合成することができる。
　量子ドットを内包したシリカナノ粒子は、ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー　３３巻　５６１ページ（２００９）に記載されているＣｄＴｅ内包シリカナノ粒子の合成を参考に合成することができる。
　蛍光有機色素を内包したポリスチレンナノ粒子は、米国特許４３２６００８（１９８２）に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許５３２６６９２（１９９２）に記載されているポリスチレンナノ粒子への蛍光有機色素の含浸法を用いて作製することができる。
　量子ドットを内包したポリマーナノ粒子は、ネイチャー・バイオテクノロジー１９巻６３１ページ（２００１）に記載されているポリスチレンナノ粒子への量子ドットの含浸法を用いて作製することができる。
　本実施形態で用いられる蛍光物質内包ナノ粒子の平均粒径は特に限定されないが、粒径が大きいものは抗原にアクセスしにくく、粒径が小さく輝度値が低いものは蛍光物質内包ナノ粒子の信号がバックグラウンドノイズ（カメラのノイズや細胞の自家蛍光）に埋もれてしまうことから、５０～３００ｎｍ程度のものが好適である。
　平均粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径として求めた。本願においては、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とした。
　蛍光物質内包ナノ粒子では、ナノ粒子に含まれる蛍光色素の密度が一定であれば、一粒子当たりの蛍光色素の量はナノ粒子の体積に比例し、すなわち、粒径の３乗に比例する。また、輝度値と蛍光色素の量は比例するため、１粒子当たりの輝度値もまた、粒径の３乗に比例する。つまり、蛍光粒子一粒子当たりの輝度値と粒径の間には正の相関がある。また、通常、化学工業的に作られるナノ粒子の粒径分布はｔ分布となり、粒径分布から輝度分布を容易に求めることができる。この原理を利用し、蛍光粒子の粒径分布から作成された輝度分布と、蛍光画像から得られた輝度分布を比較することにより、蛍光粒子一粒子当たりの平均輝度値を算出することができる。
　実際のところ、蛍光物質内包ナノ粒子一粒子の輝度値と粒径の３乗の間には正の相関があり、蛍光物質内包ナノ粒子一粒子の粒径の分布曲線の形状はほぼｔ分布となって一致した。
〔生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子との結合〕
　本実施形態に係る生体物質認識部位とは、目的とする生体物質と特異的に結合及び／又は反応する部位である。目的とする生体物質は、それと特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されるものではないが、代表的にはタンパク質（ペプチド）および核酸（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、抗体等が挙げられる。したがって、そのような目的とする生体物質に結合する物質としては、前記タンパク質を抗原として認識する抗体やそれに特異的に結合する他のタンパク質等、および前記核酸にハイブリタイズする塩基配列を有する核酸等が挙げられる。具体的には、細胞表面に存在するタンパク質であるＨＥＲ２に特異的に結合する抗ＨＥＲ２抗体、細胞核に存在するエストロゲン受容体（ＥＲ）に特異的に結合する抗ＥＲ抗体、細胞骨格を形成するアクチンに特異的に結合する抗アクチン抗体等があげられる。中でも抗ＨＥＲ２抗体及び抗ＥＲ抗体を蛍光物質内包ナノ粒子に結合させたものは、乳癌の投薬選定に用いることができ、好ましい。
　生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子の結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合等の結合力の強い結合が好ましい。
　また、生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子の間を連結する有機分子があってもよい。例えば、生体物質との非特異的吸着を抑制するため、ポリエチレングリコール鎖を用いることができ、ＳＭ（ＰＥＧ）１２（succinimidyl-［（N-maleomidopropionamid）-dodecaethyleneglycol］ester：サーモサイエンティフィック社製）を用いることができる。
　蛍光物質内包シリカナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。例えば、無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基等の官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤（例えば、Gelest社製PEG-silane　no．SIM6492.7）等が挙げられる。シランカップリング剤を用いる場合、二種以上を併用してもよい。
　蛍光有機色素内包シリカナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。例えば、得られた蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で１２時間反応させる。反応終了後、遠心分離又はろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を得ることができる。続いてアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を蛍光有機色素内包シリカナノ粒子と結合させることができる。必要に応じて、ＥＤＣ（1-Ethyl-3-［3-Dimethylaminopropyl］carbodiimide　Hydrochloride：Pierce（登録商標）社製）のような縮合剤を用いることもできる。
　必要により、有機分子で修飾された蛍光有機色素内包シリカナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。具体例として、アミノ基と選択的に反応する部位とメルカプト基と選択的に反応する部位の両方をもつsulfo-SMCC（Sulfosuccinimidyl　4［N-maleimidomethyl］-cyclohexane-1-carboxylate：Pierce社製）を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した蛍光有機色素内包シリカナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基を結合させることで、抗体結合した蛍光有機色素内包シリカナノ粒子ができる。
　蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。すなわち、アミノ基等の官能基をもつポリスチレンナノ粒子へ蛍光有機色素、量子ドットを含浸することにより、官能基をもつ蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子を得ることができ、以降ＥＤＣ又はsulfo-SMCCを用いることで、抗体結合した蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子ができる。
　特定抗原を認識する抗体としては、M.アクチン、M.S.アクチン、S.M.アクチン、ACTH、Alk-1、α1-アンチキモトリプシン、α1-アンチトリプシン、AFP、bcl-2、bcl-6、β-カテニン、BCA　225、CA19-9、CA125、カルシトニン、カルレチニン、CD1a、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD15、CD20、CD21、CD23、CD30、CD31、CD34、CD43、CD45、CD45R、CD56、CD57、CD61、CD68、CD79a、"CD99、MIC2"、CD138、クロモグラニン、c-KIT、c-MET、コラーゲン　タイプIV、Cox-2、サイクリンD1、ケラチン、サイトケラチン（高分子量）、パンケラチン、パンケラチン、サイトケラチン5/6、サイトケラチン　7、サイトケラチン　8、サイトケラチン8/18、サイトケラチン　14、サイトケラチン　19、サイトケラチン　20、CMV、E-カドヘリン、EGFR、ER、EMA、EBV、第VIII因子関連抗原、ファッシン、FSH、ガレクチン-3、ガストリン、GFAP、グルカゴン、グリコフォリン　A、グランザイムB、hCG、hGH、ヘリコバクターピロリ、HBc　抗原、HBs　抗原、ヘパトサイト特異抗原、HER2、HSV-I、HSV-II、HHV-8、IgA、IgG、IgM、IGF-1R、インヒビン、インスリン、カッパ　L鎖、Ki67、ラムダ　L鎖、LH、リゾチーム、マクロファージ、メランA、MLH-1、MSH-2、ミエロパーオキシダーゼ、ミオゲニン、ミオグロビン、ミオシン、ニューロフィラメント、NSE、p27(Kip1)、p53、p53、P63、PAX　5、PLAP、ニューモシスティス　カリニ、ポドプラニン（D2-40）、PGR、プロラクチン、PSA、前立腺酸性フォスファターゼ、Renal　Cell　Carcinoma、S100、ソマトスタチン、スペクトリン、シナプトフィジン、TAG-72、TdT、サイログロブリン、TSH、TTF-1、TRAcP、トリプターゼ、ビリン、ビメンチン、WT1、Zap-70が挙げられる。
〔染色方法〕
　以下、組織標本の染色方法について述べる。以下に説明する染色方法は組織標本に限定せず、細胞染色にも適用可能である。
　また、以下に説明する染色方法が適用できる標本の作製法は特に限定されず、公知の方法により作製されたものを用いることができる。
　１）脱パラフィン工程
　まず、操作者は、キシレンを入れた容器に組織標本を浸漬させ、パラフィンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
　次いで、エタノールを入れた容器に組織標本を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
　次いで、水を入れた容器に組織標本を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
　２）賦活化処理
　操作者は、公知の方法にならい、目的とする生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍ　クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％　尿素、０．１Ｍ　トリス塩酸緩衝液等を用いることができる。加熱機器は、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０～１３０℃、時間は５～３０分で行うことができる。
　次いで、ＰＢＳ（Phosphate　Buffered　Saline：リン酸緩衝生理食塩水）を入れた容器に、賦活化処理後の標本を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
　３）生体物質認識部位が結合された蛍光物質内包ナノ粒子を用いた染色
　操作者は、生体物質認識部位が結合された蛍光物質内包ナノ粒子のＰＢＳ分散液を組織標本に載せ、目的とする生体物質と反応させる。蛍光物質内包ナノ粒子と結合させる生体物質認識部位を変えることにより、さまざまな生体物質に対応した染色が可能となる。数種類の生体物質認識部位が結合された蛍光物質内包ナノ粒子を用いる場合には、それぞれの蛍光物質内包ナノ粒子ＰＢＳ分散液を予め混合しておいてもよいし、別々に順次組織標本に載せてもよい。
　温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
　蛍光物質内包ナノ粒子による染色を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳ等、公知のブロッキング剤を滴下することが好ましい。
　次いで、ＰＢＳを入れた容器に、染色後の組織標本を浸漬させ、未反応蛍光物質内包ナノ粒子の除去を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。カバーガラスを組織標本に載せ、封入する。必要に応じて市販の封入剤を使用してもよい。
　なお、ＨＥ染色試薬を用いて染色を行う場合、カバーガラスによる封入の前にＨＥ染色を行う。
〔蛍光画像の取得〕
　染色した組織標本に対し顕微鏡画像取得装置１Ａを用いて、広視野の顕微鏡画像（蛍光画像）を取得する。顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて、染色試薬に用いた蛍光物質の吸収極大波長及び蛍光波長に対応した励起光源及び蛍光検出用光学フィルターを選択する。
　解析に用いられる蛍光顕微鏡画像（蛍光画像）の取得条件には特に制限はないが、対物レンズの倍率は４～１００倍が好ましく、開口数（ＮＡ）は０．６以上が好ましく、さらに好ましくは０．８以上である。また、撮像するカメラのサンプリングピッチは、４００ｎｍ以下が好ましく、さらに好ましくは１５０ｎｍ以下である。
