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WO2015057009A1 - 알파나선형 세포 투과 펩타이드 다합체, 이의 제조방법 및 그 용도 - Google Patents

알파나선형 세포 투과 펩타이드 다합체, 이의 제조방법 및 그 용도 Download PDF

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WO2015057009A1
WO2015057009A1 PCT/KR2014/009778 KR2014009778W WO2015057009A1 WO 2015057009 A1 WO2015057009 A1 WO 2015057009A1 KR 2014009778 W KR2014009778 W KR 2014009778W WO 2015057009 A1 WO2015057009 A1 WO 2015057009A1
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WO
WIPO (PCT)
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peptide
peptides
cell
peptide multimer
multimer
Prior art date
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PCT/KR2014/009778
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English (en)
French (fr)
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유재훈
이연
현순실
장상목
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Original Assignee
SNU R&DB Foundation
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Priority to US15/030,051 priority patent/US20160229894A1/en
Priority to EP14853355.7A priority patent/EP3059242A4/en
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    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Definitions

  • the present invention relates to an alpha helical cell penetrating peptide multimer, a method for preparing the same, and a use thereof, and specifically, a peptide multimer comprising a plurality of double-sided peptides, a method for preparing the peptide multimer, and the peptide multimer as an active ingredient. It relates to a composition for preventing or treating HIV or a composition for delivery of the active material in the cell comprising the peptide multimer and a biologically active material.
  • Antimicrobial peptides are natural peptides that are produced from a host's primary immune response to conserve the host against externally invading pathogens. They mainly damage the cell membranes of invading pathogens to subdue the invading bacteria. Recently, however, some evidence suggests that such antibiotic peptides can suppress pathogens that invade other mechanisms in addition to damaging cell membranes. That is, they can suppress bacteria by binding to targets in the pathogen and blocking its function. In general, antibiotic peptides have a positive charge, which also binds to the negative charge of RNA, suggesting the potential of DNA or RNA as a target for pathogens. Antibiotic peptides invade mitochondria, which are organelles within pathogens, to induce apoptosis. This is because the surface of the mitochondria is charged with anions.
  • antibiotic peptides do not kill the bacteria by disrupting the membrane of the pathogen, but can bind to other targets in the cell and kill the bacteria.
  • a cell penetrating peptide (hereinafter, a cell penetrating peptide) having a property capable of penetrating cells is distinguished from an antibiotic peptide capable of killing pathogens.
  • cell-penetrating peptides have been found in viruses. These peptides have only the ability to penetrate cells different from their ability to kill cells because all functions of the host cell must be used for the survival of the virus. Representative examples are TAT peptides and Rev peptides, which help to invade the virus without killing the host.
  • the penetratin peptide derived from Antennapedia protein is a peptide containing 16 amino acids and is one of representative cell penetrating peptides having excellent cell penetrating ability (Korean Patent No. 10985841). There is a characteristic that contains a lot of positively charged arginine / lysine, such as antibiotic peptide (Fig. 1).
  • the amino acid composition of the cell-penetrating peptide the first one to be noticed is a lot of basic amino acids such as arginine and lysine. Peptides with seven or nine consecutive amide linkages of arginine are also used as cell-penetrating peptides. Such positive charges are essential for the recognition of negatively charged cell surfaces. In addition, despite having the same positive charge, the fact that arginine is relatively higher than lysine indicates that the guanidino group is a functional group that better responds to a negative charge than a simple amino group.
  • cell penetrating peptides should have at least theoretically low cytotoxicity compared to antibiotic peptides. Because of the low cytotoxicity of these cell penetrating peptides, many substances that require intracellular delivery have been sought to be introduced into cells by attaching them to the cell penetrating peptide. Oligonucleic acids such as genes (DNAs) and RNAi, compounds that can cause biological changes or cause cytotoxicity (anticancer agents), and certain proteins can also be introduced into cells by connecting to cell-penetrating peptides by cargo (Fig. 2).
  • Oligonucleic acids such as genes (DNAs) and RNAi
  • compounds that can cause biological changes or cause cytotoxicity anticancer agents
  • certain proteins can also be introduced into cells by connecting to cell-penetrating peptides by cargo (Fig. 2).
  • Cell penetrating peptides are known to penetrate cells in two ways, one of which is through endocytosis, which requires direct penetration and heat. Depending on the nature of each cell-penetrating peptide, the mechanism is different or the two methods are known to enter the cell.
  • Cell-penetrating peptides are peptides that maximize their ability to enter without destroying cells, but they can cause cracks in the cell membrane, and positively-charged cell-penetrating peptides are often negatively charged, such as DNA or RNA. May encounter cytotoxic material and give cytotoxicity.
  • cell-penetrating peptides The shape of cell-penetrating peptides is similar to that of antibiotic peptides. In order to penetrate the cell membrane, it is necessary not only to have a cation-charged hydrophilic group to recognize negatively charged cell membranes, but also to recognize the hydrophobic molecules present in the cell membrane while being able to form alpha helices under membrane conditions. Should be For this reason, cell penetrating peptides and antibiotic peptides are bilateral (hydrophobic and hydrophilic). Therefore, many cell-penetrating peptides have alpha helices in many cases, and representative examples thereof are penetratin, HIV Tat, and the like.
  • a bilateral peptide including hydrophilic and hydrophobic amino acids can include a linking portion at one or more specific amino acid positions, thereby significantly improving cell permeability and completing the present invention.
  • An object of the present invention is a peptide multimer comprising an alpha helix cell penetrating double-sided peptide capable of efficient delivery into a cell and reducing cytotoxicity in a cell, a method for preparing the same, and a method for preventing or treating HIV thereof and an active substance in a cell. To provide a delivery purpose.
  • the present invention provides a peptide multimer comprising a plurality of homo- or hetero-helical alpha-helix bilateral peptides.
  • the present invention provides a method for preparing a peptide multimer comprising the steps of: preparing an alpha helical peptide comprising hydrophilic and hydrophobic amino acids;
  • the present invention provides a composition for preventing or treating HIV comprising the alpha-helical peptide dimer as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for intracellular activator delivery comprising the alpha helix peptide dimer and a biologically active substance.
  • 1 is a list of known cell penetrating peptides comprising a large number of arginine or lysine.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing a mechanism for delivering the cell penetrating peptide into the cell.
  • Figure 3 is a unit and dimer of the double-sided alpha helix peptide according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 shows the results confirming the cell permeability of the peptide according to an embodiment of the present invention.
  • d) shows the relative cell permeability of the peptides according to the invention under 500 nM endocytosis inhibition conditions-control (white), wortmannin (gray), amiloride (dark gray) and 4 ° C (black).
  • Figure 5 shows the results of measuring the amount of RNAi delivered in the cell using a peptide according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 shows the cytotoxicity test results of the peptides according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8 shows the inhibition of Tat-mediated transcription extension of the peptides according to the invention in HeLa cells, showing the following at 10 nM and 100 nM peptide concentrations-control (white), 10 nM (gray) and 100 nM (dark) gray):
  • the marks indicate that there is no significant difference compared to 0.01 ⁇ p ⁇ 0.1, 0.001 ⁇ p ⁇ 0.01, p ⁇ 0.001, and control, respectively.
  • LK-3 inhibits HIV-1 p24 antigen production
  • Figure 12 shows the results of confirming the cytotoxicity of the peptides through the MTT assay:
  • Figure 13 shows the results confirmed the degree of peptide destabilization of the cell membrane through the LDH assay.
  • Figure 14 shows the results of experiments to decrease the inhibitory capacity of the LK peptide according to the degree of pTat expression.
  • Figure 15 shows the results of measuring peptide stability for dimer D, monomer D by HPLC: a) 20M of disulfide dimer D in 25% human serum / RPMI 1640. b) 20M of peptide 2 in 25% human serum / RPMI 1640.
  • Figure 16 shows the results of measuring peptide stability for LK-4 via HPLC: 20M of LK-4 in 25% human serum / RPMI 1640.
  • FIG. 17 shows the results of measuring peptide stability in the presence of 0.5 mM GSH, which is an in vivo reduction condition of Peptide dimer D and kink D by HPLC: a) 20M of disulfide dimer D in 0.5 mM reduced form of glutathione / RPMI 1640 b) 20M of the kink peptide in 0.5 mM reduced form of glutathione / RPMI 1640. Blue (1), 0 h; red (2), 5 h; green (3), 10 h; pink (4), 15 h.
  • Figure 18 shows the results of measuring the degree of Hemolysis in the parallel or anti-parallel peptide dimers.
  • FIG 19 illustrates a structure in which a portion of Leu is replaced by Ala in the LK dimer through the Helical wheel.
  • Figure 21 shows the substitution of Lys by Glu (K2, K4 ⁇ E2, E4) peptide structure through the Helical wheel.
  • Figure 22 shows the results of measuring the cell permeability of the HeLa cell in the peptide according to FIG.
  • FIG. 23 shows the results of measuring cell permeability of HeLa cells in a peptide including SEQ ID NO. 11 in common.
  • Figure 24 shows the results of measuring the cell permeability of HeLa cells according to the length of the peptide.
  • the present invention relates to a peptide multimer comprising a plurality of homo- or hetero-helical alpha-helix bilateral peptides.
  • the peptide may be a novel cell penetrating peptide that is different in shape before and after intracellular delivery, while having excellent cell permeability, and thus, minimizing cytotoxicity in cells.
  • a method of amplifying the alpha helix present in the cell-penetrating peptides is maximized, and a method of using a special environment of the cytoplasm such that the alpha helix is easily removed from the cytoplasm is used.
  • Peptides that have alpha helix are often maintained at low alpha helix in 100% aqueous solution, and most peptides in aqueous cytoplasm have low alpha helix at less than 50%.
  • the double-sided peptide or dimer comprising the same according to the present invention maintains a high alpha helix in the cell, but the peptide structure may be changed outside and in the cell when the high alpha helix is broken in the cytoplasm. That is, on-off switches can be made that switch off the alpha helix and turn off the cytoplasm under extracellular or membrane conditions. In this way, various cytotoxicities that may be due to the alpha helix of the peptide can be minimized in the cytoplasm.
  • Peptides are not decomposed by various peptide degrading enzymes when alpha helix is high, but random forms are made in equilibrium with the alpha helix, and random peptides are easily degraded by being attacked by a number of proteolytic enzymes. Therefore, toxicity can be minimized.
  • maximizing the alpha helix outside the cell to maximize cell permeability, and removing the helix when in the cytoplasm can minimize the cytotoxicity from the alpha helix peptide.
  • Peptides having such conditions have optimal conditions as cell penetrating peptides.
  • a plurality of double-sided peptides for improving alpha helix can be linked to one or more amino acid positions selected from the group consisting of, for example, i, i + 3, i + 4, i + 7, i + 8, i + 10 and i + 11 (i is an integer). Can be located.
  • the linking portion may be preferably linked to two or more amino acid positions selected from the group consisting of i, i + 3, i + 4, i + 7, i + 8, i + 10 and i + 11 (i is an integer).
  • each bilateral peptide is inverted in which a plurality of peptides are connected in parallel while maintaining the C-terminal direction at the N-terminal, or some of the plurality of peptides are connected in the N-terminal to the C-terminal direction, and other portions are C-terminal to the N-terminal direction. Can be connected in parallel. It was confirmed that the same activity in the peptide multimers connected in parallel or anti-parallel (Fig. 18). The alpha helix was maintained through the peptide multimer including such a linkage.
  • the alpha helix diagram may be 80 or more in cell membrane conditions in which trifluoroethanol and a buffer are mixed 1: 1, before cell permeation, preferably 85% or more, up to 100 May be%.
  • the amino acid constituting the peptide is not limited as long as the amino acid constituting the peptide to maintain an alpha helix structure
  • the hydrophilic amino acid is a group consisting of arginine, lysine and histidine It may be at least one selected from, and the hydrophobic amino acid may be at least one selected from the group consisting of leucine, valine, tryptophan, phenylalanine, tyrosine and isoleucine.
  • the peptide may comprise, for example, 5-150 amino acids, preferably 10-60, more preferably 7-23 amino acids, thereby forming an alpha helical structure that is a stable secondary structure.
  • Peptides according to the present invention shows a length dependence on the cell permeability, for example, peptides containing less than seven amino acids are very low penetration, whereas peptides containing more than seven amino acids are very penetrating ability only at a nanomolar concentration It can be confirmed that the improved, in particular, peptides containing more than 16, up to 23 amino acids can be seen that all show the cell permeability at a concentration of 10 nM or less (Fig. 24).
  • hydrophilic amino acids In order to collect the amine groups of the hydrophilic amino acid into one side of the alpha-helical peptide, one to three hydrophilic amino acids may be alternately arranged, and the remaining sequence may be one to three hydrophobic amino acids.
  • each of the hydrophilic and hydrophobic amino acids may be alternately arranged, and may include seven amino acids having amino acids having the same polarity as the i position, at least one of which is in the i + 3 or i + 4 position of the bilateral peptide. .
