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WO2015088308A1 - SOLUCIONES FITOQUÍMICAS ÚTILES COMO DESINFECTANTES DE TOMATES (Solanum lycopersicum) - Google Patents

SOLUCIONES FITOQUÍMICAS ÚTILES COMO DESINFECTANTES DE TOMATES (Solanum lycopersicum) Download PDF

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WO2015088308A1
WO2015088308A1 PCT/MX2014/000197 MX2014000197W WO2015088308A1 WO 2015088308 A1 WO2015088308 A1 WO 2015088308A1 MX 2014000197 W MX2014000197 W MX 2014000197W WO 2015088308 A1 WO2015088308 A1 WO 2015088308A1
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WO
WIPO (PCT)
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extract
solution
fractions
tomatoes
plant
Prior art date
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PCT/MX2014/000197
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English (en)
French (fr)
Inventor
Javier CASTRO ROSAS
Carlos Alberto GÓMEZ ALDAPA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE HIDALGO
Original Assignee
UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE HIDALGO
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Publication date
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    • A23V2250/21—Plant extracts

Definitions

  • the present invention relates to the development of compositions containing phytochemicals present in plant extracts that are used as disinfectants and preservatives for food, for example of plant and animal origin; more particularly to aqueous solutions based on methanolic extracts or chromatographic fractions of Jamaican chalices (Hibiscus sabdariffa), the method by which they are obtained and their uses as effective solutions to eliminate pathogenic bacteria from fruits, vegetables and vegetables, but with the most High effectiveness for tomato (Solanum lycopersicum).
  • tomatoes have been implicated in Salmonella outbreaks at least seventeen times in the period from 1990 to 2010 (Table 1).
  • tomatoes are not consumed directly as they are harvested. After harvesting either in the field or in the industry (and even at home) they receive various treatments that tend to favor their conservation and / or safety.
  • the application of washing and disinfection of tomato improves its microbial image.
  • the prevention of fruit contamination is also a control strategy because the growth of pathogens is not required to cause disease. Therefore, additional control measures may be of value.
  • the behavior of pathogenic microorganisms in tomatoes is affected by the location of the pathogen in the fruit, the quality of tomato, the temperature of Storage, type of packaging, and relative humidity. Tomatoes usually have a low acidity that limits the growth of pathogens during storage at refrigeration temperatures.
  • the microorganisms that constitute native fungal populations and yeast in raw tomatoes could increase the pH of pericarp tissues to a level that favors the growth of pathogenic bacteria during storage (Wade and Beuchat, 2003).
  • the disinfection process refers to the physical destruction of microorganisms whose activity compromises the safety or sensory characteristics of a food.
  • the effect can be achieved through physical or chemical means, its effectiveness depending on the microorganisms (type and number), the substrate on which they are (presence of organic matter), the structure of the material (which allows direct access from germicide to microorganisms) and germicide (concentration, temperature and contact time) (Fernández, 2000).
  • the germicidal substance participates in chemical reactions, so that the greater the number of microorganisms, the greater the demand of the agent to achieve a total inactivation of the population.
  • a germicide it is common for a germicide to be considered effective when it demonstrates the ability to inactivate at least 3 Log 10 of a microorganism suspension in 30s (Fernández, 2000).
  • Chlorine-based solutions are a cheap and available disinfectant as hypochlorite or in its slow-release forms (chloramines, for example) (Lelieveld et al. 2013). Hypochlorites have a broad spectrum of antibacterial activity, although they are less effective against spores than against non-spore-forming bacteria and have a low effect against mycobacteria (Russell et al., 2004). Chlorine solutions, such as sodium hypochlorite or chlorine dioxide, are widely used by the food industry as a disinfectant. Both are strong oxidants that act at the level of membranes and other cellular constituents (Harmon et al., 1987). However, the former has the disadvantage of reacting easily with organic matter, so it is inactivated faster.
  • the interference is minimal (Castro-Rosas and Escartin, 1999).
  • the main disadvantage of sodium hypochlorite is that humidity, heat, light and especially the presence of organic matter increase the loss rate of free chlorine.
  • the germicidal activity of chlorine has generally been attributed to hypochlorous acid (HOCI), which is generated in aqueous solutions of sodium hypochlorite and other chlorine-containing compounds.
  • Disinfectants can be incorporated into the wash water and thus contribute to the reduction of the microbial load.
  • the effectiveness of hypochlorite is not only affected by the exposure time and concentration of free chlorine, but also by other factors such as temperature, pH, type of strain, as well as presence and type of organic matter ( ⁇ lvarez, 1998).
  • some authors point out that the efficiency of hypochlorite in reducing pathogenic microorganisms present in vegetables is limited (Adams et al., 1997).
  • Organic acids have traditionally been used as food preservatives or in solutions to disinfect raw vegetables. Its antimicrobial effect is exerted through the undissociated form causing a decrease in pH.
  • Acetic acid is a harmless substance; There are no official limits for daily intake in man. When acetic acid is incorporated into a food, two effects are expressed, one acidifying and the other preservative. At a concentration of 1-2%, it inhibits almost all of the total flora within reasonably high initial load limits. At 0.1% it acts on the majority of pathogens and sporulates; 0.5% has an effect on toxigenic fungi. The efficacy of acetic acid against some specific pathogens has been evaluated using some foods as a medium. Published reports are often difficult to compare because acid concentrations have been variables expressed as percentage, molarity or final pH of the acidified test medium.
  • the antimicrobial activity depends on the exposure time, temperature, type of acid, acid concentration, dissociation level and pH (Harmon et al., 1987). However, the general results show that the effectiveness of acetic acid increases as the concentration increases, the pH decreases, the temperature increases and the microbial load decreases (Harmon et al., 1987). Among bacteria, Gram positive are usually more resistant than Gram negative bacteria (Rameshkumar et al., 2007). Bacterial spores and viruses are more resistant than vegetative cells. However, organic acids have also shown little effectiveness in disinfecting raw vegetables (Fernández, 2000).
  • vapor phase antimicrobial agents can be effective against bacteria adhered to locations in the fruit not reached by the active agents in aqueous solution, their use in packaged products (in plastic bags) or during product processing (in the company) could provide an extra benefit in pathogen control.
  • this type of steam treatment would not be an optional or practical treatment for primary tomato growers in the field, as producers generally sell their product packed in cardboard or wooden boxes, among other things, for ease and to avoid accumulation. and humidity what would happen if plastic bags were used. In addition, this would not be a practical treatment to apply in restaurants or homes.
  • coli 0157: H7 and Salmonella were tested and the most effective compounds were found to be thymol, cinnamaldehyde, and carvacrol (Friedman et al., 2002). This information was obtained using the oil in the liquid phase. There is limited information available on the effectiveness of essential oils in the form of steam.
  • Mu ⁇ oz (2003) evaluated the effect of two concentrations of carvacrol and the commercial disinfectant Boradantix ⁇ (EVESA, Extractos Vegetales SA) on the survival of L. monocytogenes, P. fluorescens, E. coli, Erwinia caratovora and S. Typhimurium in lettuce and carrot juice.
  • the antimicrobial effect of about 60 different plants used in herbalism has been evaluated (Cruz- Gaivez e ⁇ ai., 2013) where some of these have shown a high antimicrobial power against different pathogenic microorganisms, such as Salmonella or Escherichia coli O157: H7, among others, as well as against food spoilage microorganisms (Pseudomonas aeruginosas, for example) , and the plant that has shown the greatest antimicrobial effect has been the chalices of the Jamaican flower, in some cases the antimicrobial effect being greater than that of commercial disinfectants based on hypochlorite, iodine, colloidal silver or that of antibiotics such as penicillin .
  • Jamaica is one of the plants in which the presence of anti microbial compounds has recently been reported in dehydrated calyces (Aziz et a /. 1998; Fernández et a /. 1996; Kang e ⁇ ai, 2007).
  • a range of phytochemical compounds have been detected that could be responsible for the observed antimicrobial effect, such as for example polyphenols (Tajkarimi e ⁇ a /., 2010), among them some phenolic acids (Tajkarimi e ⁇ ai, 2010), as well as flavonoids, catechins and epicatechin (Friedman, 2007).
  • patent application JP2002128602 describes its use in an agrochemical composition to protect plants in fields of crops
  • application US20100323046 describes the use of a crude extract of the calyces of Jamaica to produce a drug to treat urinary infections caused by Escherichia coliy Candida albicans.
  • Patent application KR20080092186 describes an extract from Jamaica that is used to improve the quality of beef, pork and chicken and to increase its storage stability.
  • the extract is prepared by ethanol extraction and subjected to a cold drying process.
  • the concentration of the extract in the composition is 500 mg / ml and the meat is treated with a preparation of 0.5 to 3.0% (by weight).
  • compositions comprising extract of the Agapanthus africanus plant and compositions comprising this extract plus other extracts of other different plants are described, such as for example plants of the Rosa or alfalfa family for use as agents in the Biological protection of other plants including their seeds.
  • this patent application document refers to the article published by Leksomboon et al.
  • the present invention relates to compositions containing phytochemicals present in plant extracts that are used as disinfectants of plant and animal foods, for example directed to the disinfection and preservation of fruits and vegetables, particularly the disinfection and / or preservation of tomato ⁇ Solanum lycopersicum).
  • One embodiment of the present invention relates to obtaining a vegetable preparation comprising a methanolic extract of the chalices of the flower of Jamaica (Hibiscus sabdariffa) or specific chromatographic fractions obtained from the methanolic extract of the calyces of Jamaica, which are useful to eliminate pathogens present in food (disinfectant effect) and to delay the deterioration of food or preserve its safety (conservative effect).
  • a vegetable preparation comprising a methanolic extract of the chalices of the flower of Jamaica (Hibiscus sabdariffa) or specific chromatographic fractions obtained from the methanolic extract of the calyces of Jamaica, which are useful to eliminate pathogens present in food (disinfectant effect) and to delay the deterioration of food or preserve its safety (conservative effect).
  • Another embodiment of the present invention relates to obtaining plant-derived extracts that are used as disinfectants against pathogenic microorganisms present in food and to delay the deterioration of food and / or preserve its safety, that is, as food preservatives , those that constitute an alternative to! use of traditional disinfectants that can be toxic to humans, animals or the environment.
  • compositions containing the extract of Jamaican calyces that have a food disinfectant and preservative function together with other compounds that have disinfectant properties, for example acetic acid, hypochlorite, etc.
  • Another embodiment of the present invention relates to obtaining extracts obtained from Jamaican chalices that have a disinfectant or preservative effect when applied to food.
  • One aspect of this modality refers to the application of extracts obtained from chalices of the Jamaican plant (Hibiscus sabdariffa L.) that have a disinfectant or preservative effect when applied to foods of plant origin, preferably tomatoes.
  • Another embodiment of the present invention is the development of a method for obtaining the methanolic extract from calyxes of Jamaica, an extract that turns out to be useful as a disinfectant and food preservative.
  • Another embodiment of the present invention relates to the method for obtaining specific chromatographic fractions with antimicrobial effect obtained from the methanolic extract of Jamaican calyces, which are useful for eliminating pathogens present in food (disinfectant effect) and for delaying deterioration. of food or preserve its safety (conservative effect).
  • Another embodiment of the present invention is a method of treatment and / or preservation of foods of animal and / or vegetable origin by applying compositions containing extracts of Jamaican chalices that allow disinfection and preservation thereof.
  • Jamaican calyx extracts as a disinfectant and / or food preservative is another modality described in the present invention.
  • Compounds from the calyces of Jamaica can be useful in the development of an efficient disinfectant to eliminate the pathogenic bacteria present in raw vegetables, such as tomatoes.
  • an extract of Jamaican chalices and a specific fraction obtained by column chromatography from a methanolic extract of Jamaican calyces, comprising phytochemicals, which can be used as a disinfectant and / or food preservative are described due to its efficiency in the elimination of pathogenic bacteria from raw vegetables such as tomato.
  • compositions of the present invention are capable of eliminating the pathogenic bacteria present in raw vegetables, such as tomato per se, without altering their nutritional properties as well as quality characteristics. of the product. Consequently, the application of the compositions of the present invention in raw vegetables allows their preservation, as well as their effective disinfection, which makes them safe food for consumption.
  • compositions of the present invention comprise plant extracts with known antimicrobial activity, such as, for example, methanolic extracts of Jamaica and specific chromatographic fractions obtained from the methanolic extract of Jamaican calyces, either alone or in combination with other components with proven disinfectant activity, such as for example organic acids that include acetic acid and chlorine compounds that include sodium hypochlorite.