　蛍光画像の視野は、３ｍｍ２以上であることが好ましく、３０ｍｍ２以上であることがさらに好ましく、３００ｍｍ２以上であることがさらに好ましい。
＜病理診断支援システム１００の動作（画像処理方法を含む。）＞
　以下、病理診断支援システム１００において、上記説明した蛍光画像及び明視野画像を取得して解析を行う動作について説明する。ここでは、特定のタンパク質（ここでは、乳癌組織におけるＫｉ６７タンパクとする。以下、特定タンパクと呼ぶ。）を認識する生体物質認識部位が結合した蛍光粒子を含む染色試薬を用いて染色された組織標本を観察対象とする場合を例にとり説明するが、これに限定されるものではない。
　まず、操作者は、ヘマトキシリン染色試薬と、特定タンパクを認識する生体物質認識部位が結合した蛍光粒子を蛍光標識材料とした染色試薬との、２種の染色試薬を用いて組織標本を染色する。
　その後、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて、（ａ１）～（ａ５）の手順により明視野画像及び蛍光画像が取得される。
（ａ１）操作者は、ヘマトキシリン染色試薬と蛍光粒子を含む染色試薬とにより染色された組織標本をスライドに載置し、そのスライドを顕微鏡画像取得装置１Ａのスライド固定ステージに設置する。
（ａ２）明視野ユニットに設定し、撮影倍率、ピントの調整を行い、組織上の観察対象の領域を視野に納める。
（ａ３）撮像手段で撮影を行って明視野画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。
（ａ４）ユニットを蛍光ユニットに変更する。
（ａ５）視野及び撮影倍率を変えずに撮像手段で撮影を行って蛍光画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。
　画像処理装置２Ａにおいては、明視野画像及び蛍光画像に基づき画像解析処理が実行される。
　図５に、画像処理装置２Ａにおける画像解析処理のフローチャートを示す。図５に示す画像解析処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
　まず、通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの明視野画像が入力されると（ステップＳ１）、制御部２１により、明視野画像から細胞核の領域の抽出が行われる（ステップＳ２）。
　図６に、ステップＳ２における処理の詳細フローを示す。ステップＳ２の処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
　ステップＳ２においては、まず、明視野画像のモノクロ画像への変換が行われる（ステップＳ２０１）。図７Ａに、明視野画像の一例を示す。
　次いで、モノクロ画像に対し予め定められた閾値を用いて閾値処理が施され、各画素の値が二値化される（ステップＳ２０２）。
　次いで、ノイズ処理が行われる（ステップＳ２０３）。ノイズ処理は、具体的には、二値画像にクロージング処理が施されることにより行うことができる。クロージング処理は、膨張処理を行ってから同じ回数分だけ収縮処理を行う処理である。膨張処理は、注目画素からｎ×ｎ画素（ｎは２以上の整数）の範囲内にある画素に１つでも白が含まれている場合に注目画素を白に置き換える処理である。収縮処理は、注目画素からｎ×ｎ画素の範囲内にある画素に１つでも黒が含まれている場合に注目画素を黒に置き換える処理である。クロージング処理により、ノイズ等の小さい領域を除去することができる。図７Ｂに、ノイズ処理後の画像の一例を示す。図７Ｂに示すように、ノイズ処理後には、細胞核が抽出された画像（細胞核画像）が生成される。
　次いで、ノイズ処理後の画像にラベリング処理が施され、抽出された細胞核のそれぞれにラベルが付与される（ステップＳ２０４）。ラベリング処理とは、連結している画素に同じラベル（番号）を付与していくことで画像内のオブジェクトを識別する処理である。ラベリング処理により、ノイズ処理後の画像から各細胞核を識別してラベルを付与することができる。
　一方、通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの蛍光画像が入力されると（ステップＳ３）、制御部２１により、蛍光画像から輝点領域が抽出される（ステップＳ４：第１算出工程）。
　図８に、ステップＳ４における処理の詳細フローを示す。ステップＳ４の処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
　ステップＳ４においては、まず、蛍光画像から蛍光輝点の波長に応じた色成分の抽出が行われる（ステップＳ４０１）。
　図９Ａに、蛍光画像の一例を示す。
　ステップＳ４０１では、たとえば、蛍光粒子の発光波長が５５０ｎｍである場合には、その波長成分を有する蛍光輝点のみが画像として抽出される。
　次いで、抽出された画像に閾値処理が施されて二値化画像が生成され、輝点領域が抽出される（ステップＳ４０２）。
　なお、閾値処理の前に細胞自家蛍光や他の不要信号成分等のノイズ除去処理が施されてもよく、ガウシアンフィルタ等のローパスフィルタや二次微分等のハイパスフィルタが好ましく用いられる。
　図９Ｂに、輝点領域が抽出された輝点領域画像の一例を示す。図９Ｂに示すように、かかる画像では蛍光輝点を中心とした輝点領域が抽出されている。
　次いで、輝点領域にラベリング処理が施され、抽出された輝点領域のそれぞれにラベルが付与される（ステップＳ４０３）。
　次いで、ステップＳ５において、制御部２１が輝点領域の輝度値を算出する工程（第１算出工程）を説明する。図１０Ａは、制御部２１により、ステップＳ４０２において、蛍光画像から輝点領域が抽出された画像の一例である。ステップＳ５では、輝点領域が抽出された画像に基づいて、輝点領域ごとに、輝点領域が抽出された画像と、その輝点領域に対応する部位の蛍光画像（図１０Ｃ）とが重ね合わされる。図１０Ｂは、図１０Ａ内の□で囲まれた領域の拡大図であり、１つの輝点領域を示す。図１０Ｃは、図１０Ｂの輝点領域に対応する部位の蛍光画像である。
　次いで、輝点領域が抽出された画像（例えば、図１０Ｂ）をマスクとして、蛍光画像（例えば、図１０Ｃ）から、輝点領域に対応する第２の蛍光画像（図１０Ｄ）が生成される。
　その第２の蛍光画像の輝度値を画素ごとに計測し、Ｘ座標位置及びＹ座標位置に表示したものが、例えば図１０Ｅに示されるような輝度分布である。図１０Ｅに示される輝度値を輝点領域ごとに積算したものが、輝度積算値である。図１１Ａは、ステップＳ５において算出された輝度積算値に基づいて、横軸を輝度積算値、縦軸を頻度（蛍光画像内の全輝点領域数に対する比、又は輝点領域数）として作成された輝度分布曲線である。