  • the bilateral peptide may include one or more of seven amino acid sequences in which one or two hydrophilic and hydrophobic amino acids are alternately arranged, wherein i is a hydrophilic amino acid, at least one of i + 3 and i + 4 positions Must be a hydrophilic amino acid, and if i is a hydrophobic amino acid, at least one of the i + 3 or i + 4 positions must be a hydrophobic amino acid.
  • a sequence having the above seven amino acids may include, for example, one or more of the amino acid sequences represented by the following formula:
  • X is a hydrophilic amino acid and Y is a hydrophobic amino acid.
  • At least 25% of one or more residues selected from the group consisting of amino acids capable of exhibiting the maximum hydrophobicity among the hydrophobic amino acids of the bilateral peptide for example, leucine, tryptophan, valine, phenylalanine, tyrosine and isoleucine
  • the peptide may penetrate the cell by hydrophobicity formed through the hydrophobicity.
  • leucine (L) which is a hydrophobic amino acid
  • A alanine
  • the hydrophilic amino acid of the bilateral peptide may include at least 33% of one or more residues selected from the group consisting of positively charged arginine, lysine and histidine. In the case of having a positive charge of 33% or more, it is possible to secure a desired cell penetration ability overall. Peptides containing positively charged hydrophilic amino acids of less than 33% (about one third of hydrophilic amino acids), sufficient to penetrate the cell if the positively charged amino acids are replaced with at least two negatively charged hydrophilic amino acids Net charge is not secured, making it difficult to penetrate even at high concentrations of 1 ⁇ M.
  • the inventors of the present application replaces 1,3 lysine (K) of the positively charged lysine (K) with glutamic acid (E) so that the peptide containing a hydrophilic amino acid having a positive charge of 33% or less is 100 nM concentration Even though it did not show the desired degree of cell penetration effect, it was confirmed that the dimer could improve the penetration ability close to 100 times. (FIGS. 21 and 22).
  • the bilateral peptide may comprise a sequence represented by SEQ ID NO:
  • the amino acid of (LK) n or (LK) m at the front end of SEQ ID NO: 11 may be further bonded, and n or m may each independently be an integer of 0-2.
  • the bilateral peptide may be the amino acid sequence LKKLLKLLKKLLKL represented by SEQ ID NO: 12 or the amino acid sequence KLLKLLKKLLKLLK represented by SEQ ID NO: 13.
  • the linkage may include, for example, any form of linkage between the peptides to exhibit desired properties according to the invention, but may include, for example, covalent bonds.
  • the covalent bond is not particularly limited as long as it does not inhibit the function of the peptide and is a form of covalent bond capable of improving alpha helix, but for example, disulfide bonds, maleimide bonds, ester bonds, and thioethers between cysteines. It may be one or more selected from the group consisting of binding by click and click reaction.
  • the alpha helix may be improved by using such a linker compound, but the linker compound and the peptide form a more stable bond, and thus have a disadvantage in that they are not easily degraded under normal cellular conditions. If the alpha helix is not broken, cytotoxicity can be strong, so the technique of increasing the alpha helix should be excluded.
  • the peptide multimers connecting the double-sided alpha helix peptides by two or more disulfide bonds can form strong alpha sub-molecular bonds to shRNA while having an alpha helix shape close to 100%. It was confirmed. This is compared with the low alpha helix of the monomeric peptide (about 10% in water), and the binding force is as high as 100-1000 times that of the monomer. This high alpha helix can not only improve cell permeability, but also can be strongly bound to hairpin RNAi or shRNA, which can be a breakthrough structure for delivering RNAi into cells.
  • an artificially synthesized linker compound is used to improve alpha helix, but in the present invention, by using a disulfide bond obtained from cysteine, alpha helix can be improved as well as cytotoxicity. It can be minimized.
  • the inventors of the present application show that the multimers linked through disulfide bonds by hydrophobic amino acids at positions i and i + 7 in the peptide are substituted with cysteines, and exhibit high alpha helix, as well as nanomolar kd values for hairpin RNA targets. It was confirmed that it represents a strong affinity corresponding to.
  • the disulfide bonds may be linked via disulfide bonds between cysteines, for example by including cysteines between amino acids of the bilateral peptide.
  • the peptide may have one or more of the amino acid sequence represented by the following formula:
  • the peptide may have one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 10 described in Table 1 below.
  • the peptide according to the present invention may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 8, for example.
  • the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 8 includes a hydrophobic amino acid leucine and a hydrophilic amino acid lysine or arginine, respectively, and these hydrophilic and hydrophobic amino acids indicate that the peptide is bilateral, Has cell permeability.
  • Peptide multimers according to the present invention comprises a homo- or heterotyped alpha-helical peptide, which is a homo-peptide multimer form by connecting a plurality of homo-type alpha-helical peptides, as well as a carrier peptide with excellent intracellular delivery ability Peptides that can act as ligands can be in the form of heteropeptide multimers that are heterologously included.
  • the multimer may be in the form of a combination of peptides that play a plurality of roles as necessary while maintaining the function of the desired peptide, but may be, for example, dimers, terpolymers, tetrapolymers or olefins, preferably dimers. Can be.
  • the present invention relates to a method for preparing a peptide multimer comprising the steps of: preparing an alpha helical peptide comprising hydrophilic and hydrophobic amino acids; Selecting a plurality of alpha-helical peptides of the same type or heterotype; And linking the selected plurality of alpha helical peptides at one or more amino acid positions selected from the group consisting of i, i + 3, i + 4, i + 7, i + 8, i + 10 and i + 11 (i is an integer).
  • i is an integer.
  • the present invention relates to a composition for preventing or treating HIV comprising the alpha-helix peptide multimer as an active ingredient.
  • shRNAs located in long terminal repeats (LTRs), which participate in efficient transcription of the genome introduced into the host among HIV-1 (Human immunodeficiency virus-1). short hairpin RNA) showed a strong binding capacity.
  • LTRs long terminal repeats
  • short hairpin RNA showed a strong binding capacity.
  • the dimer formed by linking the peptide having the sequence of SEQ ID NO: 3 through the covalent bond between cysteines and cysteines contained therein also showed a very strong binding ability to shRNA called TAR.
  • the peptide multimers according to the present invention can in particular inhibit HIV-1 replication by acting as inhibitors of Tat-TAR interaction.
  • it has an excellent cell penetrating ability to act as an intracellular inhibitor for HIV-1 transcription.
  • the present invention relates to a composition for preventing or treating HIV comprising the alpha-helix cell penetrating peptide multimer as an active ingredient in another aspect.
  • alpha-helix cell penetrating peptide multimers penetrate cells and bind to TAR RNA, thereby directly inhibiting binding between TAR RNA and Tat, thereby inhibiting transcription of the HIV-1 gene.
  • compositions according to the invention include HIV infection; It may be for the treatment of patients who are actually or potentially exposed to HIV, but is not limited thereto.
  • a composition according to the present invention may be susceptible to infection by HIV after presumed exposure to HIV in the past, i.e., after transfusion, organ transplantation, fluid exchange, bite, accidental needle puncture, or exposure to patient blood during surgery. It is useful to treat.
  • alpha-helix cell penetrating peptide multimer may be used as a peptide that induces apoptosis of cancer cells by inhibiting apoptosis by recognition of Bcl2 / Bax protein on the surface of the mitochondria.
  • composition according to the invention may be prepared further comprising one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • Pharmaceutically acceptable carriers should be compatible with the active ingredients of the present invention and include saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components. It can mix and use, and if needed, other conventional additives, such as antioxidant, buffer, and bacteriostatic agent, can be added.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be additionally added to formulate injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • a formulation in the form of a lyophilized form it is desirable to formulate and provide a formulation in the form of a lyophilized form.
  • Methods commonly known in the art may be used for the preparation of lyophilized formulations, and stabilizers for lyophilization may be added.
  • it may be preferably formulated according to each disease or component by a suitable method in the art or using a method disclosed in Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA.
  • compositions according to the present invention may be determined by a person of ordinary skill in the art based on the symptoms and severity of the disease of a typical patient. It may also be formulated in a variety of forms, including solutions, injections, and the like, and may also be provided in unit-dose or multi-dose containers, such as sealed ampoules and bottles.
  • compositions according to the invention can be administered orally or parenterally.
  • Routes of administration of the compositions according to the invention are not limited to, for example, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intestinal, sublingual Or topical administration is possible.
  • the dosage of the composition according to the present invention may vary in the range depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method, placement rate, or severity of the disease of the patient, and is easily available to those skilled in the art. Can decide.
  • the compositions of the present invention can be formulated into suitable formulations using known techniques for clinical administration.
  • the present invention also relates to a composition for delivering an active material into a cell by combining the alpha helix cell penetrating peptide multimer with a biologically active material.
  • cell permeability can be increased at least 10 times compared to existing cell penetrating peptides.
  • the amount is used at a concentration of at least micromolar to transfer the load into cells, whereas the cell penetrating peptide multimer according to the present invention is about 1/10 or less with respect to the minimum use concentration of conventional cell penetrating peptides. It can be used to secure the desired cell permeability, even if you want to deliver biologically active material, for example, RNAi oligonucleic acid molecules into the cell has a desired cell permeability even at a concentration of about nanomolar. Confirmed.
  • cell-permeable peptide multimers at very low concentrations, particularly at concentrations of several tens of nanomolar or less, is also desirable even when biologically active substances, such as RNAi oligonucleic acid molecules, are also used at very low concentrations. It can be effective. Low concentrations of cell penetrating peptides and low concentrations of biologically active substances may be sufficient to minimize cytotoxicity.
  • the cell permeable peptide multimer according to the present invention may be a monomer peptide in which covalent bonds between the multimers are broken when permeated into the cytoplasm, which is a reducing condition. If covalent bonds are maintained in the cell and exist as peptide multimers, peptide multimers generally have excellent binding ability to DNA or RNA, and thus, cytotoxicity may be greatly exhibited. However, peptide monomers that have broken covalent bonds in the cytoplasm have a sharp decrease in alpha helix and have very low chemical stability, which can be easily hydrolyzed by many proteases in cells.
  • the cell permeable peptide multimer according to the present invention not only exhibits excellent cell delivery ability, but also obtains a desired effect even when using a low concentration of biologically active substance, and is degraded in cells, thereby reducing cytotoxicity or minimization. can do.
  • the biologically active substance is a kind of cargo, and may be a substance that modulates biological activity or function that binds to the cell membrane permeation domain and is delivered into a cell, thereby regulating all physiological phenomena in the living body.
  • DNA, RNA, siRNA , Aptamers, proteins, antibodies or cytotoxic compounds but is not limited thereto.
  • a substance or other transporter that modulates biological activity or function wherein the peptide multimer and a substance or other transporter that modulates biological activity or function may form a complex structure.
  • the substance or carrier may be linked, for example, via a noncovalent or covalent bond with the multimer.
  • the non-covalent bond may be, for example, one or more selected from the group consisting of hydrogen bonds, electrostatic interactions, hydrophobic interactions, van der Waals interactions, pi-pi interactions and cation-pi interactions.
  • the covalent bonds may be degradable or non-degradable bonds
  • the degradable bonds may be disulfide bonds, acid decomposable bonds, ester bonds, anhydride bonds, biodegradable bonds or enzymatic bonds
  • non-degradable bonds are amide bonds.
  • a phosphate bond but is not limited thereto.
  • the cytotoxic compound may be linked with a peptide multimer by forming a non-covalent bond such as an electrostatic bond or a host-guest bond, for example, doxorubicin, Methotrexate, Paclitaxel, Cisplatin, Bleomycin, taxol, berberine or curcumin
  • a non-covalent bond such as an electrostatic bond or a host-guest bond
  • the drug may include any type of drug that specifically binds to a specific target in a cell, and the multimer may be introduced in a form fused to an N-terminus or a C-terminus.
  • a drug-resistant cancer cell may be used as a novel substance capable of killing cancer cells by connecting methotrexate to a peptide multimer, and may use hydrophobic bioactive molecules (taxol, berberine, curcumin, etc.) having hydrophobic properties. It can be attached to peptides to increase the concentration of intracellular delivery.
  • hydrophobic bioactive molecules taxol, berberine, curcumin, etc.
  • antibodies and proteins and protein drugs that are part of antibodies can be delivered intracellularly by connecting to dimeric peptides and oligonucleotide drugs (siRNA, asDNA, DNA, aptamer) can be delivered intracellularly by connecting to dimeric peptides.
  • Dimeric peptides with disulfides are purified monomeric peptides.
  • Dimal peptide (dimal peptide) was synthesized using the Michael reaction spacer as shown in FIG.
  • Peptides labeled with FITC at the N-terminus of the peptide were also prepared to observe their permeation into cells.
  • the synthesized peptides were identified molecular weight by MALDI-TOF mass spectrometer as follows.
  • dimeric peptides like dimeric peptides, were made in two covalent bonds, so they had high alpha helix. However, due to the flexibility of the molecule, it had lower alpha helix than the dimeric peptide.
  • Dimer / dimal peptides were treated with DTT, a reducing environment (similar to the cytoplasmic environment). Through this, it can be confirmed how the dimer / dimal peptide is changed in the cytoplasm, which is a reducing environment. Dimers were decomposed into monomers, and the monomers were observed to significantly reduce the degree of alpha helix structure. Dimer, on the other hand, maintained its alpha helix structure with or without DTT.
