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WO2013117135A1 - 一种纯化固相合成利拉鲁肽粗肽的方法 - Google Patents

一种纯化固相合成利拉鲁肽粗肽的方法 Download PDF

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WO2013117135A1
WO2013117135A1 PCT/CN2013/071063 CN2013071063W WO2013117135A1 WO 2013117135 A1 WO2013117135 A1 WO 2013117135A1 CN 2013071063 W CN2013071063 W CN 2013071063W WO 2013117135 A1 WO2013117135 A1 WO 2013117135A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
phase
acetonitrile
purification
fraction
liraglutide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/CN2013/071063
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
覃亮政
潘俊锋
马亚平
袁建成
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hybio Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Priority to US14/377,536 priority Critical patent/US20150051372A1/en
Priority to EP13746833.6A priority patent/EP2813514B1/en
Priority to DK13746833.6T priority patent/DK2813514T3/en
Priority to ES13746833.6T priority patent/ES2610585T3/es
Publication of WO2013117135A1 publication Critical patent/WO2013117135A1/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/18—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns
    • B01D15/1864—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns using two or more columns
    • B01D15/1871—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns using two or more columns placed in series
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/16—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the conditioning of the fluid carrier
    • B01D15/166—Fluid composition conditioning, e.g. gradient

Definitions

  • the invention relates to the field of biomedicine, in particular to a method for purifying a solid phase synthetic crude peptide of liraglutide. Background technique
  • Diabetes Mellitus is a global high incidence. According to the latest data released by the World Health Organization, the number of people with diabetes in the world has reached 180 million in 2007, and the incidence is still increasing year by year. According to epidemiological statistics, there were nearly 92 million people with diabetes in China in 2010. Because diabetes design system of the whole body, it even induces many causative complications, seriously affects people's labor ability, and threatens people's life safety, which poses great harm to people's health. Diabetes is mainly divided into type I and type II, the latter accounting for more than 90% of the total number of diabetic patients.
  • Liraglutide is a glucagon-like peptide 1 (GLP-1) analogue that is long-acting for the treatment of type 2 diabetes. It belongs to the GLP-1 receptor agonist and is the first person to develop treatment for type 2 diabetes.
  • GLP-1 glucagon-like polypeptide-1
  • Glucagon-like polypeptide-1 (GLP-1) analog Developed by Novo Nordisk, it was approved by the FDA on January 25, 2010, and was approved by the SFDA for listing in China on March 4, 2011.
  • Liraglutide as a new generation of incretin-based hypoglycemic drugs, not only has a long duration of action, but also retains many physiological activities of natural GLP-1, safely and effectively reduces blood sugar and may have multiple cardiovascular risks. Factors have a protective effect, bringing new options for the treatment of type 2 diabetes. The clinical treatment effect is encouraging.
  • the liraglutide purification method is RP-HPLC method (Journal of Medicinal Chemistry 43 , 1664-1669, 2000 ), using a cyanopropyl column (Zorbax 300SB-CN), and the mobile phase is a standard TFA/acetonitrile system.
  • the column temperature is 65 degrees
  • the concentration gradient of acetonitrile is 0 ⁇ 100% in 60 minutes
  • the target product is isolated
  • the purification yield is 35%.
  • the Chinese patent 200610110898.3 and Chinese patent 200510107588 use the same purification method, the purification yield is 28%. .
  • Liraglutide is difficult to purify due to its long peptide chain and its strong hydrophobicity due to its palmitoyl group.
  • the invention provides a purification method of liraglutide which can be purified by solid phase chemical synthesis, which has high purity, good yield and easy industrialization. Summary of the invention
  • the present invention provides a method for purifying a solid phase synthetic liraglutide crude peptide.
  • the method comprises the solid phase synthesis of the crude liraglutide peptide dissolved in an aqueous solution of acetonitrile to obtain a crude peptide solution, followed by four steps.
  • the present invention provides the following technical solutions:
  • the invention provides a method for purifying a solid phase synthesized crude liraglutide peptide, comprising the following steps:
  • Step 1 The crude peptide of the solid phase synthesized liraglutide is dissolved in an aqueous solution of acetonitrile to obtain a crude peptide solution;
  • Step 2 taking the crude peptide solution, using octasilane-bonded silica gel as a stationary phase to contain
  • 0.1 ⁇ 0.2% trifluoroacetic acid in isopropyl alcohol aqueous solution is ⁇ phase
  • acetonitrile containing 0.1 ⁇ 0.2% trifluoroacetic acid is phase B
  • gradient is 20 ⁇ 40% B ⁇ 40 ⁇ 60% B
  • the first HPLC purification Linear gradient elution, collecting the target peak to obtain the first fraction
  • Step 3 taking the first fraction, using cyanosilane-bonded silica gel as a stationary phase, using an aqueous solution of 0.05 to 0.15% perchloric acid as phase A, and a concentration of 0.05 to 0.15% perchloric acid in acetonitrile.
