WO2015024142A1

WO2015024142A1 - 一种棉花锌指蛋白azf2-1及其编码基因与应用

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Publication number: WO2015024142A1
Application number: PCT/CN2013/000987
Authority: WO
Inventors: 梁远金; 何云蔚; 田大翠; 陈淼
Original assignee: BIOCENTURY TRANSGENE (CHINA) Co Ltd
Current assignee: BIOCENTURY TRANSGENE (CHINA) Co Ltd
Priority date: 2013-08-22
Filing date: 2013-08-22
Publication date: 2015-02-26
Anticipated expiration: 2016-02-22
Also published as: CN105008391A

Abstract

本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于棉花的锌指蛋白AZF2-1及其编码基因，以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。

Description

一种棉花锌指蛋白 AZF2-1及其编码基因与应用

技术领域本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于棉花的锌指蛋白 AZF2-1及其编码基因，以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。背景技术盐胁迫是世界农业生产最重要的非生物逆境危害之一，盐渍土壤通常以钠盐、钙盐或镁盐为主，成为影响植物生长、导致粮食和经济作物减产的主要因素。世界上盐碱土的面积约有 4亿公顷，占灌溉农田的 1/3。盐碱地在中国分布广泛，现有盐碱地面积约 0. 4亿公顷。随着我国人口增加，耕地减少，盐碱地资源的开发利用有着极其重要的现实意义。而植物抗盐碱、耐干旱能力的提高和适宜在盐碱地上生长并具有较高经济和生态价值的植物种或品系的选育，则是利用盐碱地经济、有效的措施。对绝大多数农作物来说，大多数植物对盐碱、干旱的耐受性差，只能生长在氯化钠含量为 0. 3%以下的土壤上，土壤中过量的 Na⁺会对植物体的正常的生长代谢产生毒害作用。因此如何在盐渍环境下提高作物产量就成为全世界农业生产中十分重要的问题。

植物的耐盐性是一个十分复杂的数量性状，其耐盐机制涉及从植株到器官、组织、生理生化直至分子的各个水平。各国的科学家也为此做了大量的工作，并取得了很多新进展，特别在利用高等模式植物拟南芥来研究植物的耐盐分子机理方面，使该领域的研究有了突破性的进展（Zhu JK. 2002. Salt and drought stress singal transduction in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 53： 1247-1273； Zhang ZL. 2011. Arabidopsis Floral Initiator SKB1 Confers High Salt Tolerance by Regulating Transcription and Pre— mRNA Spl icing through Altering Histone H4R3 and Smal l Nuclear Ribonucleoprotein LSM4 Methylation. Plant Cel l, 23 : 396 - 411 ) 。

高等植物细胞可通过多种途径感受外界环境中物化参数的变化，从而将胞外的信号变为胞内信号，通过系列的信号传导最后将胁迫信号传递至细胞核内，激活转录因子，而激活转录因子再作用于功能基因，启动逆境应答基因的表达从而提高植物的耐逆性。尽管研究者已从不同侧面开展了大量研究，但由于其机制十分复杂，植物抗盐中的许多重要问题仍有待探索。例如，植物抗盐的关键因子仍未找到；植物耐盐的分子机制并不十分清楚。发明内容本发明人利用 SSH (抑制差减杂交）与 RACE ( cDNA末端快速扩增）相结合的方法克隆了非洲棉 ossypi herbaceum L. ) 的一个锌指蛋白（本文命名为 AZF2-1 )的编码基因，并测定了其 DNA序列。并且发现将其导入受体植株并使其表达后，可显著改善受体植株的耐盐性，而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供棉花的一个锌指蛋白 AZF2-1的编码基因（本文命名为

GhAZF2-l) , 其序列为 SEQ ID NO: 2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含有本发明第一方面所述的基因，其是通过将所述基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述载体为图 2 所示的 35S-GhAZF2-l-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐盐性的方法，包括：将本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是拟南芥。本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明第七方面提供由本发明第一方面所述的基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如 SEQ ID NO : 1所示。附图说明图 1是 6¾^7¾- 基因的植物表达载体（35S-GhAZF2-l-2300)的构建流程（图 la- lb )。

图 2是 6¾^7¾- 基因的植物表达载体（35S-GhAZF2-l-2300)的质粒图。图 3是转 6¾^7¾4基因的 1\代转基因拟南芥植株（右图， LBS-IO ) 和作为对照的非转基因拟南芥植株（左图， CK) 的耐盐模拟实验结果。

图 4是利用反转录 PCR对 1\代转基因拟南芥植株和非转基因对照植株中

6¾^7¾4基因在转录水平上的分子检测的验证结果。图中所示上下两个部分条带分别属于 6¾^ ^-^^^ iacii 2 - ^ iacii ?-^作为内参。 1_4为不耐盐的非转基因对照拟南芥植株， 5-12为耐盐的 T1代转基因拟南芥植株（依次属于 Ί\Β8-8、 Τ!Β8-10 Ί\Β8-13和 Ί\Β8-18株系，每个株系检测 2株）， 13为 35S-GhAZF2-l_2300 质粒 PCR阳性对照， 14-17为转基因不耐盐拟南芥植株（分属 2个株系，各检测 2 株）， 18为无模板的空白对照。结果表明，不耐盐非转基因对照拟南芥植株中无 6¾^7¾ 的转录，耐盐转基因拟南芥 1\代植株中的转录水平较高，不耐盐转基因拟南芥植株的转录水平很低。具体实施方式以下结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。