　実際のところ、１つの輝点領域には１個または複数個の蛍光粒子が含まれ、例えば、蛍光粒子が１つ含まれる輝点領域、２つ含まれる輝点領域、３つ含まれる輝点領域、の輝度積算値は、図１１Ａに示すように、それぞれｔ分布に近い形状の分布曲線を示す。そして、これらの分布を全て加算した値をプロットした曲線（図１１Ａ太線）が、蛍光画像から実際に計測される輝度分布曲線である。
　図１２Ａ～図１２Ｆ及び図１３Ａ～図１３Ｆは、粒径の変動係数に応じた輝度積算値の分布曲線をシミュレーションした図である。図１２Ａ～図１２Ｆは、目的とする生体物質が低密度で発現し、輝点領域の総数のうち８０％以上が蛍光粒子を１つ含む輝点領域である場合、図１３Ａ～図１３Ｆは、目的とする生体物質が高密度で発現し、蛍光粒子を１つ含む輝点領域が輝点領域の総数のうち４０％以下の場合である。
　蛍光粒子の粒径のばらつきが比較的小さく、例えば、粒径の変動係数が５％である時は、図１２Ａ及び図１３Ａに示すように、１つの輝点領域に含まれる蛍光粒子が１つの場合、２つの場合、３つの場合、の輝度積算値の分布がほぼ分離しているため、輝度分布曲線（太線）において、それぞれの場合のピークが明確に現れ、各ピークの輝度積算値を正確に読み取ることができる。
　つまり、輝度分布曲線に現れるピークのうち、最も輝度積算値が小さいピークは、蛍光粒子を１つ含む輝点領域の輝度積算値の分布のピークと一致する。そして、蛍光粒子一粒子当たりの輝度積算値の分布は、前述したように蛍光粒子の粒径の分布の３乗と一致しており、いずれもｔ分布となるので、ピークの輝度積算値は平均輝度値と一致する。
　従来の方法（例えば、特許文献２（国際公開第２０１２／０２９３４２号）に記載された方法）においては、計測された輝度分布曲線における最も輝度積算値が小さいピークの輝度積算値を読み取り、この輝度積算値が一蛍光粒子当たりの平均輝度値であるとして、輝点領域内の蛍光粒子数を算出している。
　図１２Ｂ及び図１３Ｂに示すように、変動係数が１０％である時の輝度分布曲線においては、輝点領域に含まれる蛍光粒子数が２つ又は３つである場合のピークは不明瞭となるが、１つである場合のピークは明確に現れており、このピークの輝度積算値から一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出することができる。
　変動係数が大きくなるに従って、蛍光粒子を１つ含む輝点領域の輝度積算値の分布のピークと２つ含む輝点領域の輝度積算値の分布の重なりが大きくなるため、輝度分布曲線における最も輝度積算値が小さいピークは、蛍光粒子を１つ含む輝点領域の輝度積算値の分布のピークに対して、高輝度方向にずれる（図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１３Ｃ、及び図１３Ｄ）。特定タンパクの密度が高いほど、１つの輝点領域内に複数の蛍光粒子が含まれる確率が大きくなるため、このピークのずれは顕著になる。
　例えば、変動係数が１５％では、特に目的とする生体物質が多い場合には、輝度分布曲線における最も輝度積算値が小さいピークは、蛍光粒子を１つ含む輝点領域の輝度積算値の分布のピークに対して、高輝度方向にずれた位置に現れる（図１３Ｃ）。
　変動係数が２０％では、１つの輝点領域に含まれる蛍光粒子が１つの場合、２つの場合、及び３つの場合、の輝度積算値の分布領域の重なりが大きいため、輝点領域に含まれる蛍光粒子数に対応するピークを輝度分布曲線から読み取ることはできない（図１３Ｄ）。
　このように、変動係数が１５％以上では、輝度分布曲線に現れる最も輝度積算値が小さいピークと、蛍光粒子を１つ含む輝点領域の輝度積算値の分布のピークがずれるため、従来の方法を用いて一蛍光粒子当たりの平均輝度値を正確に算出することができない場合がある。
　しかし、輝度分布曲線における最も輝度積算値が小さいピークと蛍光粒子を１つ含む輝点領域の輝度積算値の分布のピークがずれている場合であっても、図１２Ａ～図１２Ｅ及び図１３Ａ～図１３Ｅに示すように、低輝度領域においては、測定された輝度分布曲線と、蛍光粒子を１つ含む輝点領域輝度積算値の分布はほぼ重なる。そこで、制御部２１は、本発明のステップＳ６において、輝度分布曲線の低輝度領域の部分に基づいて一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出することとすれば、一蛍光粒子当たりの平均輝度値を正確に算出することができる。
　低輝度領域とは、具体的には、例えば、図１２Ａ～図１２Ｅ及び図１３Ａ～図１３Ｅに示すような輝度分布曲線において接線の傾きが最大となる点の輝度積算値以下の輝度領域を指す。
　なお、変動係数が３０％を上回ると、例えば図１２Ｆ及び図１３Ｆに示すように、低輝度領域においても、測定された輝度分布曲線と、蛍光粒子を１つ含む輝点領域輝度積算値の分布にずれが生じる場合があるという観点から、本方法においては、変動係数が３０％以下の蛍光粒子を用いることが好ましく、２０％以下のものを用いると更に好適である。
　なお、例えば観察対象の標本における特定タンパクの発現密度が低い場合には、変動係数が３０％以上であっても、低輝度領域部分における測定された輝度分布曲線と、蛍光粒子が１つの場合の輝度積算値の分布のずれが生じない場合もある。その場合には、本発明の方法を好適に用いて一蛍光粒子当たりの平均輝度値を正確に算出することができる。
　また、蛍光粒子の粒径のばらつきが大きい場合は、蛍光粒子の粒径が大きいほど抗原に結合しにくく、抗原へのアクセスがばらつくという観点からも、変動係数が３０％以下のものを用いることが好ましく、２０％以下のものを用いると更に好適である。
　図１４に、ステップＳ６における処理の詳細フローの一例を示す。
　まず、制御部２１は、ステップＳ５で算出された輝度積算値に基づいて輝度分布曲線を作成する（ステップＳ６０１）。次いで、記憶部２５に記憶されている蛍光粒子の粒径のデータに基づく粒径の分布（図１１Ｂ）及び平均値を、輝度分布曲線と照合する（ステップＳ６０２）。輝度分布曲線の低輝度領域部分は、蛍光粒子を１つ含む輝点領域の輝度積算値の分布の低輝度領域部分を反映しており、さらに、前述したように含まれる蛍光粒子が１つである輝点領域の輝度積算値の分布と粒径分布はほぼ一致するので、ステップＳ６０１で作成された輝度分布曲線の低輝度領域部分と、記憶部２５に記憶されている粒径のデータから作成された粒径分布曲線の小粒径部分の形状は、図１１Ａに示すように重ね合わせることができる。
　図１１Ａのように輝度分布曲線に粒径分布曲線を重ね合わせて照合することで、制御部２１はステップＳ３で取得された蛍光画像における一蛍光粒子当たりの平均輝度値Ｓ（ａ）を算出することができる（ステップＳ６０３：第２算出工程）。
