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WO2015088310A1 - Desinfectantes para manzana (malus domestica) a base de plantas - Google Patents

Desinfectantes para manzana (malus domestica) a base de plantas Download PDF

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WO2015088310A1
WO2015088310A1 PCT/MX2014/000199 MX2014000199W WO2015088310A1 WO 2015088310 A1 WO2015088310 A1 WO 2015088310A1 MX 2014000199 W MX2014000199 W MX 2014000199W WO 2015088310 A1 WO2015088310 A1 WO 2015088310A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
extract
solution
fractions
plant
antimicrobial activity
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/MX2014/000199
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Javier CASTRO ROSAS
Carlos Alberto GÓMEZ ALDAPA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE HIDALGO
Original Assignee
UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE HIDALGO
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE HIDALGO filed Critical UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE HIDALGO
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A23V2250/20—Natural extracts
    • A23V2250/21—Plant extracts

Definitions

  • the present invention relates to the development of formulations containing compounds with antimicrobial activity present in plants and which are used as disinfectants and preservatives for food, for example of plant and animal origin; more particularly to aqueous formulations based on extracts of Jamaican chalices ⁇ Hibiscus sabdariffa), the method by which it is obtained and its uses as an effective formulation to eliminate pathogenic bacteria from plant-based foods, such as fruits and vegetables, but with the most High effectiveness for Apple (Malus domestica).
  • Apple ⁇ Malus domestica is an agricultural product widely consumed throughout the world. In Mexico it is one of the main agricultural products, with a little more than 60 thousand hectares dedicated to its sowing. The most important types of Apple that are sown in Mexico, both in the open field and in protected agriculture, are: Golden Delicious (the one that is most produced), Red Delicious, Creole, Red Chief, Rome Beauty, Starking, Starking Delicious and Top Red (Sagarpa, 2013).
  • apples are not consumed directly as they are harvested. After harvesting either in the field or in the industry (and even at home) they receive various treatments that tend to favor their conservation and / or safety.
  • the application of washing and disinfection of apples improves its microbial image.
  • the prevention of apple contamination is also a control strategy because the growth of pathogens is not required to cause disease. Therefore, additional control measures may be of value.
  • the behavior of pathogenic microorganisms in apples is affected by the location of the pathogen in the product, product quality, storage temperature, type of packaging, and relative humidity.
  • the surface of apples usually has little nutrients which limits the growth of pathogens during storage at room temperature or refrigeration.
  • pathogenic microorganisms such as Salmonella or E. coli 0157: 1-17 are able to survive for a long time on the surface of apples both in refrigeration and at room temperature (Fisher et al. 1998). Also once on the apple, pathogens such as Salmonella could produce extracellular polymers on the apple which leads to the formation of a biofilm that can protect them against disinfectants (Kroupitski et al., 2009); This behavior of pathogenic microorganisms has been observed in different vegetables such as tomatoes (Iturriaga et al., 2007).
  • pathogenic microorganisms such as Salmonella or E. coli 0157: H7, for example, are capable of multiplying in chopped apple or sliced oe apple juice significantly increasing its concentration and making food much more dangerous (Changa and Fang, 2007).
  • the disinfection process refers to the physical destruction of microorganisms whose activity compromises the safety or sensory characteristics of a food.
  • the effect can be achieved through physical or chemical means, its effectiveness depending on the microorganisms (type and number), the substrate on which they are (presence of organic matter), the structure of the material (which allows direct access from germicide to microorganisms) and germicide (concentration, temperature and contact time) (Fernández, 2000).
  • the germicidal substance participates in chemical reactions, so that the greater the number of microorganisms, the greater the demand of the agent to achieve a total inactivation of the population.
  • Chlorine-based solutions are a cheap and available disinfectant as hypochlorite or in its slow-release forms (chloramines, for example) (Lelieveld et al., 2013). Hypochlorites have a broad spectrum of antibacterial activity, although they are less effective against spores than against non-forming bacteria. spores and have low effect against mycobactenas (Russell et al., 2004). Chlorine solutions, such as sodium hypochlorite or chlorine dioxide, are widely used by the food industry as a disinfectant. Both are strong oxidants that act at the level of membranes and other cellular constituents (Harmon et al., 1987). However, the former has the disadvantage of reacting easily with organic matter, so it is inactivated faster.
  • the interference is minimal (Castro-Rosas and Escartin, 1999).
  • the main disadvantage of sodium hypochlorite is that humidity, heat, light and especially the presence of organic matter increase the loss rate of free chlorine.
  • the germicidal activity of chlorine has generally been attributed to hypochlorous acid (HOCI), which is generated in aqueous solutions of sodium hypochlorite and other chlorine-containing compounds.
  • Disinfectants can be incorporated into the wash water and thus contribute to the reduction of the microbial load.
  • the effectiveness of hypochlorite is not only affected by the exposure time and concentration of free chlorine, but also by other factors such as temperature, pH, type of strain, as well as presence and type of organic matter ( ⁇ lvarez, 1998).
  • some authors point out that the efficiency of hypochlorite in reducing pathogenic microorganisms present in vegetables is limited (Adams et al., 1997).
  • Organic acids have traditionally been used as food preservatives or in solutions to disinfect raw vegetables. Its antimicrobial effect is exerted through the undissociated form causing a decrease in pH.
  • Acetic acid is a harmless substance; There are no official limits for daily intake in man. When acetic acid is incorporated into a food, two effects are expressed, one acidifying and the other preservative. At 1-2% concentration It inhibits almost all of the total flora within reasonably high initial load limits. At 0.1% it acts on the majority of pathogens and sporulates; 0.5% has an effect on toxigenic fungi. The efficacy of acetic acid against some specific pathogens has been evaluated using some foods as a medium. Published reports are often difficult to compare because acid concentrations have been variables expressed as percentage, molarity or final pH of the acidified test medium.
  • the antimicrobial activity depends on the exposure time, temperature, type of acid, acid concentration, dissociation level and pH (Harmon et al., 1987). However, the general results show that the effectiveness of acetic acid increases as the concentration increases, the pH decreases, the temperature increases and the microbial load decreases (Harmon et ai., 1987). Among bacteria, Gram positive are usually more resistant than Gram negative bacteria (Rameshkumar et al., 2007). Bacterial spores and viruses are more resistant than vegetative cells. However, organic acids have also shown little effectiveness in disinfecting raw vegetables (Fernández, 2000).
  • vapor phase antimicrobial agents can be effective against bacteria adhering to locations of raw agricultural products not reached by active agents in aqueous solution, their use in packaged products (in plastic bags) or during product processing (in the company) could provide an extra benefit in pathogen control.
  • this type of steam treatment would not be an optional or practical treatment for primary apple growers in the field since they are usually Producers sell their product packed in cardboard boxes or wood among other things for ease and to avoid accumulation and humidity what would happen if plastic bags were used. In addition, this would not be a practical treatment to apply in restaurants or homes.
  • Essential oils from plants are capable of inactivating the pathogens of interest in fresh products. Of 96 different types of essential oils examined, only 3 were effective against £. co // ' 0157: H7 and enteric Salmonella which were oregano, thyme, and cinnamon. In another study, 16 individual compounds of the most effective oils against E. coli 0157: H7 and Salmonella were tested and the most effective compounds were found to be thymol, cinnamaldehyde, and carvacrol (Friedman et al., 2002). This information was obtained using the oil in the liquid phase. There is limited information available on the effectiveness of essential oils in the form of steam.
  • Mu ⁇ oz (2003) evaluated the effect of two concentrations of carvacrol and the commercial disinfectant Boradantix ⁇ (EVESA, Extracts Vegetables SA) on the survival of L. monocytogenes, P. f ⁇ uorescens, E. coli, Erwinia caratovora and S. typhimurium in Apple and carrot juice. All study microorganisms were inhibited at both concentrations of carvacrol. The bacteria studied showed greater sensitivity towards carvacrol than Boradantix ⁇ . Lin et al., (2000) evaluated the effect of allyl and methyl isocyanate (AITC / MITC) (key components of green mustard) on L. monocytogenes, E.
  • AITC / MITC allyl and methyl isocyanate
  • AITC was more effective against Salmonella and £. coli, achieving 8 Log reduction with a generated steam treatment of 400 ⁇ of AITC after 4 and 2 days, respectively on apple. 8 Logs of reduction of S. Montevideo on tomato cuticle with 500 ⁇ of AITC were also reached.
  • Jamaica is one of the plants in which the presence of antimicrobial compounds in dehydrated chalices has recently been reported (Aziz et al., 1998; Fernández et al., 1996; Kang et al., 2007).
  • a range of phytochemical compounds that could be responsible for the observed antimicrobial effect such as polyphenols (Tajkarimi et al., 2010), including some phenolic acids (Tajkarimi ef al. ., 2010), as well as flavonoids, catechins and epicatechin (Friedman et al. 2002).
  • patent application JP2002128602 describes its use in an agrochemical composition to protect plants in fields of crops
  • application US20100323046 describes the use of a crude extract of the calyces of Jamaica to produce a drug to treat urinary infections caused by Escherichia coli and Candida albicans.
  • Patent application KR20080092186 describes an extract from Jamaica that is used to improve the quality of beef, pork and chicken and to increase its storage stability.
  • the extract is prepared by extraction with ethanol and subjected to a cold drying process.
  • the concentration of the extract in the composition is 500 mg / ml and the meat is treated with a preparation of 0.5 to 3.0% (by weight).
  • the application US20120015062 describes compositions comprising extract of the Agapanthus afr ⁇ canus plant and compositions comprising this extract plus other extracts of other different plants, such as for example plants of the Rosa or alfalfa family for use as agents in the Biological protection of other plants including their seeds.
  • Figure 2 The nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum of PROT ⁇ N ( 1 H) of the fraction collection called III is shown, which was obtained from an acetonic extract of the chalices of Jamaica and which was the collection that was used in the present invention.
  • the present invention relates to compositions containing phytochemicals present in plant extracts that are used as disinfectants of plant and animal foods, for example directed to the disinfection and preservation of fruits and vegetables, particularly the disinfection and / or preservation of apple (Malus domestica).
  • One embodiment of the present invention relates to obtaining a vegetable preparation comprising a methanolic extract of the chalices of the flower of Jamaica (Hibiscus sabdariffa) or specific chromatographic fractions obtained from the acetonic extract of the calyces of Jamaica, which are useful to eliminate pathogens present in food (disinfectant effect) and to delay the deterioration of food or preserve its safety (conservative effect).
  • Another embodiment of the present invention relates to obtaining plant-derived extracts that are used as disinfectants against pathogenic microorganisms present in food and to delay the deterioration of food and / or preserve its safety, that is, as food preservatives , those that constitute an alternative to the use of traditional disinfectants that can become toxic to humans, animals or the environment.
  • Another embodiment of the present invention relates to the preparation of compositions containing the extract of Jamaican calyces (Hibiscus sabdariffa L.) that have a food disinfectant and preservative function together with other compounds that have disinfectant properties, for example acetic acid, hypochlorite, etc.
  • Another embodiment of the present invention relates to obtaining extracts obtained from Jamaican chalices that have a disinfectant or preservative effect when applied to food.
  • One aspect of this modality refers to the application of extracts obtained from chalices of the Jamaican plant (Hibiscus sabdariffa L.) that have a disinfectant or preservative effect when applied to foods of plant origin, preferably apple.
  • Another embodiment of the present invention is the development of a method for obtaining acetonic extract from Jamaican calyces, an extract that proves to be useful as a food disinfectant and preservative.
  • Another embodiment of the present invention relates to the method for obtaining specific chromatographic fractions with antimicrobial effect obtained from the acetonic extract of the chalices of Jamaica, which are useful for eliminating pathogens present in food (disinfectant effect) and for delaying deterioration. of food or preserve its safety (conservative effect).
  • Another embodiment of the present invention is a method of treatment and / or preservation of foods of animal and / or vegetable origin by applying compositions containing extracts of Jamaican chalices that allow disinfection and preservation thereof.
  • Jamaican calyx extracts as a disinfectant and / or food preservative is another modality described in the present invention.
  • Compounds from the calyces of Jamaica can be useful in the development of an efficient disinfectant to eliminate the pathogenic bacteria present in raw vegetables, such as apples.
  • It describes an extract of Jamaican chalices and a specific fraction obtained by column chromatography from an acetonic extract of Jamaican chalices, which includes phytochemicals, which can be used as a disinfectant and / or food preservative due to its efficiency in the elimination of pathogenic bacteria from raw vegetables such as apples.
  • compositions of the present invention are capable of eliminating the pathogenic bacteria present in raw vegetables, such as apples per se, without altering their nutritional properties as well as quality characteristics. of the product. Consequently, the application of the compositions of the present invention in raw vegetables allows their preservation, as well as their effective disinfection, which makes them safe food for consumption.
  • compositions of the present invention comprise plant extracts with known antimicrobial activity, such as Jamaican acetonic extracts and specific chromatographic fractions obtained from the acetonic extract of Jamaican calyces, either alone or in combination with other components with proven disinfectant activity, such as for example organic acids that include acetic acid and chlorine compounds that include sodium hypochlorite.
  • compositions of the invention that include a mixture of acetonic extracts of plants with antimicrobial activity as well as acetic acid and sodium hypochlorite and polysorbate, and a mixture of specific chromatographic fractions obtained from the acetonic extract of the chalices of Jamaica as well as acetic acid and sodium hypochlorite and polysorbate, are usually very effective in eliminating the microorganisms resident in the plant, achieving at the same time that their organoleptic and / or nutritional properties are not affected and without altering, for example the commercial quality of apples.
  • compositions described herein comprise: a) Extracts derived from plants, which exhibit antimicrobial properties, such as extracts derived from Jamaican chalices (Hibiscus sabdariffa),
  • An organic acid with disinfectant activity such as acetic acid, lactic acid, citric acid, peracetic acid, octanoic acid, peroxyethanoic acid and 1-hydroxyethylidene-1,1-diphosphonic acid, and mixtures thereof, in a concentration p / p from 0.01% to 10%, preferably from 0.1% to 1%,
  • a chlorine compound with disinfectant activity such as sodium hypochlorite, calcium hypochlorite, chlorine dioxide and mixtures thereof in a w / w concentration of 0.001% to 10%, preferably 0.001% to 0.1%
  • a surfactant with emulsifying activity of natural fats or waxes found on the surface of apples such as, for example, polysorbates, Polysorbate 80, Polysorbate 20, C12-C18 alkyl dimethyl betaine (cocobetaine, C10-C16 alkyl dimethyl betaine (lauryl betaine) ), Sulfobetaine acyl (C10-C14 fatty) amidopropylene (hydroxypropylene), sulfobetaine, Cyclodextrins, B-cyclodextrins and ⁇ -Cyclodextrin and mixtures thereof in a w / w concentration of 0.1% to 5%, preferably 0.5% to 1
  • the compositions are added to the food to be
  • compositions of the invention can be added or contacted with food in an amount of 0.1 mL per 1000g of food, preferably 0.1 to 1mL per 100g of food, or added in larger volumes according to the needs of disinfection. of food. After applied, the compositions can remain the necessary time until the disinfectant and / or Desired preservation in fruits and vegetables. Prior to consumption, the fruits and vegetables treated with the compositions described herein are simply washed with drinking water to remove said compositions.