以下实施例中提到的未注明来源的限制性内切酶均购自 New England Biolabs公司。

实施例 1、盐胁迫下棉花 SSH文库构建：

具体方法为：

利用 Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit所示的方法通过抑制差减杂交方法构建抑制差减文库。在实验过程中以盐处理的棉花幼苗的叶片的 mRNA 作为样本（tester ) , 以未处理的棉花幼苗的叶片的 mRNA 作为对照 ( driver )。具体步骤简述如下：

( 1 ) 供试材料：

非洲棉（国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号： ZM-06838) 播种到经过灭菌处理的蛭石基质上，在 25°C、光暗周期 16h/8h条件下培养，每周浇 1/2 MS液体培养基（含 9. 39 mM KN0₃， 0. 625 mM KH₂P0₄， 10. 3 mM N N0₃， 0. 75 mM MgS0₄， 1. 5 mM CaCl₂， 50 μ M KI， 100 μ Μ H₃B0₃， 100 μ Μ MnS0₄， 30 μ M ZnS0₄, 1 μ M N¾Mo0₄, 0. 1 μ Μ CoCl₂, 100 μ M N¾EDTA， 100 μ M FeS0₄) 一次。当苗株长高达 25-30 cm时用于实验。

( 2 ) 材料处理：

将供试幼苗分为 2组，每组 4株。第一组为对照组，在 25°C、光照下培养，放置到 1/2 MS液体培养基中。第二组为处理组， 25。C、光照下培养，放置到添加有终浓度为 200 mM NaCl的 1/2 MS液体培养基中，处理 6小时，处理完毕后及时剪取两组幼苗的叶片，用液氮迅速冷冻后，于 -70°C冰箱中保存。

( 3 ) 总 RNA提取：

分别取对照组和盐处理组的棉花叶片各 0. 5g，用植物 RNA 提取试剂盒 ( Invitrogen)提取棉花叶片的总 RNA。用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001 测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， 0D₂₆。/0D₂₈。比值为 1. 8-2· 0，表明总 RNA纯度较高，用 1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮度约为 18S条带的 2倍，表明 RNA的完整性良好。使用 Qiagen 公司的 Ol igotex mRNA 纯化试齐 [J盒（Purification of poly A+ RNA from total RNA)分离 mRNA。

( 4) 抑制差减杂交：

按 Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法进行抑制差减杂交。先将 Driver mRNA和 Tester mRNA分别反转录，得到双链 cDNA, 再以 2 μ g Tester cDNA和 2 μ g Driver cDNA 作为起始材料进行差减杂交。在 37°C水浴下分别将 Tester cDNA和 Driver cDNA用 Rsa I 酶切 1. 5 h，然后将酶切后的 Tester cDNA 分成两等份，连接上不同的接头，而 Driver cDNA 不连接头。两种连有不同接头的 Tester cDNA 分别与过量的 Driver cDNA混合，进行第一次正向差减杂交。将两种第一次差减杂交的产物混合，再与新变性的 Driver cDNA进行第二次正向差减杂交，然后通过两次抑制性 PCR扩增差异表达的片段，使其得到富集。

( 5 ) cDNA差减文库的构建与初步筛选、克隆、鉴定

依照 pGEM-T Easy试剂盒（购自 Promega) 的产品说明书所示方法，将上述合并的正向差减杂交 cDNA 片段的第二次 PCR 产物（使用 QIAquick PCR Purification Kit纯化，购自 Qiagen ) 与 pGEM_T Easy载体连接，具体步骤如下：用 200 μ ΐ PCR管依次加入下列成分：纯化的正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物 3 μ 1， 2 Χ Τ4连接酶缓冲液 5 μ 1， pGEM-T Easy载体 1 μ 1， T4 DNA连接酶 1 μ ΐ ，于 4°C连接过夜。取 10 连接反应产物，加入到 100 μ L大肠杆菌 JM109感受态细胞（购自 TAKARA)中，冰浴 30 min、热休克 60 s、冰浴 2 min, 然后加入 250 μ L LB培养液（含 1% Tryptone购自 0X0ID, 0. 5% Yeast Extract购自 0X0ID, 1% NaCl购自国药）置 37 °C水浴中，以 225 r/min振荡培养 30 min。取 200 μ L振荡培养后的菌液种植于含 50 μ g/mL氨苄青霉素（购自北京拜尔迪）、40 μ g/mL X-gal ( 5-溴 -4氯 -3-吲哚 - β _D_半乳糖苷）、 24 μ g/mL IPTG (异丙基 - β -D-硫代吡喃半乳糖苷）（X-gal和 IPTG均购自 TAKARA) 的 LB (同上）固体培养板上， 37 °C培育 18 h。计数培养板中直径 > 1 mm的清晰白色及蓝色菌落数，随机挑取 300个白色菌落 (编号： Gh-S2-001至 Gh-S2-300)。将所有白色菌落分别接种于含有 50 μ g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基的 96 孔细胞培养板 (CORNING)中， 37 °C培养过夜后加甘油至终浓度 20%，于 - 80 °C保存备用。以巢式 PCR 引物 Primer 1和 Primer 2R ( Clontech公司的 PCR- select™ cDNA Subtraction Kit试剂盒自带）进行菌液 PCR扩增验证，得到 231个阳性克隆，对所有阳性克隆在送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序