　具体的には、制御部２１は、例えば、図１１Ａに示されるように、輝度分布曲線において接線の傾きが最大となる部分よりも低輝度の領域と、粒径分布曲線において接線の傾きが最大となる部分よりも粒径が小さい領域を重ね合わせ、輝度分布曲線上での平均粒径（図１１Ｂ内の矢印）の位置を、一蛍光粒子当たりの平均輝度値Ｓ（ａ）として算出する（ステップＳ６０３）。
　次いで、制御部２１は、各輝点領域の輝度積算値を、一蛍光粒子当たりの平均輝度値Ｓ（ａ）で割ることによって、各輝点領域に含まれる蛍光粒子数を算出する（ステップＳ６０４：第３算出工程）。算出された輝点領域ごとの蛍光粒子数の情報は、ステップＳ４０３で付与した輝点領域のラベルの情報に追加され（ステップＳ６０５）、蛍光画像内の蛍光粒子数が算出可能となる。
　ステップＳ２とステップＳ６の処理の終了後、図５の処理に戻り、制御部２１により細胞核画像（図７Ｂ）と輝点領域画像（図９Ｂ）の加算処理が行われ（ステップＳ７）、細胞核上における輝点領域の分布が画像処理装置２Ａの表示部２３に表示される（表示制御工程）。これにより、操作者は蛍光粒子の分布をより詳細に知ることができるため好ましい。
　表示部２３に表示される画像は、組織標本における特定タンパクの発現を示す画像と細胞の形態（本実施形態においては、例えば、細胞核の形態）を示す画像を組み合わせたものであれば任意であり、例えば、制御部２１は、輝点領域画像（図９Ｂ）と明視野画像（図７Ａ）、又は蛍光画像（図９Ａ）と細胞核画像（図７Ｂ）を加算して表示してもよい。
　また、制御部２１は、ステップＳ６０４において算出された輝点領域当たりの蛍光粒子数を蛍光画像又は輝点領域画像上に表示し、さらに細胞核画像を加算して表示しても良い。これにより、操作者は蛍光粒子の分布をさらに詳細に知ることができるため好ましい。各輝点領域に含まれる蛍光粒子数の表示方法は任意であるが、例えば、輝点領域の近傍に蛍光粒子数を文字や記号で表示しても良いし、または、含まれる蛍光粒子数に応じて、輝点領域の色や大きさ等の任意のパラメータを変化させて表示しても良い。また、各輝点領域における個々の蛍光粒子の位置を公知の任意の方法によって算出して、その位置を表示する画像を作成し、細胞核画像と加算して表示しても良い。
　次いで、一細胞核当たりの蛍光粒子数が算出される（ステップＳ８）。
　以上の本発明の実施形態によれば、ステップＳ１～Ｓ２の処理により細胞核が抽出され、ステップＳ３～Ｓ６の処理により、各輝点領域の蛍光粒子数が算出され、ステップＳ７～Ｓ８の処理により、細胞核上での輝点領域の分布が具体的に表示され把握されるようになっている。このように、輝度分布曲線の低輝度領域部分に基づいて一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出することによって、粒径のばらつきが大きい場合であっても、各輝点領域における蛍光粒子の数を算出し、観察対象細胞核上での特定生体物質の発現数を正確に定量することができる。
＜変形例＞
　上記実施形態のステップＳ６の第２算出工程において、一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出する方法の変形例を説明する。
　前述したように、輝度分布曲線の低輝度領域部分は、含まれる蛍光粒子が１つである輝点領域の輝度積算値の分布の低輝度領域部分を反映しており、さらに、蛍光粒子を１つ含む輝点領域の輝度積算値の分布と粒径の３乗の分布はほぼ一致していずれもｔ分布となる。
　ｔ分布（ここでは、横軸を輝度積算値、縦軸を頻度として説明する）の曲線において、傾きが最大となる接線を引くと、その接線と横軸（頻度＝０の直線）との交点の輝度積算値は、ｔ分布における９５％信頼区間の下側臨界値（＝平均値－２×標準偏差）に相当する。このｔ分布の性質に基づいて、以下に具体的に説明するように、一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出することができる。
　本変形例の第２算出工程において、制御部２１は、まず、図１５に示されるように、輝度分布曲線の低輝度領域部分において傾きが最大となる接線と横軸（頻度＝０の直線）との交点の輝度積算値を、撮影された蛍光画像における最低輝点値（Ｓ（ｍ））とする。
　最低輝点値Ｓ（ｍ）に基づく一蛍光粒子当たりの平均輝度値Ｓ（ａ）の算出は、例えば、ｔ分布に基づいて導かれた下記の式（１）を用いる。
　　　Ｓ（ａ）＝Ｓ（ｍ）／（１－ｋ×ｃ）３、（ただし、１．６≦ｋ≦３．３）・・・（１）
　ただし、ｃは粒径の変動係数である。
　また、ｋは、最低輝点値Ｓ（ｍ）の導出方法に応じて決まる値である。具体的には、導出された最低輝点値Ｓ（ｍ）が、ｔ分布である蛍光粒子一粒子の輝度分布において有意水準ｐ％の輝度範囲内の最小の輝度積算値と等しい場合、当該ｔ分布における有意水準ｐ％、自由度∞に対応する臨界値をｋとする。例えば、前述した接線を用いる方法で導出された最低輝点値Ｓ（ｍ）は、蛍光粒子一粒子の輝度分布の有意水準９５％の輝度範囲の最小値に相当するため、このときのｋは、ｔ分布における有意水準９５％、自由度∞に対応する臨界値である１．９に設定される。
　検討の結果、最低輝点値Ｓ（ｍ）が有意水準９０％以上９９．９％以下の臨界値である場合に、大きな乖離なく一蛍光粒子当たりの平均輝度値Ｓ（ａ）が算出されたことから、ｋの好適な範囲は１．６≦ｋ≦３．３であった。また、最低輝点値Ｓ（ｍ）が有意水準９０％以上９９％以下の臨界値である場合には、一蛍光粒子当たりの平均輝度値Ｓ（ａ）の乖離がさらに小さかったことから、ｋのさらに好適な範囲は１．６≦ｋ≦２．６であった。
　以上の本変形例において式（１）より平均輝度値Ｓ（ａ）を算出した後、上記実施形態のステップＳ６０４以降と同様の工程を実施してり、輝点領域当たりの蛍光粒子数を算出する。
　なお、上記実施形態における記述内容は、本発明の好適な一例であり、これに限定されるものではない。
　また、上記実施形態では、ステップＳ５で算出した各輝点領域の輝度積算値を、ステップＳ６において一蛍光粒子当たりの平均輝度値で割ることによって、各輝点領域に含まれる蛍光粒子の数を算出したが、ステップＳ８で表示される細胞核上の輝点領域の分布から、細胞核当たりの輝点領域の輝度積算値を加算し、一蛍光粒子当たりの平均輝度値で割ることによって、細胞核当たりの蛍光粒子の総数を算出してもよい。また、蛍光画像全体における輝点領域の輝度値を加算し、一蛍光粒子当たりの平均輝度値で割ることによって、画像当たりの蛍光粒子の総数を算出してもよい。
　また、最低輝点値Ｓ（ｍ）の算出は、輝度分布曲線の低輝度領域に引いた接線を用いる方法に限られるものではなく、例えば、蛍光画像内の細胞の自家蛍光又は細胞が写っていない部分の輝度値から算出したバックグラウンドノイズの輝度値に対する低輝度領域の輝度値の比を用いる方法、蛍光画像内に観察される最も暗い輝点領域の輝度積算値とする方法、輝度分布曲線において接線の傾きが最大となる点の輝度積算値に予め設定された所定の値ｘ％を掛けた輝度積算値（ただし、５≦ｘ≦５０）とする方法など、任意の方法により算出することができる。