  • the compositions described herein can be obtained by mixing their components in the desired concentrations, to then store them at room temperature, so they are ready to be applied to food when deemed necessary.
  • the compositions described herein may contain only plant extracts with antimicrobial activity, such as extracts derived from Jamaican chalices, or chromatographic fractions obtained from acetonic extracts of Jamaican calyces, which are placed in contact with food, for example raw plant-based foods such as apples, in order to disinfect and / or preserve them.
  • plant extracts with antimicrobial activity such as extracts derived from Jamaican chalices, or chromatographic fractions obtained from acetonic extracts of Jamaican calyces, which are placed in contact with food, for example raw plant-based foods such as apples, in order to disinfect and / or preserve them.
  • the disinfectant activity of extracts derived from Jamaica and chromatographic fractions obtained from the extracts of the chalices of Jamaica, in the disinfection and / or preservation of foods, for example raw fruits and vegetables is described. which can be used directly or as part of compositions containing them.
  • chromatographic extracts or fractions derived from the chalices of Jamaica can be added or contacted with the food to be disinfected and / or preserved in a w / w concentration of 0.001% to 10%, preferably 0.1% to 1 %.
  • the disinfectant and / or preservation effectiveness of the compositions described herein is such that it inactivates or eliminates human pathogenic bacteria or food spoilage that may be present in them, while at the same time not affecting the organoleptic properties and / or nutritious food.
  • the compositions of the invention adequately disinfect the food without affecting its nutritional properties, while at the same time not affecting the organoleptic or quality properties.
  • the plant extracts of the present invention and the chromatographic fractions can be obtained by the following method: a) Place the dried plant in a container under aseptic conditions, add acetone in a 1: 9 ratio; preferably 100 g of the dried plant are placed in a container (flask) under aseptic conditions, 900 ml of methanol are added and allowed to stand for 7 days;
  • Extracts and fractions are stored at room temperature until use. Once the extracts and chromatographic fractions are obtained, they can be used alone, or in combination with other disinfectants to obtain the compositions of the invention, which can be obtained by methods known in the art where it involves the combination of the various elements that they are formed to form solutions and / or suspensions capable of being subsequently applied to food to be disinfected and / or preserved, by methods known in the art.
  • the present invention constitutes the first report of the use and effectiveness of compositions containing plant extracts with microbial activity, either alone or in combination with other disinfectants, for disinfection and / or preservation of food, particularly fruits and vegetables, such as apples.
  • the compositions of the invention are capable of disinfecting and / or eliminating microorganisms present in apples in a very efficient manner, so that it is possible to have innocuous apples ractoctobiologically and safe for consumption.
  • E. coli 0157 Strains of E. coli 0157 were used: H7 (P1C6, isolated from an outbreak of disease), enteroinvasive coli (4VC81-5, isolated from clinical case) E. Enteri toxogenic coli (1620 TL, isolated from clinical case), E. Enteropathogenic coli (52 GM 291, isolated from clinical case), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Salmonella choleraesuis (ATCC 10708), Listeria monocytogenes (ATCC 19115), Listeria monocytogenes Scott A, Staphylococcus epidermis (ATCC 12228), Staphylococcus Staphyus (ATCC 12228) 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Bordetella (ATCC 12741) Shigella sonnei (ATCC 25931) and Shigella flexneri (ATCC 12022), V.
  • H7 P1C6, isolated from an outbreak of disease
  • the strains were maintained at 4-7 ° C in blood-based agar (ABS, Merck®, Germany) with biweekly transfers, activating in tryptosesein soy broth (CST, Bioxon®, Mexico) with incubation at 35 ° C / 24h. 1.3. Obtaining aqueous extract from the chalices of Jamaica.
  • the dry extract (solvent-free) was obtained, it was mixed with silica (in order to make the extract manageable, since it still had moisture), it was added to the packed column.
  • Cotton was placed at the bottom of the column with the help of a rod to prevent the silica gel from detaching when the key was opened, the column was held with two tweezers and made sure it was straight.
  • the silica gel was mixed with hexane approximately 8: 1g (silica gel: extract), this amount was mixed with hexane until a fluid paste was obtained, the paste was poured into the column, the amount of hexane added should be sufficient to prevent the silica from drying out or air entering the paste, subsequently the extract was added little by little, a small layer of sodium sulfate (this serves as a drying agent) was added, a cotton layer was placed on top of it to cushion the solvent drop when added and thus avoid dispersion of the calcium sulfate and the extract, after this procedure the column was filled with the solvent (hexane) and the key was opened to begin lowering the fractions with the different solvent mixtures, recovering them in amounts of 50 ml each, which subsequently evaporated with the help of the rotary evaporator, and these were placed in vials, considering each of these as a fraction.
  • the dry extract (solvent-free) was obtained, it was mixed with silica (in order to make the extract manageable, since it still had moisture), it was added to the packed column. Cotton was placed at the bottom of the column with the help of a rod to prevent the release of the silica gel when the key was opened, the column was fastened with two tweezers and secured in such a way that it was straight.
  • the silica gel was mixed with chloroform approximately 8: 1g.
  • Test tubes with 24 h cultures in CST of each R + strain were centrifuged at 3500 rpm for 20 min. Subsequently, the supernatant was discarded; The cell packet was resuspended by adding 3 mL of sterile isotonic saline and stirred in vortex for 10 s. The above procedure was repeated two more times. Subsequently, the concentration of each strain was approximately 1x10 9 CFU / mL. Finally, each strain was diluted decimally in isotonic saline solution only once. 1.7.2. Preparation of solutions of extracts or fractions.
  • aqueous solutions were prepared using sterile distilled water or a solution of Polysorbate 80: water in a 20:80 ratio.
  • Water or polysorbate 80: water were added with dry extracts or fractions in a 1: 10 and 1: 100 ratio (water: extract or water: fraction) separately and deposited in sterile bottles.
  • the solutions of Jamaican calyx extracts, mixtures based on extracts and chromatographic fractions as well as mixtures containing acetic acid, hypochlorite and / or polysorbate 80% were prepared at the concentrations, proportions or mixtures described in Table 5.
  • concentrations, proportions or mixtures described in Table 5 For example, to prepare 100 ml of a solution containing 1% Jamaican calyces methanolic extract, 0.1% acetic acid and 100 mg / L hypochlorite: to 100 mL of distilled water was added 1 g of dry methanolic extract of calyces of Jamaica, in addition 1 ml of a 10% acetic acid solution and 0.2 ml of a 5% hypochlorite solution.
  • Salmonella serotypes (3 typhimur ⁇ um [ATCC 14028, one isolated from tomato, J1, and another from alfalfa seed, GA1], Salmonella choleraesuis [ATCC 10708], typhi, geminara, and ontevideo) and 3 of E. coli 0157: H7 (two isolated in our laboratory from raw ground beef [P1C6 and M5C8] and another isolated from an outbreak caused by meat consumption in the United States of America [E09]), this strain was donated by Dr. Eduardo Fernández Escartin of the Autonomous University of the State of Hidalgo.
  • Test tubes with 24 h cultures in CST of each R + strain were centrifuged at 3500 rpm for 20 min. Subsequently, the supernatant was discarded; he Cell pack was resuspended by adding 3 mL of sterile isotonic saline and stirred in vortex for 10 s. The above procedure was repeated two more times. The resulting concentration of each strain was approximately 1x10 9 CFU / mL.
  • One milliliter of each Salmonella strain was mixed in an empty test tube to have a mixture of the 7 Salmonella strains examined. The same was done with strains of E. coli 0157: H7, to have a mixture of the three strains of E. coli 0157. ⁇ 7.
  • Golden Delicious apples were used; The apples were obtained from a crazy producer! Prior to inoculation, apples were cleaned with a clean cloth to remove dust particles. Apples of a uniform or similar size were used and did not show visible damage. Separately, individual apples were inoculated placing in the central part (not in peduncle) of the fruit and drops or aliquots of 10 ⁇ of a suspension of each type of mixture of pathogenic bacteria (Salmonella or E. coli 0157: H7) containing approximately 1 x 10 7 CFU, the 5 inoculums were close without coming together the inoculated apples were placed in a tray and placed in a bioclimatic hood for two hours at a relative humidity of 90 ⁇ 1% and 26.5 ⁇ 1 ° C.
  • the apples were removed from the disinfectant solution and to remove the remaining disinfectant the inoculated part was immersed in distilled water for 10 s, then the inoculated part was cut (a box of approximately 2 x 2 cm and with a depth of approx. 2 cm) with the help of a sterile scalpel, each portion was placed independently in a plastic bag and 10 ml of peptone diluent was added. Subsequently, the materials were shaken manually by pressing and rubbing the inoculated part and the entire apple portion from the outside of the bag for a minute.
  • each bag was counted using the plate pouring technique using agar for standard methods (Bioxon, Mexico) added 100 mg / L of Rifampicin (Sigma, Mexico), the boxes were incubated at 35 ° C / 24-8 h. This procedure was performed in duplicate for each replica. Each treatment was carried out in quintuplicate.
  • results obtained were statistically analyzed with a one-way analysis of variance (ANOVA) comparing the means with the Tukey test, with a significance level of 0.05.
  • ANOVA analysis of variance
  • the NMR spectrum of the proton ( 1 H) was determined from both the dry methanolic extract obtained from the chalices of Jamaica and from of fractions referred to as "IV" which was obtained from the methanolic extract of the calyces of Jamaica and which was the collection that was used in the formulations.
  • NMR spectra were obtained using a nuclear magnetic resonance spectrometer (They vary NMR, 400 MHz). NMR spectroscopy studies atomic nuclei. This spectroscopic technique can only be used to study atomic nuclei with an odd number of protons or neutrons (or both), to determine the structures of organic compounds. This situation occurs in the atoms of 1 H, 13 C, 19 F and 31 P. These types of nuclei are magnetically active, that is, they have spin, just like electrons, since the nuclei have a positive charge and have a movement of rotation on an axis that makes them behave as if they were small magnets. The NMR spectrometer detects these signals and records them as a graph of frequencies versus intensity, which is called the NMR spectrum
  • the three types of extracts (aqueous, methanolic and acetonic) showed a marked antimicrobial effect (Table 6). All the microorganisms tested were inhibited from the first moments of contact. The inhibitory effect observed suggests the presence of antimicrobial substances in the extracts. This effect can cause lethal damage to the cell or only cause a sublethal effect or cellular stress (Busta, 1976). Different components of the vegetable could be responsible for this antimicrobial effect.
  • Type of inhibition inhibition inhibition inhibition inhibition microorganism Extract Extract Methanolic acetonic aqueous penicillin extract (control)
  • Table 7 shows the inhibitory effect expressed in length of the inhibition halo in millimeters (mm), which was observed in petri dishes seeded with different microorganisms, due to the effect of different collections of chromatographic fractions grouped by polarity obtained from acetonic extract of the calyces of Jamaica. It is observed that only collections II and III from acetonic extract show antimicrobial or inhibitory effect. Collection III is the one that showed the greatest antimicrobial effect (Table 7). This fraction III was used to make the mixtures or formulations that were used in the apple disinfection experiments. Table 7. Antimicrobial effect of acetonic collections Type of Collection Collection Collection Collection Collection Collection Collection bacteria nin ll III n IV n V n VI VII
  • Table 8 shows the inhibitory effect in mm of different collections of chromatographic fractions grouped by polarity obtained from the methanolic extract of the chalices of Jamaica. It is observed that all the collections caused halos of inhibition which is interpreted as the antimicrobial effect of the collections. However, IV is the collection WHAT ⁇ aosfcó- the greatest antimicrobial effect (Table 8). This fraction IV was used to make the mixtures or formulations that were used in the apple disinfection experiments. Example 4. Disinfectant potential of extracts and fractions alone or in mixtures with acetic acid, sodium hypochlorite and / or Polysorbate 80.
  • polysorbate 80 in the observed antimicrobial effect, since being a surfactant it is possible that it has favored the emulsification of the natural wax of apples which could increase the effect of the disinfectant solution by eliminating or decreasing the protective effect that the wax would be providing inoculated microorganisms on apples
  • compositions of the present invention are an excellent alternative for the disinfection and / or preservation of foods, for example fresh foods, without altering their nutritional properties.
  • the compositions described here allow the effective disinfection of pathogenic microorganisms of fruits and vegetables, preferably apples allowing the safe consumption of such products.
  • SAGARPA Secretary of Agriculture, Livestock, Natural Resources, Fisheries and

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Abstract

La presente invención describe composiciones para la desinfección y/o preservación efectiva de frutas y verduras contaminadas con microorganismos patógenos y deterioradores. Las composiciones descritas contienen extractos o compuestos con actividad antimicrobiana derivados de plantas, los cuales pueden actuar por si solos o en combinación con otros agentes desinfectantes, como por ejemplo ácidos orgánicos y compuestos del cloro, y tensoactivos, como el polisorbato 80. Las composiciones de la invención son capaces de eliminar o inactivar la contaminación microbiana, incluyendo la de microorganismos patógenos, de manzanas sin alterar las propiedades nutritivas y/o alimenticias y/o sensoriales de las manzanas.

Description

DESINFECTANTES PARA MANZANA i Malus domestica) A BASE DE PLANTAS
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al desarrollo de formulaciones que contienen compuestos con actividad antimicrobiana presentes en plantas y que son utilizados como desinfectantes y conservadores para alimentos, por ejemplo de origen vegetal y animal; más particularmente a formulaciones acuosas a base de extractos de cálices de Jamaica {Hibiscus sabdariffa), el método mediante el cual se obtiene y sus usos como formulación efectiva para eliminar bacterias patógenas de alimentos de origen vegetal, como frutas y hortalizas, pero con la más alta efectividad para Manzana (Malus domestica).
ESTADO DE LA TÉCNICA
La Manzana {Malus domestica) es un producto agrícola ampliamente consumido en todo el mundo. En México es uno de los principales productos agrícolas, con un poco más de 60 mil hectáreas dedicadas a su siembra. Los tipos de Manzana más importantes que se siembran en México, tanto a campo abierto como en agricultura protegida, son: Golden Delicious (la que más se produce), Red Delicious, Criolla, Red Chief, Rome Beauty, Starking, Starking Delicious y Top Red (Sagarpa, 2013).