  • phase B the gradient is 40% B ⁇ 70% B, performing a second HPLC purification, linear gradient elution, collecting the target peak to obtain a second fraction;
  • Step 4 taking the second fraction, using octasilane-bonded silica gel as a stationary phase, using an aqueous solution having a mass concentration of 0.01-0.06% ammonia as phase A, chromatographically pure acetonitrile as phase B, and having a gradient 30% B ⁇ 60% B, performing a third HPLC purification, linear gradient elution, collecting the target peak to obtain a third fraction;
  • the impurities are mainly short oligonucleotide fragments, salts and various protecting groups. Among them, the default peptide and racemic peptide are the main impurities.
  • the solid phase synthesis crude peptide has a purity of at most the maximum impurity content.
  • the volume ratio of acetonitrile to water in the aqueous acetonitrile solution is 10 ⁇
  • the volume ratio of isopropanol to water in the aqueous solution of isopropanol is 15 ⁇ 35: 65 ⁇ is preferred, in step 2, step 3 or step 4, the first HPLC purification, the second HPLC purification or the third HPLC purification
  • the flow rate is 55 ⁇ 2000ml / min.
  • step 2 the flow rate of the first HPLC purification, the second HPLC purification or the third HPLC purification is 55 to 500 ml/min.
  • the linear gradient elution time in the step or step is 40 min.
  • the linear gradient elution time in step 4 is 30 min.
  • the concentration is 50-70 mg/ml after concentration under reduced pressure.
  • the solid phase synthesis is carried out by coupling a resin solid phase carrier and an N-terminal Fmoc-protected glycine to obtain an Fmoc-Gly-resin in the presence of an activator system; by solid phase synthesis, according to liraglutide
  • the chain peptide sequence is sequentially coupled with an N-terminal Fmoc-protected and side-chain protected amino acid, wherein the lysine side chain is protected with Alloc; the lysine side chain protecting group is removed; the solid phase synthesis method, on the lysine side
  • the chain is coupled with Palmitoyl-Gllu-OtBu; cleavage, removal of the protecting group and resin to obtain the crude peptide of liraglutide.
  • the present invention provides a method for purifying a solid phase synthetic liraglutide crude peptide.
  • the crude phase-formed crude liraglutide peptide is dissolved in an aqueous solution of acetonitrile to obtain a crude peptide solution, and the liraglutide is obtained by four-step HPLC purification, and the yield is 61.1 - 64.4%, and the purity is 98.2 - 98.7%.
  • the invention discloses a method for purifying a solid phase synthetic crude liraglutide peptide, and those skilled in the art can learn from the contents of the present invention and appropriately improve the process parameters. It is specifically noted that all such similar substitutions and modifications will be apparent to those skilled in the art and are considered as a package. It is included in the present invention.
  • the method and the application of the present invention have been described by the preferred embodiments, and it is obvious that the method and application described herein may be modified or appropriately modified and combined without departing from the scope of the present invention. The technique of the present invention is applied.
  • the reagents used in the purification method of the solid phase synthetic liraglutide provided by the present invention are commercially available.
  • Example 1 The present invention will be further illustrated below in conjunction with the embodiments: Example 1
  • the solid phase synthesizes liraglutide, and the crude peptide has a purity of 50%.
  • the column was rinsed with 50% or more acetonitrile and equilibrated for loading.
  • the sample volume was 2.2 g.
  • the linear gradient was eluted for 40 min, and the target peak was collected to obtain a fraction with a purity greater than 95%.
  • the collected peak fraction of the target was concentrated under reduced pressure to about 20 mg/ml at a water temperature of not more than 35 ° C. Purify the sample.
  • the first step of the purified fraction is loaded, and the sample loading is 1.2 g.
  • the second step of the purified fraction is loaded, and the sample loading is 1.0 g.
  • the linear gradient was eluted for 30 min, and the target peak was collected to obtain a fraction having a purity of more than 98%.
  • the collected peak fraction of the collected peak was distilled under reduced pressure to a temperature of not more than 35 ° C to about 50 mg/ml, and then freeze-dried.
  • the active drug liraglutide 0.858 with a purity of 98.6% was obtained, and the total purified yield was 64.4%.
  • Solid phase synthesis of liraglutide Fmoc-Gly-resin is obtained by coupling a resin solid phase carrier and N-terminal Fmoc-protected glycine in the presence of an activator system; by solid phase synthesis, according to the liraglutide backbone
  • the peptide sequence is coupled to an amino acid having N-terminal Fmoc protection and side chain protection, wherein the lysine side chain is protected by Alloc; the lysine side chain protecting group is removed; the solid phase synthesis method is used in the lysine side chain Coupling with Palmitoyl-Gllu-OtBu; cleavage, removal of the protecting group and resin to obtain the crude peptide of liraglutide.
  • the crude peptide was 60% pure.
  • the linear gradient was eluted for 40 min, and the target peak was collected to obtain a fraction with a purity greater than 95%.
  • the collected peak fraction of the target was concentrated under reduced pressure to about 25 mg/ml at a water temperature of not more than 35 °C. Purify the sample.
  • the first step of the purified fraction is loaded, and the sample loading is 1.4g. Linear gradient elution for 40 min, the target peak was collected, and the fraction with a purity greater than 97% was obtained.
  • the collected peak fraction of the target was concentrated under reduced pressure to about 20 mg/ml at a water temperature of not more than 35 °C. The sample was desalted and purified.