　また、上記実施形態では、特定タンパクの例として乳癌におけるＫｉ６７タンパクを挙げたが、これに限定されない。診断対象となる病変（がん）種に応じて、蛍光画像を取得する際の生体物質認識部位を異なるものとすれば、病変種に応じた特定タンパクの発現量を定量的に示す特徴量を医師に提供することが可能となる。
　また、上記実施形態では、１種の特定タンパクのみを対象としたが、複数の特定タンパクに対し、発光波長が互いに異なる２種以上の蛍光粒子を用いてもよい。
　かかる場合、ステップＳ４０１においてフィルターワーク等を用いてそれぞれの色成分を抽出し、その抽出した色成分（波長成分）ごとにステップＳ４０２～Ｓ６の処理を実行し、ステップＳ７において、細胞核画像と色成分ごと作成された蛍光粒子画像とを加算すればよい。
　また、蛍光粒子は、上記実施形態のように特定タンパクに結合する生体物質認識部位に直接結合されても良いが、免疫染色における公知の間接法のように、別の物質を介して間接的に結合されても良い。例えば、組織標本に特定タンパクを抗原とする一次抗体を反応させた後、一次抗体を抗原とする二次抗体に蛍光粒子を結合したものを反応させて染色しても良い。また、例えば、組織標本に特定タンパクを抗原とする一次抗体及び、一次抗体を抗原とするビオチン化二次抗体を反応させた後、ストレプトアビジンにより修飾された蛍光粒子を反応させて、ストレプトアビジンとビオチンが特異的に結合して複合体を形成することを利用して染色しても良い。
　また、上記の説明では、本発明に係るプログラムのコンピュータ読み取り可能な媒体としてＨＤＤや半導体の不揮発性メモリー等を使用した例を開示したが、この例に限定されない。その他のコンピュータ読み取り可能な媒体として、ＣＤ－ＲＯＭ等の可搬型記録媒体を適用することが可能である。また、本発明に係るプログラムのデータを、通信回線を介して提供する媒体として、キャリアウエーブ（搬送波）も適用される。
　その他、病理診断支援システム１００を構成する各装置の細部構成及び細部動作に関しても、発明の趣旨を逸脱することのない範囲で適宜変更可能である。
（Ａ）染色試薬ａの作製
（Ａ－１）蛍光粒子の作製
　蛍光色素として赤色発光色素であるSulforhodamine101（シグマアルドリッチ社製）１４．４ｍｇを水２２ｍＬに加えて溶解させた。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルジョン（登録商標）４３０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製）の５％水溶液を２ｍＬ加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックＭＸ－０３５（日本カーバイド工業社製）を０．６５ｇ加えた。
　さらに、この溶液に界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）の１０％水溶液を１０００μＬ加え、７０℃で５０分間加熱撹拌した。その後、９０℃に昇温して２０分間加熱撹拌した。得られた蛍光色素結合メラミン樹脂粒子（蛍光粒子）の分散液から、余剰の樹脂原料や蛍光色素等の不純物を除くため、純水による洗浄を行った。
　具体的には、遠心分離機（クボタ社製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで１５分間、遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を５回繰り返した。得られた蛍光粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含むことから、プラス電荷となった。粒子の電荷の評価は、ＮＭＲやＩＲ等による樹脂成分分析と、ゼータ電位測定により行なった。
　得られた蛍光粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；日立（登録商標）社製Ｓ－８００型）で観察したところ、平均粒径は１２５ｎｍ、粒径の変動係数は１０％であった。
（Ａ－２）蛍光粒子への抗体の結合
　下記工程（１）～（１２）の方法により、蛍光粒子に対して抗Ｋｉ６７抗体を結合させた。
　工程（１）：１ｍｇの蛍光粒子を純水５ｍＬに分散させた。次いで、アミノプロピルトリエトキシシラン水分散液（ＬＳ－３１５０、信越化学工業社製）１００μＬを添加し、室温で１２時間撹拌した。
　工程（２）：反応混合物を１００００Ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
　工程（３）：エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を１回ずつ行った。
　得られたアミノ基修飾した蛍光粒子のＦＴ－ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾されたことが確認できた。
　工程（４）：工程（３）で得られたアミノ基修飾した蛍光粒子を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳを用いて３ｎＭに調整した。
　工程（５）：工程（４）で調整した溶液に、最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、succinimidyl-［（N-maleomidopropionamid）-dodecaethyleneglycol］ester）を混合し、１時間反応させた。
　工程（６）：反応混合液を１００００Ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。
　工程（７）：ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬのＰＢＳを用いて再分散させ、抗体結合用マレイミド結合蛍光粒子を得た。
　工程（８）：抗Ｋｉ６７抗体１００μｇを１００μＬのＰＢＳに溶解させたところに、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、３０分反応させた。
　工程（９）：反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去し、蛍光粒子に結合可能な還元化抗Ｋｉ６７抗体溶液を得た。
　工程（１０）：蛍光粒子を出発原料として工程（７）で得られた粒子分散液と工程（９）で得られた還元化抗Ｋｉ６７抗体溶液とをＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。