No obstante, se ha reportado que existen por lo menos entre 5 000 y 20 000 variedades/cultivares de manzanas que son cultivados en todo el mundo (Pijpers et al., 1986), y de dentro de estos los principales son: Akane, Ambrosia, Arkansas Black, Blackjohn Braeburn, Bramley, Carneo, Cortland, Cox's Orange, Pippin, Crabapple, Criterion, Egremont Russet, Empire, Esperiega, Fuji, Gala, Ginger Gold, Granny Smith, Gravenstein, Honeycrisp, Idared, Jazz, Jonagold, Jonathan, Lodi, Mclntosh, Newtown/Pippin, Oíd Apple, Pacific Rose, Pink lady, Pinova, Red El, Reineta, Rome Beauty, Royal Gala, Splendor, Spur, Starkrimson, Starking, Verde doncella, Willie Sharp, Winesap, Winter Banana, Worcester, Permain, entre muchos otros (Pijpers et al., 1986). Sin embargo, a la par con el incremento en el consumo de Manzana en todo el mundo, se han presentado brotes de enfermedades provocados por bacterias asociados al consumo de manzana o sus productos crudos (CDC, 2005). Por ejemplo, en el 1999 el jugo de manzana no pasteurizado fue el vehículo en un brote multi- estatal, es decir que afecto varios estados en la unión americana, el microorganismo implicado en este brote fue Escheríchia coli 0157:H7 (CDC, 2005). Desde 1970 hasta el momento se han reportado un poco más 50 brotes de enfermedad de etología microbiana en los Estados Unidos de Norte América (USA, por sus siglas en ingles) por el consumo de jugos de manzana crudos.
Este tipo de brotes ha provocado una regulación estricta dentro y fuera de USA para todos los productores de manzana y jugos no pasteurizados, y por supuesto, también para todos los productores de manzana que exportan a USA o a otras partes del mundo como México. Todo esto ha significado que con frecuencia se retengan embarques de manzana en las fronteras, cierre parcial o total de la exportación de este producto a los países y pérdidas económicas por parte de los productores al no cumplir con los estándares microbiológicos.
Cabe señalar que aunque en México no existen reportes de brotes de enfermedad de etiología microbiana asociados al consumo de manzanas crudas enteras o de sus productos crudos como los jugos, debido a las malas prácticas de higiene que generalmente ocurren durante el cultivo, cosecha, transporte y comercialización de las Manzanas, es desesperar la participación de estos productos crudos en brotes de enfermedad. Un hec!ho que sustenta esta observación, es la frecuencia con la que se ha aislado recientemente cepas de Salmonella, grupos patógenos de Escheríchia coli, y otras bacterias patógenas a partir de diferentes productos crudos en México (Castañeda-Ramírez et al., 2011 ; Castro-Rosas et al., 2012). Los recientes brotes de enfermedades alimentaria asociadas con manzana y subproductos crearon la necesidad de determinar las fuentes de contaminación de la manzana y comprender la sobrevivencia y/o crecimiento de microorganismos patógenos en ella; estos han conducido al desarrollo de tecnologías innovadoras de control. En general, los agentes patógenos en las manzanas se podrían controlar mediante la prevención de la contaminación durante el cultivo y la cosecha de los productos, también mediante el uso de desinfectantes con poder antimicrobiano en el producto cosechado, y por el almacenamiento de la manzana a baja temperatura. No obstante, se ha identificado a la desinfección como la etapa de mayor importancia para la inocuidad microbiana de la manzana cruda.
Por lo general las manzanas no se consumen directamente como se cosechan. Después de la cosecha ya sea en el campo o en la industria (y aún en el hogar) reciben tratamientos diversos que tienden a favorecer su conservación y/o inocuidad. La aplicación de lavado y desinfección de las manzanas mejora su imagen microbiana. No obstante, es difícil lograr de manera segura la inactivación o remoción de microorganismos patógenos aún en condiciones extremas de tratamientos que no dañen sensorialmente al las manzanas. La prevención de la contaminación de la manzana es también una estrategia de control porque no se requiere el crecimiento de patógenos para causar enfermedad. Por lo tanto, las medidas de control adicionales pueden ser de valor. Cabe señalar que el comportamiento de los microorganismos patógenos en las manzanas se ve afectado por la ubicación del patógeno en el producto, la calidad del producto, la temperatura de almacenamiento, tipo de embalaje, y la humedad relativa. La superficie de las manzanas, suele tener escasos nutrientes lo que limita el crecimiento de patógenos durante el almacenamiento a temperatura ambiente o de refrigeración.
No obstante, cabe destacar que los microorganismos patógenos como Salmonella o E. coli 0157:1-17 son capaces de sobrevivir por tiempo prolongado en la superficie de las manzanas tanto en refrigeración como a temperatura ambiente (Fisher et al. 1998). Además una vez sobre la manzana, patógenos como Salmonella podría producir polímeros extracelulares sobre la manzana lo que lleva a la formación de una biopelícula que los pueden proteger contra los desinfectantes (Kroupitski et al., 2009); este comportamiento de los microorganismos patógenos se ha observado en diferentes vegetales como por ejemplo en tomates (Iturriaga et al., 2007).
Un hecho a destacar es que los microorganismos patógenos como Salmonella o E. coli 0157:H7, por ejemplo, son capaces de multiplicarse en manzana picada o cortada o e jugo de manzana incrementando de forma muy significativa su concentración y haciendo mucho más peligroso al alimento (Changa y Fang, 2007).
Los microorganismos patógenos en la superficie de las manzanas pueden contaminar los tejidos internos e infiltrase y posteriormente durante el cortado del fruto podrían contaminar el producto picado y crecer en el (Changa y Fang, 2007). Varios hallazgos de la investigación indican que los patógenos bacterianos pueden infiltran en los productos vegetales, como las manzanas (Kroupitski et al., 2009; Bartz, 1982; Guo et al., 2002; Ibarra-Sanchez et al., 2004; Zhuang y Beuchat 1995) cuando hay un diferencial de temperatura entre el producto vegetal y el agua de lavado y por la presión hidrostática cuando los vegetales se sumergen en el tanque de recepción (Bartz, 1982; Bartz y Showalter, 1981).
La infiltración bacteriana aumenta en los vegetales crudos en presencia de heridas y pinchazos. Los patógenos infiltrados no se eliminan por las prácticas normales de lavado. El principal beneficio de la adición de productos químicos antimicrobianos (como los desinfectantes químicos a base de hipoclorito o a base de ácidos orgánicos) al agua de lavado de las manzanas es el control de la propagación de agentes patógenos, su inactivación y/o evitar su infiltración a las manzanas. No obstante, los desinfectantes químicos actualmente disponibles tienen beneficios limitados sobre los productos vegetales, como las manzanas. Se ha estudiado el efecto antimicrobiano de soluciones de hipoclorito, peróxido de hidrógeno, ácido peracético y el agua electrolizada en su capacidad para reducir los agentes patógenos en productos vegetales durante el proceso de lavado. No obstante, se ha concluido que estos tratamientos tienen un efecto limitado sobre los microorganismos patógenos, presumiblemente porque los agentes activos no tienen suficiente contacto con los microorganismos patógenos sobre los productos vegetales crudos.
El proceso de desinfección se refiere a la destrucción física de los microorganismos cuya actividad compromete la inocuidad o las características sensoriales de un alimento. El efecto puede lograrse a través de medios físicos o químicos, estando su eficacia en función de los microorganismos (tipo y número), el substrato sobre el cual se encuentran (presencia de materia orgánica), la estructura del material (que permita el acceso directo del germicida a los microorganismos) y el germicida (concentración, temperatura y tiempo de contacto) (Fernández, 2000). En el proceso de desinfección, la sustancia germicida participa en reacciones químicas, de manera que mientras mayor es el número de microorganismos mayor demanda del agente para lograr una inactivación total de la población. La susceptibilidad a un germicida específico varía entre los microorganismos; algunos se inactivan desde el primer momento de contacto, mientras que en el otro extremo pueden existir sobrevivientes. Finalmente hay que tener presente que entre los microorganismos es posible la selección de cepas con resistencia creciente al efecto de una agente germicida específico. En consecuencia, con el tiempo, llegan a requerirse concentraciones muy superiores del desinfectante a las iniciales para alcanzar el mismo nivel de inactivación (Fernández, 2000).
Diferentes estudios demuestran que los tratamientos de desinfección de productos agrícolas crudos con frecuencia tienen un efecto débil ó limitado. Por ejemplo el lavado y desinfección con 200 mg/L de cloro activo (hipoclorito), de yodo (yodóforo), de bióxido de cloro o de 100 mg/L de un producto comercial a base de extracto de semilla de toronja (citricidal) redujeron el contenido de germinado de alfalfa en sólo 1-2 logio; la disminución de S. typhi o de V. cholerae OI inoculados en el laboratorio no fue mayor a 1.5 logio UFC/g (Castro-Rosas y Escartín, 1999).
La industria de alimentos cuenta con una diversidad de agentes germicidas. Sus virtudes y limitaciones obligan a seleccionar cuidadosamente aquellos que mejor se ajusten a cada necesidad particular (Fernández, 2000). La inactivación de las bacterias patógenas en las plantas procesadores de alimentos es un requisito básico para controlarlas e impedir su acceso al producto terminado (Álvarez, 1998).
Lo común es que un germicida se considere efectivo cuando demuestra capacidad para inactivar al menos 3 Logio de una suspensión de microorganismos en 30s (Fernández, 2000).
Las soluciones a base de cloro son un desinfectante barato y disponible como hipoclorito o en sus formas de liberación lenta (cloraminas, por ejemplo) (Lelieveld et al., 2013). Los hipocloritos tienen un amplio espectro de actividad antibacteriana, aunque son menos efectivos contra esporas que contra bacterias no formadoras de esporas y tienen bajo efecto contra micobactenas (Russell et al., 2004). Las soluciones de cloro como hipoclorito de sodio ó bióxido de cloro, son ampliamente utilizadas por la industria de alimentos como desinfectante. Los dos son oxidantes fuertes que actúan a nivel de las membranas y otros constituyentes celulares (Harmon et al., 1987). No obstante, el primero presenta la desventaja de reaccionar fácilmente con la materia orgánica, por lo que se inactiva más rápido. En el segundo la interferencia es mínima (Castro-Rosas y Escartin, 1999). La principal desventaja del hipoclorito de sodio es que la humedad, el calor, la luz y sobre todo la presencia de materia orgánica, incrementan la tasa de pérdida de cloro libre. La actividad germicida del cloro generalmente ha sido atribuida al ácido hipocloroso (HOCI), el cual es generado en soluciones acuosas de hipoclorito de sodio y otros compuestos que contengan cloro.
Los desinfectantes se pueden incorporar al agua de lavado y de esta forma contribuir a la reducción de la carga microbiana. La efectividad del hipoclorito no solamente es afectada por el tiempo de exposición y la concentración del cloro libre, si no por otros factores como temperatura, pH, tipo de cepa, así como presencia y tipo de materia orgánica (Álvarez, 1998). No obstante, algunos autores señalan que la eficiencia del hipoclorito en la reducción de microorganismos patógenos presentes en verduras es limitada (Adams et al., 1997).
Compuestos químicos derivados del cloro, yodo y plata han sido típicamente usados como desinfectantes de verduras, como las manzanas. Sin embargo, recientemente diversos estudios muestran que los tratamientos de desinfección con estos compuestos resultan ineficientes en la eliminación o reducción de los niveles de patógenos microbianos. Por tal motivo, muchos países han abandonado el uso de hipoclorito o soluciones de yodo para la desinfección de verduras crudas.
Los ácidos orgánicos han sido utilizados tradicionalmente como conservadores de alimentos o en soluciones para desinfectar verduras crudas. Su efecto antimicrobiano se ejerce a través de la forma no disociada causando una baja del pH.
El ácido acético es una sustancia inocua; no existen límites oficiales para la ingesta diaria en el hombre. Cuando se incorpora ácido acético a un alimento se expresan dos efectos, uno acidulante y otro preservativo. A concentración de 1-2% inhibe casi toda la flora total dentro de límites razonablemente elevados de carga inicial. Al 0.1% actúa sobre la mayoría de los patógenos y esporulados; al 0.5% tiene efecto sobre los hongos toxigénicos. Se ha evaluado la eficacia del ácido acético contra algunos patógenos específicos utilizando como medio algunos alimentos. Los informes publicados a menudo son difíciles de comparar por que las concentraciones de ácido han sido variables expresadas como porcentaje, molaridad o pH final del medio de ensayo acidificado. La actividad antimicrobiana depende del tiempo de exposición, temperatura, tipo de ácido, concentración del ácido, nivel de disociación y pH (Harmon et al., 1987). No obstante, los resultados generales demuestran que la eficacia del ácido acético aumenta a medida que aumenta la concentración, disminuye el pH, la temperatura aumenta y la carga microbiana disminuye (Harmon et ai., 1987). Entre las bacterias, las Gram positivas suelen ser más resistentes que las bacterias Gram negativas (Rameshkumar et al., 2007). Las esporas bacterianas y los virus son más resistentes que las células vegetativas. Sin embargo, los ácidos orgánicos han mostrado también poca efectividad para desinfectar verduras crudas (Fernández, 2000).
La investigación reciente indica que los productos químicos antimicrobianos en la fase de vapor pueden reducir significativamente las poblaciones de patógenos en la superficie de vegetales. El uso de 5 mg / litro de gas dióxido de cloro durante 1 h fue significativamente más eficaz contra la Salmonella en la cicatriz del pedúnculo de tomates que eran soluciones acuosas de 200 ppm de hipoclorito de sodio (2 min de exposición) y 1200 ppm de hipoclorito de sodio acidificado (2 min de exposición) (Yuk et al., 2005). El uso de 10 mg / litro de ozono inactiva por completo 7 log UFC de Salmonella enterítidis de la superficie de tomates cherry después de 15 min, sin embargo, se afecta el color de los tomates (Das et al., 2003).
Debido a que los agentes antimicrobianos en fase vapor pueden ser eficaces contra bacterias adheridas a ubicaciones de los productos agrícolas crudos no alcanzadas por los agentes activos en solución acuosa, su uso en los productos envasados (en bolsas de plástico) o durante el procesamiento de productos (en la empresa) podría proporcionar un beneficio extra en el control de patógenos. Sin embargo, este tipo de tratamientos con vapor no sería un tratamiento opcional ni practico para los productores primarios de manzana en campo ya que por lo general los productores venden su producto empacado en cajas cartón o madera entre otras cosas por la facilidad y para evitar acumulación e humedad lo que ocurriría si se usaran bolsas de plástico. Además, este tampoco sería un tratamiento práctico para aplicarlo en los restaurantes o en los hogares.
El uso de sustancias químicas como desinfectantes de verduras crudas para mejorar o preservar su inocuidad, es un procedimiento universalmente utilizado por los productores. Sin embargo, algunos de estos antimicrobianos pueden resultar tóxicos para los consumidores; es el caso de las soluciones de hipoclorito. Reportes recientes señalan que el hipoclorito en solución puede formar precursores de cáncer. Además, muchos de los desinfectantes químicos, como las soluciones a base de yodo o plata coloidal, muestran limitado o variado efecto antimicrobiano en productos como las verduras crudas; una situación similar ocurre con los conservadores para alimentos. Debido a ello, los desinfectantes y conservadores obtenidos a partir de plantas recientemente han surgido como una alternativa viable, ya que estos podrían tener igual o mayor potencial antimicrobiano y con un mínimo riesgo para los consumidores.
La aplicación de extractos del ajo en fruta fresca contra enfermedades poscosecha han obtenido el control completo de la putrefacción marrón de los melocotones causados por el Monilinia fructicola (Roller, 2003). Yucel y Karapinar (2005) evaluaron la reducción de S. typhimurium en cebollas mediante la aplicación de jugo de limón, vinagre y sus mezclas, observando una reducción respectiva de 0.87- 2.93, 0.66-2.92 y 0.86-3.24 Log UFC/g.