  • known antimicrobial activity such as, for example, methanolic extracts of Jamaica and specific chromatographic fractions obtained from the methanolic extract of Jamaican calyces, either alone or in combination with other components with proven disinfectant activity, such as for example organic acids that include acetic acid and chlorine compounds that include sodium hypochlorite.
  • compositions of the invention including a mixture of methanolic extracts of plants with antimicrobial activity as well as acetic acid and sodium hypochlorite and polysorbate, and a mixture of specific chromatographic fractions obtained from the methanolic extract of Jamaican calyces as well as acetic acid and sodium hypochlorite and polysorbate, are usually very effective in eliminating microorganisms resident in the plant, while achieving that their organoleptic and / or nutritional properties are not affected and without being altered, for example the commercial quality of tomatoes.
  • compositions described herein comprise: a) Plant-derived extracts, which exhibit antimicrobial properties, such as extracts derived from Jamaican calyces (Hibiscus sabdariffa),
  • An organic acid with disinfectant activity such as acetic acid, lactic acid, citric acid, peracetic acid, octanoic acid, peroxyethanoic acid and 1-hydroxyethylidene-1,1-diphosphonic acid, and mixtures thereof, in a concentration p / p from 0.01% to 10%, preferably from 0.1% to 1%,
  • a chlorine compound with disinfectant activity such as sodium hypochlorite, calcium hypochlorite, chlorine dioxide and mixtures thereof in a w / w concentration of 0.001% to 10%, preferably 0.001% to 0.1%
  • a surfactant with emulsifying activity of natural fats or waxes found in tomatoes such as polysorbates, Polysorbate 80, Polysorbate 20, C12-C18 alkyl dimethyl betaine (cocobetaine, C10-C16 alkyl dimethyl betaine (lauryl betaine), Suffobetaine acyl (C10-C14 fatty) amidopropylene (hydroxypropylene), sulfobetaine, Cyclodextrins, B-cyclodextrins and ⁇ -Cyclodextrin and mixtures thereof in a w / w concentration of 0.1% to 5%, preferably 0.5% to 1%.
  • the compositions are added to food to be disinfected and / or preserved through methods known in the art, such as direct application, through aerosols, the complete immersion of fruits and vegetables in disinfectant solutions. or by means of devices that allow their adequate dispersion in the food to be treated.
  • the compositions of the invention can be added or contacted with food in an amount of 0.1 mL per 1000g of food, preferably 0.1 to 1mL per 100g of food, or added in larger volumes according to the needs of disinfection. of food. After applied, the compositions can remain the necessary time until obtaining the desired disinfectant and / or preservation effect on fruits and vegetables. Prior to consumption, the fruits and vegetables treated with the compositions described herein are simply washed with drinking water to remove said compositions.
  • compositions described herein can be obtained by mixing their components in the desired concentrations, to then store them at room temperature, so they are ready to be applied to food when deemed necessary.
  • compositions described herein may contain only plant extracts with antimicrobial activity, such as extracts derived from Jamaican calyces, or chromatographic fractions obtained from aqueous, methanolic or acetonic extracts of Jamaican calyces, which are put in contact with food, for example raw plant-based foods such as tomatoes, in order to disinfect and / or preserve them.
  • plant extracts with antimicrobial activity such as extracts derived from Jamaican calyces, or chromatographic fractions obtained from aqueous, methanolic or acetonic extracts of Jamaican calyces, which are put in contact with food, for example raw plant-based foods such as tomatoes, in order to disinfect and / or preserve them.
  • the disinfectant activity of extracts derived from Jamaica and chromatographic fractions obtained from the extracts of the chalices of Jamaica in the disinfection and / or preservation of foods, for example raw fruits and vegetables, is described. which can be used directly or as part of compositions containing them.
  • chromatographic extracts or fractions derived from the chalices of Jamaica can be added or contacted with the food to be disinfected and / or preserved in a w / w concentration of 0.001% to 10%, preferably 0.1% to 1 %.
  • the disinfectant and / or preservation effectiveness of the compositions described herein is such that it inactivates or eliminates human pathogenic bacteria or food spoilage that may be present in them, while at the same time not affecting the organoleptic properties. and / or nutritious food.
  • the compositions of the invention adequately disinfect the food without affecting its nutritional properties, while at the same time not affecting the organoleptic or quality properties.
  • the plant extracts of the present invention and the chromatographic fractions can be obtained by the following method: a) Place the dried plant in a container under aseptic conditions, add water, methanol or acetone in a ratio of 1: 9; preferably 100 g of the dried plant are placed in a container (flask) under aseptic conditions, 900 ml of methanol are added and allowed to stand for 7 days;
  • Extracts and chromatographic fractions are stored at room temperature until use. Once the extracts and chromatographic fractions are obtained, they can be used alone, or in combination with other disinfectants to obtain the compositions of the invention, which can be obtained by methods known in the art where it involves the combination of the various elements that they are formed to form solutions and / or suspensions capable of being subsequently applied to food to be disinfected and / or preserved, by methods known in the art.
  • the present invention constitutes the first report of the use and effectiveness of compositions containing plant extracts with microbial activity, either alone or in combination with other disinfectants, for the disinfection and / or preservation of food, particularly fruits and vegetables, as per example the tomato.
  • the compositions of the invention are capable of disinfecting and / or eliminating microorganisms present in tomatoes in a very efficient manner, thereby making it possible to have microbiologically safe and safe tomatoes for consumption.
  • E. coli 0157.H7 (P1C6, isolated from an outbreak of disease), enteroinvasive E. coli (4VC81-5, isolated from clinical case) E. enterotoxigenic coli (1620 TL, isolated from clinical case), E were used Enteropathogenic coli (52 GM 291, isolated from clinical case), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Salmonella choleraesuis (ATCC 10708), Listeria monocytogenes (ATCC 19115), Listeria monocyiogenes Scott A, Siaphylococcus epidermis (ATCC 12228), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Bordetella (ATCC 12741) Shigella sonnei (ATCC 25931) and Shigella flexneri (ATCC 12022), V.
  • Enteropathogenic coli 52 GM 291, isolated from clinical case
  • Salmonella typhimurium ATCC 14028
  • strains were maintained at 4-7 ° C in blood-based agar (ABS, Merck®, Germany) with biweekly transfers, activating in tryptosesein soy broth (CST, Bioxon®, Mexico) with incubation at 35 ° C / 24h.
  • the dry extract (solvent-free) was obtained, it was mixed with silica (in order to make the extract manageable, since it still had moisture), it was added to the packed column. Cotton was placed at the bottom of the column with the help of a rod to prevent the silica gel from detaching when the key was opened, the column was held with two tweezers and made sure it was straight.
  • the silica gel was mixed with hexane approximately 8: 1g.
  • the dry extract (solvent-free) was obtained, it was mixed with silica (in order to make the extract manageable, since it still had moisture), it was added to the packed column. Cotton was placed at the bottom of the column with the help of a rod to prevent the release of the silica gel when the key was opened, the column was secured with two tweezers and secured in such a way That was straight.
  • the silica gel was mixed with cioroform approximately 8: 1g.
  • Test tubes with 24 h cultures in CST of each R + strain were centrifuged at 3500 rpm for 20 min. Subsequently, the supernatant was discarded; The cell packet was resuspended by adding 3 mL of sterile isotonic saline and stirred in vortex for 10 s. The above procedure was repeated two more times. Subsequently, the concentration of each strain was approximately 1x10 9 CFU / mL. Finally, each strain was diluted decimally in isotonic saline solution only once.
  • aqueous solutions were prepared using sterile distilled water or a solution of Polysorbate 80: water in a 20:80 ratio.
  • the solutions of Jamaican calyx extracts, mixtures based on extracts and chromatographic fractions as well as mixtures containing acetic acid, hypochlorite and / or 80% poiisorbate were prepared at the concentrations, proportions or mixtures described in Table 6.
  • concentrations, proportions or mixtures described in Table 6 For example, to prepare 100 ml of a solution containing 1% Jamaican calyces methanolic extract, 0.1% acetic acid and 100 mg / L hypochlorite: to 100 mL of distilled water was added 1 g of dry methanolic extract of calyces of Jamaica, in addition 1 ml of a solution of acetic acid at MO% and 0.2 ml of a solution of hypochlorite at 5%.
  • Salmonella serotypes (3 typhimurium [ATCC 14028, one isolated from tomato, J1, and another from alfalfa seed, GA1], Salmonella choleraesuis [ATCC 10708], typhi, gaminara, and montevideo) and 3 of E. coli O157: H7 (two isolated in our laboratory from raw ground beef [P1C6 and M5C8] and another isolated from an outbreak caused by meat consumption in the United States of America [E09]), this strain was donated by Dr. Eduardo Fernández Escartin of the Autonomous University of the State of Hidalgo.
  • Test tubes with 24 h cultures in CST of each R + strain were centrifuged at 3500 rpm for 20 min. Subsequently, the supernatant was discarded; The cell packet was resuspended by adding 3 mL of sterile isotonic saline and stirred in vortex for 10 s. The above procedure was repeated two more times. The resulting concentration of each strain was approximately 1x10 9 CFU / mL.
  • One milliliter of each Salmonella strain was mixed in an empty test tube to have a mixture of the 7 Salmonella strains examined. The same was done with strains of E. coli 0157: H7, to have a mixture of the three strains of E. coli 0157: H7.
  • Tomatoes of the saladete variety were used; Tomatoes were obtained from a local producer. Prior to inoculation, the tomatoes were cleaned with a clean cloth to remove dust particles. Tomatoes of a uniform or similar size were used and did not show visible damage.
  • individual tomatoes were inoculated by placing in the central part (not in peduncle) of the fruit 10 ⁇ L of a suspension of each type of pathogenic bacteria mixture (Salmonella or E. coli O157: H7) microorganisms containing approximately 1 x 10 7 CFU Inoculated tomatoes were placed in a tray and placed in a bioclimatic hood for two hours at a relative humidity of 90 ⁇ 1% and 26.5 ⁇ 1 ° C.
  • the purpose of this treatment was to cause the adhesion or infiltration of the cells of the pathogenic bacteria under study to simulate the natural conditions, in other words, to have a model that resembles as much as possible what happens when tomatoes They are contaminated by natural or common sources of contamination with pathogenic bacteria.
  • each fruit was washed separately to remove microorganisms that did not adhere, the washing consisted in immersing and stirring the inoculated part of the tomato in distilled water for 10 s, the washed part was allowed to drain at room temperature to total dryness and subsequently separately the inoculated part of different tomatoes was immersed for 10 min in the different disinfectant solutions indicated in Table 6.
  • a treatment with distilled water alone served as a positive control.
  • the tomatoes were removed from the disinfectant solution and to remove the remaining disinfectant the inoculated part was immersed in distilled water for 10 s, then the inoculated part was cut (a box of approximately 2 x 2 cm and with a depth of approx. 2 cm) with the help of a sterile scalpel, each portion was placed independently in a plastic bag and 10 ml of peptone diluent was added. Subsequently, the materials were shaken manually by pressing and rubbing the inoculated part and the entire tomato portion from the outside of the bag for a minute.
  • each bag was counted using the plate pouring technique using agar for standard methods (Bioxon, Mexico) added 100 mg / L of Rifampicin (Sigma, Mexico), the boxes were incubated at 35 ° C / 24-48 h. This procedure was performed in duplicate for each replica. Each treatment was carried out in quintuplicate.
  • results obtained were statistically analyzed with a single-way variance analysis (ANOVA) comparing the means with the Tukey test, with a significance level of 0.05.
  • ANOVA single-way variance analysis
  • the NMR spectrum of the proton ( 1 H) was determined both from the dry methanolic extract obtained from the calyxes of Jamaica and from the collection of fractions called "IV” which was obtained from the methanolic extract of the calyxes of Jamaica and which was the collection that was used in the formulations.
  • the Carbon NMR specimen ( 13 C) was also obtained from the collection of fractions referred to as "IV", which was obtained from methanol extract from the calyces of Jamaica.
  • the dried methanol extract and / or the collection IV were solubilized in deuterated water.
  • NMR spectra were obtained using a nuclear magnetic resonance spectrometer (They vary NMR, 400 MHz).
  • NMR spectroscopy studies atomic nuclei. This spectroscopic technique can only be used to study atomic nuclei with an odd number of protons or neutrons (or both), to determine the structures of organic compounds. This situation occurs in the atoms of 1 H, 13 C, 19 F and 31 P. These types of nuclei are magnetically active, that is, they have spin, just like electrons, since the nuclei have a positive charge and have a movement of rotation on an axis that makes them behave as if they were small magnets. The NMR spectrometer detects these signals and records them as a graph of frequencies versus intensity, which is called the NMR spectrum
  • the three types of extracts (aqueous, methanol and acetonic) showed a marked antimicrobial effect (Table 7). All the microorganisms tested were inhibited from the first moments of contact. The inhibitory effect observed suggests the presence of antimicrobial substances in the extracts. This effect can cause lethal damage to the cell or only cause a sublethal effect or cellular stress (Busta, 1976). Different components of the vegetable could be responsible for this antimicrobial effect.