  • the third step is HPLC desalting purification: Column: Column with octasilane-bonded silica as the stationary phase, column diameter and length: 50 mm X 250 mm.
  • the aqueous solution of 0.04% ammonia water is phase A
  • the chromatographic pure acetonitrile is phase B
  • the injection volume was 1.18g.
  • the first step of HPLC purification Purification conditions: Column: Column with octasilane-bonded silica as the stationary phase, column diameter and length: 50 mm X 250 mm.
  • Mobile phase Phase A: 0.2% trifluoroacetic acid 65% water / 35% isopropanol solution; Phase B: 0.2% trifluoroacetic acid in acetonitrile, flow rate: 70 ml/min, gradient: 30% B - 50% B , Detection wavelength: 275 nm.
  • the injection volume is 3.0g.
  • the column was rinsed with 50% or more of acetonitrile and equilibrated for loading.
  • the sample volume was 3.0 g.
  • the linear gradient was eluted for 40 min, and the target peak was collected to obtain a fraction with a purity of more than 95%.
  • the collected peak fraction of the collected peak was distilled under reduced pressure to a temperature of not more than 35 ° C to about 10 mg/ml. Purify the sample.
  • the column was rinsed with 50% or more acetonitrile and the first step purified sample was loaded, and the sample loading was 1.53 g.
  • the linear gradient was eluted for 40 min, and the target peak was collected to obtain a fraction with a purity of more than 97%.
  • the collected peak fraction was concentrated under reduced pressure of 35 ° C to a concentration of about 15 mg/ml.
  • the sample was desalted and purified.
  • the third step is HPLC desalting purification: Column: Column with octasilane-bonded silica as the stationary phase, column diameter and length: 50 mm X 250 mm.
  • the aqueous solution of 0.06% ammonia water is phase A
  • the chromatographic pure acetonitrile is phase B
  • the injection volume was 1.24g.
  • the column was rinsed with 50% or more acetonitrile and the second purified fraction was loaded, and the loading amount was 1.24 g.
  • the linear gradient was eluted for 30 min, and the target peak was collected to obtain a fraction having a purity of more than 98%.
  • the collected peak fraction of the collected peak was distilled under reduced pressure to a temperature of not more than 35 ° C to about 70 mg/ml, and then freeze-dried.
  • the active drug liraglutide l. lg with a purity of 98.7% was obtained, and the total purified yield was 61.1%.
  • Example 4 Solid phase synthesis of liraglutide: Fmoc-Gly-resin is obtained by coupling a resin solid phase carrier and N-terminal Fmoc-protected glycine in the presence of an activator system; by solid phase synthesis, according to the liraglutide backbone The peptide sequence is coupled to an amino acid having N-terminal Fmoc protection and side chain protection, wherein the lysine side chain is protected by Alloc; the lysine side chain protecting group is removed; the solid phase synthesis method is used in the lysine side chain Coupling with Palmitoyl-Gllu-OtBu; cleavage, removal of the protecting group and resin to obtain the crude peptide of liraglutide. The crude peptide was 53% pure.
  • the column is rinsed with more than 50% acetonitrile and equilibrated to load, the amount of sample is 25g.
  • the linear gradient was eluted for 40 min, and the target peak was collected to obtain a fraction with a purity greater than 95%.
  • the collected peak fraction of the target was concentrated under reduced pressure to about 20 mg/ml at a water temperature of not more than 35 ° C. Purify the sample.
  • the first step purified sample is loaded, and the sample loading is 12.25 g. Linear gradient elution for 40 min, the target peak was collected, and the fraction with a purity greater than 97% was obtained.
  • the collected peak fraction of the target was concentrated under reduced pressure to about 20 mg/ml at a water temperature of not more than 35 °C. The sample was desalted and purified.
  • the third step is HPLC desalting purification: Column: Column with octasilane-bonded silica as the stationary phase, column diameter and length: 150 mm X 250 mm. 0.05% ammonia water The aqueous solution is phase A, the color term pure acetonitrile is phase B, flow rate: 500 ml/min, gradient: 30% B-60% B, detection wavelength: 275 nm. The injection volume was 10.7 g.
  • the column is rinsed with 50% or more of acetonitrile and equilibrated to load, the amount of sample is 90g.
  • the linear gradient was eluted for 40 min, and the target peak was collected to obtain a fraction with a purity greater than 95%.
  • the collected peak fraction of the target was concentrated under reduced pressure to about 25 mg/ml at a water temperature of not more than 35 °C. Purify the sample.
  • the first step is taken.
  • the purified fraction was loaded and the amount of the sample was 46 g. Linear gradient elution for 40 min, the target peak was collected, and the fraction with a purity greater than 97% was obtained.
  • the collected peak fraction of the target was concentrated under reduced pressure to about 20 mg/ml at a water temperature of not more than 35 °C. The sample was desalted and purified.
  • the third step is HPLC desalting purification: Column: Column with octasilane-bonded silica as the stationary phase, column diameter and length: 300 mm X 250 mm.