Los aceites esenciales provenientes de plantas son capaces de inactivar los patógenos de interés en productos frescos. De 96 diferentes tipos de aceites esenciales examinados, sólo 3 resultaron eficaces contra £. co//' 0157:H7 y Salmonella entérica los cuales fueron de orégano, tomillo, y canela. En otro estudio se ensayaron 16 compuestos individuales de los aceites más eficaces contra E. coli 0157:H7 y Salmonella y se encontró que los compuestos más eficaces fueron timol, cinamaldehído, y carvacrol (Friedman et al., 2002). Esta información se obtuvo usando el aceite en la fase líquida. Existe limitada información disponible sobre la eficacia de los aceites esenciales en forma de vapor. En otro estudio, Muñoz (2003) evaluó el efecto de dos concentraciones de carvacrol y el desinfectante comercial Boradantix© (EVESA, Extractos Vegetales S.A.) en la sobrevivencia de L. monocytogenes, P. fíuorescens, E. coli, Erwinia caratovora y S. typhimurium en jugo de Manzana y zanahoria. Todos los microorganismos de estudio fueron inhibidos en ambas concentraciones del carvacrol. Las bacterias estudiadas mostraron mayor sensibilidad hacia el carvacrol que al Boradantix©. Lin et al., (2000) evaluaron el efecto del alil y metil isocianato (AITC/MITC) (componentes clave de mostaza verde) sobre L. monocytogenes, E. coli 0157:H7 y S. montevideo, inoculadas sobre la superficie de tomate. AITC fue más efectivo contra Salmonella y £. coli, lográndose 8 Log de reducción con un tratamiento de vapor generado de 400 μΙ de AITC después de 4 y 2 días, respectivamente sobre manzana. También se alcanzaron 8 Log de reducción de S. Montevideo sobre cutícula de tomate con 500 μΙ de AITC.
Han sido relativamente pocos los estudios de la acción antimicrobiana de los aceites esenciales en sistemas modelo de alimentos y en alimentos verdaderos. Sin embargo, la eficacia de aceites esenciales in vitro es a menudo mucho mejor que in vivo o in situ, es decir en alimentos. Generalmente al aplicar un antimicrobiano de plantas a un alimento o in vitro se necesitan de 10 a 100 veces más concentración de antimicrobiano que lo observado in vivo. Por ejemplo, el aceite esencial de la menta (Mentha piperita) ha demostrado inhibir el crecimiento de Salmonella enteritidis y L. monocytogenes en medios de cultivo por 2 días a 30°C. Sin embargo, el efecto del aceite esencial de la menta en el aperitivos griegos tzatziki (pH 4.5) y el taramasalata (pH 5.0) y en paté (pH 6.8) a 4°C y 10°C fue variable (Roller, 2003). Salmonella enteritidis fue eliminada en aperitivos bajo todas las condiciones examinadas pero no cuando fue inoculado en paté y mantenido a 10°C. En éste mismo estudio, L. monocytogenes se comportó de forma semejante, ya que la cuenta microbiana disminuyó en los aperitivos pero aumentó en el paté (Roller, 2003). El crecimiento de £. coli, Salmonella sp., L. monocytogenes y Staphylococcus aureus fueron inhibidos por el aceite esencial del orégano en caldos de cultivo. Sin embargo, cuando estos aceites se probaron en alimentos tales como berenjena, taramasalata ó mayonesa se observaron reacciones tales como incremento del pH, incremento de temperatura y para el caso de las emulsiones separación del aceite usado (Roller, 2003). En otro estudio L monocytogenes y S. typhimurium fueron inhibidos en carne tratada con aceite esencial de clavo y orégano, respectivamente. Una reducción marcada de Aeromonas hydrophila ha sido también reportada en carne de cerdo cocinada que fue tratada con aceites del clavo o cilantro, empaquetada a vacío o con aire y almacenada a 2°C y 10°C. (Roller, 2003). Las diferencias que se observan entre los estudios de efecto antimicrobiano cuando se aplican directamente los aceites extraídos de plantas sobre los microorganismos (microorganismos en suspensión acuosa) y aquellos en los que existe un alimento o materia orgánica de por medio, es posible que ocurra por la interferencia con los componentes del alimento o de la materia orgánica (proteínas, grasas, azúcares, sales). Por lo tanto, es muy posible que solamente una proporción del aceite esencial adicionado al alimento tenga actividad antibacteriana. Por otra parte, la distribución espacial de las diferentes fases (sólido/líquido) en un alimento y la carencia de homogeneidad de factores como el pH, aw entre otros, pueden jugar un papel en la eficacia. Debido a todo lo anterior, en diversas partes del mundo se encuentran en curso estudios encaminados a la búsqueda de antimicrobianos alternativos (Jongen, 2005). Entre las nuevas alternativas de desinfectantes se ha optado por compuestos naturales con amplia capacidad antimicrobiana.
Cabe destacar que los extractos obtenidos de algunas plantas han mostrado efecto antimicrobiano contra cepas de patógenos multiresistentes a antibióticos, lo cual, abre todo un campo nuevo para el desarrollo de nuevos antimicrobianos para su uso en humanos y animales.
Como antecedente de la presente solicitud, se ha evaluado el efecto antimicrobiano de alrededor de 60 diferentes plantas usadas en la herbolaria (Cruz- Gálvez et al., 2013); donde algunas de éstas han mostrado un elevado poder antimicrobiano contra diferentes microorganismos patógenos, tales como Salmonella o Escheríchia coli 0157:H7, entre otros, así como contra microorganismos deterioradores de alimentos (Pseudomonas aeruginosas, por ejemplo), y la planta que mayor efecto antimicrobiano ha mostrado han sido los cálices de la flor de jamaica, siendo en algunos casos mayor el efecto antimicrobiano que el de desinfectantes comerciales a base de hipoclorito, yodo, plata coloidal o que el de antibióticos como la penicilina. Los extractos de los cálices de jamaica los hemos separado mediante cromatografía en columna para obtener fracciones con mayor poder antimicrobiano; con fracciones seleccionadas se han elaborado soluciones que han sido evaluadas para determinar su potencial antimicrobiano. De hecho, diferentes investigadores ha reportado también que los cálices de la flor de Jamaica (Hibiscus sabdaríffa L) poseen sustancias con elevado poder antimicrobiano (Aziz et al., 1998; Fernández et al., 1996; Kang er a/., 2007).
La jamaica es una de las plantas en las que recientemente se ha reportado presencia de compuestos antimicrobianos en cálices deshidratados (Aziz et al., 1998; Fernández et al., 1996; Kang et al., 2007). En los cálices de la flor de Jamaica se han detectado una gama de compuestos fitoquímicos que podrían ser los responsables del efecto antimicrobiano observado, tales como por ejemplo los polifenoles (Tajkarimi et al., 2010), entre ellos algunos ácidos fenólicos (Tajkarimi ef al., 2010), así como flavonoides, catequinas y epicatequinas (Friedman et al. 2002). No obstante, no existen estudios puntuales que muestren cuales son efectivamente las moléculas o compuestos químicos responsable del efecto antimicrobiano observado en los cálices de Jamaica. Diferentes investigadores coinciden en que es necesario realizar mayores estudios para identificar las moléculas específicas y responsables del efecto antimicrobiano provocado por los cálices de Jamaica en solución.
Escasos son los documentos de patente que describen extractos de los cálices de la flor de Jamaica (Hibiscus sabdaríffa ) y su uso como material con propiedades antimicrobianas.
Por ejemplo, la solicitud de patente JP2002128602 describe su uso en una composición agroquímica para proteger plantas en campos de sembradíos, mientras que la solicitud US20100323046 describe el empleo de un extracto crudo de los cálices de Jamaica para producir un medicamento para tratar infecciones urinarias causadas por Escherichia coli y Candida albicans.
En la solicitud de patente KR20080092186 se describe un extracto de Jamaica que es empleado para mejorar la calidad de la carne de res, puerco y pollo y para incrementar su estabilidad de almacenaje. El extracto es preparado mediante extracción con etanol y sometido a un proceso de secado en frío. La concentración del extracto en la composición es de 500 mg/ml y se trata la carne con una preparación del 0.5-al 3.0 % (por peso). Por otro lado, en la solicitud US20120015062 se describen composiciones que comprenden extracto de la planta Agapanthus afrícanus y composiciones que comprenden este extracto mas otros extractos de otras plantas diferentes, como por ejemplo plantas de la familia Rosa o de alfalfa para usarse como agentes en la protección biológica de otras plantas incluyendo sus semillas. A pesar de que en este documento de solicitud de patente se hace referencia al artículo publicado por Leksomboon et al. (Kasetsart, Journal Natural Science 35: 392-396, 2001.) en donde se menciona que extractos obtenidos de diversas plantas (Hibiscus sabdariffa, Psidium guctjava, Púnica granatum, Spondias pinnata and Tamaríndus indica) tienen una función antimicrobiana, dicho documento no aporta ninguna evidencia experimental que involucre los extractos de Hibiscus sabdariffa para el mismo uso que se le da a los extractos de Agapanthus afrícanus.
Por lo anterior, es necesario contar con composiciones antimicrobianas protectoras efectivas para evitar y/o combatir la contaminación microbiana de los alimentos, principalmente de aquellos que se consumen crudos, como por ejemplo las manzanas, con la finalidad de preservarlos y consumirlos sin el riesgo de adquirir enfermedades causadas por su contaminación con microorganismos patógenos.
Hasta antes de la presente invención, no había sido posible desarrollar composiciones efectivas para desinfectar eficientemente y sin daño al producto como las descritas aquí, y que al mismo tiempo permitieran conservar las propiedades nutritivas de frutas y verduras y no afectar, por ejemplo la calidad de las manzanas, con lo cual es posible con la presente invención obtener manzanas crudas inocuas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Se muestra el espectro de resonancia magnético nuclear (RMN) de
PROTÓN (1H) del extracto acetónico seco obtenido de los cálices de jamaica que se utilizó en la presente invención. Figura 2. Se muestra el espectro de resonancia magnético nuclear (RMN) de PROTÓN (1H) de la colección de fracciones denominada como III que fue obtenida a partir de un extracto acetónico de los cálices de Jamaica y que fue la colección que se utilizó en la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
De acuerdo con los problemas mencionados anteriormente, existe la necesidad de proveer una formulación de mayor eficacia para inactivar o remover microorganismos patógenos de la manzana (Malus domestica) aún en condiciones extremas de tratamiento, pero que no dañen sensorialmente el alimento.
La presente invención se refiere a composiciones que contienen fitoquímicos presentes en extractos de plantas que son utilizados como desinfectantes de alimentos de origen vegetal y animal, por ejemplo dirigidos a la desinfección y preservación de frutas y hortalizas, particularmente a la desinfección y/o preservación de manzana (Malus domestica). Una modalidad de la presente invención se refiere a la obtención de un preparado vegetal que comprende un extracto metanólico de los cálices de la flor de Jamaica (Hibiscus sabdaríffa) ó fracciones cromatográficas especificas obtenidas del extracto acetónico de los cálices de Jamaica, los cuales son útiles para eliminar agentes patógenos presentes en los alimentos (efecto desinfectante) y para retrasar el deterioro de los alimentos o preservar su inocuidad (efecto conservador).
Otra modalidad de la presente invención se refiere a la obtención de extractos derivados de plantas que son utilizados como desinfectantes contra microorganismos patógenos presentes en los alimentos y para retrasar el deterioro de los alimentos y/o preservar su inocuidad, es decir, como conservadores para alimentos, los que constituyen una alternativa al uso de desinfectantes tradicionales que pueden llegar a ser tóxicos al ser humano, a los animales o al medio ambiente. Otra modalidad de la presente invención se refiere a la elaboración de composiciones que contengan el extracto de los cálices de jamaica (Hibiscus sabdaríffa L.) que tengan una función desinfectante y conservadora de alimentos conjuntamente con otros compuestos que tengan propiedades desinfectantes por ejemplo ácido acético, hipoclorito, etc.
Otra modalidad de la presente invención se refiere a la obtención de extractos obtenidos a partir de cálices de jamaica que tienen un efecto desinfectante o conservador cuando son aplicados a alimentos. Un aspecto de esta modalidad se refiere a la aplicación de extractos obtenidos a partir de cálices de la planta de jamaica (Hibiscus sabdaríffa L.) que tienen un efecto desinfectante o conservador cuando son aplicados a alimentos de origen vegetal, preferentemente manzana.
Otra modalidad de la presente invención es el desarrollo de un método para la obtención del extracto acetónico a partir de cálices de Jamaica, extracto que resulta ser útil como desinfectante y conservador de alimentos.
Otra modalidad de la presente invención se refiere al método para obtener fracciones cromatográficas especificas y con efecto antimicrobiano obtenidas del extracto acetónico de los cálices de jamaica, los cuales son útiles para eliminar agentes patógenos presentes en los alimentos (efecto desinfectante) y para retrasar el deterioro de los alimentos o preservar su inocuidad (efecto conservador).
Otra modalidad de la presente invención es un método de tratamiento y/o conservación de alimentos de origen animal y/o vegetal mediante la aplicación de composiciones que contienen extractos de cálices de jamaica que permiten la desinfección y su conservación de los mismos.
El uso de los extractos de cálices de jamaica como desinfectante y/o conservador de alimentos, es otra modalidad que se describe en la presente invención.
Los compuestos provenientes de los cálices de Jamaica pueden ser de utilidad en la elaboración de un desinfectante eficiente para eliminar a las bacterias patógenas presentes en las verduras crudas, tal como las manzanas. En la presente invención se describe un extracto de cálices de jamaica y una fracción especifica obtenida por cromatografía en columna a partir de un extracto acetónico de los cálices de jamaica, que comprende fitoquímicos, el cual puede ser utilizado como desinfectante y/o conservador de alimentos debido a su eficiencia en la eliminación de bacterias patógenas de verduras crudas tales como manzanas.
A diferencia de otras composiciones conocidas hasta ahora para el mismo fin, las composiciones de la presente invención son capaces de eliminar a las bacterias patógenas presente en verduras crudas, como por ejemplo manzanas per se, sin alterar sus propiedades alimenticias así como las características de calidad del producto. En consecuencia, la aplicación de las composiciones de la presente invención en verduras crudas, permite su conservación, así como su desinfección efectiva, lo que los convierte en alimentos seguros para su consumo. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Las composiciones de la presente invención comprenden extractos de plantas con conocida actividad antimicrobiana, como por ejemplo extractos acetónicos de Jamaica y fracciones cromatográficas especificas obtenidas del extracto acetónico de los cálices de jamaica, ya sean solos o en combinación con otros componentes con probada actividad desinfectante, tales como por ejemplo ácidos orgánicos que incluyen ácido acético y compuestos de cloro que incluyen hipoclorito de sodio. Para el caso de la desinfección de verduras crudas tales como por ejemplo manzanas, las composiciones de la invención que incluyen una mezcla de extractos acetónicos de plantas con actividad antimicrobiana así como ácido acético e hipoclorito de sodio y polisorbato, y una mezcla de fracciones cromatográficas especificas obtenidas del extracto acetónico de los cálices de jamaica así como ácido acético e hipoclorito de sodio y polisorbato, suelen ser muy efectivas para eliminar los microorganismos residentes en el vegetal, logrando al mismo tiempo que sus propiedades organolépticas y/o nutricionales no se vean afectadas y sin que se altere, por ejemplo la calidad comercial de las manzanas.