　工程（１１）：１０ｍＭメルカプトエタノール４μＬを添加し、反応を停止させた。
　工程（１２）：反応混合物を１００００Ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行った。最後に５００μＬのＰＢＳを用いて再分散させ、抗Ｋｉ６７抗体が結合された蛍光粒子を得た。
　以上の工程（１）～（１２）によりナノ粒子を出発原料として得られた抗Ｋｉ６７抗体が結合された蛍光粒子を「染色試薬ａ」とする。
（Ｂ）蛍光粒子を用いた組織染色
　下記工程（１）～（１１）の方法により、染色試薬ａを用いて、ヒト乳房組織標本の免疫染色を行った。組織標本はコスモバイオ社製の組織アレイスライド（ＣＢ－Ａ７１２）を用いた。予めＤＡＢ染色によりＫｉ６７染色濃度を観察して、Ｋｉ６７の発現率（全細胞のうち、Ｋｉ６７を発現している細胞の割合（％））を計測した後、それぞれ染色を行った。
　工程（１）：キシレンを入れた容器に組織標本を３０分浸漬させた。途中３回キシレンを交換した。
　工程（２）：エタノールを入れた容器に組織標本を３０分浸漬させた。途中３回エタノールを交換した。
　工程（３）：水を入れた容器に組織標本を３０分浸漬させた。途中３回水を交換した。
　工程（４）：１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に組織標本を３０分浸漬させた。
　工程（５）：１２１度で１０分オートクレーブ処理を行った。
　工程（６）：ＰＢＳを入れた容器に、オートクレーブ処理後の組織標本を３０分浸漬させた。
　工程（７）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを組織標本に載せて、１時間放置した。
　工程（８）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗Ｋｉ６７抗体が結合された染色試薬ａを、組織標本に載せて３時間放置した。
　工程（９）：ＰＢＳを入れた容器に、染色後の組織標本をそれぞれ３０分浸漬させた。
　工程（１０）４％中性パラホルムアルデヒド溶液で１０分間固定処理した後、ヘマトキシリン染色を行った。
　工程（１１）：Merck　Chemicals社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ封入した。
　比較として、上記工程（８）において、組織標本を一次抗体である抗Ｋｉ６７モノクローナル抗体と反応させ、次いで二次抗体として０．８ｎｍ金コロイド標識２次抗体を用いて反応させた。続いて、銀増感試薬で金コロイドの粒径を増幅し、金コロイドの可視化を行なった。得られた標本を、１％四酸化オスミウムで４℃１時間後固定し、エタノール上昇系列で脱水後、ｔ－ブチルアルコールを使用して凍結乾燥装置ＪＦＤ－３００（日本電子株式会社製）で凍結乾燥し、イオンスパッタＥ－１０１０（日立ハイテクノロジーズ社製）でパラジウム蒸着を施した。
（Ｃ）画像解析処理
　染色試薬ａを用いて染色した組織標本について、顕微鏡画像（明視野画像及び蛍光画像）を取得した。
　顕微鏡として、カールツアイス社製正立顕微鏡Axio　Imager　M2を用い、画像取得撮影倍率を４０倍に設定した。蛍光画像の取得にあたっては、波長５８０ｎｍ、強度30ｍWの励起光を照射して、組織標本から発せられる６１０ｎｍの波長を有する蛍光を結像し、顕微鏡設置カメラ（モノクロ）により顕微鏡画像（画像データ）を取得した。
　なお、上記カメラは画素サイズ６．４μｍ×６．４μｍ、縦画素数１０４０個、横画素数１３８８個（撮像領域８．９ｍｍ×６．７ｍｍ）を有している。
　実施例１として、Ｋｉ６７発現率が約３０％の組織標本から得られた画像に図５の画像解析処理を実行し、上記変形例にて記載した輝度分布曲線の低輝度領域部分における傾きが最大となる接線を用いる方法によって最低輝点値Ｓ（ｍ）を算出し、一蛍光粒子当たりの平均輝度値及び、一細胞核当たりの蛍光粒子数を算出した。
　比較例１として、実施例１と同様に作成した組織標本に対して、特許文献２（国際公開第２０１２－０２９３４２号）に記載された方法を用いて、一蛍光粒子当たりの平均輝度値及び、一細胞核当たりの蛍光粒子数を算出した。
　具体的には、実施例１と同様に作成した輝度分布曲線から、最も輝度積算値が小さいピークの輝度積算値を読み取り、この輝度積算値が一蛍光粒子当たりの平均輝度値であるとして、一細胞核当たりの蛍光粒子数を算出した。
　比較例２として、金コロイドでＫｉ６７を標識した組織標本を、日立走査型電子顕微鏡Ｓ－３０００Ｎで免疫ＳＥＭ観察を行ない、一細胞核当たりの蛍光粒子数を計測した。なお、比較例２の方法は、真値に近い値を導出することができる。
　実施例１、比較例１及び２によって算出された一細胞核当たりの蛍光粒子数を、表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、実施例１の方法によって算出された一細胞核当たりの蛍光粒子数は、比較例２の方法で計測された一細胞核当たりの蛍光粒子数とほぼ一致した。
　一方、比較例１の方法で算出された一細胞核当たりの蛍光粒子数は、実施例１及び比較例２と比べて少なく、クラスタ状の輝点領域内の輝点数を正確に算出することができなかった。
　実施例１の（Ａ－１）と同様の材料及び方法を用いて、表２に示すように粒径の平均値及び変動係数が異なる蛍光粒子を作成した。（Ａ－２）蛍光粒子への抗体の結合、（Ｂ）蛍光粒子を用いた組織染色、の方法は、実施例１と同様である。
（Ｃ）画像解析処理
　実施例２として、Ｋｉ６７低発現（発現率：１０％以下）及び高発現（発現率：６０％以上）の組織標本から、実施例１と同様の方法によって算出した最低輝点値Ｓ（ｍ）と、さらに式（１）を用いて、一蛍光粒子当たりの平均輝度値及び、一細胞核当たりの蛍光粒子数を算出した。なお、式（１）において、ｋ＝１．９として計算した。
　実施例２、比較例１及び２によって算出された一細胞核当たりの蛍光粒子数を、表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、Ｋｉ６７が低発現又は高発現のいずれの場合においても、実施例２の方法によれば、比較例２の方法で計測された一細胞核当たりの蛍光粒子数と近い蛍光粒子数が算出された。
　一方、比較例１の方法によれば、Ｋｉ６７が低発現であり、変動係数が１０％である組織標本３１６を除いては、実施例２及び比較例２と比べて蛍光粒子数が常に少なく算出されていた。特に、Ｋｉ６７が高発現であり、さらに変動係数が大きいほど、蛍光粒子数が少なく見積もられる傾向が見られた（組織標本３１７～３２１）。