  • the aqueous solution of 0.05% ammonia water is phase A
  • the pure phase acetonitrile is phase B
  • the flow rate is 2000 ml/min
  • the gradient is 30% B-60% B
  • the detection wavelength is 275 nm.
  • the injection volume is 40. lg.
  • the column was rinsed with 50% or more acetonitrile, and the second step of the purified fraction was loaded, and the sample loading was 40.1 g.
  • the linear gradient was eluted for 30 min, and the target peak was collected to obtain a fraction having a purity of more than 98%.
  • the collected peak fraction of the collected peak was distilled under reduced pressure to a temperature of not more than 35 ° C to about 50 mg/ml, and then freeze-dried. 34.0 g of the active drug liraglutide having a purity of 98.2% was obtained, and the total purified yield was 62.9%.

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Description

一种纯化固相合成利拉鲁肽粗肽的方法
本申请要求于 2012 年 02 月 10 日提交中国专利局、 申请号为 201210029818.7、发明名称为 "一种纯化固相合成利拉鲁肽粗肽的方法"的 中国专利申请的优先权， 其全部内容通过引用结合在本申请中。 技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种纯化固相合成利拉鲁肽粗肽 的方法。 背景技术
糖尿病（ Diabetes Mellitus, DM )是一种全球性的高发病， 据世界卫 生组织最新公布数据显示， 2007年全球糖尿病患者人数已达 1.8亿，且发 病率仍逐年增加。 据流行病学统计， 我国 2010年糖尿病患者近 9200万。 由于糖尿病设计全身各个系统，甚至诱发许多致使性并发症，严重影响人 的劳动能力， 并威胁人的生命安全， 对人们的健康形成极大的危害。糖尿 病主要分为 I型和 II型， 后者占糖尿病患者总数的 90%以上。
利拉鲁肽是一种长效治疗 II型糖尿病的胰高血糖素样肽 1 ( GLP-1 ) 类似物， 属于 GLP-1受体激动剂， 是首个为 II型糖尿病治疗开发的人高血 糖素样多肽 -1 ( GLP-1 )类似物。 由诺和诺德公司开发研制， 并于 2010年 1月 25日获得 FDA批准上市， 于 2011年 3月 4日获 SFDA批准在中国上市。 利拉鲁肽作为新一代以肠促胰岛素为基础的降血糖药物， 不仅作用时间 长,而且充分保留了天然 GLP-1的多项生理活性,可安全有效降糖并可 能对多种心血管危险因素有保护作用，为 2型糖尿病的治疗带来了新 的选择。 临床治疗效果令人鼓舞。
该药品在我国完全依赖进口， 药品价格昂贵。诺和诺德公司通过基因 重组技术生产。多肽固相化学合成因其可定向合成且溶剂用量少等优点而 成为多肽和蛋白质药物研究、生产领域中的一个重要技术手段。但化学合 成产生的杂质因其性质相近使分离纯化难度大而导致纯化技术成为瓶颈 之一， 使其产业化带来困难。 目前有报道利拉鲁肽纯化方法为 RP-HPLC方法（ Journal of Medicinal Chemistry 43 , 1664-1669, 2000 ) , 采用氰丙基柱（ Zorbax 300SB-CN ) , 流动相为标准的 TFA/乙腈体系， 柱温为 65度， 乙腈的浓度梯度为 60分 钟内 0~100% , 分离出 目标产物， 纯化收率为 35% ; 中国专利 200610110898.3和中国专利 200510107588采用同样的纯化方法， 纯化收 率为 28%。
利拉鲁肽由于肽链长且因其棕榈酰基存在导致疏水性大强而纯化难 度大。 本发明提出了一种可纯化固相化学合成得到的利拉鲁肽纯化方法， 产品纯度高且收率好且易于产业化。 发明内容
有鉴于此，本发明提供一种纯化固相合成利拉鲁肽粗肽的方法。该方 法将固相合成的利拉鲁肽粗肽溶于乙腈水溶液获得粗肽溶液后，通过四步
HPLC纯化获得利拉鲁肽， 纯度好， 收率高。
为了实现上述发明目的， 本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种固相合成的利拉鲁肽粗肽的纯化方法，包括如下步 骤：
步骤 1 : 取固相合成的利拉鲁肽粗肽溶于乙腈水溶液中获得粗肽溶 液；
步骤 2: 取所述粗肽溶液， 以八烷基硅烷键合硅胶为固定相， 以含有
0.1 ~ 0.2%三氟醋酸的异丙醇水溶液为 Α相， 含有 0.1 ~ 0.2%三氟醋酸的 乙腈为 B相， 梯度为 20 ~ 40% B→40 ~ 60% B, 进行第一 HPLC纯化， 线 性梯度洗脱， 收集目的峰获得第一馏分；