Para efectos de la presente invención, las composiciones descritas aquí, comprenden: a) Extractos derivados de plantas, los cuales exhiban propiedades antimicrobianas, como por ejemplo extractos derivados de cálices de jamaica (Hibiscus sabdariffa),
b) Fracciones cromatográfica obtenidas del extractos acetónicos derivados de plantas, las cuales exhiban propiedades antimicrobianas, como por ejemplo fracciones cromatográfica obtenidas de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa),
c) Un acido orgánico con actividad desinfectante, como por ejemplo ácido acético, ácido láctico, acido cítrico, ácido peracético, ácido octanoico, ácido peroxietanoico y ácido 1-hidroxietiliden-1,1-difosfónico, y mezcias de los mismos, en una concentración p/p de 0.01% a 10%, preferentemente de 0.1% a 1%,
d) Un compuesto de cloro con actividad desinfectante, como por ejemplo hipoclorito de sodio, hipoclorito de calcio, bióxido de cloro y mezclas de los mismos en una concentración p/p de 0.001% a 10%, preferentemente de 0.001% a 0.1%, y e) Un tensoactivo con actividad emulsificante de las grasas o ceras naturales que se encuentran en la superficie de las manzanas como por ejemplo, polisorbatos, Polisorbato 80, Polisorbato 20, alquil C12-C18 dimetil betaína (cocobetaína, alquil C10-C16 dimetilbetaína (laurilbetaína), Sulfobetaína acil (C10-C14 graso) amidopropilen(hidroxipropilen), sulfobetaína, Ciclodextrinas, B-ciclodextrinas y β- Cyclodextrin y mezclas de los mismos en una concentración p/p de 0.1% a 5%, preferentemente de 0.5% a 1%. Para efectos de la invención, las composiciones se agregan a los alimentos a desinfectar y/o preservar a través de métodos conocidos en el arte, tales como aplicación directa, a través de aerosoles, la inmersión completa de las frutas y verduras en las soluciones desinfectantes o bien mediante dispositivos que permitan su adecuada dispersión en los alimentos a tratar. Las composiciones de la invención pueden adicionarse o ponerse en contacto con los alimentos en una cantidad de 0.1 mL por 1000g de alimento, preferentemente de 0.1 a 1mL por 100g de alimento, o bien adicionarse en volúmenes mayores conforme a las necesidades que se tengan de desinfección del alimento. Después de aplicadas, las composiciones pueden permanecer el tiempo necesario hasta obtener el efecto desinfectante y/o de preservación deseado en las frutas y verduras. Previo a su consumo, las frutas y verduras tratadas con las composiciones descritas aquí simplemente se lavan con agua potable para eliminar dichas composiciones. Las composiciones descritas aquí, pueden ser obtenidas mediante la mezcla de sus componentes en las concentraciones deseadas, para posteriormente almacenarlas a temperatura ambiente, con lo que se encuentran listas para aplicarse a los alimentos cuando se considere necesario. Para efectos de la invención, las composiciones descritas aquí pueden contener solamente extractos vegetales con actividad antimicrobiana, como por ejemplo extractos derivados de cálices de Jamaica, o bien fracciones cromatográficas obtenidas a partir de los extractos acetónicos de los cálices de Jamaica, los cuales se ponen en contacto con los alimentos, por ejemplo a alimentos de origen vegetal crudos como las manzanas, con la finalidad de desinfectarlos y/o preservarlos. En la presente invención, se describe la actividad desinfectante de extractos derivados de Jamaica y de fracciones cromatográficas obtenidas a partir de los extractos de los cálices de Jamaica, en la desinfección y/o preservación de alimentos, por ejemplo frutas y verduras crudas, por lo que pueden usarse directamente o bien formando parte de composiciones que las contengan. En este sentido, los extractos o fracciones cromatográficas derivados de los cálices de Jamaica, pueden adicionarse o ponerse en contacto con los alimentos a desinfectar y/o preservar en una concentración p/p de 0.001% a 10%, preferentemente de 0.1% a 1%. La efectividad desinfectante y/o de preservación en los alimentos de las composiciones descritas aquí es tal, que inactiva o elimina a lasiiacterias patógenas al humano o deterioradoras de alimentos que puedan estar resentes en ellos, mientras que al mismo tiempo no afecta las propiedades organolépticas y/o nutritivas del alimento. En el caso de alimentos frescos como por ejemplo manzana, las composiciones de la invención desinfectan adecuadamente el alimento sin afectar sus propiedades alimenticias, mientras que al mismo tiempo no afectan las propiedades organolépticas o de calidad. Los extractos vegetales de la presente invención y las fracciones cromatográficas puede ser obtenidos mediante el método siguiente: a) Colocar la planta seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir acetona en proporción 1:9; preferentemente se colocan 100 g de la planta seca en un recipiente (matraz) en condiciones asépticas, se añaden 900 mi de metanol y se deja reposar durante 7 días;
b) Retirar los cálices y recuperar el extracto acetónico; preferentemente el extracto resultante se recupera previa presión en las paredes del matraz para retirar el exceso de líquido;
c) Pasar el extracto por un tamiz y recuperar el extracto filtrado; preferentemente el extracto se pasa por un tamiz No. 200;
d) Retirar la acetona del extracto mediante rota-evaporación a una temperatura de 40°C, una rotación de 80 rpm y una presión a vacío de 72 mbar;
e) Recuperar el extracto seco; preferentemente en un contener previamente estéril; f) Obtener fracciones de los extractos acetónico mediante cromatografía en columna empleando solventes de diferente polaridad;
g) Eliminar el solvente de las fracciones obtenidas mediante rota-evaporación a una temperatura de 40°C, una rotación de 80 rpm y una presión a vacío de 72 mbar; y h) Recuperar las fracciones secas; preferentemente en un contenedor.
Obtenidos los extractos y las fracciones, éstas se almacenan a temperatura ambiente hasta su uso. Una vez obtenidos los extractos y las fracciones cromatográficas, éstas puede utilizarse solas, o bien en combinación con otros desinfectantes para obtener las composiciones de la invención, las cuales pueden ser obtenidas mediante métodos conocidos en el arte donde implique la combinación de los diversos elementos que las conforman para formar soluciones y/o suspensiones capaces de ser aplicadas posteriormente a los alimentos a desinfectar y/o preservar, mediante métodos conocidos en el arte.
La presente invención constituye el primer reporte de la utilización y efectividad de composiciones que contienen extractos vegetales con actividad microbiana, ya sea solos o en combinación con otros desinfectantes, para la desinfección y/o preservación de alimentos, particularmente de frutas y hortalizas, como por ejemplo manzana. Como podrá observarse más adelante, las composiciones de la invención son capaces de desinfectar y/o eliminar microorganismos presentes en manzanas de forma muy eficiente, con lo que es posible contar con manzanas inocuos raÉctobiológicamente y seguros para su consumo.
A continuación se incluyen los siguientes ejemplos con la única finalidad de ilustrar la presente invención, sin que ello implique limitación alguna a su alcance. Ejemplo 1. Materiales y métodos.
1.1. Material vegetal.
Se usaron cálices secos de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) de la variedad criolla de Oaxaca, mientras que en el caso de la manzana {Malus domestica) se utilizó la variedad Golden Delicious. Las manzanas tuvieron un tamaño uftiforme.
1.2. Cepas bacterianas.
Se utilizaron cepas de E. coli 0157:H7 (P1C6, aislada de un brote de enfermedad), £ coli enteroinvasiva (4VC81-5, aislada de caso clínico) E. coli enterotoxigénica (1620 TL, aislada de caso clínico), E. coli enteropatógena (52 GM 291, aislada de caso clínico), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Salmonella choleraesuis (ATCC 10708), Listería monocytogenes (ATCC 19115), Listería monocytogenes Scott A, Staphylococcus epidermis (ATCC 12228), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Bordetella (ATCC 12741) Shigella sonnei (ATCC 25931) y Shigella flexneri (ATCC 12022), V. cholerae (87151 , serotipo Inaba aislada del ambiente) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). Las cepas de E. coli 0157:H7 y la de V. cholerae OI fueron donadas por el Dr. Fernández Escartin de la Universidad Autónoma de Querétaro. Todas las cepas fueron marcadas con resistencia al antibiótico rifampicina (R+) para eliminar la interferencia de la flora microbiana nativa del extracto (Castro-Rosas y Escartín, 2000). Ésta resistencia al antibiótico se mantuvo en el transcurso durante todo el estudio. Las cepas se mantuvieron a 4 - 7°C en agar base sangre (ABS, Merck®, Alemania) con transferencias quincenales, activándose en caldo soya tripticaseína (CST, Bioxon®, México) con incubación a 35°C/24h. 1.3. Obtención de extracto acuoso a partir de los cálices de Jamaica.
Bajo condiciones asépticas 100 g de cálices de Jamaica fueron colocados en un matraz Erlenmeyer, a los cuales se les adicionó 900 ml_ de agua destilada, llevando a ebullición la mezcla durante 20 minutos. Una vez finalizado el tratamiento se dejó enfriar a temperatura ambiente. Los cálices fueron retirados del extracto (previa presión en las paredes del matraz para retirar el exceso de líquido de ello) y posteriormente el extracto se pasó por un tamiz No. 200 (MONTIMAX) para eliminar partículas. Finalmente se retiró toda el agua del extracto por rota evaporación empleado un rota evaporador (Buchi R-205) empleando las condiciones siguientes: temperatura de 40°C de la tina, rotación de 80 rpm y una presión a vacío de 72 mbar. El extracto seco se recuperó en un frasco estéril y se almacenó a temperatura ambiente hasta su uso.
1.4. Obtención de extracto metanólico y acetónico a partir de los cálices de Jamaica.
Bajo condiciones asépticas 100 g de cálices de Jamaica fueron colocados en un matraz Erlenmeyer, a los cuales se les adicionó 900 mL de metanol o acetona y se almacenaron durante 7 días a temperatura ambiente. Una vez finalizado el tratamiento los cálices fueron retirados del extracto (previa presión en las paredes del matraz para retirar el exceso de líquido de ello) y posteriormente el extracto se pasó por un tamiz No. 200 (MONTIMAX) para eliminar partículas. Finalmente se retiró todo el metanol o acetona del extracto por rota evaporación empleado un rota evaporador (Buchi R-205) empleando las condiciones siguientes: temperatura de 40°C de la tina, rotación de 80 rpm y una presión a vacío de 72 mbar. Los extractos secos (metanólico o acetónico) se recuperaron por separado en frasco estéril y se almacenó a temperatura ambiente hasta su uso.
1.5. Obtención de fracciones a partir del extracto metanólico mediante cromatografía en columna
Una vez que se ha obtenido el extracto seco (libre de solventes), éste se mezcló con silica (con el fin de hacer manejable el extracto, ya que este aun tenía humedad), este se agregó a la columna empaquetada. Se colocó algodón en el fondo de la columna con ayuda de una varilla para evitar que se desprendiera el gel de sílice cuando se abría la llave, se sujetó la columna con dos pinzas y se aseguró de tal manera que estuviera recta. Se mezcló el gel sílice con hexano aproximadamente 8:1g. (gel sílice: extracto), esta cantidad se mezcló con hexano hasta obtener una pasta fluida, se vertió la pasta en la columna, la cantidad de hexano agregada debió ser la suficiente para evitar que la silica se secará o ingresará aire a la pasta, posteriormente se agregó poco a poco el extracto, se le agregó una pequeña capa de sulfato de sodio (este sirve como secante), encima de este se le puso una capa de algodón para amortiguar la caída del disolvente al ser agregado y así evitar la dispersión del sulfato de calcio y el extracto, después de este procedimiento se llenó la columna con el disolvente (hexano) y se abrió la llave para comenzar a bajar las fracciones con las diferentes mezclas de solventes, recuperándolas en cantidades de 50 mi cada una, que posteriormente se evaporaron con ayuda del rotaevaporador, y estas fueron colocadas en viales, considerando cada una de estas como una fracción. Para cambiar la mezcla de solventes se realizó cromatografía en placa fina, y al encontrar diferencias claramente visibles (por la aparición de bandas distintas en tamaño y forma) entre fracciones la mezcla se cambiaron de menor a mayor polaridad (hexano, acetato de etilo y metanol) en la tabla 1 se muestran las mezclas de solvente utilizadas y con las que se eluyó.
Tabla 1. Solventes y mezclas utilizados para la obtención de fracciones a partir del extracto metanólico
Figure imgf000023_0001
De un total de 28.5 g de extracto metanólico se obtuvieron 193 fracciones de las cuales después de determinar la semejanza de las fracciones mediante cromatografía en capa fina se obtuvieron 7 colecciones de fracciones (Tabla 2). Tabla 2. Número de fracciones reunidas en cada colección obtenidas a partir del extracto metanólico
Figure imgf000024_0001
1.6. Obtención de fracciones a partir del extracto acetónico mediante cromatografía en columna.
Una vez que se ha obtenido el extracto seco (libre de solventes), éste se mezcló con silica (con el fin de hacer manejable el extracto, ya que este aun tenía humedad), este se agregó a la columna empaquetada. Se colocó algodón en el fondo de la columna con ayuda de una varilla para evitar que se desprendiera el gel de sílice cuando se abría llave, se sujetó la columna con dos pinzas y se aseguró de tal manera que estuviera recta. Se mezcló el gel sílice con cloroformo aproximadamente 8:1g. (gel sílice: extracto), esta cantidad se mezcló con cloroformo hasta obtener una pasta fluida, se vertió la pasta en la columna, la cantidad de cloroformo agregada debió ser la suficiente para evitar que la silica se secará o ingresará aire a la pasta, posteriormente se agregó poco a poco el extracto, se le agregó una pequeña capa de sulfato de sodio (este sirve como secante), encima de este se le puso una capa de algodón para amortiguar la caída del disolvente al ser agregado y así evitar la dispersión del sulfato de calcio y el extracto, después de este procedimiento se llenó la columna con el disolvente (cloroformo) y se abrió la llave para comenzar a bajar las fracciones con las diferentes mezclas de solventes, recuperándolas en cantidades de 50 mi cada una, que posteriormente se evaporaron con ayuda del rotaevaporador, y estas fueron colocadas en viáles, considerando cada una de estas como una fracción. Para cambiar la mezcla de solventes se realizó cromatografía en placa fina, y al encontrar diferencias entre fracciones la mezcla se cambiaron de menor a mayor polaridad (cloroformo-acetona) en la tabla 3 se muestran las mezclas de solvente utilizadas y con las que se eluyó. Tabla 3. Disolventes y mezclas utilizadas para la obtención de fracciones a partir del extracto acetónico
Figure imgf000025_0001
De un total de 20.5 g de extracto acetónico se obtuvieron 117 fracciones de las cuales después de determinar la semejanza de las fracciones mediante cromatografía en capa fina se obtuvieron 7 colecciones de fracciones (Tabla 4).