  • the degree of uptake of three different peptides into cells was compared by FACS experiment according to the concentration of peptides equipped with FITC (FIG. 4).
  • dimers (LK-3) / monomers (LK-1, LK-2) show a high degree of uptake efficiency (more than 90%) with little difference between them.
  • dimers (LK-3) continued to show high uptake efficiency, while monomers showed a significant decrease in efficiency below 10%.
  • dimer (LK-4) was uptake even at low concentrations, but the efficiency was found to be about 10-15% lower than the dimer (90% or more).
  • dimer> dimal> monomers were found to have cell permeability.
  • RNAi (Dy547-labeled) permeated well into cells.
  • control peptide LK, Rev, monomeric C, kinkC, and kink D were used. Positive control with 0.8 ⁇ L of Dharmafect was used.
  • the dimeric peptide was used 100 nM, the monomer peptide was 200 nM, RNAi 50 nM, and a mixed solution was prepared by mixing the peptide and RNAi.
  • the mixed solution was placed in a HeLa cell line (2.0 ⁇ 10 3 cells / well) and incubated for 24 hours. After washing once with PBS, the amount of RNAi permeated into the cells was observed by fluorescence confocal microscopy.
  • RNAi was well delivered into cells in the order of dimer RE> dimer C> dimer D. In contrast, when monomer monomer was used, RNAi was hardly delivered. have.
  • Monomers appear to be able to penetrate into cells by both energy independent / dependent mechanisms, even with slight input even under conditions of suppression of ATP independent uptake or macropinocytosis. Dimer also shows excellent cell permeability by both processes, it can be clearly seen that has a much better cell permeability than the monomer. In contrast, dimal peptides do not have cell permeability at all at low temperatures and hardly enter into the presence of suppression of apoptosis. Thus, dimal peptides appear to enter only energy-dependent pathways. It is possible to confirm that the monomer / dimer enters the cell by a direct method that is an energy independent pathway, and it is determined that the disulfide bond of the dimer plays an important role in the energy independent pathway.
  • the cytotoxicity caused by the peptide was treated with cancer peptides and the activity of the cells was examined by MTT method.
  • the monomers, dimers, and dimal three peptides did not show toxicity until 5 ⁇ M (FIG. 7).
  • a method for maximizing the alpha helix of an alpha helix peptide having cell permeability according to the present invention, and a peptide having improved delivery or permeability synthesized thereby.
  • 1) two thiols were mounted on the monomer peptide, and 2) a dimeric peptide containing two disulfide bonds was prepared using oxidation conditions in air.
  • Example 7 Measurement of binding affinity and alpha helix on TAR RNA
  • LK peptide was prepared as shown in Table 2.
  • LK-3 a double-sided peptide dimer, contains two disulfide bonds in the middle of each chain and had a sub-molar affinity for TAR RNA. Since disulfide bonds in LK-3 can be degraded in cytoplasmic conditions, the reduced monomeric peptide LK-2 was used as a control.
  • LK-4 a non-reducing dimer, was linked by two N, N '-(1,4-Phenylene) dimaleimide peptide chains. Disulfide bonds in LK-3 are indicated by dotted lines, and N, N '-(1,4-Phenylene) dimaleimide in LK-4 by solid lines.
  • Dissociation constants ( K d ) for TAR RNA binding of peptides were measured, and their affinity was measured by fluorescence anisotropy using Rhodamine-Rev peptide as probe at 20 ° C.
  • LK-3 and LK-4 showed 100-1000 times stronger affinity than the monomeric peptides LK-1 and LK-2.
  • LK peptides labeled with fluorescein isothocyanate were incubated with HeLa cells (human cervical cancer cell line) using the known cell penetrating peptide R9 consisting of nine arginines as a control.
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • the monomeric and dimeric peptides showed almost 100% cell permeability.
  • the monomeric peptide showed only 40% permeation efficiency and 70% at 100nM, while the dimeric peptide had 70-90% cell permeability.
  • the control group showed very minimal cell permeability at 10 nM.
  • the cell permeability of the LK peptide is greatly improved by dimer formation.
  • a significant portion of the peptide dimer was delivered to the cell nucleus (FIG. 4B).
  • LK peptides were tested under various endocytosis inhibitory conditions. At low concentrations (10 nM), cell permeation of all LK peptides was almost completely inhibited by lowering the temperature to about 4 ° C. or by treatment with endocytosis inhibitors (wortmannin or amyloide). . Thus, low concentrations of LK peptides can be seen to be internalized through energy-dependent endocytosis pathways, even though the activity of each LK peptide is significantly different from these concentrations. It can be confirmed. (FIG. 4C). At high concentrations (500 nM), all LK peptides show> 80% cell uptake, with varying cell infiltration mechanisms.
  • LK-4 non-reducible dimer
  • FIG. 4D low concentrations
  • buttmannin or amylolide is monomer LK-2 and dimer LK-3
  • Cell penetration was hardly inhibited, and the internalization efficiency of these peptides did not change even at 4 ° C.
  • LK-2 and LK-3 penetrate cells at high concentrations through other forms of energy-dependent pathways that are neither receptor-mediated endocytosis nor macropinocytosis. have.
  • the transfection was co-transfected with the pLTR-luc, HIV-1 LTR promoter and the firefly luciferase gene containing plasmid, pTat, the Tat gene containing plasmid of HIV-1, to build a luciferase reporter system in HeLa cells.
  • the expressed Tat protein interacts with TAR RNA under the LTR promoter as an anti-terminating factor, enhancing the transcription of the luciferase gene.
  • the relative amounts of mRNA were determined using RT-PCR (FIG. 8). According to the results, compared to the two housekeeping genes ( ⁇ -actin and 18S rRNA), the amount of mRNA in the luciferase gene decreases in a manner dependent on the amount of peptide (FIG. 8A, b). In addition, the amount of transcription of the long luciferase gene containing the total TAR RNA transcribed was determined to demonstrate that the LK peptide did not interfere with the transfection of the transfected plasmid DNA.
  • LK-1 and LK-2 exhibited less than 50% inhibitory effect even at 100 nM, while peptide dimers LK-3 and LK-4 had higher cell infiltration and at 10 nM The inhibitory activity was about 50%, and at 100 nM, the inhibitory activity was over 80%. Since the HeLa cell infiltration capacity of LK-1 and LK-2 is similar (FIG. 4A), the stronger inhibitory effect of LK-2 is believed to be the result of stronger affinity for TAR RNA. Since disulfide bonds are readily degraded under reducing cytoplasmic conditions, LK-3 is reduced in the cell substrate after internalization to form monomer LK-2, which still binds to TAR RNA with nanomolar affinity. Thus, the enhanced cell penetrating ability of LK-3 is a major cause of inhibition of Tat-TAR interaction at the level of transcription.
  • IC 50 values of LK peptides were measured via luciferase assay, decreasing in the order of LK-1 (107 nM)> LK-2 (49.6 nM)> LK-4 (34.7 nM)> LK-3 (10.3 nM) (FIG. 10).
  • the IC 50 value of dimer LK-3 was more than 10 times lower than that of monomer LK-1, which is the result of an increase in monomer peptide concentration by more than 2 times when LK-3 is degraded in the cell substrate. It was judged.
  • HIV-1 replication was inhibited in acutely infected T-lymphoblastoid cells (MOLT-4 / CCR5) (FIG. 11).
  • the IC 50 values of LK-3 and LK-4 were 590.1 and 278.5 nM, respectively, whereas the IC 50 values of LK-1 were> 2 ⁇ M.
  • larger IC 50 values may have contributed in part to the ability of the peptide to show reduced infiltration into T-lymphoblast-like cells.
  • LK-3 did not show great cytotoxicity against host cells at concentrations below 2.56 ⁇ M, much higher than the IC 50 values for HIV-1 replication.
  • LK-4 was found to be more active than LK-3, but more toxic to host cells. Through this, LK dimers, especially LK-3, is expected to have a therapeutic application for HIV-1.
  • Cytotoxicity of the peptide was confirmed by MTT assay. The results are shown in FIG. When MTT assay was performed after 24 hours, it was confirmed that both Hela cells and RAW 264.7 cells had no toxicity up to about 10 ⁇ M.
  • LDH assay confirmed the degree of peptide destabilization of the cell membrane. The results are shown in FIG. Referring to FIG. 13, when the LDH assay was performed after 12 hours of peptide treatment, it was found that almost no Hela cells and RAW 264.7 cells destabilized the cell membrane until about 2 ⁇ M.
  • LK-3 reduced dimer
  • monomer showed a slight destabilization at 8 ⁇ M
  • LK-4 non-reducible dimer
  • Peptide stability was measured using HPLC at 37 ° C.
  • the half-life of the peptide was calculated by exponential decay, shown in Table 4 and shown as in FIGS. 15-17 (rate constant plotting the peptide concentration in the time scale).
  • Disulfide linkers are indicated by dashed lines in LK-3, and N, N '-(1,4-Phenylene) dimaleimide linkers in LK-4 by solid lines.
  • Kink peptide and LK-3 overlap with various serum proteins. Since the life time is short, the half life was not measured under these conditions. All injected peptides disappeared within 1 hour. The same result is expected for dimer D.
  • FIG. 15 Stability experiments were performed in the presence of peptide dimer D and monomer D in vitro human serum and are shown in FIG. 15. Referring to FIG. 15, it can be seen that in the case of dimer D similar to LK-3, the half-life is about three hours longer than the half-life (3 hours) of the corresponding monomer in the presence of 25% human serum. This results in the formation of disulfide dimers, suggesting that structural stabilization can inhibit degradation by protease present in serum.
  • Peptide multimers comprising a linkage at one or more specific amino acid positions of the plurality of double-sided alpha-helix peptides according to the present invention may have a high cell permeability due to a marked increase in alpha helix. Through such excellent cell permeability, not only can effectively deliver a variety of biologically active substances in the cell, but also can minimize the cytotoxicity after cell permeation, it can be usefully used as a preventive or therapeutic agent of diseases.

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Abstract

본 발명은 알파나선형 세포 투과 펩타이드 다합체, 이의 제조방법 및 그 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 복수개의 양면성 펩타이드를 포함하는 펩타이드 다합체, 상기 펩타이드 다합체의 제조방법 및 상기 펩타이드 다합체를 유효성분으로 포함하는 HIV 예방 또는 치료용 조성물 또는 상기 펩타이드 다합체 및 생물학적 활성물질을 포함하는 세포 내 활성물질 전달을 위한 조성물에 관한 것이다.

Description

알파나선형 세포 투과 펩타이드 다합체, 이의 제조방법 및 그 용도
본 발명은 알파나선형 세포 투과 펩타이드 다합체, 이의 제조방법 및 그 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 복수개의 양면성 펩타이드를 포함하는 펩타이드 다합체, 상기 펩타이드 다합체의 제조방법 및 상기 펩타이드 다합체를 유효성분으로 포함하는 HIV 예방 또는 치료용 조성물 또는 상기 펩타이드 다합체 및 생물학적 활성물질을 포함하는 세포 내 활성물질 전달을 위한 조성물에 관한 것이다.
항생 펩타이드 (antimicrobial peptide; amp)는 외부에서 침입한 병원균에 대항하여 숙주를 보존하기 위해 숙주의 일차 면역 반응으로부터 생성되는 자연 펩타이드이다. 이들은 주로 침입한 병원균의 세포막을 손상시켜 침입한 세균을 제압한다. 그러나, 최근 이와 같은 항생 펩타이드가 세포막을 손상시키는 기작 이외에 다른 기작으로 침입한 병원균을 제압할 수 있음을 시사하는 몇 가지 증거가 나오고 있다. 즉 이들은 병원균 내에 있는 표적에 결합하여 그 기능을 막음으로써 세균을 제압할 수 있다. 일반적으로 항생 펩타이드는 양전하를 띄고 있는데, 이 양전하는 DNA 또한 RNA가 가지고 있는 음전하와 결합함으로써, 병원균의 DNA 또는 RNA가 표적으로서 가능성을 제시하고 있다. 병원균 내 소기관인 미토콘드리아를 항생 펩타이드가 침입하여 세포사멸을 유도함으로써, 병원균을 제압하는 기작도 가능함을 보여주고 있다. 이는 미토콘드리아의 표면이 음이온으로 하전되어 있기 때문이다.
위에 제시한 예처럼 항생 펩타이드는 병원균의 막을 붕괴시켜 균을 죽이는 것이 아니고, 세포 내의 다른 표적에 결합하여 균을 죽일 수 있다. 이는 세포를 투과할 수 있는 성질을 가진 펩타이드 (cell penetrating peptide, cpp) (이하, 세포 투과 펩타이드)가 병원균을 죽일 수 있는 항생 펩타이드와 구별되어 존재한다는 사실로도 증명되고 있다. 자연에 존재하는 세포 투과 펩타이드는 주로 바이러스에서 발견되었는데, 이들은 숙주세포의 모든 기능을 바이러스의 생존을 위해 이용해야 하므로 세포를 죽이는 능력과는 다른 세포를 투과할 수 있는 능력만을 가진 펩타이드이다. 대표적인 예가 TAT 펩타이드, Rev 펩타이드 등이며 숙주를 죽이지 않으면서도 세포 내로 바이러스가 침입하는데 도움을 주고 있다. Antennapedia 단백질로부터 연유된 penetratin 펩타이드는 16개의 아미노산을 포함하는 펩타이드이며, 탁월한 세포 투과 능력을 가지고 있는 대표적인 세포 투과 펩타이드 중 하나이다 (한국등록특허 제1095841호). 항생 펩타이드와 같이 양하전을 띤 알지닌/라이신을 많이 포함하고 있는 특징이 있다 (도 1).