  • the extracts were separated into different compounds or groups of compounds based on their polarity; for this, the compounds were separated by column chromatography, in this way different groups of compounds or groups of fractions were obtained (collections of fractions, see methodology). Subsequently, the antimicrobial effect of the collections of fractions obtained was tested. Because the extract Acetonic and methanolic had a greater antimicrobial effect than the aqueous extract, the components of the aqueous extract were not chromatographed.
  • Table 8 shows the inhibitory effect expressed in length of the inhibition halo in millimeters (mm), which was observed in petri dishes seeded with different microorganisms, due to the effect of different collections of chromatographic fractions grouped by polarity obtained from acetonic extract of the calyces of Jamaica. It is observed that only collections II and III from acetonic extract show antimicrobial or inhibitory effect. Collection III is the one that showed the greatest antimicrobial effect (Table 8). This fraction III was used to make the mixtures or formulations that were used in the tomato disinfection experiments.
  • Table 9 shows the inhibitory effect in mm of different collections of chromatographic fractions grouped by polarity obtained from the methanolic extract of the chalices of Jamaica. It is observed that all the collections caused halos of inhibition which is interpreted as the antimicrobial effect of the collections. However, the IV collection is the one that showed the greatest antimicrobial effect (Table 9). This fraction IV was used to make the mixtures or formulations that were used in the tomato disinfection experiments.
  • Example 4 Disinfectant potential of extracts and fractions alone or in mixtures with acetic acid, sodium hypochlorite and / or Polysorbate 80.
  • polysorbate 80 in the observed antimicrobial effect, since being a surfactant it is possible that it has favored the emulsification of the natural wax of tomatoes which could increase the effect of the disinfectant solution by eliminating or decreasing the protective effect that the wax would be providing inoculated microorganisms on tomatoes
  • compositions of the present invention are an excellent alternative for the disinfection and / or preservation of foods, for example fresh foods, without altering their nutritional properties.
  • the compositions described here allow the effective disinfection of pathogenic microorganisms of fruits and vegetables, preferably tomatoes allowing the safe consumption of such products.
  • Example 6 Nuclear magnetic resonance (NMR) spectra obtained from the IV chromatographic collection from the methanolic extract.
  • Fernández EE 2000 Microbiology and Food Safety. Autonomous University of Queretaro. Mexico. 13. Fernández MA, Garc ⁇ a MD, and Sáenz MT. 1996. Antibacterial activity of the phenolic acids fractions of Scrophularia frutescens and Scrophularia sambucifolia. J Ethnopharmacol 1996,53: 11-14.

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Abstract

La presente invención describe composiciones para la desinfección y/o preservación efectiva de frutas, verduras y hortalizas de microorganismos patógenos y deterioradores en dichos alimentos. Las composiciones descritas contienen extractos o fracciones cromatográficas con actividad antimicrobiana derivados de plantas, las cuales pueden actuar por si solos o en combinación con otros agentes desinfectantes, como por ejemplo ácidos orgánicos y compuestos del cloro, y tensoactivos, como el polisorbato 80. Las composiciones de la invención son capaces de eliminar o inactivar la contaminación microbiana, incluyendo la de microorganismos patógenos, de tomate sin alterar las propiedades nutritivas y/o alimenticias y/o sensoriales de los tomates.

Description

SOLUCIONES FITOQUÍMICAS ÚTILES COMO DESINFECTANTES DE TOMATES
(Solanum lycopersicum)
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al desarrollo de composiciones que contienen fitoquímicos presentes en extractos de plantas que son utilizados como desinfectantes y conservadores para alimentos, por ejemplo de origen vegetal y animal; más particularmente a soluciones acuosas a base de extractos metanólicos o fracciones cromatográficas de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa), el método mediante el cual se obtienen y sus usos como soluciones efectiva para eliminar bacterias patógenas de frutas, verduras y hortalizas, pero con la más alta efectividad para tomate (Solanum lycopersicum).
ESTADO DE LA TÉCNICA
En México la oferta de tomate es sustentable con activos rurales de un poco más de 70 mil hectáreas dedicadas a su siembra. Los tipos más importantes de tomate producidos, tanto a campo abierto como en agricultura protegida, son: Saladette (el que más se produce), seguido por los tipos Bola, Cherry, Racimo, y otras especialidades como Mimi y Campari (Sagarpa, 2013)
A la par con el incremento en el consumo de tomate se han presentado brotes de enfermedades provocados por bacterias asociados al consumo de tomates (Ottesen et al., 2013). Por ejemplo, los tomates han sido implicados en brotes de Salmonella al menos diecisiete veces en el periodo que abarca desde 1990 hasta 2010 (Tabla 1).
Los recientes brotes de enfermedades alimentaria asociadas con tomates crearon la necesidad de determinar las fuentes de contaminación del tomate y comprender la sobrevivencia y/o crecimiento de microorganismos patógenos en tomates; estos han conducido al desarrollo de tecnologías innovadoras de control. En general, los agentes patógenos en los tomates se podrían controlarse mediante la prevención de la contaminación durante el cultivo y la cosecha del fruto, también mediante el uso de desinfectantes con poder antimicrobiano en el producto cosechado, y por el almacenamiento de los tomates a baja temperatura. No obstante, se ha identificado a la desinfección del tomate como la etapa de mayor importancia para la inocuidad microbiana de tomate crudo.
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Por lo general los tomates no se consumen directamente como se cosechan. Después de la cosecha ya sea en el campo o en la industria (y aún en el hogar) reciben tratamientos diversos que tienden a favorecer su conservación y/o inocuidad. La aplicación de lavado y desinfección del tomate mejora su imagen microbiana. No obstante, es difícil lograr de manera segura la inactivación o remoción de microorganismos patógenos aún en condiciones extremas de tratamientos que no dañen sensorialmente al alimento.
La prevención de la contaminación del fruto es también una estrategia de control porque no se requiere el crecimiento de patógenos para causar enfermedad. Por lo tanto, las medidas de control adicionales pueden ser de valor. Cabe señalar que el comportamiento de los microorganismos patógenos en los tomates se ve afectado por la ubicación del patógeno en el fruto, la calidad de tomate, la temperatura de almacenamiento, tipo de embalaje, y la humedad relativa. Los tomates suelen tener una acidez baja que limita el crecimiento de patógenos durante el almacenamiento a temperaturas de refrigeración. Sin embargo, los microorganismos que constituyen las poblaciones nativas de hongos y la levadura en los tomates crudos podría aumentan el pH de los tejidos del pericarpio a un nivel que favorece el crecimiento de las bacterias patógenas durante el almacenamiento (Wade y Beuchat, 2003).
Se ha reportado que cuando las temperaturas de almacenamiento aumentan por encima de la temperatura de refrigeración, Salmonella crece en la piel de tomate entero y la cicatriz del pedúnculo y en tomates picados (Asplundm y Nurmi, 1991; Das et al., 2003; Wade y Beuchat, 2003; Weissinger et al., 2000; Zhuang y Beuchat 1995). Además una vez sobre el tomate Salmonella puede producir polímeros extracelulares en las cutículas de tomate después de 10 h a 22 y 30 °C y alta humedad relativa (97%), lo que lleva a la formación de una biopelícula bien definida después de 4 días (Iturriaga et al., 2007). Los agentes patógenos en la superficie de los tomates pueden contaminar los tejidos internos durante el rebanado y puede entonces sobrevivir o crecer en las rebanadas. Se ha reportado que Salmonella que se habían infiltrado en los tomates creció a 25 °C al rebanarse (Ibarra-Sanchez et al., 2004). Varios hallazgos de la investigación indican que los patógenos bacterianos pueden infiltran en tomates enteros (Bartz, 1982; 1999; Guo et al., 2002; Ibarra-Sanchez et al., 2004; Zhuang y Beuchat 1995) cuando hay un diferencial de temperatura entre el tomate y el agua de lavado y por la presión hidrostática cuando los tomates se sumergen en el tanque de recepción (Bartz, 1982; Bartz y Showalter, 1981).
La infiltración bacteriana aumenta en el tomate presencia de heridas y pinchazos. Los patógenos infiltrados no se eliminan por las prácticas normales de lavado. El principal beneficio de la adición de productos químicos antimicrobianos (como los desinfectantes químicos a base de hipoclorito o a base de ácidos orgánicos) al agua de lavado del tomate es el control de la propagación de agentes patógenos, su inactivación y/o su infiltración al tomate. No obstante, los desinfectantes químicos actualmente disponibles tienen beneficios limitados sobre el tomate. Se ha estudiado el efecto antimicrobiano de soluciones de hipoclorito, peróxido de hidrógeno, ácido peracético y el agua electrolizada en su capacidad para reducir los agentes patógenos en los tomates durante el proceso de lavado. No obstante, se ha concluido que estos tratamientos tienen un efecto limitado sobre los microorganismos patógenos, presumiblemente porque los agentes activos no tienen suficiente contacto con los microorganismos patógenos sobre el tomate.
El proceso de desinfección se refiere a la destrucción física de los microorganismos cuya actividad compromete la inocuidad o las características sensoriales de un alimento. El efecto puede lograrse a través de medios físicos o químicos, estando su eficacia en función de los microorganismos (tipo y número), el substrato sobre el cual se encuentran (presencia de materia orgánica), la estructura del material (que permita el acceso directo del germicida a los microorganismos) y el germicida (concentración, temperatura y tiempo de contacto) (Fernández, 2000). En el proceso de desinfección, la sustancia germicida participa en reacciones químicas, de manera que mientras mayor es el número de microorganismos mayor demanda del agente para lograr una inactivación total de la población. La susceptibilidad a un germicida específico varía entre los microorganismos; algunos se inactivan desde el primer momento de contacto, mientras que en el otro extremo pueden existir sobrevivientes. Finalmente hay que tener presente que entre los microorganismos es posible la selección de cepas con resistencia creciente al efecto de una agente germicida específico. En consecuencia, con el tiempo, llegan a requerirse concentraciones muy superiores del desinfectante a las iniciales para alcanzar el mismo nivel de inactivación (Fernández, 2000).
Diferentes estudios demuestran que los tratamientos de desinfección con frecuencia son débiles ó limitados. Por ejemplo el lavado y desinfección con 200 mg/L de cloro activo (hipoclorito), de yodo (yodóforo), de bióxido de cloro o de 100 mg/L de un producto comercial a base de extracto de semilla de toronja (citricidal) redujeron el contenido de germinado de alfalfa en sólo 1-2 log10; la disminución de S. typhi o de V. cholerae 01 inoculados en el laboratorio no fue mayor a 1.5 log10 UFC/g (Castro-Rosas y Escartín, 1999).
La industria de alimentos cuenta con una diversidad de agentes germicidas. Sus virtudes y limitaciones obligan a seleccionar cuidadosamente aquellos que mejor se ajusten a cada necesidad particular (Fernández, 2000). La inactivación de las bacterias patógenas en las plantas procesadoras de alimentos es un requisito básico para controlarlas e impedir su acceso al producto terminado (Álvarez, 1998).
Lo común es que un germicida se considere efectivo cuando demuestra capacidad para inactivar al menos 3 Log10 de una suspensión de microorganismos en 30s (Fernández, 2000).
Las soluciones a base de cloro son un desinfectante barato y disponible como hipoclorito o en sus formas de liberación lenta (cloraminas, por ejemplo) (Lelieveld et al. 2013). Los hipocloritos tienen un amplio espectro de actividad antibacteriana, aunque son menos efectivos contra esporas que contra bacterias no formadoras de esporas y tienen bajo efecto contra micobacterias (Russell et al., 2004). Las soluciones de cloro como hipoclorito de sodio ó bióxido de cloro, son ampliamente utilizadas por la industria de alimentos como desinfectante. Los dos son oxidantes fuertes que actúan a nivel de las membranas y otros constituyentes celulares (Harmon et al., 1987). No obstante, el primero presenta la desventaja de reaccionar fácilmente con la materia orgánica, por lo que se inactiva más rápido. En el segundo la interferencia es mínima (Castro-Rosas y Escartin, 1999). La principal desventaja del hipoclorito de sodio es que la humedad, el calor, la luz y sobre todo la presencia de materia orgánica, incrementan la tasa de pérdida de cloro libre. La actividad germicida del cloro generalmente ha sido atribuida al ácido hipocloroso (HOCI), el cual es generado en soluciones acuosas de hipoclorito de sodio y otros compuestos que contengan cloro.