　実施例２においても、蛍光粒子の粒径の変動係数が大きく、さらにＫｉ６７が高発現の場合には、算出した蛍光粒子数が比較例２と比べてやや少なくなる（組織標本３０６、３１５）が、比較例１の方法で算出された変動係数が小さい場合の蛍光粒子数（組織標本３１６～３２１）と比較しても、高精度に算出された。
　特に変動係数が３０％以下では、実施例２の方法で算出された蛍光粒子数（組織標本３０１～３０５、３１０～３１４）は比較例２で計測された蛍光粒子数（組織標本３２２～３２３）と極めて近く、複数の蛍光粒子が含まれる輝点領域内の蛍光粒子数を正確に算出していると考えられる。
　また、変動係数が１６％以下の場合は、Ｋｉ６７が高発現の場合であっても、実施例２の方法によれば、さらに正確に蛍光粒子数を算出可能である（組織標本３１０～３１２）。
　以上のように、本発明の輝度分布曲線の低輝度領域に基づいた定量方法によれば、簡易な光学顕微鏡を用いて、免疫電子顕微鏡法を用いた真値に近い値を得ることができる。
　本発明は、組織標本内での特定の生体物質の数を正確に定量できることを特徴とし、高精度な病理診断情報の生成に特に好適に利用することができる。
　１Ａ　　顕微鏡画像取得装置
　２Ａ　　画像処理装置
　３Ａ　　ケーブル
　２１　　制御部（第１算出手段、第２算出手段、第３算出手段、表示制御手段）
　２２　　操作部
　２３　　表示部
　２４　　通信Ｉ／Ｆ（入力手段、明視野画像入力手段）
　２５　　記憶部
　２６　　バス
　１００　病理診断支援システム

Claims (9)

  1. 　蛍光物質を複数集積した蛍光粒子を染色試薬として用いて特定の生体物質が染色された組織標本の蛍光情報に基づいて前記生体物質の発現レベルを評価する組織評価方法において、
    　前記組織標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する蛍光画像入力工程と、
    　前記蛍光画像から輝点領域を抽出し、前記輝点領域の輝度値を算出する第１算出工程と、
    　前記輝点領域の輝度値に基づいて輝度分布を作成し、当該輝度分布における所定の低輝度領域の輝度値に基づいて、予め設定された手法により一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出する第２算出工程と、
    　前記平均輝度値に基づいて、前記輝点領域内の前記蛍光粒子の数を算出する第３算出工程と、
    　を備え、
    　前記低輝度領域は、横軸を前記輝点領域の輝度値、縦軸を頻度とする輝度分布曲線において、接線の傾きが最大となる点の輝度値以下の輝度領域であることを特徴とする組織評価方法。
  2. 　前記第２算出工程において、
    　前記輝度分布における所定の低輝度領域及び予め計測された前記蛍光粒子の粒径分布に基づいて、前記平均輝度値を算出することを特徴とする請求項１に記載の組織評価方法。
  3. 　前記第２算出工程において、
    　前記輝度分布から、所定の方法によって導出される最も輝度が小さい前記輝点領域の輝度値を最低輝点値として算出し、
    　前記最低輝点値及び予め計測された前記蛍光粒子の粒径分布に基づいて、前記平均輝度値を算出することを特徴とする請求項２に記載の組織評価方法。
  4. 　前記輝度分布曲線の接線のうち傾きが最大である接線と横軸の交点の輝度値を、前記最低輝点値とすることを特徴とする請求項３に記載の組織評価方法。
  5. 　前記第２算出工程において、
    　前記平均輝度値Ｓ（ａ）を下記の式（１）から算出することを特徴とする請求項３又は４に記載の組織評価方法。
    　Ｓ（ａ）＝Ｓ（ｍ）／（１－ｋ×ｃ）３、（ただし、１．６≦ｋ≦３．３）・・・（１）
    　ただし、
    　Ｓ（ｍ）：前記最低輝点値
    　ｃ：予め計測された前記蛍光粒子の粒径の変動係数
    　ｋ：前記蛍光粒子一粒子の輝度分布において、Ｓ（ｍ）が有意水準ｐ％の輝度範囲の最小輝度値であるとした時の、ｔ分布における有意水準ｐ％、自由度∞に対応する臨界値
    である。
  6. 　前記組織標本の前記蛍光画像と同一視野範囲を撮像して得られた、前記組織標本における細胞の形態を表す明視野画像を入力する明視野画像入力工程と、
    　前記蛍光画像から抽出された前記輝点領域の画像及び前記明視野画像を重ね合わせて表示部に表示させる表示制御工程と、
    　を備えることを特徴とする請求項１～５の何れか一項に記載の組織評価方法。
  7. 　蛍光物質を複数集積した蛍光粒子を染色試薬として用いて特定の生体物質が染色された組織標本の蛍光情報に基づいて前記生体物質の発現レベルを評価する画像処理装置において、
    　前記組織標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する蛍光画像入力手段と、
    　前記蛍光画像から輝点領域を抽出し、前記輝点領域の輝度値を算出する第１算出手段と、
    　前記輝点領域の輝度値に基づいて輝度分布を作成し、当該輝度分布における所定の低輝度領域の輝度値に基づいて、予め設定された手法により一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出する第２算出手段と、
    　前記平均輝度値に基づいて、前記輝点領域内の前記蛍光粒子の数を算出する第３算出手段と、
    　を備え、
    　前記低輝度領域は、横軸を前記輝点領域の輝度値、縦軸を頻度とする輝度分布曲線において、接線の傾きが最大となる点の輝度値以下の輝度領域であることを特徴とする画像処理装置。
  8. 　請求項７に記載の画像処理装置と、
    　前記画像処理装置で使用される前記蛍光画像を取得する画像取得装置と、
    　を備えることを特徴とする病理診断支援システム。
  9. 　蛍光物質を複数集積した蛍光粒子を染色試薬として用いて特定の生体物質が染色された組織標本の蛍光情報に基づいて前記生体物質の発現レベルを評価するコンピュータを、
    　前記組織標本を撮像して得られた蛍光画像を入力する蛍光画像入力手段、
    　前記蛍光画像から輝点領域を抽出し、前記輝点領域の輝度値を算出する第１算出手段、
    　前記輝点領域の輝度値に基づいて輝度分布を作成し、当該輝度分布における所定の低輝度領域の輝度値に基づいて、予め設定された手法により一蛍光粒子当たりの平均輝度値を算出する第２算出手段、
    　前記平均輝度値に基づいて、前記輝点領域内の前記蛍光粒子の数を算出する第３算出手段、
    　として機能させるプログラムであって、
    　前記低輝度領域は、横軸を前記輝点領域の輝度値、縦軸を頻度とする輝度分布曲線において、接線の傾きが最大となる点の輝度値以下の輝度領域であることを特徴とする。
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