步骤 3: 取所述第一馏分， 以氰基硅烷键合硅胶为固定相， 以质量浓 度为 0.05 ~ 0.15%高氯酸的水溶液为 A相， 质量浓度为 0.05 ~ 0.15%高氯 酸的乙腈为 B相， 梯度为 40% B→70% B, 进行第二 HPLC纯化， 线性梯 度洗脱， 收集目的峰获得第二馏分；
步骤 4: 取所述第二馏分， 以八烷基硅烷键合硅胶为固定相， 以质量 浓度为 0.01 ~ 0.06%氨水的水溶液为 A相， 色谱纯乙腈为 B相， 梯度为 30% B→60% B, 进行第三 HPLC纯化， 线性梯度洗脱， 收集目的峰获得 第三馏分；
步骤 取所述第三馏分经减压旋蒸浓缩、 冷冻干燥， 即得。
多肽固相合成中， 杂质主要为短的寡核苷酸片段、 盐及各种保护基。 其中， 缺省肽和消旋肽为主要的去除杂质。 在本发明中， 固相合成粗肽纯 度为 杂质最大含量为 。
作为优选， 乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为 10 ~
作为优选， 异丙醇水溶液中异丙醇与水的体积比为 15 ~ 35： 65 ~ 作为优选，步骤 2、步骤 3或步骤 4中，第一 HPLC纯化、第二 HPLC 纯化或第三 HPLC纯化的流速为 55 ~ 2000ml/min。
作为优选，步骤 2、步骤 3或步骤 4中，第一 HPLC纯化、第二 HPLC 纯化或第三 HPLC纯化的流速为 55 ~ 500ml/min。
作为优选， 步骤 或步骤 中线性梯度洗脱时间为 40min。
作为优选， 步骤 4中线性梯度洗脱时间为 30min。
作为优选， 步骤 5中减压旋蒸浓缩后浓度为 50 ~ 70 mg/ml。
作为优选，所述固相合成为在活化剂系统的存在下， 由树脂固相载体 和 N端 Fmoc保护的甘氨酸偶联得到 Fmoc-Gly-树脂； 通过固相合成法， 按照利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有 N端 Fmoc保护且侧链保护的氨基 酸， 其中赖氨酸侧链采用 Alloc保护； 脱除赖氨酸侧链保护基 Alloc; 通 过固相合成法， 在赖氨酸侧链偶联 Palmitoyl-Gllu-OtBu; 裂解， 脱除保护 基和树脂得到利拉鲁肽粗肽。
本发明提供一种纯化固相合成利拉鲁肽粗肽的方法。该方法将固相合 成的利拉鲁肽粗肽溶于乙腈水溶液获得粗肽溶液后， 通过四步 HPLC 纯 化获得利拉鲁肽， 收率为 61.1 - 64.4%, 纯度为 98.2 ~ 98.7%。 具体实施方式
本发明公开了一种纯化固相合成利拉鲁肽粗肽的方法，本领域技术人 员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。 特别需要指出的是， 所有 类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包 括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关 人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用 进行改动或适当变更与组合， 来实现和应用本发明技术。
本发明提供的固相合成的利拉鲁肽的纯化方法中所用试剂均可由 市场购得。
下面结合实施例， 进一步阐述本发明： 实施例 1
固相合成利拉鲁肽， 粗肽纯度为 50%。
样品处理：
将 2.2g固体粗肽用 10%乙腈 /90%水（ V/V ), 超声使样品完全溶 解后用滤膜过滤， 收集滤液备用。
第一步 HPLC纯化：
纯化条件： 色谱柱： 以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱子直径和长度为： 50 mm x 250 mm 。 流动相： A相： 0.1%三氟 乙酸 85%水 /15%异丙醇溶液水溶液； B 相： 0.1%三氟醋酸的乙腈， 流速： 55 ml/min, 梯度： 40% B— 60% B,检测波长： 275 nm。 进样量 为 2.2g 。
纯化过程： 将色谱柱用 50%以上的乙腈沖洗干净后平衡上样， 上 样量为 2.2g。 线性梯度洗脱 40min, 收集目的峰， 得到纯度大于 95% 以上馏分， 将收集的目的峰馏分于水温不超过 35 °C的条件下减压旋 蒸浓缩至约 20 mg/ml 后作第二步纯化样品。
第二步 HPLC纯化：
纯化条件： 色谱柱： 以氰基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱 子直径和长度为： 50 mm X 250 mm 。 流动相： A相： 0.15%高氯 酸的水溶液为 A 相， 0.15%高氯酸的乙腈为 B 相， 梯度： 40% B— 70% B , 检测波长： 275 nm。 进样量为 1.2g 。
纯化过程：将色谱柱用 50%以上的乙腈沖洗干净平衡后将第一步 纯化馏分上样， 上样量为 1.2g。 线性梯度洗脱 40min, 收集目的峰， 得到纯度大于 97%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过 35 °C 的条件下减压旋蒸浓缩至约 20 mg/ml 后作第三步脱盐纯化样品。
第三步 HPLC脱盐纯化：
色谱柱： 以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱子直径和 长度为： 50 mm 250 mm 。 0.01%氨水的水溶液为 A 相， 色谱纯 乙腈为 B相， 梯度： 30% B— 60% B , 检测波长： 275 nm。 进样量为 l .Og 。