세포 투과 펩타이드의 아미노산 조성의 특성으로는 단연 알지닌과 라이신 등 염기성을 가진 아미노산이 많은 것이 가장 먼저 눈에 들어온다. 알지닌이 7개나 9개 연속적으로 아마이드 결합으로 연결된 펩타이드도 세포 투과 펩타이드로 쓰이고 있으므로, 음전하로 하전된 세포 표면의 인식을 위해선 이와 같은 양전하가 필수적이다. 또한, 같은 양전하를 띄고 있음에도 불구하고 알지닌이 라이신보다 상대적으로 많은 것은 구아니디노 기가 단순한 아미노기에 비해 음전하에 더 잘 대응하는 작용기임을 알 수 있다.
이러한 세포 투과 펩타이드들은 항생 펩타이드에 비해 적어도 이론적으로는 무시할 만큼 낮은 세포 독성을 가지고 있어야 한다. 이와 같은 세포 투과 펩타이드의 낮은 세포독성 때문에 세포 내 전달(delivery)을 필요로 하는 많은 물질들을 이 세포 투과 펩타이드에 달아 세포 내로 도입할 수 있는 방법을 모색하고 있다. 유전자 (DNA)나 RNAi와 같은 올리고핵산이나 생물학적 변화를 일으킬 수 있는 또는 세포 독성을 일으키는 화합물 (항암제)들, 특정한 단백질 등도 짐(cargo)으로 세포 투과 펩타이드에 연결하여 세포 안으로 투입할 수 있다 (도 2).
세포 투과 펩타이드들이 세포를 투과하는 기작은 크게 두 가지로 보고 있으며, 그 하나는 직접적인 침투와 열이 필요로 하는 엔도시토시스 (endocytosis)를 거치는 방법이다. 각각의 세포 투과 펩타이드의 성질에 따라 기작이 다르거나 두 가지 방법이 혼용되어 세포 안으로 들어가는 것으로 알려져 있다.
세포를 투과하는 능력을 갖추면서도 세포독성이 없어야 하는 것은 상충되는 조건이므로, 영원히 얻을 수 없을 것으로 보이기도 한다. 많은 세포 투과 펩타이드도 항생 펩타이드의 성질을 가진 것도 이 때문이다. 세포 투과 펩타이드는 세포를 파괴하지 않고 안으로 들어 갈 수 있는 성질이 극대화 된 펩타이드 이긴 하지만, 이들로 인하여 세포막에 균열이 생길 수 있으며, 양전하로 하전된 세포 투과 펩타이드는 DNA또는 RNA등 음으로 하전된 많은 세포 내 물질과 만나 세포 독성을 줄 수 있다.
세포 투과 펩타이드가 가진 모양의 특징은 항생 펩타이드와 비슷하다. 세포막을 투과하기 위해 우선 음으로 하전된 세포막을 인식하기 위해 양이온으로 하전된 친수성 기를 가져야 할 뿐만 아니라, 막 조건에서 알파나선의 모양을 이룰 수 있으면서 세포막에 존재하는 소수성의 분자들과 인식을 할 수 있어야 한다. 이러한 이유 때문에 세포 투과 펩타이드와 항생 펩타이드는 양면성 (소수성 및 친수성)을 지니고 있다. 따라서, 세포 투과 펩타이드는 많은 경우에 알파나선을 가진 펩타이드가 많으며, 그 대표적인 예가 penetratin, HIV의 Tat등이 대표적인 알파나선형 세포 투과 펩타이드이다. 다만, 이러한 펩타이드는 최소 마이크로몰 정도의 농도로 사용하여만 목적하는 세포 투과 효과를 기대할 수 있으므로, 나노몰 단위를 농도만을 사용하여도 목적하는 세포 투과능을 가지는 펩타이드의 개발이 필요한 실정이다.
이러한 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 친수성 및 소수성 아미노산을 포함하는 양면성 펩타이드가 하나 이상의 특정 아미노산 위치에 연결부를 포함함으로써, 세포 투과성이 현저하게 향상될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 세포 내로의 효율적인 전달이 가능하면서도, 세포 내에서 세포 독성이 감소하는 알파나선형 세포 투과 양면성 펩타이드를 포함하는 펩타이드 다합체, 이의 제조방법 및 이의 HIV 예방 또는 치료 용도 및 세포 내 활성물질 전달 용도를 제공하는 데 있다.
이에, 본 발명은 동형 또는 이형의 알파나선형 양면성 펩타이드를 복수개 포함하는 펩타이드 다합체를 제공한다.
본 발명은 다음 단계를 포함하는 펩타이드 다합체의 제조방법을 제공한다: 친수성 및 소수성 아미노산을 포함하는 알파나선형 펩타이드를 제작하는 단계;
동형 또는 이형의 복수개 알파나선형 펩타이드를 선택하는 단계; 및
상기 선택된 복수개의 알파나선형 펩타이드를 i, i＋3, i＋4, i＋7, i＋8, i＋10 및 i＋11 (i는 정수)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 위치에서 연결하는 단계.
본 발명은 상기 알파나선형 펩타이드 이합체를 유효성분으로 포함하는 HIV 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 알파나선형 펩타이드 이합체 및 생물학적 활성물질을 포함하는 세포 내 활성물질 전달을 위한 조성물을 제공한다.
도 1은 알지닌 또는 라이신을 다수 포함하는 공지의 세포 투과 펩타이드의 리스트이다.
도 2는 세포 투과 펩타이드를 세포 내로 전달하는 기작을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 양면성 알파나선형 펩타이드의 단위체 및 이합체이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 세포 투과능을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 각각의 오차 막대는 표준편차(n = 3)를 나타내며, ＊＊＊ 및 n.s. 표시는 각각 p<0.001이고, 대조군과 비교하여 유의한 차이가 없음을 나타낸다:
a)는 12시간 HeLa 세포와 인큐베이션 한 후 다양한 펩타이드 농도에서의 LK-1 (▲), LK-2 (■), LK-3 (●), LK-4 (◆), 및 R9 (▼)에 대한 FACS 결과를 나타냄;
b) FITC-라벨링된 LK-3 (10 nM)를 처리한 HeLa 세포의 CLSM (Confocal laser scanning microscopy) 이미지를 나타낸 것으로, 핵은 Hoechst 33442 (파란색)로 염색됨;
c) 10 nM endocytosis 저해 조건에서 본 발명에 따른 펩타이드의 상대적 세포투과능을 나타냄;
d) 500 nM endocytosis 저해 조건에서 본 발명에 따른 펩타이드의 상대적 세포투과능을 나타냄 - 대조군 (white), wortmannin (gray), amiloride (dark gray) 및 4℃(black).
도 5는 본 발명의 일 실시에에 따른 펩타이드를 사용하여 세포 내에 전달한 RNAi의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 세포 내 전달 기전을 확인한 공초점 현미경 사진을 나타낸 것이다 (도 6 중 Ac=Acetyl기를 의미함).
a) 500nM FITC (fluorescein isothiocyanate) 라벨링된 단위체 펩타이드 (37℃, 24시간) (좌측) 및 500nM FITC 라벨링된 단위체 펩타이드, 50 ㎍/mL wortmannin 처리 (37℃, 24시간) (우측)
b) 500nM Ac-FITC 이합체(37℃, 24시간) (좌측), 500nM Ao-FITC 이합체, 50 ㎍/mL wortmannin 처리 (37℃, 24시간) (우측)
c) 500nM FITC 라벨링된 단위체 펩타이드, 15㎍/mL amiloride 처리 (37℃, 24시간) (좌측), 500nM FITC 단위체 펩타이드 (4℃, 2시간) (우측)
d) 500nM Ac-FITC 이합체 펩타이드, 15㎍/mL amiloride 처리 (37℃, 24시간) (좌측), 500nM Ac-FITC 이합체 펩타이드 (4℃, 2시간) (우측)
e) 500nM Ac-dimal- FITC 이합체 펩타이드 (37℃, 24시간) (좌측), 500nM Ac-dimal- FITC 이합체 펩타이드, 50 ㎍/mL wortmannin 처리 (37℃, 24시간) (우측)
f) 500nM Ac-dimal- FITC 이합체 펩타이드, 15㎍/mL amiloride 처리 (37℃, 24시간) (좌측), 500nM Ac-dimal- FITC 이합체 펩타이드 (4℃, 2시간) (우측)
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 세포독성 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 HeLa 세포에서 본 발명에 따른 펩타이드의 Tat-매개 전사 연장 저해를 나타내는 결과로, 10 nM 및 100 nM 펩타이드 농도에서 다음을 나타냄 - 대조군 (white), 10 nM (gray) 및 100 nM (dark gray):
a) TAR-luc/β-actin의 상대적 mRNA 발현
b) TAR-luc/18S rRNA의 상대적 mRNA 발현
c) TAR-luc/TAR의 상대적 mRNA 발현
각각의 오차 막대는 표준편차(n = 3)를 나타내며, (＊), (＊＊), (＊＊＊) 및 n.s. 표시는 각각 0.01≤p<0.1, 0.001≤p<0.01, p<0.001, 대조군과 각각 비교하여 유의한 차이가 없음을 나타낸다.
도 9는 HeLa 세포에서 본 발명에 따른 다음 펩타이드의 루시퍼라제 활성 저해를 나타내고, 각각의 오차 막대는 표준편차(n = 3)를 나타낸다:
a) LK-1의 루시퍼라제 활성 저해
b) LK-2의 루시퍼라제 활성 저해
c) LK-3의 루시퍼라제 활성 저해
d) LK-4의 루시퍼라제 활성 저해.
도 10는 RAW 264.7 세포에서 LK 펩타이드의 IC50 값 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 T-lymphoblastoid 세포 (MOLT-4/CCR5)에서 본 발명에 따른 다음 펩타이드의 HIV-1 p24 항원 생성 억제를 나타내며, 각각의 오차 막대는 표준편차(n = 3)를 나타낸다:
a) LK-3의 HIV-1 p24 항원 생성 억제
b) LK-4의 HIV-1 p24 항원 생성 억제.
도 12는 MTT assay를 통해 펩타이드의 세포독성을 확인한 결과를 나타낸 것이다:
a) HeLa 세포
b) RAW 264.7 세포
도 13은 LDH assay를 통해 펩타이드가 세포막을 destabilization하는 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
a) HeLa 세포
b) RAW 264.7 세포
도 14는 pTat 발현 정도에 따른 LK 펩타이드의 저해 능력 감소 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 HPLC를 통해 dimer D, monomer D에 대한 펩타이드 안정성을 측정한 결과를 나타낸 것이다: a) 20M of disulfide dimer D in 25% human serum/ RPMI 1640. b) 20M of peptide 2 in 25% human serum/ RPMI 1640.
도 16은 HPLC를 통해 LK-4에 대한 펩타이드 안정성을 측정한 결과를 나타낸 것이다: 20M of LK-4 in 25% human serum/ RPMI 1640.
도 17은 HPLC를 통해 Peptide dimer D 와 kink D의 생체 내 환원 조건인 0.5 mM GSH 존재하에서 펩타이드 안정성을 측정한 결과를 나타낸 것이다: a) 20M of disulfide dimer D in 0.5 mM reduced form of glutathione/ RPMI 1640. b) 20M of the kink peptide in 0.5 mM reduced form of glutathione/ RPMI 1640. Blue (1), 0 h; red (2), 5 h; green (3), 10 h; pink (4), 15 h.
도 18은 평행 또는 역평행으로 연결된 펩타이드 이합체에서 Hemolysis 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 LK 다이머에서 Leu 일부를 Ala로 치환한 구조를 Helical wheel을 통해 도시한 것이다.
도 20은 도 19에 따른 다이머의 세포 투과능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 Lys을 Glu로 치환(K2, K4 → E2, E4) 펩타이드 구조를 Helical wheel을 통해 도시한 것이다.
도 22는 도 21에 따른 펩타이드에서 HeLa cell에 대한 세포 투과능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 서열번호 11을 공통적으로 포함하는 펩타이드에서 HeLa cell에 대한 세포 투과능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 펩타이드의 길이에 따른 HeLa cell에 대한 세포 투과능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
일 관점에서, 본 발명은 동형 또는 이형의 알파나선형 양면성 펩타이드를 복수개 포함하는 펩타이드 다합체에 관한 것이다.