Tabla 4. Numero de fracciones reunidas en cada colección obtenidas a partir del extracto acetónico
Figure imgf000025_0002
Finalmente se retiró todo el metanol o acetona de cada colección por rota evaporación empleado un rota evaporador (Buchi R-205) empleando las condiciones siguientes: temperatura de 40°C de la tina, rotación de 80 rpm y una presión a vacío de 72 mbar. Las colecciones secas (metanólico o acetónico) se recuperaron por separado en frascos limpios y se almacenaron a temperatura ambiente hasta su uso. 1.7. Determinación de la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos, metanólico y acetónico, del acido acético, hipoclorito y de las fracciones correspondientes provenientes de los cálices de Jamaica en medio de cultivo (estudios in vitro).
1.7.1. Preparación del inóculo de las cepas.
Tubos de ensayo con cultivos de 24 h en CST de cada cepa R+, fueron centrifugados a 3500 rpm por 20 min. Posteriormente se desechó el sobrenadante; el paquete celular se resuspendió agregando 3 mL de solución salina isotónica estéril y se agitó en vortex por 10 s. El procedimiento anterior se repitió dos veces más. Posteriormente, la concentración de cada cepa fue de aproximadamente 1x109 UFC /mL. Finalmente cada cepa se diluyó decimalmente en solución salina isotónica una sola ocasión. 1.7.2. Preparación de las soluciones de los extractos o de las fracciones.
A partir de los extractos secos o fracciones (colecciones) secas se prepararon soluciones acuosas empleando agua destilada estéril o una solución de Polisorbato 80: agua en una proporción 20:80. Los extractos acuosos y metanólico y fracciones acetónicas (fracción III) y metanólicas (fracción IV) y se solubilizaron en agua destilada mientras que los extractos acetónicos y fracciones no polares o de polaridad baja fueron solubilizados en la solución de Polisorbato 80:agua. A el agua o a el polisorbato 80: agua se les agregaron los extractos secos o fracciones en una proporción 1 :10 y 1 :100 (agua:extracto ó agua:fracción) por separado y se depositarán en frascos estériles.
1.7.3 Efecto antimicrobiano de los extractos y las fracciones en medio de cultivo.
Por separado, 100 iL de la primera dilución de los cultivos de los patógenos fueron inoculados sobre cajas de AST suplementadas con 10 mg/L de el antibiótico rifampicina, el inoculo se distribuyó en toda la superficie del agar mediante la técnica de extensión por superficie. Sobre las cajas inoculadas, por separado, se colocaron alícuotas de 10 μί de la solución de los extractos (acuoso, metanólico o acetónico), o de las fracciones cromatográficas. Se realizaron cuatro repeticiones para cada tratamiento. Después de que el extracto o fracciones fueron absorbidos por el agar, las cajas de cultivo se incubaron a 35 ± 1°C, por 24 h. Finalmente se midió el diámetro de cada uno de los halos de inhibición formados en la superficie del medio inoculado.
1.8. Evaluación del efecto antimicrobiano de los extractos acuoso, metanólico, acetónico, fracciones cromatográficas y formulaciones especificas en la reducción de Salmonella y E. coli 0157:H7 en el manzana contaminada.
1.8.1. Preparación de las soluciones desinfectantes.
Las soluciones de extractos de cálices de Jamaica, mezclas a base de extractos y fracciones cromatográficas así como las mezclas conteniendo acido acético, hipoclorito y/o polisorbato 80 % fueron preparadas a las concentraciones, proporciones o mezclas que se describen en la Tabla 5. Por ejemplo, para preparar 100 mi de una solución conteniendo extracto metanólico de cálices Jamaica al 1 %, acido acético al 0.1 % y 100 mg/L de hipoclorito: a 100 mL de agua destilada se le agregó 1 g de extracto metanólico seco de cálices de Jamaica, además 1 mi de una solución de acido acético al 10 % y 0.2 mi de una solución de hipoclorito al 5 %.
18.2. Cepas.
Para éstos estudios se trabajó con 7 serotipos de Salmonella: (3 typhimuríum [ATCC 14028, uno aislado de tomate, J1 , y otro de semilla de alfalfa, GA1], Salmonella choleraesuis [ATCC 10708], typhi, geminara, y ontevideo) y 3 de E. coli 0157:H7 (dos aisladas en nuestro laboratorio a partir de carne cruda molida de res [P1C6 y M5C8] y otra aislada de un brote provocado por consumo de carne en los Estados Unidos de Norteamérica [E09]), esta cepa fue donada por el Dr. Eduardo Fernández Escartin de la Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo. A partir de las cepas nativas se obtuvieron cepas mutantes resistencia al antibiótico rifampicina (R+), esto para ser usadas en los estudios. Al incorporar el antibiótico al medio de cultivo para monitorear el comportamiento de las cepas mutantes se eliminaría la interferencia de la flora microbiana nativa de los extracto, fracciones y material vegetal de estudio (Castro- Rosas y Escartin, 2000).
1.8.3. Preparación del inóculo de las cepas.
Tubos de ensayo con cultivos de 24 h en CST de cada cepa R+, fueron centrifugados a 3500 rpm por 20 min. Posteriormente se desechó el sobrenadante; el paquete celular se resuspendió agregando 3 mL de solución salina isotónica estéril y se agitó en vortex por 10 s. El procedimiento anterior se repitió dos veces más. La concentración resultante de cada cepa fue de aproximadamente 1x109 UFC /mL. Un mililitro de cada cepa de Salmonella fue mezclado en un tubo de ensaye vacío para tener una mezcla de las 7 cepas de Salmonella examinadas. Lo mismo se realizó con las cepas de E. coli 0157:H7, para tener una mezcla de las tres cepas de E. coli 0157.Ή7.
Tabla 5. Tratamientos a los que fueron sometidas por separado manzanas contaminadas con las mezclas de las cepas de Salmonella o E. coli OI 57:H7
No Tratamientos
"1 Sin tratamiento (control) ~ "
2 Extracto acuoso 1%
3 Extracto acetónico 1%
4 Extracto metanólico 1%
5 Fracción acetónica 1%
6 Fracción metanólica 1%
7 Hipoclorito de sodio 100 ppm
8 Ácido acético 0.1 %
9 Ácido acético 0.5 %
10 Extracto acuoso 1 % + ácido acético 0.1%
11 Extracto acuoso 1 % + ácido acético 0.5%
12 Extracto acetónico 1 % + ácido acético 0.1%
13 Extracto acetónico 1% + ácido acético 0.5%
14 Extracto metanólico 1 % + ácido acético 0.1%
15 Extracto metanólico 1 % + ácido acético 0.5%
16 Fracción acetónica 1 % + ácido acético 0.1%
7 Fracción acetónica 1 % + ácido acético 0.5%
18 Fracción metanólica 1 % + ácido acético 0.1 %
19 Fracción metanólica 1% + ácido acético 0.5%
20 Extracto acuoso 1% + ácido acético 0.1% + hipoclorito de sodio 100 ppm
21 Extracto acuoso 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 100 ppm
22 Extracto acetónico 1 % + ácido acético 0.1 % + hipoclorito de sodio 100 ppm
23 Extracto acetónico 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 100 ppm
24 Extracto metanólico 1% + ácido acético 0.1% + hipoclorito de sodio 100 ppm
25 Extracto metanólico 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 100 ppm
26 Fracción acetónica 1% + ácido acético 0.1% + hipoclorito de sodio 100 ppm
27 Fracción acetónica 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 100 ppm
28 Fracción metanólica 1 % + ácido acético 0.1 % + hipoclorito de sodio 100 ppm
29 Fracción metanólica 1% + ácido acético 0.5% + hipoclorito de sodio 100 ppm
30 Extracto acuoso 1%+ácido acético 0.1%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 80 2%
31 Extracto acuoso 1%+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 80 2%
32 Extracto acetónico 1%+ácido acético 0.1%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 80 2%
33 Extracto acetónico 1%+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 80 2%
34 Extracto metanólicol %+ácido acético 0.1%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 80 2%
35 Extracto metanólicol %+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 802% 36 Fracción acetónica 1%+ác¡do acético 0.1%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 80 2%
37 Fracción acetónica 1%+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato 802%
38 Fracción metanólica1%+ácido acético 0.1%+hipoclorito de sodio100 ppm+Polisorbato 80 2%
39 Fracción metanólica1%+ácido acético 0.5%+hipoclorito de sodio 100 ppm+Polisorbato
80 2%
Para la elaboración de las soluciones se empleo como base:
A) el extracto seco de los cálices de Jamaica en la sección anterior, B) Solución de ipoclorito de sodio con el 5 % de hipoclorito libre, C) Ácido acético glacial al 10 %, d) Monooleato de Polioxietileno Sorbitan, o polisorbato 80 (Polisorbato 80), d) Agua destilada estéril a pH 6
1.8.4. Inoculación de las manzanas
Se utilizaron manzanas de la variedad Golden Delicious; los manzanas fueron obtenidos de un productor loca!. Previo a la inoculación, las manzanas fueron limpiadas con un paño limpio para retirar partículas de polvo. Se utilizaron Manzanas de un tamaño uniforme o semejante y que no presentaron daños visibles. Por separado, se inocularon manzanas individuales colocando en la parte central (no en pedúnculo) del fruto y gotas o alícuotas de 10 μί de una suspensión de cada tipo de mezcla de bacteria patógena (Salmonella ó E. coli 0157:H7) conteniendo aproximadamente 1 x 107 UFC, los 5 inóculos estuvieron cercanos sin llegar a confluir las manzanas inoculadas se colocaron en una charolas y se introdujeron en una campana bioclimática por dos horas a una humedad relativa de 90±1% y 26.5±1 °C. La finalidad de este tratamiento fue la de provocar la adherencia o infiltración de las células de las bacterias patógenas de estudio para simular las condiciones naturales, en otras palabras, la de tener un modelo que se asemejase en lo posible a lo que ocurre cuando las manzanas se contaminan por las fuentes de contaminación naturales o comunes con las bacterias patógenas. 1.8.5. Tratamiento de desinfección de las manzanas.
Después de las dos horas en la cámara bioclimática, cada fruto se lavó por separado para eliminar los microorganismos que no se adhirieron, el lavado consistió en sumergir y agitar la parte inoculada de la manzana en agua destilada por 10 s, se dejó escurrir la parte lavada a temperatura ambiente hasta sequedad total y posteriormente por separado la parte inoculada de diferentes manzanas se sumergió por 10 min en las diferentes soluciones desinfectantes señaladas en la Tabla 5. Un tratamiento solo con agua destilada sirvió como control positivo. 1.8.6. Recuento de microorganismos sobrevivientes a ios tratamientos
Después del tratamiento, las manzanas se retiraron de la solución desinfectante y para eliminar el desinfectante remanente se sumergió la parte inoculada en agua destilada por 10 s, posteriormente se corto la parte inoculada (un cuadro de aproximadamente 2 x 2 cm y con una profundidad de aprox. 2 cm) con ayuda de un bisturí estéril, cada porción se colocó de manera independiente en una bolsas de plástico y se adicionaron 10 mi de diluyente de peptona. Posteriormente, los materiales se agitaron manualmente presionando y frotando con fuerza la parte inoculada y toda la porción de la manzana desde la parte exterior de la bolsa por un minuto. Después de este tiempo se realizó el recuento de cada bolsa mediante la técnica de vertido en placa empleando agar para métodos estándar (Bioxon, México) adicionado de 100 mg/L de Rifampicina (Sigma, México), las cajas se incubaron a 35°C/24- 8 h. Este procedimiento se realizó por duplicado para cada replica. Cada tratamiento se efectuó por quintuplicado.
1.8.7. Análisis estadístico
Los resultados obtenidos se analizaron estadísticamente con un análisis de varianza de una sola vía (ANOVA) comparando las medias con la prueba de Tukey, con un nivel de significancia del 0.05.
1.9. Resonancia Magnética Nuclear (RMN) del extracto y de la colección IV
Se determinó el espectro de RMN del protón (1H) tanto del extracto metanólico seco obtenido de los cálices de Jamaica como de
Figure imgf000030_0001
de fracciones denominada como "IV" que fue obtenida a partir del extracto metanólico de los cálices de Jamaica y que fue la colección que se utilizó en las formulaciones.
También se obtuvo el espectro de RMN de Carbono (13C) solo de la colección de fracciones denominada como "IV" que fue obtenida a partir extracto metanólico de los cálices de Jamaica.
El extracto metanólico secos y/o la colección IV se solubilizaron en agua deuterada. Los espectros de RMN se obtuvieron utilizando un espectrómetro de resonancia magnética nuclear (Varían NMR, 400 MHz). La espectroscopia de RMN estudia los núcleos atómicos. Esta técnica espectroscópica puede utilizarse sólo para estudiar núcleos atómicos con un número impar de protones o neutrones (o de ambos), para determinar las estructuras de los compuestos orgánicos. Esta situación se da en los átomos de 1H, 13C, 19F y 31 P. Este tipo de núcleos son magnéticamente activos, es decir poseen espín, igual que los electrones, ya que los núcleos poseen carga positiva y poseen un movimiento de rotación sobre un eje que hace que se comporten como si fueran pequeños imanes. El espectrómetro de RMN detecta estas señales y las registra como una gráfica de frecuencias frente a intensidad, que es el llamado espectro de RMN
Ejempio 2. Efecto antimicrobiano de los extractos de los cálices de Jamaica.
Los tres tipos de extractos (acuoso, metanólico y acetónico) mostraron un acentuado efecto antimicrobiano (Tabla 6). Todos los microorganismos ensayados fueron inhibidos desde los primeros instantes de contacto. El efecto inhibitorio observado sugiere la presencia de substancias antimicrobianas en los extractos. Este efecto puede provocar un daño letal a la célula o solo causar un efecto subletal ó estrés celular (Busta, 1976). Distintos componentes del vegetal podrían ser los responsables de éste efecto antimicrobiano. Con la finalidad de separar, aislar y/o concentrar las sustancias antimicrobianas presentes en los extractos de los cálices de Jamaica, los extractos se separaron en diferentes compuestos o grupos de compuestos con base en su polaridad; para esto se recurrió a la separación de los compuestos por cromatografía en columna, de esta manera se obtuvieron diferentes grupos de compuestos o grupos de fracciones (colecciones de fracciones, ver metodología). Posteriormente se probó el efecto antimicrobiano de las colecciones de fracciones obtenidas. Debido a que el extracto acetónico y el metanólico tuvieron mayor efecto antimicrobiano que el extracto acuoso, no se separaron por cromatografía los componentes del extracto acuoso. Tabla 6. Efecto antimicrobiano del extracto acuoso de Jamaica diluido 1:10 y el de una solución de penicilina (control) sobre diferentes microorganismos Diámetro de Diámetro de Diámetro de Diámetro de
Tipo de inhibición inhibición inhibición inhibición microorganismo Extracto Extracto Extracto Penicilina acuoso acetónico metanólico (control)
E. co// 11* 13* 14 25
E. co//O157:H7 11 14 14 22
£. coli enteroinvasiva 11 11 13 25
£ coff enteropatógena 10 12 11 20
E. co/;'
11 12
enterotoxigénica 12 20
S. aureus 11 13 14 26
V. cholerae OI 11 14 14 22
S. Typhimurium 12 14 14 24
S. Choleraesuis 11 12 12 20
P. aeruginosas 11 13 14 21
S. flexneri 10 12 14 22
S. sonnei 12 14 13 24
L. monocytogenes 10 13 14 23
* (mm)
Ejemplo 3. Efecto antimicrobiano de diferentes fracciones cromatográficas.