纯化过程：将色谱柱用 50 %以上的乙腈沖洗干净平衡后将第二步 纯化馏分上样， 上样量为 1.0g。 线性梯度洗脱 30min, 收集目的峰， 得到纯度大于 98%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过 35 °C 的条件下减压旋蒸浓缩至约 50 mg/ml 后进行冷冻干燥， 即可得到纯 度为 98.6%的活性药物利拉鲁肽0.858, 纯化总收率为 64.4%。 实施例 2
固相合成利拉鲁肽： 在活化剂系统的存在下， 由树脂固相载体和 N 端 Fmoc保护的甘氨酸偶联得到 Fmoc-Gly-树脂； 通过固相合成法， 按照 利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有 N端 Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其 中赖氨酸侧链采用 Alloc保护； 脱除赖氨酸侧链保护基 Alloc; 通过固相 合成法， 在赖氨酸侧链偶联 Palmitoyl-Gllu-OtBu; 裂解， 脱除保护基和树 脂得到利拉鲁肽粗肽。 粗肽纯度为 60%。
样品处理：
将 2.5g固体粗肽用 20%乙腈 /80%水（ V/V ), 超声使样品完全溶 解后用滤膜过滤， 收集滤液备用。
第一步 HPLC纯化：
纯化条件： 色谱柱： 以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱子直径和长度为： 50 mm X 250 mm 。 流动相： A相： 0.2%三氟 乙酸 75%水 /25%异丙醇溶液水溶液； B 相： 0.2%三氟醋酸的乙腈， 流速： 80 ml/min, 梯度： 35% B— 55% B,检测波长： 275 nm。 进样量 为 2.5g 。 纯化过程： 将色谱柱用 50%以上的乙腈沖洗干净后平衡上样， 上 样量为 2.5g。 线性梯度洗脱 40min, 收集目的峰， 得到纯度大于 95% 以上馏分， 将收集的目的峰馏分于水温不超过 35 °C的条件下减压旋 蒸浓缩至约 25 mg/ml 后作第二步纯化样品。
第二步 HPLC纯化：
纯化条件： 色谱柱： 以氰基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱 子直径和长度为： 50 mm x 250 mm 。 流动相： A相： 0.1%高氯酸 的水溶液为 A相， 0.1%高氯酸的乙腈为 B相， 梯度： 40% B— 70% B , 检测波长： 275 nm。 进样量为 1.4g 。
纯化过程：将色谱柱用 50%以上的乙腈沖洗干净平衡后将第一步 纯化馏分上样， 上样量为 1.4g。 线性梯度洗脱 40min, 收集目的峰， 得到纯度大于 97%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过 35 °C 的条件下减压旋蒸浓缩至约 20 mg/ml 后作第三步脱盐纯化样品。
第三步 HPLC脱盐纯化： 色谱柱： 以八烷基硅烷键合硅胶为固定 相的色谱柱， 柱子直径和长度为： 50 mm X 250 mm 。 0.04%氨水的 水溶液为 A相， 色谱纯乙腈为 B相， 梯度： 30% B— 60% B , 检测波 长： 275 nm。 进样量为 1.18g 。
纯化过程：将色谱柱用 50 %以上的乙腈沖洗干净平衡后将第二步 纯化馏分上样， 上样量为 1.18g。 线性梯度洗脱 30min, 收集目的峰， 得到纯度大于 98%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过 35 °C 的条件下减压旋蒸浓缩至约 60 mg/ml 后进行冷冻干燥， 即可得到纯 度为 98.4%的活性药物利拉鲁肽0.928, 纯化总收率为 61.3%。 实施例 3
固相合成利拉鲁肽， 粗肽纯度为 58%。
样品处理：
将 3.0g固体粗肽用 30%乙腈 /70%水（V/V ), 超声使样品完全溶 解后用滤膜过滤， 收集滤液备用。
第一步 HPLC纯化： 纯化条件： 色谱柱： 以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱子直径和长度为： 50 mm X 250 mm 。 流动相： A相： 0.2%三氟 乙酸 65%水 /35%异丙醇溶液水溶液； B 相： 0.2%三氟醋酸的乙腈， 流速： 70 ml/min, 梯度： 30% B— 50% B,检测波长： 275 nm。 进样量 为 3.0g 。
纯化过程： 将色谱柱用 50%以上的乙腈沖洗干净后平衡上样， 上 样量为 3.0g。 线性梯度洗脱 40min, 收集目的峰， 得到纯度大于 95% 以上馏分， 将收集的目的峰馏分于水温不超过 35 °C的条件下减压旋 蒸浓缩至约 10 mg/ml 后作第二步纯化样品。
第二步 HPLC纯化：
纯化条件： 色谱柱： 以氰基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱 子直径和长度为： 50 mm X 250 mm 。 流动相： A相： 0.05%高氯 酸的水溶液为 A 相， 0.05%高氯酸的乙腈为 B 相， 梯度： 40% B— 70% B , 检测波长： 275 nm。 进样量为 1.53g 。