상기 펩타이드는 세포 내 전달 전과 후의 모양이 달라 세포 투과 능력은 탁월하면서도, 세포 내에서 최소의 세포독성을 줄일 수 있도록 한 신규 세포 투과 펩타이드일 수 있다. 이를 위해, 세포 투과 펩타이드에 존재하는 알파나선 모양을 최대한 증폭시킬 수 있는 방법과 이러한 알파나선이 세포질 내에서는 쉽게 없어질 수 있도록 세포질의 특수한 환경을 이용하는 방법을 이용하고 있다.
본 발명을 통해 인위적으로 알파나선도를 증가시킨 펩타이드를 합성함으로써, 세포에 처리하면 높은 알파나선도로 인해 세포 내 투과율이 향상되고, 세포 내에서는 알파나선이 제거되어 펩타이드가 가진 독성을 최소화하는 방법을 수립하였다.
종래 세포 투과 펩타이드는 구조적 특징이 항생 펩타이드와 비슷하여 세포 내에 투과시 세포 내 표적에 결합하여 세포독성을 유발하였다는 문제점이 있다. 세포 투과 펩타이드가 세포막을 통과하기 전과 세포 내에 투과되었을 때 모양이 유사하기 때문이다. 따라서, 본 출원의 발명자들은 세포 내 투과하기 전과 투과 후의 모양이 크게 다를 수 있는 펩타이드를 확인하였다.
알파나선형을 하고 있다는 펩타이드도 100% 수용액에서 낮은 알파나선도를 유지하는 경우가 많으며, 수용액인 세포질에서 대다수의 펩타이드는 50% 이하의 낮은 알파나선도를 가진다. 본 발명에 따른 양면성 펩타이드 또는 이를 포함하는 이합체는 세포 밖에선 높은 알파나선도를 유지하나, 세포질 내에서 높은 알파나선도가 깨어지는 조건이 되면 세포 밖과 세포 내에서 펩타이드 구조가 달라질 수 있다. 즉, 세포 바깥이나 세포막 조건에서 알파나선 스위치가 켜지고, 세포질에서는 꺼지는 on-off 스위치를 만들 수 있다. 이렇게 되면, 펩타이드의 알파나선 때문에 올 수 있는 여러 가지 세포독성을 세포질 내에서 최소화 할 수 있다. 펩타이드는 알파나선도가 높으면 각종 펩타이드 분해효소에 의해 분해되지 않지만, 알파나선 모양과 평형을 이루면서 무작위적인 모양이 만들어지게 되고, 무작위적인 모양의 펩타이드가 다수의 단백질 가수분해 효소로부터 공격을 받아 쉽게 분해되므로 독성이 최소화 될 수 있다. 따라서, 알파나선도를 세포 밖에서 최대화하여 세포 투과력을 극대화하고, 세포질 내에 있을 때 알파나선을 제거하면 알파나선 펩타이드에서 오는 세포 독성을 최소화할 수 있게 된다. 이와 같은 조건을 갖춘 펩타이드는 세포 투과 펩타이드로서 최적의 조건을 가지게 된다.
세포 투과력을 높이기 위한 한 방법으로, 양면성을 가진 펩타이드의 알파나선도를 증가시킬 수 있다. 공유결합을 통해 알파나선의 위와 아래의 곁가지를 묶어 극적으로 향상시키는 방법을 사용할 수 있으며, 이를 통해 세포 투과 능력도 향상될 수 있다. 이를 고려하여, 알파나선도를 향상시키기 위한 복수개의 양면성 펩타이드를 예를 들어, i, i＋3, i＋4, i＋7, i＋8, i＋10 및 i＋11 (i는 정수)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 위치에 연결부를 위치시킬 수 있다. 상기 연결부는 바람직하게, i, i＋3, i＋4, i＋7, i＋8, i＋10 및 i+11 (i는 정수)로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산 위치에 연결될 수 있다. 이 때, 각 양면성 펩타이드는 복수의 펩타이드가 N 말단에서 C 말단 방향을 유지하며 평행하게 연결되거나 또는 복수의 펩타이드 중 일부는 N 말단에서 C 말단 방향, 다른 일부는 C 말단에서 N 말단 방향으로 연결된 역평행으로 연결될 수 있다. 평행 또는 역평행으로 연결된 펩타이드 다합체에서 동일한 활성을 나타냄을 확인하였다 (도 18). 이러한 연결부를 포함한 펩타이드 다합체를 통해 알파나선도가 유지될 수 있도록 하였다.
이와 관련하여, 종래 한국특허공개 제2013-0057012호 및 미국특허공개 제2010-0292164호에서 두 펩타이드 간 연결시 이황화 결합을 이용한 바 있다. 그러나, 본 발명에서와 같이 두 개 이상의 아미노산 위치에 연결부를 위치시켜 다합체 형태로 제조함으로써 알파나선도를 증가시킨 예는 없었다. 본 발명에 따른 펩타이드 다합체에서 알파나선도는 세포 투과 전 예를 들어 트리플루오로에탄올 (Trifluoroethanol) 및 버퍼가 1:1로 혼합된 세포막 조건에서 80 이상일 수 있으며, 바람직하게 85% 이상, 최대 100%일 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 펩타이드를 구성하는 아미노산은 양면성을 나타내면서도 알파나선형 구조를 유지할 수 있도록 하는 것이면 그 종류가 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 상기 친수성 아미노산은 알지닌, 라이신 및 히스티딘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있고, 상기 소수성 아미노산은 루신, 발린, 트립토판, 페닐알라닌, 타이로신 및 이소루신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 펩타이드는 예를 들어, 5-150개의 아미노산, 바람직하게 10-60개, 더욱 바람직하게 7-23개의 아미노산을 포함할 수 있으며, 이를 통해 안정한 2차 구조인 알파나선 구조를 형성할 수 있다. 본 발명에 따른 펩타이드는 세포 투과능에 길이 의존성을 보이는데, 예를 들어 7개 미만의 아미노산을 포함하는 펩타이드는 침투능이 매우 적은데 비해, 7개 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드는 나노몰의 농도만으로도 침투능이 매우 향상됨을 확인할 수 있으며, 특히 16개 이상, 최대 23개의 아미노산을 포함하는 펩타이드는 10 nM 이하의 농도에서 모두 세포 투과능을 보임을 확인할 수 있다(도 24).
친수성 아미노산의 아민기를 알파나선형 펩타이드의 한 면으로 모으기 위해, 친수성 아미노산이 한 개 내지 세 개씩 교대로 배열되어 있을 수 있으며, 나머지 서열은 소수성 아미노산이 한 개 내지 세 개씩 배열될 수 있다. 예를 들어, 상기 친수성 및 소수성 아미노산 각각이 한 개 내지 세 개씩 교대로 배열되어, 양면성 펩타이드 중 i＋3 혹은 i＋4 위치에 적어도 하나는 i 위치와 같은 극성을 지니는 아미노산을 가지는 7개 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 양면성 펩타이드는 친수성 및 소수성 아미노산 각각이 한 개 내지 두개씩 교대로 배열되어 있는 7개 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있는데, 이 때 i가 친수성 아미노산이면, i＋3 및 i＋4 위치 중 적어도 하나는 친수성 아미노산이어야 하며, i가 소수성 아미노산이면, i＋3 또는 i＋4 위치 중 적어도 하나는 소수성 아미노산이어야 한다.
위 7개 아미노산을 가지는 서열은 예를 들어, 다음의 식으로 표시되는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
XYXXYYX YXYYXXY
XYYXYYX YXXYXXY
XYYXXYX YXXYYXY
XYYXXYY YXXYYXX
XXYXXYY YYXYYXX
XXYYXYY YYXXYXX
XXYYXXY YYXXYYX
상기 식에서, X는 친수성 아미노산이고, Y는 소수성 아미노산이다.
이 때, 상기 양면성 펩타이드의 소수성 아미노산 중 최대의 소수성을 나타낼 수 있는 아미노산 예를 들어 루신, 트립토판, 발린, 페닐알라닌, 타이로신 및 이소루이신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기를 25% 이상으로 포함할 수 있으며, 이를 통해 형성된 소수성 (hydrophobicity)에 의해 펩타이드가 세포를 투과할 수 있다. 본 출원의 발명자들은 소수성 아미노산인 루신(L)을 알라닌(A)으로 치환한 결과, 소수성 아미노산 중 25% 이상에 소수성 아미노산이 위치하지 않는 경우 목적하는 정도의 세포 침투 효과를 나타내지 못함을 확인하였다 (도 19 및 도 20).
또한, 상기 양면성 펩타이드의 친수성 아미노산 중 양전하를 띄는 알지닌, 라이신 및 히스티딘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기를 33% 이상 포함할 수 있다. 33% 이상의 양전하를 가지는 경우 전반적으로 목적하는 세포 침투능을 확보할 수 있다. 33% (친수 아미노산의 약 1/3) 미만의 양전하를 띠는 친수성 아미노산을 포함하는 펩타이드(양전하를 띠는 아미노산이 적어도 2개 이상의 음전하를 띠는 친수성 아미노산으로 바뀔 경우)의 경우 세포 침투에 충분한 전하 (net charge)가 확보되지 못하여 1μM의 높은 농도에서도 침투가 어렵다. 본 출원의 발명자들은 양전하를 띠는 라이신(K)들 중 1,3번 라이신(K)를 글루탐산(E)으로 치환하여 33% 이하의 양전하를 띠는 친수성 아미노산을 포함하는 펩타이드가 100 nM의 농도에서도 목적하는 정도의 세포 침투 효과를 나타내지 못하였으나, 이를 이합체로 만들 경우 100배에 가까운 침투 능력을 향상시킬 수 있음을 확인하였다. (도 21 및 도 22).
하나의 실시예에서, 상기 양면성 펩타이드는 다음의 서열번호 11로 표시되는 서열을 포함할 수 있다:
KLLKLLK (서열번호 11).
이 때, 상기 서열번호 11의 전단에 (LK)n 또는 후단에 (LK)m의 아미노산이 추가로 결합할 수 있으며, 상기 n 또는 m은 각각 독립적으로 0-2의 정수일 수 있다. 구체적으로, 상기 양면성 펩타이드는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열 LKKLLKLLKKLLKL 또는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열 KLLKLLKKLLKLLK일 수 있다.
상기 연결부는 예를 들어, 본 발명에 따라 목적하는 특성을 나타내도록 펩타이드 사이를 연결시키는 어떠한 형태의 결합도 포함될 수 있으나, 예를 들어 공유결합을 포함할 수 있다. 상기 공유결합은 펩타이드의 기능을 저해하지 않으면서, 알파나선도를 향상시킬 수 있는 형태의 공유결합이라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 시스테인 사이의 이황화 결합, 말레이미드 결합, 에스터 결합, 티오에테르 결합 및 클릭 반응에 의한 결합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 펩타이드가 가진 안정적인 알파나선을 유지하기 위해 공유결합을 이용하여 펩타이드의 i-위치와 i＋3, i＋4, i＋7, i＋8, i＋10 또는 i＋11 위치를 묶는 것을 시도하였으며, 많은 종류의 링커 화합물들이 활용될 수 있다. 다만, 이와 같은 링커 화합물을 이용하여 알파나선도는 증진시킬 수 있었지만, 링커 화합물과 펩타이드는 보다 안정적인 결합을 형성하므로 보통의 세포질 조건에서 잘 분해되지 않는 단점을 가지고 있다. 알파나선이 깨지지 않으면 세포 독성이 강하게 나타날 수 있으므로 무작정 알파나선을 높이는 기술은 배제되어야 한다.
본 출원의 발명자들은 이를 고려하여, 양면성 알파나선 펩타이드를 두 개 이상의 다이설파이드 결합으로 연결한 펩타이드 다합체는 100%에 가까운 알파나선 모양을 하면서, shRNA에 대해 나노몰 이하의 강력한 결합을 할 수 있음을 확인하였다. 이는 단량체 펩타이드의 낮은 알파나선도 (물 속에서 10% 정도)와도 비교되며, 결합력도 단량체의 100-1000배 정도로 높다. 이러한 높은 알파나선도를 통해 세포투과능을 향상시킬 수 있을 뿐 아니라, 헤어핀 모양의 RNAi나 shRNA와 강력하게 결합할 수 있으므로, 이에 대한 RNAi를 세포 내로 전달하는 획기적인 구조가 될 수 있다.
종래, 인위적으로 합성한 링커 화합물을 사용하여 알파나선도를 향상시키는 방법을 사용하였으나, 본 발명에서는 시스테인으로부터 얻어질 수 있는 이황화 결합을 사용함으로써 알파나선도를 향상시킬 수 있음은 물론, 세포 독성 역시 최소화할 수 있다.
본 출원의 발명자들은 펩타이드 중 i 위치 및 i+7 위치의 소수성 아미노산이 시스테인으로 치환되어 이황화 결합을 통해 연결된 다합체는 높은 알파나선도를 나타낼 뿐 아니라, 헤어핀 RNA 타겟에 나노몰에 해당하는 kd 값에 상응하는 강한 친화도를 나타냄을 확인하였다.
상기 연결부가 이황화 결합을 통해 연결되는 경우, 이황화 결합은 예를 들어 양면성 펩타이드의 아미노산 사이에 시스테인을 포함시켜 시스테인 사이의 이황화 결합을 통해 연결될 수 있다.