Los desinfectantes se pueden incorporar al agua de lavado y de esta forma contribuir a la reducción de la carga microbiana. La efectividad del hipoclorito no solamente es afectada por el tiempo de exposición y la concentración del cloro libre, si no por otros factores como temperatura, pH, tipo de cepa, así como presencia y tipo de materia orgánica (Álvarez, 1998). No obstante, algunos autores señalan que la eficiencia del hipoclorito en la reducción de microorganismos patógenos presentes en verduras es limitada (Adams et al., 1997).
Compuestos químicos derivados del cloro, yodo y plata han sido típicamente usados como desinfectantes de verduras, como el tomate. Sin embargo, recientemente diversos estudios muestran que los tratamientos de desinfección con estos compuestos resultan ineficientes en la eliminación o reducción de los niveles de patógenos microbianos. Por tal motivo, muchos países han abandonado el uso de hipoclorito o soluciones de yodo para la desinfección de verduras crudas.
Los ácidos orgánicos han sido utilizados tradicionalmente como conservadores de alimentos o en soluciones para desinfectar verduras crudas. Su efecto antimicrobiano se ejerce a través de la forma no disociada causando una baja del pH.
El ácido acético es una sustancia inocua; no existen límites oficiales para la ingesta diaria en el hombre. Cuando se incorpora ácido acético a un alimento se expresan dos efectos, uno acidulante y otro preservativo. A concentración de 1-2% inhibe casi toda la flora total dentro de límites razonablemente elevados de carga inicial. Al 0.1% actúa sobre la mayoría de los patógenos y esporulados; al 0.5% tiene efecto sobre los hongos toxigénicos. Se ha evaluado la eficacia del ácido acético contra algunos patógenos específicos utilizando como medio algunos alimentos. Los informes publicados a menudo son difíciles de comparar por que las concentraciones de ácido han sido variables expresadas como porcentaje, molaridad o pH final del medio de ensayo acidificado. La actividad antimicrobiana depende del tiempo de exposición, temperatura, tipo de ácido, concentración del ácido, nivel de disociación y pH (Harmon et al., 1987). No obstante, los resultados generales demuestran que la eficacia del ácido acético aumenta a medida que aumenta la concentración, disminuye el pH, la temperatura aumenta y la carga microbiana disminuye (Harmon et al., 1987). Entre las bacterias, las Gram positivas suelen ser más resistentes que las bacterias Gram negativas (Rameshkumar et al., 2007). Las esporas bacterianas y los virus son más resistentes que las células vegetativas. Sin embargo, los ácidos orgánicos han mostrado también poca efectividad para desinfectar verduras crudas (Fernández, 2000).
La investigación reciente indica que los productos químicos antimicrobianos en la fase de vapor pueden reducir significativamente las poblaciones de patógenos en la superficie de tomate. El uso de 5 mg / litro de gas dióxido de cloro durante 1 h fue significativamente más eficaz contra la Salmonella en la cicatriz del pedúnculo que eran soluciones acuosas de 200 ppm de hipoclorito de sodio (2 min de exposición) y 1200 ppm de hipoclorito de sodio acidificado (2 min de exposición) (Yuk et al., 2005). El uso de 10 rng / litro de ozono inactiva por completo 7 log UFC de Salmonella enteritidis de la superficie de tomates cherry después de 15 min, sin embargo, se afecta el color de los tomates (Das et al., 2003).
Debido a que los agentes antimicrobianos en fase vapor pueden ser eficaces contra bacterias adheridas a ubicaciones en la fruta no alcanzado por los agentes activos en solución acuosa, su uso en los productos envasados (en bolsas de plástico) o durante el procesamiento de productos (en la empresa) podría proporcionar un beneficio extra en el control de patógenos. Sin embargo, este tipo de tratamientos con vapor no sería un tratamiento opcional ni practico para los productores primarios de tomate en campo ya que por lo general los productores venden su producto empacado en cajas cartón o madera entre otras cosas por la facilidad y para evitar acumulación e humedad lo que ocurriría si se usaran bolsas de plástico. Además, este tampoco sería un tratamiento práctico para aplicarlo en los restaurantes o en los hogares.
El uso de sustancias químicas como desinfectantes de verduras crudas para mejorar o preservar su inocuidad, es un procedimiento universalmente utilizado por los productores. Sin embargo, algunos de estos antimicrobianos pueden resultar tóxicos para los consumidores; es el caso de las soluciones de hipoclorito. Reportes recientes señalan que el hipoclorito en solución puede formar precursores de cáncer. Además, muchos de los desinfectantes químicos, como las soluciones a base de yodo o plata coloidal, muestran limitado o variado efecto antimicrobiano en productos como las verduras crudas; una situación similar ocurre con los conservadores para alimentos.
Debido a ello, los desinfectantes y conservadores obtenidos a partir de plantas recientemente han surgido como una alternativa viable, ya que estos podrían tener igual o mayor potencial antimicrobiano y con un mínimo riesgo para los consumidores.
La aplicación de extractos del ajo en fruta fresca contra enfermedades poscosecha han obtenido el control completo de la putrefacción marrón de los melocotones causados por el Monilinia fructicola (Roller, 2003). Yucel y Karapinar (2005) evaluaron la reducción de S. typhimurium en cebollas mediante la aplicación de jugo de limón, vinagre y sus mezclas, observando una reducción respectiva de 0.87- 2.93, 0.66-2.92 y 0.86-3.24 Log UFC/g. Los aceites esenciales provenientes de plantas son capaces de inactivar los patógenos de interés en productos frescos. De 96 diferentes tipos de aceites esenciales examinados, sólo 3 resultaron eficaces contra E. coli O157:H7 y Salmonella entonce los cuales fueron de orégano, tomillo, y canela. En otro estudio se ensayaron 16 compuestos individuales de los aceites más eficaces contra E. coli 0157:H7 y Salmonella y se encontró que los compuestos más eficaces fueron timol, cinamaldehído, y carvacrol (Friedman et al., 2002). Esta información se obtuvo usando el aceite en la fase líquida. Existe limitada información disponible sobre la eficacia de ios aceites esenciales en forma de vapor. En otro estudio, Muñoz (2003) evaluó el efecto de dos concentraciones de carvacrol y el desinfectante comercial Boradantix© (EVESA, Extractos Vegetales S.A.) en la sobrevivencia de L. monocytogenes, P. fluorescens, E. coli, Erwinia caratovora y S. typhimurium en jugo de lechuga y zanahoria. Todos los microorganismos de estudio fueron inhibidos en ambas concentraciones del carvacrol. Las bacterias estudiadas mostraron mayor sensibilidad hacia el carvacrol que al Boradantix®. Lin et al., (2000) evaluaron el efecto del alil y metil isocianato (AITC/MITC) (componentes clave de mostaza verde) sobre L monocytogenes, E. coli 0157:H7 y S. montevideo, inoculadas sobre la superficie de lechuga y tomate. AITC fue más efectivo contra Salmonella y E. coli, lográndose 8 Log de reducción con un tratamiento de vapor generado de 400 μΙ de AITC después de 4 y 2 días, respectivamente sobre lechuga. También se alcanzaron 8 Log de reducción de S. Montevideo sobre cutícula de tomate con 500 μΙ de AITC.
Han sido relativamente pocos los estudios de la acción antimicrobiana de los aceites esenciales en sistemas modelo de alimentos y en alimentos verdaderos. Sin embargo, la eficacia de aceites esenciales in vitro es a menudo mucho mejor que in vivo o in sfai, es decir en alimentos. Generalmente al aplicar un antimicrobiano de plantas a un alimento o in vitro se necesitan de 10 a 100 veces más concentración de antimicrobiano que lo observado in vivo. Por ejemplo, el aceite esencial de la menta (Menina piperita) ha demostrado inhibir el crecimiento de Salmonella enteritidis y L monocytogenes en medios de cultivo por 2 días a 30°C. Sin embargo, el efecto del aceite esencial de la menta en el aperitivos griegos tzatziki (pH 4.5) y el taramasalata (pH 5.0) y en paté (pH 6.8) a 4°C y 10°C fue variable (Roller, 2003). Salmonella enteritidis fue eliminada en aperitivos bajo todas las condiciones examinadas pero no cuando fue inoculado en paté y mantenido a 10°C. En éste mismo estudio, L. monocytogenes se comportó de forma semejante, ya que la cuenta microbiana disminuyó en los aperitivos pero aumentó en el paté (Roller, 2003). El crecimiento de E. coli, Salmonella sp., L. monocytogenes y Staphylococcus aureus fueron inhibidos por el aceite esencial del orégano en caldos de cultivo. Sin embargo, cuando estos aceites se probaron en alimentos tales como berenjena, taramasalata ó mayonesa se observaron reacciones tales como incremento del pH, incremento de temperatura y para el caso de las emulsiones separación del aceite usado (Roller, 2003). En otro estudio L monocytogenes y S. typhimurium fueron inhibidos en carne tratada con aceite esencial de clavo y orégano, respectivamente. Una reducción marcada de Aeromonas hydrophila ha sido también reportada en carne de cerdo cocinada que fue tratada con aceites del clavo o cilantro, empaquetada a vacío o con aire y almacenada a 2°C y 10°C. (Roller, 2003).
Las diferencias que se observan entre los estudios de efecto antimicrobiano cuando se aplican directamente los aceites extraídos de plantas sobre los microorganismos (microorganismos en suspensión acuosa) y aquellos en los que existe un alimento o materia orgánica de por medio, es posible que ocurra por la interferencia con los componentes del alimento o de la materia orgánica (proteínas, grasas, azúcares, sales). Por lo tanto, es muy posible que solamente una proporción del aceite esencial adicionado al alimento tenga actividad antibacteriana. Por otra parte, la distribución espacial de las diferentes fases (sólido/líquido) en un alimento y la carencia de homogeneidad de factores como el pH, aw entre otros, pueden jugar un papel en la eficacia. Debido a todo lo anterior, en diversas partes del mundo se encuentran en curso estudios encaminados a la búsqueda de antimicrobianos alternativos (Jongen, 2005). Entre las nuevas alternativas de desinfectantes se ha optado por compuestos naturales con amplia capacidad antimicrobiana.
Cabe destacar que los extractos obtenidos de algunas plantas han mostrado efecto anti microbiano contra cepas de patógenos multiresistentes a antibióticos, lo cual, abre todo un campo nuevo para el desarrollo de nuevos antimicrobianos para su uso en humanos y animales.
Como antecedente de la presente solicitud, se ha evaluado el efecto antimicrobiano de alrededor de 60 diferentes plantas usadas en la herbolaria (Cruz- Gaivez eí ai., 2013)¡ donde algunas de éstas han mostrado un elevado poder antimicrobiano contra diferentes microorganismos patógenos, tales como Salmonella o Escherichia coli O157: H7, entre otros, así como contra microorganismos deterioradores de alimentos (Pseudomonas aeruginosas, por ejemplo), y la planta que mayor efecto antimicrobiano ha mostrado han sido los cálices de la flor de jamaica, siendo en algunos casos mayor el efecto antimicrobiano que el de desinfectantes comerciales a base de hipoclorito, yodo, plata coloidal o que el de antibióticos como la penicilina.
Los extractos de los cálices de jamaica los hemos separado mediante cromatografía en columna para obtener fracciones con mayor poder antimicrobiano; con fracciones seleccionadas se han elaborado soluciones que han sido evaluadas para determinar su potencial antimicrobiano. De hecho, diferentes investigadores ha reportado también que los cálices de la flor de Jamaica (Hibiscus sabdariffa L) poseen sustancias con elevado poder antimicrobiano (Aziz eí al., 1998; Fernández et a/., 1996; Kang et a/., 2007).
La jamaica es una de las plantas en las que recientemente se ha reportado presencia de compuestos anti microbianos en cálices deshidratados (Aziz et a/. 1998; Fernández et a/. 1996; Kang eí ai, 2007). En los cálices de la flor de Jamaica se han detectado una gama de compuestos fitoquímicos que podrían ser los responsables del efecto antimicrobiano observado, tales como por ejemplo los polifenoles (Tajkarimi eí a/., 2010), entre ellos algunos ácidos fenólicos (Tajkarimi eí ai, 2010), así como flavonoides, catequinas y epicatequinas (Friedman, 2007). No obstante, no existen estudios puntuales que muestren cuales son efectivamente las moléculas o compuestos químicos responsable del efecto antimicrobiano observado en los cálices de Jamaica. Diferentes investigadores coinciden en que es necesario realizar mayores estudios para identificar las moléculas específicas y responsables del efecto antimicrobiano provocado por los cálices de Jamaica en solución.