( 6 ) 差异克隆的 cDNA测序分析：

将上述 231个差异克隆的 DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA 后，共得到 203个有效 EST (Unigene)。实施例 2 非洲棉锌指蛋白基因 GhAZF2-l的克隆

将克隆子 Gh-S2-163的测序结果去掉冗余 DNA后，序列为 SEQ ID NO : 3，本文将 SEQ ID NO : 3对应的全长编码基因命名为 6¾^7¾ - 其对应的蛋白命名为 AZF2- 1。

SEQ ID NO: 3

1 CTCATCATGC TCGCTCGCGG CTCTTCCGGT GCTGATCGTG ATGTTATTCG TCGGTCTTCC

TCTTCGTCGT CACCGCCTCC GCCGCCGCCT GCTTTGAAGT TGTCTTACAA GTGTAGTGTT TGTGACAAGG CGTTCCCTTC TTATCAAGCT TTGGGCGGTC ATAAAGCCAG CCACCGCAAA 181 CCCCTTTCCG CCGACGCCGC TACCACCACC GCCGCCGTCA ACGTCGATAA CCCATCAACA

241 ACCAGCACCG CCACCACCAT CACCAGCAGC GGTAGGCTTC ACGAGTGTTC CATCTGCCAC

301 AAGAGTTTCC CTACGGGCCA AGCCTTGGGT GGTCATAAAC GCTGCCACTA CGAAGGTGGC

361 AACAACAACA ACAAAAATAA CAACAACAGC GGTAGCGTTA GCGTTAGCGG GGTTACGTCT

421 TCGGATGGGG GCGCGTTGAG CCACAACCAC CGTGCAGTCG ACTTTGACTT TGACCTCAAC

481 TTGCCAGCCT TGCCGGAGTT CAGTCAAATG T

GhAZF2-l全长编码基因的克隆

根据已经获得的 SEQ ID NO: 3序列，设计两条特异性引物，作为 3 ' RACE 的 5 ' 端特异性引物：

GhAZF2-l_l GSP1 : SEQ ID NO : 4：

GCGGTAGCGT TAGCGTTAG

GhAZF2-l_2 GSP2: SEQ ID NO : 5：

CCACAACCAC CGTGCAGTC

试剂自带通用引物：

AP : SEQ ID NO : 6：

GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT

AUAP : SEQ ID NO : 7：

GGCCACGCGTCGACTAGTAC

实验步骤按试剂盒说明书操作（3 ' RACE System for Rapid Ampl ification of cDNA Ends试剂盒购自 Invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO : 4与 3 ' 端引物 SEQ ID NO : 7 (试剂盒自带的 AUAP引物），以 SEQ ID NO : 6引物（试剂盒自带的 AP引物）和棉花 mRNA反转录得到的 cDNA 为模板进行第一轮 PCR扩增。具体步骤如下：

50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP， 2. 0 μ 1 mRNA反转录的 cDNA, 1. 0 μ 1 Ex Taq (购自 TAKARA)、 10 μ M的引物 SEQ ID NO : 4禾 P SEQ ID NO : 7各 2. 0 μ 1，以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C 预变性 5 min， 33个循环（ 94°C 变性 30 s， 53°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2 min)， 72 °C 延伸 10 min。所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2. 0 μ 1作为模板，用 SEQ ID NO: 5与 3' 端引物 SEQ ID NO: 7进行第二轮 PCR扩增，具体步骤如下：

50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP， 2. 0 μ 1稀释的第一轮 PCR产物， 1. 0 μ 1 Ex Taq、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO: 7各 2. 0 μ 1，以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环（94°C 变性 30 s， 56°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2min)， 72 °C 延伸 10 min。第二次 PCR产物回收片段 (Gel Extraction Kit购自 OMEGA) 连接于 pGEM-T Easy Vector, 转化到大肠杆菌 JM109 (具体方法同上），随机挑取 8个白色菌落于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存备用。 SEQ ID NO: 5与 3' 端引物 SEQ ID NO: 7进行菌液 PCR扩增，得到 6个阳性克隆，送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序测序，获得该基因的 cDNA的 3' 端。