纯化过程：将色谱柱用 50%以上的乙腈沖洗干净平衡后将第一步 纯化馏分上样， 上样量为 1.53g。 线性梯度洗脱 40min, 收集目的峰， 得到纯度大于 97%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过 35 °C 的条件下减压旋蒸浓缩至约 15 mg/ml 后作第三步脱盐纯化样品。
第三步 HPLC脱盐纯化： 色谱柱： 以八烷基硅烷键合硅胶为固定 相的色谱柱， 柱子直径和长度为： 50 mm X 250 mm 。 0.06%氨水的 水溶液为 A相， 色谱纯乙腈为 B相， 梯度： 30% B— 60% B , 检测波 长： 275 nm。 进样量为 1.24g 。
纯化过程：将色谱柱用 50%以上的乙腈沖洗干净平衡后将第二步 纯化馏分上样， 上样量为 1.24g。 线性梯度洗脱 30min, 收集目的峰， 得到纯度大于 98%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过 35 °C 的条件下减压旋蒸浓缩至约 70 mg/ml 后进行冷冻干燥， 即可得到纯 度为 98.7%的活性药物利拉鲁肽 l . lg, 纯化总收率为 61.1 %。 实施例 4 固相合成利拉鲁肽： 在活化剂系统的存在下， 由树脂固相载体和 N 端 Fmoc保护的甘氨酸偶联得到 Fmoc-Gly-树脂； 通过固相合成法， 按照 利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有 N端 Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其 中赖氨酸侧链采用 Alloc保护； 脱除赖氨酸侧链保护基 Alloc; 通过固相 合成法， 在赖氨酸侧链偶联 Palmitoyl-Gllu-OtBu; 裂解， 脱除保护基和树 脂得到利拉鲁肽粗肽。 粗肽纯度为 53%。
样品处理：
将 25g粗肽用 20%乙腈 /80%水溶液溶解， 超声使样品完全溶解 后用滤膜过滤， 收集滤液备用。
第一步 HPLC纯化：
纯化条件： 色谱柱： 以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱子直径和长度为： 150 mm x 250 mm 。 流动相： A 相： 0.1%三氟 醋酸的 20%异丙醇 /80%水溶液； B相： 0.1 %三氟醋酸的乙腈， 流速： 500 ml/min,梯度： 30% B— 50% B,检测波长： 275 nm。进样量为 25g 。
纯化过程： 将色谱柱用 50%以上的乙腈沖洗干净后平衡上样， 上 样量为 25g。 线性梯度洗脱 40min, 收集目的峰， 得到纯度大于 95% 以上馏分， 将收集的目的峰馏分于水温不超过 35 °C的条件下减压旋 蒸浓缩至约 20 mg/ml 后作第二步纯化样品。
第二步 HPLC纯化：
纯化条件： 色谱柱： 以氰基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱 子直径和长度为： 150 mm x 250 mm 。 流动相： A相： 0.15%高氯 酸的水溶液， B相： 0.15%高氯酸的乙腈， 流速： 500 ml/min, 梯 度： 40% B— 70% B , 检测波长： 275 nm。 进样量为 12.25g 。
纯化过程：将色谱柱用 50%以上的乙腈沖洗干净平衡后将第一步 纯化馏分上样， 上样量为 12.25g。 线性梯度洗脱 40min, 收集目的峰， 得到纯度大于 97%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过 35 °C 的条件下减压旋蒸浓缩至约 20 mg/ml 后作第三步脱盐纯化样品。
第三步 HPLC脱盐纯化： 色谱柱： 以八烷基硅烷键合硅胶为固定 相的色谱柱， 柱子直径和长度为： 150 mm X 250 mm 。 0.05%氨水 的水溶液为 A相， 色语纯乙腈为 B相， 流速： 500 ml/min, 梯度： 30% B— 60% B , 检测波长： 275 nm。 进样量为 10.7g 。
纯化过程：将色谱柱用 50 %以上的乙腈沖洗干净平衡后将第二步 纯化馏分上样， 上样量为 10.7g。 线性梯度洗脱 30min, 收集目的峰， 得到纯度大于 98%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过 35 °C 的条件下减压旋蒸浓缩至约 50 mg/ml 后进行冷冻干燥， 即可得到纯 度为 98.4%的活性药物利拉鲁肽 9.2g, 纯化总收率为 61.3%。 实施例 5
固相合成利拉鲁肽， 粗肽纯度为 56%。
样品处理：
将 90g粗肽用 30%乙腈 /70%水溶液溶解， 超声使样品完全溶解 后用滤膜过滤， 收集滤液备用。
第一步 HPLC纯化：
纯化条件： 色谱柱： 以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱子直径和长度为： 300 mm X 250 mm 。 流动相： A相： 0.15%三 氟醋酸的 20%异丙醇 /80%水溶液； B相： 0.15%三氟醋酸的乙腈， 流 速： 2000 ml/min, 梯度： 30% B— 50% B,检测波长： 275 nm。 进样量 为 90g。
纯化过程： 将色谱柱用 50%以上的乙腈沖洗干净后平衡上样， 上 样量为 90g。 线性梯度洗脱 40min, 收集目的峰， 得到纯度大于 95% 以上馏分， 将收集的目的峰馏分于水温不超过 35 °C的条件下减压旋 蒸浓缩至约 25 mg/ml 后作第二步纯化样品。