이 때, 상기 펩타이드는 다음의 식으로 표시되는 아미노산 배열 중 하나 이상을 가질 수 있다:
CYYXXYXCYYXXYXZW (1)
XYYCXYXXYYCXYXZW (2)
XYYXCYXXYYXCYXZW (3)
XYYXXYCXYYXXYCZW (4); 및
XYYXXYXCYYXXYXCW (5)
(상기 식에서, X, Z 및 W는 소수성 아미노산, Y는 친수성 아미노산이며, C는 시스테인을 나타냄.)
구체적으로, 상기 펩타이드는 하기 표 1에 기재된 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 가질 수 있다.
표 1
Figure PCTKR2014009778-appb-T000001
위 식 (1)의 아미노산 배열을 만족하는 펩타이드 중, 본 발명에 따른 펩타이드는 예를 들어 서열번호 3 또는 8로 표시된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 서열번호 3 또는 8 로 표시된 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 소수성 아미노산인 루신 및 친수성 아미노산인 라이신 또는 알지닌이 각각 포함된 것으로, 이들 친수성 및 소수성 아미노산에 의해 펩타이드는 양면성을 나타내고, 알파나선 구조에 의해 세포 투과능을 가진다.
본 발명에 따른 펩타이드 다합체는 동형 또는 이형의 알파나선형 펩타이드를 포함하는데, 동형의 알파나선형 펩타이드를 복수개 연결하여 호모 펩타이드 다합체 형태일 뿐 아니라, 세포 내 전달력이 우수한 전달자 펩타이드와 세포 내 표적의 리간드로 작용할 수 있는 펩타이드가 이형으로 포함된 헤테로 펩타이드 다합체 형태일 수 있다.
상기 다합체는 목적하는 펩타이드의 기능을 유지하면서 필요에 따라 복수의 역할을 하는 펩타이드가 결합한 형태일 수 있으나, 예를 들어 이합체, 삼중합체, 사중합체 또는 오중합체일 수 있으며, 바람직하게는 이합체일 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 펩타이드 다합체의 제조방법에 관한 것이다: 친수성 및 소수성 아미노산을 포함하는 알파나선형 펩타이드를 제작하는 단계; 동형 또는 이형의 복수개 알파나선형 펩타이드를 선택하는 단계; 및 상기 선택된 복수개의 알파나선형 펩타이드를 i, i＋3, i＋4, i＋7, i＋8, i＋10 및 i＋11 (i는 정수))로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 위치에서 연결하는 단계. 앞서 설명된 본 발명에 따른 각 구성은 제조방법에서도 동일하게 적용될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 알파나선형 펩타이드 다합체를 유효성분으로 포함하는 HIV 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 출원에 따른 발명자들은 본 발명에 따른 펩타이드 다합체가 특히 HIV-1 (Human immunodeficiency virus-1) 중 숙주에 도입된 게놈의 효율적 전사에 참여하는 LTR (long terminal repeat)에 위치한 TAR로 불리는 shRNA (short hairpin RNA)에 강한 결합능을 보임을 확인하였다. 또한, 상기 서열번호 3의 서열을 가지는 펩타이드가 이에 포함된 시스테인-시스테인 사이의 공유결합을 통해 연결되어 형성된 이합체 역시 TAR로 불리는 shRNA에 매우 강한 결합능을 보임을 확인하였다.
이러한 상관관계를 더 연구한 결과, 본 발명에 따른 펩타이드 다합체는 특히, Tat-TAR 상호작용의 저해제로 작용하여 HIV-1 복제를 저해할 수 있다. 또한, 세포관통능이 우수하여 HIV-1 전사에 대한 세포내 저해제로 작용할 수 있다.
이에 기초하여, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 알파나선형 세포 투과 펩타이드 다합체를 유효성분으로 포함하는 HIV 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
앞서 언급한 TAR RNA와 바이러스의 Tat 단백질 사이의 상호작용은 바이러스 유전자의 전사를 활성화한다. 결과적으로, 이러한 상호작용은 HIV-1에 의한 질병의 치료를 위한 물질 개발에 타겟이 될 수 있다. 이러한 가능성이 알려졌음에도 불구하고, TAR RNA에 Tat이 결합하는 것을 저해하는 약학 제제는 존재하지 않는다. 이는 세포 투과 가능한 저분자 화합물이라도 TAR RNA에 효과적으로 결합할 수 없고, 거대분자는 TAR RNA와 Tat의 결합을 저해할 수 있을지라도 세포 투과 자체가 어렵다.
이를 고려하여, 본 출원의 발명자들은 알파나선형 세포 투과 펩타이드 다합체가 세포를 투과하여 TAR RNA에 결합함으로써, TAR RNA와 Tat 사이의 결합을 직접 저해하여 HIV-1 유전자의 전사가 저해됨을 확인하였다.
본 발명에 따른 조성물은 HIV 감염; HIV에 대한 실제적으로 또는 잠재적으로 노출되어 있는 환자의 치료용일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명에 따른 조성물은 과거 HIV에 노출되었다고 추정된 후, 즉 수혈, 기관 이식, 체액의 교환, 물림, 우발적인 바늘 찔림, 또는 수술동안 환자 혈액에 노출된 후에 HIV에 의한 감염을 치료하는 데 유용하다.
또한, 알파나선형 세포 투과 펩타이드 다합체는 미토콘드리아의 표면에 있는 Bcl2/Bax 단백질 인식이 세포사멸을 저해하여 암세포의 세포사멸을 유도하는 펩타이드로 사용될 수도 있다.
본 발명에 따른 조성물은 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 특히, 동결건조(lyophilized)된 형태의 제형으로 제제화하여 제공하는 것이 바람직하다. 동결건조 제형 제조를 위해서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 방법이 사용될 수 있으며, 동결건조를 위한 안정화제가 추가될 수도 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍톤 약학 과학(Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질병에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 유효성분 등의 함량 및 투여방법은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한, 액제, 주사제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.
본 발명에 따른 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설비율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 알파나선형 세포 투과 펩타이드 다합체를 생물학적 활성물질과 결합시켜, 세포 내로 활성물질을 전달하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 펩타이드 다합체를 통해, 세포 투과력이 기존에 존재하는 세포 투과 펩타이드에 비해 적어도 10배 증가할 수 있다. 이는 종래 세포 투과 펩타이드의 경우 양을 적어도 마이크로몰 정도의 농도로 사용하여 짐을 세포 안으로 전달하는데 반해, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드 다합체는 종래 세포 투과 펩타이드의 최소 사용 농도에 대하여 약 1/10 이하를 쓰고도 목적하는 세포 투과능을 확보할 수 있으며, 생물학적 활성물질 예를 들어, RNAi 올리고핵산 분자를 세포내로 전달하고자 하는 경우에도 나노몰 정도의 농도만을 사용하여도 목적하는 세포 투과능을 가짐을 확인하였다.
이와 같이, 매우 적은 농도 특히, 수십 나노몰 또는 그 이하의 농도의 세포 투과성 펩타이드 다합체를 사용함으로써 생물학적 활성물질 예를 들어, RNAi 올리고핵산 분자 역시 종래에 비해 매우 적은 농도로 사용하는 경우에도 목적하는 효과를 발휘할 수 있다. 적은 농도의 세포 투과 펩타이드와 적은 농도의 생물학적 활성물질은 세포 독성을 최소화 할 수 있는 충분조건이 될 수 있다.
본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드 다합체는 환원조건인 세포질 내로 투과하면 다합체 사이 공유결합이 깨진 단량체 펩타이드가 될 수 있다. 만약에 세포 내에서 공유결합이 계속 유지되어 펩타이드 다합체로 존재한다면, 펩타이드 다합체는 일반적으로 DNA 또는 RNA 등에 결합능력이 우수한 편이므로, 세포 독성이 크게 나타날 수 있다. 그러나, 세포질에서 공유결합이 깨진 펩타이드 단위체는 알파나선도도 급격하게 감소되면서 화학적 안정성이 매우 낮아져 세포 내에서 많은 단백질 분해효소에 의해 쉽게 가수분해 될 수 있다.
이를 통해, 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드 다합체는 우수한 세포 전달능을 나타낼 뿐 아니라, 낮은 농도의 생물학적 활성물질을 사용하여도 목적하는 효과를 획득할 수 있고, 세포 내에서 분해됨으로써 세포 독성 또는 최소화할 수 있다.
상기 생물학적 활성물질은 일종의 짐 (cargo)으로, 세포막 투과 도메인에 결합되어 세포 내로 전달됨으로써 생체 내의 모든 생리 현상을 조절하는 생물학적 활성 또는 기능을 조절하는 물질일 수 있으며, 예를 들어 DNA, RNA, siRNA, 압타머, 단백질, 항체 또는 세포독성 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 펩타이드 다합체에 추가적으로 생물학적 활성 또는 기능을 조절하는 물질 또는 기타 전달체를 결합시킬 수 있으며, 이 때 펩타이드 다합체와 생물학적 활성 또는 기능을 조절하는 물질 또는 기타 전달체가 복합체 구조를 형성할 수 있다. 상기 물질 또는 전달체는 예를 들어, 다합체와의 비공유성 결합 또는 공유성 결합을 통해 연결될 수 있다. 상기 비공유성 결합은 예를 들어, 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용 및 양이온-파이 상호작용으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 공유성 결합은 분해성 또는 비분해성 결합일 수 있으며, 상기 분해성 결합은 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합일 수 있고, 비분해성 결합은 아미드 결합 또는 포스페이트 결합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세포독성 화합물의 경우 펩타이드 다합체와 정전기적 결합 또는 host-guest 결합 등 비공유성 결합을 형성하여 연결될 수 있으며, 예를 들어 doxorubicin, Methotrexate, Paclitaxel, Cisplatin, Bleomycin, taxol, berberine 또는 curcumin일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 또는 항체의 경우 세포 내 특정 타겟에 특이적으로 결합하는 어떠한 형태의 약물이라도 포함할 수 있으며, N-말단 또는 C-말단에 융합되는 형태로 다합체를 도입할 수 있다.
경우에 따라서, 약물 내성을 가진 암세포 (MCF7)에 methotrexate를 펩타이드 다합체에 연결하여 암세포를 괴멸시킬 수 있는 새로운 물질로 사용될 수 있고, 물성이 소수성인 생리활성 저분자 (taxol, berberine, curcumin 등)를 펩타이드에 달아 세포 내 전달의 농도를 높일 수 있다. 또한, 항체 및 항체의 일부인 단백질 및 단백질 약물을 이합체 펩타이드에 연결하여 세포 내 전달 할 수 있고, oligonucleotide drug (siRNA, asDNA, DNA, aptamer)를 이합체 펩타이드에 연결하여 세포 내 전달 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 펩타이드 단위체 및 이합체의 합성
단량체 LK (LKKLLKLLKKLLKLAG), 시스테인이 두 개 들어간 단량체 A (CKKLLKLCKKLLKLAG), B (LKKCLKLLKKCLKLAG), C (LKKLCKLLKKLCKLAG), D (LKKLLKCLKKLLKCAG), E (LKKLLKLCKKLLKLCG), LK 아미노산 서열에서 모든 K를 R로 치환한 단량체 AR (LRRLLRLLRRLLRLAG), 시스테인이 두 개씩 들어간 단량체 RA (CRRLLRLCRRLLRLAG), RB (LRRCLRLLRRCLRLAG), RC (LRRLCRLLRRLCRLAG), RD (LRRLLRCLRRLLRCAG), RE (LRRLLRLCRRLLRLCG)등을 고체상 합성법과 Fmoc화학을 이용
하여 만들었다. 이황화가 달려있는 이합체 펩타이드는 정제된 단량체 펩타이
드를 공기 산화조건에서 산화시켜서 얻어내었다 (이합체 A, B, C, D, E, RA, RB,
RC, RD, RE). 다이멀 펩타이드(dimal peptide)는 도 3에 나타난 바와 같이 스페이서를 마이클 반응을 이용하여 합성하였다.
세포 내로 투과하는 성질을 관측하기 위해 펩타이드의 N-말단에 FITC를 라벨링한 펩타이드도 제조하였다. 합성된 펩타이드들은 MALDI-TOF 질량 분석기에 의해 분자량을 다음과 같이 확인하였다.
LK - MS [M＋H]＋: 1861.3 (calcd.), 1862.3 (found), FITC-labeled LK - MS [M＋H]＋: 2208.4 (calcd.), 2208.0 (found), C - MS [M+H]+: 1841.2 (calcd.), 1840.8 (found), FITC-labeled C - MS [M＋H]＋: 2188.2 (calcd.), 2188.5 (found)), 이합체 C - MS [M＋H]＋: 3677.4 (calcd.), 3677.9 (found), FITC-labeled 이합체 C - MS (M＋H＋): 4024.4 (calcd.), 4024.1 (found)), 다이멀 MS [M＋H]＋: 2381.3 (calcd.), 2381.7 (found)), FITC-labeled 다이멀 - MS [M＋H]＋: 4519.5 (calcd.), 4520.1 (found)).