所得的 3' RACE产物克隆子测序获得序列与 SEQ ID NO: 3进行拼接，获得 ID NO: 8：

CTCATCATGC TCGCTCGCGG CTCTTCCGGT GCTGATCGTG ATGTTATTCG TCGGTCTTCC

TCTTCGTCGT CACCGCCTCC GCCGCCGCCT GCTTTGAAGT TGTCTTACAA GTGTAGTGTT

TGTGACAAGG CGTTCCCTTC TTATCAAGCT TTGGGCGGTC ATAAAGCCAG CCACCGCAAA

CCCCTTTCCG CCGACGCCGC TACCACCACC GCCGCCGTCA ACGTCGATAA CCCATCAACA

ACCAGCACCG CCACCACCAT CACCAGCAGC GGTAGGCTTC ACGAGTGTTC CATCTGCCAC

AAGAGTTTCC CTACGGGCCA AGCCTTGGGT GGTCATAAAC GCTGCCACTA CGAAGGTGGC

AACAACAACA ACAAAAATAA CAACAACAGC GGTAGCGTTA GCGTTAGCGG GGTTACGTCT

TCGGATGGGG GCGCGTTGAG CCACAACCAC CGTGCAGTCG ACTTTGACTT TGACCTCAAC

TTGCCAGCCT TGCCGGAGTT CAGTCAAATG TACCCAGATG AAGAAGAGGT CCAAAGCCCA

TTGCCGACCA AGAAACCACG TTTCTTGATC GCCAAGAAAG AGAAACTGGA TTCTTCATTA

GCATAAGATT TAGAATTAAA TTGAAAAATT CAGATAACCT TGTTTTTAGT TTT

根据已经获得的 SEQ ID NO: 8序列，设计三条特异性引物，作为反转录引物及 5' RACE的 3' 端特异性引物。

GhAZF2-l_l GSP1 : SEQ ID NO: 9：

GATGGGTTAT CGACGTTGAC GhAZF2-l_2 GSP2: SEQ ID NO: 10：

CCAAAGCTTG ATAAGAAGGG AACG

GhAZF2- 1—3GSP: SEQ ID NO: 11：

CGAATAACAT CACGATCAGC AC

实验步骤按试剂盒说明书操作（5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 Invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO: 10与通用引物 AAP (试剂盒自带），以棉花 mRNA反转录所得的 cDNA (反转录引物 SEQ IDN0:9)为模板进行第一轮 PCR扩增，具体步骤如下：

50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟΧΕχ Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1 mRNA反转录的 cDNA, 1.0 μ 1 Ex Taq (购自 TAKARA)、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 10和 AAP各 2.0 μ 1，以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环（94°C 变性 30 s， 55°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2min)， 72 °C 延伸 10 min。

将所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μ 1作为模板，用 SEQ ID NO: 11与通用引物 AUAP (试剂盒自带）进行第二轮 PCR扩增，具体步骤如下：

50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟΧΕχ Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1稀释的第一轮 PCR产物， 1.0 μ 1 Ex Taq, 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 11和 AUAP各 2.0 μ 1，以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环（94°C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72V 延伸 2 min), 72 °C 延伸 10 min。回收第二轮 PCR产物（使用 Gel Extraction Kit, 购自 OMEGA), 并将其连接到 pGEM-T Easy载体，转化到 JM109感受态细胞中（具体方法同上），并将转化后的菌液涂布于含 50 μ g/mL氨苄青霉素、 40 μ g/mL X_gal、 24 μ g/mL IPTG 的 LB固体培养基上进行筛选。随机挑取 10个白色菌落分别接种于含有 50 μ g/mL 氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存备用。使用 SEQ ID NO: 11与通用引物 AUAP进行菌液 PCR扩增验证（反应体系及反应条件同上），得到 3个阳性克隆，送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，获得该基因的 cDNA的 5' 端。

将所得的 5' RACE产物克隆测序后所得序列与 SEQ ID N0: 8拼接，获得 SEQ ID NO: 12：

1 GGAAGCAGTC ATATGAAGGC ATAGTCTCCA CCTCATGAGA GCATCCCCCC ACACTATTTC 61 ACCCAATACA CCCTCCTCCC CTTTTCTTCG TAGTTGACCC ACTTCACTTC CTTCTTAGCT