Escasos son los documentos de patente que describen extractos de los cálices de la flor de Jamaica (Hibiscus sabdariffa ) y su uso como material con propiedades antimicrobianas. Por ejemplo, la solicitud de patente JP2002128602 describe su uso en una composición agroquímica para proteger plantas en campos de sembradíos, mientras que la solicitud US20100323046 describe el empleo de un extracto crudo de los cálices de Jamaica para producir un medicamento para tratar infecciones urinarias causadas por Escherichia coliy Candida albicans.
En la solicitud de patente KR20080092186 se describe un extracto de Jamaica que es empleado para mejorar la calidad de la carne de res, puerco y pollo y para incrementar su estabilidad de almacenaje. El extracto es preparado mediante extracción con etanol y sometido a un proceso de secado en frío. La concentración del extracto en la composición es de 500 mg/ml y se trata la carne con una preparación del 0.5-al 3.0 % (por peso).
Por otro lado, en la solicitud US20120015062 se describen composiciones que comprenden extracto de la planta Agapanthus africanus y composiciones que comprenden este extracto mas otros extractos de otras plantas diferentes, como por ejemplo plantas de la familia Rosa o de alfalfa para usarse como agentes en la protección biológica de otras plantas incluyendo sus semillas. A pesar de que en este documento de solicitud de patente se hace referencia al artículo publicado por Leksomboon et al. (Kasetsart, Journal Natural Science 35: 392-396, 2001.) en donde se menciona que extractos obtenidos de diversas plantas (Hibiscus sabdaríffa, Psidium guctjava, Púnica granatum, Spondias pinnata and Tamarindus indica) tienen una función antimicrobiana, dicho documento no aporta ninguna evidencia experimental que involucre los extractos de Hibiscus sabdaríffa para el mismo uso que se le da a los extractos de Agapanthus africanus.
Por lo anterior, es necesario contar con composiciones antimicrobianas protectoras efectivas para evitar y/o combatir la contaminación microbiana de los alimentos, principalmente de aquellos que se consumen crudos, como por ejemplo los tomates, con la finalidad de preservarlos y consumirlos sin el riesgo de adquirir enfermedades causadas por su contaminación con microorganismos patógenos.
Hasta antes de la presente invención, no había sido posible desarrollar composiciones efectivas para desinfectar eficientemente y sin daño al producto como las descritas aquí, y que al mismo tiempo permitieran conservar las propiedades nutritivas de frutas y verduras y no afectar, por ejemplo la calidad del tomate, con lo cual es posible con la presente invención obtener tomates crudos inocuos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Se muestra el espectro de resonancia magnético nuclear (RMN) de
PROTÓN (1H) del extracto metanólico seco obtenido de los cálices de jamaica que se utilizó en la presente invención.
Figura 2. Se muestra el espectro de resonancia magnético nuclear (RMN) de
PROTÓN (1H) de la colección de fracciones denominada como IV que fue obtenida a partir extracto metanólico de los cálices de Jamaica y que fue la colección que se utilizó en la presente invención.
Figura 3. Se muestra el espectro de resonancia magnético nuclear (RMN) de
CARBONO (13C) de la colección de fracciones denominada como IV que fue obtenida a partir extracto metanólico de los cálices de Jamaica y que fue la colección que se utilizó en la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
De acuerdo con los problemas mencionados anteriormente, existe la necesidad de proveer una formulación de mayor eficacia para inactivar o remover microorganismos patógenos del tomate (Solanum lycopersicum) aún en condiciones extremas de tratamiento, pero que no dañen sensorialmente el alimento.
La presente invención se refiere a composiciones que contienen fitoquímicos presentes en extractos de plantas que son utilizados como desinfectantes de alimentos de origen vegetal y animal, por ejemplo dirigidos a la desinfección y preservación de frutas y hortalizas, particularmente a la desinfección y/o preservación de tomate {Solanum lycopersicum).
Una modalidad de la presente invención se refiere a la obtención de un preparado vegetal que comprende un extracto metanólico de los cálices de la flor de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) ó fracciones cromatográficas especificas obtenidas del extracto metanólico de los cálices de Jamaica, los cuales son útiles para eliminar agentes patógenos presentes en los alimentos (efecto desinfectante) y para retrasar el deterioro de los alimentos o preservar su inocuidad (efecto conservador).
Otra modalidad de la presente invención se refiere a la obtención de extractos derivados de plantas que son utilizados como desinfectantes contra microorganismos patógenos presentes en los alimentos y para retrasar el deterioro de los alimentos y/o preservar su inocuidad, es decir, como conservadores para alimentos, los que constituyen una alternativa a! uso de desinfectantes tradicionales que pueden llegar a ser tóxicos al ser humano, a los animales o al medio ambiente.
Otra modalidad de la presente invención se refiere a la elaboración de composiciones que contengan el extracto de los cálices de jamaica (Hibiscus sabdaríffa L.) que tengan una función desinfectante y conservadora de alimentos conjuntamente con otros compuestos que tengan propiedades desinfectantes por ejemplo ácido acético, hipoclorito, etc.
Otra modalidad de la presente invención se refiere a la obtención de extractos obtenidos a partir de cálices de jamaica que tienen un efecto desinfectante o conservador cuando son aplicados a alimentos. Un aspecto de esta modalidad se refiere a la aplicación de extractos obtenidos a partir de cálices de la planta de jamaica (Hibiscus sabdaríffa L.) que tienen un efecto desinfectante o conservador cuando son aplicados a alimentos de origen vegetal, preferentemente tomates.
Otra modalidad de la presente invención es ei desarrollo de un método para ¡a obtención del extracto metanólico a partir de cálices de Jamaica, extracto que resulta ser útil como desinfectante y conservador de alimentos.
Otra modalidad de la presente invención se refiere al método para obtener fracciones cromatográficas especificas y con efecto antimicrobiano obtenidas del extracto metanólico de los cálices de jamaica, los cuales son útiles para eliminar agentes patógenos presentes en los alimentos (efecto desinfectante) y para retrasar el deterioro de los alimentos o preservar su inocuidad (efecto conservador). Otra modalidad de la presente invención es un método de tratamiento y/o conservación de alimentos de origen animal y/o vegetal mediante la aplicación de composiciones que contienen extractos de cálices de jamaica que permiten la desinfección y su conservación de los mismos.
El uso de los extractos de cálices de jamaica como desinfectante y/o conservador de alimentos, es otra modalidad que se describe en la presente invención.
Los compuestos provenientes de los cálices de Jamaica pueden ser de utilidad en la elaboración de un desinfectante eficiente para eliminar a las bacterias patógenas presentes en las verduras crudas, tal como el tomate. En la presente invención se describe un extracto de cálices de jamaica y una fracción especifica obtenida por cromatografía en columna a partir de un extracto metanólico de los cálices de jamaica, que comprende fitoquímicos, el cual puede ser utilizado como desinfectante y/o conservador de alimentos debido a su eficiencia en la eliminación de bacterias patógenas de verduras crudas tales como tomate.
A diferencia de otras composiciones conocidas hasta ahora para el mismo fin, las composiciones de la presente invención son capaces de eliminar a las bacterias patógenas presente en verduras crudas, como por ejemplo tomate per se, sin alterar sus propiedades alimenticias así como las características de calidad del producto. En consecuencia, la aplicación de las composiciones de la presente invención en verduras crudas, permite su conservación, así como su desinfección efectiva, lo que los convierte en alimentos seguros para su consumo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Las composiciones de la presente invención comprenden extractos de plantas con conocida actividad antimicrobiana, como por ejemplo extractos metanólicos de Jamaica y fracciones cromatográficas especificas obtenidas del extracto metanólico de los cálices de jamaica, ya sean solos o en combinación con otros componentes con probada actividad desinfectante, tales como por ejemplo ácidos orgánicos que incluyen ácido acético y compuestos de cloro que incluyen hipoclorito de sodio. Para el caso de la desinfección de verduras crudas tales como por ejemplo tomate, las composiciones de la invención que incluyen una mezcla de extractos metanólicos de plantas con actividad antimicrobiana así como ácido acético e hipoclorito de sodio y polisorbato, y una mezcla de fracciones cromatográficas especificas obtenidas del extracto metanólico de los cálices de jamaica así como ácido acético e hipoclorito de sodio y polisorbato, suelen ser muy efectivas para eliminar los microorganismos residentes en el vegetal, logrando al mismo tiempo que sus propiedades organolépticas y/o nutricionales no se vean afectadas y sin que se altere, por ejemplo la calidad comercial del tomate.
. Para efectos de la presente invención, las composiciones descritas aquí, comprenden: a) Extractos derivados de plantas, los cuales exhiban propiedades antimicrobianas, como por ejemplo extractos derivados de cálices de jamaica (Hibiscus sabdaríffa),
b) Fracciones cromatográfica obtenidas del extractos metanólicos derivados de plantas, las cuales exhiban propiedades antimicrobianas, como por ejemplo fracciones cromatográfica obtenidas de cálices de Jamaica (Híbiscus sabdaríffa),
c) Un acido orgánico con actividad desinfectante, como por ejemplo ácido acético, ácido láctico, acido cítrico, ácido peracético, ácido octanoico, ácido peroxietanoico y ácido 1-hidroxietiliden-1,1-difosfónico, y mezclas de los mismos, en una concentración p/p de 0.01% a 10%, preferentemente de 0.1% a 1%,
d) Un compuesto de cloro con actividad desinfectante, como por ejemplo hipoclorito de sodio, hipoclorito de calcio, bióxido de cloro y mezclas de los mismos en una concentración p/p de 0.001% a 10%, preferentemente de 0.001% a 0.1%, y e) Un tensoactivo con actividad emulsificante de las grasas o ceras naturales que se encuentran en el tomate, como por ejemplo, polisorbatos, Polisorbato 80, Polisorbato 20, alquil C12-C18 dimetil betaína (cocobetaína, alquil C10-C16 dimetilbetaína (laurilbetaína), Suffobetaína acil (C10-C14 graso) amidopropilen(hidroxipropilen), sulfobetaína, Ciclodextrinas, B-ciclodextrinas y β- Cyclodextrin y mezclas de los mismos en una concentración p/p de 0.1% a 5%, preferentemente de 0.5% a 1%. Para efectos de la invención, las composiciones se agregan a los alimentos a desinfectar y/o preservar a través de métodos conocidos en el arte, tales como aplicación directa, a través de aerosoles, la inmersión completa de las frutas y verduras en las soluciones desinfectantes o bien mediante dispositivos que permitan su adecuada dispersión en los alimentos a tratar. Las composiciones de la invención pueden adicionarse o ponerse en contacto con los alimentos en una cantidad de 0.1 mL por 1000g de alimento, preferentemente de 0.1 a 1mL por 100g de alimento, o bien adicionarse en volúmenes mayores conforme a las necesidades que se tengan de desinfección del alimento. Después de aplicadas, las composiciones pueden permanecer el tiempo necesario hasta obtener el efecto desinfectante y/o de preservación deseado en las frutas y verduras. Previo a su consumo, las frutas y verduras tratadas con las composiciones descritas aquí simplemente se lavan con agua potable para eliminar dichas composiciones.
Las composiciones descritas aquí, pueden ser obtenidas mediante la mezcla de sus componentes en las concentraciones deseadas, para posteriormente almacenarlas a temperatura ambiente, con lo que se encuentran listas para aplicarse a los alimentos cuando se considere necesario.
Para efectos de la invención, las composiciones descritas aquí pueden contener solamente extractos vegetales con actividad antimicrobiana, como por ejemplo extractos derivados de cálices de Jamaica, o bien fracciones cromatográficas obtenidas a partir de los extractos acuosos, metanólicos o acetónicos de los cálices de Jamaica, los cuales se ponen en contacto con los alimentos, por ejemplo a alimentos de origen vegetal crudos como el tomate, con la finalidad de desinfectarlos y/o preservarlos. En la presente invención, se describe la actividad desinfectante de extractos derivados de Jamaica y de fracciones cromatográficas obtenidas a partir de los extractos de los cálices de Jamaica, en la desinfección y/o preservación de alimentos, por ejemplo frutas y verduras crudas, por lo que pueden usarse directamente o bien formando parte de composiciones que las contengan. En este sentido, los extractos o fracciones cromatográficas derivados de los cálices de Jamaica, pueden adicionarse o ponerse en contacto con los alimentos a desinfectar y/o preservar en una concentración p/p de 0.001% a 10%, preferentemente de 0.1% a 1%. La efectividad desinfectante y/o de preservación en los alimentos de las composiciones descritas aquí es tal, que inactiva o elimina a las bacterias patógenas al humano o deterioradoras de alimentos que puedan estar presentes en ellos, mientras que al mismo tiempo no afecta las propiedades organolépticas y/o nutritivas del alimento. En el caso de alimentos frescos como por ejemplo tomate, las composiciones de la invención desinfectan adecuadamente el alimento sin afectar sus propiedades alimenticias, mientras que al mismo tiempo no afectan las propiedades organolépticas o de calidad.