실시예 2: 합성된 펩타이드의 CD(Circular Dichroism) 분석
단량체, 이합체 또는 다이멀의 2차 구조를 CD(Circular Dichroism)를 이용하여 관측하였다. 특히 수용액 환경에서도 이합체들은 거의 100%에 가까운 알파나선도를 보이고 있었다. 이는 단량체 (수용액에서 30%)와는 매우 다른 양상을 보여주고 있다.
이황화 결합 두 개가 알파나선의 한 쪽 방향으로 각각 i 위치와 i+7 위치에 존재하면 이 두 개의 공유결합이 알파나선 모양을 묶음으로써, 높은 알파나선을 유지할 수 있는 것으로 판단된다. 다이멀 펩타이드도 이합체 펩타이드와 마찬가지로 두 개의 공유결합 형태로 만들어졌기 때문에 높은 알파나선도를 가지고 있었다. 하지만 분자의 유연함으로 인해 이합체 펩타이드 보다는 낮은 알파나선도를 가지고 있었다.
이합체/다이멀 펩타이드에 환원환경 (세포질의 환경과 비슷함)인 DTT를 처리해 보았다. 이를 통해, 환원환경인 세포질에서 이합체/다이멀 펩타이드가 어떻게 변하는지를 확인할 수 있다. 이합체는 단량체로 분해되었으며, 단량체는 알파나선 구조의 정도가 크게 떨어지는 것을 관측하였다. 반면, 다이멀은 DTT 유무에 상관없이 알파나선구조를 유지하였다.
실시예 3: 펩타이드의 세포 투과실험
세 개의 서로 다른 펩타이드들이 세포 내로 uptake되는 정도를 FITC가 장착된 펩타이드의 농도에 따라 FACS 실험을 통해 비교하였다(도 4). 높은 펩타이드 농도 (500 nM) 에서는 이합체 (LK-3)/단량체 (LK-1, LK-2)가 서로 거의 차이 없이 높은 정도의 uptake 효율 (90% 이상)을 보이고 있다. 그러나, 낮은 농도 (10 nM)의 경우에는 이합체 (LK-3)는 계속해서 높은 uptake 효율을 보이는 반면, 단량체는 효율이 10% 미만으로 크게 감소한 것을 관측하였다.
특이하게도 다이멀 (LK-4)의 경우에는 낮은 농도에서도 uptake되지만, 효율은 이합체 (90% 이상)에 비해 약 10-15% 정도로 떨어짐을 확인하였다. 낮은 농도와 높은 농도에서 모두 이합체 > 다이멀 > 단량체의 순서로 세포투과능을 보유함을 확인하였다.
실시예 4: 이합체를 이용한 siRNA 전달
10개의 이합체 펩타이드 (이합체 A, B, C, D, E, RA, RB, RC, RD, RE)와 대조구 펩타이드를 이용하여 RNAi (Dy547-labeled)가 세포 내로 잘 투과하는지 여부를 확인하는 실험을 수행하였다. 대조군 펩타이드로는 LK, Rev, 단량체C, kinkC, kink D를 이용하였다. Dharmafect를 0.8 μL 넣은 양성 대조군을 사용하였다. 이합체 펩타이드는 100 nM, 단량체 펩타이드는 200 nM, RNAi 50 nM을 사용하였으며, 펩타이드와 RNAi를 혼합하여 혼합 용액을 제조하였다. 혼합 용액을 HeLa 세포주 (2.0×103개/well)에 넣어 24시간 배양하였다. PBS로 1회 세척 후, 형광 공초점 현미경으로 세포 내로 투과한 RNAi의 양을 관찰하였다.
도 5에 기재한 바와 같이, 이합체 RE > 이합체 C > 이합체 D를 사용한 순서로 RNAi가 세포 내로 잘 전달된 것을 확인할 수 있으며, 이에 비하여 단량체 펩타이드를 사용했을 때에는 RNAi가 거의 전달되지 않았음을 확인할 수 있다.
실시예 5: 펩타이드의 세포 내 침투 기작의 확인
각 물질의 흡수 메커니즘을 비교하기 위하여, FITC가 장착된 펩타이드와 confocal microscopy를 이용해 확인하였다 (도 6).
단량체는 낮은 온도 (ATP independent uptake) 또는 대음세포작용(macropinocytosis)의 억제 상황에서도 약간은 투입되는 것으로 볼 때 에너지 독립적/의존적 두 기작 모두에 의해 세포 내로 침투 가능한 것으로 보인다. 이합체 역시 두 과정에 의해 모두 우수한 세포 투과능을 보이며, 단량체에 비해 훨씬 우수한 세포 투과능을 가짐을 극명하게 확인할 수 있다. 이에 비해, 다이멀은 낮은 온도에서는 전혀 세포투과능을 가지지 못하고, 대음세포작용의 억제 상황에서도 거의 들어가지 못하는 것으로 보아, 다이멀 펩타이드는 에너지 의존적 경로로만 들어가는 것으로 보인다. 단량체/이합체가 에너지 독립적 경로인 직접적인 방법에 의해 세포 안으로 들어감을 확인할 수 있으며, 이합체의 이황화 결합이 끊어지는 것이 에너지 독립적 경로에 중요한 역할을 하는 것으로 판단된다.
실시예 6: 펩타이드의 세포독성 실험
펩타이드에 의한 세포 독성을 암세포에 펩타이드를 처리하고 세포의 활성을 MTT 방법으로 살펴보았는데, 단량체, 이합체, 다이멀 세 펩타이드 모두 5μM 까지는 독성을 보이지 않았다(도 7).
본 발명에 따른 세포 투과 능력이 있는 알파나선 펩타이드의 알파나선도를 극대화시키는 방법과 이에 의해 합성된 전달 또는 투과 능력이 향상된 펩타이드를 개시한다. 알파나선도를 극대화하기 위해 1) 단량체 펩타이드에 두 개의 티올(thiol)을 장착하였고 2) 이를 공기 중 산화조건을 이용하여 이황화 결합이 두 개 들어간 이합체 펩타이드를 제조하였다.
실시예 7: TAR RNA에 대한 결합친화도 및 알파나선도 측정
서열번호 3의 서열을 가지는 펩타이드를 통해, 표 2와 같이 LK 펩타이드를 제조하였다.
표 2
Figure PCTKR2014009778-appb-T000002
양면성 펩타이드 이합체인 LK-3는 각 쇄의 중간에 2개의 이황화 결합을 포함하며, TAR RNA에 대하여 나노몰 이하의 친화도를 가졌다. LK-3 중 이황화 결합이 세포질 조건에서 분해될 수 있으므로, 환원된 단위체 펩타이드 LK-2는 대조군으로 사용하였다. 비환원 이합체인 LK-4는 펩타이드 체인이 2개의 N,N’-(1,4-Phenylene)dimaleimide에 의해 연결되었다. LK-3에서 이황화 결합은 점선으로 표시하였으며, LK-4에서 N,N’-(1,4-Phenylene)dimaleimide는 실선으로 표시하였다.
(1) 결합친화도
펩타이드의 TAR RNA 결합에 대한 K d (dissociation constants)를 측정하였으며, 친화도는 20℃에서 로다민-Rev 펩타이드를 프로브로 사용하여 형광 이방법 (fluorescence anisotropy)으로 측정하였다. 측정 결과, 단위체 펩타이드인 LK-1 및 LK-2와 비교하여 LK-3 및 LK-4는 100-1000배 더 강한 친화도를 나타냄을 보여주었다.
(2) 알파나선도
CD (circular dichroism)를 이용하여 첫번째 값은 PBS (pH 7.4)의 막 모방 조건 중에서, 두번째 값은 동일한 버퍼 중 50% TFE에서 알파나선도를 측정하였으며, 그 결과 이합체 펩타이드가 단위체 펩타이드에 비해 더 높은 알파나선도를 나타냄을 보여준다. 실제로, LK-3 및 LK-4는 약 90%의 알파나선도를 보임을 확인하였다.
(3) 세포투과도
FITC (fluorescein isothocyanate)가 표지된 LK 펩타이드를 9개의 알지닌으로 이루어진 공지의 세포 투과 펩타이드 R9을 대조군으로 하여, HeLa 세포 (human cervical cancer cell line)와 인큐베이션하였다. FACS (fluorescence activated cell sorting) 실험 결과 (도 4), FITC 양성세포의 백분율은 분석에 사용된 모든 농도에서 세포 투과능은 다음 순서로 증가함을 보여준다 (도 4a): R9 < LK-1 및 LK-2 < LK-4 < LK-3.
고농도(>500 nM)에서 단위체 및 이합체 펩타이드는 거의 100%의 세포 투과율을 나타내었다. 그러나, 매우 낮은 농도 (10 nM)에서 단위체 펩타이드는 40%의 투과 효율, 100nM에서는 70%의 투과 효율만을 나타낸 반면, 이합체 펩타이드는 70-90%의 세포 투과능을 가짐을 확인하였다. 대조군이 R9은 10 nM에서 극히 최소의 세포 투과능을 나타내었다. 관찰 결과, LK 펩타이드의 세포 투과능은 이합체 형성에 의해 크게 향상됨을 확인할 수 있다. 또한, 펩타이드 이합체 상당 부분이 세포 핵으로 전달되었음을 확인하였다 (도 4b).
(4) 세포 내 침투 기작의 확인
세포 침투에 사용된 기작을 확인하기 위하여, 다양한 엔도시토시스 저해 조건에서 LK 펩타이드를 시험하였다. 낮은 농도(10 nM)에서 모든 LK 펩타이드의 세포 투과는 온도를 약 4℃로 낮추거나 엔도시토시스 저해제 (보르트만닌 (wortmannin) 또는 아밀로라이드 (amiloride)) 처리에 의해, 거의 전부 저해되었다. 따라서, 낮은 농도의 LK 펩타이드는 각 LK 펩타이드의 활성이 이들 농도와 현저하게 다를지라도, 에너지 의존적 엔도시토시스 경로 (endocytic pathway)를 통해 내재화 (internalization)됨을 알 수 있으며, macropinocytosis 또는 clathrin mediated endocytosis로 침투됨을 확인할 수 있다. (도 4c). 고농도(500 nM)에서, 모든 LK 펩타이드가 >80% 세포 uptake를 나타내는데, 세포 침투 기작이 다양하다. LK-4 (non-reducible dimer)의 경우에는 저농도와 유사한 메커니즘으로 들어간다는 것을 알 수 있고 (도 4d), 예를 들어, 보르트만닌 또는 아밀로라이드는 단위체 LK-2 및 이합체 LK-3에 의해 세포 침투가 거의 저해되지 않고, 이들 펩타이드의 내재화 효율은 4℃에서도 변하지 않았다. 따라서, LK-2 및 LK-3는 고농도에서 수용체 매개 엔도시토시스 (receptor-mediated endocytosis)도 아니고, 대음세포작용 (macropinocytosis)도 아닌, 다른 형태의 에너지 의존적 경로를 통해 세포로 침투함을 알 수 있다.
비환원 말레이미드 링커 (maleimide linker)를 포함하는 500 nM LK-4 이합체는 온도를 낮추거나 또는 엔도시토시스 저해제 둘 다에서 완전히 저해되었다. 이 결과를 통해, 펩타이드 이합체의 알파 나선도가 높을수록 낮은 농도에서 에너지 의존적 세포 침투가 촉진되는 반면, 단위체 형태는 고농도에서 에너지 비의존적 세포 침투 (예를 들어, 홀 또는 카펫 형성)하게 됨을 알 수 있다.
(5) Tat-TAR 상호작용 저해 효과 확인
나노몰의 농도에서 세포로 전달될 수 있기 때문에, LK 이합체 펩타이드가 숙주세포 내의 바이러스 타겟을 저해할 수 있는지 여부를 확인하였다. pLTR-luc, HIV-1 LTR 프로모터 및 반딧불이 루시퍼라제 유전자 포함 플라스미드, pTat, HIV-1의 Tat 유전자 포함 플라스미드와 함께 공동으로 형질감염하여, HeLa 세포에서 루시퍼라제 리포터 시스템을 구축하였다. 이 시스템에서, 발현된 Tat 단백질은 항-종결 인자로 LTR 프로모터 하에서 TAR RNA와 상호작용하여, 루시퍼라제 유전자의 전사를 증진시킨다. LK 펩타이드와 리포터 세포를 12시간 인큐베이션한 이후, mRNA의 상대적 양을 RT-PCR을 이용하여 결정하였다 (도 8). 결과에 따르면, 2개의 하우스 키핑 유전자 (β-actin 및 18S rRNA)와 비교하여, 루시퍼라제 유전자 중 mRNA의 양은 펩타이드 양에 의존적인 방식으로 감소한다 (도 8a, b). 또한, LK 펩타이드가 형질감염된 플라스미드 DNA에 결합하여 전사하는 것을 방해하지 않음을 입증하기 위해 전사된 총 TAR RNA를 포함하는 긴 루시퍼라제 유전자의 전사량을 측정하였다. TAR-luc (long transcript) 및 TAR (total transcript)의 비율은 TAR-luc 및 하우스 키핑 유전자의 mRNA의 비율과 유사함을 확인하였다. 이러한 결과는 전사 수준에서 LK 펩타이드에 의해 Tat-TAR 상호작용이 저해됨을 의미한다 (도 8c).