121 ACCACCTTCA CTTCCCTATA TATATATTAC CCTTTTCACT CAGTCTCTCA CACCACGCCC

181 CACCTCACAG ATTAAACCCC TCCAAAAAAG CTTACTTTTA GCACTCTGTT TTTGCTCTCA

241 AACTCGAAGG GATTCGGAAG TATTAGATAT GGCGCTTGAA GCTCTGAACT CGCCGGCGAC

301 GCCTTTCACC AACAAATACG ATGACGTGGA CAACAATTAC GTCGAGACAT GGAAGAAAGG

361 CAAGCGTTCG AAGCGCCAAC GCGGCGACTC TCCTGCTGCT GTTGAACTTC AACCCACCAC

421 CGAAGAAGAG TACCTCGCTC TTTGTCTCAT CATGCTCGCT CGCGGCTCTT CCGGTGCTGA

481 TCGTGATGTT ATTCGTCGGT CTTCCTCTTC GTCGTCACCG CCTCCGCCGC CGCCTGCTTT

541 GAAGTTGTCT TACAAGTGTA GTGTTTGTGA CAAGGCGTTC CCTTCTTATC AAGCTTTGGG

601 CGGTCATAAA GCCAGCCACC GCAAACCCCT TTCCGCCGAC GCCGCTACCA CCACCGCCGC

661 CGTCAACGTC GATAACCCAT CAACAACCAG CACCGCCACC AC CAT C AC C A GCAGCGGTAG

721 GCTTCACGAG TGTTCCATCT GCCACAAGAG TTTCCCTACG GGCCAAGCCT TGGGTGGTCA

781 TAAACGCTGC CACTACGAAG GTGGCAACAA CAACAACAAA AATAACAACA ACAGCGGTAG

841 CGTTAGCGTT AGCGGGGTTA CGTCTTCGGA TGGGGGCGCG TTGAGCCACA ACCACCGTGC

901 AGTCGACTTT GACTTTGACC TCAACTTGCC AGCCTTGCCG GAGTTCAGTC AAATGTACCC

961 AGATGAAGAA GAGGTCCAAA GCCCATTGCC GACCAAGAAA CCACGTTTCT TGATCGCCAA

1021 GAAAGAGAAA CTGGATTCTT CATTAGCATA AGATTTAGAA TTAAATTGAA AAATTCAGAT

1081 AACCTTGTTT TTAGTTTT

根据 SEQ ID NO : 12序列设计一对引物如下：

GhAZF2-l F: SEQ ID NO : 13：

ATGGCGCTTG AAGCTCTG

GhAZF2-l R: SEQ ID NO : 14：

TTATGCTAAT GAAGAATCCA GTTTCTC

通过 SEQ ID N0 : 13和 SEQ ID NO : 14来克隆 6¾^7¾_ 全长编码序列。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以棉花的 cDNA为模板进行 PCR 反应。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 2. 0 μ 1 cDNA， 1. 0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO : 13和 SEQ ID NO : 14各 2. 0 μ 1，以及 30 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C 预变性 5 111 ，33个循环（ 94。C 变性 30 s，58。C退火 30 s，72。C 延伸 lmin40s)， 72 °C 延伸 10 min。

PCR扩增产物加 A尾： PCR产物加 2. 5倍体积的无水乙醇， _20°C放置 10分钟，离心，去上清，晾干，用 21 μ 1双蒸水溶解。加入 2. 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer, 0. 5 μ 1 5 mM的 dATP ， 2. 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Taq。反应条件： 70°C反应 30分钟。将得到约 900 bp的 DNA片段回收（使用 Omega回收试剂盒），并将其连接至 pGEM T-easy载体上（得到 6¾^7¾ _pGEM) ，然后将所得质粒转化到 JM109大肠杆菌感受态细胞 (方法同上），并将转化后的菌液涂布于含 50 g/mL氨苄青霉素、 40 μ g/mL X-gal、 24 μ g/mL IPTG的 LB固体培养基上进行筛选。随机挑取 10个白色菌落分别接种于含有 50 μ g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存备用。 SEQ ID NO: 13与 SEQ ID NO: 14 进行菌液 PCR扩增验证（反应体系及反应条件同上），得到 4个阳性克隆，送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，序列为 SEQ ID NO: 2，其编码的 AZF2-1 蛋白氨基酸序列如 SEQ ID N0: 1所示。