Los extractos vegetales de la presente invención y las fracciones cromatográficas puede ser obtenidos mediante el método siguiente: a) Colocar la planta seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir agua, metanol o acetona en proporción1 :9; preferentemente se colocan 100 g de la planta seca en un recipiente (matraz) en condiciones asépticas, se añaden 900 mi de metanol y se deja reposar durante 7 días;
b) Retirar los cálices y recuperar el extracto acuoso, metanólico y/o acetónico; preferentemente el extracto resultante se recupera previa presión en las paredes del matraz para retirar el exceso de líquido;
c) Pasar el extracto por un tamiz y recuperar el extracto filtrado; preferentemente el extracto se pasa por un tamiz No. 200;
d) Retirar el agua, metanol o acetona del extracto mediante rota-evaporación a una temperatura de 40°C, una rotación de 80 rpm y una presión a vacío de 72 mbar; e) Recuperar el extracto seco; preferentemente en un contener previamente estéril; f) Obtener fracciones de los extractos acuoso, metanólico o acetónico mediante cromatografía en columna empleando solventes de diferente polaridad;
g) Eliminar el solvente de las fracciones obtenidas mediante rota-evaporación a una temperatura de 40°C, una rotación de 80 rpm y una presión a vacío de 72 mbar; y h) Recuperar las fracciones secas; preferentemente en un contener previamente estéril.
Obtenidos los extractos y las fracciones cromatográficas, éstas se almacena a temperatura ambiente hasta su uso. Una vez obtenidos los extractos y las fracciones cromatográficas, éstas puede utilizarse solas, o bien en combinación con otros desinfectantes para obtener las composiciones de la invención, las cuales pueden ser obtenidas mediante métodos conocidos en el arte donde implique la combinación de los diversos elementos que las conforman para formar soluciones y/o suspensiones capaces de ser aplicadas posteriormente a los alimentos a desinfectar y/o preservar, mediante métodos conocidos en el arte.
La presente invención constituye el primer reporte de la utilización y efectividad de composiciones que contienen extractos vegetales con actividad microbiana, ya sea solos o en combinación con otros desinfectantes, para la desinfección y/o preservación de alimentos, particularmente de frutas y hortalizas, como por ejemplo el tomate. Como podrá observarse más adelante, las composiciones de la invención son capaces de desinfectar y/o eliminar microorganismos presentes en tomate de forma muy eficiente, con lo que es posible contar con tomates inocuos microbiológicamente y seguros para su consumo.
A continuación se incluyen los siguientes ejemplos con la única finalidad de ilustrar la presente invención, sin que ello implique limitación alguna a su alcance.
Ejemplo 1. Materiales y métodos.
1.1. Material vegetal.
Se usaron cálices secos de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) de la variedad criolla de Oaxaca, mientras que en el caso del tomate (Solanum lycopericum) se utilizó la variedad saladette y fue proporcionado por un productor del estado de Hidalgo. Los tomates tuvieron un tamaño uniforme.
1.2. Cepas bacterianas.
Se utilizaron cepas de E. coli 0157.H7 (P1C6, aislada de un brote de enfermedad), E. coli enteroinvasiva (4VC81-5, aislada de caso clínico) E. coli enterotoxigénica (1620 TL, aislada de caso clínico), E. coli enteropatógena (52 GM 291 , aislada de caso clínico), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Salmonella choleraesuis (ATCC 10708), Listeria monocytogenes (ATCC 19115), Listeria monocyiogenes Scott A, Siaphylococcus epidermis (ATCC 12228), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Bordetella (ATCC 12741) Shigella sonnei (ATCC 25931) y Shigella flexneri (ATCC 12022), V. cholerae (87151, serotipo Inaba aislada del ambiente) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). Las cepas de E. coli 0157:H7 y la de V. cholerae 01 fueron donadas por el Dr. Fernández Escartin de la Universidad Autónoma de Querétaro. Todas las cepas fueron marcadas con resistencia al antibiótico rifampicina (R+) para eliminar la interferencia de la flora microbiana nativa del extracto (Castro-Rosas y Escartin, 2000). Ésta resistencia al antibiótico se mantuvo en el transcurso durante todo el estudio. Las cepas se mantuvieron a 4 - 7°C en agar base sangre (ABS, Merck®, Alemania) con transferencias quincenales, activándose en caldo soya tripticaseína (CST, Bioxon®, México) con incubación a 35°C/24h.
1.3. Obtención de extracto acuoso a partir de los cálices de Jamaica.
Bajo condiciones asépticas 100 g de cálices de Jamaica fueron colocados en un matraz Erlenmeyer, a los cuales se les adicionó 900 mL de agua destilada, llevando a ebullición la mezcla durante 20 minutos. Una vez finalizado el tratamiento se dejó enfriar a temperatura ambiente. Los cálices fueron retirados del extracto (previa presión en las paredes del matraz para retirar el exceso de líquido de ello) y posteriormente el extracto se pasó por un tamiz No. 200 (MONTIMAX) para eliminar partículas. Finalmente se retiró toda el agua del extracto por rota evaporación empleado un rota evaporador (Buchi R-205) empleando las condiciones siguientes: temperatura de 40°C de la tina, rotación de 80 rpm y una presión a vacío de 72 mbar. El extracto seco se recuperó en un frasco estéril y se almacenó a temperatura ambiente hasta su uso.
1.4. Obtención de extracto metanólico y acetónico a partir de los cálices de Jamaica.
Bajo condiciones asépticas 100 g de cálices de Jamaica fueron colocados en un matraz Erlenmeyer, a los cuales se les adicionó 900 mL de metanol o acetona y se almacenaron durante 7 días a temperatura ambiente. Una vez finalizado el tratamiento los cálices fueron retirados del extracto (previa presión en las paredes del matraz para retirar el exceso de líquido de ello) y posteriormente el extracto se pasó por un tamiz No. 200 (MONTIMAX) para eliminar partículas. Finalmente se retiró todo el metanol o acetona del extracto por rota evaporación empleado un rota evaporador (Buchi R-205) empleando las condiciones siguientes: temperatura de 40°C de la tina, rotación de 80 rpm y una presión a vacío de 72 mbar. Los extractos secos (metanólico o acetónico) se recuperaron por separado en frasco estéril y se almacenó a temperatura ambiente hasta su uso.
1.5. Obtención de fracciones a partir del extracto metanólico mediante cromatografía en columna
Una vez que se ha obtenido el extracto seco (libre de solventes), éste se mezcló con silica (con el fin de hacer manejable el extracto, ya que este aun tenía humedad), este se agregó a la columna empaquetada. Se colocó algodón en el fondo de la columna con ayuda de una varilla para evitar que se desprendiera el gel de sílice cuando se abría la llave, se sujetó la columna con dos pinzas y se aseguró de tal manera que estuviera recta. Se mezcló el gel sílice con hexano aproximadamente 8:1g. (gel sílice: extracto), esta cantidad se mezcló con hexano hasta obtener una pasta fluida, se vertió la pasta en la columna, la cantidad de hexano agregada debió ser la suficiente para evitar que la silica se secará o ingresará aire a la pasta, posteriormente se agregó poco a poco el extracto, se le agregó una pequeña capa de sulfato de sodio (este sirve como secante), encima de este se le puso una capa de algodón para amortiguar la caída del disolvente al ser agregado y así evitar la dispersión del sulfato de calcio y el extracto, después de este procedimiento se llenó la columna con el disolvente (hexano) y se abrió la llave para comenzar a bajar las fracciones con las diferentes mezclas de solventes, recuperándolas en cantidades de 50 mi cada una, que posteriormente se evaporaron con ayuda del rotaevaporador, y estas fueron colocadas en viales, considerando cada una de estas como una fracción. Para cambiar la mezcla de solventes se realizó cromatografía en placa fina, y al encontrar diferencias claramente visibles (por la aparición de bandas distintas en tamaño y forma) entre fracciones la mezcla se cambiaron de menor a mayor polaridad (hexano, acetato de etilo y metanol) en la tabla 2 se muestran las mezclas de solvente utilizadas y con las que se eluyó.
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De un total de 28.339 g de extracto metanólico se obtuvieron 193 fracciones de las cuales después de determinar la semejanza de las fracciones mediante
cromatografía en capa fina se obtuvieron 7 colecciones de fracciones (Tabla 3).
Tabla 3. Numero de fracciones reunidas en cada colección obtenidas a partir del extracto metanólico
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1.6. Obtención de fracciones a partir del extracto acetónico mediante cromatografía en columna.
Una vez que se ha obtenido el extracto seco (libre de solventes), éste se mezcló con silica (con el fin de hacer manejable el extracto, ya que este aun tenía humedad), este se agregó a la columna empaquetada. Se colocó algodón en el fondo de la columna con ayuda de una varilla para evitar que se desprendiera el gel de sílice cuando se abría llave, se sujetó la columna con dos pinzas y se aseguró de tal manera que estuviera recta. Se mezcló el gel sílice con cioroformo aproximadamente 8: 1g. (gel sílice: extracto), esta cantidad se mezcló con cloroformo hasta obtener una pasta fluida, se vertió la pasta en la columna, la cantidad de cloroformo agregada debió ser la suficiente para evitar que la silica se secará o ingresará aire a la pasta, posteriormente se agregó poco a poco el extracto, se le agregó una pequeña capa de sulfato de sodio (este sirve como secante), encima de este se le puso una capa de algodón para amortiguar la caída del disolvente al ser agregado y así evitar la dispersión del sulfato de calcio y el extracto, después de este procedimiento se llenó la columna con el disolvente (cloroformo) y se abrió la llave para comenzar a bajar las fracciones con las diferentes mezclas de solventes, recuperándolas en cantidades de 50 mi cada una, que posteriormente se evaporaron con ayuda del rotaevaporador, y estas fueron colocadas en viales, considerando cada una de estas como una fracción. Para cambiar la mezcla de solventes se realizó cromatografía en placa fina, y al encontrar diferencias entre fracciones la mezcla se cambiaron de menor a mayor polaridad (cloroformo-acetona) en la tabla 4 se muestran las mezclas de solvente utilizadas y con las que se eluyó.
De un total de 20.5 g de extracto acetónico se obtuvieron 117 fracciones de las cuales después de determinar la semejanza de las fracciones mediante cromatografía en capa fina se obtuvieron 7 colecciones de fracciones (Tabla 5).
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Finalmente se retiró todo el metanol o acetona de cada colección por rota evaporación empleado un rota evaporador (Buchi R-205) empleando las condiciones siguientes: temperatura de 40°C de la tina, rotación de 80 rpm y una presión a vacío de 72 mbar. Las colecciones secas (metanólico o acetónico) se recuperaron por separado en frascos limpios y se almacenaron a temperatura ambiente hasta su uso.
1.7. Determinación de la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos, metanólico y acetónico, del acido acético, hipoclorito y de las fracciones correspondientes provenientes de los cálices de Jamaica en medio de cultivo (estudios in vitro).
1.7.1. Preparación del inoculo de las cepas.
Tubos de ensayo con cultivos de 24 h en CST de cada cepa R+, fueron centrifugados a 3500 rpm por 20 min. Posteriormente se desechó el sobrenadante; el paquete celular se resuspendió agregando 3 mL de solución salina isotónica estéril y se agitó en vortex por 10 s. El procedimiento anterior se repitió dos veces más. Posteriormente, la concentración de cada cepa fue de aproximadamente 1x109 UFC /mL. Finalmente cada cepa se diluyó decimalmente en solución salina isotónica una sola ocasión.
1.7.2. Preparación de las soluciones de los extractos o de las fracciones.
A partir de los extractos secos o fracciones (colecciones) secas se prepararon soluciones acuosas empleando agua destilada estéril o una solución de Polisorbato 80: agua en una proporción 20:80. Los extractos acuosos y metanólico y fracciones acetónicas (fracción III) y metanólicas (fracción IV) y se solubilizaron en agua destilada mientras que los extractos acetónicos y fracciones no polares o de polaridad baja fueron solubilizados en ia solución de Polisorbato 80:agua. A el agua o a el polisorbato 80:agua se les agregaron los extractos secos o fracciones en una proporción 1:10 y 1 :100 (agua:extracto ó agua:fracción) por separado y se depositarán en frascos estériles.