Tat 매개 전사 저해능과 관련하여, 단위체 LK-1 및 LK-2는 100 nM에서도 50% 미만의 저해 효과를 나타내는 반면, 펩타이드 이합체 LK-3 및 LK-4은 더 높은 세포 침투능을 가지면서도 10 nM에서 약 50%의 저해능을 보였으며, 100 nM에서는 80% 이상의 저해능을 보였다. LK-1 및 LK-2의 HeLa 세포 침투능이 유사하기 때문에 (도 4a), LK-2의 더 강한 저해 효과는 TAR RNA에 대한 더 강한 친화도의 결과인 것으로 판단된다. 이황화 결합이 환원 세포질 조건에서 용이하게 분해되기 때문에, LK-3는 내재화 이후 세포 기질에서 환원되어 TAR RNA와 여전히 나노몰의 친화도로 결합하는 단위체 LK-2를 형성한다. 따라서, LK-3의 향상된 세포 침투능은 전사 수준에서 Tat-TAR 상호작용을 저해할 수 있는 주된 원인이다.
(6) IC50 측정
LK 펩타이드의 IC50 값은 루시퍼라제 어세이를 통해 측정되었으며, LK-1 (107 nM) > LK-2 (49.6 nM) > LK-4 (34.7 nM) > LK-3 (10.3 nM) 순으로 감소하였다 (도 10). 이합체 LK-3의 IC50 값은 단위체 LK-1에 비해 10배 이상 낮았으며, 이는 향상된 세포 투과능뿐 아니라, LK-3가 세포기질에서 분해되는 경우 단위체 펩타이드 농도가 2배 이상으로 증가한 결과인 것으로 판단되었다. LK-3의 IC50 값은 LK-2 (Kd = 9.6 nM)의 해리상수(dissociation constant)와 거의 동일하였는데, 이는 세포막 침투가 더 이상 세포 활성에 대한 장벽으로 작용하지 않았음을 의미하며, 다른 펩티드 약물에는 존재하지 않는 특이적 구성을 통해 Kd 및 IC50 값 사이에 큰 차이를 보였다.
유사한 세포 기반 측정 시스템인 RAW 264.7 세포 (mouse monocyte/macrophage cell line) 에서 IC50 값 측정 결과를 도 10에 나타내었다. 이를 통해 LK 펩타이드의 IC50 값이 15-150nM임을 확인할 수 있었다.
(7) HIV-1 복제 저해 및 세포 독성 확인
급성 감염된 T-림프아구양(T-lymphoblastoid) 세포 (MOLT-4/CCR5)에서 HIV-1 복제 저해 여부를 확인하였다 (도 11). HIV-1 복제에서 LK-3 및 LK-4의 IC50 값은 각각 590.1 및 278.5 nM인 반면, LK-1의 IC50 값은 > 2μM 이었다. HeLa 또는 RAW 264.7 세포와 비교하여, 더 큰 IC50 값은 펩타이드가 T-림프아구양 세포로 감소된 침투능을 보이는데 일부 기여하였을 가능성이 있다. 그러나, LK-3는 2.56μM 이하의 농도에서 숙주세포에 대한 큰 세포독성을 보이지 않았으며, 이는 HIV-1 복제에 대한 IC50 값보다 훨씬 큰 수치이다. LK-4는 LK-3에 비해 좀 더 활성이 있는 것으로 확인되었으나, 숙주세포에 더욱 독성이 있었다. 이를 통해, LK 이합체 특히, LK-3는 HIV-1에 대한 치료적 응용이 가능할 것으로 판단된다.
펩타이드의 세포독성을 MTT assay를 통해 확인하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다. 24시간 처리 후 MTT assay를 하였을 때, 약 10μM에 이르기까지 Hela 세포 및 RAW 264.7 세포 모두 독성이 없는 것을 확인하였다.
(8) 세포막 destabilization
LDH assay를 통해 펩타이드가 세포막을 destabilization하는 정도를 확인하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13를 참조하면, 12시간 펩타이드 처리 후 LDH assay를 하였을 때, 약 2μM에 이르기까지는 Hela 세포 및 RAW 264.7 세포 모두 거의 세포막을 destabilization하지 않는 것을 알 수 있다.
세포막 투과가 거의 10 nM 수준에서 일어나는 것을 볼 때, 세포내 투과는 세포막 destabilization 과 직접적인 연관이 없다는 것을 알 수 있다.
LK-3 (reducible dimer) 및 monomer는 8μM에서는 약간의 destabilization을 보이는 것을 알 수 있는데 반해, LK-4 (non-reducible dimer)는 8 ?M에서도 거의 destabilization을 보이지 않음을 확인하였다.
(9) Tat-TAR 상호작용 저해 유형 확인
pTat 발현 정도에 따른 LK 펩타이드의 저해 능력에 대한 감소 실험을 진행하였다. Hela 세포 기반 시스템에 pTat 플라스미드의 양을 다르게 형질감염한 후, LK 펩타이드의 저해 능력을 luciferase로 측정하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14 중 각 그룹에 대한 구체적 설명은 다음 표 3과 같다:
표 3
Figure PCTKR2014009778-appb-T000003
도 14을 참조하면, pTat 발현 정도에 따라 LK 펩타이드의 저해 능력이 서서히 감소함을 확인할 수 있는데 (92.9% > 92.3% > 72.3% (100 nM LK-3의 경우), 이를 통해 Tat과 LK 펩타이드의 competitive binding이 TAR-luciferase 발현에 관련이 깊다는 것을 간접적으로 알 수 있다.
(10) 펩타이드 안정성
37℃에서 HPLC를 사용하여 펩타이드 안정성을 측정하였다. 펩타이드의 반감기를 exponential decay에 의해 계산하여, 표 4에 나타내고, 도 15-도 17에서와 같이 도시하였다 (rate constant plotting the peptide concentration in the time scale). Disulfide 링커를 LK-3에서 점선으로 표시하였고, LK-4에서 N,N’-(1,4-Phenylene)dimaleimide 링커를 실선으로 표시하였다. Kink peptide 및 LK-3는 다양한 세럼 단백질과 중첩되었다. Life time이 짧아, 이 조건에서 반감기는 측정되지 않았다. 모든 투입된 펩타이드는 1시간 내에 사라졌다. 동일한 결과가 다이머 D에서도 예상된다.
표 4
Figure PCTKR2014009778-appb-T000004
Peptide dimer D 와 monomer D의 in vitro human serum 존재하의 안정성 실험을 진행하여 도 15에 나타내었다. 도 15를 참조하면, LK-3과 유사한 dimer D의 경우 25% human serum 존재하에 반감기가 약 9시간 정도로 해당 monomer의 반감기 (3시간)보다 세배 정도 길어짐을 확인할 수 있다. 이는 disulfide dimer를 형성하여, 구조적인 안정화가 serum내에 존재하는 protease에 의한 분해를 저해할 수 있음을 보이는 것이다.
LK-4의 serum 조건에서의 안정성 테스트 결과를 도 16에 나타내었다. Disulfide가 아닌 다른 결합이 도입된 LK-4의 경우는 동일한 조건에서 반감기가 2 시간으로 측정되었다. Dimer D와는 동일한 위치에 다이설파이드 결합을 갖는 dimer가 아니므로 직접 비교를 할 수 없으나, dimer를 형성하는 위치에 따라 peptide의 안정성이 달라질 수 있음을 의미한다.
Peptide dimer D 와 kink D의 생체 내 환원 조건인 0.5 mM GSH 존재하의 안정성 테스트 결과를 도 17에 나타내었다. 펩타이드의 안정성에 구조적인 영향을 단적으로 보여주는 예로서, dimer를 형성하여 disulfide 결합이 안정하게 구조의 안쪽에 위치하게 되면 동일한 환원조건하에서도 환원되는 시간이 길어짐을 보였다. 반면, 분자 내 disulfide 결합을 형성하여 상대적으로 disulfide 결합이 노출이 되는 경우는 반감기가 1시간 이내임을 확인하였다.
본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.
본 발명에 따른 복수개의 양면성 알파나선형 펩타이드 중 하나 이상의 특정 아미노산 위치에 연결부를 포함하는 펩타이드 다합체는 알파나선도가 현저하게 증가하여 높은 세포 투과능을 보유할 수 있다. 이러한 우수한 세포 투과능을 통해, 세포 내에 여러 종류의 생물학적 활성물질을 효과적으로 전달할 수 있을 뿐 아니라, 세포 투과 이후 세포 독성 역시 최소화할 수 있으므로, 질병의 예방 또는 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
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Claims (26)

  1. 동형 또는 이형의 알파나선형 양면성 펩타이드를 복수개 포함하는 펩타이드 다합체.
  2. 제1항에 있어서,
    i, i＋3, i＋4, i＋7, i＋8, i＋10 및 i＋11 (i는 정수)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 위치에 연결부를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 다합체.
  3. 제2항에 있어서,
    i, i＋3, i＋4, i＋7, i＋8, i＋10 및 i＋11 (i는 정수)로 이루어진 군에서 선택된 두 개 이상의 아미노산 위치에 존재하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 다합체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 양면성 펩타이드는 알지닌, 라이신 및 히스티딘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 친수성 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 다합체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 양면성 펩타이드는 루신, 발린, 트립토판, 페닐알라닌, 타이로신 및 이소루신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 소수성 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 다합체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 5-50개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 다합체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 7-23개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 다합체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드 중 친수성 및 소수성 아미노산 각각이 한 개 내지 세 개씩 교대로 배열되어 있는 것을 특징으로 하는 펩타이드 다합체.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 양면성 펩타이드는 다음의 식으로 표시되는 7개 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 다합체:
    XYXXYYX YXYYXXY
    XYYXYYX YXXYXXY
    XYYXXYX YXXYYXY
    XYYXXYY YXXYYXX
    XXYXXYY YYXYYXX
    XXYYXYY YYXXYXX
    XXYYXXY YYXXYYX
    상기 식에서, X는 친수성 아미노산이고, Y는 소수성 아미노산임.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 양면성 펩타이드의 친수성 아미노산 중 양전하를 띄는 알지닌, 라이신 및 히스티딘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기를 33% 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 다합체.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 양면성 펩타이드의 소수성 아미노산 중 루신, 트립토판, 발린, 페닐알라닌, 타이로신 및 이소루이신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기를 25% 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 다합체.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 양면성 펩타이드는 다음의 서열번호 11로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 다합체:
    KLLKLLK (서열번호 11).
  13. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 다음의 식으로 표시되는 아미노산 배열 중 하나 이상을 가지는 것을 특징으로 하는 펩타이드 다합체:
    CYYXXYXCYYXXYXZW (1)
    XYYCXYXXYYCXYXZW (2)
    XYYXCYXXYYXCYXZW (3)
    XYYXXYCXYYXXYCZW (4); 및
    XYYXXYXCYYXXYXCW (5)
    상기 식에서, X, Z 및 W는 소수성 아미노산, Y는 친수성 아미노산이며, C는 시스테인을 나타냄.
  14. 제13항에 있어서,
    서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 펩타이드 다합체.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드의 알파 나선도는 트리플루오로에탄올 (Trifluoroethanol) 및 버퍼가 1:1로 혼합된 세포막 조건에서 80% 이상인 것을 특징으로 하는 펩타이드 다합체.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 연결부는 펩타이드 사이의 공유결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 다합체.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 공유결합은 시스테인 사이의 이황화 결합, 말레이미드 결합, 에스터 결합, 티오에테르 결합 및 클릭 반응(click reaction)에 의한 결합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 펩타이드 다합체.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 다합체는 이합체, 삼중합체 또는 사중합체인 것을 특징으로 하는 펩타이드 다합체.
  19. 다음 단계를 포함하는 펩타이드 다합체의 제조방법:
    친수성 및 소수성 아미노산을 포함하는 알파나선형 펩타이드를 제작하는 단계;
    동형 또는 이형의 복수개 알파나선형 펩타이드를 선택하는 단계; 및
    상기 선택된 복수개의 알파나선형 펩타이드를 i, i＋3, i＋4, i＋7, i＋8, i＋10 및 i＋11 (i는 정수)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 위치에서 연결하는 단계.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 복수개의 알파나선형 펩타이드를 i, i＋3, i＋4, i＋7, i＋8, i＋10 및 i＋11 (i는 정수)로 이루어진 군에서 선택된 두 개 이상의 아미노산 위치에서 연결하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 복수개의 알파나선형 펩타이드를 펩타이드 사이의 공유결합을 통해 연결하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 공유결합은 시스테인 사이의 이황화 결합, 말레이미드 결합, 에스터 결합, 티오에테르 결합 및 클릭 반응(click reaction)에 의한 결합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  23. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 알파나선형 펩타이드 다합체를 유효성분으로 포함하는 HIV 예방 또는 치료용 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 펩타이드 다합체는 HIV의 TAR(trans-activating region)에 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 알파나선형 펩타이드 다합체 및 생물학적 활성물질을 포함하는 세포 내 활성물질 전달을 위한 조성물.
  26. 제24항에 있어서, 상기 생물학적 활성물질은 DNA, RNA, siRNA, 압타머, 단백질, 항체 또는 저분자 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
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