AZF2-1蛋白的氨基酸序列: SEQ ID NO: 1

1 MALEALNSPA TPFTNKYDDV

21 DNNYVETWKK GKRSKRQRGD

41 SPAAVELQPT TEEEYLALCL

61 IMLARGSSGA DRDVIRRSSS

81 SSSPPPPPPA LKLSYKCSVC

101 DKAFPSYQAL GGHKASHRKP

121 LSADAATTTA AVNVDNPSTT

141 STATTITSSG RLHECS ICHK

161 SFPTGQALGG HKRCHYEGGN

181 NNNKNNNNSG SVSVSGVTSS

201 DGGALSHNHR AVDFDFDLNL

221 PALPEFSQMY PDEEEVQSPL

241 PTKKPRFLIA KKEKLDSSLA

261 * GhAZF2-l编码基因的核苷酸序列： SEQ ID NO: 2

1 ATGGCGCTTG AAGCTCTGAA CTCGCCGGCG ACGCCTTTCA CCAACAAATA CGATGACGTG

61 GACAACAATT ACGTCGAGAC ATGGAAGAAA GGCAAGCGTT CGAAGCGCCA ACGCGGCGAC

121 TCTCCTGCTG CTGTTGAACT TCAACCCACC ACCGAAGAAG AGTACCTCGC TCTTTGTCTC

181 ATCATGCTCG CTCGCGGCTC TTCCGGTGCT GATCGTGATG TTATTCGTCG GTCTTCCTCT

241 TCGTCGTCAC CGCCTCCGCC GCCGCCTGCT TTGAAGTTGT CTTACAAGTG TAGTGTTTGT

301 GACAAGGCGT TCCCTTCTTA TCAAGCTTTG GGCGGTCATA AAGCCAGCCA CCGCAAACCC

361 CTTTCCGCCG ACGCCGCTAC CACCACCGCC GCCGTCAACG TCGATAACCC ATCAACAACC

421 AGCACCGCCA CCACCATCAC CAGCAGCGGT AGGCTTCACG AGTGTTCCAT CTGCCACAAG

481 AGTTTCCCTA CGGGCCAAGC CTTGGGTGGT CATAAACGCT GCCACTACGA AGGTGGCAAC

541 AACAACAACA AAAATAACAA CAACAGCGGT AGCGTTAGCG TTAGCGGGGT TACGTCTTCG

601 GATGGGGGCG CGTTGAGCCA CAACCACCGT GCAGTCGACT TTGACTTTGA CCTCAACTTG

661 CCAGCCTTGC CGGAGTTCAG TCAAATGTAC CCAGATGAAG AAGAGGTCCA AAGCCCATTG

721 CCGACCAAGA AACCACGTTT CTTGATCGCC AAGAAAGAGA AACTGGATTC TTCATTAGCA 781 TAA 实施例 3 6¾^7¾^基因植物表达载体构建

选择植物双元表达载体 PCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）作为植物表达载体，用 Pnos启动子替换基因含双增强子的 35S启动子，以降低 ΝΡΤΠ蛋白在植物中的表达。选择含双增强子的组成型启动子 35S 及终止子 Tnos分别作为 6¾^7¾4基因的启动子和终止子，构建流程如图 1所示。

使用引物 SEQ ID NO : 9和 SEQ ID NO : 10以植物表达载体 pBI 121 (购自北京华夏远洋科技有限公司）为模板扩增 Pnos，采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ ΐ 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP， 1. 0 μ 1 pBI 121 , 1· 0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ M的引物 SEQ ID NO : 15 和 SEQ ID NO : 16各 2. 0 μ 1，以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环（94°C 变性 30 s， 56 °C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s)， 72 °C 延伸 10 min。通过 f coR I、 Bgl I I酶切后将所得 PCR产物连接到 pCAMBIA2300 (购自 promega, T4 连接酶盒）获得 pCAMBIA2300_l。

SEQ ID NO: 15 ：

GCACGAATTCATACAAATGGACGAACGGAT

SEQ ID NO: 16：

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG

使用引物 SEQ ID NO: 17和 SEQ ID NO: 18以 pBI121质粒为模板扩增 Tnos，采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5XPS Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 1.0 μ 1 ρΒΙ121, 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 17禾 P SEQ ID NO: 18各 2.0 μ 1，以及 31 μ 1 的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 33个循环（ 94°C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s)， 72 °C 延伸 10 min。通过 Sac I、 EcoR I酶切后将所得 PCR产物连接到 pCAMBIA2300-l获得 pCAMBIA2300_2。

SEQ ID NO: 17：

AAGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA SEQ ID NO: 18：

TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA

使用引物 SEQ ID NO: 19和 SEQ ID NO: 20以 pCAMBIA2300质粒为模板扩增 CaMV 35S启动子。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ ΐ 5XPS Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP， 1.0 μ 1 pCAMBIA2300质粒 DNA， 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 19和 SEQ ID NO: 20各 2.0 μ 1，以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 33个循环（ 94°C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s)， 72 °C 延伸 10 min。通过^ z' 2d III、 Pst I酶切将所得 PCR产物连接（连接方法同上）到 pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300_3。

SEQ ID NO: 19：

ACTAAGCTTATGGTGGAGCACGACACTCTC

SEQ ID NO: 20：

TGACTGCAGAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACTGGTG

使用引物 SEQ ID NO: 21和 SEQ ID NO: 22扩增 GhAZF2—l (模板是实施例 2 所获得阳性质粒），采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ ΐ 5XPS Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP， 1.0 μ 1 GAAZF2-l-pGEM, 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 21和 SEQ ID NO: 22各 2.0 μ 1，以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C 预变性 5 min， 33个循环（ 94°C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2min)， 72 °C 延伸 10 min。通过/ ¾ί I、 Sac I酶切将所得 PCR产物连接（连接方法同上）到 pCAMBIA2300-3，并经验证获得植物表达载体 35S-GhAZF2-l_2300 (图 2)。

SEQ ID NO: 21：

TGACTGCAGATGGCGCTTGAAGCTCTG

SEQ ID NO: 22：

AAGGAGCTCTTATGCTAATGAAGAATCCAGTTTCTC 实施例 4 35S-GhAZF2-l-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab, Inc) 感受态细胞的制备：将农杆菌 LBA4404在含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB固体培养基上划单斑接种， 28°C培养 1至 2天。挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB液体培养基中， 28°C下摇动培养过夜（约 12-16 h) 至 0D600值为 0.4，形成种子菌液。取 5 ml活化后的菌液（1:20的比例）接种于 100 ml含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB液体培养基中， 28°C摇动培养 2-2.5 h至 0D₆。。=0.8。冰浴菌液 10 min, 每隔 3 min摇匀一次，令细菌均匀进入休眠状态。于 4°C下 4000 g离心 10 min, 弃上清液；加入一定量预冷的 10%甘油重悬浮菌体， 4°C下 4000 g离心 10 min, 收集沉淀；用冰预冷的 10% 甘油重复洗 3-4 次；加入适量冰预冷的 10%甘油重新悬浮细菌沉淀，即制得 LBA4404感受态细胞。然后以 40 μ 1/管将其分装，于 _70°C保存备用。