1.7.3 Efecto antimicrobiano de los extractos y las fracciones en medio de cultivo.
Por separado, 100 μL de la primera dilución de los cultivos de los patógenos fueron inoculados sobre cajas de AST suplementadas con 10 mg/L de el antibiótico rifampicina, el inoculo se distribuyó en toda la superficie del agar mediante la técnica de extensión por superficie. Sobre las cajas inoculadas, por separado, se colocaron alícuotas de 10 de la solución de los extractos (acuoso, metanólico o acetónico), o de las fracciones cromatográficas. Se realizaron cuatro repeticiones para cada tratamiento. Después de que el extracto o fracciones fueron absorbidos por el agar, las cajas de cultivo se incubaron a 35 ± 1°C, por 24 h. Finalmente se midió el diámetro de cada uno de los halos de inhibición formados en la superficie del medio inoculado.
1.8. Evaluación del efecto antimicrobiano de los extractos acuoso, metanólico, acetónico, fracciones cromatográficas y formulaciones específicas en la reducción de Salmonella y E. coli O157: H7 en el tomate contaminado.
1.8.1. Preparación de las soluciones desinfectantes.
Las soluciones de extractos de cálices de Jamaica, mezclas a base de extractos y fracciones cromatográficas así como las mezclas conteniendo acido acético, hipoclorito y/o poiisorbato 80 % fueron preparadas a las concentraciones, proporciones o mezclas que se describen en la Tabla 6. Por ejemplo, para preparar 100 mi de una solución conteniendo extracto metanólico de cálices Jamaica al 1 %, acido acético al 0.1 % y 100 mg/L de hipoclorito: a 100 mL de agua destilada se le agregó 1 g de extracto metanólico seco de cálices de Jamaica, además 1 mi de una solución de acido acético aMO % y 0.2 mi de una solución de hipoclorito al 5 %.
1.8.2. Cepas.
Para éstos estudios se trabajó con 7 serotipos de Salmonella: (3 typhimurium [ATCC 14028, uno aislado de tomate, J1 , y otro de semilla de alfalfa, GA1], Salmonella choleraesuis [ATCC 10708], typhi, gaminara, y montevideo) y 3 de E. coli O157:H7 (dos aisladas en nuestro laboratorio a partir de carne cruda molida de res [P1C6 y M5C8] y otra aislada de un brote provocado por consumo de carne en los Estados Unidos de Norteamérica [E09]), esta cepa fue donada por el Dr. Eduardo Fernández Escartin de la Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo. A partir de las cepas nativas se obtuvieron cepas mutantes resistencia al antibiótico rifampicina (R+), esto para ser usadas en los estudios. Al incorporar el antibiótico al medio de cultivo para monitorear el comportamiento de las cepas mutantes se eliminaría la interferencia de la flora microbiana nativa de los extracto, fracciones y material vegetal de estudio (Castro y Escartin, 2000).
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1.8.3. Preparación del inoculo de las cepas.
Tubos de ensayo con cultivos de 24 h en CST de cada cepa R+, fueron centrifugados a 3500 rpm por 20 min. Posteriormente se desechó el sobrenadante; el paquete celular se resuspendió agregando 3 mL de solución salina isotónica estéril y se agitó en vortex por 10 s. El procedimiento anterior se repitió dos veces más. La concentración resultante de cada cepa fue de aproximadamente 1x109 UFC /mL. Un mililitro de cada cepa de Salmonella fue mezclado en un tubo de ensaye vacío para tener una mezcla de las 7 cepas de Salmonella examinadas. Lo mismo se realizó con las cepas de E. coli 0157:H7, para tener una mezcla de las tres cepas de E. coli 0157:H7.
1.8.4. Inoculación del tomate
Se utilizaron tomates de la variedad saladete; los tomates fueron obtenidos de un productor local. Previo a la inoculación, los tomates fueron limpiados con un paño limpio para retirar partículas de polvo. Se utilizaron tomates de un tamaño uniforme o semejante y que no presentaron daños visibles. Por separado, se inocularon tomates individuales colocando en la parte central (no en pedúnculo) del fruto 10 μL de una suspensión de cada tipo de mezcla de bacteria patógena (Salmonella ó E. coli O157:H7) microorganismos conteniendo aproximadamente 1 x 107 UFC, los tomates inoculados se colocaron en una charolas y se introdujeron en una campana bioclimática por dos horas a una humedad relativa de 90±1% y 26.5±1 °C. La finalidad de este tratamiento fue la de provocar la adherencia o infiltración de las células de las bacterias patógenas de estudio para simular las condiciones naturales, en otras palabras, la de tener un modelo que se asemejase en lo posible a lo que ocurre cuando los tomates se contaminan por las fuentes de contaminación naturales o comunes con las bacterias patógenas.
1.8.5. Tratamiento de desinfección de los tomates.
Después de las dos horas en la cámara bioclimática, cada fruto se lavó por separado para eliminar los microorganismos que no se adhirieron, el lavado consistió en sumergir y agitar la parte inoculada del tomate en agua destilada por 10 s, se dejó escurrir la parte lavada a temperatura ambiente hasta sequedad total y posteriormente por separado la parte inoculada de diferentes tomates se sumergió por 10 min en las diferentes soluciones desinfectantes señaladas en la Tabla 6. Un tratamiento solo con agua destilada sirvió como control positivo.
1.8.6. Recuento de microorganismos sobrevivientes a los tratamientos
Después del tratamiento, los tomates se retiraron de la solución desinfectante y para eliminar el desinfectante remanente se sumergió la parte inoculada en agua destilada por 10 s, posteriormente se corto la parte inoculada (un cuadro de aproximadamente 2 x 2 cm y con una profundidad de aprox. 2 cm) con ayuda de un bisturí estéril, cada porción se colocó de manera independiente en una bolsas de plástico y se adicionaron 10 mi de diluyente de peptona. Posteriormente, los materiales se agitaron manualmente presionando y frotando con fuerza la parte inoculada y toda la porción de tomate desde la parte exterior de la bolsa por un minuto. Después de este tiempo se realizó el recuento de cada bolsa mediante la técnica de vertido en placa empleando agar para métodos estándar (Bioxon, México) adicionado de 100 mg/L de Rifampicina (Sigma, México), las cajas se incubaron a 35°C/24-48 h. Este procedimiento se realizó por duplicado para cada replica. Cada tratamiento se efectuó por quintuplicado.
18.7. Análisis estadístico
Los resultados obtenidos se analizaron estadísticamente con un- análisis de varianza de una sola vía (ANOVA) comparando las medias con la prueba de Tukey, con un nivel de significancia del 0.05.
1.9. Resonancia Magnética Nuclear (RMN) del extracto y de la colección IV
Se determinó el espectro de RMN del protón (1H) tanto del extracto metanólico seco obtenido de los cálices de Jamaica como de la colección de fracciones denominada como "IV" que fue obtenida a partir del extracto metanólico de los cálices de Jamaica y que fue la colección que se utilizó en las formulaciones. También se obiuvo ei especiro de RMN de Carbono (13C) soio de ia colección de fracciones denominada como "IV" que fue obtenida a partir extracto metanolico de los cálices de Jamaica.
El extracto metanolico secos y/o la colección IV se solubilizaron en agua deuterada. Los espectros de RMN se obtuvieron utilizando un espectrómetro de resonancia magnética nuclear (Varían NMR, 400 MHz).
La espectroscopia de RMN estudia los núcleos atómicos. Esta técnica espectroscópica puede utilizarse sólo para estudiar núcleos atómicos con un número impar de protones o neutrones (o de ambos), para determinar las estructuras de los compuestos orgánicos. Esta situación se da en los átomos de 1H, 13C, 19F y 31P. Este tipo de núcleos son magnéticamente activos, es decir poseen espín, igual que los electrones, ya que los núcleos poseen carga positiva y poseen un movimiento de rotación sobre un eje que hace que se comporten como si fueran pequeños imanes. El espectrómetro de RMN detecta estas señales y las registra como una gráfica de frecuencias frente a intensidad, que es el llamado espectro de RMN
Ejemplo 2. Efecto antimicrobiano de ios extractos de los cálices de Jamaica.
Los tres tipos de extractos (acuoso, metanolico y acetónico) mostraron un acentuado efecto antimicrobiano (Tabla 7). Todos los microorganismos ensayados fueron inhibidos desde los primeros instantes de contacto. El efecto inhibitorio observado sugiere la presencia de substancias antimicrobianas en los extractos. Este efecto puede provocar un daño letal a la célula o solo causar un efecto subletal ó estrés celular (Busta, 1976). Distintos componentes del vegetal podrían ser los responsables de éste efecto antimicrobiano.
Con la finalidad de separar, aislar y/o concentrar las sustancias antimicrobianas presentes en los extractos de los cálices de Jamaica, los extractos se separaron en diferentes compuestos o grupos de compuestos con base en su polaridad; para esto se recurrió a la separación de los compuestos por cromatografía en columna, de esta manera se obtuvieron diferentes grupos de compuestos o grupos de fracciones (colecciones de fracciones, ver metodología). Posteriormente se probó el efecto antimicrobiano de las colecciones de fracciones obtenidas. Debido a que el extracto acetónico y el metanólico tuvieron mayor efecto antimicrobiano que el extracto acuoso, no se separaron por cromatografía los componentes del extracto acuoso.
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Ejemplo 3. Efecto antimicrobiano de diferentes fracciones cromatográficas.
En las Tabla 8 se muestra el efecto inhibitorio expresado en longitud del halo de inhibición en milímetros (mm), que se observó en cajas de petri sembradas con diferentes microorganismos, por el efecto de diferentes colecciones de fracciones cromatográficas agrupadas por polaridad obtenidas a partir del extracto acetónico de los cálices de Jamaica. Se observa que sólo las colecciones II y III provenientes de extracto acetónico muestran efecto antimicrobiano o inhibitorio. La colección III es la que mostró el mayor efecto antimicrobiano (Tabla 8). Esta fracción III se utilizó para realizar las mezclas o formulaciones que se utilizaron en los experimentos de desinfección de los tomates.
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En las Tabla 9 se muestra el efecto inhibitorio en mm de diferentes colecciones de fracciones cromatográficas agrupadas por polaridad obtenidas a partir del extracto metanólico de los cálices de Jamaica. Se observa que todas las colecciones provocaron halos de inhibición lo cual se interpreta como efecto antimicrobiano de las colecciones. No obstante, la colección IV es la que mostró el mayor efecto antimicrobiano (Tabla 9). Esta fracción IV se utilizó para realizar las mezclas o formulaciones que se utilizaron en los experimentos de desinfección de los tomates.
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Ejemplo 4. Potencial desinfectante de los extractos y fracciones solos o en mezclas con ácido acético, hipoclorito de sodio y/ó Polisorbato 80.
Se encontró que todos los tratamientos tuvieron efecto anti microbiano con respecto al control. Los datos de este estudio se encuentran reportados en la tabla 10. Se observa que aunque todos los tratamientos muestran efecto antimicrobiano sólo 4 combinaciones lograron eliminar a niveles no detectables la concentración de las mezclas de cada patógeno: los tratamientos 24, 25, 28 y 29 redujeron 5 log10 la concentración de ambos patógenos (Tabla 10).
En la presente invención, 4 combinaciones específicas (tratamiento 24, 25, 28 y 29) de tres antimicrobianos y un tensoactivo (polisorbato) se logró la eliminación total de los microorganismos patógenos inoculados sobre el tomate; esto es un ejemplo de lo que actualmente se conoce como tratamiento de barreras múltiples. Las barreras múltiples son la combinación de tratamientos antimicrobianos que potencian el efecto antimicrobiano global, lo que da como resultado alimentos estables, seguros e inocuos.
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Cabe señalar el posible papel potenciador del polisorbato 80 en el efecto antimicrobiano observado, ya que al ser un tensoactivo es posible que haya favorecido la emulsificación de la cera natural de los tomates lo cual pudo incrementar el efecto de la solución desinfectante al eliminar o disminuir el efecto protector que la cera estaría proporcionando a los microorganismos inoculados sobre los tomates
Por lo anterior, las composiciones de la presente invención son una excelente alternativa para la desinfección y/o preservación de alimentos, por ejemplo alimentos frescos, sin que alteren sus propiedades nutritivas. En este sentido, las composiciones descritas aquí, permiten la desinfección efectiva de microorganismos patógenos de frutas y hortalizas, preferentemente tomates permitiendo el consumo seguro de tales productos.
Ejemplo 5. Espectro de resonancia magnético nuclear (RMN) obtenido del extracto metanólico seco.
El espectro de RMN obtenido del extracto metanólico seco de los cálices de Jamaica se presenta en la Figura 1. En el espectro se observan varios picos característicos del extracto que utilizamos en las formulaciones. Este espectro caracteriza el extracto metanólico usado en las formulaciones antimicrobianas de la tabla 10.