En las Tabla 7 se muestra el efecto inhibitorio expresado en longitud del halo de inhibición en milímetros (mm), que se observó en cajas de petri sembradas con diferentes microorganismos, por el efecto de diferentes colecciones de fracciones cromatográficas agrupadas por polaridad obtenidas a partir del extracto acetónico de los cálices de Jamaica. Se observa que sólo las colecciones II y III provenientes de extracto acetónico muestran efecto antimicrobiano o inhibitorio. La colección III es la que mostró el mayor efecto antimicrobiano (Tabla 7). Esta fracción III se utilizó para realizar las mezclas o formulaciones que se utilizaron en los experimentos de desinfección de las manzanas. Tabla 7. Efecto antimicrobiano de colecciones acetónica Tipo de Colecció Colecció Colección Colecció Colecció Colecció Colección bacteria n i n ll III n IV n V n VI VII
S.
0 0 14 0 0 0 0
Choleraesuis
E. coli
0 9 * 8 0 0 0 0
0157:H7
S. flexneri 0 19 25 0 0 0 0
S. aureus 0 13 12 0 0 0 0
S.
0 22 18 0 0 0 0
Typhimurium
L
monocytogen 0 18 22 0 0 0 0 es
S. epidermis 0 13 21 0 0 0 0
P.
0 14 19 0 0 0 0 aeruginosas
Bordetella 0 0 12 0 0 0 0
S. sonnei 0 11 18 0 0 0 0 * Halo de inhibición expresado en milímetros (mm); el Cero (0) significa que no se observo efecto inhibitorio.
En las Tabla 8 se muestra el efecto inhibitorio en mm de diferentes colecciones de fracciones cromatográficas agrupadas por polaridad obtenidas a partir del extracto metanólico de los cálices de Jamaica. Se observa que todas las colecciones provocaron halos de inhibición lo cual se interpreta como efecto antimicrobiano de las colecciones. No obstante, la colección IV es la que ¿aosfcó-^el mayor efecto antimicrobiano (Tabla 8). Esta fracción IV se utilizó para realizar las mezclas o formulaciones que se utilizaron en los experimentos de desinfección de las manzanas. Ejemplo 4. Potencial desinfectante de los extractos y fracciones solos o en mezclas con ácido acético, hipoclorito de sodio y/ó Polisorbato 80.
Se encontró que todos los tratamientos tuvieron efecto antimicrobiano con respecto al control. Los datos de este estudio se encuentran reportados en la tabla 9. Se observa que aunque todos los tratamientos muestran efecto antimicrobiano sólo 4 combinaciones lograron eliminar a niveles no detectables la concentración de las mezclas de cada patógeno: los tratamientos 32, 33, 36 y 37 redujeron 5 log concentración de ambos patógenos (Tabla 9).
Tabla 8. Efecto antimicrobiano de colecciones metanólicas
Tipo de Colecció Colecció Colecció Colección Colecció Colecció Colección bacteria n i n II n III IV n V n VI VII
L
monocytogen 6 10 15 24 12 11 15 es
S. sonnei 8 11 10 30 10 12 6
P.
6 10 11 22 8 8 7 aeruginosas
s.
10 12 13 36 9 13 6
Choleraesuis
S. fíexnerí 14 29 10 12 8
S.
11 32 12 10 10
Typhimurium
Bordetella 10 23 9 13 6
E. co//'
17 20 26 14 11 6
0157.H7
S. aumus 13 22 17 30 11 10 7
S.
6 15 12 28 10 12 6 epidermidis
* Halo de inhibición expresado en milímetros (mm); el Cero (0) significa que no se observo efecto inhibitorio
En la presente invención, 4 combinaciones específicas (tratamiento 32, 33, 36 y 37) de tres antimicrobianos y un tensoactivo (polisorbato) se logró la eliminación total de los microorganismos patógenos inoculados sobre las manzanas; esto es un ejemplo de lo que actualmente se conoce como tratamiento de barreras múltiples. Las barreras múltiples son la combinación de tratamientos antimicrobianos que potencian el efecto antimicrobiano global, lo que da como resultado alimentos estables, seguros e inocuos. Por alguna razón, ya al aplicar los extractos acetónicos o las fracciones en o ©
O C C
CD a. (fí (fí Q.
3" 3
3 (ñ 3 <t> o O—i O
O
3 3
1.90 ±0.30
1.50 ±0.30 8 U s 3r
o a ·< ±0.30 1.50 ±0.30 o 8
±0.30 1.20 ±0.30 3 g- (fí CD
0.0 Q. 3 s 3r Q co
CD
1.40 ±0.20 C o ±0.30 CD
CD CD CD
Figure imgf000035_0001
Cabe señalar el posible papel potenciador del polisorbato 80 en el efecto antimicrobiano observado, ya que al ser un tensoactivo es posible que haya favorecido la emulsificación de la cera natural de las manzanas lo cual pudo incrementar el efecto de la solución desinfectante al eliminar o disminuir el efecto protector que la cera estaría proporcionando a los microorganismos inoculados sobre las manzanas
Por lo anterior, las composiciones de la presente invención son una excelente alternativa para la desinfección y/o preservación de alimentos, por ejemplo alimentos frescos, sin que alteren sus propiedades nutritivas. En este sentido, las composiciones descritas aquí, permiten la desinfección efectiva de microorganismos patógenos de frutas y hortalizas, preferentemente manzanas permitiendo el consumo seguro de tales productos.
Ejemplo 5. Espectro de resonancia magnético nuclear (RMN) obtenido del extracto acetónico seco.
El espectro de RMN obtenido del extracto acetónico seco de los cálices de Jamaica se presenta en la Figura 1. En el espectro se observan varios picos característicos del extracto que utilizamos en las formulaciones. Este espectro caracteriza el extracto acetónico usado en las formulaciones antimicrobianas de la tabla 9.
Ejemplo 6. Espectro de resonancia magnético nuclear (RMN) obtenido de la colección cromatográfica III proveniente del extracto acetónico.
De la colección cromatográfica III obtenida a partir del extracto acetónico, se obtuvo el espectro de RMN (Figura 2). Se observan varios y diferentes picos característicos de la colección cromatográfica que utilizamos en las formulaciones. Este espectro caracteriza a la colección cromatográfica III usada en las formulaciones antimicrobianas de la tabla 9. Referencias.
1. Adams M. R. 1997. Microbiología de los alimentos. Editorial Acribia S.A. 2. Álvarez M.B.L 1998. Contaminación, sobrevivencia y desarrollo de Listería monocytogenes durante el procesamiento de brócoli precocido y congelado. Tesis de maestría. Universidad Autónoma de Querétaro.
3. Aziz NH, Farag SE, Mousa LA, and Abo-Zaid MA. 1998. Comparative antibacterial and antifungal effects of some phenolic compounds. Microbios. 93:43-54.
4. Bartz, J. A. 1982. Infiltration of tomatoes immersed at different temperaturas to different depths in suspensions of Erwinia carotovora subsp. carotovora. Plant Dis. 66:302-306.
5. Bartz, J. A., and R. K. Showalter. 1981. Infiltration of tomatoes by aqueous bacterial suspensions. Phytopathology. 71 :515-518.
6. Castañeda-Ramírez, C, Cortes-Rodríguez, V., de la Fuente-Salcido, N., Bideshi, D.K., del Rincón-Castro, M.C., Barboza-Corona, J.E. 2011. Isolation of Salmonella spp. from lettuce and evaluation of its susceptibility to novel bacteriocins of Bacillus thuringiensis and antibiotics. J. Food Prot. 74(2):274-278.
7. Castro-Rosas, J. and Escartín, E.F. 1999. Incidence and germicide sensitivity of Salmonella typhi and Vibrio cholerae OI in alfalfa sprouts. J. Food Safety. 19:137- 146.
8. Castro-Rosas, J., Escartín, E.F., 2000. Survival and growth of V. cholerae 01 , S. typhi and £. coli 0157:H7 in alfalfa sprouts. J. Food Sci. 65:162-165.
9. Castro-Rosas, J., Cerna-Cortés, J.F., Méndez-Reyes, E., Lopez-Hernandez, D., Gómez- Aldapa, C.A., Estrada-García, T. 2012. Presence of faecal coliforms, Escheríchia coli and diarrheagenic E. coli pathotypes in ready-to-eat salads, from an área where crops are irrigated with untreated sewage water. Int. J. Food Microbiol.156: 176-180.
10. CDC (Centers for Disease Control and Prevention). 2005. Epidemiology of Escheríchia coli 0157:H7 Outbreaks, United States, 1982-2002 Available at: httD://wwwnc.cdc.aov/eid/article/11/4/pdfs/04-0739.pdf Consultado: Diciembre 1 , 2013.
11. Changa, J.M., and Fang T.J. 2007. Survival of Escheríchia coli 0157.Ή7 and Salmonella entérica serovars Typhimurium in iceberg lettuce and the antimicrobial effect of rice vinegar against E. coli 0157:H7 Food Microbiol. 24:745-751.
12. Cruz-Gálvez, A. M., C. A Gómez-Aldapa, J. R. Villagómez-lbarra, N. Chavarría- Hernández, J. Rodríguez-Baños, E. Rangel-Vargas, and J. Castro-Rosas. 2013. Antibacterial effect against foodborne bacteria of plants used in traditional medicine in central México: Studies in vitro and in raw beef. Food Control. 32:289-295.
13. Das, E., G. C. Gurakan, and A. Bayinirli. 2003. Effect of controlled atmosphere storage, modified atmosphere packaging and gaseous ozone treatment on the survival of S. enteritidis on cherry tomatoes. Food Microbiol. 23:430-438.
14. Fernández E.E. 2000. Microbiología e inocuidad de los Alimentos. Universidad Autónoma de Querétaro. México.
15. Fernández MA, García MD, and Sáenz MT. 1996. Antibacterial activity of the phenolic acids fractions of Scrophularia frutescens and Scrophutaría sambucifolia. J Ethnopharmacol. 53:11-14.
16. Fisher T,L, and David A. Golden. 1998. Fate of Escherichia co1i 0157:H7 in Ground Apples Used in Cider Production. J Food Protect. 61:1372-1374.
17. Friedman, M., P. R. Henika, and R. E. Mandrell. 2002. Bactericidal activities of plant essential oils and some of their isolated constituents against Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, and Salmonella entérica. J. Food Prot. 65:1545-1560.
18. Guo, X., J. Chen, R. E Brackett, and L. R. Beuchat. 2002. Survival of Salmonella on tomatoes stored at high relative humidity, in soil, and on tomatoes in contact with soil. J. Food Prot. 65:274-279.
19. Harmon, S. M., Kautter, D. A. y Solomon, H. M. 1987. Bacillus cereus contamination of seeds and vegetables sprouts grown in home sprouting kit. J. Food Prot. 50:62-65.
20. Ibarra-Sanchez, L. S., S. Alvarado-Casillas, M. O. Rodriguez-Garcia, N. E.
Martinez-Gonzales, and A. Castillo. 2004. Internalization of bacterial pathogens in tomatoes and their control by selected Chemicals. J. Food Prot. 76:1353-1358.
21. Iturriaga, M. H., M. L. Tamplin, and E. F. Escartín. 2007. Colonization of tomatoes by Salmonella Montevideo is affected by relative humidity and storage temperature. J. Food Prot. 70:30-34.
22. Jongen, W.M.F. 2005. Improving the Safety of Fresh Fruit and Vegetables.
Publication: Cambridge Woodhead Publishing.
23. Kang PS, Seok JH, Kim YH, Eun JS, and Oh SH. 2007. Antimicrobial and antioxidative effects of roselle (Hibiscus sabdariffa L.) flower extract and its fractions on skin microorganisms and oxidation. Food Sci Biotechnol. 16:409-414. 24. Kroupitski, Y., Pinto, R., Brandl, M.T., Belausov, E., and Sela, S. 2009. Interactions of Salmonella entérica with lettuce leaves. J. Appl. Microbiol. 106:1876-1885.
25. Lelieveld H.L.M., Holah, J., Napper, D. 2013. Hygiene in food processing: Principies and practice- Woodhead Publishing Limited.
26. Lin, C. M., J. J. Kim, W. X. Du, and C. I. Wei. 2000. Bactericidal activity of isothiocyanate against pathogens on fresh produce. J. Food Prot. 63:25-30.
27. Muñoz M. 2003. Aplicación de nuevos agentes antimicrobianos para controlar la seguridad de productos vegetales frescos precortados (IV gama). Tesis Doctoral,
Departamento de Química Física Aplicada, Universidad Autónoma de Madrid.
28. Pijpers, D., Constant, J. G., Jansen, K. 1986. The Complete Book of Fruit.
Multimedia Publications (UK) Ltd., London
29. Rameshkumar, K. B., V. George, and S. Shiburaj. 2007. Chemical constituents and antibacterial activity of the leaf oil of Cinnamomum chemungianum Mohán et Henry.
J. Essent. Oil Res. 19:98-100.
30. Roller, S. 2003. Natural Antimicrobials for the Minimal Processing of Foods.
Woodhead Publishing. Cambridge, England.
31. Russell A.D., Hugo W.B., Ayliffe G.A.J., Fraise, Adam P., Lambert, Peter A.,
Maillard J.Y. 2004. Principies and Practice of Disinfection, Preservation and
Sterilization. Malden, Mass Blackwell Publishing.
32. SAGARPA (Secretaria de Agricultura, Ganadería, Recursos naturales, Pesca y
Alimentación). 2013. Cierre de la producción agrícola por cultivo, México. Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera. Available at: http://wwv. siap.gob. mx/index. php?opti
50 consultado: Noviembre 23, 2013.
33. Tajkarimi MM, Ibrahim SA, and Cliver DO. 2010. Antimicrobial herb and spice compounds in food. Food Control. 21 :1199-1218.
34. Yucel S.l. and Karapinar M. 2005. Effectiveness of household natural sanitizers in the elimination of Salmonella Typhimurium on rocket (Enica sativa Miller) and spring onion (Allium cepaL). Int. J. Food Microbiol. 9:319-323.
35. Yuk, H.-G., J. A. Bartz, and K. R. Schneider. 2005. Effectiveness of individual or combined sanitizer treatments for inactivating Salmonella spp. on smooth surface, stem scar, and wounds of tomatoes. J. Food Sci. 70:M409-M414. Zhuang, R. Y., and L. R. Beuchat. 1995. Fate of Salmonella Montevideo on and in raw tomatoes as affected by temperature and treatment with chlorine. Appl Environ Microbiol. 61 :2127-2131.