转化农杆菌：在冰上融化感受态细胞，往 40 μ 1的感受态细胞中加入 1 μ 1 实施例 3中所得的阳性 35S-GhAZF2-l-2300质粒，混匀后冰浴约 10 min。将冰浴后的所述感受态细胞和 35S-GhAZF2-l-2300 质粒的混合物用微量移液器转移到冰预冷的 0. 1 cm规格的电击杯（购自 bio-rad) 中，轻敲使悬浮液到达底部，注意不要有气泡。将所述电击杯放到电击室的滑道上，推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。将 MicroPulser (购自 bio-rad) 的程序设置为 "Agr" ，电击一次。立即取出电击杯，加入 1 ml 28 °C预热的 LB液体培养基。快速而轻柔的用微量移液器将细胞打匀。将悬浮液转入 1. 5 ml的离心管， 28°C、 225 rpm培养 1 h。取 100〜200 μ 1的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上（LB固体培养基，含 50 y g/ml利福平、 50 μ g/ml链霉素、 50 μ g/ml卡那霉素）， 28 °C 培养。筛选阳性转化克隆，并将其菌液于 -70°C保存备用。实施例 5 用于转化的拟南芥种植

选择吸水性好，土质松软的蛭石配合营养土（1 : 1 ) 作为拟南芥种植土壤。直径 9 cm的花盆，每盆播种 20-30颗拟南芥种子（哥伦比亚型，来自美国俄亥俄州立大学的拟南芥生物资源中心）。播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。恒温 22°C、光照强度 3500-4000 lx、光照周期为 12 h 黑暗 /12 h光照培养，每 7天浇灌一次 1/2 MS液体培养基。培养 30天后，每盆保留 4-5棵植株，光照周期调整为 8 h黑暗 /16 h光照培养。待大部分植株都抽苔之后，在花序基部剪掉整个主苔，去其顶端优势，约 1 周后在腋芽部位长出 4-6个新生侧苔，待侧苔花序形成花蕾并部分开花或形成 1-2个角果时，便可用于转化。实施例 6 拟南芥花浸转化

将实施例 4所得的含 35S-GhAZF2-l-2300质粒的农杆菌 LBA4404转化阳性克隆的菌液接种至含有 50 μ g/ml卡那霉素的 LB液体培养基中培养过夜，第二天早上以 1 : 50接种至含有 50 μ g/ml卡那霉素的新的 LB培养基（1L) 中，培养约 8 个小时，至农杆菌液 0D₆。。在 1. 0到 1. 2之间。 5000 rpm室温离心 5分钟，弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的浸染培养基里（1/2 MS; 含 5%蔗糖；用 K0H 调至 pH5. 7; 并含有 200 μ 1/L的 Si lwet L_77)，使 0D₆。。在 0. 8左右。将拟南芥的上部缓缓、螺旋式浸入所述含农杆菌的浸染培养基内，轻轻顺时针晃动，约 2 分钟，用透明塑料罩盖严以保持湿度，放入温室过夜。 24 小时后移去塑料透明罩，将水浇透。浸泡后 2-3周，保证植株水分充足。当植株停止开花，第一个果荚成熟变黄时，用纸袋套住，当纸袋内的所有果荚变黄后，停止浇水， 1-2周干燥后收取种子，进行转化子筛选。实施例 7 拟南芥转基因阳性转化子的筛选

种子消毒：先用 70%乙醇浸泡 10分钟，并不时地使种子悬浮；然后用无菌水洗四次，并不时地使种子悬浮。然后，将处理后的种子均匀涂布在含 50 μ g/ml 卡那霉素的 1/2 MS固体筛选培养基表面上（一块 150mm直径的平皿最多播种 1500 棵）， 4°C春化 2天。然后，恒温 22 °C、光照强度 3500-4000 lx、光照周期为 8 h 黑暗 /16 h光照条件下，培养 7-10天。能够正常萌发并生长的种子即为转基因种子。所述转基因种子在含 50 μ g/ml卡那霉素的 1/2 MS固体平板上萌发 2周以后，将能够生长的阳性植株转入土壤继续培养，并每株剪取 1-2个叶片，提取 DNA作为模板，用引物 SEQ ID NO : 7和 SEQ ID NO : 8进行 PCR检测。去除 PCR 检测阴性植株，收集阳性植株的种子，分别标号为 T。B8-1至 T。B8-20并保存。实施例 8 过表达 GhAZF2-l转基因拟南芥 1\代植株的种植

选择吸水性好，土质松软的蛭石配合营养土（1 : 1 ) 作为拟南芥种植土壤。将 T。B8-1至 T。B8-20每个转化株系播种 2盆，非转基因对照拟南芥播种 2盆，每盆播种 20-30颗种子。播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。恒温 22 °C、光照强度 3500-4000 lx、光照周期为 12 h黑暗 /12 h光照培养，每 7天浇灌一次 1/2 MS液体培养基。培养 25天后，剪取转基因拟南芥株系的叶片并提取基因组 DNA，然后用引物 SEQ ID NO : 7和 SEQ ID NO : 8 进行 PCR检测。去除 PCR阴性植株，保留 7-8阳性棵苗，继续培养 10天后，每盆保留大小较一致的 4-5棵转基因拟南芥或非转基因对照拟南芥苗进行耐盐实验。实施例 9 过表达 GhAZF2-l转基因拟南芥 1\代植株的耐盐实验