第二步 HPLC纯化：
纯化条件： 色谱柱： 以氰基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱 子直径和长度为： 300 mm x 250 mm。 流动相： A相： 0.15%高氯酸 的水溶液， B相： 0.15%高氯酸的乙腈， 流速： 2000 ml/min, 梯度： 40% B— 70% B , 检测波长： 275 nm。 进样量为 46g 。
纯化过程：将色谱柱用 50 %以上的乙腈沖洗干净平衡后将第一步 纯化馏分上样， 上样量为 46g。 线性梯度洗脱 40min, 收集目的峰， 得到纯度大于 97%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过 35 °C 的条件下减压旋蒸浓缩至约 20 mg/ml 后作第三步脱盐纯化样品。
第三步 HPLC脱盐纯化： 色谱柱： 以八烷基硅烷键合硅胶为固定 相的色谱柱， 柱子直径和长度为： 300 mm X 250 mm。 0.05%氨水的 水溶液为 A相， 色语纯乙腈为 B相， 流速： 2000 ml/min, 梯度： 30% B— 60% B , 检测波长： 275 nm。 进样量为 40. lg 。
纯化过程：将色谱柱用 50 %以上的乙腈沖洗干净平衡后将第二步 纯化馏分上样， 上样量为 40.1g。 线性梯度洗脱 30min, 收集目的峰， 得到纯度大于 98%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过 35 °C 的条件下减压旋蒸浓缩至约 50 mg/ml 后进行冷冻干燥， 即可得到纯 度为 98.2%的活性药物利拉鲁肽 34.0g, 纯化总收率为 62.9%。
以上对本发明所提供的纯化固相合成利拉鲁肽粗肽的方法进行了详 上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。 应当指 出， 对于本技术领域技术人员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可 以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求 的保护范围内。
-μ

Claims

权 利 要 求
1、 一种纯化固相合成利拉鲁肽粗肽的方法， 其特征在于， 包括如下 步骤：
步骤 1 : 取固相合成的利拉鲁肽粗肽溶于乙腈水溶液中获得粗肽溶 液；
步骤 2: 取所述粗肽溶液， 以八烷基硅烷键合硅胶为固定相， 以含有 0.1 ~ 0.2%三氟醋酸的异丙醇水溶液为 A相， 含有 0.1 ~ 0.2%三氟醋酸的 乙腈为 B相， 梯度为 20 ~ 40% B→40 ~ 60% B, 进行第一 HPLC纯化， 线 性梯度洗脱， 收集目的峰获得第一馏分；
步骤 3: 取所述第一馏分， 以氰基硅烷键合硅胶为固定相， 以质量浓 度为 0.05 ~ 0.15%高氯酸的水溶液为 A相， 质量浓度为 0.05 ~ 0.15%高氯 酸的乙腈为 B相， 梯度为 40% B→70% B, 进行第二 HPLC纯化， 线性梯 度洗脱， 收集目的峰获得第二馏分；
步骤 4: 取所述第二馏分， 以八烷基硅烷键合硅胶为固定相， 以质量 浓度为 0.01 ~ 0.06%氨水的水溶液为 A相， 色谱纯乙腈为 B相， 梯度为 30% B→60% B, 进行第三 HPLC纯化， 线性梯度洗脱， 收集目的峰获得 第三馏分；
步骤 5: 取所述第三馏分经减压旋蒸浓缩、 冷冻干燥， 即得。
2、 根据权利要求 1所述的纯化方法， 其特征在于， 所述乙腈水溶液 中乙腈与水的体积比为 10 ~ 30： 70 ~ 90。
3、 根据权利要求 1所述的纯化方法， 其特征在于， 所述异丙醇水溶 液中异丙醇与水的体积比为 15 ~ 35： 65 ~ 85。
4、 根据权利要求 1所述的纯化方法， 其特征在于， 步骤 2、 步骤 3 或步骤 4中，所述第一 HPLC纯化、所述第二 HPLC纯化或所述第三 HPLC 纯 4匕的流速为 55 ~ 2000ml/min。
5、 根据权利要求 1所述的纯化方法， 其特征在于， 步骤 2、 步骤 3 或步骤 4中，所述第一 HPLC纯化、所述第二 HPLC纯化或所述第三 HPLC 纯 4匕的流速为 55 ~ 500ml/min。
6、 根据权利要求 1所述的纯化方法， 其特征在于， 步骤 2或步骤 3 中所述线性梯度洗脱时间为 40min。
7、 根据权利要求 1所述的纯化方法， 其特征在于， 步骤 4中所述线 性梯度洗脱时间为 30min。
8、 根据权利要求 1所述的纯化方法， 其特征在于， 步骤 5中所述减 压旋蒸浓缩后浓度为 50 ~ 70 mg/ml。
9、 根据权利要求 1所述的纯化方法， 其特征在于， 所述固相合成为 在活化剂系统的存在下，由树脂固相载体和 N端 Fmoc保护的甘氨酸偶联 得到 Fmoc-Gly-树脂； 通过固相合成法， 按照利拉鲁肽主链肽序依次偶联 具有 N端 Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中赖氨酸侧链采用 Alloc保 护； 脱除赖氨酸侧链保护基 Alloc; 通过固相合成法， 在赖氨酸侧链偶联 Palmitoyl-Gllu-OtBu; 裂解， 脱除保护基和树脂得到利拉鲁肽粗肽。
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