Ejemplo 6. Espectros de resonancia magnético nuclear (RMN) obtenidos de la colección cromatográfica IV proveniente del extracto metanólico.
De la colección cromatográfica IV obtenida a partir del extracto metanólico, (que fue usada en las formulaciones con afecto antimicrobiano), se obtuvieron 2 espectro de RMN, un espectro de carbono (13C) y otro del protón (1H); cada determinación nos da información diferente de la naturaleza de las moléculas que conforman la fracción cromatográfica de estudio, estos espectros se presentan en las Figuras 2 y 3. Debido al tipo de estudio de RMN realizado a la colección cromatográfica IV (análisis del carbón o del protón), se observan varios y diferentes picos característicos del extracto que utilizamos en las formulaciones. Estos dos espectros caracterizan la colección cromatográfica IV usada en las formulaciones antimicrobianas de la tabla 10. Referencias.
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Claims

REIVINDICACIONES Habiendo descrito suficientemente mi invención, considero corno una novedad y por io tanto reclamo como de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes cláusulas:
1. Una solución con actividad antimicrobiana para desinfectar y/o preservar tomates (Solanum lycopersicum). caracterizada porque comprende: a) Extracto metanólico de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa);
b) Ácido acético;
c) Hipoclorito de Sodio;
d) Monooleato de Polioxietileno Sorbitan, o polisorbato 80 (Polisorbato 80)
2. La solución con actividad anti microbiana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el a) extracto metanólico de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) está presente en una concentración entre 0.01% al 10%.
3. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el b) ácido acético está presente en una concentración entre 0.01 a 10%.
4. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el c) hipoclorito de Sodio está presente en una concentración entre 10 a 1000 ppm.
5. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el d) monooleato de Polioxietileno Sorbitan, o polisorbato 80 está presente en una concentración entre 0.1 a 10 %.
6. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el e) extracto metanólico de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) presenta un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) corno se observa en la Figura 1.
7. La solución de la reivindicación 1 , caracterizada porque tiene una presentación como formulación acuosa.
8. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque donde una o varias partes de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) pueden ser usadas para la obtención del extracto.
9. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, donde la parte de la planta de Jamaica que se emplea son los cálices.
10. La solución definida en las reivindicaciones anteriores, caracterizada por un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) del extracto metanólico obtenido de los cálices de la Jamaica (Hibiscus sabdariffa) (Figura 1).
11. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque es útil como desinfectante y conservador de alimentos de origen vegetal y animal.
12. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la formulación acuosa es útil como desinfectante y conservador de de frutas y verduras, especialmente tomates.
13. La solución de la reivindicación 1 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque las principales variedades del tomate {Solanum lycopersicum) sobre las que actúa como desinfectante se seleccionan de Saladette, Bola, Criolllo, Beef y Cherry, Racimo, Mini, Campari.
14. Un método para la desinfección y/o preservación de tomates (Solanum lycopersicum), caracterizado porque comprende aplicar al tomate la solución definida en las reivindicaciones anteriores.
15. Un extracto vegetal con actividad antimicrobiana para desinfectar y/o preservar tomates (Solanum lycopersicum), caracterizado porque es obtenido mediante las siguientes etapas: a) Colocar la planta seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir metanol y almacenar a 22° ± 2o C por 7 días,
b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar el metanol del extracto, y
c) Recuperar el extracto seco.
16. El extracto de la reivindicación 15, caracterizado porque se obtiene con metanol.
17. El extracto de conformidad con la reivindicación 15, porque donde una o varias partes de la planta pueden ser usadas para la obtención del extracto.
18. El extracto de la reivindicación 15, caracterizado porque la planta es la planta de Jamaica (Hibiscus sabdariffa).
19. El extracto de la reivindicación 15 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el extracto es obtenido de los cálices de la Jamaica.
20. El extracto de la reivindicación 15 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que presenta un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) como se observa en la Figura 1.
21. El extracto de la reivindicación 15 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque es útil como desinfectante y conservador de alimentos de origen animal y vegetal
22. El extracto de la reivindicación 15 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque es útil como desinfectante y conservador de frutas y verduras, preferentemente tomates.
23. El extracto de la reivindicación 15 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las principales variedades del tomate (Solanum lycopersicum) sobre las que actúa como desinfectante se seleccionan se seleccionan de Saladette, Bola, Criolllo, Beef y Cherry, Racimo, Mini, Campari.
24. Un método para la desinfección y/o preservación de tomate (Solanum lycopersicum), caracterizado porque comprende aplicar a los tomates el extracto definido en las reivindicaciones de la 15 a la 23.
25. Un método para obtener un extracto vegetal con actividad anti microbiana para desinfectar y/o preservar tomates (Solanum lycopersicum), caracterizado porque comprende las siguiente etapas: a) Colocar la planta seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir metanol y almacenar a 22° ± 2° C por 7 días,
b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar el metanol del extracto, y
c) Recuperar el extracto seco.
26. El método para obtener los extractos vegetales de la reivindicación 25, caracterizado porque el extracto puede tener una presentación sólida o liquida.
27. Un método para la preparación de una solución con actividad antimicrobiana para desinfectar y/o preservar tomates (Solanum lycopersicum), caracterizado por comprender los pasos de: a) Colocar Jamaica (Hibiscus sabdariffa) seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir metanol y almacenar a 22° ± 2° C por 7 días,
b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar el metanol del extracto y,
c) Recuperar el extracto seco,
d) Preparar la solución acuosa en un recipiente conteniendo: agua, extracto metanólico seco de la planta, ácido acético, hipoclorito de sodio y monooleato de Polioxietileno Sorbitan o polisorbato 80.
28. El método conforme a la reivindicación 27, donde la parte de la planta de Jamaica que se emplea son los cálices.
29. Una solución con actividad antimicrobiana para desinfectar y/o preservar tomates (Solanum lycopersicum), caracterizada porque comprende: a) Una colección de fracciones cromatográficas obtenida de un extracto metanólico de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa)',
b) Ácido acético;
c) Hipoclorito de Sodio;
d) Monooleato de Polioxietileno Sorbitan, o polisorbato 80 (Polisorbato 80).
30. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la a) colección de fracciones cromatográficas obtenida de un extracto metanólico de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) está presente en una concentración entre 0.01% al 10%.
31. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el b) ácido acético está presente en una concentración entre 0.01 a 10%.
32. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el c) hipoclorito de sodio está presente en una concentración entre 10 a 1000 ppm.
33. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el d) monooleato de Polioxietileno Sorbitan, o polisorbato 80 está presente en una concentración entre 0.1 a 10 %.
34. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la e) colección de fracción cromatográfica obtenida de un extracto metanólico de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) presenta un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) como se observa en la Figura 2.
35. La solución de la reivindicación 29, caracterizada porque tiene una presentación como formulación acuosa.
36. La solución de la reivindicación 29 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque donde una o varías partes de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) pueden ser usadas para la obtención de las colecciones de fracciones cromatográficas.
37. La solución de la reivindicación 29 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, donde la parte de la planta de Jamaica que se emplea son los cálices.
38. La solución de la reivindicación 29 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada por un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) de la colección de fracciones cromatográficas obtenida de un extracto metanólíco de cálices de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) (Figura 2).
39. La solución de la reivindicación 29 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque es útil como desinfectante y conservador de alimentos de origen vegetal y animal.
40. La solución de la reivindicación 29 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la formulación acuosa es útil como desinfectante y conservador de frutas y verduras, especialmente tomates.
41. La solución con actividad antimicrobiana de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque las principales variedades del tomate (Solanum lycopersicum) sobre las que actúa como desinfectante se seleccionan de Saladette, Bola, Criolllo, Beef y Cherry, Racimo, Mini, Campari.
42. Un método para la desinfección y/o preservación de tomates (Solanum lycopersicum), caracterizado porque comprende aplicar al tomate la solución definida en las reivindicaciones 29 a la 41.
43. Una colección de fracciones cromatográficas con actividad antimicrobiana para desinfectar y/o preservar tomates (Solanum lycopersicum), caracterizada porque es obtenida mediante las siguientes etapas: a) Colocar la planta seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir metanol y almacenar a 22° ± 2° C por 7 días,
b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar el metanol del extracto,
c) Recuperar el extracto seco,
d) Efectuar cromatografía para separar el extracto metanólico seco en fracciones cromatográficas utilizando solventes y mezclas de solventes de diferentes polaridades,
e) Recuperar en recipientes fracciones cromatográficas de diferentes polaridades, f) Retirar el solvente de las fracciones,
g) Agrupar o reunir en recipientes las fracciones para formar grupos (colecciones) de polaridades iguales o semejantes,
h) Efectuar ensayos microbiológicos con las colecciones,
i) Recuperar las colecciones de fracciones con actividad antimicrobiana.
44. La colección de fracciones cromatográficas de conformidad con la reivindicación 43, porque donde una o varias partes de la planta pueden ser usadas para la obtención de la colección de fracciones cromatográficas.
45. La colección de fracciones cromatográficas de la reivindicación 43 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la planta es la Jamaica (Hibiscus sabdariffa).
46. La colección de fracciones cromatográficas de la reivindicación 43 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque las fracciones son obtenidas de los cálices de la Jamaica.
47. La colección de fracciones cromatográficas con actividad antimicrobiana de la reivindicación 43 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la colección presenta un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) como se observa en la Figura 2.
48. La colección de fracciones cromatograficas de la reivindicación 43 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque es útil como desinfectante y conservador de alimentos de origen animal y vegetal.
49. La colección de fracciones cromatográficas de la reivindicación 43 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque es útil como desinfectante y conservador de frutas y verduras, preferentemente tomates.
50. La colección de fracciones cromatográficas de la reivindicación 43 de conformidad con las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque las principales variedades del tomate (Solanum lycopersicum) sobre las que actúa como desinfectante se seleccionan de Saladette, Bola, Criolllo, Beef y Cherry, Racimo, Mini, Campari.
51. El método para desinfectar y/o conservar frutas y verduras, preferentemente tomates con la colecciones de fracciones cromatográficas con actividad antimicrobiana del extracto de los cálices de Jamaica definida en las reivindicación de la 43 a la 50.
52. Un método para obtener colecciones de fracciones cromatográficas con actividad antimicrobiana a partir de un extracto vegetal para desinfectar y/o preservar tomates (Solanum lycopersicum), caracterizado porque comprende las siguiente etapas: a) Colocar la planta seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir metanol y almacenar a 22° ± 2° C por 7 días,
b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar el metanol del extracto,
c) Recuperar el extracto seco,
d) Efectuar cromatografía para separar el extracto metanólico seco en fracciones cromatográficas utilizando solventes y mezclas de solventes de diferentes polaridades,
e) Recuperar en recipientes fracciones cromatográficas de diferentes polaridades, f) Retirar el solvente de las fracciones, g) Agrupar o reunir en recipientes las fracciones para formar grupos (colecciones) de polaridades iguales o semejantes,
h) Efectuar ensayos microbiológicos con las colecciones,
i) Recuperar las colecciones de fracciones con actividad antimicrobiana.
53. El método conforme a la reivindicación 52, caracterizado porque las colecciones de fracciones cromatográficas puede tener una presentación sólida o liquida.
54. Un método para la preparación de una solución con actividad antimicrobiana para desinfectar y/o preservar tomates (Solanum lycopersicum), caracterizado por comprender los pasos de: a) Colocar la planta de Jamaica (Hibiscus sabdariffa) seca en un recipiente en condiciones asépticas, añadir metanol y almacenar a 22° ± 2° C por 7 días, b) Pasar el extracto por un tamiz y retirar el metanol del extracto,
c) Recuperar el extracto seco,
d) Efectuar cromatografía para separar el extracto metanólico seco en fracciones cromatográficas utilizando solventes y mezclas de solventes de diferentes polaridades,
e) Recuperar en recipientes fracciones cromatográficas de diferentes polaridades, f) Retirar el solvente de las fracciones,
g) Agrupar o reunir en recipientes las fracciones para formar grupos (colecciones) de polaridades iguales o semejantes,
h) Efectuar ensayos microbiológicos con las colecciones,
i) Recuperar las colecciones de fracciones con actividad antimicrobiana.
j) Preparar la solución acuosa en un recipiente conteniendo: agua, colecciones de fracciones cromatográficas con actividad antimicrobiana, ácido acético, hipoclorito de sodio y monooleato de Polioxietileno, Sorbitan o polisorbato 80.
55. El método conforme a la reivindicación 54, donde la parte de la planta de Jamaica que se emplea son los cálices.
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