取实施例 8中转基因拟南芥、对照拟南芥各一盆不作处理，正常浇灌 1/2 MS 液体培养基；另外将转基因拟南芥、对照拟南芥各一盆浇灌含有 150 mM NaCl的 1/2 MS液体培养基，恒温 22 °C、光照强度 3500-4000 lx、 12小时光培养 /12小时暗培养循环， 10天后观察实验结果。 1\代转基因植株（T。代转基因植株的种子长成的植株）的耐盐性鉴定表明， Ί\Β8— 3、 Ί\Β8— 8、 Ί\Β8— 10、 Ί\Β8-13与 Ί\Β8-18 五个株系表现出显著的耐盐性（见图 3，以 LBS-IO为例，余者结果与之类似，在此未图示）。实施例 10 在转录水平上验证 AZF2-1蛋白表达

将实施例 9中耐盐性状良好的转基因 1\代植株中随机选取 8棵（依次属于上述 Ί\Β8-8、 Ί\Β8- 10、 Ί\Β8- 13和 Ί\Β8- 18四个耐盐株系，每个株系 2株），实施例 6中对照植株随机选取 4棵，各剪取 150 mM NaCl处理 14天的叶片 0.05 g，用植物 RNA提取试剂盒（Invitrogen) 提取总 RNA。紫外分光光度测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值，计算各个 RNA浓度。依照 Invitrogen 反转录试齐 Ll盒 Superscript III Reverse Transcriptase所示方法进行反转录 (1 总 RNA作为模板，反转录引物为 SEQ ID NO: 14) 。

通过 SEQ ID NO: 23禾口 SEQ ID NO: 24弓 |物扩增 Atactin-2

(http://www. uniprot. org/uniprot/Q96292) ，检测看家基因 Actin-2蛋白的相对表达情况，作为内参。采用 TaKaRa的 PrimeSTARHSDNA聚合酶，以反转录的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 15 X PS Buf f er， 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1 cDNA, 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ M的引物 SEQ ID NO :23和 SEQ ID NO: 24各 2.0 μ 1，以及 30 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 32个循环（94°C 变性 30 s， 58 °C 退火 30 s， 72 °C 延伸 lmin) ， 72 °C 延伸 10 min。

SEQ ID NO: 23：

GCTGATGATATTCAACCAATCGTG SEQ ID NO: 24：

CTCTGCTGTTGTGGTGAACATG

通过 SEQ ID NO: 13禾 P SEQ ID NO: 14引物扩增 GhAZF2-l, 检测 AZF2-1 蛋白相对表达情况。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以反转录的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 15 X PS Buffer, 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1 cDNA, 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ M 的引物 SEQ ID NO: 13和 SEQ ID NO: 14各 2.0 μ 1，以及 30 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5min， 32个循环（94°C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 lmin ) ， 72 °C 延伸 10 min。

产物电泳结果如图 4 所示。图中所示上下两个部分条带分别属于 GhAZF2-l与 A tac tin-2, 以 ^ iac ii ?-^作为内参。 1_4为不耐盐的非转基因对照拟南芥植株， 5-12 为耐盐的 T1 代转基因拟南芥植株（依次属于 Ί\Β8-8、 Τ^δ-ΙΟ、 Ί\Β8-13 和 Ί\Β8-18 株系，每个株系检测 2 株）， 13 为 35S-GhAZF2-l-2300质粒 PCR阳性对照， 14-17为转基因不耐盐拟南芥植株（分属 2个株系，各检测 2株）， 18为无模板的空白对照。结果表明，不耐盐非转基因对照拟南芥植株中无 GhAZF2-l 的转录，耐盐转基因拟南芥 1\代植株中 GhAZF2-l的转录水平较高，不耐盐转基因拟南芥植株 GhAZF-1的转录水平很低。

Claims

权利要求书

1. 棉花的一个锌指蛋白，其序列为 SEQ ID NO: 1。

2. 编码权利要求 1的锌指蛋白的基因，其序列为 SEQ ID NO: 2。

3. 一种重组表达载体，其是通过将权利要求 2所述的基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述表达载体是 pCAMBIA2300。

4. 权利要求 3所述的载体，其为图 2所示的 35S-GhAZF2-l-2300载体。

5. —种重组细胞，其含有权利要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

6. 一种改善植物耐盐性的方法，包括：将权利要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达;优选地，所述植物是拟南芥。

7. 一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有权利要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组表达载体的植物或植物组织。

8. 权利要求 7所述的方法，其中所述植物是拟南芥。

9. 权利要求 2所述的基因、权利要求 3或 4所述的重组表达载体或者权利要求 5所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育种的用途。

10. 权利要求 9所述的用途，其中所述植物是拟南芥。