Claims

REIVINDICACIONES Habiendo descrito suficientemente mi invención, considero como una novedad y por lo tanto reclamo como de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes cláusulas:
1. Una solución con actividad antimicrobiana para desinfectar y/o preservar manzanas (Malus domestica), caracterizada porque comprende: a) Extracto acetónico de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa);
b) Ácido acético;
c) Hipoclorito de Sodio;
d) Monooleato de Polioxietileno Sorbitan, o polisorbato 80 (Polisorbato 80)
2. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el a) extracto acetónico de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) está presente en una concentración entre 0.01% al 10%. '
3. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el b) ácido acético está presente en una concentración entre
0.01 a 10%.
4. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el c) hipoclorito de Sodio está presente en una concentración entre 10 a 1000 ppm.
5. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el d) monooleato de Polioxietileno Sorbitan, o polisorbato 80 está presente en una concentración entre 0.1 a 10 %.
6. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el e) extracto acetónico de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) presenta un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) como se observa en la Figura 1.
7. La solución de la reivindicación 1, caracterizada porque tiene una presentación como formulación acuosa.
8. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque donde una o varias partes de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) pueden ser usadas para la obtención del extracto.
9. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, donde la parte de la planta de Jamaica que se emplea son los cálices.
10. La solución definida en las reivindicaciones anteriores, caracterizada por un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) del extracto acetónico obtenido de los cálices de la Jamaica {Hibiscus sabdariffa) (Figura 1).
11. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque es útil como desinfectante y conservador de alimentos de origen vegetal y animal.
12. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la formulación acuosa es útil como desinfectante y conservador de frutas y verduras, especialmente manzanas.
13. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque las principales variedades de manzana (Malus domestica) sobre las que actúa como desinfectante se seleccionan de Golden Delicious, Red Delicious, Criolla, Red Chief, Rome Beauty, Starking, Starking Delicious, Top Red, Akane, Ambrosia, Arkansas Black, Blackjohn Braeburn, Bramley, Carneo, Cortland, Cox's Orange, Pippin, Crabapple, Criterion, Egremont Russet, Empire, Esperiega, Fuji, Gala, Ginger Gold, Granny Smith, Gravenstein, Honeycrisp, Idared, Jazz, Jonagold, Jonathan, Lodi, Mclntosh, Newtown/Pippin, Oíd Apple, Pacific Rose, Pink lady, Pinova, Red El, Reineta, Rome Beauty, Royal Gala, Splendor, Spur, Starkrimson, Starking, Verde doncella, Willie Sharp, Winesap, Winter Banana, Worcester, Permain.
14. Un método para la desinfección y/o preservación de manzanas (Malus domestica), caracterizado porque comprende aplicar a la manzana la solución definida en las reivindicaciones anteriores.
15. Un extracto vegetal con actividad antimicrobiana para desinfectar y/o preservar manzanas (Malus domestica), caracterizado porque es obtenido mediante las siguientes etapas: a) Colocar la planta seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir acetona y almacenar a 22° ± 2o C por 7 días,
b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar la acetona del extracto, y
c) Recuperar el extracto seco.
16. El extracto de la reivindicación 15, caracterizado porque se obtiene con acetona.
17. El extracto de conformidad con la reivindicación 15, porque donde una o varias partes de la planta pueden ser usadas para la obtención del extracto.
18. Ei extracto de la reivindicación 5, caracterizado porque la planta es la planta de Jamaica (Hibiscus sabdariffa).
19. El extracto de la reivindicación 15 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el extracto es obtenido de los cálices de la Jamaica.
20. El extracto de la reivindicación 15 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque presenta un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) como se observa en la Figura 1.
21. El extracto de la reivindicación 15 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque es útil como desinfectante y conservador de alimentos de origen animal y vegetal.
22. El extracto de la reivindicación 15 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque es útil como desinfectante y conservador de frutas y verduras, preferentemente manzanas.
23. El extracto de la reivindicación 15 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las principales variedades de manzana (Malus domestica) sobre las que actúa como desinfectante se seleccionan de Golden Delicious, Red Delicious, Criolla, Red Chief, Rome Beauty, Starking, Starking Delicious, Top Red, Akane, Ambrosia, Arkansas Black, Blackjohn Braeburn, Bramley, Carneo, Cortland, Cox's Orange, Pippin, Crabapple, Criterion, Egremont Russet, Empire, Esperiega, Fuji, Gala, Ginger Gold, Granny Smith, Gravenstein, Honeycrisp, Idared, Jazz, Jonagold, Jonathan, Lodi, Mclntosh, Newtown/Pippin, Oíd Apple, Pacific Rose, Pink lady, Pinova, Red El, Reineta, Rome Beauty, Royal Gala, Splendor, Spur, Starkrimson, Starking, Verde doncella, Willie Sharp, Winesap, Winter Banana, Worcester, Permain.
24. Un método para la desinfección y/o preservación de manzana (Malus domestica), caracterizado porque comprende aplicar a las manzanas el extracto definido en las reivindicaciones de la 15 a la 23.
25. Un método para obtener un extracto vegetal con actividad antimicrobiana para desinfectar y/o preservar manzana (Malus domestica), caracterizado porque comprende las siguiente etapas: a) Colocar la planta seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir acetona y almacenar a 22° ± 2o C por 7 días,
b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar el metanol del extracto, y
c) Recuperar el extracto seco.
26. El método para obtener el extracto vegetal de la reivindicación 25, caracterizado porque el extracto puede tener una presentación sólida o liquida.
27. Un método para la preparación de una solución con actividad antimicrobiana para desinfectar y/o preservar manzanas (Malus domestica), caracterizado por comprender los pasos de: a) Colocar Jamaica (Hibiscus sabdariffa) seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir acetona y almacenar a 22° ± 2o C por 7 días,
b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar la acetona del extracto y,
c) Recuperar el extracto seco,
d) Preparar la solución acuosa en un recipiente conteniendo: agua, extracto acetónico seco de la planta, ácido acético, hipoclorito de sodio y monooleato de Polioxietileno Sorbitan o polisorbato 80,
28. El método conforme a la reivindicación 27, donde la parte de la planta de Jamaica que se emplea son los cálices.
29. Una solución con actividad antimicrobiana para desinfectar y/o preservar manzanas (Malus domestica), caracterizada porque comprende: a) Una colección de fracciones cromatográficas obtenida de un extracto acetónico de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa);
b) Ácido acético;
c) Hipoclorito de Sodio;
d) Monooleato de Polioxietileno Sorbitan, o polisorbato 80 (Polisorbato 80).
30. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la a) colección de fracciones cromatográficas obtenida de un extracto acetónico de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) está presente en una concentración entre 0.01% al 10%.
31. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el b) ácido acético está presente en una concentración entre 0.01 a 10%.
32. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el c) hipoclorito de sodio está presente en una concentración entre 10 a 1000 ppm.
33. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el d) monooleato de Polioxietileno Sorbitan, o polisorbato 80 está presente en una concentración entre 0.1 a 10 %.
34. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la e) colección de fracción cromatográfica obtenida de un extracto acetónico de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) presenta un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) como se observa en la Figura 2.
35. La solución de la reivindicación 29, caracterizada porque tiene una presentación como formulación acuosa.
36. La solución de la reivindicación 29 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque donde una o varias partes de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) pueden ser usadas para la obtención de las colecciones de fracciones cromatográficas.
37. La solución de la reivindicación 29 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, donde la parte de la planta de Jamaica que se emplea son los cálices.
38. La solución de la reivindicación 29 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada por un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) de la colección de fracciones cromatográficas obtenida de un extracto acetónico de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) (Figura 2).
39. La solución de la reivindicación 29 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque es útil como desinfectante y conservador de alimentos de origen vegetal y animal.
40. La solución de la reivindicación 29 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la formulación acuosa es útil como desinfectante y conservador de frutas y verduras, especialmente manzanas.
41. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque las principales variedades de manzana (Malus domestica) sobre las que actúa como desinfectante se seleccionan de Golden Delicious, Red Delicious, Criolla, Red Chief, Rome Beauty, Starking, Starking Delicious, Top Red, Akane, Ambrosia, Arkansas Black, Blackjohn Braeburn, Bramley, Carneo, Cortland, Cox's Orange, Pippin, Crabapple, Criterion, Egremont Russet, Empire, Esperiega, Fuji, Gala, Ginger Gold, Granny Smith, Gravenstein, Honeycrisp, Idared, Jazz, Jonagold, Jonathan, Lodi, Mclntosh, Newtown/Pippin, Oíd Apple, Pacific Rose, Pink lady, Pinova, Red El, Reineta, Rome Beauty, Royal Gala, Splendor, Spur, Starkrimson, Starking, Verde doncella, Willie Sharp, Winesap, Winter Banana, Worcester, Permain.
42. Un método para la desinfección y/o preservación de manzanas (Malus domestica), caracterizado porque comprende aplicar a la manzana la solución definida en las reivindicaciones 29 a la 41.
43. Una colección de fracciones cromatográficas con actividad antimicrobiana para desinfectar y/o preservar manzana (Malus domestica), caracterizada porque es obtenido mediante las siguientes etapas: a) Colocar la planta seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir acetona y almacenar a 22° ± 2o C por 7 días,
b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar la acetona del extracto,
c) Recuperar el extracto seco, d) Efectuar cromatografía para separar el extracto acetónico seco en fracciones cromatográficas utilizando solventes y mezclas de solventes de diferentes polaridades,
e) Recuperar en recipientes fracciones cromatográficas de diferentes polaridades, f) Retirar el solvente de las fracciones,
g) Agrupar o reunir en recipientes las fracciones para formar grupos (colecciones) de polaridades iguales o semejantes,
h) Efectuar ensayos microbiológicos con las colecciones,
i) Recuperar las colecciones de fracciones con actividad antimicrobiana
44. La colección de fracciones cromatográficas de conformidad con la reivindicación 43, porque donde una o varias partes de la planta pueden ser usadas para la obtención de la colección de fracciones cromatográficas.
45. La colección de fracciones cromatográficas de la reivindicación 43 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la planta es la Jamaica (Hibiscus sabdariffa).
46. La colección de fracciones cromatográficas de la reivindicación 43 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque las fracciones son obtenidas de los cálices de la Jamaica.
47. La colección de fracciones cromatográficas con actividad antimicrobiana de la reivindicación 43 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la colección presenta un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) como se observa en la Figura 2.
48. La colección de fracciones cromatográficas de la reivindicación 43 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque es útil como desinfectante y conservador de alimentos de origen animal y vegetal.
49. La colección de fracciones cromatográficas de la reivindicación 43 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque es útil como desinfectante y conservador de frutas y verduras, preferentemente manzanas.
50. La colección de fracciones cromatográficas con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 43 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque las principales variedades de manzana (Malus domestica) sobre las que actúa como desinfectante se seleccionan de Golden Delicious, Red Delicious, Criolla, Red Chief, Rome Beauty, Starking, Starking Delicious, Top Red, Akane, Ambrosia, Arkansas Black, Blackjohn Braeburn, Bramley, Carneo, Cortland, Cox's Orange, Pippin, Crabapple, Criterion, Egremont Russet, Empire, Esperiega, Fuji, Gala, Ginger Gold, Granny Smith, Gravenstein, Honeycrisp, Idared, Jazz, Jonagold, Jonathan, Lodi, Mclntosh, Newtown/Pippin, Oíd Apple, Pacific Rose, Pink lady, Pinova, Red El, Reineta, Rome Beauty, Royal Gala, Splendor, Spur, Starkrimson, Starking, Verde doncella, Willie Sharp, Winesap, Winter Banana, Worcester, Permain.
51. El método para desinfectar y/o conservar frutas y verduras, preferentemente manzanas con la colecciones de fracciones cromatográficas con actividad antimicrobiana del extracto de los cálices de Jamaica definida en las reivindicación de la 43 a la 50.
52. Un método para obtener colecciones de fracciones cromatográficas con actividad antimicrobiana a partir de un extracto vegetal para desinfectar y/o preservar manzana (Malus domestica), caracterizado porque comprende las siguiente etapas: a) Colocar la planta seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir acetona y almacenar a 22° ± 2o C por 7 días,
b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar la acetona del extracto,
c) Recuperar el extracto seco,
d) Efectuar cromatografía para separar el extracto acetónico seco en fracciones cromatográficas utilizando solventes y mezclas de solventes de diferentes polaridades,
e) Recuperar en recipientes fracciones cromatográficas de diferentes polaridades, f) Retirar el solvente de las fracciones, g) Agrupar o reunir en recipientes las fracciones para formar grupos (colecciones) de polaridades iguales o semejantes,
h) Efectuar ensayos microbiológicos con las colecciones,
i) Recuperar las colecciones de fracciones con actividad antimicrobiana.
53. El método conforme a la reivindicación 52, caracterizado porque las colecciones de fracciones puede tener una presentación sólida o liquida.
54. Un método para la preparación de una solución con actividad antimicrobiana para desinfectar y/o preservar manzana (Malus domestica), caracterizado por comprender los pasos de: a) Colocar la planta de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir acetona y almacenar a 22° ± 2o C por 7 días, b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar la acetona del extracto,
c) Recuperar el extracto seco,
d) Efectuar cromatografía para separar el extracto acetónico seco en fracciones cromatográficas utilizando solventes y mezclas de solventes de diferentes polaridades,
e) Recuperar en recipientes fracciones cromatográficas de diferentes polaridades, f) Retirar el solvente de las fracciones,
g) Agrupar o reunir en recipientes las fracciones para formar grupos (colecciones) de polaridades iguales o semejantes,
h) Efectuar ensayos microbiológicos con las colecciones,
i) Recuperar las colecciones de fracciones con actividad antimicrobiana, j) Preparar la solución acuosa en un recipiente conteniendo: agua, colecciones de fracciones cromatográficas con actividad antimicrobiana, ácido acético, hipoclorito de sodio y monooleato de Polioxietileno Sorbitan o polisorbato 80.
55. El método conforme a la reivindicación 54, donde la parte de la planta de Jamaica que se emplea son los cálices.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JPH0646812A (ja) * 1992-08-05 1994-02-22 Hitoshi Nishiyama 食品の洗浄殺菌方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ELSAYED, M. A. ET AL.: "Antimicrobial activity of Roselle (Hibiscus sabdariffa) calyces and clove (Syzygium aromaticum) buds-water extracts using different extraction conditions.", ADVANCES IN FOOD SCIENCIES, vol. 33, no. 3, 2011, pages 141 - 145 *
FULLERTON M ET AL.: "Determination of antimicrobial activity of sorrel (Hibiscus sabdariffa) on Escherichia coli 0157:H7 isolated from food, veterinary, and clinical samples.", JOURNAL OF MEDICINAL FOOD, vol. 14, no. 9, 2011, pages 950 - 956 *
MORALES-CABRERA M ET AL.: "Influence of variety and extraction solvent on antibacterial activity of roselle (Hibiscus sabdariffa L.) calyxes.", JOURNAL OF MEDICINAL PLANTS RESEARCH, vol. 7, no. 31, August 2013 (2013-08-01), pages 2319 - 2322 *

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